ES2385239A1 - Uso de colagenasa g recombinante, colagenasa h recombinante y pz-peptidasa recombinante para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno. - Google Patents

Abstract

Uso de colagenasa G recombinante, colagenasa H recombinante y pz-peptidasa recombinante para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno.Uso de colagenasa G recombinante, colagenasa H recombinante y pz-peptidasa recombinante para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del tejido conectivo. En concreto se refiere al uso de dichas enzimas, donde la proporción colagenasa G recombinante, colagenasa H recombinante es de 1:3, y a su uso secuencial, administrando primero colagenasa G y después colagenasa H.

Description

Uso de colagenasa G recombinante, colagenasa H recombinante V pzpeptidasa recombinante para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la de la biología molecular, la biotecnología y la medicina, y se refiere al uso de colagenasa G recombinante, colagenasa H recombinante y pz-peptidasa recombinante para el tratamiento de enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno. En concreto se refiere al uso de dichas enzimas, donde la proporción colagenasa G recombinante, colagenasa H recombinante es de 1:3, y a su uso secuencial, administrando primero colagenasa G y después colagenasa H.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El colágeno es el principal constituyente estructural de los mamíferos y constituye una gran proporción del contenido proteico total de la piel y otras partes del cuerpo. Numerosos traumas de la piel, como quemaduras, cirugías, infecciones, y accidentes, se caracterizan frecuentemente por la acumulación errática de tejido fibroso rico en colágeno y con un alto contenido en proteoglucanos. Además de reparar el tejido normal que ha sido destruido o dañado, se acumulan depósitos excesivos y desfigurantes de colágeno. El exceso de colágeno se ha atribuido a un mal balance entre la síntesis y la degradación de colágeno.

Numerosas enfermedades y condiciones patológicas están asociadas con el exceso de depósito y acumulación errática de tejido fibroso rico en colágeno. Tales enfermedades y condiciones patológicas se han denominado colectivamente como "enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno". Las colagenasas se han empleado para tratar varias enfermedades que cursan con alteraciones del colágeno.

Las colagenasas son enzimas proteasas que se unen específicamente a secuencias de aminoácidos Pro-X-Gly-Pro, donde X es normalmente un aminoácido neutro. Estas secuencias son frecuentes en colágenos y raramente se dan en otro tipo de proteínas, de ahí su alta especificidad. Además, así como otros enzimas proteasas son capaces de degradar el colágeno desnaturalizado, las colagenasas G y H son las únicas capaces de atacar y degradar a triple hélice de colágeno en condiciones nativas encontradas comúnmente en tejido conectivo (Seifter y Harper, 1970. Methods Enzymol. 19, 613-635; Harper, 1980. Ann. Rev. Biochem. 49, 1063-1078; Peterkofsky 1982. Methods Enzymol. 82, 453-471)

La PZ-peptidasa se considera un enzima esencial en la degradación del colágeno en colaboración con proteasas colagenolíticas. Las propiedades de la

PZ-Peptidasa son:

(1)

Son metalooligoproteasas;

(2)

Poseen un motivo HEXXH de unión a Zn2+;

(3)

No tienen similitud con las colagenasas ColG y ColH de C.

histolyticum

(4)

Son capaces de degradar oligopéptidos pero no sustratos de

proteínas

Actualmente, el tratamiento de las enfermedades relacionadas con colágeno se lleva a cabo mediante una combinación en relación 1:1 de colagenasa G y H procedente de la fermentación de C/ostridium histolyticum y purificadas cromatográficamente, (W02007/089851A3). Algunas de estas enfermedades son la enfermedad de Dupuytren (US005589171A), o enfermedades oftálmicas (US4174389).

En todos los casos se expone el empleo de una mezcla de colagenasa (Col I y Col 11 o bien Col H y Col G). Este hecho se ha debido a que hasta la fecha todos los procedimientos de obtención de este enzima han sido mediante la purificación del extracto total producido por la fermentación de Closfridium hisfolyticum. En el extracto total de esta fermentación se obtiene ColG y ColH conjuntamente, en proporción 1 :1. Posteriormente se procede a un proceso de purificación mediante cromatografía para alcanzar una mezcla de ColG y ColH suficiente como para ser empleada como medicamento, como es el caso del Xiaflex, el primer medicamento a base de colagenasas aprobado por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Dupuytren.

Xiaflex se facilita como un polvo liofilizado, que debe ser reconstituido en un diluyente antes de su uso. La dosis es de 0.58 mg por inyección en un cordón palpable metacarpofalangeal, o interfalangeal. Administrar cada 2 horas, 3 veces en intervalos de 4 semanas.

Este producto cursa con los siguientes efectos secundarios: Daño en los ligamentos, ruptura de tendones, CRPS (complex regional pain síndrome), edema periférico, contusión, dolor.

Xiaflex contiene colagenasa AUX-I y colagenasa AUX-II, aislados y purificadas' de la fermentación de las bacterias Closfridium hisfolyticum.

La colagenasa AUX-I es una cadena simple de polipéptidos que consiste aproximadamente en 1000 aminoácidos de secuencia conocida. Se observa un peso molecular de 114 kiloDaltons (kDa). Pertenece a la clase I de Colagenasas de Closfridium hysfoliticum.

La colagenasa AUX-II es una cadena simple de polipéptidos que consiste aproximadamente en 1000 aminoácidos de secuencia conocida. Se observa un peso molecular de 113 kiloDaltons (kDa). Pertenece a la clase 11 de Colagenasas de Closridium hysfoliticum.

No obstante, estos tratamientos poseen limitaciones derivadas de la fuente de origen y de la combinación de las colagenasas G y H en proporción 1: 1 que hacen del medicamento, un producto difícil de controlar en su dosificación y tratamiento. Los efectos secundarios más llamativos son:

1.

Ruptura de tendón y daños serios en las extremidades tratadas

2.

Reacciones alérgicas

3.

Problemas de coagulación

Es necesario, por tanto, encontrar un tratamiento alternativo que permita alcanzar un mayor efecto sin los efectos secundarios de los medicamentos actuales.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

Los autores de la presente invención han identificado el efecto terapéutico superior del empleo de la colagenasa G (CoIG ó AUX-I) y H (CoIH ó AUX-II) recombinantes (rCoIG y rCoIH), de forma separada o combinada, y más específicamente en relación 1:3, para alcanzar efectos farmacológicos que actualmente no se pueden alcanzar con los medicamentos actuales que tienen como principio activo colagenasa, y que además permite evitar los efectos laterales negativos derivados del empleo de colagenasas obtenidas por fermentación, y en proporciones 1: 1. Asimismo, los tratamientos farmacológicos promovidos por la PZ-peptidasa pueden ser complementarios a los de la ColG y ColH al actuar sobre sustratos más pequeños (oligopéptidos) y no sobre colágeno completo.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende colagenasa G Y colagenasa H en una proporción 1 :3.

En una realización preferida de este aspecto, la composición de la invención además comprende PZ-Peptidasa. En otra realización preferida, la composición además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización más preferida, la composición de la invención comprende otro principio activo.

Otro aspecto de la invención se refiere a la composición de la invención para su uso como medicamento, o alternativamente, al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento.

Otro aspecto se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que cursen con desórdenes del tejido conectivo, o alternativamente a la composición de la invención para el tratamiento de enfermedades que cursen con desórdenes del tejido conectivo.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con desórdenes del tejido conectivo es una fibromatosis. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la fibromatosis S6 selecciona de la lista que comprende: contractura palmar de Dupuytren enfermedad de La Peyronie, enfermedad de Ledderhose o fibromatosis de la aponeurosis plantar, o la existencia de tejido fibroso en el lóbulo de la oreja

En esta memoria se entiende por desórdenes del tejido conectivo a enfermedades que cursan con acumulaciones de placas subdérmicas de dicha tejido.

El término fibromatosis refiere a un grupo de benigno tejido fino suave tumores cuáles tienen ciertas características en campo común, incluyendo la ausencia de características citológicas y clínicas malignas, a un cuadro histológico constante con la proliferación de fibroblastos bien distinguidos, una estructura de crecimiento infiltrativa, y un comportamiento clínico agresivo con la repetición local frecuente. Incluye diversos subtipos, entre los que se encuentran: fibromatosis juvenil, fibromatosis de colli, fibromatosis digital infantil, miofibromatosis infantil, ipofibromatosis, fibromatosis hialínica juvenil, fibromatosis plantar, enfermedad de Peyronie, y la contractura de Dupuytren.

La enfermedad de Dupuytren (también llamada contractura de Dupuytren, o contractura palmar de Dupuytren) consiste en la retracción de la palma de la mano con la consiguiente flexión fija de algunos dedos; normalmente, empieza con un engrosamiento de la piel de la palma de la mano, el cual se puede convertir en un bulto duro o banda gruesa.

La enfermedad de La Peyronie o induración plástica del pene es un proceso de causa desconocida caracterizado por una banda fibrosa en la túnica albugínea de los cuerpos cavernosos del pene. Suele ser unilateral y tiene como consecuencia la desviación del pene durante la erección. Dependiendo de la extensión de la banda fibrosa, el proceso puede imposibilitar la penetración o hacer que la erección resulte dolorosa.

La enfermedad de Ledderhose, también conocido como Morbus Ledderhose, fibromatosis plantar, y aponeurosis plantar, es un relativamente infrecuente espesamiento anómalo del tejido fino conectivo profundo de los pies, o faja. En el principio, donde los nódulos o las cuerdas comienzan a crecer adelante tendones del pie, la enfermedad es de menor importancia, puede ser dolorosa. Eventualmente, sin embargo, las cuerdas espesan, los dedos del pie se atiesan y se doblan, y el caminar llega a ser doloroso. Como en la mayoría de las formas de fibromatosis, es generalmente benigno y su inicio varía con cada paciente. Los nódulos son típicamente de crecimiento lento y encontrado lo más a menudo posible en las porciones centrales e intermedias de la faja plantar. De vez en cuando, los nódulos pueden permanecer inactivos por meses o años para comenzar de repente un crecimiento rápido e inesperado. Necesita solamente ser tratado quirúrgicamente si el malestar obstaculiza caminar.

En esta memoria las enfermedades que cursen con alteraciones del colágeno son fácilmente identificables por diagnóstico médico, mediante la ayuda de pruebas histológicas.

La "colagenasa G" posee una secuencia nucleotídica formada por 3357 nucleótidos (SEO ID NO: 3). Los 330 primeros codifican para un péptido señal (SEO ID NO: 4) ya que el primer aminoácido de la proteína madura secretada es el codificado por el codón ata. El péptido señal se incorpora para permitir la secreción del enzima en el medio extracelular. Una vez en la membrana bacteriana el péptido señal es cortado y el enzima activa es liberada al medio En el caso de la Colagenasa G recombinante, el último codón (stop codón) eS eliminado y en su lugar se añade una secuencia nucleotídica que codifica para 6 histidinas, necesarias para el posterior proceso de purificación o inmovilización en formas farmacéuticas.

La secuencia aminoacídica está formada por 1118 aminoácidos. Los 110 residuos del extremo amino terminal componen el péptido señal (SEO ID NO 5) Y los restantes 1008 para la colagenasa secretada (SEO ID NO: 1).

La colagenasa G con péptido señal tiene los siguientes parámetros físicoquímicos:

-

Peso molecular: 127 KOa.

-

Punto isoeléctrico: 5.8.

-

Número de cargas negativas (Asp + Glu) : 160.

-

Número de cargas positivas (Arg+ Lys) : 142.

-

índice de inestabilidad teórico: 26.61, lo que clasifica a la proteína de

estable.

-

Vida media teórica estimada en Escherichia coli (in vivo): mayor a 10

horas.

La colagenasa G sin péptido señal tiene los siguientes parámetros físicoquímicos:

-

Peso molecular: 114.8 KDa.

-

Punto isoeléctrico: 5.53.

-

Número de cargas negativas (Asp + Glu) : 145.

-

Número de cargas positivas (Arg+ Lys) : 122.

-

índice de inestabilidad teórico: 24.11, lo que clasifica a la proteína de

estable.

-

Vida media teórica estimada en Escherichia coli (in vivo): mayor a 10

horas.

En el contexto de la presente invención, "colagenasa G" (CoIG o AUX-I) se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína "colagenasa G", y que comprende diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucléico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 1, b) moléculas de ácido nucléico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucléico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, ó

d) moléculas de ácido nucléico que codifican un polipétptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 1. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucléicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína "colagenasa G". El término incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales.

La "colagenasa H" posee una secuencia nucleotídica formada por 3066 nucleótidos (SEQ ID NO: 6). Los 120 primeros SEQ ID NO: 7) codifican para un péptido señal ya que el primer aminoácido de la proteína madura secretada es el codificado por el codón gta). El péptido señal se incorpora para permitir la secreción del enzima en el medio extracelular. Una vez en la membrana bacteriana el péptido señal es cortado y el enzima activa es liberada al medio. En el caso de la Colagenasa H recombinante, el último codón (stop codón) es eliminado y en su lugar se añade una secuencia nucleotídica que codifica para 6 histidinas, necesarias para el posterior proceso de purificación o inmovilización en formas farmacéuticas.

La secuencia aminoacídica está formada por 1021 aminoácidos. Los 40 residuos del extremo amino terminal que componen el péptido señal (SEQ ID NO: 8) y los restantes 981 para la colagenasa secretada (SEQ ID NO: 2)

La colagenasa H con péptido señal tiene los siguientes parámetros físicoquímicos:

-

Peso molecular: 117.2 KOa

-

Punto isoeléctrico: 5.99

-

Número de cargas negativas (Asp + Glu) : 142

-

Número de cargas positivas (Arg+ Lys) : 128

-

índice de inestabilidad teórico: 35.48, lo que clasifica a la proteína de

estable.

-

Vida media teórica estimada en Escherichia coli (in vivo): mayor a 1a

horas.

La colagenasa H sin péptido señal tiene los siguientes parámetros físico

químicos:

-

Peso molecular: 112.98 KOa

-

Punto isoeléctrico: 5.76

-

Número de cargas negativas (Asp + Glu) : 141

-

Número de cargas positivas (Arg+ Lys) : 122

-

índice de inestabilidad teórico: 35.30, lo que clasifica a la proteína de

estable. -Vida media teórica estimada en Escherichia coli (in vivo): mayor a 10 horas.

En el contexto de la presente invención, "colagenasa H" (CoIH o AUX-II) se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína "colagenasa H", y que comprende diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucléico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 2, b) moléculas de ácido nucléico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucléico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, ó

d) moléculas de ácido nucléico que codifican un polipétptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 2. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucléicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína "colagenasa H". El término incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales.

Debido a que existen varios tipos de colagenasas y cada una de ellas (G y H) poseen actividades y especificidades diferentes frente al colágeno, es conveniente el empleo de ambas enzimas de forma separada o combinada (en relación 1 :3) para alcanzar determinados efectos farmacológicos que actualmente no se pueden alcanzar con otros medicamentos.

Las colagenasas pueden emplearse por separado. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante segunda composición de la invención, que comprende colagenasa G y no colagenasa H.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante tercera composición de la invención, que comprende colagenasa H y no colagenasa G.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composlclon, de ahora en adelante cuarta composición de la invención, que comprende PZ-peptidasa y no colagenasa H o colagenasa G.

Tanto la segunda como la tercera composición de la invención pueden tener un vehículo farmacéuticamente aceptable, o los excipientes adecuados para su correcta formulación.

En otro aspecto de la invención se describe una preparación combinada (de ahora en adelante preparación combinada de la invención) que comprende, al menos, colagenasa G y colagenasa H en una proporción 1:3 para su uso por separado, simultáneo ó secuencial como medicamento. En una realización preferida, la preparación combinada de la invención además comprende PZPeptidasa. En otra realización preferida, la preparación combinada de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización preferida, la preparación combinada de la invención además comprende otro principio activo.

Debe enfatizarse que el término "preparación combinada" o también denominada "yuxtaposición", en esta memoria, significa que los componentes de la preparación combinada no necesitan encontrarse presentes como unión, por ejemplo en una composición, para poder encontrarse disponibles para su aplicación separada o secuencial. De esta manera, la expresión "yuxtapuesta" implica que no resulta necesariamente una combinación verdadera, a la vista de la separación física de los componentes.

Otro aspecto se refiere al uso por separado, simultáneo ó secuencial de los principios activos de la preparación combinada de la invención para la elaboración de un medicamento.

Otro aspecto se refiere al uso por separado, simultáneo ó secuencial de los principios activos de la preparación combinada de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de de enfermedades que cursen con desórdenes del tejido conectivo.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con desórdenes del tejido conectivo es una fibromatosis. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la fibromatosis se selecciona de la lista que comprende: contractura palmar de Dupuytren enfermedad de La Peyronie, enfermedad de Ledderhose o fibromatosis de la aponeurosis plantar, o la existencia de tejido fibroso en el lóbulo de la oreja

Como se emplea aquí, el término "principio activo", "sustancia activa",. "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialment& proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la __ _ elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una formó modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.

Tanto las composiciones de la presente invención, así como la preparación combinada pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, pueden estar, sin limitarse, en disolución acuosa estéril o en fluidos biológicos, tal como suero. Las disoluciones acuosas pueden estar tamponadas o no tamponadas y tienen componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y similares, y nutrientes incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes tales como menta o salicilato de metilo.

El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es una enfermedad que cursa con alteraciones del tejido conectivo, preferiblemente es una fibromatosis, y aún más preferiblemente es contractura palmar de Dupuytren, enfermedad de La Peyronie, enfermedad de Ledderhose o fibromatosis de la aponeurosis plantar.

Tales composiciones o preparaciones combinadas y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intracecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o dérmico.

La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo, tolerancia, del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de colagenasa G, colagenasa H, o PZ-peptidasa que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos profármacos, derivados o análogos y el efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" y "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.

Otro aspecto de la invención se refiere a una forma farmacéutica, de ahora e adelante forma farmacéutica de la invención, que comprende malquiera de las composiciones o preparaciones combinadas de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención la forma farmacéutica de la invención se selecciona de la lista que comprende: emplasto, pomada, pasta, crema, solución, suspensión, emulsión, loción, linimento, gel, espuma, polvo, o cualquiera de sus combinaciones. En una realización aún mucho más preferida, la forma farmacéutica es una solución. En otra realización aún mucho más preferida, la forma farmacéutica es una crema.

El empleo de hidrogeles acoplados a los enzimas permite evitar la trasvasación del principio activo y disminuir efectos secundarios por acción en las zonas cercanas a las del tratamiento. Por tanto, en otra realización aún mucho más preferida, la forma farmacéutica es un gel, y más preferiblemente un hidrogel.

En esta memoria se entiende por "forma farmacéutica" la mezcla de uno o más principios activos con o sin aditivos que presentan características físicas para su adecuada dosificación, conservación, administración y biodisponibilidad.

Una "crema" es una forma farmacéutica que consiste en una preparación líquida o semisólida que contiene el o los principios activos y aditivos necesarios para obtener una emulsión, generalmente aceite en agua, con un contenido de agua superior al 20 por ciento.

Una "solución" es una forma farmacéutica que consiste en un preparado líquido, transparente y homogéneo, obtenido por disolución de él o los principios activos y aditivos en agua, y que se utiliza para el uso externo o interno. En el caso de soluciones inyectables, oftálmicas y óticas deben ser soluciones estériles.

Un "gel" es una forma farmacéutica que consiste en preparación semisólida, que contiene el o los principios activos y aditivos, sólidos en un liquido que puede ser agua, alcohol o aceite, de tal manera que se forma una red de partículas atrapadas en la fase liquida.

Los hidrogeles son materiales poliméricos entrecruzados en forma de red tridimensional de origen natural o sintético, que se hinchan en contacto con el agua formando materiales blandos y elásticos, y que retienen una fracción significativa de la misma en su estructura sin disolverse. Los geles se pueden clasificar en dos tipos, en función de la naturaleza de las uniones de la red tridimensional que los constituyen: geles físicos y geles químicos,

Todas las enzimas (colagenasa G, colagenasa H y PZ-Peptidasa) poseen una cola de 6 histidinas que permiten conjugar las enzimas a los hidrogeles, como el ácido hialyurónico o azarosa. La cola de 6 histidinas además permite purificar los enzimas empleando cromatografía de afinidad a Níquel.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Efecto sinérgico del empleo de colagenasa G y colagenasa H en proporción 1 :3. Actividad de la colagenasa G y la colagenasa H por separado, yen combinación, en proporción 1 :3.

Fig.2..Esquema del efecto de las colagenasas y la PZ.peptidasa.

Fig. 3. Figura esquemática de la aplicación de las colagensas. Fase 1: Rotura parcial de fibras de colágno. Distensión parcial de fibras. Fase 2: Se alcanza hidrólisis de fibras de colágeno. Distensión casi total de las fibras. Fase 3: Se hidrolizan los oligopéptidos resultantes. Facilitación de la absorción de colágeno.

Fig. 4. Comprobación por SOS -PAGE de la concentración y pureza de la enzima A: Col.H, B: CoI.G.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores.

Obtención y características de las colagenasas

Colagenasa H y Colagenasa G son metaloproteinasas (clase 11) capaces de degradar específicamente las regiones helicoidales del colágeno, reconociendo el motivo Gly-Pro-X característico de la macromolécula. Estas proteínas poseen una cola de 6 Histidinas en su extremo carboxilo (Demina & Lysenko. Mikrobiologiía. 1996 May-Jun;65(3):293-304).

Punto isoeléctrico y Peso molecular: CoI,H: pi 5.76, PM 112.98 KDa; CoI,G: pi

5. 53, PM 114.8 KDa

Pureza: 99,9% Purificación en columnas de afinidad por Níquel

Se presenta como liofilizada y estéril. Se emplea agua estéril desionizada para su óptima reconstitución:

Preparación del Stock. Para la preparación Colagenasa G/H 1:3 la presentación liofilizada contiene 800 CDUs (aprox 0.3mg). Para su administracón se recomienda resuspender el contenido del vial en 1 mi de agua mQ estéril (incluida) para obtener una disolución de la enzima 800 CDUs/ml en buffer Tris 20 mM pH 8.0. Se recomienda preparar esta solución en el momento de su utilización. La dosis recomendada dependerá del grado de evolución de la enfermedad variando entre 100-800 CDUs por aplicación. La colagenasas G y H recombinantes presenta una actividad 4-10 veces mayor que las mejores enzimas comerciales del mercado (ensayada in vitro a pH 8.0;

37 OC).

La colagenasas G y H recombinantes no presenta actividad proteasa inespecífica (caseinasa) Test Ladd-Butler negativo. No contiene endotoxinas (test Gen Script negativo).

Obtención y características de la PZ-Peptidasa

Organismo de origen: Bacillus licheniformis Producida de forma recombinante en: Escherichia coli BL21 DE3 rosetta y Bacillus megaterium Descripción: La PZ-peptidasa de PROTEOS Biotech se considera un enzima esencial en la degradación del colágeno en colaboración con proteasas colágeno líticas. Las propiedades de la PZ-Peptidasa son:

(1)

Metalooligoproteasas;

(2)

Poseen un motivo HEXXH de unión a Zn2+;

(3)

No tienen similitud con las colagenasas ColG y ColH de C.

histolyticum

(4) Capaces de degradar oligopeptidos pero no sustratos de proteínas

Son proteasas de gran pureza al ser producidas en condiciones recombinantes y purificadas por cromatografía de afinidad. La Pl peptidasa procede de Baeillus Iieheniformis cepa PWD y producidas en Baeillus megaferium y E. eoli.

5 Punto isoeléctrico y Peso molecular Pl peptidasa: pi 5.16, PM 76,95 KDa Pureza: 99,9% Purificación en columnas de afinidad por Níquel Presentación: Liofilizada y estéril. Se acompaña de agua estéril desionizada para su óptima reconstitución: Disponible en viales de 100 y 300 Unidades. Preparación del Stock. Se recomienda resuspender el contenido del vial en agua mQ estéril

10 (incluida) para obtener una disolución de la enzima en buffer Tris 20 mM pH

8.0. Se recomienda preparar esta solución en el momento de su utilización.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una composición que comprende colagenasa G recombinante y colagenasa H recombinante en una proporción 1 :3.

2. 2.

   La composición según la reivindicación anterior, que además comprende PZ-Peptidasa recombinante.

3. 3.

   La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. 4.

   La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que además comprende otro principio activo.

5. 5.

   El uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para la elaboración de un medicamento.

6. 6.

   Una preparación combinada que comprende colagenasa G recombinante y colagenasa H recombinante en una proporción 1 :3.

7. 7.

   La preparación combinada según la reivindicación anterior, que además comprende PZ-Peptidasa recombinante.

8. 8.

   La preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. 9.

   La preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, que además comprende otro principio activo.

10. 10.

    El uso de una preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 6-9, para su uso por separado, simultáneo o secuencial como medicamento.

11. 11.

    El uso de una preparación combinada que comprende colagenasa G recombinante y colagenasa H recombinante en una proporción 1 :3, para la elaboración de un medicamento, caracterizado porque se administra primero la colagenasa G recombinante, y después la colagenasa H recombinante.

12. 12.

    El uso de una preparación combinada que comprende colagenasa G recombinante y colagenasa H recombinante en una proporción 1:3, y además PZ-peptidasa recombinante, para la elaboración de un medicamento, caracterizado porque se administra primero la colagenasa G recombinante, después la colagenasa H recombinante, y por último la PZPeptidasa recombinante.

13. 13.

    Forma farmacéutica que comprende la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 6-9.

14. 14.

    Forma farmacéutica según la reivindicación anterior que se selecciona de la lista que comprende: emplasto, pomada, pasta, crema, solución, suspensión, emulsión, loción, linimento, jalea, gel, espuma, polvo, o cualquiera de sus combinaciones.

15. 15.

    Forma farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, donde la forma farmacéutica es una solución.

16. 16.

    Forma farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, donde la forma farmacéutica es una crema.

17. 17.

    Forma farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, donde la forma farmacéutica es un gel.

18. 18.

    El uso de la composición según cualquiera de las composiciones 1-4, de

    5 una preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 6-9, o de una forma farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que cursen con alteraciones del tejido conectivo.

    10 19. El uso de la composición, de una preparación combinada o de una forma farmacéutica según la reivindicación 18, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la fibromatosis.
19. 20. El uso de la composición, de una preparación combinada o de una forma

    15 farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 18-19, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que se selecciona de la lista que comprende: contractura palmar de Dupuytren, enfermedad de La Peyronie, enfermedad de Ledderhose o fibromatosis de la aponeurosis plantar.

    -

    en

    E

    ........

    fn

    e ~

    o

    "C

    ca

    "C

    .-500

    .-...>

    (.)

    ca:

    o

    -

    500

    2000

    • Actv.

    Colactnasa

    • Actv .

    Castínasa

    -

    0,8

    ColH ColG CoIH/G(1:3)

    Fig.1

    -

    "j.......,. ........ ..,..,.

    ..

    colágeno

    r '

    Proteasa colagenolítica

    Péptidos de

    N -N-'"

20. -

    .

    N_

    -

    colágeno

    N-_

    ~ Pz-peptidasas

    XXPL GPYX-XZ XZPL GPXY-XX ZXPL GP~ZX

    Fig.2

    A B

    kDa

    Fig.4

    <110> zurko Research

    <120> Uso de colagenasa G recombinatante, cola~enasa H recombinante y pz-peptidasa recombinante para el tratamlento de enfermedades que

    cursan con alteraciones del colágeno.

    <130> zurko 2281

    <160> 8

    <170> PatentIn version 3.5

    <210> 1

    <211> 1008

    <212> PRT

    <213> Artificial sequence

    <220>

    <223> colagenasa G

    <400> 1

    Ile Ala Asn Thr Asn Ser Glu Lys Tyr Asp Phe Glu Tyr Leu Asn Gly1 5 10 15

    Leu Ser Tyr Thr Glu Leu Thr Asn Leu Ile Lys Asn Ile Lys Trp Asn 20 25 30

    Gln Ile Asn Gly Leu phe Asn Tyr ser Thr Gly Ser Gln Lys Phe Phe 35 40 45

    Gly ASp Lys Asn Arg val Gln Ala Ile Ile Asn Ala Leu Gln Glu Ser 50 55 60

    Gly Arg Thr Tyr Thr Ala Asn ASp Met Lys Gly Ile Glu Thr Phe Thr 65 70 75 80

    Glu val Leu Arg Ala Gly phe Tyr Leu Gly Tyr Tyr Asn ASp Gly Leu 85 90 95

    Ser Tyr Leu Asn ASp Arg Asn Phe Gln ASp Lys Cys Ile Pro Ala Met

    100 105 110

    Ile Ala Ile Gln Lys Asn Pro Asn Phe Lys Leu Gly Thr Ala val Gln 115 120 125

    ASp Glu val Ile Thr Ser Leu Gly Lys Leu Ile Gly Asn Ala ser Ala

    130 135 140

    Asn Ala Glu val val Asn Asn Cys val Pro val Leu Lys Gln phe Arg

    145 150 155 160

    Glu Asn Leu Asn Gln Tyr Ala Pro ASp Tyr val Lys Gly Thr Ala val 165 170 175

    Asn Glu Leu Ile Lys Gly Ile Glu Phe ASp Phe Ser Gly Ala Ala Tyr 180 185 190

    Glu Lys ASp val Lys Thr Met pro Trp Tyr Gly Lys Ile ASp pro phe 195 200 205

    Ile Asn Glu Leu Lys Ala Leu Gly Leu Tyr Gly Asn Ile Thr Ser Ala 210 215 220

    Thr Glu Trp Ala ser ASp val Gly Ile Tyr Tyr Leu Ser Lys Phe Gly 225 230 235 240

    Leu Tyr ser Thr Asn Arg Asn ASp Ile val Gln ser Leu Glu Lys Ala 245 250 255

    val ASp Met Tyr Lys Tyr Gly Lys Ile Ala Phe val Ala Met Glu Arg260 265 270

    Ile Thr Trp ASp Tyr ASp Gly Ile Gly Ser Asn Gly Lys Lys val ASp 275 280 285

    H; s ASp Lys Phe Leu ASp ASp Ala Glu Lys H;s Tyr Leu Pro Lys Thr 290 295 300

    Tyr Thr Phe ASp Asn Gly Thr Phe Ile Ile Arg Ala Gly ASp Lys Val 305 310 315 320

    Ser Glu Glu Lys Il e Lys Arg Leu Tyr Trp Ala Ser Arg Glu val Lys325 330 335

    ser Gln phe H;S Arg val val Gly Asn ASp Lys Ala Leu Glu val Gly340 345 350

    Asn Ala ASP ASp Val Leu Thr Met Lys Ile phe Asn Ser Pro Glu Glu 355 360 365

    Tyr Lys phe Asn Thr Asn Ile Asn Gly val Ser Thr ASp Asn Gly Gly 370 375 380

    Leu Tyr Ile Glu Pro Arg Gly Thr Phe Tyr Thr Tyr Glu Arg Thr Pro 385 390 395 400

    Gln Gln Ser Ile phe Ser Leu Glu Glu Leu phe Arg H; s Glu Tyr Thr 405 410 415

    H;S Tyr Leu Gln Ala Arg Tyr Leu val ASp Gly Leu Trp Gly Gln Gly 420 425 430

    Pro Phe Tyr Glu Lys Asn Arg Leu Thr Trp phe ASp Glu Gly Thr Ala 435 440 445

    Glu Phe Phe Ala Gly Ser Thr Arg Thr Ser Gly Val Leu Pro Arg Lys

    450 455 460

    Ser rle Leu Gly Tyr Leu Ala Lys ASp Lys val ASp H;S Arg Tyr ser 465 470 475 480

    Leu Lys Lys Thr Leu Asn Ser Gly Tyr ASp ASP Ser ASp Trp Met phe485 490 495

    Tyr Asn Tyr Gly Phe Ala val Ala H;S Tyr Leu Tyr Glu Lys ASp Met 500 505 510

    Pro Thr Phe rle Lys Met Asn Lys Ala rle Leu Asn Thr ASp val Lys515 520 525

    Ser Tyr Asp Glu rle rle Lys Lys Leu Ser ASp ASp Ala Asn Lys Asn 530 535 540

    Thr Glu Tyr Gln Asn H;s rle Gln Glu Leu Ala ASp Lys Tyr Gln Gly545 550 555 560

    Ala Gly rle Pro Leu val Ser ASp ASp Tyr Leu Lys ASp H;s Gly Tyr 565 570 575

    Lys Lys Ala Ser Glu val Tyr Ser Glu Il e Ser Lys Ala Ala Ser Leu 580 585 590

    Thr Asn Thr Ser val Thr Ala Glu Lys ser Gln Tyr Phe Asn Thr phe 595 600 605

    Thr Leu Arg Gly Thr Tyr Thr Gly Glu Thr ser Lys Gly Glu Phe Lys

    610 615 620

    ASp Trp ASp Glu Met ser Lys Lys Leu ASp Gly Thr Leu Glu Ser Leu 625 630 635 640

    Ala Lys Asn Ser Trp Ser Gly Tyr Lys Thr Leu Thr Ala Tyr Phe Thr 645 650 655

    Asn Tyr Arg val Thr Ser ASp Asn Lys val Gln Tyr ASp val val phe660 665 670

    H;S Gly val Leu Thr ASp Asn Ala ASp rle ser Asn Asn Lys Ala pro 675 680 685

    Ile Ala Lys val Thr Gly Pro Ser Thr Gly Ala Val Gly Arg Asn Ile

    690 695 700

    Glu phe Ser Gly Lys Asp Ser Lys ASp Glu ASp Gly Lys rle val Ser 705 710 715 720 Tyr ASp Trp ASp phe Gly ASp Gly Ala Thr Ser Arg Gly Lys Asn Ser 725 730 735

    val His Ala Tyr Lys Lys Ala Gly Thr Tyr Asn val Thr Leu Lys val 740 745 750

    Thr ASP ASP Lys Gly Ala Thr Ala Thr Glu ser Phe Thr Ile Glu Ile 755 760 765

    Lys Asn Glu ASp Thr Thr Thr Pro Ile Thr Lys Glu Met Glu pro Asn 770 775 780

    ASp ASp Ile Lys Glu Ala Asn Gly Pro Ile val Glu Gly val Thr val 785 790 795 800

    Lys Gly ASp Leu Asn Gly Ser ASp ASp Ala ASP Thr Phe Tyr Phe ASp805 810 815

    val Lys Glu ASp Gly ASp val Thr Ile Glu Leu Pro Tyr Ser Gly Ser 820 825 830

    Ser Asn Phe Thr Trp Leu val Tyr Lys Glu Gly ASp ASp Gln Asn His

    835 840 845

    Ile Ala Ser Gly Ile ASp Lys Asn Asn Ser Lys val Gly Thr Phe Lys850 855 860

    Ser Thr Lys Gly Arg His Tyr val Phe rle Tyr Lys Hi s ASp Ser Ala 865 870 875 880

    Ser Asn rle Ser Tyr Ser Leu Asn rle Lys Gly Leu Gly Asn Glu Lys885 890 895

    Leu Lys Glu Lys Glu Asn Asn ASp ser Ser ASP Lys Ala Thr val Ile 900 905 910

    Pro Asn Phe Asn Thr Thr Met Gln Gly Ser Leu Leu Gly ASp ASp ser

    915 920 925

    Arg ASp Tyr Tyr Ser Phe Glu val Lys Glu Glu Gly Glu val Asn rle 930 935 940

    Glu Leu ASp Lys Lys ASp Glu phe Gly val Thr Trp Thr Leu His Pro 945 950 955 960

    Glu Ser Asn Ile Asn ASp Arg Ile Thr Tyr Gly Gln val ASp Gly Asn 965 970 975

    Lys val Ser Asn Lys val Lys Leu Arg Pro Gly Lys Tyr Tyr Leu Leu 980 985 990

    val Tyr Lys Tyr Ser Gly Ser Gly Asn Tyr Glu Leu Arg val Asn Lys995 1000 1005

    <210> 2

    <211> 981

    <212> PRT

    <213> Artificial sequen ce

    <220>

    <223> colagenasa H

    <400> 2

    val Gln Asn Glu Ser Lys Arg Tyr Thr val Ser Tyr Leu Lys Thr Leu 1 5 10 15

    Asn Tyr Tyr ASp Leu val ASp Leu Leu val Lys Thr Glu Ile Glu Asn 20 25 30

    Leu Pro ASp Leu phe Gln Tyr Ser Ser ASp Ala Lys Glu phe Tyr Gly 35 40 45

    Asn Lys Thr Arg Met Ser Phe Ile Met ASp Glu Ile Gly Arg Arg Ala 50 55 60

    pro Gln Tyr Thr Glu Ile ASp His Lys Gly Ile pro Thr Leu val Glu

    65 70 75 80

    val val Arg Ala Gly Phe Tyr Leu Gly phe His Asn Lys Glu Leu Asn 85 90 95

    Glu Ile Asn Lys Arg Ser Phe Lys Glu Arg val Ile Pro Ser Ile Leu 100 105 110

    Ala Ile Gln Lys Asn Pro Asn phe Lys Leu Gly Thr Glu val Gln ASp115 120 125

    Lys Ile val Ser Ala Thr Gly Leu Leu Ala Gly Asn Glu Thr Ala pro 130 135 140

    Pro Glu val val Asn Asn Phe Thr Pro Ile Leu Gln ASp Cys Ile Lys145 150 155 160

    Asn Ile ASp Arg Tyr Ala Leu ASp ASp Leu Lys Ser Lys Ala Leu Phe 165 170 175

    Asn Val Leu Ala Ala Pro Thr Tyr ASp Ile Thr Glu Tyr Leu Arg Ala 180 185 190

    Thr Lys Glu Lys Pro Glu Asn Thr Pro Trp Tyr Gly Lys Ile ASp Gly195 200 205

    Phe Ile Asn Glu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Tyr Gly Lys Ile Asn ASp210 215 220

    Asn Asn Ser Trp 1le 1le ASp Asn Gly 1le Tyr H; s 1le Ala Pro Leu 225 230 235 240

    Gly Lys Leu H; s Ser Asn Asn Lys 1le Gly 1le Glu Thr Leu Thr Glu 245 250 255

    val Met Lys val Tyr Pro Tyr Leu Ser Met G1n H; s Leu G1n Ser Ala 260 265 270

    ASp G1n 11e Lys Arg H; s Tyr ASp Ser Lys ASp Ala Glu G1y Asn Lys275 280 285

    rle pro Leu ASp Lys phe Lys Lys Glu Gly Lys G1u Lys Tyr Cys Pro 290 295 300

    Lys Thr Tyr Thr phe ASp ASp Gly Lys Val 11 e 1le Lys Ala Gly Ala 305 310 315 320

    Arg val Glu Glu Glu Lys val Lys Arg Leu Tyr Trp Ala Ser Lys Glu 325 330 335

    val Asn ser Gln phe phe Arg val Tyr Gly 1le ASp Lys pro Leu Glu 340 345 350

    Glu Gly Asn pro ASp ASp 1le Leu Thr Met val 1le Tyr Asn Ser pro 355 360 365

    Glu Glu Tyr Lys Leu Asn Ser val Leu Tyr Gly Tyr ASp Thr Asn Asn 370 375 380

    Gly Gly Met Tyr 1le Glu Pro Glu Gly Thr phe Phe Thr Tyr Glu Arg385 390 395 40

    Glu Ala Gln Glu Ser Thr Tyr Thr Leu Glu Glu Leu Phe Arg H; s Glu 405 410 415

    Tyr Thr His Tyr Leu Gln Gly Arg Tyr Ala val Pro Gly G1n Trp Gly420 425 430

    Arg Thr Lys Leu Tyr ASp Asn ASp Arg Leu Thr Trp Tyr Glu Glu Gly 435 440 445

    G1y Ala G1u Leu Phe Ala G1y Ser Thr Arg Thr Ser Gly 1le Leu Pro 450 455 460

    Arg Lys Ser 1le val Ser Asn 11e H;S Asn Thr Thr Arg Asn Asn Arg465 470 475 480

    Tyr Lys Leu Ser ASp Thr val H;S Ser Lys Tyr G1y Ala Ser Phe Glu 485 490 495

    phe Tyr Asn Tyr Ala Cys Met Phe Met ASp Tyr Met Tyr Asn Lys ASp500 505 510

    Met Gly ¡le Leu Asn Lys Leu Asn ASp Leu Ala Lys Asn Asn ASp val 515 520 525

    ASp Gly Tyr ASP Asn Tyr ¡le Arg ASP Leu Ser Ser Asn Tyr Ala Leu 530 535 540

    Asn ASp Lys Tyr Gln ASp His Met Gln Glu Arg ¡le ASp Asn Tyr Glu 545 550 555 560

    Asn Leu Thr val Pro Phe val Ala ASp ASp Tyr Leu val Arg His Ala 565 570 575

    Tyr Lys Asn Pro Asn Glu ¡le Tyr Ser Glu ¡le Ser Glu val Ala Lys580 585 590

    Leu Lys ASp Ala Lys Ser Glu val Lys Lys Ser Gln Tyr Phe ser Thr 595 600 605

    Phe Thr Leu Arg Gly Ser Tyr Thr Gly Gly Ala Ser Lys Gly Lys Leu 610 615 620

    Glu ASp Gln Lys Ala Met Asn Lys Phe ¡le ASp ASp Ser Leu Lys Lys625 630 635 640

    Leu ASp Thr Tyr Ser Trp ser Gly Tyr Lys Thr Leu Thr Ala Tyr Phe 645 650 655

    Thr Asn Tyr Lys val ASp Ser Ser Asn Arg val Thr Tyr ASp val val 660 665 670

    phe Hi s Gly Tyr Leu pro Asn Glu Gly ASp Ser Lys Asn Ser Leu Pro 675 680 685

    Tyr Gly Lys ¡le Asn Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Glu Lys Glu Lys ¡le 690 695 700

    Lys phe Ser Ser Glu Gly Ser phe ASp Pro ASp Gly Lys ¡le val Ser 705 710 715 720

    Tyr Glu Trp ASp phe Gly ASP Gly Asn Lys Ser Asn Glu Glu Asn pro 725 730 735

    Glu Hi s Ser Tyr ASp Lys val Gly Thr Tyr Thr val Lys Leu Lys val 740 745 750

    Thr ASp ASp Lys Gly Glu ser Ser val Ser Thr Thr Thr Ala Glu ¡le755 760 765

    Lys ASp Leu Ser Glu Asn Lys Leu pro val rle Tyr Met His val Pro 770 775 780

    Lys Ser Gly Ala Leu Asn Gln Lys val val Phe Tyr Gly Lys Gly Thr

    785 790 795 800

    Tyr ASp Pro ASp Gly Ser rl e Ala Gly Tyr Gln Trp ASp Phe Gly ASp805 810 815

    Gly Ser ASp phe Ser Ser Glu Gln Asn Pro Ser His val Tyr Thr Lys820 825 830

    Lys Gly Glu Tyr Thr val Thr Leu Arg val Met ASp Ser Ser Gly Gln 835 840 845

    Met Ser Glu Lys Thr Met Lys rle Lys rle Thr ASp Pro val Tyr Pro 850 855 860

    rle Gly Thr Glu Lys Glu Pro Asn Asn Ser Lys Glu Thr Ala Ser Gly

    865 870 875 880

    pro rle val pro Gly rle pro val ser Gly Thr rle Glu Asn Thr ser 885 890 895

    ASp Gln ASP Tyr Phe Tyr Phe ASp val rle Thr Pro Gly Glu val Lys900 905 910

    rle ASp rle Asn Lys Leu Gly Tyr Gly Gly Ala Thr Trp val val Tyr915 920 925

    ASp Glu Asn Asn Asn Ala val Ser Tyr Ala Thr ASp ASp Gly Gln Asn 930 935 940

    Leu Ser Gly Lys Phe Lys Ala ASp Lys Pro Gly Arg Tyr Tyr rle His 945 950 955 960

    Leu Tyr Met phe Asn Gly Ser Tyr Met Pro Tyr Arg rle Asn rle Glu 965 970 975

    Gly Ser val Gly Arg980

    <210> 3

    <211> 3357

    <212> DNA

    <213> Arti fi cial sequence

    <220>

    <223> colagenasa G y péptido señal

    <400> 3

    atgaaaaaaa atattttaaa gattcttatg gatagttatt ctaaagaatc taaaattcaa 60

    actgtacgta gggttacgag tgtatcactt ttagcggtat atcttactat gaatacttca 120 agtttagttt tagcaaaacc aatagaaaat actaatgata ctagtataaa aaatgtggag 180 aaattaagaa atgctccaaa tgaagagaat agtaaaaagg tagaagatag taaaaatgat 240 aaggtagaac atgtgaaaaa tatagaagag gcaaaggttg agcaagttgc acccgaagta 300 aaatctaaat caactttaag aagtgcttct atagcgaata ctaattctga gaaatatgat 360 tttgagtatt taaatggttt gagctatact gaacttacaa atttaattaa aaatataaag 420 tggaatcaaa ttaatggttt atttaattat agtacaggtt ctcaaaagtt ctttggagat 480 aaaaatcgtg tacaagctat aattaatgct ttacaagaaa gtggaagaac ttacactgca 540 aatgatatga agggtataga aactttcact gaggttttaa gagctggttt ttatttaggg 600 tactataatg atggtttatc ttatttaaat gatagaaact tccaagataa atgtatacct 660 gcaatgattg caattcaaaa aaatcctaac tttaagctag gaactgcagt tcaagatgaa 720 gttataactt ctttaggaaa actaatagga aatgcttctg ctaatgctga agtagttaat 780 aattgtgtac cagttctaaa acaatttaga gaaaacttaa atcaatatgc tcctgattac 840 gttaaaggaa cagctgtaaa tgaattaatt aaaggtattg aattcgattt ttctggtgct 900 gcatatgaaa aagatgttaa gacaatgcct tggtatggaa aaattgatcc atttataaat 960 gaacttaagg ccttaggtct atatggaaat ataacaagtg caactgagtg ggcatctgat 1020 gttggaatat actatttaag taaattcggt ctttactcaa ctaaccgaaa tgacatagta 1080 cagtcacttg aaaaggctgt agatatgtat aagtatggta aaatagcctt tgtagcaatg 1140 gagagaataa cttgggatta tgatgggatt ggttctaatg gtaaaaaggt ggatcacgat 1200 aagttcttag atgatgctga aaaacattat ctgccaaaga catatacttt tgataatgga 1260 acctttatta taagagcagg ggataaggta tccgaagaaa aaataaaaag gctatattgg 1320 gcatcaagag aagtgaagtc tcaattccat agagtagttg gcaatgataa agctttagag 1380 gtgggaaatg ccgatgatgt tttaactatg aaaatattta atagcccaga agaatataaa 1440 tttaatacca atataaatgg tgtaagcact gataatggtg gtctatatat agaaccaaga 1500 gggactttct acacttatga gagaacacct caacaaagta tatttagtct tgaagaattg 1560 tttagacatg aatatactca ctatttacaa gcgagatatc ttgtagatgg tttatggggg 1620 caaggtccat tttatgaaaa aaatagatta acttggtttg atgaaggtac agctgaattc 1680 tttgcaggat ctacccgtac atctggtgtt ttaccaagaa aatcaatatt aggatatttg 1740 gctaaggata aagtagatca tagatactca ttaaagaaga ctcttaattc agggtatgat 1800 gacagtgatt ggatgttcta taattatgga tttgcagttg cacattacct atatgaaaaa 1860 gatatgccta catttattaa gatgaataaa gctatattga atacagatgt gaaatcttat 1920 gatgaaataa taaaaaaatt aagtgatgat gcaaataaaa atacagaata tcaaaaccat 1980 attcaagagt tagcagataa atatcaagga gcaggcatac ctctagtatc agatgattac 2040 ttaaaagatc atggatataa gaaagcatct gaagtatatt ctgaaatttc aaaagctgct 2100

    tctcttacaa acactagtgt aacagcagaa aaatctcaat attttaacac attcacttta 2160 agaggaactt atacaggtga aacttctaaa ggtgaattta aagattggga tgaaatgagt 2220 aaaaaattag atggaacttt ggagtccctt gctaaaaatt cttggagtgg atacaaaact 2280 ttaacagcat actttacgaa ttatagagtt acaagcgata ataaagttca atatgatgta 2340 gttttccatg gggttttaac agataatgcg gatattagta acaataaggc tccaatagca 2400 aaggtaactg gaccaagcac tggtgctgta ggaagaaata ttgaatttag tggaaaagat 2460 agtaaagatg aagatggtaa aatagtatca tatgattggg attttggcga tggtgcaact 2520 agtagaggca aaaattcagt acatgcttac aaaaaagcag gaacatataa tgttacatta 2580 aaagtaactg acgataaggg tgcaacagct acagaaagct ttactataga aataaagaac 2640 gaagatacaa caacacctat aactaaagaa atggaaccta atgatgatat aaaagaggct 2700 aatggtccaa tagttgaagg tgttactgta aaaggtgatt taaatggttc tgatgatgct 2760 gataccttct attttgatgt aaaagaagat ggtgatgtta caattgaact tccttattca 2820 gggtcatcta atttcacatg gttagtttat aaagagggag acgatcaaaa ccatattgca 2880 agtggtatag ataagaataa ctcaaaagtt ggaacattta aatctacaaa aggaagacat 2940 tatgtgttta tatataaaca cgattctgct tcaaatatat cctattcttt aaacataaaa 3000 ggattaggta acgagaaatt gaaggaaaaa gaaaataatg attcttctga taaagctaca 3060 gttataccaa atttcaatac cactatgcaa ggttcacttt taggtgatga ttcaagagat 3120 tattattctt ttgaggttaa ggaagaaggc gaagttaata tagaactaga taaaaaggat 3180 gaatttggtg taacatggac actacatcca gagtcaaata ttaatgacag aataacttac 3240 ggacaagttg atggtaataa ggtatctaat aaagttaaat taagaccagg aaaatattat 3300 ctacttgttt ataaatactc aggatcagga aactatgagt taagggtaaa taaataa 3357

    <210> 4

    <211> 330

    <212> DNA

    <213> Artificial sequence

    <220>

    <223> péptido señal colagenasa G

    <400> 4 atgaaaaaaa atattttaaa gattcttatg gatagttatt ctaaagaatc taaaattcaa 60 actgtacgta gggttacgag tgtatcactt ttagcggtat atcttactat gaatacttca 120 agtttagttt tagcaaaacc aatagaaaat actaatgata ctagtataaa aaatgtggag 180 aaattaagaa atgctccaaa tgaagagaat agtaaaaagg tagaagatag taaaaatgat 240 aaggtagaac atgtgaaaaa tatagaagag gcaaaggttg agcaagttgc acccgaagta 300 aaatctaaat caactttaag aagtgcttct 330

    <210> 5

    <211> 110 <212> PRT

    <213> Artificial sequence

    <220>

    <223> péptido señal colagenasa G

    <400> 5 Met Lys Lys Asn Ile Leu Lys Ile Leu Met ASp Ser Tyr Ser Lys Glu

    1 5 10 15

    Ser Lys Ile Gln Thr val Arg Arg val Thr Ser val Ser Leu Leu Ala 20 25 30

    val Tyr Leu Thr Met Asn Thr Ser Ser Leu val Leu Ala Lys Pro Ile 35 40 45

    Glu Asn Thr Asn ASP Thr Ser Ile Lys Asn val Glu Lys Leu Arg Asn

    50 55 60

    Ala Pro Asn Glu Glu Asn Ser Lys Lys val Glu ASp Ser Lys Asn ASp65 70 75 80

    Lys val Glu His val Lys Asn Ile Glu Glu Ala Lys val Glu Gln val 85 90 95

    Ala pro Glu val Lys Ser Lys Ser Thr Leu Arg Ser Ala Ser 100 105 110

    <210> 6

    <211> 3066

    <212> DNA

    <213> Artificial sequen ce

    <220>

    <223> colagenasa H y péptido señal

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    3066

    <210> <211> <212> <213>

    7 120 DNA Artificial sequen ce

    <220> <223>

    péptido señal

    <400> 7 atgaaaagga aatgtttatc taaaaggctt atgttagcta taacaatggc tacaatattt

    60

    acagtgaaca gtacattacc aatttatgca gctgtagata aaaataatgc aacagcagct

    120

    <210> <211> <212> <213>

    8 40 PRT Artificial sequence

    <220> <223>

    péptido señal

    <400>

    8

    Met Lys Arg Lys cys Leu Ser Lys Arg1 5

    Leu Met Leu Ala Ile Thr Met 10 15

    Ala Thr rle phe Thr val 20

    Asn Ser Thr Leu Pro rle Tyr Ala Ala val 25 30

    ASP Lys Asn Asn Ala Thr Ala Ala 35 40