ES2709202T3 - Composiciones adecuadas para el tratamiento de enfermedades mediadas por colágeno - Google Patents

Composiciones adecuadas para el tratamiento de enfermedades mediadas por colágeno Download PDF

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Tito Del Jr
Phillip Bassett
Hazel Tharia
Antony Hitchcock
Bo Yu
Thomas L Wegman
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Abstract

Una composición de colagenasa que consiste en colagenasa I y colagenasa II de Clostridium histolyticum, respectivamente, que tiene una proporción de masa de 1 a 1 en donde la composición de colagenasa tiene una pureza de al menos el 95% por área, medida por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa, para su uso como un medicamento.

Description

DESCRIPCION
Composiciones adecuadas para el tratamiento de enfermedades mediadas por colageno
Antecedentes de la invencion
El colageno es el principal componente estructural de los organismos mairnferos y constituye una gran parte del contenido total de protemas de la piel y otras partes del cuerpo del animal. En los seres humanos, es particularmente importante en el proceso de curacion de heridas y en el proceso de envejecimiento natural. Varios traumas de la piel, como quemaduras, cirugfa, infeccion y accidente, a menudo se caracterizan por la acumulacion erratica de tejido fibroso rico en colageno y que tiene un mayor contenido de proteoglicanos. Ademas del reemplazo del tejido normal que ha sido danado o destruido, a veces se forman depositos excesivos y desfigurantes de tejido nuevo durante el proceso de curacion. El exceso de deposicion de colageno se ha atribuido a una alteracion en el equilibrio entre la smtesis de colageno y la degradacion del colageno.
Numerosas enfermedades y afecciones estan asociadas con el exceso de deposicion de colageno y la acumulacion erratica de tejido fibroso rico en colageno. Dichas enfermedades y afecciones se denominan colectivamente en el presente documento "enfermedades mediadas por colageno". La colagenasa se ha utilizado para tratar una variedad de enfermedades mediadas por colageno. La colagenasa es una enzima que tiene la capacidad espedfica para digerir el colageno.
La colagenasa para su uso en terapia se puede obtener de una variedad de fuentes que incluyen mai^eras (por ejemplo, humanos), crustaceos (por ejemplo, cangrejo, camaron), hongos y bacterias (por ejemplo, de la fermentacion de Clostridium, Streptomyces, Pseudomonas, o Vibrio). La colagenasa tambien ha sido disenada geneticamente. Una fuente comun de colagenasa bruta proviene de un proceso de fermentacion bacteriana, espedficamente la fermentacion de C. histolyticum (C. his). La colagenasa bruta obtenida de C. his puede purificarse utilizando cualquiera de una variedad de tecnicas cromatograficas.
Un inconveniente del proceso de fermentacion de C. his es que produce proporciones inciertas de las diversas colagenasas, como la colagenasa I y la colagenasa II, que se utilizan a menudo en composiciones terapeuticas para tratar afecciones mediadas por colageno. Ademas, el cultivo ha requerido historicamente el uso de productos carnicos. Este cultivo de carne derivo originalmente de la cepa H4 de Clostridium histolyticum, Dr. I. Laboratorio de Mandl en la Universidad de Columbia en 1956 y se deposito en la ATCC. Los viales liofilizados se hicieron con el cultivo de carne cocida y se denominaron banco de celulas maestras ABC.
Clostridium histolyticum.
Diversas proporciones de colagenasa I a colagenasa II en una preparacion terapeutica de colagenasa tienen diferentes efectos biologicos. Por lo tanto, sena deseable una preparacion terapeutica de colagenasa en la que la proporcion de colagenasa I a colagenasa II en la preparacion pueda determinarse y controlarse facil y eficazmente para obtener una actividad enzimatica y un efecto terapeutico superiores y consistentes.
El documento WO 98/24889 describe composiciones que comprenden colagenasa I, colagenasa II y una endoproteasa. Las composiciones son para la disociacion enzimatica de matrices de tejido extracelular para permitir la remodelacion del tejido y el aislamiento eficaz de celulas viables y grupos de celulas del tejido. El documento US 2004/0137596 describe un metodo para purificar al menos una enzima obtenida en una fermentacion en exceso de Clostridium histolyticum. Se describe la colagenasa tipo II que tiene una pureza del 82% y la colagenasa tipo I que tiene una pureza del 85%.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona una composicion de colagenasa que consiste en colagenasa I y colagenasa II de Clostridium histolyticum, respectivamente, que tiene una proporcion de masa de 1 a 1 en la que la composicion de colagenasa tiene una pureza de al menos el 95% por area, medida por cromatograffa lfquida de alto rendimiento de fase inversa, para su uso como un medicamento. En otro aspecto, la composicion de colagenasa de la invencion es para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad mediada por colageno seleccionada del grupo que consiste en la enfermedad de Dupuytren; enfermedad de Peyronie; hombro congelado (capsulitis adhesiva), queloides; cicatrices hipertroficas; cicatrices deprimidas como las que resultan del acne inflamatorio; adherencias postquirurgicas; acne comun; lipomas, y fibrosis neoplasica.
Cuando se utiliza como una composicion farmaceutica para el tratamiento de enfermedades mediadas por colageno, la composicion de la invencion proporciona un efecto terapeutico mejorado y consistente al tiempo que reduce el potencial de efectos secundarios.
En otro aspecto, la invencion proporciona una formulacion farmaceutica, que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una composicion de colagenasa que consiste en colagenasa I y colagenasa II que tienen la secuencia de la colagenasa I y colagenasa II de Clostridium histolyticum, respectivamente, en donde la colagenasa I y colagenasa II tienen una proporcion de masa de aproximadamente 1 a 1 y la composicion de colagenasa es al menos el 95% por area pura medida por cromatograffa Kquida de alto rendimiento de fase inversa. En otro aspecto, la invencion proporciona la formulacion de la invencion para su uso como un medicamento.
En otro aspecto, la formulacion de la invencion es para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad mediada por colageno se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Dupuytren; enfermedad de Peyronie; hombro congelado (capsulitis adhesiva), queloides; cicatrices hipertroficas; cicatrices deprimidas como las que resultan del acne inflamatorio; adherencias postquirurgicas; acne comun; lipomas, y fibrosis neoplasica.
En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo cosmetico no terapeuti
celulitis en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto la composicion de colagenasa de la invencion o la formulacion de la invencion.
En otro aspecto, la invencion proporciona colagenasa I de Clostridium histolyticum con una pureza de al menos el 95% por area, medida por cromatograffa lfquida de alto rendimiento de fase inversa, para su uso como un medicamento.
En otro aspecto, la invencion proporciona colagenasa II de Clostridium histolyticum con una pureza de al menos el 95% por area, medida por cromatograffa lfquida de alto rendimiento de fase inversa, para su uso como un medicamento.
En el presente documento tambien se divulgan metodos para preparar una composicion de colagenasa de la invencion, formulaciones farmaceuticas que comprenden una composicion de la invencion y metodos para tratar pacientes que padecen una enfermedad mediada por colageno usando una composicion de colagenasa de la invencion.
Breve descripcion de los dibujos
Los anteriores y otros objetos, caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion mas particular de las realizaciones preferidas de la invencion, como se ilustra en los dibujos adjuntos en los que caracteres con la misma referencia se refieren a las mismas partes a lo largo de las diversas vistas. Los dibujos no estan necesariamente a escala, en su lugar, se pone enfasis en ilustrar los principios de la invencion. La Figura 1 muestra las curvas de crecimiento (DO frente al tiempo) de C. histolyticum en fermentaciones de 5 l de DCFT24a,b.
La Figura 2 muestra las curvas de crecimiento neto (DO neta frente al tiempo) de C. histolyticum en fermentaciones de 5 l de DCFT24a,b.
La Figura 3 es un gel de SDS PAGE de Tris-glicina al 8% de la segunda fermentacion:
Carril 1 Marcador de alto peso molecular
Carril 2 Colagenasa I - 0,27 |jg
Carril 3 Colagenasa II - 0,29 jg
Carril 4 20h (6,12 j l de muestra) - Momento de cosecha
Carril 5 19h (6,12 j l de muestra)
Carril 6 17h (6,12 j l de muestra)
Carril 7 16h (6,12 j l de muestra)
Carril 8 15h (6,12 j l de muestra)
Carril 9 14h (6,12 j l de muestra)
Carril 10 13h (6,12 j l de muestra)
Carril 11 11,6h - 19h (6,12 j l de muestra)
Carril 12 10,5h (6,12 j l de muestra);
La Figura 4 es un gel de SDS PAGE de Tris-glicina al 8% de la primera fermentacion:
Carril 1 Marcador de alto peso molecular
Carril 2 Colagenasa I - 0,27 jg
Carril 3 Colagenasa II - 0,29 jg
Carril 4 20h (6,12 j l de muestra) - Momento de cosecha
Carril 5 19h (6,12 j l de muestra)
Carril 6 17h (6,12 j l de muestra)
Carril 7: 16h (6,12 |jl de muestra)
Carril 8: 15h (6,12 j l de muestra)
Carril 9: 14h (6,12 j l de muestra)
Carril 10: 13h (6,12 j l de muestra)
Carril 11: 11.4h (6,12 j l de muestra)
Carril 12: 10,4h (6,12 j l de muestra);
La Figura 5 es un gel de SDS PAGE semicuantitativa de la segunda fermentacion, muestra del momento de cosecha:
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 0,87 j l de muestra (dilucion 1/7 de muestra de fermentacion)
Carril 3: 1,22 j l de muestra (dilucion 1/5 de muestra de fermentacion)
Carril 4: 1,53 j l de muestra (dilucion 1/4 de muestra de fermentacion)
Carril 5: 2,04 j l de muestra (dilucion 1/3 de muestra de fermentacion)
Carril 6: 0,27 jg de colagenasa I
Carril 7: 0,18 jg de colagenasa I
Carril 8: 0,135 jg de colagenasa I
Carril 9: 0,29 jg de colagenasa II
Carril 10: 0,193 jg de colagenasa II
Carril 11: 0,145 jg de colagenasa II;
La Figura 6 representa la estrategia de fermentacion utilizada para DCFT26a y DCFT26b;
La Figura 7 muestra las curvas de crecimiento (DO frente al tiempo) de C. histolyticum en fermentaciones de 5 l de DCFT26a,b;
La Figura 8 muestra las curvas de crecimiento neto (DO neta frente al tiempo) de C. histolyticum en fermentaciones de 5 l de DCFT26a,b;
La Figura 9 es un gel SDS PAGE para DCFT26a:
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: Colagenasa I - 0,67 jg
Carril 3: Colagenasa II - 0,72 jg
Carril 4: 20h (6,12 j l de muestra) - Momento de cosecha
Carril 5: 19h (6,12 j l de muestra)
Carril 6: 18h (6,12 j l de muestra)
Carril 7: 17h (6,12 j l de muestra)
Carril 8: 16h (6,12 j l de muestra)
Carril 9: 14h (6,12 j l de muestra)
Carril 10: 13h (6,12 j l de muestra)
Carril 11: 11h (6,12 j l de muestra);
La Figura 10 es un gel de SDS PAGE para DCFT26b:
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 20h (6,12 j l de muestra) - Momento de
cosecha
Carril 3: 19h (6,12 j l de muestra)
Carril 4: 18h (6,12 j l de muestra)
Carril 5: 17h (6,12 j l de muestra)
Carril 6: 16h (6,12 j l de muestra)
Carril 7: 15h (6,12 j l de muestra)
Carril 8: 14h (6,12 j l de muestra)
Carril 9: 13h (6,12 j l de muestra)
Carril 10 11h (6,12 j l de muestra)
Carril 11 Colagenasa I - 0,67 jg
Carril 12 Colagenasa II - 0,72 jg;
La Figura 11 es un gel de SDS PAGE semicuantitativa para DCFT26a, muestra del momento de cosecha:
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 0,27 |jg de colagenasa I
Carril 3: 0,18 jg de colagenasa I
Carril 4: 0,135 jg de colagenasa I
Carril 5: 0,29 jg de colagenasa II
Carril 6: 0,193 jg de colagenasa II
Carril 7: 0,145 jg de colagenasa II
Carril 8: 0,87 j l de muestra (dilucion 1/7 de muestra de fermentacion) Carril 9: 1,22 j l de muestra (dilucion 1/5 de muestra de fermentacion) Carril 10: 1,53 j l de muestra (dilucion 1/4 de muestra de fermentacion) Carril 11: 2,04 j l de muestra (dilucion 1/3 de muestra de fermentacion);
La Figura 12 es un gel de SDS PAGE semicuantitativa para DCFT26b, muestra del momento de cosecha:
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 0,27 jg de colagenasa I
Carril 3: 0,18 jg de colagenasa I
Carril 4: 0,135 jg de colagenasa I
Carril 5: 0,29 jg de colagenasa II
Carril 6: 0,193 jg de colagenasa II
Carril 7: 0,145 jg de colagenasa II
Carril 8: 2,04 j l de muestra (dilucion 1/3 de muestra de fermentacion)
Carril 9: 1,53 j l de muestra (dilucion 1/4 de muestra de fermentacion)
Carril 10: 1,22 j l de muestra (dilucion 1/5 de muestra de fermentacion)
Carril 11: 0,87 j l de muestra (dilucion 1/7 de muestra de fermentacion);
La Figura 13 es un gel de SDS PAGE para muestras precipitadas con sulfato de amonio post-dializado (100 g/l y 150 g/l), DCFT26a, muestra del momento de cosecha:
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 0,67 jg de colagenasa I y 0,72 jg de colagenasa II
Carril 3: 0,27 jg de colagenasa I y 0,29 jg de colagenasa II
Carril 4: 6,12 j l de muestra sobrenadante de SC11
Carril 5: Muestra post dializada - 100 g/l de SA (Puro)
Carril 6: Muestra post dializada - 100 g/l de SA (1/5)
Carril 7: Muestra post dializada - 100 g/l de SA (1/10)
Carril 8: Muestra post dializada - 150 g/l de SA (Puro)
Carril 9: Muestra post dializada - 150 g/l de SA (1/5)
Carril 10: Muestra post dializada - 150 g/l de SA (1/10);
La Figura 14 es un gel de SDS PAGE para muestras precipitadas con sulfato de amonio post-dializado (200 g/l y 250 g/l), DCFT26a, momento de cosecha:
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 0,67 jg de colagenasa I y 0,72 jg de colagenasa II
Carril 3: 0,27 jg de colagenasa I y 0,29 jg de colagenasa II
Carril 4: 6,12 j l de muestra sobrenadante de SC11
Carril 5: Muestra post dializada - 200 g/l de SA (Puro)
Carril 6: Muestra post dializada - 200 g/l de SA (1/5)
Carril 7: Muestra post dializada - 200 g/l de SA (1/10)
Carril 8: Muestra post dializada - 250 g/l de SA (Puro)
Carril 9: Muestra post dializada - 250 g/l de SA (1/5)
Carril 10: Muestra post dializada - 250 g/l de SA (1/10);
La Figura 15 es un gel de SDS PAGE para muestras precipitadas con sulfato de amonio post-dializado (300 g/l y 400 g/l), DCFT26a, momento de cosecha:
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 0,67 |jg de colagenasa I y 0,72 |jg de colagenasa II
Carril 3: 0,27 jg de colagenasa I y 0,29 jg de colagenasa II
Carril 4: 6,12 j l de muestra sobrenadante de SC11
Carril 5: muestra post dializada - 300 g/l de SA (Muestra Pura) Carril 6: muestra post dializada - 300 g/l de SA (dilucion 1/5)
Carril 7: muestra post dializada - 300 g/l de SA (dilucion 1/10)
Carril 8: Muestra post dializada - 400 g/l de SA (Puro)
Carril 9: muestra post dializada - 4000 g/l de SA (dilucion 1/5)
Carril 10: muestra post dializada - 400 g/l de SA (dilucion 1/10);
La Figura 16 muestra las curvas de crecimiento (DO frente al tiempo y DO neta frente al tiempo) de C. histolyticum en fermentacion de PBFT57; La Figura 17 es un gel de SDS PAGE semicuantitativa, muestra del momento de cosecha:
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 0,27 jg de colagenasa I
Carril 3: 0,18 jg de colagenasa I
Carril 4: 0,135 jg de colagenasa I
Carril 5: 0,29 jg de colagenasa II
Carril 6: 0,193 jg de colagenasa II
Carril 7: 0,145 jg de colagenasa II
Carril 8: 2,04 j l de muestra (dilucion 1/3 de muestra de cosecha de
fermentacion)
Carril 9: 1,53 j l de muestra (dilucion 1/4 de muestra de cosecha de
fermentacion)
Carril 10: 1,22 j l de muestra (dilucion 1/5 de muestra de cosecha de
fermentacion)
Carril 11: 0,87 j l de muestra (dilucion 1/7 de muestra de cosecha de
fermentacion);
La Figura 18a es un gel de SDS PAGE cuantitativa para una muestra post-dializada de 500 ml de la fermentacion de PBFT57, muestra del momento de cosecha. 400 g/l de sulfato de amonio agregado:
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 0,272 jg de colagenasa I y 0,286 jg de colagenasa II
Carril 3: 0,181 jg de colagenasa I y 0,190 jg de colagenasa II
Carril 4: 0,136 jg de colagenasa I y 0,142 jg de colagenasa II
Carril 5: 0,109 jg de colagenasa I y 0,114 jg de colagenasa II
Carril 6: muestra post dializada - 400 g/l de SA (dilucion 1/15)
Carril 7: muestra post dializada - 400 g/l de SA (dilucion 1/20)
Carril 8: muestra post dializada - 400 g/l de SA (dilucion 1/25)
Carril 9: muestra post dializada - 400 g/l de SA (dilucion 1/30)
Carril 10: muestra post dializada - 400 g/l de SA (dilucion 1/35)
Carril 11: Marcador de alto peso molecular;
La Figura 18b es una SDS PAGE de los sobrenadantes despues de la centrifugacion de las muestras precipitadas con sulfato de amonio:
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 0,27 jg de Col I y 0,29 jg de Col II
Carril 3: Sobrenadante (puro) de una muestra precipitada con sulfato de amonio (400 g/l de adicion lenta)
Carril 4: Sobrenadante (puro) de una muestra precipitada con sulfato de amonio (400 g/l de adicion rapida)
Carril 5: Sobrenadante (puro) de una muestra precipitada con sulfato de amonio (440 g/l de adicion lenta)
Carril 6: Sobrenadante (puro) de una muestra precipitada con sulfato de amonio (480 g/l de adicion lenta)
Carril 7: Sobrenadante (puro) de una muestra precipitada con sulfato de amonio (520 g/l de adicion lenta)
Carril 8: Sobrenadante (puro) de una muestra precipitada con sulfato de amonio (400 g/l, pH 6)
Carril 9: Sobrenadante (puro) de una muestra precipitada con sulfato de amonio (400 g/l, oxigenado);
La Figura 19 es un gel de SDS PAGE semicuantitativa que muestra muestras diluidas del sobrenadante del momento de recoleccion y la muestra precipitada con sulfato de amonio post dializada (con 400 g/l - adicion rapida):
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: Muestra de fermentacion - cosecha (pura)
Carril 3: Muestra de fermentacion - cosecha (dilucion 1/1)
Carril 4: Muestra de fermentacion - cosecha (dilucion 1/2)
Carril 5: Muestra de fermentacion - cosecha (dilucion 1/3)
Carril 6: Muestra de fermentacion - cosecha (dilucion 1/4)
Carril 7: Muestra post dializada - cosecha (dilucion 1/17,54) corresponde al carril 1
Carril 8: Muestra post dializada - cosecha (dilucion 1/35,08) corresponde al carril 2
Carril 9: Muestra post dializada - cosecha (dilucion 1/52,62) corresponde al carril 3
Carril 10: Muestra post dializada - cosecha (dilucion 1/70,16) corresponde al carril 4
Carril 11: Muestra post dializada - cosecha (dilucion 1/87,70 ) corresponde al carril 5
La Figura 20 es un gel de SDS PAGE semicuantitativa para PBFT57 que muestra muestras diluidas del sobrenadante del momento de recoleccion y la muestra precipitada con sulfato de amonio post dializada (con 520 g/l):
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: Muestra de fermentacion - cosecha (pura)
Carril 3: Muestra de fermentacion - cosecha (dilucion 1/1)
Carril 4: Muestra de fermentacion - cosecha (dilucion 1/2)
Carril 5: Muestra de fermentacion - cosecha (dilucion 1/3)
Carril 6: Muestra de fermentacion - cosecha (dilucion 1/4)
Carril 7: Muestra post dializada - cosecha (dilucion 1/15,63) corresponde al
carril 1
Carril 8: Muestra post dializada - cosecha (dilucion 1/31,26) corresponde al
carril 2
Carril 9: Muestra post dializada - cosecha (dilucion 1/46,89) corresponde al
carril 3
Carril 10: Muestra post dializada - cosecha (dilucion 1/62,52) corresponde al
carril 4
Carril 11: Muestra post dializada - cosecha (dilucion 1/78,15) corresponde al
carril 5;
La Figura 21 muestra las curvas de crecimiento (DO neta frente al tiempo) de las cepas 004 y 013 de C. histolyticum en fermentaciones de PBFT58c,d; La Figura 22 es un gel de SDS PAGE para PBFt 58c (Cepa 004):
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: Colagenasa I - 1,00 |jg
Carril 3: Colagenasa I - 0,67 jg
Carril 4: Colagenasa II - 1,08 jg
Carril 5: Colagenasa II - 0,72 jg
Carril 6: 16.25h (6,12 j l de muestra)
Carril 7: 17h (6,12 j l de muestra)
Carril 8: 18h (6,12 j l de muestra)
Carril 9: 19h (6,12 j l de muestra)
Carril 10: 20.5h (6,12 j l de muestra);
La Figura 23 es un gel de SDS PAGE para PBFT58d (Cepa 013):
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: Colagenasa I - 1,00 |jg
Carril 3: Colagenasa I - 0,67 jg
Carril 4: Colagenasa II - 1,08 jg
Carril 5: Colagenasa II - 0,72 jg
Carril 6: 16.25h (6,12 j l de muestra)
Carril 7: 17h (6,12 j l de muestra)
Carril 8: 18h (6,12 j l de muestra)
Carril 9: 19h (6,12 j l de muestra)
Carril 10: 20.5h (6,12 j l de muestra)
La Figura 24 es un gel de SDS PAGE semicuantitativa para PBFT58c (cepa 004), muestra de momento de cosecha:
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 0,27 jg de colagenasa I y 0,29 jg de colagenasa II
Carril 3: 0,18 jg de colagenasa I y 0,19 jg de colagenasa II
Carril 4: 0,135 jg de colagenasa I y 0,145 jg de colagenasa
II
Carril 5: 0,108 jg de colagenasa I y 0,116 jg de colagenasa
II
Carril 6: 6,12 j l de muestra
Carril 7: 3,06 j l de muestra
Carril 8: 2,04 j l de muestra
Carril 9: 1,53 j l de muestra
Carril 10: 1,22 j l de muestra;
La Figura 25 es un gel de SDS PAGE semicuantitativa para PBFT58d (cepa 013), muestra de momento de cosecha:
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 0,27 jg de colagenasa I y 0,29 jg de colagenasa II
Carril 3: 0,18 jg de colagenasa I y 0,19 jg de colagenasa II
Carril 4: 0,135 jg de colagenasa I y 0,145 jg de colagenasa II
Carril 5: 0,108 jg de colagenasa I y 0,116 jg de colagenasa II
Carril 6: 6,12 j l de muestra
Carril 7: 3,06 j l de muestra
Carril 8: 2,04 j l de muestra
Carril 9: 1,53 j l de muestra
Carril 10: 1,22 j l de muestra;
La Figura 26 es un gel de SDS PAGE para una muestra de momento de recoleccion post-dializada (520 g/l de sulfato de amonio) de la fermentacion de PBFT58c (cepa 004):
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 0,27 jg de colagenasa I y 0,29 jg de colagenasa II
Carril 3: 0,18 jg de colagenasa I y 0,19 jg de colagenasa II
Carril 4: 0,135 jg de colagenasa I y 0,145 jg de colagenasa II
Carril 5: 0,108 jg de colagenasa I y 0,116 jg de colagenasa II
Carril 6: muestra de momento de cosecha post dializada - Pura
Carril 7: muestra de momento de cosecha post dializada -(dilucion 1/5)
Carril 8: muestra de momento de cosecha post dializada -(dilucion 1/10)
Carril 9: muestra de momento de cosecha post dializada -(dilucion 1/15)
Carril 10: muestra de momento de cosecha post dializada -(dilucion 1/20);
La Figura 27 es un gel de SDS PAGE para una muestra de momento de cosecha post-dializada (400 g/l de sulfato de amonio) de la fermentacion de PBFT58d (cepa 013):
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 0,27 |jg de colagenasa I y 0,29 |jg de colagenasa II
Carril 3: 0,18 jg de colagenasa I y 0,19 jg de colagenasa II
Carril 4: 0,135 jg de colagenasa I y 0,145 jg de colagenasa II
Carril 5: 0,108 jg de colagenasa I y 0,116 jg de colagenasa II
Carril 6: muestra de momento de cosecha post dializada - Pura
Carril 7: muestra de momento de cosecha post dializada - (dilucion
1/5)
Carril 8: muestra de momento de cosecha post dializada - (dilucion
1/10)
Carril 9: muestra de momento de cosecha post dializada - (dilucion
1/15)
Carril 10: muestra de momento de cosecha post dializada - (dilucion
1/20);
La Figura 28 ilustra un diagrama de flujo del procedimiento experimental utilizado para analizar las peptonas vegetales alternativas;
La Figura 29 ilustra una estrategia de alimentacion discontinua para fermentaciones de DCFT27a,b;
La Figura 30 muestra las curvas de crecimiento (DO neta frente al tiempo) de C. histolyticum en fermentaciones discontinuas alimentadas de 5 l de DCFT27a y DCFT27b;
La Figura 31 muestra las curvas de crecimiento (DO neta frente al tiempo) de C. histolyticum en fermentaciones discontinuas de 5 l de PBFT59a,b,c;
La Figura 32 muestra una curva de crecimiento (DO frente al tiempo) de C. histolyticum en fermentaciones discontinuas alimentadas de 5 l de DCFT27d;
La Figura 33a es un gel de SDS PAGE para DCFT27d (Fitona suplementada con aminoacidos):
Carril 1: Marcador de alto peso molecular
Carril 2: 18h (6,12 j l de muestra)
Carril 3: 17h (6,12 j l de muestra)
Carril 4: 15h (6,12 j l de muestra)
Carril 5: 14h (6,12 j l de muestra)
Carril 6: 13h (6,12 j l de muestra)
Carril 7: 11.3h (6,12 j l de muestra)
Carril 8: 0,27 jg de Colagenasa I y 0,29 jg de Colagenasa II
La figura 33b representa un diagrama esquematico del procedimiento de inoculacion;
La Figura 33c representa un diagrama de flujo de un proceso de inoculacion discontinua alimentada de aproximadamente 200 l;
La figura 34 muestra un cromatograma despues de la cromatograffa con hidroxiapatita;
La Figura 35 muestra un cromatograma despues de un intercambio anionico en fractogel TMAE;
La Figura 36 es un analisis de SDS-PAGE de Tris-Glicina al 8% de material Pre HA, Post HA y Post TMAE a partir del proceso de escala de 5 l:
Carril Muestra Volumen de carga,
j l
1 Marcador de alto peso molecular 20
2 1 jg de referencia de colagenasa 20
ABC I
3 1 jg de referencia de colagenasa 20
ABC II
4 Pre HA- 1 jg 20
5 Post HA - 1 jg 20
6 Post TMAE - 1 jg 20
La Figura 37 muestra un cromatograma despues de un intercambio anionico en fractogel TMAE;
La Figura 38 es un analisis de SDS-PAGE con Tris-Glicina al 8% de la cromatograffa Q-Sepharose IEX del material post-TMAE ejecutada en presencia de leupeptina:
Carril Muestra Volumen de carga, j l
1 Marcador de alto peso molecular 20
2 1 jg de referencia de colagenasa 20
ABC I
3 1 jg de referencia de colagenasa 20
ABC II
4 Post TMAE/Post Dialisis - 1 jg 20
5 Fraccion D6 - Pura 20
6 Fraccion E6 - Pura 20
7 Fraccion F7 - 1 jg 20
8 Fraccion F6 - 1 jg 20
9 Fraccion F5 - 1 jg 20
10 Fraccion F4 - Pura 20;
La Figura 39 es un analisis de SDS-PAGE con Tris-Glicina al 8% de la cromatograffa Q-Sepharose IEX del material post-TMAE ejecutada en presencia de leupeptina. Gel 2-Pico 2 (ABCI):
Carril Volumen de carga de muestra, j l Volumen de carga, j l 1 Marcador de alto peso molecular 20
2 1 jg de referencia de colagenasa ABC I 20
3 1 jg de referencia de colagenasa ABC II 20
4 Fraccion B2 - Pura 20
5 Fraccion C1 - 1 jg 20
6 Fraccion C2 - 1 jg 20
7 Fraccion C3 - 1 jg 20
8 Fraccion C4 - 1 jg 20
9 Fraccion C5 - Pura 20
10 Fraccion C6 - Pura 20;
La Figura 40 muestra un cromatograma despues de un intercambio anionico Q Sepharose HP con gradiente modificado;
La Figura 41 muestra un cromatograma despues de una cromatograffa de permeacion en gel Superdex 75 de ABCII; La Figura 42 es un analisis de SDS-PAGE de Bis-Tris al 12% de Superdex 75 GPC de la ejecucion de ABC II concentrado en presencia de arginina:
Carril Muestra Volumen de
carga, j l
1 Marcador de la marca 12 10
2 1 jg de referencia de colagenasa 15
ABC I
3 1 jg de referencia de colagenasa 15
ABC II
4 Carga GPC 1 jg 15
5 Fraccion D4 15
6 Fraccion D3 15
7 Fraccion D2 15
8 Fraccion D1 Pura 15
9 Fraccion E1 15
10 Fraccion E2 15
11 Fraccion E3 15
12 Fraccion E4 15;
La Figura 43 muestra un cromatograma despues de una cromatograffa de permeacion en gel Superdex 75 de ABCI; La Figura 44 es un analisis de SDS-PAGE de Bis-Tris al 4-12 % de Superdex 75 GPC de la ejecucion de ABC I concentrado en presencia de arginina:
Carril Muestra Volumen de
carga, |jl
1 Marcador de la marca 12 10
2 1 jg de referencia de colagenasa 15
ABC I
3 1 jg de referencia de colagenasa 15
ABC II
4 Carga GPC 1 jg 15
5 Fraccion D4 15
6 Fraccion D3 15
7 Fraccion D2 15
8 Fraccion D1 15
9 Fraccion E1 15
10 Fraccion E2 15
11 Fraccion E3 15
12 Fraccion E4 15;
La Figura 45 representa un diagrama de flujo de un proceso de fabricacion propuesto;
La Figura 46 representa un diagrama de flujo del procedimiento de fermentacion para el proceso 3;
La Figura 47 representa un diagrama de flujo del procedimiento de purificacion para el proceso 3;
La Figura 48 es una SDS-PAGE (reducida) tenida con Coomassie para los Intermedios AUXI y AUXII: Carril
1. Marcadores de alto peso molecular
2. 0,132 mg/ml de referencia de ABC-I
3. 0,0265 mg/ml de referencia de ABC-I
4. 0,132 m/ml de intermedio de AUX-I
5. 0,0265 m/ml de intermedio de AUX-I
6. 0,132 mg/ml de referencia de ABC-II
7. 0,0265 mg/ml de referencia de ABC-II
8. 0,132 mg/ml de intermedio de AUX-II
9. 0,0265 mg/ml de intermedio de AUX-II;
La Figura 49 es una SDS-PAGE (reducida) tenida con Coomassie para el Farmaco:
Carril
1. Marcadores de alto peso molecular
2. 0,132 mg/ml de referencia de BTC mezclado
3. 0,0265 mg/ml de referencia de BTC mezclado
4. 0,132 mg/ml de Farmaco
5. 0,0265 mg/ml de Farmaco;
La Figura 50 es una SDS-PAGE (reducida) con tincion de Plata para el Farmaco:
Carril
1. Marcador HMW
2. Referencia de BTC mezclada 1,3 |jg
3. Blanco
4. Farmaco 1,3 jg
5. Farmaco 0,27 jg
6. Farmaco 0,13 jg.
La Figura 51 muestra una comparacion de C. histolyticum cultivado en Proteosa Peptona N.° 3 en un proceso de fermentacion discontinua con el proceso de fermentacion existente utilizando Fitona Peptona durante el cultivo discontinuo alimentado; 1 » ■ lote GCFT03b PP3 " * discontinua alimentada con GCFT03d Fitona.
La Figura 52 es un analisis de SDS-PAGE del producto de colagenasa en el momento de cosecha (20h) de una fermentacion discontinua de 5 l de Proteosa Peptona n.° 3 (GCFT03b) (Tris-Glicina al 8%):
Carril Muestra
1 Marcador de alto peso molecular
2 0,27 jg AUXI
3 0,18 jg AUXI
4 0,135 jg AUXI
5 0,29 jg AUXI
6 0,193 jg AUXI
Carril Muestra
7 0,145 pg AUXI
8 0,87 pl de muestra (dilucion 1/7 de muestra de
fermentacion)
9 1,22 pl de muestra (dilucion 1/5 de muestra de
fermentacion)
10 1,53 pl de muestra (dilucion 1/4 de muestra de
fermentacion)
11 2,04 pl de muestra (dilucion 1/3 de muestra de
_______fermentacion)____ '_____________________
Estimacion
AUXI ~ 176 mg/l
AUXII ~ 190 mg/l______________________________
La Figura 53 es un analisis de SDS-PAGE del producto de colagenasa en el momento de cosecha (20h) de una fermentacion discontinua alimentada con Fitona de 5 l (GCFT03d) (Tris-Glicina al 8%):
Carril Muestra
1 Marcador de alto peso molecular
2 0,27 pg AUXI
3 0,18 pg AUXI
4 0,135 pg AUXI
5 0,29 pg AUXI
6 0,193 pg AUXI
7 0,145 pg AUXI
8 0,87 pl de muestra (dilucion 1/7 de muestra de
fermentacion)
9 1,22 pl de muestra (dilucion 1/5 de muestra de
fermentacion)
10 1,53 pl de muestra (dilucion 1/4 de muestra de
fermentacion)
11 2,04 pl de muestra (dilucion 1/3 de muestra de
fermentacion)
Estimacion
AUXI ~ 88 mg/l
AUXII ~ 142 mg/l
La Figura 54 ilustra tres fermentaciones de Clostridium histolyticum crecido en 50 g/l de PP3 que demuestran un perfil de crecimiento reproducible: 1 * ■ GCFT03b GCFT04c * GCFT05d.
La Figura 55 es un analisis de SDS-PAGE que muestra el curso temporal de GCFT05d (fermentacion discontinua con Proteosa peptona n° 3), gel de Tris-glicina al 8%, tenido coloidal):
Carril Muestra
1 Marcador de alto peso molecular
2 Referencia, AUXI y AUXII
3 3 horas
4 4 horas
5 5 horas
6 6 horas
7 7 horas
8 8 horas
9 9 horas
10 10 horas
11 11 horas
La Figura 56 es un analisis de SDS-PAGE que muestra el curso temporal de GCFT05d (fermentacion discontinua con Proteosa peptona n° 3), (gel de Tris-glicina al 8%, con tincion de plata):
Figure imgf000013_0001
La Figura 57 es un analisis de SDS-PAGE que muestra el curso temporal de DCFT24b (fermentacion discontinua alimentada con Fitona peptona), (gel de Tris-glicina al 8%, tenido coloidal): 5
Figure imgf000013_0002
La Figura 58 ilustra una comparacion de curvas de crecimiento de las fermentaciones de C. histolyticum utilizando diferentes lotes de PP3:
Figure imgf000013_0003
La Figura 59 ilustra una comparacion a pequena escala de tres lotes de PP3 y su evaluacion El lote 5354798 (50 g/l) □ lote 5332398 (50 g/l) de 100 g/l dePP3: ■ lote 5325835 (50 g/l) □ lote 5332398 (100 g/l).
La Figura 60 muestra unos perfiles de crecimiento de dos fermentaciones de 5 I utilizando PP3 a 100 g/l: 1 » ■ PBFT70C n.° de lote 5354796 PBFT70d n.° de lote 5325635.
La Figura 61 es un analisis SDS-PAGE del curso temporal de la fermentacion de PBFT70c, 100 g/l de PP3 (n.° de lote 5354796) (Tris-Glicina al 8%):
Figure imgf000013_0004
La Figura 62 es un analisis SDS-PAGE del curso temporal de la fermentacion de PBFT70d, 100 g/l de PP3 (n.° de lote 5325635) (Tris-Glicina al 8%):
Figure imgf000014_0002
La Figura 63 representa un analisis de densitometrfa de SDS-PAGE para comparar el crecimiento celular con la formacion del producto a partir de fermentacion de 5 I de PBFT70c: DO d e - * * - - precursor 1 » ■ Aux 1 1 » ■ Aux 2.
La Figura 64 ilustra una comparacion de un proceso con PP3 100 g/l a escala de 5 I y 200 I:
Figure imgf000014_0001
PBFT70d fermentacion a escala de 200 I
La Figura 65 es un analisis SDS-PAGE del curso temporal de la fermentacion de 200 l (Tris-Glicina al 8%):
Figure imgf000014_0003
La Figura 66 representa un analisis de densitometrfa de SDS-PAGE para comparar el crecimiento celular con la formacion del producto a partir de fermentacion de 200 I: DO de- * * - - precursor Aux 1 Aux 2.
La Figura 67 es un analisis SDS-PAGE del curso temporal de la fermentacion de 200 l (Bis-Tris al 4 -12 %):
Figure imgf000014_0004
La Figura 68 muestra una curva patron para la cuantificacion de densitometna de la concentracion de colagenasa. La Figura 69 representa una ilustracion esquematica de la fermentacion y cosecha de Clostridium histolyticum. Las figuras 70(a) y (b) son cromatogramas resultantes de la cromatograffa de interaccion hidrofobica usando Fenil Sepharose FF (sub bajo): (a) es un cromatograma a escala completa y (b) es un cromatograma expandido que muestra la coleccion de fracciones.
La Figura 71 es un analisis de Bis-Tris SDS-PAGE al 4-12% de muestras en proceso desde la etapa Mustang Q hasta la etapa TFF1. El gel se tine con azul coloidal y se sobrecarga (2,5 pg de protema total/carril) para mostrar las bandas contaminantes:
Figure imgf000015_0001
La Figura 72 es un cromatograma de intercambio ionico (Q Sepharose HP) del material post HIC despues de la concentracion y diafiltracion en Tris 10 mM, leupeptina 200 pM pH 8.
La Figura 73 es un analisis de Bis Tris SDS-PAGe al 4-12% de las fracciones del pico 1 (AUXII) eluido durante la columna de intercambio ionico (figura 5). Gel 1: el gel se tine con azul Coloidal:
Figure imgf000015_0002
La Figura 74 es un analisis Bis Tris SDS-PAGE al 4-12% de las fracciones del pico 1 (AUXII) eluido durante la columna de intercambio ionico (figura 5). Gel 2: el gel se tine con azul Coloidal:
Figure imgf000015_0003
La Figura 75 es un analisis Bis Tris SDS-PAGE al 4-12% de las fracciones del pico 2 (AUXI) eluido durante la columna de intercambio ionico (figura 5). Gel 3: el gel se tine con azul Coloidal:
Figure imgf000015_0004
Figure imgf000016_0001
La Figura 76 es un analisis Bis Tris SDS-PAGE al 4-12% de las fracciones del pico 2 (AUXI) eluido durante la columna de intercambio ionico (figura 5). Gel 4: el gel se tine con azul Coloidal:
Figure imgf000016_0002
La Figura 77 es un analisis de Bis-Tris SDS-PAGE al 4-12% de muestras en proceso desde la etapa de intercambio anionico hasta el producto final. El gel se tine con azul Coloidal. Gel 1:1 pg/carga de carril:
Figure imgf000016_0003
La Figura 78 es un analisis de Bis-Tris SDS-PAGE al 4-12% de muestras en proceso desde la etapa de intercambio anionico hasta el producto final. El gel se tine con azul Coloidal. Gel 2:2,5 pg/carga de carril:
Figure imgf000016_0004
La Figura 79 es una SDS-PAGE con Tris Glicina al 8% (NB Ref. SA/1640/020):
1. Marcadores de alto peso molecular
2. Carril en blanco
3. 1 pg de Filtrado de Fermentacion Dfa 4
4. 1 pg de Filtrado de Fermentacion Dfa 5
5. 1 |jg de Post Mustang Q Dfa 4
6. 1 jg de Post HIC Dfa 3
7. 1 jg de Post HIC Dfa 6
8. 1 jg de Post TFF Dfa 2
9. 1 jg de Post TFF Dfa 4
La Figura 80 es una SDS-PAGE con Tris Glicina al 8%:
1. Marcadores de alto peso molecular
2. 1 jg de referencia de AUX-I
3. 1 jg de referencia de AUX-II
4. 1 jg de Post IEX AUX-I Dfa 5
5. 1 jg de Post IEX AUX-I Dfa 12
6. 1 jg de Post IEX AUX- II Dfa 5
7. 1 jg de Post IEX AUX- II Dfa 12
La Figura 81 es un gel de SDS-PAGE:
1. Marcadores de alto peso molecular
2. 1 jg de referencia de AUX-I
3. 1 jg de referencia de AUX-II
4. 1 jg de AUX-I Intermedio Dfa 5
5. 1 jg de AUX-I Intermedio Dfa 12
6. 1 jg AUX-II Intermedio Dfa 5
7. 1 jg de AUX-II Intermedio Dfa 12. La Figura 82 representa el analisis de cromatograffa analftica.
La figura 83 muestra la determinacion de la concentracion de protemas por UV.
La Figura 84 es un analisis Bis-Tris SDS-PAGE al 4-12% de muestras en proceso de la ejecucion de demostracion 20 l tomado en el punto de fabricacion y almacenado a -20 °C. El gel se tine con azul coloidal. 1 jg de carga:
Figure imgf000017_0001
La Figura 85 es un analisis Bis-Tris SDS-PAGE al 4-12% de muestras en proceso la ejecucion de demostracion 20 l despues de 22h a temperatura ambiente. El gel se tine con azul Coloidal:
Figure imgf000018_0001
La Figura 86 es un analisis Bis-Tris SDS-PAGE al 4-12% de muestras en proceso de la ejecucion de demostracion 20 l despues de 22 horas a 37 °C. El gel se tine con azul coloidal:
Figure imgf000018_0002
La Figura 87 es un analisis Bis-Tris SDS-PAGE al 4-12% de muestras en proceso la ejecucion de demostracion 20 l despues de 94 horas a temperatura ambiente. El gel se tine con azul Coloidal:
Figure imgf000018_0003
La Figura 88 es un analisis Bis-Tris SDS-PAGE al 4-12% de muestras en proceso de la ejecucion de demostracion 20 l despues de 94 horas a 37 °C. El gel se tine con azul coloidal:
Figure imgf000018_0004
Figure imgf000019_0002
La Figura 89 es un analisis de SDS-PAGE con Tris-glicina al 8% de las fracciones post IEX AUX I y post IEX AUX II seleccionadas. Las fracciones se seleccionaron de la ejecucion de demostracion de 20 L que se enriquecio para la protema contaminante requerida. El gel se tine con azul Coloidal:
Figure imgf000019_0003
La Figura 90 es un analisis de SDS-PAGE con Tris-glicina al 8% de las fracciones post IEX AUX I y post IEX AUX II seleccionadas. Las fracciones se seleccionaron a partir de material purificado generado a partir de la fermentacion con PP3 de 20 l y enriquecido para la protema contaminante de ~ 90 kDa. El gel se tine con azul Coloidal:
Figure imgf000019_0004
Descripcion detallada de la invencion
La invencion proporciona una composicion de colagenasa que consiste en colagenasa I y colagenasa II de Clostridium histolyticum, respectivamente, que tiene una proporcion de masa de 1 a 1 en la que la composicion de colagenasa tiene una pureza de al menos el 95% por area, medida por cromatograffa lfquida de alto rendimiento de fase inversa, para su uso como un medicamento.
Se ha descubierto que una composicion que comprende una mezcla de colagenasa I y colagenasa II en una proporcion de masa artificial de 1 a 1 proporciona una actividad enzimatica optima y altamente reproducible e imparte un efecto terapeutico superior al tiempo que reduce el potencial de efectos secundarios. Se entiende que los terminos "farmaco", "producto farmacologico" o "composicion de colagenasa" se pueden usar indistintamente.
En el presente documento se divulga un farmaco que consiste en colagenasa I y colagenasa II que tienen la secuencia de colagenasa I y colagenasa II de Clostridium histolyticum, respectivamente, que tienen una proporcion de masa de aproximadamente 1 a 1 con una pureza de al menos el 95% por area, y preferentemente una pureza de al menos 98% por area.
En el presente documento tambien se describe un farmaco, en donde la sustancia farmaceutica tiene al menos una especificacion seleccionada de la tabla A a continuacion:
Tabla A
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
En el presente documento tambien se divulga un proceso para producir un farmaco que consiste en colagenasa I y colagenasa II que tienen la secuencia de colagenasa I y colagenasa II de Clostridium histolyticum, respectivamente, que tiene una proporcion de masa de aproximadamente 1 a 1 con una pureza de al menos el 95% por area, que comprende las etapas de:
a) fermentar Clostridium histolyticum;
b) cosechar un producto bruto que comprende colagenasa I y colagenasa II;
c) purificar la colagenasa I y la colagenasa II de la cosecha bruta mediante filtracion y cromatograffa en columna; y
d) combinar la colagenasa I y la colagenasa II purificadas de la etapa (c) en una proporcion de aproximadamente 1 a 1.
La etapa de fermentacion se puede llevar a cabo en presencia de un derivado porcino, una fitona peptona o un medio de peptona vegetal. Mas preferentemente, el medio derivado porcino es la proteosa peptona n.° 3.
En el presente documento se divulga un procedimiento de fermentacion que comprende las etapas de:
a) inocular el medio en una primera etapa con Clostridium histolyticum y agitar la mezcla;
b) incubar la mezcla de la etapa (a) para obtener una affcuota;
c) inocular el medio en una segunda etapa con affcuotas resultantes de la etapa (b) y agitar la mezcla;
d) incubar mezclas de la etapa (c);
e) inocular el medio en una tercera etapa con affcuotas resultantes de la etapa (d) y agitar;
f) incubar las mezclas de la etapa (e);
g) inocular el medio en una cuarta etapa con una affcuota resultante de la etapa (f) y agitar;
h) incubar mezclas de la etapa (g); y
i) cosechar el cultivo resultante de la etapa (h) por filtracion.
El procedimiento de fermentacion puede comprender las etapas de:
a) Inocular 3 x 25 ml de medio PP3 (proteosa peptona) con 3 x 250 pl de WCB (cultivos de 25 ml en 3 x matraces de agitacion de 125 ml, contenida dentro del recipiente de gas Anaerobe) a un punto de ajuste de temperatura de 37 °C y agitar la mezcla a 125 rpm;
b) incubar la mezcla de la etapa (a) durante 12 horas;
c) inocular el medio PP3 inoculado 4 x 200 ml con 4 x affcuotas de 5 ml de 1 de los cultivos de aproximadamente 25 ml (cultivos de 200 ml en 4 x 500 ml en matraces de agitacion, contenida dentro del recipiente de gas Anaerobe) a un punto de ajuste de temperatura de 37 °C y agitar la mezcla a 125 rpm;
d) incubar mezclas de la etapa (c) durante 12 horas;
e) inocular 14,4 l de medio PP3 con 3 x cultivo de 200 ml (cultivo de 15 l en fermentador de 20 l) a un punto de ajuste de temperatura de 37 °C y un punto de ajuste de pH de 7,00, y agitar la mezcla a 125 rpm;
f) incubar mezclas de la etapa (e) durante 12 horas;
g) inocular 192 l de medio PP3 con 8 l de cultivo de 15 l (cultivo de 200 l de cultivo en fermentador de 270L) a un punto de ajuste de temperatura de 37 °C y un punto de ajuste de pH de 7,00, y agitar la mezcla a 125 rpm; h) incubar mezclas de la etapa (g) durante 14 horas; y
i) cosechar el cultivo de 200 l por filtracion (profundidad seguida por 0,2 pm) a traves de Millipore Millistak 4m2 y filtro de 0,2 pm (2 x filtros Millipore Express XL 10) a un caudal de 200 l/h.
En el presente documento se divulga un procedimiento de purificacion que comprende las etapas de:
a) filtrar la cosecha bruta a traves de un filtro de capsula de intercambio anionico Mustang Q;
b) anadir sulfato de amonio; preferentemente a una concentracion final de 1M;
c) filtrar la cosecha bruta; preferentemente a traves de un filtro de 0,45 pm;
d) someter el filtrado a traves de una columna HIC; preferentemente una fenil Sepharose 6FF (sub bajo); e) anadir leupeptina al filtrado; preferentemente a una concentracion final de 0,2 mM al producto eluido post HIC; f) eliminar el sulfato de amonio y mantener la leupeptina para una correcta union de colagenasa I y colagenasa II con intercambio de tampon por TFF; preferentemente con intercambio de tampon por TFF;
g) filtrar la mezcla de la etapa (f); preferentemente a traves de un filtro de 0,45 pm;
h) separar colagenasa I y colagenasa II usando Q-Sepharose HP;
i) preparar la concentracion de TFF y la formulacion para colagenasa I y colagenasa II por separado; en donde TFF es una filtracion de flujo tangencial que utiliza 10 y/o 30K MWCO (ffmite de peso molecular) PES o RC -polietersulfona o membranas de filtro de celulosa regenerada. Proporciona medios para retener y concentrar la protema seleccionada e intercambiar la protema de una solucion tampon a otra; y
j) filtrar a traves de un sistema de filtracion de 0,2 pm.
La composicion de colagenasa de la presente invencion incluye tanto colagenasa I como colagenasa II. Una fuente preferida de colagenasa bruta proviene de un proceso de fermentacion bacteriana, espedficamente la fermentacion de C. histolyticum (C. his).
En el presente documento, se describe un proceso de fermentacion. La colagenasa bruta obtenida de C. his puede purificarse mediante una variedad de metodos conocidos por los expertos en la tecnica, incluyendo cromatograffa de afinidad de ligando de colorante, cromatograffa de afinidad con heparina, precipitacion en sulfato de amonio, cromatograffa de hidroxilapatita, cromatograffa de exclusion molecular, cromatograffa de intercambio ionico y cromatograffa de quelacion de metales. La colagenasa bruta y parcialmente purificada esta disponible comercialmente de muchas fuentes incluyendo Advance Biofactures Corp., Lynbrook, Nueva York.
Tanto la colagenasa I como la colagenasa II son metaloproteasas y requieren zinc fuertemente unido y calcio ligeramente unido para su actividad (Eddie L. Angleton y H. E. Van Wart, Biochemistry 1988, 27, 7406 - 7412). Ambas colagenasas tienen una amplia especificidad hacia todos los tipos de colageno (Steinbrink, D; Bond, M y Van Wart, H; (1985), JBC, 260 p2771-2776). La colagenasa I y la colagenasa II digieren el colageno hidrolizando la region de helice triple del colageno en condiciones fisiologicas (Steinbrink, D; Bond, M y Van Wart, H; (1985), JBC, 260 p2771 - 2776). Aunque cada colagenasa muestra una especificidad diferente (por ejemplo, cada una tiene una secuencia amino preferida diferente para la escision), conjuntamente, tienen una actividad sinergica hacia el colageno [Mandl, I., (1964), Biochemistry, 3: p.1737-1741; Vos-Scheperkeuter, GH, (1997), Cell Transplantation, 6: p.403-412]. La colagenasa II tiene una actividad mas alta hacia todos los tipos de sustratos pepffdicos sinteticos que la colagenasa I segun se informa para la colagenasa de clase II y clase I en las bibliograffas. [Bond, M.D. (1984), Biochemistry, 23: p.3085-3091. Hesse, F, (1995), Transplantation Proceedings, 27: p.3287-3289].
Ejemplos de enfermedades mediadas por colageno que pueden tratarse con las composiciones de la invencion y los metodos divulgados en el presente documento incluyen, pero sin limitacion: enfermedad de Dupuytren; enfermedad de Peyronie; hombro congelado (capsulitis adhesiva), queloides; cicatrices hipertroficas; cicatrices deprimidas como las que resultan del acne inflamatorio; adherencias postquirurgicas; acne comun; lipomas, y condiciones desfigurantes tales como arrugas, formacion de celulitis y fibrosis neoplasica. Las Patentes de EE.UU. Numeros 6.086.872 y 5.589.171 divulgan el uso de preparaciones de colagenasa en el tratamiento de la enfermedad de Dupuytren. La Patente de EE.UU. N.° 6.022.539 divulga el uso de preparaciones de colagenasa en el tratamiento de la enfermedad de Peyronie.
Ademas de su uso en el tratamiento de enfermedades mediadas por colageno, la composicion de la invencion tambien es util para la disociacion de tejido en celulas individuals y grupos de celulas, como es util en una amplia variedad de aplicaciones de laboratorio,diagnosticas y terapeuticas. Estas aplicaciones implican el aislamiento de muchos tipos de celulas para diversos usos, incluidas las celulas endoteliales microvasculares para la siembra de injertos vasculares sinteticos de diametro pequeno, hepatocitos para terapia genica, deteccion de toxicolog^a de farmacos y dispositivos de asistencia hepatica extracorporea, condrocitos para la regeneracion del cardlago e islotes de Langerhans para el tratamiento de la diabetes mellitus dependiente de insulina. El tratamiento enzimatico trabaja para fragmentar protemas de la matriz extracelular y protemas que mantienen el contacto de celula a celula. Debido a que el colageno es el principal componente proteico de la ultraestructura tisular, la enzima colagenasa se ha usado con frecuencia para lograr la desintegracion tisular deseada. En general, la composicion de la presente invencion es util para cualquier aplicacion en la que se desee la eliminacion de celulas o la modificacion de una matriz extracelular.
Las composiciones de colagenasa de la invencion tambien pueden prepararse mezclando un numero espedfico de unidades de actividad o masas espedficas de las enzimas preferentemente purificadas. La actividad de la colagenasa se puede medir por la capacidad de la enzima para hidrolizar el peptido sintetico o el sustrato de colageno. Los expertos en la materia reconoceran que los ensayos enzimaticos distintos de los divulgados en el presente documento tambien se pueden usar para definir y preparar composiciones enzimaticas funcionalmente equivalentes.
Tambien se divulga a continuacion la optimizacion reproducible de la proporcion de masa de 1 a 1 de colagenasa I a colagenasa II en la composicion de la invencion. La reproducibilidad de la proporcion de colagenasa I a colagenasa II ha sido previamente un desaffo debido a varios factores. En primer lugar, la fermentacion comercial de Clostridium generalmente da como resultado una proporcion de colagenasa I y colagenasa II de 1 a 2. En segundo lugar, se sabe que los procedimientos de purificacion alteran esta proporcion significativamente, dando como resultado proporciones inconsistentes del producto purificado. La proporcion de masa fija optimizada de la composicion de la presente invencion maximiza la actividad sinergica proporcionada por las dos colagenasas diferentes, dando como resultado un beneficio terapeutico superior.
La invencion tambien proporciona formulaciones farmaceuticas de las composiciones de la invencion. Las formulaciones farmaceuticas de la presente invencion comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion de colagenasa de la presente invencion formulada junto con uno o mas transportadores o excipientes farmaceuticamente aceptables.
Como se usa en el presente documento, el termino "transportador o excipiente farmaceuticamente aceptable" significa un agente de relleno, diluyente, material de encapsulado o formulacion auxiliar no toxica, solida inerte, semisolida o lfquida de cualquier tipo. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como transportadores farmaceuticamente aceptables son azucares tal como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidon de mafz y almidon de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sodica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; glicoles, tales como propilenglicol; esteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes, tales como hidroxido de magnesio e hidroxido de aluminio; acido algmico; agua apirogena; solucion salina isotonica; solucion de Ringer; alcohol etflico y soluciones de tampon fosfato, asf como otros lubricantes compatibles no toxicos, tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, asf como agentes colorantes, agentes de liberacion, agentes de recubrimiento, agentes perfumantes, conservantes y antioxidantes pueden estar tambien presentes en la composicion, segun el criterio del experto en formulacion.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se pueden administrar por via parenteral, topica o por medio de un deposito implantado. El termino parenteral tal como se usa en el presente documento incluye tecnicas de inyeccion o infusion subcutanea, intracutanea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraneal. En una realizacion preferida, la composicion se inyecta en el tejido desfigurante. En el caso de las enfermedades de Peyronie o Duputyren o la capsulitis adhesiva, la composicion se inyecta en el cordon o la placa. El termino "administracion local" se define en el presente documento para abarcar dicha inyeccion directa.
Asimismo, se pueden obtener resultados particularmente buenos inmovilizando el sitio de inyeccion despues de la administracion. Por ejemplo, el sitio de administracion se puede inmovilizar durante 4 horas o mas.
Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables esteriles, pueden formularse de acuerdo con la tecnica conocida usando aquellos agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspension adecuados. La preparacion inyectable esteril tambien puede ser una solucion, suspension o emulsion inyectable esteril en un diluyente o disolvente atoxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solucion en 1, 3-butanodiol. Entre los vehmulos y disolventes aceptables que pueden emplearse estan el agua, solucion de Ringer, U. S. P. y solucion de cloruro sodico isotonica. Ademas, se usan convencionalmente aceites fijos esteriles en forma de un disolvente o un medio de suspension. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite suave no volatil, incluyendo mono o digliceridos sinteticos. Ademas, se usan acidos grasos tales como acido oleico en la preparacion de los inyectables.
Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtracion a traves de un filtro de retencion de bacterias o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones solidas esteriles que pueden disolverse o dispersarse en agua esteril u otro medio inyectable esteril antes de su uso. Las soluciones esteriles tambien se pueden liofilizar para su uso posterior.
Las formas de dosificacion para administracion topica y/o transdermica de un compuesto de la presente invencion pueden incluir pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, pulverizados, inhalantes o parches. El componente activo se premezcla en condiciones esteriles con un transportador farmaceuticamente aceptable y cualquier conservante o tampon necesario, segun se requiera.
Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, ademas del compuesto activo de la presente invencion, excipientes tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidon, tragacanto, los derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, acido silfcico, talco y oxido de cinc, o mezclas de los mismos.
Los polvos y pulverizaciones pueden contener, ademas de los compuestos de la presente invencion, excipientes tales como lactosa, talco, acido silfcico, hidroxido de aluminio, silicatos calcicos y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Las pulverizaciones pueden contener ademas propelentes habituales tal como clorofluorohidrocarburos.
Los parches transdermicos tienen la ventaja anadida de proporcionar un suministro controlado de un compuesto al organismo. Dichas formas de dosificacion pueden prepararse disolviendo o dispensando el compuesto en el medio adecuado. Tambien se pueden usar potenciadores de la absorcion para aumentar el flujo del compuesto a traves de la piel. La velocidad puede controlarse proporcionando una membrana de control de la velocidad o dispersando el compuesto en una matriz polimerica o gel.
En una realizacion preferida, la composicion de colagenasa de la invencion es una composicion inyectable liofilizada formulada con lactosa. En una realizacion, cada miligramo de colagenasa inyectable se formula con 1,9 mg de lactosa. En otra realizacion, cada miligramo de colagenasa de inyeccion tiene preferentemente aproximadamente 2800 unidades SRC y 51000 unidades medidas con un ensayo de potencia utilizando un sustrato sintetico, pzGPGGPA.
En otra realizacion preferida, la composicion de colagenasa de la invencion es una composicion inyectable liofilizada formulada con sacarosa, Tris a un nivel de pH de alrededor de 8,0. Mas preferentemente, 1,0 mg de la composicion de colagenasa de la invencion se formula en sacarosa 60 mM, Tris 10 mM, a un pH de aproximadamente 8,0 (esto equivale a 20,5 mg/ml de sacarosa y 1,21 mg/ml de Tris en el tampon de formulacion). Ejemplos de algunas de las formulaciones incluyen, pero sin limitacion: para una dosis de 0,58 mg del farmaco, se agregan 18,5 mg de sacarosa y 1,1 mg de Tris en cada vial, donde el objetivo de un volumen de llenado del vial es 0,9 ml; y para una dosis de 0,58 mg del farmaco, 12,0 mg de sacarosa (multicompendial) y 0.7 mg de Tris (multicompendial).
Se proporcionan metodos para tratar enfermedades mediadas por colageno que comprenden la etapa de administrar a un paciente que lo necesite, una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion de la invencion, o una cantidad terapeuticamente eficaz de una formulacion farmaceutica de la invencion. Por "cantidad terapeuticamente eficaz" de un compuesto de la invencion se entiende una cantidad del compuesto que confiere un efecto terapeutico al sujeto tratado, con una relacion beneficio/riesgo razonable aplicada a cualquier tratamiento medico.
El efecto terapeuticamente eficaz puede ser objetivo (es decir, medible mediante alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto proporciona una indicacion de o percibe un efecto). Las dosis efectivas tambien variaran dependiendo de la via de administracion, asf como la posibilidad de uso conjunto con otros agentes. Se entendera, sin embargo, que el uso diario total de las composiciones de la presente invencion se decidira por el medico a cargo del tratamiento dentro del alcance del buen juicio medico. El nivel terapeuticamente espedfico de dosis eficaz para cualquier paciente concreto dependera de una diversidad de factores, incluyendo el trastorno que se este tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto espedfico empleado; la composicion espedfica empleada; la edad, el peso corporal, el estado de salud general, genero y dieta del paciente; el tiempo de administracion, la ruta de administracion y la tasa de excrecion del compuesto espedfico empleado; la duracion del tratamiento; los farmacos usados en combinacion o simultaneamente con el compuesto espedfico empleado; y factores similares bien conocidos en la practica medica.
El farmaco para la colagenasa inyectable consiste en dos colagenasas microbianas, denominadas colagenasa AUX I y colagenasa ABC I y colagenasa AUX II y colagenasa ABC II. Se entiende que los terminos "Colagenasa I", "ABC I", "AUX I", "colagenasa AUX I" y "colagenasa ABC I" significan lo mismo y se pueden usar indistintamente. De manera similar, los terminos "Colagenasa II", "ABC II", "AUX II", "colagenasa a Ux II" y "colagenasa ABC II" se refieren a la misma enzima y pueden tambien usarse indistintamente. Estas colagenasas son secretadas por celulas bacterianas. Se afslan y se purifican a partir del sobrenadante de cultivo de Clostridium histolyticum mediante metodos cromatograficos. Ambas colagenasas son proteasas especiales y comparten el mismo numero de EC (E.C 3.4.24.3).
La colagenasa AUX I tiene una unica cadena polipeptidica que consta de aproximadamente 1000 aminoacidos con un peso molecular de 115 kDa. La colagenasa AUX II tiene tambien una unica cadena polipeptfdica que consta de aproximadamente 1000 aminoacidos con un peso molecular de 110 kDa.
Aunque la bibliograffa indica que existen homologfas de secuencia en las regiones de la colagenasa AUX I y AUX II, los dos polipeptidos no parecen tener reactividad cruzada inmunologica como lo indica el analisis de transferencia Western.
El farmaco (concentrado de colagenasa) tiene una proporcion de masa de aproximadamente 1 a 1 para la colagenasa AUX I y AUX II. El concentrado de colagenasa tiene un coeficiente de extincion de 1,528.
Ejemplos
Las composiciones y procesos de la presente invencion se comprenderan mejor en conexion con los siguientes ejemplos, que pretenden ser solo una ilustracion y no limitan el alcance de la invencion. Diversos cambios y modificaciones a las realizaciones divulgadas seran evidentes para los expertos en la materia y tales cambios y modificaciones que incluyen, sin limitacion, aquellos relacionados con las formulaciones de la invencion pueden hacerse sin alejarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
PROCESO 2:
Proceso de fermentacion
Este trabajo se propuso desarrollar un proceso de fermentacion que tema como objetivo proporcionar un rendimiento objetivo de 250 m /l de colagenasas ABC I y II totales a partir del proceso de fermentacion a escala de 5 litros en un medio de crecimiento de componentes libres de animales. Se analizaron varias fuentes de nitrogeno alternativas potenciales para ver si teman algun efecto en la expresion de colagenasa y en el componente de fitona que se usa actualmente en los medios de crecimiento. Un experimento que compara las productividades de dos cepas de C. histolyticum, 004 y 013, fue determinar cualquier diferencia entre las dos cepas con respecto a las cineticas de crecimiento, la productividad de la colagenasa y la produccion de proteasas contaminantes cultivadas en un medio derivado de animales. Esta comparacion resalto diferencias significativas entre el crecimiento de la cepa de C. histolyticum en medios derivados de animales en lugar de medios de crecimiento libres de animales.
Los resultados anteriores describieron que se demostro que el aumento de las concentraciones de fitona y extracto de levadura soportan concentraciones mas altas de biomasa y, por lo tanto, niveles mas altos de expresion de colagenasa total. En un intento por aumentar aun mas las concentraciones de biomasa y la productividad total de colagenasa de los medios de fermentacion discontinua optimizados, se diseno una estrategia de fermentacion discontinua alimentada. Se realizaron dos fermentaciones de 5 litros, una con una alta concentracion de medios en la fase discontinua seguida de una fase de alimentacion discontinua de baja concentracion, la segunda con una baja concentracion de medios en la fase discontinua seguida de una fase de alimentacion de alta concentracion. Ambas fermentaciones produjeron altas concentraciones de biomasa, sin embargo, la fase discontinua de alta concentracion mostro niveles relativamente bajos de expresion de colagenasa. La fermentacion discontinua de baja concentracion mostro niveles muy altos de expresion de colagenasa (~ 280 mg/l), sin embargo, este cultivo tambien produjo cantidades significativas de la proteasa contaminante, clostripama.
Aunque la fermentacion discontinua de baja concentracion dio muy buenos resultados con respecto a la expresion de las colagenasas, la solucion de alimentacion de extracto de levadura y fitona altamente concentrada fue muy diffcil de preparar. Se realizaron dos fermentaciones adicionales, la primera fue una repeticion de la anterior fermentacion discontinua alimentada exitosa, la segunda tema una composicion de medios de fase discontinua de concentracion ligeramente mas alta con una solucion de alimentacion concentrada inferior. Ambas fermentaciones lograron concentraciones de biomasa similares y mostraron el mismo perfil de expresion de las colagenasas y clostripama. La cantidad de colagenasa producida se estimo nuevamente en aproximadamente 280 mg/l en ambas fermentaciones. Sin embargo, estas fermentaciones produjeron cantidades significativas de la proteasa clostripama contaminante.
Se evaluo una seleccion de fuentes de nitrogeno alternativas por su capacidad para reemplazar la fitona peptona utilizada en la estrategia de fermentacion discontinua alimentada. El C. histolyticum crecio extremadamente bien en las peptonas vegetales alcanzando densidades opticas (600 nm) de 4 a 5 unidades. Sin embargo, el analisis SDS-PAGE de estas fermentaciones no mostro expresion de colagenasa ni clostripama. Debido al exuberante crecimiento celular observado en estas peptonas, se penso que la concentracion de una fuente de nitrogeno compleja era demasiado alta, dando como resultado una inhibicion de la expresion de proteasas. Por lo tanto, se llevo a cabo un segundo conjunto de fermentaciones utilizando las peptonas alternativas a 50 g/l en una estrategia discontinua. Cuando las fermentaciones se analizaron mediante SDS-PAGE, no se volvio a ver la expresion de colagenasa ni clostripama. Una fermentacion discontinua alimentada con fitona peptona se complemento con tres aminoacidos, glutamina, triptofano y asparagina. Estos aminoacidos se identificaron como presentes en cantidades mas bajas en los medios no animales. El perfil de crecimiento de la fermentacion fue muy similar al de la fermentacion discontinua alimentada sin suplementacion de aminoacidos. El analisis de SDS-PAGE mostro un rendimiento similar de colagenasa pero un nivel ligeramente mas bajo de clostripama. El ensayo de clostripama mostro una actividad reducida en el amino suplementado cuando se comparo con el control de la fermentacion discontinua alimentada. La reduccion en la actividad de clostripama aunque todavfa era significativa no fue tan grande como la diferencia entre los medios animales y no animales.
La evaluacion de la etapa de recuperacion primaria de las colagenasas utilizando precipitacion con sulfato de amonio se llevo a cabo en filtrados de 0,2 pm de los sobrenadantes de fermentacion brutos. El objetivo aqu era ayudar a aumentar el rendimiento de colagenasa e, idealmente, disminuir la cantidad de clostripama que se llevo a cabo a traves del proceso. Inicialmente, se evaluaron concentraciones de sulfato de amonio de 100 a 400 g/l. El sulfato de amonio a 400 g/l produjo una recuperacion significativa de colagenasa. Se realizo un estudio adicional con un intervalo mas alto de sulfato de amonio (400 - 520 g/l). Ademas, tambien se investigo el efecto de disminuir el pH a 6,0 y de oxigenar los medios antes de la precipitacion. No se observaron diferencias ni en la cantidad de colagenasas ni de clostripama recuperadas del sobrenadante en cualquiera de estas condiciones. El sedimento generado a partir de 400 g/l de sulfato de amonio fue el mas facil de resuspender.
El estudio para comparar las dos cepas de C. histolyticum (004 y 013) mostro que la productividad de las colagenasas de los medios derivados de animales era menor que la de los medios optimos no derivados de animales. El analisis de SDS-PAGE, apoyado por un ensayo enzimatico para la actividad de clostripama, destaco que habfa cantidades significativamente mas bajas de clostripama en el material producido a partir de los medios derivados de animales que de los medios no animales. Esto destaco el hecho de que la materia prima producida a partir de la fermentacion de medios no derivados de animales era una materia prima significativamente diferente de la fermentacion utilizando medios derivados de animales con respecto a la produccion de proteasas contaminantes.
1er conjunto de fermentaciones discontinuas alimentadas- DCFT24
Los resultados del trabajo de desarrollo del proceso mostraron que el uso de un medio enriquecido (100 g/l de fitona peptona y 50 g/l de extracto de levadura) daba lugar a la expresion de mayores cantidades de colagenasas en comparacion con el medio original (50 g/l fitona peptona y 8,5 g/l de extracto de levadura). Ademas, inicialmente parecfa que reducfa las cantidades de clostripama producida.
A continuacion, se realizaron dos fermentaciones de 5 L. En primer lugar, la estrategia consistio en una fase discontinua larga/fase discontinua alimentada corta, mientras que el segundo consistio en una fase discontinua corta/fase discontinua alimentada larga. En ambas estrategias al final de la fermentacion (despues de 20 h), las concentraciones de fitona peptona y de extracto de levadura fueron de 100 g/l y 50 g/l, respectivamente, como en el caso de las fermentaciones discontinuas. Las tablas 1 y 2 detallan las recetas de medios y las estrategias utilizadas.
T l 1 R m i r i lim n i n i nin
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La Figura 1 muestra las curvas de crecimiento (DO600nm frente al tiempo) de las dos fermentaciones, mientras que la Figura 2 muestra las curvas de crecimiento neto (DO600nm neta frente al tiempo). Se observo que las celulas de la primera fermentacion crecieron muy rapido y alcanzaron su DO maxima despues de aproximadamente 10 horas. Esto se debio al hecho de que los medios en la fase discontinua eran muy ricos. Durante la fase de alimentacion discontinua, las celulas no parecieron crecer. Los valores de DO disminuyeron ligeramente, lo que podna atribuirse en parte al hecho de que las celulas estaban muriendo y al efecto de dilucion de la alimentacion en el fermentador. Para la segunda fermentacion, la fase de alimentacion discontinua se inicio despues de 6 horas. En ese punto, el valor de DO habna sido bajo, como lo sugiere la curva de crecimiento en la Figura 1. Las celulas continuaron creciendo lentamente hasta aproximadamente 18 horas.
Se observo que las curvas de crecimiento neto en la Figura 2 sugenan que las densidades celulares en la fermentacion de DCFT24b eran mas altas que en la fermentacion de DCFT24a. La DO600nm de los medios antes de la inoculacion fue de aproximadamente 1,7, mientras que en DCFT24b fue de aproximadamente 0,4. Estas diferencias se deben al hecho de que cuando los fermentadores se autoclavan, se forma un precipitado. Para la DCFT24a, se formaron mayores cantidades en comparacion con DCFT24b.
Geles de SDSPAGE:
Se llevo a cabo un analisis SDS PAGE (geles de Tris-glicina al 8%) de las muestras de sobrenadante para cada una de las dos fermentaciones. Los geles se muestran en la Figura 3 y 4. Tambien se produjo un gel de SDS PAGE semicuantitativa para la muestra del momento de cosecha de la segunda fermentacion.
El analisis de gel de SDS PAGE en la Figura 4 indico que se expresaron cantidades muy bajas de colagenasas. Esto podna deberse al hecho de que las celulas crecieron muy rapido durante la fase discontinua y, como resultado, se alcanzo la concentracion maxima de celulas despues de aproximadamente 10 horas. Por el contrario, se observo un alto nivel de expresion de colagenasa en la segunda fermentacion, probablemente debido al hecho de que las celulas crecieron mas lentamente durante la fase discontinua corta y continuaron creciendo durante la fase de alimentacion discontinua. Por lo tanto, se divulga un metodo de fermentacion mejorado para C. his en el que el crecimiento celular se controla y se ralentiza durante la fase de lotes cortos y el crecimiento continuo durante la fase de lotes alimentados. Se define que crecimiento lento significa que la tasa de crecimiento durante la fase de lote corto no da como resultado una concentracion celular maxima antes de la fase de lote alimentado, tal como dentro de aproximadamente 10 horas desde el inicio del proceso de fermentacion. La tasa de crecimiento puede ser aproximadamente la resultante del segundo ciclo de fermentacion descrito en el presente documento.
Las productividades estimadas de la colagenasa a partir del gel de SDS PAGE semicuantitativa en el momento de cosecha del segundo ciclo de fermentacion (Figura 5) fueron 132 mg/l para la colagenasa ABC I y 158 mg/l para la colagenasa ABC II. Al comparar estos valores con los obtenidos previamente, hay un aumento de aproximadamente 3 veces en los niveles de expresion usando la estrategia de alimentacion discontinua.
La siguiente etapa fue realizar un conjunto adicional de fermentaciones discontinuas alimentadas utilizando estrategias y medios de alimentacion discontinua ligeramente modificados. El objetivo era mejorar la escalabilidad y la consistencia del proceso de fermentacion.
La receta del medio para esta fermentacion fue la misma que la anterior, con la excepcion de que la fitona peptona y el extracto de levadura en la fase discontinua se esterilizaron por filtracion en lugar de autoclavarse. Esto se hizo con el fin de evitar el autoclave del extracto de levadura y la fitona, que potencialmente pueden afectar su composicion por el calor y la desnaturalizacion de las protemas en los medios. Para la fermentacion de DCFT26b, se incremento la cantidad de extracto de levadura y fitona peptona. Esto se hizo para que la concentracion de extracto de levadura y peptona en la alimentacion fuera menor que en DCFT26a y, por lo tanto, mas facil de preparar y de esterilizar por filtracion. Para ambas fermentaciones, la estrategia seguida fue la misma, una fase discontinua de 6 h seguida de una fase de alimentacion discontinua de 14 h. Las Tablas 3 y 4 presentan las recetas de los medios, mientras que en la Figura 6 la estrategia usada para ambas fermentaciones.
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La Figura 7 muestra las curvas de crecimiento (DO600nm frente al tiempo) de las dos fermentaciones, mientras que la Figura 8 muestra las curvas de crecimiento neto (DO600nm neta frente al tiempo).
Las curvas de crecimiento para DCFT26a y DCFT26b fueron muy similares a las de DCFT24b que se muestran en la Figura 2. Las celulas crecieron lentamente durante la fase de alimentacion discontinua y alcanzaron una DO600nm neta final de aproximadamente 3,5.
Geles de SDS PAGE de muestras de fermentacion:
Se llevo a cabo un analisis SDS PAGE (geles de Tris-glicina al 8%) de las muestras de sobrenadante para cada una de las dos fermentaciones (Figura 9 y Figura 10). Ademas, Con el fin de obtener una mejor estimacion de la cantidad de colagenasas, se llevo a cabo un gel de SDS PAGE semicuantitativa para la muestra del momento de la cosecha de DCFT26a (Figura 11) y DCFT26b (Figura 12).
En ambas fermentaciones, los niveles de colagenasas fueron similares a los de DCFT24b (Figura 3). El gel de SDS PAGE semicuantitativa muestra que se obtuvieron niveles muy similares a DCFT24b (entre 280 mg/l a 300 mg/l de colagenasa total) tanto para DCFT26a como para DCFT26b. El momento de cosecha del ciclo de fermentacion de DCFT26a (Figura 11) fue ~ 142 mg/l para colagenasa I y ~ 132 mg/l para colagenasa II. El momento de cosecha del ciclo de fermentacion de DCFT26b (Figura 12) fue ~ 147 mg/l para colagenasa I y ~ 158 mg/l para colagenasa II. Los niveles de clostripama, como en el caso de DCFT24b, segrnan siendo altos.
Estudio de la etapa de precipitacion con sulfato de amonio:
Los resultados de estas fermentaciones indicaron que aunque los niveles de colagenasas eran altos usando la estrategia de alimentacion discontinua, los niveles de clostripama tambien eran significativamente altos. Por lo tanto, se establecio un estudio experimental a pequena escala para investigar el efecto de la concentracion de sulfato de amonio en las cantidades recuperadas de clostripama y colagenasas en el sedimento precipitado del sobrenadante de fermentacion filtrado.
Con el fin de evaluar la eficacia de la etapa de precipitacion con sulfato de amonio, se cosecharon 6 muestras de sobrenadante de 100 ml de la fermentacion de DCFT26a. Estas muestras se precipitaron con 6 concentraciones diferentes de sulfato de amonio como se detalla en la siguiente tabla. Los sedimentos se resuspendieron en 3,3 ml de API y se dializaron frente a K2HPO4100 mM (pH 6,7).
Tabla 5 Concentraciones de sulfato de amonio que se utilizaron para precipitar muestras de sobrenadante de 100 ml de DCFT26a.
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Las muestras post-dializadas se analizaron a continuacion por analisis SDS PAGE. Figura 13: muestra del momento de cosecha post-dializado precipitada con 15% y 22.5% Figura 14: muestra del momento de cosecha post-dializado precipitada con 30 % y 37.5 % Figura 15: muestra del momento de cosecha post-dializada precipitada con 45% y 60%
Los geles muestran que, en el caso de que el sulfato de amonio utilizado era entre 15% y 45% de saturacion, los niveles de colagenasas en las muestras post-dializadas fueron muy bajos. La recuperacion en estos casos pareda ser inferior al 5%.
En el caso en que se uso una saturacion del 60% de sulfato de amonio (400 g/l), los niveles de colagenasas en la muestra post-dializada fueron muy altos (Figura 15). Al comparar la intensidad de las bandas (muestra frente a referencias), se puede estimar que estaban presentes aproximadamente 70 mg/l para cada una de las colagenasas en la muestra post-dializada. Esto sugiere una recuperacion de alrededor de 50 a 60%, ya que de acuerdo con el gel de semi-cuantificacion para DCFT26a (Figura 11) habfa aproximadamente 130 mg/l de cada una de las colagenasas en la muestra del momento de cosecha. Por lo tanto, la presente divulgacion se refiere al uso de la receta de medios (por supuesto, las cantidades que se exponen en ella son aproximadas) expuesta anteriormente en DCFT26b y el uso de sulfato de amonio para precipitar la colagenasa en donde se agregan aproximadamente 400 g/l de sulfato de amonio al medio que contiene colagenasa.
3er conjunto de fermentaciones discontinuas alimentadas
Aqm, el objetivo principal era evaluar la reproducibilidad de la estrategia desarrollada de alimentacion discontinua. Se realizo una fermentacion discontinua alimentada que fue una fermentacion repetida de DCFT26b. Ademas, las etapas de sulfato de amonio/precipitacion se investigaron con mas detalle en comparacion con el estudio anterior a pequena escala. Mas espedficamente, el objetivo fue examinar el efecto de varias concentraciones de sulfato de amonio, desde 60% (400 g/l) hasta 80% (530 g/l) en la recuperacion de colagenasas y clostripama en las muestras post precipitadas/dializadas. Ademas, Ademas, tambien se evaluaron dos metodos para tratar las muestras de sobrenadante cosechadas, es decir, cambiar el pH y oxigenar los medios.
Curva de crecimiento:
La estrategia de medios y de alimentacion discontinua utilizada fue exactamente la misma que en DCFT26b. La Figura 16 muestra la curva de crecimiento (DO600nm frente al tiempo) y la curva de crecimiento neto (DO600nm frente al tiempo) de la fermentacion. La curva de crecimiento fue muy similar a la de DCFT26b, lo que indica la buena reproducibilidad del proceso.
El analisis SDS PAGE (geles de Tris - glicina al 8%) de las muestras de sobrenadante tomadas durante la fermentacion indico que los niveles de colagenasas y clostripama eran muy similares a los de DCFT26b (no se muestra el gel de SDS PAGE). Se realizo un gel de SDS PAGE semicuantitativa (gel Tris - glicina al 8%) para la muestra del momento de cosecha (Figura 17). El gel sugiere que hay mas de 120 mg/l de cada una de las colagenasas presentes, similar a los niveles observados en DCFT26b.
Precipitacion con sulfato de amonio de las muestras de la cosecha de fermentacion:
Con el fin de evaluar la eficacia de la etapa de precipitacion con sulfato de amonio, se cosecharon 7 muestras de sobrenadante de 500 ml. Estos se precipitaron utilizando los siguientes seis metodos.
En todos los casos, los sedimentos se resuspendieron en 16,5 ml de API y se dializaron frente a K2HPO4100 mM (pH 6,7), con la excepcion del metodo 4, donde el sedimento se resuspendio en 16,5 ml de K2HPO4 (pH 6) 100 mM y se dializo frente al mismo tampon. A continuacion se realizaron geles de SDS PAGE para estimar las cantidades de colagenasas en las muestras post-dializadas y evaluar la recuperacion de las etapas de precipitacion/dialisis.
Los metodos de precipitacion/dialisis seguidos son los siguientes:
1 Precipitacion con 400 g/l de sulfato de amonio agregado de una vez en la muestra del sobrenadante. Dialisis contra K2HPO4J 00 mM, pH 6,7.
2 Precipitacion con 400 g/l de sulfato de amonio agregado lentamente (aproximadamente 30 minutos) en la muestra del sobrenadante. Dialisis contra K2HPO4J 00 mM, pH 6,7.
3 Precipitacion con 400 g/l de sulfato de amonio agregado lentamente (aproximadamente 30 minutos) en la muestra del sobrenadante, que estaba previamente oxigenado. Esto se realizo mediante la oxigenacion durante aproximadamente 10 minutos de 500 ml de cultivo celular cosechado del fermentador. El cultivo fue esterilizado a continuacion por filtracion. El sedimento formado despues de la precipitacion con sulfato de amonio se dializo frente a 100 mM de K2HPO4 a pH 6,7.
4 Precipitacion con 400 g/l de sulfato de amonio agregado lentamente (aproximadamente 30 minutos) en la muestra del sobrenadante, cuyo pH se ajusto a pH 6 anadiendo HCl 5N. El sedimento formado despues se dializo frente a K2HPO4100 nM, pH 6.
5 Precipitacion con 440 g/l de sulfato de amonio agregado lentamente (aproximadamente 30 minutos) en la muestra del sobrenadante. Dialisis contra K2HPO4,100 mM, pH 6,7.
6 Precipitacion con 480 g/l de sulfato de amonio agregado lentamente (aproximadamente 30 minutos) en la muestra del sobrenadante. Dialisis contra K2HPO4,100 mM, pH 6,7.
7 Precipitacion con 520 g/l de sulfato de amonio agregado lentamente (aproximadamente 30 minutos) en la muestra del sobrenadante. Dialisis contra K2HPO4,100 mM, pH 6,7.
El sulfato de amonio no se disolvio completamente cuando se agrego a 480 g/l y 520 g/l en las muestras de sobrenadantes, mientras que se disolvio completamente cuando se agrego a 400 g/l y 440 g/l.
Los resultados de la SDS PAGE indicaron que los diferentes niveles de sulfato de amonio utilizados para la etapa de precipitacion (400 g/l, 440 g/l, 480 g/l, 520 g/l) o los otros metodos utilizados (oxigenacion, cambio de pH). ) no parecen tener un efecto obvio sobre las cantidades de colagenasas presentes en las muestras post dializadas. En todos los casos, la concentracion de cada una de las colagenasas en las muestras post dializadas oscilo entre 50 mg/l y 60 mg/l. La Figura 18a muestra un gel de SDSPAGE representativo, como el de la muestra post dializada precipitada con 400 g/l de sulfato de amonio. Debido a que todos los geles fueron muy similares, los otros geles SDS PAGE no se presentan en este informe.
Teniendo en cuenta las concentraciones estimadas de colagenasas en la muestra del momento de cosecha (Figura 17) y en las muestras post dializadas, la recuperacion de la colagenasa despues de las etapas de precipitacion/dialisis fue de aproximadamente el 50%. Con el fin de investigar si el valor de recuperacion del 50% fue exacto, debido a que el error en la estimacion de la concentracion de colagenasa por gel SDS es en general alto, se llevaron a cabo los siguientes geles de SDS PAGE.
• Un gel de SDS PAGE de todos los sobrenadantes despues de la centrifugacion de las muestras precipitadas con sulfato de amonio (Figura 18a). El objetivo era evaluar si se pierde alguna cantidad de colagenasas en el sobrenadante.
• Un gel de SDS PAGE en el que la muestra de sobrenadante del momento de cosecha y la muestra precipitada con sulfato de amonio post dializada (400 g/l) se diluyeron adecuadamente para contener cantidades iguales de colagenasas y se cargaron en el mismo gel (Figura 19).
• Un gel de SDS PAGE en el que la muestra de sobrenadante del momento de cosecha y la muestra precipitada con sulfato de amonio post dializada (520 g/l) se diluyeron adecuadamente para contener cantidades iguales de colagenasas y se cargaron en el mismo gel (Figura 20).
Se puede ver en la Figura 18b que la cantidad de colagenasas presentes en los sobrenadantes despues de la centrifugacion de las muestras precipitadas con sulfato de amonio era muy baja. En la Figura 19 y la Figura 20, la cantidad de colagenasas despues de las etapas de precipitacion/dialisis parecio ser muy similar a la de la muestra de cosecha del sobrenadante. Por lo tanto, era probable que el valor de recuperacion que se obtuvo al comparar los geles de SDS PAGE semicuantitativa del sobrenadante y de las muestras post-dializadas fuera realmente mayor. Analisis comparativo de experimentos de fermentacion con TSB/proteosa de origen animal:
Se realizaron fermentaciones de las cepas de C. histolyticum 013 y 004 en los medios que contienen componentes derivados de animales. El objetivo era comparar la cepa 013 con la cepa 004 y evaluar el efecto de los componentes animales sobre el crecimiento celular, la expresion de colagenasa y sobre los niveles de contaminantes.
C. histolyticum 013:
La cepa liofilizada se reconstituyo en PBS y se coloco en placas de agar TSB/Proteosa (30 g/l de TSB, 10 g/l de proteosa peptona, 12 g/l de agar. Las placas se incubaron en un recipiente anaerobico en presencia de paquetes de gas anaerobico. Se seleccionaron colonias individuales y se usaron para inocular 5 ml de medio TSB/Proteosa. Despues de 15 horas de incubacion a 37 °C, la DO600nm del cultivo fue de aproximadamente 1,0 unidad. A continuacion se mezclaron 5 ml de cultivo con 1 ml de solucion esteril y se almacenaron por debajo de -70 °C.
Fermentaciones de PBFT58
Curvas de crecimiento:
Se llevaron a cabo dos fermentaciones discontinuas de 5 litros, de PBFT58c (cepa 004) y PBFT58d (cepa 013). La tabla 6 presenta la receta de los medios TSB/Proteosa utilizados. La Figura 21 muestra las curvas de crecimiento obtenidas (DO600nm frente al tiempo).
T l R r l m i T BPr
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Se vio en la Figura 21 que la cepa 013 crecio a una DO mas alta que la cepa 004. En ambos casos, sin embargo, la DO600nm final fue superior a 2,5, lo que indica que los medios derivados de animales soportaron un buen crecimiento para ambas cepas.
Se observo que la cepa 013 continuo creciendo lentamente hasta el momento de cosecha (20 horas) mientras que la cepa 004 crecio hasta una DO600nm neta de aproximadamente 2,7 y a continuacion, dejo de crecer. En comparacion con las fermentaciones discontinuas alimentadas por lotes presentadas anteriormente, utilizando los medios no derivados de animales, la DO final obtenida utilizando los medios de TSB/Proteosa derivados de animales fue menor.
Analisis SDS PAGE:
Los geles de SDS PAGE (geles de Tris-Glicina al 8%) de las muestras de sobrenadante tomadas a lo largo de las fermentaciones se muestran en la Figura 22 y la Figura 23.
No parece haber ninguna clostripama en los sobrenadantes de la fermentacion, especialmente en el caso de la cepa 013. Este fue un hallazgo muy importante ya que podna explicar el hecho de que el autor puede no haber tenido problemas o haber reducido problemas durante la purificacion de las colagenasas. Por el contrario, se habfan experimentados problemas significativos con la degradacion de las colagenasas previamente durante el proceso de purificacion. Esto podna atribuirse en parte a la presencia de clostripama en la fermentacion.
Para obtener una mejor estimacion de la cantidad de colagenasas presentes en las fermentaciones, se llevo a cabo un gel de SDS PAGE semicuantitativa para las muestras del momento de cosecha (Figura 24 y Figura 25). Los geles sugieren que se produjo una menor cantidad de colagenasas en las fermentaciones discontinuas con los medios TSB/Proteosa (PBFT58c) en comparacion con la fermentacion discontinua alimentada con los medios vegetales (PBFT57). Esto podna atribuirse al hecho de que se obtuvieron densidades celulares mas altas en el ultimo caso (DO600nm ~ 4 a DO600nm ~ 2.7). La Tabla 7 resume los resultados de los geles semi-cuantitativos.
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Precipitacion con sulfato de amonio de las muestras de la cosecha de fermentacion:
Para cada fermentacion, se precipitaron 2 muestras de 500 ml del momento de cosecha con 400 g/l (60%) y 520 g/l (80%) de sulfato de amonio. Los sedimentos se resuspendieron en 16,5 ml de API y se dializaron contra K2HPO4 100 mM (pH 6,7). A continuacion se realizo un analisis SDS PAGE (geles de Tris-glicina al 8%) de las muestras post-dializadas (Figura 26 y Figura 27).
Los resultados de estos geles indicaron que los niveles de clostripama, incluso en las muestras post-dializadas muy concentradas (carriles 6 y 7 de las Figuras 26 y 27) eran extremadamente bajos. Esto es mas evidente en el caso de la cepa 013 en comparacion con la cepa 004.
Por lo tanto, la invencion se refiere a composiciones de colagenasa que estan libres de clostripama, tales como las producidas por los procesos de fermentacion descritos en el presente documento.
Medicion de la actividad de la clostripama:
Con el fin de investigar mas a fondo el papel de clostripama, se establecio un ensayo enzimatico para medir la actividad de clostripama de muestras post dializadas. Se utilizo el siguiente metodo:
Ensayo enzimatico de clostripama:
Clostripama
B A E E H 2O ----------► N-a Benzoil-L-Arginina Etanol
BAEE = Ester Etilico de N-a-benzoilo-L-arginina
Condiciones: T = 25 °C, pH = 7,6, A253nm, Trayectoria de la luz = 1 cm
Metodo: Determinacion de la Velocidad Espectrofotometrica Continua
Definicion de la unidad: Una unidad hidrolizara 1,0 pmol de BAEE por minuto a pH 7,6 a 25 °C en presencia de DTT 2,5 mM.
Analisis de muestras post dializadas para la actividad de la clostripama:
El ensayo de la actividad de la clostripama se uso para analizar las muestras post-dializadas de las fermentaciones con el TSB/Proteosa (PBFT58) y la fermentacion discontinua alimentada basada en vegetales (PBFT57). La tabla 8 resume los resultados.
Los resultados demuestran que hubo muy poca actividad de clostripama en el caso de las fermentaciones en TSB/Proteosa. En contraste, la actividad de clostripama en el caso de la fermentacion discontinua alimentada de PBFT58 fue muy alta.
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Investigacion de peptonas alternativas
Experimentos de analisis en matraz de agitacion:
En este trabajo se utilizaron varias peptonas vegetales como alternativas a la fitona peptona. El objetivo fue evaluar su efecto sobre los niveles de expresion de las colagenasas y de la clostripama. Todas las peptonas probadas derivan de fuentes vegetales y son comercializadas por Sigma.
El procedimiento experimental utilizado se describe en la Figura 28. Las recetas de los medios se detallan en la Tabla 9, mientras que se muestra una lista de las peptonas utilizadas en la Tabla 10. Tambien se realizo un matraz de agitacion de control, que contema fitona peptona. En todos los casos, se utilizaron 50 g/l de extracto de levadura y 100 g/l de cada peptona en un esfuerzo por imitar las concentraciones de estos componentes en el momento de cosecha de la fermentacion discontinua alimentada desarrollada (vease la Tabla 4).
Tabla 9 Composicion de los medios utilizados en el experimento matraz de agitacion. Todos los medios fueron riliz r filr i n.
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Los matraces de agitacion se incubaron durante 18 horas. Los cultivos se analizaron para determinar la DO600nm y los recuentos de celulas viables. Los cultivos se filtraron y los sobrenadantes se analizaron mediante SDS PAGE. Los resultados de las mediciones de DO600nm y los recuentos de celulas viables se resumen en la Tabla 10.
La mayona de las peptonas vegetales dieron como resultado valores netos mas altos de DO en comparacion con la fitona peptona. Sin embargo, los valores de DO no se correlacionaron con los recuentos de celulas viables. Esto podna atribuirse en parte a la variabilidad del metodo de recuento de celulas viables o al hecho de que las celulas ya habfan comenzado a lisarse antes del momento de cosecha preseleccionado (18 horas).
De forma interesante, el gel de SDS-PAGE indico que no habfa expresion de colagenasa (gel no mostrado) en todos los matraces, incluyendo el de control (fitona peptona). Una posible razon para esto podna ser el hecho de que las concentraciones de la fitona peptona y del extracto de levadura utilizados fueron muy altas y, como resultado, reprimieron la expresion de colagenasas.
Tabla 10 Resultados 1er ex erimento de analisis
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Fermentaciones discontinuas alimentadas utilizando peptonas alternativas - DCFT27a, b:
Basandose en la informacion de los experimentos en matraces de agitacion anteriores de que no se observo expresion de colagenasas, se decidio evaluar las peptonas alternativas utilizando la estrategia de alimentacion discontinua desarrollada.
Se realizaron dos fermentaciones discontinuas alimentadas, DCFT27a (extracto vegetal 2) y DCFT27b (hidrolizado vegetal 2). En ambas fermentaciones se utilizo la estrategia de alimentacion discontinua desarrollada para los medios que contienen fitona peptona. La Tabla 11 describe las recetas de los medios, mientras que en la Figura 29 la estrategia utilizada.
T l 11 R m i r f rm n i n i nin lim n D FT27 D FT27
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Curvas de crecimiento:
Las curvas de crecimiento (DO600nm neta frente al tiempo) para DCFT27a y DCFT27b se muestran en la Figura 30. En ambas fermentaciones, fitona peptona las celulas crecieron a una DO600nm ligeramente superior en comparacion con los medios que contienen fitona peptona (fermentacion de PBFT57, Figura 16). Esto fue de acuerdo con los recuentos de celulas viables (aproximadamente 2 x 109 UFC/ml para DCFT27a, b en comparacion con 1,5 x 109 UFC/ml para PBFT57).
Geles de SDSPAGE:
Al igual que con los experimentos en matraz de agitacion, el analisis SDS PAGE indico que no habfa expresion de colagenasas tanto en DCFT27a como en DCFT27b (geles no mostrados).
Esto podna atribuirse al hecho de que los medios, que consisten en altas cantidades de peptona, soportan la expresion de colagenasas cuando se usa fitona peptona, pero son demasiado ricos cuando se usa una peptona alternativa y, por lo tanto, reprimen la expresion de cualquier metabolito, incluyendo colagenasa y clostripama. Parece que las celulas experimentan condiciones de crecimiento comodas en los medios que contienen las peptonas alternativas y no necesitan producir ninguna proteasa.
Fermentaciones discontinuas utilizando peptonas alternativas - PBFT59a,b,c:
Los resultados de las fermentaciones discontinuas alimentadas de DCFT27a y DCFT27b, llevaron a un trabajo adicional para investigar tres peptonas alternativas adicionales, aunque, utilizando concentraciones mas bajas que las utilizadas anteriormente.
Se realizaron tres fermentaciones discontinuas de 5 l, PBFT59a (triptona vegetal), PBFT59b (extracto vegetal) y PBFT59c (extracto vegetal N.° 1). Las fermentaciones se cosecharon despues de 18 horas.
Todas las peptonas se usaron a concentraciones de 50 g/l en un esfuerzo por imitar la concentracion de la proteosa peptona en los medios animales (proteosa/peptona) y la concentracion de fitona peptona que se uso previamente. La receta de los medios se muestra en la Tabla 12.
Tabla 12 Receta de medios y estrategia de fermentacion para fermentaciones de 5 l de PBFT59a, b, c
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Curvas de crecimiento:
Las curvas de crecimiento obtenidas de las fermentaciones de PBFT59a,b,c se muestran en la Figura 31. En todos los casos, las celulas crecieron a una DO600nm mas baja (entre 1,8 y 2,8) en comparacion con las fermentaciones discontinuas alimentadas de DCFT27. Esto tambien estuvo de acuerdo con los recuentos de celulas viables (entre 0,7 x 109 UFC/ ml y 1,2 x 109 UFC/ ml para PBFT59a,b,c en comparacion con 2 x 109 UFC/ ml para DCFT27a,b). En los medios que conteman triptona, las celulas demostraron la tasa de crecimiento mas lenta y alcanzaron la densidad celular mas baja despues de 18 horas.
Geles de SDSPAGE:
En cuanto al experimento en matraces de agitacion y las fermentaciones discontinuas alimentadas de DCFT27a, no se observo expresion de colagenasa en los geles de SDS PAGE (geles no mostrados).
Estos resultados muestran que las peptonas alternativas, aunque soportan el crecimiento celular, no permiten la expresion de colagenasas. Como se sugirio anteriormente, esto podna deberse al hecho de que estas peptonas son muy ricas en nutrientes, por ejemplo, aminoacidos libres, peptidos pequenos.
4° conjunto de fermentaciones discontinuas alimentadas- DCFT27d
Como los resultados de los experimentos que utilizaron las peptonas vegetales alternativas no tuvieron exito, el siguiente objetivo de este trabajo fue investigar la posibilidad de disminuir los niveles de clostripama en la fermentacion discontinua alimentada desarrollada utilizando los medios de fitona peptona. Como se describe previamente, la clostripama probablemente estaba causando la degradacion de las colagenasas durante el proceso de purificacion.
Se llevo a cabo una fermentacion discontinua alimentada utilizando los medios de fitona peptona convencionales complementados con tres aminoacidos, es decir, glutamina, triptofano y asparagina. Esta fermentacion se realizo porque las concentraciones de estos aminoacidos en particular eran mas bajas en la fitona peptona en comparacion con los medios de TSB/proteosa de animales, segun la composicion de aminoacidos de estos componentes, proporcionada por los fabricantes.
El objetivo aqu fue investigar si la adicion de estos aminoacidos podna reducir cualquier limitacion de nutrientes que pueda ser un factor contribuyente para la expresion de clostripama. La receta de los medios se muestra en la Tabla 13. La estrategia de fermentacion utilizada fue la estrategia convencional de alimentacion discontinua utilizada para las fermentaciones de DCFT26 y de PBFT57 (vease la Figura 6).
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Curva de crecimiento:
Las curvas de crecimiento obtenidas de la fermentacion de DCFT27d se muestran en la Figura 32. El perfil de crecimiento obtenido fue muy similar al obtenido para la fermentacion discontinua alimentada convencional en ausencia de aminoacidos (DCFT26b y PBFT57) mostrada anteriormente.
Geles de SDSPAGE:
La Figura 33a muestra el gel SDS PAGE de las muestras de sobrenadante tomadas durante la fermentacion. El nivel de colagenasas es similar al observado para la fermentacion discontinua alimentada convencional (vease la Figura 10 para el gel de SDS PAGE de DCFT26b). Aunque clostripama sigue presente en la fermentacion, pareda que su nivel era mas bajo que en DCFT26b.
Para seguir investigando esto, la actividad de clostripama de la muestra del momento de cosecha post-dializada se estimo utilizando el ensayo de la actividad de la clostripama. Ademas, tambien se estimo la actividad de la clostripama de la muestra del momento de cosecha post-dializada tomada del lote de liofilizacion de 20 l. Debido a que este lote particular se purifico sin mostrar una degradacion significativa de la colagenasa, el conocimiento de su actividad de clostripama sena informativo. La Tabla 14 resume las actividades enzimaticas de las muestras postdializadas. Tambien incluye las actividades enzimaticas para la fermentacion discontinua alimentada convencional de PBFT57 y en TSB/proteosa peptona de animales presentada en la Tabla 8, con fines comparativos.
T l 14 A ivi nzim i m r - liz
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Los resultados de DCFT27d indican que la adicion de los aminoacidos reduce la actividad de clostripama producida por la cepa. La relacion de clostripama a colagenasa es aproximadamente cuatro veces menor en la fermentacion suplementada con aminoacidos en comparacion con la fermentacion discontinua alimentada de control. La proporcion de clostripain a colagenasa en la fermentacion derivada de animales fue diez veces mas baja que la fermentacion discontinua alimentada suplementada con aminoacidos. Es posible que la reduccion de la actividad de clostripama pueda dar lugar a una reduccion significativa en la degradacion de colagenasas durante la purificacion.
Se realizaron una serie de fermentaciones de 5 litros para evaluar varias estrategias de fermentacion discontinua alimentada. Las estrategias se evaluaron en funcion de su rendimiento de colagenasa, la cantidad de contaminantes y la escalabilidad. Basandose en estos resultados, se identifico una estrategia optima de alimentacion discontinua que dio como resultado una productividad de las colagenasas totales de aproximadamente 280 mg/l. La estrategia de fermentacion se modifico incrementando ligeramente la concentracion de medios discontinuos y reduciendo la concentracion de medios alimentados para mejorar su escalabilidad. Este cambio en la estrategia de fermentacion no tuvo ningun efecto sobre la productividad o los niveles de contaminantes.
El segundo objetivo fue optimizar la etapa de recuperacion primaria de las colagenasas. La optimizacion de esta etapa implico una mejora en el rendimiento de la etapa del proceso o una reduccion en la cantidad de contaminantes recuperados o un aumento en la escalabilidad. Se evaluo un intervalo de concentraciones de sulfato de amonio de 100 a 520 g/l. Tambien se evaluo el efecto de disminuir el pH a 6,0 y de oxigenar los medios. Todas las concentraciones de sulfato de amonio por debajo de 400 g/l mostraron muy bajas recuperaciones de colagenasa. No se observaron diferencias en la recuperacion de colagenasa o clostripama en ninguna de las concentraciones de sulfato de amonio entre 400 y 520 g/l. El sedimento de la precipitacion de 400 g/l fue el mas facil de resuspender y, por lo tanto, esta concentracion se definio como el nivel optimo.
Se llevo a cabo un experimento de analisis comparativo para determinar y comparar el crecimiento y la produccion de colagenasas y clostripama en un medio derivado de animales con las cepas de C. histolyticum 013 y 004. La receta de medios derivados de animales se tomo de los medios de fermentacion del Proceso 1, utilizando TSB y proteasa peptona. Este experimento tambien permitio una comparacion de la cepa 004 cultivada en medios animales y no animales. Los resultados del analisis SDS-PAGE mostraron que cantidades mucho menores de clostripama de C. histolyticum crecieron en los medios derivados de animales. Estos resultados se confirmaron utilizando un ensayo enzimatico para determinar la actividad de clostripama. El ensayo demostro una reduccion significativa en la actividad de clostripama en fermentaciones utilizando los medios derivados de animales. Cuando se compararon las dos cepas, 004 mostro una mayor actividad de clostripama que 013.
Las selecciones de fuentes de nitrogeno alternativas se evaluaron por su capacidad para reemplazar la Fitona peptona en la estrategia de fermentacion discontinua alimentada. Estas peptonas fueron el Extracto Vegetal N.°2 (Sigma, 49869) y el Hidrolizado Vegetal N.° 2 (Sigma, 07436). El C. histolyticum crecio extremadamente bien en las peptonas vegetales, alcanzando densidades opticas (600 nm) de 4 a 5 unidades. el analisis SDS-PAGE de estas fermentaciones no mostro expresion de colagenasa ni clostripama. Debido al exuberante crecimiento celular observado en estas peptonas, se penso que la concentracion de una fuente de nitrogeno compleja era demasiado alta, dando como resultado una inhibicion de la expresion de proteasas. Por lo tanto, se llevo a cabo un segundo conjunto de fermentaciones utilizando las peptonas alternativas a 50 g/l en una estrategia discontinua. La Triptona vegetal (Sigma, 16922) Extracto vegetal (Sigma, 05138) y Extracto vegetal N.° 1 (Sigma, 04316) se usaron como peptonas alternativas para estos experimentos. Cuando las fermentaciones se analizaron por SDS-PAGE, no se observo expresion de colagenasa o clostripama. Se complemento una fermentacion discontinua alimentada utilizando Fitona peptona con tres aminoacidos, glutamina, triptofano y asparagina. Estos aminoacidos se identificaron como presentes en cantidades mas bajas en los medios no animales. El perfil de crecimiento de la fermentacion fue muy similar al de la fermentacion discontinua alimentada sin suplementacion de aminoacidos. El analisis de SDS-PAGE mostro un rendimiento similar de colagenasa pero un nivel ligeramente mas bajo de clostripama. El ensayo de clostripama mostro una actividad reducida en el amino suplementado cuando se comparo con el control de la fermentacion discontinua alimentada. La reduccion en la actividad de clostripama aunque todavfa era significativa no fue tan grande como la diferencia entre los medios animales y no animales.
Materiales y metodos:
Medios de inoculo para fermentaciones utilizando medios vegetales
A lo largo de este trabajo de desarrollo se utilizaron las siguientes recetas para los medios de inoculo. Medios de inoculo-Vegetal
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El medio fue esterilizado por filtracion
Procedimiento de inoculacion
Se descongelo un vial del banco de celulas interno y se utilizaron 0,025 ml para inocular 5 ml del medio de inoculo en un universal de 30 ml. El cultivo de 5 ml se incubo a 37 °C en un recipiente anaerobico en presencia de generadores de gas anaerobicos. Despues de aproximadamente 13 a 15 horas de incubacion, se usaron 4 ml del cultivo para inocular 200 ml del medio de inoculo en un matraz de 500 ml. Como anteriormente, el matraz se coloco en un recipiente anaerobico en presencia de generadores de gas anaerobicos. Despues de aproximadamente 13 a 15 horas de incubacion a 37 °C y 75 rpm, se utilizo el contenido total del matraz para inocular el fermentador.
El pH y la temperatura de los fermentadores se controlaron a 7,0 y 37 °C, respectivamente. El caudal de nitrogeno se ajusto a 1 l/min (~ 0,2 vvm) y la velocidad del agitador a 100 rpm. Se tomo una muestra del fermentador a intervalos de tiempo regulares para mediciones de DO600nm y recuentos de celulas viables. Las muestras se filtraron a traves de un filtro de 0,22 pm. Los filtrados se almacenaron a -20 °C y se congelaron a -20 °C para el analisis SDS PAGE. La figura 33b muestra un diagrama esquematico del procedimiento de inoculacion.
Se establece a continuacion una receta preferida para la fermentacion discontinua alimentada.
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Tambien es deseable ampliar el proceso de fermentacion adicionalmente sin restar valor a la calidad o los rendimientos de los productos de colagenasa. Por lo tanto, la presente divulgacion se refiere adicionalmente a un proceso de alimentacion discontinua de aproximadamente 200 litros, como se describe en el diagrama de flujo en la Figura 33c.
Metodo de recuento de celulas viables
Las muestras tomadas de los matraces de agitacion se diluyeron con un factor de 10-4 a 10-7 y se colocaron en placas de agar TB. Las placas se incubaron a 37 °C durante aproximadamente 48 horas en un recipiente Genbox. Se utilizo un paquete de generador de gas anaerobico para crear condiciones anaerobicas dentro del recipiente. A continuacion se conto el numero de colonias.
Precipitacion en sulfato de amonio:
Materiales: Centnfuga Sorvall Evolution
Productos qmmicos: Sulfato de amonio, grado GPR (BDH)
Las muestras de sobrenadante (100 ml a 500 ml) se filtraron a traves de un filtro de 0,22 pm. Dependiendo del experimento, se agregaron varias cantidades de sulfato de amonio (del 15% al 80% de saturacion). La solucion se mezclo lentamente en un agitador magnetico durante aproximadamente 15 minutos, hasta que se disolvio todo el sulfato de amonio. A continuacion se mantuvo sin mezclar durante ~ 3,5 horas a 2-8 °C. Despues de la etapa de espera, se formo una cantidad significativa de precipitado. La solucion se centrifugo a continuacion a 7.200 x g durante 20 minutos a 4 °C. El sobrenadante se decanto y el sedimento se almaceno a -20 °C.
Dialisis
Materiales: Agitador magnetico de tubos de dialisis MWk SnakeSkin de 10kDa (68100, Pierce)
Productos qmmicos: Ortofosfato de potasio dihidrogeno AnalaR (BDH) Agua para inyeccion (API)
Los sedimentos obtenidos de una muestra de 100 ml de sulfato de amonio se resuspendieron en 3,3 ml de API. El sedimento reconstituido se transfirio a un tubo de dialisis SnakeSkin de 10 kDa MWCO pre humedecido y se dializo contra K2HPO4100 mM (pH 6,7) durante ~ 12 a 16 horas a 2-8 °C. A continuacion se cambio el API y se continuo la dialisis durante 2 a 4 horas. El material dializado se recupero y se determino el volumen. La muestra post-dializada se almaceno a -20 °C.
Analisis SDS PAGE (geles de Tris - glicina al 8%)
Materiales: Xcell SureLock Mini-Cell
Productos qmmicos:
Patron de SDS-PAGE de alto peso molecular (161-0303, Bio Rad)
Geles de Tris-Glicina al 8% de Novex, 1,5 mm, 10 pocillos (EC6018BOX, Invitrogen)
Geles de Tris-Glicina al 8% de Novex, 1,5 mm, 15 pocillos (EC60185BOX, Invitrogen)
Tampon de ejecucion de SDS Tris-Glicina de Novex (10x) (LC2675, Invitrogen)
Tampon de muestra de SDS Tris-Glicina de Novex (2x) (LC2676, Invitrogen)
Agente de reduccion de muestras NuPAGE (10x) (NP0009, Invitrogen)
Kit de tincion de azul Coloidal (LC6025, Invitrogen)
Sal disodica del acido etilendiaminotetraacetico Analar R (BDH)
Las muestras se prepararon para la SDS-PAGE reductora mediante la adicion de 10 pl de muestra a 10 pl de tampon de muestra (2x), 2,5 pl de agente reductor (10x) y 2 pl de EDTA 0,1M (para lograr una concentracion final de 10 mM). El marcador de alto peso molecular (HMW) se preparo agregando 10 pl de solucion madre concentrada a 80 pl de agente reductor (10x), 310 pl de API y 400 pl de tampon de muestra (2x). El HMW diluido convencional se calento a continuacion a 95 °C durante 5 minutos antes de hacer alfcuotas y el almacenamiento a -20 °C para su uso en geles posteriores. Las muestras (15 pl) que conteman colagenasas se procesaron directamente (es decir, sin tratamiento termico previo) en geles de Tris-Glicina al 8% utilizando tampon de ejecucion de tris-glicina a 130 V durante aproximadamente 1 hora y 50 minutos. Tras la electroforesis, los geles se tineron con un reactivo de tincion azul coloidal segun las instrucciones del fabricante.
Proceso de Purificacion
Resumen del metodo para el proceso de purificacion de 5 l:
Etapa 1. Precipitacion con sulfato de amonio del sobrenadante de los medios de cultivo (protema secretada). Reconstitucion y dialisis en fosfato de potasio 0,1M, arginina 0,1 M pH 6,7.
Etapa 2. Cromatografia con hidroxiapatita (en presencia de leupeptina 200 j M) Eluir con un gradiente de 0-100% de fosfato potasico 0,264 M, pH 6,7 sobre 4 VC.
Los picos de elucion tardfa del grupo 2 donde A280> A260, se cargan directamente en TMAE. Etapa 3. Intercambio ionico con Fractogel TMAE (en presencia de leupeptina 200 j M) Eliminacion de acido nucleico (tambien se puede usar un filtro Pall Mustang Q) Recolectar y agrupar el flujo continuo no unido.
Etapa 4. Dialisis en TRis 10 mM pH8,0
Etapa 5. Intercambio ionico con Q Sepharose HP (en presencia de leupeptina 200 j M) Separar AUXI de AUXII Eluir con un gradiente de 0-40% de Tris 10 mM, CaCb 3 mM, NaCl 360 mM, pH8,0 sobre 20 VC
2 picos recogidos: Pico 1 = AUXII
Pico 2 = AUXI
Arginina agregada a 0,1M a las fracciones que contienen AUXI y AUXII
Etapa 6. Agrupaciones de AUXI y AUXII concentradas por celulas agitadas presurizadas
Etapa 7. Filtracion con Superdex 75 Gel Eliminacion de clostripama y gelatinasa de AUXI y AUXII AUXI y AUXII se ejecutan individualmente en columnas separadas. Muestras cargadas al 5% de VC
Tampon: Tris 10 mM, CaCb 3 mM, NaCl 150 mM, Arginina 0,1 M pH 8
Etapa 8. La AUXI y la AUXII se agrupan y se concentran individualmente, se diafiltran en agua y a continuacion, se agrupan para formar el farmaco final.
Detalles de las columnas:
T l 1. E ifi i n l mn r r l
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Envasado de las columnas
• Las columnas se envasaron segun las instrucciones del fabricante cuando fue posible.
• Columna TMAE: no se encontraron problemas.
• Q Sepharose y Superdex 75: se encontraron dificultades en el envasado para corregir la presion debido al tamano de la columna. Sin embargo, las columnas pudieron ejecutarse a la presion recomendada.
• HA- Se envasa como una suspension al 50% y se ejecuta a 10 ml/min.
Rendimientos/recuperaciones del proceso de 5 l:
Tabla 16: Purificacion de la precipitacion con SA a la cromatograffa de Q-Sepharose IEX rendimiento de la etapa en n ri
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T l 17: P rifi i n - h r IEX r x 7 P .
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Los rendimientos de un proceso de 5 l son aproximadamente 60-75 mg cada uno de ABCI y ABCII
Para la ampliacion, dependiendo de la fermentacion, se pueden esperar rendimientos de 250-300 mg para 20 l y 2500-3000 mg para 200 l.
Etapas de Cromatografia individual del proceso a escala de 5 l:
Cromatografia con hidroxiapatita
Tamano de columna: 2 x 300 ml en XK50/30 (15cm de altura de lecho cada una)
Tampon A: fosfato de potasio 0,1M, leupeptina 200 j M, pH6,7
Tampon B: fosfato de potasio 0,264 M, leupeptina 200 j M, pH6,7
Muestra: ~ 350 ml (en fosfato de potasio 0,1M, arginina 0,1M pH 6,7) cargado a <1,0 mg/ml medio * Caudal: 9,8 ml/min
Elucion: 0-100 % de B sobre 4 VC
La Figura 34 muestra un cromatograma despues de la hidroxiapatita con una carga de 1,0 mg/l de medios, en donde se produce una perdida considerable de resolucion y una degradacion de la diana.
Intercambio anionico en Fractogel TMAE
Tamano de columna: 58 ml en XK26/20 (10cm de altura de lecho)
Tampon A: fosfato de potasio 10 mM, NaCl 0,2 M, leupeptina 200 j M, pH6,7
Tampon B: fosfato de potasio 10 mM, NaCl 2 M, pH6,7
Muestra: ~ 650 ml a 0,5 mg/ml (en fosfato de potasio pH 6,7, directamente de la columna de HA) cargados a ~ 5,5 mg/ml de medios
Caudal: 8,8 ml/min
Elucion: (100% de B para eluir el acido nucleico)
La Figura 35 ilustra un cromatograma despues de un intercambio anionico en fractogel TMAE. La fraccion no unida se agrupo para dar ~ 650 ml a 0,5 mg/ml. Dializado en Tris 10 mM a pH 8.
La Figura 36 muestra un gel de SDS-PAGE de material de Pre HA, Post HA y Post TMAE del proceso a escala de 5 l. El gel se tine con azul Coloidal.
Intercambio anionico con Q Sepharose HP con gradiente de elucion original
Tamano de columna: 100 ml en XK50/20 (5,0cm de altura de lecho)
Tampon A: Tris 10 mM, CaCb 3 mM, leupeptina 200 j M, pH8,0
Tampon B: Tris 10 mM, CaCb 3 mM, NaCl 360 mM, leupeptina 200 j M, pH8,0
Muestra: ~ 650 ml a 0,5 mg/ml (en Tris 10 mM, pH 8,0 leupeptina 200 j M) cargados a ~ 3,0 mg/ml de medios
Caudal: 18,0 ml/min
Elucion: 0-40 % de B sobre 20 VC
La Figura 37 ilustra un cromatograma despues de un intercambio anionico con Q Sepharose HP con gradiente de elucion original. La arginina se agrega a 0,1M a las fracciones que contienen ABCI y ABCII. La fraccion del pico 1 (ABCII) se reunio para dar ~ 220 ml a 0,55 mg/ml, que se concentro por celula agitada para dar ~ 45 ml a 2,8 mg/ml. Las fracciones del pico 2 (ABCI, excluyendo el desnivel de gelatinasa) se agruparon para dar ~ 190 ml a 0,45 mg/ml, que se concentro por celula agitada para dar ~ 42 ml a 2 mg/ml.
La Figura 38 muestra un gel de SDS-PAGE de cromatograffa IEX con Q-Sepharose de material post-TMAE ejecutado en presencia de leupeptina para el Pico 1 (ABCII). El gel se tine con azul Coloidal.
La Figura 39 muestra un gel SDS-PAGE de la cromatograffa IEX en Q-Sepharose del material post-TMAE ejecutado en presencia de leupeptina para el Pico 2 (ABCI). El gel se tine con azul Coloidal.
Intercambio anionico con Q Sepharose HP con gradiente modificado
Prueba a pequena escala de la adicion de NaCl al tampon A y utilizando un gradiente mas pronunciado/mas rapido. La muestra procedfa de un proceso de 1/35 l, post TMAE, previamente congelado (-20 °C). Tamano de columna: 1 ml
Tampon A: Tris 10 mM, NaCl 30 mM, CaCb 3 mM, leupeptina 200 j M, pH8,0
Tampon B: Tris 10 mM, CaCb 3 mM, NaCl 360 mM, leupeptina 200 j M, pH8,0
Muestra: 3 mg post TMAE, post dialisis en Tris 10 mM, NaCl 30 mM, leupeptina 200 j M, pH 8,0. cargado a 3 mg/ml de medios
Gradiente: 0-25 % de B sobre 2 VC, 25 % de B para 2 VC, 25-40 % de B sobre 7,5 VC
La Figura 40 ilustra un cromatograma despues de un intercambio anionico Q Sepharose HP con gradiente de elucion modificado. Se observa una buena separacion de ABCI y ABCII. La segunda parte del gradiente se puede hacer mas pronunciada para agudizar el pico ABCI. La mejora del pico tambien se puede realizar utilizando 5 ml de VC cargados a 3 y 10 mg/ml de medios.
Cromatograffa de permeacion en gel Superdex 75 de ABCII (Pico 1 de IEX)
Tamano de columna: 880 ml en XK50/60 (54cm de altura de lecho)
Tampon: Tris 10 mM, CaCb 3 mM, NaCl 150 mM, arginina 0,1 M, pH8,0
Muestra: ~ 44 ml (5 % de VC) a 2,5 mg/ml (en Tris 10 mM, CaCb 3 mM, ~ NaCl 60 mM, arginina 0,1 M, pH8.0)
Caudal: 8,8 ml/min
La Figura 41 ilustra un cromatograma despues de la cromatograffa de permeacion en gel Superdex 75 de ABCII (Pico 1 de IEX). El pico se agrupo para dar ~ 60 ml de ABC II a 1,2 mg/ml.
La Figura 42 muestra un gel de SDS-PAGE de cromatograffa de permeacion en gel superdex 75 de ABC II concentrada ejecutado en presencia de arginina. El gel se tine con azul Coloidal.
Cromatograffa de permeacion en gel Superdex 75 de ABCI (Pico 2 de IEX):
Tamano de columna: 880 ml en XK50/60 (54cm de altura de lecho)
Tampon: Tris 10 mM, CaCb 3 mM, NaCl 150 mM, arginina 0,1 M, pH8,0
Muestra: ~ 42 ml (5 % de VC) a 2,0 mg/ml (en Tris 10 mM, CaCb 3 mM, ~ NaCl 60 mM, arginina 0,1 M, pH8.0)
Caudal: 8,8 ml/min
La Figura 43 ilustra un cromatograma despues de la cromatograffa de permeacion en gel Superdex 75 de ABCI (Pico 2 de IEX). El pico se agrupo para dar ~ 60 ml de ABC I a 1,1 mg/ml.
La Figura 44 muestra un gel de SDS-PAGE de cromatograffa de permeacion en gel superdex 75 de ABC I concentrada ejecutado en presencia de arginina. El gel se tine con azul Coloidal.
Aumento del tamano de la columna
Tabla 18
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* El tipo de columna y la altura de lecho resultante deben optimizarse aun mas. Los volumenes de medios son aumentos de escala lineales desde la escala de 5 l.
La Figura 44b ilustra un esquema de flujo del proceso de purificacion de 5 l.
Las etapas de dialisis del proceso de purificacion descrito anteriormente pueden sustituirse con operaciones de ultrafiltracion/diafiltracion (UF/DF) utilizando dialisis y las celulas agitadas se reemplazaran por TFF, filtracion de flujo tangencial. La etapa TMAE analizado anteriormente es opcional.
La invencion incluye los productos de colagenasa que son producidos por (o pueden ser producidos por) los procesos de purificacion anteriores. Dichos productos de colagenasa poseen un alto grado de pureza y una actividad enzimatica retenida. Por ejemplo, las composiciones estan libres de clostripama (por ejemplo, poseen niveles despreciables o indetectables de clostripama).
Optimizacion de los Procesos de Fabricacion:
Para respaldar los estudios clmicos y proporcionar un proceso a escala comercial, se completo la optimizacion del proceso de fabricacion desarrollado anteriormente. Los cambios del proceso se describen brevemente a continuacion y se describen en la Tabla 19.
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Optimizacion de la Fermentacion
Se llevo a cabo la eliminacion de las materias primas de origen bovino del banco de celulas original y el proceso de fermentacion. La cepa 004 de Clostridium histolyticum se propago para su uso como banco de celulas maestras en funcion de la viabilidad de pasaje requerida para la ampliacion. Las especificaciones y los resultados anaffticos para el banco de celulas maestras se capturan en la Tabla 20. Para aumentar la biomasa y la produccion de colagenasa, se desarrollo una estrategia de fermentacion discontinua alimentada utilizando materias primas libres de animales en el medio de crecimiento a una escala de fermentacion de 20 litros. Se observo que la ampliacion adicional de la fermentacion hasta 200 litros requeffa el uso de un componente de medio derivado de porcino (es decir, proteosa peptona n.o3, citada a continuacion) para asegurar un crecimiento celular consistente, expresion de colagenasa y un perfil de impurezas mejorado. Se hicieron cambios posteriores para aumentar el rendimiento y la pureza de la colagenasa en el proceso posterior. Estos cambios incluyen la adicion de nuevas estrategias de separacion y filtracion, asf como la ampliacion del equipo de produccion para soportar la escala de fermentacion discontinua de 200 litros. La Figura 45 muestra un diagrama de flujo de la fermentacion para el proceso 3.
T l 2 : E ifi i n n lii r l r r l B n l l M r
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Optimizacion de la Recuperacion y Purificacion Primaria
Se esta llevando a cabo un desarrollo adicional para optimizar la recuperacion primaria y el proceso de purificacion posterior. La sustitucion de la precipitacion con sulfato de amonio con cromatograffa de sub-columna baja de caudal rapido de fenil sepharose para capturar las colagenasas se ha implementado para mejorar los rendimientos, eliminar el uso de sulfato de amonio a granel y mejorar el procesamiento aseptico.
Con respecto a la purificacion, el filtro Pall Mustang Q se ha implementado para la eliminacion de impurezas y ADN residual para mejorar aun mas los rendimientos y simplificar el tren del proceso de produccion y los requisitos de validacion. Los parametros de funcionamiento de la Amina Cuaternaria Sepharose de Alto Rendimiento (Q HP) se han optimizado para eliminar la etapa de Cromatograffa de Permeacion en Gel (GPC). Ademas de los cambios en el proceso citados anteriormente, la formulacion del farmaco se ha modificado para incluir Tris 10 mM, sacarosa 60 mM, pH 8.0, mejorando la solubilidad del producto y la estabilidad del farmaco y del producto farmaceutico.
El proceso de optimizacion se llevo a cabo en dos etapas. El proceso inicial (Proceso 2) utiliza un medio libre de animales para todas las etapas de banco celular y fermentacion, con la fermentacion discontinua alimentada realizada en la escala de 20 litros. El proceso posterior se ha adaptado del Proceso 1 para incluir la filtracion Mustang Q para la eliminacion del ADN residual y Superdex 75 GPC para la eliminacion adicional de contaminantes de la celula hospedadora. La leupeptina tambien se ha agregado a los sistemas de tampon de cromatograffa para prevenir la degradacion proteolffica. El material del proceso 2 se ha superado analfticamente con el material del proceso 1 (Tabla 21A) y se probo en un estudio pre clmico en paralelo indicado en el presente documento. El material del proceso 2 se ha propuesto para su uso en la etapa inicial del programa clmico de la Fase 3. Las especificaciones para los intermedios del proceso 2 y el farmaco se detallan en las Tablas 22 y 23, respectivamente. El desarrollo adicional de procesos, formulacion y liofilizacion proporciono un proceso de fabricacion optimizado (Proceso 3). Estos cambios incluyen la adicion de nuevas estrategias de separacion y filtracion, asf como la ampliacion del equipo de produccion para soportar la escala de fermentacion discontinua de 200 litros como se indica en la Tabla 19. La Figura 46 muestra un diagrama de flujo de la purificacion para el proceso 3.
Declaracion de dosis: El ensayo de potencia in vitro inicial fue un ensayo de colagenasa bovina y no diferencio los tipos I y II de colagenasa. Este ensayo se utilizo unicamente para el material utilizado en los estudios clmicos de marcador abierto, DUPY101 y DUPY 202, con la dosis de 0,58 mg que generalmente da como resultado una potencia de 10.000 unidades. El analisis del material del Proceso 1 que utiliza los ensayos de potencia in vitro separados actuales para la colagenasa tipo I y la colagenasa tipo II generalmente da como resultado 1.700 a 3.500 Unidades/dosis (dosis de 0,58 mg) para la colagenasa tipo I y de 43.000 a 69.000 Unidades/dosis (dosis de 0,58 mg) ) para la colagenasa tipo II. El analisis del material del Proceso 2 que utiliza los actuales ensayos de potencia in vitro ha confirmado que ffpicamente se alcanzan valores de potencia relativa similares en comparacion con el material del Proceso 1.
Demostracion de la comparabilidad analitica entre el Proceso 1 y el Proceso 2: Con el fin de soportar los cambios entre el Proceso 1 y el Proceso 2, los datos de comparabilidad se han presentado en forma de pruebas de liberacion y caracterizacion analffica. Estos datos se presentan en la Tabla 21.
Comparacion de los intermedios, descritos como AUX-I y AUX-II, y farmaco del proceso anterior (Proceso 1; Referencia) con un proceso divulgado en el presente documento (Proceso 2). Esta comparacion analffica muestra que el material fabricado a partir del Proceso 2 es comparable al realizado con el Proceso 1 (Tabla 21). En particular, la identidad, potencia y pureza entre estos materiales son comparables.
El nivel de pureza de los productos intermedios del Proceso 2 se muestra en la Fig. 47, un gel tenido con Coomassie de SDS-PAGE reducido. El gel muestra una banda unica para cada intermedio sin ninguna otra banda menor evidente. AUX-I tiene un MW aparente de 115 kDa y se compara con la referencia (ABC I), AUX-II tiene un MW aparente de 110 kDa y se compara con la referencia (ABC II). La figura 48 muestra un gel tenido con Coomassie de SDS-PAGE reducido que representa el farmaco. Al igual que con los intermedios, el farmaco fabricado por el Proceso 2 se compara con la referencia (Proceso 1). En la Fig. 49 se muestra un gel de SDS-PAGE con tincion de plata que demuestra adicionalmente el alto nivel de pureza del farmaco del Proceso 2. En resumen, las pruebas de liberacion y la caracterizacion analftica de los intermedios (AUX-I y AUX-II) y el farmaco fabricado utilizando el Proceso 2 demuestran claramente la comparabilidad con los materiales del Proceso 1 (Referencia). Adicionalmente, se realizaron pruebas adicionales de liberacion en el material del Proceso 2 y se enumeran en la Tabla 21B. En conclusion, la comparacion analftica directa entre los materiales del Proceso 1 y del Proceso 2 (Tabla 21), y las pruebas adicionales de intermedio y liberacion (Tabla 22) indican que el material del Proceso 2 es adecuado para su uso en estudios en humanos. Las tablas 23 y 24 enumeran adicionalmente las especificaciones analfticas resultantes del proceso de fabricacion del Proceso 2.
Tabla 21: Com arabilidad analftica entre intermedios Proceso 1 Auxilium Proceso 2 farmaco.
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T l 24: E ifi i n n ff i r l F rm l Pr 2
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EXPERIMENTO DETALLADO PARA EL PROCESO 3:
PROCESO 3 FERMENTACION:
El proceso de fermentacion utilizando Fitona peptona empleada durante el Proceso 2 habfa mostrado una variabilidad significativa durante ambos suministros para el desarrollo de DSP y la fabricacion de GMP.
Durante el trabajo anterior, se ha demostrado que una Proteosa Peptona derivada de animales soporta muy bien el crecimiento de C. histolyticum. El cultivo de Proteosa Peptona de origen animal produjo significativamente menos clostripama que la observada durante el Proceso 2 y expreso AUXI y AUXII en una proporcion de 1:1. Como resultado, una peptona derivada de animales aceptable para la regulacion, Proteosa Peptona N.° 3 de Becton Dickinson (PP3) se evaluo en fermentadores de 5 l. La comparacion inicial con el proceso existente basado en Fitona (Proceso 2) mostro que el uso de PP3 a 50 g/l genero una alta concentracion de biomasa con una tasa de crecimiento exponencial rapida. La fermentacion dio como resultado un mayor rendimiento del producto de> 350 mg/l de colagenasa total en oposicion a ~ 230 mg/l del Proceso 2 (mediante analisis de SDS-PAGE semicuantitativo). Las fermentaciones adicionales utilizando PP3 demostraron que se produjo significativamente menos clostripama utilizando el medio de fermentacion derivado de animales. Las tres primeras fermentaciones (utilizando un lote de PP3) demostraron perfiles de crecimiento muy consistentes. Cuando el producto se analizo mediante SDS-PAGE, se encontro que el rendimiento y la pureza de la colagenasa eran muy reproducibles entre las tres fermentaciones.
Para suministrar DSP con material para el desarrollo del proceso, se llevaron a cabo varias fermentaciones utilizando PP3. Para este material de suministro se utilizaron tres lotes diferentes de PP3. Se observo que cuando se utilizaron dos de estos lotes, los perfiles de crecimiento de los cultivos no eran consistentes con las fermentaciones con PP3 anteriores y demostraron una variabilidad en el perfil de crecimiento entre las fermentaciones. Una investigacion a pequena escala mostro que la variabilidad de lote a lote en la PP3 causo esta variacion. El estudio a pequena escala tambien demostro que un aumento en la concentracion de PP3 a 100 gfl evitana esta variacion. Se realizaron dos fermentaciones de 5 litros con 100 g/l de PP3 utilizando dos lotes de peptona, uno que dio como resultado el perfil de crecimiento tfpico y uno que no lo hizo (como se demostro durante el experimento a pequena escala). El experimento mostro que el aumento en la concentracion aseguro que las dos fermentaciones con diferentes lotes de PP3 fueran reproducibles. Los perfiles de crecimiento fueron muy similares y el producto se expreso con un rendimiento y pureza similares.
El proceso de fermentacion optimizado que utiliza 100 g/l de PP3 fue finalmente ampliado a 200 l. El perfil de crecimiento de 200 l fue muy similar al observado en la escala de 5 l. El analisis de SDS-PAGE del filtrado de fermentacion mostro un alto rendimiento de la fermentacion de 200 l, ~ 320 mg/l de colagenasa total (mediante analisis de densitometna cuantitativa). La pureza del producto de colagenasa (post fermentacion) fue similar a escala tanto de 5 l como de 200 l. El grupo DSP proceso 20 l del filtrado de fermentacion de 200 l para representar una ampliacion parcial del proceso posterior (infra).
El proceso de fermentacion de Proteosa Peptona n^ 3 (Proceso 3) genero colagenasa con un rendimiento mas alto y con menos clostripama que el proceso con Fitona existente. A 100 g/l se demostro que PP3 produda cultivos de C. histolyticum con curvas de crecimiento reproducibles a pesar de usar varios lotes de PP3. Tambien se demostro que tanto el rendimiento como la pureza de la colagenasa son reproducibles cuando se usan varios lotes de PP3.
Evaluacion de la Proteasa Peptona n^ 3 como materia prima para la produccion de colagenasa a partir de Clostridium histolyticum.
Debido a la variabilidad observada en las fermentaciones que utilizan la Fitona Peptona como una fuente de nitrogeno compleja, se evaluo la adecuacion de la Proteasa Peptona n^ 3 (Becton Dickinson, 212230) (PP3) en fermentaciones de 5 l. Se utilizo una estrategia discontinua simple con 50 g/l de PP3. La composicion exacta del medio se puede encontrar en la seccion de materiales y metodos.
La Figura 51 compara la curva de crecimiento de la fermentacion de 50 g/l de PP3 (una concentracion mas baja que la concentracion de Fitona en el Proceso 2) con la fermentacion discontinua alimentada con Fitona. El cultivo con PP3 demuestra una tasa de crecimiento espedfico muy rapida durante el crecimiento exponencial antes de entrar en la fase estacionaria aproximadamente 8 horas despues de la inoculacion. La fermentacion con PP3 alcanzo una densidad optica maxima (600 nm) de 4,7 unidades. El cultivo se dejo durante 12 horas mas en fase estacionaria para controlar la formacion/degradacion del producto.
La Figura 52 muestra el analisis de SDS-PAGE semicuantitativa de la concentracion de los productos de colagenasa a partir del punto de 20 horas del cultivo con PP3. La Figura 53 muestra el mismo analisis para el proceso de alimentacion discontinua con Fitona. Se puede observar que la fermentacion con PP3 genera mas producto que el proceso basado en Fitona (un aumento de 230 mg/l a 360 mg/l de colagenasa total, basado en el analisis semicuantitativo en las figuras 52 y 53). El cultivo con PP3 tambien expreso AUXI y AUXII en una proporcion de 1:1, mientras que el Proceso 2 produjo las dos protemas en una proporcion de 1: 1,6.
Reproducibilidad de la fermentacion discontinua de Proteosa Peptona n.o3.
La reproducibilidad del proceso discontinuo con PP3 se examino adicionalmente utilizando el lote numero 5354796 de Proteosa Peptona numero 3. Las tres ejecuciones ilustradas en la figura 54 demuestran perfiles de crecimiento consistentes con una densidad optica maxima (600 nm) de aproximadamente 4,5 obtenida despues de 8 horas. El analisis de SDS-PAGE semicuantitativa de los momentos de cosecha de la fermentacion mostro que el rendimiento de colagenasa total fue de ~ 350 - 400 mg/l.
El momento de cosecha de la fermentacion tambien se evaluo durante este estudio. Las fermentaciones se cosecharon a las 8, 11 y 20 horas. Las Figuras 55 y 56 muestran el analisis de SDS-PAGE del curso temporal de la fermentacion con PP3 GCFT05d (cosechada a las 11 horas). El gel representado en la figura 55 se ha tenido con azul coloidal y el gel en la figura 56 se ha tenido con plata. Puede observarse una tercera banda de peso molecular mas alto por encima de las dos bandas de colagenasa en los geles en las figuras 55 y 56. Se piensa que esta banda corresponde a una protema precursora de AUXI indicada en la bibliograffa. La banda precursora esta presente durante la fase de crecimiento exponencial. Al final del crecimiento exponencial, la banda precursora disminuye en intensidad y no esta presente despues de 11 horas (en GCFT05d). Los principales contaminantes de peso molecular mas bajo se pueden ver en el gel con tincion de plata a aproximadamente 90, 60, 55, 45 y 40 kDa. Se debe tener en cuenta que estos contaminantes estan presentes en un nivel bajo y solo se detectan claramente en el gel con tincion de plata. Se determino que el momento de cosecha optimo para la fermentacion era ~ 11 horas en esta etapa de desarrollo. La Figura 57 muestra el analisis de SDS-PAGE de muestras del curso temporal de una fermentacion discontinua alimentada con Fitona convencional. Se puede observar un contaminante de 40 kDa en el gel en la figura 57. Esta banda de contaminante de 40 kDa del proceso de alimentacion discontinua de Fitona se identifico como la proteasa clostripama. Al comparar los geles en las figuras 55 y 57, es posible determinar que la cantidad de clostripama producida usando el proceso de fermentacion con PP3 es significativamente menor que la fermentacion basada en Fitona.
Generacion de material de suministro para el desarrollo de procesos Posteriores
Para soportar el desarrollo del proceso posterior (DSP), se realizaron varias fermentaciones con 50 g/l de PP3. Durante estas fermentaciones se utilizaron dos lotes diferentes de PP3 (5332398 y 5325635). La Figura 58 muestra las curvas de crecimiento de estas fermentaciones (que se muestran en diamante) en comparacion con una fermentacion (que se muestra en un cuadrado) utilizando el lote numero 5354796 (GCFT05d). Las fermentaciones con los nuevos lotes de PP3 muestran perfiles de crecimiento muy variados. Aunque las tasas de crecimiento inicial de los cultivos son todas muy similares, el punto en el que entran en la fase estacionaria y, por lo tanto, las concentraciones maximas de biomasa difieren considerablemente. Las densidades opticas (600 nm) en los cultivos de inoculo mostraron muy poca variacion (DO600 de la etapa de 5 ml; 2,9 - 3,6 unidades, DO600 de la etapa de 200 ml; 4,5 - 5,9 unidades) y ninguna reduccion de los inoculos anteriores utilizando el lote PP3 n.° 5354796. La variacion y la densidad optica reducida (600 nm) solo se manifestaron en la etapa final (fermentacion) del cultivo. Esto sugiere que la razon de la variacion fue una limitacion de nutrientes en la PP3 y la cantidad del nutriente limitante vario entre los lotes de PP3.
Aunque estas fermentaciones se utilizaron con exito para el desarrollo de DSP y el analisis de SDS-PAGE mostro que no hubo una gran variacion en la cantidad de colagenasa producida (350 - 400 mg/l de colagenasa total basada en el analisis de SDS-PAGE semicuantitativo, los datos no se muestran ) se decidio que todavfa era cntico investigar la razon de la variacion. La variacion en el perfil de crecimiento hana muy diffcil predecir el momento de cosecha de la fermentacion. Tambien hubo inquietudes de que la limitacion de nutrientes puede inducir la expresion de otras proteasas como se ve con el proceso de alimentacion discontinua con Fitona y espedficamente la proteasa, clostripama.
Investigacion sobre la variacion entre los lotes de Proteosa Peptona n.° 3.
El trabajo inicial con PP3 hada demostrado un proceso altamente consistente con un mayor rendimiento de producto y niveles mas bajos de la proteasa clostripama. Cuando se emplearon nuevos lotes de PP3, se observo que la consistencia del proceso disminuyo significativamente con perfiles de crecimiento altamente variables. Se realizo un experimento en matraces de agitacion para comparar directamente los tres lotes de PP3 utilizados hasta ahora (lotes 5354796, 5325635 y 5332398). El experimento replico el proceso de inoculo en dos etapas del proceso de 5 l, pero reemplazo la fase de fermentacion final con otro cultivo de 200 ml. Tener esta tercera etapa fue cntico, ya que la variacion solo se observo en la etapa final de fermentacion del proceso en experimentos previos. Las densidades opticas (600 nm) de los cultivos se midieron en cada etapa de transferencia y los cultivos se utilizaron para inocular la siguiente etapa. El medio se preparo utilizando los tres lotes de PP3 a 50 g/l. Uno de los dos lotes que hada dado como resultado concentraciones de biomasa mas bajas de C. histolyticum durante los experimentos de 5 l (lote n^ 5332398) tambien se preparo a 100 g/l.
La Figura 59 muestra los resultados del experimento a pequena escala. Se puede observar que los lotes 5325635 y 5332398 mostraron densidades opticas reducidas (600 nm) en la tercera etapa de aproximadamente 2,5 unidades, que se consideraron lotes "malos" de PP3. El lote 5354796 mantiene una densidad optica (600 nm) de 5 unidades en la tercera etapa de cultivo, este se considero un lote "bueno" de PP3. Curiosamente, cuando la concentracion de un lote "malo" de PP3 (5332398) se incremento a 100 g/l, se logro la misma densidad optica (600 nm) en la segunda y tercera etapa del cultivo. Estos datos soportan la teona de que las desviaciones en los perfiles de crecimiento son causadas por la variacion en la cantidad de un nutriente limitante entre lotes de PP3. No fue posible identificar este nutriente mediante pruebas analfticas de los lotes de PP3.
Evaluacion de la Proteosa peptona numero 3 a 100 g/l en fermentacion de 5 l
Los resultados del estudio a pequena escala demostraron que al aumentar la concentracion de PP3 de 50 a 100 g/l se eliminaba el problema de la variabilidad de lote a lote. Este cambio de proceso se probo en una escala de 5 l usando un lote "bueno" y "malo" de PP3 (lote 5354796 y 5325635, respectivamente) segun lo determinado durante la investigacion a pequena escala sobre la variabilidad de PP3. La figura 60 muestra los perfiles de crecimiento de las dos fermentaciones. Los dos cultivos muestran tasas de crecimiento espedficas identicas durante la fase exponencial. La fermentacion entra en la fase estacionaria y alcanza densidades opticas maximas muy similares (600 nm) de aproximadamente 6,5 unidades. Estos datos demuestran que el aumento de la concentracion de PP3 alivia el problema de la variabilidad de lote a lote de PP3. Debido a la mayor concentracion de biomasa lograda y la fase exponencial mas larga en la fermentacion, el momento de cosecha se extendio a 12 horas.
Las Figuras 61 y 62 muestran el analisis de SDS-PAGE de las dos fermentaciones utilizando 100 g/l de PP3. Los geles demuestran una expresion consistente de colagenasa en ambas fermentaciones. Las muestras de ambas fermentaciones parecen contener niveles similares de contaminante descrito en la figura 56, aunque parece que PBFT70d contiene un poco mas de la banda de 40 kDa (clostripama). Es posible que estas pequenas diferencias se deban a las diferencias de tincion o carga. Nuevamente, la cantidad de clostripama producida usando el proceso con PP3 es significativamente menor que el proceso con Fitona. La banda precursora parece persistir mas tiempo en el curso temporal de la fermentacion. Se recomendo que las futuras fermentaciones a 100 g/l se extendieran a una cosecha de 14 horas.
La presencia de la banda precursora destaca la importancia de la definicion del momento de cosecha y su calificacion durante la validacion del proceso.
La Figura 63 muestra los datos del analisis de densitometna del gel en la figura 61. El grafico compara la formacion del producto y del precursor (area del pico de densitometna) con el crecimiento celular (DO600). La formacion del producto parece ser consistente con el crecimiento celular y la tasa de produccion disminuye a medida que el cultivo entra en la fase estacionaria. La banda precursora disminuye en intensidad a medida que termina el crecimiento exponencial, pero todavfa esta presente en el momento de cosecha de la fermentacion.
Ampliacion de 100 g/l de la fermentacion con proteosa peptona numero 3 hasta 200 l.
Tras el aumento de la concentracion de PP3 a 100 g/l, el proceso se escalo a 200 l. Para generar la cantidad requerida de inoculo para el recipiente de 200 l, se introdujo una tercera etapa de inoculo utilizando un fermentador de volumen de trabajo de 15 l. Se utilizaron 3 x cultivos de 200 ml para inocular el fermentador de 15 l y despues de 12 horas de crecimiento, se inocularon 8 l de los 15 l en el recipiente de 200 l. La Figura 64 compara la curva de crecimiento de la fermentacion de 200 l con las dos de 5 l utilizando 100 g/l de PP3. Segun lo recomendado, el perfil de crecimiento se extendio a 14 horas para garantizar que la banda precursora hubiera desaparecido completamente antes de que comenzara el procesamiento. El perfil de crecimiento de la fermentacion de 200 l es muy similar a la fermentacion a escala de 5 l, lo que demuestra una ampliacion exitosa del cultivo.
La Figura 65 muestra el analisis de SDS-PAGE del curso temporal de la fermentacion de 200 l. El gel muestra la formacion del producto durante el curso de la fermentacion. El material en el momento de cosecha de 14 horas no contiene ningun precursor detectable y contiene niveles muy bajos de contaminantes. El producto generado a partir de la fermentacion de 200 l parece muy similar al producido a partir del proceso de 5 l, lo que indica que el aumento en el numero de generacion del proceso de 200 l no ha tenido un efecto perjudicial. La Figura 66 muestra los datos del analisis de densitometna del gel en la figura 64. El grafico compara la formacion del producto y del precursor (area del pico de densitometna) con el crecimiento celular (DO600). La formacion del producto parece ser consistente con el crecimiento celular y la tasa de produccion disminuye a medida que el cultivo entra en la fase estacionaria. La banda precursora disminuye en intensidad a medida que termina el crecimiento exponencial. La banda precursora disminuye en intensidad mas rapidamente en la fermentacion de 200 l que en el cultivo de 5 l, PBFT70c ( Figura 63). La Figura 67 muestra el analisis de SDS-PAGE utilizando un gel Bis-Tris AL 4-12%en el curso temporal de la fermentacion de 200 l. Los pesos moleculares aproximados de los contaminantes detectados se anotan en el gel.
El proceso de cosecha (aclarado por filtracion) desarrollado para el Proceso 2 se evaluo durante la fermentacion ampliada a 200 l. El cultivo celular se aclaro con exito utilizando el proceso existente sin bloqueo del tren de filtro. El proceso de cosecha se describe en la seccion de materiales y metodos. Se procesaron 20 l de filtrado de la fermentacion de 200 l mediante DSP para demostrar una ampliacion parcial del proceso 3 aguas abajo (citado a continuacion).
Cuantificacion del rendimiento del producto mediante Analisis de Densitometna
Se requirio un metodo mas preciso y cuantificable para determinar la concentracion del producto durante la etapa del proceso anterior que el analisis de SDS-PAGE semicuantitativa (figuras 62 y 63). El filtrado de fermentacion tiene una gran cantidad de pigmento y peptidos del medio de crecimiento que hace que las tecnicas de cuantificacion de protemas convencionales, como la UV y el ensayo Bradford, sean inutilizables. El analisis semicuantitativo realizado previamente se modifico y actualizo mediante el analisis de densitometna de los geles tenidos con Coomassie. El metodo involucro la carga de un intervalo de cantidades (0,2 - 1,2 pg/carril) de material de referencia mezclado AUXI y AUXII y diluciones de la muestra a cuantificar en un gel de Tris Glicina. A continuacion se analizo la imagen escaneada y se estimo el area del pico para los patrones y las muestras. A continuacion se construyo una curva patron (colagenasa total) y se uso para cuantificar la cantidad de colagenasa total en las diluciones de la muestra. La Figura 68 muestra un ejemplo de una curva patron de colagenasa y resalta la linealidad del metodo de cuantificacion dentro del intervalo anticipado de las muestras. Los geles de Tris Glicina no resolvieron completamente AUXI y AUXII, por lo que se cuantifico la colagenasa total en lugar de intentar cuantificar por separado las dos protemas. La cantidad de colagenasa se analizo para PBFT70c, PBFT70d y para las fermentaciones a escala de 200 l. Se encontro que la cantidad de colagenasa total era ~ 280 - 350 mg/l para las tres fermentaciones.
Materiales y metodos
Preparation de los Medios:
Preparacion de medios de 1 l
Se autoclavaron los fosfatos para la preparacion del inoculo (tabla 25) en una botella de 1 l a 121 °C durante 20 minutos. El medio a granel (tabla 26) se calento inicialmente en un microondas a 60 °C para disolver completamente los componentes antes de autoclavar en una botella de 1 l a 121 °C durante 20 minutos. El PSA 1 (tabla 27) se filtro a traves de un filtro Sartopore 2 de 150 cm2 de 0,2 pm en una botella esteril de 250 ml. Los 300 ml de fosfatos autoclavados, 600 ml de medios a granel autoclavados y 100 ml de PSA 1 filtrado esteril se agruparon antes de preparar en almuota en 30 ml de universales irradiados con rayos gamma (8x5 ml) y 500 ml en matraces Erlenmeyer (4x200 ml).
Tal 2: m ii n f f r l r r i n in ulo
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T abla 2: m iin l m i rnl r l r r i n inoculo
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Tal 27: m ii n P A 1 m n i l r l r r i n in ulo
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Tabl 2: l in vi min r l r r i n inculo
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Preparacion de medios de 5 l
Se autoclavo la solucion de fosfato para la escala de 5 l (tabla 29) en una botella de 1 l a 121 °C durante 20 minutos. El medio a granel (tabla 30) se anadio directamente al recipiente de 5 l y se autoclavo a 121 °C durante 20 minutos. El PSA 1 (tabla 31) se filtro a traves de un filtro Sartopore 2 de 150 cm2 de 0,2 pm en una botella esteril de 500 ml. La solucion de 250 ml de fosfato y 200 ml de PSA 1 se bombearon por separado en el recipiente de 5 l al completar el autoclave y enfriar el recipiente.
Tabl 2: m ii n F f r l f rmn i n e 5 l
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Tabla : m ii n l m i rnl r l f rmn i n de 5 l
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Tabl e 5 l
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Tabla 32: Solucion de vitaminas ara la fermentacion de 5 l
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Preparacion de medios de 15 l
La solucion de fosfato (tabla 33) se filtro a traves de un filtro Sartopore 2 de 300cm2 de 0,2 pm en una botella esteril de 2 l. El medio a granel (tabla 34) se agrego directamente al recipiente de 20 l antes de la esterilizacion con vapor en el sitio (SIP) del recipiente. El PSA 1 (tabla 35) se filtro a traves de un filtro Sartopore 2300cm2 de 0,2 pm en una botella esteril de 1 l. Los 750 ml de fosfatos y 600 ml de PSA 1 se bombearon por separado en el recipiente de 20 litros al completar la SIP y enfriar el recipiente.
Tal : m ii n F f r l f rmn i n 15 l
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Tabla de 15 l
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Tabl : m ii n P A 1 M n i l r l f rmn in 15 l
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Tabl : l in vi min ^ r l f rmn i n e 15 l
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Preparacion de medios de 200 l
La solucion de fosfato (tabla 37) se filtro a traves de un filtro Sartopore 2 de 300cm2 de 0,2 pm en una bolsa de 10 l Gammasart Biosystem SA10. El medio a granel (tabla 38) se agrego directamente al recipiente de 200 l antes de la esterilizacion SIP del recipiente. La solucion de PSA 1 (tabla 39) se filtro a traves de un filtro de 300 cm2 de 0,2 pm en una bolsa de 10 l Gammasart Biosystem SA10. Los 10 l de fosfatos y 8L de PSA 1 se bombearon por separado en el recipiente de 200 litros al completar la SIP y enfriar el recipiente.
Tab 00 l
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Tabla : m i i n l m i r n l r l f rm n i n e 200 l
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Tabl : m i i n P A 1 M n i l r l f rm n i n 200 l
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Tabla 200 l
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Fermentacion
La Figura 69 ilustra descripciones generales de los flujos de proceso para los procesos de fermentacion con Fitona y PP3 a escala 5 y 200 l.
Fermentacion a escala 51
Se descongelo un vial de WCB (2005 numero 1019D) y se usaron partes alfcuotas de 50 pl para inocular 8x5 ml de medio de inoculo en universales irradiados con rayos gamma de 30 ml. Los cultivos de 5 ml se incubaron a 37 °C en una jarra anaerobica en presencia de 3 paquetes de gas anaerobico. Despues de aproximadamente 12 horas de incubacion (DO600 3,0-4,0), se seleccionaron 2 cultivos de 5 ml y se usaron para inocular 2x200 ml de medio de inoculo en matraces Erlenmeyer de 500 ml. Los dos matraces se colocaron juntos en una jarra anaerobica con paquetes de 3 gases y se incubaron a 37 °C en una incubadora de agitacion (70 rpm) durante 12 horas. Despues de 12 horas de incubacion (DO6006,0-7,0) se utilizo cada inoculo de 200 ml para inocular un recipiente de 5 l.
El volumen de trabajo de los vasos 5/7 L FT Applikon fue de 5 l, de los cuales el 4% (v/v) fue inoculo de la etapa de 200 ml. La velocidad de agitacion se fijo a 100 rpm. El pH, dO2 y la temperatura se controlaron a 7.00 unidades, 0% de saturacion y 37 oC respectivamente. El pH se controlo con adiciones de HCl (5M) o NaOH (5M). La concentracion de dO2 se mantuvo al 0% mediante una continua inyeccion de nitrogeno, con un caudal de 1 l/min. Se tomaron muestras durante la fermentacion y se filtraron a traves de filtros de 0,2 pm antes de almacenarlos a -20 °C con fines analtticos. Las fermentaciones comenzaron a entrar en la fase estacionaria a una DO600 de 6,0-7,0. Despues de 12 horas, el fermentador se enfrio a 10-20 °C antes de comenzar la recuperacion de la cosecha.
Fermentacion a escala 200l
Se descongelo un vial de WCB (2005 numero 1019D) y se usaron partes aKcuotas de 50 |jl para inocular 8x 5ml de medio de inoculo en universales irradiados con rayos gamma de 30 ml. Los cultivos de 5 ml se incubaron a 37 °C en una jarra anaerobica en presencia de 3 paquetes de gas anaerobico. Despues de aproximadamente 12 horas de incubacion (DO6003.0-4.0), se seleccionaron 4 cultivos de 5 ml y se utilizaron para inocular 4 medios de inoculo de 200 ml de medio de inoculo en matraces Erlenmeyer de 500 ml. Dos matraces se colocaron juntos en jarras de gas anaerobicas con paquetes de 3 gases y se dejaron incubar a 37 °C en un incubador de agitacion (70 rpm) durante 12 horas. Despues de 12 horas de incubacion (DO6006.0-7.0), se juntaron tres de los cuatro matraces y se usaron para inocular el recipiente de 20 l.
El volumen de trabajo de los recipientes de 20 l fue de 15 l, de los cuales el 4% (v/v) fue inoculo de la etapa de 200 ml. La velocidad de agitacion se fijo a 100 rpm. El pH, dO2 y la temperatura se controlaron a 7.00 unidades, 0 % y 37oC respectivamente. El pH se controlo con adiciones de HCl (5M) o NaOH (5M). La concentracion de dO2 se mantuvo al 0% mediante una continua inyeccion en el espacio de cabeza de nitrogeno, con un caudal de 20 l/min. Despues de 12 horas de crecimiento en el recipiente de 20 l (DO6006,0-7,0), se usaron 8 l de cultivo para inocular el recipiente de 200 l. Las condiciones de ejecucion fueron identicas a las de la escala de 20 l. La densidad optica final (600 nm) en la cosecha fue de 6,0-7,0. Despues de 14 horas, el fermentador se enfrio a 10-20 °C antes de comenzar la recuperacion de la cosecha.
Cosecha
Cosecha de 5 l
Los cultivos de 5 l se bombearon con un caudal de 5 l/h a traves de un filtro de profundidad Millistak+ 10" Opticap (Millipore, KC0HC10FF1) y un filtro Sartopore 2 de 300 cm2 de 0,2 jm en recipientes esteriles de 250 ml. El material procesado se almaceno a -20 °C o se almaceno a 4 °C durante la noche antes del procesamiento por DSP.
Cosecha de 200 l
La cosecha de 200 litros se realizo utilizando un tren de cosecha por filtracion. El cultivo se bombeo con un caudal de 200 l/h a traves de un filtro de profundidad desechable Milistak (MC0HC10FS1) con un area de filtracion de 4x1m2 seguido por dos filtros Express Opticap XL 10 de 0.2 jm, 2x0,49m2 (Millipore, KHGES10TT1). El tiempo de proceso para el aclarado primario fue de 1 hora. Se permitieron 10 minutos adicionales al final de la cosecha para recuperar el producto residual retenido en los filtros. El sobrenadante aclarado se recogio en un banco de Palletank de Stedim de 200 l con el peso del filtrado registrado. Se pasaron 20 l de filtrado a traves de una columna de ADN de alta afinidad Mustang Q con un caudal de ~ 6 l/min y se recogieron en dos bolsas stedim esteriles de 20 l, antes del almacenamiento a 4 °C durante la noche.
Analisis
Mediciones de la Densidad optica
El espectrofotometro se puso en blanco usando PBS a una longitud de onda de 600 nm. Las muestras de fermentacion se diluyeron con factores de 10, 20 o 100 (dependiendo de la densidad celular) utilizando PBS.
Se transfirio 1 ml de cada muestra diluida a una cubeta de 1 ml; la parte superior se sello e invirtio 5 veces antes de registrar lecturas de densidad optica por triplicado a una longitud de onda de 600 nm.
Geles de Tris-Glicina
Las muestras de fermentacion se filtraron a traves de filtros de 0,2 jm antes de prepararlas para el analisis de SDS-PAGE. Se anadieron 10 j l de muestra filtrada a 10 j l de tampon de muestra (2x), 2,5 j l de agente reductor (10x) y 2 j l de EDTA 0,1M (para lograr una concentracion final de 10 mM). El marcador de alto peso molecular (HMW) se preparo agregando 10 j l de solucion madre concentrada a 80 j l de agente reductor (10x), 310 j l de API y 400 j l de tampon de muestra (2x). El HMW diluido convencional se calento a continuacion a 95 °C durante 5 minutos antes de hacer alfcuotas y el almacenamiento a - 20oC para su uso en geles posteriores. Se procesaron 15 j l de muestra de fermentacion y 10 j l de marcador HMW en gel de Tris-Glicina al 8% utilizando un tampon de ejecucion de Tris-Glicina pre-enfriado (4 °C) a 130 V, 400 mA y 100 W durante aproximadamente 1 hora y 50 minutos. Tras la electroforesis, los geles se sumergieron en 100 ml de reactivo de tincion azul coloidal (55 ml de API, 20 ml de metanol, 5 ml de tinte A, 20 ml de tinte B) y se dejo tenir durante 5 h en un agitador orbital a 60 rpm. Los geles se decoloraron con 200 ml de API. El gel se dejo en API durante 15-20 h hasta que se elimino el exceso de tintura, despues de lo cual el gel se escaneo y se seco de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Geles de Bis-Tris
Las muestras de fermentacion se prepararon para el analisis de SDS-PAGE mediante la adicion de 10 |jl de muestra filtrada de 0,2 jm a 4 j l de tampon de muestra (4x), 1,5 j l de agente reductor (10x) y 1,7 j l de EDTA 0,1M (para lograr una concentracion final de 10 mM). Se ejecutaron l5 j l de muestra de fermentacion y 10 j l de marcador Mark 12 en un gel de Bis-Tris al 4-12% y se ejecutaron utilizando un tampon de ejecucion MES a 200 V, 400 mA y 100 W durante aproximadamente 40 minutos. Tras la electroforesis, los geles se sumergieron en una solucion de fijacion de 100 ml (40 ml de dH2O, 50 ml de metanol, 10 ml de acido acetico) durante 10 minutos antes de reemplazar con una solucion de tincion de 95 ml (55 ml de dH2O, 20 ml de metanol, 20 ml de tinte A) durante otros 10 minutos. Se agregaron 5 ml del tinte B a la solucion de tincion y se dejo que los geles se tineran durante 5 h en un agitador orbital a 60 rpm antes de tenir con 200 ml de API. El gel se dejo en API durante 15-20 h hasta que se elimino el exceso de tintura, despues de lo cual el gel se escaneo y se seco de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
PROCESO 3 PURIFICACION:
La primera escala de 20 l se ejecuto a traves de un proceso recientemente desarrollado (Proceso 3) para la purificacion de colagenasas de Clostridium histolyticum, el cual se modifico del Proceso 2 realizado a GMP a escala 20 l. Se introdujeron cambios significativos de proceso en el desarrollo del Proceso 3 para hacer que la purificacion sea mas consistente y mas modificable para su ampliacion y posterior validacion del proceso. Un factor importante para facilitar este cambio de proceso fue la eleccion del componente de fermentacion. El proceso 2 se habfa basado en el requisito de mantener un medio de fermentacion a base de fitona, mientras que para el proceso 3 se uso proteosa peptona n.° 3. El proceso de ejecucion se divide en las etapas clave de la purificacion posterior y las colagenasas AUXI y AUXII. Estos incluyen el tratamiento del filtrado de fermentacion utilizando una capsula Mustang Q, cromatograffa de interaccion hidrofobica, etapa 1 de filtracion de flujo tangencial (denotada TFF1), cromatograffa de intercambio anionico y etapa 2 de filtracion de flujo tangencial (denotada TFF2 ). AUXI y AUXII se purifican conjuntamente en las etapas iniciales de la purificacion y solo se separan durante la etapa de cromatograffa de intercambio anionico (se realiza con medios Q-Sepharose HP). AUXI y AUXII se procesan por separado y se formulan. A continuacion, los compuestos intermedios se mezclan en una proporcion 1:1 (segun el contenido de protema determinado por UV) y se filtran para formar el farmaco. En el proceso de desarrollo 3, se eliminaron las etapas clave asociadas con el proceso 2. En particular, se eliminaron la etapa de precipitacion con sulfato de amonio, dos etapas de cromatograffa (hidroxiapatita y cromatograffa de permeacion de gel) y todas las etapas de espera a -20 °C. El uso de etapas no escalables, tal como las celulas agitadas y la dialisis, tambien se eliminaron y se reemplazaron por filtracion de flujo tangencial (TFF). El problema de la inestabilidad del producto, que fue evidente en el proceso 2 (y elimino el uso de TFF), no fue aparente en la escala de 20 l del proceso 3. Sin embargo, el perfil de contaminantes asociado con el proceso 3 fue diferente al proceso 2 en el que clostripama y gelatinasa habfan sido componentes principales. Mas en particular, se detectaron contaminantes de 40 kDa, 55 kDa y dos de 90 kDa (uno copurificante con AUXI y el otro con AUXII) mediante SDS-PAGE. Como resultado de estos nuevos contaminantes, algunos de los ensayos de control de calidad (como RPHPLC y SEC-HPLC) fueron de uso limitado ya que no resolvieron todas las impurezas del proceso 3. La incapacidad de utilizar los ensayos de control de calidad establecidos para la determinacion de la pureza en el proceso, dio lugar a la necesidad de definir un metodo para establecer que material de la columna de QSepharose era adecuado para una purificacion adicional. Esto fue necesario ya que los contaminantes no se resolvieron claramente a partir de los productos AUXI y AUXII en la columna QSepharose y, por lo tanto, fue necesario recolectar el material eluido en fracciones discretas, que podffan analizarse retrospectivamente. El analisis se realizo mediante SDS PAGE y la decision de agrupamiento para la ejecucion a traves de 20 l se baso en la experiencia de la intensidad de tincion relativa de la impureza al producto utilizando una carga patron de 1 jg.
El analisis de densitometffa retrospectivo de SDS-PAGE permitio que los criterios de agrupacion se describieran en funcion del porcentaje relativo de pureza del producto. Un analisis de densitometffa adicional con material de la ejecucion de demostracion de 200 L permitio establecer un metodo estandarizado, asf como una aproximacion de la variacion del ensayo. Esto llevo a un procedimiento acordado para la agrupacion de las fracciones en proceso que se implementaran en la primera campana de GMP.
Ademas de la descripcion del proceso, se presenta un trabajo preliminar que describe un estudio de estabilidad del tampon y estabilidad de la muestra en proceso junto con la caracterizacion inicial de algunas de las impurezas asociadas con el Proceso 3.
El proceso 3 difeffa del proceso 2 en tres areas principales. En primer lugar, se eliminaron la etapa de precipitacion con sulfato de amonio y las etapas de cromatograffa con hidroxiapatita; en segundo lugar, se elimino la etapa de cromatograffa de permeacion en gel (GPC) y, en tercer lugar, todas las etapas de intercambio de tampon se realizaron por filtracion de flujo tangencial. La etapa de precipitacion se reemplazo por el uso de cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC) por recomendacion del cliente. El desarrollo de esta etapa dio como resultado la implementacion exitosa de HIC para (i) la captura del producto (por lo tanto, sirvio como una etapa de concentracion) y (ii) la eliminacion de algunos contaminantes de protemas y pigmentos. Posteriormente, tambien se demostro que la etapa de HIC reduce los niveles de ADNdc. Como resultado del programa de desarrollo de procesos, la introduccion de HIC y la inclusion de una etapa Mustang Q eliminaron la necesidad tanto de la etapa de precipitacion con sulfato de amonio como de la etapa de cromatograffa con hidroxiapatita. El efecto general fue simplificar la captura frontal del producto y eliminar una etapa de espera potencial asociada con el Proceso 2. Este ultimo punto tuvo importancia porque previamente la evaluacion de la fermentacion pod^a realizarse antes de la purificacion posterior, ya que los sedimentos resultantes de la etapa de precipitacion podfan mantenerse a -20 °C antes del procesamiento.
Despues de la etapa de HIC, se intercambio el tampon del producto utilizando filtracion de flujo tangencial (TFF). Esto se realizo utilizando membranas de lfmite de peso molecular de 30 kDa (MWCO) y se reemplazo el procedimiento de dialisis utilizado para el Proceso 2. La contaminacion del agregado, que cuando estaba presente se detecto como derivado de AUXII, parecio eliminarse durante la etapa de cromatograffa de intercambio anionico (IEX). Como resultado, se elimino la etapa de GPC ya que tanto los intermedios AUXI como AUXII estaban dentro de las especificaciones para los agregados despues de iEx . Por ultimo, la concentracion final y la formulacion de los intermedios AUXI y AUXII se realizaron utilizando TFF en lugar del metodo anterior de utilizacion de celulas agitadas.
En general, el Proceso 3 represento un proceso mas simple que fue mas facil de ampliar y validar que el Proceso 2. Ademas, la reduccion en el costo de los consumibles fue evidente al eliminar la necesidad de medios de permeacion de hidroxiapatita y gel y por la cantidad reducida de etapas que requiere leupeptina. En la figura 46 se ofrece una descripcion general del esquema de purificacion para el Proceso 3.
Demostracion no GMP ejecutada en escala 20 l
El proceso 3 se realizo a una escala de 20 l en los laboratorios de desarrollo de procesos para demostrar si se podffa generar material de calidad adecuada utilizando este proceso modificado a escala de 20 l. Un requisito clave para el procesamiento fue la capacidad de limitar la actividad potencial de la proteasa realizando etapas refrigeradas siempre que fuera posible y mediante la inclusion del inhibidor de la cistema proteasa leupeptina en etapas clave del procedimiento. Se procesaron 20 litros completos de filtrado de fermentacion, ya que la materia prima se genero a partir de fermentacion con PP3 de 200 L. Los detalles de la fermentacion y la posterior cosecha y filtracion se documentan en un informe separado.
Tratamiento Mustang Q del filtrado de fermentacion
Despues de una filtracion de 0,2 pm, se cargaron aproximadamente 22 litros de sobrenadante de fermentacion en una capsula de cromatograffa Mustang Q como se describe anteriormente. Algo de contaminacion de pigmento visible (verde/marron) parecio eliminarse por la capsula del Mustang Q durante la filtracion de los primeros 10 litros, ya que el contenido de la primera bolsa de Stedim de 10 litros parecfa visiblemente menos pigmentado que el segundo. La capacidad de la capsula Mustang Q para eliminar el ADNdc se monitorizo a traves de esta etapa mediante un analisis de pico verde de muestras pre y post Mustang Q (Tabla 41). En el proceso, el analisis indico que, a diferencia de los datos anteriores generados a pequena escala, la eliminacion a granel de acidos nucleicos no era evidente en la etapa de Mustang Q. Por lo tanto, la consistencia y la aplicacion de esta etapa requiere mas investigacion.
Tabla 41
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Cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC)
El uso de HIC cumplio tres funciones en la purificacion. En primer lugar, el producto se redujo en volumen ya que se identificaron las condiciones en las que las colagenasas se uman a la resina. En segundo lugar, se elimino algo de contaminante de pigmento y protema en esta etapa y, en tercer lugar, el analisis de pico verde de esta ejecucion indico una reduccion de ADNdc. La etapa HIC se realizo utilizando el sobrenadante procesado directamente de la fermentacion (despues del tratamiento con Mustang Q) y, como resultado, ya no estaba presente una etapa de espera (evidente en el Proceso 2 como el sedimento de sulfato de amonio) para el Proceso 3.
Con el fin de proporcionar condiciones para que las colagenasas se unan a la columna HIC, el producto (20 l) de la etapa Mustang Q se diluyo con una solucion de sulfato de amonio 3M hasta una concentracion final de 1M. Tras la filtracion, el producto se cargo en la columna y se eluyo utilizando una elucion isocratica de 2 etapas.
La concentracion de protema del material de carga HIC fue diffcil de determinar con precision y se estimo de dos maneras. En primer lugar, se realizo un ensayo Bradford sobre el material antes de la adicion de sulfato de amonio. Esto se realizo con material no diluido para normalizar la contribucion del pigmento presente en los medios de fermentacion, que se sa^a que interfena con el ensayo. En segundo lugar, la estimacion se baso en el volumen de medios de fermentacion cargados por ml de resina de columna. La carga de la columna se estimo en 5,9 mg de protema total/ml de resina mediante el ensayo Bradford o, alternativamente, ~ 13 ml de medios de fermentacion por ml de resina. Se determino una estimacion de la cantidad total de protema diana eluida de la columna en 3,4 g usando UV (vease la Tabla 42). Suponiendo que la protema total presente en la carga de HIC era de 9 g (ensayo Bradford), esto equivalfa a una recuperacion del 38%. Sin embargo, este valor solo se considero como una medida relativa, debido a la inexactitud del ensayo para las muestras que contienen componentes de medios de fermentacion.
Un metodo alternativo para estimar la concentracion de la carga de HIC se determino mediante densitometna, aunque se reconocio que esta estimacion dana un contenido de colagenasa en lugar de una estimacion de la protema total (que podna variar entre las fermentaciones). Usando esta estrategia, las colagenasas totales se estimaron en 360 mg/l con una proporcion aproximada de AUXI a AUXII estimada en 40:60. Utilizando estos datos, la colagenasa total esperada en la carga de HIC sena de 7,2 g, lo que da un rendimiento de la etapa del 47%.
El cromatograma resultante de la etapa de HIC se muestra en la figura 70. El pigmento visible fue evidente en el flujo continuo, asf como unido a la columna. Despues de lavar la columna con el tampon de equilibrio para eliminar la contaminacion de flujo continuo, el pico 1 se eluyo utilizando una solucion de sulfato de amonio de concentracion intermedia (0,3 M).
Se demostro que este pico contema contaminantes de protemas, aunque en esta etapa tambien se eluyo algo de AUXII (figura 71). Esta perdida de producto se esperaba y se habfa senalado anteriormente. Con el fin de minimizar la cantidad de producto perdido, sin comprometer la pureza, el volumen de elucion para la eliminacion del pico 1 se establecio en 5 volumenes de columna. El pico 2, que contiene la mayor parte del producto, se eluyo a continuacion utilizando un tampon sin sulfato de amonio. El pico 2 se recolecto como un grupo unico con el metodo de cromatograffa programado de manera que la recoleccion comenzo despues de que se aplicara a la columna % de un volumen de columna de tampon de elucion. La recoleccion se termino despues de que se hubieran recolectado un total de 4 volumenes de columna. Con el fin de minimizar la potencial proteolisis en el producto en esta etapa del proceso, se anadio leupeptina al eluato post HIC y el material se mantuvo a 2-8 °C.El tiempo de espera para el eluato post HIC fue de 2 dfas de duracion.
Filtracion de flujo tangencial 1 (TFF1)
Se introdujo TFF utilizando membranas de 30 kDa despues de la HIC para reducir el volumen de producto (5 veces) y para intercambiar el tampon en condiciones adecuadas para unirse a la columna de intercambio anionico. De particular importancia fue la reduccion suficiente en el sulfato de amonio, de modo que la conductividad de la muestra de carga de IEX fue <1,8mS. El tampon de diafiltracion se enfrio y se anadio leupeptina antes de su uso para reducir la probabilidad de proteolisis. No se estimo ninguna perdida de protema en el transcurso de esta etapa (> 100% de recuperacion), aunque esto puede reflejar la inexactitud en la estimacion de la concentracion de protema en esta etapa del proceso debido a la presencia de pigmento en el material pre TFF1. Aproximadamente el 97,5% de la protema total (3325 mg) se recupero en el retenido con 204,8 mg adicionales recuperados en el primer enjuague de membrana (citado anteriormente). La filtracion de la protema total del producto retenido y el enjuague combinados se realizo al final de la etapa de TFF antes de mantener el material durante la noche a 2-8 °C. El analisis de SDS-PAGE indico que no se detectaron diferencias significativas antes y despues de la etapa de TFF (figura 71).
Cromatograffa Q-Sepharose
La columna de Q-Sepharose se cargo a una capacidad maxima de 5 mg de protema total por ml de resina. Como resultado, No se utilizo todo el material disponible de la etapa TFF en esta etapa (consulte la Tabla 421). La columna de Q-Sepharose resolvio las colagenasas AUXI y AUXII como se esperaba (figura 72). El inicio de la elucion de AUXII comenzo a aproximadamente 13,6% de B (donde el tampon A = Tris 10 mM, leupeptina 0,2 mM pH 8 y el tampon B = Tampon A NaCl 360 mM) que equivaffa a una conductividad posterior a la columna de 5,7mS. Las fracciones (100 ml) se recolectaron a lo largo de la elucion de AUXII hasta que el valor de absorbancia se redujo al 25% de la altura maxima (550 mUA). Se eluyo un pequeno pico a aproximadamente 8 mS (20,3% de B) despues de la elucion de AUXII. El analisis en proceso de este pico de experimentos previos a pequena escala indico que se trataba de material agregado derivado de AUXII. El inicio de la elucion de AUXI fue aproximadamente del 27% de B (lo que equivale a 10,4 ms). Como antes, se recogieron fracciones de 100 ml hasta que la absorbancia cayo al valor requerido del 25% (190mUA).
Cada fraccion de AUXI y AUXII recolectada se analizo mediante SDS-PAGE y se sometio a densitometna (figuras 73-76). La densitometna se realizo de forma retrospectiva, por lo que la decision sobre el agrupamiento de fracciones se baso en la experiencia de los niveles de contaminantes visibles mediante la tincion con azul coloidal. En colaboracion con Auxilium, las fracciones 6-12 se agruparon para el producto AUXII y las fracciones 19-26 se agruparon para AUXI. Los rendimientos escalonados y las concentraciones de protema presentes en el material agrupado de la ejecucion con Q-Sepharose se incluyen en la tabla 42.
El analisis de SDS-PAGE de los productos AUXI y AUXII post IEX de la ejecucion de demostracion de 20 l (figura 77 y 78) mostro pocos contaminantes visibles por SDSPAGE. Ademas, os contaminantes detectados estaban de acuerdo con experimentos previos a pequena escala, aunque se observaron diferencias en la resolucion de los contaminantes, que parecfa estar mas definido (es decir, picos o desniveles separados) en el modelo a pequena escala. Estos contaminantes tambien fueron diferentes a los identificados para el Proceso 2 en los que clostripama y gelatinasa habfan sido componentes principales. Como resultado, los protocolos de control de calidad desarrollados para el Proceso 2 no se optimizaron para la deteccion de los nuevos contaminantes asociados con el Proceso 3. La densitometna retrospectiva del material agrupado estimo la pureza en 95,1% para AUXI y 99,4% para AUXII. En la actualidad, sin embargo, la especificacion de pureza de >97% se especifica mediante RP-HPLc y no se ha establecido ninguna especificacion de producto final utilizando densitometna.
Concentration e intercambio de tampones de AUXI y AUXII
Los productos separados AUXI y AUXII de la columna Q Sepharose se procesaron por separado mediante TFF utilizando una membrana de 30 kDa. Esta etapa fue necesaria para; (i) eliminar/reducir la leupeptina en el producto final (ii) formular los intermedios en el tampon correcto (Tris 10 mM, sacarosa 60 mM, pH 8) y (iii) para lograr la concentracion de protema diana requerida de 0,9-1,1 mg/ml. Se concentraron un total de 799 mg (~ 683 ml a 1,17 mg/ml) de AUXII y 860 mg (796 ml a 1,08 mg/ml) de AUXI hasta una concentracion objetivo de 1,75 mg/ml. Esta concentracion teorica se baso en la reduccion calculada en el volumen requerido, asumiendo que no hubo perdida de producto durante la etapa de concentracion. A continuacion, se realizo una diafiltracion en el tampon de formulacion requerido, las membranas se lavaron con el volumen mmimo del sistema TFF (~ 250 ml) y la cantidad total se combino con el concentrado para lograr la concentracion objetivo requerida de 0,9-1,1 mg/ml. Estuvieron disponibles despues de la filtracion, un total de 819,5 mg de AUXII (a 1,03 mg/ml) y 797,0 mg de AUXI (a 1,09 mg/ml). En ambos casos, la mayona del producto se recupero en el retenido y se estimo en 95,4% (762 mg) para AUXII y 83,1% (715 mg) para AUXI. El material adicional proporcionado por el enjuague de membrana se estimo en 153 mg y 89,6 mg para AUXII y AUXI respectivamente.
Mezcla de intermedios a farmaco
Se combinaron aproximadamente 200 mg de cada intermedio para dar 400 mg del farmaco. A continuacion, se filtro y se proporcionaron aproximadamente 26 mg a control de calidad para su analisis. Los resultados de control de calidad para los intemedios AUXI, AUXII y el farmaco se proporcionan en la Tabla 43. Todas las pruebas en el farmaco y el intermedio AUXII pasaron la especificacion requerida. Sin embargo, la prueba de potencia del intermedio AUXI, no estaba dentro del rango especificado, aunque todas las demas pruebas pasaron. Con la excepcion del resultado de la potencia de AUXI, estos datos indicaron que el Proceso 3 fue capaz de generar material de la especificacion requerida cuando se purifico en la escala de 20 l.
Ademas de las pruebas de control de calidad, el material de la ejecucion de demostracion de 20 L se utilizo para la validacion del metodo en KBI BioPharma, Inc. A solicitud del cliente, se enviaron 200 mg de farmaco en hielo seco a KBI para la validacion de los metodos del farmaco y producto farmaceutico. La ultima prueba se realizo despues de la liofilizacion del farmaco en KBI. Ademas, se suministraron 25 mg de cada intermedio a KBI para la validacion de los metodos analfticos.
Los rendimientos de etapas individuales para la ejecucion de demostracion de 20 L se muestran en la tabla 42. Una extrapolacion de los datos en los que todo el material disponible se habfa cargado en la columna de Q-Sepharose indico que la cantidad maxima total de farmaco disponible de este proceso se ejecuto a traves de 1,6 g (suponiendo que no haya perdida de material a traves de retenciones). Esto equivale a un rendimiento global aproximado del proceso del 17,8% basado en la estimacion inicial de 9 g (utilizando el ensayo Bradford) para la cantidad de protema total disponible para cargar en la columna de HIC. Con la limitacion en la carga para la columna Q-Sepharose, estana disponible un maximo de 1,4 g de farmaco en la ejecucion actual si todos los intermedios disponibles se hubieran mezclado para formar el farmaco.
Tabla 42
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Tabla 43
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Estudio de estabilidad de la muestra
Durante la ejecucion de demostracion de 20 l, se tomaron muestras en los puntos clave del proceso. Dado que la ejecucion de demostracion se realizo como un proceso continuo (sin etapas de espera), se intento evaluar la estabilidad del material en proceso durante los tiempos de espera anticipados para lotes de GMP. La duracion extendida de la ejecucion esperada para GMP se reconocio debido al requisito de obtener datos de aclaramiento del equipo entre las etapas del proceso. El material en proceso se mantuvo a 2-8 °C durante aproximadamente la duracion esperada para la fabricacion de GMP. Ademas, se mantuvieron muestras durante un tiempo prolongado que representa dos veces lo esperado para la campana de GMP. En la tabla 44 se proporciona una descripcion de las muestras tomadas, junto con los respectivos tiempos de espera. Los tiempos de procesamiento para la ejecucion de demostracion de 20 l se representan en la tabla 45. Todas las muestras se sometieron a QC para analisis de SDS-PAGE, RP-HPLC, SEC-HPLC y UV (Figuras 79-83).
En general, los resultados no mostraron un deterioro detectable en el producto con respecto al primer punto de espera con respecto a la pureza (segun lo determinado por RP-HPLC), la degradacion (segun lo detectado por SDS-PAGE de Tris-Glicina al 8%) y la agregacion (segun lo determinado por SECHPLC) ). Sin embargo, se reconocio que algunos de los ensayos eran limitantes, ya que los componentes de baja masa molecular no senan detectados por SDS-PAGE al 8% y el ensayo RPHPLC no se habfa desarrollado para detectar los contaminantes de 40 kDa, 55 kDa y 90 kDa asociados con el Proceso 3. Algunos ensayos tambien fueron menos relevantes para muestras brutas, como el uso de UV y SEC-HPLC en las muestras de fermentacion. A pesar de estas limitaciones, el unico cambio detectado en el perfil del producto se identifico para el segundo punto de espera (dfa 12) para la muestra en proceso de AUXII tomada de la columna Q-Sepharose. Esto mostro un aumento en el nivel agregado entre el dfa 5 y el dfa 12, aunque este aumento fue solo de 0 a 0,62%.
Se realizo un segundo estudio de estabilidad en las retenciones en proceso que se tomaron en el punto de fabricacion durante la ejecucion de demostracion de 20 litros y se almacenaron a - 20 °C. En este estudio, las muestras se descongelaron e incubaron a temperatura ambiente ya 37 °C y se monitorizaron mediante un analisis de SDS-PAGE al 4-12% para permitir evaluar el intervalo de masa molecular total de contaminantes (figuras 84-88). Estos datos demostraron que las muestras antes del intercambio anionico de Q-Sepharose eran vulnerables a la degradacion. Despues de la separacion de las colagenasas AUXI y AUXII (por la columna de Q-Sepharose), las muestras paredan ser relativamente estables y paredan comparables a las muestras de tiempo cero por SDS-PAGE.
Tomados en conjunto, ambos estudios indican que siempre que la temperatura se mantenga entre 2-8 °C, no se espera que el material en proceso se deteriore durante el procesamiento durante los tiempos de espera investigados. Esto da un nivel de confianza de que el uso de leupeptina y el control de la temperatura son suficientes para restringir los niveles de degradacion del producto durante el procesamiento durante las duraciones previstas en GMP.
Tabla 44
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Tabla 45
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Estudio de estabilidad del tampon
Las muestras de tampon ilustradas en la tabla 46 se reservaron de la demostracion de 20 l y se volvieron a analizar despues del almacenamiento a 2-8 °C. El pH, la conductividad, la temperatura y el aspecto de los tampones se observaron en el momento de la finalizacion y despues de 12-13 dfas de almacenamiento. Los resultados de este estudio se dan en la tabla 47. Se observaron pequenas diferencias en los valores de pH y conductividad, pero esto puede deberse a diferencias de temperatura entre los tampones originales y las retenciones analizadas. En particular, los tampones de HIC mostraron la mayor variacion en conductividad y temperatura. Como resultado, los estudios futuros sobre la estabilidad del tampon deben incluir la especificacion de un intervalo de temperatura aceptado para registrar todos los parametros. En todos los casos, las retenciones del tampon teman una apariencia clara en el momento cero y despues del tiempo de retencion requerido.
Tabla 46
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Tabla 47
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Identificacion de contaminantes por secuenciacion N-terminal
Se detectaron tres impurezas principales para el Proceso 3 mediante analisis de SDS-PAGE. Estos paredan estar coeluidos con las colagenasas AUXI y AUXII y solo se resolvieron mediante el fraccionamiento de los picos eluidos de la columna Q-Sepharose. Los contaminantes se asignaron por su masa molecular aparente en SDS-PAGE como contaminantes de 40 kDa, 55 kDa y 90 kDa. Las fracciones con niveles elevados de un contaminante particular se enviaron para la secuenciacion N-terminal despues de la escision de la banda de SDS-PAGE.
El analisis de secuencia fue exitoso tanto para el contaminante de 55 kDa como para el de 40 kDa aislados de la ejecucion de demostracion de 20 l. Se mostro que el extremo N de la banda del contaminante de 55 kDa asociada con AUXI (Carriles 1-5; figura 89) coincide con una region de la secuencia de Col G para la colagenasa AUXI, mientras que la banda contaminante de 40 kDa de AUXII (Carriles 6-10; figura 89). ) era identica a una region de la secuencia de Col H para la colagenasa AUXII. Se realizo un intento previo para secuenciar la banda de 90 kDa asociada con los productos AUXI y AUXII (figura 90). La secuenciacion del contaminante de 90 kDa asociado con el producto AUXI fue exitosa, ya que la identidad se correlaciono con el extremo N de la secuencia AUXI. Por el contrario, no fue posible obtener una secuencia completa para el contaminante de 90 kDa asociado con AUXII, lo que sugena que los dos contaminantes de 90 kDa eran productos diferentes.
Los principales contaminantes asociados con el Proceso 3 paredan estar relacionados con el producto y se identificaron como productos escindidos del extremo N de AUXI (55kDa) y AUXII (40kDa) o un producto escindido del extremo C de AUXI (90kDa). Como estos contaminantes eran diferentes de los identificados en el Proceso 2, los ensayos de control de calidad utilizados para la especificacion de los compuestos intermedios y el farmaco no resolvieron los nuevos contaminantes, ya que el desarrollo del ensayo se origino en torno al Proceso 2. En particular, el ensayo de pureza convencional (RP-HPLC) no pudo usarse para detectar los niveles de los contaminantes de 40 kDa y 55 kDa.
Analisis de densitometria
Ejecucion de demostracion de 201
Los contaminantes de 40 kDa, 55 kDa y 90 kDa asociados con el Proceso 3 se identificaron y resolvieron mediante SDS-PAGE. Estos contaminantes se detectaron claramente en las fracciones eluidas de la columna de Q-Sepharose y paredan eluirse en los bordes anterior y posterior del perfil del pico (veanse las figuras 72-76). La decision sobre que fracciones se incluyeron o excluyeron para una purificacion adicional se baso en la experiencia de la intensidad relativa de la tincion para contaminantes y el producto en geles tenidos con azul Coloidal. Con el fin de hacer de esta una estimacion menos subjetiva, se utilizo densitometna para determinar los criterios de agrupacion espedficos para las fracciones despues de la etapa de Q-Sepharose. La densitometna se uso con preferencia al ensayo de control de calidad actual para la pureza (RP-HPLC), ya que este ensayo no pudo resolver los nuevos contaminantes asociados con el Proceso 3.
Datos de densitometna de fracciones post Q de la ejecucion de demostracion de 201
Los valores de densitometna de 2 analisis separados de las fracciones post-lEX se promediaron y se muestran en la tabla 48. Las fracciones 1-12 y el ultimo 25% (cola) del pico 1 contienen AUXII y las protemas contaminantes asociadas de 40, 75 y 90 kDa. Las fracciones 13-27 y el ultimo 25% (cola) del pico 2 contienen AUXI y los contaminantes asociados de 55 y 90 kDa. Se resaltan las agrupaciones de las fracciones seleccionadas, basadas en SDS-PAGE sin analisis densitometrico.
Tabla 48
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Documentos de resumen de densitometna de fracciones post Q de la ejecucion de demostracion de 2001
Resumen del Analisis de Densitometna
Las fracciones posteriores a IEX de la ejecucion de diseno de 200 l se analizaron varias veces para establecer un criterio de agrupacion que se puede documentar en el IEX BMR para la campana GMP. Este criterio de agrupacion se basa en la suposicion de que (i) la calidad del material generado a partir de la ejecucion de diseno es apropiada para el material GMP y (ii) la aproximacion del metodo de densitometna es aceptable. Si el objetivo es generar material de mayor calidad en la campana GMP, sera necesario revisar la especificacion para los criterios de agrupacion.
Especificacion para la agrupacion de IEX
En total, Las muestras de la ejecucion de diseno de 200 l se analizaron 6 veces (2 operadores y 3 repeticiones de cada gel) y se enviaron los datos promedio en la tabla 49. Se resaltan en rojo las fracciones que se agruparon para la ejecucion de diseno. A partir de este analisis, se pueden establecer los siguientes criterios de agrupacion:
(i) Se puede agrupar cualquier fraccion de pureza mayor o igual al 88,5%
(ii) No se puede agrupar cualquier fraccion con una sola impureza mayor o igual al 10% no se puede agrupar (iii) Las fracciones a agrupar deben ser de fracciones consecutivas.
(iv) La pureza teorica calculada de la agrupacion debe ser:
Mayor de o igual a 93% de pureza teorica para AUXI
Mayor de o igual a 96% de pureza teorica para AUXII
Este ultimo punto se baso en las estimaciones de la ejecucion de diseno de 200 L en la que se estimo la protema total en las fracciones disponibles (aunque una limitacion fue que no todas las fracciones estaban presentes para el analisis UV para AUXI). Los datos de este analisis se presentan en la tabla 50.
** NOTA: de estos criterios, la fraccion 7 para el pico de AUXII se excluina a continuacion.
Variacion del ensayo
A partir de los datos de las fracciones posteriores a IEX de la ejecucion de diseno de 200 L, se ha estimado el siguiente nivel de precision:
(i) para el producto (AUXI y AUXII) el % de VC se calculo como 2,1% (AUXI) y 2,3% (AUXII). Por lo tanto, la especificacion de pureza del 88,6% para la agrupacion podna estar en el intervalo de 86,3-90,9%.
(ii) para las impurezas, el % de VC es mucho mayor y el intervalo se ha estimado en 18,5% -33,7% dependiendo de la impureza. Por consiguiente, la especificacion de pureza de excluir fracciones con una impureza unica no superior al 10% podna ser para fracciones con un intervalo de impureza real de 6,63 - 13,37%. Por lo tanto, el valor para la pureza del producto (y no las impurezas) es el valor mas confiable para la especificacion de la agrupacion.
Pureza estimada del material final por densitometna
El analisis de densitometna del material final (DS e intermedios) para la ejecucion de diseno de 200 L tambien se ha determinado por densitometna y es como sigue:
AUXI = 96,0% (3,1% del contaminante de 90kDa)
AUXII = 98,7% (1,2% del contaminante de 90kDa)
DS = 97,6% (2,1% del contaminante de 90kDa)
(Nota: Este es el intervalo determinado para una unica SDS-PAGE analizada 3 veces por 3 operadores diferentes.) Normalizacion del metodo
En el transcurso del analisis de repeticion, el metodo de densitometna se normaliza para minimizar el error entre los operadores y la variacion entre geles y se documentara en un SOP. Mas en particular:
(i) La carga patron de protema total en cada carril del gel sera de 1 |jg.
(ii) Se seleccionara un maximo de 16 fracciones para el analisis de cada uno de los picos del producto (AUXI y AUXII). Esto limitara el numero de geles para el analisis de densitometna a 4.
(iii) Las 16 fracciones seleccionadas comenzaran en la ultima fraccion a recolectar para cada pico y avanzaran consecutivamente. Esto es para garantizar la precision en la cifra calculada para la pureza promedio (ya que es probable que se incluyan todas las fracciones a agrupar).
Tabla 49: Las cantidades relativas medias de producto e impurezas en las fracciones posteriores a IEX de la ejecucion de diseno de 200 l, segun lo determinado por el analisis de densitometna. Las fracciones agrupadas se resaltan en rojo.
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Tabla 50: Las cantidades relativas medias de producto e impurezas en las fracciones posteriores a IEX de la ejecucion de diseno de 200 l, segun lo determinado por el analisis de densitometna. Las fracciones agrupadas se resaltan en rojo. La pureza teorica promedio del producto se calcula como 92,3% y 95,8% para los intermedios AUXI AUXII res ectivamente.
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Criterios de agrupacion GMP para las fracciones posteriores a Q-Sepharose
Detalle a especificar en la BMR de intercambio ionico
A. Los siguientes criterios de agrupacion deben especificarse para las fracciones tanto de los picos AUXI como de AUXII que se han analizado por densitometna:
(i) Se seleccionara un maximo de 16 fracciones para el analisis de cada uno de los picos del producto (AUXI y AUXII). Esto limitara el numero de geles para el analisis de densitometna a 4.
(ii) Se puede agrupar cualquier fraccion de pureza mayor o igual al 90,00% (indicada a 2 lugares decimales). (iii) No se puede agrupar cualquier fraccion con una sola impureza mayor o igual al 9.00% (a 2 lugares decimales).
(iv) Las fracciones a agrupar deben ser de fracciones consecutivas.
B. Los siguientes criterios de agrupacion se deben especificar para las fracciones del pico AUXII que se han analizado mediante SEC-HPLC:
(i) El numero maximo de muestras que se enviaran para SEC-HPLC es 10 y debe ser de la ultima fraccion recolectada para este pico y las fracciones consecutivas en adelante.
(ii) No se puede agrupar cualquier fraccion con un agregado mayor o igual al 2,00% (a 2 ld).
Detalles a ser registrados solo para informacion
A. La pureza teorica estimada de la agrupacion se debe calcular solo con fines informativos y se espera que sea:
Mayor de o igual a 93,00 % de pureza teorica para AUXI
Mayor de o igual a 97,00 % de pureza teorica para AUXII
B. La cantidad minima de protema en cada grupo debe anotarse para establecer si podnan usarse en el futuro los criterios para excluir fracciones con menos de 0,5 g. C. Las fracciones para el pico AUXI se enviaran para RP-HPLC, pero se analizaran retrospectivamente y solo para informacion. Estos datos NO se consideraran como parte de los criterios de agrupacion.
Impacto esperado en la agrupacion
Se ha calculado lo siguiente a partir del conjunto de datos promedio presentado en la tabla 51 para reflejar el efecto en la seleccion de rendimiento y fraccion siguiendo los nuevos criterios de agrupacion:
Tabla 51
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Tabla 52: Las cantidades relativas medias de producto e impurezas en las fracciones posteriores a IEX de la ejecucion de diseno de 200 l, segun lo determinado por el analisis de densitometna.
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Tabla 53: Las cantidades relativas medias de producto e impurezas en las fracciones posteriores a IEX de la ejecucion de diseno de 200 l, segun lo determinado por el analisis de densitometna. Las fracciones agrupadas se resaltan en rojo. La pureza teorica promedio del producto se calcula como 92,3% y 95,8% para los intermedios AUXI AUXII res ectivamente.
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Una comparacion de 2 conjuntos de datos (es decir, las mismas muestras en proceso ejecutadas en diferentes geles por diferentes operadores) permitio que se anotaran los siguientes criterios de agrupacion retrospectiva para el conjunto de datos promedio, aunque se incluir^a una fraccion adicional (fraccion 27 de AUXI) de los que realmente se agruparon en la ejecucion de 20 l:
• AUXI
Agrupar todas las fracciones con una pureza de >87% pero que no tengan una impureza unica de >10%.
• AUXII
Agrupar todas las fracciones con una pureza de >94 % pero que no tengan una impureza unica de >4 %.
Los datos de control de calidad del analisis del material final de la ejecucion de demostracion de 20 l mostraron que el intermedio AUXII 99,4% puro, el intermedio AUXI era 99,1% puro y el farmaco era 99.9% colagenasa por RP-HPLC. Por lo tanto, se esperana que los criterios especificados para el proceso de agrupacion den como resultado material que pase las especificaciones de liberacion para el material final.
Ejecucion de demostracion de 2001
Los criterios establecidos para la ejecucion de demostracion de 20 l mencionada anteriormente fueron diferentes a los implementados para la ejecucion de diseno de 200 l. En este caso, la agrupacion se especifico para los productos tanto AUXI como AUXII como fracciones con una pureza de >86,5% pero que no teman un solo contaminante de impureza de >10%. Tambien se excluyeron las muestras de AUXII con un nivel de impureza >2% detectado por SEC-HPLC. Los intermedios AUXI/AUXII resultantes y el farmaco tambien se analizaron por densitometna, usando un metodo normalizado, y se demostro que tienen la siguiente pureza estimada basada en el analisis de un solo gel 3 veces (3 operadores diferentes): AUXI = 96,0% (3,1% del contaminante de 90kDa); AUXII = 98,7% (1,2% del contaminante de 90kDa); DS = 97,6% (2,1% del contaminante de 90kDa).
Ademas, se demostro que la pureza determinada de por el control de calidad de los compuestos intermedios y el farmaco superaba la especificacion mediante el ensayo RP-HPLC (AUXI = 98,2%; AUXII = 98,1 %; farmaco = 99,4%). Por consiguiente, los criterios de agrupacion seguidos para la ejecucion de diseno de 200 L tuvieron exito en la entrega de un producto de pureza adecuada basado en los metodos analfticos disponibles en la actualidad.
Materiales y metodos
Cromatograffa Mustang Q (ejecucion en escala de 20 L)
Equipo:
Capsula de cromatograffa Mustang Q, 60 ml (CL3MSTGQP1, Pall)
Medidor de pH y conductividad 4330 (Jenway)
Productos qufmicos:
Cloruro de sodio (grado USP, Merck)
Solucion de hidroxido de sodio (volumetrico 4M) (AnalaR, BDH)
Tris (hidroximetil) metilamina (grado USP, Merck)
Sulfato de amonio (Extra Pure, Merck)
Agua de inyeccion Hyclone - Calidad de agua (API-QW)
Se desinfecto una capsula de cromatograffa Mustang Q de 60 ml de volumen de lecho con NaOH 1M a un caudal de 30 ml/min durante 30 minutos. La capsula se acondiciono previamente durante el mismo tiempo y caudal utilizando NaCl 1M. La capsula se equilibro con 2 litros de tampon de equilibrio Mustang Q (Tris 10 mM, sulfato de amonio 1M, pH 8), a un caudal de 60 ml/min. El flujo de salida se verifico para asegurar que el pH fuera <8. El sobrenadante (22 l) de fermentacion con PP3 de 200 l (que se habfa filtrado a 0,2 pm) se cargo en la capsula a un caudal de 540 ml/min (aproximadamente 40 min. de duracion). El caudal de operacion maximo recomendado para la capsula fue de 600 ml/min. El material filtrado se almaceno en 2 bolsas Stedim de 10 l a 2-8 °C durante la noche.
Cromatograffa de Interaccion Hidrofobica (eiecucion en escala de 20 L)
Equipo:
AKTA Pilot instalado con el software Unicorn V 5.01 (GE Healthcare)
Columna Vantage S130 (seccion transversal 125 cm2, Millipore)
Medidor de pH y conductividad 4330 (Jenway)
Capsula de filtro Sartopore 20,8 0,45 pm (Sartorius)
Unidad de Refrigeracion Medica MP150 (Electrolux)
Productos qufmicos:
Fenil Sepharose 6 FF sub bajo (GE Healthcare)
Solucion de hidroxido de sodio (volumetrico 4M) (AnalaR, BDH)
Cloruro de sodio (grado USP, Merck)
Tris (hidroximetil) metilamina (grado USP, Merck)
Sulfato de amonio (Extra Pure, Merck)
Leupeptina (MP Biomedicals, Inc)
Agua de inyeccion Hyclone - Calidad de agua (API-QW)
Envasado de las columnas de HIC
Se sedimentaron 2400 ml de suspension de Fenil Sepharose 6 FF Sub bajo (Lote n. ° 312089) durante 3 horas y se elimino el etanol y se reemplazo con 1800 ml de API. Los medios se resuspendieron (50%), se sedimentaron y se lavaron una vez con API y dos veces con 1800 ml de NaCl 200 mM, y se sedimentaron durante la noche entre lavados. Los medios se resuspendieron con 1800 ml de NaCl 200 mM, se vertieron en la columna y se dejaron sedimentar durante 1 h. El adaptador se redujo a ~ 1 cm por encima del lecho de resina (eliminando todas las burbujas de aire) y el medio se envaso en NaCl 200 mM a un caudal de 400 ml/min (192 cm/h) durante 10 min. Esta tasa de flujo de envasado se utilizo como equivalente a la tasa maxima de flujo de operacion para el sistema K-prime disponible en GMP. El adaptador se bajo a la parte superior del lecho y la columna se envaso a 192 cm/h durante 10 minutos antes de atornillar el adaptador en la parte superior de la resina y se envaso a 192 cm/hora durante otros 10 minutos, durante los cuales no se observo compresion de la resina. La prueba de paquete se llevo a cabo utilizando el metodo AKTA Pilot: HIC 1500 ml Pack Test. Para ello, la columna se equilibro con 1 volumen de columna (VC) de NaCl 200 mM en API y el paquete se probo con 15 ml (1% de VC) de NaCl 1 M en API a un caudal de 313 ml/min (150 cm/h). La columna se lavo con 2VC de API y se almaceno con 2VC de NaOH 10 mM. La columna envasada tema una asimetna de 1,2, un recuento de placas de 2659 placas/metro, un VC de 1525 ml y una altura del lecho de 12,2 cm.
Desinfeccion y equilibrio de columnas
La columna Fenil Sepharose 6 FF (sub bajo) se desinfecto con NaOH 0,5 M durante 60 minutos, se lavo con 2 volumenes de columna (VC) de API y se equilibro con 5VC 10 mM Tris, pH 8 (Tampon B de HIC) seguido de 5VC de Tris 10 mM, sulfato de amonio 1,0M, pH 8 (Tampon A de HIC).
Preparation de la carga de HIC
Se anadio 13,48 kg (11,05 l) de sulfato de amonio 3,0 M, Tris 10 mM, pH 8 a 22,1 kg de filtrado de fermentacion despues del tratamiento con Mustang Q (seccion 3.1). El filtrado se mezclo durante 5 minutos antes de filtrar a traves de una capsula de filtro de 0.05m2 (0,8 0,45 pm). El material filtrado (indicado como material de carga de HIC) se almaceno en hielo (aproximadamente 30 minutos de duracion) hasta su uso.
Ejecucion de las columnas de HIC
La ejecucion de HIC se realizo a un caudal lineal constante de 150 cm/hora utilizando tampones enfriados mantenidos a 2-8 °C. Se cargaron 30 l de materia prima (equivalente a 20 l del filtrado post-Mustang Q) en la columna de Fenil Sepharose 6 FF de 1525 ml (sub bajo) equilibrada previamente con 2 VC de Tris 10 mM, sulfato de amonio 1,0M, pH 8 (Tampon A de HIC). El material no unido se lavo de la columna con 10VC de tampon A de HIC. La columna se lavo a continuacion con 5VC de Tris 10 mM, sulfato de amonio 0,3M, pH 8 (Tampon A2 de HIC) y las protemas unidas se eluyeron con 10VC de Tris 10 mM, pH 8 (Tampon B de HIC). Los primeros 0,67 VC (1 L) del tampon de elucion se descartaron y se recogio una agrupacion post-HIC de 4VC. Se anadio leupeptina (126,4 ml) a la agrupacion post-HIC (6191,3 g) a una concentracion final de 200 pM de una solucion madre de leupeptina 10 mM, Tris 10 mM, pH 8. La solucion mixta (6,3 kg) se almaceno a 2-8 °C durante 2 dfas antes del procesamiento adicional mediante filtracion de flujo tangencial.
Etapa 1 de Filtracion de flujo tangencial (TFF1 ejecucion de escala de 20 l)
Equipo:
Sistema ProFlux M12 TFF (Millipore)
Medidor de pH y conductividad 4330 (Jenway)
Capsula de filtro Sartopore 20,8 0,45 pm (Sartorius)
Membranas de filtro Pellicon 2 "Mini" de 0,1 m230kDa MWCO PES (Millipore)
Unidad de Refrigeracion Medica MP150 (Electrolux)
Materiales/Qufmicos:
Solucion de hidroxido de sodio (volumetrico 4M) (AnalaR, BDH)
Tris (hidroximetil) metilamina (grado USP, Merck)
Leupeptina (MP Biomedicals, Inc)
Agua de inyeccion Hyclone - Calidad de agua (API-QW)
Configuration del Sistema
El sistema ProFlux M12 TFF se configuro de acuerdo con las instrucciones del fabricante con dos membranas Pellicon 2 "Mini" Filter 30kDa MWCO PES, se desinfectaron con NaOH 0,5 M durante 60 minutos y se almacenaron en NaOH 0,1 M hasta su uso. El sistema se dreno y se enjuago con 14 L de API y se midio la permeabilidad al agua normal (NWP) como 23 L/m2/h/psi a 25 °C a una presion trans-membrana (TMP) de 15 psig (presion de entrada de 20 psig y presion de salida de 10 psig). El sistema se lavo con 0,5 l de Tris 10 mM, pH 8 (tampon de diafiltracion) y se equilibro con 1 l del mismo tampon durante 10 minutos. La conductividad y el pH del permeado se determinaron y compararon con el del tampon de diafiltracion para garantizar que las membranas se equilibraran antes de su uso. Concentration y diafiltracion
Las etapas de concentracion y diafiltracion se realizaron con un tampon de diafiltracion enfriado (Tris 10 mM, pH 8) que contema leupeptina 200 pM. El sistema TFF se lavo con 1 l de tampon enfriado justo antes de su uso. Se bombearon 2 l del material post-HIC (6,3 l de volumen total) al deposito del sistema TFF y se recirculo durante 10 minutos sin contrapresion para acondicionar la membrana. El sensor de nivel en el deposito se ajusto a 1,2 L y el material post-HIC se concentro a una TMP de 15 psig (presion de entrada de 20 psig y presion de salida de 10 psig) hasta que todo el material ingreso al sistema. El permeado se recogio y almaceno a 2-8 °C para su analisis. El tubo de entrada se conecto al tampon de diafiltracion y la diafiltracion del material se realizo a una TMP de 15 psig (presion de entrada de 20 psig y presion de salida de 10 psig) para aproximadamente 8,5 volumenes de rotacion (TOV), manteniendo el volumen de material en el deposito a 1,2 l. La conductividad y el pH del permeado se determinaron despues de 5, 7 y 8,5 TOV y se compararon con los del tampon de diafiltracion. El retenido se dreno del sistema y se almaceno a 2-8 °C. Se bombearon 250 ml de tampon de diafiltracion en el deposito, recirculado alrededor del sistema durante 10 minutos sin contrapresion para enjuagar el sistema, drenar, enjuagar de manera repetida y se almacenaron ambos enjuagues por separado a 2-8 °C. La concentracion de protema del retenido y los enjuagues se determino (por UV) y el primer enjuague (204,8 g de peso) se agrego al retenido (1231,4 g de peso).
Este material post TFF1 (1,4 kg) se filtro a continuacion a traves de una capsula de filtro Sartopore 20.8 0,45 pm y se almaceno a 2-8 °C durante la noche hasta el procesamiento adicional mediante cromatograffa de intercambio ionico Q Sepharose.
Cromatograffa de Intercambio Ionico (ejecucion en escala de 20 L)
Equipo:
AKTA Pilot instalado con el software Unicorn 5.01 (GE Healthcare)
Medidor de pH y conductividad 4330 (Jenway)
Columna Vantage S90 (seccion transversal 62cm 2, Millipore)
Unidad de Refrigeracion Medica MP150 (Electrolux)
Productos qufmicos:
Solucion de hidroxido de sodio (volumetrico 4M) (AnalaR, BDH)
Cloruro de sodio (grado USP, Merck)
Tris (hidroximetil) metilamina (grado USP, Merck)
Cloruro de calcio 2-hidrato (grado USP, Merck)
Leupeptina (MP Biomedicals, Inc)
Q Sepharose HP (GE Healthcare)
Agua de inyeccion Hyclone - Calidad de agua (API-QW)
Envasado y preparacion de la columna
Se empaqueto una columna Vantage S90 utilizando un sistema de cromatograffa AKTA Pilot con medios Q Sepharose HP en API para obtener una columna envasada con una altura de lecho de 10 cm, por lo tanto un volumen de columna (VC) de 620 ml. El envasado se realizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero con el ffmite de presion de la columna Vantage impuesta (0,3MPa), lo que equivale a un flujo de envasado de 210 cm/hr y un ffmite de presion de 0,28MPa. Despues del envasado, la columna se equilibro con 2VC de NaCl 0,2 M y el paquete se probo con 1% de VC (6,2 ml) de NaCl 1 M a un caudal de 100 cm/h (103 ml/min). La columna envasada tema una asimetna de 1,6 y un recuento de placas de 12605 placas/metro, que estaba dentro de las especificaciones para los medios (asimetna entre 0,8 y 1,8, con un recuento de placas> 10.000). La columna se almaceno en NaOH 10 mM hasta que se necesito.
Antes de usarse, la columna de Q-Sepharose se lavo con 1,5 volumenes de columna (VC) de API para eliminar el tampon de almacenamiento, se desinfecto con NaOH 0,5 M durante 60 minutos a 40 cm/h antes de enjuagar nuevamente con 1,5 VC de API. A continuacion, se cargo y se equilibro la columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante con 2VC de Tris 10 mM, cloruro de calcio 3 mM, pH 8 seguido de 2VC de Tris 10 mM, CaCl23 mM, NaCl 360 mM, pH 8 y finalmente y 5 VC de Tris 10 mM, CaCl23 mM, pH 8.
Ejecucion de columna
Inmediatamente antes de cargar la muestra en la columna, la columna se reequilibro con Tris 10 mM enfriado, CaCl2 3 mM, leupeptina 200 pM pH 8 (Tampon A de IEX). Se cargaron 1216 ml de material post-TFF 1 enfriado a una concentracion de 2,55 mg/ml (determinada por UV) en la columna a un caudal de 100 cm/h (103 ml/min). Esto equivale a una carga de columna de 5 mg de protema total por ml de medio. Despues de cargar el producto, la columna se lavo con 3 volumenes de columna (VC) de Tampon A de IEX y la protema se eluyo con Tris 10 mM, CaCl23 mM, NaCl 360 mM, leupeptina 200 pM, pH 8 (Tampon B de IEX) con un gradiente de 0-40% de tampon de elucion (A a B), sobre 20 VC a un caudal de 70,2 ml/min (68 cm/h). La elucion se controlo a 280nm y 260nm y las fracciones de 100 ml recogidas a traves de los dos picos del producto que conteman AUX II y AUX I. La recoleccion de fracciones se inicio a partir del avance del pico y continuo hasta el 25% de la altura del pico en el borde posterior. Se recogieron un total de 12 fracciones a lo largo del pico AUX II y 15 fracciones a lo largo del pico AUX I. La cromatograffa Q Sepharose HP se llevo a cabo a una temperatura convencional de laboratorio de 18-23 °C, aunque los tampones utilizados fueron enfriados previamente. Las fracciones se almacenaron a 2-8 °C hasta que se obtuvo un resultado del analisis de SDSPAGE. Las fracciones 6 a 12 (pico 1) se agruparon como colagenasa AUX II con el volumen determinado como 683 g (despues del muestreo) y la concentracion mediante analisis UV se midio como 1,17 mg/ml. Las fracciones 19 a 26 (pico 2) se agruparon como colagenasa AUX I con el volumen determinado como 796 g (despues del muestreo) y la concentracion por UV se midio como 1,08 mg/ml.
Etapa 2 de Filtracion de flujo tangencial (TFF2 ejecucion de escala de 20 l)
Equipo:
Sistema ProFlux M12 TFF (Millipore)
Medidor de pH y conductividad 4330 (Jenway)
Membrana Pellicon 2 "Mini" Filter 0,1m230kDa MWCO PES (Millipore)
Unidad de filtro de 90 mm (1 l) Membrana PES de 0,2 pm (Nalgene)
Unidad de Refrigeracion Medica MP150 (Electrolux)
Materiales/Qufmicos:
Solucion de hidroxido de sodio (volumetrico 4M) (AnalaR, BDH)
Tris (hidroximetil) metilamina (grado USP, Merck)
Sacarosa (grado BP, Merck)
Leupeptina (MP Biomedicals, Inc)
Agua de inyeccion Hyclone - Calidad de agua (API-QW)
Agua para inyeccion de Fresenius Kabi (API)
Configuracion del Sistema
El sistema ProFlux M12 TFF se configuro de acuerdo con las instrucciones del fabricante con una membrana Pellicon 2 "Mini" Filter 30kDa MWCO PES, se desinfecto con NaOH 0,5 M durante 60 minutos y se almaceno en NaOH 0,1 M hasta su uso. El sistema se dreno y se lavo con 14 L de API y la permeabilidad al agua normal (NWP) se midio como 19,5 L/m2/h/psi para la membrana utilizada para AUXI y como 14,5 L/m2/hora/psi a 25 °C para la membrana utilizada para AUXII a 25 °C y a una presion trans-membrana (TMP) de 15 psig (presion de entrada de 20 psig y presion de salida de 10 psig). El sistema se lavo con 0,5 l de Tris 10 mM, sacarosa 60 mM, pH8 (tampon de Formulacion) y se equilibro con 1 l del mismo tampon durante 10 minutos. La conductividad y el pH del permeado se determinaron y compararon con los del tampon de formulacion.
Concentracion y formulacion
Las etapas de concentracion y diafiltracion se realizaron por separado en cada uno de las agrupaciones post IEX de AUXI y AUXII. Todas las etapas se realizaron utilizando un tampon de formulacion enfriada (Tris 10 mM, sacarosa 60 mM, pH 8 mantenido a 2-8 oC. El sistema TFF se lavo con 1 l de tampon enfriado justo antes de su uso. La agrupacion post-IEX (683 g de peso de AUXII y 796 g de AUXI) se bombeo al deposito del sistema TFF y se hizo recircular a una velocidad de bombeo del 10% durante 10 minutos sin contrapresion para acondicionar la membrana. El sensor de nivel en el deposito se ajusto a aproximadamente 400 ml y la agrupacion de AUXI o AUXII se concentro a una TMP de 15 psig (presion de entrada de 20 psig y presion de salida de 10 psig) hasta que el volumen en el deposito se redujo a aproximadamente 360-390 ml (esto supuso un sistema con un volumen de 100 ml). La reduccion del volumen objetivo se baso en lograr una concentracion teorica de 1,75 mg/ml para el producto, suponiendo que no haya perdida de protema durante la operacion de concentracion. El permeado se recogio y almaceno a 2-8 °C para su analisis. Para la operacion de diafiltracion, el tubo de entrada se conecto al tampon de formulacion y la diafiltracion se realizo a una TMP de 15psig (presion de entrada de 20psig y presion de salida de 10psig). Se realizaron aproximadamente 12 volumenes de rotacion (TOV) para AUXII y 8,5 TOV para AUXI, manteniendo el volumen de material en el deposito a ~ 400 ml. La conductividad y el pH del permeado se determinaron despues de 12 TOV para AUXII y despues de 6, 7 y 8,5 TOV para AUXI y se compararon con los del tampon de formulacion. El retenido se dreno del sistema y se almaceno a 2-8 °C. Se utilizaron 250 ml de tampon de formulacion para lavar el producto residual de las membranas mediante la recirculacion alrededor del sistema durante 10 minutos (sin contrapresion). Despues de drenar la solucion de enjuague, se realizo un segundo lavado y tanto el enjuague 1 como el enjuague 2 se almacenaron a 2-8 °C.Despues de la determinacion UV del contenido de protema del retenido y los enjuagues, el primer enjuague se anadio al retenido, se mezclo y se determino la concentracion de protema de UV de la mezcla. Para AUXII, tambien se agregaron 122 g del segundo enjuague al retenido mas el enjuague 1 para dar una concentracion teorica de AUXII de 1,1 mg/ml. Para AUXI, se agregaron 94 g del segundo enjuague al material para dar una concentracion teorica de AUXI de 1,1 mg/ml. Tanto el material AUXI como el AUXII se filtraron a traves de una unidad de filtro Nalgene de 0,2 pm 1 l en una campana de Clase II y se determino la concentracion de protema postfiltrada. Los intermedios AUXI y AUXII se almacenaron a 2-8 °C.
Determinacion de la concentracion de protemas
Absorbancia
Equipo:
Espectrofotometro DU800 (Beckman)
En el proceso, las muestras se analizaron mediante espectrofotometna UV realizando una exploracion UV de muestras entre 220 y 330 nm. El tampon apropiado se uso como blanco y se realizo un escaneo del blanco de tampon antes de escanear las muestras. En caso necesario, Las muestras se diluyeron con el mismo tampon para asegurar que A280 <1,0 UA. Las concentraciones de protema (mg/ml) se determinaron de acuerdo con la ley de Beer-Lambert, c = A/b.£, donde A es la absorbancia (A280-A330), b es la longitud (1,0 cm) y £ es el coeficiente de extincion de la protema. Se utilizaron coeficientes de extincion de 1,48 mg-1 cm-1 ml para AUXI, 1,576 mg-1 cm-1 ml para AUXII y 1,428 mg-1 cm-1 ml para una mezcla AUXI/AUXII.
Ensayo Bradford
Materiales:
BSA Liofilizado (hidratado a 1,4 mg/ml)
Productos qufmicos:
Concentrado de Reactivo de Tinte de Ensayo de Protema (500-0006, Bio - Rad)
Se prepare una curva patron de BSA diluyendo BSA con agua, a concentraciones conocidas. El reactivo de tinte de ensayo de protema Bio-Rad se prepare diluyendo una parte de concentrado con cuatro partes de agua. Las muestras de prueba se prepararon diluyendo con agua. Se agregaron 50 j l de muestra de prueba, ya sea pura o diluida, a una cubeta y se agregaron 2,5 ml de reactivo diluido. Las muestras se prepararon por duplicado. Las muestras se incubaron durante 10 minutos antes de leer la DO. La curva patron de DOs95nm frente a la concentracion de protema se obtuvo al medir la DO595nm de soluciones de BSA de concentracion conocida. Las muestras de prueba se ensayaron y la concentracion de protema se determino a partir de la curva de ensayo de protema patron. Las muestras de la etapa posterior a Mustang Q se analizaron siempre sin dilucion para estandarizar la contribucion del pigmento. En este caso, se utilizaron 50 j l del material no diluido posterior a Mustang Q en el ensayo.
Analisis de SDS-PAGE
Equipo:
Sistema de electroforesis Xcell SureLock Mini-Cell (Invitrogen)
Fuente de alimentacion de electroforesis EPS 601, (Amersham Pharmacia Biotech)
Plataforma agitadora Rocky, (Scientific Laboratory Supplies)
Productos qufmicos:
Patron de SDS-PAGE de alto peso molecular (161-0303, Bio Rad)
Mark12 patron sin tenir (LC5677, Invitrogen)
Geles de Tris-Glicina al 8% de Novex, 1,5 mm, 10 pocillos (EC6018BOX, Invitrogen)
geles Bis-Tris al 4-12 % de NuPAGE Novex, 1,0 mm, 12 pocillos (NP0322BOX, Invitrogen)
Tampon de ejecucion de SDS Tris-Glicina de Novex (10x) (LC2675, Invitrogen)
Tampon de ejecucion de SDS de MES NuPAGE (20x) (NP0002, Invitrogen)
Tampon de muestra de SDS Tris-Glicina de Novex (2x) (LC2676, Invitrogen)
Tampon de Muestra NuPAGE LDS (4x) (NP0007, Invitrogen)
Agente de reduccion de muestras NuPAGE (10x) (NP0009, Invitrogen)
Kit de tincion de azul Coloidal (LC6025, Invitrogen)
Sal disodica del acido etilendiaminotetraacetico Analar R (BDH)
Geles de Tris-Glicina
Las muestras se prepararon para la SDS-PAGE reductora mediante la adicion de 12 j l de muestra a 20 j l de tampon de muestra (2x), 4 j l de agente reductor (10x) y 4 j l de EDTA 0,1M (para lograr una concentracion final de 10 mM). El marcador de alto peso molecular (HMW) se prepare agregando 10 j l de solucion madre concentrada a 80 j l de agente reductor (10x), 310 j l de API y 400 j l de tampon de muestra (2x). El HMW diluido convencional se calento a continuacion a 95 °C durante 5 minutos antes de hacer alfcuotas y el almacenamiento a -20 °C para su uso en geles posteriores. Las muestras (volumen de carga de 20 jl) que conteman colagenasas se ejecutaron directamente (es decir, sin tratamiento termico previo) en geles de Tris-Glicina al 8% utilizando tampon de ejecucion de tris-glicina a 130 V durante aproximadamente ~2horas. Tras la electroforesis, los geles se tineron con un reactivo de tincion azul coloidal segun las instrucciones del fabricante.
Geles de Bis-Tris
Las muestras se prepararon para reducir SDS-PAGE mediante la adicion de 16 -5 j l de muestra a 7,5 j l de tampon de muestra (4x), 3 j l de agente reductor (10x) y 3 j l de EDTA 0,1M (para lograr una concentracion final de 10 mM). Marcador MARK 12 cargado puro(10 jl). Las muestras (15 j l de volumen de carga) que conteman colagenasas se procesaron directamente (es decir, sin tratamiento termico previo) en geles de Bis-Tris al 4-12% utilizando un tampon de ejecucion MES a 200 V durante ~40 minutos. Tras la electroforesis, los geles se tineron con un reactivo de tincion azul coloidal segun las instrucciones del fabricante o con tincion de plata usando un procedimiento convencional (GE Healthcare).
Analisis de densitometna de fracciones post-IEX
Equipo:
Sistema de electroforesis Xcell SureLock Mini-Cell (Invitrogen)
Fuente de alimentacion de electroforesis EPS 601, (Amersham Pharmacia Biotech)
Plataforma agitadora Rocky, (Scientific Laboratory Supplies) Escaner plano (Hewlett Packard) Materiales/Qufmicos:
geles Bis-Tris al 4-12 % de NuPAGE Novex, 1,0 mm, 12 pocillos (NP0322BOX, Invitrogen)
Tampon de ejecucion de SDS de MES NuPAGE (20x) (NP0002, Invitrogen)
Tampon de Muestra NuPAGE LDS (4x) (NP0007, Invitrogen)
Agente de reduccion de muestras NuPAGE (10x) (NP0009, Invitrogen)
Mark12 patron sin tenir (LC5677, Invitrogen)
Kit de tincion de azul Coloidal (LC6025, Invitrogen)
Sal disodica del acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) (AnalaR, BDH) Agua purificada
SDS-PAGE Reductora
Las muestras post-IEX se procesaron en geles Bis-Tris al 4-12% utilizando un tampon de ejecucion MES a 1 pg/carril de carga. Las muestras se prepararon agregando 20 pl de material diluido post-IEX a 8 pl de tampon de muestra (4x), 3 pl de Agente Reductor (10x) y 3,4 pl de EDTA 0,1M. Se cargaron 15 pl de cada muestra en el pocillo directamente despues de la mezcla (es decir, sin tratamiento termico) y se ejecutaron a 200 V durante 40 minutos. Tras la electroforesis, los geles se tineron con el reactivo de la tincion de Azul Coloidal segun las instrucciones del fabricante, pero con una duracion de tincion fija para reducir la variacion de la tincion (fijacion de 10 minutos, 5 horas de tincion, 15-20 horas con agua purificada).
Escaneo de gel y densitometria
Los geles se colocaron entre 2 hojas de acetato para asegurar la eliminacion de todas las burbujas de aire, se escanearon en un escaner de lecho plano a una resolucion de 600 ppp y la imagen se recorto, se cambio el tamano y se corrigio el color con el software HP Image zone. La imagen se convirtio en una imagen TIFF en escala de grises de 8 bits con el software Alpha EaseFC y las bandas de protemas se analizaron utilizando el software de documentacion en gel QuantityOne (BioRad). Despues de la sustitucion de fondo, las areas de pico de intensidad de las bandas seleccionadas se convirtieron a valores de porcentaje relativo de producto (AUXI o AUXII) e impurezas en cada carril.
Estabilidad del Tampon
Equipo:
Bomba Peristaltica (Watson Marlow)
125 ml de biotainers PETG (Cellon)
Tubo Watson Marlow para bomba peristaltica
Medidor de pH y conductividad 4330 (Jenway)
Capsula de filtro Sartopore 2300 (0,45/0,2 pm) (Sartorius)
Los tampones para la ejecucion de demostracion de 20 l se filtraron despues de la preparacion a traves de una capsula de filtro de 0,45/0,2 pm en bolsas Stedim de 10 o 20 l para su almacenamiento a 2-8 °C antes de su uso. Cuando se filtro la mayor parte del tampon, se recogieron aproximadamente 75 ml del tampon restante en biotainers PETG de 125 ml previamente etiquetados y se almacenaron a 2-8 °C. Se registraron el pH, la conductividad, la temperatura y la fecha de preparacion del tampon. Al finalizar la ejecucion de demostracion de 20 l, las muestras de tampon se recuperaron del almacenamiento en frio y se volvio a analizar el pH, la conductividad y la apariencia. Tambien se registro la temperatura del tampon en el momento de la prueba.
Preparacion de muestras para analisis de secuenciacion N-terminal
Equipo:
Fuente de alimentacion de electroforesis EPS 601, (Amersham Pharmacia Biotech)
Sistema de electroforesis Xcell SureLock Mini-Cell, (Invitrogen)
Plataforma agitadora Rocky, (Scientific Laboratory Supplies)
Productos qufmicos:
Geles de Tris-Glicina al 8% de Novex, 1,5 mm, 10 pocillos, (Invitrogen)
Marcador de Alto Peso Molecular, (BioRad)
Agente de reduccion de muestras NuPAGE (10x), (Invitrogen)
Tampon de ejecucion de SDS Tris-Glicina de Novex (10x), (Invitrogen)
Tampon de muestra de SDS Tris-Glicina de Novex (2x), (Invitrogen)
Kit de Tincion Azul Coloidal, (Invitrogen)
Sal disodica del acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) (AnalaR, BDH)
Metanol, AnalaR (BDH)
Acido acetico, AnalaR (BDH)
Agua para inyeccion (API)
Agua purificada
Las muestras para la secuenciacion N-terminal se prepararon y se separaron en geles de Tris-glicina al 8% como se describe anteriormente. Las muestras identificadas como enriquecidas para el contaminante de 40 kDa (fraccion 2 del pico de AUXII post IEX, CTL2006 n.° 0610H;) y el contaminante de 55 kDa (fraccion 16 del pico de AUXI post IEX, CTL2006 n^ 0611H) se cargaron cada una en 5 carriles del gel para proporcionar material suficiente para la secuenciacion (figura 89). Las fracciones post IEX de una fermentacion previa de 20 l (20 l de PP3), que se enriquecieron para los contaminantes de 90 kDa asociados con ambos AUXI (fraccion B7 R2, CTL2006 n^ 0581P) y AUXII (fraccion D1, CTL2006 n^ 0582P) tambien se cargaron en varios carriles (figura 90). Tras la electroforesis, los geles se tineron con reactivo de tincion azul coloidal segun las instrucciones del fabricante y las bandas de contaminantes se cortaron y enviaron a Alta Bioscience (Universidad de Birmingham, Reino Unido) para la secuenciacion N-terminal. El contaminante asociado con AUXI de 90 kDa (CTL2006 n^ 0612H) de la ejecucion de demostracion de 20 l tambien se envio para secuenciacion pero no se obtuvieron datos.
RESUMEN DE LA FABRICACION DEL PROCESO 3
Fermentacion
El proceso de fermentacion discontinua alimentada con Fitona (Proceso 2) para la produccion de colagenasa a partir de Clostridium histolyticum ha demostrado ser altamente variable debido a la variabilidad de lote a lote en la Fitona peptona. Por este motivo, se evaluo la proteosa peptona n^ 3 (PP3) en fermentaciones de 5 l. La evaluacion demostro que cuando se usaba un lote espedfico de PP3 a 50 g/l, el proceso de fermentacion era consistente y reproducible. Sin embargo, cuando se emplearon otros lotes de PP3 a 50 g/l, se observaron grandes variaciones en los perfiles de crecimiento de los cultivos. La concentracion maxima de biomasa que apoyanan los diversos lotes de PP3 se evaluo en una evaluacion a pequena escala. Estos lotes se consideraron "buenos" o "malos" en funcion de su capacidad para soportar concentraciones altas o bajas de biomasa de C. histolyticum respectivamente. Cuando se realizaron dos fermentaciones a escala de 5 l con lotes "malos" y "buenos" de p P3 a 100 g/l, ambos demostraron perfiles de crecimiento y rendimientos de producto altamente similares. Este experimento mostro que aumentar la concentracion de PP3 a 100 g/l aliviaba el problema asociado a la variacion de lote a lote en la peptona.
Se llevo a cabo una ampliacion de la escala de fermentacion a 200 l. La fermentacion utilizo la concentracion optimizada de PP3 (100 g/l). La fermentacion fue exitosa y replico tanto el perfil de crecimiento como el rendimiento/calidad del producto observados a escala de 5 l. El proceso de cosecha (aclarado por filtracion) desarrollado para el Proceso 2 se evaluo durante la fermentacion ampliada a 200 l. El cultivo celular se aclaro con exito utilizando el proceso existente sin bloqueo del tren de filtracion.
La cuantificacion de la concentracion de colagenasa en muestras de fermentacion brutas se mejoro mediante el analisis de densitometna de los geles de Tris Glicina tenidos con Coomassie. Se cargo una curva patron de mezcla de AUXI y AUXII con diluciones de muestras de fermentacion. La relacion entre la concentracion de colagenasa y el area del pico de densitometna se mostro lineal dentro del intervalo de las diluciones de la muestra. Las concentraciones de colagenasa en las muestras se extrapolaron a continuacion utilizando su area de pico y la curva patron. Este metodo estimo que el rendimiento de colagenasa era de 280 a 350 mg/l a partir del proceso con PP3 de 100 g/l a escala de 5 y 200 l.
El proceso optimizado de fermentacion con PP3 genero una mayor concentracion de biomasa (DO6007 unidades) y un mayor rendimiento del producto (280 - 350 mg/l de colagenasa total, por densitometna cuantitativa) en comparacion con el proceso de alimentacion discontinua con Fitona. El filtrado de fermentacion contema significativamente menos clostripama que el proceso con Fitona. La proporcion de AUXI: AUXII fue mas cercana a 1 en comparacion con la observada durante la evaluacion del Proceso 2. En resumen, el proceso con PP3 aumento el rendimiento del producto, la pureza (post-fermentacion) y la reproducibilidad de la fermentacion.
Purificacion
El proceso 3 se desarrollo en un marco de tiempo acelerado para mejorar los procesos desarrollados previamente en Cobra (Proceso 2) y ejecutarse a una escala de 20 l en GMP. Se realizaron mejoras importantes en el proceso para simplificar el proceso de purificacion, facilitar la consistencia y hacer que el proceso sea mas facil de escalar hasta 200 l. Estas mejoras tambien se consideraron claves para ayudar a la validacion del proceso.
El proceso 3 se realizo utilizando material de una fermentacion de 200 litros de Clostridium histolyticum en el que se purificaron 20 litros completes de fermentacion. El material se proceso directamente a partir de la fermentacion y no se implementaron etapas de espera. Despues de la filtracion, el producto se paso a traves de un filtro Mustang Q, ya que los experimentos a pequena escala demostraron la reduccion de ADNdc (segun lo detectado por el analisis de pico verde) utilizando este procedimiento. Sin embargo, el analisis de las muestras en proceso de la ejecucion de demostracion de 20 l, no mostro una reduccion en el ADNdc, lo que sugirio que la consistencia y la aplicacion de esta etapa requieren una investigacion adicional. Una comparacion de los parametros utilizados para la ejecucion de 20 L y los experimentos previos a pequena escala demostraron la eliminacion del ADNdc cuando la capsula estaba sobredimensionada por un factor de 1000 (basado en las capacidades de union al ADN de 15-25 mg de capsula de ADN/ml descrita por el fabricante). En comparacion, la capsula utilizada en la ejecucion de 20 l se sobredimensiono en un factor de aproximadamente 177-296. El material de la capsula Mustang Q se mantuvo durante la noche a 2-8 °C. Un estudio de estabilidad fuera de lmea en material de muestra tomado en esta etapa del proceso indico que mantener una temperatura baja era clave para la estabilidad del producto en este punto del proceso, ya que las muestras incubadas a temperatura ambiente y 37 °C eran susceptibles de degradacion, segun lo indicado por el analisis de SDS-PAGE.
El producto de la capsula Mustang Q se preparo para la cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC) mediante la adicion y mezcla de una solucion de sulfato de amonio (3M) para lograr una concentracion final de 1M. Esto proporciono las condiciones adecuadas para la union de colagenasa a medios de Fenil Sepharose FF (sub bajo). A continuacion, se eluyo una proporcion de protemas contaminantes y pigmento de la columna HIC usando una elucion escalonada de sulfato de amonio 0,3 M seguida de la elucion del producto de colagenasa con una solucion que no contema sulfato de amonio. Los criterios para la recoleccion del pico de producto se establecieron como un volumen fijo de 4 volumenes de columna (aunque esto se extendio posteriormente a 5 volumenes de columna para la ejecucion de demostracion de escala 200 l). A continuacion, se anadio leupeptina inmediatamente despues de la elucion y el material se mantuvo durante un pertedo de 2 dfas a 2-8 °C. El rendimiento de esta etapa fue difteil de determinar con precision debido a la naturaleza compleja de la materia prima. El rendimiento de la etapa del proceso se estimo en (i) 38% basandose en el ensayo de Bradford de la carga y UV del material eluido o (ii) 47% basandose en el contenido de colagenasa en la carga estimada por densitometna y UV del material eluido. Como alternativa, Se eluyeron 0,17 g de protema total de la columna HIC por el equivalente de cada 1 l de filtrado de fermentacion aplicado.
La agrupacion post HIC se preparo para la purificacion con Q-Sepharose por concentracion (5 veces) e intercambio de tampon usando filtracion de flujo tangencial (TFF1) utilizando 2 x 0,1m2 de membranas de 30 kDa. No se detecto ninguna perdida en esta etapa y el aumento reportado en la protema recuperada puede reflejar la inexactitud de UV en este punto del proceso. La inexactitud podna atribuirse a la contaminacion por pigmento o al uso del coeficiente de extincion para colagenasas, que sera menos preciso para el material antes en la purificacion cuando es probable que este presente un complejo de protemas. La etapa de TFF se complete con una etapa de filtracion del producto antes de mantener el material a 2-8 °C durante la noche.
Al igual que con el Proceso 2, la columna Q-Sepharose fue una etapa clave de purificacion en el Proceso 3 y dio como resultado la separacion de las colagenasas AUXI y AUXII. Los contaminantes asociados con el proceso 3, sin embargo, eran diferentes a los del proceso 2 y paredan co-purificarse estrechamente con los productos AUXI y AUXII. Sin embargo, fue posible eliminar los contaminantes de los productos mediante el fraccionamiento de los picos del producto, ya que los contaminantes paredan eluir en los bordes delanteros o en la cola de ambos picos. Los contaminantes se indicaron por su masa molecular relativa en la SDS-PAGE reductora. Aquellos asociados con el producto AUXII (el primer pico eluido de la columna Q-Sepharose) se identificaron como (i) 40kDa (asociado con el borde anterior del pico) y (ii) 75kDa y 90kDa (asociado con el borde posterior del pico). La secuenciacion de aminoacidos N-terminal indico que el de 40 kDa estaba relacionado con AUXII ya que la secuencia coincidfa con la identidad de una region de la secuencia de Col H. En comparacion, no se pudo confirmar la identidad del contaminante de 90 kDa debido a problemas de baja senal. Los contaminantes asociados con el producto AUXI (el segundo pico eluido de la columna Q-Sepharose) fueron (i) 55 kDa (asociado con el borde anterior del pico) y (ii) 90 kDa (asociado con el borde posterior del pico). La secuenciacion N-terminal mostro que tanto los contaminantes de 55 kDa como los de 90 kDa se identificaban como relacionados con AUXI, donde el contaminante de 55kDa mostro una identidad de secuencia con una region media en la secuencia de Col G y el de 90kDa mostro una coincidencia N-terminal identica a AUXI. Por consiguiente, las principales impurezas identificadas en esta etapa del proceso estaban relacionadas con el producto y se identificaron como productos de escision interna de AUXI (55kDa) y AUXII (40kDa) o un producto de AUXI (90kDa) escindido en el extremo C-terminal.
Despues de la columna de Q-Sepharose, una etapa clave del proceso fue la decision de que fracciones debenan avanzar para una purificacion adicional. Para la ejecucion de demostracion de 20 l, este criterio se baso en las intensidades de tincion relativas de los contaminantes en el producto cuando se analizo con SDS-PAGE al 4-12% y se tino con tincion Azul Coloidal. La decision fue subjetiva y se baso en la experiencia colectiva del grupo de desarrollo de procesos, asf como en las solicitudes del cliente. Para establecer los criterios definidos que describieron el procedimiento de agrupacion, se realizo densitometna en SD-SPAGE. A partir de esto, se describio que el agrupamiento inclma fracciones que eran >87% puras (sin impureza unica >10%) para AUXI y >94% puras (sin impureza unica >4%) para AUXII. Esto dio lugar a un rendimiento por etapas basado en la estimacion de UV del 27,7% y 25,8% para AUXI y AUXII respectivamente. Se logro un refinamiento y normalizacion adicionales del metodo de densitometna a partir de los datos adquiridos a partir de la ejecucion de demostracion a escala de 200 l que dio como resultado la definicion de criterios modificados para la posterior ejecucion de GMP.
Las fracciones que conteman el producto AUXI o AUXII de la columna Q-Sepharose se formularon por separado mediante TFF (denominada TFF2) utilizando 1 x 0,1m2 de membrana de 30 kDa para cada colagenasa. El tampon de formulacion de Tris 10 mM, sacarosa 60 mM, pH 8, fue establecido por KBI BioPharma Inc. El producto se filtro despues de la etapa TFF2 y los rendimientos de la etapa total para TFF y la filtracion se estimaron en 97,5% para AUXi y 92,2% para AUXII. En esta etapa, las muestras se denominaron intermedios y se conservaron a 2-8 oC para el analisis de control de calidad y antes de mezclar el farmaco. Un estudio de estabilidad retrospectivo indico que los intermedios eran estables durante un penodo de al menos 5 dfas a 2-8 °C segun lo determinado por analisis de SDS-PAGE, UV, RP-HPLC y SEC-HPLC. El unico deterioro detectado en los intermedios se identifico en el intermedio AUXII despues de una espera de 12 dfas en el que los niveles de agregados aumentaron de 0 a 0,62%.
Los intermedios AUXI y AUXII se mezclaron en una proporcion igual (determinada por UV) para generar el farmaco antes de realizar una filtracion del producto final. Solo se prepararon 400 mg de farmaco, de los cuales 200 mg se enviaron a KBI BioPharma Inc. junto con 25 mg de cada intermedio. El rendimiento general del proceso se estimo para la ejecucion de demostracion de 20 litros en la que se proceso todo el material disponible de los 20 litros de materia prima de fermentacion y suponiendo que todo el material se habfa mezclado como farmaco. Esto dio un rendimiento previsto de 1,6 g de farmaco para la purificacion a escala de 20 l. Esto equivale a una recuperacion del proceso del 17,8% basandose en la suposicion de que la estimacion inicial de 9 g (usando el ensayo Bradford) para la cantidad de protema total disponible para cargar en la columna HIC fue precisa. Como alternativa, si la protema total disponible estaba relacionada con el contenido de colagenasa en la carga de HIC (segun lo estimado por densitometna), el rendimiento global del proceso se calculo como 22%.
Ademas de la ejecucion del proceso, se realizaron algunos estudios preliminares en la muestra y las reservas de tampon se tomaron del proceso para evaluar la estabilidad. Estos datos indicaron que para el producto, la baja temperatura era un factor clave para controlar la degradacion y las muestras tomadas temprano en la purificacion (antes de la columna de Q-Sepharose) eran mas susceptibles a la proteolisis. Sin embargo, un estudio de retencion de productos demostro, que la combinacion de leupeptina y control de temperatura (2-8 ° C) era exitosa para mantener la calidad del producto en los cursos de tiempo previstos para el proceso de GMP.
Las Tablas 54 y 55 detallan las especificaciones analtticas de los productos intermedios AUX-I y AUX-II y tambien para el farmaco para el Proceso 3.
T l 4: E ifi i n n lii r l in rm i A X-I A X-II l Pr
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La patente y la bibliograffa cienfffica a la que se hace referencia en el presente documento establecen el conocimiento que esta disponible para los expertos en la materia.
Si bien esta invencion se ha mostrado y descrito particularmente con referencias a realizaciones preferidas de la misma, los expertos en la materia entenderan que se pueden realizar diversos cambios en la forma y los detalles sin apartarse del alcance de la invencion abarcada por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (30)

REIVINDICACIONES
1. Una composicion de colagenasa que consiste en colagenasa I y colagenasa II de Clostridium histolyticum, respectivamente, que tiene una proporcion de masa de 1 a 1 en donde la composicion de colagenasa tiene una pureza de al menos el 95% por area, medida por cromatograffa ffquida de alto rendimiento de fase inversa, para su uso como un medicamento.
2. La composicion de colagenasa para el uso de la reivindicacion 1, en donde cuando la composicion de colagenasa esta en tampon Tris 10 mM y sacarosa 60 mM a un pH de aproximadamente 8, y la composicion de colagenasa tiene una actividad espedfica para colagenasa I de 13.000 a 23.000 unidades de fSRC/mg medida por un ensayo de SRC, y una actividad espedfica para colagenasa II de 200.000 a 380.000 unidades de fGPA/mg medida por un ensayo de GPA.
3. La composicion de colagenasa para el uso de la reivindicacion 1, en donde la composicion de colagenasa contiene menos del 2% de protema agregada por area, medida por cromatograffa de exclusion por tamano.
4. La composicion de colagenasa para el uso de la reivindicacion 3, en donde la composicion de colagenasa contiene menos del 1% de clostripama por area, medida por cromatograffa ffquida de fase inversa.
5. La composicion de colagenasa para el uso de la reivindicacion 4, en donde la composicion de colagenasa contiene menos del 1 % de gelatinasa por area, medida por cromatograffa de intercambio anionico.
6. La composicion de colagenasa para el uso de la reivindicacion 5, en donde la composicion de colagenasa contiene menos de 1 ug/mg (p/p) de leupeptina.
7. La composicion de colagenasa para el uso de la reivindicacion 6, en donde la composicion de colagenasa tiene una carga biologica inferior a 1 ufc/ml, y en donde se esteriliza la composicion de colagenasa.
8. La composicion de colagenasa para el uso de la reivindicacion 7, que contiene menos de 10 UE/ml de endotoxina.
9. La composicion de colagenasa para el uso de la reivindicacion 7, que contiene menos de 5 UE/ml de endotoxina.
10. La composicion de colagenasa para el uso de la reivindicacion 1, en donde la colagenasa I y II tienen una pureza de al menos el 97% por area, medida por cromatograffa ffquida de alto rendimiento de fase inversa.
11. La composicion de colagenasa para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la composicion de colagenasa es para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad mediada por colageno seleccionada del grupo que consiste en la enfermedad de Dupuytren; enfermedad de Peyronie; hombro congelado (capsulitis adhesiva), queloides; cicatrices hipertroficas; cicatrices deprimidas como las que resultan del acne inflamatorio; adherencias postquirurgicas; acne comun; lipomas, y fibrosis neoplasica.
12. Una formulacion farmaceutica, que comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable y una composicion de colagenasa que consiste en colagenasa I y colagenasa II que tienen la secuencia de la colagenasa I y colagenasa II de Clostridium histolyticum, respectivamente, en donde la colagenasa I y colagenasa II tienen una proporcion de masa de aproximadamente 1 a 1 y la composicion de colagenasa es al menos el 95% por area pura medida por cromatograffa ffquida de alto rendimiento de fase inversa.
13. La formulacion de la reivindicacion 12, en donde la composicion de colagenasa tiene una pureza de al menos el 97% por area, determinada por cromatograffa ffquida de alto rendimiento de fase inversa.
14. La formulacion de la reivindicacion 12, en donde la composicion de colagenasa se liofiliza con sacarosa y Tris, y tiene un pH de aproximadamente 8,0 al reconstituirse con un medio acuoso.
15. La formulacion de la reivindicacion 12, en donde la formulacion es una composicion inyectable liofilizada que comprende aproximadamente 0,9 mg de la composicion de colagenasa, aproximadamente 18,5 mg de sacarosa y aproximadamente 1,1 mg de Tris, y en donde el objetivo es un volumen de llenado de vial de aproximadamente 0,9 ml.
16. La formulacion de la reivindicacion 12, en donde la formulacion es una composicion inyectable liofilizada que comprende aproximadamente 0,58 mg de la composicion de colagenasa, 18,5 mg de sacarosa y 1,1 mg de Tris, en donde el objetivo es un volumen de llenado de vial de 0,9 ml.
17. La formulacion de la reivindicacion 12, en donde la formulacion es una composicion inyectable liofilizada que comprende aproximadamente 0,58 mg de la composicion de colagenasa, 12,0 mg de sacarosa y 0,7 mg de Tris.
18. La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 12-17, para su uso como un medicamento.
19. La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 12-17, en donde la formulacion es para su uso en el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad mediada por colageno seleccionada del grupo que consiste en la enfermedad de Dupuytren; enfermedad de Peyronie; hombro congelado (capsulitis adhesiva), queloides; cicatrices hipertroficas; cicatrices deprimidas como las que resultan del acne inflamatorio; adherencias postquirurgicas; acne comun; lipomas, y fibrosis neoplasica.
20. Un metodo cosmetico no terapeuti
el metodo, administrar al sujeto la composicion de colagenasa como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o la formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 12-17.
21. Colagenasa I de Clostridium histolyticum con una pureza de al menos el 95% por area, medida por cromatograffa ffquida de alto rendimiento de fase inversa, para su uso como un medicamento.
22. Colagenasa I para el uso de la reivindicacion 21, que tiene una actividad espedfica para colagenasa I de aproximadamente 13.000 a aproximadamente 23.000 unidades fSRC/mg medida mediante un ensayo de SRC.
23. Colagenasa I para el uso de la reivindicacion 21, que contiene menos del 2% de protema agregada por area medida por cromatograffa de exclusion por tamano, contiene menos de 1% de clostripama por area medida por cromatograffa ffquida de fase inversa, contiene menos de 1% de gelatinasa por area medida por cromatograffa de intercambio anionico, contiene menos de 1 ug/mg (p/p) de leupeptina, tiene una carga biologica inferior a 1 ufc/ml en donde se esteriliza la composicion de colagenasa, contiene menos de 10 UE/ml de endotoxina o contiene menos de 5 UE/mg de endotoxina, o una combinacion de las mismas.
24. Colagenasa I para el uso de la reivindicacion 21, que tiene una pureza de al menos el 97% por area, medida por cromatograffa ffquida de alto rendimiento de fase inversa.
25. Colagenasa I para el uso de la reivindicacion 21, que tiene una pureza de al menos el 98 % por area, medida por cromatograffa ffquida de alto rendimiento de fase inversa.
26. Colagenasa II de Clostridium histolyticum con una pureza de al menos el 95% por area, medida por cromatograffa ffquida de alto rendimiento de fase inversa, para su uso como un medicamento.
27. Colagenasa II para el uso de la reivindicacion 26, que tiene una actividad espedfica para la colagenasa II de aproximadamente 200.000 a aproximadamente 380.000 unidades de fGPA/mg medida por un ensayo de GPA.
28. Colagenasa II para el uso de la reivindicacion 26, que contiene menos del 2% de protema agregada por area medida por cromatograffa de exclusion por tamano, contiene menos de 1% de clostripama por area medida por cromatograffa ffquida de fase inversa, contiene menos de 1% de gelatinasa por area medida por cromatograffa de intercambio anionico, contiene menos de 1 ug/mg (p/p) de leupeptina, tiene una carga biologica inferior a 1 ufc/ml en donde se esteriliza la composicion de colagenasa, contiene menos de 10 UE/ml de endotoxina o contiene menos de 5 UE/mg de endotoxina, o una combinacion de las mismas.
29. Colagenasa II para el uso de la reivindicacion 26, que tiene una pureza de al menos el 97% por area, medida por cromatograffa ffquida de alto rendimiento de fase inversa.
30. Colagenasa II para el uso de la reivindicacion 26, que tiene una pureza de al menos el 98 % por area, medida por cromatograffa ffquida de alto rendimiento de fase inversa.
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