ES2386338T3

ES2386338T3 - Colección de mutantes de toxinas y métodos para su uso

Info

Publication number: ES2386338T3
Application number: ES10159280T
Authority: ES
Inventors: Jean Gariepy; Xin Wei
Original assignee: Molecular Templates Inc
Current assignee: Molecular Templates Inc
Priority date: 2004-03-26
Filing date: 2004-03-26
Publication date: 2012-08-17
Anticipated expiration: 2024-03-26
Also published as: EP1727827A1; DE602004027168D1; EP2228383A1; JP2007531716A; EP1727827B1; EP2228383B1; CA2559536A1; US20070298434A1; JP4934761B2; AU2004317555A1; WO2005092917A1; ES2344844T3; AU2004317555B2; ATE467641T1

Abstract

Una colección combinatoria de proteínas que comprende una pluralidad de especies proteicas, compren- diendo cada especie de proteína una cadena A de una proteína tóxica ABx que comprende un bucle sensible a proteasa en el cual se ha introducido un inserto, en donde el inserto es un polipéptido de secuencia de aminoácidos variable que tiene una longitud de 2-7 residuos de aminoácidos, y en donde cuando la pluralidad de especies proteicas se ponen en contacto con al menos una diana/receptor candidato, una especie proteica que comprende un inserto se une a una diana/un receptor específico, identificando de este modo el inserto como un ligando de la diana/el receptor específicos.

Description

Colecci6n de mutantes de toxinas y metodos para su uso.

Antecedentes de la invenci6n

Esta solicitud se refiere a colecciones de mutantes de toxinas y a metodos para usar las mismas en el desarrollo de 5 agentes terapeuticos dirigidos contra tipos celulares especfficos.

Las toxinas vegetales y bacterianas tienen una organizaci6n estructural con dos o mas dominios o subunidades polipeptfdicas responsables de distintas funciones, denominadas A y B. Las toxinas pueden denominarse toxinas ABx, en donde x representa el numero de subunidades B identicas u hom6logas en la toxina. Esta familia de toxinas relacionadas con el armaz6n, incluye ejemplos tales como las toxinas Shiga y de tipo Shiga, las enterotoxinas termo

10 sensibles de E. coli, la toxina del c6lera, la toxina difterica, la toxina pertussis, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (0lsnes, S. y Sandvik, K. (1988) en Immunotoxins pp. 39-73, Kluwer Academic, Boston; Sandvik, K., Oubinina, E., Garred, 0. y col. (1992) Biochem. Soc. Trans. 20:724) asf como toxinas vegetales tales como ricina y abrina. En algunos casos las toxinas son heter6meras, porque las cadenas B son en realidad entidades separadas que se conectan con la cadena t6xica A mediante un enlace no covalente. En otros casos, la toxina es mon6mera, puesto

15 que la cadena B forma parte de la misma protefna cuando la toxina se produce en la naturaleza.

Basandose en su capacidad para bloquear la sfntesis de protefnas, protefnas tales como las toxinas Shiga y de tipo Shiga, asf como la ricina, abrina, gelonina, crotina, protefna antivfrica de fitolaca americana, saporina, momordina, modecina, sarcina, toxina difterica y exotoxina A, se han denominado protefnas inactivadoras de ribosomas (RIP, del ingles "ribosome-inactivating proteins"). La potencia de las RIPs es extremadamente alta, habiendose demostrado

20 que una molecula de la cadena A de la toxina difterica (Yamaizumi y col. (1978) Cell 15:245-250) o de la cadena A de la ricina (Eiklid y col. (1980) Exp. Cell Res. 126:321-326) es suficiente para destruir una celula eucari6tica.

El documento de Publicaci6n de Patente Internacional nQ W099/40185 describe colecciones de toxinas mutantes en las que se introducen las mutaciones en el dominio de uni6n para alterar el tipo de celulas al que se suministran las especies t6xicas. Las nuevas protefnas se obtienen mutando una subunidad de uni6n de la protefna citot6xica hete

25 r6mera de tipo silvestre, para crear una colecci6n de clones de microorganismos que producen protefnas mutantes que, a continuaci6n, se someten a un escrutinio para estudiar su capacidad para unirse y destruir especfficamente un tipo de celula diana.

El documento de Patente de los EE.UU. nQ 5.552.144 describe una variante de la toxina II de tipo Shigella en la que se introduce una mutaci6n en la cadena A en la posici6n 167, para cambiar el aminoacido en esta posici6n por uno

30 con diferente carga. Esto dio como resultado una toxina con menor actividad enzimatica asociada con la toxicidad.

El documento de Patente de los EE.UU. nQ 6.593.132 describe protefnas t6xicas recombinantes que son t6xicas especfficamente para celulas enfermas, pero que no dependen para su especificidad de la acci6n de un componente especffico de la uni6n a la celula. Las protefnas recombinantes de la patente '132 tienen una cadena A de una toxina de tipo ricina enlazada a una cadena B mediante una secuencia enlazadora sintetica que puede ser escindida espe

35 cfficamente por una proteasa localizada en las celulas o tejidos afectados por una enfermedad especffica, para liberar la cadena t6xica A, inhibiendo o destruyendo asf selectivamente las celulas o los tejidos enfermos.

El documento de Patente de los EE.UU. nQ 6.649.742 describe protefnas inactivadoras de ribosomas (RIPs) de Tipo I y analogos de RIPs que tienen una cistefna disponible para formar un puente disulfuro con moleculas diana. Las RIPs y los analogos de RIPs se usan como componentes de agentes terapeuticos citot6xicos para eliminar selecti

40 vamente cualquier tipo celular al que se dirija el componente RIP, mediante la capacidad de uni6n especffica del segundo componente del agente.

Sumario de la invenci6n

La presente proporciona colecciones combinatorias de protefnas que comprenden una pluralidad de especies proteicas, en las que cada especie proteica comprende una cadena A de una protefna t6xica heter6mera en la que se ha

45 introducido un inserto. Segun la invenci6n, el inserto es un polipeptido con una secuencia de aminoacidos variable que tiene una longitud de 2 o mas residuos de aminoacido, por ejemplo, de 3 a 200 residuos de aminoacido; y el inserto se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A. El resultado de la introducci6n del inserto crea un dominio de uni6n artificial dentro de la cadena A, de tal forma que la cadena A desarrolla una especificidad t6xica que es independiente y diferente de la especificidad normal asociada con los dominios de uni6n de las

50 cadenas B. El escrutinio de la colecci6n permite la selecci6n e identificaci6n de toxinas mutantes que son especfficas de tipos celulares diferentes, incluyendo los tipos de celulas cancerosas. En una realizaci6n de la invenci6n, la colecci6n combinatoria comprende especies proteicas que se forman introduciendo el inserto en la cadena A de una toxina I de tipo Shiga, por ejemplo, en la regi6n entre los aminoacidos 242 y 261, tal y como se define con referencia a SEQ IO N0: 1.

55 La invenci6n proporciona tambien una colecci6n combinatoria de expresi6n que comprende una pluralidad de espe

cies de sistemas de expresi6n, expresando cada especie una especie proteica que comprende una cadena A de una protefna t6xica heter6mera en la que se ha introducido el inserto tal y como se ha descrito anteriormente. La expresi6n de protefnas a partir de la colecci6n combinatoria de expresi6n da como resultado la formaci6n de una colecci6n combinatoria de protefnas.

En un aspecto adicional, la invenci6n proporciona una composici6n para tratar melanomas y metodos para usar tal composici6n. La composici6n comprende una especie proteica que comprende una cadena A de una protefna t6xica heter6mera, en la que un polipeptido que tiene una longitud de 2 o mas residuos de aminoacido, por ejemplo de 3 a 200 residuos de aminoacido, se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A. El inserto se selecciona de tal forma que la especie proteica tenga actividad t6xica frente a celulas de melanoma. La especie proteica se usa en el tratamiento de melanomas, administrandola a un paciente diagnosticado con melanoma en una cantidad suficiente para producir la reducci6n del numero de celulas de melanoma vivas.

En un aspecto adicional, la invenci6n proporciona una composici6n para tratar otros tipos de cancer. La composici6n comprende una especie proteica que comprende una cadena A de una protefna t6xica heter6mera en la que un polipeptido que tiene una longitud de 2 o mas residuos de aminoacido, por ejemplo de 3 a 200 residuos de aminoacido, se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A. El inserto se selecciona de tal forma que la especie proteica tenga actividad t6xica frente a las celulas cancerosas. En una realizaci6n especffica, el inserto se selecciona para que se una a receptores MUC-1. La especie proteica se usa en el tratamiento del melanoma, administrandola a un paciente diagnosticado con melanoma en una cantidad suficiente para que se produzca una reducci6n del numero de celulas de melanoma vivas.

En un aspecto adicional, la invenci6n proporciona un metodo para identificar ligandos que se unen a dianas/receptores especfficos, tales como marcadores tumorales que se sabe que existen en las celulas cancerosas. En este metodo, la toxina de la colecci6n combinatoria actua como informadora, y una colecci6n combinatoria de protefnas segun la invenci6n, se somete a escrutinio en busca de celulas conocidas por poseer la diana/el receptor. Las protefnas que presentan toxicidad frente a las celulas, se evaluan para determinar la secuencia de la regi6n insertada. Los peptidos con esta secuencia pueden usarse seguidamente, en combinaci6n con una toxina u otras moleculas, para dirigir compuestos a celulas que poseen la diana/el receptor.

En aun otro aspecto adicional de la invenci6n, se proporciona un metodo para identificar sustancias t6xicas especfficas de un marcador celular conocido. En esta realizaci6n de la invenci6n, la toxina no necesita actuar como informadora. Por tanto, las celulas que tienen el marcador o una diana/un receptor aislado, cuando esta disponible, se exponen a la colecci6n combinatoria de protefnas. En realizaciones preferidas, las celulas o la diana/el receptor aislado, se inmovilizan sobre un soporte s6lido, tal como pocillos de plastico. Las protefnas capturadas de la colecci6n se someten seguidamente a un nuevo escrutinio para confirmar su toxicidad y su especificidad hacia las celulas que expresan la diana/el receptor y su idoneidad para usarse como agente terapeutico.

Breve descripci6n de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama esquematico que representa los dominios A1 y A2 de SLT-1. La cadena A esta compuesta por 293 aminoacidos. La cadena se escinde con furina para producir un fragmento catalftico A1 y una cola Cterminal A2 asociada de manera no covalente al pentamero B. Un bucle sensible a proteasa (area rallada) queda definido por los dos unicos residuos de cistefna en la cadena A (Cys 242 y 261). Tyr77, Glu167, Arg170 y Trp203 representan residuos decisivos para la actividad catalftica del dominio A1 (flechas).

La Fig. 2A es una representaci6n esquematica de la cadena A de SLT-1 (1-293) con el epftopo de MUC1 asociado a cancer de mama, POTRPAP (secuencia testigo reconocida por el AcMo 0nc M27) insertado entre los residuos 245 y 246 y un marcador de 6 histidinas en su extremo N-terminal.

La Fig. 2B es una representaci6n de nuestra estructura artificial de la colecci6n de la cadena A de SLT-1-tripeptidos, en donde las tres posiciones clave del epftopo de MUC1 reconocidas por el AcMo 0nc M27 se combinaron aleatoriamente (regi6n XXX). La colecci6n de tripeptidos se insert6 en una regi6n en forma de bucle de la cadena A presente en la naturaleza, creada por la presencia de un puente disulfuro entre Cys 242 y Cys 261.

La Fig. 3 muestra un conjunto de datos de ELISA representativos, obtenidos a partir de un escrutinio de 96 variantes distintas con una unica cadena A procedentes de nuestra colecci6n de cadena A de SLT-1-tripeptidos con el AcMo 0nc M27. La variante de toxina nQ 41 (Tablas 1 y 2) presentaba una fuerte senal en el ensayo ELISA y tenfa el epftopo esperado.

La Fig. 4 muestra un diagrama esquematico de un segmento al azar de 7 aminoacidos insertado entre los residuos 245 y 246 de la cadena A.

La Fig. 5 muestra los resultados de los ensayos con siete variantes de toxina que se identificaron como destructores repetitivos de la lfnea celular de melanoma humano 518A2. El eje de abscisas representa el logaritmo de la concentraci6n de toxina usada para tratar las celulas y el eje de ordenadas representa el porcentaje observado de celulas que son viables despues de 48 horas. Los triangulos negros representan el efecto de la toxina de tipo silvestre sobre las celulas 518A2, mientras que las variantes de la cadena A mas eficaces se denominaron SAMnQ3 (cuadrados sin

relleno) y SAMnQ5 (sfmbolos X).

Descripci6n detallada de la invenci6n

La presente invenci6n se refiere a una colecci6n combinatoria de protefnas que comprende una pluralidad de especies proteicas, comprendiendo cada especie proteica una cadena A de una protefna t6xica heter6mera en la que se ha introducido un inserto. El inserto es un polipeptido con una secuencia de aminoacidos variable que tiene una longitud de 2 o mas residuos de aminoacido, por ejemplo de 3 a 200 residuos de aminoacido; y se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A. La colecci6n proporciona un conjunto de especies proteicas que pueden someterse a escrutinio para seleccionar protefnas individuales que sean t6xicas frente a tipos celulares especfficos, tales como tipos especfficos de celulas cancerosas. Las especies proteicas individuales asf seleccionadas se usan adecuadamente en el tratamiento del cancer.

Tal y como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones de esta solicitud, la expresi6n "colecci6n combinatoria" se refiere a una mezcla de especies, cada una de las cuales tiene una porci6n comun y una porci6n variable. En el caso de una "colecci6n combinatoria de protefnas", cada una de las especies es una protefna o un peptido, y las porciones comunes y las porciones variables son cada una de ellas secuencias de aminoacidos. En el caso de una colecci6n combinatoria de expresi6n, las especies son microorganismos, vectores de expresi6n o polinucle6tidos que, cuando se expresan, producen protefnas o peptidos que tienen porciones comunes y porciones variables. En este caso, las porciones comunes y las porciones variables son cada una de ellas secuencias de nucle6tidos. Puesto que el objetivo de la colecci6n combinatoria es proporcionar multiples variantes con el fin de ser sometidas a escrutinio, la colecci6n combinatoria contiene preferiblemente al menos 100 especies distintas de unidades proteicas o de expresi6n, mas preferiblemente al menos 1000 especies distintas.

Tal y como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones de esta solicitud, la expresi6n "protefna t6xica heter6mera" se refiere a la clase de toxinas proteicas con la caracterfstica de organizaci6n comun de ser heter6meras por naturaleza, con dos o mas dominios o subunidades polipeptfdicas responsables de distintas funciones (Merritt, E.A. y HoI, W.G.J. (1995) Curr. 0pin. Struct. Biol. 5:165 1). En tales protefnas, las dos o mas subunidades o dominios podrfan denominarse A y B, y las toxinas ABx en donde x representa el numero de subunidades B identicas u hom6logas en la toxina. Esta familia de toxinas relacionadas con el armaz6n incluye ejemplos tales como las toxinas Shiga y de tipo Shiga, las enterotoxinas termosensibles de E. coli, la toxina del c6lera, la toxina difterica, la toxina pertussis, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, asf como toxinas vegetales tales como ricina y abrina. Basandose en su capacidad para bloquear la sfntesis de protefnas, protefnas tales como las toxinas Shiga y de tipo Shiga, asf como la ricina, abrina, gelonina, crotina, protefna antivfrica de fitolaca americana, saporina, momordina, modecina, sarcina, toxina difterica y exotoxina A se han denominado protefnas inactivadoras de ribosomas (RIP). En estas protefnas t6xicas heter6meras existentes en la naturaleza, la cadena A es la porci6n t6xica, mientras que las cadenas B forman un resto de de fijaci6n que se une a un receptor en una celula susceptible a la toxina, suministrandose de esta forma la cadena A a la celula.

Un ejemplo especffico de la cadena A de una protefna t6xica heter6mera es la cadena A de SLT-1 que tiene la secuencia proporcionada como SEQ IO N0: 1. La cadena A de SLT-1 comprende 293 aminoacidos, abarcando el dominio enzimatico (t6xico) desde los residuos 1 al 239. Un bucle sensible a proteasa que abarca los residuos 242 a 261 queda normalmente expuesto, y es un sitio adecuado para insertar una secuencia peptfdica.

SLT-1 es una protefna inactivadora de ribosomas de tipo II, producida por una cepa pat6gena de Escherichia coli (0157:H7) (24). SLT-1 es un complejo AB5 de aproximadamente 70 kO (0'Brien, A. O. y Holmes, R. K. (1987) "Shiga and Shiga-like toxins". Microbiol Rev 51, 206-220). La subunidad A catalftica de 32 kO de cadena sencilla esta asociada de manera no covalente con un pentamero de cinco subunidades B identicas de 7,7 kO. El pentamero de subunidades B reconoce el glicolfpido globotriaosilceramida (tambien conocido como CO77 o Gb3) en la superficie de las celulas diana (Lingwood, C. A. (1993) "Verotoxins and their glycolipid receptors". Adv Lipid Res 25, 189-211; Jacewicz, y col. (1986) "Pathogenesis of shigella diarrhea: XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide". J Exp Med 163, 1391-1404). Un bucle sensible a proteasa situado entre Cys242 y Cys261 en el extremo C-terminal de la cadena A se escinde con furina durante el encaminamiento celular (Fig. 1). La cadena A permanece asociada con su pentamero de subunidades B gracias a un enlace disulfuro intracatenario entre Cys242 y Cys261 a medida que viaja hacia el lumen del retfculo endoplasmatico (Sandvig y col. (1989) "Endocytosis from coated pits of Shiga toxin: a glycolipid-binding protein from Shigella dysenteriae 1". J Cell Biol 108, 1331-1343; Garred, y col. (1995) "Role of processing and intracellular transport for optimal toxicity of Shiga toxin and toxin mutants". Exp Cell Res: 218, 39-49). El puente disulfuro es finalmente reducido en el lumen del retfculo endoplasmatico y la cadena A1 (primeros 251 aa) se libera y se retrotransloca subsiguientemente al citosol, en donde inactiva los ribosomas (0'Brien y col. (1992) "Shiga toxin: biochemistry, genetics, mode of action, and role in pathogenesis". Curr Top Microbiol Immunol 180, 65-94). Mas especfficamente, la cadena A de SLT-1 es una N-glicosidasa que escinde catalfticamente un nucle6tido de adenina especffico (4324) procedente del ARNr 28 S (Brigotti y col. (1997) "The RNA-N-glycosidase activity of Shiga-like toxin I: kinetic parameters of the native and activated toxin". Toxicon 35, 1431-1437). Este suceso lleva a la inhibici6n de la sfntesis proteica, impidiendo la uni6n de los aminoacil-ARNt al ribosoma y deteniendo la elongaci6n de la protefna. Estudios de mutagenesis, asf como analisis estructurales realizados sobre las cadenas A de ST y ricina, han definido los residuos clave conservados, implicados en la actividad catalftica (Oeresiewicz y col. (1992) "Mutations affecting the activity of the

Shiga-like toxin I A-chain". Biochemistry 31, 3272-3280; Ready y col. (1991) "Site-directed mutagenesis of ricin A chain and implications for the mechanism of action". Proteins 10, 270-278). Los residuos decisivos para la actividad catalftica de SLT-1 son la tirosina 77, el acido glutamico 167, la arginina 170 y el tript6fano 203 (Hovde y col. (1988) "Evidence that glutamic acid 167 is an active-site residue of Shiga-like toxin I". Proc Natl Acad Sci USA. 85, 25682572; Yamasaki y col. (1991) "Importance of arginine at position 170 of the A subunit of Vero toxin I produced by enterohemorrhagic Escherichia coli for toxin activity". Microb Pathog 11, 1-9). Ademas, la uni6n de la toxina a la superficie celular es decisiva para su introducci6n dentro de la celula y, por tanto, para su actividad t6xica. Oebido a esto, la cadena A en solitario no es considerablemente t6xica.

Ademas de la cadena A de SLT-1, pueden usarse tambien otras toxinas para formar colecciones y composiciones segun la invenci6n, y pueden usarse en los metodos de la invenci6n. Especfficamente, pueden usarse las toxinas Shiga y otras de tipo Shiga, asf como ricina, abrina, gelonina, crotina, protefna antivfrica de fitolaca americana, saporina, momordina, modecina, sarcina, toxina difterica y exotoxina A, y otras protefnas inactivadoras de ribosomas (RIP) relacionadas funcionalmente.

Con el fin de preparar la colecci6n combinatoria de la invenci6n, se insertan en este bucle sensible a proteasa secuencias cortas de aminoacidos de al menos 2 aminoacidos, por ejemplo de 3 a 200 residuos de aminoacidos de longitud. El numero de aminoacidos en el inserto define el numero de posibles variantes al azar que puede haber en la colecci6n. Por ejemplo, cuando el numero de aminoacidos en el inserto es 3, el numero maximo de variantes es 203 u 8000 variantes. Insertos mas largos proporcionan un mayor numero correspondiente de posibles variantes.

Como alternativa al uso de insertos con secuencias puramente al azar, pueden disenarse insertos basados en un molde conocido. Por ejemplo, tal y como se describe mas abajo en el contexto de Muc-1, para identificar un inserto que asegura la optimizaci6n de las propiedades t6xicas de la estructura artificial proteica, pueden usarse variaciones de una secuencia que se sabe que proporciona propiedades de uni6n a un receptor para un tipo celular en particular. Esta misma optimizaci6n puede realizarse en una secuencia individual aislada mediante el escrutinio de una colecci6n combinatoria mayor. Se apreciara, sin embargo, que el inserto en los ensayos de la prueba de concepto del Ejemplo 1, se usa un inserto que es la diana/el receptor, mientras que en el caso actual el inserto se basarfa en la secuencia de un ligando conocido, que se va a mejorar para conseguir una eficacia y especificidad maximas.

Este acercamiento, en el que un tipo de receptor especffico y conocido es la diana, ilustra un aspecto adicional de la invenci6n, a saber, un metodo para identificar ligandos peptfdicos que se unen a dianas/receptores especfficos, tales como marcadores tumorales que se sabe que existen sobre las celulas cancerosas. En este metodo, una colecci6n combinatoria de protefnas segun la invenci6n, se somete a escrutinio frente a celulas que se sabe que poseen la diana/el receptor. La toxina actua como informadora, de tal forma que las protefnas que muestran ser t6xicas para las celulas, se valoran para determinar la secuencia de la regi6n insertada. Los peptidos de esta secuencia pueden usarse seguidamente, en combinaci6n con una toxina u otras moleculas, para dirigir compuestos a las celulas que poseen la diana/el receptor. 0tros peptidos en reposo de la secuencia de la regi6n insertada pueden ser apropiados para confirmar que son un ligando para la diana/el receptor especfficos, en contraposici6n con otros receptores en el tipo celular. Esto puede realizarse usando ensayos de uni6n con receptor aislado, cuando este disponible.

La invenci6n proporciona tambien un metodo para identificar sustancias t6xicas especfficas para un marcador celular conocido, y particularmente marcadores que estan disponibles de forma aislada. En esta realizaci6n de la invenci6n, la toxina no necesita actuar como informadora. Asf, las celulas que tienen el marcador, o una diana/un receptor aislados, cuando estan disponibles, se exponen a la colecci6n combinatoria de protefnas. En realizaciones preferidas, las celulas o la diana/el receptor aislados se inmovilizan sobre un soporte s6lido, tal como en pocillos de plastico. Las protefnas capturadas desde la colecci6n se someten a continuaci6n nuevamente a un escrutinio frente a las celulas, para confirmar su toxicidad y especificidad hacia las celulas que expresan la diana/el receptor y su idoneidad para usarse como agente terapeutico. Este metodo puede usarse para identificar toxinas con insertos que se unen, especfficos para cualquier marcador tumoral o receptor celular, incluyendo sin limitaciones marcadores tumorales tales como las mucinas, como MUC-1 y sus glicoformas, Her-2, Her2-Neu, marcadores de cinasa de tirosina, EGFR, GO2 y GO3.

Por tanto, segun este aspecto especffico de la invenci6n, se proporciona un metodo para aislar una toxina especffica para una diana/un receptor conocidos, que comprende las etapas de:

(a) exponer la diana/el receptor a una colecci6n combinatoria de protefnas que comprende una pluralidad de especies proteicas, comprendiendo cada especie proteica una cadena A de una protefna t6xica en la que se ha introducido un inserto, en donde,

el inserto es un polipeptido con una secuencia variable de aminoacidos que tiene una longitud de al menos 2 residuos de aminoacido; y

el inserto se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A; y

(b) aislar al menos una especie proteica desde la colecci6n combinatoria de protefnas capturada mediante la uni6n a la diana/el receptor. Tal como se emplea en la memoria descriptiva y las reivindicaciones de la presente, el termino "aislar" se refiere a cualquier mecanismo para obtener una composici6n que contiene la protefna separada del en

torno en el que se expresa, en forma adecuada para analisis adicionales. Esto incluirfa la liberaci6n de la diana/el receptor despues de la captura (por ejemplo, por exposici6n a un agente de uni6n competitivo) o el aislamiento a partir de un cultivo de un clon que expresa la protefna que se va a capturar. El metodo puede comprender ademas la etapa de someter a escrutinio la protefna aislada frente a celulas que expresan la diana/el receptor, para confirmar su toxicidad para las celulas que expresan la diana/el receptor. Los procedimientos adecuados para este escrutinio se describen en el Ejemplo 3. Como se ha senalado anteriormente, en este metodo, la diana/el receptor puede ser una diana/un receptor purificado y puede inmovilizarse sobre un soporte s6lido. La diana/el receptor puede estar tambien en la superficie de celulas, que se pueden inmovilizar. Cuando la diana/el receptor esta en la superficie de celulas, la toxina puede actuar como informadora, y la muerte de las celulas es indicativa de la uni6n al receptor.

Nuestra experiencia en la construcci6n de colecciones de SLT-1 nos ha senalado varias cuestiones practicas que se consideran apropiadas en la selecci6n de un molde proteico para crear colecciones combinatorias. Un factor importante es elegir una protefna de cadena sencilla, preferiblemente una protefna bacteriana de menos de 300 aminoacidos (si las colecciones van a expresarse en procariotas). El uso de una toxina mas pequena aumenta su potencial para penetrar en tumores s6lidos y disminuye su inmunogenicidad. En segundo lugar, el molde proteico deberfa plegarse espontaneamente en soluci6n en su forma activa, de manera que hay una necesidad mfnima de chaperonas del hospedante. Oeberfan evitarse, por ejemplo, estructuras que contienen multiples residuos de cistefna, implicados normalmente en los puentes disulfuro. Ademas, una protefna de cadena sencilla, en contraposici6n con un complejo de multiples subunidades, se puede exportar mas facilmente desde las bacterias. En tercer lugar, el molde proteico deberfa poseer una actividad enzimatica, que se pueda medir facilmente para confirmar el plegamiento apropiado de las variantes peptfdicas que contienen mutaciones sencillas o multiples dirigidas al sitio. En cuarto lugar, deberfa incorporarse un acercamiento simple de escrutinio al diseno de colecciones combinatorias. Tales busquedas deberfan ser susceptibles de permitir el uso de metodos de escrutinio de alto rendimiento. La cadena A catalftica de SLT-1 (residuos 1 a 293) cumple estos criterios porque es una cadena sencilla que no tiene ninguna funci6n conocida de uni6n a receptores, y que tiene una estructura y un sitio catalftico bien definidos.

Un aspecto adicional de la invenci6n es una colecci6n combinatoria de expresi6n que comprende una pluralidad de especies de sistemas de expresi6n. Cada especie en la colecci6n de expresi6n expresa una especie proteica que comprende una cadena A de una protefna t6xica heter6mera en la que se ha introducido un inserto. El inserto es un polipeptido con una secuencia de aminoacidos variable que tiene una longitud de 2 o mas residuos de aminoacido, por ejemplo de 3 a 200 residuos de aminoacido, y se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A. Los sistemas de expresi6n adecuados incluyen plasmidos y vectores vfricos.

La invenci6n se describira ahora adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Prueba de concepto: diseno y evaluaci6n de una colecci6n prototipo de cadena A-tripeptidos

0riginalmente creamos una colecci6n simple de tripeptidos insertados en el bucle sensible a proteasa del extremo Cterminal de la cadena A de STL-1 (Figs. 2A y B). Esta regi6n en forma de bucle de la cadena A esta restringida de forma natural debido a la presencia de un unico puente disulfuro que forma un puente desde Cys242 a Cys261. Puede calcularse, por tanto, que la diversidad maxima de esta colecci6n sera de 203 6 8000 permutaciones de una secuencia tripeptfdica. Como prueba de concepto de que las colecciones de cadena A pueden someterse a escrutinio facilmente para detectar una nueva actividad de uni6n a un receptor, seleccionamos mas de 3000 colonias a partir de esta colecci6n de cadena A-tripeptidos y purificamos la toxina mutante producida por cada clon. En este estudio, observamos enseguida que el nivel de expresi6n del mutante de la cadena A aumentaba espectacularmente cuando se expresaba en presencia de la subunidad B de SLT-1 de tipo silvestre. Por tanto, las formas mutantes de la cadena A se expresaron y purificaron inicialmente como variantes de la toxina AB5. Puesto que todas las subunidades A llevan una secuencia marcadora de poliHis para su purificaci6n, resulta relativamente facil eliminar la subunidad B con agentes desnaturalizantes (por ejemplo, urea) y recuperar la cadena A en columnas o perlas de afinidad con metales. Las transferencias Western realizadas con clones bacterianos seleccionados al azar, indicaron que >70% de estas colonias producfan cantidades significativas de estos mutantes de la cadena A.

Estas variantes de toxina se revistieron seguidamente en pocillos individuales en placas de 96 pocillos y se sometieron a escrutinio mediante ELISA para estudiar su capacidad para unirse al anticuerpo monoclonal 0nc M27 (Linsley y col. (1988) "Monoclonal antibodies reactive with mucin glycoproteins found in sera from breast cancer patients". Cancer Res 48, 2138-2148), dirigido contra el epftopo tripeptfdico bien caracterizado de cancer de mama Thr-Arg-Pro de la repetici6n en tandem de MUC1 humano (Gendler y col. (1988) "A highly immunogenic region of a human polymorphic epithelial mucin expressed by carcinomas is made up of tandem repeats". J Biol Chem 263, 1282012823; Girling y col. (1989) "A core protein epitope of the polymorphic epithelial mucin detected by the monoclonal antibody SM-3 is selectively exposed in a range of primary carcinomas". Int J Cancer 43, 1072-1076). Tal y como se muestra en las Tablas 1 y 2, la mayorfa de los mutantes de la cadena A no codificaban el inserto tripeptfdico que era complementario al epftopo diana de 0nc M27, ni eran reconocidos por el anticuerpo. Sin embargo, en dos ocasiones, una variante de toxina que llevaba el epftopo exacto (Tabla 1, Fig. 3) present6 una fuerte senal en el ensayo de ELISA, comparable a la observada con nuestra cadena A testigo que llevaba el epftopo tripeptfdico de MUC1, y tenfa la secuencia del epftopo esperada en su regi6n tripeptfdica al azar. En la Fig. 3 se presenta un conjunto de datos

de ELISA tfpico para 96 mutantes de la cadena A, que subraya el hecho de que la mayorfa de los mutantes de la cadena A no reconocfan el AcMo 0nc M27, excepto una variante de la cadena A (mutante nQ 41 en las Tablas 1 y 2). Estos resultados mostraron claramente que las colecciones de cadenas A pueden construirse facilmente y someterse a escrutinio para encontrar variantes de la toxina capaces de dirigirse especfficamente a un receptor dado, en este caso un sitio de combinaci6n con antfgeno.

Ejemplo 2

Preparaci6n de una Colecci6n Combinatoria de A de SLT-1-heptapeptidos

La diversidad de las colecciones representa un parametro crucial en el escrutinio de colecciones combinatorias para buscar ligandos capaces de unirse especfficamente y con alta afinidad a una diana en particular. La colecci6n de cadenas A de SLT-1-tripeptidos descrita en el Ejemplo 1 tiene una diversidad maxima de 203 o 8000 cadenas A mutadas posibles. Este repertorio de muestras es pequeno pero result6 util en la elaboraci6n de mapas de un epftopo tripeptido para establecer nuestra prueba de concepto. Una colecci6n de siete residuos (207 o 1,3 x 109posibles mutantes) representa un nivel de diversidad mfnimo mas tfpico, utilizado normalmente en el diseno de colecciones de expresi6n de fagos, asf como de peptidos sinteticos. Por tanto, como punto de partida, construimos una colecci6n de cadenas A de SLT-1 con una secuencia al azar de 7 aminoacidos de longitud, insertada en su extremo C-terminal. Esta colecci6n se instal6 en el bucle sensible a proteasa de la cadena A, una regi6n en forma de bucle restringida naturalmente por un puente disulfuro. Esta colecci6n proporcion6 suficiente diversidad para asegurar que pueden identificarse variantes de toxina de cadena A que se dirigen hacia receptores interiorizados nuevos o conocidos en celulas cancerosas. Todos los elementos de esta colecci6n (asf como todas las otras colecciones propuestas) contienen una secuencia marcadora His N-terminal para purificar rapidamente los mutantes de la cadena A. La colecci6n (Fig. 4) se gener6 usando una estrategia de PCR con megacebadores (Sarkar G. y Sommers S., (1990)) "The megaprimer method of site-directed mutagenesis". Biotechniques 8, 404-407). La estrategia del megacebador se emplea ampliamente para introducir mutaciones en una secuencia de AON diana, a traves de dos rondas de PCR que usan dos cebadores flanqueantes y un cebador interno mutagenico. La descripci6n del diseno de la colecci6n para la colecci6n de cadenas A de SLT-1-heptapeptidos, servira como ejemplo para otras colecciones futuras de cadenas A sencillas. La colecci6n de cadenas A de SLT-1-heptapeptidos (Fig. 5) lleva una inserci6n al azar de 7 aminoacidos entre los aminoacidos 245 y 246 de la cadena A, sitio identico al usado para construir nuestra colecci6n de cadenas A de SLT-1-tripeptidos (Tablas 1, 2, Fig. 3). Brevemente, dos cebadores flanqueantes A (GTT ACT GTG ACA GCT GAA GCT TTA CGT TTT CG (SEQ IO N0: 2) y B (GAG AAG AAG AGA CTG CAG ATT CCA TCT GTT G (SEQ IO N0: 3) que portaban los sitios de restricci6n HindIII y PstI, respectivamente, se reasociaron en los extremos 5' y 3' del oper6n de SLT-1. Se sintetiz6 una colecci6n de oligonucle6tidos F que contenfa los siete aminoacidos al azar (NNS) asf como una larga secuencia complementaria para reasociarse con el molde. En la sfntesis del oligonucle6tido al azar, la representaci6n relativa de cada aminoacido se mejor6 restringiendo la tercera posici6n de cada cod6n a G o T (Noren, K. A. y Noren, C. J. (2001) "Construction of high-complexity combinatorial phage display peptide libraries". Methods 23, 169-178). Este tipo de restricci6n reduce la complejidad global de la secuencia de AON asf como las discrepancias en la codificaci6n entre los residuos (Reidhaar-0lson y col. (1991) "Random mutagenesis of protein sequences using oligonucleotide cassettes". Methods Enzymol 208, 564-586). Esta estrategia minimiza tambien la aparici6n de codones de detenci6n (TAA y TGA), mientras que el cod6n de detenci6n (TAG) se elimina usando una cepa bacteriana supE, que especifica la inserci6n de un residuo Gln cuando se traducen codones TAG. La primera reacci6n de PCR se realiz6 usando los cebadores A y F y el producto resultante se purific6 mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, en condiciones desnaturalizantes. Este producto sirvi6 a continuaci6n como megacebador con el cebador B para una segunda reacci6n de PCR, para amplificar el AON al azar. El AON final de la colecci6n (producto de la PCR) se digiri6 seguidamente con HindIII y PstI y se clon6 en la cadena principal de un vector de expresi6n pECHE9a (MTI, Toronto). El vector pECHE resultante se utiliz6 subsiguientemente para transformar la cepa de E. coli JM101 y se seleccionaron las colonias bacterianas aisladas, se lisaron y el material sobrenadante se analiz6 para detectar la expresi6n de toxinas de cadena A sencilla o se dispusieron en una capa sobre celulas cancerosas y se sometieron a escrutinio usando SRB para someter a ensayo la citotoxicidad celular.

Ejemplo 3

Evaluaci6n de la colecci6n combinatoria formada por A de SLT-1-heptapeptidos frente a lfneas de celulas cancerosas usando un ensayo de citotoxicidad

Sometimos a escrutinio nuestra colecci6n formada por A de SLT-1-heptapeptidos usando la funci6n citot6xica de la cadena A como senal informadora. La citotoxicidad es una propiedad a medir que proporciona mas informaci6n que la uni6n a un receptor, ya que implica que la toxina es interiorizada, procesada y suministrada cerca de los ribosomas, un suceso que ocurre claramente en multiples etapas. El ensayo de citotoxicidad se realiz6 esencialmente tal y como se ha descrito previamente (Bray y col. (2001) "Probing the surface of eukaryotic cells using combinatorial toxin libraries". Current Biology 11, 697-701). Brevemente, la estrategia para someter a escrutinio todas nuestras colecciones de cadena A se bas6 en los siguientes principios. Se cultivaron lfneas de celulas cancerosas establecidas, tales como SK-BR-3 (cancer de mama humano), CAMA-1 (cancer de mama humano), 518A2 (melanoma humano), PC3 (cancer de pr6stata humano) y B16 (melanoma de murido) en placas de 96 pocillos y se usaron como dianas en las primeras etapas del escrutinio. Estas lfneas celulares se seleccionaron inicialmente para nuestras busquedas de colecciones de holotoxinas (Bray, vease mas arriba) basandose en su adherencia (plastico), sus propiedades de

tinci6n segun la viabilidad de las celulas (SRB) en un ejemplo de escrutinio de alto rendimiento, asf como en su falta de receptor y sensibilidad hacia SLT-1 natural (para asegurar un nivel reducido de falsos positivos). Se seleccionaron colonias bacterianas aisladas a partir de cada colecci6n y se cultivaron en placas de 96 pocillos profundos. Se recogieron las celulas, se lisaron y sus lisados se aclararon. Puesto que todas las variantes expresadas de la cadena A de SLT-1 tienen una secuencia marcadora de 6 histidinas en su extremo N-terminal, se purific6 cada una de ellas a partir de su lisado, usando perlas de afinidad con nfquel (en formato de 96 pocillos) y se dispusieron en capa sobre las celulas diana. Las placas que contenfan las celulas diana tratadas con las variantes de la cadena A se incubaron seguidamente a 37°C durante 48 horas, y a continuaci6n se procedi6 a la fijaci6n y tinci6n con Sulforodamina B (SRB). El ensayo con SRB es un ensayo de indicadores colorimetricos que cuantifica las celulas viables tinendo su contenido proteico celular (Skehan y col., (1990) "New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening". J Natl Cancer Inst 82, 1107-1112). El ensayo con SRB ha sido adoptado por NCI/NIH para su escrutinio de alto rendimiento de candidatos a farmacos sobre lfneas de celulas cancerosas. Los ensayos de viabilidad se repitieron con cualquier extracto bacteriano que conducfa a la muerte celular. Se realiz6 una primera ronda de escrutinio sobre mas de 5000 clones bacterianos (equivalentes a 5000 toxinas de cadena A distintas) y se identificaron 7 variantes de toxina como destructores repetitivos de la lfnea celular de melanoma humano 518A2 (Fig. 5). El eje de abscisas representa el logaritmo de la concentraci6n de toxina usada para tratar las celulas y el eje de ordenadas representa el porcentaje observado de celulas que son viables despues de 48 horas. Los triangulos rellenos representan el efecto de la toxina de tipo silvestre sobre las celulas 518A2, mientras que las dos variantes mas eficaces de la cadena A se denominaron SAMnQ3 (cuadrados sin relleno) y SAMnQ5 (sfmbolos X).

Siete variantes prometedoras de la cadena A se sometieron nuevamente a escrutinio frente a un panel de lfneas celulares (Vero [mono, rin6n normal]; PC-3 [humano, cancer de pr6stata]; HepG2 [humano, hepatoma]; SiHa [humano, cancer de cuello uterino ]; PanC [humano, cancer pancreatico]; SKBR-3 [humano, cancer de mama]; 518-A2 (humano, melanoma]; U87 [humano, glioma]; B16-F10 [rat6n, melanoma]; HS-216 [humano, fibroblasto normal]; CAMA-1 [humano, cancer de mama]; 0VCar-3 [humano, cancer de ovario]). Entre estas siete, se observ6 que cuatro tenfan actividad frente a una lfnea de celulas cancerosas, dos hacia melanoma humano 518-A2, una hacia SiHa (celulas de cancer de cuello uterino humano) y otra hacia U87-A (celulas de cancer cerebral humano; glioma).

Los genes que codificaban las dos toxinas de la cadena A (SAM3 y SAM5) que dieron como resultado la toxicidad de las lfneas celulares de melanoma humano, se secuenciaron para determinar las secuencias de aminoacidos insertadas entre los residuos 245 y 246 de la cadena A de tipo silvestre. Las secuencias, incluyendo el marcador His, se incluyen en la lista de SEQ IO N0s: 4 y 5, respectivamente.

TABLA 1: Secuencias de AON de clones seleccionados al azar a partir de la colecci6n de cadenas A de SLT-1tripeptidos. Las bases mutadas estan en negrita. El mutante nQ41 se identific6 en nuestro escrutinio mediante ELISA por ligarse fuertemente al AcMo 0nc M27 (Fig. 3)

Secuencia de nucle6tidos de la cadena A de SLT-1 Variante: Oiversidad (cambios de nucle6tidos en la regi6n mutada)

epftopo MUC1: CCA GAC ACG CGA CCA GCT CCA 0/9

Mutante nQ 1: CCA GAC GGG ATC GGG GCT CCA 8/9

Mutante nQ 2: CCA GAC CTG GAG ATG GCT CCA 8/9

Mutante nQ 3: CCA GAC CCC CGT GGG GCT CCA 6/9

Mutante nQ 4: CCA GAC GAC GAC TTG GCT CCA 9/9

Mutante nQ 5: CCA GAC GTC CGG TGG GCT CCA 7/9

Mutante nQ 6: CCA GAC CAG CGC TGG GCT CCA 6/9

Mutante nQ 7: CCA GAC CTC AGG ATG GCT CCA 8/9

Mutante nQ 8: CCA GAC TCC CAG GAG GCT CCA 7/9

Mutante nQ 9: CCA GAC TCC GAC CCC GCT CCA 6/9

Mutante nQ 41: CCA GAC ACG CGC CCC GCT CCA 2/9

TABLA 2: Alineamiento de las secuencias de aminoacidos de clones seleccionados al azar a partir de la colecci6n de cadenas A de SLT-1-tripeptidos y la senal en el ensayo ELISA de las variantes de la cadena A de SLT-1 purificadas detectadas con un AcMo (0nc M27) obtenido contra el epftopo de MUC1 Thr-Arg-Pro. La regi6n tripeptfdica mutada esta en negrita. El mutante nQ41 se identific6 en nuestro escrutinio mediante ELISA por presentar una fuerte uni6n al AcMo 0nc M27

Secuencia de aminoacidos deducida de la cadena A de SLT-1 Variante: Lecturas de ELISA (405 nm)

epftopo MUC1: CHHHPO TRP APASRVARMASOEFPSMC 1,3

Mutante nQ 1: CHHHPO GIG APASRVARMASOEFPSMC 0,08

Mutante nQ 2: CHHHPO LQM APASRVARMASOEFPSMC 0,03

Mutante nQ 3: CHHHPO PRG APASRVARMASOEFPSMC 0,03

Mutante nQ 4: CHHHPO OOL APASRVARMASOEFPSMC 0,06

Mutante nQ 5: CHHHPO VRW APASRVARMASOEFPSMC 0,07

Mutante nQ 6: CHHHPO QRL APASRVARMASOEFPSMC 0,06

Mutante nQ 7: CHHHPO LRM APASRVARMASOEFPSMC 0,11

Mutante nQ 8: CHHHPO SQE APASRVARMASOEFPSMC 0,13

Mutante nQ 9: CHHHPO SOP APASRVARMASOEFPSMC 0,07

Mutante nQ 41: CHHHPO TRP APASRVARMASOEFPSMC 1,25

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Molecular Templates, Inc.

<120> C0LECCION OE MUTANTES OE T0XINAS Y MET0O0S PARA SU US0

<130> M2798 EP/1 S3 5 <150> EP04785852.7

<151>

<160> 7

<170> PatentIn versi6n 3.2

<210> 1 10 <211> 299

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<220>

<221> misc feature 15 <223> cadena A de SLT-1 de tipo silvestre

<400> 1 <210> 2

<211> 32 5 <212> AON

<213> Artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota � "Oescripci6n de la Secuencia Artificial: Cebador"

10 <400> 2

<210> 3

<211> 31

<212> AON 15 <213> Artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota � "Oescripci6n de la Secuencia Artificial: Cebador"

<400> 3

<210> 4

<211> 302

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota � "Oescripci6n de la Secuencia Artificial: secuencia de la protefna libnQ3 de la cadena A de SLT-1 (SAM3)"

<400> 4 <210> 5

<211> 319 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota � "Oescripci6n de la Secuencia Artificial: secuencia de la protefna libnQ5 de la cadena A de SLT-1 10 (SAM5)"

<400> 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota � "Oescripci6n de la Secuencia Artificial: primer inserto activo de melanoma"

<400> 6 <210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<221> Fuente

<223> /nota � "Oescripci6n de la Secuencia Artificial: segundo inserto activo de melanoma"

<400> 7

Claims

REIvINDICACIONES

1.

Una colecci6n combinatoria de protefnas que comprende una pluralidad de especies proteicas, comprendiendo cada especie de protefna una cadena A de una protefna t6xica ABx que comprende un bucle sensible a proteasa en el cual se ha introducido un inserto, en donde el inserto es un polipeptido de secuencia de aminoacidos variable que tiene una longitud de 2-7 residuos de aminoacidos, y en donde cuando la pluralidad de especies proteicas se ponen en contacto con al menos una diana/receptor candidato, una especie proteica que comprende un inserto se une a una diana/un receptor especffico, identificando de este modo el inserto como un ligando de la diana/el receptor especfficos.
2.

Una colecci6n combinatoria de protefnas que comprende una pluralidad de especies proteicas, comprendiendo cada especie de protefna una cadena A de una protefna t6xica ABx que comprende un bucle sensible a proteasa en el cual se ha introducido un inserto, en donde el inserto es un polipeptido de secuencia de aminoacidos variable que tiene una longitud de 2-7 residuos de aminoacidos, y en donde cuando la pluralidad de las especies proteicas se ponen en contacto con al menos una diana/un receptor candidato, localizado en la superficie de una celula una especie proteica que comprende un inserto, se une a una diana/un receptor especffico y es t6xico para la celula, identificando de este modo un inserto que comprende un ligando de la diana/el receptor.
3.

La colecci6n combinatoria de protefnas de acuerdo con la reivindicaci6n 1, en donde la diana/el receptor se localiza en la superficie de una celula.
4.

La colecci6n combinatoria de protefnas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la colecci6n comprende al menos 100 especies proteicas.
5.

La colecci6n combinatoria de protefnas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde las especies proteicas se forman introduciendo el inserto en una cadena A de una toxina I de tipo Shiga, que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ IO N0: 1.
6.

La colecci6n combinatoria de protefnas de acuerdo con la reivindicaci6n 5, en donde la especie proteica se forma introduciendo el inserto entre los aminoacidos 242 y 261, tal y como se define haciendo referencia a SEQ IO N0: 1.
7.

La colecci6n combinatoria de protefnas de acuerdo con la reivindicaci6n 6, en donde la especie proteica se forma introduciendo el inserto entre los aminoacidos 245 y 246, tal y como se define haciendo referencia a SEQ IO N0: 1.
8.

La colecci6n combinatoria de protefnas de acuerdo con la reivindicaci6n 5, en donde la especie proteica se forma introduciendo el inserto antes o despues de los aminoacidos 1-239 de la cadena A de la toxina I de tipo Shiga, tal y como se define haciendo referencia a SEQ IO N0: 1.
9.

La colecci6n combinatoria de protefnas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el inserto tiene una longitud de 7 aminoacidos.
10.

Una colecci6n combinatoria de protefnas que comprende una pluralidad de especies de sistemas de expresi6n, expresando cada especie una especie proteica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
11.

Una protefna mutante que comprende una cadena A de una protefna t6xica ABx en la que se ha introducido un inserto, en donde

(a)

el inserto es un polipeptido con una secuencia de aminoacidos variable que tiene una longitud de 2-7 residuos de aminoacidos; y

(b)

el inserto se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A.
12.

La protefna mutante de acuerdo con la reivindicaci6n 11, en donde la cadena A de la protefna t6xica ABx es una cadena A de la toxina I de tipo Shiga.
13.

La protefna mutante de acuerdo con la reivindicaci6n 12, en donde el inserto se introduce entre los aminoacidos 242 y 261, tal y como se define haciendo referencia a SEQ IO N0: 1.
14.

La protefna mutante de acuerdo con la reivindicaci6n 13, en donde el inserto se introduce entre los aminoacidos 245 y 246, tal y como se define haciendo referencia a SEQ IO N0: 1.
15.

La protefna mutante de acuerdo con la reivindicaci6n 14, en donde el inserto comprende la secuencia IYSNKLM (SEQ IO N0: 6).
16.

La protefna mutante de acuerdo con la reivindicaci6n 14, en donde el inserto comprende la secuencia AA-FAOLI (SEQ IO N0: 7).
17.

La protefna mutante de acuerdo con la reivindicaci6n 12, en donde el inserto se introduce antes o despues de los aminoacidos 1-239 de la cadena A de la toxina I de tipo Shiga, tal y como se define haciendo referencia a SEQ IO N0: 1.
18.

La protefna mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-17, en donde el inserto tiene una longitud de 7 aminoacidos.
19.

Un metodo para identificar un ligando que se une a una diana/un receptor especffico, que comprende las etapas de:

(a)

exponer las celulas que se sabe que tienen la diana/el receptor a miembros de una colecci6n combinatoria de protefnas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9; y

(b)

seleccionar miembros de la colecci6n de protefnas que se observan que son t6xicos para las celulas.
20.

El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 19, que comprende adicionalmente la etapa de evaluar los miembros seleccionados de la colecci6n proteica para determinar la secuencia de la regi6n insertada, identificandose de ese modo un peptido de la secuencia de la regi6n insertada como posible ligando de una diana/un receptor sobre la celula.
21.

El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19-20, que comprende adicionalmente la etapa de someter a ensayo adicionalmente los miembros seleccionados de la colecci6n proteica para confirmar que son ligandos de la diana/el receptor especffico.
22.

Un metodo para aislar una toxina especffica de una diana/un receptor que comprende las etapas de:

(a)

exponer la diana/el receptor a una colecci6n combinatoria de protefnas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9;y

(b)

aislar al menos una especie proteica de la colecci6n de protefnas capturada por la uni6n a la diana/el receptor.
23.

El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 22, que comprende adicionalmente la etapa de escrutar la protefna aislada frente a celulas que expresan la diana/el receptor para confirmar su toxicidad para celulas que expresan la diana/el receptor.
24.

El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 22, en el que la diana/el receptor es una diana/el receptor purificado y se inmoviliza sobre un soporte s6lido.
25.

El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 23, en donde la diana/el receptor esta en la superficie de las celulas.
26.

El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 25, en donde las celulas se inmovilizan sobre un soporte s6lido.
27.

El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-26, en donde la toxina sirve como informadora y la muerte de las celulas es indicativa de la uni6n al receptor.
28.

Un metodo para identificar una toxina para una celula que expresa una diana/un receptor especffico, que comprende las etapas de:

(a)

exponer las celulas que se sabe que tienen la diana/el receptor a miembros de una colecci6n combinatoria de protefnas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9; y

(b)

seleccionar miembros de la colecci6n de protefnas que se observan que son t6xicos para las celulas,

en donde los miembros de la colecci6n proteica que se observan que son t6xicos para las celulas, son toxinas para las celulas que expresan la diana/el receptor especffico.
29. El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 28, que comprende adicionalmente la etapa deidentificar un ligando que se une a una diana/un receptor especffico, que comprende las etapas de:

(a)

exponer las celulas que se sabe que tienen la diana/el receptor a miembros de una colecci6n combinatoria de protefnas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9; y

(b)

seleccionar los miembros de la colecci6n de protefnas que se observan que son t6xicos para las celulas,

en donde los miembros de la colecci6n proteica que se observan que son t6xicos para las celulas, son ligandos que se unen a la diana/el receptor especffico.
30.

El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28-29, que comprende adicionalmente una etapa o etapas de mutaci6n de un inserto para incrementar adicionalmente la toxicidad de la especie proteica en

comparaci6n con la especie proteica que comprende el inserto original.
31.

Un metodo para incrementar la toxicidad de una especie proteica de acuerdo con la reivindicaci6n 11, que comprende las etapas de:

(a) mutar un inserto conocido que posee toxicidad para las celulas que expresan una diana/un receptor especffico; y

5 (b) comparar la toxicidad de la especie proteica que comprende el inserto mutado con la especie proteica que comprende el inserto original.
32. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28-31, que comprende adicionalmente una etapa de evaluaci6n de los miembros seleccionados de la colecci6n proteica para determinar la secuencia de la regi6n insertada.

10 33. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 28-32, que comprende adicionalmente una etapa de someter a ensayo adicionalmente los miembros seleccionados de la colecci6n proteica para confirmar que son t6xicos para una celula que expresa una diana/un receptor especffico.
34. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19-21, 23 o 25-33, en donde las celulas son celulas cancerosas.

15 35. El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 34, en donde las celulas cancerosas se seleccionan entre el grupo consistente en celulas de melanoma, celulas de cancer de cuello uterino o celulas de cancer cerebral.
36.

El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 35, en donde las celulas cancerosas son celulas de melanoma.
37.

El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 35, en donde las celulas cancerosas son celulas de cancer de cuello uterino.

20 38. El metodo de acuerdo con la reivindicaci6n 35, en donde las celulas cancerosas son celulas de cancer cerebral.