ES2386377T3

ES2386377T3 - Antagonistas selectivos del receptor A2A para el tratamiento de la fibrilación auricular

Info

Publication number: ES2386377T3
Application number: ES06830873T
Authority: ES
Inventors: Rafael FRANCO FERNÁNDEZ; Francisco CIRUELA ALFÉREZ; Carmen LLUÍS BISET; Christa MÜLLER; Joan Cinca Cuscullola; Leif Hove-Madsen
Original assignee: Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Current assignee: Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2006-10-10
Publication date: 2012-08-20
Anticipated expiration: 2026-10-10
Also published as: EP1949903A2; MX2008004886A; RU2445099C2; EP1949903B8; CN101325956B; WO2007045705A3; BRPI0617369A2; CN101325956A; CA2626020A1; RU2008118995A; ES2273599A1; EP1949903B1; WO2007045705A2; AU2006303240B2; DK1949903T3; JP2009511551A; US20090312332A1; AU2006303240A1; ES2273599B1; ATE553763T1

Abstract

Los antagonistas del receptor de adenosina A2A son útiles para lapreparación de medicamentos contra la fibrilación auricular en mamíferos, incluyendo el hombre. Se ha encontrado que el receptorde adenosina A2A es presente en los cardiomiocitos auriculares humanos y participa en los mecanismos patológicos fundamentales dela fibrilación auricular. Una ventaja de utilizar antagonistas A2A sobre otros agentes conocidos en la técnica es que los antagonistas A2A van dirigidos específicamente a pacientes con fibrilación auricular.

Description

Antagonistas selectivos del receptor A2A para el tratamiento de la fibrilación auricular.

Esta invención se relaciona con el campo de la medicina humana y veterinaria y específicamente con compuestos para el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares, en particular para el tratamiento de la fibrilación auricular.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La fibrilación auricular es la arritmia cardiaca más frecuente y se asocia a una mortalidad y morbilidad sustanciales. Su incidencia y prevalencia está incrementando y representa una creciente carga clínica y económica (la prevalencia actual es del 2% de la población general). Además de los síntomas clínicos severos como palpitaciones, mareos, disnea y otros, la fibrilación auricular es el factor aislado de riesgo más importante para el accidente isquémico cerebral en la población de más de 75 años de edad. En conjunto la fibrilación auricular es responsable de un 5% de los ingresos hospitalarios por enfermedades cardiacas. En el 90% de los casos la fibrilación auricular acontece en presencia de otras enfermedades cardiacas como la enfermedad cardiaca hipertensiva, el fallo cardiaco congestivo o las enfermedades de las válvulas cardiacas. En sólo un 10% de los casos la fibrilación auricular se desarrolla en ausencia de anormalidades cardiacas (‘‘lone’’ fibrilación auricular). Se puede diferenciar entre tres formas de fibrilación auricular: (1) fibrilación auricular paroxística caracterizada por episodios de fibrilación auricular autolimitados con duraciones que varían entre segundos y días; (2) fibrilación auricular persistente que dura indefinidamente hasta que se termina por medio de intervención médica; (3) fibrilación auricular permanente que no revierte tras cardioversión eléctrica o farmacológica.

Existen estudios que han demostrado que la fibrilación auricular está causada por múltiples ondas eléctricas reentrantes que se mueven al azar alrededor de la aurícula. Estas ondas se inician por extrasistoles comúnmente localizados en las extensiones miocárdicas que van de la aurícula izquierda hasta los 5-6 cm proximales de las venas pulmonares. Una vez iniciada la fibrilación auricular se producen cambios en la aurícula (remodelado auricular) que afectan a sus propiedades eléctricas, mecánicas y metabólicas, responsables de la perpetración de la arritmia. La frecuencia ventricular en presencia de fibrilación auricular es elevada y si ésta no puede reducirse con tratamiento médico, se producirá una dilatación ventricular y una disfunción sistólica que se conoce como taquimiocardiopatía. El accidente vascular cerebral o ictus ("stroke") y el tromboembolismo son la mayor causa de mortalidad y morbilidad asociadas a la fibrilación auricular, y la base patofisiológica de ello es el estado protrombótico o de hipercoagubilidad asociado a anormalidades del flujo sanguíneo (estasis auricular, por ejemplo) y daño endotelial o endocárdico.

Como en otras subespecialidades en cardiología, se han realizado importantes progresos en las últimas cuatro décadas en el diagnóstico y el tratamiento de arritmias cardíacas. A pesar de dichos avances la curación real de las arritmias cardíacas y de la muerte súbita arrítmica sólo es posible en una minoría de pacientes. Actualmente la terapia para la fibrilación auricular está enfocada a reducir los síntomas relacionados con la fibrilación auricular, la prevención de las complicaciones tromboembólicas y la terminación de la arritmia cuando ello sea posible.

En general hay dos formas de enfocar el tratamiento de la fibrilación auricular: a) control de la propia arritmia y b) reducción del riesgo tromboembólico (cfr. M.B. Iqbal et al., "Recent developments in atrial fibrillation", British Medical Journal 2005, vol. 330, pp. 238-43). El control de la arritmia va dirigido al control del ritmo (restauración y mantenimiento del ritmo sinusal) y al control de la velocidad. Farmacológicamente, el control de ritmo y de la velocidad se realiza con fármacos antiarrítmicos (agentes antiarrítmicos de clase I y III). Ejemplos de ellos que se usan hoy en día son flecainida, propafenona, amiodarona, dofetilida, ibutilida y sotalol. El control del ritmo y de la velocidad por medios no farmacológicos se realiza con cardioversión eléctrica, marcapasos auricular, desfibrilador auricular implantable y procedimiento quirúrgico de Maze.

La reducción del riesgo tromboembólico y por tanto, la prevención del ictus es de mayor importancia en la estrategia terapéutica. Farmacológicamente, la aspirina y la warfarina se recomiendan a la mayoría de pacientes para prevenir la formación de trombos auriculares y de episodios tromboembólicos. Datos de ensayos clínicos con pacientes de alto riesgo indican que la warfarina es mejor que la aspirina para prevenir el ictus, pero que el riesgo de hemorragia es dos veces mayor con warfarina que con aspirina. En cualquier caso, el tratamiento anticoagulante debe ser individualizado en base a la edad, comorbilidad y contraindicaciones. La reducción del riesgo tromboembólico mediante procedimientos no farmacológicos se consigue actualmente mediante la obliteración de la orejuela auricular izquierda o con catéter (procedimiento en fase de investigación).

Investigaciones recientes han vislumbrado nuevas aproximaciones en las estrategias de tratamiento farmacológico y no farmacológico. Los agentes más prometedores son los inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE) y los agentes bloqueantes de los receptores de angiotensina II. Inhibidores de proteasas, fosfatasas con suficiente selectividad y especificidad o antioxidantes pueden también ofrecer estrategias terapéuticas noveles para reducir o revertir los cambios estructurales, la dilatación auricular y la disfunción contráctil. Sin embargo, el problema del tratamiento de la fibrilación auricular está todavía lejos de ser resuelto satisfactoriamente.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han encontrado que un grupo bien conocido de compuestos farmacéuticos, a saber los antagonistas selectivos del receptor de adenosina A2A, son útiles para la preparación de medicamentos contra la fibrilación auricular en mamíferos, incluyendo el hombre.

La invención se ha originado del sorprendente hallazgo de que el receptor de adenosina A2A está presente en los cardiomiocitos de aurícula humana y participa en los mecanismos patológicos fundamentales de la fibrilación auricular. En particular, los inventores han encontrado que la expresión de la especie homodimérica del receptor de adenosina A2A, que es la especie funcional en la membrana plasmática, está regulada al alza en pacientes con fibrilación auricular. Experimentos electrofisiológicos han probado que la activación del receptor de adenosina A2A en miocitos auriculares de estos pacientes da lugar a incrementos mediados por la proteína quinasa A de liberaciones espontáneas de calcio del retículo sarcoplásmico medidos como ondas de calcio.

Además, utilizando dos aproximaciones experimentales diferentes (captación de imágenes de calcio por confocal y técnica de patch clamp) los inventores han encontrado que los antagonistas del receptor de adenosina A2A reducen la frecuencia de onda de calcio elevada encontrada en fibrilación auricular. En realidad, los antagonistas del receptor de adenosina A2A no sólo revierten el efecto estimulatorio agonista sobre las ondas de calcio sino que además reducen la frecuencia de onda de calcio basal. Reuniéndolos, estos resultados sugieren que una desregulación mediada por el receptor de adenosina A2A de los flujos de calcio intracelular contribuye a la compleja remodelación eléctrica de la aurícula que fibrila. Estos hechos convierten a los antagonistas del receptor de adenosina A2A en agentes terapéuticos selectivos para tratar la fibrilación auricular.

Previamente, y como investigación más cercana, los inventores habían sólo descrito que los miocitos aislados de aurícula derecha de pacientes con episodios de fibrilación auricular exhibían una liberación espontánea de Ca2+ de retículo sarcoplásmico más frecuente que miocitos de pacientes sin esta arritmia (cfr. L. Hove-Madsen et al., "Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes", Circulation 2004, vol. September, pp. 1358-63).

En consecuencia, la invención se refiere al uso de un antagonista del receptor de adenosina A2A para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de la fibrilación auricular en un mamífero, incluyendo un humano. A partir de aquí, "antagonista del receptor de adenosina A2A" será llamado "antagonista A2A" y "receptor de adenosina A2A" como "receptor A2A".

Una ventaja de utilizar antagonistas A2A sobre otros agentes conocidos en la técnica es que los antagonistas A2A van dirigidos específicamente a pacientes con fibrilación auricular. Así, la expresión de los receptores A2A diméricos funcionales es baja en pacientes con un tamaño normal de aurícula y sin una historia previa de fibrilación auricular mientras que la expresión de la especie de receptor dimérico está fuertemente regulada al alza en pacientes con fibrilación auricular. Por el contrario, otros agentes actualmente empleados actúan más ampliamente sobre receptores o canales que regulan críticamente múltiples funciones en una variedad de células. Así, los antagonistas de calcio no sólo reducirán la sobrecarga de calcio por inhibición de los canales de calcio tipo L, sino que también reducen la contractibilidad cardiaca. Además, los canales de calcio tipo L también regulan la función del músculo liso y las células secretoras, con los consecuentes efectos secundarios indeseados de los antagonistas de calcio.

El receptor A2A

La adenosina es un nucleósido de purina producido por todas las células metabólicamente activas del cuerpo. La adenosina ejerce su efecto a través de cuatro subtipos diferentes de receptor de superficie celular: A1, A2A, A2B y A3 que pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a proteína G. A1 y A3 acoplan proteína G inhibitoria, mientras que A2A y A2B acoplan proteína G estimuladora. Los receptores A2A se encuentran principalmente en cerebro, tanto en neuronas como en células gliales (máximos niveles en el cuerpo estriado y el núcleo accumbens, de moderados a altos en bulbo olfatorio, regiones del hipotálamo e hipocampo). En el cuerpo estriado el receptor A2A regula la liberación y la función de neurotransmisores (cfr. H. Kase et al. "Progress in pursuit of therapeutic A2A antagonists: the adenosine A2A receptor selective antagonist KW 6002: research and development toward a novel nondopaminergic therapy for Parkinson's disease", Neurology 2003, vol. 61, pp. 97-100). En tejidos periféricos, los receptores A2A se conoce que están presentes en plaquetas, neutrófilos, bazo, timo, células endoteliales y del músculo liso vascular, donde inducen una potente vasodilatación coronaria que permite la evaluación de la perfusión miocárdica en pacientes con enfermedad coronaria (cfr. Z. Gao et al., "Novel short-acting A2A adenosine receptor agonists for coronary vasodilatation: inverse relationship between affinity and duration of action of A2A agonists", J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001, vol. 298, pp. 209-18). Sin embargo, el receptor A2A no se había localizado nunca en cardiomiocitos de aurícula humana.

Compuestos adecuados para tratar la fibrilación auricular

En general, un antagonista es una molécula que se une al receptor sin activarlo. Compite con el/los ligandos endógenos o el/los sustratos por los sitios de unión del receptor y así, inhibe la habilidad del receptor para transducir una señal intracelular en respuesta a la unión de ligando endógeno. Un antagonista funciona de varias maneras. Puede unirse a o secuestrar la adenosina con suficiente afinidad y especificidad para interferir sustancialmente con, bloquear o de otra manera, evitando la unión de la adenosina al receptor A2A, y así, inhibiendo, suprimiendo o causando la cesación de la actividad biológica mediada por la adenosina.

El receptor A2A en cardiomiocitos y en ausencia de ligando endógeno, presenta una actividad basal. Esta actividad puede ser debida a una actividad constitutiva del receptor o a activación del receptor por adenosina endógena. En esta situación, el tratamiento de la fibrilación auricular puede llevarse a cabo mediante la reducción de esta actividad basal utilizando un antagonista o un agonista inverso. Algunos de los antagonistas A2A de la invención pueden presentar agonismo inverso.

De acuerdo con la localización conocida y la función del receptor A2A, los antagonistas A2A han sido utilizados hasta ahora contra el Parkinson y otras enfermedades del SNC (esquizofrenia, demencia senil como en la enfermedad de Alzheimer, psicosis de origen orgánico, etc.). Entre ellas, la principal es la enfermedad de Parkinson.

Cada antagonista selectivo de A2A se contempla para utilizarse para los propósitos de esta invención. Se han investigado profundamente muchos compuestos diferentes como antagonistas A2A, que pueden clasificarse en dos grandes familias: derivados de xantina y heterociclos no derivados de xantina.

En una realización particular de la invención, el antagonista selectivo de A2A es un derivado de xantina o una sal farmacéuticamente aceptable de éste. Diferentes sustituyentes en varias posiciones, también análogos azo-o deazo-, u otros análogos heterocíclicos del anillo de purina o derivados/análogos tri- o tetracíclicos, pueden tener actividad A2A-antagonística similar. Entre los derivados de xantina, la estructura preferida común a algunos compuestos es la estructura 1,3,7-trialquil-8-estiril-xantina. En una realización preferida, el antagonista A2A es un compuesto que se selecciona del grupo que consiste de teobromina, conocida como DMPX (fórmula 1); KF 17837 (fórmula 2); istradefillina, conocida como KW 6002 (fórmula 3); p-sulfoestiril-DMPX (fórmula 4); BS-DMPX (fórmula 5); MSX-2 (fórmula 6); CSC (fórmula 7); "xanthine amine congener" (XAC, fórmula 8); y MSX-3 .

En una realización más preferida, el antagonista selectivo de A2A es KW 6002. Este compuesto está actualmente en ensayos de fase clínica III para la enfermedad del Parkinson. En otra realización preferida, el antagonista selectivo de A2A es MSX-2. En otra realización preferida, el antagonista selectivo de A2A es MSX-3 o el éster de ácido fosfórico de MSX-2.

OO

CH3 H3C

CH3

N

NN

N CH3

N

O

NO N O N

CH3

OCH3

CH3

(1)

(2)

OO CH3 CH3

NN

N CH3

NH3C

-K+

SO3

O NN O NO N

CH3

CH3 OCH3

(3) (4)

O O

CH3

CH3 N

NN

N

NO N

O N CH3 Br

OCH3

OH C

(5) (6)

O

O CH3

H3C

N ON

H3C

N

O

NH2

N

O N H

H

NO N

CH3 Cl

CH3

5 (7) (8)

Otros compuestos de xantina conocidos por presentar actividad antagonística para el receptor A2A se describen por ejemplo en US 5484920, US 5587378, US 5543415 y EP 1016407A1.

En otra realización particular de la invención, el antagonista selectivo de A2A es un heterociclo no derivado de xantina. Antagonistas A2A no-xantina típicos pueden derivar de la adenina y representar derivados de la adenina en

10 el sentido más amplio, incluyendo compuestos mono-, di-, tri- y tetracíclicos con varios sustituyentes. Se han identificado otros compuestos heterocíclicos no derivados de la adenina que poseen actividad antagonística A2A. Se conocen algunos compuestos 2-aminopiridina que exhiben antagonismo para el receptor A2A (p.ej. WO 02/14282, WO 01/25210), y también se conocen algunos compuestos 9-aminopirimidina (p.ej. US 2001/0027196).

En una realización preferida, el antagonista selectivo de A2A se selecciona del grupo que consiste de SCH 58261

15 (fórmula 9); ANR-82 (fórmula 10); ZM 241385 (fórmula 11); SCH 63390 (fórmula 12), 8FB-PTP (fórmula 14); VER6623 (también conocido como V2006, fórmula 15); (-) R,S-mefloquina (fórmula 16); y 7FB-PTP (fórmula 17). En una realización más preferida, el antagonista selectivo de A2A entre el grupo de compuestos no-xantina es VER-6623.

Otros compuestos preferidos como antagonistas selectivos de A2A son el derivado de pirazolopirimidina de fórmula 18; el deirvado de triazoloquinoxalina de fórmula 19; el derivado 9-sustituido 2-amino-6-furil-adenina de fórmula 20;

20 y los derivados de triazolotriazina de fórmula 21, 22 y 23.

NH2 NH2

N

NN N N

Br N O

N

N N

CH3

(9) (10)

NH2

N

N N

O

N

N O

N N

N

H

N

HO

(11) (12)

NH2

NN N

N O

N N

F10 (14)

CF3

N N CF3

S S

N

H

HO RN HN

(15) (16)

NH2

N

NH2

NN

N O ON

N

S

H2N

F

15 (17) (18)

NH2

O

N

H

N

O

N

H2N N

Cl

CF3

F

(19) (20

NH2

F

N Cl

(23)

Otros antagonistas A2A de triazolopirimidina se describen por ejemplo en WO 2004/029056, WO 95/01356, US 5565460, WO 97/05138, WO 98/52568, WO 01/92264 y PCT/US02/32630. Específicamente, compuestos sustituidos de pirazol[4,3-e]-1,2,4-triazolo-[1,5-c]pirimidina se describen en WO 2005/054245, US 2004/220194 y US 2003212059.

Otros ejemplos específicos de antagonistas A2A adecuados incluyen los compuestos descritos en las siguientes patentes, solicitudes de patente y artículos: WO 95/01356, US 6630475, US 5935964, WO 03/032996, WO 03/048165, WO 03/048164, WO 03/048163, WO 2005/042500, WO 2005/058883, WO 2005/040151, WO 2005/039572, WO 2004/092177, US 2004138235, WO 2004/019949, WO 02/14282, WO 2004/016605, WO 03/082873, US 5484920, US 5703085, WO 92/06976, WO 94/01114, US 5565460, WO 98/42711, WO 00/7201, WO 99/43678, WO 99/26627, WO 01/92264, WO 99/35147, WO 00/13682, WO 00/13681, WO 00/69464, WO 01/40230, WO 01/02409, WO 01/02400, EP 1054012, WO 01/62233, WO 01/17999, WO 01/80893, WO 02/14282, WO 01/97786, WO 01/16134, WO 00/73307, US 2005043315, US 2003149060, Baraldi et al., "Recent developments in the field of A2A and A3 adenosine receptor antagonists", European Journal of Medicinal Chemistry 2003, vol. 38, pp. 367-82; E. Ongini, et al. "Selective adenosine A2A receptor antagonists", Farmaco 2001, vol. 56, pp. 87-90; C.E. Müller et al., "A2A Adenosine receptor antagonists - future drugs for Parkinson's disease?", Drugs of the Future 2000, vol. 25, pp. 1043-52; L.J. Knutsen et al.,"KW-6002 (Kyowa Hakko Kogyo)", Curr. Opin. Investig. Drugs 2001, vol. 2, pp. 668-73; B. Cacciari et al., "Medicinal chemistry of A2A adenosine receptor antagonists", Curr. Top. Med. Chem. 2003, vol. 3, pp. 403-11; G. Yao et al., "Synthesis of alkyne derivatives of novel triazolopyrazine as A2A adenosine receptor antagonists", Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, vol. 15, pp. 511-5; E. Kiselgof et al., "6-(2furanyl)-9H-purin-2-amine derivatives as A2A adenosine antagonists", Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, vol. 15, pp. 2119-22; S.M. Weiss et al., "Discovery of nonxanthine adenosine A2A receptor antagonists for the treatment of Parkinson’s disease", Neurology 2003, vol. 61 (Supp. 6), pp. S101-6; C.B. Vu et al., "Novel diamino derivatives of [1,24]triazolo[1,5-a][1,3,5]triazine as potent and selective adenosine A2A receptor antagonists", J. Med. Chem. 2005, vol. 48, pp. 2009-18; C.B. Vu et al., "Piperazine derivatives of [1,2,4]triazolo[1,5-a][1,3,5]triazine as potent and selective adenosine A2A receptor antagonists", J. Med. Chem. 2004, vol. 47, pp. 4291-9.

El experto en la materia sabrá si un compuesto es un buen antagonista selectivo de A2A para el propósito de la invención. Por ejemplo, hay en la técnica métodos adecuados para valorar si un compuesto es un buen antagonista selectivo de A2A. Un ejemplo es el método basado en un ensayo de unión de radioligando que se describe en la solicitud de patente US 2004/0138235 secciones [0226]-[0240].

Todos los antagonistas A2A antes descritos son selectivos para el receptor A2A, pero el grado de selectividad es diferente entre ellos. Las selectividades pueden también diferir un tanto entre diferentes especies (p.ej. rata, humano).

Los antagonistas A2A se preparan por métodos conocidos como se describe en las patentes y solicitudes citadas.

Composiciones farmacéuticas y administración

En términos de tratamiento, una cantidad efectiva se refiere a aquella cantidad de ingrediente activo que es suficiente para dar un resultado clínico beneficioso o deseado: paliar, mejorar, estabilizar, revertir o retrasar la progresión de la enfermedad o desorden, o si no, reducir las consecuencias patológicas de la enfermedad o desorden. La cantidad efectiva la determina normalmente un médico caso por caso.

Mientras que el compuesto activo para usarse de acuerdo con la invención en terapia puede administrarse en forma de compuesto químico bruto, se prefiere introducir el ingrediente activo, opcionalmente en forma de sal fisiológicamente aceptable, en una composición farmacéutica junto con uno o más adyuvantes, excipientes, portadores, tampones, diluyentes y/o otros auxiliares farmacéuticos habituales. Los componentes pueden administrarse en una sola o en múltiples dosis por cualquiera de los modos de administración aceptables de agentes con utilidad similar, incluyendo las rutas rectal, bucal, intranasal y transdérmica, por inyección intra-arterial, intravenosa, intraperitoneal, parenteral, intramuscular, subcutánea, oral, tópica, como inhalante, o vía un aparato impregnado o recubierto como un stent, por ejemplo, o un polímero cilíndrico insertado en la arteria.

Un modo de aministración preferido es el parenteral, particularmente por inyección. Las formas para la administración por inyección incluyen las suspensiones acuosas o oleosas, o las emulsiones, así como las soluciones acuosas estériles. La administración oral es otra ruta de administración preferida. La composición farmacéutica puede estar en forma de pastillas, píldoras, polvos, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones jarabes, aerosoles, cápsulas, etc.

Las composiciones de la invención pueden formularse para proporcionar una liberación rápida, sostenida o de acción retardada del ingrediente activo después de la administración al paciente mediante el empleo de procedimientos conocidos en la técnica. Sistemas de liberación controlada del fármaco para administración oral incluyen sistemas de bombas osmóticas y sistemas disolucionales que contienen reservorios recubiertos de polímero o formulaciones con una matriz fármaco-polímero. Otra formulación para usarse en los métodos de la presente invención emplea aparatos de liberación transdérmica (parches). Estos parches transdérmicos pueden usarse para proporcionar la infusión continua o discontinua de los compuestos en cantidades controladas.

Las composiciones se formulan preferiblemente en forma de dosis única. La dosis depende de la naturaleza y la severidad de la enfermedad y determinarla queda dentro del criterio del médico.

Salvo que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia a la que la invención pertenece. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de la solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIG. 1. Regulación al alza (up-regulation) de la expresión del receptor A2A en pacientes con fibrilación auricular.

FIG. 2. La estimulación por agonistas del receptor A2A incluye en pacientes con fibrilación auricular un incremento dependiente de PKA de la liberación espontánea de calcio del retículo sarcoplásmico.

FIG. 3. Los antagonistas A2A reducen la liberación basal espontánea de calcio del retículo sarcoplásmico en pacientes con fibrilación auricular. Experimentos que muestran INCX espontáneo a un potencial mantenido a -80 mV.

EXPOSICION DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN

Descripción detallada de las figuras

(RyR). La FIG. 1B muestra membranas celulares de células HEK transfectadas transitoriamente con el receptor A2A humano (control positivo, C+) y membranas auriculares de corazón humano de individuos con ritmo sinusal (SINUS)

o con fibrilación auricular (AF) resueltas por SDS-PAGE e inmunoblot empleando un anticuerpo de conejo antireceptor A2A. "Di" significa dímero y "Mo" significa monómero. La FIG. 1C muestra el escaneado densitométrico relativo ("Relative Densitometric Scan", RDS) del inmunoblot de la FIG. 1B. La cantidad total de receptor A2A (monómero más dímero) se muestra en barras negras. Las cantidades relativas de monómero de receptor A2A (barras blancas) y de dímero (barras grises) se normalizan utilizando la suma total de receptor A2A (dímero más monómero ) en cada carril.

En la FIG. 2A, el INCX espontáneo se midió con el potencial de membrana mantenido a -80 mV antes (control), durante (CGS) y después (lavado, W) de la exposición del miocardiocito a 200 nM de CGS 21680. Las barras de escala horizontales y verticales corresponden respectivamente a 30 s y 100 pA. La FIG. 2B muestra la dependencia con el tiempo del efecto estimulador del CGS 21680 en el número de corrientes espontáneas de intercambio Na-Ca (contadas como eventos en cada barrido de 30 s, e/s). La línea gruesa situada sobre las barras indica el periodo de aplicación de CGS 21680. La FIG. 2C muestra cómo el antagonista A2A, ZM 241385 (1 M) fue capaz de revertir el efecto estimulador de 200 nM de CGS 21680 sobre el INCX espontáneo. Las barras de escala horizontales y verticales corresponden respectivamente a 30 s y 100 pA. La FIG. 2D es un resumen del efecto de CGS en los cardiomiocitos de 8 pacientes sin y de 11 pacientes con fibrilación auricular. El test de t de parejas se usó para evaluar el efecto del CGS 21680 y los valores de p se indican sobre las barras. I NCX F significa frecuencia INCX. La FIG. 2E muestra que la adición de 10 M de H-89 abole el efecto estimulador de 200 nM de CGS 21680 en 5 pacientes. ANOVA muestra un efecto significativo del tratamiento en la frecuencia de ondas (p=0.001) y el post-test dió una p=0.03 para CGS versus control, p=0.002 para CGS versus CGS+H-89 y p=0.05 para CGS+89 versus control.

En la FIG. 3A, el antagonista de receptor A2A, SCH 58261 (50 nM) causó una reducción reversible de la frecuencia INCX espontánea en muestras de pacientes con fibrilación auricular. Las barras de escala horizontales y verticales corresponden respectivamente a 30 s y 100 pA. En la FIG. 3B, los antagonistas A2A reducen la frecuencia de ondas de calcio espontáneas (WF) medidas por captación de imágenes de calcio por confocal (panel izquierdo, n=6) o por la técnica de fijación de membrans (patch-clamp en inglés) (panel derecho, n=7). Los efectos de 50 nM de ZM 241385 y de SCH 58261 fueron comparables y se reunieron. La significación estadística empleando un test de t no aparejado en los experimentos de confocal y un test de t de parejas de patch-clamp se muestra sobre las barras.

Expresión y localización del receptor A2A en la aurícula humana derecha

La presencia de receptor A2A en cardiomiocitos de aurícula derecha se investigó por inmmunoblot. Los resultados muestran que el receptor A2A está presente en la aurícula humana y que tanto la forma monomérica como la dimérica se expresan en este tejido, siendo la especie dimérica minoritaria en muestras provenientes de aurícula en ritmo sinusal. La localización del receptor A2A en miocardio auricular se estudió por microscopía confocal en muestras teñidas doblemente con anticuerpos dirigidos contra el receptor A2A, miosina, -actinina, connexina-43 o el receptor de rianodina (RyR). El receptor A2A se expresó de acuerdo a un patrón de bandas transversal al eje de la fibra miocárdica y colocalizó a nivel de la línea Z del sarcómero con la proteína de citoesqueleto -actinina. La distribución del receptor A2A fue cuantitativamente similar en muestras de pacientes con y sin fibrilación auricular.

Regulación al alza de la expresión de receptor A2A en pacientes con fibrilación auricular

Los miocitos auriculares aislados mantenían el patrón bandeado del receptor A2A, la colocalización con -actinina, y la distribución solapada con el RyR que se puso de manifiesto en las muestras de tejido auricular (cfr. FIG. 1A). No se observaron diferencias en los cardiomiocitos de pacientes con y sin fibrilación auricular (datos no mostrados). Los niveles de proteína correspondientes al receptor A2A medidos por inmunoblot fueron marcadamente superiores en pacientes con fibrilación auricular (cfr. FIG. 1B-C) e interesantemente, la especie dimérica de receptor A2A, que es la forma funcional presente en la superficie celular, estaba notablemente elevada en fibrilación auricular (cfr. FIG. 1C). No se observaron diferencias significativas en vasos sanguíneos. Por lo tanto los hallazgos presentes no sólo demuestran por vez primera la existencia de receptor A2A en miocitos auriculares humanos, sino su regulación al alza, principalmente en forma homodimérica, en pacientes con fibrilación auricular.

La estimulación por agonistas de los receptores A2A induce un incremento dependiente de PKA en la liberación espontánea de calcio del retículo sarcoplásmico (SR) en pacientes con fibrilación auricular.

El efecto de los agonistas del receptor A2A en la liberación espontánea de calcio del SR se analizó en miocitos auriculares aislados de pacientes con ritmo sinusal y en pacientes con fibrilación auricular. Fueron analizadas tanto la liberación de calcio local no progagado o destellos de calcio ("calcium sparks") como la liberación de calcio regeneradora del SR (calcium waves). La preincubación con el agonista de receptor A2A, CGS 21680 (200 nM), incrementó el número de ondas (waves) de calcio en pacientes con fibrilación auricular pero no en aquéllos sin la arritmia.

Para determinar si el efecto del CGS 21680 en la liberación espontánea de calcio del SR es secundaria a un efecto en el potencial de membrana, se utilizó la técnica de patch-clamp para mantener el potencial de membrana a -80 mV. Ello no impidió que el CGS 21680 incrementara de forma reversible el número de ondas de liberación espontánea de calcio medidas como corrientes de intercambio Na-Ca (INCX) activadas por ellos (cfr. FIG. 2A y B). De hecho esta aproximación confirmó el efecto estimulador significativo del CGS 21680 en pacientes con fibrilación auricular (cfr. FIG. 2D). Por lo tanto, el incremento en la liberación espontánea de calcio del SR inducido por el CGS 21680 es debido a una regulación dependiente del receptor A2A en la actividad del RyR. El efecto específico del CGS 21680 fue revertido por los dos antagonistas selectivos ZM 241385 (cfr. FIG. 2C) y SCH 58261.

Puesto que el receptor A2A está acoplado a proteínas Gs, su activación mediada por agonistas debe incrementar los niveles de cAMP, que a su vez da lugar a la activación de la PKA y a la fosforilación del RyR. Para investigar si el receptor A2A ejerce su efecto a través de una activación de PKA mediada por cAMP, se empleó el inhibidor selectivo de la PKA, H-89. El efecto estimulador del CGS 21680 en miocitos de pacientes con fibrilación auricular fue contrarestado por H-89 (cfr. FIG. 2E), confirmando que la regulación de la liberación espontánea de calcio del SR dependiente de receptor A2A está de hecho mediada por la activación de la PKA. De manera interesante, el H-89 no sólo abolía el efecto del CGS 21680 sino que también reduce la liberación espontánea de calcio a un nivel significativamente menor que el nivel basal existente antes de la aplicación de CGS 21680. El análisis de las ondas y destellos de calcio mediante microscopía confocal confirmó la dependencia de PKA en la liberación espontánea de calcio mediada por receptor A2A.

El bloqueo de los receptores A2A reduce el nivel basal de liberación espontánea de calcio del SR.

La existencia de un tono basal de cAMP in miocitos auriculares humanos se ha sospechado a partir de estudios de modulación neuro-hormonal de corrientes de calcio de tipo L. La observación de los inventores de que un bloqueante de la PKA, el H-89, reduce la frecuencia de ondas de calcio por debajo del nivel basal sugiere la existencia de un tono basal de cAMP dependiente de receptor A2A. En concordancia con esto, los antagonistas selectivos del receptor A2A, SCH 58261 o ZM 241385, aplicados a células de pacientes con fibrilación auricular que muestran un elevado nivel basal de liberación de calcio, redujeron significativamente la frecuencia de las ondas de calcio medidas por mciroscopía confocal o por la técnica de patch clamp (cfr. FIG. 3).

Muestras humanas

Se utilizaron en este estudio muestras de tejido cardiaco de un total de 54 pacientes sometidos a cirugía cardiaca. Aunque las muestras correspondían a tejido auricular que se desecha durante la cirugía, se pidió permiso a cada paciente para utilizarlas. El estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital de Sant Pau (Barcelona, España).

Diecisiete de los 54 pacientes tuvo una historia de fibrilación auricular mientras que el resto no tenía la arritmia. Veinticinco pacientes no tenían fibrilación auricular pero sí dilatación auricular izquierda (diámetro de la aurícula izquierda > 40 mm). Cuando es pertinente se indica el número de pacientes empleados en series experimentales específicas. Los pacientes tratados con antagonistas de Ca2+ se excluyeron del estudio. Otro tipo de medicación no se consideró que pudiera afectar significativamente los parámetros medidos. En los estudios inmunohistoquímicos se emplearon un total de 8 pacientes con fibrilación auricular (diámetro de aurícula izquierda: 53.8 6.8 mm), y 15 pacientes sin dilatación auricular y sin historia de fibrilación auricular sirvieron de control (diámetro de aurícula izquierda: 36.5 3.4 mm).

Anticuerpos

Los anticuerpos primarios utilizados fueron los siguientes: anticuerpo policlonal VC21-Ab anti-receptor A2A purificado por afinidad; VC21-Ab fue desarrollado contra un péptido que corresponde al segundo bucle extratracelular del receptor A2A; anticuerpo anti-receptor A2A de conejo (Clone PA1-042, Affinity BioReagents, Golden, CO, U.S.A.); anticuerpo de ratón anti-miosina muscular (Clone NOQ7.5.4D, Chemicon International, Temecula, California, U.S.A.); anticuerpo de ratón anti--actinina (Clone EA-53, Sigma Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, U.S.A.); anticuerpo de ratón anti-connexina-43 (Clone 2, Transduction Laboratories, Lexington, KY, U.S.A.); anticuerpo de ratón anti-receptor de rianodina (Clone C3-33, Calbiochem, San Diego, California, U.S.A.). Los anticuerpos secundarios empleados fueron: IgG de cabra anti-ratón conjugado a ALEXAFLUOR 488® (1/1000), IgG de cabra anti-conejo conjugado a TEXAS RED® (1/2000) (Molecular Probes, Eugene, OR, U.S.A.), IgG de cabra anti-conejo conjugado a peroxidasa de rábano (1/60000) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, U.S.A.) e IgG de conejo anti-ratón (1:2000) (Dako, Glostrup, Denmark).

Obtención de miocitos

Los miocitos fueron aislados de muestras de tejido auricular humano mediante el protocolo descrito previamente (cfr. L. Hove-Madsen et al., "Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes", Circulation 2004, vol. 110, pp. 1358-63). Brevemente, las muestras se lavaron, se cortaron en pequeñas piezas en una disolución libre de calcio que contenía 30 mM de monoxima de butanodiona (BDM), y se incubaron a 35 ºC en una disolución libre de Ca2+ que contenía 0.5 mg/ml de colagenasa (Worthington type 2, 318 u/mg) y 0.5 mg/ml de proteinasa (Sigma type XXIV, 11 u/mg solid). Después de 45 min, el tejido se extrajo de la disolución enzimática y las células se disgregaron en una disolución libre de Ca2+ con ayuda de una pipeta Pasteur. El tejido sobrante se digerió (3x15 minutos) en un medio fresco libre de calcio que contenía 0.4 mg/ml de colagenasa. Las disoluciones que contenían las células disgregadas se centrifugaron a 600 rpm durante 1 min, se resuspendieron en medio libre de calcio y entonces el calcio se añadió gradualmente hasta una concentración de 1 mM. Sólo las células elongadas con estriaciones cruzadas claras y sin granulaciones se usaron en los experimentos.

Control positivo: cultivo celular y transfección

Las células HEK-293 se hicieron crecer en un medio de Dulbecco’s modificado por Eagle (DMEM, Sigma Aldrich Chemical Co.). Las células se transfectaron transitoriamente con el DNA que codifica para el receptor A2A humano (cfr. M. Canals et al. "Adenosine A2A-dopamine D2 receptor-receptor heteromerization: qualitative and quantitative assessment by fluorescence and bioluminescence energy transfer", J. Biol. Chem. 2003, vol. 278, pp. 46741-9) mediante precipitación con fosfato de calcio. Las células se colectaron a 24 o 48 h después de la transfección.

Liberación espontánea de calcio del SR.

Las señales de calcio (destellos y ondas de calcio) se detectaron en células cargadas con fluo-3 empleando un microscopio confocal laser (Leica TCS SP2 AOBS, Germany). La solución experimental contenía (en mM): NaCl 136, KCl 4, NaH2PO4 0.33, NaHCO3 4, CaCl2 2, MgCl2 1.6, HEPES 10, Glucosa 5, ácido pirúvico 5, (pH = 7.4). La emisión de fluorescencia se detectó a 500 y 650 nm con excitación a 488 nm atenuada a 1-5 %. Los destellos y las ondas de calcio se midieron en condiciones basales (resting) durante 2 x 10.24 s, a una velocidad de barrido de 1 kHz. Los destellos de calcio se identificaron según el incremento en la cantidad de señal de una sección de 3 través del centro del destello de calcio, sin incremento detectable en la sección de 3 m adyacente. Un incremento en la cantidad de señal en dos o más secciones de 3 m adyacentes se consideró una onda de calcio. La amplitud de cada destello de calcio, y su vida media fueron determinados a partir de una representación exponencial de la fase de declive de la señal transitoria del destello de calcio. La frecuencia de destellos de calcio se determinó para cada una de las células y se normalizó por la longitud de célula barrida.

Fijación de Membranas (Patch-Clamp)

La corriente de entrada transitoria de intercambio Na-Ca asociada a las ondas de calcio se cuantificó en configuración de patch perforada utilizando un software de control del amplificador de patch-clamp (EPC 10, HEKA, Germany). La resistencia de la pipeta fue de 1.5-4 M Los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente y se iniciaron cuando la resistencia del sistema fue estable y hubo decrecido hasta menos de 5 veces la resistencia de la pipeta. La solución intracelular contenía (en mM): NaCl 127, tetraetilamonio (TEA) 5, HEPES 10, NaHCO3 4, NaH2PO4 0.33, glucosa 10, ácido pirúvico 5, CaCl2 2, MgCl2 1.8, (pH = 7.4). La solución de la pipeta contenía (en mM): ácido aspártico 109, CsCl 47, Mg 2ATP 3, MgCl2 1, Na2fosfocreatina 5, Li2GTP 0.42, HEPES 10 and 250 g/ml anfotericina B, (pH = 7.2). El agonista de receptor A2A, CGS 21860, los antagonistas ZM 241385 y SCH 58261, y el inhibidor de PKA, H-89, se disolvieron en DMSO y se mantuvieron en disoluciones stock de 10 mM. El contenido de calcio liberable por cafeína se determinó por exposición transitoria de las células a 10 mM de cafeína. La corriente de intercambio Na-Ca resultante se convirtió a pmoles (10-18 mol) de calcio liberado del SR asumiendo una estequiometría de 3Na+:1Ca2+ para el intercambiador Na-Ca.

Tratamiento de datos y estadística

Los experimentos de determinación de calcio por técnicas electrofisiológicas y de microscopia confocal se llevaron a cabo sin conocimiento de los datos clínicos de los pacientes. Se hizo la media de los destellos de Ca2+ y de las ondas de Ca2+ cuantificados en células de un mismo paciente. Excepto cuando se mantenía lo contrario, los valores medios de cada paciente se usaron para el análisis estadístico y se expresaron como media S.E.M. Se comprobó el test de normalidad para el conjunto de los datos. El test de la t de Student se empleó para saber si las diferencias eran estadísticamente significativas para cada efecto específico. Se empleó el test de ANOVA para comparar múltiples efectos y el post-test de Student-Newman-Keuls se usó para evaluar la significación de los efectos específicos.

Preparación de membranas

Las membranas se obtuvieron por centrifugación después de una disrupción de las células con un homogenizador tipo Polytron (Kinematica, PTA 20TS rotor, nivel 5, tres periodos de 15 s) en una disolución refrigerada en hielo que contenía 0.32 M de sacarosa y 5 mM de Tris-HCl (pH 7.4; tampón A). Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 1000 x g durante 30 min a 4 ºC (3500 rpm en un rotor 75Ti). El sobrenadante se centrifugó a 26000 x g durante 30 min a 4 ºC (20000 rpm en un rotor 75Ti) y el residuo se resuspendió en tampón A, se incubó a 37 ºC durante 30 min y se centrifugó en las mismas condiciones. El residuo se resuspendió en 0.3 M de KCl, se agitó durante la noche a 4 ºC, se centrifugó a 26000 x g durante 30 min a 4 ºC (20000 rpm en un rotor 75Ti) y se lavó una vez con el tampón tal como se describe arriba. El residuo final (preparación de membranas) se resuspendió en 50 mM de Tris-HCl y se congeló a -80 ºC. La suspensión de membranas de células HEK transfectadas se obtuvieron como se ha descrito previamente (cfr. C. Herrera, et al., "Adenosine A2B receptors behave as an alternative anchoring protein for cell surface adenosine deaminase in lymphocytes and cultured cells", Mol. Pharmacol. 2001, vol. 59, pp. 127-34). La proteína se cuantificó por el método del ácido bicinconínico (Pierce Chemical Co.)

Electroforesis en gel e inmunoblot

Las membranas de células humanas o de células HEK transfectadas transitoriamente se trataron con tampón de SDS-PAGE (8 M urea, 2% SDS, 100 mM DTT, 375 mM Tris, pH 6.8), se calentaron a 37 ºC durante 2 h y las proteínas se resolvieron por electroforesis en gel de polyacrylamide (10%). Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF mediante un sistema de transferencia semi-seco y el inmunoblot se llevó a cabo con el anticuerpo indicado en cada caso y subsecuentemente con IgG de cabra anti-conejo conjugada a peroxidasa de rábano (1/60,000). Las bandas inmunoreactivas se desarrollaron usando un kit de detección por quimioluminiscencia (SuperSignal, West Pico Chemiluminiscent substrate, Pierce).

Tinción inmunológica

Para la inmunohistoquímica, el tejido humano se embebió en OCT y se congeló en isopentano enfriado en nitrógeno líquido. Secciones de ocho micrómetros se cortaron en un criostato enfriado a -18 ºC. Las secciones se recogieron sobre láminas SUPERFROST PLUS® (BDH Chemicals Ltd., Poole, United Kingdom), se secaron al aire y se guardaron a -70 ºC. Para la inmunofluorescencia, las secciones se bloquearon 30 min en un medio de 10% de suero de mulo en tampón Tris-salino (TBS) (150 mM NaCl/50 mM Tris-HCl, pH 7.5). Las muestras se incubaron con anticuerpo anti-receptor A2A purificado por afinidad (VC21, 25 g/ml) y con anticuerpos anti--actinina (1:500 dilución), anti-miosina (2 g/ml), anti-connexina-43 (2.5 g/ml) y anti-receptor de rianodina (6.5 g/ml) durante una hora a temperatura ambiente y después lavadas tres veces durante 10 min en TBS. Las IgG de cabra anti-ratón conjugadas con ALEXA FLUOR 488® y las IgG de cabra anti-conejo conjugadas a TEXAS RED® se aplicaron en disolución de bloqueo a una dilución de 1:2000. Las secciones se lavaron y se montaron en medio de inmunofluorescencia VECTASHIELD® (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, U.S.A.). Para la inmunocitoquímica, miocitos humanos recién aislados se plaquearon en cubres de 24 mm recubiertos con poly-Dlysina. Tras la adhesión de las células los miocitos se lavaron con tampón fosfato-salino (PBS) y se fijaron con un 2% de paraformaldehido en PBS durante 20 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron con PBS y se incubaron con 0.1 M de glicina 5 min para bloquear los grupos aldehido. Después de lavar con PBS, los miocitos se permeabilizaron con 0.2% de Triton-X-100 en PBS 15 min. Las células fueron después lavadas con PBS, bloqueadas 30 min con suero de caballo al 10% a temperatura ambiente y se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios: policlonal anti-receptor A2A de conejo (10 g/ml), anti--actinina (1:500 dilución), anti-miosina

(1:500 dilución) y anti-connexina-43 (1:150 dilución) durante una hora a temperatura ambiente. Se lavaron tres veces con PBS y se tiñeron con anticuerpo anti-ratón conjugado a ALEXA FLUOR 488® y/o anticuerpo anti-conejo conjugado a TEXAS RED®. Finalmente las células se lavaron de nuevo tres vesces y se montaron en medio VECTASHIELD®. Las observaciones de microscopía confocal se llevaron a cabo con el equipo Leica TCS 4D (Leica Lasertechnik GmbH, Heidelberg, Germany).

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A para uso en la prevención y/o el tratamiento de la fibrilación auricular en un mamífero, incluyendo un humano.
2.

El antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A para el uso según la reivindicación 1, en el que dicho

5 antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A es un derivado de xantina o una sal farmacéuticamente aceptable de éste.
3. El antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A para el uso según la reivindicación 2, en el que dicho antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A es un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en aquéllos con las siguientes fórmulas:

O O

CH3 H3C

CH3

N

NN

N CH3

N

O

N

O N O N

CH3

OCH3

CH3

(2)

(1)

O O CH3 CH3

NN

N CH3

NH3C

-K+

SO3

O NN

O N

O N

CH3

CH3 OCH3

(3) (4)

O O

CH3

CH3 N

NN

N

N

N

O N

O N CH3 Br

OCH3

OH

C

(5) (6)

O

O CH3

H3C

N ON

H3C

N

O

NH2

N

N

N

O N H

H

NO N

CH3 Cl

CH3

(7) (8)
4. El antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A para el uso según la reivindicación 3, en el que dicho

antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A es el compuesto de fórmula (3) también conocido como KW 5 6002.
5.

El antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A para el uso según la reivindicación 3, en el que dicho antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A es el compuesto de fórmula (6) también conocido como MSX-2.
6.

El antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A para el uso según la reivindicación 2, en el que el dicho

antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A es el éster de ácido fosfórico del compuesto de fórmula (6) 10 como se define en la reivindicación 3.
7.

El antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A para el uso según la reivindicación 1, en el que dicho antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A es un derivado de pirazolopirimidina.
8.

El antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A para el uso según la reivindicación 1, en el que dicho antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A es un derivado de triazoloquinoxalina.

15 9. El antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A para el uso según la reivindicación 1, en el que dicho antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A es un derivado de triazolotriazina.
10. El antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A para el uso según la reivindicación 1, en el que dicho antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A es un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en aquéllos con las siguientes fórmulas:

NH2 NH2

N

NN N N

Br N O

N

N

N CH3

(9) (10) NH2

NH2

N

N

25 N N

NN

ON O

NN N

H NHO N

(11) (12)

NH2

N

N

N

N O

N N

F

(14)

CF3

N CF3

NS

S

H

N

HO

R

N

HN

(15) (16)

NH2 N

NH2

NN N O

N N H2N

F

(17) (18)

O NH2

N

NNN

H N

NN

H2N N O

N

CF3 F (19) Cl (20)

NH2 NH2

N

NON N

N N N N

N N N

N O F

N

F

NO

Compound 21

F

F

(21) (22) NH2

N

N N N O

N

N

N

Cl 10 (23)
11. El antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A para el uso según la reivindicación 10, en el que dicho antagonista selectivo del receptor de adenosina A2A es el compuesto de fórmula (15) también conocido como VER6623.

α-actinina

Fijación de Membrana (Patch-Clamp)