ES2389989T3

ES2389989T3 - Producción de ácido dicarboxílico en levadura recombinante

Info

Publication number: ES2389989T3
Application number: ES08851806T
Authority: ES
Inventors: René VERWAAL; Liang Wu; Robbertus Antonius Damveld; Cornelis Maria Jacobus Sagt
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2007-11-20
Filing date: 2008-11-14
Publication date: 2012-11-05
Anticipated expiration: 2028-11-14
Also published as: EP2220234B1; BRPI0819717A2; US20140065680A1; CN101896606A; EP2220234A1; US20110143405A1; CN101896606B; US9556459B2; BRPI0819717B1; WO2009065779A1; US8735112B2

Abstract

Una levadura recombinante que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una enzima heteróloga que cataliza la conversión de ácido málico a ácido fumárico, en la que la enzima tiene una identidad de al menos el 70% con SEQ ID NO: 3, en la que la enzima es activa en el citosol con la expresión de la secuencia nucleotídica.

Description

Producción de ácido dicarboxílico en levadura recombinante

La presente invención se refiere a una levadura recombinante que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico, y a un procedimiento para la producción de un ácido dicarboxílico.

Los ácidos dicarboxílicos, tales como ácido fumárico y ácido succínico, son precursores potenciales para numerosos productos químicos. Por ejemplo, el ácido succínico se puede convertir en 1,4-butanodiol (BDO), tetrahidrofurano y gamma-butirolactona. Otro producto derivado de ácido succínico es un polímero de poliéster que se prepara enlazando ácido succínico y BDO.

El ácido succínico se produce predominantemente a través de procedimientos petroquímicos mediante hidrogenación de butano. Se considera que estos procedimientos son perjudiciales para el medio ambiente, y costosos. La producción fermentativa de ácido succínico puede ser un procedimiento alternativo atractivo para la producción de ácido succínico, en el que se puede usar un material de alimentación renovable como fuente de carbono.

Se sabe que cierto número de diferentes bacterias, tales como Escherichia coli y las bacterias de la panza Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Bacteroides, Mannheimia o Succinimonas sp., producen ácido succínico. La ingeniería metabólica de estas cepas bacterianas ha mejorado el rendimiento y/o productividad de ácido succínico,

o ha reducido la formación de subproductos.

El documento WO 2007/061590 describe una levadura negativa para piruvato descarboxilasa para la producción de ácido málico y/o ácido succínico, que se transforma con una enzima piruvato carboxilasa o una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una enzima malato deshidrogenasa y una proteína transportadora de ácido málico (MAE).

Pines et al., 1999 Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, p. 393.399, describen que la sobreexpresión de la fumarasa citosólica de S. cerevisiae en levadura no da como resultado acumulación de ácido fumárico, pero parece que potencia la producción de ácido L-málico.

A pesar de las mejoras que se han realizado en la producción fermentativa de ácido succínico, sigue existiendo una necesidad de microorganismos mejorados para la producción fermentativa de ácido succínico.

El objetivo de la presente invención es una levadura alternativa para la producción de un ácido dicarboxílico, tal como ácido fumárico y ácido succínico.

El objetivo se consigue de acuerdo con la invención con una levadura recombinante que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una enzima heteróloga que cataliza la conversión ácido málico a ácido fumárico. Sorprendentemente, se encontró que se produjo una mayor cantidad de ácido dicarboxílico, tal como ácido fumárico y/o ácido succínico, mediante la levadura recombinante según la presente invención, en comparación con una levadura de tipo salvaje.

Como se usa aquí, una levadura recombinante según la presente invención se define como una célula que contiene, o se transforma o se modifica genéticamente con una secuencia nucleotídica y/o proteína que no aparece de forma natural en la levadura, o contiene una copia o copias adicionales de una secuencia de ácido nucleico (o proteína) endógena. Una levadura de tipo salvaje se define aquí como la levadura progenitora de la levadura recombinante.

Preferiblemente, la enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico es activa en el citosol tras la expresión de la secuencia nucleotídica que codifica la enzima.

Una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico, preferiblemente tiene actividad de fumarasa, preferiblemente la enzima es una fumarasa de E.C. 4.2.1.2.

Una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico puede derivar de cualquier origen adecuado, por ejemplo bacterias, levaduras, hongos, protozoos o plantas. Preferiblemente, la enzima según la presente invención deriva de Rhizopus oryzae.

Se demostró que la expresión de un gen fumR heterólogo de Rhizopus oryzae en Aspergillus niger no dio como resultado la producción de ácido succínico en condiciones limitadas de oxígeno (tesis doctoral, 2006 W.A. de Jongh, Biocentrum Technical University of Denmark). Sorprendentemente, una levadura que expresa fumarasa heteróloga según la presente invención produjo una mayor cantidad de ácido succínico en condiciones limitadas de oxígeno en comparación con la levadura de tipo salvaje.

El término “homóloga”, cuando se usa para indicar la relación entre una molécula de ácido nucleico o polipéptido (recombinante) dada y un organismo hospedante o célula hospedante dado, se entiende que significa que en la naturaleza la molécula de ácido nucleico o polipéptido se produce por parte de una célula hospedante o de organismos de la misma especie, preferiblemente de la misma variedad o cepa.

El término “heterólogo”, cuando se usa con respecto a un ácido nucleico (ADN o ARN) o proteína, se refiere a un ácido nucleico o proteína que no se produce de forma natural como parte del organismo, célula, genoma o secuencia de ADN o ARN en la que está presente, o que se encuentra en una célula o lugar o lugares en el genoma o la secuencia de ADN o ARN que difieren de aquellos en los que se encuentra en la naturaleza. Los ácidos nucleicos o proteínas heterólogos no son endógenos a la célula en la que se introducen, pero han sido obtenidos a partir de otra célula o han sido producidos por vía sintética o recombinante.

Preferiblemente, la levadura según la presente invención es una levadura que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico, en la que la enzima tiene al menos 70%, 75%, preferiblemente al menos 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1, o SEC ID NO:3, preferiblemente con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3, preferiblemente la enzima comprende secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3.

La identidad de secuencia se define aquí como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (poliipéptidos o proteínas) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótidos), según se determina comparando las secuencias. Habitualmente, las secuencias se comparan a lo largo de toda la longitud de las secuencias comparadas. En la técnica, “identidad” significa también el grado de relación de la secuencia entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, según sea el caso, según se determina por mediante el emparejamiento entre hebras de dichas secuencias.

Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar el mayor emparejamiento entre las secuencias sometidas a ensayo. Los métodos para determinar la identidad son codificados en programas de ordenador públicamente disponibles. Los métodos de programas de ordenador preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen BLASTP y BLASTN, públicamente disponibles de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de aminoácidos usando BLASTP son abertura de salto 11,0, extensión de salto 1, matriz Blosum 62. Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de ácidos nucleicos usando BLASTP son abertura de salto 11,0, extensión de salto 1, matriz completa de ADN (matriz de identidad de ADN).

Una secuencia nucleotídica que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico en el citosol según la invención también se puede definir por su capacidad para hibridarse con secuencias nucleotídicas que codifican las enzimas de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en condiciones de hibridación moderadas, o preferiblemente en condiciones de hibridación rigurosas. Condiciones de hibridación rigurosas se definen aquí como condiciones que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos alrededor de 25, preferiblemente alrededor de 50 nucleótidos, 75 ó 100 y, lo más preferible, de alrededor de 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de alrededor de 65ºC en una disolución que comprende una sal alrededor de 1 M, preferiblemente 6 x SSC (cloruro de sodio, citrato de sodio) o cualquier otra disolución que tenga una fuerza iónica comparable, y el lavado a 65ºC en una disolución que comprende una sal alrededor de 0,1 M, o menor, preferiblemente 0,2 x SSC, o cualquier otra disolución que tenga una fuerza iónica comparable. Preferiblemente, la hibridación se lleva a cabo durante la noche, es decir, al menos durante 10 horas, y preferiblemente el lavado se lleva a cabo durante al menos una hora con al menos dos cambios de la disolución de lavado. Habitualmente, estas condiciones permitirán la hibridación específica de secuencias con una identidad de secuencia de alrededor de 90%

o más.

Las condiciones moderadas se definen aquí como condiciones que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos 50 nucleótidos, preferiblemente de alrededor de 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de alrededor de 45ºC en una disolución que comprende una sal alrededor de 1 M, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra disolución que tenga una fuerza iónica comparable, y el lavado a temperatura ambiente en una disolución que comprende una sal alrededor de 1 M, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra disolución que tenga una fuerza iónica comparable. Preferiblemente, la hibridación se lleva a cabo durante la noche, es decir, al menos durante 10 horas, y preferiblemente el lavado se lleva a cabo durante al menos una hora con al menos dos cambios de la disolución de lavado. Habitualmente, estas condiciones permitirán la hibridación específica de secuencias con una identidad de secuencia de hasta 50%. La persona experta en la técnica será capaz de modificar estas condiciones de hibridación con el fin de identificar específicamente secuencias que varíen en la identidad entre 50% y 90%.

El término “gen”, tal como se utiliza aquí, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que contiene un molde para una ácido nucleico polimerasa, en eucariotas, ARN polimerasa II. Los genes se transcriben en los ARNm, que luego se traducen en proteínas.

La expresión “ácido nucleico”, tal como se utiliza aquí, incluye la referencia a un polímero desoxirribonucleotídico o ribonucleotídico, es decir, un polinucleótido, en una forma monocatenaria o bicatenaria, y a menos que se limite de otro modo, comprende análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de nucleótidos naturales, por cuanto se hibridan a ácidos nucleicos monocatenarios de una manera similar a nucleótidos que se producen en la naturaleza (p. ej. ácidos nucleicos peptídicos). Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen estructural o regulador nativo o heterólogo. A menos que se indique de otro modo, el término incluye la referencia a la secuencia específica, así como a la secuencia complementaria de la misma.

Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan de forma indistinta aquí para aludir a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente que se produce en la naturaleza, así como a polímeros de aminoácidos que se producen en la naturaleza. La naturaleza esencial de tales análogos de aminoácidos que se producen en la naturaleza es que, cuando se incorporan en una proteína, esa proteína es específicamente reactiva a anticuerpos inducidos contra la misma proteína, pero que consisten enteramente en aminoácidos que se producen en la naturaleza. Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteínas” incluyen también modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, la glucosilación, fijación de lípidos, sulfatación, gammacarboxilación de restos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación.

El término “enzima”, tal como se utiliza aquí, se define como una proteína que cataliza una reacción (bio)química en una célula, tal como una célula de levadura.

Para aumentar la probabilidad de que la enzima introducida sea expresada en forma activa en una levadura de la invención, se puede adaptar la secuencia nucleotídica codificante correspondiente para optimizar su uso de codones con el de la célula de levadura elegida. En la técnica se conocen varios métodos para la optimización de codones. Un método preferido para optimizar el uso de codones de las secuencias nucleotídicas al de la levadura es la tecnología de la optimización del par de codones como se describe en el documento WO 2008/000632. La optimización del par de codones es un método para producir un polipéptido en una célula hospedante, en el que las secuencias nucleotídicas que codifican el polipéptido han sido modificadas con respecto a su uso de codones, en particular los pares de codones que se usan, para obtener una expresión mejorada de la secuencia nucleotídicas que codifica el polipéptido y/o la producción mejorada del polipéptido. Pares de codones se definen como un conjunto de dos tripletes (codones) subsiguientes en una secuencia codificante.

Habitualmente, la secuencia nucleotídica que codifica una enzima, por ejemplo la enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico, está operablemente enlazada a un promotor que provoca una expresión suficiente de la secuencia nucleotídica correspondiente en la levadura de acuerdo con la presente invención, para conferir a la levadura la capacidad de producir ácido fumárico y/o ácido succínico.

Tal como se usa aquí, la expresión “operablemente enlazada” se refiere a un enlace de elementos polinucleotídicos (o secuencias codificantes o secuencias de ácidos nucleicos) en una relación funcional. Una secuencia de ácido nucleico está “operablemente enlazada” cuando está situada en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operablemente enlazado a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante.

Tal como se utiliza aquí, el término “promotor” se refiere a un fragmento de ácido nucleico que actúa para controlar la transcripción de uno o más genes, situados en dirección 5’ con respecto a la dirección de la transcripción del sitio de inicio de la transcripción del gen, y está estructuralmente identificado por la presencia de un sitio de unión para ARN polimerasa dependiente de ADN, sitios de iniciación de la transcripción y cualesquiera otras secuencias de ADN conocidas por un experto en la técnica. Un promotor “constitutivo” es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones medioambientales y de desarrollo. Un promotor “inducible” es un promotor que es activo en la regulación medioambiental o de desarrollo.

Un promotor que podría usarse para conseguir la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica una enzima, tal como una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico, puede no ser nativo a la secuencia nucleotídica que codifica la enzima a expresar, es decir, un promotor que es heterólogo a la secuencia nucleotídica (secuencia codificante) a la que está operablemente enlazado. Preferiblemente, el promotor es homólogo, es decir, endógeno a la célula hospedante.

Los promotores adecuados en este contexto incluyen promotores naturales tanto constitutivos como inducibles, así como promotores manipulados mediante ingeniería, que son conocidos por la persona experta en la técnica. Los promotores adecuados en células eucariotas pueden ser GAL7, GAL10 o GAL 1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI y AOX1. Otros promotores adecuados incluyen PDC, GPD1, PGK1, TEF1 y TDH.

Habitualmente, una secuencia nucleotídica que codifica una enzima comprende un terminador. En la presente invención se puede usar cualquier terminador que sea funcional en la célula eucariota. Los terminadores preferidos se obtienen a partir de genes naturales de la célula hospedante. Las secuencias de terminadores adecuadas son bien conocidas en la técnica. Preferiblemente, tales terminadores se combinan con mutaciones que evitan el deterioro del ARNm mediado sin sentido en la célula hospedante de la invención (véase, por ejemplo: Shirley et al., 2002, Genetics 161: 1465-1482).

En una realización preferida, la secuencia nucleotídica que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico, tal como fumarasa, se sobreexpresa para lograr una producción incrementada de ácido fumárico y/o ácido succínico por parte de una levadura recombinante según la presente invención.

Existen diversos medios en la técnica para la sobreexpresión de secuencias nucleotídicas que codifican enzimas en la célula de levadura de la invención. En particular, una secuencia nucleotídica que codifica una enzima se puede sobreexpresar aumentando el número de copias del gen que codifica la enzima en la célula, p. ej. integrando copias adicionales del gen en el genoma de la célula, expresando el gen a partir de un vector centromérico, a partir de un vector de expresión de múltiples copias episómico, o introduciendo un vector de expresión (episómico) que comprende múltiples copias del gen. Preferiblemente, la sobreexpresión de la enzima de acuerdo con la invención se consigue con un promotor constitutivo (fuerte).

El constructo de ácido nucleico puede ser un plásmido, por ejemplo un plásmido de bajo número de copias o un plásmido de alto número de copias. La levadura de acuerdo con la presente invención puede comprender una sola copia, pero preferiblemente comprende múltiples copias de la secuencia nucleotídica que codifica una fumarasa, por ejemplo mediante múltiples copias de un constructo nucleotídico.

El constructo de ácido nucleico se puede mantener episómicamente y, de este modo, comprende una secuencia para la replicación autónoma, tal como una secuencia de replicación autosómica. Un constructo de ácido nucleico episódico adecuado puede basarse, por ejemplo, en los plásmidos 2 o pKD1 de levadura (Gleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975), o en los plásmidos AMA (Fierro et al., 1995, Curr Genet. 29: 482-489). Alternativamente, cada constructo de ácido nucleico puede integrarse en una o más copias en el genoma de la célula de levadura. La integración en el genoma de la célula puede producirse aleatoriamente mediante recombinación no homóloga, pero preferiblemente el constructo de ácido nucleico se puede integrar en el genoma de la célula mediante recombinación homóloga, tal como se conoce bien en la técnica (véanse los documentos WO90/14423, EP-A0481008, EP-A-0635574 y US 6.265.186).

En una realización preferida, una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico es activa en el citosol con la expresión de la secuencia nucleotídica codificante. La actividad citosólica de la enzima se prefiere para una productividad elevada de ácido fumárico y/o ácido succínico por parte de la célula eucariótica.

Una secuencia nucleotídica que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido succínico puede comprender una señal seleccionadora de dianas peroxisómica o mitocondrial, por ejemplo como se determina por el método descrito por Schlüter et al, Nucleic Acid Research 2007, Vol 25, D815-D822. En el caso de que la enzima comprenda una señal seleccionadora de dianas, puede ser preferido que la levadura según la invención comprenda una forma truncada de la enzima, en la que se elimine la señal seleccionadora de dianas.

La levadura de acuerdo con la presente invención pertenece preferiblemente a uno de los géneros Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, o Zygosaccharomyces. Más preferiblemente, la célula eucariótica es Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus, Pichia stipidis, Kluyveromyces marxianus, K. lactis,

K. thermotolerans, o Zygosaccharomyces bailii.

Preferiblemente, la levadura es una Saccharomyces cerevisiae, preferiblemente una Saccharomyces cerevisiae que comprende SEQ ID NO: 4.

Además de una secuencia nucleotídica que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico de acuerdo con la presente invención, la levadura recombinante de acuerdo con la presente invención puede comprender otras modificaciones genéticas, por ejemplo mutaciones, supresiones o interrupciones, en secuencias nucleotídicas homólogas, y/o transformación con secuencias nucleotídicas que codifican enzimas homólogas y/o heterólogas que catalizan una reacción en la célula, dando como resultado un flujo incrementado hacia ácido fumárico y/o ácido succínico. Por ejemplo, puede ser favorable introducir, modificar genéticamente y/o sobreexpresar secuencias nucleotídicas heterólogas y/u homólogas que codifican i) una enzima que cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato o piruvato en oxaloacetato; ii) una malato deshidrogenasa que cataliza la conversión de oxaloacetato en ácido málico; iii) una fumarasa reductasa, que cataliza la conversión de ácido fumárico en ácido succínico. Preferiblemente, las enzimas en i), ii) y iii) se expresan en el citosol. La expresión citosólica se puede lograr mediante supresión o modificación de una señal seleccionadora de dianas mitocondrial o peroxisómica, como se ha descrito aquí antes. Otras técnicas de ADN molecular como se describen aquí anteriormente, tales como la sobreexpresión y la optimización de codones, también son aplicables a estas secuencias nucleotídicas.

La levadura se puede transformar o modificar genéticamente con cualquier secuencia nucleotídica adecuada que cataliza la reacción de una molécula de C3 a C4 carbonos, tal como fosfoenolpiruvato (PEP, C3) a oxaloacetato (OAA, C4) y piruvato (C3) a OAA o ácido málico. Las enzimas adecuadas son PEP carboxicinasa (EC 4.1.1.49, EC 4.1.1.38) y PEP carboxilada (EC 4.1.1.31), que catalizan la conversión de PEP a OAA; piruvato carboxilasa (EC 6.4.1.1), que cataliza la reacción de piruvato a OAA; o enzima málica (EC 1.1.1.38), que cataliza la reacción de piruvato a ácido málico.

Preferiblemente, la actividad de fumarasa endógena en la levadura según la presente invención se reduce, por ejemplo, mediante supresión, interrupción o mutación del gen que codifica la fumarasa endógena de la levadura.

En otra realización preferida, la célula según la presente invención comprende además una malato deshidrogenasa (MDH) homóloga o heteróloga. Preferiblemente, la actividad de malato deshidrogenasa está incrementada por la sobreexpresión mediante métodos conocidos en la técnica como se describe aquí. Preferiblemente, la MDH es expresada en el citosol, por ejemplo como se describe en el documento WO 2007/061590.

Preferiblemente, la levadura según la presente invención es una levadura en la que al menos un gen que codifica alcohol deshidrogenasa no es funcional. Una alcohol deshidrogenasa que no es funcional se usa aquí para describir una levadura, en la que un gen que codifica alcohol deshidrogenasa está inactivado por mutación, interrupción, o supresión, por ejemplo mediante el método descrito por Gueldener et al., 2002, Nucleic Acids Research, Vol. 30, nº 6, e23. Preferiblemente, la levadura es una Saccharomyces cerevisiae, en la que uno o más genes adh1 y/o adh2, que codifican alcohol deshidrogenasa, están inactivados.

Preferiblemente, la levadura según la presente invención comprende además al menos un gen que codifica glicerol3-fosfato deshidrogenasa, que no es funcional. Una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa que no es funcional se usa aquí para describir una célula de levadura, en la que un gen que codifica glicerol-3-fosfato deshidrogenasa es inactivado por mutación, interrupción, o supresión, dando como resultado una formación reducida de glicerol en comparación con la levadura de tipo salvaje.

En una realización preferida, la levadura de acuerdo con la presente invención puede ser capaz de crecer en cualquier fuente de carbono adecuada conocida en la técnica y convertirse en un ácido dicarboxílico, tal como ácido fumárico y/o ácido succínico. La levadura puede ser capaz de convertir directamente biomasa vegetal, celulosas, hemicelulosas, pectinas, ramnosa, galactosa, fucosa, maltosa, maltodextrinas, ribosa, ribulosa, o almidón, derivados de almidón, sacarosa, lactosa y glicerol. Así, una célula de levadura preferida expresa enzimas tales como celulasas (endocelulasas y exocelulasas) y hemicelulasas (p. ej. endo- y exo-xilanasas, arabinasas) necesarias para la conversión de celulosa en monómeros de glucosa, y hemicelulosa en monómeros de xilosa y arabinosa, pectinasas capaces de convertir pectinas en ácido glucurónico y ácido galacturónico, o amilasas para convertir el almidón en monómeros de glucosa. La capacidad de una levadura para expresar tales enzimas puede estar presente de forma natural, o se puede haber obtenido mediante modificación genética de la levadura. Preferiblemente, la levadura es capaz de convertir una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, lactosa, rafinosa y glicerol.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un ácido dicarboxílico, seleccionado de ácido fumárico y ácido succínico, que comprende fermentar la levadura de acuerdo con la presente invención en presencia de un medio de fermentación adecuado. Los medios de fermentación adecuados son conocidos por el experto en la técnica. Preferiblemente, el ácido carboxílico producido en el procedimiento según la presente invención es ácido succínico.

Se encontró ventajoso utilizar una levadura según la invención en el procedimiento para la producción de un ácido dicarboxílico, seleccionado de ácido fumárico y ácido succínico, ya que se produjo una mayor cantidad de ácido succínico y/o ácido fumárico en comparación con una levadura de tipo salvaje. Preferiblemente, una levadura según la presente invención produce al menos 1,1, preferiblemente al menos 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 o al menos 2 veces más ácido succínico y/o ácido fumárico en comparación con una levadura de tipo salvaje.

El procedimiento de acuerdo con la presente invención puede llevarse a cabo en condiciones aerobias y anaerobias. Preferiblemente, el procedimiento se lleva a cabo en condiciones anaerobias o en condiciones microaerófilas o limitadas en oxígeno. Un procedimiento de fermentación anaerobio se define aquí como un procedimiento de fermentación realizado en ausencia de oxígeno, o en el que no se consume esencialmente oxígeno, preferiblemente menos de 5, 2,5 ó 1 mmol/L/h, y en el que las moléculas orgánicas sirven tanto como donantes de electrones como aceptores de electrones.

Un procedimiento de fermentación limitado en oxígeno es un procedimiento en el que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno desde el gas al líquido. El grado de limitación en oxígeno se determina por la cantidad y composición del flujo de gas entrante, así como por las propiedades de mezcladura/transferencia de masa reales del equipo de fermentación usado. Preferiblemente, en un procedimiento en condiciones limitadas en oxígeno, la tasa de consumo de oxígeno es al menos o alrededor de 5,5, lo más preferiblemente al menos o alrededor de 6, e incluso más preferiblemente al menos o alrededor de 7 mmol/l/h.

El procedimiento para la producción de un ácido dicarboxílico de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo a cualquier pH adecuado entre 1 y 9. Preferiblemente, el pH en el caldo de fermentación oscila entre 2 y 7, preferiblemente entre 3 y 5. Se encontró ventajoso poder llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con la presente invención a un pH bajo, ya que esto evita la contaminación bacteriana. Además, puesto que el pH cae durante la producción de ácido fumárico y/o ácido succínico, se necesita una menor cantidad de valorante para mantener el pH en un nivel deseado.

Una temperatura adecuada a la que se puede llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con la presente invención oscila entre 5 y 60ºC, preferiblemente entre 10 y 50ºC, más preferiblemente entre 15 y 35ºC, lo más preferiblemente entre 18ºC y 30ºC. El experto en la técnica conoce qué temperaturas óptimas son las adecuadas para fermentar una célula de levadura específica.

Preferiblemente, el ácido dicarboxílico, tal como ácido fumárico y ácido sunccínico, se recupera del caldo de fermentación por un método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo mediante cristalización o precipitación con amonio.

Preferiblemente, el ácido dicarboxílico que se prepara en el procedimiento de acuerdo con la presente invención se convierte ulteriormente en un producto deseable, tal como un producto farmacéutico, cosmético, alimentario, para piensos o químico. En el caso de que se produzca ácido succínico, puede convertirse adicionalmente en un polímero, tal como poli(succinato de butileno) (PBS) u otros polímeros adecuados derivados del mismo.

Modificaciones genéticas

Técnicas genéticas convencionales tales como la sobreexpresión de enzimas en células hospedantes, la modificación genética de células hospedantes o técnicas de hibridación son métodos conocidos en la técnica, tal como se describen en Sambrook y Russel (2001) “Molecular Cloning; A Laboratory Manual (3ª edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, o F. Ausubel et al., eds., “Current protocols in molecular biology”, Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987). Los métodos para la transformación, la modificación genética, etc., de células hospedantes fúngicas se conocen, p. ej., de los documentos EP-A-0 635 574, WO 98/46772, WO 99/60102 y WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 y US 6.265.186.

Descripción de las figuras

Figura 1: Mapa del plásmido de pGBS415SUS-01, que codifica fumarasa procedente de Rhizopus oryzae para la expresión en Saccharomyces cerivisiae. CPO designa el par de codones optimizado.

Figura 2: Mapa del plásmido de pGBS416FUM-1, que codifica fumarasa procedente de Rhizopus oryzae para la expresión en Sacharomyces cerevisiae. CPO indica par de codones optimizado.

Los ejemplos siguientes son sólo para fines ilustrativos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Clonación de fumarasa procedente de Rhizopus oryzae en Sacharomyces cerevisiae usando como vehículo de clonación E. coli DH10B 1.1. Constructos de expresión

La fumarasa [E.C. 4.2.1.2], número de acceso de GenBank 469103, procedente de Rhizopus oryzae se analizó para determinar la presencia de secuencias señal usando SignalP 3.0 (http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) Bendtsen,

J. et al. (2004) Mol. Biol. 340:783-795 y TargetP 1.1 (http:/www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) Emanuelsson, O. et al. (2007) Nature Protocols 2, 953-971.

Se identificó una secuencia selecionadora de dianas mitocondrial putativa en los primeros 23 aminoácidos de la proteína. Para evitar una selección potencial de mitocondrias como dianas en S. cerevisiae, se eliminaron los primeros 23 aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 2 corresponde a la secuencia nucleotídica), y se reintrodujo un aminoácido metionina, lo que dio como resultado SEQ ID NO: 3. La SEQ ID NO: 3 se sometió al método del par de codones como se describe en el documento PCT/EP2007/05594 para S. cerevisiae. La secuencia resultante SEQ ID NO: 4 se puso detrás de la secuencia del promotor TDH1 constitutivo SEQ ID NO: 5 y delante de la secuencia del terminador TDH1 SEQ ID NO: 6, y se añadieron sitios de restricción convenientes. El codón de terminación en SEQ ID NO: 4 se modificó en TAAG. La secuencia resultante se sintetizó en Sloning (Puchheim, Alemania). El constructo de expresión pGBS415SUS-01 se creó después de una restricción con BamHI/NotI del vector de expresión pRS415 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. y Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):1927) y ligando subsiguientemente en este vector un fragmento de restricción BamHI/NotI que consistía en el constructo del gen sintético de fumarasa (origen Rhizopus oryzae) (Figura 1). La mezcla de ligamiento se usa para la transformación de DH10B de E. coli (Invitrogen), dando como resultado el constructo de expresión pGBS415SUS-01 de levaduras (Figura 1).

El constructo pGBS415SUS-01 se transforma en las cepas CEN.PK113-6B de S. cerevisiae (MATA ura3-52 leu2112 trp1-289), RWB066 (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::Kanlox) y RWB064 (MATA ura3-52 leu2112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox). Las mezclas de transformación se extienden en placas sobre levadura con base de nitrógeno (YNB) sin AA (Difco) + glucosa al 2% suplementado con aminoácidos apropiados. Los transformantes se inoculan en medio de Verduyn que comprende glucosa, suplementado con aminoácidos apropiados (Verduyn et al., 1992, Yeast. Jul; 8(7):501-17) y se hacen crecer en matraces oscilantes en condiciones aerobias, anaerobias y limitadas en oxígeno. El medio para el cultivo anaerobio se suplementa con 0,01 g/l de ergosterol y 0,42 g/l de Tween 80 disuelto en etanol (Andreasen y Stier, 1953, J. Cell. Physiol. 41, 23-36; Andreasen y Stier, 1954, J. Cell. Physiol, 43: 271-281). Todos los cultivos de levadura se hacen crecer a 30ºC en una incubadora oscilante a 250-280 rpm. A diferentes tiempos de incubación, se retiran partes alícuotas de los cultivos, se centrifugan, y el medio se analiza mediante HPLC para determinar la formación de ácido oxálico, ácido málico, ácido fumárico y ácido succínico como se describe más abajo.

1.2 Análisis por HPLC

La HPLC se realiza para la determinación de ácidos orgánicos y azúcares en diferentes tipos de muestras. El principio de la separación en una columna de monosacáridos de Phenomenex Rezex-RHM se basa en la exclusión por el tamaño, exclusión de iones e intercambio de iones usando mecanismos de fase inversa. La detección tiene lugar mediante el índice de refracción diferencial y detectores ultravioleta.

Ejemplo 2

Clonación de fumarasa procedente de Rhizopus oryzae en Sacharomyces cerevisiae

2.1. Constructos de expresión

Fumarasa procedente de Rhizopus oryzae (SEQ ID NO: 4) se ligó en el vector de expresión pRS416 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. y Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) de manera similar a como se describe en el Ejemplo 1.1. La mezcla de ligamiento se usó para la transformación de TOP10 de E. coli (Invitrogen), dando como resultado el constructo de expresión en levaduras pGBS416FUM-1 (Figura 2).

2.2. Experimentos de transformación y de crecimiento en placas de microtitulación (MTPs)

El constructo pGBS416FUM-1 se transformó en la cepa CEN.PK113-5D de S. cerevisiae (MATA ura3-52). Como control negativo, el vector vacío pRS416 se transformó en la cepa CEN.PK 113-5D. Mezclas de transformación se 5 extendieron en placas sobre levadura con base de nitrógeno (YNB) sin AA (Difco) + glucosa al 2%. Los siguientes números de transformantes individuales se inocularon por duplicado en 250 microlitros de medio de Verduyn que comprende glucosa al 2% (Verduyn et al., 1992, Yeast. Jul; 8(7):501-17) en MTPs de 96 pocillos profundos, y se pre-cultivaron a 30ºC, 550 rpm, y una humedad de 80% en una incubadora oscilante Infors Microplate: 12 transformantes pGBS416FUM-1 (FUMR), y 24 de vector vacío pRS416 de control. Después de 3 días, 25 microlitros 10 del precultivo presente en los pocillos de las MTPs se transfirieron a nuevas MTPs de 96 pocillos profundos que contenían medio de Verduyn que contiene glucosa y CaCO3 (concentraciones finales: glucosa 10%, CaCO3 1% p/v en un volumen total de 250 microlitros). Después de 3 días y 7 días de crecimiento a 30ºC, 550 rpm, y una humedad de 80% en una incubadora oscilante Infors Microplate, las MTPs se centrifugaron durante 2 minutos a 2000 rpm, se recogieron 200 microlitos de sobrenadante usando el dispositivo Multimek 96 (Beckman), y el 15 sobrenadante se analizó mediante HPLC como se describe en el Ejemplo 1.2 para determinar la presencia de ácido

succínico. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Efecto de la inserción de fumarasa procedente de Rhizopus oryzae (FumR) en la cepa CEN.PK113-5D de

S. cerevisiae sobre los niveles de producción de ácido succínico después de 3 y 7 días de cultivo. 20

CEN.PK 113-5D transformada con el vector:: Ácido succínico (mg/l) después de 3 días Ácido succínico (mg/l) después de 7 días

pRS416: 138 18 (n=48) 203 48 (n=48)

pGBS416FUM-1: 156 10 (n=24) 317 59 (n=24)

Los resultados en la Tabla 1 demuestran que la introducción y la sobreexpresión de fumarasa procedente de Rhizopus oryzae dio como resultado un incremento significativo de 1,13 veces de los niveles de producción de ácido succínico (p=4,71E-7, prueba de la t de Student) después de 3 días de incubación. Después de 7 días de

25 incubación, la introducción y la sobreexpresión de fumarasa procedente de Rhizopus oryzae dio como resultado un incremento significativo de 1,56 veces de los niveles de producción de ácido succínico (p=4,49E-10, prueba de la t de Student).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> DSM IP Assets BV Verwaal, René Wu, Liang

5 Sagt, Cornelis Maria Jacobus Damveld, Robbertus Antonius

<120> Producción de ácido dicarboxílico en levadura recombinante

<130> 26346

<140> 26346WO 10 <141> 2008-11-14

<160> 6

<170> Patentln version 3.2

<210> 1

<211> 494 15 <212> PRT

<213> Rhizopus oryzae

<400> 1

<210> 2

<211> 1419

<212> ADN

<213> Rhizopus oryzae

<400> 2

<210> 3

<211> 472

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fumarasa de R. oryzae menos la señal putativa seleccionadora de dianas

<400> 3

<210> 4

<211> 1419

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> nt FumR menos el codón putativo seleccionador de dianas optimizado para S. cerevisae

<400> 4

<210> 5

<211> 1000

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Promotor TDH1

<400> 5

<210> 6

<211> 500

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Terminador TDH1

<400> 6

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una levadura recombinante que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una enzima heteróloga que

cataliza la conversión de ácido málico a ácido fumárico, en la que la enzima tiene una identidad de al menos el 70% 5 con SEQ ID NO: 3, en la que la enzima es activa en el citosol con la expresión de la secuencia nucleotídica.
2. Una levadura de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la enzima deriva de Rhizopus oryzae.
3.

Una levadura de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que la enzima es una fumarasa. 10
4. Una levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que pertenece a uno de los géneros Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, o Zygosaccharomyces.
5.

Una levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es una Saccharomyces cerevisiae 15 que comprende SEQ ID NO: 4.
6. Un procedimiento para la producción de ácido succínico, que comprende fermentar una levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un medio de fermentación adecuado, en el que se produce el ácido succínico.

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