ES2383473T3

ES2383473T3 - Producción de ácido dicarboxílico en eucariotas

Info

Publication number: ES2383473T3
Application number: ES08851601T
Authority: ES
Inventors: René VERWAAL; Liang Wu; Robbertus Antonius Damveld; Cornelis Maria Jacobus Sagt
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2007-11-20
Filing date: 2008-11-14
Publication date: 2012-06-21
Anticipated expiration: 2028-11-14
Also published as: JP2014236739A; CN101978063B; BRPI0819275B1; CA2704654C; BRPI0819275B8; US20120165569A1; EP2687602A1; EP2220233A1; WO2009065778A1; US9689005B2; JP2011502524A; BRPI0819275A2; CN101903522A; BRPI0819273A2; BRPI0819273B1; WO2009065780A1; CN101978063A; CA2704654A1; US20110081694A1; EP2220233B1

Abstract

Una célula microbiana eucariótica recombinante, seleccionada del grupo que consiste en una levadura y en unhongo filamentoso, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversiónde fosfoenolpiruvato en oxaloacetato, en donde se genera ATP, en donde la enzima comprende una secuencia deaminoácidos que tiene una identidad de al menos el 55% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y/oSEQ ID NO: 5, en donde la secuencia de nucleótidos se expresa en el citosol y la enzima es activa en el citosol.

Description

Producción de ácido dicarboxílico en eucariotas

La presente invención se refiere a una célula eucariótica recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato en oxaloacetato, y a un procedimiento para la producción de un ácido dicarboxílico, a saber ácido succínico.

Los ácidos dicarboxílicos de 4 carbonos, ácido málico, ácido fumárico y ácido succínico son potenciales precursores para numerosos productos químicos. Por ejemplo, el ácido succínico se puede convertir en 1,4-butanodiol (BDO), tetrahidrofurano y gamma-butirolactona. Otro producto derivado de ácido succínico es un polímero de poliéster que se prepara enlazando ácido succínico y BDO.

El ácido succínico se produce predominantemente a través de procedimientos petroquímicos mediante hidrogenación de butano. Se considera que estos procedimientos son perjudiciales para el medio ambiente y costosos. La producción fermentativa de ácido succínico puede ser un procedimiento alternativo atractivo para la producción de ácido succínico, en el que se puede utilizar un material de alimentación renovable como fuente de carbono.

Se conoce que un cierto número de diferentes bacterias tales como Escherichia coli y las bacterias de la panza Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Bacteroides, Mannheimia o Succinimonas sp. producen ácido succínico. La ingeniería metabólica de estas cepas bacterianas ha mejorado el rendimiento y/o productividad de ácido succínico, o ha reducido la formación de subproductos.

Lin et al., 2005, Metabolic Engineering 7, págs. 116-127, por ejemplo, describen que la sobre-expresión de fosfoenolpiruvato carboxilasa a partir de Sorghum en E. coli era eficaz para aumentar la producción de succinato en sistemas de producción aerobios de E. coli.

El documento WO 2007/061590 describe una levadura piruvato descarboxilasa negativa para la producción de ácido málico y/o ácido succínico, la cual se transforma con una enzima piruvato carboxilasa o una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una enzima malato deshidrogenasa y una proteína transportadora de ácido málico (MAE).

Bauer et al., 1999, FEMS Microbiology Letters 179, págs. 107-112 describen que la expresión de la fosfoenolpiruvato carboxilasa a partir de Escherichia coli en Saccharomyces cerevisiae y cepas de S. cerevisiae que sobre-expresan piruvato carboxilasa producía una mayor cantidad de malato en comparación con el tipo salvaje.

Kubo et al., 2000, J. Bioscience and Bioengineering, 90, págs. 619-624 describe que la interrupción de genes de succinato deshidrogenasa en S. cerevisiae incrementaba la producción de ácido succínico bajo condiciones de sacudimiento, pero no bajo condiciones estáticas y de elaboración de sake.

Goldberg et al., 2006, J. Chem. Techn. Biotechnol. 81, pág. 1601-1611 reseña la importancia del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) citosólico reductivo, que incluye las actividades citosólicas de piruvato carboxilasa, malato deshidrogenasa y fumarasa para la producción de ácido fórmico y ácido málico en hongos filamentosos.

Sanville Millard et al., 1996, Appl. Environm. Microbiol. 62, págs. 1808-1810 describe que la producción fermentativa de ácido succínico a partir de glucosa por parte de Escherichia coli se incrementó significativamente mediante la sobre-expresión de fosfoenolpiruvato carboxilasa. En contraposición, la sobre-expresión de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa no tenía efecto alguno.

A pesar de las mejoras que se han realizado en la producción fermentativa de ácido dicarboxílico, sigue existiendo una necesidad de microorganismos mejorados para la producción fermentativa de ácidos dicarboxílicos, en particular ácido succínico.

El objetivo de la presente invención es un microorganismo eucariótico alternativo para la producción de un ácido dicarboxílico, a saber ácido succínico.

El objetivo se consigue de acuerdo con la invención con una célula microbiana eucariótica recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato en oxaloacetato, con lo que se genera ATP, en donde la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 5% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 y/o SEQ ID NO:5, en donde la secuencia de nucleótidos es expresada en el citosol, y la enzima es activa en el citosol.

Preferiblemente, la enzima tiene actividad de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, preferiblemente la enzima es una fosfoenolpiruvato (PEP) carboxiquinasa (E.C. 4.1.1.49). Preferiblemente, la PEP carboxiquinasa es activa bajo condiciones anaerobias o limitadas en oxígeno en presencia de una fuente de carbono fermentable o glicerol. Una fuente de carbono fermentable puede ser glucosa, fructosa, galactosa, rafinosa, arabinosa o xilosa. Se encontró ventajoso que la célula eucariótica comprendiera una PEP carboxiquinasa de acuerdo con la presente invención, dado que la PEP carboxiquinasa, que cataliza la conversión de PEP en OAA fija CO2 y genera energía en forma de ATP.

Sorprendentemente, se encontró que una célula eucariótica recombinante de acuerdo con la presente invención produce una cantidad incrementada de ácido dicarboxílico tal como ácido succínico y ácido fumárico en comparación con la cantidad de ácido dicarboxílico producido por una célula eucariótica de tipo salvaje. Preferiblemente, una célula eucariótica de acuerdo con la presente invención produce al menos 1,2, preferiblemente al menos 1,5, 1,6, 1,8, preferiblemente al menos 2 veces más de ácido dicarboxílico que una célula eucariótica de tipo salvaje que no comprende la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato en oxaloacetato de la invención.

Preferiblemente, una célula microbiana eucariótica de acuerdo con la presente invención expresa una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima con actividad de PEP carboxiquinasa, preferiblemente una PEP carboxiquinasa en donde la PEP carboxiquinasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 55%, preferiblemente de al menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3 y/o SEQ ID NO: 5. Preferiblemente, la PEP carboxiquinasa comprende la SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 5.

La identidad de la secuencia se define en esta memoria como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (poliipéptidos o proteínas) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótidos), según se determina comparando las secuencias. Habitualmente, las identidades o similitudes entre secuencias se comparan a lo largo de toda la longitud de las secuencias comparadas. En la técnica, “identidad” significa también el grado de relación de la secuencia entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, según sea el caso, según se determina por el apareamiento entre hebras de dichas secuencias.

Se diseñan métodos preferidos para determinar la identidad y para dar el apareamiento mayor entre las secuencias sometidas a ensayo. Métodos para determinar la identidad y similitud son codificados en programas de ordenador públicamente disponibles. Métodos de programa de ordenador preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen BLASTP y BLASTN, públicamente disponibles de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Parámetros preferidos para la comparación de secuencias de aminoácidos utilizando BLASTP son hueco abierto 11.0, extensión de hueco 1, matriz Blosum 62.

Una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima expresada en una célula según se describe también se puede definir por su capacidad de hibridarse con secuencias de nucleótidos que codifican una enzima que tiene actividad de PEP carboxiquinasa de SEQ ID NO: 1, 3 y/o 5, o con la secuencia de nucleótidos que codifica una malato deshidrogenada de SEQ ID NO: 14 o con la secuencia de nucleótidos que codifica fumarasa de SEQ ID NO: 16, bajo condiciones de hibridación moderadas o, preferiblemente, bajo condiciones de hibridación rigurosas. Condiciones de hibridación rigurosas se definen en esta memoria como condiciones que permiten que una secuencia de ácidos nucleicos de al menos aproximadamente 25, de preferencia aproximadamente 50 nucleótidos, 75 ó 100 y, lo más preferiblemente, de aproximadamente 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de aproximadamente 65ºC en una disolución que comprende una sal aproximadamente 1 M, preferiblemente 6 x SSC (cloruro de sodio, citrato de sodio) o cualquier otra disolución que tenga una fuerza iónica equiparable, y el lavado a 65ºC en una disolución que comprende una sal aproximadamente 0,1 M, o menor, preferiblemente 0,2 x SSC, o cualquier otra disolución que tenga una fuerza iónica equiparable. Preferiblemente, la hibridación se realiza durante una noche, es decir, al menos durante 10 horas y, preferiblemente, el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la disolución de lavado. Habitualmente, estas condiciones permitirán la hibridación específica de secuencias con una identidad de la secuencia de aproximadamente 90% o más.

Condiciones moderadas se definen en esta memoria como condiciones que permiten que una secuencia de ácidos nucleicos de al menos 50 nucleótidos, de preferencia de aproximadamente 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de aproximadamente 45ºC en una disolución que comprende una sal aproximadamente 1 M, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra disolución que tenga una fuerza iónica equiparable, y el lavado a temperatura ambiente en una disolución que comprende una sal aproximadamente 1 M, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra disolución que tenga una fuerza iónica equiparable. Preferiblemente, la hibridación se realiza durante una noche, es decir, al menos durante 10 horas y, preferiblemente, el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la disolución de lavado. Habitualmente, estas condiciones permitirán la hibridación específica de secuencias con una identidad de la secuencia de hasta 50%. La persona experta en la técnica será capaz de modificar estas condiciones de hibridación con el fin de identificar específicamente secuencias que varíen en la identidad entre 50% y 90%.

Una célula microbiana eucariótica recombinante de acuerdo con la presente invención se define en esta memoria como una célula que contiene, o es transformada o modificada genéticamente con una secuencia de nucleótidos que no se produce de forma natural en la célula eucariótica, o que contiene una copia o copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos endógena. Una célula eucariótica de tipo salvaje se define en esta memoria como la célula parental de la célula recombinante.

El término “homóloga”, cuando se utiliza para indicar la relación entre una molécula de ácido nucleico o polipéptido (recombinante) dada y un organismo hospedante o célula hospedante dado, se entiende que significa que en la naturaleza la molécula de ácido nucleico o polipéptido se produce por parte de una célula hospedante o de organismos de la misma especie, preferiblemente de la misma variedad de cepa.

El término “heterólogo”, cuando se utiliza con respecto a un ácido nucleico (ADN o ARN) o proteína se refiere a un ácido nucleico o proteína que no se produce de forma natural como parte del organismo, célula, genoma o secuencia de ADN o ARN en la que está presente, o que se encuentra en una célula o lugar o lugares en el genoma o la secuencia de ADN o ARN que difieren de la que se encuentra en la naturaleza. Ácidos nucleicos o proteínas heterólogos no son endógenos para la célula en la que se introducen, pero han sido obtenidos a partir de otra célula

o han sido producidos por vía sintética o recombinante.

El término “gen”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que contiene un molde para una ácido nucleico polimerasa, en eucariotas, ARN polimerasa II. Los genes se transcriben en ARNms que luego se traducen en proteínas.

La expresión “ácido nucleico”, tal como se utiliza en esta memoria, incluye la referencia a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, es decir, un polinucleótido, en una forma de una sola cadena o de doble cadena y, a menos que se limite de otro modo, comprende análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de nucleótidos naturales, debido a que se hibridan a ácidos nucleicos de cadena sencilla de una manera similar a nucleótidos que se producen en la naturaleza (p. ej. ácidos nucleicos peptídicos). Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una sub-secuencia de un gen estructural o regulador nativo o heterólogo. A menos que se indique de otro modo, el término incluye la referencia a la secuencia específica, así como a la secuencia complementaria de la misma.

Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se utilizan de forma indistinta en esta memoria para aludir a un polímero de residuos aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos aminoácidos son un análogo químico artificial de un correspondiente aminoácido que se produce en la naturaleza, así como a polímeros de aminoácidos que se producen en la naturaleza. La naturaleza esencial de análogos de este tipo de aminoácidos que se producen en la naturaleza es que, cuando se incorporan en una proteína, esa proteína es específicamente reactiva a anticuerpos inducidos a la misma proteína, pero que consisten enteramente en aminoácidos que se producen en la naturaleza. Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteínas” incluyen también modificaciones que incluyen, pero no se limitan a la glicosilación, fijación de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de residuos ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación.

El término “enzima” tal como se utiliza en esta memoria se define como una proteína que cataliza una reacción (bio)química en una célula.

Para aumentar la probabilidad de que la enzima introducida se exprese en forma activa en una célula eucariótica de la invención, se puede adaptar la correspondiente secuencia de nucleótidos codificadora para optimizar su uso del codón con el de la célula hospedante eucariótica elegida. En la técnica se conocen varios métodos para la optimización de codones. Un método preferido para optimizar el uso de codones de las secuencias de nucleótidos a la célula eucariótica de acuerdo con la presente invención es la tecnología de la optimización del par de codones según se describe en el documento WO 2008/000632. La optimización del par de codones es un método para producir un polipéptido en una célula hospedante, en el que las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido han sido modificadas con respecto a su uso de codones, en particular los pares de codones que se utilizan para obtener una expresión mejorada de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido y/o la producción mejorada del polipéptido. Pares de codones se definen como un conjunto de dos tripletes (codones) subsiguientes en una secuencia codificadora.

Habitualmente, una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima tal como una enzima con actividad de PEP carboxiquinasa, o cualquier otra enzima descrita en esta memoria está enlazada de forma operativa a un promotor que determina una suficiente expresión de la correspondiente secuencia de nucleótidos en la célula eucariótica de acuerdo con la presente invención, con el fin de conferir a la célula la capacidad de producir un ácido dicarboxílico.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión “operativamente enlazada” se refiere a un enlace de elementos de polinucleótidos (o secuencias codificadoras o secuencias de ácidos nucleicos) en una relación funcional. Una secuencia de ácidos nucleicos está “operativamente enlazada” cuando está situada en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o reforzador está operativamente enlazado a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia codificadora.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término “promotor” se refiere a un fragmento de ácido nucleico que actúa para controlar la transcripción de uno o más genes situados aguas arriba con respecto a la dirección de la transcripción del lugar de inicio de la transcripción del gen, y está estructuralmente identificado por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa ADN-dependiente, sitios de iniciación de la transcripción y cualesquiera otras secuencias de ADN conocidas por un experto en la técnica. Un promotor “constitutivo” es un promotor que es activo bajo condiciones medioambientales y de desarrollo. Un promotor “inducible” es un promotor que es activo bajo la regulación medioambiental o de desarrollo.

Un promotor que podría utilizarse para conseguir la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima, p. ej. una enzima con actividad de PEP carboxiquinasa, puede no ser nativo a la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima a expresar, es decir, un promotor que es heterólogo a la secuencia de nucleótidos (secuencia codificadora) a la que está operativamente enlazado. Preferiblemente, el promotor es homólogo, es decir, endógeno a la célula hospedante.

Promotores adecuados en células hospedantes eucarióticas son conocidos por la persona experta en la técnica. Promotores adecuados pueden ser, pero no se limitan a TDH, GPDA, GAL7, GAL10 o GAL 1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI y AOX1. Otros promotores adecuados incluyen PDC, GPD1, PGK1 y TEF1.

Habitualmente, una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima comprende un terminador. En la presente invención se puede utilizar cualquier terminador que sea funcional en la célula. Terminadores preferidos se obtienen a partir de genes naturales de la célula hospedante. Secuencias de terminador adecuadas son bien conocidas en la técnica. Preferiblemente, terminadores de este tipo se combinan con mutaciones que evitan el deterioro del ARNm mediado sin sentido en la célula hospedante de la invención (véase, por ejemplo: Shirley et al., 2002, Genetics 161: 1465-1482).

En una realización preferida, se sobre-expresa una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima tal como una enzima con actividad de PEP carboxiquinasa. Se encontró que una producción incrementada de ácido málico, ácido fumárico o ácido succínico por parte de la célula se puede conseguir cuando se sobre-expresan las secuencias de nucleótidos.

Se conocen métodos en la técnica para la sobre-expresión de secuencias de nucleótidos que codifican enzimas. Una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima se puede sobre-expresar aumentando el número de copias del gen que codifica la enzima en la célula, p. ej. integrando copias adicionales del gen en el genoma de la célula, expresando el gen a partir de un vector centromérico, a partir de un vector de expresión de múltiples copias epìsomal

o introduciendo un vector de expresión (episomal) que comprende múltiples copias de uno o más genes. Preferiblemente, la sobre-expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima de acuerdo con la invención se consigue con un promotor constitutivo (fuerte).

La invención se refiere también a una construcción de nucleótidos que comprende una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.

Una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima se puede ligar en una construcción de ácido nucleico, por ejemplo un plásmido tal como un plásmido de bajo número de copias o un plásmido de alto número de copias. La célula eucariótica de acuerdo con la presente invención puede comprender una sola copia, pero preferiblemente comprende múltiples copias de la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de PEP en OAA, por ejemplo mediante múltiples copias de una construcción de nucleótidos.

Una construcción de ácidos nucleicos se puede mantener episomalmente y, así, comprende una secuencia para la replicación autónoma tal como una secuencia de replicación autosomal. Si la célula eucariótica es de origen fúngico, una construcción de ácido nucleico episomal adecuada puede basarse, p. ej., en los plásmidos 21 o pKD1 de levadura (Gleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975), o en los plásmidos AMA (Fierro et al., 1995, Curr Genet. 29: 482-489). Alternativamente, cada una de las construcciones de ácido nucleico puede integrarse en una o más copias en el genoma de la célula eucariótica. La integración en el genoma de la célula puede producirse aleatoriamente mediante recombinación no homóloga pero, preferiblemente, la construcción de ácido nucleico se puede integrar en el genoma de la célula mediante recombinación homóloga, tal como se conoce bien en la técnica.

En una realización preferida, una célula microbiana eucariótica de acuerdo con la presente invención comprende una enzima que tiene actividad de PEP carboxiquinasa, en donde la enzima es una enzima heteróloga, preferiblemente la enzima heteróloga se deriva de una bacteria, más preferiblemente la enzima con actividad de PEP carboxiquinasa se deriva de Escherichia coli, Mannheimia sp., Actinobacillus sp., o Anaerobiospirillum sp., más preferiblemente de Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, o Anaerobiospirillum succiniciproducens.

En una realización preferida, una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima con actividad de PEP carboxiquinasa en la célula eucariótica de acuerdo con la presente invención se expresa en el citosol. Sorprendentemente, la actividad citosólica de la enzima dio como resultado una producción incrementada de un ácido dicarboxílico por parte de la célula eucariótica.

Se encontró que una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima con actividad de PEP carboxiquinasa puede comprender una señal diana peroxisomal o mitocondrial, por ejemplo según se determina por el método descrito por Schlüter et al, Nucleic Acid Research 2007, Vol 25, D815-D822.

Se encontró que la PEP carboxiquinasa derivada de Actinobacillus succinogenes comprende una señal diana peroxisomal. Sorprendentemente, se encontró que cuando la señal diana peroxisomal se reemplazaba por el correspondiente motivo en la PEP carboxiquinasa derivada de Mannheimia succiniproducens, se evitó la fijación como diana peroxisomal.

Una célula eucariótica de acuerdo con la presente invención expresa una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima con PEP carboxiquinasa, en donde la enzima es una PEP carboxiquinasa, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 ó 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 5. Preferiblemente, la PEP carboxiquinasa comprende la SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 5.

En una realización, puede preferirse que la actividad de una enzima nativa o endógena u homóloga que cataliza la conversión de OAA en PEP en la célula eucariótica de acuerdo con la presente invención se reduzca o se inactive por completo. La inactivación o reducción de la actividad de una enzima que cataliza la conversión de OAA en PEP son métodos conocidos para la persona experta en la técnica. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante mutación, interrupción o deleción de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima con actividad de PEP carboxiquinasa. Se prefiere una actividad reducida de una PEP carboxiquinasa nativa con el fin de evitar que se produzca la reacción inversa de OAA a PEP.

Una célula microbiana eucariótica de acuerdo con la presente invención se selecciona del grupo que consiste en una levadura y en un hongo filamentoso. Una célula eucariótica pertenece preferiblemente a los géneros

Saccharomyces, Aspergillus, Penicillium, Pichia, Kluyveromyces, Yarrowia, Candida, Hansenula, Humicola, Torulaspora, Trichosporon, Brettanomyces, Rhizopus, Zygosaccharomyces, Pachysolen o Yamadazyma. Preferiblemente, la célula eucariótica pertenece a una especie de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, P. symplissicum, Pichia stipidis, Kluyveromyces marxianus, K. lactis, K. thermotolerans, Yarrowia lipolytica, Candida sonorensis, C. glabrata, Hansenula polymorpha, Torulaspora delbrueckii, Brettanomyces bruxellensis, Rhizopus oryzae o Zygosaccharomyces bailii.

Preferiblemente, una célula eucariótica de acuerdo con la invención es una levadura, preferiblemente Saccharomyces cerevisiae, preferiblemente una Saccharomyces cerevisiae que comprende una o más de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. La célula eucariótica también puede ser un hongo filamentoso, preferiblemente A. niger, preferiblemente A. niger que comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogas seleccionadas de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.

Además de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima con actividad de PEP carboxiquinasa, la célula eucariótica de acuerdo con la presente invención puede ser modificada o transformada genéticamente de forma adicional con secuencias de nucleótidos que codifican enzimas homólogas y/o heterólogas que catalizan reacciones en la célula, dando como resultado un flujo incrementado hacia el ácido málico, el ácido fumárico y/o el ácido succínico. Por ejemplo, puede ser favorable introducir y/o sobre-expresar secuencias de nucleótidos que codifiquen i) una malato deshidrogenasa que cataliza la conversión de OAA en ácido málico; ii) una fumarasa que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico; o iii) una fumarato reductasa que cataliza la conversión de ácido fumárico en ácido succínico, dependiendo del ácido dicarboxílico a producir.

Preferiblemente, una célula eucariótica de acuerdo con la presente invención sobre-expresa una secuencia de nucleótidos que codifica una piruvato carboxilasa (PYC), preferiblemente una piruvato carboxilasa que es activa en el citosol tras la expresión de la secuencia de nucleótidos, por ejemplo una piruvato carboxilasa que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 26. Preferiblemente, se sobre-expresa una piruvato carboxilasa endógena u homóloga. Sorprendentemente, se encontró que la sobre-expresión de una piruvato carboxilasa endógena daba como resultado niveles de producción de ácido succínico incrementados por parte de la célula eucariótica de acuerdo con la presente invención que comprende una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa según se describe en esta memoria. Se encontró que la (sobre)expresión concomitante de una piruvato carboxilasa y una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa daba como resultado un incremento sorprendente de los niveles de producción de ácido succínico de al menos 1,5 en comparación con una célula eucariótica que comprende piruvato carboxilasa o una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa según se describe en esta memoria.

En otra realización preferida, una célula de acuerdo con la presente invención comprende, además, una secuencia de nucleótidos que codifica una malato deshidrogenasa (MDH) activa en el citosol tras la expresión de la secuencia de nucleótidos. Una MDH citosólica puede ser cualquier malato deshidrogenasa homóloga o heteróloga adecuada. Preferiblemente, la MDH es una MDH de S. cerevisiae tal como MDH3 o MDH1. Preferiblemente, la MDH carece de una señal diana peroxisomal o mitocondrial con el fin de localizar la enzima en el citosol. Alternativamente, la MDH es MDH2 de S. cerevisiae que ha sido modificada de modo que no sea inactivada en presencia de glucosa y sea activa en el citosol. Es conocido que la transcripción de MDH2 se reprime y Mdh2p se degrada tras la adición de glucosa a células privadas de glucosa. Mdh2p suprimida para los 12 aminoácidos amino-terminales es menos susceptible a una degradación inducida por glucosa (Minard y McAlister-Henn, J Biol Chem. 1992 25 agosto;267(24):17458-64). Preferiblemente, una célula eucariótica de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una malato deshidrogenasa que tiene una identidad de la secuencia de al menos el 70%, preferiblemente de al menos el 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o 100% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Preferiblemente, la actividad de malato deshidrogenasa se incrementa al sobreexpresar la secuencia de nucleótidos codificadora por métodos conocidos en la técnica.

Preferiblemente, una célula eucariótica de acuerdo con la presente invención comprende, además, una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico, que puede ser una enzima heterógola u homóloga. Una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico, por ejemplo una fumarasa, puede proceder de cualquier origen adecuado, preferiblemente de un origen microbiano, por ejemplo una levadura tal como Saccharomyces o un hongo filamentoso tal como Rhizopus oryzae, Preferiblemente, una célula eucariótica de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una fumarasa que tiene una identidad de la secuencia de al menos el 70%, preferiblemente de al menos el 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, preferiblemente la fumarasa comprende SEQ ID NO: 16.

Preferiblemente, la enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico es activa en el citosol tras la expresión de la secuencia de nucleótidos. La actividad citosólica de la enzima con actividad de fumarasa se prefiere para una elevada productividad de un ácido dicarboxílico por parte de la célula eucariótica. En el caso de que una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima con actividad de fumarasa comprenda una señal diana peroxisomal o mitocondrial (por ejemplo según se determina por el método descrito por Schlüter et al., Nucleic Acid Research 2007, Vol 25, D815-D822), se puede preferir suprimir dicha señal diana para localizar una enzima con actividad fumarasa en el citosol. Preferiblemente, una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico se sobre-expresa por métodos conocidos en la técnica.

Se describe también una célula en donde al menos un gen que codifica alcohol deshidrogenasa no es funcional. Un gen de alcohol deshidrogenasa que no es funcional se utiliza en esta memoria para describir una célula eucariótica que comprende una actividad de alcohol-deshidrogenasa reducida en comparación con una célula en donde todos los genes que codifican una alcohol deshidrogenasa son funcionales. Un gen se puede convertir en no funcional por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo por mutación, interrupción o deleción, por ejemplo mediante el método descrito por Gueldener et al. 2002 Nucleic Acids Research, Vol. 30, Nº 6, e23. Preferiblemente, la célula es una Saccharomyces cerevisiae en donde uno o más genes adh1 y/o adh2 que codifican alcohol deshidrogenasa están inactivados.

Se describe también una célula que comprende, además, al menos un gen que codifica glicerol-3-fosfato deshidrogenasa que no es funcional. Un gen de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa que no es funcional se utiliza en esta memoria para describir una célula eucariótica que comprende una actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa reducida, por ejemplo mediante mutación, interrupción o deleción del gen que codifica glicerol-3fosfato deshidrogenasa, dando como resultado una formación disminuida de glicerol en comparación con la célula de tipo salvaje.

En otra realización preferida, la célula eucariótica recombinante de acuerdo con la presente invención comprende al menos un gen que codifica succinato deshidrogenasa que no es funcional. Una succinato deshidrogenasa que no es funcional se utiliza en esta memoria para describir una célula eucariótica que comprende una actividad de succinato deshidrogenasa reducida mediante mutación, interrupción o deleción de al menos un gen que codifica succinato deshidrogenasa, dando como resultado una formación incrementada de ácido succínico en comparación con la célula de tipo salvaje. Una célula eucariótica que comprende un gen que codifica succinato deshidrogenasa, que no es funcional, puede ser, por ejemplo, Aspergillus niger, preferiblemente un Aspergillus niger, en donde uno o más genes que codifican succinato deshidrogenasa tales como sdhA no son funcionales.

Preferiblemente, una célula eucariótica de acuerdo con la presente invención que comprende una cualquiera de las modificaciones genéticas descritas en esta memoria es capaz de producir al menos 0,3, 0,5, 0,7 g/L de ácido succínico, preferiblemente al menos 1 g/L de ácido succínico, preferiblemente al menos 1,5, preferiblemente al menos 2 ó 2,5, 4,5, preferiblemente al menos 8, 10, 15 ó 20 g/L de ácido succínico, pero habitualmente es menor que 200 o menor que 150 g/L.

Una célula eucariótica preferida de acuerdo con la presente invención puede ser capaz de crecer en cualquier fuente de carbono adecuada conocida en la técnica y convertirse en un ácido dicarboxílico deseable según se menciona antes en esta memoria. La célula eucariótica puede ser capaz de convertir directamente biomasa vegetal, celulosas, hemicelulosas, pectinas, ramnosa, galactosa, fucosa, maltosa, maltodextrinas, ribosa, ribulosa, o almidón, derivados de almidón, sacarosa, lactosa y glicerol. Así, un organismo hospedante preferido expresa enzimas tales como celulasas (endocelulasas y exocelulasas) y hemicelulasas (p. ej. endo- y exo-xilanasas, arabinasas), necesarias para la conversión de celulosa en monómeros de glucosa y de hemicelulosa en monómeros de xilosa y arabinosa, pectinasas capaces de convertir pectinas en ácido glucurónico y ácido galacturónico, o amilasas para convertir el almidón en monómeros de glucosa. Preferiblemente, la célula es capaz de convertir una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, lactosa, rafinosa y glicerol.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un ácido dicarboxílico, a saber ácido succínico, que comprende fermentar la célula eucariótica de acuerdo con la presente invención en un medio de fermentación adecuado y preparar el ácido dicarboxílico. Se encontró ventajoso utilizar una célula eucariótica según se define antes en esta memoria en el procedimiento para la producción de un ácido dicarboxílico tal como ácido succínico, ya que la mayoría de las células eucarióticas no requieren condiciones estériles para su propagación y son insensibles a las infecciones por bacteriófagos. El procedimiento de acuerdo con la presente invención puede realizarse en condiciones aerobias y anaerobias. Preferiblemente, el procedimiento se lleva a cabo en condiciones anaerobias o bajo condiciones micro-aerófilas o limitadas en oxígeno. Un proceso de fermentación anaerobio se define en esta memoria como un proceso de fermentación realizado en ausencia de oxígeno, o en el que no se consume esencialmente oxígeno, preferiblemente menos de 5, 2,5 ó 1 mmol/L/h, y en donde las moléculas orgánicas sirven tanto como donantes de electrones como aceptores de electrones.

Un proceso de fermentación limitado en oxígeno es un proceso en el que el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno desde el gas al líquido. El grado de limitación en oxígeno se determina por la cantidad y composición del flujo de gas entrante, así como por las propiedades de mezcladura/transferencia de masa reales del equipo de fermentación utilizado. Preferiblemente, en un proceso bajo condiciones limitadas en oxígeno, la tasa de consumo de oxígeno es de al menos 5,5, lo más preferiblemente de al menos 6 e incluso más preferiblemente de al menos 7 mmol/L/h.

El procedimiento para la producción de un ácido dicarboxílico de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo a cualquier pH adecuado entre 1 y 9. Preferiblemente, el pH en el caldo de fermentación oscila entre 2 y 7, preferiblemente entre 3 y 5. Se encontró ventajoso poder llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con la presente invención a un pH bajo, ya que esto evita la contaminación bacteriana y se necesitan menos sales alcalinas para la titulación para mantener el pH a un nivel deseado en el procedimiento para la producción de un ácido dicarboxílico.

Una temperatura adecuada a la que se puede llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con la presente invención oscila entre 5 y 60ºC, preferiblemente entre 10 y 50ºC, más preferiblemente entre 15 y 35ºC, lo más preferiblemente entre 18ºC y 30ºC. El experto en la técnica conoce las temperaturas óptimas para fermentar una célula eucariótica específica.

El ácido dicarboxílico que se produce en el procedimiento de acuerdo con la presente invención es ácido succínico. Se describen adicionalmente ácido fumárico y ácido málico.

Preferiblemente, el ácido dicarboxílico se recupera del caldo de fermentación por un método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo mediante cristalización, precipitación con amonio o tecnología de intercambio de iones.

Preferiblemente, el ácido dicarboxílico que se prepara en el procedimiento de acuerdo con la presente invención se convierte ulteriormente en un producto farmacéutico, cosmético, alimentario, para piensos o químico. El ácido succínico puede convertirse adicionalmente, por ejemplo, en un polímero tal como poli(succinato de butileno) (PBS) u otros polímeros adecuados derivados del mismo.

La presente invención se refiere también a un caldo de fermentación que comprende un ácido dicarboxílico, a saber ácido succínico, que se puede obtener mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invención.

La invención se refiere a un procedimiento para la producción de un ácido dicarboxílico, a saber ácido succínico, en el que se utiliza una célula eucariótica en calidad de productor de ácido dicarboxílico, en donde se utiliza fosfoenolpiruvato carboxiquinasa para incrementar la producción de ácido dicarboxílico, preferiblemente en donde la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa es activa en el citosol. Preferiblemente, la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa es una enzima heteróloga, derivada preferiblemente de Actinobacillus succinogenes o Mannheimia succiniciproducens.

Modificaciones genéticas

Técnicas genéticas convencionales tales como la sobre-expresión de enzimas en las células hospedantes, la modificación genética de células hospedantes o técnicas de hibridación son métodos conocidos en la técnica tal como se describen en Sambrook y Russel (2001) “Molecular Cloning; A Laboratory Manual (3ª edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press o F. Ausubel et al. comps., “Current protocols in molecular biology”, Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987). Métodos para la transformación, modificación genética, etc. de células hospedantes fúngicas se conocen, p. ej., de los documentos EP-A-0 635 574, WO 98/46772, WO 99/60102 y WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 y US 6.265.186.

Descripción de las figuras

Figura 1: Mapa del vector pGBTOP-11 utilizado para la expresión fosfoenolpiruvato carboxiquinasa en A. niger.

Figura 2: Mapa del plásmido de pGB414SUS-01 que codifica PEP carboxiquinasa procedente de Actinobacillus succinogenes para la expresión en Saccharomyces cerivisiae. CPO designa el par de codones optimizado.

Figura 3: Mapa del plásmido de pGB414SUS-04 que codifica PEP carboxiquinasa procedente de Mannheimia succiniciproducens para la expresión en Saccharomyces cerivisiae. CPO designa el par de codones optimizado.

Figura 4: Mapa del plásmido de pDEL-SDHA.

Figura 5: Esquema de reemplazamiento de sdhA.

Figura 6: Mapa de pGBTOPAn5, en donde el promotor constitutivo gpdA impulsa la expresión de PCKa. Se utilizaron los flancos GlaA para la integración. ADN de E. coli se separó mediante digestión con NotI.

Figura 7: Mapa de pGBTOPAn6, en donde el promotor constitutivo gpdA impulsa la expresión de PCKa. Se utilizaron los flancos GlaA para la integración. ADN de E. coli se separó mediante digestión con NotI.

Figura 8: Mapa del plásmido de pGBS416PPK-1, que codifica PEP carboxiquinasa procedente de Actinobacillus succinogenes para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. CPO indica par de codones optimizado.

Figura 9: Mapa del plásmido de pGBS416PEK-1, que codifica PEP carboxiquinasa procedente de Mannheimia succiniciproducens para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. CPO indica par de codones optimizado.

Figura 10: Mapa del plásmido de pGBS415FUM-3 que contiene fumarasa procedente de Rhizopus oryzae (FUMR) y malato deshidrogenasa peroxisomal procedente de Saccharomyces cerevisiae (MDH3) para la expresión en Sacharomyces cerevisiae. Las construcciones de genes sintéticas promotor de TDH1-FUMR-terminador de TDH1 y promotor de TDH3-MDH3-terminador de TDH3 se clonaron en el vector de expresión pRS415. CPO indica par de codones optimizado.

Figura 11: Niveles de ácido succínico (líneas discontinuas) y de ácido fumárico (líneas continuas) en cepas SUC101 (0, control de vectores vacío), SUC -152 ((, sobre -expresión de PCKa, MDH3, FUMR), SUC-154 ((, PCKm, MDH3, FUMR). Todos los genes sobre-expresados fueron optimizados en el par de codones para la expresión en S. cerevisiae. Todos los datos representan medias y desviaciones estándar de 3 experimentos de crecimiento independientes de SUC-152 y 2 experimentos de crecimiento independiente de SUC-154 y desviaciones medias y estándares de 6 experimentos de crecimiento independiente de SUC-101.

Figura 12: Mapa del plásmido de pGBS414PPK-3, que contiene PEP carboxiquinasa procedente de Actinobacillus succinogenes (PCKa) y fumarato reductasa glicosomal procedente de Trypanosoma brucei (FRDg) para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. Las construcciones de genes sintéticas promotor de TDH1-PCKa-terminador de TDH1 y promotor de TDH3-FRDg-terminador de TDH3 se clonaron en el vector de expresión pRS414.

Figura 13: Mapa del plásmido de pGBS426PYC-2 que contiene piruvato carboxilasa procedente de Saccharomyces cerevisiae para expresión en Saccharomyces cerevisiae. La secuencia de nucleótidos codificadora de PYC2 se obtuvo mediante PCR utilizando ADN genómico procedente de la cepa CEN.PK113-5D en calidad de molde y el producto de la PCR se clonó en el vector de expresión p426GPD.

Figura 14: Mapa del plásmido de pGBS414FRE-1 que codifica fumarato reductasa glicosomal (FRDg) procedente de Trypanosoma brucei para la expresión en Saccharomyces cerevisiae. La construcción de genes sintética promotor de TDH3-FRDg-terminador de TDH3 se clonó en el vector de expresión pRS414.

Figura 15: Niveles de ácido succínico en cepas SUC-226 ((, PCKa, MOH3, FUMR, FROg)-227 (., PYC2, PCKa, MDH3, FUMR, FRDg), SUC-228 ((, PYC2, MOH3, FUMR, FROg) Y SUC-230 (0, MOH3, FUMR, FROg). Los datos representan la media de 3 experimentos de crecimiento independientes.

Los ejemplos siguientes son sólo para fines ilustrativos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Clonación de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa procedente de Actinobacillus succinogenes y Mannheimia succiniciproducens en Aspergillus niger

1.1. Construcciones de expresión

Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa [E.C. 4.1.1.49], número de acceso de GenBank 152977907, procedente de Actinobacillus succinogenes se analizó en cuanto a la presencia de secuencias señal utilizando SignalP 3.0 (http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) Bendtsen, J. et al. (2004) Mol. Biol. 340:783-795 y TargetP 1.1 (http:/www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) Emanuelsson, O. et al. (2007) Nature Protocols 2, 953-971. El análisis según se describe por Schlüter et al., (2007) NAR, 35, D815-D822 reveló una secuencia señal PTS2 putativa en la posición 115-123. La secuencia de A. succinogenes (secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2) se modificó para asemejarse a la secuencia proteica de Mannheimia succiniciproducens reemplazando los aminoácidos EGY en la posición 120-122 por DAF (secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3; secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4). La secuencia SEQ ID NO: 3 se sometió al método del par de codones según se describe en el documento WO2008/000632 para A. niger. La secuencia resultante SEQ ID NO: 7 se colocó detrás de la secuencia del promotor de GPDA constitutiva SEQ ID NO: 11, en donde las últimas 10 secuencias de nucleótidos fueron reemplazadas por la secuencia Kozak CACCGTAAA óptima. Se añadieron sitios de restricción convenientes. La secuencia resultante se sintetizó en Sloning (Puchheim, Alemania). El fragmento era SnaBI, SfiI clonado en el vector de expresión pGBTOP11 de A. niger (véase la figura 1) utilizando sitios de restricción apropiados.

De igual manera, fosfoenolpiruvato carboxiquinasa [E.C. 4.1.1.49], número de acceso de GenBank 52426348, procedente de Mannheimia succiniciproducens, se analizó en cuanto a la presencia de secuencias señal según se describe en Schlüter et al., (2007) NAR, 35, D815-D822. La secuencia tal como se muestra en SEQ ID NO: 5 (secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6) no requería modificaciones. Subsiguientemente, la secuencia se sometió al método del par de codones según se describe en el documento WO2008/000632 para A. niger. La secuencia SEQ ID NO: 8 resultante se colocó detrás de la secuencia del promotor de GPDA constitutiva SEQ ID NO: 11, y se añadieron sitios de restricción convenientes. La secuencia resultante se sintetizó en Sloning (Puchheim, Alemania). El fragmento era SnaBI, SfiI clonado en el vector de expresión pGBTOP11 de A. niger (véase la figura 1) utilizando sitios de restricción apropiados. Después de la clonación del gen PCKa en pGBTOP11, el vector se renombró pGBTOPAn5 (figura 6). Después de la clonación del gen PCKa en pGBTOP11, el vector se renombró pGBTOPAn6 (figura 7).

1.2. Transformación de A. niger

WT-1 de A. niger: Esta cepa de A. niger es CBS513.88 que comprende deleciones de los genes que codifican glucoamilasa (glaA), amilasa fúngica y amilasa ácida. WT-1 de A. niger se construyó utilizando la estrategia “MARKER-GENE FREE” según se describe en el documento EP 0 635 574 B1.

Las construcciones de expresión se co-transformaron en la cepa WT-1 de A. niger de acuerdo con el método descrito por Tilburn, J. et al. (1983) Gene 26, 205-221 y Kelly, J y Hynes, M. (1985) EMBO J., 4.475-479, con las siguientes modificaciones:

Las esporas germinan y se cultivan durante 16 horas a 30 grados Celsius en un matraz oscilante colocado en un agitador rotatorio a 300 rpm en medio mínimo de Aspergillus (100 ml). El medio mínimo de Aspergillus contiene, por litro: 6 g de NaNO3, 0,52 g de KCl, 1,52 g de KH2PO4, 1,12 ml de KOH 4 M, 0,52 g de MgSO4.7H2O, 10 g de glucosa, 1 g de casaminoácidos, 22 mg de ZnSO4.7H2O, 11 mg de H3BO3, 5 mg de FeSO4.7H2O, 1,7 mg de CoCl2.6H2O, 1,6 mg de CuSO4.5H2O, 5 mg de MnCl2.2H2O, 1,5 mg de Na2MoO4.2H2O, 50 mg de EDTA, 2 mg de riboflavina, 2 mg de tiamina-HCl, 2 mg de nicotinamida, 1 mg de piridoxina-HCl, 0,2 mg de ácido pantoténico, 4 g de biotina, 10 ml de penicilina (5000 UI/ml), estreptomicina (5000 UG/ml) (Gibco).

-: Para la preparación de protoplastos se utiliza Novozym 234™ (Novo Industries) en lugar de helicasa;

-: Después de la formación de los protoplastos (60-90 minutos), se añade tampón KCl (KCl 0,8 M, ácido cítrico 9,5 mM, pH 6,2) hasta un volumen final de 45 ml, la suspensión de protoplastos se centrifuga durante 10 minutos a 3000 rpm a 4 grados Celsius en un rotor con cubo oscilante. Los protoplastos se resuspenden en 20 ml de tampón KCl y subsiguientemente se añaden 25 ml de tampón STC (sorbitol 1,2 M, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, CaCl2 50 mM). La suspensión de protoplastos se centrifuga durante 10 minutos a 3000 rpm a 4 grados Celsius en un rotor con cubo oscilante, se lava con tampón STC y se resuspende en tampón STC a una concentración de 108 protoplastos/ml;

-: A 200 microlitos de la suspensión de protoplastos se añade el fragmento de ADN, disuelto en 10 microlitros de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 0,1 mM) y 100 microlitros de disolución PEG (PEG 4000 al 20% (Merck), sorbitol 0,8 M, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, CaCl2 50 mM);

-: Después de la incubación de la suspensión de protoplastos de ADN durante 10 minutos a la temperatura ambiente se añade lentamente una disolución de 1,5 ml de PEG (PEG 4000 al 60%, (Merck), Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl2 50 mM), con mezcladura repetida de los tubos. Después de incubación durante 20 minutos a la temperatura ambiente, las suspensiones se diluyen con 5 ml de sorbitol 1,2 M, se mezclan mediante inversión y se centrifugan durante 10 minutos a 4000 rpm a la temperatura ambiente. Los protoplastos se resuspenden suavemente en 1 ml de sorbitol 1,2 M y se extienden en placas sobre medio de regeneración selectivo sólido que consiste en medio mínimo de Aspergillus sin riboflavina, tiamina.HCl, nicotinamida, piridoxina, ácido pantoténico, biotina, casaminoácidos y glucosa. En el caso de la selección de acetamida, el medio contiene acetamida 10 mM en calidad de la única fuente de nitrógeno y sacarosa 1 M en calidad agente osmótico y fuente de C. Alternativamente, los protoplastos se extienden sobre PDA (agar de patata dextrosa, Oxoid) suplementado con 1-50 microgramos/ml de fleomicina y sacarosa 1 M en calidad de agente osmótico. Las placas de regeneración se solidifican utilizando agar al 2% (agar nº 1, Oxoid L11). Después de la incubación durante 6-10 días a 30 grados Celsius, conidiosporas de transformantes se transfieren a placas que consisten en medio selectivo de Aspergillus (medio mínimo con contenido en acetamida como única fuente de nitrógeno en el caso de la selección de acetamida o PDA suplementado con 1-50 microgramos/ml de fleomicina en el caso de la selección de fleomicina) con glucosa al 2% y agarosa al 1,5% (Invitrogen) y se incuban durante 5-10 días a 30 grados Celsius. Los transformantes sencillos se aíslan y esta etapa de purificación selectiva se repite una vez, tras lo cual se almacenan los transformantes purificados.

1.3. Crecimiento en matraz oscilante de A. niger

En total 10 transformantes se seleccionan para cada una de las construcciones y la presencia de la construcción se confirma mediante PCR utilizando cebadores específicos para las construcciones. Subsiguientemente, las esporas se inoculan en 100 ml de medio enriquecido mínimo de Aspergillus que comprende 100 g/l de glucosa. Las cepas se desarrollan en una incubadora a 250 revoluciones por minuto durante cuatro días a 34 grados Celsius. El sobrenadante del medio de cultivo se analiza en cuanto a la formación de ácido oxálico, ácido málico, ácido fumárico y ácido succínico mediante HPLC y se compara con una cepa no transformada.

1.4. Análisis por HPLC

La HPLC se realiza para la determinación de ácidos orgánicos y azúcares en diferentes tipos de muestras. El principio de la separación en una columna de monosacáridos de Phenomenex Rezex-RHM se basa en la exclusión por el tamaño, exclusión de iones e intercambio de iones utilizando mecanismos de fase inversa. La detección tiene lugar mediante el índice de refracción diferencial y detectores ultravioleta.

Ejemplo 2A

Clonación de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa procedente de Actinobacillus succinoges o Mannheimia succiniciproducens en Saccharomyces cerevisiae.

2A.1. Construcciones de expresión

Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa [E.C. 4.1.1.49] número de acceso de GenBank 152977907 procedente de Actinobacillus succinogenes se analizó en cuanto a la presencia de secuencias señal según se describe bajo el parágrafo 1.1. La SEQ ID NO: 3 se sometió al método del par de codones según se describe en el documento WO2008/000632 para S. cerevisiae. La secuencia SEQ ID NO: 9 resultante se colocó detrás de la secuencia del promotor TDH1 constitutiva SEQ ID NO: 12 y delante de la secuencia del terminador TDH1 SEQ ID NO: 13, y se añadieron sitios de restricción convenientes. La secuencia resultante se sintetizó en Sloning (Puchheim, Alemania). La construcción de expresión pGBS414SUS-01 se creó después de una restricción con BamHI/NotI del vector de expresión pRS414 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. y Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) y ligando subsiguientemente en este vector un fragmento de restricción BamHI/NotI que consistía en la construcción del gen sintético de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (origen Actinobacillus succinogenes) (figura 2). La mezcla de ligamiento se utiliza para la transformación de DH10B de E. coli (Invitrogen), dando como resultado la construcción de expresión pGBS414SUS-01 en levaduras (figura 2).

Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa [E.C. 4.1.1.49] número de acceso de GenBank 52426348 procedente de Mannheimia succiniciproducens, se identificó y modificó según se describe en el parágrafo 1.1. La SEQ ID NO: 5 se sometió al método del par de codones según se describe en el documento WO2008/000632 para S. cerevisiae. La secuencia SEQ ID NO: 10 resultante se colocó detrás de la secuencia del promotor TDH1 constitutiva SEQ ID NO: 12 y delante de la secuencia del terminador TDH1 SEQ ID NO: 13, y se añadieron sitios de restricción convenientes. La secuencia resultante se sintetizó en Sloning (Puchheim, Alemania). La construcción de expresión pGBS414SUS04 se creó después de una restricción con BamHI/NotI del vector de expresión pRS414 de S. cerevisiae (Sirkoski

R.S.: y Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) y ligando subsiguientemente en este vector un fragmento de restricción BamHI/NotI que consistía en la construcción del gen sintético de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (origen Mannheimimia succiniciproducens) (figura 3). La mezcla de ligamiento se utiliza para la transformación de DH10B de

E.: coli (Invitrogen), dando como resultado la construcción pGBS414SUS-04 de expresión en levaduras (figura 3).

2A.2. Transformación y crecimiento en matraz oscilante

Las construcciones pGBS414SUS-01 y pGBS414SUS-04 se transforman independientemente en las cepas CEN.PK113-6B de S. cerevisiae (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289), RWB066 (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::Kanlox) y RWB064 (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox). Las mezclas de transformación se extienden en placas sobre levadura con base de nitrógeno (YNB) sin AA (Difco) + glucosa al 2% suplementado con aminoácidos apropiados. Los transformantes se inoculan en medio de Verduyn que comprende glucosa, suplementado con aminoácidos apropiados (Verduyn et al., 1992, Yeast. Jul; 8(7):501-17) y se hacen crecer en condiciones aerobias, anaerobias y limitadas en oxígeno en matraces oscilantes. El medio para el cultivo anaerobio se suplementa con 0,01 g/l de ergosterol y 0,42 g/l de Tween 80 disuelto en etanol (Andreasen y Stier, 1953, J. Cell. Physiol. 41, 23-36; Andreasen y Stier, 1954, J. Cell. Physiol, 43: 271-281). Todos los cultivos de levaduras se hacen crecer a 30ºC en una incubadora oscilante a 250-280 rpm. A diferentes tiempos de incubación, se retiran partes alícuotas de los cultivos, se centrifugan y el medio se analiza mediante HPLC en cuanto a la formación de ácido oxálico, ácido málico, ácido fumárico y ácido succínico según se describe en la sección 1.4.

Ejemplo 2B

Clonación de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa procedente de Actinobacillus succinogenes o Mannheimia succiniciproducens en Saccharomyces cerevisiae

2B.1. Construcciones de expresión

De una manera similar a la descrita en el Ejemplo 2A.1, el gen PCKa (SEQ ID NO: 9) se ligó en el vector de expresión pRS416 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. y Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27). La mezcla de ligamiento se utilizó para la transformación de células TOP10 de E. coli (Invitrogen), dando como resultado la construcción de expresión en levaduras pGBS416PPK-1 (Figura 8).

De igual manera, el gen PCKm (SEQ ID NO: 10) se ligó en pRS416. La mezcla de ligamiento se utilizó para la transformación de células TOP10 de E. coli (Invitrogen), dando como resultado la construcción pGBS416PEK-1 de expresión en levaduras (figura 9).

2B.2. Experimentos de transformación y de crecimiento en placas de microtitulación (MTP’s)

Las construcciones pGBS416PPK-1 y pGBS416PEK-1 se transformaron independientemente en la cepa

5 CEN.PK113-5D de S. cerevisiae (MATA ura3-52). Como control negativo, el vector vacío pRS416 se transformó en la cepa CEN.PK 113-5D. Mezclas de transformación se extendieron en placas sobre levadura con base de nitrógeno (YNB) sin AA (Difco) + glucosa al 2%. Los siguientes números de transformantes individuales se inocularon por duplicado en 250 microlitros de medio de Verduyn que comprende glucosa al 2% en MTP’s de 96 pocillos profundos y se pre-cultivaron a 30 grados Celsius, 550 rpm y una humedad de 80% en una incubadora oscilante Infors Microplate: 12 transformantes pGBS416PPK-1 (PCKa), 12 pGBS416PEK-1 (PCKm) y 24 de control vector vacío pRS416. Después de 3 días, 25 microlitros del pre-cultivo presente en los pocillos de las MTP’s se transfirieron a nuevas placas de MTP de 96 pocillos profundos que contenían medio de Verduyn con contenido en glucosa y CaCO3 (concentraciones finales: glucosa 10%, CaCO3 1% p/v en un volumen total de 250 microlitros). Después de 7 días de crecimiento a 30 grados Celsius, 550 rpm y una humedad de 80% en una incubadora oscilante Infors

15 Microplate, las MTP’s se centrifugaron durante 2 minutos a 2000 rpm, se recogieron 200 microlitos de sobrenadante utilizando el dispositivo Multimek 96 (Beckman) y el sobrenadante se analizó mediante HPLC según se describe en el Ejemplo 1.4 en cuanto a la presencia de ácido succínico. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 1. Efecto de la inserción de PCKa y PCKm en S. cerevisiae sobre los niveles de producción de ácido succínico, comparado con la cepa control que comprende el vector vacío pRS416 después de 7 días de cultivo.

Cepa CEN.PK 113-5D de S. cerevisiae que comprende: Ácido succínico (mg/L)

el plásmido:

pRS416: 203±48 (n=48)

pGBS416PPK-1 (PCKa): 259±63 (n=24)

pGBS416PEK-1 (PCKm): 268±49 (n=24)

Los resultados en la Tabla 1 demuestran que la introducción y la sobre-expresión de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa procedente de Actinobacillus succinogenes o Mannheimia succiniciproducens daba como resultado

25 un nivel de producción incrementado de ácido succínico en S. cerevisiae (1,8 veces, p=4,92E-, y 1,32 veces P=2,95E-6 test t de Student, respectivamente).

Ejemplo 2C

Clonación de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa procedente de Actinobacillus succinogenes o Mannheimia succiniciproducens, malato deshidrogenasa procedente de Saccharomyces cerevisiae y fumarasa procedente de Rhyzopus oryzae en Saccharomyces cerevisiae.

2C.1. Secuencias de genes

35 Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa:

Las secuencias de genes de PEP carboxiquinasa procedente de A. succinogenes (PCKa) y M. succiniciproducens (PCKm) se diseñaron y sintetizaron según se describe en el apartado 2A.1.

Malato deshidrogenasa:

Malato deshidrogenasa peroxisomal (Mdh3) [E.C. 1.1.1.37], número de acceso de GenBank 1431095 se analizó en cuanto a la fijación como diana peroxisomal en hongos filamentosos utilizando el predictor PTS1

45 http://mendel.imp.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/PTS1predictor.jsp con la función de predicción específica para hongos. Se separaron los aminoácidos C-terminales en las posiciones 341-343 (SKL), dando como resultado la proteína de SEQ ID NO: 14. SEQ ID NO: 14 se sometió al método del par de codones según se describe en el documento WO2008/000632 para S. cerevisiae, dando como resultado la SEQ ID NO: 15. El codón de terminación TGA en la SEQ ID NO: 15 se modificó a TAAG. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 15, que contenía TAAG como codón de terminación, se sintetizó detrás de la secuencia del promotor TDH3 constitutiva SEQ ID NO: 18 (600 pb más arriba del codón de inicio) y delante de la secuencia del terminador TDH3 SEQ ID NO: 19 (300 pb más abajo del codón de terminación) y se añadieron sitios de restricción convenientes. La construcción TDH3p-MDH3-TDH-3t sintética (SEQ ID NO: 20) se sintetizó en Sloning (Puchheim, Alemania).

55 Fumarasa:

Fumarasa [E.C. 4.2.1.2], número de acceso de GenBank 469103, procedente de Rhizopus oryzae se analizó en cuanto a la presencia de secuencias señal utilizando SignalP 3.0 (http/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) Bendtsen,

J. et al. (2004) Mol. Biol. 340:783-795 y TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) Emanuelsson, O. et al. (2007) Nature Protocols 2, 953-971. Se identificó una secuencia diana mitocondrial putativa en los primeros 23 aminoácidos de la proteína. Para evitar una potencial fijación como objetivo a mitocondrias en S. cerevisiae, se 5 separaron los primeros 23 aminoácidos, dando como resultado la SEQ ID NO: 16, y se reintrodujo un aminoácido metionina. La SEQ ID NO: 16 se sometió al método del par de codones según se describe en el documento WO2008/000632 para S. cerevisiae, proporcionando la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 17. El codón de terminación TAA en la SEQ ID NO: 17 se modificó a TAAG. La SEQ ID NO: 17 que contenía TAAG como codón de terminación se sintetizó detrás de la secuencia del promotor TDH1 constitutiva SEQ ID NO: 12 y delante de la

10 secuencia del terminador TDH1 SEQ ID NO: 13, y se añadieron sitios de restricción convenientes. La construcción TDH1p-FumR-TDH1t sintética (SEQ ID NO: 21) se sintetizó en Sloning (Puchheim, Alemania).

2C.2. Construcción de construcciones de expresión.

15 La construcción de expresión pGBS415FUM-3 (figura 10) se creó después de una restricción BamHI/NotI del vector de expresión pRS415 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. y Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) y ligando subsiguientemente en este vector un fragmento de restricción BamHI/NotI que consistía en la construcción del gen sintético fumarasa (origen Rhizopus oryzae) (SEQ ID NO: 21). La mezcla de ligamiento se utilizó para la transformación de TOP10 de E. coli (Invitrogen), dando como resultado la construcción pGBS415FUM-1 de

20 expresión en levaduras. Subsiguientemente, pGBK415FUM-1 se restringió con AscI y NotI. Para crear pGBS415FUM-3, un fragmento de restricción Ascl/NotI que consistía en malato deshidrogenasa peroxisomal procedente de la construcción génica sintética (MDH3) de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 20) se ligó en el vector pGBS415FUM-1 restringido. La mezcla de ligamiento se utilizó para la transformación de TOP10 de E. coli (Invitrogen), dando como resultado la construcción pGBS415FUM-3 de expresión en levaduras (figura 10).

25 La construcción de las construcciones de expresión pGBS414SUS-01 y pGBS414SUS-04 se describe bajo el Ejemplo 2A.1.

2C.3. Cepas de S. cerevisiae

30 Los plásmidos pGBS414SUS-01, pGBS415FUM-3 y pRS416 se transformaron en la cepa CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289) de S. cerevisiae para crear la cepa SUC-152. Los plásmidos pGBS414SUS-04, pGBS415FUM-3 y pRS416 se transformaron en la cepa CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289) de S. cerevisiae para crear la cepa SUC-154. Una cepa control que sobre-expresa sólo vectores vacíos (SUC-101) se creó

35 mediante transformación de pRS414, pRS415 y pRS416. Todos los genes se optimizaron mediante el par de codones para la expresión en S. cerevisiae. Los vectores de expresión se transformaron en levaduras mediante electroporación. Las mezclas de transformación se extendieron en placas sobre levadura con base de nitrógeno (YNB) sin AA (Difco) + glucosa al 2%. Los genes sobre-expresados en las cepas SUC-152 y SUC-154 se describen en la Tabla 2.

40 Tabla 2. Cepas de levaduras construidas para el Ejemplo 2C.

Nombre: Antecedente Plásmidos Genes

SUC-152: CEN.PK113-6B pGBS414SUS-01 pGBS415FUM-3 pRS416 (vector vacío) PCKa FUMR, MDH3

SUC-154: CEN.PK113-6B pGBS414SUS-04 pGBS415FUM-3 pRS416 (vector vacío) PCKm FUMR, MDH3

SUC-101: CEN.PK113-6B pRS414 (vector vacío) pRS415 (vector vacío) pRS415 (vector vacío)

2D.4. Experimentos de crecimiento y producción de ácido succínico y ácido fumárico

45 Transformantes se inocularon en 20 ml de medio de pre-cultivo que consistía en medio de Verduyn (Verduyn et al., 1992, Yeast. Jul;8(7):501-17) que comprende galactosa al 2% (p/v) y se hacen crecer en condiciones aerobias en matraces oscilantes de 100 ml en una incubadora oscilante a 30ºC a 250 rpm. Después de 72 horas, el cultivo se centrifugó durante 5 minutos a 4750 rpm. Se utilizó 1 ml de sobrenadante para medir los niveles de ácido succínico

50 mediante HPLC según se describe en la sección 1.5. El sobrenadante remanente se decantó y el sedimento (células) se resuspendió en 1 ml de medio de producción. El medio de producción consistía en medio de Verduyn con galactosa al 10% (p/v) y CaCO3 al 1% (p/v). Las células resuspendidas se inocularon en 50 ml de medio de producción en matraces oscilantes de 100 ml y se hicieron crecer en una incubadora oscilante a 30ºC a 100 rpm. A diversos instantes, se tomó del cultivo 1 ml de muestra. Los niveles de ácido succínico y ácido fumárico se midieron mediante HPLC según se describe en la sección 1.4 (Figura 11).

Cepas transformadas con vectores vacíos (cepa control) producían hasta 0,3 g/L de ácido succínico (figura 11, línea discontinua). La sobre-expresión de PEP carboxiquinasa procedente de M. succiniciproducens (PCKm), malato deshidrogenasa peroxisomal (MDH3) procedente de S. cerevisiae y fumarasa procedente de R. oryzae (FUMR) dio como resultado un nivel de producción de 0,9 g/L de ácido succínico. La sobre-expresión de PEP carboxiquinasa procedente de A. succinogenes (PCKa), MDH3 y FUMR dio como resultado un nivel de producción de ácido succínico de 1,0 g/L. Estos resultados demuestran que cuando S. cerevisiae se transformó con un MDH3 truncado y FUMR además de PCKa o PCKm, se produjo una cantidad adicionalmente incrementada de ácido succínico en comparación con una S. cerevisiae que sobre-expresa PCKa o PCKm solo (Tabla 1).

Cepas transformadas con vectores vacíos (cepa control) producían hasta 14 mg/L de ácido fumárico después de 8 días de crecimiento (figura 11, línea continua). La sobre-expresión de PEP carboxiquinasa procedente de A. succinogenes (PCKa), malato deshidrogenasa procedente de S. cerevisiae (MDH3) y fumarasa procedente de R. oryzae (FUMR) dieron como resultado una producción máxima de 55 mg/L de ácido fumárico después de 7 días de crecimiento. La sobre-expresión de PEP carboxiquinasa procedente de M. succiniciproducens (PCKm), malato deshidrogenasa procedente de S. cerevisiae (MDH3) y fumarasa procedente de R. oryzae (FUMR) dieron como resultado una producción máxima de 52 mg/L de ácido fumárico después de 8 días de crecimiento.

Estos datos demuestran que la sobre-expresión de PCKa o PCKm, MDH3 y FUMR en S. cerevisiae daba como resultado niveles de producción incrementados de ácido fumárico en comparación con una correspondiente S. cerevisiae de tipo salvaje.

Ejemplo 2D

Clonación de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa procedente de Actinobacillus succinogenes, piruvato carboxilasa procedente de Saccharomyces cerevisiae, malato deshidrogenasa procedente de Saccharomyces cerevisiae, fumarasa procedente de Rhyzopus oryzae en Saccharomyces cerevisiae y fumarato reductasa procedente de Trypanosoma brucei.

2D.1. Secuencias de genes

Fumarato reductasa glicosomal (FRDg) [E.C. 1.3.1.6], número de acceso de GenBank 23928422, procedente de Trypanosoma brucei se analizó en cuanto a la fijación como objetivo peroxisomal en hongos filamentosos utilizando el predictor PTS1 http://mendel.imp.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/PTS1predictor.jsp con la función de predicción específica para hongos. Los aminoácidos C-terminales en las posiciones 1140-1142 (SKI) se separaron de la proteína, dando como resultado la SEQ ID NO: 22. La SEQ ID NO: 22 se sometió al método del par de codones según se describe en la solicitud PCT/EP2007/05594 para la expresión en S. cerevisiae. La secuencia SEQ ID NO: 23 resultante se colocó detrás de la secuencia del promotor TDH3Sc constitutiva de SEQ ID NO: 24 y delante de la secuencia del terminador TDH3Sc SEQ ID NO: 25, y se añadieron sitios de restricción convenientes. El codón de terminación en SEQ ID NO: 23 se modificó a TAAG. La secuencia resultante se sintetizó en Sloning (Puchheim, Alemania).

La secuencia de genes de PEP carboxiquinasa procedente de A. succinogenes se describió en la sección 2A.1. Las secuencias de genes de malato deshidrogenasa procedente de S. cerevisiae y fumarasa procedente de R. oryzae se describieron bajo 2C.1.

Piruvato carboxilasa citoplásmica procedente de Saccharomyces cerevisiae (Pyc2p) [E.C. 6.4.1.1.], número de acceso de GenBank 1041734, SEQ ID NO: 26 es codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 27. ADN genómico procedente de la cepa CEN.PK113-5D (MATA ura3-52) de S. cerevisiae se utilizó como molde para amplificar la secuencia codificadora de PYC2 (SEQ ID NO: 29), utilizando los cebadores P1 SEQ ID NO: 28 y P2 SEQ ID NO: 29 y la ADN polimerasa de Phusion (Finnzymes, Finlandia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se incluyeron sitios de restricción convenientes en los cebadores para fines de clonación ulteriores.

2D.2. Construcción de construcciones de expresión

La construcción de expresión pGBS414PPK-3 (figura 12) se creó después de una restricción BamHI/NotI del vector de expresión pRS414 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. y Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) y subsiguientemente 5 se ligó en este vector un fragmento de restricción BamHI/NotI que consistía consistía en la construcción del gen sintético de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (origen Actinobacillos succinogenes) (véase 2A.1). La mezcla de ligamiento se utilizó para la transformación de TOP10 de E. coli (Invitrogen), dando como resultado la construcción de expresión pGBS414PPK-1 en levaduras. Subsiguientemente, pGBK414PPK-1 se restringió con AscI y NotI. Para crear pGBS414PPK-3, un fragmento de restricción AscI/NotI, que consistía en la construcción del gen sintético de

10 fumarato reductasa glicosomal procedente de T. brucei (FRDg) (véase 2D.1) se ligó en el vector pGBS414PPK-1 restringido. La mezcla de ligamiento se utilizó para la transformación de TOP10 de E. coli (Invitrogen), dando como resultado la construcción pGBS414PPK-3 de expresión en levaduras (figura 12).

La construcción de expresión pGBS426PYC-2 (figura 13) se creó después de una restricción SpeI/XhoI del vector de

15 expresión p426GPD en S. cerevisiae (Mumberg et al., Gene. 1995, 14 abril 1995; 156(1):119-22) y ligando subsiguientemente en este vector un fragmento de restricción SpeI/XhoI que consistía en la secuencia de nucleótidos de PYC2 amplificada (SEQ ID NO: 29). La mezcla de ligamiento se utilizó para la transformación de TOP10 de E. coli (Invitrogen), dando como resultado la construcción pGBS426PYC-2 de expresión en levaduras (figura 13).

20 La construcción de expresión pGBS414FRE-1 (figura 14) se creó después de una restricción BamHI/NotI del vector de expresión pRS414 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. y Hieter P, Genetics, 1989, 122(1):19-27) y subsiguientemente se ligó en este vector un fragmento de restricción BamHI/NotI que consistía en la construcción del gen sintético de fumarato reductasa glicosomal (origen Trypanosoma brucei) (véase 2D.1). La mezcla de ligamiento se utilizó para la

25 transformación de TOP10 de E. coli (Invitrogen), dando como resultado la construcción pGBS414FRE-1 de expresión en levaduras (figura 14).

La construcción de la construcción de expresión pGBS415FUM-3 se describió en el apartado 2C.2.

30 2D.3. Cepas de S. cerevisiae

Las cepas SUC-226, SUC-227, SUC-228 y SUC-230 se obtuvieron mediante transformación de diferentes combinaciones de los plásmidos pGBS414FRE-1, pGBS414PPK-3, pGBS415FUM-1, pGBS426PYC-2 y p426GPD en la cepa CEN.PK113-6B (MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289), según se representa en la Tabla 3.

35 Tabla 3. Cepas de levaduras construidas para el Ejemplo 2D.

Nombre: Antecedente Plásmidos Genes

SUC-226: CEN.PK113-6B pGBS414PPK-3 pGBS415FUM-3 p426GPD (vector vacío) PCKa, FRDg FUMR, MDH3

SUC-227: CEN.PK113-6B pGBS414PPK-3 pGBS415FUM-3 pGBS426PYC-2 PCKa, FRDg FUMR, MDH3 PYC2

SUC-228: CEN.PK113-6B pGBS414FRE-1 pGBS415FUM-3 pGBS426PYC-2 FRDg FUMR, MDH3 PYC2

SUC-230: CEN.PK113-6B pGBS414FRE-1 pGBS415FUM-3 p426GPD (vector vacío) FRDg FUMR, MDH3

2D.4. Experimentos de crecimiento y producción de ácido succínico

40 Los parámetros de crecimiento y los análisis de las muestras se realizaron según se describe en el ejemplo 2C.4 con las siguientes modificaciones: el pre-cultivo se realizó utilizando glucosa al 2% (p/v) como fuente de carbono. En el medio de producción se utilizó glucosa al 10% (p/v) como fuente de carbono.

45 Según se representa en la Figura 15, la cepa SUC-230 que sobre-expresa MDH3, FUMR y FRDg producía hasta 3,0 g/L de ácido succínico. La sobre-expresión adicional de PCKa incrementaba la producción de ácido succínico hasta 3,4 g/L (cepa SUC-226), y la sobre-expresión adicional de PYC2 incrementaba la producción de ácido succínico hasta 3,7 g/L (cepa SUC-228). Sorprendentemente, la sobre-expresión tanto de PCKa como de PYC2 (SUC-227) dio como resultado un incremento de 1,5 de los niveles de producción de ácido succínico hasta 5,0 g/L, en comparación con el efecto de PCK y PYC solos. Estos resultados demuestran un efecto sinérgico de la sobre-expresión combinada procedente tanto de A. succinogenes (PCKa) como de piruvato carboxilasa procedente de S. cerevisiae (PYC2) sobre los niveles de producción de ácido succínico en S. cerevisiae.

Ejemplo 3

Inactivación de los genes codificadores de succinato deshidrogenasa en Aspergillus niger

3.1. Identificación

ADN genómico de la cepa CBS513.88 de Aspergillus niger se secuenció y analizó. Se identificaron dos genes con proteínas traducidas anotadas como proteínas homólogas a succinato deshidrogenasa, y se denominaron sdhA y sdhB, respectivamente. Secuencias de los loci de sdhA (An16g07150) y sdhB (An02g12770) están disponibles de GenBank con los números de acceso 145253004 y 145234071, respectivamente. Vectores de reemplazamiento génico para sdhA y sdhB se diseñaron de acuerdo con principios conocidos y que se construyeron de acuerdo con procesos de clonación rutinarios (véanse las Figuras 4 y 5). Los vectores comprenden las regiones flanqueantes de aproximadamente 1000 pb de los ORFs de sdh para la recombinación homóloga en los locis genómicos predestinados. Además, contienen el marcador de selección amdS bi-direccional de A. nidulans, impulsado por el promotor gpdA, entre repeticiones directas. El diseño general de estos vectores de deleción se describió previamente en los documentos EP635574B y WO 98/46772.

3.2. Inactivación del gen sdhA en Aspergillus niger.

Se aisló ADN lineal del vector de deleción pDEL-SDHA (figura 4) y se utilizó para transformar CBS513.88 de Aspergillus niger según se describe en: Biotechnology of Filamentous fungi: Technology and Products. (1992) Reed Publishing (EE.UU.); Capítulo 6: Transformation págs. 113 a 156. Este ADN lineal puede integrarse en el genoma en el locus sdhA, sustituyendo así al gen sdhA por el gen amdS según se representa en la Figura 6. Se seleccionaron transformantes en medios de acetamida y se purificaron colonias de acuerdo con los procesos convencionales según se describe en el documento EP635574B. Las esporas se extendieron en placas en medio de fluoroacetamida para seleccionar las cepas que perdían el marcador amdS. Las colonias en crecimiento se diagnosticaron mediante PCR para la integración en el locus sdhA, y las cepas candidatas se sometieron a ensayo mediante análisis Southern para la deleción del gen sdhA. La deleción del gen sdhA era detectable mediante la reducción en tamaño de ~ 2,2 kb de fragmentos de ADN (fragmento de tipo salvaje de 4,6 kb frente a 2,4 kb para una deleción con éxito de SDHA) que cubren el locus completo y se hibridaron a sondas apropiadas. Aproximadamente 9 cepas mostraban una separación del gen sdhA genómico procedente de una agrupación de aproximadamente 96 transformantes iniciales.

La cepa dSDHA se seleccionó como una cepa representativa con un gen sdhA inactivado. La producción de ácido succínico por parte de la cepa dSDHA se midió según se describe en el Ejemplo 4.

Ejemplo 4

Clonación de PCKa y PCKm en dSDHA de A. niger y crecimiento en placas de microtitulación (MTP’s)

La cepa dSDHA de A. niger del ejemplo 3.2 se transformó con la construcción de expresión pGBTOPAn5 (figura 6) que comprende PEP carboxiquinasa procedente de Actinobacillus succinigenes (PCKa, SEQ ID NO: 7) y la construcción de expresión pGBTOPAn6 (figura 7) que comprende PEP carboxiquinasa procedente de Mannheimia succiniciproducens (PCKm, SEQ ID NO: 8) según se describe en el Ejemplo 1.1., de acuerdo con el método de transformación según se describe en el Ejemplo 1.2.

Se tomaron transformantes de A. niger utilizando Qpix y se transfirieron a MTP’s que contenían medio selectivo. Después de 7 días de incubación a 30 grados Celsius, la biomasa se transfirió a mano o con un recolector de colonias a MTP’s que contenían PDA. Después de 7 días de incubación a 30 grados Celsius, se esporuló la biomasa. Estas esporas se resuspendieron utilizando el Multimek 96 (Beckman) en 100 microlitros de medio de Aspergillus enriquecido mínimo que contenía glucosa al 10%. Subsiguientemente, 2 MTP’s con 170 microlitros de medio de Aspergillus enriquecido mínimo que contenía glucosa al 10% y CaCO3 al 1% se inocularon con 30 microlitros de la suspensión de esporas. De igual manera, dSDHA y la cepa GBS513.88 control de A. niger se inocularon en las MTP’s. Estas MTP’s se incubaron durante 5 días a 34 grados Celsius, 550 rpm a 80% de humedad. Al cabo de 5 días, se recolectaron 160 microlitros utilizando el Multimek 96 (Beckman). El ácido succínico en el medio se midió mediante HPLC según se describe en el Ejemplo 1.4. Los resultados se muestran en la Tabla

3.

Tabla 4. Efecto de la deleción de succinato deshidrogenasa (SDHA) e inserción de PCKa y PCKm en A. niger sobre los niveles de producción de ácido succínico

Cepa de A. niger: Ácido succínico mg/l

CBS513.88: 38

dSDHA: 50

dSDHA + PCKa: 160

d,SDHA + PCKm: 241

Los resultados en la Tabla 4 demuestran que la inserción de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa procedente tanto de A. succinogenes como de M. succiniciproducens aumentaba los niveles de producción de ácido succínico por parte de A. niger.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> DSM IP Assets BV Verwaal, René Damveld, Robbertus Antonius Sagt, Cornelis, Maria, Jacobus Wu, Liang

<120> Producción de ácido dicarboxílico en eucariotas

<223> PEPCK A.s., en donde EGY está reemplazado por DAF

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> nt PEPCK A.s. EGY reemplazado por DAF <213> Secuencia artificial

<223> PEPCK A.s., optimizado para A. niger

<213> Secuencia artificial 2

<220>

<223> PEPCK M.s., optimizado para A. niger

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> PEPCK A.s., optimizado para S. cerevisiae

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> PEPCK M.s., optimizado para S. cerevisiae

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Promotor GPDA

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Promotor TDH1

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Terminador TDH1

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> MDH3 de S. cerevisiae que carece de señal diana SKL

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> nt de MDH3 de S. cerevisiae que carecen de nt que codifican la señal diana SKL

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fumarasa de R. oryzae que carece de los primeros 23 aa + M

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> nt de FumR cpo para S. cerevisiae que carecen de nt que codifican los primeros 23 aa + M

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Promotor TDH3

<211> 300

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Terminador TDH3

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética TDH3p-MDH3-TDH3t

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción sintética TDH1p-FUMR-TDH1t

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> FRDg de Trypanosoma brucei que carece de la secuencia diana SKI C-terminal

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cpo nt de FRDg de T. brucei que carece de nt que codifican SKI C-terminal

<210> 24

<211> 1000

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Promotor TDH3Sc

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Terminador TDH3Sc

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador P1

<400> 28 ggactagtat gagcagtagc aagaaattgg 30

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador P2

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Claims

REIVINDICACIONES

1.- Una célula microbiana eucariótica recombinante, seleccionada del grupo que consiste en una levadura y en un hongo filamentoso, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato en oxaloacetato, en donde se genera ATP, en donde la enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 55% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 5, en donde la secuencia de nucleótidos se expresa en el citosol y la enzima es activa en el citosol.
2.- Una célula de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enzima es una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa.
3.- Una célula de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde la enzima es una enzima heteróloga, preferiblemente derivada de una bacteria.
4.- Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la célula es una levadura, preferiblemente una Saccharomyces cerevisiae, o un hongo filamentoso tal como Aspergillus niger.
5.- Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la célula sobre-expresa, además, una secuencia de nucleótidos que codifica una piruvato carboxilasa.
6.- Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la célula comprende, además, una secuencia de nucleótidos que codifica una malato deshidrogenasa, en donde la malato deshidrogenasa es activa en el citosol tras la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica malato deshidrogenasa.
7.- Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la célula comprende, además, una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico en el citosol, tras la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico.
8.- Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde al menos un gen que codifica succinato deshidrogenasa no es funcional.
9.- Una célula de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, que es una Aspergillus niger que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfoenolpiruvato carboxquinasa de SEQ ID NO: 7 y/o SEQ ID NO: 8.
10.- Una célula de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, que es una Saccharomyces cerevisiae que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una fosfoenolpiruvato carboxiquinasa de SEQ ID NO: 9 y/o SEQ ID NO:
10.
11.- Un procedimiento para la preparación de ácido succínico, que comprende fermentar la célula microbiana eucariótica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en un medio de fermentación adecuado, y preparar el ácido succínico.
12.- Un caldo de fermentación que comprende ácido succínico, en donde el caldo de fermentación se puede obtener mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11.