ES2391744T3 - Composiciones y procedimientos para el diagnóstico de trastornos del colon - Google Patents

Composiciones y procedimientos para el diagnóstico de trastornos del colon Download PDF

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Abstract

Procedimiento para diagnosticar una enfermedad inflamatoria intestinal en un paciente, que comprende determinar el aumento o la disminución en comparación con una muestra de mucosa normal de Moraxella sp. del grupo Pseudomonas, Comamonas sp. del grupo Acidovorax, Cryseobacterium sp. del grupo I Cytophaga, Enterococcus sp. del grupo Enterococcus, Bacteroides sp. del grupo Bacteroides, Propionibacterium sp. del grupo Propionibacterium, Ruminococcus sp. del grupo de Clostridium Coccoides y Bacteroides sp. en una muestra de tejido de la mucosa del colon de dicho paciente, en el que (a) la enfermedad inflamatoria intestinal es la enfermedad de Crohn y en el que un aumento de Moraxella sp., Comamonas sp. y Chryseobacter sp. y una disminución de Bacteroides sp., Propionibacterium sp., Enterococcus sp. y Ruminococcus sp. indica la enfermedad de Crohn en dicho paciente, o en el que (b) la enfermedad inflamatoria intestinal es la colitis ulcerosa y en el que un aumento de Moraxella sp., Comamonas sp. y Enterococcus sp. y una disminución de Bacteroides sp., Propionibacterium sp., Chryseobacter sp. y Ruminococcus sp. indica colitis ulcerosa en dicho paciente.

Description

Composiciones y procedimientos para el diagnostico de trastornos del colon. Esta solicitud reivindica los derechos de la solicitud provisional US n° 60/623.771, presentada el 1 de noviembre de 2004 y de la solicitud provisional US n° 60/646.592, presentada el 26 de enero de 2005.
Antecedentes de la invencion
La colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn son enfermedades inflamatorias cronicas del colon y del recto. Aunque los corticosteroides, los aminosalicilatos y los inmunomoduladores han proporcionado alguna ventaja en el tratamiento de la colitis ulcerosa, la anastomosis de la bolsa ileoanal por proctocolectomia restauradora (RP/IPAA) sigue siendo el tratamiento estandar para la gestion de la enfermedad esteroide-refractaria activa de forma prolongada. La complicacion mas corriente y debilitante de la IPAA es una inflamacion sintomatica de la bolsa del ileon o pouchitis. Estudios anteriores han demostrado una disminucion significativa en la calidad de vida (IBDQ y SF36) cuando RP/IPAA se complica por pouchitis. La frecuencia de la pouchitis esta entre el 30 y 50% hasta 5 aros despues de la operacion, siendo la mayoria de los casos iniciales en los primeros 3-6 meses. Clinicamente, la pouchitis se caracteriza por aumento en la frecuencia de las deposiciones, urgencia fecal, hemorragia rectal y malestar general. Sin embargo, el diagnostico de la pouchitis es una combinacion de criterios clinicos, endoscopicos e histologicos. Existe un gran debate en cuanto a si la pouchitis es una extension de la colitis ulcerosa o una enfermedad distinta. No ha habido ningun dato que favorezca fuertemente ninguna de las dos. Aunque se han propuesto muchas teorias, el mecanismo exacto de la enfermedad en pouchitis sigue siendo impreciso. La respuesta clinica espectacular a los antibioticos en la pouchitis sugiere que la microflora puede desemperar una funcion causal. A pesar de una respuesta inicial a los antibioticos del 80%, el 60% de los pacientes presenta episodios de recaida de pouchitis y hasta el 30% de los pacientes desarrollan pouchitis cronica sintomatica. No se han realizado estudios hasta la fecha para identificar ningun patron u organismo especifico de microflora en la patogenia de la pouchitis. En este estudio, los autores introducen Heterogeneidad de la Longitud del Amplicon, una nueva tecnica de cultivo independiente para la caracterizacion detallada de la microflora en la pouchitis. El documento WO03053220 describe un procedimiento de diagnostico de la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa utilizando una sonda que detecta la flagelina de Helicobacter bilis o una bacteria desconocida en la que un aumento indica un estado de la enfermedad. Los cambios en la flora microbiana se han asociado la enfermedad inflamatoria intestinal y especificamente a la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa (Seksik et al., 2003, Gut 52:237-242; Ott et al., 2004, Gut 53: 685-693; Kleesen et al., Scand. J. Gastroenterol. 37: 1034-1041; Linskens et al., 2002, Scand. J. Gastroenterol. 36 Suppl. 234: 29-40).
Descripcion de los dibujos
Figura 1. Histograma de tejido de Crohn y huellas con HLA del lumen. Figura 2. Histograma de tejido de colitis ulcerosa y huellas con HLA del lumen. Figura 3. Analisis principal de coordenadas (PCO) de huellas de Crohn y HLA de colitis ulcerosa. Figura 4. Histograma de bolsa normal y huellas con HLA de tejido de pouchitis. Figura 5. Analisis de coordenadas del principio (PCO) de huellas con HLA de pouchitis. Figura 6. Identificacion de los picos en histograma de la bolsa normal y pouchitis.
Descripcion de la invencion
La presente descripcion se refiere a procedimientos y composiciones para el diagnostico, seguimiento, pronostico, analisis, etc., de enfermedades polimicrobianas. Una enfermedad polimicrobiana es una enfermedad o afeccion que esta asociada a la presencia de al menos dos microorganismos diferentes, incluyendo, por ejemplo, las asociaciones entre bacteria-bacteria, virus-virus, parasito-parasito, bacteria-virus, bacteria-parasito y virus-parasito. Un procedimiento preferido de determinacion de la poblacion microbiana presente en una enfermedad polimicrobiana es la heterogeneidad de la longitud del amplicon (UHLAU). Los ejemplos de enfermedades polimicrobianas comprenden de manera no limitativa, por ejemplo, la coinfeccion de Borrelia y Ehrlichia en la borreliasis de Lyme; infecciones mixtas virico-bacterianas durante epidemias de gripe; enfermedades respiratorias; gastroenteritis; conjuntivitis; queratitis, hepatitis, enfermedades periodontales, infecciones genitales; infecciones intra-abdominales; enfermedades intestinales inflamatorias; infecciones de las vias urinarias; infeccion necrosante de tejidos blandos. La presente invencion se refiere tambien a la poblacion microbiana presente en el aparato digestivo y el lumen en pacientes normales, y en pacientes con enfermedades del aparato digestivo, especialmente enfermedades del colon, tales como la enfermedad inflamatoria intestinal, incluyendo la colitis ulcerosa, el sindrome de Crohn y la pouchitis. La presente invencion se refiere especialmente a composiciones y procedimientos para diagnosticar, pronosticar, y/o hacer el seguimiento de la evolucion de la enfermedad de las enfermedades y afecciones mencionadas, por ejemplo, para determinar la presencia de la enfermedad en un paciente, para determinar un regimen terapeutico, para determinar la aparicion de la enfermedad activa, para determinar la predisposicion a la enfermedad, para determinar el curso de la enfermedad, etc.
La presente invencion proporciona procedimientos para el diagnostico y seguimiento de la evolucion de la enfermedad de enfermedades inflamatorias intestinales, tales como la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn o la pouchitis, que comprende determinar la presencia o ausencia de microbios, tales como bacterias, en una muestra de colon o lumen extraida de dicho paciente. La invencion no se limita a la forma en que se lleva a cabo la determinacion; se puede utilizar cualquier procedimiento adecuado. El termino UmicrobioU incluye virus, bacterias, hongos y protistas. Aunque la descripcion siguiente se puede redactar desde el punto de vista de bacterias, puede utilizarse cualquier microbio. La invencion se refiere a un procedimiento para el diagnostico de una enfermedad inflamatoria intestinal en un paciente, que comprende determinar el aumento o disminucion en comparacion con una muestra de mucosa normal de Morexella sp. del grupo de las Pseudomonas, de Comamonas sp. del grupo Acidovorax, Cryseobacterium sp. del grupo I Cytophaga, Enterococus sp.del grupo de los Enterococcus, Bacteroides sp. del grupo Bacteroides, Propionibacterium sp. del grupo Propionibacterium, Ruminoccocus sp. del grupo Clostridium Coccoides y Bacteroides sp. en una muestra de tejido de la mucosa del colon de dicho paciente, en el que
(a)
la enfermedad inflamatoria intestinal es la enfermedad de Crohn y en el que un aumento de Moraxella sp., Comomonas sp.y Chryseobacter sp.y una disminucion de Bacteroides sp., Propionibacterium sp., Enterococcus sp.y Ruminococcus sp. indica la enfermedad de Crohn en dicho paciente, o en el que
(b)
la enfermedad inflamatoria intestinal es la colitis ulcerosa y en el que un aumento de Moraxella sp., Comomonas sp.y Enterococcus sp. y una disminucion de Bacteroides sp., Propionibacterium sp., Chryseobacter sp. y Ruminococcus sp. indica colitis ulcerosa en dicho paciente.
El procedimiento de la invencion puede comprender ademas determinar el aumento o disminucion de una o mas bacterias seleccionadas de entre el grupo constituido por Bacteriodes sp., Ruminococcus sp., Moraxella sp. y Comomonas sp. en una muestra del lumen del paciente.
La invencion se refiere tambien a un procedimiento para diagnosticar pouchitis en un paciente de ileal-bolsa, que comprende detectar Fusobacter sp., Propionibacterium sp. y al menos una de las bacterias del grupo de E.coli y/o Shigella sp. en una muestra de tejido de la mucosa del colon de dicho paciente, en el que un aumento de Fusobacter sp. y una disminucion de una o mas de las bacterias del grupo de E. coli y/o Shigella sp. en comparacion con una muestra de bolsa normal y ausencia de Propionibacterium sp. es diagnostico de pouchitis.
La presente descripcion se refiere a cualquier composicion o procedimiento que es adecuado para la deteccion de una poblacion microbiana en una muestra (por ejemplo, de un paciente que padece una enfermedad polimicrobiana), tal como una muestra de aparato digestivo, lumen o heces. Una muestra de lumen es de interior del intestino.
Cualquier marcador que sea adecuado para identificar y distinguir un tipo microbiano puede utilizarse segun la presente invencion. Estos procedimientos pueden implicar la deteccion de acido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, ARNm, ARNt, ARNr, etc.), proteina (por ejemplo, utilizando anticuerpos, reactivos de union a proteinas), y cualquier otra biomolecula (por ejemplo, lipidos, hidratos de carbono, etc.) que sea util para determinar especificamente la presencia o ausencia de bacterias en una muestra. Cualquier indicador variable o segmento no codificador (por ejemplo, elementos repetitivos, etc.) se pueden utilizar tambien, asi como genes indicadores. Las regiones ITS puede utilizarse en los hongos.
Tambien puede utilizarse metodos de cultivo convencionales, en los que se identifican bacterias y otros microorganismos cultivandoles en un medio, por ejemplo, utilizando un medio selectivo (por ejemplo, que comprende una fuente de carbono especifica para bacterias) y/o en los que los microorganismos son identificados por sus caracteristicas de crecimiento, morfologia y otros criterios aliados tipicos utilizados para determinar la identidad celular y clasificacion filogenetica. Cualquiera de estos metodos tambien se pueden utilizar en combinacion con metodos citologicos e histologicos, con los que se pueden terir y observar muestras de biopsia o muestras cultivadas (por ejemplo, por corte, o por montaje en un portaobjetos u otro portador).
Como se ha mencionado, las composiciones y procedimientos son utiles para diagnostico y pronostico relacionados con enfermedades polimicrobianas, tales como enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn y la pouchitis. Se pueden utilizar marcadores y huellas para diagnosticar las enfermedades, y distinguirlas de otras enfermedades del aparato digestivo. Tambien se puede utilizar para evaluar el estado de la enfermedad, la gravedad y el pronostico, solos, o en combinacion con otras pruebas. Por ejemplo, los marcadores se pueden utilizar en combinacion con el indice de actividad de la enfermedad de Crohn (CDAI) o los criterios de Trulove y Witts para evaluar la actividad de la enfermedad en la colitis ulcerosa. La informacion sobre el estado de los microorganismos se puede utilizar tambien para determinar cuando iniciar el tratamiento farmaceutico u otros regimenes terapeuticos.
Los procedimientos y composiciones tambien se pueden utilizar para controlar el curso de la enfermedad en un paciente bajo tratamiento o para seguir la evolucion de la enfermedad, independientemente del regimen de tratamiento. Por ejemplo, los pacientes con sindromes inflamatorios del intestino pueden presentar remisiones espontaneas o provocadas por farmacos. Para seguir el curso de la remision y determinar cuando la enfermedad esta activa, se pueden tomarse muestras periodicamente, y analizarse para determinar el aspecto de los marcadores microbianos especificos o huellas en el tejido intestinal, lumen, lavado de colon, muestras de mucosa o heces.
La evaluacion de la poblacion microbiana se puede realizar en cualquier muestra extraida de un paciente, incluyendo de lumen, lavado del colon, tejido intestinal, mucosa intestinal, tejido gastrico, mucosa gastrica, heces, etc. Pueden extraerse muestras de cualquier parte del aparato digestivo, especialmente de los intestinos delgado y grueso. El intestino grueso o colon es la parte del intestino desde el ciego hasta el recto. Se divide en ocho secciones: el ciego, el apendice, el colon ascendente, el colon transverso, el colon descendente, el colon sigmoideo, el recto y el ano. Un lavado de colon es el liquido que queda en el intestino despues de administrar a un paciente un laxante. La mucosa intestinal es el revestimiento en superficie del aparato intestinal. Los sujetos incluyen, por ejemplo, animales, seres humanos, primates no humanos, mamiferos, monos, ganado, ovejas, cabras, cerdos, animales domesticos (por ejemplo, perros, gatos), animales pequeros, reptiles, aves, etc.
Cualquier procedimiento adecuado puede utilizarse para extraer muestras del intestino. La biopsia endoscopica es un procedimiento frecuente en la que se inserta un endoscopio de fibra optica en el aparato digestivo a traves de un orificio natural del cuerpo. Se observa directamente el revestimiento del intestino y se pellizca una muestra con forceps acoplados a un cable largo que discurre en el interior del endoscopio. Los endoscopios e instrumentos adecuados para la extraccion de muestras de biopsia son bien conocidos, e incluyen los dados a conocer en, por ejemplo, las patentes US n° 6.632.182 y n° 6.443.909.
La Tabla 3 resume las bacterias que se han detectado en tejido de mucosa y el lumen de los pacientes de referencia, y los pacientes que tienen la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. La Tabla 5 resume las bacterias que se han detectado en la mucosa y el lumen de pacientes que tienen pouchitis y pouchitis de referencia (pacientes con proctocolectomia restauradora, pero sin complicaciones posoperatorias). Se clonaron amplicones de RCP y se secuenciaron de estas muestras. En resumen, se extrajo ADN de cada muestra mezclada. La mezcla de ADN de la mucosa comprendia ADN de las celulas de la mucosa gastrointestinal y otras celulas gastrointestinales, asi como de las bacterias. Las primeras dos regiones variables del ARN ribosomico 16S se ampliaron utilizando cebadores universales eubacterianos. Posteriormente, la mezcla de ampliacion se separo y se caracterizo en un gel de toma de huellas. La imagen resultante del gel o tabular la compilacion de los datos (veanse, por ejemplo, las Tablas 1, 2 y 4)
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que comprenden bandas individuales, discretas (amplicones de RCP) -puede denominarse la Uhuella de la HLAU. La huella digital de la HLA puede caracterizarse ademas identificando la longitud de cada uno de los replicones que la componen y/o sus secuencias de nucleotidos especificas. Los amplicones de la poblacion microbiana pueden clonarse y secuenciarse a continuacion, cuando la secuencia se correlaciona con un grupo especifico de bacterias, especies o cepa. Utilizando este procedimiento, la abundancia de los clones de cada especie es proporcional a su abundancia en la poblacion correspondiente, y se puede correlacionar con los picos de la huella digital de la HLA. Los datos de la secuencia se pueden utilizar para buscar en la base de datos ribosomica (RDP) utilizando una herramienta de busqueda de secuencias convencional (Megablast) disponible en el Centro Nacional de Informacion Biotecnologica (NCBI) en el NIH. Vease, por ejemplo, J.R. Cole, Chai B., Marsh T.L., Farris R.J., Wang Q., Kulam S.A., Chandra S., McGarrell D.M., Schmidt T.M., Garrity G.M., Tiedje J.M.. El proyecto de base de datos ribosomica (RDP-II): anticipo de un nuevo autoalineador que permite actualizaciones periodicas y la nueva taxonomia procariota. Nucleic Acids Res. 1 de enero de 2003, 31(1):442-3. El numero RDP obtenido de los resultados de la busqueda se puede analizar utilizando una secuencia PERL habitual para clasificar la Division, Subdivision, Grupo y Subgrupo de cada clon, y los resultados pueden tabularse, e importarse en Excel u otras bases de datos adecuadas.
Procedimientos de deteccion de acidos nucleicos
Los procedimientos de deteccion tienen una variedad de aplicaciones, incluyendo aplicaciones para diagnostico, pronostico, forense y para investigacion. Para llevar a cabo la deteccion de acidos nucleicos, un polinucleotido segun la presente invencion se puede utilizar como UsondaU. El termino UsondaU o Usonda de polinucleotidoU tiene su significado habitual en la tecnica, por ejemplo, un polinucleotido que es eficaz para identificar (por ejemplo, por hibridacion), cuando se utiliza en un proceso apropiado, la presencia de un polinucleotido diana para el que esta diserado. La identificacion puede implicar simplemente determinar la presencia o ausencia, o puede ser cuantitativo, por ejemplo, en la evaluacion de las cantidades de un polinucleotido (por ejemplo, copias de un ARN ribosomico) presentes en una muestra. Como se explica con mas detalle mas adelante, se puede utilizar cualquier procedimiento adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, HLA, RCP, secuenciacion de nucleotidos, inmunotransferencia Southern y o micromatrices de ADN (por ejemplo, cuando una micromatriz comprende un gran numero de secuencias especificas para una o mas bacterias de la presente invencion).
Pueden utilizarse ensayos que permiten la cuantificacion y/o deteccion de la presencia o ausencia de un acido nucleico diana en una muestra. Los ensayos pueden llevarse a cabo a nivel de una sola celula, o en una muestra que comprende muchas celulas, en donde el ensayo es la expresion UpromedioU de toda el conjunto completo de celulas y tejido presente en la muestra. Se puede utilizar cualquier formato de ensayo adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, analisis de inmunotransferencia Southern, analisis de inmunotransferencia Northern, reaccion en cadena de la polimerasa (URCPU) (por ejemplo, Saiki et al., Science, 241:53, 1988; patente US n° 4.683.195, n° 4.683.202 y n° 6.040.166; PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Innis et al., eds, Academic Press, Nueva York, 1990), reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (URT-RCPU), RCP anclada, ampliacion rapida de extremos del ADNc (URACEU) (por ejemplo, Schaefer en Gene Cloning and Analysis: Current Innovations, paginas 99-115, 1997), reaccion en cadena de la ligasa (URCLU) (patente EP 320 308), RCP por una sola cara (Ohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:5673-5677, 1989), procedimientos de indexacion (por ejemplo, patente US n° 5.508.169), hibridacion in situ, presentacion diferencial (por ejemplo, Liang et al., Nucl. Acid. Res., 21:3269-3275, 1993; patente US n° 5.262,311, n° 5.599.672 y n° 5.965.409; documento WO 97/18454; Prashar y Weissman, Proc. Natl. Acad. Sci., 93:659-663, y patente US n° 6.010.850 y n° 5.712.126; Welsh et al., Nucleic Acid Res.., 20:4965-4970, 1992, y patente US n° 5.487.985) y otras tecnicas de huellas de ARN, ampliacion basada en la secuencia de acido nucleico (UNASBAU) y otros sistemas de ampliacion basados en la transcripcion (por ejemplo, patente US n° 5.409.818 y n° 5.554.527; documento WO 88/10315), matrices de polinucleotidos (por ejemplo, patente US n° 5.143.854, n° 5.424.186; n° 5.700.637, n° 5.874.219 y n° 6,054,270; documentos PCT WO 92/10092; PCT WO 90/15070), Qbeta Replicasa (documento PCT/US87/00880), Strand Ampliacion con Desplazamiento de cadena (USDAU), Reaccion en Cadena de reparacion (URCRU), ensayos de proteccion de nucleasa, los procedimientos basados en sustraccion, Rapid-ScanT, etc. Otros procedimientos utiles comprenden de manera no limitativa, por ejemplo, procedimientos de ampliacion con plantillas, RCP competitiva (por ejemplo, patente US n° 5.747.251), ensayos basados en redox (por ejemplo, patente US n° 5.871.918), Ensayos basados en Taqman (por ejemplo, Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:7276-7280, 1991; patente US n° 5.210.015 y n° 5.994.063), seguimiento por fluorescencia en tiempo real (por ejemplo, patente US n° 5.928.907), etiquetas moleculares de transferencia de energia (por ejemplo, patente US n° 5.348.853, n° 5.532.129, n° 5.565.322, n° 6.030.787 y n° 6.117.635; Tyagi y Kramer, Nature Biotech., 14:303-309, 1996). Cualquier procedimiento adecuado para el analisis de celulas individuales de expresion de polinucleotido o de proteinas se pueden utilizar, incluyendo la hibridacion in situ, inmunocitoquimica, MACS, FACS, citometria de flujo, etc. Para los ensayos de una sola celula, los productos de expresion se pueden medir utilizando anticuerpos, RCP u otros tipos de ampliacion de acido nucleico (por ejemplo, Brady et al., Methods Mol. & Cell. Biol. 2, 17-25, 1990; Eberrine et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 3010-3014, 1992; patente US n° 5.723.290). Estos y otros metodos se puede llevar a cabo de manera convencional, por ejemplo, como se describe en las publicaciones mencionadas.
Muchos de dichos procedimientos pueden requerir que el polinucleotido este marcadp, o comprenda un tipo de nucleotido concreto util para la deteccion. La presente invencion incluye dichos polinucleotidos modificados que son necesarios para llevar a cabo dichos procedimientos. Por lo tanto, los polinucleotidos pueden ser ADN, ARN, hibridos ADN:ARN, APN, etc., y pueden comprender cualquier modificacion o sustituyente que sea eficaz para conseguir la deteccion.
La presente invencion proporciona procedimientos para diagnosticar o pronosticar la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn o la pouchitis, en un paciente, que comprende, uno o mas de las siguientes etapas en cualquier orden eficaz, por ejemplo, poner en contacto un tejido gastrointestinal o una muestra de lumen que comprende acido nucleico con una sonda de polinucleotidos que es especifica para al menos una bacteria en condiciones eficaces para que dicha sonda se hibride especificamente con dicho acido nucleico, y detectar la hibridacion entre dicha sonda y dicho acido nucleico, en los que la presencia de una o mas bacterias seleccionadas de entre el grupo siguiente dicha bacteria indica la presencia de la enfermedad o el estado de enfermedad de la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn o la pouchitis. El procedimiento puede comprender ademas la obtencion de una muestra de colon, por ejemplo, por biopsia endoscopica y/o la extraccion del acido nucleico de la muestra.
La frase Uespecifico paraU un microbio tiene un significado funcional que indica que la sonda (o anticuerpo si se utiliza en un contexto de proteinas) se puede utilizar para identificar la presencia del microbio objetivo en una muestra y distinguirlo del microbio que no es objetivo. Tambien es especifico en el sentido de que puede utilizarse para detectar microbios objetivo por encima del ruido de fondo (Uunion no especificaU). Esta misma definicion es aplicable tambien a una sonda de polinucleotido o anticuerpo. Las sondas tambien pueden ser descritas como especificas para una secuencia, donde una secuencia especifica es un orden definido de nucleotidos (o secuencias de aminoacidos, si se trata de una secuencia de polipeptido) que se produce en el polinucleotido.
La frase Uhibridar especificamenteU indica que la hibridacion entre polinucleotidos monocatenarios se basa en la complementariedad de secuencia de nucleotidos. Las condiciones eficaces se seleccionan de tal manera que la sonda se hibrida a un acido nucleico diana preseleccionada y/o definida en la muestra. Por ejemplo, si se desea la deteccion de un polinucleotido de un ARN ribosomico, se puede seleccionar una sonda que puede hibridarse con el ARN ribosomico diana en condiciones de alta severidad, sin hibridacion significativa con otras secuencias que no son diana en la muestra. Por ejemplo, pueden seleccionarse de forma rutinaria las condiciones que requieren 100%
o complementariedad completa entre la diana y la sonda.
La puesta en contacto de la muestra con la sonda puede llevarse a cabo por cualesquier medios eficaces en cualesquier medios eficaces. Se puede llevar a cabo en una matriz solida, liquida, congelada, gaseosa, amorfa, solidificada, coagulada, coloide, etc., mezclas de las mismas. Por ejemplo, una sonda en un medio acuoso puede ponerse en contacto con una muestra que esta tambien en un medio acuoso, o que esta fijada a una matriz solida, o viceversa.
Generalmente, tal como se utiliza en toda la memoria, la expresion Ucondiciones eficacesU significa, por ejemplo, el medio concreto en el que se logra el efecto deseado, tal como la hibridacion entre una sonda y su diana, o la union del anticuerpo a una proteina diana. Dicho medio incluye, por ejemplo, tampones adecuados, agentes oxidantes, agentes reductores, pH, cofactores, temperatura, concentraciones de iones, edad adecuada y/o etapa de la celula (tales como, en particular la parte del ciclo celular, o en una etapa especifica en la que se estan expresando los genes especificos) en la que las celulas se estan utilizando, condiciones de cultivo (incluyendo substrato, oxigeno y dioxido de carbono, etc.) Cuando la hibridacion es el medio elegido para conseguir la deteccion, la sonda y la muestra se pueden combinar de tal manera que las condiciones resultantes son funcionales para que dicha sonda se hibride especificamente al acido nucleico en dicha muestra.
Para detectar la presencia de una sonda especificamente hibridada a una diana, se puede utilizar cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, los polinucleotidos se pueden marcar utilizando marcadores radiactivos tales como 32P, 35S, 3H o 14C, por mencionar algunos trazadores utilizados frecuentemente. se puede utilizar tambien marcaje no radiactivo, por ejemplo, biotina, avidina, digoxigenina, antigenos, enzimas o sustancias que tienen propiedades fisicas detectables, tales como la fluorescencia o la emision o absorcion de luz a una longitud de onda deseada, etc.
Se puede utilizar cualquier muestra de ensayo en la que se desea identificar la presencia o ausencia de bacterias, incluyendo, por ejemplo, sangre, orina, saliva, lumen (para la extraccion de acido nucleico, vease, por ejemplo, patente US n° 6.177.251), heces, extensiones compuestas de tejido, tejido de biopsia, secciones de tejidos, celulas cultivadas, lavado intestinal, lavado del colon, mucosa intestinal, etc.
Los resultados para cualquiera de los ensayos mencionados en la presente memoria (incluyendo los ensayos en otras secciones a continuacion) pueden ser con respecto a una muestra de referencia. Por ejemplo, un aumento o disminucion puede ser con respecto (en comparacion) a un lumen normal o muestra de mucosa. La muestra normal puede ser del mismo paciente, pero de una region o periodo no aquejado (por ejemplo, cuando el paciente esta en remision). Tambien puede ser de un valor estandar que se calcula basandose en una poblacion normalizada de individuos. Pueden utilizarse estadisticas estandar para determinar si los valores son significativos.
La presente descripcion tambien proporciona procedimientos para la toma de huellas de acido nucleico de la poblacion de microbios presentes en una muestra, por ejemplo, utilizando cebadores universales para los microorganismos en cuestion, si son eubacterias, arqueobacterias, hongos o protistas. Puesto que cada muestra contiene una poblacion de microbios caracteristica que es representativa de la enfermedad, el muestreo de los acidos nucleicos de los microbios puede producir una variedad caracteristica de fragmentos de polinucleotidos asociados a la enfermedad. Estos pueden presentarse con cualquier caracteristica fisica, incluyendo el tamaro, la secuencia, la movilidad, el peso molecular (por ejemplo, utilizando espectroscopia de masas), etc. Cualquier procedimiento de toma de huellas digitales pueden utilizarse, incluyendo, por ejemplo, AFLP, HLA, LH-RCP, ARISA, RAPD, etc. Las tablas 1, 2 y 4 muestran la frecuencia de los amplicones en diversas muestras de referencia y enfermedad. Aunque un amplicon especifico puede no ser diagnostico de la afeccion el 100% de las veces, la utilizacion de amplicones multiples aumenta la seguridad diagnostica. Por otra parte, cuando se esta haciendo el seguimiento de una afeccion, puede ser ventajoso hacer el seguimiento de una huella digital compleja (tal como se muestra en la Tabla 1) a medida que se diferencia de un tiempo de muestreo a otro.
A lo largo de estas lineas, la presente descripcion proporciona un procedimiento para diagnosticar, pronosticar, o hacer el seguimiento de la evolucion de una enfermedad polimicrobiana (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria del intestino, como la colitis ulcerosa, pouchitis, o enfermedad de Crohn), que comprende uno o mas de las siguientes etapas en cualquier orden eficaz, por ejemplo, realizando una reaccion de ampliacion en una muestra que comprende acido nucleico con al menos dos cebadores sonda de polinucleotidos que son eficaces para la ampliacion de la poblacion microbiana presente en dicha muestra, y detectando los productos de reaccion de dicha reaccion de ampliacion, por lo que dichos productos de reaccion comprenden un patron que indica la presencia de la enfermedad o el estado de la enfermedad.
Por Uestado de enfermedadU, se entiende la afeccion relativa de la enfermedad en comparacion con su estado en un momento anterior. Por ejemplo, cuando los productos de reaccion de la muestra son diferentes (por ejemplo, en cantidad o tamaro) de un periodo de gravedad de la enfermedad, esto indicaria que el estado de la enfermedad del paciente habia cambiado. Los productos de reaccion pueden presentar una diferencia antes de que el paciente realmente manifieste sintomas de la enfermedad, y por lo tanto se puede utilizar como pronostico para predecir una recaida. Asimismo, un cambio en los productos de reaccion tambien puede indicar que la enfermedad esta mejorando y/o responder a un regimen de tratamiento.
El termino UampliacionU indica que las secuencias de acido nucleico aumentan en numero de copias a una suma o cantidad a la que se pueden detectar. La ampliacion se puede llevar a cabo convencionalmente, utilizando cualquier tecnica adecuada, incluyendo la reaccion en cadena de la polimerasa (RCP), NASBA (por ejemplo, utilizando T7 ARN polimerasa), RCL (reaccion en cadena de ligadura), LH-RCP, ARISA.
Los acidos nucleicos totales se puede extraer de una muestra, o la muestra puede ser tratada de tal manera que se extraiga preferentemente acido nucleico solo de los microbios que estan presentes en ella. Las extracciones de ADN se pueden realizar con los kits disponibles en el mercado, tales como el kit Bio101 de Qbiogene, Inc., Montreal, Quebec. Para evitar la contaminacion por multiples muestras durante el proceso de homogeneizacion de una muestra, cada muestra se puede procesar por separado y completamente dando lugar a extracciones de ADN con alto rendimiento.
En determinadas formas de realizacion de la presente invencion, se puede utilizar ARN ribosomico (UARNrU) para distinguir y detectar bacterias. Por ejemplo, los ribosomas bacterianos se componen de una subunidad pequera y una grande, cada una de las cuales esta compuesto ademas de ARN ribosomicos y proteinas. El ARNr de la subunidad pequera puede denominarse SSU ARNr, y de la subunidad mayor LSU ARNr. Un gran numero de ARNr se han secuenciado, y estos estan disponibles al publico en varias bases de datos accesibles. Vease, por ejemplo, Wuyts et al., The European database on small subunit ribosomal RNA, Nucleic Acids Res., 30, 183-185, 2002; Cole et al., The Ribosomal Database Project (RDP-II): previering a ner autoaligner that allors regular updates and the ner prokaryotic taxonomy. Nucleic Acids Res., 31 (1): 442-3, 2003. Vease, tambien, http://rdp.cme.msu.edu/html/ consultado el 14 de junio de 2004. Cualquier ARNr puede utilizarse como marcador, incluyendo, pero sin limitarse a, 16S, 23S y 5S.
Las secuencias de cebador para ARNr pueden diserarse de forma rutinaria para detectar especies especificas de bacterias, o para detectar grupos de bacterias, por ejemplo, cuando una secuencia conservada es caracteristica de un grupo de bacterias. HLA-RCP puede llevarse a cabo de forma rutinaria, por ejemplo, utilizando un cebador directo marcado por fluorescencia 27F (5'-[6FAM] AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') (SEQ ID n° 37) y cebador inverso sin marcar 338R' (5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3') (SEQ ID n° 38). Ambos cebadores son muy especificos para las eubacterias (Lane, D.J., 16S/23S rRNA Sequencing, in Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, E.S.a.M. Goodfellor, Editor. 1991, John Wiley & Sons Ltd:West Sussex, Inglaterra. pags. 115-175).
Pueden utilizarse tambien cebadores que amplian la region correspondiente en Archae (Burggraf, S., T. Mayer, R. Amann, S. Schadhauser, C.R. Woese y K.O. Stetter, Identifying Members of the Domain Archaea rith rRNA-Targeted Oligonucleotide Probes. App. Environ. Microbiol., 1994. 60: pags. 3112-3119), Eucariotas (Roran, R. y
D.A. Porers, Ribosomal RNA sequences and the diversity of symbiotic dinoflagellates (zooxanthellae). Proceedings of the National Academy of Sciences,USA, 1992. 89: pags. 3639-3643) y hongos (Borneman, J. y J. Hartin, PCR primers that amplify fungal rRNA genes from Environmental Samples. App. Environ. Microbiol., 2000. 66 (10): pags. 4356-4360).
Pueden seleccionarse cebadores de cualquier acido nucleico del agente infeccioso, incluyendo de ARNr, ARNt, ADN genomico, etc. Los cebadores pueden ser para regiones variables, helices, regiones conservadas, etc.
Los cebadores seleccionados pueden utilizarse en la heterogeneidad de la longitud del amplicon (UHLAU) para generar huellas digitales que caracterizan a la poblacion bacteriana (Ritchie, N.J., et al., Use of Length Heterogeneity PCR and Fatty Acid Methyl Ester Profiles to Characterize Microbial Communities in Soil. Applied and Environmental Microbiology, 2000. 66(4): pags. 1668-1675; Suzuki, M. M.S. Rappe y S.J. Giovannoni, Kinetic bias in estimates of coastal picoplankton community structure obtained by measurements of small-subunit rRNA gene PCR amplicon length heterogeneity. Applied and Environmental Microbiology [Appl. Environ. Microbiol.]. 1998. 64(11): pags. 45224529; Litchfield, C.D. y P.M. Gillevet, Microbial diversity and complexity in hypersaline environments: A preliminary assesssment. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology [J. Ind. Microbiol. Biotechnol.]. 2002. 28(1): pags. 48-55; Mills, D.K., et al., A Comparison of DNA Profiling Techniques for Monitoring Nutrient Impact on Microbial Community Composition during Bioremediation of Petroleum Contaminated Soils. J. Microbiol. Method, 2003. 54: pags. 57-74).
Pueden utilizarse cebadores individuales o una mezcla, por ejemplo, que comprende secuencias degeneradas, secuencias de uno o mas grupos, reaccion multiple en la que se evaluan diferentes grupos utilizando cebadores marcados con diferentes etiquetas fluorescentes, etc.
Los productos de reaccion (es decir, los fragmentos que se detectan despues de la reaccion de ampliacion) pueden analizarse por analisis estadistico, como por ejemplo el analisis PCO (vease Ejemplos) para determinar que productos que son diagnostico de la enfermedad.
Deteccion de polipeptidos
La presente descripcion tambien proporciona composiciones y metodos para detectar polipeptidos y otras biomoleculas que son caracteristicos de la poblacion microbiana. Por ejemplo, la presente descripcion proporciona procedimientos para diagnosticar o pronosticar la colitis ulcerosa, pouchitis o enfermedad de Crohn, que comprende: una o mas de las etapas siguientes en cualquier orden eficaz, por ejemplo, poner en contacto una muestra que comprende proteina con un anticuerpo que es especifico para una bacteria en condiciones eficaces para que dicho anticuerpo se una especificamente a dichas bacterias, y detectar la union entre dicho anticuerpo y dicha bacteria.
Los polipeptidos se pueden detectar, observar, determinar, cuantificar, etc. segun cualquier metodo eficaz. Los metodos utiles comprenden, por ejemplo, de manera no limitativa, inmunoanalisis, RIA (radioinmunoanalisis), ELISA, (ensayo inmunosorbente con enzima ligada), inmunofluorescencia, citometria de flujo, histologia, microscopia electronica, microscopia de luz, analisis in situ, inmunoprecipitacion, inmunotransferencia Western, etc.
Pueden realizarse inmunoanalisis en liquidos o sobre soporte biologico. Por ejemplo, una muestra (por ejemplo, sangre, lumen, orina, celulas, tejido, fluido del bulbo raquideo, fluidos corporales, etc.) se puede poner en contacto con e inmovilizarse sobre un soporte en fase solida o un vehiculo tal como nitrocelulosa, u otro solido compatible que es capaz de inmovilizar celulas, particulas celulares o proteinas solubles. El soporte se puede lavar despues con tampones adecuados seguido de tratamiento con el anticuerpo especifico de la bacteria marcada de forma detectable. El soporte en fase solida puede lavarse a continuacion con un tampon una segunda vez para eliminar el anticuerpo no unido. La cantidad de marcador unido sobre un soporte solido se puede detectar entonces por medios convencionales.
Un Usoporte o portador en fase solidaU incluye cualquier soporte capaz de unirse a un antigeno, anticuerpo u otro acomparante de union especifica. Los soportes o portadores incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nilon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, y magnetita. Un material de soporte puede tener cualquier configuracion estructural o fisica. Por lo tanto, la configuracion del soporte puede ser esferica, como en una perla, o cilindrica, como en la superficie interior de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una varilla. Alternativamente, la superficie puede ser plana tal como una lamina, tira de ensayo, etc. Los soportes preferidos incluyen perlas de poliestireno.
Una de las muchas maneras en que un anticuerpo especifico de bacterias puede marcarse de forma detectable es enlazandolo a una enzima y utilizandolo en un inmunoanalisis enzimatico (EIA). Vease, por ejemplo, Voller, A., UThe Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)U, 1978, Diagnostic Horizons 2, 1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.); Voller, A. et al., 1978, J. Clin. Pathol. 31, 507-520; Butler, J. E., 1981, Meth. Enzymol. 73,482-523; Maggio, E. (ed.), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla.. La enzima que se une al anticuerpo reaccionara con un sustrato apropiado, preferentemente un sustrato cromogeno, de tal manera como para producir un resto quimico que puede detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotometricos fluorimetricos o visualmente. Las enzimas que se pueden utilizar para marcar de forma detectable el anticuerpo comprenden de manera no limitativa, malato deshidrogenasa, estafilococo nucleasa, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol de levadura deshidrogenasa, .alfa.-glicerofosfato, deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rabano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa glucosa oxidasa, .beta.-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. La deteccion puede realizarse por metodos colorimetricos que emplean un sustrato cromogeno para la enzima. La deteccion tambien puede realizarse por comparacion visual del grado de reaccion enzimatica de un sustrato en comparacion con estandares preparados de manera similar.
La deteccion tambien puede realizarse utilizando cualquiera de varios otros inmunoanalisis. Por ejemplo, mediante marcado radiactivo de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, es posible los peptidos mediante la utilizacion de un radioinmunoanalisis (RIA). Vease, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Marzo, 1986. El isotopo radioactivo puede detectarse por medios tales como la utilizacion de un contador gamma o un contador de centelleo o por autorradiografia.
Tambien es posible marcar el anticuerpo con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado con fluorescencia se expone a luz de la longitud de onda apropiada, su presencia puede detectarse entonces debido a la fluorescencia. Entre los compuestos marcadores fluorescentes mas comunmente utilizados estan el isotiocianato de fluoresceina, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehido y fluorescamina. El anticuerpo tambien puede marcarse de forma detectable utilizando metales emisores de fluorescencia tales como los de la serie de los lantanidos. Estos metales pueden unirse al anticuerpo utilizando grupos quelantes metalicos tales como acido dietilentriamin-pentaacetico (DTPA) o acido etilendiamintetraacetico (EDTA).
El anticuerpo tambien puede marcarse de manera detectable por acoplamiento a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado con quimioluminiscencia se determina entonces detectando la presencia de luminiscencia que aparece durante el curso de una reaccion quimica. Ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes utiles son el luminol, isoluminol, ester de acridinio teromatico, imidazol, sal de acridinio y ester de oxalato.
Del mismo modo, un compuesto bioluminiscente puede utilizarse para marcar el anticuerpo de la presente invencion. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biologicos en los que una proteina catalitica aumenta la eficacia de la reaccion quimioluminiscente. La presencia de una proteina bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes importantes para etiquetado son luciferina, luciferasa y acquorin.
La presente descripcion tambien se refiere a la prevencion y/o tratamiento de afecciones inflamatorias del intestino, en un paciente que lo necesita, que comprende la administracion de lantibioticos, asi como otros compuestos antibacterianos, que son producidos por las bacterias en el aparato digestivo de individuos normales. Puede utilizarse un procedimiento probiotico, en el que se administran las bacterias que producen estos compuestos, en vez de proporcionar los compuestos en formas purificadas.
Como se ha descrito con detalle anteriormente, la poblacion microbiana de pacientes con afecciones inflamatorias del intestino es perturbada. Estas perturbaciones pueden tener profundas consecuencias en la salud del paciente. Algunas bacterias, tales como Ruminococcus sp. producen lantibioticos que tienen efectos protectores y antibacterianos sobre las bacterias patogenas. Por ejemplo, se muestra anteriormente en la Tabla 5 anterior que R. gnavusse se reduce en pacientes que padecen la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. R. gnavus produce un lantibiotico (RumA) que es activo frente a bacterias patogenas. La reduccion en la poblacion de R. gnavus en estos pacientes puede producir el crecimiento de bacterias perjudiciales (tales como bacterias patogenas) que a su vez esta asociada a una respuesta inflamatoria. Por el contrario, determinadas bacterias asociadas a estas afecciones inflamatorias del intestino pueden producir lantibioticos que inhiben bacterias beneficiosas, tales como especies de Lactobacillus. Al proporcionar el lantibiotico (ya sea en forma purificada o como probiotico), los pacientes con estas afecciones pueden tratarse. Cualquier lantibiotico producido por una bacteria descrito en este documento puede utilizarse para prevenir y/o tratar afecciones inflamatorias del intestino. El grupo RDP, el genero representativo, o las especies de las bacterias enumeradas en las Tablas 3 y 5 se pueden utilizar para el diagnostico, pronostico y para el seguimiento de enfermedades de la presente invencion. Por ejemplo, se observo un aumento en una Moraxella osloensis en la mucosa de Crohn en comparacion con la mucosa de referencia. Esta informacion se obtuvo a partir de un clon secuenciado que se origina en la mucosa de un paciente con la enfermedad de Crohn. La secuencia de busqueda de la base de datos RDP version 8.1 (Cole J.R., Chai B., Marsh T.L., Farris R.J., Wang Q., Kulam S.A., Chandra S., McGarrell D.M., Schmidt T.M., Garrity G.M., Tiedje J.M. The Ribosomal Database Project (RDP-II): previering a ner autoaligner that allors regular updates and the ner prokaryotic taxonomy. Nucleic Acids Res. 1 de enero de 2003, 31(1):442-3) (Vease, por ejemplo, rrr en rdp8.cme.msu.edu/html) indicaba que era un miembro del grupo Pseudomonas y afines a RDP, y analisis mas preciso de la secuencia le asigno al genero Moraxella. En el contexto de la presente invencion, el grupo RDP solo, puede utilizarse como indicador de estado de la enfermedad. De este modo, en el ejemplo mencionado anteriormente, la clasificacion de una bacteria como un miembro de Pseudomonas y afines al grupo RDP (independientemente de su clasificacion en genero o especie) es suficiente para indicar que el paciente que alberga la bacteria en su mucosa intestinal es mas probable que padezca la enfermedad de Crohn, o que este en regresion en una remision temporal. Uno o mas grupos pueden utilizarse para el diagnostico. Por lo tanto, con respecto al ejemplo anterior, la determinacion de una poblacion microbiana de un paciente comprende tanto Pseudomonas como afines y las bacterias del grupo Acidovorax indican la existencia de la enfermedad de Crohn. Un analisis similar puede hacerse para todos los grupos RDP descritos en las tablas 3 y 5. Aunque no todas las permutaciones pueden darse a conocer en la aplicacion, pueden seleccionarse de forma rutinaria en las Tablas 3, 5, y en las reivindicaciones adjuntas.
Para cualquier clon dado aislado de un paciente que se sospecha que padece la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, o pouchitis, una identidad del 97% de la secuencia SSU del ARNr con una especie conocida es generalmente suficiente para que se clasifique como esta especie. Asimismo, aproximadamente el 95% de identidad es generalmente suficiente para la clasificacion genero y grupo RDP. La identidad se determino utilizando el algoritmo BLAST (Tatusova, T. A., & Madden, T. L. (1999). BLAST 2 Sequences, a Ner Tool for Comparing Protein and Nucleotide Sequences. FEMS Microbiology Letters, 174, 247-250; Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., et al. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a ner generation of protein database search programs. Nucleic acids research, 1 Sep. 1997, 25(17):3389-402; Wheeler, D. L., Chappey, C., Lash, A. E., Leipe, D. D., Madden, T. L., Schuler, G. D., et al. (2000). Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Res., 28(1), 10-14.).
La presente descripcion proporciona procedimientos de diagnostico, pronostico, y/o seguimiento de la evolucion de la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa o pouchitis, o en un paciente, que comprende: poner en contacto una muestra de tejido de la mucosa de colon que comprende acido nucleico con una sonda de polinucleotidos que es especifica para al menos una bacteria en condiciones eficaces para que dicha sonda se hibride especificamente con dicho acido nucleico, y detectar la hibridacion entre dicha sonda y dicho acido nucleico, en en los que un aumento, en comparacion con una muestra normal de la mucosa, de una o mas especies de bacterias o grupo RDP seleccionados de entre los siguientes indica la presencia de la enfermedad o el estado de la enfermedad: a) enfermedad de Crohn): Morexella sp. del grupo Pseudomonas; Comamonas sp. del grupo Acidovorax; o Cryseobacterium sp.del grupo I de Cytophaga (en el que puede utilizarse el grupo RDP y/o el genero y/o el genero especie); b) colitis ulcerosa: Morexella sp. de Pseudomonas y afines; Comamonas sp. del grupo Acidovorax; Clostridium sp. del grupo Clostridium botulinum; o Enterococus sp. del grupo Enterococcus (en el que puede utilizarse el grupo RDP y/o genero y/o genero especie), o c) pouchitis (en comparacion con la bolsa normal): Ruminococus sp. del grupo Clostridium Coccoides; Escherichia coli y Shigella sp. de los grupos entericos y afines; o Fusobacterium sp. del grupo Fusobacteria (en los que se puede utilizar el grupo RDP y/o el genero y/o el genero especie).
La presente descripcion tambien proporciona procedimientos para el diagnostico, pronostico, y/o seguimiento de la evolucion de las enfermedades de Crohn, colitis ulcerosa o pouchitis, que comprende: poner en contacto una muestra de tejido de la mucosa del colon que comprende acido nucleico con una sonda de polinucleotidos que es especifica para al menos una bacteria en condiciones eficaces para que dicha sonda se hibride especificamente con dicho acido nucleico, y detectar la hibridacion entre dicha sonda y dicho acido nucleico, en los que una disminucion, en comparacion con una muestra de mucosa normal, de una o mas bacterias seleccionadas de entre el grupo siguiente dichas bacterias indican la presencia de la enfermedad o el estado de la enfermedad: a) enfermedad de Crohn: Bacteroides sp.del grupo Bacteroides; Propionibacterium sp.del grupo Propionibacterium; o Ruminoccocus sp.del grupo Clostridium Coccoides (en los que el grupo RDP y/o genero y/o genero especie puede utilizarse); b) la colitis ulcerosa: Bacteroides sp. del grupo Bacteroides; Propionibacterium sp. del grupo Propionibacterium; o Ruminoccocus sp. del grupo Clostridium Coccoides (donde el grupo RDP y/o genero y/o genero especie puede utilizarse), c) pouchitis: Bacteroides sp. del grupo Bacteroides; Propionibacterium sp. del grupo de Propionibacterium (en los que se puede utilizar el grupo RDP y/o el genero y/o el genero especie).
La presente descripcion tambien proporciona procedimientos para el diagnostico, pronostico y/o seguimiento de la evolucion de las enfermedades de Crohn, colitis ulcerosa o pouchitis, en un paciente, que comprende: determinar la presencia de una o mas de las siguientes bacterias en un tejido de la mucosa del colon en un paciente que padece la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, o pouchitis: a) enfermedad de Crohn: Morexella sp. del grupo Pseudomonas; Comamonas sp. Del grupo Acidovorax; o Cryseabacterium sp. del grupo I de Cytophaga (en el que puede utilizarse el grupo RDP y/o el genero y/o el genero especie); b) colitis ulcerosa: Morexella sp. de Pseudomonas y afines; Comamonas sp. del grupo Acidovorax; Clostridium sp. del grupo Clostridium botulinum; o Enterococus sp. del grupo Enterococcus (en el que se puede utilizar el grupo RDP y/o el genero y/o el genero especie), c) pouchitis (en comparacion con la bolsa normal): Ruminococus sp. del grupo Clostridium Coccoides; Escherichia coli y Shigella sp. de los Entericos y grupos afines; o Fusobacterium sp. del grupo Fusobacteria (en el que se puede utilizar el grupo RDP y/o el genero y/o el genero especie).
La presente descripcion tambien proporciona procedimientos para el diagnostico, pronostico y/o el seguimiento de la evolucion de las enfermedades de Crohn, colitis ulcerosa o pouchitis, que comprende: determinar la ausencia de una
o mas de las siguientes bacterias en un tejido de mucosa del colon de un paciente que padece la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, o pouchitis: a) enfermedad de Crohn: Bacteroides sp. del grupo Bacteroides; Propionibacterium sp. del grupo Propionibacterium; o Ruminoccocus sp. del grupo Clostridium Coccoides (en los que puede utilizarse el grupo RDP y/o el genero y/o el genero especie); b) la colitis ulcerosa: Bacteroides sp. del grupo Bacteroides; Propionibacterium sp. del grupo Propionibacterium; o Ruminoccocus sp. del grupo de Clostridium Coccoides (en los que se puede utilizar el grupo RDP y/o el genero y/o el genero especie), c) pouchitis: Bacteroides sp. del grupo Bacteroides; o Propionibacterium sp. del grupo Propionibacterium (en los que se puede utilizar el grupo RDP y/o el genero y/o el genero especie).
La presente descripcion tambien proporciona un procedimiento para el diagnostico, pronostico y/o el seguimiento de la evolucion de la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa, en un paciente, que comprende: poner en contacto una muestra de lumen que comprende acido nucleico con una sonda de polinucleotidos que es especifica para al menos una bacteria en condiciones eficaces para que dicha sonda se hibride especificamente con dicho acido nucleico, y detectar la hibridacion entre dicha sonda y dicho acido nucleico, en la que un aumento, en comparacion con una muestra de lumen normal, de una o mas bacterias seleccionadas de entre las siguiente indica la presencia de la enfermedad o el estado de la enfermedad: a) enfermedad de Crohn: Bacteriodes sp. del grupo Bacteriodes; o Chryseobacterium sp. del grupo I de Cytophaga (en los que puede utilizarse el grupo RDP y/o el genero y/o el genero especie), o b) colitis ulcerosa: Bacteriodes sp. del grupo Bacteriodes; o Chryseobacterium sp. del grupo I de Cytophaga (en los que se puede utilizar el grupo RDP y/o el genero y/o el genero especie).
La presente descripcion tambien proporciona procedimientos para diagnosticar, pronosticar, y/o seguir la evolucion de la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa en un paciente, que comprende: poner en contacto una muestra del lumen que comprende acido nucleico con una sonda de polinucleotidos que es especifica para al menos una bacteria en condiciones eficaces para que dicha sonda se hibride especificamente con dicho acido nucleico, y detectar la hibridacion entre dicha sonda y dicho acido nucleico, en donde una disminucion, en comparacion con una muestra normal de lumen, de Acinetobacter sp. o Moraxella sp. de la Pseudomonas y grupos afines indica que dicho paciente padece la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa (en los que puede utilizarse el grupo RDP y/o el genero y/o el genero especie).
Sin mas elaboracion, se cree que un experto en la tecnica puede, utilizando la descripcion precedente, utilizar la presente invencion en toda su extension. Las siguientes formas de realizacion especificas preferidas deben deben interpretarse, por lo tanto, como meramente ilustrativas, y no restrictivas del resto de la descripcion en modo alguno.
Ejemplos
Recogida de muestras y extraccion de ADN: Se recogieron muestras endoscopicas de tejido de la mucosa del ileon, terminal, ciego+colon ascendente, colon transverso, colon sigmoide y recto de los pacientes con IBD y pouchitis, asi como referencias sanas sometidas a la colonoscopia. Algunas de las muestras de tejido se lavaron en solucion salina antes del analisis para eliminar las bacterias no adherentes (muestras lavadas frente a sin lavar). Tambien se recogieron muestras de lumen conservadas con el endoscopio en el momento del procedimiento. Se tomaron huellas en las muestras para patrones bacterianos en la referencia 4, 2 UC, 4 CD y 3 pacientes con pouchitis, y 5 pacientes con bolsa sin pouchitis utilizando la metodologia HLA. Las extracciones de ADN se realizaron utilizando el kit de suelo Bio101 de Qbiogene, Inc., Montreal, Quebec segun las instrucciones del fabricante. Estos amplicones con HLA se agruparon, a continuacion se clonaron y secuenciaron para identificar los componentes bacterianos que eran indicativos del estado de enfermedad.
Toma de huellas de la heterogeneidad de la longitud del amplicon (HLA): HLA es una tecnica de toma de huellas bacteriana, vease Ritchie, N.J., et al., Use of Length Heterogeneity PCR and Fatty Acid Methyl Ester Profiles to Characterize Microbial Communities in Soil. Applied and Environmental Microbiology, 2000. 66(4): p. 1668-1675; Suzuki, M., M.S. Rappe y S.J. Giovannoni, Kinetic bias in estimates of coastal picoplankton community structure obtained by measurements of small-subunit rRNA gene PCR amplicon length heterogeneity. Applied and Environmental Microbiology [Appl. Environ. Microbiol.]. HLA es un analisis basado en RCP que puede distinguir diferentes organismos basandose en variaciones naturales en la longitud de las secuencias de ADN ribosomico 16S. ADN purificado (10 ng) se amplio con RCP utilizando un cebador directo marcado con fluorescencia 27F (5'-[6FAM] AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3') y un cebador inverso sin marcar 338R' (5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'). Ambos cebadores son muy especificos para las eubacterias. Alternativamente, los autores disponen de cebadores que amplian la region correspondiente en Archae vease Burggraf, S., T. Mayer, R. Amann, S. Schadhauser, C.R. Woese y K.O. Stetter, Identifying Members of the Domain Archaea rith rRNA-Targeted Oligonieleotide Probes. App. Environ. Microbiol., 1994. 60: pags. 3112-3119. Recientemente los autores han optimizado cebadores especificos para la ITS de hongos y demostraron que esa region del operon de ARNr tiene mas informacion que la SSU ARNr vease Borneman, J. y J. Hartin, PCR primers that amplify fungal rRNA genes from Environmental Samples. App. Environ. Microbiol., 2000. 66(10): pags. 4356-4360. Las reacciones se realizaron con mezclas de 50 1l (volumen final) que contenia 1 x tampon de RCP, albumina de suero bovino al 0,6%, MgCl2 1,5 mM, cada trifosfato de desoxinucleotido a una concentracion de 0,2 mM, cada cebador a una concentracion de 0,2 1M, y 2 U de Taq ADN polimerasa. La desnaturalizacion inicial a 94°C durante 3 min fue seguida de 25 ciclos que consisten en la desnaturalizacion a 94°C durante 45 segundos, hibridacion a 55°C durante 45 s, y ampliacion a 72°C durante 2 min. Habia una etapa de ampliacion final que consta de 72°C durante 7 min. Las muestras con HLA se almacenaron a 20°C en la oscuridad hasta su utilizacion (generalmente menos de 1 semana).
Los productos HLA de RCP se separaron en el secuenciador capilar fluorescente SCE9610 (Spectrumedix LLC, State College, AP) y se analizaron con el paquete del programa informatico GenoSpectrum. El programa informatico convierte los datos de fluorescencia en electroferogramas. Los picos de los electroferogramas representan diferentes poblaciones de microflora de diferentes tamaros. Todos los datos de huellas se analizaron utilizando el programa informatico (Interleave 1.0, BioSpherex LLC) que combina datos de varias pasadas, entrelaza los diferentes perfiles, normaliza los datos, y calcula indices de diversidad. Las areas normalizadas de los picos se calcularon dividiendo cada una de las areas de los picos por el area total del pico en ese perfil.
El analisis de huellas con HLA: La diversidad de las huellas con HLA se analizo utilizando indices de riqueza (R), equitatividad (E) y el indice de diversidad Shamnon-Weaver (SW) en los grupos comparando IBD con las referencias, vease Hughes, J.B., et al.,, Counting the Uncountable: Statistical Approaches to Estimating Microbial Diversity. App. Environ. Microbiol., 2001. 67(10): pags. 4399-4406. Los parametros relacionados con la IBD como la actividad de la enfermedad, y las partes histologicamente involucradas y no involucradas del ileon y del colon se compararon con los indices de diversidad.
Estas huellas se analizaron para determinar la agrupacion globial de las huellas con HLA en presencia o ausencia de IBD, tipos de IBD (CD, UC y pouchitis), actividad de la enfermedad, y las partes iinvoluadas y no involucradas del ileon y colon (estado del tejido). Analisis Multidimensional de Reducciones [Analisis de Componentes Principales (PCA), analisis de coordenadas principales (PCO), Analisis de Correspondencia Canonica (CCA)] y el analisis de agrupamiento se realizo utilizando el paquete estadistico multivariable (MVSP), Kovach Computing Services, Gales, Reino Unido. Los siguientes analisis se llevaron a cabo. Generacion de dendogramas por el metodo no ponderado de grupo par con medias aritmeticas (UPGMA).
Analisis de Componentes Principales (PCA): PCA es uno de los metodos de ordenacion mas conocido y el mas antiguo, descrito por primera vez por Karl Pearson (1901). Graficamente, es una rotacion de un enjambre de puntos de datos en el espacio multidimensional de manera que el eje mas largo (el eje con la mayor varianza) es el primer eje de PCA, el segundo eje mas largo perpendicular al primero es el segundo eje PCA y asi sucesivamente. Los pocos primeros ejes PCA representan la mayor cantidad de variacion en el conjunto de datos. Los primeros dos o tres ejes es de esperar que en general representen una gran proporcion de la varianza, por ejemplo, 50-60% o mas.
Analisis de Coordenadas Principales (PCO): PCO puede verse como una forma mas general del PCA. PCO puede utilizar varias medidas diferentes de distancia o similitud. En general, las distancias o similitudes se miden entre los casos directamente, en lugar de las variables como en PCA. La principal ventaja de PCO es que se pueden utilizar muchos tipos diferentes de medidas de similitud o distancia. PCO esta restringido a analizar distancias o similitudes que son metricas y las distancias utilizadas deben poderse ver de alguna manera geometrica sensible por ejemplo, un triangulo.
Analisis de correspondencia can�nica (CCA): En PCA y PCO, los datos se someten a algun tipo de manipulacion matematica a fin de poner de manifiesto las tendencias mas importantes. Estas tendencias se comparan entonces a menudo con otros datos relativos a las mismas muestras para determinar la relacion entre los dos. Sin embargo, en el CCA, los datos estan directamente relacionados. CCA es un metodo analitico multivariado de gradiente directo que ha llegado a utilizarse muy ampliamente en ecologia.
Analisis por grupos: El analisis por grupos es un termino utilizado para describir un conjunto de tecnicas numericas en las que el principal objetivo es dividir los objetos de estudio en grupos separados. Estos grupos se basan en las caracteristicas de los objetos y se espera que los grupos tengan algun tipo de significacion en relacion con las cuestiones de investigacion que se piden. El analisis por grupos se utiliza en muchas disciplinas cientificas y se ha desarrollado una amplia variedad de tecnicas para adaptarse a diferentes tipos de enfoques. Los mas comunmente utilizados son los metodos jerarquicos de aglomeracion. Los metodos jerarquicos organizar los grupos en una jerarquia de modo que las relaciones entre los diferentes grupos son evidentes y los resultados se presentan en un diagrama tipo arbol, denominado dendrograma. Los metodos de aglomeracion utilizados para crear un dendograma empiezan combinando sucesivamente los objetos mas similares hasta que todos estan en un solo grupo jerarquico. Del mismo modo los dendogramas se pueden crear utilizando el Metodo de grupo par no ponderado bien demostrado que utiliza medias aritmeticas (UPGMA) y medios K.
Se identificaron supuestos patrones de huellas digitales con HLA (es decir, presencia o ausencia de determinados picos de ampliacon) asociados a la presencia de IBD, a los tipos de enfermedades, a la actividad de la enfermedad y al estado de los tejidos. Con este objeto, los autores inspeccionaran a simple vista los histogramas de las huellas con HLA. Para determinar las correlaciones estadisticas de los picos con las variables relacionadas con IBD, los autores utilizaron tambien el analisis multivariante para grandes conjuntos de variables, es decir analisis discriminado y analisis de correspondencia canonica. Se emplearon tambien herramientas de mineria de datos informatizados con algoritmos de reconocimiento de patrones supervisados y no supervisados. Estos incluyen C4.5, maquinas de vectores soporte y planos de autoorganizacion. Por lo tanto, estos analisis se utilizaran para determinar si las huellas con HLA pueden distinguir entre parametros relacionados con IBD (presencia de enfermedad, tipo, actividad, estado del tejido) y determinar patrones especificos con HLA (presencia o ausencia de un pico o conjuntos de picos) asociados a IBD.
Secuenciacion de clones con HLA: El producto de la RCP generado con cebadores utilizados para la huella con HLA se clonaron utilizando pGEM-T Easy Vector System II (Promega Corp., Madison, WI). Los clones se seleccionaron evaluando inserciones que utilizan la complementacion alfa con �-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indoil-B-Dgalactopiranosido) e IPTG (isopropil-BD-tiogalactopiranosido). Las inserciones se secuenciaron utilizando la quimica del colorante terminador Taq y los productos de secuenciacion se separaron en un secuenciador capilar fluorescente SCE9610.
Analisis de los datos de clones con HLA: Las secuencias anteriores de clones con HLA se compararon con las secuencias en la base de datos RDP para evaluar patrones de microflora utilizando un nuevo programa (CloneID 1.0, BioSpherex LLC). El algoritmo utiliza basicamente Megablast para comparar los datos de la secuencia de clones con la base de datos RDP y compila una tabla con los numeros de RDP para correlacionar la identificacion con un esquema de clasificacion jerarquica. De estos mismos clones con HLA se tomaron sus huellas digitales para determinar el tamaro HLA empirico y se correlacionaron con la huella con HLA original de la muestra utilizando un segundo programa (CloneMatch 1.0, BioSpherex, LLC).
Resultados de analisis de Crohn (CD) y colitis ulcerosa (UC)
Aunque las huellas con HLA varian cualitativa y cuantitativamente entre los individuos, existen patrones de diagnostico muy diferentes que se pueden ver procedentes del analisis de muestras de tejidos combinados (mucosa) y de lumen. La figura 1 es un histograma compilado de la media de la huella con HLA de todas las muestras de Crohn y muestras de referencia (es decir, todos los individuos y todas las posiciones) que muestra las longitudes de amplicon en pares de bases (pb) en el eje x y las abundancias relativas en el eje y. Las muestras tisulares combinadas de las referencias (barras blancas) tenian el perfil con HLA muy distinto que difieren drasticamente de las muestras de lumen de referencia (barras negras) lo que indican que hay una poblacion microflora distinta que se adhiere a la mucosa como un biofilme. En cambio no habia una clara diferenciacion entre la microflora del lumen y del tejido en la enfermedad de Crohn lo que indica una disbiosis drastica en la que muchas de las especies de bacterias normalmente en el lumen se encuentran en el biofilme. Por lo tanto, existe mucha mas superposicion entre los amplicones con HLA de tejido de Crohn (barras gris claro) y el lumen de Crohn (barras gris oscuro) con lumen de referencia (barras negras). Existen amplicones con HLA para diagnostico que se producen principalmente en las muestras de lumen de referencia y el tejido de Crohn (es decir, en 333,0 pb, 334,3 pb y 338,6 pb). Ademas, existen algunos amplicones con HLA que son exclusivos para el tejido de Crohn (es decir 310,9 pb y 313,4 pb), pero por termino medio, representan una proporcion pequera de la poblacion de microflora.
Del mismo modo, parece que existen disbiosis en la colitis ulcerosa (UC) ya que los perfiles con HLA de tejido con UC y lumen de UC son similares para el lumen de referencia al perfil con HLA de las referencias que son muy distintas (Figura 2). Por lo tanto, habia mucha mas superposicion entre los amplicones con HLA de tejido con UC (barras gris claro) y lumen con UC (barras gris oscuro) con lumen de referencia (barras negras). Algunos de los amplicones con HLA de diagnostico que se observaron en CD (vease mas arriba) son los mismos amplicones que son para diagnostico en UC (es decir, a 333,0 pb, 334,3 pb y 338,6 pb). Ademas, hay diferentes amplicones de HLA que se producen solo en el tejido de UC (es decir, 334,6 pb).
Cuando las diferencias de caracter medio para los perfiles con HLA de referencias, CD y UC se examinaron utilizando el Analisis de Coordenadas Principales (PCO), pueden observarse patrones drasticos de agrupamiento para UC y CD que son distintos de las muestras de referencia (figura 3). Los autores observan claramente distinta agrupacion de perfiles con HLA de referencia en el 1er cuadrante, grupos con UC en el 3er 4° cuadrantes, y CD se agrupan principalmente en el 2° cuadrante. Tambien es importante observar que las muestras de lumen se agrupan en el 3er y 4° cuadrantes asociado a la UC. Hay tambien varios perfiles con HLA de Crohn que se agrupan en estos 3er y 4° cuadrantes lo que sugiere que hay variacion en la microflora del tejido de Crohn y que, en muestras especificas, estos perfiles con HLA son similares a los de la UC.
El PCA y los analisis de correspondencia canonica demuestran una agrupacion similar de referencias sanas independientes de los pacientes con EC y UC. Los dendogramas producidos con la agrupacion UPGMA utilizando una medida de distancia Jacard tambien muestran los mismos patrones generales que el analisis PCO.
Se han clonado y secuenciado amplicones con HLA mezclados de muestras de UC, CD y de referencias sanas y estos datos de secuencia se utilizaron para identificar las especies bacterianas asociadas a cada enfermedad. La tabla 1 resume los principales grupos bacterianos basado en el esquema de clasificacion de RDP que se producen con una frecuencia de mas del 5% de la poblacion de microflora. Los datos apoyan los perfiles con HLA en la microflora que se encuentra en la superficie de la mucosa de tejido con CD y UC se asemejan a la composicion de la microflora de lumen en individuos sanos y que esta composicion difiere de la composicion de la microflora de la mucosa de las referencias. En concreto, los miembros de las Pseudomonas, tales como Moraxella sp. y miembros del grupo Acidovorax tal como Comoamonas sp. estan asociados con el lumen de referencia, lumen con CD, mucosa con CD, lumen con UC y la mucosa con UC. Ademas, los miembros del grupo Cyotphaga tal como Chryseobacterium balustinum estan asociados a la mucosa con CD, lumen con CD y lumen con UC. Por ultimo, los miembros tanto del grupo Clostridium (Clostridium paraputrificum) como Enterococcus (Enterococcus hirae) tambien estan asociados a la mucosa con UC. Se observa asimismo una disminucion cuantitativa en el grupo de Bacteroides en la mucosa con UC y la mucosa con CD en comparacion con la mucosa de referencia. En resumen, podemos concluir que existen especies bacterianas que estan asociadas en el biofilme con CD y el biofilme con UC que se encuentran normalmente en el lumen y que esto indica disbiosis grave.
Resultados de analisis de pouchitis
La figura 4 es un histograma compilado a partir de la media de la huella de HLA de todas las muestras con pouchitis (AP) y las muestras de bolsa normal (NP), es decir muestras de pacientes con pouchitis activa (AP) y pacientes con una bolsa pero que son normales en el examen (NP). Como se aprecia en CD y UC, las muestras mezcladas de mucosa con NP (barras blancas) tenian el perfil con HLA muy distinto que diferia drasticamente de las muestras de mucosa con NP (barras negras) que indican que existe una poblacion de microflora distinta que se adhiere a la mucosa como un biofilme. Ademas, los perfiles de amplicon con HLA de las muestras de NP fueron diferentes de los pacientes de referencia sanos que no tenian una bolsa. Existen amplicones con HLA para diagnostico que se producen predominantemente en las muestras de mucosa con AP (es decir, a 309,2 pb, 310,0 pb, 310,9 pb, 331,2 pb, 350,2 pb, y 359,6 pb) que no son los amplicones con HLA predominantes de diagnostico en CD y UC. Por lo tanto, la disbiosis en la pouchitis parece ser muy diferente que en CD y UC y puede implicar diferentes patologia. Ademas, los componentes reales de la poblacion en la enfermedad varian de un individuo a otro. Por ejemplo, los amplicones con HLA en 309,2 pb, 310,0 pb, 310,9 pb son los principales componentes en un paciente, pero solo son componentes menores de otros. Es importante destacar que los pacientes con bolsa normal tienen contenido anormal de microflora en el biofilme de la mucosa y estos pacientes pueden estar continuamente en un estado semipatologico.
Cuando las diferencias medias de caracter para los perfiles con HLA de muestras de NP y AP se examinaron utilizando el analisis de coordenadas principales (PCO), un patron de agrupamiento general puede observarse para NP en el centro de la grafica que es distinto de los tres grupos de muestras con AP (figura 5 ). Curiosamente, cada uno de estos grupos de AP son de pacientes independientes lo que confirma que los pacientes con pouchitis presentan mucha mas variacion en la microflora en el biofilme de la mucosa. Cabe seralar que el grupo separado encontrado en el eje Y por encima del grupo de bolsa normal es el paciente que presentaba los amplicones con HLA distintos a 309,2 pb, 310,0 pb y 310,9 pb. El grado de actividad de la enfermedad se puede reflejar en la medida de disbiosis representada en lel diagrama de PCO. Ademas, el patron es coherente si las muestras se han lavado o no se han lavaron en solucion salina como es el caso en las muestras de CD y de UC.
Se han clonado y secuenciado amplicones con HLA mezclados de muestras de mucosas con NP y AP y estos datos de secuencia se utilizaron para identificar las especies bacterianas asociadas a cada enfermedad. La tabla 1 resume los principales grupos bacterianos basandose en el esquema de clasificacion de RDP que se produce a una frecuencia de mas del 5% de la poblacion de microflora. Los datos apoyan los perfiles con HLA porque las microfloras que se encuentran en la superficie de la mucosa tanto de tejido con AP como con NP son diferentes de las que se encuentran en individuos sanos y estos no reflejan la microflora encontrada en lumen normal como la encontrada en CD y UC. Especificamente, los miembros del grupo Clostridium (es decir Clostridium paraputrificum), los miembros de entericos (es decir, E. coli y Shigella sp.)y los miembros del grupo Streptococcus (es decir, Streptococcus brevis) se encuentran asociado a la mucosa de pacientes con NP. Por otra parte, la microflora asociada a la mucosa en pacientes con AP era muy diversa y se diferenciaba de la de los pacientes con NP. Especificamente, los autores observaron que los miembros de los Entericos (es decir E. coli y Shigella sp.) y del grupo Fusobacterium (es decir, Fusobacterium varium) estaban asociados a la mucosa en los pacientes con AP y que habia una perdida drastica de miembros del grupo Streptococci (es decir Streptococcus brevis). Ademas, una especie diferente Ruminococcus (Ruminococcus obeum) estaba asociada a pacientes con AP, pero no esta claro que esta cepa diferente contribuyese a la patologia. En resumen, parece que tanto los pacientes con NP como con AP tienen disbiosis en comparacion con las referencias normales, y que hay una perdida dramatica de estreptococos en los pacientes con AP. Por otra parte, parece ser especifico del paciente (vease figura 5) huellas con HLA, lo que sugiere una variacion significativa en la microflora entre los pacientes.
Correlacion de amplicones con HLA y microflora
Se ha correlacionado el tamaro del amplicon con HLA determinado experimentalmente de clones con las identificaciones obtenidas a partir de esta secuenciacion. Por ejemplo, se han marcado los amplicones principales en las huellas con HLA de pouchitis y bolsa normal del histograma en la figura 6. A continuacion, se utilizan esta informacion para correlacionar que especies bacterianas estan en los picos de diagnostico de los perfiles con HLA.
Los ejemplos anteriores pueden repetirse con exito similar sustituyendo los reactivos descritos generica o especificamente y/o las condiciones de operacion de la presente invencion por los utilizados en los ejemplos anteriores.
Tabla 1 Aumento o disminucion de amplicones con huellas con HLA superior al 5% en mucosa de Crohn frente a mucosa de referencia
Tamaro de 333,0 334,3 336,2 337,6 338,6 340,2 341,9 342,6 343,6 347,3 347,9 349,3 351,6 358,3 amplicon (pb)
Mucosa de 2% 1% 6% 6% 12% 1% 4% 11% 21% 16% 5% referencia Mucosa de 20% 7% 2% 3% 2% 3% 5% 6% 1% 31% 1% referencia Aumento en la 333,0 334,3 338,6 343,6 mucosa de Crohn Disminucion en la 340,2 341,9 342,6 347,9 347,9 349,3 351,6 358,3 mucosa de Crohn
Tabla 2 Aumento o disminucion de amplicones con huellas con HLA mayores del 5% en la mucosa con colitis ulcerosa frente a la mucosa de referencia
Tamaro de amplicon (pb)
333,0 334,3 340,2 341,9 342,6 347,9 349,3 351,6 358,3
Mucosa de referencia
6% 6% 12% 11% 21% 16% 5%
Mucosa con UC
39% 13% 9% 3% 7% 7%
Aumento en la mucosa con UC
333,0 334,3 340,2
Disminucion en la mucosa con UC
341,9 342,6 347,9 349,3 351,6 358,3
TABLA 3 Especies bacterianas asociadas a pouchitis
�R�P� RDP
Ejemplo de ��nero especie �ucosa de re erencia umen de re erencia _olsa normal �ucosa de pouc�itis
GRUPO BACTEROIDES (2.15.1.2.8)
Bacteroides vulgatus M a M �
GRUPO BACTEROIDES (2.15.1.2.7)
Bacteroides distasonis M M
GRUPO PROPIONIBACTERIUM (2.30.1.10.1)
Propionibacterium acnes M M
GRUPO CLOSTRIDIUM COCCOIDES (2.30.4.1.4)
Ruminococcus gnavus M M M Aa M M
GRUPO CLOSTRIDIUM COCCOIDES (2.30.4.1.1)
Ruminococcus obeum M Ab
PSEUDOMONAS Y AFINES (2.28.3.13.1.6)
Acinetobacter junii M AM
PSEUDOMONAS Y AFINES (2.28.3.13.1.1)
Moraxella osloensis M bA
GRUPO ACIDOVORA� (2.28.2.9.4.14)
Comamonas sp M Ab
GRUPO ACIDOVORA� (2.28.2.9.4.1)
Comamonas terrigena M A_
GRUPO CYTOPHAGA I (2.15.1.3.6)
Chryseobacterium balustinum
GRUPO CLOSTRIDIUM BOTULINUM (2.30.9.2.11.14)
Clostridium paraputrificum M M
GRUPO ENTEROCOCCUS (2.30.7.20)
Enterococcus hirae
ENT�RICOS Y AFINES (2.28.3.27.2)
E. coli/Shigella sp M A M AA
GRUPO STREPTOCOCCI (2.30.7.21.6)
Streptococcus bovis M ab
GRUPO FUSOBACTERIA (2.29.5)
Fusobacterium varium M A�
Tabla 4 Aumento o disminucion de amplicones con huellas con HLA mayores del 5% en mucosa con pouchitis frente a bolsa normal Tamaro de amplicon (pb) 309,2 310,0 310,9 329,8 331,2 340,2 341,9 342,6 349,3 350,2 356,6 357,5 359,6
Bolsa normal 1% 5% 2% 11% 11% 17% 32% 5% 1% Pouchitis 17% 5% 5% 7% 7% 5% 2% 9% 6% 19% 1% 6% Aumento en pouchitis 309,2 310,0 310,9 331,2 340,2 350,2 356,6 359,6 Disminucion en pouchitis 329,8 341,9 342,6 349,3 357,5
TABLA 5 Especies bacterianas asociadas a la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa
�R�P� RDP
Ejemplo de �nero especie �ucosa dere erencia umen dere erencia �ucosa deCro�n umendeCro�n ucosa de �C umen de �C
GRUPO BACTEROIDES (2.15.1.2.8)
Bacteroides vulgatus M a M A M M�
GRUPO BACTEROIDES (2.15.1.2.7)
Bacteroides distasonis M M
GRUPO PROPIONIBACTERIUM (2.30.1.10.1)
Propionibacterium acnes M M
GRUPO CLOSTRIDIUM COCCOIDES (2.30.4.1.4)
Ruminococcus gnavus M M
GRUPO CLOSTRIDIUM COCCOIDES (2.30.4.1.1)
Ruminococcus obeum
PSEUDOMONAS Y AFINES (2.28.3.13.1.6)
Acinetobacter junii M AM
PSEUDOMONAS Y AFINES (2.28.3.13.1.1)
Moraxella osloensis M bA M � M A_ M AM M aM
GRUPO ACIDOVORA� (2.28.2.9.4.14)
Comamonas sp M Ab M Aa M A� M A� M Ab
GRUPO ACIDOVORA� (2.28.2.9.4.1)
Comamonas terrigena M A_ M � M �a M a M A
GRUPO CYTOPHAGA I (2.15.1.3.6)
Chryseobacteriumbalustinum M M M M M AA
GRUPO CLOSTRIDIUM BOTULINUM (2.30.9.2.11.14)
Clostridium paraputrificum M M
GRUPO ENTEROCOCCUS (2.30.7.20)
Enterococcus hirae M M
ENT �RICOS Y AFINES (2.28.3.27.2)
E. coli/Shigella sp
GRUPO STREPTOCOCCI (2.30.7.21.6)
Streptococcus bovis
GRUPO FUSOBACTERIA (2.29.5)
Fusobacterium varium
TA_ A
REFERENCIA DE RDP
SEC. ID. n° �NNER� ESPECIE
2.28-3.13.1.6
14 Acinetobacter Junii
2.15.1.2.7
1 Bacteroides distasonis
2.15.1.2.8
2 Bacteroides fragilis
2.15.1.2.8
3 Bacteroides ovatus
2.15.1.2.8
4 Bacteroides vulgatus
2.15.1.3.6
17 Bergeyella zoohelcum
2.15.1.3.6
18 Chryseobacterium balustinum str. SBR1044
2.15.1.3.6
19 Chryseobacterium balustinum str. SBR2024
2.28.2.9.4.1
16 Comamonas terrigena
2.28.2.9.4.14
15 Comamonas sp.
2.28.3.13.1.1
11 Moraxella cuniculi
2.28.3.13.1.1
12 Moraxella lacunata
2.28.3.13.1.1
13 Moraxella osloensis
2.28.3.27.2
25 Escherichia coli
2.28.3.27.2
26 Salmonella bovis
2.28.3.27.2
27 Shigella boydii
2.28.3.27.2
28 Shigella dysenteriae
2.28.3.27.2
29 Shigella flexneri
2.29.5
34 Fusobacterium alocis
2.29.5
35 Fusobacterium nucleatum
2.29.5
36 Fusobacterium varium
2.30.1.10.1
5 Propionibacterium acnes
2.30.4.1.1
10 Clostridium sp.
2.30.4.1.4
6 Clostridium nexile
2.30.4.1.4
7 Eubacterium formicigenerans
2.30.4.1.4
8 Ruminococcus gnavus
2.30.4.1.4
9 Pares Ruminacoccus
2.30.7.20
21 Enterococcus cecorum
2.30.7.20
22 Enterococcus columbae
2.30.7.20
23 Enterococcus hirae
2.30.7.20
24 Tetragenococcus halophilus
2.30.7.2.1.6
30 Streptococcus bovis
2.30.7.21.6
31 Streptococcus infantarius
2.30.7.21.6
32 Streptococcus salivarius
2.30.7.21.6
33 Streptococcus thermophilus
2.30.9.2.11.4
20 Clostridium paraputrificum
istado de secuencias
<110> GEORGE MASON UNIVERSITY 10 <120> COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNOSTICO DE TRASTORNOS DEL COLON
<130> GMU-001-WO
<140> 15 <141>
<150> 60/646,592
<151> 2005-01-26 20 <150> 60/673,771
<151> 2004-11-01
<160> 38 25 <170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1489
<212> ARN
<213> Bacteroides distasonis
<220>
<221> modified base
<222> (39)..(39)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (99) .. (99)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (101)..(101)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (108)..(108)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (235)..(235)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (482)..(482)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (656)..(656)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (932)..(932)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (936)..(936)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1160)..(1160)
<223> n es a, c, g, o u
<400> 1 5 <210> 2
<211> 1533
<212> ARN
<213> Bacteroides fragilis
10 <400> 2 5 <210> 3
<211> 1468
<212> ARN
<213> Bacteroides ovatus
10 <220>
<221> modified base
<222> (204)..(207)
<223> n es a, c, g, o u
15 <220>
<221> modified base
<222> (339)..(339)
<223> n es a, c, g, o u
20 <220>
<221> modified base
<222> (439) .. (439)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (530) .. (530)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (544) .. (544)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (700) .. (700)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (739)..(739)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (788)..(788)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (953)..(953)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (962)..(962)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (988)..(988)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1031)..(1031)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1084)..(1084)
<223> n es a, c, g, o u
<400> 3 <210> 4
<211> 1524
<212> ARN
<213> Bacteroides vulgatus
<220>
<221> modified base
<222> (35) .. (35)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (97) .. (97)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (99)..(99)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (395)..(395)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (481) .. (481)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (544)..(544)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (744)..(744)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (932)..(932)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1204)..(1204)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1255)..(1255)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1499)..(1499)
<223> n es a, c, g, o u
<400> 4
<210> 5
<211> 1173 5 <212> ARN
<213> Propionibacterium acnes
<400> 5
<210> 6 15 <211> 1517
<212> ARN
<213> Clostridium nexile
<220>
5 <221> modified base
<222> (184)..(185)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
10 <221> modified base
<222> (341)..(341)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
15 <221> modified base
<222> (430)..(430)
<223> n es a, c, g, o u
<400> 6 20
<210> 7
<211> 1480
<212> ARN
<213> Eubacterium formicigenerans
<220>
<221> modified base
<222> (1) .. (1)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (124) .. (126)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (221)..(223)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (288)..(288)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (350)..(351)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (518)..(518)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (535) .. (536)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (726)..(726)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (919)..(919)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (922)..(922)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (956)..(957)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1185)..(1186)
<223> n es a, c, g, o u
<400> 7 <210> 8
<211> 1423
<212> DNA
<213> Ruminococcus gnavus
<220>
<221> modified base
<222> (1148)..(1148)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> modified base
<222> (1188)..(1188)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> modified base
<222> (1257)..(1257)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 8 <210> 9
<211> 1418
<212> DNA
<213> Ruminococcus torques
<220>
<221> modified base
<222> (724) .. (724)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> modified base
<222> (771)..(771)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> modified base
<222> (776)..(776)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221> modified base
<222> (807)..(807)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 9
<210> 10 10 <211> 1458
<212> ARN
<213> Clostridium sp.
<400> 10 15 5 <210> 11
<211> 728
<212> ARN
<213> Moraxella cuniculi
10 <400> 11
<210> 12
<211> 1519
<212> ARN
<213> Moraxella lacunata
<400> 12
<210> 13
<211> 1448
<212> ARN
<213> Moraxella osloensis
<400> 13
<210> 14
<211> 452
<212> ARN
<213> Acinetobacter junii
<400> 14
<210> 15 15 <211> 1488
<212> ARN
<213> Comamonas sp.
<400> 15 20 5 <210> 16
<211> 1520
<212> ARN
<213> Comamonas terrigena
10 <220>
<221> modified base
<222> (623)..(623)
<223> n es a, c, g, o u
15 <220>
<221> modified base
<222> (630)..(630)
<223> n es a, c, g, o u
20 <400> 16 5 <210> 17
<211> 1476
<212> ARN
<213> Bergeyella zoohelcum
10 <220>
<221> modified base
<222> (138)..(138)
<223> n es a, c, g, o u
15 <220>
<221> modified base
<222> (141) .. (143)
<223> n es a, c, g, o u
20 <220>
<221> modified base
<222> (183)..(183)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (278) .. (278)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (285) .. (285)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (317)..(318)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (341) .. (342)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (344)..(344)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (528) .. (528)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (532)..(533)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (542)..(542)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (547)..(547)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (737)..(737)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (766)..(767)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (965)..(966)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1022)..(1022)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1085)..(1086)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1096)..(1096)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1205)..(1205)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1288)..(1289)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1384)..(1384)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1406)..(1406)
<223> n es a, c, g, o u
<400> 17
<210> 18
<211> 395 5 <212> ARN
<213> Chryseobacterium balustinum str. SBR1044
<220>
<221> modified base 10 <222> (343) .. (343)
<223> n es a, c , g, o u
<400> 18
<210> 19
<211> 395
<212> ARN 20 <213> Chryseobacterium balustinum str. SBR2024
<220>
<221> modified base
<222>
(11) .. (11) 25 <223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222>
(14) .. (14) 30 <223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222>
(17)..(18) 35 <223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222>
(310)..(310) 40 <223> n es a, c, g, o u
<400> 19 <210> 20
<211> 1435 5 <212> ARN
<213> Clostridium paraputrificum
<400> 20
<210> 21 15 <211> 1509
<212> ARN
<213> Enterococcus cecorum
<400> 21
5 <210> 22
<211> 1493
<212> ARN
<213> Enterococcus columbae
10 <220>
<221> modified base
<222> (33)..(33)
<223> n es a, c, g, o u
15 <220>
<221> modified base
<222> (103)..(103)
<223> n es a, c, g, o u
20 <220>
<221> modified base
<222> (158)..(158)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (194)..(196)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (209) .. (209)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (230)..(230)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (254)..(254)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (289)..(289)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (316)..(316)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (346)..(347)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (367)..(367)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (430)..(432)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (441) .. (441)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (492) .. (492)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (555)..(556)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (565)..(565)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (613)..(613)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (639)..(639)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (783)..(783)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (788)..(788)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (792)..(792)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (811) .. (811)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (871)..(871)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (898)..(898)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (965)..(965)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (979)..(979)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1013)..(1013)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1035)..(1037)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1063)..(1063)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1068)..(1068)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1071)..(1071)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1102)..(1102)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1127) .. (1128)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1228)..(1228)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1337)..(1337)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1399)..(1399)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1401)..(1401)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1424) .. (1424)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1462)..(1462)
<223> n es a, c, g, o u
<400> 22
<210> 23
<211> 1535
<212> ARN
<213> Enterococcus hirae
<400> 23
<210> 24
<211> 1435 5 <212> DNA
<213> Tetragenococcus halophilus
<220>
<221>
modified base 10 <222> (6)..(6)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221>
modified base 15 <222> (53) .. (53)
<223> n es a, c, g, o t
<220>
<221>
modified base 20 <222> (253)..(253)
<223> n es a, c, g, o t <220>
<221> modified base
<222> (298)..(298)
<223>
n es a, c, g, o t 5
<220>
<221> modified base
<222> (1094)..(1094)
<223>
n es a, c, g, o t 10
<220>
<221> modified base
<222> (1182)..(1182)
<223>
n es a, c, g, o t 15
<220>
<221> modified base
<222> (1426)..(1426)
<223>
n es a, c, g, o t 20
<400> 24
<210> 25
<211> 1452
<212> ARN
<213> Escherichia coli
<220>
<221> modified base
<222> (491)..(492)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (567)..(567)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (571) .. (571)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (852)..(853)
<223> n es a, c, g, o u
<400> 25
<210> 26
<211> 1541
<212> ARN
<213> Salmonella bovis
<400> 26
<210> 27
<211> 1488
<212> ARN
<213> Shigella boydii 15
<400> 27 <210> 28
<211> 1471 5 <212> ARN
<213> Shigella dysenteriae
<220>
<221>
modified base 10 <222> (1)..(2)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221>
modified base 15 <222> (1470)..(1470)
<223> n es a, c, g, o u
<400> 28 5 <210> 29
<211> 1468
<212> ARN
<213> Shigella flexneri
10 <220>
<221> modified base
<222> (1) .. (2)
<223> n es a, c, g, o u
15 <220>
<221> modified base
<222> (372)..(372)
<223> n es a, c, g, o u
20 <400> 29 5 <210> 30
<211> 1541
<212> ARN
<213> Streptococcus bovis
10 <400> 30 5 <210> 31
<211> 1492
<212> ARN
<213> Streptococcus infantarius
10 <400> 31 5 <210> 32
<211> 1487
<212> ARN
<213> Streptococcus salivarius
10 <220>
<221> modified base
<222> (939)..(939)
<223> n es a, c, g, o u
15 <220>
<221> modified base
<222> (1059)..(1059)
<223> n es a, c, g, o u
20 <400> 32 5 <210> 33
<211> 1540
<212> ARN
<213> Streptococcus thermophilus
10 <220>
<221> modified base
<222> (130)..(130)
<223> n es a, c, g, o u
15 <400> 33 5 <210> 34
<211> 1332
<212> ARN
<213> Fusobacterium alocis
10 <220>
<221> modified base
<222> (76)..(76)
<223> n es a, c, g, o u
15 <220>
<221> modified base
<222> (80) .. (80)
<223> n es a, c, g, o u
20 <220>
<221> modified base
<222> (258) .. (258)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (261)..(261)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (374) .. (374)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (812)..(812)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (847)..(847)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (999)..(999)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1076)..(1076)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1174)..(1174)
<223> n es a, c, g, o u
<400> 34 <210> 35
<211> 1461
<212> ARN
<213> Fusobacterium nucleatum
<220>
<221> modified base
<222> (288)..(288)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (637)..(637)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (744)..(746)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (941)..(941)
<223> n es a, c, g, o u
<400> 35 <210> 36
<211> 1452
<212> ARN
<213> Fusobacterium varium
<220>
<221> modified base
<222> (256)..(256)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (271).. (271)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (320)..(320)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (422)..(422)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (509)..(509)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (683)..(683)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (844)..(844)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (891)..(891)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (923)...(926)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (998)..(998)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1157)..(1158)
<223> n es a, c, g, o u
<220>
<221> modified base
<222> (1447)..(1447)
<223> n es a, c, g, o u
<400> 36 <210> 37
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripcion de la secuencia artificial: Oligonucleotido sintetico
<400> 37
agagtttgat cctggctcag
<210> 38
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripcion de la secuencia artificial: Oligonucleotido sintetico
<400> 38
gctgcctccc gtaggagt

Claims (9)

  1. REIvINDICACIoNEs
    1. Procedimiento para diagnosticar una enfermedad inflamatoria intestinal en un paciente, que comprende determinar el aumento o la disminucion en comparacion con una muestra de mucosa normal de Moraxella sp. del grupo Pseudomonas, Comamonas sp. del grupo Acidovorax, Cryseobacterium sp. del grupo I Cytophaga, Enterococcus sp. del grupo Enterococcus, Bacteroides sp. del grupo Bacteroides, Propionibacterium sp. del grupo Propionibacterium, Ruminococcus sp. del grupo de Clostridium Coccoides y Bacteroides sp. en una muestra de tejido de la mucosa del colon de dicho paciente, en el que
    (a)
    la enfermedad inflamatoria intestinal es la enfermedad de Crohn y en el que un aumento de Moraxella sp., Comamonas sp. y Chryseobacter sp. y una disminucion de Bacteroides sp., Propionibacterium sp., Enterococcus sp. y Ruminococcus sp. indica la enfermedad de Crohn en dicho paciente, o en el que
    (b)
    la enfermedad inflamatoria intestinal es la colitis ulcerosa y en el que un aumento de Moraxella sp., Comamonas sp. y Enterococcus sp. y una disminucion de Bacteroides sp., Propionibacterium sp., Chryseobacter sp. y Ruminococcus sp. indica colitis ulcerosa en dicho paciente.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, que comprende ademas determinar el aumento o la disminucion de una
    o mas bacterias seleccionadas de entre el grupo constituido por Bacteriodes sp., Ruminococcus sp., Moraxella sp. y Comamonas sp. en una muestra de lumen del paciente.
  3. 3.
    Procedimiento para diagnosticar pouchitis en un paciente con bolsa del ileon, que comprende detectar Fusobacter sp., Propionibacterium sp. y por lo menos una de las bacterias del grupo de E.coli y/o Shigella sp. en una muestra de tejido de la mucosa del colon de dicho paciente, en el que un aumento de Fusobacter sp. y una disminucion de una o mas de las bacterias del grupo de E.coli y/o Shigella sp. en comparacion con una muestra de bolsa normal y la ausencia de Propionibacterium sp. es diagnostico de pouchitis.
  4. 4.
    Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las bacterias se detectan utilizando un anticuerpo especifico para dichas bacterias.
  5. 5.
    Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las bacterias son detectadas utilizando una sonda de oligonucleotidos especifica para dichas bacterias.
  6. 6.
    Procedimiento segun la reivindicacion 5, en el que las bacterias son detectadas utilizando tecnica de huella de acidos nucleicos, RCP, secuenciacion de nucleotidos, inmunotransferencia Southern, y/o micromatrices de ADN que comprenden una pluralidad de secuencias especificas para una o mas de dichas bacterias.
  7. 7.
    Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en el que dicha sonda de oligonucleotidos hibrida con una pequera subunidad de ARN ribosomico o con una gran unidad de ARN ribosomico.
  8. 8.
    Procedimiento segun la reivindicacion 7, en el que dicha sonda de oligonucleotidos hibrida con las regiones variables o las regiones de helice de dicho ARN ribosomico.
  9. 9.
    Utilizacion de un procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para pronosticar y/o para realizar el seguimiento del curso de una enfermedad inflamatoria intestinal en un sujeto.
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