ES2392190T3 - Método para modificar la morfología, bioquímica y fisiología de plantas que comprende la expresión de citoquinina oxidasa de plantas - Google Patents

Abstract

Un método para incrementar el tamaño o peso de las semillas que comprende incrementar el nivel o actividad deuna citoquinina oxidasa en las semillas en una planta.

Description

Método para modificar la morfología, bioquímica y fisiología de plantas que comprende la expresión de citoquinina oxidasa de plantas

Campo de la invención

La presente invención se relaciona en general con métodos para modificar propiedades o características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas de plantas, tales como uno o más procesos de desarrollo y/o procesos de adaptación ambiental, incluyendo desarrollo de semillas. Los métodos para incrementar el tamaño y/o peso de semillas, incrementar el tamaño y/o peso de los embriones, e incrementar el tamaño y/o peso de los cotiledoneos también se proveen aquí. Los métodos comprenden expresar una proteína de control de la degradación de la citoquinina, en particular la citoquinina oxidasa, en la planta, operablemente bajo el control de una secuencia promotora regulable tal como una secuencia promotora específica de células, promotora específica de tejidos o promotora específica de órganos. Preferiblemente, las características modificadas por la presente invención son características mediadas por la citoquinina y/o mediadas por la auxina.

Antecedentes de la invención

Las raíces son un órgano importante de las plantas superiores. Sus funciones principales son anclar la planta al suelo y absorber agua y nutrientes (nutrición N, minerales, etc.) Así, el crecimiento de las raíces tiene una influencia directa o indirecta sobre el crecimiento y rendimiento de los órganos aéreos, en particular bajo condiciones de limitación de nutrientes. Las raíces también son relevantes para la producción de productos secundarios de las plantas, tales como compuestos defensivos y hormonas vegetales.

Las raíces también son órganos de almacenamiento en un cierto número de cultivos de consumo importantes. La remolacha de azúcar es la planta más importante para la producción de azúcar en Europa (260 Millones de toneladas/año, 38% de la producción mundial). La mandioca (casaba), ñames y patatas dulces (batatas) son productores importantes de almidón (aproximadamente 150 Millones de toneladas/cada año). Su contenido de almidón puede ser dos veces más alto que el de la patata. Las raíces también son el órgano relevante para el consumo en un cierto número de vegetales (por ejemplo, zanahorias, rábanos), hierbas (por ejemplo, jengibre, cúrcuma) y plantas medicinales (por ejemplo, ginseng). Además, algunos de los productos vegetales secundarios encontrados en las raíces son de importancia económica para la industria química y farmacéutica. Un ejemplo es el ñame, el cual contiene moléculas básicas para la síntesis de hormonas esteroidales. Otro ejemplo es shikonina, la cual se produce en las raíces de la Lithospermum erythrorhizon en cultivos de raíces vellosas. La shikonina se utiliza por sus propiedades antiinflamatorios, antitumorales y para curación de heridas.

Además, el crecimiento mejorado de las raíces de plantas de cultivo también potenciará la competitividad con malezas y mejorará el crecimiento en áreas áridas, incrementando la accesibilidad y absorción de agua.

El crecimiento mejorado de las raíces también el relevante para propósitos ecológicos, tales como la biorremediación y prevención/detención de la erosión del suelo.

La arquitectura de las raíces es un área que ha permanecido largamente inexplorada a través de los cruces clásicos, por las dificultades de establecer esta característica en el campo. Así, la biotecnología podría tener un impacto significativo en la mejora de estas características, porque no se basa en selecciones a gran escala en el campo. Al contrario, las metodología biotecnológicas requieren un entendimiento básico de los componentes moleculares que determinan una característica específica de la planta. Hoy, este conocimiento es sólo fragmentario, y como consecuencia, la biotecnología hasta ahora ha sido incapaz de generar un cambio en esta área.

Un regulador bien establecido del crecimiento de las raíces es la auxina. La aplicación de ácido indol-3-acético (IAA) a plantas en crecimiento estimula el desarrollo de las raíces laterales y la elongación lateral de las raíces (Torrey, Am J Bot 37: 257-264, 1950; Blakely et al., Bot Gaz 143: 341-352, 1982; Muday and Haworth, Plant Physiol Biochem

32: 193-203, 1994). Raíces expuestas a un rango de concentraciones de IAA inciciaron números crecientes de raíces laterales. (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000). Además, cuando las raíces que han producido laterales en respuesta a una concentración particular de auxina exógena fueron expuestas subsecuentemente a una concentración más alta de IAA, se formaron numerosas raíces laterales supernumerarias espaciadas entre las ya existentes (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000). Por el contrario, el crecimiento de las raíces sobre agar que contenía inhibidores de para el transporte de la auxina incluyendo NPA, disminuye el número de raíces laterales (Muday and Haworth, Plant Physiol Biochem 32: 193-203, 1994).

Se han aislado mutantes de arabidopsis que contienen inhibidores incrementados de IAA endógeno (Boerjan et al., Plant Cell 7: 1405-141, 1995; Celenza et al., Gene Dev 9: 2131-2142, 1995; King et al., Plant Cell 7: 2023-2037, 1995; Lehman et al., Cell 85: 183-194, 1996). Son conocidos por ser alelos de locus individuales localizados en el cromosoma 2. Estas plantas mutantes tienen raíces adventicias y laterales en exceso, lo cual está de acuerdo con los efectos antes descritos de la aplicación externa de auxina.

Los efectos estimuladores de las auxinas sobre la formación de raíces adventicias y laterales sugiere que la sobreproducción de auxinas en las plantas transgénicas es una estrategia válida para incrementar el crecimiento de las raíces. Aún así, es también cuestionable si esto produciría un producto comercial con características mejoradas. Aparte de su efecto estimulador sobre la formación de raíces adventicias y laterales, la sobreproducción de auxina dispara otros efectos, tales como la reducción en el número de hojas, morfología anormal de las hojas (hojas estrechas, rizadas), inflorescencias abortados, dominio incrementado apical, formación de raíces adventicias en el tallo, la mayoría de los cuales son indeseables desde una perspectiva agronómica (Klee et al., Genes Devel 1: 8696, 1987; Kares et al., Plant Mol Biol 15: 225-236, 1990). Por lo tanto, el problema principal con la metodología que se basa en la síntesis de auxina incrementada es un problema de control, es decir confinar los efectos de la auxina a la raíz. Este problema de control no ha sido superado probablemente utilizando promotores específicos para tejidos: las auxinas son transportados en la planta y su acción consecuentemente no está confinada al sitio de síntesis. Otro aspecto es si las auxinas siempre potenciarán la biomasa de la raíz total. Para plantas cultivadas en agar, se ha notado que el incremento de las concentraciones estimuló progresivamente la formación de raíces laterales pero concurrentemente inhibió el crecimiento de estas raíces (Kerk et al., Plant Physiol, 122: 925-932, 2000).

Las semillas son la unidad reproductiva de las plantas superiores. Las semillas de las plantas contienen compuestos de reserva para asegurar la nutrición del embrión después de la germinación. Estos órganos de almacenamiento contribuyen significativamente a la nutrición humana así como a la alimentación animal. Las semillas consisten de tres partes principales, a saber el embrión, el endospermo y la cubierta de la semilla. Los compuestos de reserva están depositados en el órgano de almacenamiento el cual es bien sea el endospermo (resultante de doble fertilización, por ejemplo en todos los cereales), el así llamado perispermo (derivado del tejido de las nucelas) o los cotiledones (por ejemplo, variedades de judías). Los compuestos de almacenamiento son lípidos (colza de aceite), proteínas (por ejemplo, en el aleurón de los cereales) o hidratos (almidón, oligosacáridos como la rafinosa).

El almidón es el compuesto de almacenamiento en las semillas de los cereales. Las especies más importantes de maíz (producción anual cercana a 570 millones de toneladas; de acuerdo con FAO 1995), arroz (540 millones de toneladas por año) y trigo (530 millones de toneladas por año). Las semillas ricas en proteínas son diferentes clases de judías (Phaseolus spec., Vicia faba, Vigna spec.; cerca de 20 millones de toneladas por año), guisantes (Pisum sativum; 14 millones de toneladas por año) y soja (Glycine max; 136 millones de toneladas por año). Las semillas de soja son también una fuente importante de lípidos. Las semillas ricas en lípidos son también aquellas de diferentes especies de Brassica (aproximadamente 30 millones de toneladas por año), algodón, sésamo oriental, linaza, amapola, castor, girasol, cacahuete, coco, aceite de palma y algunas otras plantas de menor importancia económica.

Después de la fertilización, las semillas en desarrollo se convierten en un órgano de acumulación que trae compuestos nutricionales a partir de órganos fuente de la planta y los utiliza para producir los compuestos de reserva en el órgano de almacenamiento. El incremente en el tamaño de las semillas y el peso, son deseables para muchas diferentes especies de cultivo. Además de las reservas incrementadas de almidón, proteína y lípidos y de una nutrición potenciada por ingestión, el incremento en el tamaño de las semillas y/o el peso y el tamaño y/o el peso de los cotiledones están correlacionados con un crecimiento más rápido después de la germinación (vigor temprano) y tolerancia mejorada al estrés. Las citoquininas son un factor importante en la determinación de la capacidad de almacenamiento. El concepto común predice que las citoquininas son un regulador positivo de la capacidad de almacenamiento.

Numerosos reportes adjudican una función estimuladora o inhibidora a las citoquininas en diferentes procesos del desarrollo tales como crecimiento y ramificación de las raíces, control del dominio apical en el brote, desarrollo del cloroplasto y senescencia de la hoja (Mok M.C. (1994) in Cytokines: Chemistry, Activity and Function, eds., Mok,

D.W.S. & Mok, M.C. (CRC Boca Ratón, FI), pp.155-166). Las conclusiones acerca de las funciones biológicas de las citoquininas han sido derivadas principalmente de estudios sobre las consecuencias de la aplicación de citoquinina exógena o de niveles de citoquinina potenciados endógenamente (Klee, H.J. & Lanehon, M.B. (1995) in Plant Hormones:Physiology, Biochemisry and Molecular Biology, ed. Davies, P.J. (Kluwer, Dordrdrocht, the Netherlands), pp. 340-353, Smulling, T., Rupp, H.M. Frank, M& Schafer, S. (1999) in Advances in Regulation of Plant Growth and Development, eds. Surnad, M. Pac P. & Beck, E. (Peres, Prague), pp. 85-96). Hasta ahora, no ha sido posible abordar la pregunta contraria: ¿cuáles son las consecuencias para el crecimiento y desarrollo de la planta si la concentración de citoquinina endógena disminuye? Se espera que las plantas con un contenido reducido de citoquinina produzcan información más precisa acerca de los procesos que las citoquininas limitan y, por lo tanto, puedan regular. A diferencia de otras hormonas vegetales tales como ácido abscísico, giberelinas y etileno, no se han aislado mutantes biosintéticos de la citoquinina (Hooykens, P.J.J., Hall, M.A. & Libbeuga, K.R.,eds.(1999)Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones (Elsevier, Ámsterdam).

La enzima catabólica citoquinina oxidasa (CKX) juega un papel principal en el control de los niveles de citoquinina en tejidos vegetales. La actividad de la CKX ha sido encontrada en un gran número de plantas superiores y en diferentes tejidos vegetales. La enzima es una oxidorreductasa que contiene FAD que cataliza la degradación de las citoquininas que portan cadenas laterales isoprenoides insaturadas. Las bases libres iP y Z, y sus ribósidos respectivos son los sustratos preferidos. Los productos de reacción del catabolismo de la iP son adenina y el aldehído 3-metil-2-butonal insaturado (Armstrong, D.J. (1994) in Cytokinins: Chemistry, Activityand Functions, eds. Mok. D.W.S & Mok, M.C. (CRC Boca Ratón, FL), pp. 139-154). Recientemente, se ha aislado un gen de citoquinina oxidasa de Zea mays (Morris, R.O., Bilyeu, K.D., Laskey, J.G. & Cherich, N.N. (1999) Biochem. Biophys.Res. Commun. 255, 328-333, Houba-Heria, N.,Pethe, C. d’Alayer, J & Lelouc, M. (1999) Plant J. 17:615-626). La manipulación de la expresión del gen de CKX podría superar parcialmente la falta de mutantes biosintéticos de citoquinina y puede utilizarse como una herramienta poderosa para estudiar la relevancia de las citoquininas tipo iP y Z durante el ciclo de vida completo de las plantas superiores.

La presente invención supera los problemas relacionados con el control de los efectos de la auxina, mantenimiento del crecimiento de raíces y promoción del tamaño y/o peso incrementado de semillas, embriones y cotiledones a través de la reducción de la concentración endógena de citoquinina.

Resumen de la invención

La presente invención se relaciona con el objetivo tal como se define en las reivindicaciones anexas 1 a 29.

La presente especificación describe proteínas de citoquinina oxidasa, secuencias de ácidos nucleicos que codifican tales proteínas y vectores, células huésped y células vegetales transgénicas, plantas y partes de plantas que comprenden las proteínas, secuencias de ácidos nucleicos y vectores. Por ejemplo, la presente invención se relaciona con un constructo genético que comprende un gen que codifica una proteína con actividad de citoquinina oxidasa de Arabidopsis thaliana. Este gen puede expresarse bajo el control de un promotor regulado. Este promotor puede ser regulado por factores específicos para tejidos o específicos para ambientes endógenos o, alternativamente, puede ser inducido por la aplicación de agentes químicos específicos.

La presente especificación también describe un método para modificar la arquitectura y biomasa de las raíces por expresión de un gen de citoquinina oxidasa o expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas. Preferiblemente, la expresión está bajo el control de un promotor que es específico para la raíz o para ciertos tejidos o tipos de células de la raíz.

Adicionalmente, la presente especificación describe métodos para incrementar el tamaño y/o peso de las semillas, tamaño y/o peso de los embriones, y tamaño y/o peso de los cotiledones. Los métodos involucran la expresión de un gen de citoquinina oxidasa o la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas. Preferiblemente, la expresión está bajo el control de un promotor que dirige la expresión preferencialmente en la semilla, embrión, o cotiledón.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Representación esquemática de genes de citoquinina oxidasa de plantas

Se muestran las estructuras de diferentes genes de citoquinina oxidasa aislados a partir de maíz (ZmCKX1, número de acceso AF044603, Biochem. Biophys. Res. Com. 255:328-333, 1999) y Arabidopsis (AtCKX1 a AtCKX4). Los exones se denominan con “E” y se representan mediante cajas sombreadas. Los intrones son representados por cajas blancas. Se indican adicionalmente los tamaños de los genes (en kb, sobre la parte superior de cada estructura), los números de acceso genético (bajo los nombres) y una barra lateral que representa 0.5 kb.

Figura 2. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la citoquinina oxidasa de plantas.

Se alinean las secuencias de aminoácidos para citoquinina oxidasas de maíz (ZmCKX1) y Arabidopsis (AtCKX1 a AtCKX4). Se marcan residuos idénticos de aminoácidos mediante una caja negra, los residuos de aminoácidos similares están en una caja gris. Grupos de similitud de aminoácidos: (M, I, L, V), (F, W, Y), (G, A), (S, T), (R, K, H), (E, D), (N, Q),

Figura 3. Análisis por inmunoprecipitación Northern de tabaco que expresa AtCKX1 y plantas de Arabidopsis.

(A)

Análisis de inmunoprecipitación Northern de plantas de tabaco que expresan constitutivamente (líneas 1-8) en comparación con tabaco SNN tipo silvestre (línea 9)

(B)

Comparación de la expresión de gen inducida por tetraciclina en hojas después de 12 horas de inducción con un clon de expresión constitutiva. Líneas 2-9, hojas de cuatro diferentes clones AtCKX1-W38TetR (+, -, con o sin tratamiento con tetraciclina), línea 1, expresando constitutivamente el clon 35S:: AtCKX1.

(C)

Análisis por inmunoprecipitación Northern de plantas de Arabidopsis que expresan constitutivamente el gen AtCKX1. Líneas 2-4, tres diferentes clones que expresan constitutivamente 35S::AtCKX1 en comparación con una planta de Arabidopsis tipo silvestres (línea 1).

Figura 4: Características de crecimiento de plantas de Arabidopsis transgénicas 35S::AtCKX1.

(A)

Dos tipos de plantones silvestres (izquierda) comparados con plantones que expresan 35S::AtCKX1 (derecha). Nótese la formación incrementada de raíces adventicias y ramificación de raíces incrementadas en los plantones transgénicos. Las imágenes fueron tomadas 14 días después de la germinación. Las plantas se cultivaron in vitro sobre medio MS en cajas de petri en una posición vertical.

(B)

Como A, pero con las raíces teñidas con azul de toluidina.

(C)

Vista superior de una caja de petri con plantones transgénicos de 35S::AtCKX1 tres semanas después de la germinación.

(D)

Plantas transgénicas 35S::AtCKX1 cultivadas en cultivo líquido. Los plantones con raíces de tipo silvestre crecen pobremente bajo estas condiciones (no mostrada).

(E)

Transformantes (T0) que expresan el gen 35S::AtCKX1 (tres plantas a la derecha), un tipo de planta silvestre se muestra a la izquierda.

(F)

Fenotipo de plantas T1 cultivadas en suelo. La planta de tipo silvestre (izquierda) comparada con dos plantas transgénicas 35S::AtCKX1.

Figura 5: Fenotipo de plantas de Arabidopsis que sobreexpresan AtCKX2. Generación de T1 de plantas de Arabidopsis que expresan 35S::AtCKX2 (dos plantas en la derecha) en comparación con una planta tipo silvestre (planta a la izquierda).

Figura 6. Análisis por inmunoprecipitación Northern de plantas de tabaco y Arabidopsis que expresan AtCKX2.

(A)

Un análisis de inmunoprecipitación Northern de plantas de tabaco que expresan constitutivamente (líneas 1-7) en comparación con tabaco tipo SNN (línea 8)

(B)

Análisis por inmunoprecipitación Northern de plantas de Arabidopsis que expresan constitutivamente el gen AtCKX2. Las líneas 2-8, siete diferentes clones que expresan constitutivamente 35S::AtCKX2 en comparación con la planta de Arabidopsis (línea 1).

Figura 7. Fenotipo de brote de plantas de tabaco que expresan AtCKX1 y AtCKX2.

(A)

Vista superior de plantas de seis semanas de edad.

(B)

Plantas de tabaco en etapa de floración.

(C)

Cinética de la elongación de tallos. Las flechas marcan la aparición de la floración. La edad de las plantas (días después de la germinación) y el número de hojas en esa etapa se indican por encima de las flechas. Las barras indican SD; n = 12.

(D)

Número de hojas (n = 12) formadas entre el día 68 y el día 100 después de la germinación y área superficial final de estas hojas (100% del tipo silvestre es 3646 ± 144 cm2; n = 3).

(E)

Comparación del tamaño de las hojas y la senescencia. Las hojas fueron de los números 4, 9, 12, 16 y 20 desde arriba (de izquierda a derecha).

Figura 8. Fenotipo de raíz de plantas de tabaco transgénico que expresan AtCKX.

(A)

Plantones de 17 días después de la germinación.

(B)

Sistema radicular de plantas de crecimiento en suelo en la etapa de floración.

(C)

Longitud de las raíces, número de raíces laterales (LR) y raíces adventicias (AR) en el día 10 después de la germinación.

(D)

Curva de respuesta a la dosis de la inhibición de crecimiento de raíces por citoquinina exógena. Las barras indican ± SD; n = 30.

Figura 9: Crecimiento de meristemas axilares de brotes en plantas de tabaco que expresan 35S::AtCKX1.

Figura 10: Histología de los meristemas de brotes, meristemas de hojas y raíz de plantas de tabaco que sobreexpresan AtCKX1 versus tabaco tipo silvestre (WT).

(A)

Sección media longitudinal a través del meristema apical de brote vegetativo. P, hoja primordial.

(B)

Tejido vascular en venas de segundo orden de las hojas. X, xilema, PH, un haz de floema.

(C)

Secciones transversales de hojas completamente desarrolladas.

(D)

Microscopía electrónica de barrido de la epidermis superior de la hoja.

(E)

Ápices de raíz teñidos con DAPI. RM, meristema de raíz.

(F)

Secciones medias longitudinales de meristemas de raíz diez días después de la germinación. RC, punta de raíz; PM, promeristema

(G)

Secciones transversales de raíz 10 mm desde el ápice. E, epidermis, C1-C4 capa celular cortical, X, xilema, PH, floema. Las barras son de 100 µm.

Figura 11: El análisis por inmunoprecipitación Northern de plantas de tabaco que expresan AtCKX3 y AtCKX4.

(A)

Un análisis de inmunoprecipitación Northern de plantas de tabaco que expresan constitutivamente AtCKX3. Las designaciones de línea incluyen números de plantas transgénicas individuales, WT es tabaco SNN tipo silvestre. La inmunoprecipitación sobre la izquierda fue probada con una sonda específica de AtCKX3, la inmunoprecipitación inferior con una sonda específica para el ARNr 25S y sirve como control para la carga de ARN.

(B)

El análisis por inmunoprecipitación Northern de plantas de tabaco que expresan constitutivamente AtCKX4. La designación de línea indica números de plantas individuales transgénicas, WT es tabaco SNN tipo silvestre. La inmunoprecipitación sobre la parte superior fue probada con una sonda específica para AtCKX4, la inmunoprecipitación inferior con una sonda específica para el ARNr 25S y sirve como control para la carga de ARN.

Figura 12: Injertos recíprocos de plantas de tabaco transgénicas AtCKX2 y plantas tipo silvestre.

(A)

Dos plantas a la izquierda: Control (injerto WT injertado sobre raíces WT). Dos plantas a la derecha: injerto WT injertado sobre raíces transgénicas AtCKX2-38.

(B)

Izquierda: Control (injerto WT injertado sobre raíces WT). Derecha: Injerto de planta AtCKX2-38 injertada sobre raíz WT.

(C)

Magnificación del área de raíz. Izquierda: Control (Injerto WT injertado sobre raíz WT). Derecha: Injerto WT injertado sobre una raíz transgénica AtCKX2-38.

(D)

Formación de raíces adventicias. Izquierda: Control (Injerto WT injertado sobre una raíz WT). Derecha: Injerto WT injertado sobre una raíz transgénica AtCKX2-38.

Figura 13: Fenotipo de semillas, embriones y plantones de Arabidopsis.

(A)

Semillas de una línea transgénica AtCKX1 y semillas tipo silvestre. Tamaño de barra 1 mm.

(B)

Semillas de líneas transgénicas AtCKX1, AtCKX2, AtCKX3 y AtCKX4 y semillas tipo silvestre. Tamaño de barra 1 mm.

(C)

Embriones maduros de Arabidopsis transgénica AtCKX1 y de una planta tipo silvestre. Tamaño de barra 200 µm. Los embriones fueron obtenidos a partir de semillas maduras que habían estado embebidas durante 12 horas en EtOH al 20%, extraídas de la cubierta de la semilla, lavadas con cloralhidrato y fotografiadas utilizando óptica Nomarski.

(D)

Plantones de Arabidopsis tipo silvestre (parte superior) y de AtCKX1 que expresan después de 4 días de la germinación.

(E)

Acercamiento de D.

Figura 14: Peso de semilla de tipo silvestre y dos clones independientes para cada uno de los cuatro genes AtCKX investigados. Peso promedio obtenido por el análisis de cinco lotes diferentes de 200 semillas para cada clon.

Descripción detallada de la invención

Para obviar los problemas antes mencionados con el incremento de la biosíntesis de la auxina, se decidió seguir una metodología alternativa. Razonamos que la subregulación de los antagonistas biológicos de las auxinas podría evocar efectos similares o incluso superiores sobre el crecimiento de las raíces en comparación con niveles de auxina incrementados. Las acciones e interacciones hormonales son extremadamente complejas, pero tenemos la hipótesis de que las citoquinas podrían funcionar como antagonistas de las auxinas con respecto al crecimiento de las raíces. Los estudios hormonales sobre cultivos de tejidos vegetales han demostrado que la relación de la auxina versus la citoquinina es más importante para la organogénesis que los niveles absolutos de cada una de estas hormonas, lo cual indica en efecto que estas hormonas funcionan como antagonistas – al menos en ciertos procesos biológicos. Además, la formación de raíces laterales es inhibida por la aplicación exógena de citoquininas. De manera interesante, también la elongación de la raíz es afectada negativamente por el tratamiento con citoquinina, lo que sugiere que las citoquininas controlan tanto la ramificación de las raíces como el crecimiento de las raíces.

Junto con lo anterior, los datos de la literatura actual indican que los niveles de citoquinina incrementados afectan negativamente el crecimiento de las raíces, pero los mecanismos que subyacen bajo este proceso no están entendidos. Los sitios de síntesis de la citoquinina en la planta son las puntas de las raíces y los tejidos jóvenes de los brotes. Las concentraciones endógenas de las citoquininas están en el rango de nM. Sin embargo, puesto que su cuantificación es difícil, se necesita extraer cantidades de tejido bastante grandes y las concentraciones locales reales no son conocidas. También la compartimentación subcelular de las citoquininas no es conocida. Se piensa generalmente que la base libre y los ribósidos están localizados en el citoplasma y el núcleo, mientras que los glucósidos están localizados en la vacuola. Existen también diferentes citoquininas con estructura química ligeramente diferente. Como consecuencia, no se sabe si los efectos de las citoquininas exógenas podrían ser adscritos a un incremento en la concentración total de citoquinina o más bien a la competencia de otras formas de citoquininas originadas en las plantas (que difieren bien sea en la estructura, localización celular o subcelular) para enzimas receptoras, translocalizadoras, transportadoras y modificadoras.

Con el fin de probar la hipótesis de que los niveles de citoquinina en la raíz exceden en efecto el nivel óptimo para el crecimiento de las raíces, se clonaron genes novedosos que codifican citoquinina oxidasas (las cuales son enzimas que metabolizan la citoquinina) de Arabidopsis thaliana (designadas AtCKX) y fueron expresadas subsecuentemente bajo un promotor fuerte constitutivo en tabaco y Arabidopsis transgénicos. Los transformantes que mostraron la expresión de AtCKX ARNm y actividad incrementada de citoquinina oxidasa también manifestaron una formación potenciada del crecimiento de las raíces. También se observaron efectos negativos sobre el crecimiento de los brotes. Esto último está de acuerdo con la expresión constitutiva del gen de citoquinina oxidasa en estas plantas, que ilustra la importancia de una expresión confinada del gen de citoquinina oxidasa para propiedades de crecimiento generales de las plantas. El control de la actividad de la citoquinina oxidasa puede ser logrado utilizando promotores específicos para células, tejidos u órganos, puesto que la degradación de la citoquinina es un proceso limitado a los tejidos o células que expresan la proteína CKX, esto en contraste con las metodologías que se basan en la síntesis hormonal, como se explicó anteriormente.

Los efectos negativos observados de la expresión de la citoquinina oxidasa sobre el crecimiento de brotes demuestran que la citoquinina oxidasas son objetivos interesantes para el diseño de o para la selección de agentes químicos promotores del crecimiento. Tales agentes químicos deberían inhibir la actividad de la citoquinina oxidasa, preferiblemente no deberían ser transportados a la raíz y deberán ser degradados rápidamente en el suelo, de tal manera que la aplicación de estos agentes químicos no inhiban el crecimiento de las raíces. Las citoquininas también retardan la senescencia de las hojas, lo que significa que los efectos positivos incluirán también el crecimiento y mantenimiento de los tejidos fotosintéticos. Además, la observación de que las citoquininas retardan la senescencia, potencian el enverdecimiento de las hojas (contenido de clorofila) y la reducción del dominio apical de los brotes muestra que las estrategias basadas en la supresión de la actividad de CKX (tales como tecnología antisentido, de ribozimas, y cosupresión) en las partes aéreas de la planta podría dar como resultado una senescencia retardada, enverdecimiento potenciado de las hojas y ramificación incrementada.

De la misma forma, los efectos positivos observados de la expresión de la citoquinina oxidasa sobre el crecimiento de raíces demuestra que las citoquinina oxidasas son objetivos interesantes para el diseño o selección de herbicidas. Tales herbicidas podrían inhibir la actividad de la citoquinina oxidasa, preferiblemente no ser transportados al brote, y deberían ser solubles y relativamente estables en un solvente que pueda ser administrado a la raíz a través del suelo.

Estos efectos de la sobreexpresión de citoquinina oxidasa sobre el desarrollo y arquitectura de la planta eran hasta ahora desconocidos y, como consecuencia, la invención presentada y sus realizaciones no podían ser previstas.

Los efectos negativos observados sobre el crecimiento de los brotes demuestran que la manipulación de las citoquinina oxidasas también puede ser utilizada para obtener fenotipos de enanos. Los fenotipos enanos son particularmente útiles en cultivos comerciales tales como cereales y árboles frutales por ejemplo.

De acuerdo con la presente invención, también se ha descubierto sorprendentemente que las plantas transgénicas que sobreexpresan un gen de citoquinina oxidasa desarrollan semillas (incluyendo embriones) y cotiledones de tamaño y/o peso incrementados. Estos resultados son sorprendentes puesto que se esperaría que el contenido reducido de citoquinina estuviera asociado con un crecimiento reducido de los órganos.

La especificación describe el efecto positivo de la expresión de citoquinina oxidasa sobre el crecimiento y arquitectura de las plantas, y en particular sobre el crecimiento y arquitectura de raíces, tamaño y peso de las semillas, tamaño y peso de los embriones y tamaño y peso de los cotiledones. La familia de genes de citoquinina oxidasa contiene al menos seis miembros en Arabidopsis (véase ejemplos más abajo) y los presentes inventores han demostrado que hay deferencias cuantitativas en los efectos alcanzados con algunos de estos genes en plantas transgénicas. Se anticipa que los homólogos funcionales de las citoquininas oxidasa de Arabidopsis descritas pueden aislarse a partir de otros organismos, dada la evidencia de la presencia de actividad de citoquinina oxidasa en muchas plantas verdes (Hare y van Staden, Plant Physiol 91:128-136, 1994; Jones y Schreiber, Reg Plant Growth 23:123-134, 1997), así como en otros organismos (Armstrong, en citoquininas: Química, Activity and function Eds Mok y Mok, CRC Press, pp139-154, 1994). Por lo tanto, la secuencia de la citoquinina oxidasa, funcional en la invención, no necesita ser idéntica a las descritas aquí. Esta invención es particularmente útil para cultivos de cereales y cultivos de monocotiledóneas en general y genes de citoquinina oxidasa del ejemplo de trigo o maíz también pueden utilizarse (Morris et al., 1999; Rinaldi and Comandini 1999). Se prevé que otros genes con actividad de citoquinina oxidasa o con cualquier otra actividad metabólica (véase Zaz–ímalová et al., Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones, Hooykaas, Hall and Libbenga (Eds.), Elsevier Science, pp141-160, 1997) pueden usarse también para el propósito de esta invención. De la misma forma, los genes que codifican proteínas que incrementarían la actividad metabolizadora de la citoquinina endógena pueden usarse también para el mismo propósito. En principio, podrían obtenerse también fenotipos similares interfiriendo con genes que funcionan corriente abajo de la citoquinina tal como receptores o proteínas involucrados en las rutas de transducción de señales de la citoquinina.

Debe entenderse que el término “crecimiento de raíces” abarca todos los aspectos del crecimiento de las diferentes partes que constituyen el sistema radicular en diferentes etapas de su desarrollo, tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Debe entenderse que el crecimiento potenciado de la raíz puede ser el resultado de un crecimiento potenciado de una o más de sus partes incluyendo las raíces primarias, raíces laterales, raíces adventicias, etc.

Para propósitos de esta invención, debe entenderse que los incrementos en el peso de las semillas o en el tamaño de las semillas pueden inducir incrementos en el tamaño de uno o más de embrión, endospermo, aleuronas, y recubrimiento de las semillas. Además, los incremento en el tamaño y/o peso de los embriones puede incluir incrementos en diferentes órganos asociados con los mismos tales como, por ejemplo, cotiledones, hipocotilos, y raíces.

La presente especificación describe un método para estimular el crecimiento de las raíces y/o potenciar la formación de raíces laterales y/o adventicias y/o alterar el geotropismo de las raíces que comprende la expresión de la citoquinina oxidasa de las plantas o comprende la expresión de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas.

De acuerdo con una primera realización, la presente invención se relaciona con un método para incrementar el tamaño y/o peso de una semilla de una planta, incrementando el nivel o actividad de una citoquinina oxidasa en la planta o por expresión de otra proteína que reduzca el nivel de las citoquininas activas en una planta o partes de una planta. Preferiblemente, el nivel o actividad incrementados de una citoquinina oxidasa o expresión de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en una planta o parte de una planta se localiza en la semilla incluyendo tejidos o tipos de células diferentes de la semilla.

En otra realización, la presente invención se relaciona con un método para incrementar el tamaño y/o peso del embrión de la planta, incrementando el nivel o actividad de una citoquinina oxidasa en una planta o por expresión de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en una planta o en una parte de una planta. Preferiblemente, el nivel o actividad incrementados de una citoquinina oxidasa o expresión de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en una planta o parte de una planta se localiza en la semilla. Aún más preferiblemente, el nivel o actividad incrementados de una citoquinina oxidasa o expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en una planta o parte de una planta se localiza en el embrión.

En aún otra realización, la presente invención se relaciona con un método para incrementar el tamaño y/o peso de un cotiledón de una planta incrementando el nivel o actividad de una citoquinina oxidasa en la planta o por expresión de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en una planta o parte de una planta. Preferiblemente, el nivel o actividad incrementados de una citoquinina oxidasa o expresión de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en una planta o partes de una planta se localiza en el cotiledón.

En el contexto de la presente invención debe entenderse que los término “expresión” y/o “sobreexpresión” se utilizan de manera intercambiable y ambos se relacionan con una “expresión potenciada y/o ectópica” de una citoquinina oxidasa de una planta o cualquier otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en plantas. Debe quedar claro que se entiende con esto una expresión potenciada de la citoquinina oxidasa de una planta así como la expresión “de novo” de citoquinina oxidasas de plantas o dichas otras proteínas. Alternativamente, dicha otra proteína potencia la actividad metabolizante de la citoquinina de una citoquinina oxidasa de una planta.

Debe entenderse adicionalmente que en el contexto de la presente invención la expresión “raíces laterales y/o adventicias” puede significar “raíces laterales y adventicias”, pero también “raíces laterales o adventicias”. El potenciamiento puede existir en la formación de raíces laterales o en la formación de raíces adventicias así como en la formación de ambos tipos de raíces no primarias, pero no necesariamente.

Además, tal como se utiliza aquí, “incrementar el tamaño y/o peso de la semilla”, puede significar incrementar el tamaño y peso de las semillas, pero también el tamaño o el peso. Así, el potenciamiento puede existir en un incremento en el tamaño de la semilla o en el peso de la semilla o ambos. Interpretaciones similares deben aplicarse a “incrementar el tamaño y/o peso del embrión” y “incrementar el tamaño y/o peso de los cotiledones”.

Los términos “plantas” y “parte de una planta” se utilizan de manera intercambiable con los términos “plantas” y “partes de una planta”.

La presente especificación describe un método para estimular el crecimiento de raíces y/o potenciar la formación de raíces laterales o adventicias y/o alterar el geotropismo de las raíces y/o incrementar el rendimiento y/o potenciar el vigor temprano y/o modificar la relación raíz/brote y/o mejorar la resistencia al alojamiento y/o incrementar la tolerancia a la sequia y/o promover la propagación in vitro de explantes, que comprende la expresión de una citoquinina oxidasa de una planta o comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas.

La presente especificación también describe un método para estimular el crecimiento de raíces que dan como resultado un incremento en la masa de las raíces por sobreexpresión de citoquinina oxidasa, u otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas, preferiblemente en raíces.

La producción más alta de biomasa de raíces debida a la sobreexpresión de secuencias promotoras del crecimiento tiene un efecto directo en el rendimiento y un efecto indirecto de producción de compuestos producidos por células de raíces o por células de raíces transgénicas o cultivos celulares de dichas células de raíces transgénicas. Un ejemplo de un compuesto interesante producido en cultivos de raíces es la Shikonina, cuyo rendimiento puede ser potenciado ventajosamente por dichos métodos.

La presente especificación también describe métodos para estimular el crecimiento de las raíces o para potenciar la formación de raíces laterales y/o adventicias o para alterar el geotropismo de las raíces o para incrementar el tamaño y/o peso de las semillas, o para incrementar el tamaño y/o peso de los embriones, o para incrementar el tamaño y/o peso de los cotiledones. Los métodos comprenden la expresión de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta seleccionada del grupo consistente de:

(a)

ácido nucleicos que comprenden una secuencia de ADN tal como la dada en cualquiera de SEQ ID NOs: 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 o 34, o el complemento de la mismas,

(b)

ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de SEQ ID NOs: 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 o 34, o los complementos de las mismas.

(c)

ácidos nucleicos que hibridan específicamente a cualquiera de SEQ ID NOs: 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 o 31, 33 o 34, o a complementos de las mismas,

(d)

ácidos nucleicos que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 32 o 35, o el complemento de las mismas,

(e)

ácidos nucleicos tal como se define en cualquiera de (a) hasta (d) caracterizados porque dicho ácido nucleico es ADN, ADN genómico, ADNc, ADN o ARN sintéticos en donde T es remplazado por U,

(f)

ácidos nucleicos que son degenerados hasta un ácido nucleico como los dados en cualquiera de SEQ ID NOs: 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 o 34, o que son degenerados hasta un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) (e) como resultado del código genético,

(g)

ácidos nucleicos que son divergentes de un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, o 35 o que son divergentes de un ácido nucleico tal como el definido en cualquiera de (a) a (e), debido a diferencias en el uso de codones entre los organismos,

(h)

ácido nucleicos que codifican una proteína como se da en SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, o 35 o ácidos nucleicos como se define en (a) a (e) los cuales son divergentes debido a las diferencias entre alelos,

(i)

ácidos nucleicos que codifican una proteína tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12 o 35,

(j)

fragmentos funcionales de ácidos nucleicos tal como se define en cualquiera de (a) hasta (i) que tienen la actividad biológica de una citoquinina oxidasa, y

(k)

ácidos nucleicos que codifican una citoquinina oxidasa de planta,

o comprenden la expresión, preferiblemente en raíces, o en semillas (incluyendo partes de semillas tales como el embrión, endospermo, recubrimiento de la semilla o aleurona) o en cotiledones, de un ácido nucleico que codifica una proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas.

En la presente especificación los ácidos nucleicos que codifican novedosa citoquinina oxidasas de Arabidopsis thaliana han sido aislados y por primera vez, los presentes inventores han mostrado sorprendentemente que la expresión de las citoquininas oxidasas en plantas transgénicas o en partes de plantas transgénicas dan como resultado las características antes mencionadas relacionadas con las raíces y las semillas. Con el fin de que se efectúen las características relacionadas con las raíces, la expresión de las citoquininas oxidasas debe tener lugar en raíces, preferiblemente bajo el control de un promotor específico para raíces. Con el fin de que las características relacionadas con las semillas sean efectuadas (incluyendo el embrión), la expresión de las citoquininas oxidasas debería tener lugar en semillas, preferiblemente bajo el control de un promotor específico para semillas. Un ejemplo de tal promotor específico para raíces se provee en SEQ ID NO: 36. Ejemplos de promotores específicos para semillas incluye pero no se limitan a los listados en la Tabla 4.

Con el fin de que las características relacionadas con el cotiledón sean efectuadas, la expresión de las citoquininas oxidasas debería tener lugar en los cotiledones, preferiblemente bajo el control de un promotor que se exprese preferencialmente en cotiledones.

Debe quedar claro que, aunque la especificación de la invención divulga en la sección de ejemplos nuevos genes y proteínas AtCKX, el concepto inventivo también se relaciona con el uso de otras citoquininas oxidasas aisladas de y expresadas en otras plantas, preferiblemente en las raíces y/o semillas y/o cotiledones de dichas otras plantas para obtener efectos similares en plantas como las descritas en la sección de ejemplos.

Por lo tanto, la presente especificación describe más en general el uso de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta o codifica una proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas para estimular el crecimiento de las raíces o para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias o para alterar el geotropismo de las raíces. La presente invención también se relaciona con el uso de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de una planta o codifica una proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o en partes de plantas para incrementar el tamaño y/o peso de las semillas, o para incrementar el tamaño y/o peso de los embriones, o para incrementar el tamaño y/o peso de los cotiledones. Las citoquininas oxidasas preferidas para uso son codificadas por los ácidos nucleicos que codifican la citoquinina oxidasa tal como se definieron anteriormente y son codificadas por los ácidos nucleicos novedosos de la invención tal como se define aquí más adelante.

La especificación divulga un ácido nucleico aislado que codifica a una proteína de planta novedosa que tiene actividad de citoquinina oxidasa seleccionada del grupo consistente de:

(a)

un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN de SEQ ID NOs: 29, 3, 5, 9, 26, 27 31, 33 o 34, o el complemento de los mismos,

(b)

un ácido nucleico que comprende las secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de SEQ ID NOs: 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34, o los complementos de los mismos,

(c)

un ácido nucleico que hibrida específicamente a un ácido nucleico como el dado en cualquiera de SEQ ID NOs: 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34, o los complementos de los mismos,

(d)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que comprende el polipéptido tal como se da en SEQ ID NO:32 y el cual es al menos 70% similar, preferiblemente al menos 75%, 80% u 85%, más preferiblemente al menos 90% o 95%, lo más preferiblemente al menos 99% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 4,

(e)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 35% similar, preferiblemente 37%, 40%, 45%, 47% o 50% similar, más preferiblemente 55%, 60%, 65%, 70%, 75% u 80% similar, lo más preferiblemente 85%, 90% o 95% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 6,

(f)

un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que es al menos 35% similar, preferiblemente 37%, 40%, 45%, 47% o 50%, más preferiblemente 55%, 60%, 65%, 70%, 75% u 80% similar, lo más preferiblemente 85%, 90% o 95% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 10 o 35,

(g)

un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs; 4, 6, 10, 32 o 35,

(h)

un ácido nucleico que es degenerado a un ácido nucleico como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 29, 3, 5, 9, 26, 27, 33 o 34, el cual es degenerado hasta un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) hasta (g) como resultado del código genético,

(i)

un ácido nucleico el cual es divergente de un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 6, 10 o 35 o el cual es divergente de un ácido nucleico como se define en cualquiera de (a) hasta

(g)

debido a las diferencias en el uso de codones entre los organismos,

(j)

Un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en SEQ ID NOs: 4, 6, 10 o 35, o un ácido nucleico como el definido en (a) hasta (g) el cual es divergente debido a las diferencias entre alelos,

(k)

un ácido nucleico que codifica un fragmento inmunológicamente activo de una citoquinina oxidasa codificado por un ácido nucleico como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34, o un fragmento inmunológicamente activo de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) hasta (j),

(l)

un ácido nucleico que codifica un fragmento funcional de una citoquinina oxidasa codificado por un ácido nucleico como el dado en cualquiera de SEQ ID NOs: 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 o 34, o un fragmento funcional de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) hasta (j), en donde dicho fragmento tiene la actividad biológica de una citoquinina oxidasa, y

(m)

un ácido nucleico que codifica una proteína como se define en SEQ ID NOs: 4, 6, 10 o 35, con la condición de que dicho ácido nucleico no sea el ácido nucleico tal como se ha depositado bajo los siguientes números de acceso de Genbank: AC005917, AB024035, y AC023754.

La especificación divulga un ácido nucleico aislado el cual es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético, o ARN donde T es remplazado por U.

La especificación divulga una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud que hibridan específicamente con o amplifican específicamente un ácido nucleico de la invención.

Formas de citoquinina diferentes pueden tener papeles diferentes en los diversos procesos de desarrollo. Así, los efectos diferenciales de CKX1, CKX2, CKX3 y CKX4 pueden relacionarse con efectos distintos en las reservas de diferentes citoquininas. Por ejemplo, CKX1 y CKX3 promueven principalmente la elongación y ramificación de las raíces, mientras que CKX2 y CKX4 estimulan primariamente la formación de raíces adventicias. Además, CKX1 y CKX3 incrementan el tamaño y peso de la semilla hasta un grado mayor que CKX2 y CKX4. Sin estar ceñidos a un modo particular de acción, este efecto diferencial en las reservas de citoquinas puede resultar de algunas diferencias en la especificidad del sustrato o de compartimentación diferencial de la citoquinina oxidasas en la célula (predichas como mitocondriales para CKX1 y CKX2, a la vez que extracelulares para CKX2, CKX4, CKX5 y CKX6).

La especificación describe adicionalmente un vector que comprende un ácido nucleico como el descrito. Dicho vector puede ser un vector de expresión en donde el ácido nucleico esta enlazado de manera operativa a una o más secuencias de control que permiten la expresión de dicha secuencia en células huésped procarióticas y/o eucarioticas.

Debe entenderse que para la expresión de los genes de oxidasa divulgados en monocotiledóneas, debe utilizarse una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia de ADNc para evitar la división errónea de intrones en monocotiledones. Las secuencias de ADNc preferidas para ser expresadas en monocotiledones tienen una secuencia de ácido nucleico tal como la representada en cualquiera de SEQ ID NOs 25 a 30 y 34.

La especificación describe una célula huésped que contiene cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos o vectores tal como se describieron. Tal célula huésped se escoge del grupo que comprende células bacterianas, de insectos, fúngicas, de plantas o animales.

La especificación también describe un polipéptido aislado codificable con un ácido nucleico tal como se describe, o un homólogo derivado del mismo, o un fragmento inmunológicamente activo o funcional del mismo. Los polipéptidos tal como se describen comprenden las secuencias de aminoácidos tal como se representan en cualquiera de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 32 y 35, o un homologo derivado de los mismos, o un fragmento inmunológicamente activo y/o funcional del mismo. La especificación también describe un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como la que se da en SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 12 o 35, o un homologo o un derivado del mismo, o un fragmento inmunológicamente activo y/o funcional del mismo. Fragmentos funcionales preferidos del los mismos son aquellos fragmentos que están desprovistos de su péptido de señalización.

La especificación también describe un método para producir un polipéptido de la invención que comprende cultivar una célula huésped tal como se describe bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido y la recuperación del polipéptido producido a partir del cultivo.

La especificación también describe un anticuerpo que reconoce específicamente un polipéptido tal como se describe

o un epítopo específico del mismo.

La especificación describe adicionalmente un método para la producción de plantas, células de plantas o tejidos de plantas transgénicos que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico divulgada en un formato expresable o en un vector divulgado en dicha planta, célula de la planta o tejido de la planta.

La especificación también describe un método para la producción de plantas, células de plantas o tejidos de plantas alterados que comprende la introducción de un polipéptido divulgado directamente en una célula, un tejido o un órgano de dicha planta.

La especificación también divulga un método para filtrar la expresión de un polipéptido descrito que comprende la introducción de una molécula de ácido nucleico divulgada enlazado operativamente con una o más secuencias de control o un vector divulgado de manera estable en el genoma de una célula de planta. La especificación describe adicionalmente un método tal como se describe más arriba que comprende adicionalmente regenerar una planta a partir de dicha célula de planta.

La especificación también describe una célula de planta transgénica que comprende una secuencia de ácido nucleico divulgada la cual esta enlazada operativamente a elementos reguladores que permiten la transcripción y/o expresión de dicho ácido nucleico en células de plantas o que es obtenible por un método como el explicado anteriormente.

La especificación también describe una célula de planta transgénica tal como la descrita anteriormente en donde el ácido nucleico divulgado está integrado de manera estable en el genoma de dicha célula de planta.

La especificación describe también una planta transgénica o un tejido de planta que comprende células de planta tal como se describen aquí y también a una parte cosechable de dicha planta transgénica, preferiblemente seleccionada del grupo consistente de semillas, hojas, frutos, cultivos de tallos, raíces, tubérculos, rizomas y bulbos. La invención también se relaciona con la progenie derivada de cualquiera de dichas plantas o partes de plantas transgénicas.

La especificación también describe un método para estimular el crecimiento de las raíces que comprende la expresión de un ácido nucleico divulgado o que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de las citoquininas activas en plantas o partes de plantas.

En otro aspecto de la invención, se provee un método para incrementar el tamaño y/o peso de la semilla. El método comprende incrementar el nivel o actividad de una citoquinina oxidasa en una planta o incrementar el nivel o actividad de una proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en una planta o en una parte de una planta, preferiblemente semillas.

También pueden incrementarse diversas partes (órganos) de la semilla en tamaño y/o peso, tal como, por ejemplo, embrión, endospermo, recubrimiento de la semilla o aleurona. Por ejemplo, de acuerdo con la presente invención, se provee un método para incrementar el tamaño y/o peso del embrión. El método comprende el incremento en el nivel

o actividad de una citoquinina oxidasa en una planta o en el incremento del nivel o actividad de una proteína que reduzca el nivel de las citoquininas activas en una planta o parte de una planta, preferiblemente en embriones. En aún otro aspecto de la invención, se provee un método para incrementar el tamaño y/o peso de los cotiledones. El método comprende incrementar el nivel o actividad de una citoquinina oxidasa en una planta o incrementar el nivel o actividad de una proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en una planta o parte de una planta, preferiblemente cotiledones.

De acuerdo con los métodos de incremento del tamaño y/o peso de la semilla, hay un incremento resultante en la velocidad de crecimiento de las semillas o un incremento en el vigor temprano. También se obtienen incrementos en rendimiento. De la misma forma, de acuerdo con los métodos para incrementar el tamaño y/o peso de los embriones, y tamaño y/o peso de los cotiledones, hay un incremento resultante en la velocidad de crecimiento de las semillas o un incremento en el vigor temprano. En muchos casos, se obtiene también incrementos en rendimiento. Los incrementos en el crecimiento de las semillas o del vigor temprano se asocian frecuentemente con tolerancia incrementada al estrés. Por ejemplo, el desarrollo más rápido de plantones, incluyendo los sistemas de raíces de los de plantones por germinación es crítico para la supervivencia particularmente bajo condiciones adversas tales como sequía.

Cualquier secuencia de nucleótidos que codifica un polipétido con actividad de citoquinina oxidasa puede utilizarse en los métodos de la invención. Por ejemplo, cualquiera de las secuencias diversas provistas aquí que codifican un polipéptido con actividad de citoquinina oxidasa pueden utilizarse en los métodos para incrementar el tamaño y/o peso de semillas, embriones o cotiledones.

Preferiblemente, se producen plantas transgénicas que expresan un ácido nucleico tal como el definido en cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 5, 25, o 27 o un ortólogo de dicho ácido nucleico. Preferiblemente, el ortólogo se deriva de una especie relacionada de la planta transgénica. Aún más preferiblemente, el ortólogo es específico (nativo o endógeno) a las especies de la planta transgénica.

Tal como se describió anteriormente, los promotores que controlan la expresión específica o preferencialmente pueden ser usados en los métodos de la invención. Así, cuando se desean incrementos en tamaño o peso de semillas, puede utilizarse un promotor específico para semillas. Cuando se desean incrementos en tamaño y peso de embriones, puede usarse un promotor específico para embriones. Cuando se desean incrementos en tamaño o peso de cotiledones, se prefiere un promotor que controle la expresión en cotiledones. Tales promotores son bien conocidos, ampliamente disponibles y se listan aquí por ejemplo en la Tabla 4.

En otra realización, la invención se relaciona con un método para incrementar el tamaño o peso de la semilla, o ambos, comprendiendo dicho método la expresión de un ácido divulgado o comprendiendo la expresión de otra proteína que reduzca el nivel de la actividad de las citoquininas en plantas o partes de plantas.

En aún otra realización, la invención se relaciona con un método para incrementar el tamaño o peso de un embrión,

o ambos, comprendiendo dicho método la expresión de un ácido divulgado o comprendiendo la expresión de otra proteína que reduzca el nivel de las citoquininas activas en plantas o partes de plantas.

En aún otra realización, la invención se relacionas con un método para incrementar el tamaño de los cotiledones que comprende la expresión de un ácido nucleico divulgado o comprende la expresión de otra proteína que reduzca el nivel de las citoquininas en plantas o partes de plantas. La expresión localizada de un gen sujeto de citoquinina oxidasa o parte del mismo, o de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas lleva a un crecimiento potenciado de los cotiledones. En especies que tienen cotiledones como órganos de almacenamiento, tal crecimiento potenciado de los cotiledones lleva a rendimientos potenciados y/o a un rendimiento potenciado del crecimiento de los plantones. Adicionalmente en este aspecto, los carbohidratos, lípidos y proteínas son todos almacenados dentro de las semillas y son metabolizados durante la germinación con el fin de proveer energía y metabolitos durante el crecimiento temprano de la planta. El tamaño de las semillas está asociado frecuentemente con el vigor temprano, puesto que semillas más grandes contienen más carbohidratos, lípidos y proteínas y así confieren un crecimiento más rápido. Así, los métodos de la presente invención llevan a un crecimiento más rápido de los plantones. Tal vigor temprano está asociado con una tolerancia mejorada al estrés. Por ejemplo, el desarrollo más rápido de un sistema radicular de una planta es crítico para la supervivencia, particularmente bajo condiciones adversas, tales como sequía. El vigor temprano también está relacionado con el rendimiento potenciado y en tiempo acortado de la floración.

Una célula de una planta o un cultivo de tejidos es un cultivo producido artificialmente de células de la planta o tejidos de la planta que crece en un medio especial, bien sea líquido o sólido, el cual provee a estas células o tejidos vegetales con todos los requerimientos necesarios para el crecimiento y/o producción de ciertos compuestos. Los cultivos de células y/o tejidos vegetales pueden utilizarse para la propagación rápida de plantas y para la producción de plantas transgénicas para nombrar unos pocos ejemplos. La formación de las raíces puede ser difícil para algunos explantes o bajo algunas condiciones en dichos cultivos y la expresión de un gen de citoquinina oxidasa en dichas células o tejidos vegetales cultivados puede utilizarse para potenciar la formación de raíces. El cultivo de células y/o tejidos vegetales puede utilizarse para la producción industrial de compuestos valiosos. Los compuestos de producción posibles son agentes farmacéuticos, pesticidas, pigmentos, cosméticos, perfumes, aditivos para alimentos, etc. Un ejemplo de tal producto es la shikonina, la cual es producida por las raíces de la planta Lithospermum erythrorhizon. Un ejemplo de un cultivo de tejido vegetal es un cultivo de raíces vellosas, el cual es una masa producida artificialmente de raíces vellosas. Las raíces de L. erythrorhizon son difíciles de recolectar en gran número y preparando cultivos de raíces vellosas, la shikonina como producto final puede ser preparada industrialmente a una velocidad más rápida de lo que ocurriría normalmente. Como se divulga aquí, la expresión de la citoquinina oxidasas potencia el crecimiento y desarrollo de las raíces y por lo tanto puede ser utilizada ventajosamente en dichos procedimientos de cultivos de células y tejidos vegetales. La especificación describe un método para estimular el crecimiento y desarrollo de raíces que comprende la expresión de un ácido nucleico que codifica una citoquinina oxidasa de planta, preferiblemente una citoquinina oxidasa divulgada, en un cultivo de célula

o tejido de planta transgénica que comprende dichas células de planta transgénica.

La especificación bien describe un método para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias que comprende la expresión de un ácido nucleico de la invención o comprende la expresión de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas.

La especificación también describe un método para alterar el geotropismo de una raíz que comprende alterar la expresión de un ácido nucleico de la invención o comprende la expresión de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas de plantas o partes de plantas.

La especificación también describe métodos para potenciar el vigor temprano y/o para modificar la relación raíces/brotes y/o para mejorar la resistencia al alojamiento y/o para incrementar la tolerancia a la sequía y/o para promover la propagación in vitro de explantes que comprende la expresión de un ácido nucleico divulgado que comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de las citoquininas activas en plantas o partes de plantas.

La especificación describe adicionalmente métodos para incrementar el tamaño de la raíz o el tamaño del meristema de la raíz que comprende la expresión de un ácido nucleico divulgado o comprende la expresión de otra proteína que reduce el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas, preferiblemente en raíces. La especificación describe un método para incrementar el tamaño del meristema de brote que comprende la subregulación de la expresión de un ácido nucleico de la invención, preferiblemente en brotes.

La especificación también describe un método para retardar la senescencia de las hojas que comprende la subregulación de la expresión de cualquiera de las citoquinina oxidasas en hojas, preferiblemente en hojas senescentes. También la especificación describe un método para alterar la senescencia de las hojas que comprende la expresión de una de las citoquinina oxidasas en la senescencia de las hojas.

La especificación también describe métodos para incrementar el espesor de las hojas que comprende la expresión de un ácido nucleico divulgado o comprende la expresión de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas en plantas o partes de plantas, preferiblemente en hojas.

La especificación también describe un método para reducir el tamaño de los vasos que comprende la expresión de un ácido nucleico divulgado o comprende la expresión de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas, preferiblemente en vasos.

La especificación describe adicionalmente un método para incrementar el tamaño del vaso que comprende la subregulación de la expresión de un ácido nucleico divulgado en plantas o partes de plantas.

La especificación también describe un método para mejorar la verticalidad de los plantones que comprende la expresión de un ácido divulgado o que comprende la expresión de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en plantones.

Adicionalmente, la especificación describe cualquiera de los métodos descritos anteriormente, llevando dicho método a un incremento en rendimiento.

La especificación describe adicionalmente cualquiera de los métodos en donde dicha expresión de dicho ácido nucleico ocurra bajo el control de un promotor constitutivo fuerte. Con respecto a aquellos aspectos que tiene efectos sobre las raíces de las plantas, tales como, por ejemplo, métodos para estimular el crecimiento de las raíces, potenciar la formación de raíces laterales o adventicias, o para alterar el geotropismo de las raíces, preferiblemente, la expresión de un ácido nucleico objeto preferiblemente ocurre bajo el control de un promotor que se expresa preferencialmente en las raíces. En la Tabla 5 se incluye una lista no exhaustiva de los promotores específicos para raíces. Un promotor específico para ser utilizado en los métodos de la especificación es el promotor homólogo de la raíz clavata, que tiene una secuencia como la dada en SEQ ID NO: 36.

Con respecto a aquellos aspectos de la invención que tienen efectos sobre las semillas de las plantas tales como, por ejemplo, métodos para incrementar el tamaño o peso de las semillas, tamaño o peso de los embriones, o que tienen efectos sobre los cotiledones de las plantas tales como métodos para incrementar el tamaño o peso de los cotiledones, la expresión de un ácido nucleico objeto ocurre bajo el control de un promotor que se expresa específicamente en semillas. Un promotor específico para semillas puede ser uno que se exprese en todos los órganos de las semillas o uno que permita una preferencia en la expresión en uno o más órganos o tejidos tales como el embrión, endospermo, o aleurona. Ejemplos de tales promotores se definen aquí en la Tabla 4.

La especificación también describe un método para modificar el desarrollo de la célula y/o modificar el desarrollo de la planta y/o modificar la morfología de la planta y/o modificar la bioquímica de la planta y/o modificar la fisiología de la planta y/o modificar la velocidad de progresión del ciclo celular que comprende la medicación de la expresión en células, tejidos u órganos particulares de una planta, de un ácido nucleico divulgado.

La especificación también describe un método para un crecimiento potenciado, y/o un rendimiento incrementado y/o una senescencia alterada de una célula, tejido y/o órgano de una planta y/ o una frecuencia incrementada de formación de órganos laterales en una planta, comprendiendo la expresión ectópica de un ácido nucleico divulgado.

La especificación también describe un método para promover y extender la actividad de división celular en células en condiciones adversas de crecimiento y/o bajo estrés, comprendiendo la expresión ectópica de una secuencia de ácido nucleico divulgado.

La especificación también describe un método para identificar y obtener proteínas, interactuar con un polipéptido divulgado que comprende una prueba de selección donde se utiliza uno de los divulgados.

La especificación también describe un método para identificar y obtener proteínas que interactúan con un polipéptido divulgado que comprende una prueba de selección de dos híbridos en donde se usan un polipéptido divulgado como cebo y una biblioteca de ADNc como presa.

La especificación describe adicionalmente un método para modular la interacción entre un polipéptido divulgado y asociados de interacción con la proteína mediante un método tal como el descrito anteriormente.

La especificación se relaciona con un método para identificar y obtener compuestos que interactúan con un polipéptido divulgado que comprende las etapas de:

(a)

proveer un sistema de dos híbridos en donde un polipéptido divulgado y un asociado proteínico interactuante obtenibles por el método como se describió anteriormente,

(b)

interactuar dicho compuesto con el complejo formado por los polipéptidos expresados tal como se define en a), y,

(c)

llevar a cabo mediciones (en tiempo real) de la interacción de dicho compuesto con dicho polipéptido o el complejo formado por los polipéptidos expresados tal como se definen en a).

La especificación describe adicionalmente un método para identificar compuestos o mezclas de compuestos que se enlazan específicamente a un polipéptido divulgado que comprende:

(a)

combinar un polipéptido divulgado con dicho compuesto o mezclas de compuestos bajo condiciones adecuadas para permitir la formación de complejos, y,

(b)

detectar la formación de complejos, en donde la presencia de un complejo identifica un compuesto o mezcla que se enlaza específicamente a dicho polipéptido.

La especificación también describe un método como el descrito anteriormente en donde dicho compuesto o mezcla inhibe la actividad de dicho polipéptido divulgado y puede ser utilizado para el diseño racional de agentes químicos.

La especificación describe el uso de un compuesto o mezcla identificado por medio de un método tal como se describió anteriormente como regulador del crecimiento vegetal o herbicida.

La especificación también describe un método para la producción de una composición reguladora del crecimiento vegetal o herbicida que comprende las etapas de los métodos de selección de compuestos descritos anteriormente y la formulación de los compuestos obtenidos a partir de dichas etapas en una forma adecuada para la aplicación en agricultura o en el cultivo de células o tejidos vegetales.

La especificación también describe un método para incrementar la ramificación que comprende la expresión de un ácido nucleico divulgado en plantas o partes de plantas, preferiblemente en tallos o brotes axilares.

La especificación también describe un método para mejorar la resistencia al alojamiento que comprende la expresión de un ácido nucleico de la invención en plantas o partes de plantas, preferiblemente en tallos o brotes axilares.

La especificación también describe un método para el diseño de o selección de agentes químicos promotores del crecimiento o herbicidas que comprende el uso del ácido nucleico divulgado o de un vector divulgado.

La especificación describe el uso de una molécula de ácido nucleico divulgado, un vector divulgado o un polipéptido divulgado para incremento del rendimiento.

La especificación también describe el uso de una molécula de ácido nucleico divulgada, un vector divulgado o un polipéptido divulgado para la estimulación del crecimiento de la raíz.

La especificación también describe el uso de una molécula de ácido nucleico divulgado, un vector divulgado o un polipéptido divulgado para potenciar la formación de raíces laterales o adventicias.

La especificación también describe el uso de una molécula de ácido nucleico divulgado, un vector divulgado o un polipéptido divulgado para alterar el geotropismo de la raíz.

La especificación también describe el uso de una molécula de ácido nucleico divulgado, un vector divulgado o un polipéptido divulgado para incrementar al menos uno de tamaño de semilla, peso de semilla, tamaño del embrión, peso de embrión, tamaño de cotiledón, y peso de cotiledón.

La especificación describe adicionalmente el uso de una molécula de ácido nucleico divulgado, un vector divulgado o un polipéptido divulgado para potenciar el vigor temprano y/o para modificar la relación raíces/brotes y/o para mejorar la resistencia al alojamiento y/o para incrementar la tolerancia a la sequía y/o para promover la propagación in vitro de explantes.

La especificación también describe el uso de una molécula de ácido nucleico divulgado, un vector recombinante divulgado o un polipéptido divulgado para modificar el desarrollo de una planta y/o para modificar la morfología de una planta y/o para modificar la bioquímica de una planta y/o para modificar la fisiología de una planta.

La especificación describe una composición de diagnóstico que comprende al menos una molécula de ácido nucleico descrita, un vector divulgado, un polipéptido divulgado o un anticuerpo divulgado.

La presente especificación también describe el uso de material de raíces transgénicas que tiene un crecimiento y desarrollo de raíz potenciado debido a la expresión de una citoquinina oxidasa en procedimientos de injerto con un injerto para producir una planta o árbol con características agrícolas u hortícolas mejoradas. El injerto puede ser transgénico o no transgénico. Las características específicas previstas son aquellas conferidas por los sistemas de raíces e incluyen anclado mejorado de la planta/árbol en el suelo y/o absorción mejorada de agua dando como resultado por ejemplo en una tolerancia mejorada a la sequía y/o una absorción mejorada de nutrientes del suelo y/o un transporte mejorado de sustancias orgánicas a través de la planta y/o una secreción potenciada de sustancias en el suelo tales como por ejemplo fitosideróforos y/o respiración mejorada y/o resistencia mejorada a enfermedades y/o rendimiento mejorado. Una ventaja de utilizar raíces transformadas AtCKX para injertos, además de su sistema de raíces potenciado, es la senescencia retrasada de las hojas en el injerto, tal como se divulga aquí (véase Figura 12 A). Plantas o árboles preferidos para esta realización particular incluyen plantas o árboles que no crezcan bien con sus propias raíces y que se injertan en localizaciones cultivadas tales como variedades comercialmente explotables de viñas, cítricos, albaricoques, almendras, ciruelas, melocotones, manzanas, peras, cerezas, nueces, higos, avellanas y níspero del Japón.

Como se mencionó supra, las auxinas y las citoquininas actúan como antagonistas en ciertos procesos biológicos. Por ejemplo, la relación citoquinina/auxina regula la producción de raíces y brotes, teniendo una alta concentración de auxina el efecto de generar raíces organizadas y una alta concentración de citoquininas teniendo como efecto la producción de brotes. Tal como se divulgó en esta especificación, la expresión de las citoquinina oxidasas en tabaco y Arabidopsis da como resultado un desarrollo de raíces potenciado consistente con los efectos potenciados de la auxina. Las auxinas también están involucradas en el desarrollo de los frutos. El tratamiento de partes femeninas de la flor con auxina da como resultado el desarrollo de frutos partenocárpicas en algunas especies de plantas. El desarrollo de frutos partenocárpicos ha sido manipulado genéticamente en varias plantas de cultivo hortícola a través de la biosíntesis incrementada de auxinas en los órganos reproductores femeninos (WO0105985).

Por lo tanto, esta especificación describe un método para introducir las características partenocárpicas en plantas, consistiendo dicho método en la subregulación de la expresión de una o más de citoquinina oxidasas o de otra proteína que reduzca el nivel de citoquininas activas en plantas o partes de plantas, preferiblemente en los órganos reproductores femeninos tales como placenta, óvulos y tejidos derivados de la misma. La región promotora DefH9 de Antirrhinum majus o de uno de sus homólogos, la cual confiere una alta especificidad en la expresión en placenta y óvulos, puede ser utilizada para este propósito.

Los experimentados en la técnica entenderán que la invención descrita aquí está sujeta a variaciones y modificaciones diferentes a las descritas específicamente. Debe entenderse que la invención descrita aquí incluye todas tales variaciones y modificaciones. La invención también incluye todas las tales etapas, características, tales composiciones y compuestos citados o indicados en esta especificación, individual o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones de cualquiera o más de dichas etapas o características.

La presente invención es aplicable a cualquier planta, en particular a plantas monocotiledóneas y plantas dicotiledóneas que incluyen una legumbre para alimentación o forraje, plantas ornamentales, cultivos para alimentación, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp.,Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp.,

Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp.,Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incarnata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotiloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostilis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stilosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophilla, Vaccinium spp., Vicia spp. Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aetiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, espárragos, brócoli, repollitas de bruselas, repollo, canola, zanahoria, coliflor, apio, coles, linazaberza, lentejas, colza, ocra, cebollas, patatas, arroz, soja, heno, remolacha de azúcar, caña de azúcar girasol, tomates, calabazas y te, entre otros, o la semilla de cualquier planta citada específicamente más arriba o un cultivo de tejidos, células u órganos de cualquiera de las especies anteriores.

A través de esta especificación, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprende", y sus variaciones tales como "comprenden" y "que comprende", se entenderán con la implicación de la inclusión del entero establecido o etapa o grupos de enteros o etapas pero no la exclusión de ningún entero o etapa o grupo de enteros

o etapas.

Tal como se utiliza aquí, el término "derivado de" debe entenderse para indicar que un entero particular o grupo de enteros se ha originado de las especies identificadas, pero no ha sido obtenido de manera necesaria directamente de la fuente especificada.

Los términos "proteína (s)", "péptido (s)" u "oligopéptido (s)", cuando se utilizan aquí se refieren a aminoácidos en una forma polimérica de cualquier longitud. Dichos términos también incluyen modificaciones conocidas de aminoácidos tales como formación de puentes de disulfuro, cisteinilación, oxidación, glutationilación, metilación, acetilación, farnesilación, biotinilación, estearoilación, formilación, adición de ácido lipoico, fosforilación, sulfatación, , ubiquitinación miristoilación, palmitoilación, geranilgeranilación, ciclización (por ejemplo, formación de ácido piroglutámico), oxidación, desamidación, deshidratación, glicosilación (por ejemplo, pentosas, hexosaminas, Nacetilhexosaminas, desoxihexosas, hexosas, ácido siálico, etc.) y acilación, así como residuos de aminoácidos de origen no natural, residuos de L-aminoácidos y residuos de D-aminoácidos.

"Homólogos" de una proteína divulgada son aquellos péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que contienen sustituciones eliminaciones y/o adiciones de aminoácidos con respecto a la dicha proteína con respecto a la cual son un homólogo, sin alterar una o más de sus propiedades funcionales, en particular sin reducir la actividad del resultado. Por ejemplo, un homólogo de dicha proteína consistirá de una secuencia de aminoácidos bioactiva variante de dicha proteína. Para producir tales homólogos, los aminoácidos presentes en la dicha proteína pueden ser reemplazados por otros aminoácidos que tengan propiedades similares, por ejemplo hidrofobicidad, hidrofilicidad, momento hidrófobo, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras en hélice a o estructuras en lámina � y así sucesivamente. Una revisión de las propiedades físicas y químicas de los aminoácidos se da en la Tabla 1.

Las variantes de sustitución de una proteína divulgada son aquellas en las cuales al menos un residuo en dicha secuencia de aminoácidos de dicha proteína ha sido eliminado y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero pueden ser aglomeradas dependiendo de las restricciones funcionales colocadas en el polipéptido; las inserciones normalmente serán del orden de aproximadamente 1 -10 residuos de aminoácidos y las eliminaciones variarán desde aproximadamente 1 20 residuos. Preferiblemente las sustituciones de aminoácidos comprenderán sustituciones de aminoácidos conservadoras, tales como los descritos supra.

Tabla 1. Propiedades de aminoácidos de origen natural

Propiedades de Carga/ Hidrofobicidad

Grupo lateral Aminoácido

No polar hidrófoba

Alifático Alifático, con contenido de S Aromático Imino ala, ile, leu, val met phe, trp pro

polar no cargado

Alifático Amida Aromático Hidroxilo Sulfhidrilo gly asn, gln tyr ser, thr cys

Cargado positivamente

Básico arg, his, lys

Cargado negativamente

Ácido asp, glu

Las variantes de la secuencia de inserción de aminoácidos de una proteína divulgada de la invención son aquellas en las cuales uno o más residuos de aminoácidos son introducidos en un sitio predeterminado en dicha proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones amino terminales y/o carboxiterminales así como inserciones intrasecuencia de aminoácidos individuales o múltiples. En general, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones amino o carboxilo terminales, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Ejemplos de proteínas o péptidos de fusión amino o carboxilo terminales incluyen el dominio de enlazamiento o dominio de activación de un activador transcripcional tal como se utiliza en un sistema de dos híbridos, proteínas de recubrimiento de fagos, etiqueta de (histidina)6, glutationa S-transferasa, proteína A, proteína de enlazamiento a maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo tage100 (EETARFQPGYRS) epítopo c-myc (EQKLISEEDL), epítopo FLAG® (DYKDDDK), lacZ, CMP (péptido de enlazamiento a la calmodulina), epítopo HA (YPYDVP-DYA), epítopo proteína C (EDQVDPRLIDGKI) y epítopo VSV (YTDIEMNRLGK).

Las variantes de eliminación de una proteína de la invención se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de dicha proteína.

Las variantes de aminoácidos de una proteína divulgada pueden hacerse fácilmente utilizando técnicas de síntesis de péptidos bien conocidas en el arte, tales como la síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por manipulaciones de ADN recombinante. La manipulación de secuencias de ADN para producir proteínas variantes que manifiesten las variantes de sustitución, inserción o eliminación son bien conocidas en el arte. Por ejemplo, las técnicas para hacer mutaciones por sustituciones en sitios predeterminados en ADN que tienen secuencia conocida son bien conocidas para los expertos en la técnica, tales como la mutagénesis M13, el conjunto de mutagénesis in vitro del gen T7 (USB, Cleveland, OH), el conjunto de mutagénesis de QuickChange Site Directed (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis mediada por PCR dirigida al sitio u otros protocolos de mutagénesis dirigidas al sitio.

En la presente especificación los porcentajes de “identidad” y/o “similitud” entre secuencias de ADN y/o proteínas se calculan utilizando programas de ordenador conocidos en la técnica tales como los programas DNAstar/MegAlign en combinación con el método Clustal.

“Derivados” de una proteína divulgada son aquellos péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que comprenden al menos aproximadamente cinco residuos de aminoácidos contiguos de dicho polipéptido pero que retienen la actividad biológica de dicha proteína. Un “derivado” puede comprender adicionalmente otros residuos de aminoácidos de origen natural, alterados por glicosilación, asilados o de origen no natural en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma de origen natural de dicho polipéptido. Alternativamente o además, un derivado puede comprender uno o más sustituyentes diferentes a aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma de origen natural de dicho polipéptido, por ejemplo, una molécula informadora u otro ligando, enlazada de manera covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos tal como, por ejemplo, una molécula informadora la cual es enlazada al mismo para facilitar su detención.

Con “inmunológicamente activo” se entiende que una molécula o fragmento específicos de la misma tales como epítopos o haptenos específicos son reconocidos por, por ejemplo enlazarse a anticuerpos. Pueden determinarse epítopos específicos utilizando, por ejemplo, técnicas de barrido de péptidos tal como se describe en Geysen et al.

(1996) (Geysen, H. M., Rodda, S.J. and Mason, T.J. (1986). A priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant. Mol. Immunol. 23, 709-715.).

El término “fragmento de una secuencia” o “parte de una secuencia” significa una secuencia truncada de la secuencia original a al cual se hace referencia. La secuencia truncada (secuencia de ácidos nucleicos o proteínas) puede variar ampliamente en longitud; es el tamaño mínimo para hacer una secuencia de tamaño suficiente para proveer una secuencia con al menos una función y/o actividad comparable o la secuencia original a la que se hace referencia (por ejemplo, “fragmento funcional”), mientras que el tamaño máximo no es crítico. En algunas aplicaciones, el tamaño máximo usualmente no es sustancialmente superior que el requerido para proveer la actividad y/o función deseadas de la secuencia original. Típicamente, la secuencia de aminoácidos truncada va desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 60 aminoácidos de longitud. Más típicamente, sin embargo, la secuencia tendrá un máximo de 50 aminoácidos de longitud, preferiblemente un máximo de aproximadamente 60 aminoácidos. Esto es deseable usualmente para seleccionar secuencias de al menos 10, 12 o 15 aminoácidos, hasta un máximo de aproximadamente 20 o 25 aminoácidos.

Los fragmentos funcionales también pueden incluir aquellos que comprenden un epítopo el cual es específico para las proteínas divulgadas. Los fragmentos funcionales preferidos tienen una longitud de al menos, por ejemplo, 5, 10, 25, 100, 150 o 200 aminoácidos.

Debe entenderse así que los fragmentos funcionales también pueden ser o no fragmentos inmunológicamente activos.

En el contexto de la presente especificación son homólogos incorporados, derivados y/o fragmentos inmunológicamente activos y/o funcionales de la citoquinina oxidasa tal como se definieron anteriormente. Homólogos, derivados y/o fragmentos inmunológicamente y/o funcionalmente activos preferidos particularmente de las proteínas de citoquinina oxidasa que se contemplan para uso en la presente invención son derivados de plantas, más específicamente de Arabidopsis thaliana, aún más específicamente dichas citoquinina oxidasas son la Arabidopsis thaliana (At) CKX, o son capaces de ser expresados en la misma. La presente invención contempla claramente el uso de homólogos funcionales o derivados y/o fragmentos inmunológicamente activos de las proteínas AtCKX y no está limitada en su aplicación al uso de secuencias de nucleótidos que codifican una de dichas proteínas AtCKX.

Cualquiera de dichas proteínas, polipéptidos, péptidos o fragmentos de los mismos pueden producirse en un sistema biológico, por ejemplo, un cultivo de células. Alternativamente cualquiera de dichas proteínas, polipéptidos, péptidos y fragmentos de los mismos pueden ser manufacturados químicamente, por ejemplo, mediante síntesis de péptidos en fase sólida. Dichas proteínas o fragmentos de los mismos pueden ser parte de una proteína de fusión como en el caso de por ejemplo, un ensayo de dos híbridos lo que permite, por ejemplo, la identificación de las proteínas que interactúan con una citoquinina oxidasa divulgada.

Las proteínas o fragmentos de las mismas son adicionalmente útiles, por ejemplo, para modular la interacción entre una citoquinina oxidasa divulgada y asociados proteínicos de interacción obtenidos por un método de la invención. Los péptidos sintetizados químicamente son particularmente útiles, por ejemplo, como fuente de antígenos para la producción de antisueros y/o anticuerpos.

“Anticuerpos” incluye anticuerpos monoclonales, policlonales, sintéticos o de camello de cadena pesada así como fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab, Fv o scFv. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales por técnicas tal como se describen en, por ejemplo, Liddle y Cryer (1991) los cuales comprenden la función de células de mieloma de ratón en células de bazo derivadas de animales inmunizados. Adicionalmente, los anticuerpos o fragmentos de los mismos hasta una molécula o fragmentos de la misma pueden obtenerse utilizando métodos como los que se describen en, por ejemplo, Harlow y Lane (1988). En el caso de anticuerpos dirigidos contra péptidos pequeños tales como fragmentos de una proteína divulgada, dichos péptidos están acoplados generalmente a una proteína portadora antes de la inmunización de los animales. Tales portadores proteínicos incluyen a la hemocianina de lapa (KLH), albumina de suero bovino (BSA), o valbúmina y toxoides de tétano. La proteína portadora potencia la respuesta inmune del animal y proporciona epítopos para los sitios de enlazamiento del receptor de células T. El término “anticuerpo” incluye adicionalmente derivados de los mismos tales como anticuerpos marcados. Los marcadores de anticuerpos incluyen fosfatasa alcalina, PKH2, PKH26, PKH67, fluoresceína (FITC), Hoechst 33258, R-ficoeritrina (PE), rodamina (TRITC), rojo cuantum, rojo Texas, Cy3, biotina, agarosa, peroxidasa y esferas de oro. Herramientas en la biología molecular que se basan en anticuerpos contra una proteína incluyen análisis de inmunoprecipitación en gel de proteínas, selección de bibliotecas de expresión que permiten identificación de genes, métodos cuantitativos para proteínas incluyendo ELISA y RIA, purificación de proteínas por inmunoafinidad, inmunoprecipitación de proteínas (véase, por ejemplo, Ejemplo 6) e inmunolocalización. Otros usos de anticuerpos y especialmente de anticuerpos de péptidos incluyen el estudio de el procesamiento proteolítico (Loffler et al 1994, Woulfe et al, 1994), la determinación de sitios activos en proteínas (Lerner 1982), el estudio del precursor y el tratamiento por postranslacional (Baron and Interactions (Murakami et al.

1992), identificación de dominios proteínicos involucrados en la interacciones proteína-proteína (Murakami et al, 1992) y el estudio de el uso de exones en la expresión genética (Tamura et al, 1991).

Se describen anticuerpos que reconocen específicamente una citoquinina oxidasa o un homólogo, derivado o fragmento de la misma como se definió anteriormente. Preferiblemente dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa vegetal, específicamente una de las citoquinina oxidasas de la Arabidopsis thaliana (ATCKX).

Los términos “gen (s)” “polinucleótido (s)”, ácido (s) nucleico (s)”, “secuencia (s)” de ácido (s) nucleico (s)”, “secuencia (s) de nucleótido (s)” o “molécula (s) de ácido (s) nucleico (s)”, cuando se utilizan aquí se refieren a nucleótidos, bien sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en una forma polimérica de cualquier longitud. Dichos términos incluyen adicionalmente ADN y ARN de cadena doble y cadena individual. Dichos términos también incluyen modificaciones conocidas en nucleótidos tales como metilación, ciclización y “tapas” y sustitución de uno o más nucleótidos de origen natural con un análogo tal como inosina. Modificaciones de nucleótidos incluyen la adición de acridina, amina, biotina, azul cascada, colesterol, Cy3®, Cy5®, Cy5.5®, dabcil, digoxigenina, dinitrofenilo, Edans, 6-FMA, fluoresceína, 3’-glicerilo, HEX, IRD-700, IRD-800, JOE, fosfato psoraleno, rodamina, ROX, tiol (SH), espaciadores, TAMRA, TET, AMCA-S®, SE. BOOIPY®, Marina Blue®, Pacific Blue®, Oregon Green ®, Rhodamine Green®, Rhodamine Red®, Rhodol Red® y Texas Red®. Modificaciones del esqueleto de los polinucleótidos incluyen metilfosfonato, 2’-OMe-metilfosfonato RNA, fosforotiorato, RNA, 2’-OMeRNA. Modificaciones en base incluyen 2-amino-dA, 2-aminopurina, 3’-(ddA), 3’dA(cordicepin), 7-desaza-dA, 8-Br-dA, 8-oxo-dA, N6-Me-dA, sitio abásico (dSpacer), biotina dT, 2’-OMe-5Me-C, 2’OMe-propinil-C, 3’-(5-Me-dC), 3’-(ddC), 5-Br-dC, 5-1-dC, 5-MedC, 5-F-dC, carboxi-dT, dA convertible, dC convertible, dG convertible, dT convertible, dU convertible, 7-desaza-dG, 8-Br-dG, 8-oxo-dG, O6-Me-dG, S6-DNPdG, 4-metil-indol, 5-nitroindol, 2’-OMe-inosiae, 2’-dl, 06-fenil-dl, 4-metilindol, 2’-desoxinebularina, 5-nitroindol, 2aminopurina, dP (análogo de purina), dK análogo de pirimidina, 3-nitropirrol, 2-tio-dT, 4-tio-dT, biotin-dT, carboxi-dT, 04-Me-dT, O4-triazol dT, 2’-OMe-propinil-U, 5-Br-dU, 2’-dU, 5-F-dU, 5-IdU, O4-triazol dU. Dichos términos también abarcan ácidos nucleicos peptídicos (PNA), un análogo de ADN en el cual el esqueleto es un pseudopéptido que consiste de unidades N-(2-aminoetil)-glicina en vez de un azúcar. El PNA imita el comportamiento del ADN y se enlaza a cadenas de ácidos nucleicos complementarias. El esqueleto neutro de PNA da como resultado un enlazamiento más fuerte y una especificidad mayor de la alcanzada normalmente. Además, las propiedades químicas, físicas y biológicas únicas de PNA han sido explotadas para producir herramientas biomoleculares poderosas, agentes antisentido y antígeno, sondas moleculares y biosensores.

La presente especificación también provee ventajosamente secuencias de ácidos nucleicos de al menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos de un ácido nucleico divulgado y preferiblemente de 15 a 50 nucleótidos. Estas secuencias pueden ser usadas, ventajosamente, como sondas para hibridar específicamente a secuencias de la invención tal como se define anteriormente o cebadores para iniciar amplificación o replicación especificas de secuencias divulgadas tal como se definen anteriormente, o similares. Tales secuencias de ácidos nucleicos pueden producirse de acuerdo con técnicas bien conocidas en el arte, tal como por medios recombinantes o sintéticos.

Pueden ser usadas también en kits de diagnostico o similares para detectar la presencia de un ácido nucleico. Estas pruebas generalmente comprenden poner en contacto la sonda con la muestra bajo condiciones de hibridación y detectar la presencia de cualquier formación dúplex o triple entre la sonda y cualquier ácido nucleico en la muestra.

Ventajosamente, las secuencias de ácidos nucleicos, de acuerdo con la especificación pueden producirse utilizando tales medios recombinantes o sintéticos, tales como por ejemplo el uso de mecanismos de clonación por PCR los cuales generalmente involucran construir un par de cebadores, los cuales pueden tener de aproximadamente 15 a 50 nucleótidos hasta una región del gen en la cual se desea la clonación, poniendo los cebadores en contacto con ARNm, ADNc o ADN genómico de una célula, llevando a cabo una reacción en cadena de polimerasa bajo condiciones que produzcan la amplificación de la región deseada, aislando la región o fragmento amplificados y recuperando el ADN amplificado. En general, tales técnicas tal como se definen aquí son bien conocidas en el arte, tal como se describen en Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989).

Una “secuencia de codificación” o “marco de lectura abierto” o “ORF” se define como una secuencia de nucleótidos que puede ser transcrita en ARNm y/o traducida en un polipéptido cuando se coloca bajo el control de secuencias de control apropiadas o secuencias reguladoras, esto es, cuando dicha secuencia de codificación u ORF está presente en un formato expresable. Dicha secuencia de codificación de ORF está enlazada mediante un codón de inicio de traducción 5’ y un codón de detención de traducción 3’. Una secuencia de codificación u ORF puede incluir, pero no se limita a ARN, ARNm, ADNc, secuencias de nucleótidos recombinantes, secuencias de nucleótidos manufacturados sintéticamente o ADN genómico. Dicha secuencia de codificación u ORF puede ser interrumpida por secuencias de ácidos nucleicos intervinientes.

Los genes y secuencias de codificación que codifican esencialmente la misma proteína pero se aíslan a partir de diferentes fuentes pueden consistir de secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente divergentes. De manera reciproca, secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente divergentes pueden diseñarse para efectuar la expresión de esencialmente la misma proteína. Dichas secuencias de ácidos nucleicos son el resultado de, por ejemplo, la

existencia de alelos diferentes de un gen dado, o la degeneración del código genético o de diferencias en el uso de codones. Así, tal como se indica en la Tabla 2, aminoácidos tales como metionina o triptófano son codificados por un codón individualmente mientras que otros aminoácidos tales como arginina, leucina y serina pueden ser traducidos cada uno desde hasta 6 diferentes codones. Las diferencias en el uso de codones preferidos se ilustran en la Tabla 5 3 para agrobacterium tumefaciens (una bacteria), A. thaliana, M. sativa (plantas de dos dicotiledones) y Oryza sativa (una planta monocotiledónea). Para extraer un ejemplo, el codón GGC (para glicina) es el codón más frecuentemente usado en A. tumefaciens (36.2 ‰), es el segundo codón más frecuentemente utilizado en O. sativa pero se utilizan en frecuencias mucho menores en A. thaliana y M. sativa (9 ‰ y 8.4 ‰, respectivamente). De los cuatro posibles codones que codifican glicina (véase Tabla 2), dicho codón GGC es el más preferiblemente usado

10 en A. tumefaciens y O. sativa. Sin embargo, el A. thaliana es el codón GGA (y GGU) mientras que en M. sativa es el codón GGU (y GGA).

Las secuencias de ADN tal como se definen en la presente especificación pueden ser interrumpidas por secuencias intervinientes. Con “secuencias intervinientes” se indica cualquier secuencia de ácidos nucleicos que perturbe una secuencia de codificación que comprende dicha secuencia de ADN de la invención o que perturba el formato

15 expresable de una secuencia de ADN que comprende dicha secuencia de ADN de la invención. La eliminación de la secuencia interviniente restaura dicha secuencia de codificación o dicho formato expresable.

Ejemplos de secuencias intervinientes incluyen intrones y secuencias de ADN movilizables tales como transposones. Con “secuencia de ADN movilizable” se entiende cualquier secuencia de ADN que puede ser movilizada como el resultado de un evento de recombinación

20 Tabla 2. Degeneración del código genético

Aminoácido

Código de tres letras Código de una letra Codones posibles

Alanina

Ala A GCA GCC GCG GCU

Arginina

Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Asparagina

Asn N AAC AAU

Ácido Aspártico

Asp D GAC GAU

Cisteina

Cys C UGC UGU

Ácido Glutámico

Glu E GAA GAG

Glutamina

Gln Q CAA CAG

Glicina

Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina

His H CAC CAU

Isoleucina

Ile I AUA AUC AUU

Leucina

Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Lisina

Lys K AAA AAG

Metionina

Met M AUG

Fenilalanina

Phe F UUC UUU

Prolina

Pro P CCA CCC CCG CCU

Serina

Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU

Treonina

Thr T ACA ACC ACG ACU

Triptófano

Trp W UGG

Tirosina

Tyr Y UAC UAU

Valina

Val V GUA GUC GUG GUU

Posibles codones de "DETENCIÓN"

UAA

UAG UGA

Tabla 3. Uso de los codones indicados en los diferentes organismos dados como frecuencia por mil codones (http: //www.kazusa.or.jp/codon) (continuación)

Codón

Agrobacterium tumefaciens Arabidopsis thaliana Medicago sativa Oryza sativa

UUU

13.9 22.5 24.1 11.3

UUC

24.3 20.7 16.9 26.3

UUA

3.5 12.9 10.4 4.7

UUG

13.2 21.0 22.4 11.8

UCU

7.0 24.6 19.8 10.1

UCC*

14.8 10.8 7.7 16.9

UCA

7.4 17.8 17.2 9.7

UCG

18.2 8.9 3.2 10.8

UAU

12.3 15.2 16.6 9.2

UAC

10.3 13.7 14.0 20.6

UAA

0.9 0.9 1.2 0.9

UAG

0.6 0.5 0.8 0.8

UGU

3.0 10.8 10.6 5.0

UGC

7.4 7.2 5.8 14.3

UGA

1.8 1.0 0.8 1.3

UGG

12.2 12.7 10.0 12.8

CUU

19.1 24.3 28.3 14.6

CUC

25.7 15.9 12.0 28.0

CUA

5.2 10.0 8.8 5.7

CUG

31.6 9.9 8.5 22.1

CCU

7.7 18.3 23.2 11.8

CCC

10.6 5.3 5.3 12.5

CCA

8.9 16.1 22.6 12.2

CCG

20.7 8.3 3.6 16.7

CAU

10.6 14.0 14.6 9.2

CAC

9.1 8.7 9.1 14.6

CAA

11.2 19.7 23.2 11.9

CAG

24.9 15.2 12.3 24.6

CGU

12.2 8.9 10.1 6.8

CGC

25.5 3.7 4.2 15.9

CGA

8.2 6.2 4.2 4.2

CGG

13.2 4.8 1.8 9.7

AUU

15.4 22.0 29.4 13.8

AUC

36.9 18.5 14.7 25.5

Codón

Agrobacterium tumefaciens Arabidopsis thaliana Medicago sativa Oryza sativa

AUA

6.2 12.9 11.7 7.2

AUG

24.7 24.5 21.7 24.4

ACU

6.4 17.8 20.8 10.3

ACC

20.9 10.3 11.7 18.6

ACA

9.1 15.9 18.9 10.0

ACG

18.8 7.6 2.8 10.8

AAU

13.5 22.7 25.0 12.9

AAC

18.7 20.9 18.7 25.1

AAA

13.6 31.0 32.2 12.0

AAG

24.4 32.6 35.1 39.4

AGU

5.7 14.0 12.6 7.3

AGC

15.8 11.1 8.8 16.9

AGA

5.3 18.7 13.6 7.7

AGG

6.5 10.9 11.7 14.9

GUU

16.6 27.3 34.7 15.0

GUC

29.3 12.7 9.9 22.8

GUA

6.1 10.1 10.0 5.7

GUG

19.7 17.5 16.5 25.0

GCU

17.4 28.0 34.6 19.8

GCC

35.8 10.3 11.4 33.2

GCA

19.5 17.6 25.9 15.6

GCG

31.7 8.8 3.4 25.3

GAU

25.8 36.8 40.0 21.5

GAC

28.0 17.3 15.5 31.6

GAA

29.9 34.4 35.9 17.1

GAG

26.3 32.2 27.4 41.1

GGU

16.5 22.2 28.7 16.3

GGC

36.2 9.0 8.4 34.7

GGA

12.5 23.9 27.3 15.0

GGG

11.3 10.2 7.4 16.6

“Hibridación” es el proceso donde secuencias de nucleótidos complementarios sustancialmente homólogos se fusionan uno con otro. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente en solución, esto es, ambos ácidos 5 nucleicos complementarios están en solución. Las herramientas de biología molecular que se basan sobre tal proceso incluyen PCR, hibridación sustractiva y determinación de la secuencia de ADN. El proceso de hibridación también puede ocurrir con uno de los ácidos nucleicos complementarios y movilizado a una matriz tal como perlas magnéticas, perlas de Sefarosa o cualquier otra resina. Herramientas en biología molecular que se basan en tal proceso incluyen el aislamiento de poli ARNm (A+). El proceso de hibridación puede ocurrir adicionalmente con uno 10 de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizado sobre un soporte sólido tal como nitrocelulosa o membrana de nailon o inmovilizado por, por ejemplo, fotolitografía a, por ejemplo, un soporte de vidrio silíceo (el último conocido

como disposición de ácido nucleico o microdisposición o como chips de ácido nucleico). Las herramientas en biología molecular que se basan en tal proceso incluyen análisis de inmunoprecipitación en gel de ARN y ADN, hibridación de codones, hibridación en placa e hibridación en microdisposición. Con el fin de permitir que ocurra la hibridación, las moléculas de ácido nucleico son desnaturalizadas en general térmica o químicamente (por ejemplo, mediante NaOH) para fundir una cadena doble en dos cadenas sencillas y/o para eliminar horquillas u otras estructuras secundarias de ácidos nucleicos de cadena individual. La restricción de la hibridación es influenciada por condiciones tales como temperatura, concentración de sal y composición del regulador de hibridación. Las condiciones de alta restricción para la hibridación incluyen alta temperatura y/o baja concentración de sal (las sales incluyen NaCl y citrato de Na3) y/o la inclusión de formamida en el regulador de hibridación y/o la disminución de la concentración de los compuestos tales como SDS (detergente en el regulador de hibridación y/o exclusión de compuestos tales como sulfato de dextrano o polietilén glicol (que promueve la aglomeración molecular) del regulador de hibridación. Las condiciones de hibridación convencionales están descritas en, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) pero el experto en la técnica apreciará que pueden diseñarse numerosas condiciones de hibridación diferentes en función de la homología conocida o esperada y/o la longitud de la secuencia de aminoácidos. De manera suficiente las condiciones de hibridación con baja restricción son particularmente preferidas para aislar ácidos nucleicos heterólogos a las secuencias de ADN definidas más arriba. Elementos que contribuyen a dicha heterología incluyen alelismo, degeneración del código genético y diferencias en el uso del codón preferido como se discutió más arriba.

El término "hibridación específica" o "hibridación específicamente" se refiere al enlazamiento, duplicación o hibridación de una molécula a una secuencia de nucleótido particular bajo condiciones medias a restrictivas cuando tal secuencia se presenta en una mezcla compleja, por ejemplo, ADN o ARN celular total.

"Condiciones de hibridación restrictivas" y "condiciones de lavado de hibridación restrictiva" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico tal como hibridaciones Southern y Northern dependen de las secuencias y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Por ejemplo, secuencias más largas hibridizan específicamente a altas temperaturas. La Tm es la temperatura bajo fuerza iónica y pH definidos, en la cual el 50% de la secuencia objetivo hibridiza a una sonda perfectamente coincidente. La especificidad es típicamente función de los lavados posthibridación. Factores críticos de tales lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final.

En general, se seleccionan condiciones restrictivas alrededor de 50ºC por debajo del punto de fusión térmico (Tm) de la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos) en la cual el 50% de la secuencia objetivo hibridiza a una sonda perfectamente coincidente. Las Tm dependen de las condiciones de la solución y la composición básica de la sonda, y puede calcularse utilizando la siguiente ecuación:

Condiciones restrictivas más preferidas son cuando la temperatura está 20ºC por debajo de Tm, y las condiciones de restricción más preferidas son cuando la temperatura está 10ºC por debajo de Tm. El enlazamiento no específico puede controlarse también utilizando cualquiera de un número de técnicas conocidas tales como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen proteína, adición de ARN, ADN y SDS heterólogos, al regulador de hibridación, y tratamientos con RNasa.

Las condiciones de lavado se ejecutan típicamente en o por debajo de la restricción. En general, las condiciones restrictivas adecuadas para los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos o procedimientos de detección de la amplificación genética están bien definidas anteriormente. Pueden seleccionarse también más o menos condiciones restrictivas

Para los propósitos de definir el nivel de restricción, puede hacerse referencia convenientemente a Sambrook, J.,

E.F. Fritsch, et al. 1989 "Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, at 11.45. Un ejemplo de condiciones de baja restricción es 4-6X SSC/0.1-0.5% p/v de SDS a 37º-45ºC durante 2-3 horas. Dependiendo de la fuente y concentración del ácido nucleico involucrado en la hibridación, pueden emplearse condiciones alternativas de astringencia tales como condiciones de astringencia media. Ejemplos de condiciones de astringencia media incluyen 1-4X SSC/0.25% p/v de SDS a � 45°C durante 2-3 horas. Un ejemplo de condiciones de alta restricción incluye 0.1-1X SSC/0.1% p/v de SDS a 60ºC durante 1-3 horas. La persona experimentada en la técnica está al tanto de parámetros diversos que pueden ser alterados durante la hibridación y el lavado y que aún así mantendrán o cambiarán las condiciones de restricción. Por ejemplo, otra condición de hibridación restrictiva es hibridación a 4X SSC a 65ºC, seguida por un lavado a 0.1 X SSC a 65ºC durante aproximadamente una hora. Alternativamente, una condición de hibridación astringente de ejemplo es en 50% de formamida, 4XSSC, a 42ºC. Aún otro ejemplo de condiciones de restricción incluye hibridación a 62ºC en 6X SSC, .05 X BLOTTO, y lavado a 2X de SSC, 0.1% de SDS a 62ºC.

Claramente, la especificación presente incorpora el uso de secuencias de ADN divulgadas que codifican una citoquinina oxidasa, homólogo, derivado o fragmento inmunológicamente activo y/o funcional de la misma tal como se define más claramente en cualquier método de hibridación. La especificación presente se relaciona adicionalmente también con secuencias de ADN que hibridizan a dichas secuencias de ADN de la especificación. Preferiblemente dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa vegetal, más específicamente la Arabidopsis thaliana (At)CKX.

Para efectuar la expresión de una proteína en una célula, tejido u órgano, preferiblemente de origen vegetal, la proteína puede ser introducida directamente en dicha célula, tal como mediante microinyección o medios balísticos o alternativamente, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica dicha proteína puede ser introducida en dicha célula, tejido u órgano en un formato expresable.

Preferiblemente, la secuencia de ADN divulgada comprende una secuencia de codificación o marco de lectura abierto (ORF) que codifica una proteína citoquinina oxidasa o un homólogo o derivado de la misma o un fragmento inmunológicamente activo y/o funcional de la misma como se definió anteriormente. La proteína preferida divulgada comprende la secuencia de aminoácidos de dicha citoquinina oxidasa. Preferiblemente dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa vegetal y más específicamente una Arabidopsis thaliana (At)CKX.

Con "vector" o "secuencia de vector" se entiende una secuencia de ADN que puede ser introducida en un organismo por transformación y puede ser mantenida de manera estable en dicho organismo. El mantenimiento del vector es posible por ejemplo en cultivos de Escherichia coli, A. tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe. Otros vectores tales como fagémidos y vectores de cósmido pueden mantenerse y multiplicarse en bacterias y/o virus. Las secuencias de vector generalmente comprenden un conjunto de sitios únicos reconocidos por enzimas de restricción, el sitio de clonación múltiple (MCS), en donde pueden insertarse una o más secuencias no vectoras.

Con "secuencia no vectora" se entiende concordantemente una secuencia de ADN que está integrada en uno o más de los sitios del MCS comprendido dentro de un vector.

"Vectores de expresión" forman un subconjunto de vectores los cuales, en virtud de comprender las secuencias reguladoras o de control apropiadas permiten la creación de un formato expresable para la secuencia no vectora insertada, permitiendo así la expresión de la proteína codificada por dicha secuencia no vectora. Los vectores de expresión son conocidos en el arte por permitir la expresión de proteínas en organismos que incluyen bacterias (por ejemplo E. coli), hongos (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris), células de insectos (por ejemplo vectores de expresión en baculovirus), células animales (por ejemplo, células COS o CHO) y células vegetales (por ejemplo, vectores de expresión basadas en virus de patata X).

La presente especificación incluye claramente cualquier citoquinina oxidasa, homólogo, derivado y/o fragmento inmunológicamente activo y/o funcional de la misma tal como se definió anteriormente. Preferiblemente dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa vegetal, más específicamente una Arabidopsis thaliana (At)CKX.

Como alternativa a la producción de proteína mediada por el vector de expresión en sistemas biológicos, puede aplicarse la síntesis química de proteínas. Los péptidos sintéticos pueden ser manufacturados en fase en solución o en fase sólida. La síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield 1963) es, sin embargo, la manera más común e involucra la adición secuencial de aminoácidos para crear una cadena de péptidos lineal. La síntesis de péptidos en fase sólida incluye ciclos consistente de tres etapas: (i) inmovilización del aminoácido carboxi terminal de la cadena peptídica en crecimiento a un soporte sólido o resina; (ii) ensamblaje de la cadena, un proceso consistente de la activación, acoplamiento y desprotección del aminoácido que se va a agregar a la cadena peptídica en crecimiento; y (iii) ruptura que involucra la eliminación de la cadena peptídica completa de la resina y eliminación de los grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos. Metodologías comunes en la síntesis de péptidos en fase sólida incluyen Fmoc/tBu (9-fluorenilmetiloxicarbonil/t-butil) y Boc (t-butiloxicarbonil) como grupos protectores amino terminales de aminoácidos. Grupos protectores de cadenas laterales de aminoácidos incluyen metil (Me), formil (CHO), etil (Et), acetil (Ac), t-butil (t-Bu), anisil, bencil (Bzl), trifluroacetil (Tfa), N-hydroxisuccinimide (ONSu, OSu), benzoil (Bz), 4-metilbencil (Meb), tioanizil, tiocresil, benciloximetil (Bom), 4-nitrofenil (ONp), benciloxicarbonil (Z), 2nitrobenzoil (NBz), 2-nitrofenilsulfenil (Nps), 4-toluenesulfonil (Tosil,Tos), pentafluorofenil (Pfp), difenilmetil (Dpm), 2clorobenciloxicarbonil (CIZ), 2,4,5-triclorofenil, 2-bromobenciloxicarbonil (Br-Z), tripheilmetil (Tritil, Trt), and 2,5,7,8pentametil-croman-6-sulfonil (Pmc). Durante el ensamblaje de la cadena, se eliminan el Fmoc o Boc dando como resultado un terminal amino activado del residuo de aminoácido enlazado a la cadena en crecimiento. El terminal carboxi del aminoácido entrante es activado por conversión a un éster altamente reactivo, por ejemplo, mediante HBTU. Con tecnologías actuales (por ejemplo, sintetizador PerSeptive Biosystems 9050, Applied Biosystems Model 431A Peptide Synthesizer), pueden manufacturarse péptidos lineales de hasta 50 residuos. Hay disponible un cierto número de guías para producir péptidos que sean adecuados para uso en sistemas biológicos incluyendo (i) limitar el uso de aminoácidos difíciles tales como Cis, Met, Trp (que se oxidan y/o degradan fácilmente durante la síntesis de péptidos) o arg; (ii) minimizar los aminoácidos hidrófobos (pueden impedir la solubilidad del péptido); y (iii) evitar un ácido glutámico aminoterminal (pueda ciclizarse a piroglutamato).

Por "formato expresable" se entiende que la molécula de ácido nucleico aislada está en una forma adecuada para ser transcrita en ARNm y/o traducida para producir una proteína, bien sea constitutivamente o siguiendo la inducción por una señal intracelular o extracelular, tal como un estímulo ambiental o tensión (mitógenos, anoxia, hipoxia, temperatura, sal, luz, deshidratación, etc.) o un compuesto químico tal como IPTG (isopropil--Dtiogalactopiranósido) o tales como un antibiótico (tetraciclina, ampicilina, rifampicina, kanamicina), hormonas (por ejemplo, giberelina, auxina, citoquinina, glucocorticoides, brasinoesteroides, etileno, ácido abscísico, etc.), análogos de hormonas (ácido indol acético (IAA), 2,4-D, etc.), metales (zinc, cobre, hierro, etc.) o dexametasona, entre otros. Tal como es conocido para los expertos en la técnica, la expresión de una proteína funcional puede requerir también una o más modificaciones postraducción, tales como glicosilación, fosforilación, desfosforilación, o una o más interacciones proteína-proteína, entre otras. Todos tales procesos están incluidos dentro del alcance del término "formato expresable".

Preferiblemente, la expresión de una proteína en una célula, tejido u órgano específicos, preferiblemente de origen vegetal, es efectuada por la introducción y expresión de una molécula de ácido nucleico aislada que codifica dicha proteína, tal como una molécula de ADNc, un gen genómico, una molécula de oligonucleótido sintética, una molécula de ARNm o un marco de lectura abierto, en dicha célula, tejido u órgano, en donde dicha molécula de ácido nucleico se coloca de manera operativa en conexión con secuencias reguladoras o de control adecuadas que incluyen un promotor, preferiblemente un promotor expresable en plantas, y una secuencia de terminación.

La referencia aquí a un "promotor" debe tomarse en su contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico eucariote clásico, incluyendo la caja TATA la cual se requiere para una iniciación exacta de la transcripción, con o sin una secuencia de caja CCAAT y elementos adicionales reguladores o de control (esto es, secuencias activadoras corriente arriba, potenciadores y silenciadores) los cuales alteran la expresión del gen en respuesta a estímulos de desarrollo y/o externos, o en una manera específica para cada tejido.

El término "promotor" también incluye las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen procariote clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o unas secuencias reguladoras transcripcionales de caja -10.

El término "promotor" también se utiliza para describir una molécula sintética o de fusión, o un derivado que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.

Los promotores pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos, para potenciar adicionalmente la expresión y/o alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de una molécula de ácido nucleico a la cual está conectado operativamente. Tales elementos reguladores pueden colocarse de forma adyacente a una secuencia promotora heteróloga para conducir la expresión de una molécula de ácido nucleico en respuesta a, por ejemplo, cobre, glucocorticoides, dexametasona, tetraciclina, giberelina, cAMP, ácido abscísico, auxina, lesiones, etileno, jasmonato o ácido salicílico o para conferir la expresión de una molécula de ácido nucleico en células, tejidos u órganos específicos tales como meristemas, hojas, raíces, embriones , flores, semillas o frutos.

En el contexto de la presente especificación, el promotor preferiblemente es una secuencia promotora expresable en plantas. Los promotores que también funcionan o funcionan solamente en células no vegetales tales como bacterias, células de levadura, células de insectos y células animales no están excluidos. Por "expresable en plantas" se entiende que la secuencia promotora, incluyendo cualquier elemento regulador adicional agregado a la misma o contenido en la misma, es al menos capaz de inducir, conferir, activar o potenciar la expresión en una célula, tejido u órgano vegetal, preferiblemente una célula, tejido u órgano vegetal monocotiledónea o dicotiledónea.

Los términos "operable en planta" y "operable en una planta" cuando se utilizan aquí, con respecto a una secuencia promotora, deben tomarse como equivalentes a una secuencia promotora expresable en plantas.

Los promotores regulables como parte de un sistema de expresión en plantas viral binario son también conocidos para la persona experimentada en la técnica (Yadav 1999 -WO9922003; Yadav 2000 -W00017365).

En el presente contexto, una "secuencia promotora regulable" es un promotor que es capaz de conferir expresión sobre un gen estructural en una célula, tejido u órgano en particular o grupo de células, tejidos u órganos de una planta, opcionalmente bajo condiciones específicas, sin embargo no confiere en general la expresión a través de la planta bajo todas las condiciones. De acuerdo con lo anterior, una secuencia promotora regulable puede ser una secuencia promotora que confiera expresión en un gen al cual está conectado operativamente en una localización particular dentro de la planta o alternativamente, a través de la planta bajo un conjunto específico de condiciones, tales como la inducción siguiente a la expresión de un gen por un compuesto químico u otro propiciador.

Preferiblemente, el promotor regulable usado en el desempeño de la presente invención confiere expresión en una localización específica dentro de la planta, bien sea constitutivamente o después de una inducción, sin embargo no en la planta completa bajo cualquier circunstancia. Incluidas dentro del alcance de tales promotores están las secuencias promotoras específicas para células, secuencias promotoras específicas para tejidos, secuencias promotoras específicas para órganos, secuencias promotoras de genes específicos de un ciclo celular, secuencias promotoras inducibles y secuencias promotoras constitutivas que han sido modificadas para conferir expresión en una parte particular de la planta en cualquier momento, tal como por integración de dicho promotor constitutivo con un elemento genético transponible (Ac, Ds, Spm, En, u otro transposón).

De la misma forma, el término "específico para tejido" será tomado para indicar que la expresión es predominantemente en un tejido o tipo de tejido en particular, preferiblemente de origen vegetal, aunque no necesariamente exclusiva en dicho tejido o tipo de tejido.

De la misma forma, el término "específico para órgano" se tomará para indicar que la expresión es predominantemente en un órgano particular, preferiblemente de origen vegetal, aunque no necesariamente de forma exclusiva en dicho órgano.

De la misma forma, el término "específica para un ciclo celular" se tomará para indicar que la expresión es predominantemente cíclica y que ocurre en una o más fases, no necesariamente consecutivas del ciclo celular aunque no necesariamente de forma exclusiva en células en ciclo, preferiblemente de origen vegetal.

Los experimentados en la técnica entenderán que un "promotor inducible" es un promotor cuya actividad transcripcional se incrementa o induce en respuesta a un estímulo de desarrollo, químico, ambiental o físico. De la misma forma, la persona experimentado en la técnica entenderá que un "promotor constitutivo" es un promotor que es activo transcripcionalmente a través de la mayoría, pero no necesariamente de todas las partes de un organismo, preferiblemente una planta, durante la mayor parte pero no necesariamente de todas las fases de su crecimiento y desarrollo.

Los experimentados en la técnica será capaces fácilmente de seleccionar secuencias promotoras apropiadas para uso en la regulación de la expresión apropiada de la proteína de citoquinina oxidasa a partir de fuentes públicamente disponibles o fácilmente disponibles, sin experimentación indebida.

Colocar una molécula de ácido nucleico bajo el control regulador de una secuencia promotora, o en conexión operable con una secuencia promotora, significa posicionar dicha molécula de ácido nucleico de tal manera que la expresión es controlada por la secuencia promotora. Un promotor usualmente, pero no necesariamente, es posicionado corriente arriba, o en el extremo 5' y dentro de 2 kb del sitio de inicio de la transcripción de la molécula de ácido nucleico que regula. En la construcción de combinaciones de genes promotores/estructurales heterólogos se prefiere generalmente posicionar el promotor a una distancia del sitio de inicio de la transcripción de genes que sea aproximadamente la misma que la distancia entre el promotor y el gen que él controla en su localización natural (esto es, el gen del cual se deriva el promotor). Tal como es conocido en el arte, alguna variación en esta distancia puede ser admitida sin pérdida de la función promotora. De la misma forma, el posicionamiento preferido de un elemento de secuencia regulador con respecto a un gen heterólogo que se va a colocar bajo su control está definido por el posicionamiento del elemento en su localización natural (esto es, el gen del cual se deriva). De nuevo, tal como es conocido en el arte, puede ocurrir también alguna variación en esta distancia.

Ejemplos de promotores adecuados para uso en los constructos de genes divulgados incluyen los listados en la Tabla 4, entre otros. Los promotores listados en la Tabla 4 se proveen para propósitos de ejemplificación solamente y no van a estar limitados por la lista provista en la misma. Los expertos en la técnica estarán fácilmente en posición de proveer promotores adicionales que son útiles.

En el caso de promotores constitutivos o promotores que induzcan la expresión a través de la planta completa, se prefiere que tales secuencias sean modificadas mediante la adición de secuencias de nucleótidos derivadas de uno

o más de los promotores específicos para tejidos listados en la Tabla 4, o alternativamente, secuencias de nucleótidos derivadas de uno o más de los promotores inducibles específicos para tejidos mencionados más arriba, para conferir a los mismos especificidad para tejidos. Por ejemplo, el promotor CaMV 35S puede ser modificado por la adición de la secuencia promotora Adh1 de maíz, para conferir expresión de la misma específica para raíces regulada anaeróbicamente, tal como se describió previamente (Ellis et al., 1987). Otro ejemplo describe conferir expresión genética específica para raíces o abundante en raíces fusionando el promotor CaMV 35S con elementos de la proteína de maíz rica en proteína del gen GRP3 (Feix y Wulff 2000 -WO0015662). Tales modificaciones pueden alcanzarse por experimentación de rutina por parte de los experimentados en la técnica.

El término "terminador" se refiere a una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que señaliza la terminación de la transcripción. Los terminadores son secuencias de ADN no traducidas 3’ que contienen una señal de poliadenilación, la cual facilita la adición de secuencias de poliadenilato al extremo 3' de un transcripto primario. Los terminadores activos en células derivados de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas son conocidos y están descritos en la literatura. Pueden ser aislados a partir de bacterias, hongos, virus, animales y/o plantas.

Tabla 4. Promotores expresables en plantas de ejemplo para uso en desarrollo de la presente especificación

I: PROMOTORES ESPECÍFICOS PARA CÉLULAS,ESPECÍFICOS PARA TEJIDOS Y ESPECÍFICOS PARAÓRGANOS

FUENTE DEL GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

a-amilasa (Amy32b)

aleurona Lanahan, M.B., et al., Plant Cell 4: 203-211, 1992; Skriver, K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 7266-7270, 1991

Gen similar a catepsina �

aleurona Cejudo, F.J., et al. Plant Molecular Biology 20:849-856, 1992.

Agrobacterium rhizogenes rolb

cambium Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456-462, 1997

AtPRP4

Flores http://salus.medium.edu/mmg/ tierney/ html

chalcone synthase (chsA)

Flores Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990.

LAT52

anteras Twell et al Mol. Gen Genet. 217: 240-245 (1989)

apetala-3

Flores

Quitinasa

Frutos (bayas, uvas, etc.) Thomas et al. CSIRO Plant Industry, Urrbrae, South Australia, Australia; http://winetitles.com.au/ gwrdc/csh95-1.html

rbcs-3A

Tejido verde (por ejemplo hoja) Lam, E. et al., The Plant Cell 2: 857866, 1990.; Tucker et al., Plant Physiol. 113: 1303-1308, 1992.

Genes específicos de hojas

Hoja Baszczynski, et al., Nucl. Acid Res. 16: 4732, 1988.

AtPRP4

Hoja http://salus.medium.edu/mmg/ tierney/ html

Promotor del gen del virus clorela adenina metil transferasa

Hoja Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93

Promotor del gen aldP de arroz

Hoja Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674

Promotor rbcs de arroz o tomate

Hoja Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000

Pinus cab-6

Hoja Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994.

Promotor de rubisco

Hoja

cab (proteína enlazantes clorofila a/b

Hoja

SAM22

Hoja senescente Crowell, et al., Plant Mol. Biol. 18: 459-466, 1992.

Gen Itp (gen de transferencia lipídica)

Fleming, et al, Plant J. 2, 855-862.

Gen de R. japonicum nif

Nódulo Patente de los Estaos Unidos No. 4, 803, 165

(continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación) (continuación)

I: PROMOTORES ESPECÍFICOS PARA CÉLULAS,ESPECÍFICOS PARA TEJIDOS Y ESPECÍFICOS PARA ÓRGANOS

FUENTE DEL GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

Gen de B. japonicum nifH

Nódulo Patente de los Estaos Unidos No. 5, 008, 194

GmENOD40

Nódulo Yang, et al., The Plant J. 3: 573-585.

PEP carboxilasa (PEPC)

Nódulo Pathirana, et al., Plant Mol. Biol. 20: 437-450, 1992.

Leghemoglobina (Lb)

Nódulo Gordon, et al., J. Exp. Bot. 44: 14531465, 1993.

Gen del virus Tungro bacilliform

Floema Bhattacharyya-Pakrasi, et al, The Plant J. 4: 71-79, 1992.

Genes específicos para polen

polen; microespora Albani, et al., Plant Mol. Biol. 15: 605, 1990; Albani, et al., Plant Mol. Biol. 16: 501, 1991)

Zm13

polen Guerrero et al Mol. Gen. Genet. 224: 161-168 (1993)

Gen apg

Microespora Twell et al Sex. Plant Reprod. 6: 217-224 (1993)

Gen específico de polen de maíz

polen Hamilton, et al., Plant Mol. Biol. 18: 211-218, 1992.

Gen de girasol expresado en polen

polen Baltz, et al., The Plant J. 2: 713-721, 1992.

Gen de B. napus específico de polen

polen; tapetum de la antera Arnoldo, et al., J. Cell. Biochem., Abstract No. Y101, 204, 1992.

Genes expresables en raíz

Raíces Tingey, et al., EMBO J. 6: 1, 1987.

Gen de tabaco inducible por auxina

Punta de raíz Van der Zaal, et al., Plant Mol. Biol. 16,983,1991.

-tubulina

Raíz Oppenheimer, et al., Gene 63: 87, 1988.

Genes específicos de raíz de tabaco

Raíz Conkling, et al., Plant Physiol. 93: 1203,1990.

Gen de B. napus G1-3b

Raíz Patente de los Estaos Unidos No. 5, 401, 836

SbPRP1

Raíces Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109-119, 1993.

AtPRP1; AtPRP3

raíces; raíces vellosas http://saius.medium.edu/mmg/ tierney/ html

Gen RD2

cortex de raíz http://www2.cnsu.edu/ncsu/research

Gen TobRB7

Vasculatura de raíz http://www2.cnsu.edu/ncsu/research

AtPRP4

hojas; flores; raíces primordiales laterales http://salus.medium.edu/mmg/ tierney/ html

I: PROMOTORES ESPECÍFICOS PARA CÉLULAS,ESPECÍFICOS PARA TEJIDOS Y ESPECÍFICOS PARA ÓRGANOS

FUENTE DEL GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

Genes específicos de semilla

Semilla Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

Albumina de nuez del Brasil

Semilla Pearson, et al., Plant Mol. Biol. 18: 235-245,1992.

Leguminosa

Semilla Ellis, et al., Plant Mol. Biol. 10: 203214, 1988.

glutelina (arroz)

Semilla Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987.

Zeína

Semilla Matzke et al Plant Mol Biol, 14(3): 323-32 1990

NapA

Semilla Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996.

Glutenina-1 LMW y HMW de trigo

Endospermo Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2, 1989

SPA de trigo

Semilla Albani et al, Plant Cell, 9: 171-184, 1997

a y gliadinas de trigo

Endospermo EMBO 3:1409-15, 1984

Promotor Itr1 de cebada

Endospermo

B1, C, D, hordeina de cebada

Endospermo Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996

DOF de cebada

Endospermo Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998

blz2

Endospermo EP99106056.7

Promotor sintético

Endospermo Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998.

Prolamina NRP33 de arroz

Endospermo Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998

a-globulina Glb-1 de arroz

Endospermo Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889,1998

OSH1 de

Embrión Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996

a-globulin REB/OHP-1 de arroz

Endospermo Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997

ADP-glucosa PP de arroz

Endospermo Trans Res 6:157-68,1997

Familia de genes ESR de maíz

Endospermo Plant J 12:235-46, 1997

y-kafirina de sorgo

Endospermo PMB 32:1029-35, 1996

KNOX

Embrión Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999

Oleosina de arroz

Embrión y aleurón Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998

I: PROMOTORES ESPECÍFICOS PARA CÉLULAS,ESPECÍFICOS PARA TEJIDOS Y ESPECÍFICOS PARA ÓRGANOS

FUENTE DEL GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

Oleosina de girasol

Semilla (embrión y semilla seca) Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873-876,1992

LEAFY

Meristema de brote Weigel et al., Cell 69:843-859, 1992.

Arabidopsis thaliana knat1

Meristema de brote Accession numberAJ131822

Malus domestica kn 1

Meristema de brote Accession number Z71981

CLAVATA1

Meristema de brote Accession number AF049870

Genes específicos de estigma

estigma Nasrallah, et al., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 85: 5551, 1988; Trick, et al., Plant Mol. Biol. 15: 203, 1990.

Gen patatina clase I

tubérculo Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386395, 1991.

arroz PCNA

Meristema Kosugi et al, Nucleic Acids Research 19:1571-1576, 1991; Kosugi S. and Ohashi Y, Plant Cell 9:1607-1619, 1997.

Tubulina de guisante TubA1

Células en división Stotz and Long, Plant Mol.Biol. 41, 601-614. 1999

Arabidopsis cdc2a

Células en ciclo Chung and Parish, FEBS Lett, 3;362 (2):215-9, 1995

Arabidopsis Rop1A

Anteras; polen maduro + tubos de polen Li et al. 1998 Plant Physiol 118, 407417.

Arabidopsis AtDMC1

Asociado con meiosis Klimyuk and Jones 1997 Plant J. 11, 1-14.

PS-IAA4/5 y PS-IAA6 de guisante

Inducible por auxina Wong et al. 1996 Plant J. 9, 587599.

Farnesiltransferasa de guisante

Tejidos meristemáticos; floema cercano a tejidos en crecimiento; reprimido por luz y azúcar Zhou et al. 1997 Plant J. 12, 921930

Ciclina B1;1 de Tabaco (N. silvestris)

Células en división/ tejido meristemático Trehin et al. 1997 Plant Mol.Biol. 35, 667-672.

Ciclinas CYS (tipo A) y CYM (tipo B) mitóticas

Células en división/ tejido meristemático Ito et al. 1997 Plant J. 11, 983-992

cyc1At (=cyc B1;1) y cyc3aAt (tipo A) de Arabidopsis

Células en división/ tejido meristemático Shaul et al. 1996 Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A 93, 48684872.

Caja promotora de Arabidopsis tef1

Células en división/ tejido meristemático Regad et al. 1995 Mol. Gen. Genet. 248, 703-711.

Catharanthus roseus cyc07

Células en división/ tejido meristemático Ito et al. 1994 Plant Mol.Biol. 24, 863-878.

II: PROMOTORES CONSTITUTIVOS DE EJEMPLO

FUENTE DEL GEN

PATRÓN DE EXPRESIÓN REFERENCIA

Actina

Constitutivo McElroy et al, Plant Cell, 2: 163171,1990

CAMV 35S

Constitutivo Odell et al, Nature, 313: 810-812, 1985

CaMV 19S

Constitutivo Nilsson et al., Physiol. Plant. 100:462, 1997

GOS2

Constitutivo de Pater et al, Plant J. 2:837-844, 1992

Ubiquitina

Constitutivo Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992

Ciclofilina de arroz

Constitutivo Buchholz et al, Plant Mol Biol. 25: 837-843, 1994

histona H3 de maíz

Constitutivo Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285,1992

histona H3 de alfalfa

Constitutivo Wu et al., Nucleic Acids Res. 17: 3057-3063, 1989; Wu et al., Plant Mol. Biol. 11:641-649,1988

actina 2

Constitutivo An et al, Plant J. 10(1); 107-121, 1996

III: PROMOTORES DE EJEMPLO INDUCIBLES POR ESTRÉS

NOMBRE

ESTRÉS REFERENCIA

P5CS (delta(1)-pirolin-5-carboxilato sintasa)

sal, agua Zhang et al. Plant Science. 129: 8189, 1997

cor15a

Frio Hajela et al., Plant Physiol. 93: 1246-1252,1990

cor15b

Frio Wlihelm et al., Plant Mol Biol. 23: 1073-1077, 1993

cor15a (-305 a +78 nt)

Frio, sequía Baker et al., Plant Mol Biol. 24: 701713, 1994

rd29

Sal, sequía, frio Kasuga et al., Nature Biotechnology 18:287-291, 1999

Proteínas de choque calorífico, incluyendo promotores artificiales que contiene el elemento de choque por calor (HSE)

Calor Barros et al., Plant Mol Biol 19: 66575, 1992. Marrs et al., Dev Genet.14: 27-41, 1993. Schoffl et al., Mol Gen Gent, 217: 246-53, 1989.

smHSP (proteínas de choque por calor pequeñas)

Calor Waters et al, J Experimental Botany 47:325-338, 1996

wcs 120

Frío Ouellet et al., FEBS Lett. 423: 324328,1998

ci7

Frío Kirch et al., Plant Mol Biol 33: 897909, 1997

III: PROMOTORES DE EJEMPLO INDUCIBLES POR ESTRÉS

NOMBRE

ESTRÉS REFERENCIA

Adh

Frío, sequía, hipoxia Dolferus et al., Plant Physiol 105: 1075-87, 1994

pwsi 18

agua: sal y sequía Joshee et al., Plant Cell Physiol 39: 64-72, 1998

ci21A

Frío Schneider et al., Plant Physiol 113: 335-45, 1997

Trg-31

Sequía Chaudhary et al., Plant Mol Biol 30: 1247-57, 1996

Osmotina

Osmótica Raghothama et al., Plant Mol Biol 23: 1117-28, 1993

Rab17

Osmótica, ABA Vilardell et al., Plant Mol Biol 17: 985-93, 1991

LapA

Lesiones, ambiental WO99/03977 University of California/ INRA

IV: PROMOTORES DE EJEMPLO, INDUCIBLES POR PATÓGENOS

NOMBRE

PATÓGENO REFERENCIA

RB7

Nemátodos en nódulos radiculares (Meloidogyne spp.) US5760386 -North Carolina State University; Opperman et al (1994) Science 263: 221-23.

PR-1, 2, 3, 4, 5, 8, 11

Fúngico, viral, bacteriano Ward et al (1991) Plant Cell 3: 10851094; Reiss et al 1996; Lebel et al (1998), Plant J, 16(2):223-33;

Melchers et al (1994), Plant J, 5(4): 469-80; Lawton et al (1992), Plant Mol Biol, 19(5):735-43.

HMG2

Nemátodos WO9503690 -Virginia Tech Intellectual Properties Inc.

Abi3

Nemátodos CIST(Heterodera spp.) Unpublished

ARM1

Nemátodos Barthels et al., (1997) The Plant Cell 9, 2119-2134. WO 98/31822 -Plant Genetic Systems

Att0728

Nemátodos Barthels et al., (1997) The Plant Cell 9, 2119-2134. PCT/EP98/07761

Att1712

Nemátodos Barthels et al., (1997) The Plant Cell 9, 2119-2134. PCT/EP98/07761

Gst1

Diferentes tipo de patógenos Strittmatter et al (1996) Mol. Plant-Microbe Interact. 9, 68-73.

IV: PROMOTORES DE EJEMPLO, INDUCIBLES POR PATÓGENOS

NOMBRE

PATÓGENO REFERENCIA

LEMMI

Nemátodos WO 92/21757-Plant Genetic Systems

CLE

geminivirus PCT/EP99/03445 -CINESTAV

PDF1.2

Fúngico incluyendo Alternaria brassicicola y Botrytis cinerea Manners et al (1998), Plant Mol Biol, 38(6):1071-80.

Thi2.1

Fúngico -Fusarium oxisporum f sp. mattiolae Vignutelli et al (1998) Plant J;14(3): 285-95

DB#226

Nemátodos Bird and Wilson (1994) Mol. Plant-Microbe Interact., 7, 419-42 WO 95.322888

DB#280

Nemátodos Bird and Wilson (1994) Mol. Plant-Microbe Interact., 7,419-42 WO 95.322888

Cat2

Nemátodos Niebel et al (1995) Mol Plant Microbe Interact 1995 MayJun;8(3):371-8

hTub

Nemátodos Aristizabal et al (1996), 8th International Congress on Plant-Microbe Interaction, Knoxville US B29

SHSP

Nemátodos Fenoll et al (1997) In: Cellular and molecular aspects of plantnematode interactions. Kluwer Academic, C. Fenoll, F.M.W. Grundler and S.A. Ohl (Eds.),

Tsw12

Nemátodos Fenoll et al (1997) In: Cellular and molecular aspects of plantnematode interactions. Kluwer Academic, C. Fenoll, F.M.W. Grundler and S.A. Ohl (Eds.)

Hs1(pro1)

Nemátodos WO 98/122335 -Jung

NsLTP

viral, fúngico, bacteriano Molina & Garcia-Olmedo (1993) FEBS Lett. 316(2):119-22

RIP

viral, fúngico Turner et al (1997) Proc Natl Acad Sci U S A, 94(8):3866-71

Ejemplos de terminadores particularmente adecuados para uso en los constructos de gen divulgados incluyen el terminador de gen de nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, la secuencia terminadora del gen de

5 octopina sintasa (OCS) de Agrobacterium tumefaciens, la secuencia terminadora del gen (CaMV) 35S del virus mosaico de la coliflor, la secuencia (t3'Bt2) terminadora de la ADP-glucosa pirrofosforilasa de Oriza sativa, la secuencia terminadora del gen de zeína de Zea mays, el terminador del gen rbcs-1A, y las secuencias terminadoras del gen rbcs-3A, entre otros.

Secuencias promotoras preferidas de la invención incluyen promotores específicos para raíces y promotores

10 específicos para semillas tales como pero no limitándose a los que aparecen en lista en la Tabla 5, Tabla 4, y tal como se delineó en los Ejemplos.

Tabla 5. Promotores de ejemplo específicos para raíces para uso en la ejecución de la presente especificación

NOMBRE

ORIGEN REFERENCIA

SbPRP1

Soja Suzuki et al., Plant Mol Biol, 21: 109-119, 1993

636 bp fragmento de TobRB7

Tabaco Yamamoto et al., Plant Cell 3:371-382, 1991

GGPS3

Arabidopsis Okada et al.,Plant Physiol 122: 1045-1056, 2000

580 bp fragmento de prxEa

Arabidopsis Wanapu and Shinmyo, Ann N Y Acad Sci 782: 107114, 1996

Promotor Ids2

Cebada Okumura et al., Plant Mol Biol 25: 705-719, 1994

AtPRP3

Arabidopsis Fowler et al., Plant Physiol 121: 1081-1092, 1999

Los experimentados en la técnica conocerán secuencias promotoras y secuencias terminadoras adicionales que pueden ser adecuadas para uso en la ejecución de la invención. Tales secuencias pueden ser utilizadas fácilmente sin experimentación indebida.

En el contexto de la presente invención, “expresión ectópica” o “sobreexpresión ectópica” de un gen o una proteína se refieren a los patrones de expresión y/o niveles de expresión de dicho gen o proteína que no se presentan normalmente bajo condiciones naturales, más específicamente se entiende que incrementan los niveles de expresión y/o expresión incrementada. La expresión ectópica puede lograrse de diferentes maneras incluyendo el enlazamiento operativo de una secuencia de codificación que codifica dicha proteína a un promotor homólogo o heterológo o aislado con el fin de crear un gen quimérico y/o enlazando de manera operativa dicha secuencia de codificación a su propio promotor aislado (esto es, el promotor aislado de forma natural que conduce la expresión de dicha proteína) con el fin de crear una duplicación de gen recombinante o un efecto de multiplicación de genes. Con “coexpresión ectópica” se entiende la expresión ectópica o sobreexpresión ectópica de dos o más genes o proteínas. El mismo o, más preferiblemente, diferentes promotores se usan para conferir expresión ectópica de dichos genes o proteínas.

Preferiblemente, la secuencia de promotor utilizada en el contexto de la presente invención está enlazada operativamente a una secuencia de codificación o un marco de lectura abierta (ORF) que codifica una proteína citoquinina oxidasa o un homólogo, derivado o un fragmento inmunológicamente activo y/o funcional de la misma como se definió anteriormente.

“Subregulación de la expresión” tal como se utiliza aquí indica hacer disminuir los niveles de la expresión genética y/o los niveles de producto genético activo y/o los niveles de actividad del producto genético. Los descensos en la expresión pueden ser logrados por ejemplo mediante la adición de secuencias codificadoras o partes de las mismas en una orientación de sentido (si no da como resultado la cosupresión) o en una orientación antisentido con respecto a una secuencia promotora y adicionalmente por ejemplo mutagénesis por inserción (por ejemplo, inserción de T-ADN o inserción por transposón), o por estrategias de silenciamiento de genes tal como lo describe por ejemplo Angell y Baulcombe ((1998 WO9836083), Lowe et al. (1989 -WO9853083), Lederer et al. (1999 -WO9915682) or Wang et al. (1999 -WO9953050). Los constructos genéticos como objetivo en la expresión del gen silenciador pueden tener la secuencia de nucleótidos de dicho gen (o una o más partes de la misma) contenidas en una orientación en sentido y/o antisentido con respecto a la secuencia de promotor. Otro método para subregular la expresión de los genes comprende el uso de Ribozimas.

La modulación, incluyendo la disminución, del nivel de productos genéticos activos o de la actividad de un producto genético puede lograrse administrando o exponiendo células, tejidos, órganos y organismos a dicho producto genético, un homólogo, derivado y/o fragmento inmunológicamente activo del mismo. La inmunomodulación es otro ejemplo de técnica capaz de subregular los niveles de producto genético activo y/o de actividad del producto genético y comprende la administración de o la exposición a o la expresión de anticuerpos a dicho producto genético a o en células, tejidos, órganos u organismos en donde los niveles de dicho producto genético y/o de actividad del producto genético deben ser modulados. Tales anticuerpos comprenden “planticuerpos”, anticuerpos de cadena individual, anticuerpos IgG y anticuerpos de camello de cadena pesada así como fragmentos de los mismos.

La modulación, incluyendo la disminución, el nivel de productos genéticos activos o la actividad de productos genéticos pueden adicionalmente lograrse mediante la administración o exposición de células, tejidos, órganos u organismos a un antagonista de dicho producto genético o la actividad del mismo. Tales agonistas incluyen proteínas (que comprenden, por ejemplo, quinasas y proteinasas) y compuestos químicos identificados de acuerdo con la presente especificación como se describió anteriormente.

En el contexto de la presente especificación se prevé la subregulación de la expresión de un gen de citoquinina oxidasa como se definió anteriormente. Preferiblemente dicho gen de citoquinina oxidasa es un gen de citoquinina oxidasa vegetal, más específicamente un AtCKX. La especificación divulga adicionalmente las subregulación de los niveles de una proteína citoquinina oxidasa o de una actividad de citoquinina oxidasa mediante la cual dicha proteína de citoquinina oxidasa ha sido definida anteriormente. Preferiblemente dicha proteína de citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa vegetal, más específicamente una AtCKX.

Por “modificar el destino de una célula y/o el desarrollo y/o la morfología de la planta y/o la bioquímica y/o la fisiología” se entiende que una o más características de desarrollo y/o morfológicas y/o bioquímicas y/o fisiológicas de una planta se alteran por la ejecución de una o más etapas que son pertinentes a la invención aquí descritas.

“Destino de las células” se refiere a las características de tipo celular o celulares de una célula en particular que son producidas durante el desarrollo de una planta o de un proceso celular de la misma, en particular durante el ciclo celular o como una consecuencia de un proceso del ciclo celular.

“Desarrollo de la planta” o el término “característica de desarrollo de la planta” o un término similar, cuando se utiliza aquí, se entenderá como cualquier proceso celular de una planta que está involucrado en la determinación del destino en el desarrollo de una célula vegetal, en particular el tipo de tejido u órgano específico en el cual se desarrollará una célula del progenitor. Procesos celulares relevantes para el desarrollo de las plantas serán conocidos para los experimentados en la técnica. Tales procesos incluyen, por ejemplo, morfogénesis, fotomorfogénesis, desarrollo de brotes, desarrollo de raíces, desarrollo vegetativo, desarrollo reproductivo, elongación del tallo, floración y mecanismos reguladores involucrados en la determinación del destino celular, en particular un proceso o proceso regulatorio que involucra el ciclo celular.

“Morfología de la planta” o el término “característica morfológica de la planta” o un término similar, tal como se utilizan aquí, se entenderán por los expertos en la técnica como haciendo referencia a la apariencia externa de una planta, incluyendo una cualquiera o más características estructurales o combinación de características estructurales de la misma. Tales características estructurales incluyen la forma, tamaño, número, posición, color, textura, disposición y patronamiento de cualquier célula, tejido u órgano o grupos de células, tejidos u órganos de una planta, incluyendo raíz, tallo, hoja, brotes, peciolo, tricoma, flor, pétalo, estigma, estilo, estamen, polen, ovulo, semilla, embrión, endospermo, recubrimiento de la semilla, alebrona, fibra, fruto, cambium, madera, madera interna, parénquima, aerenquima, elemento de tamizaje, floema o tejido vascular, entre otros.

“Bioquímica de la planta” o el término “característica de la bioquímica de la planta” o similar o término similar, tal como se utiliza aquí, se entenderá por los experimentados en la técnica como referencia a los procesos metabólicos y catalíticos de una planta, incluyendo metabolismo primario y secundario y los productos de los mismos, incluyendo moléculas pequeñas, macromoléculas o compuestos químicos, tales como pero no limitándose a almidones, azúcares, proteínas, péptidos, enzimas, hormonas, factores de crecimiento, moléculas de ácidos nucleicos, celulosas, hemicelulosas, callosas, lectinas, fibras, pigmentos tales como antocianinas, vitaminas, minerales, micronutrientes o macronutrientes, que son producidos por las plantas.

“Fisiología de la planta” o el término “característica fisiológica de la planta” o términos similares, cuando se utilicen aquí, se entenderán como referencia a los procesos funcionales de una planta, incluyendo los procesos de desarrollo tales como crecimiento, expansión y diferenciación, desarrollo sexual, reproducción sexual, fijación de semillas, desarrollo de semillas, llenado de granos, reproducción asexual, división celular, hibernación, germinación, adaptación, a la luz, fotosíntesis, expansión de las hojas, producción de fibra, crecimiento secundario o producción de madera, entre otros; respuestas de una planta a factores aplicados externamente tales como metales, agentes químicos, hormonas, factores de crecimiento, factores de estrés del ambiente y ambiental (por ejemplo, anoxia, hipoxia, alta temperatura, baja temperatura, y deshidratación, luz, longitud del día, inundación, sal, metales pesados, entre otros), incluyendo respuestas adaptativas de las plantas a dichos factores aplicados externamente.

Los medios para introducir ADN recombinante en un tejido o células vegetales incluyen, pero no se limitan a, trasformación utilizando CaCl2 y variaciones del mismo, en particular el método descrito por Hanahan (1983), absorción de ADN directa en los protoplastos (Krens et al, 1982; Paszkowski et al, 1984), toma de protoplastos mediada por PEG (Armstrong et al, 1990), bombardeo con micropartículas, electroporación (Fromm et al., 1985), microinyección de ADN (Crossway et al., 1986), bombardeo con micropartículas de explantes o células de tejidos (Christou et al., 1988), infiltración al vacío de tejidos con ácido nucleico, o en el caso de las plantas, transferencia mediada por T-ADN de Agrobaterium al tejido de la planta tal como se describe esencialmente en An et al. 1985 Dodds et al., (1985), Herrera-Estrella et al. (1983a, 1983b, 1985). Métodos para la transformación de plantas monocotiledoneas son bien conocidas en el arte e incluyen la transformación mediada por Agrobacterium (Cheng et al., 1997 -WO9748814; Hansen 1998 -WO9854961; Hiei et al., 1994 -WO9400977; Hiei et al., 1998 -WO9817813; Rikiishi et al., 1999 -WO9904618; Saito et al., 1995 -WO9506722), bombardeo con microproyectiles (Adams et al., 1999 -US5969213; Bowen et al., 1998 -US5736369; Chang et al., 1994 -WO9413822; Lundquist et al., 1999 -US5874265/US5990390; Vasil and Vasil, 1995 -US5405765. Walker et al., 1999 -US5955362), consume de ADN (Eyal et al., 1993 -WO9318168), microinyección de células de Agrobacterium (von Holt, 1994 -DE4309203) y sonicación (Finer et al., 1997 -US5693512).

Para el bombardeo de células con micropartículas, se impulsa una micropartícula hacia una célula para producir una célula transformada. Puede utilizarse cualquiera metodología y aparato balístico adecuado para la transformación celular en la ejecución de la presente invención. Aparatos y procedimientos de ejemplo son discutidos por Stomp et al. (patente de los Estados Unidos No 5,122,466) y Sanford y Wolf (patente de los Estados Unidos No 4,945,050). Cuando se utilizan procedimientos balísticos de transformación, el constructo del gen puede incorporar un plásmido capaz de replicarse en la célula que se va a transformar. Ejemplos de micropartículas adecuadas para uso en tales sistemas incluyen esferas de oro de 1 a 5 µm. El constructo de ADN puede ser depositado en la micropartícula por cualquier técnica adecuada, tal como precipitación.

Una planta entera puede ser regenerada a partir de la célula transformada o transfectada de acuerdo con procedimientos bien conocidos en el arte. El tejido vegetal capaz de propagación clonal subsecuente, bien sea por organogénesis o embriogénesis, puede ser transformado por un constructo del gen divulgado y una planta entera regenerada a partir de la misma. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas de propagación de clones disponibles, y más adecuados a las especies en particular que están siendo transformadas. Objetivos de tejidos de ejemplo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, megagametofitos, tejido calloso, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, nódulos axilares y meristemas de raíz), y tejido de meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocotilo); el término “organogénesis” tal como se utiliza aquí, significa un proceso por el cual se desarrollan brotes y raíces secuencialmente a partir de centros meristemáticos.

El término “embriogénesis”, tal como se utiliza aquí, significa un proceso mediante el cual brotes y raíces se desarrollan juntos en un forma concertada (no secuencialmente) bien sea de células somáticas o gametos.

Preferiblemente, la planta producida de acuerdo con el método de la invención es transfectada o transformada con una secuencia genética o susceptible a la introducción de una proteína, por medios reconocidos en el arte, tales como bombardeo con microproyectiles, microinyección, transformación mediada por Agrobacterium (incluyendo transformación in planta), fusión de protoplastos, o electroporación, entre otros. Más preferiblemente dicha planta es producida por transformación mediada por Agrobacterium. La transformación mediada por Agrobacterium o transformación agrolística de plantas, levaduras, mohos u hongos filamentosos se basa en la trasferencia de parte de las secuencias de vector de transformación, llamado T-ADN, al núcleo e integración de dicho T-ADN en el genoma de dicho eucariote.

Con “Agrobacterium” se entiende un miembro de las Agrobacteriasceas, más preferiblemente Agrobacterium o Rizobacterium y lo más preferiblemente Agrobacterium tumefaciens.

Con “T-ADN” o “ADN transferido”, se entiende que parte del vector de transformación flanqueado por bordes de T-ADN, el cual, después de la activación de los genes del Agrobacterium vir, es replicado en los bordes de T-ADN y es transferido como un ADN de cadena individual al núcleo de una célula eucariótica.

Cuando se usa aquí, con “bordes de T-ADN”, “región frontera de T-ADN” o región frontera” se entienden como frontera derecha de T-ADN (RB) o frontera izquierda de T-ADN (LB). Tal frontera comprende una secuencia de núcleo flanqueada por una región de frontera interna como parte del flanqueamiento de T-ADN de la frontera y/o una región externa a la frontera como parte del esqueleto de vector que plantea la frontera. Las secuencias de núcleo comprenden 22 bp en caso de vectores tipo octopina y 25 bp en caso de vectores tipo nopalina. Las secuencias de núcleo en la región de la frontera derecha y la región de la frontera izquierda forman repeticiones imperfectas. Las secuencias de núcleo de frontera son indispensables para el reconocimiento y procesamiento del complejo de duplicación de Agrobacterium que consiste de al menos VirD1 y VirD2. Las secuencias de núcleo que flanquean un T-ADN son suficientes para promover la transferencia de dicho T-ADN. Sin embargo, la eficiencia de la transformación utilizando vectores de transformación que portan dicho T-ADN flanqueado solamente por dichas secuencias de núcleo es baja. La frontera interna y las regiones externas son conocidas por modular la eficiencia de transferencia por T-ADN (Wang et al, 1987). Un elemento que potencia la transferencia de T-ADN ha sido caracterizado y reside en la región externa de la frontera derecha y se denomina sobreconductor (Peralta et al. 1986, van Haaren et al. 1987).

Con “vector de transformación de T-ADN” o “vector de T-ADN” se entiende cualquier vector que abarca una secuencia de T-ADN flanqueada por una frontera derecha e izquierda de T-ADN consistente de al menos las secuencias de núcleo de la frontera derecha e izquierda, respectivamente, y se utiliza para transformación de cualquier célula eucariótica.

Con “secuencia del esqueleto del vector de T-ADN” o “secuencias del esqueleto de vector de T-ADN” se entienden todos los ADN de un vector que contiene T-ADN el cual yace fuera de las fronteras de T-ADN y, más específicamente, por fuera de los sitios de duplicación de las repeticiones imperfectas del núcleo de la frontera.

La especificación presente incluye vectores de T-ADN optimizados de tal forma que la integración del esqueleto de vector en el genoma de una célula eucariótica es minimizada o ausente. Con “vector de T-ADN optimizado” se entiende un vector de T-ADN diseñado bien sea para hacer disminuir o abolir la transferencia de las secuencias esqueleto del vector al genoma de la célula eucariótica. Tales vectores de T-ADN son conocidos para la persona familiarizada con la técnica e incluyen los descritos por Hanson et al. (1999) y por Stuiver (1999 – W09901563).

La presente invención claramente considera la inclusión de una secuencia de ADN que codifica una citoquinina oxidasa, homólogo, fragmento o fragmento inmunológicamente activo y/o funcional de la misma tal como se definió anteriormente, en cualquier vector de T-ADN que comprende vectores de transformación binaria, vectores de transformación superbinaria, vectores de transformación cointegrada, vectores de transformación derivada Ri así como en vectores que portan T-ADN utilizados en transformación agrolística. Preferiblemente, dicha citoquinina oxidasa es una citoquinina oxidasa vegetal, más específicamente una Arabidopsis thaliana (At)CKX

Con “vector de transformación binario” se entiende un vector de transformación de T-AND que comprende:

(a)

una región de T-ADN que comprende al menos un gen de interés y/o al menos un marcador seleccionable activo en la célula eucariótica que va ha ser transformada; y

(b)

una región de esqueleto de vector que comprende al menos orígenes de la replicación activa en E. coli y Agrobacterium y marcadores para la selección en E. coli y Agrobacterium.

Las fronteras de T-ADN de un vector de transformación binario pueden derivarse a partir de plásmidos tipo octopina

o tipo nopalina Ti o de ambos. El T-ADN de un vector binario se transfiere solamente a una célula eucariótica en conjunción con un plásmido auxiliar.

Con “plásmido auxiliar” se entiende un plásmido que se mantiene de manera estable en un Agrobacterium y al menos porta el conjunto de genes Vir necesarios para permitir la transferencia del T-ADN. Dicho conjunto de genes vir puede derivarse bien sea de los plásmidos tipo octopina o tipo nopalina Ti o de ambos.

Con “vector de transformación superbinario” se entiende un vector de transformación binaria que porta adicionalmente en la región del esqueleto del vector una región vir del plásmido Ti pTiBo542 de la cepa A281 de A. Tumefaciens supervirulenta (EP0604662, EP0687730). Los vectores de conformación superbinaria se utilizan en conjunción con un plásmido auxiliar.

Con “vector de transformación cointegrados” se entiende un vector de T-ADN el cual comprende al menos:

(a)

una región de T-ADN que comprende al menos un gen de interés y/o al menos un marcador seleccionable activo en plantas; y

(b)

una región de esqueleto de vector que comprende al menos orígenes de la replicación activa en Escherichia coli y Agrobacterium, y marcadores para la selección en E. coli y Agrobacterium y un conjunto de genes vir necesarios para potenciar la transferencia del T-ADN.

Las fronteras de T-ADN y dicho conjunto de genes vir de dicho vector de T-ADN pueden derivarse bien sea de plásmidos tipo octopina o plásmidos tipo neopalina o de ambos.

Con “vectores de transformación de plantas derivados de Ri” se entiende un vector de transformación binario en el cual las fronteras de T-ADN son derivadas de un plásmido Ti, y dicho vector de transformación binario que se usa junto con un plásmido Ri formando el conjunto necesario de genes vir.

Tal como se utiliza aquí, el término “gen marcador seleccionable” o “marcador seleccionable” o “marcador para selección” incluye cualquier gen que confía un fenotipo sobre una célula que se exprese para facilitar la identificación y/o selección de células que son transfectadas o transformadas con un constructo de gen divulgado o un derivado del mismo. Genes de marcadores adecuados seleccionables contemplan aquí incluyen la resistencia a la ampicilina (Amp’), gen de resistencia a la tetraciclina (Tc’), gen de resistencia de la kanamicina bacteriana Kan’), gen de resistencia a fosfinotricina, gen de neomicina fosfotransferasa (npfII), gen de resistencia a la higromicina, (gen de glucuronidasa (GUS), gen de cloramfenicol acetiltransferasa (KAT), gen de la proteína verde fluorescente resistente (gfp), (Haseloff et al, 1997) y gen de la luciferasa, entre otros.

Con “agrolística”, “transformación agrolística” o “transferencia agrolística” se entiende aquí un método de transformación que combina características de transformación mediada por Agrobacterium o administración biolística de ADN. Como tal, un plásmido objetivo que contiene T-ADN es coadministrado con ADN/ARN lo que permite la producción de una planta de VirD1 y VirD2 con o sin VirE2 (Hansen y Chilton 1996, Hansen et al. 1997; Hansen y Chilton 1997 – W09712046).

Con “ADN foráneo” se entiende cualquier secuencia de ADN que es introducida en el genoma del huésped mediante técnicas recombinantes. Tal ADN foráneo incluye por ejemplo, una secuencia de T-ADN o una parte de la misma tal como la secuencia de T-ADN que comprende el marcador seleccionable en un formato expresable. El ADN foráneo incluye adicionalmente secuencias de ADN intervinientes tal como se definió anteriormente.

Con “evento de recombinación” se entiende cualquier evento de recombinación específica en un sitio o un evento de recombinación efectuado por “salto” de transposón.

Con “recombinasa” se entiende cualquier recombinasa específica de un sitio o una transposasa.

Con “sitio de recombinación” se entiende cualquier sitio de recombinación específica del sitio o secuencias de frontera de transposón.

Con “evento de recombinación específico del sitio” se entiende cualquier evento catalizado por un sistema que consiste generalmente de tres elementos: un par de secuencias de ADN (las secuencias o sitios de recombinación específicos para el sitio) y una enzima específica “la recombinasa específica para el sitio”. La recombinasa específica para el sitio cataliza una reacción de recombinación solamente entre dos secuencias de recombinación específicas para el sitio dependiendo de la orientación de las secuencias de recombinación específicas para el sitio. Las secuencias intervinientes entre dos sitios de recombinación específicos para el sitio se invertirán en la presencia de la recombinasa específica para el sitio cuando las secuencias de recombinación específicas para el sitio se orienten en direcciones opuestas una con respecto a la otra (esto es, repeticiones invertidas). Si las secuencias de recombinación específicas del sitio se orientan en la misma dirección una con respecto a la otra (esto es, repeticiones directas), entonces cualquier secuencia interviniente será eliminada por interacción con la recombinasa específica para el sitio. Así, si las secuencias de recombinación específicas para el sitio están presentes como repeticiones directas en ambos extremos de una secuencia de ADN foránea integrada en un genoma eucariótico, tal integración de dichas secuencias puede ser reversada subsecuentemente por interacción de las secuencias de recombinación específicas para el sitio con la correspondiente recombinasa específica para el sitio.

Puede utilizarse un cierto número de diferentes sistemas de recombinasa específicos para el sitio incluyendo pero no limitándose al sistema cre/lox del bacteriófago P1, el sistema FLP/FRT de levaduras, la recombinasa Gin del fago Mu, la recombinasa Pin de E. coli, la PinB, PinD y PinF de Shigella, y el sistema R/RS del plásmido pSR1. Las recombinasas en general son integrasas, resolvasas o flipasas. También pueden utilizarse recombinasas de especificidad doble en conjunción con repeticiones directas o indirectas de dos sitios de recombinación específicas para el sitio diferentes correspondientes a la recombinasa de especificidad doble (WO99/25840). Los dos sistemas de recombinasa específica para el sitio preferidos son los sistemas de bacteriófago P1 Cre/Iox y de levadura FLP/FRT. Estos sistemas una recombinasa (Cre o FLP) interactúa específicamente con su secuencia de recombinación específica para el sitio (Iox o FRT respectivamente) para invertir o escindir las secuencias intervinientes. Las secuencias de recombinación específicas para el sitio para cada uno de estos dos sistemas son relativamente cortas (34 bp para Iox y 47 bp para FRT). Algunos de estos sistemas ya han sido usados con alta eficiencia en plantas tales como tabaco (Dale et al. 1990) y Arabidopsis (Osborne et al. 1995). Los sistemas de recombinación específicos para el sitio tiene muchas aplicaciones en la biología molecular de las plantas incluyendo métodos para controlar la recombinación homóloga (por ejemplo US 5527695), para inserción dirigida, apilamiento de genes, etc. (WO99/25821) y para resolución de patrones de integración de T-ADN complejos o para la escisión de un marcador seleccionable (WO99/23202).

Aunque las secuencias de recombinación específicas para el sitio deben estar enlazadas a los extremos del ADN o para ser escindidas o invertidas, el gen que codifica la recombinasa específica para el sitio puede estar localizado en cualquier lugar. Por ejemplo, el gen de recombinasa podría estar presente ya en el ADN de las eucariotas o podría ser suministrado mediante un fragmento posterior de ADN introducido bien sea directamente en las células, a través de cruzamiento o a través de polinización cruzada. Alternativamente, una proteína recombinasa sustancialmente purificada podría ser introducida directamente en la célula eucariótica, por ejemplo, por microinyección o bombardeo con partículas. Típicamente, la región de codificación y la recombinasa específica del sitio estaría enlazada operativamente a secuencias reguladoras que permiten la expresión de la recombinasa específica para el sitio en la célula eucariótica.

Con “evento de recombinación afectado por el salto de transposones” o “recombinación mediada por transposasa” se entiende una recombinación catalizada bien sea por un sistema consistente de tres elementos: un par de secuencias de ADN (las secuencias de frontera del transposón) y una enzima específica (la transposasa). La transposasa cataliza una reacción de recombinación solamente entre dos secuencias de frontera de transposones los cuales están dispuestos como repeticiones invertidas.

Puede utilizarse cierto número de diferentes sistemas transposón/transposasa, incluyendo pero no limitándose al sistema Ds/Ac, el sistema Spm y el sistema Mu. Estos sistemas se originan a partir de maíz, pero han demostrado que al menos los sistemas Ds/Ac y el Spm también funcionan en otras plantas (Fedoroff et al. 1993, Schlappi et al.

1993, Van Sluys et al. 1987). Se prefieren los transposones tipo Ds-y SPM-los cuales son delineados por secuencias de frontera de 11 bp-y 13 bp-, respectivamente.

Aunque las secuencias de frontera del transposón deben estar enlazadas a los extremos del ADN que se va a escindir, el gen que codifica la transposasa puede estar localizado en cualquier lugar. Por ejemplo, el gen de recombinasa podría ya estar presente en el ADN de eucariotas o podría ser suministrado por un fragmento de ADN introducido posteriormente bien sea introducido directamente en las células, a través de cruzamiento o a través de polinización cruzada. Alternativamente, una proteína transposasa sustancialmente purificada podría ser introducida directamente en las células, por ejemplo por microinyección o por bombardeo con partículas.

Como parte de la especificación presente, las secuencias de frontera de transposón se incluyen en una secuencia de ADN foráneo tal que caen por fuera de dicha secuencia de ADN y transforman dicho ADN en una entidad similar a un transposón que puede moverse por la acción de una transposasa.

Puesto que los transposones se reintegran frecuentemente en otra localización del genoma del huésped, podría ser necesaria la segregación de la progenie del huésped en el cual se permitió que la transposasa actúe para separar huéspedes transformados que contienen, por ejemplo, solamente la huella del transposón y huéspedes transformados que contienen aún el ADN foráneo.

Al llevar a cabo la presente invención, el elemento genético es preferiblemente inducido a movilizarse tal como, por ejemplo, mediante la expresión de una proteína recombinasa en la célula la cual entra en contacto con el sitio de integración del elemento genético y facilita un evento de recombinación en el mismo, escindiendo el elemento genético completamente, o alternativamente, dejando una "huella", generalmente de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud o mayor, en el sitio de integración original. Estos huéspedes y partes del huésped que han sido producidos de acuerdo con el método de la invención pueden ser identificados por hibridación estándar de ácidos nucleicos y/o técnicas de amplificación para detectar la presencia del elemento genético movilizable o un constructo de gen que comprende el mismo. Alternativamente, en el caso de células huésped transformadas, tejidos y huéspedes en donde el elemento genético movilizable ha sido escindido, es posible detectar una huella en el genoma del huésped al que se ha dejado seguir el evento de escisión, utilizando tales técnicas. Tal como se utiliza aquí, el término "huella" debe tomarse como referencia a cualquier derivado de un elemento genético movilizable o constructo de gen que comprende el mismo tal como se describe aquí el cual es producido por escisión, eliminación u otra eliminación del elemento genético movilizable del genoma de una célula transformada previamente con dicho constructo de gen. Una huella comprende generalmente al menos una copia sencilla de los lugares de recombinación o transposón utilizados para promover la escisión. Sin embargo, una huella puede comprender secuencias adicionales derivadas del constructo del gen, por ejemplo secuencias de nucleótidos derivadas de la secuencia de frontera izquierda, secuencia de frontera derecha, origen de la replicación, secuencia de codificación de recombinasa o de codificación de transposasa si se usa, o las secuencias de nucleótidos derivadas del vector. De acuerdo con lo anterior, una huella es identificable de acuerdo con la secuencia de nucleótidos del lugar de recombinación o transposón del constructo de gen usado, tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que corresponden o son complementarios a un sitio lox o un sitio frt.

El término "ciclo celular" significa los eventos bioquímicos y estructurales cíclicos asociados con el crecimiento y con la división de las células, y en particular con la regulación de la replicación del ADN y la mitosis. El ciclo celular incluye fases denominadas: G0, Gap1 (G1), síntesis de ADN (S), Gap2 (G2) y mitosis (M). Normalmente estas cuatro fases ocurren secuencialmente, sin embargo el ciclo celular también incluye ciclos modificados en donde una

o más fases están ausentes dando como resultado un ciclo celular modificado tal como endomitosis, acitoquinesis, poliploide, politenia, y endorreduplicación.

El término " progresión del ciclo celular" se refiere al proceso de pasar a través de las diferentes fases del ciclo celular. El término "rata de progresión del ciclo celular" de acuerdo con lo anterior se refiere a la velocidad a la cual dichas fases del ciclo celular trascurren o los lapsos de tiempo requeridos para completar dichas fases de ciclo celular.

Con "ensayo de dos híbridos" se entiende un ensayo que se basa en la observación de muchos factores de transcripción eucariótica que comprenden dos dominios, un dominio enlazante a ADN (DB) y un dominio de activación (AD) los cuales, cuando se separan físicamente (esto es, perturbación en enlace covalente) no efectúan la expresión genética objetivo. Dos proteínas capaces de interactuar físicamente con una de dichas proteínas fusionadas a DB y la otra de dichas proteínas fusionadas a AD reunirán los dominios DB y AD del factor de transcripción dando como resultando la expresión del gen objetivo. El gen objetivo en el ensayo de dos híbridos en levaduras es usualmente un gen informador tal como el gen de -galactosidasa. La interacción entre asociados de proteína en el ensayo de dos híbridos en levadura puede cuantificarse midiendo la actividad del producto del gen informador (Bartel y Fields, 1997). Alternativamente, puede utilizarse un sistema de dos híbridos de mamífero el cual incluye por ejemplo una proteína fluorescente verde quimérica que codifica el gen informador (Shioda et al., 2000).

Adicionalmente las simulaciones de plegamiento y el rediseño por ordenador de los motivos estructurales de la proteína divulgada pueden ejecutarse utilizando programas de ordenador apropiados (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput Appl Biosci 1 (1995), 675-679). La modelación por ordenador del plegamiento de las proteínas puede utilizarse para el análisis conformacional y energético del péptido y modelos de proteína detallados (Monge, J. Mol Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv Exp Med Biol. 376 (1995), 37-45). En particular, pueden utilizarse programas apropiados para la identificación de sitios interactivos de las citoquinina oxidasas, sus ligandos u otras proteínas interactuantes mediante búsquedas asistidas por ordenador para secuencias de péptidos complementarias (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Sistemas de ordenador apropiados adicionales para el diseño de proteínas y péptidos se describen en la técnica anterior, por ejemplo en Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann, N. Y. Acac. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 59875991. Los resultados obtenidos a partir de los análisis por ordenador antes descritos pueden ser utilizados para, por ejemplo, la preparación de peptidomiméticos de la proteína divulgada o fragmentos de la misma. Tales análogos seudopeptídicos de la secuencia natural de aminoácidos de la proteína pueden imitar muy eficientemente la proteína original (Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33.218 a 33224). 33224). Por ejemplo, la incorporación de residuos de O-aminoácidos aquirales fácilmente disponibles en una proteína divulgada o en un fragmento de la misma da como resultado la sustitución de enlaces amino por unidades polimetileno de una cadena alifática, proveyendo por lo tanto una estrategia conveniente para construir un peptidomimético (Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777). Los análogos peptidomiméticos superactivos de hormonas peptídicas pequeñas en otros sistemas están descritos en la técnica anterior (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996), 327-331). Los peptidomiméticos apropiados de la proteína divulgada en la invención también pueden ser identificados mediante la síntesis de bibliotecas combinacionales peptidomiméticos a través de alquilación amínica sucesiva y prueba de los compuestos resultantes, por ejemplo, en cuanto a sus propiedades de enlazamiento, inhibidoras de la quinasa y/o inmunológicas. En la técnica se describen métodos para la generación y uso de bibliotecas combinacionales peptidomiméticas, por ejemplo en Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 y Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715.

Adicionalmente, puede utilizarse una estructura tridimensional y/o cristalográfica de la proteína divulgada en la invención para el diseño de inhibidores peptidomiméticos de la actividad biológica de la proteína divulgada (Rose, Biochemistry, 35 (1996), 12933-12944; Ruterber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

Los compuestos que se van a obtener o identificar en los métodos de la especificación pueden ser compuestos que son capaces de enlazarse a cualquiera de los ácidos nucleicos, péptidos o proteínas divulgados. Otros compuestos interesantes para ser identificados son compuestos que modulan la expresión de los genes o las proteínas de la especificación de tal manera que la expresión de dicho gen o proteína es potenciada o disminuida por la acción de dicho compuesto. Alternativamente el compuesto puede ejercer su acción potenciando o haciendo disminuir la actividad de cualquiera de las proteínas de la especificación. Aquí, las proteínas preferidas son citoquinin oxidasas novedosas.

Dicho compuesto o pluralidad de compuestos puede estar comprendido en, por ejemplo, muestras, por ejemplo extractos celulares de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos. Adicionalmente, dichos compuestos pueden ser conocidos en el arte pero hasta ahora no conocidos como capaces de suprimir o activar las proteínas interactuantes con la citoquinina oxidasa. La mezcla de reacción puede ser un extracto libre de células o puede comprender un cultivo de células o tejidos. Configuraciones adecuadas del método divulgado son conocidas para la persona experimentada en la técnica y están descritas, por ejemplo, de manera general en Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, third edition (1994), en particular en el Capítulo 17. La pluralidad de los compuestos puede ser agregada, por ejemplo, a la mezcla de reacción, medio de cultivo o inyectada en la célula.

Si una muestra que contiene un compuesto o una pluralidad de compuestos es identificada en el método de la especificación, es posible entonces aislar el compuesto de la muestra original identificada por contener el compuesto capaz de actuar como agonista, o puede adicionalmente subdividir la muestra original, por ejemplo, si consiste de una pluralidad de compuestos diferentes, de tal manera que se reduzca el número de sustancias diferentes por muestra y repetir el método con las subdivisiones de la muestra original. Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas descritas anteriormente pueden llevarse a cabo varias veces, preferiblemente hasta que la muestra identificada de acuerdo con el método divulgado comprenda solamente un número limitado de o solamente una sustancia (s). Preferiblemente dicha muestra comprende sustancias o propiedades químicas y/o físicas similares, y lo más preferiblemente dichas sustancias son idénticas. Preferiblemente, el compuesto identificado con el método antes descrito o su derivado se formula adicionalmente en una forma adecuada para la aplicación en cultivo de la plantas o en cultivo de células y tejidos de plantas.

El término "vigor temprano" se refiere a la capacidad de una planta para crecer rápidamente durante un desarrollo temprano, y se relaciona con el establecimiento exitoso, después de la germinación, de un sistema de raíces bien desarrollado y un aparato fotosintético bien desarrollado.

El término "resistencia al alojamiento" o "verticalidad" se refiere a la capacidad de una planta para fijarse por si misma al suelo. Para plantas con un hábito de crecimiento erecto o semierecto este término también se refiere a la capacidad de mantener una posición vertical bajo condiciones (ambientales) adversas. Esta característica se relaciona con el tamaño, profundidad y morfología del sistema radicular.

El término "injerto" tal como se utiliza aquí, se refiere a la unión entre sí de las partes de dos plantas diferentes de tal manera que se unan entre sí y la savia pueda fluir, formando así una nueva planta individual que puede crecer y

5 desarrollarse. Un injerto consiste por lo tanto de dos partes: (i) la parte inferior es la raíz tal como se denomina aquí y consiste esencialmente del sistema radicular y una porción del tallo, y (ii) la parte superior, el injerto, el cual da lugar a las partes aéreas de la planta.

Tal como se utiliza aquí, tblastn se refiere a una herramienta de alineamiento que es parte de la familia de programas BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). BLAST tiene como 10 objetivo identificar regiones de alineamiento local óptimo, esto es, el alineamiento de una porción de dos secuencias de ácidos nucleicos o proteínas, para detectar relaciones entre secuencias que comparten solamente regiones aisladas de similitud (Altschul et al., 1990). En la presente invención, el tblastn del paquete de programas BLAST 2.0 fue utilizado para comparar la secuencia de proteína citoquinina oxidasa de maíz contra una base de datos de secuencias de nucleótidos traducida dinámicamente en todos los marcos de lectura (Altschul et al, Nucleic Acids

15 Res. 25: 3389-3402 (1997)).

Los siguientes ejemplos se dan a manera de ilustración de la presente invención y de ninguna manera son limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1. Breve descripción de las secuencias de la especificación

SEQ ID NO:

DESCRIPCIÓN

1

AtCKX1 genómico

2

AtCKX1 de proteína

3

AtCKX2 genómico

4

AtCKX2 de proteína

5

AtCKX3 genómico

6

AtCKX3 de proteína

7

AtCKX4 genómico

8

AtCKX4 de proteína

9

AfCKX5 genómico (versión corta)

10

AtCKX5 de proteína (versión corta)

11

AtCKX6 genómico

12

AtCKX6 de proteína

13

Cebador 5’ de AtCKX1

14

Cebador 3’ de AtCKX1

15

Cebador 5’ de AtCKX2

16

Cebador 3’ de AtCKX2

17

Cebador 5’ de AtCKX3

18

Cebador 3’ de AtCKX3

19

Cebador 5’ de AtCKX4

20

Cebador 3’ de AtCKX4

21

Cebador 5’ de AtCKX5

(continuación)

SEQ ID NO:

DESCRIPCIÓN

22

Cebador 3’ de AtCKX5

23

Cebador 5’ de AtCKX6

24

Cebador 3’ de AtCKX6

25

ADNc de AtCKX1

26

ADNc de AtCKX2

27

ADNc de AtCKX3

28

ADNc de AtCKX4

29

ADNc de AtCKX5 (versión corta)

30

ADNc de AtCKX6

31

Fragmento de ADNc de AtCKX2

32

Fragmento de péptido de AtCKX2

33

AtCKX5 genómico (versión larga)

34

ADNc de AtCKX5 (versión larga)

35

Proteína de AtCKX5 (versión larga)

36

Promotor homólogo de raíz de clavata

Ejemplo 2. Identificación de genes candidatos que codifican citoquinina oxidasa de Arabidopsis thaliana

Se identificaron seis genes diferentes de Arabidopsis thaliana que portan similitud de secuencia a un gen de 5 citoquinina oxidasa de maíz (Morris et al, Biochem Biophys Res Comm 255:328-333, 1999; Houda-Herin et al Plant J

17: 615-626; WO99/06571). Estos genes fueron encontrados por selección de traducciones de marco 6 de secuencias de nucleótidos a partir de bases de datos genómicas públicas con la secuencia de proteínas del maíz, empleando el programa TBLASTN. Estas secuencias fueron designadas como genes similares a oxidasa de citoquinina de Arabidopsis thaliana o AtCKX. Fueron numerados arbitrariamente como AtCKX1 hasta AtCKX6. La 10 lista que sigue resume la información sobre estos genes. Las fronteras ORF predichas y las secuencias de proteínas son indicativas, con el fin de ilustrar la aproximación de la divergencia en las secuencia de proteínas entre las citoquinina oxidasas de Arabidopsis y maíz, así como entre las diferentes citoquinina oxidasas de Arabidopsis. Las fronteras ORF y las secuencias de proteínas mostradas no deberían tomarse como evidencia concluyente para el modo de acción de estos genes de AtCKX. Para secuencias de ADN y proteína se usaron comparaciones del

15 programa MegAlign de DNAstar. Este programa utiliza el método Clustal para alineamientos.

Para alineamientos múltiples de secuencias de proteínas y ADNc, la penalidad por brecha y la penalidad de longitud de brecha se fijaron en 10 cada uno. Para alineamientos apareados de proteínas los parámetros son como sigue: Ktuple en 1; penalidad por brecha en 3; ventana en 5; diagonales salvadas en 5. Para alineamientos pareados de ADNc los parámetros son como sigue: Ktuple en 2; penalidad por brecha en 5; ventana en 4; diagonales salvadas en

20 4. Los grupos de similitud para alineamientos de proteínas fueron: (M,I,L,V), (F,W,Y), (G,A), (S,T), (R,K,H), (E,D), (N,Q). Los valores que son indicados entre las secuencias de Arabidopsis ADNc y proteína presentan los valores más bajos y más altos encontrados en todas las combinaciones.

A. Nombre del gen:AtCKX1 (proteína de Arabidopsis thaliana similar a citoquinina oxidasa 1 SEQ ID NO: 1)

Localización en la base de datos (número de acceso, localización bac): AC002510, Cromosoma II de Arabidopsis 25 thaliana sección 225 de 255 de la secuencia completa. Secuencia de los clones T32G6.

ORF predicho en la base de datos:

15517..16183, 16415..16542, 16631..16891, 16995..17257, 17344..17752

La secuencia de AtCKX1 ADNc se lista como SEQ ID NO: 25

Secuencia predicha de proteína: SEQ ID NO: 2: Homologías

% identidad con ADNc de Z. mays:

31.5% (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

% similitud con Proteína de Z. mays:

32.2% (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

% identidad con otros (rangos de) ADNc de Arabidopsis):

38.2 % (AtCKX2) -54.1 % (AtCKX6) (Dnastar/MegAlign -Método Clustal) % similitud con otras proteínas (rango) de Arabidopsis:

37.1 % (AtCKX2) -58.1 % (AtCKX6) (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

B. Nombre del gen: AtCKX2 (proteína 2 similar a citoquinina oxidasa de Arabidopsis thaliana, SEQ ID NO: 3)

Localización en la base de datos (número de acceso, localización bac): AC005917, Cromosoma II de Arabidopsis thaliana sección 113 of 255 de la secuencia completa. Secuencia de los clones F27F23, F3P11.

ORF predicho en la base de datos:

complemento, 40721..41012, 41054..41364, 41513..41770, 42535..42662, 43153..43711

Nótese, por favor: La secuencia de ADNc identificada por el inventor usando el programa de predicción de genes NetPlantGene (hftp://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/) fue diferente a la anotada en la base de datos. Con base en la nueva secuencia de ADNc del ORF predicho en la base de datos se revisó:

complemento, 40721..41012, 41095..41364, 41513..41770, 42535..42662, 43153..43711

La secuencia de proteína codificada por este ADNc se lista como SEQ ID NO: 4. El ADNc de AtCKX2 fue clonado por RT-PCR del ARN total de tejido de planta trnasgénica con el kit de una etapa de RT-PCR (Qiagen, Hilden, Germany) y secuenciado usando un kit de reacción de secuenciamiento en ciclo ABI PRISM Big Dye Terminator (Perkin Elmer Applied Biosystems Division). Esto confirmó que la secuencia de ADNc identificada y predicha por el inventor era correcta. La nueva secuencia de AtCKX2 cDNA se lista como SEQ ID NO: 26. Un fragmento de 84-bp correspondiente a los nucleótidos 1171 a 1254 del ADNc de AtCKX2 se lista como SEQ ID NO: 31. La correspondiente secuencia de péptidos de esta secuencia de ADNc de 84-bp se lista como SEQ ID NO: 32.

Homologías

% identidad con ADNc de Z. mays:

38.4% (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

% similitud con Proteína de Z. mays:

37.5% (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

% identidad con otros (rangos de) ADNc de Arabidopsis): 34.9% (AtCKX6) -64.5% (AtCKX4) (Dnastar/MegAlign -Método Clustal) % similitud con otras proteínas (rango) de Arabidopsis: 36.5% (AtCKX6) -66.1 % (AtCKX4) (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

C. Nombre del gen: AtCKX3 (proteína 3 de Arabidopsis thaliana similar a citoquinina oxidasa, SEQ ID NO: 5)

Localización en la base de datos (número de acceso, localización bac): AB024035, AND genómico de Arabidopsis thaliana, cromosoma 5, P1 clone: MHM17, secuencia completa.

Sin predicción del ORF en la base de datos. El gen fue identificado por el inventor usando varios programas de predicción de genes incluyendo GRAIL (ftp: //arthur.epm.ornl.gov/pub/xgrail), Genscan (http://CCR-081.mit.edu/ GENSCAN html) y NetPlantGene (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/):

complemento, 29415..29718, 29813..30081, 30183..30443, 30529..30656, 32107..32716 La nueva secuencia de ADNc de AtCKX3 identificada por el inventor se lista como SEQ ID NO: 27 Secuencia predicha de proteína, basada en la propia predicción de ORF: SEQ ID NO: 6 Homologías

% identidad con ADNc de Z. mays:

38.7% (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

% similitud con Proteína de Z. mays:

39.2% (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

% identidad con otros (rangos de) ADNc de Arabidopsis): 38.8% (AtCKX6) -51.0% (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign -Método Clustal) % similitud con otras proteínas (rango) de Arabidopsis: 39.9% (AtCKX6) -46.7% (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

D. Nombre del gen: AtCKX4 (Proteína 4 de Arabidopsis thaliana similar a citoquinina oxidasa, SEQ ID NO: 7) Localización en la base de datos (número de acceso, localización bac): 1) AL079344, AND de Arabidopsis thaliana DNA cromosoma 4, BAC clon T16L4 (proyecto ESSA) 2) AL161575, ADN de Arabidopsis thaliana cromosoma 4, fragmento contiguo No. 71. ORF predicho en la base de datos: 1) 76187..76814, 77189..77316, 77823..78080, 78318..78586, 78677..78968 2) 101002..101629, 102004..102131, 102638..102895, 103133..103401, 103492..103783 La secuencia de ADNc de AtCKX4 cDNA se lista como SEQ ID NO: 28 Secuencia predicha de proteína: SEQ ID NO: 8 Homologías

% identidad con ADNc de Z. mays:

41.0% (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

% similitud con Proteína de Z. mays:

41.0% (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

% identidad con otros (rangos de) ADNc de Arabidopsis): 35.2% (AtCKX6) -64.5% (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign -Método Clustal) % similitud con otras proteínas (rango) de Arabidopsis:

35.1 % (AtCKX6) -66.1 % (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

E. Nombre del gen: AtCKX5 (Proteína 5 de Arabidopsis thaliana similar a citoquinina oxidasa, SEQ ID NO: 9)

Localización en la base de datos (número de acceso, localización bac): AC023754, F1B16, secuencia completa, cromosome 1 Sin predicción del ORF en la base de datos. El gen fue identificado por los inventores usando varios programas de predicción de genes que incluyen GRAIL

(ftp://arthur.epm.ornl.gov/pub/xgrail), Genscan (http://CCR-081.mit.edu/ GEN SCAN.html) and NetPlantGene (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/). 43756..44347, 44435..44562, 44700..44966, 45493..45755, 46200..46560 La nueva secuencia de ADNc de AtCKX5 cDNA identificada y predicha por los inventores se lista como SEQ ID NO:

29. La secuencia predicha de proteína para este ADNc se lista como SEQ ID NO: 10. Uu segundo codón potencial de inicio ATG está presente 9 nucleótidos más corriente arriba en la secuencia genómica. No está claro cuál de estos dos codones de inicio codifica el primer aminoácido de la proteína. Por lo tanto, un segundo ADNc potencial deinicio de AtCKX5 cDNA en este codón de inicio corriente arriba es listado también en esta invención como SEQ ID NO: 34. La secuencia genómica correspondiente está listada como SEQ ID NO: 33 y la proteína codificada como SEQ ID NO: 35.

Homologías

% identidad con ADNc de Z. mays:

39.1% (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

% similitud con Proteína de Z. mays:

36.6% (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

% identidad con otros (rangos de) ADNc de Arabidopsis):

40.1 % (AtCKX2) -44.0% (AtCKX3) (Dnastar/MegAlign -Método Clustal) % similitud con otras proteínas (rango) de Arabidopsis: 41.6% (AtCKX4) -46.4% (AtCKX6) (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

F. Nombre del gen: AtCKX6 (Proteína 6 de Arabidopsis thaliana similar a citoquinina oxidasa, SEQ ID NO: 11)

Localización en la base de datos (número de acceso, localización bac): AL163818, ADN de Arabidopsis thaliana cromosoma 3, P1 clon MAA21 (projecto ESSA). ORF predicho en la base de datos: 46630..47215, 47343..47470, 47591..47806, 47899..48161, 48244..48565 La secuencia AtCKX6 cDNA está listada como SEQ ID NO: 30 Secuencia predicha de proteína: SEQ ID NO: 12 Homologías

% identidad con ADNc de Z. mays:

37.3% (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

% similitud con Proteína de Z. mays:

36.1% (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

% identidad con otros (rangos de) ADNc de Arabidopsis):

34.9% (AtCKX2) -54.1 % (AtCKX1) (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

% similitud con otras proteínas (rango) de Arabidopsis:

35. 1 % (AtCKX4) -58.1 % (AtCKX1) (Dnastar/MegAlign -Método Clustal)

Los genes AtCKX3 y AtCKX5 no fueron anotados como citoquinina oxidasas putativas en la base de datos y no se dieron los ORF para estos genes. Adicionalmente, los ORF (y consecuentemente las estructuras proteínicas) predichas para AtCKX2 fueron diferentes de nuestra propia predicción y nuestra predicción fue confirmada por secuenciamiento del ADNc AtCKX2.

En la Figura 1 se muestra una comparación de la estructura genética de los genes de Arabidopsis AtCKX 1 a 4 y el gen de maíz CKX.

Las proteínas predichas codificadas por los genes de Arabidopsis AtCKX muestran entre 32% y 41% de similitud en secuencia con la proteína de maíz, mientras que muestran entre 35% y 66% de similitud en secuencias uno con otro. Debido a esta conservación de secuencias reducida, no es claro a priori si los genes de Arabidopsis AtCKX codifican proteínas con actividad de citoquinina oxidasa. En la Figura 2 se muestra un alineamiento de las proteínas predichas de Arabidopsis AtCKX 1 a 4 y del gen de maíz CKX.

Ejemplo 3. Plantas transgénicas que sobreexpresan AtCKX1 mostraron actividad de citoquinina oxidasa incrementada y morfología de la planta alterada

1. Descripción de los procesos de clonación

Se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar por PCR el gen AtCKX1 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas para clonar están en letras minúsculas):

Secuencia del cebador 5’: cggtcgacATGGGATTGACCTCATCCTTACG (SEQ ID NO:13)

Secuencia del cebador 3’: gcgtcgacTTATACAGTTCTAGGTTTCGGCAGTAT (SEQ ID NO: 14)

Un fragmento de PCR de 2235-bp, amplificado por estos cebadores, fue insertado en el sitio SaI I de pUC19. El inserto fue secuenciado y confirmó que el producto de amplificación por PCR no contenía ninguna mutación. El fragmento SalI/SalI de este vector fue subclonado en el sitio SalI corriente abajo de un promotor CaMV 35S modificado (que porta tres secuencias operadoras de tetraciclina) en el vector binario pBinHyg-Tx (Gatz et al., 1992). El constructo resultante fue introducido en tabaco y Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada por Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación estándar.

2. Análisis molecular de las líneas transgénicas

Se identificaron varias líneas transgénicas que sintetizan el transcripto de AtCKX1 a altos niveles (Figura 3). Las líneas transgénicas que expresan el transcripto de AtCKX1 también mostraron una actividad incrementada de citoquinina oxidasa según se determinó mediante una prueba estándar para citoquinina oxidasa con base en la conversión de [2-3H]iP a adenina tal como se describe (Motyka et al., 1996). Esto es ejemplificado para 2 líneas de tabaco y 2 de Arabidopsis en la Tabla 6. Este resultado prueba que el gen AtCKX1 codifica una proteína con actividad de citoquinina oxidasa.

Tabla 6. Actividad de citoquinina oxidasa en tejidos de plantas transgénicas AtCKX1 3. Descripción fenotípica de las líneas transgénicas

Muestra de hojas

Especie de plantas

Línea de planta Actividad de citoquininas oxidasa (nmol Ade/mg proteína.h)

Arabidopsis

Col-0 Tipo Silvestre 0.009

CKX1-11

0.024

CKX1-22

0.026

CKX1-22

0.027

Tabaco

SNN Tipo Silvestre 0.004

CKX1-SNN-8

0.016

CKX1-SNN-28

0.021

3.1 En tabaco: Las plantas tienen un fenotipo enanificado con dominio apical reducido (Figura 7 A, B y C) y producción radicular incrementada (Figura 8).

5 Cinco categorías de fenotipo:

1) fuerte -2 clones

2) intermedio -3 clones

3) débil -4 clones

4) plantas altas (como WT) con gran inflorescencia -5 clones 10 5) similar a WT, 9 clones

Altura (véase Figura 7 B y C)

-

WT: entre 100-150 cm

-

Débil: aproximadamente 75 cm

-

Intermedio: aproximadamente 40-45 cm (tallo principal de aproximadamente 25 cm pero con sobrecrecimiento

15 mediante ramificaciones laterales.

-

Fuerte: aproximadamente 10 cm

Los AtCKX1-48 y AtCKX1-50 transgénicos desplegaron un fenotipo fuerte. Abajo están las mediciones para

elongación del tallo en comparación con plantas WT:

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50

Días después de la germinación

Altura (cm) Altura (cm) Altura (cm)

47

9.5 ± 0.5 1.3 ± 0.3 1.2 ± 0.2

58

22.4 ± 2.3 2.2 ± 0.3 2.3 ± 0.3

68

35.3 ± 2.6 3.1 ± 0.5 2.6 ± 0.5

100

113.3 ± 9.8 7.1 ± 0.8 4.8 ± 0.9

117

138.6 ± 8.1 9.7 ± 0.7 3.6 ± 0.9

131

39.0 ± 9.3 9.3 ± 0.7 3.6 ± 1.0

152

136.6 ± 10.4 10.9 ± 1.1 10.0 ± 1.0

165

11.8 ± 1.9 11.4 ± 1.4

181

16.5 ± 1.7 14.9 ± 1.2

198

19.5 ± 1.5 18.1 ± 1.3

20 Parte experimental: Las plantas fueron cultivadas en suelo en un invernadero. Los datos fueron recolectados a partir de al menos diez plantas por línea.

Hojas (véase Figura 7 D y E)

La forma de las hojas de los expresadores transgénicos de AtCKX1 fue lanceoladas (largas y estrechas): la relación

anchura a longitud de las hojas maduras se redujo de 1:2 en plantas tipo salvaje a 1:3 en transgénicos de AtCKX1 25 (Figura 7 E). El número de hojas y la superficie de las hojas se redujo en comparación con WT (véase Figura 7 D).

También se notó una diferencia prominente en la progresión de la senescencia de las hojas. En el tabaco WT, la

senescencia de las hojas comienza en las hojas más basales y lleva a una reducción uniforme del pigmento de las

hojas (Figura 7 E). En contraste, las hojas en envejecimiento de plantas que expresan fuertemente AtCKX1 permanecieron verdes a lo largo de las venas de las hojas y tomaron un color amarillo en las regiones intercostales, indicando una senescencia alterada de las hojas. La textura de las hojas más viejas era más rígida.

Raíces

Las plantas en crecimiento in vitro que expresaban altamente el gen fueron distinguibles fácilmente de las WT por su capacidad para formar más raíces que son más gruesas (más fuertes) (Figura 8 A), así como por la formación de raíces aéreas a lo largo del tallo.

La raíz primaria fue más larga y el número de raíces laterales y adventicias fue más alto como se ilustra en la figura 8C para plantones que sobreexpresaban AtCKX1-50 (véase también Ejemplo 9).

La curva de respuesta a la dosis de inhibición de crecimiento de raíces por citoquinina exógena mostró que las raíces de los plantones transgénicos son más resistentes a la citoquinina que las raíces WT (Figura 8 D). La resistencia de los transgénicos de AtCKX1 al iPR fue menos marcada que para AtCKX2, lo cual es consistente con los cambios menores en las citoquininas tipo IP en este último (véase Tabla 10).

Se observó un gran incremento en la biomasa de la raíz para plantas adultas cultivadas en suelo (véase Figura 8B para un crecimiento de planta en suelo de 4 a 5 meses), a pesar del hecho de que el crecimiento de las partes aéreas de las plantas se redujo altamente.

Distancia internodos

•

fenotipo intermedio: el internodo 5º por debajo de la inflorescencia tiene aproximadamente 2.5 cm de longitud y el internodo 9º tenía aproximadamente 0.5 cm de longitud en comparación con 5 cm y 2 cm para longitud del 5º y 9º internodos respectivamente, en plantas WT.

•

fenotipo fuerte: la planta AtCKX1-50 La longitud del 20º internodo desde abajo medido en el día 131 después de la germinación tenía 1.3 ± 0.4 mm en comparación con 39.2 ± 3.8 mm para WT.

Dominio apical y ramificación

Se formaron más ramificaciones laterales indicando un domino apical reducido en comparación con plantas W durante el crecimiento vegetativo (véase Figura 9). Las ramificaciones laterales sobrecrecieron al tallo principal, alcanzando una altura de 40-45 cm para expresadores intermedios de AtCKX1. Incluso aparecieron ramificaciones secundarias. Sin embargo, las yemas no se libraron completamente del dominio apical, esto es, los brotes laterales no continuaron realmente su desarrollo. El dominio apical reducido puede deberse a una producción reducida de auxina por parte del meristema apical de brote más reducido (véase Ejemplo 10).

Desarrollo reproductivo

La aparición de la floración en transgénicos de AtCKX1 fue retardada, siendo reducido el número de flores y de semillas producidas por cápsula. El tamaño de las flores no se alteró en las plantas transgénicas y el peso de las semillas individuales fue comparable al peso de las semillas de las plantas tipo silvestre. Se resumen más abajo los datos para dos transgénicos AtCKX1 no representativos:

A. Aparición de la floración

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50

Tiempo de floración (DAG)

106.2 ± 3.3 193.3 ± 4.3 191.8 ± 3.8

Parte experimental: Datos recolectados para al menos diez plantas por línea. La elongación completa de la primera flor fue definida como la aparición de la floración. DAG = días después de la germinación.

B. Número de cápsulas de semilla por planta

Línea

Tipo salvaje AtCKX1-48 AtCKX1-50

Número de cápsulas

83.33 ± 5.13 2.00 ± 1.00 2.60 ± 1.67

Parte experimental: El número de cápsulas de semillas fue determinado al menos a partir de 5 plantas diferentes. Nótese por favor que estas plantas fueron cultivadas bajo condiciones de invernadero durante tiempo de invierno.

Esto afecta negativamente el número de flores que se forman, en particular en los clones transgénicos. Sin embargo, el dibujo general de que forman un número reducido de flores es correcto. n.d., no determinado.

C. Rendimiento de semillas/cápsula (mg)

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50

Semilla/cápsula (mg)

87.41 ± 28.75 23.83 ± 13.36 61.8 ± 40.66

Parte experimental: El rendimiento de semillas fue determinado para al menos 12 cápsulas de semillas. El tamaño de las cápsulas de semillas fue muy variable, por lo tanto la desviación estándar fue grande. n.d., no determinado.

D. Peso de 100 semillas (mg)

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50

Peso de semillas (mg)

9.73 ± 0.44 10.70 ± 1.60 9.54 ± 0.94

Parte experimental: Se determinó la biomasa de semillas como el peso de 100 semillas a partir de al menos 5 10 diferentes cápsulas de semillas. n.d., no determinado.

3.2 En Arabidopsis -La aparición de la germinación fue la misma que para WT -El sistema radicular total fue agrandado y el número de raíces laterales y adventicias se incrementó (véase Figura

4A a D)

15 -El crecimiento de los órganos aéreos fue reducido dando como resultando un fenotipo enanificado (véase Figura 4E y F) y se redujo la biomasa de hojas. Se retarda la formación de hojas y flores. -El ciclo vital fue más largo en comparación con WT y el rendimiento en semillas fue más bajo en comparación con

WT Los siguientes datos morfométricos ilustran estos fenotipos: 20 Desarrollo de raíces

A. Longitud total del sistema radicular

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-11 AtCKX1-15

Longitud(mm)

32.5 76.5 68.4

B. Longitud raíces primarias

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-11 AtCKX1-15

Longitud (mm)

32.3 ± 3.8 52.3 ± 4.8 39.9 ± 4.2

25 C. Longitud de raíces laterales (LR) D. Longitud de las raíces adventicias

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-11 AtCKX1-15

Longitud (mm)

0.2 ± 0.4 15.6 ± 11.0 10.4 ± 7.6

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-11 AtCKX1-15

Longitud (mm)

0.03 ± 0.18 8.6 ± 8.5 19.1 ± 11.0

E. Número de raíces laterales (LR)

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-11 AtCKX1-15

Número de LR

0.3 ± 0.5 10.4 ± 5.4 2.6 ± 1.1

F. Número de raíces adventicias (AR)

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-11 AtCKX1-15

Número de AR

3.03 ± 0.18 1.6 ± 1.1 2.6 ± 1.1

Parte experimental: Las mediciones fueron llevadas a cabo en plantas 8 días después de la germinación in vitro sobre medio MS. Se calificaron al menos 17 plantas por línea. Desarrollo de brotes 10 A. Superficie de hojas

Línea

Tipo silvestre Plantas homocigotas T3 AtCKX1-11-7 T3 Plantas homocigotas T3 AtCKX1-11-12 Plantas homocigotas AtCKX1-15-1

Superficie de hojas (cm2)

21.16 ± 1.73 2.28 ± 0.58 2.62 ± 0.28 1.66 ± 0.22

Parte experimental: Se midió el área superficial de las hojas de hojas roseta principales formadas después de 30 días después de la germinación. Se analizaron 3 plantas por clon. Desarrollo reproductivo 15 Aparición de la floración

Línea

Tipo silvestre Plantas heterocigotas AtCKX1-11 T3 Plantas heterocigotas AtCKX2-2 T2 Plantas heterocigotas AtCKX2-5 T2

Tiempo de floración (DAG)

43.6 ± 5.8 69.7 ± 9.4 51.2 ± 4.1 45.1 ± 6.9

Parte experimental: Las plantas fueron cultivadas bajo condiciones de invernadero. Se analizaron al menos 13 plantas por clon.

DAG= días después de la germinación

20 Conclusión: El análisis de las plantas de Arabidopsis transgénicas de AtCKX1 confirmó ampliamente los resultados obtenidos a partir del tabaco e indica la naturaleza general de las consecuencias de un contenido reducido de citoquinina. El sistema radicular total creció (la longitud radicular total se incrementó aproximadamente 110-140% en transgénicos de AtCKX1), el brote se desarrolló más lentamente (floración retardada) y se redujo la biomasa de hojas. El rendimiento de semillas fue inferior en las transgénicas también.

Ejemplo 4. Sobreexpresión de AtCKX2 en plantas transgénicas mostró actividad incrementada de citoquinina oxidasa y morfología de la planta alterada

1. Descripción del proceso de clonación

Los siguientes cebadores fueron utilizados para amplificar por PCR el gen AtCKX2 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas para la clonación están en letras minúsculas):

Secuencia de cebador 5’: gcggtaccAGAGAGAGAAACATAAACAAATGGC (SEQ ID N0:15)

Secuencia de cebador 3’: gcggtaccCAATTTTACTTCCACCAAAATGC (SEQ ID NO:16)

Un fragmento por PCR de 3104-bp, amplificado por estos cebadores, fue insertado en el sitio KpnI de pUC19. El inserto fue secuenciado para verificar que no se introdujeron diferencias en la secuencia publicada por el procedimiento de PCR. El fragmento KpnI/KpnI de este vector fue subclonado en el sitio KpnI corriente abajo de un promotor CaMV 35S modificado (que porta tres secuencias del operador de tetraciclina) en el vector binario pBinHyg-Tx (Gatz et al., 1992). El constructo resultante fue introducido en tabaco y Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada por Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación estándar.

2. Análisis molecular de las líneas transgénicas

Se identificaron varias líneas transgénicas que sintetizaban el transcripto AtCKX2 a niveles altos (Figura 6). Las líneas transgénicas que expresan el transcripto AtCKX2 también mostraron actividad incrementada de citoquinina oxidasa. Esto se ejemplifica por 2 líneas de tabaco y 3 de Arabidopsis en la Tabla 7. Este resultado prueba que el gen AtCKX2 codifica una proteína con actividad de citoquinina oxidasa.

Tabla 7. Actividad de citoquinina oxidasa en tejidos de plantas transgénicas con AtCKX2

Muestra

Especie de planta y tejido

Línea de planta Actividad de citoquinina oxidasa (nmol Ade/mg proteína.h)

Arabidopsis callo

Col-0 tipo silvestre 0.037

CKX2-15

0.351

CKX2-17

0.380

CKX2-55

0.265

Tabaco hojas

SNN tipo silvestre 0.009

CKX2-SNN-18

0.091

CKX2-SNN-19

0.091

3. Descripción fenotípica de las líneas transgénicas

3.1 En tabaco (véase Figura 7 a 10): Tres categorías de fenotipo: 1) fuerte -15 clones (similar al fenotipo intermedio de AtCKX1) 2) débil -6 clones 3) otros -similar a plantas WT, 7 clones Partes de plantas aéreas Las observaciones concernientes a altura de la planta, distancia internodal, ramificación, forma de hojas y

amarillamiento fueron similares que para las transgénicos con AtCKX1 con diferencias cuantitativas generalmente menores en que las características de enanificación fueron más severas en transgénicos con AtCKX1 que en transgénicos con AtCKX2 (compárense las plantas con AtCKX1 con plantas AtCKX2 en la Figura 7A y B). Esto es ilustrado más abajo por las mediciones de elongación de tallo y distancia internodal de clones con un fenotipo fuerte AtCKX2-38 y AtCKX2-40: Elongación de tallo

Línea

Tipo silvestre AtCKX2-38 AtCKX2-40

Días después de la germinación

Altura (cm) Altura (cm) Altura (cm)

47

9.5 ± 0.5 2.4 ± 0.1 2.6 ± 0.2

58

22.4 ± 2.3 5.5 ± 0.7 5.3 ±0.5

68

35.3 ± 2.6 7.1 ± 0.8 7.0 ±0.7

100

113.3 ±9.8 15.5 ± 2.5 20.3 ± 6.4

117

138.6 ± 8.1 19.8 ± 3.8 29.5 ±6.0

131

139.0 ± 9.3 26.5 ± 7.0 33.4 ±5.8

152

136.6 ±10.4 33.7 ±6.3 33.9 ± 6.4

165

36.2 ±4.3

Parte experimental: Las plantas fueron cultivadas en suelo en un invernadero Los datos fueron recolectados a partir de al menos diez plantas por línea. Distancia internodal

Línea

Tipo silvestre AtCKX2-38

Distancia Internodal (mm)

39.2 ± 3.8 7.2 ± 1.6

Parte experimental: La longitud del 20º internodo de la parte inferior fue medida en el día 131 después de la germinación.

Raíces

10 Las plantas cultivadas in vitro con alta expresión del gen fueron fácilmente distinguibles de las plantas WT por su capacidad para formar más raíces que son más gruesas (más fuertes), así como por la formación de raíces aéreas a lo largo del tallo.

La raíz primaria fue más larga y el número de raíces laterales y adventicias fue más alto como se ilustra en la figura 8C para plantones que sobreexpresan AtCKX2-38 (véase también Ejemplo 9).

15 Esta curva de respuesta a la dosis de la inhibición de crecimiento por citoquinina exógena mostró que las raíces de los plantones transgénicos eran más resistentes a la citoquinina que las raíces WT (Figura 8 D). La resistencia de los transgénicos de AtCKX1-28 al iPR fue menos marcada que para AtCKX2-38, lo cual es consistente con los cambios más pequeños en la citoquinina tipo iP en esta última (véase Tabla 10).

Un incremento en el peso fresco y seco de la biomasa de raíces de las líneas TO de plantas transgénicas con

20 AtCKX2 en comparación con WT se observó para el crecimiento de plantas en suelo, tal como lo ilustra la siguiente tabla:

Línea

Tipo silvestre AtCKX2 (T0)

Peso fresco(g)

45.2 ± 15.4 77.1 ± 21.3

Peso seco (g)

6.3 ± 1.9 9.6 ± 2.2

Parte experimental: Se cultivaron seis plantas WT y seis líneas independientes T0 del clon 35S::AtCKX2 en suelo. Después de la floración el sistema radicular fue lavado con agua, el suelo fue retirado tanto como fue posible y se 25 midieron el peso fresco y el peso seco.

Un incremento en el peso fresco y seco y en la biomasa de la raíces también fue observado para la progenie F1 de transgénicos de AtCKX2 cultivados en hidropónicos en comparación con WT, tal como lo ilustra la siguiente tabla:

Línea

Tipo silvestre AtCKX2-38 AtCKX2-40

Peso fresco RAÍZ (g)

19.76 ± 6.79 33.38 ± 7.76 50.04 ± 15.59

Peso seco RAÍZ (g)

2.36 ± 0.43 2.61 ± 0.39 3.52 ± 1.06

Peso fresco BROTE (g)

159.8 ± 44.53 33.66 ± 2.67 48.84 ± 11.83

Relación peso frescoBROTE/RAÍZ

8.24 ± 0.63 1.04 ± 0.18 1.08 ± 0.51

Parte experimental: Las plantas cultivadas en el suelo fueron transferidas 60 días después de la germinación a un sistema hidropónico (solución de Hoagland) y cultivadas durante 60 días adicionales. La solución hidropónica fue aireada continuamente y reemplazada por solución fresca cada tercer día.

En resumen, las plantas transgénicas cultivadas en solución hidropónica formaron aproximadamente 65-150% más de biomasa de raíz (peso fresco) que las plantas tipo silvestre. El incremento en peso seco fue 10-50%. Esta diferencia en parte posiblemente se debe al mayor volumen celular de los transgénicos. Esto reduce la porción relativa de paredes celulares, las cuales forman el volumen del material de materia seca. La biomasa de brotes fue reducida a 20% -70% frente a los brotes tipo silvestre. La diferencia en peso fresco lleva a un desplazamiento en la relación brote/raíz, que fue aproximadamente 8 en tipo silvestre, pero aproximadamente 1 en los clones transgénicos.

Conclusión:

Un incremento en el crecimiento de la raíz y la biomasa se observó para paltones transgénicos de AtCKX2 y el crecimiento de plantas adultas bajo diferentes condiciones en comparación con los controles de WT a pesar del hecho de que el crecimiento de las partes aéreas de las plantas se reduce. Se observaron diferencias cuantitativas entre diferentes plantas transgénicas: Se observaron incrementos más altos en biomasa de raíces para los clones de expresión más fuerte.

Desarrollo reproductivo

La aparición de la floración en transgénicos de AtCKX2 fue retardada, reduciéndose el número de flores y el rendimiento en semillas por cápsula. Estos efectos fueron muy similares a los observados en plantas transgénicas con AtCKX1 pero fueron menos prominentes en transgénicos con AtCKX2, tal como se indica en las tablas más abajo. El tamaño de las flores no se alteró en las plantas transgénicas y el peso de las semillas individuales fue comparable al peso de las semillas de las plantas tipo silvestre.

A. Aparición de la floración

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50 AtCKX2-38 AtCKX2-40

Tiempo de floración(DAG)

106.2 ± 3.3 193.3 ± 4.3 191.8 ± 3.8 140.6 ± 6.5 121.9 ± 9.8

Parte experimental: Se recolectaron los datos para al menos diez plantas por línea. La elongación completa de la primera flor fue definida como la aparición de la floración. DAG = días después de la germinación.

B. Número de cápsulas de semillas por planta

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50 AtCKX2-38 AtCKX2-40

Número de cápsulas

83.33 ± 5.13 2.00 ± 1.00 2.60 ± 1.67 4.30 ± 2.58 n.d.

Parte experimental: El número de cápsulas de semillas fue determinado en al menos 5 plantas diferentes. Por favor nótese que estas plantas fueron cultivadas bajo condiciones de invernadero durante tiempo de invierno. Esto afecta negativamente el número de flores que se forman, en particular en los clones transgénicos. Sin embargo, la imagen general de que forman un número reducido de flores es correcta. n.d., no determinada

C. Rendimiento de semilla/cápsula (mg)

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50 AtCKX2-38 AtCKX2-40

Semilla/cápsula (mg)

87.41 ± 28.75 23.83 ± 13.36 61.8 ± 40.66 46.98 ± 29.30 n.d.

Parte experimental: El rendimiento de semillas fue determinado para al menos 12 cápsulas de semillas. El tamaño de las cápsulas de semillas fue muy variable, por lo tanto las desviaciones estándar fueron grandes. n.d., no determinado

D. Peso de 100 semillas (mg)

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-48 AtCKX1-50 AtCKX2-38 AtCKX2-40

Peso de semillas (mg)

9.73 ± 0.44 10.70 ± 1.60 9.54 ± 0.94 10.16 ± 0.47 n.d.

Parte experimental: Se determinó la biomasa en semillas como peso de 100 semillas de al menos 5 cápsulas de semillas diferentes. n.d., no determinado

10 3.2 En Arabidopsis: Se obtuvieron los siguientes datos morfométricos para transgénicos con AtCKX2: Desarrollo de raíces

A. Longitud total del sistema radicular

Línea

Tipo silvestre AtCKX2-2 AtCKX2-5

Longitud (mm)

32.5 50.6 48.5

15 B. Longitud de raíz primaria

Línea

Tipo silvestre AtCKX2-2 AtCKX2-5

Longitud (mm)

32.3 6 3.8 30.7 6 4.8 31.6 6 6.8

C. Longitud de raíces laterales

Línea

Tipo silvestre AtCKX2-2 AtCKX2-5

Longitud (mm)

0.2 6 0.4 5.5 69.0 1.9 62.5

D. Longitud raíces adventicias E. Número de raíces laterales (LR)

Línea

Tipo silvestre AtCKX2-2 AtCKX2-5

Longitud (mm)

0.03 6 0.18 14.4 6 10.2 14.9 6 9.1

Línea

Tipo silvestre AtCKX2-2 AtCKX2-5

Número de LR

0.3 6 0.5 2.9 62.3 1.9 61.0

F. Número de raíces adventicias (AR)

Línea

Tipo silvestre AtCKX2-2 AtCKX2-5

Número de AR

3.03 6 0.18 1.8 60.9 1.8 61.0

Parte experimental: Las mediciones fueron llevadas a cabo en plantas 8 días después de la germinación, in vitro sobre medio MS. Se calificaron al menos 17 plantas por línea. Desarrollo de brotes Superficie de hojas

Línea

Tipo silvestre Plantas heterocigotas AtCKX2-2 T2 Plantas heterocigotas AtCKX2-5 T2 Plantas heterocigotas AtCKX2-9 T2

Superficie de hoja (cm2)

21.16 ± 1.73 8.20 ± 2.35 8.22 ± 0.55 7.72 ± 0.85

10 Parte experimental: Se midió el área superficial de las hojas de hojas roseta principales formadas después de 30 días de la germinación. Se analizaron 3 plantas por clon. Desarrollo reproductivo Aparición de la floración

Línea

Heterocigota tipo silvestre plantas [AtCKX1-11 T3 Plantas heterocigotas AtCKX2-2 T2 Plantas heterocigotas AtCKX2-5 T2

Tiempo de floración (DAG)

43.6 ± 5.8 69.7 ± 9.4 51.2 ± 4.1 45.1 ± 6.9

15 Parte experimental: las plantas fueron cultivadas bajo condiciones de invernadero. Se analizaron al menos 13 plantas por clon. DAG = días después de la germinación.

Conclusión: los transgénicos de AtCKX2 de Arabidopsis habían reducido la biomasa de hojas y de un fenotipo de enanificación similar a los transgénicos de AtCKX1 (compárese Figura 5 con Figura 4F). El sistema radicular total también se agrandó en Arabidopsis transgénica de AtCKX2. La longitud total de las raíces se incrementó

20 aproximadamente en 50% en transgénicos de AtCKX2. Los transgénicos de AtCKX1 tiene raíces primarias más largas, más raíces laterales y forman más raíces adventicias. Los transgénicos de AtCKX2 carecen del crecimiento potenciado de la raíz primaria pero forman más raíces laterales y crecen las raíces laterales más que en WT.

Resumen:

Los fenotipos observados para los transgénicos AtCKX2 fueron muy similares pero no idénticos a los transgénicos

25 de AtCKX1, los cuales a su vez fueron muy similares pero no idénticos a los resultados obtenidos para los transgénicos de tabaco. Esto confirma la naturaleza general de las consecuencias de un contenido reducido de citoquinina en estas dos especies de plantas y por lo tanto, pueden esperarse fenotipos similares en otras especies de plantas también. La diferencia principal entre tabaco y Arabidopsis es la carencia de crecimiento de raíz primaria potenciado en plantas que sobreexpresan AtCKX2.

Ejemplo 5. Plantas transgénicas que sobreexpresan AtCKX3 mostraron actividad incrementada de citoquinina oxidasa y morfología alterada de la planta.

1. Descripción del proceso de clonación.

Se usaron los siguientes cebadores para amplificar por PCR el gen AtCKX3 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas para la clonación están en letras minúsculas):

Secuencia del cebador 5’: gcggtaccTTCATTGATAAGAATCAAGCTATTCA (SEQ ID NO:17)

Secuencia del cebador 3’: gcggtaccCAAAGTGGTGAGAACGACTAACA (SEQ ID NO:18)

Se insertó un fragmento de PCR de 3397 bp, producido por esta amplificación de PCR en el sitio Kpnl de pBluescript. El inserto fue secuenciado para confirmar que el producto de PCR no tenía cambios de secuencia en comparación con el gen. El fragmento Kpnl/Kpnl de este vector fue subclonado en el sitio Kpnl corriente debajo de un promotor CaMV35S modificado (que porta 3 secuencias de operador de tetraciclina) en el vector binario pBinHyg-Tx (Gatx et al, 1992). El constructo resultante fue introducido en tabaco y Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada por Agrobacterium, utilizado protocolos de transformación estándar.

2. Análisis molecular de las líneas transgénicas

Se identificaron varias líneas transgénicas de tabaco que sintetizan el transcripto AtCKX3 a altos niveles (Figura 11A). Las líneas transgénicas de tabaco que expresan el transcripto de AtCKX3 mostraron también actividad incrementada de citoquinina oxidasa. Esto se ejemplifica para 3 plantas en la Tabla 8. Esto demuestra que el gen AtCKX3 codifica una proteína con actividad de citoquinina oxidasa.

Tabla 8. Actividad citoquinina oxidasa en tejidos de plantas transgénicas con AtCKX4

Ejemplo

Especies y tejidos de plantas

Línea de planta Actividad de citoquinina oxidasa (nmol Ade/mg proteína.h)

Hojas de tabaco

SNN tipo silvestre 0.011

CKX3-SNN-3

0.049

CKX3-SNN-6

0.053

CKX3-SNN-21

0.05

3. Análisis fenotípicos de las plantas

Los fenotipos generados por sobreexpresión del gen AtCKX3 en tabaco y Arabidopsis fueron similares básicamente a los de las plantas que expresan AtCKX1 y AtCKX2, esto es, formación y enanificación potenciadas. Sin embargo, la sobreexpresión del gen AtCKX3 en tabaco dio como resultado un fenotipo más fuerte en comparación con AtCKX2. En este sentido la sobreexpresión de AtCKX3 fue más similar a la sobreexpresión de AtCKX1.

Ejemplo 6. Plantas transgénicas que sobreexpresan AtCKX4 muestran actividad incrementada de citoquinina oxidasa y morfología alterada de la planta

1. Descripción del proceso de clonación

Se usaron los siguientes cebadores para amplificar por PCR el gen AtCKX4 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas utilizadas para la clonación están en letras minúsculas):

Secuencia del cebador 5’: gcggtaccCCCATTAACCTACCCGTTTG (SEQ ID NO:19)

Secuencia del cebador 3’: gcggtaccAGACGATGAACGTACTTGTCTGTA (SEQ ID NO:20)

Un fragmento de PCR de 2890 bp producido por esta amplificación de PCR, fue insertado en el sitio Kpnl de pBluescript. El inserto fue secuenciado para confirmar que el producto de PCR no tenía cambios de secuencia en comparación con el gen. El fragmento Kpnl/Kpnl de este vector fue subclonado en el sitio Kpnl corriente abajo de un promotor CaMV35S (que porta 3 secuencias de operador de tetraciclina) en el vector binario pBinHyg-Tx (Gatz et al., 1992). El constructor resultante fue introducido en tabaco y Arabidopsis thaliana a través de transformación mediada por Agrobacterium, utilizando protocolos de transformación estándar.

2. Análisis molecular de las líneas transgénicas

Varias líneas transgénicas de tabaco sintetizaron el transcripto de ArCKX4 a altos niveles (Figura 11B). Las líneas transgénicas que expresan el transcripto de AtCKX4 también mostraron actividad incrementada de citoquinina oxidasa. Esto es ejemplificado por 3 líneas de Arabidopsis y 3 de tabaco en la Tabla 9. Este resultado prueba que el gen AtCKX4 codifica una proteína con actividad de citoquinina oxidasa.

Tabla 9. Actividad de citoquinina oxidasa en tejidos de plantas transgénicas con AtCKX4

Muestra

Especie y tejido de plantas

Línea de planta Actividad de citoquinina oxidasa (nmol Ade/mg proteína.h)

Arabidopsis callo

Col-0 tipo silvestre 0.037

CKX4-37

0.244

CKX4-40

0.258

CKX4-41

0.320

Tabaco hojas

SNN tipo silvestre 0.011

CKX4-SNN-3

0.089

CKX4-SNN-18

0.085

CKX4-SNN-27

0.096

Globalmente, los datos mostraron que los valores aparentes de Km para las cuatro oxidasas de citoquinina estaban en el rango de 0.2 a 9.5 µM con iP como sustrato, lo cual demuestra adicionalmente que las proteínas codificadas por AtCKX1 hasta 4 son en efecto enzimas de citoquinina oxidasa tal como se divulga aquí.

3. Análisis fenotípico de plantas

Los fenotipos generados por sobreexpresión del gen de AtCKX4 en tabaco y Arabidopsis fueron básicamente similares a los de las plantas que expresan AtCKX1 y AtCKX2, esto es, formación de raíces potenciada, dominio apical reducido, enanificación y amarillamiento de las regiones intercostales en hojas más viejas de tabaco. Un fenotipo adicional en el tabaco fue el de hojas lanceoladas (relación alterada de longitud a anchura).

Observaciones generales de las plantas de tabaco que sobreexpresan AtCKX.

En general, el análisis fenotípico demostró que la sobreexpresión del gen de AtCKX produce alteraciones de desarrollo drásticas en el brote de las plantas y en el sistema de raíces en tabaco, incluyendo un desarrollo potenciador sistema radicular y enanificación de la parte aérea de la planta. Otros efectos tales como senescencia alterada de las hojas, formación de raíces adventicias en los tallos, y otros también fueron observados tal como se divulga aquí. Las alteraciones fueron muy similares, pero no idénticas, para los diferentes genes. En el tabaco, los sobreexpresadores de AtCKX1 y AtCKX3 fueron similares a lo que fueron AtCKX2 y AtCKX4. En general, los dos primeros mostraron una expresión más alta de las características, particularmente en el brote. Por lo tanto, un gen de citoquinina oxidasa en particular puede ser preferido para alcanzar los fenotipos que se describen en las realizaciones de está invención.

Ejemplo 7. Clonación del gen AtCKX5

Los siguientes cebadores fueron utilizados para amplificar por PCR el gen de AtCKX5 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas para la clonación están en letras minúsculas):

Secuencia del cebador 5’: ggggtaccTTGATGAATCGTGAAATGAC (SEQ ID NO:21)

Secuencia del cebador 3’: ggggtaccCTTTCCTCTTGGTTTTGTCCTGT (SEQ ID NO:22)

La secuencia del cebador 5’ incluye los dos codones de partida potenciales de la proteína de AtCKX5, el codón 5’ más iniciador está subrayado y un segundo ATG está indicado en itálicas.

Un fragmento de PCR de 2843 bp, producido por esta amplificación de PCR, fue insertado en un producto con extremo bloqueado en un vector de clonación pCR-Blunt-II-TOPO (Invitrogen).

Ejemplo 8. Clonación del gen AtCKX6

Se usaron los siguientes cebadores para amplificar por PCR el gen AtCKX6 de Arabidopsis thaliana, acceso Columbia (las secuencias no homólogas usadas para clonación están en letras minúsculas): Secuencia del cebador 5’: gctctagaTCAGGAAAAGAACCATGCTTATAG (SEQ ID NO:23)

5 Secuencia del cebador 3’: gctctagaTCATGAGTATGAGACTGCCTTTTG (SEQ ID NO:24) Un fragmento de PCR de 1949 bp, producido por esta amplificación por PCR, fue insertado en un producto bloqueado en el vector de clonación pCR-Blunt-II-TOPO (Invitrogen).

Ejemplo 9. Pruebas de crecimiento de plantones de tabaco demostraron un vigor temprano de transgénicos de AtCKX

10 Semillas de los transgénicos sobreexpresantes AtCKX1-50 y AtCKX2-38 y tabaco WT fueron sembrados in vitro sobre medio MS, cultivados durante 4 días después del tratamiento en frio y germinados después de 6 días. Las observaciones sobre el crecimiento de los plantones se hicieron 10 días después de la germinación (véase también Figura 8C) y se resumen abajo. Al menos se calificaron 20 individuos por clon. Se obtuvieron datos similares en otros dos experimentos.

15 A. Longitud total del sistema de raíces

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-50 AtCKX2-38

Longitud (mm)

61.1 122.0 106.5

B. Longitud de raíces primarias

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-50 AtCKX2-38

Longitud (mm)

32.3 ± 2.6 50.8 ± 4.5 52.4 ± 4.8

C. Longitud de raíces laterales

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-50 AtCKX2-38

Longitud (mm)

9.8 ± 5.5 18.0 ± 8.1 13.0 ± 6.0

D. Longitud de raíces adventicias

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-50 AtCKX2-38

Línea (mm)

19.0 ± 5.0 53.0 ± 12.0 42.0 ± 9.8

E. Número de raíces laterales (LR)

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-50 AtCKX2-38

Longitud (mm)

19.0 ± 5.0 53.0 ± 12.0 42.0 ± 9.8

25 F. Número de raíces adventicias AR

Línea

Tipo silvestre AtCKX1-50 AtCKX2-38

Número de AR

2.2 ± 0.6 3.5 ± 0.9 3.6 ± 1.3

Plantas con AtCKX1 y AtCKX2, observaciones generales:

Los plantones de plantas de tabaco que sobreexpresan AtCKX1 y AtCKX2 tienen 60% más de raíces adventicias y tres veces más raíces laterales que las plantas no transformadas 10 días después de la germinación. La longitud de la raíz primaria se incrementó en aproximadamente 70%. Esto – junto con más y más largas raíces laterales y raíces secundarias – dio como resultado un 70-100% de incremento en la longitud total de las raíces. Estos resultados muestran que la sobreexpresión de la citoquinina oxidasa potencia el crecimiento y desarrollo tanto de la raíz principal como de las raíces adventicias, dando como resultado un vigor temprano.

Ejemplo 10. Análisis histológico de morfología de plantas alteradas en plantas de tabaco con sobreexpresión de AtCKX1

Los análisis microscópicos de los diferentes tejidos revelaron que los cambios morfológicos en los transgénicos de AtCKX se reflejan mediante cambios distintos en número de células y velocidad de formación de células (véase Figura 10). El meristema apical de brote (SAM) de los transgénicos de AtCKX1 fue más pequeño que en el tipo silvestre y menos células ocupan el espacio entre la zona central y la zona periférica de la formación de órganos laterales, pero las células eran del mismo tamaño (Figura 10A). El número reducido de células y el tamaño del SAM como consecuencia del contenido reducido de citoquinina indica que la citoquinina tiene un papel en el control de la proliferación de SAM. No ocurrieron cambios obvios en el patrón de diferenciación, sugiriendo que la organización espacial de las zonas de diferenciación en SAM es fundamentalmente independiente del número de células y de la concentración de citoquinina local. El patrón de tejidos generales de las hojas sobreexpresado de las de citoquinina oxidasa permaneció sin cambios. Sin embargo, el tamaño del floema y xilema se redujo significativamente (Figura 10B). En contraste, el tamaño de células promedio del parénquima de las hojas y las células epidérmicas se incrementó de 4 a 5 veces (Figura 10C, D). Se forman nuevas células de transgénicos de AtCKX1 a 3-4% de la rata de hojas tipo silvestre y el número de células de hojas final se estimó en el rango de 5-6% del tipo silvestre. Esto indica un requerimiento absoluto para las citoquininas en hojas con el fin de mantener el ciclo de división celular. Ni el tamaño de las células ni la forma de las células de los órganos florales se alteró y el rendimiento de semillas por cápsula fue similar en el tipo silvestre y en las plantas transgénicas con AtCKX. La población celular de los meristemas de raíz de plantas transgénicas con AtCKX1 se incrementó aproximadamente cuatro veces y el número de células tanto en la columnela central como en la lateral se potenció (Figura 10E, F). El diámetro final de la raíz se incrementó en un 60% debido a un diámetro incrementado en todos los tipos de células de raíces. Los patrones de raíces radiales fueron idénticos en el tipo silvestre y en los transgénicos, con la excepción de que se notó frecuentemente una cuarta capa de células de córtex en las raíces transgénicas (Figura 10G). El número de células incrementado y la longitud celular ligeramente reducida indican que el crecimiento potenciado de las raíces es debido al número incrementado de células en ciclo más que al incremento en el crecimiento celular. En la presencia de un contenido disminuido de citoquinina, las células del meristema de las raíces deben sufrir rondas adicionales de mitosis antes de que salgan del meristema y comiencen a elongarse. La salida del meristema está regulada por lo tanto por un mecanismo que es sensible a las citoquininas. Aparentemente, las citoquininas tienen un efecto regulador negativo en el meristema de la raíz y concentraciones de citoquinina tipo silvestre son inhibidoras para el desarrollo de un sistema de raíces máximo. Por lo tanto, la reducción del nivel de citoquininas activas por la sobreexpresión de la citoquinina oxidasas estimula el desarrollo de la raíz, lo cual da como resultado un incremento en el tamaño de la raíz con más raíces laterales y adventicias en comparación con plantas WT.

Ejemplo 11. Plantas de tabaco con sobreexpresión de AtCKX1 y AtCKX2 tienen un contenido reducido de citoquinina.

Entre los 16 diferentes metabolitos de la citoquinina que fueron medidos, el cambio más grande ocurrió en las citoquininas tipo iP en sobreexpresadores de AtCKX2 (Tabla 10): el descenso global en el contenido de citoquininas tipo iP es más pronunciado en plantas que expresan AtCKX2 que en transgénicos de AtCKX1. Los transgénicos de AtCKX1 mostraron un fenotipo más fuerte en el brote. No se sabe cual metabolito de citoquinina es relevante para las características diferentes que fueron analizadas. Puede ser que las diferentes formas de citoquinina juegan papeles diferentes en los diversos procesos del desarrollo. Se notaron alteraciones más pequeñas para citoquininas tipo Z, lo cual podría deberse a una accesibilidad diferente del sustrato o una especificidad de sustrato inferior de la proteína. El contenido total de iP y metabolitos Z en clones transgénicos individuales estaba entre 31% y 63% del tipo silvestre. La reserva general de citoquinina de los O-glucósidos también disminuyó en los transgénicos (Tabla 10). La concentración de N-glucósidos y citoquininas tipo DHZ fue muy baja y no se alteró o solo se alteró maquinalmente en plantones transgénicos (datos no mostrados).

Tabla 10. Contenido de citoquinina de plantas transgénicas de AtCKX. Extracción, inmunopurificación, separación por HPLC y cuantificación de la citoquininapor métodos de ELISA llevados a cabo tal como se describe en Faiss et al., 1997. Se analizaron tres muestras reservadas independientemente de plantones de aproximadamente 100 semanas de edad (2.5 g por muestra) para cada clon. Las concentraciones están en pmol por gramo de peso fresco-1. Abreviaturas: iP, N6-( �is�penten il)adenina; iPR, N6-( 2isopentenil)adenina ribósido; iPRP, N6-( 2isopentenil)adenina ribósido 5’-monofosfato; Z, transzeatina; ZR, zeatina ribósido; ZRP, zeatina ribósido 5’-monofosfato; ZOG, zeatina O-glucósido; ZROG, zeatina ribósido O-glucósido.

LíneaWTAtCKX1-2 AtCKX1-28 AtCKX2-38 AtCKX2-40

Metabolito deConcentraciónConcentración% de WTConcentración% de WTConcentración% de WTConcentración% de WTcitoquinina

5.90± 4.764.941.822.85iP± 81± 84± 31± 48

1.800.822.620.440.62

2.36± 1.530.750.550.89IPR± 65± 32± 23± 38

0.740.140.270.390.07

3.32± 0.871.120.801.68IPRP± 26± 34± 24± 51

0.730.260.130.480.45

0.24± 0.170.220.210.22Z± 71± 92± 88± 92

0.060.020.030.060.02

0.60± 0.320.340.340.32ZR± 53± 57± 57± 53

0.130.120.030.150.05

0.39± 0.420.280.060.17ZRP± 107± 72± 15± 44

0.170.110.150.010.06

0.46± 0.320.260.200.12ZOG± 70± 57± 43± 26

0.200.090.130.070.02

0.48± 0.300.470.230.30ZROG± 63± 98± 48± 63

0.170.060.020.050.13

Total 13.75 8.69 63 8.38 61 4.21 31 6.55 48

Ejemplo 12. Experimentos de injerto mostraron que la enanificación y el desarrollo potenciado de raíces debido a la sobreexpresión de AtCKX es confinado a tejidos transgénicos.

Para investigar cuáles efectos genotípicos de la sobreexpresión de citoquinina oxidasa están restringidos a los tejidos de expresión, esto es, son características autónomas de la célula o el órgano, se llevaron a cabo experimentos de injertos. Se hicieron injertos recíprocos entre una planta de tabaco transgénico con AtCKX2 y un tabaco WT. La planta transgénica utilizada en este experimento fue AtCKX2-38, la cual presentaba un fenotipo fuerte caracterizado por un crecimiento radicular potenciado y desarrollo reducido de las partes aéreas de la planta. Tal como se describe en el ejemplo 3 hasta 6, estos fueron dos fenotipos importantes que resultaron de la sobreexpresión de la citoquinina oxidasa en tabaco y Arabidopsis.

Las plantas tenían aproximadamente 15 cm de altura cuando fueron injertadas y la unión del injerto fue aproximadamente 10 cm por encima del suelo. La Figura 12 muestra las plantas 15 semanas después del injerto. Los resultados principales fueron que: (i) el fenotipo aéreo de un injerto WT injertado sobre una raíz de reserva transgénica fue similar al injerto de control WT (=injerto WT o raíz de reserva WT). De forma importante, esto muestra que la sobreexpresión del transgén de AtCKX2 en la raíz de reserva no incluye la enanificación de las partes aéreas no transgénicas de la planta (véase Figura 12A). El crecimiento mejorado de la raíz de la reserva de raíces transgénicas fue mantenido, indicando que el crecimiento mejorado de la raíz de los transgénicos de AtCKX es autónomo y no depende del brote transgénico de AtCKX (Figura 12C). De forma interesante, los injertos WT injertados sobre las reservas de raíces transgénicas aparecían más saludables y se desarrollaron mejor. De forma notable, la senescencia de las hojas basales fue retardada en estas plantas (véase Figura 12A); (ii) el injerto transgénico injertado sobre la raíz de reserva WT aparecía similar a la parte aérea de la planta transgénica de la cual se derivó, esto es, el fenotipo de enanificación del brote es también autónomo y no depende del crecimiento mejorado de la raíz (véase Figura 12B). Además de la mejor apariencia antes mencionada de los brotes WT injertados sobre una raíz de reserva transgénica, se notó la formación de raíces adventicias en la parte basal de los brotes WT (Figura 12D, planta de la derecha). La formación de raíces adventicias también se presentó en el tallo de transgénicos con AtCKX pero no en tallos de los injertos de control WT (Figura 12D, planta de la izquierda) y por lo tanto parece ser una característica no autónoma.

En resumen, se divulga en esta invención que la formación de raíces y enanificación potenciadas del brote en tabaco con sobreexpresión de AtCKX son características autónomas que pueden ser desacopladas por procedimientos de injerto. Sorprendentemente, el injerto de un injerto WT sobre una raíz de reserva transgénica con AtCKX dio como resultado un crecimiento más vigoroso en las plantas y un retardo de la senescencia de las hojas.

Como alternativa al injerto, podrían ser usados promotores específicos para tejidos para desacoplar los efectos fenotípicos autónomos de la sobreexpresión de citoquinina. Por lo tanto, se divulga en esta invención que la sobreexpresión de citoquinina oxidasa en una manera específica para un tejido puede ser utilizada para alterar la morfología de una planta tal como el brote o el sistema radicular.

Ejemplo 13. Expresión de un gen de AtCKX bajo un promotor específico para raíz en plantas transgénicas lleva a una producción incrementada de raíces

Un gen de AtCKX (véase Ejemplo 4) se clona bajo control del promotor homólogo de raíz de clavata de Arabidopsis (SEQ ID NO:36), el cual es un promotor que conduce a la expresión específica para raíces. Pueden utilizarse también otros promotores específicos para raíces para el propósito de esta invención. Véase la Tabla 5 para promotores específicos para raíces de ejemplo.

Las plantas transgénicas que expresan el gen de AtCKX específicamente en las raíces muestran una producción incrementada de raíces sin afectar negativamente el crecimiento y desarrollo de las parte aéreas de la planta. Se observan efectos positivos en la senescencia de las hojas y el crecimiento de las partes aéreas de la planta.

Ejemplo 14. Supresión de un gen de AtCKX bajo un promotor inducido por senescencia en plantas transgénicas lleva a una senescencia retardada de las hojas y a un rendimiento potenciado en semillas.

Un constructo de gen quimérico derivado de un gen de AtCKX y diseñado para suprimir la expresión de un gen o genes endógenos de citoquinina oxidasa se clona bajo el control de un promotor inducido por senescencia. Por ejemplo, pueden utilizarse promotores derivados de genes asociados con la senescencia (SAG) tal como el promotor SAG12. (Quirino et al., 2000). Las plantas transgénicas que suprimen los genes endógenos de citoquinina oxidasa específicamente en hojas senescentes muestran senescencia retardada de las hojas y un rendimiento incrementado en semillas sin afectar negativamente la morfología y crecimiento del desarrollo de la planta.

Ejemplo 15. Sobreexpresión de un gen de AtCKX en los órganos reproductores femeninos lleva a un desarrollo de un fruto partenocárpico

El marco de lectura abierta de un gen de AtCKX es clonado bajo control de un promotor que confiere sobreexpresión en los órganos reproductores femeninos tales como por ejemplo el promotor de DefH9 para Antirrhinum majus o uno de sus homólogos, los cuales tienen altas especificidad de expresión en la placenta y óvulos. Las plantas transgénicas con actividad de citoquinina oxidasa incrementada en estos tejidos muestran un desarrollo de frutos partenocárpicos.

Ejemplo 16. La sobreexpresión de genes de AtCKX da como resultado un incremento en el tamaño de las semillas y los cotiledones

Plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan genes de citoquinina oxidasa (AtCKX) bajo el control del promotor 35S tal como se describieron anteriormente. Plantas transgénicas en particular aquellas que expresan los genes de AtCKX1 y AtCKX3, desarrollaron semillas con tamaño incrementado lo que se debió casi completamente a un embrión agrandado. Detalles de las semillas, embriones y fenotipos tempranos postembriónicos se muestran en las Figuras 13 A a 13E. La Tabla 11 muestra el peso en semillas de tipo silvestre y dos clones independientes para cada uno de los cuatro genes AtCKX investigados. El peso promedio fue obtenido analizando cinco lotes diferentes de 200 semillas para cada clon. Una evaluación cuantitativa mostró que el peso en semillas de los clones que expresan AtCKX1 y AtCKX3 fue aproximadamente 1.8-2.3 veces más alto que en el tipo silvestre. La ganancia de peso para las semillas de las líneas de expresión de AtCKX2 y AtCKX4 estuvo en el rango de 10-25% (Tablas 11 y Figura 14).

Los incrementos en tamaño y peso para semillas, embriones y cotiledones son inesperados puesto que se esperaría que un contenido reducido de citoquinina estuviera asociado con un crecimiento reducido de los órganos. Una razón posible para el incremento en el tamaño de semillas, embrión y cotiledones es una función reguladora negativa desconocida previamente de las citoquininas en estos órganos de almacenamiento. Una función reguladora negativa de las citoquininas en el control del crecimiento de los órganos es hasta ahora conocida solamente en raíces (Werner et al., 2001). Proponemos, por lo tanto, que la expresión localizada de genes de citoquinina oxidasa en tejidos donde el crecimiento es regulado negativamente por citoquininas lleva a un crecimiento potenciado de ese tejido. Por ejemplo, la expresión localizada de genes de CKX durante el desarrollo del cotiledón probablemente lleva a un crecimiento potenciado de los cotiledones y en especies con cotiledones como órganos de almacenamiento, a un rendimiento potenciado y a un desempeño de crecimiento potenciado de los plantones. El número total de semillas disminuye con los expresadores de AtCKX1 y AtCKX3. No ha habido reportes previos sin embargo, de números inferiores de semillas en Arabidopsis ligados a un incremento en tamaño.

Ejemplo 17.

Explantes de hoja de nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN fueron transformados con el vector Bin-Hyg-Tx que porta el gen AtCKX1 o AtCKX2 bajo control del promotor CaMV 35 S. Se cultivaron varias líneas originadas a partir de estas plantas transformadas y se analizó el tamaño de sus semillas (Tabla 12).

La planta de tabaco que tenía el transgén CKX1 y el CKX2 mostraron todas un incremento en el área de semillas, un parámetro para el tamaño de las semillas.

Tabla 12

Planta de tabaco

Descripción Transgén Área promedio de semilla

2

T1 38 nulizigote 0

3

T1 38 nulizigote 0.279

4

T1 38 nulizigote 0.297

5

WT 0.248

6

WT 0.243

7

WT 0.264

8

WT 0.277

1

T1 38 transgénico CKX2 0.353

9

T1 38 transgénico CKX2 0.281

10

T1 38 transgénico CKX2 0.293

11

T1 38 transgénico CKX2 0.329

12

T1 38 transgénico CKX2 0.282

13

T1 8 transgénico CKX1 0.278

14

T1 8 transgénico CKX1 0.315

15

T1 8 transgénico CKX1 0.322

16

T1 8 transgénico CKX1 0.312

Listado de secuencias 5 <110> SCHMULLING, Thomas WERNER, Tomas

<120> Método para modificar la morfología, bioquímica y fisiología de plantas que comprende la expresión de citoquinina oxidasa de plantas

<130> CROP-005-EP2-DIV1

<150> US 10/014,101 10 <151> 2001-10-12

<160> 36

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211>

2236 15 <212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

<210> 2

<211> 575

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

<210> 3

<211> 2991

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3

<210> 4

<211> 501

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

<210> 5

<211> 3302

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 5

<210> 6

<211> 523

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

<210> 7

<211> 2782

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 7

<210> 8

<211> 524

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 8

<210> 9

<211> 2805

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 9

<210> 10

<211> 536

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 10

<210> 11

<211> 1936

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 11

<210> 12

<211> 504

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 12

<210> 13

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencias Artificiales: oligonucleótidos: cebadores o sondas

<400> 13

cggtcgacat gggattgacc tcatccttac g 31

<210> 14

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencias Artificiales: oligonucleótidos: cebadores o sondas

<400> 14 gcgtcgactt atacagttct aggtttcggc agtat 35

<210> 15

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencias Artificiales: oligonucleótidos: cebadores o sondas

<400> 15 gcggtaccag agagagaaac ataaacaaat ggc 33

<210> 16

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencias Artificiales: oligonucleótidos: cebadores o sondas

<400> 16 gcggtaccca attttacttc caccaaaatg c 31

<210> 17

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencias Artificiales: oligonucleótidos: cebadores o sondas

<400> 17

gcggtacctt cattgataag aatcaagcta ttca 34

<210> 18

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencias Artificiales: oligonucleótidos: cebadores o sondas

<400> 18 gcggtaccca aagtggtgag aacgactaac a 31

<210> 19

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencias Artificiales: oligonucleótidos: cebadores o sondas

<400> 19 gcggtacccc cattaaccta cccgtttg 28

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencias Artificiales: oligonucleótidos: cebadores o sondas

<400> 20 gcggtaccag acgatgaacg tacttgtctg ta 32

<210> 21

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencias Artificiales: oligonucleótidos: cebadores o sondas

<400> 21 ggggtacctt gatgaatcgt gaaatgac 28

<210> 22

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencias Artificiales: oligonucleótidos: cebadores o sondas

<400> 22 ggggtaccct ttcctcttgg ttttgtcctg t 31

<210> 23

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencias Artificiales: oligonucleótidos: cebadores o sondas

<400> 23 gctctagatc aggaaaagaa ccatgcttat ag 32

<210> 24

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencias Artificiales: oligonucleótidos: cebadores o sondas

<400> 24 gctctagatc atgagtatga gactgccttt tg 32

<210> 25

<211> 1728

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 25

<210> 26

<211> 1506

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 26

<210> 27

<211> 1572

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 27

<210> 28

<211> 1575

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 28

<210> 29

<211> 1611

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 29

<210> 30

<211> 1515

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 30

<210> 31

<211> 84

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 31

<210> 32

<211>

28 10 <212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 32

<210> 33

<211> 2814

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 33

<210> 34

<211> 1620

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 34

<210> 35

<211> 539

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 35

<210> 36

<211> 842

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 36

Referencias

WO0105985. Method to modulate the expression of genes inducing the parthenocarpic trait in plants.

Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., and Watson, J. D. (1994). "Molecular Biology of the Cell." Garland Publishing Inc. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schäffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST

and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402.

Armstrong, D.J. (1994) in Cytokinins: Chemistry, Activity and Functions, eds. Mok. D.W.S & Mok, M.C. (CRC Boca Raton, FL), pp. 139-154. An, G., Watson, B. D., Stachel, S., Gordon, M. P., and Nester, E. W. (1985). New cloning vehicles for transformation

of higher plants. EMBO J. 4, 277-284.

Armstrong, C. L., Petersen, W. P., Buchholz, W. G., Bowen, B. A., and Sulc, S. L. (1990). Factors affecting PEGmediated stable transformation of maize protoplasts. Plant Cell Reports 9, 335-339. Banerjee, A., Pramanik, A., Bhattacharjya, S., and Balaram, P. (1996). Omega amino acids in peptide design:

incorporation into helices. Biopolymers 39, 769-777.

Baron, M. H. and Baltimore, D. (1982). Antibodies against the chemically synthesized genome-linked protein of poliovirus react with native virus-specific proteins. Cell 28, 395-404. Bartel, P. L. and Fields, S. (1997). "The Yeast Two-Hybrid System." Oxford University Press. Benkirane, N., Guichard, G., Briand, J. P., and Muller, S. (1996). Exploration of requirements for peptidomimetic

immune recognition. Antigenic and immunogenic properties of reduced peptide bond pseudopeptide analogues of a

histone hexapeptide. J. Biol Chem. 271, 33218-33224. Berry, A. and Brenner, S. E. (1994). A prototype computer system for de novo protein design. Biochem.Soc. Trans. 22, 1033-1036.

Christou, P., McCabe, D. E., and Swain, W. F. (1988). Stable transformation of soybean callus by DNA-coated gold

particles. Plant Physiol. 87, 671-674. Crossway, A., Oakes, J. V., Irvine, J. M., Ward, B., Knauf, V. C., and Shewmaker, C. K. (1986). Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophill protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202, 179-185.

Dale, E. C. and Ow, D. W. (1990). Intra-and intermolecular site-specific recombination in plant cells mediated by bacteriophage P1 recombinase. Gene 91, 79-85.

Dodds, J. H. (1985). "Plant genetic engineering." Cambridge University Press. Doerner, P., Jorgensen, J. E., You, R., Steppuhn, J., and Lamb, C. (1996). Control of root growth and development by cyclin expression. Nature 380, 520-523.

Dorner, B., Husar, G. M., Ostresh, J. M., and Houghten, R. A. (1996). The synthesis of peptidomimetic combinatorial

libraries through successive amide alkilations. Bioorg.Med.Chem. 4, 709-715. Ellis, J. G., Llewellyn, D. J., Dennis, E. S., and Peacock, W. J. (1987). Maize Adh-1 promoter sequences control anaerobic regulation: addition of upstream promoter elements from constitutive genes is necessary for expression in tobacco. EMBO J. 6, 11-16.

Faiss, M., Zalubilová, J., Strnad, M., Schmülling, T. (1997). Conditional transgenic expression of the ipt gene

indicates a function for cytokinins in paracrine signaling in whole tobacco plants. Plant J. 12, 401-415. Fassina, G. and Melli, M. (1994). Identification of interactive sites of proteins and protein receptors by computerassisted searches for complementary peptide sequences. Immunomethods. 5, 114-120.

Fedoroff, N. V. and Smith, D. L. (1993). A versatile system for detecting transposition in Arabidopsis. Plant J. 3, 273

289. Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J.Mol.Biol 166, 557-580.

Hansen, G. and Chilton, M. D. (1996). "Agrolistic" transformation of plant cells: integration of T-strands generated in planta. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93, 14978-14983.

Hansen, G., Shillito, R. D., and Chilton, M. D. (1997). T-strand integration in maize protoplasts after codelivery of a T-DNA substrate and virulence genes. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94, 11726-11730.

Hanson, B., Engler, D., Moy, Y., Newman, B., Ralston, E., and Gutterson, N. (1999). A simple method to enrich an Agrobacterium-transformed population for plants containing only T-DNA sequences. Plant J. 19, 727-734.

Harlow, E. and Lane, D. (1988). "Antibodies: A Laboratory Manual." Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Herrera-Estrella, L., De Block, M., Messens, E. H. J. P., Van Montagu, M., and Schell, J. (1983). Chimeric genes as dominant selectable markers in plant cells. EMBO J. 2, 987-995.

Hoffman, D. L., Laiter, S., Singh, R. K., Vaisman, I. I., and Tropsha, A. (1995). Rapid protein structure classification using one-dimensional structure profiles on the bioSCAN parallel computer. Comput.Appl.Biosci. 11, 675-679.

Hooykens, P.J.J.,Hall, M.A. & Libbeuga, K.R.,eds.(1999) Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones (Elsevier, Amsterdam).

Houba-Heria, N.,Pethe, C. d’Alayer, J & Lelouc, M. (1999) Plant J. 17:615-626.

Klee, H.J. & Lanehon, M.B. (1995) in Plant Hormones:Physiology, Biochemisry and Molecular Biology, ed. Davies,

P.J. (Kluwer, Dordrdrocht, the Netherlands), pp. 340-353.

Krens, F. A., Molendijk, L., Wullems, G. J., and Schilperoort, R. A. (1982). In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature 296, 72-74.

Lerner, R. A. (1982). Tapping the immunological repertoire to produce antibodies of predetermined specificity. Nature 299, 593-596. Lerner, R. A., Green, N., Alexander, H., Liu, F. T., Sutcliffe, J. G., and Shinnick, T. M. (1981). Chemically synthesized peptides predicted from the nucleotide sequence of the hepatitis B virus genome elicit antibodies reactive with the native envelope protein of Dane particles. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78, 3403-3407.

Liddle, J. E. and Cryer, A. (1991). "A Practical Guide to Monoclonal Antibodies." Wiley New York.

Loffler, J., Langui, D., Probst, A., and Huber, G. (1994). Accumulation of a 50 kDa N-terminal fragment of beta-APP695 in Alzheimer’s disease hippocampus and neocortex. Neurochem.Int. 24, 281-288.

Mok M.C. (1994) in Cytokines: Chemistry, Activity and Function, eds., Mok, D.W.S. & Mok,M.C. (CRC Boca Raton, FI), pp.155-166.

Monge, A., Lathrop, E. J., Gunn, J. R., Shenkin, P. S., and Friesner, R. A. (1995). Computer modeling of protein folding: conformational and energetic analysis of reduced and detailed protein models. J.Mol.Biol 247, 995-1012.

Morris, R.O. et al. (1999). Isolation of a gene encoding a glycosilated cytokinin oxidase from maize. Bioechem. Biophys. Res. Commun. 255, 328-333

Motyka, V., Faiss, M., Strnad, M., Kaminek, M. and Schmuelling, T. (1996). Changes in cytokinin content and cytokinin oxidase activity in response to derepression of ipt gene transcription in transgenic tobacco calli and plants. Plant Physiol. 112, 1035-1043.

Murakami, T., Simonds, W. F., and Spiegel, A. M. (1992). Site-specific antibodies directed against G protein beta and gamma subunits: effects on alpha and beta gamma subunit interaction. Biochemistry 31, 2905-2911.

Olszewski, K. A., Kolinski, A., and Skolnick, J. (1996). Folding simulations and computer redesign of protein A threehelix bundle motifs. Proteins 25, 286-299.

Osborne, B. I., Wirtz, U., andBaker, B. (1995).Asystem for insertional mutagenesisand cromosomal rearrangement using the Ds transposon and Cre-Iox. Plant J. 7, 687-701.

Ostresh, J. M., Blondelle, S. E., Dorner, B., and Houghten, R. A. (1996). Generation and use of nonsupport-bound peptide and peptidomimetic combinatorial libraries. Methods Enzymol. 267, 220-234.

Pabo, C. O. and Suchanek, E. G. (1986). Computer-aided model-building strategies for protein design. Biochemistry 25, 5987-5991.

Paszkowski, J., Shillito, R. D., Saul, M., Mandak, V., and Hohn, T. H. B. P. I. (1984). Direct gene transfer to plants. EMBO J. 3, 2717-2722.

Peralta, E. G., Hellmiss, R., and Ream, W. (1986). Overdrive, a T-DNA transmission enhancer on the A. tumefaciens tumour-inducing plasmid. EMBO J. 5, 1137-1142.

Quirino, B.F., Noh, Y.-S., Himelbau, E., and Amasino, R.M. (2000). Molecular aspects of leaf senescence. Trends in Plant Science 5, 278-282.

Renouf, D. V. and Hounsell, E. F. (1995). Molecular modelling of glycoproteins by homology with non-glycosilated protein domains, computer simulated glycosilation and molecular dynamics. Adv.Exp.Med.Biol 376, 37-45.

Rinaldi, A.C. and Comandini, O. (1999). Cytokinin oxidase strikes again. Trends in Plant Sc. 4, 300.

Rose, R. B., Craik, C. S., Douglas, N. L., and Stroud, R. M. (1996). Three-dimensional structures of HIV-1 and SIV protease product complexes. Biochemistry 35, 12933-12944.

Rutenber, E. E., McPhee, F., Kaplan, A. P., Gallion, S. L., Hogan, J. C., Jr., Craik, C. S., and Stroud, R. M. (1996). A new class of HIV-1 protease inhibitor: the crystallographic structure, inhibition and chemical synthesis of an aminimide peptide isostere. Bioorg.Med.Chem. 4, 1545-1558.

Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). "Molecular Cloning: A Laboratory Manual." Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Schlappi, M., Smith, D., and Fedoroff, N. (1993). TnpA trans-activates metilated maize Suppressor-mutator transposable elements in transgenic tobacco. Genetics 133, 1009-1021.

Shioda, T., Andriole, S., Yahata, T., and Isselbacher, K. J. (2000). A green fluorescent protein-reporter mammalian two-hybrid system with extracromosomal maintenance of a prey expression plasmid: Application to interaction screening. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97, 5220-5224.

Smulling, T., Rupp, H.M. Frank,M&Schafer, S.. (1999) in Advances in Regulation of Plant Growth and Development, eds. Surnad, M. Pac P. & Beck, E. (Peres, Prague), pp. 85-96.

Tamura, R. N., Cooper, H. M., Collo, G., and Quaranta, V. (1991). Cell type-specific integrin variants with alternative alpha chain cytoplasmic domains. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 88, 10183-10187.

Werner, T., Vadau Motyka, Miroslav Strnad, and Thomas Schmülling (2001) Regulation of plant growth by cytokinin. Proc. Nat. Acad. Sci., 58 (18) 10487-10492.

Van Haaren, M. J., Sedee, N. J., Schilperoort, R. A., and Hooykaas, P. J. (1987). Overdrive is a T-region transfer enhancer which stimulates T-strand production in Agrobacterium tumefaciens. Nucleic Acids Res. 15, 8983-8997.

Van Sluys, M. A., Tempe, J., and Fedoroff, N. (1987). Studies on the introduction and mobility of the maize Activator element in Arabidopsis thaliana and Daucus carota. EMBO J. 6, 3881-3889.

Wang, K., Genetello, C., Van Montagu, M., and Zambryski, P. C. (1987). Sequence context of the T-DNA border repeat element determines its relative activity during T-DNA transfer to plant cells. Mol. Gen. Genet. 210, 338-346.

Woulfe, J., Lafortune, L., de Nadai, F., Kitabgi, P., and Beaudet, A. (1994). Post-translational processing of the neurotensin/neuromedin N precursor in the central nervous system of the rat-II. Immunohistochemical localization of maturation products. Neuroscience 60, 167-181.

Zhang, Y. L., Dawe, A. L., Jiang, Y., Becker, J. M., and Naider, F. (1996). A superactive peptidomimetic analog of a farnesilated dodecapeptide yeast pheromone. Biochem.Biophys.Res.Commun. 224, 327-331.

Claims (28)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para incrementar el tamaño o peso de las semillas que comprende incrementar el nivel o actividad de una citoquinina oxidasa en las semillas en una planta.

2. 2.

   Un método para incrementar el tamaño o peso de los embriones que comprende incrementar el nivel o actividad de una citoquinina oxidasa en semillas en una planta, preferiblemente en embriones.

3. 3.

   Un método para incrementar el tamaño de los cotiledones que comprende incrementar el nivel o actividad de una citoquinina oxidasa en cotiledones en una planta.

4. 4.

   Un método de acuerdo con la reivindicación 1 para incrementar el tamaño o peso de una semilla que comprende la expresión de un ácido nucleico seleccionado del grupo consistente de:

   (a)

   un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

   (b)

   un ácido nucleico que comprende las secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

   (c)

   un ácido nucleico que hibrida específicamente al complemento de un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

   (d)

   un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que comprende el polipéptido como se da en SEQ ID NO: 32 y el cual es al menos 70% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 4,

   (e)

   un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 47% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 6,

   (f)

   un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 47% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 10 o 35,

   (g)

   un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12, 32 o 35,

   (h)

   un ácido nucleico el cual es degenerado a un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 33 o 34 o el cual es degenerado a un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (g) como resultado del código genético,

   (i)

   un ácido nucleico el cual es divergente de un ácido nucleico que codifica una proteína tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12 o 35 o el cual es divergente de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (g) debido a las diferencias en la utilización de codones entre los organismos,

   (j)

   un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12 o 35, o un ácido nucleico como se define en (a) a (g) el cual es divergente debido a las diferencias entre alelos,

   (k)

   un ácido nucleico que codifica un fragmento funcional de una citoquinina oxidasa codificada por un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34, o un fragmento funcional de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (j), en donde dicho fragmento tiene la actividad biológica de una citoquinina oxidasa,

   (l)

   un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (k) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADn, ADNc, ADN genómico o ADN sintético, o ARN donde T es reemplazado por U.

5. 5. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 para incrementar el tamaño o peso de un embrión el cual comprende la expresión de un ácido nucleico seleccionado del grupo consistente de.

   (a)

   un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

   (b)

   un ácido nucleico que comprende las secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

   (c)

   un ácido nucleico que hibrida específicamente al complemento de un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

   (d)

   un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que comprende el polipéptido como se da en SEQ ID NO: 32 y el cual es al menos 70% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 4,

   (e)

   un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 47% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 6,

   (f)

   un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 47% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 10 o 35,

   (g)

   un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12, 32 o 35,

   (h)

   un ácido nucleico el cual es degenerado a un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 33 o 34 o el cual es degenerado a un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (g) como resultado del código genético,

   (i)

   un ácido nucleico el cual es divergente de un ácido nucleico que codifica una proteína tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12 o 35 o el cual es divergente de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (g) debido a las diferencias en la utilización de codones entre los organismos,

   (j)

   un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12 o 35, o un ácido nucleico como se define en (a) a (g) el cual es divergente debido a las diferencias entre alelos,

   (k)

   un ácido nucleico que codifica un fragmento funcional de una citoquinina oxidasa codificada por un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34, o un fragmento funcional de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (j), en donde dicho fragmento tiene la actividad biológica de una citoquinina oxidasa,

   (l)

   un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (k) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético, o ARN donde T es reemplazado por U.

6. 6. Un método de acuerdo con la reivindicación 3 para incrementar el tamaño de un cotiledón el cual comprende la expresión de un ácido nucleico seleccionado de acuerdo con el grupo consistente de:

   (a)

   un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

   (b)

   un ácido nucleico que comprende las secuencias de ARN correspondientes a cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

   (c)

   un ácido nucleico que hibrida específicamente al complemento de un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34,

   (d)

   un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos que comprende el polipéptido como se da en SEQ ID NO: 32 y el cual es al menos 70% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 4,

   (e)

   un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 47% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 6,

   (f)

   un ácido nucleico que codifica una proteína con una secuencia de aminoácidos la cual es al menos 47% similar a la secuencia de aminoácidos tal como se da en SEQ ID NO: 10 o 35,

   (g)

   un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12, 32 o 35,

   (h)

   un ácido nucleico el cual es degenerado a un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 33 o 34 o el cual es degenerado a un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (g) como resultado del código genético,

   (i)

   un ácido nucleico el cual es divergente de un ácido nucleico que codifica una proteína tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12 o 35 o el cual es divergente de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (g) debido a las diferencias en la utilización de codones entre los organismos,

   (j)

   un ácido nucleico que codifica una proteína como se da en SEQ ID NOs: 4, 2, 6, 8, 10, 12 o 35, o un ácido nucleico como se define en (a) a (g) el cual es divergente debido a las diferencias entre alelos,

   (k)

   un ácido nucleico que codifica un fragmento funcional de una citoquinina oxidasa codificada por un ácido nucleico tal como se da en cualquiera de SEQ ID NOs: 26, 3, 1, 7, 11, 25, 28, 30, 29, 5, 9, 27, 31, 33 o 34, o un fragmento funcional de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (j), en donde dicho fragmento tiene la actividad biológica de una citoquinina oxidasa,

   (l)

   un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de (a) a (k) caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADn, ADNc, ADN genómico o ADN sintético, o ARN donde T es reemplazado por U.

7. 7.

   El método de la reivindicación 4 en donde el ácido nucleico está bajo control de un promotor que controla la expresión preferencialmente en semillas.

8. 8.

   El método de la reivindicación 5 en donde el ácido nucleico está bajo el control de un promotor que controla la expresión preferencialmente en embriones.

9. 9.

   El método de la reivindicación 6 en donde el ácido nucleico está bajo el control de un promotor que controla la expresión preferencialmente en cotiledones.

10. 10.

    El método de la reivindicación 7 en donde el promotor es específico adicionalmente al endosperma o aleurona.

11. 11.

    El método de la reivindicación 4 donde dicho método lleva a un incremento en crecimiento de plantones o un incremento en el vigor temprano.

12. 12.

    El método de la reivindicación 5 en donde dicho método lleva a un incremento en el crecimiento de los plantones

    o a un incremento en el vigor temprano.

13. 13.

    El método de la reivindicación 6 en donde dicho método lleva a un incremento en crecimiento de plantones o un incremento en el vigor temprano.

14. 14.

    El método de la reivindicación 11 en donde el incremento en el crecimiento de los plantones o el vigor temprano está asociado con una tolerancia incrementada al estrés.

15. 15.

    El método de la reivindicación 12 en donde el incremento en crecimiento de los plantones o el vigor temprano está asociado con el incremento en la tolerancia al estrés.

16. 16.

    El método de la reivindicación 13 en donde el incremento en crecimiento de los plantones o el vigor temprano está asociado con un incremento en la tolerancia al estrés.

17. 17.

    El método de acuerdo con la reivindicación 4, el cual comprende la expresión en una planta de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 5, 25, o 27 o un ortólogo de dicho ácido nucleico, en donde dicho ortólogo es específico para la especie de la planta.

18. 18.

    El método de acuerdo con la reivindicación 5, el cual comprende la expresión en una planta de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de SEC ID NOs: 1, 5, 25, o 27 o un ortólogo de dicho ácido nucleico, en donde dicho ortólogo es específico para la especie de la planta.

19. 19.

    El método de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende la expresión en una planta de un ácido nucleico tal como se define en cualquiera de SEC ID NOs: 1, 5, 25, o 27 o un ortólogo de dicho ácido nucleico, en donde dicho ortólogo es específico para la especie de la planta.

20. 20.

    El método de la reivindicación 17 en donde el ácido nucleico está bajo control de un promotor que controla la expresión preferencialmente en semillas.

21. 21.

    El método de la reivindicación 18 en donde el ácido nucleico está bajo el control de un promotor que controla la expresión preferencialmente en embriones.

22. 22.

    El método de la reivindicación 19 donde el ácido nucleico está bajo el control de un promotor que controla la expresión preferiblemente en cotiledones.

23. 23.

    El método de la reivindicación 20 en donde el promotor es específico adicionalmente al endosperma o aleurona.

24. 24.

    El método de la reivindicación 17 en donde dicho método lleva a un incremento en el crecimiento de plantones o un incremento en el vigor temprano.

25. 25.

    El método de la reivindicación 18 en donde dicho método lleva a un incremento en el crecimiento de plantones o a un incremento en el vigor temprano.

26. 26.

    El método de la reivindicación 19 donde dicho método lleva a un incremento en el crecimiento de plantones o a un incremento en el vigor temprano.

    5 27. El método de la reivindicación 24 en donde el incremento en el crecimiento de los plantones o el vigor temprano está asociado con tolerancia incrementada al estrés.
27. 28. El método de la reivindicación 25 en donde el incremento en crecimiento de plantones o vigor temprano está asociado con tolerancia incrementada al estrés.
28. 29. El método de la reivindicación 26 donde el incremento en el crecimiento de plantones o el vigor temprano está 10 asociado con tolerancia incrementada al estrés.

    Figura 1 Figura 2

    Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13A Figura 13B Figura 13C Figura 13D Figura 13E Figura 14