ES2393979T3 - Proceso para la producción de polipéptidos - Google Patents

Abstract

Un vector para la producción de un polipéptido heterólogo para células procariotas que comprende (1) ácido nucleico anti-terminación que inhibe la terminación de la transcripción intragénica con un promotor nolambda para este, (2) ARN codificante para el polipéptido con un promotor no-lambda para este, en donde un sitio de reconocimiento del ARN para el enlace de la proteína anti-terminación producida a partir del ácido nucleico se localiza en 5' del ARN codificante para el polipéptido, y (3) ácido nucleico codificante para una proteína GreA o GreB con un promotor para este.

Description

Proceso para la producción de polipéptidos

Antecedentes de la Invención

Campo de la Invención:

Esta invención se relaciona con vectores mejorados y métodos para la producción de polipéptidos utilizando tales vectores. En particular, esta invención se relaciona con la expresión mejorada de polipéptidos a partir de ácidos nucleicos tales como genes clonados y la producción de varios polipéptidos y proteínas, incluyendo aquellos de origen eucariota en huéspedes procariotas.

Descripción de la Técnica Relacionada

El nivel de producción de una proteína en una célula huésped está regido por tres factores principales: el número de copias de su gen dentro de la célula, la eficiencia con las cuales se transcriben aquellas copias del gen, y la eficiencia con la cual se traduce el ARN mensajero resultante (ARNm). La calidad de la proteína producida se rige de forma similar por varios factores, incluyendo el mecanismo anti-terminación en la célula huésped.

Las proteínas recombinantes producidas en E. coli ocasionalmente contienen modificaciones estructurales que restringen su utilidad como fármacos terapéuticos o reactivos para estudios de relación estructura-función. Tales modificaciones incluyen truncamientos N- y C-terminal, extensiones, eliminación incompleta de iniciador metionina N-terminal, mis-incorporación de lisina para arginina, y norleucina para la metionina. Por ejemplo, durante la purificación de interleucina-6 murino recombinante de E. coli, se observó que el 5-10% de las moléculas mIL-6 contenía una modificación C-terminal novedosa (Tu et al., J. Biol. Chem., 270: 9322-9326 (1995)).

Esta "etiqueta" C-terminal se codifica mediante un ARN estable metabólicamente pequeño de E. coli (ARN 10Sa) (Chauhan and Apirion, Mol. Microbiol., 3: 1481-1485 (1989)). ARN 10Sa, también conocido como ARN mensajero de transferencia, o ARNtm, contiene un estructura como ARNt in vivo con las secuencias del extremo 5’- y 3’ y un marco de lectura interno codificante para una péptido "etiqueta".

La primera causa de la producción de proteínas 10Sa-etiquetadas truncadas, es la traducción de ARNm truncado dentro de la región codificante (Keiler et al., Science, 271: 990-993 (1996)). La terminación prematura de la transcripción y la escisión de RNasa parecen ser los factores principales capaces de producir tal ARNm truncado. El primero de estos factores, terminación prematura de la transcripción, es potencialmente susceptible a algún tipo de anti-terminación de la transcripción. Varios de estos sistemas se han descrito, incluyendo λN, λQ, HK022, rrn, y Psu (Weisberg et al., J. Bacteriol., 181: 359-367 (1999)). La mayoría de estos sistemas se utilizan para controlar la expresión del gen temporalmente en el desarrollo del fago, mediante la transcripción a través de terminadores de la transcripción intergénica. La función de la anti-terminación rrn es algo diferente, y se ha propuesto para prevenir la terminación de la transcripción rho-dependiente dentro de los operones no-traducidos del ARN ribosómico.

A pesar de la acumulación del conocimiento considerable de estos sistemas durante muchos años, su utilidad demostrada solo en términos de tecnología recombinante ha estado en el control de la expresión del gen reemplazando terminadores transcripcionales intergénicos (Mertens et al., Bio/Technol., 13: 175-179 (1995)). Otros reportes describen el fallo de uno de estos sistemas (rrn) para aliviar los problemas dentro de una secuencia codificante traducida que contiene la estructura secundaria extensa (Makrides, Microbiol. Rev., 60: 512-538 (1996)).

Se han revelado varias fusiones de una proteína con al menos una porción de una proteína anti-terminadora, especialmente la proteína del gen N y más particularmente el fragmento N-terminal de este (JP 9059299 publicado el 4 de Marzo, 1997; WO 89/03886 publicado el 5 de Mayo, 1989; WO 88/06628 publicado el 7 de Septiembre, 1988;

U.S. Pat. No. 5,834,184 emitida el 10 de Noviembre, 1998; EP 700,997 publicada el 13 de Marzo, 1996; U.S. Pat. No. 5,354,846 emitida el 11 de Octubre, 1994; U.S. Pat. No. 5,618,715 emitida el 8 de Abril, 1997; U.S. Pat. No. 5,374,520 emitida el 20 de Diciembre, 1994; Zhukovskaya et al., Nucl. Acids. Res., 20: 6081-6090 (1992); Horiuchi et al., Biotechnol. Lett., 16: 113-118 (1994); Kamasawa et al., IFAC Symp. Ser., 10: 255-258 (1992); Kovgan et al., Vopr. Virusol., 31: 485-489 (1986)).

Se han construido, varios plásmidos que contienen un sitio de utilización N, para el enlace de proteína N antiterminadora producida por la célula huésped, tal como E. coli, (U.S. Pat. No. 5,256,546 emitida el 26 de Octubre, 1993; EP 691,406 publicada el 10 de Enero, 1996; U.S. Pat. No. 5,162,217 emitida el 10 de Nov., 1992; EP 131,843 publicada el 23 de Enero, 1985). Se han descrito otros plásmidos que involucran el gen N, operón, o porción de este (SU 1405313 publicado el 15 de Marzo, 1994; EP 314,184 publicado el 3 de Mayo, 1989; U.S. Pat. No. 4,578,355 emitida el 25 de Marzo, 1986; WO 85/04418 publicado el 10 de Octubre, 1985; Rees et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 342-346 (1996); Hwang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 173: 711-717 (1990); Bielawski et al.,

Acta Biochim. Pol., 34: 29-34 (1987); Stanssens et al., Cell, 44: 711-718 (1986); Gatenby and Castleton, Mol. Gen. Genet., 185: 424-429 (1982)); Martin-Gallardo et al., J. Gen. Virol., 74: 453-458 (1993); Das, 72nd Annual Meeting of the American Society of Biological Chemists, 31 de Mayo-Junio 4, 1981, Fed. Proc., 40 (6): 1764 (1981); Beck et al., Bio/Technology, 6: 930-935 (1988)).

Se encontró que la expresión del interferón-gamma aumenta más de dos veces, cuando se eliminó el sistema antiterminación λN y se utilizó solo el promotor PL (WO 85/02624 publicado el 20 de Junio, 1985). También se describen, los vectores de clonación y expresión en los cuales el gen N activo preferiblemente está ausente (U.S. Pat. No. 5,401,658 emitida el 28 de Marzo, 1995).

La transcripción del ADN a menudo se detiene en sitios en el ADN que atrapan una fracción de moléculas de ARN polimerasa de elongación que pasa a través, dando lugar a complejos ternarios bloqueados que no pueden propagar

o disociar su producto de ARN. Los factores de escisión de la transcripción dividen el ARN en tales complejos en el extremo 3’, permitiendo que la ARN polimerasa retroceda y vuelva a intentar leer a través del trap potencial. Además de asegurar la eficiente elongación de la transcripción, los factores de escisión de la transcripción aumentan la fidelidad de la transcripción, ya que las bases misincorporadas en el extremo 3’ del ARN naciente también conducen a complejos detenidos (Erie et al., Science, 262: 867-873 (1993)). Además, tales factores permiten que la ARN polimerasa transcriba a través de bloques fuertes de elongación que de otro modo pueden detener la enzima en el ADN (Lee et al., J. Biol. Chem., 269: 22295-22303 (1999)). Además, estos factores pueden facilitar la transición del ARN del estado de iniciación infructuosa de elongación en ciertos promotores (Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

92: 11588-11592 (1995)).

Ambas bacterias y eucariotas contienen proteínas que pueden estimular dicha escisión (Surratt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7983-7987 (1991); Borukhov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8899-8902 (1992); Borukhov et al., Cell, 72: 459-466 (1993); Izban and Luse, Genes & Dev., 6: 1342-1356 (1992); Izban and Luse, J. Biol. Chem., 267:13647-13655 (1992); Izban and Luse, J. Biol. Chem., 268: 12864-12873 (1993); Izban and Luse, J. Biol. Chem., 268:12874-12885 (1993); Kassavetis and Geiduschek, Science, 259: 944-945 (1993); Reines, J. Biol. Chem., 267: 3795-3800 (1992); Wang and Hawley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 843-847 (1993); Gu et al., J. Biol. Chem., 268: 25604-25616 (1993); Guo and Price, J. Biol. Chem., 268: 18762-18770 (1993)). Se han descrito, dos modos de escisión. Uno produce uno a tres fragmentos de nucleótidos y el otro produce fragmentos más grandes, hasta al menos 12 nucleótidos en tamaño. Dos factores de escisión de la transcripción, GreA y GreB, se han identificado en

E. coli (Borukhov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, supra, and Borukhov et al., Cell, supra, respectivamente). La escisión de la transcripción GreA-dependiente por lo general da lugar a la eliminación de di- y trinucleótidos del extremo 3’ del ARN estancado. La escisión GreB-dependiente produce oligonucleótidos más grandes, hasta una longitud de nueve nucleótidos. Ambas las proteínas unidas a la ARN polimerasa. Ni las proteínas GreA ni las GreB poseen actividad intrínseca de la nucleasa; sino, que estimulan una actividad inherente de la nucleasa en ARN polimerasa (Oriova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 4596-4600 (1995)). Las proteínas GreA y GreB son homólogas, que comparten 38% de identidad de la secuencia y 59% de similitud de la secuencia. Se encontró que la escisión de la transcripción inducida por GreA, en complejos de transcripción que contienen ARN polimerasa de E. coli se controla mediante múltiples factores, incluyendo estructura y lugar de la transcripción naciente (Feng et al., J. Biol. Chem., 269: 22282-22294 (1994)).

Se ha revelado, la cristalización de GreA (Darst et al., J. Mol. Biol., 242: 582-585 (1994)) así como su estructura de cristal (Stebbins et al., Nature, 373: 636-640 (1995)). Se han investigado la organización y las funciones de los dominios de GreA y/o GreB (Koulich et al., J. Biol. Chem., 272: 7201-7210 (1997); Koulich et al., J. Mol. Biol., 276: 379-389 (1998); Polyakov et al., J. Mol. Biol., 281: 465-473 (1998)). Adicionalmente, se reportan los procedimientos de ensayo y purificación para GreA y GreB (Borukhov and Goldfarb, Meth. Enzymol., 274: 315-326 (1996)). Las interacciones entre ARN polimerasa y la transcripción afectan la translocación reversa GreA- y GreB-mediada (Feng et al., J. Cellular Biochem. Suppl., 0: 18C, p. 58 (1994)). Tanto GreA y GreB han demostrado que potencian el escape del promotor (Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 11588-111592 (1995)).

En los eucariotas, el factor de elongación de la transcripción TFIIS, también conocido como SII (Reines et al., J. Biol. Chem., 264: 10799-10809 (1989); Sluder et al., J. Biol. Chem., 264: 8963-8969 (1989)), es similar al de las proteínas GreA y GreB en que estimula la escisión del ARN del extremo 3’ de ARN en un complejo estancado pero no comparten homología de secuencia significante con la proteína GreA y GreB (Borukhov et al., Cell, supra). TFIIS estimula la escisión del fragmento ya sea pequeño o grande, dependiendo de las condiciones de reacción y el complejo particular examinado (Izban and Luse, J. Biol. Chem., 268:12874-12885 (1993), supra; Wang and Hawley, supra). Se han encontrado la evidencia de la similitud funcional entre la elongación de la transcripción procariota y eucariota y los mecanismos a través de la lectura (Mote and Reines, J. Biol. Chem., 273:16843-16852 (1998)).

Se han identificado los homólogos de E. coli GreA. La secuencia de aminoácido pronosticada codificada por el gen Rickettsia prowazekii greA tiene 50.3% de identidad del aminoácido y 66.9% de similitud del aminoácido con E. coli GreA (Marks and Wood, Nucl. Acids Res., 20: 3785 (1992)). La secuencia de aminoácido de GreA deducida de Pseudomonas aeruginosa muestra 65.2% de identidad con su homólogo en E. coli K-12 (Lu et al., J. Bacteriol., 179: 3043-3046 (1997)). También se ha revelado, el polipéptido de GreA del Streptococcus pneumonia, junto con los

métodos para producir el polipéptido de GreA por medios recombinantes y para utilizar GreA o sus antagonistas para el tratamiento o diagnóstico de la infección (EP 838,525 publicada el 2 de Abril, 1998). Además, también se ha revelado GreA del Staphylococcus aureus, así como los métodos recombinantes para hacerlo y los métodos para utilizarlo para la selección de compuestos antibacterianos (EP 893,502 publicada el 27 de Enero, 1999).

Existe una necesidad actual y continua en la técnica para mejorar la calidad de proteína recombinante producida por las células huésped, de tal manera que la producción de formas truncadas de la proteína, tales como material 10Saetiquetado, se minimiza o elimina. Existe también una necesidad de cantidades superiores de proteína de longitud completa producida por los procariotas.

Resumen de la Invención

En consecuencia, la presente invención provee, en un aspecto, un vector para la producción de un polipéptido heterólogo para las células procariotas que comprende (1) ácido nucleico anti-terminación que inhibe la terminación de la transcripción intragénica con un promotor no-lambda para esto, y (2) ARN codificante para el polipéptido con un promotor no-lambda para esto, en donde un sitio de reconocimiento de ARN para el enlace de proteína antiterminación producida a partir del ácido nucleico se localiza en 5’ del ARN codificante para el polipéptido, y el vector además comprende ácido nucleico codificante para una proteína GreA o GreB con un promotor para esto.

En otro aspecto, la invención provee un proceso para la producción de un polipéptido heterólogo en células huésped procariotas que comprende:

(a)

cultivo de las células huésped, que comprende (1) ácido nucleico anti-terminación que inhibe la terminación de la transcripción intragénica con un promotor no-lambda para esto, y (2) ARN codificante para el polipéptido con un promotor no-lambda para esto, en donde un sitio de reconocimiento de ARN para el enlace de proteína antiterminación producida a partir del ácido nucleico se localiza en 5’ del ARN codificante para el polipéptido, y en donde el ácido nucleico anti-terminación se expresa en el tiempo de expresión del ARN; y

(b)

recuperación del polipéptido heterólogo a partir de las células o del medio de cultivo celular; en donde las células huésped además comprenden un ácido nucleico que codifica para la proteína GreA o GreB con un promotor para esto.

Fago lambda utiliza anti-terminación N, para controlar la expresión del gen mediante la transcripción a través de terminadores intergénicos colocados estratégicamente. En este documento se encuentra que el sistema antiterminación es efectivo contra señales de terminación intragénica dentro de los genes heterólogos.

Adicionalmente, la tendencia general en la literatura en los últimos años es eliminar el sistema anti-terminación N lambda que se utilizó con el sistema promotor PL adyacente y solo usa el promotor PL o reemplazar el gen N con un poliligador u otro socio de fusión. En contraste, la invención involucra el uso del sistema anti-terminación sin el promotor PL.

Además, el sistema en este documento se diseña específicamente para prevenir la formación y acumulación de proteínas heterólogas truncadas y 10Sa-etiquetadas, que causa problemas con la purificación de la proteína. Una de las primeras causas de proteínas truncadas y 10Sa-etiquetadas es la terminación prematura de la transcripción dentro de una secuencia codificante traducida. La acumulación de proteína de longitud completa puede ser similar con o sin el sistema anti-terminación, pero la acumulación de las formas truncadas se reduce significativamente promoviendo la lectura transcripcional a través de las señales de terminación intragénica dentro de la secuencia codificante de la proteína.

Adicionalmente, la escisión no deseada del polipéptido se minimiza mediante la inclusión de ácidos nucleicos que codifica para GreA o GreB.

Breve Descripción de los Dibujos

Figura 1, muestra la construcción del plásmido pMP331.

Figura 2, muestra la construcción del plásmido pMP843.

Figura 3, muestra la construcción del plásmido pMP871.

Figura 4, muestra la construcción del plásmido pMP931.

Figura 5, muestra la construcción del plásmido pMP945.

Figura 6, muestra la construcción del plásmido pMP951.

Figura 7, muestra la construcción del plásmido pMP982.

Figura 8, muestra la construcción del plásmido pMP1016.

Figura 9, muestra la construcción del plásmido pMP1086.

Figura 10, muestra la construcción del plásmido pMP1099.

Figura 11, muestra la construcción del plásmido pMP1201.

Figura 12, muestra la construcción del plásmido pMP1217.

Figura 13, muestra la construcción del plásmido pJJ142.

Figura 14, muestra la construcción del plásmido pDR1.

Figura 15, muestra la construcción del plásmido pDR3.

Las Figuras 16A-16C muestran un análisis de expresión de trombopoyetina (TPO) bajo el control transcripcional de los promotores del triptófano (trp) y fosfatasa alcalina (AP o phoA). A la izquierda están los marcadores de peso molecular en kDs. Los carriles 1 son el plásmido pBR322 control negativo después de la inducción del promotor trp en medio M9, los carriles 2 son el plásmido de expresión pMP331 trp TPO, después de la inducción del promotor trp, los carriles 3 son el plásmido pBR322 control negativo después de inducción del promotor AP en medio C.R.A.P., y carriles 4 son el plásmido de expresión pMP1099 de AP TPO, después de la inducción del promotor AP. La Figura 16A es un gel SDS teñido con azul de Coomassie de extractos de célula completa; La Figura 16B es una membrana de transferencia hibridada con histidina/peroxidasa de rábano picante (HRP) de extractos de célula completa (el lisado de célula completa se separa por SDSPAGE, transferida a nitrocelulosa, y se hibridan con un agente que se une al motivo polyhis en el líder TPO); y La Figura 16C es un Western blot del anticuerpo policlonal anti-10Sa de extractos de célula completa de cultivos de inducción TPO. Las flechas señalan una TPO de longitud completa.

Las Figuras 17A y 17B respectivamente muestran la inserción de un sitio nutL en las construcciones de expresión TPO trp (SEQ ID NO:1) y AP (SEQ ID NO:2). En la secuencia de la Fig. 17A, la secuencia nutL se insertó en el inicio de la secuencia de ARNm basada en la caja -10 del promotor. La secuencia de la Fig. 17B, muestra la inserción del sitio nutL, en la construcción del promotor AP. Aquí, el sitio nut se sitúa además en dirección 3’ del sitio de inicio de ARNm.

Las Figuras 18A y 18B, muestran la expresión de la proteína λN bajo el control transcripcional del promotor tacII. La secuencia inicial de la proteína λN se muestra en cada una de las Figs. 18A y 18B (SEQ ID NO:3). La secuencia de nucleótidos de la Fig. 18A (SEQ ID NO:4) muestra la fusión del promotor tacII con la secuencia codificante de λN. En este caso la secuencia tacII Shine-Dalgarno se ha suprimido para proveer la traducción de λN reducida, y se utiliza una secuencia alterna con el enlace de ARN ribosómico 16S inferior. La secuencia de nucleótidos de la Fig. 18B (SEQ ID NO:5) muestra la fusión del promotor tacII con el gen λN utilizando la secuencia Shine-Dalgarno completa para la un nivel alto de expresión de N.

Las figuras 19A-19C muestran un análisis de la expresión de TPO con el promotor trp +/- anti-terminación λN. A la izquierda están los marcadores de peso molecular en kDs. Los carriles 1 son el plásmido pBR322 control negativo, los carriles 2 son los plásmidos de expresión pMP331 de TPO trp, los carriles 3 con los plásmido de expresión pMP951de TPO trp con anti-terminación λN y nivel bajo de expresión de N, y los carriles 4 son los plásmidos de expresión pMP1217 de TPO trp con anti-terminación λN y el nivel alto de expresión de N. La Figura 19A es un gel SDS teñido con azul de Coomassie de extractos de célula completa; La Figura 19B es una membrana de transferencia hibridada con histidina/peroxidasa de rábano picante (HRP) de extractos de célula completa; y La Figura 19C es un Western blot del anti-10Sa policlonal de extractos de célula completa. Las flechas señalan una TPO de longitud completa.

Las Figuras 20A-20C muestran un análisis de expresión de TPO con el promotor AP +/- anti-terminación λN. A la izquierda están los marcadores de peso molecular en kDs. Los carriles 1 son el plásmido pBR322 control negativo, los carriles 2 son el plásmido de expresión pMP1099de TPO AP, los carriles 3 son el plásmido de expresión pMP1086 de TPO AP con anti-terminación λN y el nivel bajo de expresión de N, y los carriles 4 son el plásmido de expresión pMP1201 de TPO AP con anti-terminación λN y el nivel alto expresión de N. La Figura 20A es un gel SDS teñido con azul de Coomassie de extractos de célula completa; La Figura 20B es una membrana de transferencia hibridad con histidina/peroxidasa de rábano picante (HRP) de extractos de célula completa; y la Figura 20C es un

Western blot del anticuerpo policlonal anti-10Sa de extractos de célula completa. Las flechas señalan una TPO de longitud completa.

La Figura 21, muestra la construcción del plásmido pFGF5IT.

La Figura 22, muestra la construcción del plásmido pFGF5IT-AT.

Las figuras 23A-23C muestran un análisis de expresión de FGF-5 +/- anti-terminación λN. Los carriles 1 son el plásmido pBR322 control negativo, los carriles 2 son la expresión de FGF-5 sin anti-terminación λN (pFGF5IT), y los carriles 3 son la expresión de FGF-5 con anti-terminación λN (pFGF5IT-AT). La Fig. 23A es un gel SDS teñido con azul de Coomassie de lisado de células completas de cultivos de fermentación inducida (O.D.600 equivalente); La Fig. 23B es un Western blot del lisado de células completas hibridado con un anticuerpo anti-FGF-5; y la Fig. 23C es un Western blot del lisado de células completas hibridado con un anticuerpo anti-10Sa. Las flechas señalan un FGF5 de longitud completa.

Descripción de las Modalidades Preferidas

Como se utiliza en este documento, "greA" y "greB" se refiere a genes que codifican para los factores de escisión de la transcripción conocidos en la literatura como proteínas GreA y GreB, respectivamente, y las variantes de la secuencia de aminoácido de este que son funcionales y efectivas para el mismo propósito de escisión de la transcripción útil en la invención revelada en este documento. Pueden ser de cualquier fuente, siendo un ejemplo los genes greA y greB de E. coli como se describe por Borukhov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, supra, y Borukhov et al., Cell, supra, y siendo otro ejemplo los genes greA revelados por EP 838,525.

Como se utiliza en este documento, "factor anti-terminación" es una proteína anti-terminadora que generalmente tiene actividad de enlace de ARN y actividad anti-terminadora. Ejemplos incluyen las proteínas N anti-terminadoras de fagos λ, ϕ21, y P22, que se han secuenciado completamente. Ver Franklin, J. Mol. Biol., 181: 85-91 (1985) y Lazinski et al., Cell, 59: 207-218 (1989). Todas estas proteínas N contienen un dominio rico en arginina que corresponde a aproximadamente 1-19 aminoácidos en el N-terminal de la proteína que es responsable de la actividad de enlace de ARN de estas proteínas, mientras que el resto de cada proteína confiere actividad antiterminadora (Franklin, J. Mol. Biol., 231: 343-360 (1993)). Preferiblemente, el factor anti-terminación es un factor fago. Más preferiblemente es un gen λN o λQ, más preferiblemente una proteína λN fago.

Un "sitio de reconocimiento de ARN" se refiere a un sitio en una molécula de ARN que reconoce una proteína específica. Por ejemplo, un sitio de reconocimiento de ARN para el enlace de proteína anti-terminación sería nut para el gen N, y qut para el gen Q.

Un "terminador transcripcional" o "señal de terminación transcripcional", se define operativamente como un punto donde la velocidad de liberación de una transcripción del ARN es mayor que la velocidad de adición del siguiente nucleótido. Para los fines en este documento, el terminador puede ser rho-dependiente o rho-independiente. En este documento, un terminador "intragénico" es uno que es homólogo para la secuencia codificante del polipéptido heterólogo. En este documento, un terminador "intergénico" es uno que es exógeno para la secuencia codificante del polipéptido heterólogo, por ejemplo, señales de terminación bacteriana o bacteriófago cuando el polipéptido es de origen mamífero.

"Ácido nucleico anti-terminación que inhibe la terminación de la transcripción intragénica" significa ácido nucleico codificante para factores anti-terminación que bloquean o anulan terminadores transcripcionales intragénicos dentro de los genes heterólogos. Esta definición incluye los genes N y Q, así como ácido nucleico anti-terminación HK022 y rrn. Preferiblemente, este es el gen N o Q.

Como se utiliza en este documento, "cistrón" es una secuencia traducible claramente definida por tener una única transcripción del ARN mensajero con un promotor.

Como se utiliza en este documento, "policistrónica" se refiere a un polinucleótido que comprende dos o más cistrones, donde varios genes diferentes se transcriben como un mensaje único a partir de sus operones, y dos o más pares de codones de inicio y de parada.

Como se utiliza en este documento, "polipéptido" o "polipéptido de interés" se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos. Los polipéptidos son "heterólogos", i.e., extraño a la célula huésped que se utiliza, tal como una proteína humana producida por una célula bacteriana, o un polipéptido bacteriano producida de una línea celular bacteriana que no es la fuente nativa del polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido es mamífero, y más preferiblemente un humano.

Ejemplos de polipéptidos de mamífero incluyen moléculas tales como, por ejemplo, renina, una hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humana; hormona de crecimiento de bovino; factor de liberación de hormona de crecimiento; hormona paratiroide; hormona estimulante de tiroides; lipoproteínas; α1-antitripsina; cadena-A de insulina; cadena-B de insulina; proinsulina; trombopoyetina; hormona estimulante de folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IX, factor de tejido, y factor de von Willebrands; factores anti-coagulación tales como Proteína C; factor natriurético atrial; tensoactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como uroquinasa u orina humana o un activador de plasminógeno del tipo tejido (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral-alfa y -beta; encefalinasa; una albúmina de suero tal como albúmina de suero humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena-A de relaxina; cadena-B de relaxina; prorelaxina; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNASA; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores de hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofin-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-α; cardiotrofinas (factor de hipertrofia cardíaca) tal como cardiotrofin-1 (CT-1); factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF, bFGF, y FGF-5; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, o TGF-β5; factor de crecimiento similar a la insulina-I y -II (IGF-I y IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de enlace del factor de crecimiento similar a la insulina; proteínas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8, CD-19, CD-20, y CD-40; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una proteína morfogenética del hueso (BMP); un interferón tal como interferón-alfa, -beta, y -gamma; factores estimulantes de colonias (CSFs), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; interleucinas (ILs), por ejemplo, IL-1 a IL-10; anticuerpo anti-HER-2; superoxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de superficie de la membrana; factor acelerador de la degradación; antígeno viral tal como, por ejemplo, una porción de la cubierta del SIDA; proteínas de transporte; receptores autoguiados; adresinas; proteínas reguladoras; anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos indicados anteriormente.

Los polipéptidos de mamífero preferidos incluyen t-PA, gp120, anti-HER-2, anti-CD20, anti-CD11a, anti-CD18, anti-CD40, DNasa, IGF-I, IGF-II, FGF-5, trombopoyetina, IGF-I cerebral, trombopoyetina, hormona de crecimiento, cadenas de relaxina, factor de liberación de hormona de crecimiento, cadenas de insulina o pro-insulina, uroquinasa, inmunotoxinas, neurotrofinas, y antígenos. Los polipéptidos de mamífero particularmente preferidos incluyen, por ejemplo, t-PA, gp120(IIIb), anti-HER-2, anti-CD20, anti-CD11a, anti-CD18, anti-CD40, DNasa, trombopoyetina, IGF-I, IGF-II, FGF-5, hormona de crecimiento, NGF, NT-3, NT-4, NT-5, y NT-6, y más preferiblemente, FGF-5 y trombopoyetina.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante ligada operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son apropiadas para procariotas incluyen un promotor tal como el promotor AP o trp, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlace del ribosoma.

El ácido nucleico es "ligado operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o líder secretora se liga operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor se liga operativamente a una secuencia codificante si esto afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace del ribosoma se liga operativamente a una secuencia codificante si se posiciona así como para facilitar la traducción. Generalmente, "ligado operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de una líder secretora, contiguas y en fase de lectura. El enlace se logra, mediante la unión en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se utilizan los ligadores o adaptadores de ologinucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Como se utiliza en este documento, las expresiones "célula," "línea celular", y "cultivo celular" se utilizan indistintamente y todas estas designaciones incluyen la progenie. De esta manera, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de estos sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie no puede ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye, la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la analizada en la célula transformada originalmente. Cuando estén destinadas diferentes designaciones, será claro del contexto.

Un sitio "nut" se refiere al sitio de utilización N, al cual la proteína N se une. El término incluye tanto nut natural como manipulaciones o variaciones de este, que siguen trabajando con la proteína N, mediante el enlace a esta para realizar la anti-terminación N lambda específica del ARNm. Ejemplos incluyen lambda nutL, nutR, Caja B por sí misma, Caja A y Caja B, sitios nut mutantes, y sitios nut a partir de fagos lamboides relacionados. Estos se describen, por ejemplo, en Friedman et al., Genes Dev., 4: 2210-2222 (1990); Mogridge et al., J. Biol. Chem., 273: 4143-4148 (1998); Olson et al., Cell, 31: 61-70 (1982); Patterson et al., J. Mol. Biol., 236: 217-228 (1994); y Schauer et al., J. Mol. Biol., 194: 679-690 (1987).

Unos sitios de terminación "promotor no-lambda" y "no-lambda" indican respectivamente promotores y sitios de terminación no de fago lambda, por ejemplo, no el promotor PL lambda. Ejemplos de promotores no-lambda apropiados en este documento incluyen, por ejemplo, los promotores trp y AP.

B. Modos para Realizar la Invención

En un aspecto, se provee un vector para la producción de un polipéptido heterólogo para células procariotas, preferiblemente un polipéptido de mamífero, y más preferiblemente un polipéptido humano. Tal vector tiene al menos los siguientes elementos: ácido nucleico anti-terminación que inhibe la terminación de la transcripción intragénica, ARN codificante para el polipéptido, un promotor no-lambda o separados para el ácido nucleico y ARN, y ácido nucleico codificante para una proteína GreA o GreB junto con un promotor para este ácido nucleico, que puede ser lambda o no-lambda. En este vector un sitio de reconocimiento de ARN para el enlace de la proteína antiterminación producida a partir del ácido nucleico se localiza en 5’ del ARN codificante para el polipéptido.

En otro aspecto, se describe un proceso para la producción de un polipéptido heterólogo en células huésped procariotas. En este proceso las células huésped se cultivan y el polipéptido se recupera de las células o medio de cultivo celular. Las células comprenden los componentes del vector descrito anteriormente, i.e., ácido nucleico antiterminación que inhibe la terminación de la transcripción intragénica y el ARN codificante para el polipéptido, con el o los promotores no-lambda para cada uno, en donde un sitio de reconocimiento de ARN para el enlace de la proteína anti-terminación producida a partir del ácido nucleico se localiza en 5’ del ARN codificante para el polipéptido, y ácido nucleico que codifica para la proteína GreA o GreB junto con un promotor para esto, que puede ser un promotor lambda o no-lambda. En este proceso el ácido nucleico anti-terminación se expresa en el tiempo de expresión del ARN.

El sistema anti-terminación se puede realizar con o sin la presencia del ácido nucleico que codifica para GreA o GreB, dado que por sí mismo el sistema anti-terminación descrito anteriormente da lugar a una disminución significativa en el truncamiento de la proteína heteróloga y etiquetado con 10Sa y conduce a un incremento correspondiente en la proteína de longitud completa. La co-expresión con ácido nucleico de GreA o GreB conduce a más producción de proteína recombinante, independientemente de si, se utiliza el sistema anti-terminación descrito en este documento.

El ácido nucleico anti-terminación así como el ácido nucleico de GreA/GreB y el ácido nucleico que codifica para la proteína heteróloga puede ser ADNc o ADN genómico de cualquier fuente. La anti-terminación y ácidos nucleicos de GreA/GreB por lo general son la secuencia nativa, pero no es necesario si se proporcionar los mismos beneficios para la producción del polipéptido heterólogo, como se publica en este documento.

Si los factores anti-terminación o las proteínas GreA o GreB son productos nativos de la célula huésped, y si los factores que controlan la expresión de estos genes nativos se entienden, tales factores se puede manipular para lograr la sobre-expresión de estos genes, por ejemplo, por la inducción de la transcripción a partir del promotor natural utilizando moléculas inductoras conocidas, mediante la mutación de los ácidos nucleicos que controla o que representa la expresión del producto génico para producir una cepa mutante que sobre-expresa inductivamente el producto génico, mediante las segundas mutaciones de sitio que deprimen la síntesis o función de factores que normalmente reprimen la transcripción del producto génico, y similares.

El ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) se inserta apropiadamente en un vector replicable para la expresión en las células procariotas bajo el control de un promotor apropiado de células procariotas. Muchos vectores están disponibles para este propósito, y la selección del vector apropiado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico que se inserta en el vector y la célula huésped particular que se transforma con el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y la célula huésped particular con la cual es compatible. Los componentes del vector para la transformación de célula procariota generalmente incluyen, pero no se limitan a, una o más de las siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, y un promotor.

Los promotores en este documento pueden ser constitutivos o inducibles, preferiblemente inducibles, y se reconocen por el organismo huésped procariota y se ligan operativamente a los componentes del ácido nucleico codificantes de polipéptido y GreA/GreB, y/o anti-terminación de los vectores en este documento. Para el plásmido anti-terminación, el promotor es no-lambda. Para el plásmido que no contiene ácido nucleico anti-terminación, el promotor puede ser lambda o no-lambda. Los vectores en este documento contienen ya sea un promotor para los dos o tres elementos, siempre que sea apropiado para todos los elementos, o dos o más promotores separados, que pueden ser los mismos o diferentes siempre que sean apropiados, ligados operativamente a cada uno de los ácidos nucleicos que codifican para el factor anti-terminación, el polipéptido, y/o la proteína GreA/GreB. Los promotores se seleccionan para ser compatibles con el tipo de célula, en la que se debe realizar la expresión.

Para el factor anti-terminación el promotor es no-lambda, y para la GreA/GreB, el promotor puede ser lambda o nolambda. Los promotores no-lambda apropiados para utilizar en el tipo de célula preferido, E. coli, incluyen, por ejemplo, los sistemas promotor β~lactamasa y lactosa (lac) (Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)), el sistema promotor arabinosa (Guzman et al., J. Bacteriol., 174: 7716-7728 (1992)), AP, un sistema promotor trp (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) y EP 36,776), los promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)), y el promotor T3 o T7 (Ver en general, por ejemplo, Itakura et al., Science, 198: 1056-1063 (1977); Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 106-110 (1979), Emtage et al., Nature, 283: 171-174 (1980); y Martial et al., Science, 205: 602-606 (1979)). En este documento, los promotores no-lambda más preferidos son los promotores trp y AP.

Los promotores lambda o no-lambda apropiados para utilizar con huéspedes procariotas incluyen el promotor nolambda como se publica anteriormente, más los promotores lambda, i.e., los de fago lambda, por ejemplo, el promotor PL lambda y el promotor Pr lambda. Sin embargo, otros promotores lambda o no-lambda conocidos son apropiados. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, permitiendo así, que un experto los una operativamente al ADN codificante para el polipéptido de interés o a la anti-terminación o genes de GreA o GreB (Siebenlist et al., Cell, 20: 269 (1980)) utilizando ligadores o adaptadores para suprimir cualquiera de los sitios de restricción necesarios.

Los promotores para utilizar en sistemas procariotas también generalmente contienen una secuencia Shine-Dalgarno (SD) ligada operativamente al ADN codificante para el polipéptido de interés. El promotor se puede retirar del ADN de origen procariota por digestión de enzima de restricción y se inserta en el vector que contiene el ADN deseado.

Si el huésped contiene un gen de la variante pstS, el vector de expresión para la producción de un polipéptido heterólogo apropiadamente contiene un promotor AP que se reconoce por el organismo huésped y se liga operativamente al ácido nucleico codificante para el polipéptido de interés. Este promotor inicia niveles incrementados de la transcripción del ADN bajo su control en respuesta a una concentración disminuida de fosfato inorgánico en el medio de cultivo. El promotor AP se puede retirar del ADN de origen procariota, mediante la digestión de la enzima de restricción y se inserta en el vector que contiene el ADN deseado.

En una alternativa, las células procariotas comprenden dos vectores separados respectivamente, que contienen el ácido nucleico anti-terminación y/o la proteína GreA/GreB y el ARN que codifica para el polipéptido heterólogo.

En otra alternativa, el ácido nucleico anti-terminación o de greA/greB y el ARN que codifica para el polipéptido heterólogo están contenidos en el mismo vector y están bajo el control de un único promotor o más de uno de los promotores inducibles por separado. En este caso, el polipéptido se puede fusionar apropiadamente en marco a una proteína anti-terminadora y/o proteína GreA o GreB como se define anteriormente de tal manera que la secuencia codificante combinada se liga operativamente a un único promotor. Por consiguiente, el gen del polipéptido y el ácido nucleico anti-terminación y/o ácido nucleico de greA/greB se acoplan apropiadamente para formar una unidad policistrónica. Alternativamente, se pueden expresar independientemente bajo promotores separados, inducibles de forma diferente en el mismo vector, de tal manera que el inicio de la expresión pueda ocurrir en el orden apropiado.

El ácido nucleico anti-terminación y/o de greA/greB y el ácido nucleico del polipéptido puede estar en cualquier lugar en el citoplasma celular, incluyendo el cromosoma. Por consiguiente, pueden estar integrados en el genoma de la célula huésped o contenidos en los plásmidos replicantes autonómicamente. El ácido nucleico anti-terminación tal como el gen N o Q, se puede expresar con cualquier promotor controlado razonablemente, y solo se expresa preferiblemente cuando el ARN del polipéptido está activado.

Los vectores en este documento que contienen el ácido nucleico anti-terminación también contienen un sitio de reconocimiento de ARN. Este debería incluir la secuencia de la Caja B en NutR o NutL para la proteína λN del fago. Este también puede incluir un sitio de la Caja A, si el factor anti-terminación es una proteína del fago. El sitio de reconocimiento de ARN está diseñado en el ARNm del polipéptido en el extremo 5’. El ácido nucleico antiterminación luego se une a su sitio de reconocimiento de ARN en el ARNm del polipéptido y, en conjunto con la ARN polimerasa y varios factores del huésped tales como factores nus, en el caso del gen N, forma un complejo antiterminación.

Preferiblemente el sitio Nut es un sitio NutR, más preferiblemente un sitio λ NutR, más preferiblemente un Caja A completa y NutR de Caja B o una Caja B parcial. Se han publicado, las secuencias completas de los sitios Nut, incluyendo los dominios de la Caja A y la Caja B de los fagos λ, ϕ21, y P22 (Lazinski, Cell, 59: 207-218 (1989)). La Caja B es responsable del enlace de una proteína anti-terminadora. Las secuencias de la Caja A existe no solo en los fagos, sino en una variedad de otros operones anti-terminación, incluyendo los operones del ARN ribosómico de

E. coli (Friedman and Olson, Cell, 34: 143-149 (1983); Li et al., Cell, 38: 851-860 (1984)). Una secuencia conservada de 8-12 nucleótidos proximales al promotor en un operón natural, la Caja A es responsable del enlace de un factor

de elongación huésped, que interactúa con la proteína anti-terminación para estimular la actividad anti-terminación (Greenblatt et al., Nature, 364: 401-406 (1993)).

El dominio de la Caja A, preferiblemente debe coincidir con la proteína anti-terminadora codificada por el gen utilizado. De esta manera, si la proteína anti-terminadora es la proteína λN del fago, se puede elegir una secuencia de λ, NutL, o Caja A de NutR, que difiere ligeramente en la secuencia de nucleótidos. Análogamente, si la proteína anti-terminación es una proteína N del fago P22, se puede elegir una secuencia de la Caja A de Nut P22.

La fuente de la proteína λN es una que es apropiada, incluyendo a partir de la región codificante del gen de la proteína de pHE6 (Franklin and Bennett, Gene, 8: 107-119 (1979); EP 467,676 published Jan. 22, 1992) que se elimina en el sitio de restricción 7 HinfI. Alternativamente, se puede utilizar el plásmido disponible comercialmente de Pharmacia LKB o un plásmido revelado en EP 700,997, por ejemplo.

En general, los vectores plasmídicos que contienen el replicón y las secuencias de control que se derivan de especies compatibles con la célula huésped se utilizan en conexión con huéspedes procariotas. El vector habitualmente lleva un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de proveer selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli por lo general se transforma utilizando pBR322, un plásmido derivado de una especie E. coli (ver, por ejemplo, Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977)). pBR322 contiene genes de resistencia a la ampicilina y la tetraciclina y de esta manera provee medios fáciles para identificar células transformadas. El plásmido pBR322, u otro plásmido microbiano o fago, también generalmente contiene, o se modifica para contener, promotores que pueden ser utilizados por el organismo microbiano para la expresión de los genes marcadores seleccionables.

El ADN codificante para el polipéptido de interés en este documento se puede expresar no solo directamente, sino también como una fusión con otro polipéptido, preferiblemente una secuencia señal (líder) u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el N-terminal del polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN del polipéptido que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada sería una que se reconoce y procesa (i.e., escindida por una señal peptidasa) por la célula huésped. Por ejemplo, por células huésped procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal del polipéptido nativo, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o secuencias líder enterotoxina II estable al calor.

El vector también contiene un sitio de terminación de la transcripción. La elección del sitio de terminación por lo general no es crítica. Los sitios de terminación son secuencias de ARN de aproximadamente 50-100 bases en dirección de 3’ del sitio de parada traslacional de una secuencia codificante de la proteína. Con frecuencia, los sitios de terminación de ARN pueden plegar a una estructura de horquilla. Los sitios de terminación se reconocen por ARN polimerasa como una señal para cesar la transcripción (von Hippel, Science, 255: 809 (1992)). En células eucariotas, la selección del sitio de terminación depende del promotor al cual los genes se unen. Sin embargo, en las células procariotas, la ARN polimerasa reconoce virtualmente cualquier sitio de terminación procariótica, por lo que la elección del sitio de terminación no es crítico. En algunos vectores, múltiples sitios de terminación se incluyen en tándem.

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicar en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en vectores de clonación esta secuencia es la que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autonómicamente. Tales secuencias son bien conocidas de una variedad de procariotas. El origen de replicación del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de bacterias Gram-negativas.

Los vectores de expresión y clonación también generalmente contienen un gen de selección, también llamado un marcador genético. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de las células huésped, transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica para la D-alanina racemasa de Bacilli. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transforman exitosamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y por lo tanto sobreviven al régimen de selección.

La construcción de vectores apropiados que contienen uno o más de los componentes enumerados anteriormente emplea técnicas estándar de unión. Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN se cortan, se adaptan, y se vuelven a ligar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se utilizan para transformar la cepa K12 de E. coli 294 (ATCC 31,446) u otras cepas, y los transformantes exitosos se seleccionan por resistencia de ampicilina o tetraciclina, cuando sea apropiado. Los plásmidos de los transformantes se preparan, se analizan por digestión de la endonucleasa de restricción, y/o se secuencian por el método de Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977), Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981), o Maxam et al., Methods in Enzymology, 65: 499 (1980).

Las células procariotas apropiadas útiles como células huésped en este documento incluyen bacteria, por ejemplo, archaebacteria y eubacteria, especialmente eubacteria, y más preferiblemente Enterobacteriaceae. Ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, y Paracoccus. Estas células huésped pueden ser lisogénicas. Huéspedes de E. coli apropiados incluyen E. coli W3110 (ATCC 27,325), E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), y E. coli JM105 (New England Biolabs). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. Las células mutantes de cualquiera de las células procariotas mencionadas anteriormente también se pueden emplear. Por supuesto, es necesario seleccionar las células procariotas apropiadas teniendo en consideración la replicabilidad del replicón en las células de un procariota. Por ejemplo, especies de E. coli, Serratia,

o Salmonella se pueden utilizar apropiadamente como el huésped, cuando se utilizan plásmidos bien conocidos tales como pBR322, pBR325, pACYC177, o pKN410 para suprimir el replicón.

La cepa de E. coli W3110 es un huésped preferido debido a que es una cepa de huésped común para fermentaciones de producto de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 se puede modificar para realizar una mutación genética en los genes que codifican para las proteínas, con ejemplos de tales huéspedes incluyendo cepa 1A2 de E. coli W3110, la cual tiene un genotipo completo tonAl (también conocido como lfhuA); cepa 9E4 de E. coli W3110, la cual tiene un genotipo completo tonAl ptr3; cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55,244), la cual tiene un genotipo completo tonAl ptr3 phoAlE15 l(argF-lac)169 ompTl degP41kanr; cepa 37D6 de E. coli W3110, la cual tiene un genotipo completo tonAl ptr3 phoAlE15 l(argF-lac)169 ompTl degP41kanr rbs7l ilvG; cepa 40B4 de E. coli W3110, la cual es la cepa 37D6 con una mutación de deleción degP no resistente a la kanamicina; cepa 33D3 de E. coli W3110, la cual tiene un genotipo completo tonA ptr3 lacIq LacL8 ompT degP kanr; cepa 36F8 de E. coli W3110, la cual tiene un genotipo completo tonA phoA l(argF-lac) ptr3 degP kanR ilvG+, y es resistente a la temperatura a 37°C; una cepa de E. coli que tiene el mutante periplasmico proteasa(s) revelado en U.S. Pat. No. 4,946,783 issued August 7, 1990; cepa 52A7 de E. coli W3110, la cual tiene un genotipo completo tonAl (fhuAl) lonl galE rpoHts (htpRts) lclpP lacIq; cepa 54C2 de E. coli W3110, la cual tiene un genotipo completo fhuA(tonA)lon galE rpoHts (htpRts) clpP lacIq; y cepa 59B9 de E. coli W3110, la cual tiene un genotipo completo fhuAl (tonAl) lonl galE rpoHts (htpRts) lclpP lacIq lompT l(nmpc-fepE) llacY.

La transformación significa la introducción del ADN en un organismo, de tal manera que el ADN sea replicable, ya sea como un elemento extracromosomal o mediante el integrante cromosomal. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se hace utilizando técnicas estándar apropiadas a tales células. El tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), generalmente se utiliza para las células procariotas que contienen barreras de la pared celular sustancial. Otro método para la transformación emplea polietileno glicol/DMSO, como se describe en Chung and Miller, Nucleic Acids Res., 16: 3580 (1988). Incluso otro método es el uso de la técnica llamada electroporación.

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión descritos anteriormente de esta invención y se cultivan en medio nutriente convencional modificado como apropiado si los promotores se inducen. Los medios apropiados para este propósito por lo general se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., supra. Cualquiera de los otros suplementos necesarios también se puede incluir a concentraciones apropiadas introducidas solas o como una mezcla con otro suplemento o medio tal como un complejo de fuente de nitrógeno. El pH del medio puede ser cualquier pH de aproximadamente 5-9, dependiendo principalmente del organismo huésped.

La expresión génica se puede medir en una muestra mediante cualquier medio, incluyendo indirecta o directamente, por ejemplo, mediante northern blotting convencional para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)). Se pueden emplear varios marcadores, los más comunes los radioisótopos, particularmente 32P. Sin embargo, también se pueden emplear otras técnicas, tales como el uso de nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. La biotina entonces sirve como el sitio del enlace con la avidina o con los anticuerpos, que se pueden marcar con una amplia variedad de marcadores, tales como radionuclidos, agentes fluorescentes, enzimas, o similares.

Los procedimientos para observar si un producto génico expresado o sobre-expresado se secreta son fácilmente disponibles para el experto. Una vez que el medio de cultivo se separa de las células huésped, por ejemplo, por centrifugación o filtración, luego el producto génico se puede detectar en el medio de cultivo libre de células o cultivo celular tomando ventaja de características de propiedades conocidas del producto génico. Tales propiedades pueden incluir las distintas propiedades inmunológicas, enzimáticas, o físicas del producto génico.

Por ejemplo, si un producto génico sobre-expresado tiene una actividad enzimática única, se puede realizar un ensayo para esa actividad en el medio de cultivo utilizado por las células huésped o pellets de células extraídas. Adicionalmente, cuando los anticuerpos reactivos contra un producto génico dado están disponibles, tales anticuerpos se pueden utilizar para detectar el producto génico en cualquier ensayo inmunológico conocido (por ejemplo, como en Harlowe et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press:New York, 1988)).

Si el producto génico se secreta, también se puede detectar utilizando pruebas que distinguen los polipéptidos en base a las propiedades físicas características tales como peso molecular. Para detectar las propiedades físicas del producto génico, todos los polipéptidos recién sintetizados por la célula huésped se pueden marcar, por ejemplo, con un radioisotopo. Los radioisótopos comunes que pueden ser utilizados para marcar los polipéptidos sintetizados dentro de una célula huésped incluyen tritio (3H), carbono-14 (14C), azufre-35 (35S), y similares. Por ejemplo, la célula huésped se puede cultivar en medio 35S-metionina o 35S-cisteína, y una cantidad significante de la etiqueta 35S será preferencialmente incorporada en cualquier polipéptido recién sintetizado, incluyendo el polipéptido heterólogo sobre-expresado. El medio de cultivo que contiene 35S luego se retira y las células se lavan y colocan en medio de cultivo no-radioactivo fresco. Después las células se mantienen en el medio fresco durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la secreción del radiomarcado-35S, polipéptido heterólogo expresado, el medio de cultivo se recolecta y se separa de las células huésped. El peso molecular del polipéptido etiquetado, secretado en el medio de cultivo o asociado a la célula en el pellet celular luego se puede determinar por procedimientos conocidos, por ejemplo, electroforesis de gel de poliacrilamida. Tales procedimientos, y/u otros procedimientos para detectar los productos génicos secretados, se proveen, por ejemplo, en Goeddel, D.V. (ed.) 1990, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, Vol. 185 (Academic Press), y Sambrook et al., supra.

Para la secreción de un producto génico expresado o sobre-expresado, la célula huésped se cultiva bajo condiciones suficientes para la secreción del producto génico. Tales condiciones incluyen, por ejemplo, condiciones de temperatura, nutriente, y densidad celular que permiten la secreción mediante la célula. Adicionalmente, tales condiciones son aquellas bajo las cuales la célula puede realizar funciones celulares básicas de transcripción, traducción, y paso de proteínas a partir de un compartimiento celular a otra, como se conocen por los expertos en la técnica.

Si los elementos secretores están en su lugar, el polipéptido de interés se recupera del periplasma o medio de cultivo como un polipéptido secretado. Por lo general, se prefiere purificar el polipéptido de interés a partir de polipéptidos o proteínas de célula recombinante y a partir del factor anti-terminación o proteína GreA o GreB para obtener preparaciones que son homogéneas sustancialmente como para el polipéptido de interés. Como una primera etapa, el medio de cultivo o lisado se puede centrifugar para eliminar los desechos celulares particulados. La membrana y fracciones de proteína solubles luego se pueden separar si es necesario. El polipéptido luego se puede purificar la fracción de proteína soluble y a partir de la fracción de membrana del lisado del cultivo, dependiendo de si el polipéptido está unido a la membrana, es soluble, o está presente en una forma agregada. Después de esto, el polipéptido se solubiliza y se vuelve a plegar, si es necesario, y se purifica a partir de polipéptidos y proteínas solubles contaminadas.

Un método para aislar los polipéptidos exógenos a partir de una mezcla biológica compleja que contiene polipéptidos y no-polipéptidos contenidos en un caldo de fermentación, involucra el contacto de los reactivos con las células, preferiblemente el cultivo celular, que contiene el polipéptido en una confirmación no-nativa, de tal manera que puede tener lugar un aislamiento/extracción acuosa. Preferiblemente, el método implica la adición directa de los reactivos al recipiente de fermentación después de que el polipéptido se ha producido recombinantemente, evitando así las etapas extra de recolección, homogenización, y centrifugación para obtener el polipéptido. Mientras que los particulados restantes se pueden retirar mediante homogenización Gaulin y re-suspensión, filtración, o una combinación de estos, este método utiliza un sistema de extracción de múltiples fases para purificar polipéptidos recombinantes a partir de los particulados restantes.

Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación apropiados: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o intercambio-iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase reversa; cromatografía de silica o de una resina de intercambio catiónico tales como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; y filtración en gel utilizando, por ejemplo, medio SEPHADEX™ G-75 de Amersham Biosciences.

La invención se entenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos. No deberían, sin embargo, interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

EJEMPLO 1

Efecto del Sistema Anti-terminación λN en la Producción de TPO (Matraz de agitación)

Materiales y Métodos:

Descripción y Construcción de Vectores de Expresión de E. coli

Los plásmidos pMP331, pMP843, pMP871, pMP931, pMP951, pMP982, pMP945, pMP1016, pMP1086, pMP1099, pMP1201, y pMP1217 todos se diseñan para expresar TPO madura de longitud completa (deSauvage et al., Nature, 369:533-538 (1994)) en el citoplasma de E. coli utilizando un vector basado en pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2: 95113 (1977)). La secuencia codificante de TPO de 332-aminoácidos está precedida en todos los plásmidos por una líder que consiste de los primeros siete aminoácidos de la secuencia señal de la enterotoxina II estable al calor (Picken et al., Infect. Immun., 42: 269-275(1983)), seguido por ocho residuos de histidina, y finalmente el sitio de escisión de trombina IEPR (SEQ ID NO:6). La transcripción en los plásmidos pMP331, pMP843, pMP871, pMP931, pMP945, pMP951, pMP982, y pMP1217 está bajo el control del promotor trp (Yanofsky et al., Nucleic Acids Res., 9: 6647-6668 (1981)), mientras que pMP1016, pMP1086, pMP1099, y pMP1201 utiliza el promotor AP (Kikuchi et al., Nucleic Acids Res., 9: 5671-5678 (1981)). Justo en dirección 3’ de la secuencia codificante de TPO se sitúa el terminador transcripcional λto (Scholtissek et al., Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987)).

Los elementos genéticos adicionales en pMP843, pMP871, pMP931, y pMP945 incluyen la Caja B parcial del sitio λ nutR (o caja B), mientras que los plásmidos pMP951, pMP982, pMP1086, pMP1201, y pMP1217 tienen el sitio λ nutR completo de las Cajas A y B (Olson et al., Cell, 31: 61-70 (1982)) en el sitio donde el mensaje codificante de TPO inicia. Los plásmidos pMP871, pMP931, pMP945, pMP951, pMP982, pMP1086, pMP1201, y pMP1217 también contienen el gen para la proteína λN (Franklin, J. Mol. Biol., 181: 75-84 (1984)). Finalmente, los plásmidos pMP982, pMP1086, pMP1099, y pMP1201 contienen la secuencia para un ARNt de arginina raro, el gen argU (gen dnaY) (Garcia et al., Cell, 45: 453-459 (1986)).

El plásmido pDR1 se diseña para expresar la proteína GreB (Borukhov et al., Cell, supra) bajo el control del promotor tacII (DeBoer et al., supra). El esqueleto de este plásmido es pACYC177 (Chang et al., J. Bacteriol., 134:1141-1156 (1978); Rose, Nucleic Acids Res., 16: 356 (1988)), que permita que sea mantenida compatiblemente en la misma célula de E. coli con los plásmidos basados en pBR322.

Plásmido pMP331

El plásmido pMP331 es un derivado del plásmido de expresión pMP202 de TPO (WO 95/18858 published 7/13/95). En resumen, pMP202 se diseña para expresar los primeros 155 aminoácidos de TPO en dirección 3’ de una líder que comprende siete aminoácidos de la secuencia señal STII, ocho histidinas, y un sitio de escisión de trombina. El plásmido pMP331 extiende la secuencia codificante de TPO de 155 a 332 aminoácidos.

Tres fragmentos de ADN se ligaron juntos para hacer pMP331 como se muestra en la Figura 1, el primero de los cuales fue el fragmento grande del vector pdh108 previamente cortado con XbaI y StuI. pdh108 se deriva del vector pHGH207-1 (DeBoer et al., Promoters: Structure and Function (Praeger: New York, 1982), pp. 462-481) y contiene el terminador transcripcional λto en dirección 3’ del promotor trp. La segunda parte fue el fragmento XbaI-BamHI de 431 pares de base a partir del plásmido pMP202 que codifica para los primeros 122 aminoácidos de TPO. La tercera parte fue un fragmento BamHI-RsaI de aproximadamente 669 pares de base de phmpll (deSauvage et al., Nature,

369: 533-538 (1994)) que codifica la última mitad del gen TPO.

Plásmido pMP843

El plásmido pMP843 es el resultado de adicionar la caja λ nutB (Caja B de nutR) en dirección 3’ del promotor trp en el plásmido pMP331. Dos fragmentos se ligaron juntos para producir pMP843 como se muestra en la Figura 2, el primero de los cuales fue pMP331 en el cual el fragmento SpeI-SacI pequeño se ha eliminado. El segundo fue un fragmento SpeI-SacI de 642 pares de base, obtenido mediante la unión de un ADN sintético dúplex con el fragmento XbaI-SacI de 582 pares de base de pMP331. El ADN sintético dúplex tuvo la siguiente secuencia:

(SEQ ID NOS: 7 y 8, respectivamente)

Plásmido pMP871

El plásmido pMP871 se deriva del pMP843 y contiene el gen de la proteína λN acoplada de forma policistrónica en dirección 3’ de la secuencia codificante de TPO. pMP871 fue construido como se muestra en la Figura 3, mediante la unión de tres fragmentos de ADN juntos, el primero de los cuales fue el vector pMP843 del cual el fragmento SacI-NheI pequeño se ha eliminado. El segundo es un fragmento SacI-FokI de aproximadamente 500 pares de base

preparado, mediante la pre-unión de un ADN sintético dúplex con el fragmento SacI-AlwNI de 459 pares de base del pMP843 codificante para los aminoácidos 174-327 de TPO. El ADN sintético dúplex tuvo la siguiente secuencia:

(SEQ ID NOS: 9 y 10, respectivamente)

La parte final en la ligación fue un fragmento de FokI-NheI de aproximadamente 657 pares de base, a partir del vector comercial pPL-λ (Pharmacia Biotech Inc.) codificante para los aminoácidos 7-107 de la proteína λN.

Plásmido pMP931

El plásmido pMP931 es un derivado de pMP843 en los cuales el gen de λN se coloca bajo el control del promotor tacII. Como se muestra en la Figura 4, pMP931 fue construido mediante la unión de tres fragmentos de ADN juntos. El primero de estos fue el vector pMP843 en los cuales el fragmento de ClaI-NheI pequeño se ha eliminado. El segundo fue un fragmento de HinPI-HindIII de aproximadamente 100 pares de base del plásmido pKMTacII (DeBoer et al., (1983), supra) que contiene el promotor tacII. La tercera parte en la ligación fue un fragmento de HindIII-NheI de 684 pares de base del pMP871 que codifica para el gen de λN.

Plásmido pMP945

El plásmido pMP945 es un derivado de pMP931 en el cual la expresión del gen λN del promotor tacII se acompaña por una secuencia Shine-Dalgarno completa para niveles de traducción altos. Como se muestra en la Figura 5, este plásmido fue construido mediante la unión de tres fragmentos de ADN juntos, el primero de los cuales fue el fragmento del vector grande obtenido mediante la digestión de pMP931 con HindIII y NheI. El segundo fragmento fue un ADN sintético dúplex con la siguiente secuencia:

(SEQ ID NOS: 11 y 12, respectivamente)

La última parte fue el fragmento de FokI-NheI de 657 pares de base utilizado en la construcción de pMP871.

Plásmido pMP951

El plásmido pMP951 se deriva de pMP931 y adicionalmente contiene el sitio nut completo (ambas Cajas A y B). Como se muestra en la Figura 6, pMP951 fue construido mediante la unión de dos fragmentos de ADN juntos. El primero de estos fue el vector pMP931 del cual el fragmento de AatII-XbaI pequeño se ha eliminado. El segundo fue preparado mediante la pre-unión de un ADN sintético dúplex con el fragmento de AatII-SpeI de 322 pares de base del pMP931. El ADN sintético dúplex tuvo la siguiente secuencia:

-GACTTTTTCCCGTTTCAAGTGCATTTTTCCTATAGATC-5’ (SEQ ID NO:14)

Plásmido pMP982

El plásmido pMP982 es un derivado de pMP951 con la adición del gen argU en el plásmido en dirección 3’ del gen λN. Como se muestra en la Figura 7, este plásmido fue construido mediante la unión de dos fragmentos de ADN juntos. El primero de estos fue el vector pMP951 en los cuales el fragmento de NheI-SphI pequeño se ha eliminado, y en los cuales el sitio NheI ha sido despuntado mediante el tratamiento con ADN polimerasa I (Klenow). La segunda

parte fue un fragmento de ClaI-SphI de 440 pares de base del pST141, en los cuales el sitio ClaI ha sido despuntado mediante el tratamiento con ADN polimerasa I (Klenow). pST141 es un derivado del plásmido pHGH207-1 (DeBoer et al., (1983), supra), y este fragmento solo codifica el gen argU (Garcia et al., Cell, 45: 453-459 (1986)).

Plásmido pMP1016

El plásmido pMP1016 es un derivado de pMP331 en los cuales el promotor trp ha sido reemplazado con el promotor AP. Este plásmido fue construido como se muestra en la Figura 8, mediante la unión de dos fragmentos de ADN juntos. El primero de estos fue el vector pST182 en los cuales el fragmento de XbaI-SphI pequeño se ha eliminado. El plásmido pST182 es un derivado de phGH1 (Chang et al., Gene, 55: 189-196 (1987)), y este último vector podría ser utilizado en lugar de generar este fragmento de ADN. La segunda parte en la ligación fue un fragmento de XbaI-SphI de 1791 pares de base del pMP331 que codifica para el gen TPO y el terminador transcripcional λto.

Plásmido pMP1086

El plásmido pMP1086 se deriva de pMP982 y da lugar al promotor AP que es sustituido por el promotor trp. Tres fragmentos de ADN se ligaron juntos para construir pMP1086 como se muestra en la Figura 9. El primero de estos fue el vector pST182 del cual se ha eliminado el fragmento de SpeI-SphI pequeño. El plásmido pST182 es un derivado de phGH1 (Chang et al., Gene, supra) y este último vector podría ser utilizado en lugar de generar este fragmento. La segunda parte en la ligación fue un fragmento de SpeI-SacI de 647 pares de base del pMP982 que codifica para el sitio nut y el primero de 173 aminoácidos de TPO. La tercera parte fue un fragmento de SacI-SphI de 1809 pares de base del pMP982 que codifica para los aminoácidos 174-332 de TPO, y que contiene el terminador λto, gen λN, y gen argU.

Plásmido pMP1099

El plásmido pMP1099 se deriva de pMP1016 y adicionalmente contiene el gen argU en dirección 3’ del terminador transcripcional Ato. Como se muestra en la Figura 10, fue construido mediante la unión de dos fragmentos de ADN juntos. El primero de estos fue el vector pMP1016, en el cual se ha eliminado el fragmento de SacI-SphI pequeño. El segundo fue un fragmento de SacI-SphI de 1020 pares de base del plásmido pMP591 que codifica para los últimos 159 aminoácidos de TPO, el terminador transcripcional Ato, y el gen argU. El plásmido pMP591 es un derivado de pMP331 con la adición del gen argU justo en dirección 3’ del terminador transcripcional Ato.

Plásmido pMP1201

El plásmido pMP1201 es un derivado de pMP1086, en el cual la expresión del gen λN del promotor tacII se acompaña por una secuencia Shine-Dalgarno completa para niveles de traducción altos. Como se muestra en la Figura 11, este plásmido fue construido mediante la unión de tres fragmentos de ADN juntos, el primero de los cuales fue el fragmento del vector grande obtenido mediante la digestión de pMP1086 con SacI y SphI. El segundo fue un fragmento SacI-ClaI de 1007 pares de base del pMP945 que contiene el promotor tacII con Shine-Dalgarno completa y más del gen λN. La pieza final fue un fragmento ClaI-SphI de 814 pares de base obtenido mediante la digestión de pMP1086 completamente con SphI, y parcialmente con ClaI.

Plásmido pMP1217

El plásmido pMP1217 es un derivado de pMP951 en el cual la expresión del gen λN del promotor tacII se acompaña por una secuencia Shine-Dalgarno completa para niveles de traducción altos. Como se muestra en la Figura 12, este plásmido fue construido mediante la unión de dos fragmentos de ADN juntos. El primero de estos fue el fragmento del vector grande de pMP951, después de la digestión con HindIII y NheI. El segundo fue un fragmento de HindIII-NheI de 696 pares de base del pMP945 codificante para una secuencia Shine-Dalgarno completa precedente del gen λN.

Plásmido pJJ142

El plásmido pJJ142 es un intermedio en la construcción de pDR1 y se preparó mediante la unión de dos fragmentos de ADN juntos, como se muestra en la Figura 13. El primero de estos fue el plásmido pACYC177 en los cuales se ha eliminado el fragmento de AatII-HincII pequeño. La segunda parte en la ligación fue el fragmento de AatII-ClaI de 1021 pares de base del pJJ41 (U.S. Pat. No. 5,639,635) en el cual el sitio ClaI ha sido despuntado, mediante el tratamiento con ADN polimerasa I (Klenow). Este último fragmento codifica el promotor tacII seguido por el gen dsbC.

Plásmido pDR1

El plásmido pDR1 se diseña para expresar GreB bajo el control del promotor tacII. pDR1 fue construido como se muestra en la Figura 14, mediante la unión de dos fragmentos de ADN. El primero de estos fue el vector pJJ142 en el cual, se ha eliminado el fragmento XbaI-PstI pequeño. La segunda parte fue un fragmento XbaI-PstI de 488 pares de base que contiene el gen greB. Este fragmento fue preparado mediante una primera amplificación de la secuencia greB codificante por PCR, utilizando ADN cromosomal de E coli y a continuación la digestión de esta mezcla con XbaI y PstI. Los siguientes cebadores se utilizaron para esta etapa:

5’-CCCCCCCCCTCTAGAAAAATGAAAACTCCTCTGGTAACGCGGGAAGGG (SEQ ID NO:15)

5’-CCCCCCCCCCTGCAGTTACGGTTTCACGTACTCGATAGC (SEQ ID NO:16)

Plásmido pDR3

El plásmido pDR3 se diseña para expresar GreA, bajo el control del promotor tacII. pDR3 fue construido como se muestra en la Figura 15, mediante la unión de dos fragmentos de ADN. El primero de estos fue el vector pJJ142 en los cuales se ha eliminado el fragmento XbaI-PstI pequeño. La segunda parte fue un fragmento de XbaI-PstI de 491 pares de base que contiene el gen greA. Este fragmento fue preparado mediante una primera amplificación de la secuencia greA codificante por PCR, utilizando ADN cromosomal de E coli y a continuación la digestión de esta mezcla con XbaI y PstI. Los siguientes cebadores se utilizaron para esta etapa:

5’-CCCCCCCCCTCTAGAATTCTATGCAAGCTATTCCGATGACCTTA (SEQ ID NO:17)

5’-CCCCCCCCCCTGCAGTTACAGGTATTCCACCTTAAT (SEQ ID NO:18)

Huésped E. coli

La cepa 52A7, que es un derivado de W3110 (ATCC 27,325) que tiene el genotipo tonAl (fhuAl) lonl gale rpoHts (htpRts) lclpP lacIq, se utilizó para los experimentos de transformación.

Transformación y cultivo

Para determinar si la anti-terminación λN tuvo cualquiera de los efectos en la truncación y etiquetado con 10Sa de TPO, el vector de expresión trp de pMP331 y los plásmidos anti-terminación con niveles bajos (pMP951) y altos (pMP1217) de la expresión de N, fueron transformados en la cepa 52A7 utilizando procedimientos estándar. Todos estos transformantes fueron cultivados en medio Luria Broth (LB) con ampicilina durante la noche a 30°C, y luego se diluye 20 veces en medio M9 con casaminoácidos que también contiene ampicilina. Después de aproximadamente 6 horas a 30°C con agitación, la densidad óptica de l os cultivos (600 nm) fue entre 2 y 2.5, y se adicionó isopropil β-Dtiogalactopiranosida (IPTG) (1mM) a los dos cultivos anti-terminación pMP951 y pMP1217. A continuación todos los cultivos fueron cultivados otras 15 horas con agitación a 30°C. Las muestras luego se retiraron, se pr epararon como se describe en Yansura et al., Methods in Mol. Biol., 62: 44-62 (1997), y analizaron por SDS-PAGE.

A continuación, la expresión de TPO con el promotor AP se probó para ver si resultados similares serían obtenidos con anti-terminación λN. El plásmido pMP1099 de expresión AP, así como los plásmidos anti-terminación con nivel bajo- (pMP1086) y alto (pMP1201) de expresión de N, primero fueron transformados en la cepa de E. coli 52A7. Los transformantes primero fueron cultivados en medio LB que contiene ampicilina durante la noche a 30°C, y luego se diluye 100 veces en un medio limitante de fosfato llamado C.R.A.P., que también contiene ampicilina. (medio

C.R.A.P. contiene 3.57g de (NH4)2SO4, 0.71g de Citrato de Na-2H2O, 1.07g de KCl, 5.36g de extracto de levadura (Certificado), 5.36g de HY-CASE® SF caseína hidrolizada-ácido refinada (Quest International), 110 mL de ácido propanosulfónico morfolino 1M (MOPS) pH 7.3, 11 mL de una solución de glucosa al 50%, y 7 mL de MgSO4 1M en un volumen final de 1 litro). Después del cultivo a 30°C por aproximadamente 6 horas, los cultivos alc anzaron una densidad óptica (600 nm) de entre 1.5 y 2.0, y se adicionó IPTG (1 mM) a los dos plásmidos anti-terminación. El cultivó a 30°C se continúo por otras 15 horas, tiem po en el cual las muestras se retiraron, se prepararon como se describe para los vectores trp, y se analizaron por SDS-PAGE.

Resultados:

Producción de TPO utilizando los plásmidos control pMP331 y pMP1099

TPO (de Sauvage et al., Nature, 369: 533-538 (1994)) se expresó en el citoplasma de la cepa de E. coli 52A7 bajo el control de ambos los promotores trp (pMP331) y AP (pMP1099) con una líder polyhis amino-terminal pequeña para proveer una purificación fácil. La inducción de ya sea el promotor trp o AP conduce a la producción de la proteína relacionada de TPO que podría ser detectada por extractos de célula completa teñidos con Coomassie, separados en un gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE), como se muestra en la Fig. 16A.

Además de la esperada banda de proteína para la líder-TPO polyhis de longitud completa a 37 kD, se observaron otras varias bandas de proteína inducidas de masa molecular más pequeña. La más notable de estas tuvo masas de aproximadamente 25, 18, y 14 kD. Para determinar si estas bandas de peso molecular inferior fueron TPOrelacionadas, el lisado de célula completa se separa otra vez por SDS-PAGE, se transfiere a nitrocelulosa, y se hibrida con un agente que se une al motivo polyhis en la líder (INDIA™ sonda de histidina metal quelado unida a HRP (HisProbe-HRP) ofrecida por Pierce Chemical Company) como se muestra en la Fig. 16B. Los resultados verificaron que las bandas de peso molecular inferior señaladas previamente fueron por supuesto TPO-relacionadas, y también revelaron un problema de truncación mucho más severa que se presenta en el extremo C-terminal de la proteína.

Para determinar si estas múltiples formas truncadas de TPO resultaron de la degradación de la líder polyhis que contiene proteína de longitud completa o fueron sintetizadas inicialmente de esta manera, un análisis pulso y caza se realizó utilizando la misma construcción del plásmido. Sin limitación a ninguna teoría, los resultados sugieren que el último caso fue la explicación más probable. La formación de formas truncadas de TPO se puede ver claramente aparecer en los tiempos de caza muy tempranos de 0.5 y 1 minutos y permanecen durante todo el experimento hasta 6 minutos. No hubo ningún movimiento obvio de la proteína relacionada TPO de longitud completa para formas truncadas o viceversa, lo que sugiere que las formas de peso molecular inferior fueron producidas directamente durante la síntesis de la proteína.

Una posible explicación que necesitaba ser descartada fue la inestabilidad del plásmido, en particular las deleciones en la secuencia codificante de TPO. Por lo tanto, el ADN del plásmido se aisló por cultivo de inducción, con el ADN resultante sometido a análisis PAGE después de la digestión con varias endonucleasas de restricción. Además, colonias individuales a partir del cultivo de inducción se analizaron de una manera similar. En todos los casos no hubo evidencia de ninguna de las alteraciones del plásmido, particularmente en la secuencia codificante de TPO.

Finalmente, se investigó la posibilidad de producir fragmentos de TPO truncados, mediante la traducción de ARNm truncado. Previamente se ha demostrado que tales fragmentos de proteína contienen un C-terminal, etiqueta de 11 aminoácidos codificada por un marco de lectura abierto pequeño en el ARN 10Sa (Tu et al., supra; Keiler et al., supra). Un anticuerpo policlonal dirigido contra la etiqueta sintetizada químicamente se utilizó para probar los extractos de célula completa a partir de cultivos de inducción de TPO. Los resultados en la Fig. 16C muestran claramente que la mayoría de los fragmentos de TPO truncados contenía la etiqueta 10Sa de 11 aminoácidos, y sugieren, sin limitación a ninguna teoría, que el ARNm de TPO es truncado o dañado.

Producción de TPO utilizando el sistema anti-terminación y efecto en el etiquetado con 10Sa

Aunque la expresión de TPO de longitud completa con la líder polyhis N-terminal fue relativamente alta con ambos el promotor trp y el promotor AP, la acumulación de formas truncadas de TPO en gran medida interfirió con la purificación de la proteína. Dado que todas las formas truncadas tienen la líder polyhis N-terminal, ellas co-purifican con la proteína de longitud completa sobre una columna de quelación de metales. La eliminación de estas formas truncadas por lo tanto se convierte en un factor importante en la purificación y producción de una proteína tal como TPO.

A pesar de la falla de anti-terminación rrnB para trabajar para este propósito (Makrides, supra), un diferente agente anti-terminación de la transcripción, λN, se utilizó en este Ejemplo para minimizar o eliminar la truncación y etiquetado con 10Sa de TPO, promoviendo la lectura transcripcional a través de señales de terminación intragénicas dentro de la secuencia codificante de TPO.

Incorporación de la anti-terminación λN

Para incorporar la anti-terminación λN en los sistemas de expresión trp y AP para TPO, la secuencia de utilización de N (nutL) primero se insertó en los plásmidos en las localizaciones correspondientes al inicio del ARNm de TPO. El diseño actual de estas secuencias, incluyendo los promotores en dirección 5’y la líder polyhis en dirección 3’, se muestra en la Fig. 17. El gen λN luego se insertó en los plásmidos en dirección 3’ de la secuencia codificante de TPO y el terminador transcripcional λto. La expresión de N se colocó bajo el control del promotor tacII (DeBoer et al., (1983), supra), y fueron construidos los plásmidos con y sin las secuencias Shine-Dalgarno tacII. Esta variación en la traducción de N provee una manera fácil de ver dos diferentes niveles de expresión de N, y sus posteriores efectos en la expresión de TPO. Las secuencias parciales que muestran el promotor tacII con y sin la secuencia Shine-Dalgarno se muestran en la Fig. 18.

Efectos de anti-terminación λN en la expresión de TPO

La tinción de Coomassie de los geles SDS para los plásmidos de expresión trp, pMP331, pMP951, y pMP1217 reveló principalmente un aumento en la expresión de TPO de longitud completa con ambos nivel bajo (pMP951) y nivel alto (pMP1217) de expresión de N, según se compara con el control (pMP331) como se muestra en la Fig. 19A.

El análisis del gel SDS, después de transferir a nitrocelulosa e hibridar con HisProbe-HRP, mostró no solo un aumento en la expresión de TPO de longitud completa, sino también una disminución significativa en la formación de formas truncadas de TPO para ambos plásmidos anti-terminación (Fig. 19B). Finalmente, un análisis del gel después de transferir a nitrocelulosa e hibridar con anticuerpo a la etiqueta 10Sa también mostró una disminución significativa en la acumulación de formas de truncado y etiquetado con 10Sa de TPO con ambos plásmidos anti-terminación (Fig. 19C).

La tinción de Coomassie de los geles SDS para los plásmidos de expresión AP pMP1099, pMP1086, y pMP1201 mostró un aumento en el nivel de TPO de longitud completa con ambos plásmidos anti-terminación, según se compara con el plásmido control pMP1099, como se vio con los plásmidos trp (Fig. 20A). Después de transferir a nitrocelulosa e hibridar con HisProbe-HRP, también se puede ver un aumento en el nivel de TPO de longitud completa así como una disminución significativa en la expresión de formas truncadas de TPO (Fig. 20B). En un análisis similar, la hibridación con el anticuerpo anti-10Sa mostró una disminución en las formas de acumulación de truncado y etiquetado con 10Sa de TPO con ambos plásmidos anti-terminación (Fig. 20C).

Conclusión:

Es evidente a partir de los anteriores resultados del matraz de agitación que la presencia de anti-terminación λN con bajas o altas cantidades de proteínas N utilizando cualquier promotor aumentó el título del polipéptido. Además, la presencia del sistema de anti-terminación de proteína λN en bajas o altas cantidades con cualquier promotor redujo la cantidad de proteína etiquetada con 10Sa producida por las células.

EJEMPLO 2

Efecto del Sistema Anti-terminación λN en la Producción de TPO (Fermentador)

Materiales y Métodos:

Transformación

La cepa 52A7, se transformó con cada uno de pMP331, pMP951, pMP1099, o pMP1086, cada uno de los cuales se describió anteriormente en el Ejemplo 1, utilizando procedimientos estándar que implican la ampicilina o la tetraciclina, según sea apropiado.

Cultivo de células transformadas

Ejemplo para pMP331 y pMP951:

Se llevó a cabo, una fermentación de 10-litros en el siguiente medio, con las modificaciones señaladas. Una bolsa de sales apropiadas para una fermentación de 10-litros contenía las siguientes sales:

Sal Gramos

Sulfato de Amonio 50.0

Fosfato de Potasio, dibásico 60.0

Fosfato de Sodio, monobásico, dihidrato 30.0

Citrato de Sodio, dihidrato 10.0

Además de las sales, 5 g de L-isoleucina y 3 mL de una solución al 25% de poliol antiespumante PLURONIC® L-61 (BASF Corporation) se adicionaron al fermentador. El fermentador se esterilizó con estos componentes y 5-6.5 litros de agua desionizada. Después de que el fermentador y los contenidos se enfriaron, se adicionaron los ingredientes post-estériles. Los ingredientes post-estériles consistieron de 15 mL de una solución de glucosa al 50%, 70 mL de sulfato de magnesio 1 M, 5 mL de metales trazas (receta a continuación), 250 mL de solución de caseína ácidohidrolizado 20% HY-CASE®, 250 mL de solución al 20% de extracto de levadura, y 250 mL de una solución de 2 mg/mL de ampicilina. El volumen inicial en el fermentador, después de la inoculación, por lo general fue de 8.5 litros.

El fermentador se inoculó con 500 mL de un cultivo LB de 16-20-horas que ha sido cultivado con agitación a 30°C. El cultivo LB se cosechó en la presencia de ampicilina. El cultivo de 10-litros se agitó a 750 rpm y se aireó a 10 slpm. El pH del cultivo se mantuvo a 7.0-7.3 por la adición automática de hidróxido de amonio, y la temperatura se mantuvo a 30°C. Cuando se agotó, la glucosa inicial en el cul tivo, se inició un suministro de glucosa y se mantuvo a una velocidad tal como para prevenir la inanición y también evitar la acumulación de la glucosa en el medio.

El crecimiento del cultivo se monitorizó midiendo la densidad óptica (O.D.) a una longitud de onda de 550 nm. Cuando la O.D. del cultivo alcanzó 25-35, se adicionaron 25 mL de una solución de 25 mg/mL de ácido acrílico 3-βindol (IAA) y 2-50 mL de una solución 200 mM de IPTG (para pMP951 solo). La pasta de células se cultivó vía centrifugación 14-18 horas después de la adición de IAA.

Elemento Traza Cantidades Ácido Clorhídrico 100 mL Cloruro Férrico hexahidratado 27 g/L Sulfato de Zinc heptahidratado 8 g/L Cloruro de Cobalto hexahidratado 7 g/L Molibdato de Sodio 7 g/L Sulfato Cúprico pentahidratado 8 g/L Ácido Bórico 2 g/L Monohidrato de Sulfato de Manganeso 5 g/L Agua Desionizada a 1 litro

Ejemplo para pMP1099 y pMP1086:

Una fermentación de 10-litros se llevó a cabo en el siguiente medio, con las modificaciones señaladas. Una bolsa de sales apropiadas para una fermentación de 10-litros contenía las siguientes sales:

Sal Gramos

Sulfato de Amonio 50.0

Fosfato de Potasio, dibásico 26.0

Fosfato de Sodio, monobásico, dihidrato 13.0

Citrato de Sodio, dihidrato 10.0

Cloruro de Potasio 15.0

Además de las sales, se adicionaron al fermentador 5 g de L-isoleucina y 3 mL de una solución al 25% de poliol antiespumante PLURONIC® L-61 (BASF Corporation). El fermentador se esterilizó con estos componentes y 5-6.5 10 litros de agua desionizada. Después de que el fermentador y los contenidos se enfriaron, se adicionaron los ingredientes post-estériles. Los ingredientes post-estériles consistían de 15 mL de una solución de glucosa al 50%, 70 mL de sulfato de magnesio 1 M, 5 mL de metales trazas (receta a continuación), 250 mL de solución de caseína ácido-hidrolizado 20% HY-CASE®, 250 mL de 20% de solución de extracto de levadura, y 250 mL de una solución de 2 mg/mL de ampicilina. El volumen inicial en el fermentador, después de la inoculación, por lo general era de 8.5

15 litros.

El fermentador se inoculó con 500 mL de un cultivo LB de 16-20-horas que ha sido cultivado con agitación a 30°C. El cultivo LB se cosechó en la presencia de ampicilina. El cultivo de 10-litros se agitó a 750 rpm y se aireó a 10 slpm. El pH del cultivo se mantuvo entre 7.0-7.3, mediante la adición automática de hidróxido de amonio, y la temperatura se mantuvo a 30°C. Cuando se agotó la glucosa inicial en el cultivo, se inició un suministro de glucosa y se mantuvo a

20 una velocidad tal como para prevenir la inanición y también evitar la acumulación de glucosa en el medio.

El crecimiento del cultivo se monitorizó midiendo la O.D. a una longitud de onda de 550 nm. Cuando la O.D. del cultivo alcanzó 25-35, se adicionaron 2-50 mL de una solución 200 mM de IPTG (para pMP1086 solo). La pasta de células se cultivó vía centrifugación 20-30 horas después de la inoculación.

Elemento Traza Cantidades Ácido Clorhídrico 100 mL

Cloruro Férrico hexahidratado 27 g/L

Sulfato de Zinc heptahidratado 8 g/L

Cloruro de Cobalto hexahidratado 7 g/L

Molibdato de Sodio 7 g/L

Sulfato cúprico pentahidrato 8 g/L

Ácido Bórico 2 g/L

Monohidrato de Sulfato de Manganeso 5 g/L

Agua Desionizada a 1 litro

Generación de anticuerpos policlonales y monoclonales para el péptido 10Sa:

El siguiente péptido se sintetizó para generar anticuerpos: CAANDENYALAA (SEQ ID NO:19). La cisteína N-terminal está presente para permitir la conjugación del péptido con ya sea KLH o el inhibidor de la tripsina de soja, u otro socio de conjugación apropiado. Los residuos restantes se codifican por el gen ssrA de E. coli y traducen para suministrar el péptido 10Sa. El péptido anterior se sintetizó y conjugó con KLH mediante Zymed Corporation y se utilizó como el antígeno para generar anticuerpos en ambos conejos y ratones.

Los anticuerpos específicos para el péptido 10Sa fueron obtenidos tomando ya sea el suero de los conejos inyectados con el antígeno o el fluido ascítico de los ratones. El suero o fluido ascítico se pasó sobre una columna de afinidad que tenía el péptido 10Sa sintético unido a este. Los anticuerpos específicos fueron eluidos de la columna de afinidad 10Sa, utilizando un pH bajo.

Cuantificación de etiquetado 10Sa y TPO de longitud completa:

Las proteínas de fusión de TPO producidas de los plásmidos pMP331, pMP951, pMP1099, y pMP1086 fueron extraídas del pellet celular completo utilizando una solución reguladora que contiene guanidina HCl 7.5 M, sulfito de sodio 0.1 M, tetrationato de sodio 0.02 M, y solución reguladora Tris 50 mM, pH 8.0. Las extracciones se dejaron continuar 1-16 horas con agitación a temperatura ambiente. A continuación, la solución extraída se clarificó con centrifugación y el sobrenadante fue dializado 1-16 horas a 4°C contra una solución reguladora que con tiene GuHCl 6 M y solución reguladora Tris 20 mM, pH 7.5. Las proteínas que contienen polyhis del dializado se purificaron vía una columna quelante (Talon Metal Affinity Resins, Clontech). La proteína eluída de la columna se paso sobre un SDS-PAGE, se transfirió a nitrocelulosa, y se hibrida con un anticuerpo policlonal dirigido contra ya sea TPO153 (WO 95/18858 publicado 7/13/95) o el péptido 10Sa. Las membranas de transferencia luego se escanearon utilizando un densitómetro láser mejorado ópticamente (PDI Inc., modelo 325oe). Se determinaron, las áreas del pico para la TPO de longitud completa, así como la otra especie de TPO que presentan reacción cruzada con el anticuerpo policlonal de TPO153.

Resultados:

Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla 1. Se calculó, la relación de TPO de longitud completa para todas las especies de TPO y se reporta como % TPO. Además, el área del pico total detectada en la membrana de transferencia se hibrida con el anticuerpo policlonal generado para el péptido 10Sa también se calculó y se reporta como etiqueta 10Sa.

Tabla 1

Efecto de Construcción del Plásmido en la Acumulación de TPO332 y Etiquetado con 10Sa Plásmido Sitio Nut Proteína N % TPO Etiqueta 10Sa pMP331 --4.5 11.5

pMP951 + + 49.0 2.6

pMP1099 --50.0 4.6

pMP1086 + + 73.0 1.6

Los datos en la Tabla 1 muestran que la expresión de TPO a partir de un plásmido con el sistema anti-terminación λN resultó en un aumento del porcentaje de TPO, que es TPO de longitud completa y una disminución en TPO etiquetado con 10Sa acumulado. Esto se ve si se utiliza el promotor AP o el trp para controlar la expresión de TPO.

EJEMPLO 3

Efecto de GreA o GreB en la Producción de TPO (Matraz de agitación)

Materiales y Métodos:

Transformaciones

La cepa 59B9 (W3110 fhuAl(tonAl)lonlgalErpoHts(htpRts) lclpP lacIq lompT l(nmpc-fepE) llacY) se transformó con cada uno de pMP331, pMP951, pMP1217, pMP1099, pMP1086, o pMP1201 ya sea solo o en combinación con pDR1 o pDR3, cada uno de los cuales se describe anteriormente en el Ejemplo 1, utilizando procedimientos estándar.

Cultivo de células transformadas

Las células transformadas fueron cultivadas en medio LB con ampicilina y kanamicina (cuando se co-transforma con pDR1 o pDR3 solo) a 30°C con agitación durante la n oche y luego se diluye 50-veces en un matraz de agitación con medio de cultivo que contiene ampicilina y se cultiva a 30°C con agitación. Los transformantes que con tienen los plásmidos pMP331, pMP951, o pMP1217 fueron cultivados en medio THCD con los antibióticos apropiados hasta que alcanzaron una O.D. 550 de 1-2, tiempo en el cual se adicionaron IAA (50 mg/ml de concentración final) e IPTG (concentración final, 1 mM) (para pMP951 y pMP1217 solo) al cultivo. Todos los cultivos fueron cultivados durante un total de 24 horas. Las muestras luego se retiraron y se prepararon por SDS-PAGE.

El medio THCD contiene 1.86 g de Na2HPO4, 0.93 g de NaH2PO4-H20, 3.57 g de (NH4)2SO4, 0.71 g de Citrato de Na-2H20, 1.07 g de KCl, 5.36 g de extracto de levadura (Difco® Bacto® brand, #0127-01-7), 5.36 g de casaminoácidos (Difco® Bacto® brand, #0230-17-3), 7 mL de MgSO4 1M, 11 mL de una solución de glucosa al 50%, y 110 mL de MOPS 1 M, pH 7.3, en un volumen final de 1 litro.

Los transformantes que contienen los plásmidos pMP1099, pMP1086, o pMP1201 con o sin cualquiera pDR1 o pDR3 fueron cultivados en medio C.R.A.P. con los antibióticos apropiados hasta que alcanzaron una O.D.550 de 12, tiempo en el cual se adicionó IPTG (concentración final, 1 mM) a todos los cultivos excepto para el que contiene pMP1099 solo. Todos los cultivos fueron cultivados durante un total de 24 horas. Las muestras luego se retiraron y se prepararon por SDS-PAGE.

Cuantificación de etiquetado con 10Sa y TPO de longitud completa

Las muestras del cultivo de matraz de agitación descrito anteriormente, se prepararon y corrieron en SDS-PAGE, fueron transferidas a nitrocelulosa, y se hibridaron con un anticuerpo policlonal dirigido contra ya sea TPO153 o el péptido 10Sa. Las membranas de transferencia luego se escanearon utilizando un densitómetro láser mejorado ópticamente (PDI, Inc., modelo 325oe). Se determinaron, las áreas del pico para la TPO de longitud completa, así como las otras especies de TPO que presentan reacción cruzada con el anticuerpo policlonal de TPO153.

El mismo conjunto de muestras del matraz de agitación también se corrió en SDS-PAGE y se hizo la tinción con Azul de Coomassie. Los geles fueron escaneados utilizando un densitómetro láser mejorado ópticamente (PDI, Inc., modelo 325oe) y se calculó, el porcentaje de proteína de célula total representado como TPO de longitud completa.

Resultados:

Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla 2, donde SD significa la secuencia Shine-Dalgarno. Se calculó, la relación de TPO de longitud completa para todas las especies de TPO y se reporta como % de TPO. Además, también se calculó el área del pico total detectado en la membrana de transferencia hibridizada con el anticuerpo policlonal generado para el péptido 10Sa y se reporta como etiqueta 10Sa. El porcentaje de proteína de célula total representado como TPO de longitud completa se muestra como % de proteína total.

Tabla 2 Efecto de Construcción del Plásmido en la Acumulación de TPO332 y Etiquetado con 10Sa Plásmido(s) Sitio Nut Proteína N % de proteína total %TPO Etiqueta 10Sa pMP331 --5.8 11.3 7.6

pMP951 + +, no SD 5.8 30.9 2.5

pMP1217 + +, SD completa 5.0 33.0 1.7

pMP1099 --6.1 17.8 3.3

pMP1099/ pDR1 --8.2 21.2 4.2

pMP1099/ pDR3 --8.2 21.2 4.8

pMP1086 + +, no SD 7.3 27.6 2.3

pMP1086/ pDR1 + +, no SD 7.7 37.5 2.0

pMP1086/ pDR3 + +, no SD 8.5 32.0 2.9

pMP1201 + +, SD completa 6.8 43.7 1.6

Los datos en la Tabla 2 muestran que la expresión de TPO de un plásmido con el sistema anti-terminación λN da lugar a una disminución dramática en TPO etiquetado con 10Sa, como se refleja en la columna marcada con la Etiqueta 10Sa. El porcentaje de TPO presente como TPO de longitud completa también aumenta con el sistema anti-terminación λN (columna % de TPO de la Tabla 2).

Se observa que el plásmido control con el promotor AP (pMP1099), pero no con el promotor trp (pMP331), produjo más % de TPO en el fermentador que en el matraz de agitación (comparar la Tabla 1 con la Tabla 2). Las condiciones del fermentador proporcionan un suministro de glucosa más constante y pH controlado con un periodo de inducción más largo que las condiciones del matraz de agitación, de tal manera que más proteína se produce en el primero, utilizando el promotor AP. Sin embargo, con el sistema anti-terminación, los resultados muestran una tendencia de mejora consistente en el % de TPO si el TPO se produce en los matraces de agitación o en el fermentador y si el promotor es trp o AP. Adicionalmente, la etiqueta 10Sa es menor para el sistema anti-terminación en todos los casos.

Además, es evidente a partir de los datos que la co-expresión de TPO y ya sea GreA o GreB con o sin el sistema anti-terminación λN da lugar a un aumento en la producción de TPO (columna de % de proteína total en la Tabla 2). Existe también un aumento en el porcentaje de TPO presente como TPO de longitud completa cuando GreA o GreB se co-expresa con TPO.

EJEMPLO 4

Efecto del Sistema Anti-terminación λN en la Producción de FGF-5 (Fermentador)

Materiales y Métodos:

Descripción y Construcción de los Plásmidos de Expresión FGF-5

Plásmido pFGF5IT

El plásmido de expresión de E.coli hFGF-5, pFGF5IT, fue construido a partir de un esqueleto básico de pBR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harb Symp Quant Biol., 43: 77-90 (1978)). El promotor trp provee la secuencia transcripcional

necesaria para la expresión eficiente del gen FGF-5 en E. coli (Yanofsky et al., Nucleic Acids Res., 9: 6647-6668 (1981)). Dos secuencias Shine-Dalgarno, la trp Shine-Dalgarno y una segunda Shine-Dalgarno, facilitaron la traducción del ARNm de FGF-5 (Yanofsky et al., Nucleic Acids Res., 9: 6647-6668 (1981); Ringquist et al., Molecular Microbiol., 6: 1219-1229 (1992)). La secuencia codificante para FGF-5 maduro (carente de la secuencia señal del tipo salvaje) se localiza en dirección 3’ del promotor y secuencias Shine-Dalgarno y está precedida por un codón de inicio de la metionina.

El vector utilizado para la construcción de pFGF5IT se generó mediante el aislamiento del fragmento más grande cuando pRelCIII fue digerido con XbaI y BamHI. Este vector contiene el promotor trp y secuencia Shine-Dalgarno trp. El segundo fragmento necesario para esta construcción se aisló por una primera digestión de pFGF5I con HindIII seguido por el tratamiento con ADN Polimerasa I (fragmento Klenow) para crear un extremo romo. Esta reacción luego fue digerida con XbaI, dando lugar a un fragmento de aproximadamente 770 bp con un extremo pegajoso (XbaI) y un extremo romo (HindIII Pol). Este fragmento contiene una secuencia Shine-Dalgarno, un codón de inicio de metionina, y la secuencia codificante para hFGF-5 maduro. El fragmento final necesario para esta construcción se aisló de pdh108. Este fragmento StuI-BamHI de aproximadamente 420 bp contiene la secuencia que codifica para el terminador transcripcional λto (Scholtissek et al., Nucleic Acids Res., 15 (7): 3185 (1987)) y aproximadamente el primer 375 bp de pBR322 (Sutcliffe, supra). Estos tres fragmentos se ligaron entre sí como se representa en la Fig. 21, para la construcción de pFGF5IT.

Plásmido pFGF5IT-AT

El plásmido pFGF5IT-AT simplemente coloca la secuencia codificante para FGF-5 en un plásmido de expresión antiterminación λN. El vector utilizado para esta construcción fue creado mediante el aislamiento del fragmento más grande cuando pMP951 fue digerido con XbaI y BamHI. Este vector contiene el promotor trp y el sitio nut (Cajas A+B). El segundo fragmento necesario para esta construcción se aisló después de la digestión de pFGF5IT-PhoA con XbaI y HincII. El plásmido pFGF5ITPhoA es un derivado de pFGF5IT en el cual el promotor trp se reemplaza por el promotor AP (Kikuchi et al., supra). Este fragmento de aproximadamente 810-bp contiene una secuencia Shine-Dalgarno, un codón de inicio de la metionina, la secuencia codificante para hFGF5 maduro, y la secuencia para el terminador transcripcional λto. El fragmento final necesario para la ligación se aisló mediante la digestión de pMP931 con SspI y BamHI. La digestión de SspI fue solo una digestión parcial, dando lugar a un fragmento de aproximadamente 900 bp. Este último fragmento contiene el promotor tacII (sin una Shine-Dalgarno) seguido en dirección 3’ por la secuencia codificante para la proteína λN. Estos tres fragmentos se ligaron juntos como se ilustra en la Fig. 22, para producir el plásmido pFGF5IT-AT.

Transformación

La cepa 54C2 (E. coli W3110 fhuA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts) clpP lacIq) se transformó con cada uno de pFGF5IT

o pFGF5IT-AT utilizando procedimientos estándar que implican la ampicilina.

Cultivo de células transformadas

Las células transformadas se hicieron crecer en un fermentador bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 2 para los plásmidos trp pMP331 y pMP951, excepto que la solución de IPTG se utilizó solo para pFGF5IT-AT y no para pFGF5IT. Los lisados de célula completa de las muestras de fermentación se prepararon para SDS-PAGE.

Resultados:

El plásmido de expresión intracelular de FGF-5 pFGF5IT produjo una cantidad significante de proteína de longitud completa (Fig. 23A, Carril 2). A pesar de este resultado prometedor, las especies de FGF-5 truncadas también se acumulan en adición a la proteína de longitud completa (Fig. 23B, Carril 2), y la mayoría de estas especies fueron etiquetadas con 10Sa (Fig. 23C, Carril 2). Estos resultados implican, sin limitarse a ninguna teoría, que la terminación prematura de la transcripción es una fuente probable del problema de truncación.

Para abordar este problema, el sistema anti-terminación λN se co-expresó con el gen FGF-5. La producción de FGF5 de longitud completa fue aproximadamente equivalente para ambos plásmidos, con o sin anti-terminación λN (Fig. 23A, carriles 2 y 3). Sin embargo, la acumulación de especie truncada se redujo por aproximadamente 50% cuando el sistema anti-terminación λN se co-expresó con el gen codificante de FGF-5 (Figs. 23B y 23C). La reducción de estas especies truncadas no solo permite simplificar la purificación de la proteína de longitud completa FGF-5, sino que minimizando la producción de estos fragmentos más pequeños de FGF-5 también conduce a una eficiencia mejorada en el replegamiento, dado que las especies más pequeñas pueden contribuir a la agregación en las reacciones de replegamiento. Además, cualquiera de las especies truncadas que repliegan y permanecen en solución puede complicar la evaluación de bioactividad interfiriendo con el enlace de la proteína de longitud completa con el receptor. De esta manera, es ventajoso reducir el nivel de terminación prematura de la transcripción para prevenir que surjan estos potenciales problemas.

Ejemplo 5

Efectos de Anti-terminación λN y GreA/B en la Producción de FGF-5 (Matraz de agitación)

Materiales y Métodos:

Los experimentos de matraz de agitación con co-expresión de FGF-5 y GreA o GreB:

La cepa 59B9 {W3110 fhuAl(tonAl)lonlgalE rpoHts(htpRts) lclpP lacIq lompT l(nmpc-fepE) llacY} se transformó con pFGF5IT-PhoA (descrito en el Ejemplo 4) o pFGF5IT-PhoAAT, ya sea solo o en combinación con pDR1 o pDR3, cada uno de los cuales se describe anteriormente. El plásmido pFGF5IT-PhoAAT es un derivado de pFGF51T en los cuales el mismo elemento anti-terminación está presente como en pFGF5IT-AT descrito en el Ejemplo 4, y en los cuales el promotor trp se reemplaza por el promotor AP (Kikuchi et al., supra).

Cultivo de la células transformadas

Las células transformadas fueron cultivadas en medio LB con ampicilina y kanamicina (cuando se co-transforma con pDR1 y pDR3 solo) a 30°C con agitación durante la n oche y luego se diluye 50-veces en medio C.R.A.P. que contiene los antibióticos apropiados y se cultiva a 30°C con agitación. Los transformantes fueron cult ivados en este medio hasta que alcanzaron una OD550 de 1-2, tiempo en el cual se adicionó IPTG (concentración final, 1 mM) a todos los cultivos excepto para el que contiene pFGF5IT-PhoA solo. Todos los cultivos fueron cultivados durante un total de 24 horas. Las muestras luego se retiraron y se prepararon para SDS-PAGE.

Cuantificación de etiquetado 10Sa y FGF-5 de longitud completa:

Las muestras del cultivo de matraz de agitación descrito anteriormente se prepararon y corrieron en SDS-PAGE, fueron transferidas a nitrocelulosa, y se hibridaron con un anticuerpo policlonal dirigido contra ya sea FGF-5 (R&D Systems) o el péptido 10Sa. Las membranas de transferencia luego se escanearon utilizando un densitómetro láser mejorado ópticamente (PDI, Inc., modelo 325oe). Se determinaron, las áreas del pico para el FGF-5 de longitud completa, así como las otras especies de FGF-5 que presentan reacción cruzada con el anticuerpo policlonal FGF-5.

Resultados:

Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla 3. Se calculó la relación de FGF-5 de longitud completa con todas las especies de FGF-5 y se reporta como % de FGF-5. Además, el área del pico total detectada en la membrana de transferencia se hibrida con el anticuerpo policlonal generado para el péptido 10Sa también se calculó y se reportó como etiqueta 10Sa.

Tabla 3

Efecto de Construcción del Plásmido en la Acumulación FGF-5 y Etiquetado con 10Sa Plásmido(s) %FGF-5 Etiqueta 10Sa pFGF5IT-PhoA 15 10.6

pFGF5IT-PhoA/ pDR1 16 11.3

pFGF5IT-PhoA/ pDR3 21 7.6

pFGF5IT-PhoAAT 40 3.0

pFGF5IT-PhoAAT/ pDR1 52 1.7

pFGF5IT-PhoAAT/ pDR3 45 3.4

Los datos en la Tabla 3 muestran que la expresión de FGF-5 de un plásmido con el sistema anti-terminación λN da lugar a una disminución dramática en FGF-5 etiquetado con 10Sa, según se demuestra mediante los datos del escáner para las proteínas etiquetadas con 10Sa en la Tabla 3. El porcentaje de FGF-5 presente como FGF-5 de longitud completa también aumenta con el sistema anti-terminación λN.

Además, es evidente a partir de los datos que la co-expresión de FGF-5 con ya sea GreA o GreB con o sin el sistema anti-terminación λN da lugar a un aumento en el porcentaje de FGF-5 presente como FGF-5 de longitud completa, como se muestra por los datos en la columna marcada % de FGF-5.

Lista de Secuencias

<110> Genentech, Inc.

<120> PROCESO PARA LA PRODUCCIÓN DE POLIPÉPTIDOS

<130> P1732R1PCT 5 <141> 2002-02-22

<150> US 60/274,384

<151> 2001-03-09

<160> 19

<210> 1 10 <211> 80

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción de la expresión 15 <400> 1

<210> 2

<211> 114

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construcción de la expresión

<400> 2

25 <210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento de fago lambda N

<400> 3

<210> 4

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> fragmento E. coli y fago lambda N fusión

<400> 4

<210> 5 15 <211> 68

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fusión del fragmento E. coli y fago lambda N 20 <400> 5

<210> 6

<211> 4

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<400> 6 <210> 7

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento para la construcción del plásmido

<400> 7

10 <210> 8

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Fragmento para la construcción del plásmido

<400> 8

<210> 9

<211> 40 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento para la construcción del plásmido

<400> 9 25 ctgtctcagg aagggtaagc ttttatggat gcacaaacac 40

<210> 10 <211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento para la construcción del plásmido

<400> 10 cggcgtgttt gtgcatccat aaaagcttac ccttcctgag acagatt 47

<210> 11

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento para la construcción del plásmido

<400> 11 agcttaggat tctagaatta tggatgcaca aacac 35

<210> 12

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento para la construcción del plásmido

<400> 12 cggcgtgttt gtgcatccat aattctagaa tccta 35

<210> 13

<211> 73

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento para la construcción del plásmido

<400> 13

<210> 14

<211> 73

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Fragmento para la construcción del plásmido

<400> 14

10 <210> 15

<211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Cebador

<400> 15 ccccccccct ctagaaaaat gaaaactcct ctggtaacgc gggaaggg 48

<210> 16

<211> 39 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400>

16 25 cccccccccc tgcagttacg gtttcacgta ctcgatagc 39

<210> 17

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400>

17 5 ccccccccct ctagaattct atgcaagcta ttccgatgac ctta 44

<210> 18

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 10 <220>

<223> Cebador

<400> 18 cccccccccc tgcagttaca ggtattccac cttaat 36

<210> 19 15 <211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido para generar anticuerpos 20 <400> 19

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un vector para la producción de un polipéptido heterólogo para células procariotas que comprende

   (1)

   ácido nucleico anti-terminación que inhibe la terminación de la transcripción intragénica con un promotor nolambda para este,

   (2)

   ARN codificante para el polipéptido con un promotor no-lambda para este, en donde un sitio de reconocimiento del ARN para el enlace de la proteína anti-terminación producida a partir del ácido nucleico se localiza en 5’ del ARN codificante para el polipéptido, y

   (3)

   ácido nucleico codificante para una proteína GreA o GreB con un promotor para este.

2. 2.

   El vector de la reivindicación 1, en donde las células procariotas son células bacterianas.

3. 3.

   El vector de la reivindicación 1, en donde el polipéptido es un polipéptido de mamífero.

4. 4.

   El vector de cualquiera de la reivindicaciones 1-2, en donde el promotor no-lambda es un promotor de fosfatasa alcalina o trp o ambos.

5. 5.

   Un proceso para la producción de un polipéptido heterólogo en células huésped procariotas que comprende:

   (a)

   cultivo de las células huésped, que comprende (1) ácido nucleico anti-terminación que inhibe la terminación de la transcripción intragénica con un promotor no-lambda para este, y (2) ARN codificante para el polipéptido con un promotor no-lambda para este, en donde un sitio de reconocimiento del ARN para el enlace de proteína antiterminación producida a partir del ácido nucleico se localiza en 5’ del ARN codificante para el polipéptido, y en donde el ácido nucleico anti-terminación se expresa en el tiempo de expresión del ARN; y

   (b)

   recuperación del polipéptido heterólogo a partir de las células o del medio de cultivo celular, en donde las células huésped además comprenden un ácido nucleico codificante para una proteína GreA o GreB con un promotor para esto.

6. 6.

   El proceso de la reivindicación 5, en donde el polipéptido heterólogo es un polipéptido eucariótico; en particular en donde el polipéptido heterólogo es un polipéptido de mamífero; en particular en donde el polipéptido heterólogo es un polipéptido humano.

7. 7.

   El proceso de las reivindicaciones 5 o 6, en donde el polipéptido heterólogo es la trombopoyetina humana (TPO) o el factor de crecimiento de fibroblasto humano-5 (FGF-5).

8. 8.

   El proceso de cualquiera de la reivindicaciones 5-7, en donde el promotor no-lambda es un promotor de fosfatasa alcalina o trp o ambos.

9. 9.

   El proceso de cualquiera de la reivindicaciones 5-8, en donde el ARN y el ácido nucleico anti-terminación comprenden una unidad genética policistrónica que comprende un primer cistrón que codifica para el polipéptido heterólogo y un segundo cistrón en dirección 3’ del primer cistrón, que es el ácido nucleico anti-terminación con un solo promotor que controla la transcripción de dicha unidad genética policistrónica; o en donde el ARN y el ácido nucleico anti-terminación se expresan bajo los promotores separados.

10. 10.

    El proceso de cualquiera de la reivindicaciones 5-9, en donde las células procariotas son células bacterianas.

11. 11.

    El proceso de cualquiera de la reivindicaciones 5-10, en donde el polipéptido se recupera del citoplasma o periplasma de las células; o en donde el polipéptido se recupera del medio de cultivo celular.

12. 12.

    El proceso de cualquiera de la reivindicaciones 5-11, en donde el ácido nucleico anti-terminación es un gen N o Q del bacteriófago; en particular en donde el ácido nucleico anti-terminación es un gen N de lambda.

13. 13.

    El proceso de cualquiera de la reivindicaciones 5-12, en donde el sitio de reconocimiento del ARN es un sitio nut; en particular en donde el sitio de reconocimiento del ARN es nutL, nutR, Caja B, nut mutante, o nut de lambda a partir de un fago lambdoide diferente del fago lambda.

    FIG. 1

    FIG. 2

    FIG. 3

    FIG. 4

    FIG. 6

    FIG. 7

    FIG. 8

    FIG. 9

    FIG. 10

    FIG. 11

    FIG. 12

    FIG. 13

    FIG. 14

    FIG. 15