PL208884B1

PL208884B1 - Wektor do wytwarzania polipeptydu heterologicznego oraz sposoby zwiększania wytwarzania pełnej długości polipeptydu heterologicznego

Info

Publication number: PL208884B1
Application number: PL364659A
Authority: PL
Inventors: Eriks Sasha Paegle; Dorothea Reilly; Daniel G. Yansura
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2002-02-22
Publication date: 2011-06-30
Also published as: US20030109024A1; HK1060369A1; ES2393979T3; JP2010075198A; CA2438074A1; AU2002306547B2; PL364659A1; HUP0500349A3; US7029876B2; MXPA03008022A; HU230335B1; HUP0500349A2; CA2438074C; IL157378A0; DK1368483T3; WO2002072847A3; JP2004524845A; SI1368483T1; JP4510059B2; IL157378A

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wektor do wytwarzania polipeptydu heterologicznego oraz sposoby zwiększania wytwarzania pełnej długości polipeptydu heterologicznego jako odsetka ogółu takiego wytwarzanego polipeptydu heterologicznego.

Dziedzina wynalazku

Wynalazek niniejszy dotyczy ulepszonych wektorów i sposobów wytwarzania polipeptydów przy użyciu tych wektorów. W szczególności, wynalazek niniejszy dotyczy polepszonej ekspresji polipeptydów generowanej przez kwasy nukleinowe takie, jak klonowane geny, oraz wytwarzania rozmaitych polipeptydów i białek, włącznie z białkami pochodzącymi z eukariontów, w prokariotycznych komórkach gospodarza.

Stan techniki

Poziomem produkcji białka w komórkach gospodarza kierują trzy główne czynniki: liczba kopii genu danego białka w komórce, wydajność przepisywania informacji zawartej w tych kopiach genu (transkrypcji) oraz wydajność wytwarzania białka na podstawie sekwencji powstałego kwasu rybonukleinowego informacyjnego (mRNA) (translacji). Podobnie, jakość wytworzonego białka zależy od rozmaitych czynników, włączając w to mechanizm antyterminacyjny w komórce gospodarza.

Białka rekombinacyjne wytworzone w E. coli niekiedy zawierają modyfikacje strukturalne, ograniczające ich użyteczność jako leków lub odczynników do badań nad zależnością budowa-funkcja. Do modyfikacji tych należą skrócenia (obcięcia) N- i C-końcowe, elongacje, niecałkowite usunięcie N-końcowej metioniny inicjatorowej, błędne włączenie lizyny zamiast argininy, i norleucyny zamiast metioniny. Na przykład, podczas oczyszczania rekombinowanej mysiej interleukiny 6 z E. coli zauważono, że 5 - 10% cząsteczek mIL-6 zawierało nową modyfikację C-końcową [Tu i in., J. Biol. Chem., 270, 9322 - 9326 (1995)].

Taki C-końcowy „znacznik” kodowany jest przez mały metabolicznie trwały RNA E. coli (10Sa RNA) [Chauhan i Apirion, Mol. Microbiol., 3, 1481 - 1485 (1989)]. 10Sa RNA znany także jako „transportujący-informacyjny” RNA lub tmRNA, zawiera strukturę tRNA-podobną in vivo z sekwencjami 5'i 3'-koń cowymi oraz wewnę trzną ramką odczytu kodują c ą peptyd „znacznikowy” (tag).

Pierwotną przyczyną wytwarzania skróconych form białek znakowanych 10Sa jest translacja mRNA skróconego w obrębie regionu kodującego [Keller i in., Science, 271, 990 - 993 (1996)]. Przedwczesna terminacja transkrypcji i cięcie RNazy są, jak się wydaje, głównymi czynnikami zdolnymi do powodowania wytwarzania takiego skróconego mRNA. Pierwszy z tych czynników, a mianowicie przedwczesna terminacja transkrypcji, potencjalnie jest odpowiedzialna za pewnego typu antyterminację transkrypcji. Opisano szereg takich systemów, włącznie z λΝ, λQ, HK022, rrn i Psu [Weisberg i in., J. Bacteriol., 181, 359 - 367 (1999)]. Większość tych systemów używanych jest do przejściowej regulacji ekspresji genów w rozwoju faga przez transkrypcję z udziałem międzygenowych terminatorów transkrypcyjnych. Działanie antyterminacyjne rrn jest nieco odmienne i proponuje się interpretować je jako zapobieganie terminacji transkrypcji rho-zależnej w obrębie niepoddanych translacji operonów rybosomowych RNA.

Pomimo nagromadzenia się w ciągu wielu lat znacznej wiedzy na temat tych systemów, to w aspekcie technologii rekombinacji zademonstrowano jedynie ich użyteczność w kontroli ekspresji genów przez tłumienie międzygenowych terminatorów transkrypcyjnych [Mertens i in., Bio/Technol., 13, 175 - 179 (1995)]. W innych doniesieniach opisano niezdolność jednego z tych systemów (rrn) do łagodzenia problemów zaistniałych w obrębie uległej translacji sekwencji kodującej zawierającej rozbudowaną strukturę drugorzędową [Makarides, Microbiol. Rev., 60, 512 - 538 (1996)].

Ujawniono szereg fuzji białka z co najmniej częścią białka antyterminatorowego, w szczególności białka genu N, a bardziej szczegółowo, jego fragment N-końcowy [(dokument patentowy JP 9059299, opublikowany 4 marca 1997 r.; dokument patentowy WO 89/03886, opublikowany 5 maja 1989 r.; dokument patentowy WO 88/06628, opublikowany 7 września 1988 r.; Patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5834184, wydany 10 listopada 1998 r.; dokument patentowy EP 700997, opublikowany 13 marca 1996 r.; patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5354846, wydany 11 października 1994 r.; patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5618715, wydany 8 kwietnia 1997 r.; patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5374520 r., wydany 20 grudnia 1994 r., Zhukovskaya i in., Nucl. Acids Res., 20, 6081 - 6090 (1992); Horiuchi i in., Biotechnol. Lett. 16, 113 - 118 (1994); Kamaswa i in., IFAC Symp. Ser., 10, 255 - 258 (1992); Kovgan i in., Vopr. Virusol., 31, 485 - 489 (1986)].

PL 208 884 B1

Skonstruowano szereg plazmidów zawierających miejsce wykorzystania N do wiązania antyterminatorowego białka N wytworzonego przez komórkę gospodarza, taką jak E. coli (patent Stanów Zjednoczonych nr 5256546, wydany 26 października 1993; dokument patentowy EP 691406, opublikowany 10 stycznia 1996; patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5162217, wydany 10 listopada 1992; dokument patentowy EP 131843, opublikowany 23 stycznia 1985). Opisano inne plazmidy angażujące gen N, jego operon lub część [dokument patentowy SU 1405313, opublikowany 5 marca 1994 r.; dokument patentowy WO 85/04418, opublikowany 10 października 1985; Rees i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 342 - 346 (1996); Hwang i in., Biochem. Biophys. Res. Commun., 173, 711 717 (1990); Bielawski i in., Acta Biochim. Pol., 34, 29 - 34 (1987); Stanssens i in., Cell, 44, 711 - 718 (1986); Gatenby i Castleton, Mol. Gen. Genet., 185, 424 - 429 (1982); Martin-Gallardo i in., J. Gen Virol., 74, 453 - 458 (1993); The, 72^nd Annual Meeting the American Society of Biological Chemists, 31 maja - 4 czerwca 1981 r., Fed. Proc, 40 (6), 1764 (1981); Beck i in., Bio/Technology, 6, 930 - 935 (1988)].

Stwierdzono, że ekspresja interferonu γ zwiększa się ponad dwukrotnie po wyeliminowaniu systemu antyterminacyjnego λΝ i zastosowaniu jedynie promotora P_L (dokument patentowy WO 85/02624, opublikowany 20 czerwca 1885 r.). Opisano również wektory do klonowania i ekspresyjne, w których dogodnie nieobecny jest aktywny gen N (patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5401658, wydany 28 marca 1985 r.).

Transkrypcja DNA często zatrzymywana jest w miejscach DNA, które wychwytują frakcję przechodzących cząsteczek polimerazy wydłużającej RNA, czego wynikiem są zatrzymane kompleksy tripletów, które nie mogą rozprzestrzeniać się lub oddysocjowywać swego produktu RNA. Czynniki cięcia transkryptu tną RNA w takich kompleksach na końcu 3', co pozwala polimerazie na powrót i ponowną próbę dokonania transkrypcji poza potencjalne miejsce terminacji. Poza zapewnieniem wydajnej elongacji transkryptu, czynniki cięcia transkryptu zwiększają wierność transkrypcji, ponieważ błędnie włączone zasady na końcu 3' powstającego RNA także prowadzą do zatrzymania kompleksów [Erie i in., Science, 262, 867 - 873 (1993)]. Następnie, czynniki takie umożliwiają polimerazie RNA transkrypcję poza silne bloki elongacji; które w przeciwnym razie mogą zatrzymać enzym na DNA [Lee i in., J. Biol. Chem., 269, 22295 - 22303 (1994)]. Oprócz tego, czynniki te mogą ułatwiać przejście RNA ze stadium poronnej inicjacji do elongacji przy pewnych promotorach [Hsu i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 11588 - 11592 (1995)].

Zarówno bakterie jak i eukarionty zawierają białka, które mogą stymulować takie cięcie [Surratt i in., Proc. Natl. Acad. Sci. Acad. USA, 88, 7983 - 7987 (1991); Borukhov i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8899 - 8902 (1992); Borukhov i in., Cell, 72, 459 - 466 (1993); Izban i Luse, Genes & Dev., 6, 1342 - 1356 (1992); Izban i Luse, J. Biol. Chem., 267, 13647 - 13655 (1992); Izban i Luse, J. Biol. Chem., 268, 12864 - 12873 (1993); Izban i Luse, J. Biol. Chem., 268, 12874 - 12885 (1993)]; Kassavetis i Geiduschek, Science, 259, 944 - 945 (1993); Reines, J. Biol. Chem., 267, 3795 - 3800 (1992); Wang i Hawlwy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 843 - 847 (1993); Gu i in., J. Biol. Chem., 268, 25604 - 25616 (1993); Guo i Proce, J. Biol. Chem., 268, 18762 - 18770 (1993)]. Opisano dwa sposoby takiego cięcia. W pierwszym, otrzymuje się fragmenty o długości od jednego do trzech nukleotydów, a w drugim otrzymuje się większe fragmenty, o długości sięgającej 12 nukleotydów. W E. coli zidentyfikowano dwa czynniki tnące transkrypty, a mianowicie GreA i GreB (odpowiednio, Borukhov i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, supra, oraz Borukhov i in., Cell, supra). Cięcie transkryptu zależne od GreA zazwyczaj prowadzi do usunięcia di- i trinukleotydów z końca 3' unieruchomionego RNA. Cięcie zależne od GreB prowadzi do otrzymania większych oligonukleotydów, o długości sięgającej dziewięciu nukleotydów. Oba białka wiążą polimerazę RNA. Ani białka GreA, ani białka GreB nie posiadają samoistnej aktywności nukleazy, a raczej stymulują one aktywność nukleazy obecnej w polimerazie RNA [Oriva i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4596 - 4600 (1995)]. Białka GreA i GreB są homologiczne, i wykazują 38% identyczności sekwencji oraz 59% podobieństwa sekwencji. Stwierdzono, że indukowane GreA cięcie transkryptu w kompleksach transkrypcyjnych zawierających polimerazę RNA E. coli kontrolowane jest przez liczne czynniki, włączając w to miejsce i strukturę powstającego transkryptu [Feng i in., J. Biol. Chem., 269, 22282 - 22294 (1994)].

Ujawniono krystalizację GreA [Darst i in., J. Mol. Biol. 242, 582 - 585 (1994), jak również jego strukturę krystaliczną [Stebbins i in., Nature, 373, 636 - 640 (1995)]. Badano organizację i czynność domen GreA i/lub GreB [Koulich i in., J. Biol. Chem., 272, 7201 - 7210 (1997); Koulich i in., J. Mol. Biol., 276, 379 - 389 (1998); Polyakov i in., J. Mol. Biol., 281, 465 - 473 (1998)]. Ponadto, doniesiono o metodach oczyszczania i badania GreA i GreB [Borukhov i Goldfarb, Meth. Enzymol., 274, 315 326 (1996)]. Interakcje między polimerazą RNA a transkryptem wpływają na zachodzącą za pośred4

PL 208 884 B1 nictwem GreA i GreB odwrotną translokację [Feng i in., J. Cellular Biochem. Suppl., 0, 18C, str. 58 (1984)]. Wykazano, że zarówno GreA, jak i GreB wzmagają ucieczkę promotora [Hsu i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 11588 - 11592 (1995)]. W przypadku eukariontów, elongacyjny czynnik transkrypcyjny, TFIIS, skądinąd znany jako SIl [Reines i in., J. Biol. Chem., 264, 10799 - 10809 (1989); Sluder i in., J. Biol. Chem., 264, 8963 - 8969 (1989), podobny jest do białek GreA i GreB pod tym względem, że stymuluje rozszczepienie RNA od końca 3' RNA w unieruchomionym kompleksie, ale nie wykazuje w stosunku do białka GreA i białka GreB istotnej homologii sekwencji (Borukhov i in., Cell, supra). TFIIS stymuluje cięcie albo małych, albo dużych fragmentów, w zależności od warunków reakcji i rodzaju konkretnego badanego kompleksu [Izban i Luse, J, Biol. Chem., 268, 12874 - 12885 (1993), supra, Wang i Hawley, supra]. Znaleziono dowody na funkcjonalne podobieństwo transkrypcyjnej elongacji u prokariontów i eukariontów, a także mechanizmów transkrypcji poza właściwe miejsce terminacji (ang. „readthrough”) [Mote i Reines, J. Biol. Chem, 273, 16843 - 16852 (1998)].

Zidentyfikowano homologi GreA E. coli. Przewidywana sekwencja aminokwasów kodowana przez gen greA Rickettsia prowazekii wykazuje 50,3% identyczności aminokwasów i 66,9% podobieństwa aminokwasów do GreA E. coli [Marks i Wood, Nucl. Acids Res., 20, 3785 (1992)]. Wydedukowana sekwencja aminokwasów GreA z Pseudomonas aeruginosa wykazuje 65,2% identyczności z jej odpowiednikiem w E. coli K-12 [Lu i in., J. Bacteriol., 179, 3043 - 3046 (1997)]. Ujawniono także polipeptyd GreA ze Streptococcus pneumoniae, łącznie z metodami wytwarzania polipeptydu GreA sposobem rekombinacyjnym i wykorzystania GreA lub jego antagonistów do leczenia lub diagnozowania zakażeń (dokument patentowy EP 838525 opublikowany 2 kwietnia 1998 r.). Następnie, ujawniono GreA ze Staphylococcus aureus, jak również rekombinacyjne metody wytwarzania i wykorzystania go do skriningu związków o aktywności przeciwbakteryjnej (dokument patentowy EP 893502, opublikowany 27 stycznia 1999 r.).

W tej dziedzinie wiedzy istnieje aktualna i cią gle wystę pują ca potrzeba polepszenia jakoś ci biał ka rekombinacyjnego produkowanego przez komórki gospodarza, tak, aby zminimalizować lub wyeliminować wytwarzanie skróconych form białka, takich jak produkt znakowany 10Sa. Istnieje także zapotrzebowanie na większe ilości produkowanego przez prokarionty białka o pełnej długości.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wektor do wytwarzania polipeptydu heterologicznego dla komórek prokariotycznych, charakteryzujący się tym, że zawiera (1) antyterminacyjny kwas nukleinowy hamujący wewnątrzgenową terminację transkrypcji wraz z promotorem nie-lambda do niego; (2) DNA kodujący polipeptyd wraz z promotorem nie-lambda do niego, w którym miejsce rozpoznawania RNA dla wiązania białka antyterminacyjnego wytwarzanego z tego kwasu nukleinowego znajduje się w położeniu 5' DNA kodującego polipeptyd; i (3) kwas nukleinowy kodujący białko GreA albo GreB z promotorem do niego.

Korzystnie komórki prokariotyczne stanowią komórki bakteryjne.

Korzystnie polipeptyd stanowi polipeptyd ssaczy.

Korzystnie promotor nie-lambda stanowi promotor trp lub promotor fosfatazy alkalicznej, albo oba te promotory.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób zwiększania wytwarzania pełnej długości polipeptydu heterologicznego jako odsetka ogółu takiego polipeptydu heterologicznego w prokariotycznych komórkach gospodarza, polegający na tym, że:

(a) hoduje się komórki gospodarza zawierające 1) antyterminacyjny kwas nukleinowy hamujący wewnątrzgenową terminację transkrypcji z promotorem nie-lambda do niego; i (2) RNA kodujący polipeptyd, przy czym RNA jest eksprymowany z genu z promotorem nie-lambda do niego, w którym miejsce rozpoznawania RNA dla wiązania białka antyterminacyjnego wytwarzanego z tego kwasu nukleinowego znajduje się w położeniu 5' RNA kodującego polipeptyd, i przy czym antyterminacyjny kwas nukleinowy jest eksprymowany w czasie ekspresji tego RNA; i (b) odzyskuje się polipeptyd heterologiczny z komórek lub z pożywki do hodowli komórkowej, przez co ilość pełnej długości polipeptydu heterologicznego wytwarzanego w tym sposobie jest zwiększona jako odsetek ogółu takiego wytwarzanego polipeptydu heterologicznego.

Korzystnie jako polipeptyd heterologiczny stosuje się polipeptyd eukariotyczny.

Korzystniej jako polipeptyd heterologiczny stosuje się polipeptyd ssaczy.

Jeszcze korzystniej jako polipeptyd ssaczy stosuje się polipeptyd ludzki.

Najkorzystniej jako polipeptyd ssaczy stosuje się ludzką trombopoetynę (TPO) lub ludzki czynnik wzrostu fibroblastów 5 (FGF-5).

PL 208 884 B1

Korzystnie jako promotor nie-lambda stosuje się promotor trp lub promotor fosfatazy alkalicznej, albo oba te promotory.

Korzystnie RNA i antyterminacyjny kwas nukleinowy obejmują policistronową jednostkę genetyczną obejmującą pierwszy cistron kodujący polipeptyd heterologiczny i drugi cistron poniżej pierwszego cistronu, który jest antyterminacyjnym kwasem nukleinowym z pojedynczym promotorem kontrolującym transkrypcję tej policistronowej jednostki genetycznej.

Korzystnie ekspresja RNA i antyterminacyjnego kwasu nukleinowego odbywa się pod kontrolą osobnych promotorów.

Korzystnie jako komórki prokariotyczne stosuje się komórki bakteryjne.

Korzystnie polipeptyd odzyskuje się z cytoplazmy albo z periplazmy komórek.

Korzystnie polipeptyd odzyskuje się z pożywki do hodowli komórkowej.

Korzystnie jako antyterminacyjny kwas nukleinowy stosuje się gen N albo Q bakteriofaga.

Korzystniej jako antyterminacyjny kwas nukleinowy stosuje się gen lambda N.

Jeszcze korzystniej jako miejsce rozpoznawania RNA stosuje się miejsce nut.

Najkorzystniej jako miejsce rozpoznawania RNA stosuje się lambda nutL, nutR, Kasetę B, mutanta nut lub nut z faga lambdoidalnego innego niż fag lambda.

Korzystnie stosuje się komórki gospodarza zawierające ponadto kwas nukleinowy kodujący białko GreA lub GreB z promotorem do nich.

Korzystniej eksprymowany jest kwas nukleinowy kodujący GreB.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób zwiększania wytwarzania pełnej długości polipeptydu heterologicznego jako odsetka ogółu takiego polipeptydu heterologicznego w prokariotycznych komórkach gospodarza, polegający na tym, że:

(a) hoduje się komórki gospodarza zawierające kwas nukleinowy kodujący białko GreA albo białko GreB, kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny, oraz jeden, lub większą ilość promotorów dla tych kwasów nukleinowych;

i (b) odzyskuje się polipeptyd heterologiczny z komórek albo z pożywki do hodowli komórkowej, przez co ilość pełnej długości polipeptydu heterologicznego wytwarzanego w tym sposobie jest zwiększona jako odsetek ogółu takiego wytwarzanego polipeptydu heterologicznego.

Korzystnie eksprymowany jest kwas nukleinowy kodujący białko GreB.

Korzystnie jako komórki stosuje się komórki bakteryjne.

Korzystnie jako polipeptyd heterologiczny stosuje się polipeptyd ssaczy.

Korzystnie jako polipeptyd ssaczy stosuje się polipeptyd ludzki.

Korzystniej jako polipeptyd ludzki stosuje się ludzką trombopoetynę (TPO) lub ludzki czynnik wzrostu fibroblastów 5 (FGF-5).

Korzystnie jako promotor stosuje się promotor trp lub promotor fosfatazy alkalicznej, albo oba te promotory.

Korzystnie polipeptyd izoluje się z cytoplazmy lub periplazmy komórek.

Korzystnie polipeptyd izoluje się z pożywki do hodowli komórkowej.

Zgodnie z wynalazkiem opisano ponadto wektor do wytwarzania polipeptydu heterologicznego dla komórek prokariotycznych, obejmującego (1) antyterminacyjny kwas nukleinowy hamujący wewnątrzgenową terminację transkrypcji wraz z promotorem nie-lambda do niego, i (2) RNA kodujący polipeptyd wraz z promotorem nie-lambda do niego, przy czym miejsce rozpoznawania RNA dla wiązania białka antyterminacyjnego wytwarzanego z udziałem kwasu nukleinowego znajduje się w położeniu 5' RNA kodującego polipeptyd.

Zgodnie z wynalazkiem opisano również sposób wytwarzania heterologicznego polipeptydu w prokariotycznych komórkach gospodarza, w którym:

(a) hoduje się komórki gospodarza zawierające (1) antyterminacyjny kwas nukleinowy hamujący wewnątrzgenową terminację transkrypcji wraz z promotorem nie-lambda do niego, oraz (2) RNA kodujący polipeptyd wraz z promotorem nie-lambda do niego, przy czym miejsce rozpoznawania RNA dla wiązania białka antyterminacyjnego wytwarzanego z udziałem kwasu nukleinowego znajduje się w położeniu 5' RNA kodującego polipeptyd, a ekspresja antyterminacyjnego kwasu nukleinowego odbywa się w czasie ekspresji RNA; oraz (b) odzyskuje się heterologiczny polipeptyd z komórek lub z pożywki do hodowli komórkowej.

PL 208 884 B1

Zgodnie z wynalazkiem opisano też kwas nukleinowy kodujący białko GreA lub białko GreB, oraz kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny dla komórek prokariotycznych, dogodnie z jednym, lub wię kszą iloś cią promotorów do tych kwasów nukleinowych.

Zgodnie z wynalazkiem opisano również sposób wytwarzania polipeptydu heterologicznego w prokariotycznych komórkach gospodarza, w którym:

(a) hoduje się komórki gospodarza, zawierające kwas nukleinowy kodujący białko GreA lub białko GreB i kwas nukleinowy kodujący heterologiczny polipeptyd, oraz jeden, lub większą ilość promotorów dla tych kwasów nukleinowych; oraz (b) odzyskuje się polipeptyd heterologiczny z komórek lub z pożywki do hodowli komórkowej.

Fag lambda wykorzystuje antyterminację N do kontrolowania ekspresji genów za pomocą przepisywania informacji poza strategicznie umiejscowione terminatory wewnątrzgenowe. Stwierdzono, że opisywany tu system antyterminacyjny działa skutecznie przeciw wewnątrzgenowym sygnałom terminacyjnym w obrębie genów heterologicznych.

Ponadto, ogólny trend obserwowany w literaturze przedmiotu w ciągu lat polega na eliminowaniu systemu antyterminacyjnego lambda N, stosowanego wraz z towarzyszącym systemem promotora PL i użycie tylko promotora PL lub zastąpienie genu N poliłącznikiem lub innym partnerem fuzji. W przeciwieństwie do tego, wynalazek niniejszy polega na użyciu systemu antyterminacyjnego bez promotora PL.

Następnie, opisywany tu zgodnie z wynalazkiem system przeznaczony jest w szczególności do zapobiegania tworzeniu się i nagromadzaniu skróconych i znakowanych 10Sa białek heterologicznych, które stwarzają problemy przy oczyszczaniu białka. Jednym z głównych powodów powstawania skróconych i znakowanych 10Sa białek jest przedwczesna terminacja transkrypcji w obrębie wytworzonej sekwencji kodującej. Nagromadzanie się białka o pełnej długości może być podobne tak w przypadku uż ycia, jak i pominię cia uż ycia systemu antyterminacyjnego, ale nagromadzanie się form skróconych ulega wyraźnemu zmniejszeniu w wyniku stymulowania kontynuacji transkrypcji poza wewnątrzgenowe sygnały terminacji w obrębie sekwencji kodującej białko.

Dodatkowo, dzięki włączeniu kwasów nukleinowych kodujących GreA i GreB zminimalizowane zostaje niepożądane cięcie polipeptydu.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 przedstawia konstrukcję plazmidu pMP331.

Fig. 2 przedstawia konstrukcję plazmidu pMP843

Fig. 3 przedstawia konstrukcję plazmidu pMP871.

Fig. 4 przedstawia konstrukcję plazmidu pMP931.

Fig. 5 przedstawia konstrukcję plazmidu pMP945.

Fig. 6 przedstawia konstrukcję plazmidu pMP951.

Fig. 7 przedstawia konstrukcję plazmidu pMP982.

Fig. 8 przedstawia konstrukcję plazmidu pMP1016.

Fig. 9 przedstawia konstrukcję plazmidu pMP1086.

Fig. 10 przedstawia konstrukcję plazmidu pMP1099.

Fig. 11 przedstawia konstrukcję plazmidu pMP1201.

Fig. 12 przedstawia konstrukcję plazmidu pMP1217.

Fig. 13 przedstawia konstrukcję plazmidu pJJ142.

Fig. 14 przedstawia konstrukcję plazmidu pDR1.

Fig. 15 przedstawia konstrukcję plazmidu pDR3.

Figury 16A - 16C przedstawiają analizę ekspresji trombopoetyny (TPO) pod transkrypcyjną kontrolą promotorów tryptofanu (trp) i fosfatazy alkalicznej (AP lub phoA). Z lewej strony znajdują się markery masy cząsteczkowej w kD. Ścieżki 1 stanowią kontrolę negatywną, plazmid pBR322, po indukcji promotora trp w pożywkach M9, ścieżki 2 stanowią plazmid ekspresyjny trp TPO, pMP331, po indukcji promotora trp, ścieżki 3 stanowią kontrolę negatywną, plazmid pBR322, po indukcji promotora AP w poż ywkach C.R.A.P., i ś cież ki 4 stanowią plazmid ekspresyjny AP TPO, pMP1099, po indukcji promotora AP. Fig. 16A przedstawia żel SDS zabarwiony barwnikiem Coomassie blue dla ekstraktów pełnych komórek; fig. 16B stanowi blot sondowany histydyną/peroksydazą chrzanową (HRP) dla ekstraktów pełnych komórek (lizat pełnych komórek oddziela się metodą SDS-PAGE, przenosi na nitrocelulozę i sonduje środkiem wiążącym się z motywem poliHis na liderowej sekwencji TPO); oraz fig. 16C stanowi Western blot poliklonalnego przeciwciała anty-10Sa dla ekstraktów pełnych komórek z hodowli z indukcją TPO. Strzałki pokazują TPO o pełnej długości.

PL 208 884 B1

Fig. 17A i 17B przedstawiają, odpowiednio, insercję miejsca nutL do konstruktów ekspresyjnych TPO trp (Nr identyfikacyjny sekw.: 1) i AP (Nr identyfikacyjny sekw.: 2). W sekwencji pokazanej na fig. 17A, sekwencje nutL wstawiono na początku sekwencji mRNA opartej na kasecie -10 promotora. Sekwencja przedstawiona na fig. 17B pokazuje wstawienie miejsca nutL do konstruktu promotora AP. W tym przypadku, miejsce nut usytuowane jest dalej poniżej („w dół”) od miejsca startu transkrypcji mRNA.

Fig. 18A i 18B przedstawiają ekspresję białka λΝ pod transkrypcyjną kontrolą promotora tacll. Sekwencję startową białka λN pokazano na obu figurach 18A i 18B (Nr identyfikacyjny sekw.: 3). Sekwencja nukleotydowa pokazana na fig. 18A (Nr identyfikacyjny sekw.: 4) przedstawia fuzję promotora tacll z sekwencją kodującą Ż-N. W tym przypadku, doprowadzono do delecji sekwencji tacll ShineDalgarno, aby zapewnić zredukowaną translację ŻN, oraz zastosowano alternatywną sekwencję z niższym wiązaniem rybosomowowego 16S RNA. Pokazana na fig. 18B sekwencja nukleotydowa (Nr identyfikacyjny sekw.: 5) przedstawia fuzję promotora tacll z genem ŻN, z zastosowaniem pełnej sekwencji Shine-Dalgarno w celu uzyskania wysokiego poziomu ekspresji N.

Fig. 19A - 19C przedstawiają analizę ekspresji TPO z promotorem trp +/- antyterminacja ŻN. Z lewej strony znajdują się markery masy cząsteczkowej w kD. Ścieżki 1 stanowią kontrolę negatywną, plazmid pBR322; ścieżki 2 stanowią plazmid ekspresyjny trp TPO, pMP331; ścieżki 3 stanowią plazmid ekspresyjny trp TPO pMP951 z antyterminacją ŻN i niskim poziomem ekspresji N; oraz ścieżki 4 stanowią plazmid ekspresyjny trp TPO, pMP1217, z antyterminacją ŻN i wysokim poziomem ekspresji N. Fig. 19A przedstawia żel SDS zabarwiony barwnikiem Coomassie blue dla ekstraktów pełnych komórek; fig. 19B stanowi blot sondowany histydyną/peroksydazą chrzanową (HRP) dla ekstraktów pełnych komórek; oraz fig. 19C stanowi Western blot poliklonalnego przeciwciała anty-10Sa dla ekstraktów pełnych komórek. Strzałki pokazują TPO o pełnej długości.

Fig. 20A - 20C przedstawiają analizę ekspresji TPO z promotorem trp +/- antyterminacja ŻN. Z lewej strony znajdują się markery masy cząsteczkowej w kD. Ścieżki 1 stanowią kontrolę negatywną, plazmid pBR322; ścieżki 2 stanowią plazmid ekspresyjny AP TPO, pMP1099; ścieżki 3 stanowią plazmid ekspresyjny AP TPO pMP1086 z antyterminacją ŻN i niskim poziomem ekspresji N; oraz ścieżki 4 stanowią plazmid ekspresyjny AP TPO, pM1201, z antyterminacją ŻN i wysokim poziomem ekspresji N. Fig. 20A stanowi żel SDS zabarwiony barwnikiem Coomassie blue dla ekstraktów pełnych komórek; fig. 20B stanowi blot sondowany histydyną/peroksydazą chrzanową (HRP) dla ekstraktów pełnych komórek; oraz fig. 20C stanowi Western blot poliklonalnego przeciwciała anty-10Sa dla ekstraktów pełnych komórek. Strzałki pokazują TPO o pełnej długości.

Fig. 21 przedstawia konstrukcję plazmidu pFGF5IT.

Fig. 22 przedstawia konstrukcję plazmidu pFGF5lT-AT. Fig. 23A - 23C przedstawiają analizę ekspresji FGF-5 +/- antyterminacja ŻN. Ścieżki 1 stanowią kontrolę negatywną, plazmid pBR322; ścieżki 2 stanowią ekspresję FGF-5 bez antyterminacji ŻN (pFGF5IT); oraz ścieżki 3 stanowią plazmid ekspresyjny FGF-5 z antyterminacją ŻN (pFGF5IT). Fig. 23A przedstawia żel SDS zabarwiony barwnikiem Coomassie blue dla ekstraktów pełnych komórek z indukowanych hodowli fermentacyjnych (równoważnik OD600); fig. 23B stanowi Western blot lizatów pełnych komórek sondowanych przeciwciałem anty-FGF-5; oraz fig. 23C stanowi Western blot lizatów pełnych komórek sondowanych przeciwciałem anty-10Sa. Strzałki pokazują FGF-5 o pełnej długości.

Opis korzystnych sposobów wykonania wynalazku

Stosowane w niniejszym opisie określenia „greA” i „greB” odnoszą się do genów kodujących czynniki cięcia transkryptu, znane w piśmiennictwie jako, odpowiednio, białka GreA i GreB, oraz warianty ich sekwencji aminokwasowych, które są funkcjonalne i skuteczne pod względem cięcia transkryptów, użytecznego w ujawnianym tu wynalazku. Mogą one pochodzić z jakiegokolwiek źródła, a jednym z przykładów takich genów mogą być geny greA i greS z E. coli, opisane przez Borukhov i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, supra), oraz Borukhov i in. (Cell, supra), a innymi przykładami genów są geny greA ujawnione w dokumencie patentowym EP 838525.

Stosowane w niniejszym opisie określenie „czynnik antyterminacyjny” odnosi się do białka antyterminatorowego, które normalnie wykazuje aktywność wiązania RNA oraz aktywność antyterminatorową. Przykładowymi takimi białkami antyterminatorowymi są antyterminatorowe białka N fagów Ż, φ21 i P22, całkowicie zsekwencjonowane. Patrz: Franklin, J. Mol. Biol., 181, 85 - 91 (1985) oraz Lazinski i in., Cell, 59, 207 - 218 (1989). Wszystkie te białka N zawierają domenę o dużej zawartości argininy odpowiadającą, mniej więcej, aminokwasom 1 - 19 N-końca białka odpowiedzialnego za aktywność tych białek polegającą na wiązaniu RNA, podczas gdy pozostała część każdego białka nadaje aktywność antyterminatorową [Franklin, J. Mol. Biol., 231, 343 - 360 (1993)]. Zalecanym czynnikiem

PL 208 884 B1 antyterminacyjnym jest czynnik fagowy. Bardziej zalecany jest gen λΝ lub λQ, a jeszcze w szczególności białko N faga λ (λΝ).

Stosowane w niniejszym opisie określenie „miejsce rozpoznawania RNA” odnosi się do miejsca na cząsteczce RNA rozpoznającego konkretne białko. Na przykład, miejscami rozpoznawania RNA dla wiązania białka antyterminacyjnego będą nut dla genu N i qut dla genu Q.

Określenia „terminator transkrypcyjny” lub „transkrypcyjny sygnał terminacyjny” definiuje się funkcjonalnie jako punkt, w którym szybkość uwalniania transkryptu RNA jest większa niż szybkość dodawania następnego nukleotydu. Dla celów niniejszego wynalazku, terminator może być rhozależny lub rho-niezależny. Terminatorem „wewnątrzgenowym” jest terminator homologiczny dla danej sekwencji kodującej heterologiczny polipeptyd. Terminatorem „międzygenowym” jest terminator egzogenny dla danej sekwencji kodującej heterologiczny polipeptyd, na przykład bakteryjne lub bakteriofagowe sygnały terminacyjne w przypadku polipeptydu pochodzącego ze ssaka.

Określenie „antyterminacyjny kwas nukleinowy hamujący wewnątrzgenową terminację transkrypcji” oznacza kwas nukleinowy kodujący czynniki antyterminacyjne blokujące lub tłumiące wewnątrzgenowe terminatory transkrypcyjne w obrębie genów heterologicznych. Definicja ta obejmuje geny N i Q, jak również rrn i antyterminacyjny kwas nukleinowy KH022. Zalecany jest gen N lub gen Q.

Stosowany w niniejszym opisie termin „cistron” oznacza sekwencję oddzielnie zdolną do translacji, definiowaną przez pojedynczy transkrypt informacyjnego RNA z jednym promotorem.

Stosowane w niniejszym opisie określenie „policistronowy” odnosi się do polinukleotydu obejmującego jeden, lub większą ilość cistronów, przy czym szereg różnych genów ulega transkrypcji ze swych operonów w postaci pojedynczego mRNA, oraz dwie pary, lub więcej, kodonów inicjatorowych i kodonów terminacyjnych (kodonów start i kodonów stop).

Stosowane w niniejszym opisie określenia „ polipeptyd” lub „polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania” odnosi się, ogólnie, do peptydów i polipeptydów obejmujących więcej niż około 10 aminokwasów. Polipeptydy są „heterologiczne” wtedy, gdy, na przykład, są obce dla użytej komórki gospodarza, tak jak w przypadku produkcji białka ludzkiego przez komórkę bakteryjną, albo produkcji polipeptydu bakteryjnego przez linie komórek bakteryjnych nie będących naturalnym źródłem polipeptydu. Zalecany polipeptyd pochodzi ze ssaka, najkorzystniej jest to polipeptyd ludzki.

Do przykładowych polipeptydów pochodzących ze ssaków należą cząsteczki takie jak, na przykład, renina, hormon wzrostu, w tym ludzki hormon wzrostu; bydlęcy hormon wzrostu; czynnik uwalniający hormon wzrostu; hormon przytarczyczny; tyreotropina; lipoproteiny; α-1-antytrypsyna; łańcuch A insuliny; łańcuch B insuliny; proinsulina; trombopoetyna; hormon folikulotropowy; kalcytonina; hormon luteinizujący; glukagon; czynniki krzepliwości krwi, takie jak czynnik VIIIC, czynnik IX, czynnik tkankowy i czynnik von Willebranda; czynniki przeciwkrzepliwe, takie jak białko C; czynnik natriuretyczny przedsionkowy; surfaktanty płucne; aktywator plazminogenu, taki jak urokinaza lub ludzki aktywator plazminogenu występujący w moczu lub tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA); bombezyna; trombina; hemopoetyczny czynnik wzrostu; czynnik martwicy nowotworu alfa i beta; enkefalinaza; albumina surowicy, taka jak albumina surowicy ludzkiej; inhibitor Mϋlleriana; łańcuch A relaksyny; łańcuch B relaksyny; prorelaksyna; mysi peptyd związany z gonadotropiną; białko drobnoustrojowe, takie jak betalaktamaza; DNaza; inhibina; aktywina; czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF); receptory dla hormonów lub czynników wzrostu; integryny; białko A lub białko D; czynniki reumatoidalne; czynnik neurotrofowy, taki jak czynnik neurotrofowy mózgowy (BDNF); neurotrofina 3, -4, -5 lub -6 (NT-3, NT-4, NT-5 lub NT-6), lub czynnik wzrostu nerwu, taki jak NGF-α; kardiotrofiny (czynniki hipertrofii serca), takie jak kardiotrofina 1 (CT-1); płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF); czynniki wzrostu fibroblastów, takie jak aFGF, bFGF i FGF-5; naskórkowy czynnik wzrostu (EGF); transformujący czynnik wzrostu (TGF), taki jak TGF-alfa i TGF-beta, włącznie z TGF-βΙ, TGF-e2, TGF-e3, TGF-e4 i TGF-e5; insulinopodobny czynnik wzrostu I i II (IGF-I i IGF-II); des(1-3)-IGF-1 (mózgowy IGF-I), insulinopodobne białka wiążące czynnik wzrostu; białka CD takie jak CD-3, CD-4, CD-8, CD-19, CD-20 i CD-40; erytropoetyna; czynniki osteoindukcyjne; immunotoksyny; morfogenetyczne białko kości (BMP); interferon, taki jak interferon-alfa, interferon-beta i interferon gamma; czynniki stymulujące tworzenie kolonii (CSF), na przykład: M-CSF, GM-CSF i G-CSF; interleukiny (IL), na przykład IL-1 do IL-10; przeciwciało anty-HER-2; dysmutaza ponadtlenkowa; receptory komórek T; białka powierzchniowe błony; czynnik przyspieszający rozkład; antygen wirusowy, taki jak, na przykład, część otoczki HIV; białka transportujące; receptory zasiedlania; adresyny; białka regulatorowe; przeciwciała; oraz fragmenty któregokolwiek z wyliczonych powyżej polipeptydów.

PL 208 884 B1

Do zalecanych, pochodzących ze ssaków polipeptydów należą:, t-PA, gp120, anty-HER-2, antyCD20, anty-CD11a, anty-CD18, anty-CD40, DNaza, IGF-I, IGF-II, FGF-5, trombopoetyna, mózgowy IGF-I, hormon wzrostu, łańcuchy relaksyny, czynnik uwalniający hormon wzrostu, łańcuchy insuliny lub proinsulina, urokinaza, immunotoksyny, neurotrofiny i antygeny. Do szczególnie zalecanych polipeptydów pochodzących ze ssaków należą, na przykład, t-PA, gp120(IIIb), anty-HER-2, anty-CD20, anty-CD11a, anty-CD18, anty-CD40, DNaza, trombopoetyna, IGF-I, IF-II, FGF-5, hormon wzrostu, NGF, NT-3, NT-4, NT-5 i NT-6, a najkorzystniej FGF-5 i trombopoetyna.

Określenie „sekwencja kontrolna” odnosi się do sekwencji DNA potrzebnej do ekspresji operacyjnie związanej sekwencji kodującej w konkretnym organizmie gospodarza. Sekwencje kontrolne odpowiednie dla prokariontów obejmują promotor, taki jak promotor AP lub promotor trp, ewentualnie sekwencję operatorową i miejsce wiązania rybosomu.

Kwas nukleinowy jest „operacyjnie związany” wtedy, gdy znajduje się w funkcjonalnym związku z inną sekwencją kwasu nukleinowego. I tak, na przykład, DNA dla presekwencji lub sekrecyjnej sekwencji liderowej wtedy jest operacyjnie związany z DNA dla polipeptydu, gdy wyrażony jest jako prebiałko, które uczestniczy w sekrecji polipeptydu; promotor wtedy jest operacyjnie związany z sekwencją kodującą, jeżeli oddziałuje na transkrypcję sekwencji; albo miejsce wiązania rybosomu wtedy jest operacyjnie związane z sekwencją kodującą, gdy jest usytuowane tak, aby ułatwiało translację. Ogólnie, „operacyjnie związany” oznacza, że związane sekwencje DNA są przyległe do siebie oraz, w przypadku sekrecyjnej sekwencji liderowej, są przyległe do siebie i znajdują się w fazie odczytu. Wiązanie takie odbywa się przez ligację w dogodnych miejscach restrykcyjnych. Gdy takich miejsc nie ma, wtedy, zgodnie z typową praktyką, stosuje się syntetyczne oligonukleotydowe adaptory lub łączniki.

Stosowane w niniejszym opisie określenie „komórka”, „linia komórkowa” i „hodowla komórkowa” używane jest zamiennie i wszystkie takie nazwy obejmują potomstwo. I tak, słowa „transformaty” i „komórki transformowane” obejmują pierwotne komórki przedmiotowe i wywodzące się z nich hodowle, niezależnie od liczby pasaży. Także, zrozumiałe jest, że całe potomstwo może nie być dokładnie identyczne pod względem zawartości DNA, a to w wyniku umyślnych i mimowolnych mutacji. Wynalazek obejmuje swym zakresem zmutowane potomstwo, które zachowuje taką samą funkcję lub aktywność biologiczną, jaką stwierdzono w wyniku skriningu (przeszukania) u pierwotnie transformowanych komórek. Tam, gdzie zamierzone jest wprowadzenie odmiennych znaczeń, będzie to jasno wynikało z kontekstu.

Miejsce „nut” oznacza miejsce wykorzystania N, z którym wiąże się białko N. Termin ten obejmuje zarówno naturalne nut, jak i produkty jego obróbki lub odmiany, które jeszcze współdziałają z białkiem N przez wiązanie go z powodowaniem specyficznej względem mRNA antyterminacji lambda N. Do przykładowych nut należą lambda nutL, nutR, kaseta (box) B sama, kaseta A i kaseta B, zmutowane miejsca nut i miejsca nut z pokrewnych fagów lambdoidalnych. Opisane są one, na przykład, w: Friedman i in., Gene Dev., 4, 2210 - 2222 (1990); Mogridge i in., J. Biol Chem., 273, 4143 4148 (1998); Olson i in., Cell, 31, 61 - 70 (1982); Patterson i in., J. Mol. Biol., 236, 217 - 228 (1994); oraz Schauer i in., J. Mol. Biol., 194, 679 - 690 (1987).

Określenia „promotor nie-lambda” i miejsca terminacji „nie-lambda” wskazują na, odpowiednio, promotory i miejsca terminacji niepochodzące z faga (bakteriofaga) lambda, na przykład na promotor nielambda PL. Do przykładowych stosownych promotorów nie-lambda należą, na przykład, promotory trp i AP.

B. Sposoby wykonania.

Zgodnie z wynalazkiem opisano wektor do wytwarzania polipeptydu heterologicznego względem komórek prokariotycznych, korzystnie polipeptydu pochodzącego ze ssaka, a w szczególności polipeptydu ludzkiego. Wektor taki obejmuje co najmniej następujące elementy: antyterminacyjny kwas nukleinowy hamujący wewnątrzgenową terminację transkrypcji, RNA kodujący polipeptyd oraz jeden, lub osobne promotory nie-lambda dla kwasu nukleinowego i RNA. W wektorze tym, miejsce rozpoznawania RNA dla wiązania białka antyterminacyjnego tworzonego z kwasu nukleinowego znajduje się w położeniu 5' RNA kodującego polipeptyd. Wektor może w dalszym ciągu obejmować kwas nukleinowy kodujący białka GreA lub GreB łącznie z promotorem dla tego kwasu nukleinowego, który może być promotorem lambda lub nie-lambda.

Zgodnie z wynalazkiem opisano też sposób wytwarzania heterologicznego polipeptydu w prokariotycznych komórkach gospodarza. W sposobie tym, hoduje się komórki gospodarza i z komórek, lub z pożywki do hodowli komórkowej, odzyskuje się polipeptyd. Komórki zawierają składniki opisanego powyżej wektora, to znaczy antyterminacyjny kwas nukleinowy hamujący wewnątrzgenową terminację transkrypcji i RNA kodujący polipeptyd, z promotorem (promotorami) nie-lambda dla każdego z nich, przy czym miejsce rozpoznawania RNA dla wiązania białka antyterminacyjnego tworzonego z kwasu

PL 208 884 B1 nukleinowego znajduje się w położeniu 5' RNA kodującego polipeptyd. W sposobie tym, antyterminacyjny kwas nukleinowy wyrażany jest w czasie ekspresji RNA.

Zgodnie z wynalazkiem opisano też wektor obejmujący kwas nukleinowy kodujący białko GreA lub GreB i kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny, łącznie z jednym, lub większą ilością ich promotorów, które mogą być promotorami lambda lub nie-lambda.

Zgodnie z wynalazkiem opisano też sposób wytwarzania heterologicznego polipeptydu w prokariotycznych komórkach gospodarza obejmujący hodowlę komórek gospodarza, zawierających składniki opisanego powyżej wektora GreA/GreB, to znaczy kwas nukleinowy kodujący białko GreA lub GreB i kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny, oraz jeden, lub większą ilość promotorów dla tych kwasów nukleinowych. Po etapie hodowli, odzyskuje się z komórek lub pożywki do hodowli komórkowej heterologiczny polipeptyd.

System antyterminacyjny można wykonać z udziałem (lub z pominięciem) kwasu nukleinowego kodującego GreA lub GreB, ponieważ system antyterminacyjny powyżej opisany sam z siebie zapewnia uzyskanie znaczącego ograniczenia skracania białka heterologicznego i znakowania 10Sa, i odpowiednio do tego zwiększenia ilości białka o pełnej długości. Koekspresja z udziałem kwasu nukleinowego GreA lub GreB prowadzi do zwiększonej produkcji białka rekombinacyjnego, niezależnie od tego, czy został użyty, czy pominięty, opisywany tu system antyterminacyjny.

Antyterminacyjny kwas nukleinowy, jak również kwas nukleinowy GreA/GreB i kwas nukleinowy kodujący białko heterologiczne może stanowić cDNA lub genomowy DNA z jakiegokolwiek źródła. Ogólnie, antyterminacyjne kwasy nukleinowe GreA/GreB stanowią sekwencję natywną, ale nie jest to niezbędne, jeżeli zapewniają one takie same korzyści w odniesieniu do wytwarzania heterologicznego peptydu, jak to powyżej przedstawiono.

W przypadku, gdy czynniki antyterminacyjne, albo białka GreA lub GreB, są natywnymi produktami komórki gospodarza, i jeżeli czynniki kontrolujące ekspresję tych natywnych genów są zrozumiałe, wtedy czynnikami takimi można manipulować dla uzyskania nadekspresji tych genów, na przykład, przez indukowanie transkrypcji z naturalnego promotora przy użyciu cząsteczek znanego induktora, lub sposobem mutacji kwasów nukleinowych kontrolujących lub tłumiących ekspresję produktu genowego, z utworzeniem zmutowanego szczepu, w którym odbywa się indukowana nadekspresja produktu genowego, albo sposobem mutacji drugiego miejsca, ze zmniejszeniem syntezy lub funkcjonalności czynników normalnie tłumiących transkrypcję produktu genowego, itp.

Heterologiczny kwas nukleinowy (na przykład cDNA lub genomowy DNA) wstawia się odpowiednio do zdolnego do replikacji wektora celem ekspresji w komórkach prokariotycznych pod kontrolą promotora odpowiedniego dla komórek prokariotycznych. Dostępnych jest szereg wektorów do tego celu i dobranie właściwego wektora zależeć będzie głównie od rozmiarów kwasu nukleinowego przewidzianego do wstawienia do wektora oraz rodzaju konkretnej komórki gospodarza poddawanej transformacji przy użyciu tego wektora. Każdy wektor zawiera różne składniki w zależności od jego funkcji (amplifikacja DNA lub ekspresja DNA) i rodzaju danej komórki gospodarza, z którą jest zgodny. Na ogół, do składników wektora przeznaczonego do transformacji komórki prokariotycznej należą, ale bez ograniczania się tylko do nich, jeden, lub większa ilość następujących składników: sekwencja sygnałowa, początek replikacji, jeden, lub więcej niż jeden gen markerowy oraz promotor.

Stosowane tu promotory mogą być konstytutywne lub indukowalne, a w szczególności indukowalne, i są one rozpoznawane przez prokariotyczny organizm gospodarza oraz operacyjnie wiązane ze składnikami, kwasami nukleinowymi kodującymi białko GreA/GreB i/lub czynnik antyterminacyjny i polipeptyd, obecnymi w opisywanym tu wektorze. Dla plazmidu antyterminacyjnego promotor jest nie-lambda. Dla plazmidu niezawierającego antyterminacyjnego kwasu nukleinowego promotor może być lambda lub nie-lambda. Omawiane tu wektory zawierają albo jeden promotor dla wszystkich dwóch lub trzech składników (z tym, że musi on być odpowiedni dla tych wszystkich składników) albo dwa, lub więcej niż dwa osobne promotory, które mogą być takie same lub różne, z tym, że są one odpowiednie, operacyjnie związane z każdym z kwasów nukleinowych kodujących czynnik antyterminacyjny, polipeptyd i/lub białko GreA/GreB. Promotory dobiera się tak, aby były zgodne z typem komórek, w których ma być przeprowadzona ekspresja. Dla czynnika antyterminacyjnego promotor jest nielambda, a dla GreA/GreB promotor może być lambda lub nie-lambda. Do stosownych promotorów nielambda, nadających się do użycia w komórkach zalecanego typu, E. coli, należą, na przykład: βlaktamazowe i laktozowe (lac) systemy promotorowe [Chang i m., Nature, 275, 615 (1978); Goeddel i in., Nature, 281, 544 (1979)], arabinozowy system promotorowy [Guzman i in., J. Bacteriol., 174, 7716 - 7728 (1992)], AP, system promotorowy trp [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980) i doPL 208 884 B1 kument patentowy EP 36776)], promotory hybrydowe, takie jak promotor tac [DrBoer i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 21 - 25 (1983)] oraz promotor T3 lub T7 [patrz, ogólnie, na przykład: Itakura i in., Science, 198, 1056 - 1063 (1977); Goeddel i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 106 - 110 (1979); Emtage i in., Nature, 283, 171 - 174 (1980); oraz Martial i in., Science, 205, 602 - 606 (1979)]. Najkorzystniejszymi promotorami nie-lambda tu opisywanymi są promotory trp i AP.

Do stosownych promotorów lambda i nie-lambda nadających się do użycia z gospodarzami prokariotycznymi należą promotory nie-lambda przedstawione powyżej, oraz promotory lambda, to znaczy te pochodzące z faga lambda, na przykład promotor lambda PL i promotor lambda Pr. Jednakże, właściwe okazują się także i inne znane promotory lambda i nie-lambda. Ich sekwencje nukleotydowe zostały już opublikowane, co umożliwia specjalistom w tej dziedzinie operacyjnie ligować je do DNA kodującego polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania, albo do genów antyterminacyjnych lub GraA i GreB [Siebenlist i in., Cell, 20, 269 (1980)] przy użyciu łączników lub adaptorów celem dostarczenia jakichkolwiek potrzebnych miejsc restrykcyjnych.

Na ogół, promotory przeznaczone do użycia w układach prokariotycznych zawierają także sekwencję Shine-Dalgarno (SD), operacyjnie związaną z DNA kodującym polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania. Promotor można wyodrębnić z prokariotycznego źródła DNA za pomocą trawienia z udziałem enzymu restrykcyjnego i wstawić do wektora zawierającego pożądany DNA.

Gdy gospodarz zawiera wariant genu pstS, wtedy wektor ekspresyjny do wytwarzania polipeptydu heterologicznego odpowiednio zawiera promotor AP rozpoznawany przez organizm gospodarza i jest operacyjnie zwią zany z kwasem nukleinowym kodują cym polipeptyd bę d ą cy przedmiotem zainteresowania. Promotor ten inicjuje podwyższone poziomy transkrypcji z DNA pod jego kontrolą w odpowiedzi na zmniejszone stężenie fosforanu nieorganicznego w pożywce hodowlanej. Promotor AP można wyodrębnić z prokariotycznego źródła DNA za pomocą trawienia z udziałem enzymu restrykcyjnego i wstawić do wektora zawierającego pożądany DNA.

Alternatywnie, komórki prokariotyczne zawierają dwa osobne wektory obejmujące, odpowiednio, antyterminacyjny kwas nukleinowy i/lub białko GreA/GreB oraz RNA kodujący polipeptyd heterologiczny.

W alternatywnym sposobie antyterminacyjny kwas nukleinowy i GreA/GreB oraz RNA kodujący polipeptyd heterologiczny zawarte są w tym samym wektorze i znajdują się pod kontrolą pojedynczego promotora, lub większej ilości osobnych indukowalnych promotorów. W takim przypadku, polipeptyd można odpowiednio poddać fuzji w ramce z białkiem antyterminacyjnym i/lub białkiem GreA lub GreB, jak to powyżej zdefiniowano, tak, że połączona sekwencja kodująca zostaje operacyjnie związana z pojedynczym promotorem. Stąd też, gen polipeptydu oraz antyterminacyjny kwas nukleinowy i/lub kwas nukleinowy greA/greB są odpowiednio sprzęgane z utworzeniem jednostki policistronowej. Alternatywnie, mogą być one niezależnie wyrażane pod kontrolą osobnych, odmiennie indukowalnych promotorów na tym samym wektorze tak, że inicjacja ekspresji może odbywać się we właściwym porządku.

Zatem antyterminacyjny kwas nukleinowy i/lub kwas nukleinowy greA/greB i kwas nukleinowy polipeptydu mogą występować gdziekolwiek w cytoplazmie komórki, włączając w to chromosom. Dlatego też, mogą one być zintegrowane z genomem komórki gospodarza lub zawarte w autonomicznie replikujących się plazmidach. Antyterminacyjny kwas nukleinowy, taki jak gen N lub gen Q, może być wyrażany z udziałem dowolnego racjonalnie kontrolowanego promotora i, dogodnie, wyrażany jest jedynie wtedy, gdy włączony jest DNA polipeptydu.

Opisywane tu wektory, zawierające antyterminacyjny kwas nukleinowy, zawierają także miejsce rozpoznawania RNA. Obejmuje ono NutB kasety B lub NutL dla białka N faga λ. Może ono także obejmować miejsce kasety A jeżeli czynnikiem antyterminacyjnym jest białko fagowe. Miejsce rozpoznawania RNA umiejscawia się metodami inżynierii genetycznej na końcu 5' mRNA polipeptydu. Następnie, antyterminacyjny kwas nukleinowy wiąże się z jego miejscem rozpoznawania RNA na polipeptydowym RNA, w połączeniu z polimerazą RNA i szeregiem czynników gospodarza, takich jak czynniki nus, w przypadku genu N, z utworzeniem kompleksu antyterminacyjnego.

Zalecane miejsce Nut jest miejscem NutR, zwłaszcza miejscem NutR λ, w szczególności kompletną sekwencją NutR kasety A i kasety B lub częściową kasety B. Opublikowano kompletne sekwencje miejsc Nut, do których należą domeny kasety A i kasety B z fagów λ, φ21 i P22 [Lazinski, Cell, 59, 207 - 218 (1989)]. Kaseta B jest odpowiedzialna za wiązanie białka antyterminacyjnego. Kaseta A egzystuje nie tylko w fagach, ale także w szeregu innych operonów antyterminacyjnych, włącznie z operonami rybosomowego RNA E. coli [Friedman i Olson, Cell, 34, 143 - 149 (1983); Li i in., Cell, 38, 851 - 860 (1984)]. Konserwatywna sekwencja 8 - 12 nukleotydów najbliższa promotorowi w naturalnym operonie, kaseta A, jest odpowiedzialna za wiązanie czynnika elongacji gospodarza, współ12

PL 208 884 B1 działając z białkiem antyterminacyjnym i stymulując w ten sposób aktywność antyterminacyjną [Greenblatt i in., Nature, 364, 401 - 406 (1993)].

Zalecana kaseta A powinna być dopasowana do białka antyterminacyjnego kodowanego przez użyty gen. I tak, jeżeli białko antyterminacyjne jest białkiem N faga λ, można wybrać sekwencję NutL lub Nut R kasety A λ,; różnią się one nieznacznie między sobą w sekwencji nukleotydów. Analogicznie, jeżeli białko antyterminacyjne jest białkiem N faga P22, wtedy należy wybrać sekwencję kasety Nut P22.

Źródłem białka λΝ jest jakiekolwiek odpowiednie źródło, włącznie z białkiem z regionu kodującego genu białka N pHE6 [Franklin i Bennett, Gene, 8, 107 - 119 (1979); dokument patentowy EP 467676, opublikowany 22 stycznia 1992)], usunięty w miejscu restrykcyjnym 7 Hinfl. Alternatywnie, można użyć, na przykład, plazmidu dostępnego w handlu (z firmy Pharmacia LKB) lub plazmidu ujawnionego w dokumencie patentowym EP 700997.

Ogólnie, w odniesieniu do gospodarzy prokariotycznych stosuje się wektory plazmidowe obejmujące replikon i sekwencje kontrolne wywodzące się z gatunków zgodnych z komórką gospodarza. Typowo, wektor niesie miejsce replikacji, jak również sekwencje znakujące, zdolne do zapewniania selekcji fenotypowej w komórkach transformowanych. I tak, na przykład, E. coli typowo transformuje się stosując pBR322, plazmid pochodzący z gatunków E. coli [patrz, na przykład: Bolivar i in., Gene, 2, 95 (1997)]. Plazmid pBR322 obejmuje geny oporności na ampicylinę i tetracyklinę i w ten sposób dostarcza łatwego narzędzia do identyfikacji komórek transformowanych. Plazmid pBT322, lub inny pochodzący z drobnoustrojów plazmid lub fag, zawiera także, na ogół, (lub jest tak zmodyfikowany, aby zawierał) promotory, które organizm drobnoustroju może wykorzystać do ekspresji markerowych genów selekcyjnych.

DNA kodujący polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania może być wyrażany nie tylko bezpośrednio, ale także w postaci fuzji z innym polipeptydem, dogodnie sekwencją sygnałową (liderową) lub innym polipeptydu o specyficznym miejscu rozszczepienia na N-końcu dojrzałego polipeptydu. Ogólnie, sekwencja sygnałowa może stanowić składnik wektora, albo może być częścią DNA polipeptydu wstawionego do wektora. Wybrana heterologiczna sekwencja sygnałowa powinna być sekwencją rozpoznawaną i przetwarzaną (to jest rozszczepianą przez peptydazę sygnałową) przez komórkę gospodarza. I tak, na przykład, w przypadku prokariotycznych komórek gospodarza, które nie rozpoznają i nie przetwarzają natywnej sekwencji sygnałowej polipeptydu, sekwencja sygnałowa zostaje zastąpiona wybraną sekwencją sygnałową prokariotyczną, wybraną, na przykład, z grupy złożonej z sekwencji fosfatazy alkalicznej, penicylinazy, lpp lub termostabilnej liderowej enterotoksyny II.

Wektor zawiera także miejsce terminacji transkrypcji. Zazwyczaj, wybór miejsca terminacji nie jest decydujący. Miejscami terminacji są sekwencja RNA o około 50 - 100 zasadach poniżej miejsca terminacji translacji sekwencji kodującej białko. Często, miejsca terminacji RNA mogą złożyć się w strukturę „szpilki do włosów”. Miejsca terminacji rozpoznawane są przez polimerazę RNA jako sygnał do wstrzymania transkrypcji [V. Hippel, Science, 255, 809 (1992)]. W komórkach eukariotycznych, dobór miejsca terminacji zależy od promotora, z którym wiążą się geny. Jednakże, w komórkach prokariotycznych, polimeraza RNA rozpoznaje w rzeczywistości jakiekolwiek prokariotyczne miejsce terminacji tak, że wybór miejsca terminacji nie jest decydujący. W niektórych wektorach wiele miejsc rozpoznawania włączonych jest tandemowo.

Zarówno wektory ekspresyjne, jak i wektory do klonowania zawierają sekwencję kwasu nukleinowego umożliwiającą replikację wektora w jednej, lub większej ilości komórek gospodarza. Ogólnie, w wektorach do klonowania sekwencja ta stanowi sekwencję umożliwiającą replikację wektora niezależną od chromosomowego DNA gospodarza, i obejmuje początki replikacji lub sekwencje replikujące autonomicznie. Sekwencje takie są dobrze znane u wielu różnych prokariontów. Początek replikacji z plazmidu pBR322 jest odpowiedni dla większości bakterii Gram-ujemnych.

Na ogół, wektory ekspresyjne i do klonowania zawierają także gen selekcyjny, nazywany także markerem selekcyjnym. Gen ten koduje białko niezbędne do przeżycia lub rozwoju transformowanych komórek gospodarza w selekcyjnej pożywce hodowlanej. W pożywce takiej komórki gospodarza nie transformowane wektorem zawierającym gen selekcyjny nie przeżyją. Typowe geny selekcyjne kodują białka, które: (a) nadają oporność na antybiotyki lub inne toksyny, na przykład na ampicylinę, neomycynę, metotreksat lub tetracyklinę, (b) uzupełniają niedobory auksotrofowe, lub (c) dostarczają niezbędne środki odżywcze, nieosiągalne z pożywek złożonych, na przykład gen kodujący racemazę Dalaninową dla Bacilli. W jednym z przykładowych schematów postępowania wykorzystuje się lek do zahamowania wzrostu komórek gospodarza. Komórki takie, które z powodzeniem transformuje się

PL 208 884 B1 przy użyciu genu heterologicznego, produkują białko nadające lekooporność, a tym samym zapewniające przeżycie w reżymie selekcyjnym.

Konstruowanie odpowiednich wektorów zawierających jeden, lub większą ilość wyżej wyszczególnionych składników obejmuje typowe metody ligowania. Izolowane plazmidy lub fragmenty DNA zostają rozszczepione, dopasowane i powtórnie zligowane w postaci pożądanej, jeśli chodzi o generowanie docelowego plazmidu.

Do przeprowadzenia analizy potwierdzającej prawidłową sekwencję skonstruowanego plazmidu stosuje się mieszaniny ligacyjne służące transformowaniu E. coli K12 szczep 294 (ATCC 31446) lub innych szczepów, a udane transformanty dobiera się, jeżeli jest to stosowne, na podstawie oporności na ampicylinę lub tetracyklinę. Z transformantów otrzymuje się plazmidy, które analizuje się metodą trawienia z udziałem endonukleazy restrykcyjnej i/lub sekwencjonuje metodą Sangera i in. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 - 5467 (1977); Messing i in., Nucleic Acids Res., 9, 309 (1981) lub Maxam i in., Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)].

Do odpowiednich komórek prokariotycznych, użytecznych jako komórki gospodarza w niniejszym wynalazku, należą bakterie, na przykład bakterie z rodzajów Archaebacterium i Eubacterium, zwłaszcza Eubacterium, a najkorzystniej z rodziny Enterobacteriaceae. Do przykładowych użytecznych tu bakterii należą: Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla i Paracoccus. Te komórki gospodarza mogą być lizogenne. Do odpowiednich gospodarzy z gatunku E. coli należą: E. coli W3110 (ATCC 27325), E. coli 294 (ATCC 31446), E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537) i E. coli JM105 (New England Biolabs). Te przykładowe szczepy przytoczono tu raczej dla objaśnienia wynalazku, a nie w celu ograniczenia jego zakresu. Można także użyć zmutowanych komórek którejkolwiek z wyż ej podanych komórek prokariotycznych. Potrzebne jest, oczywiś cie, wyselekcjonowanie odpowiednich komórek prokariotycznych, z uwzględnieniem zdolności do replikacji replikonu w komórkach prokariontów. I tak, na przykład, E. coli, Serratia sp. lub Salmonella sp. można użyć jako komórek gospodarza, gdy do dostarczenia replikonu użyje się dobrze znanych plazmidów, takich jak pBR322, p3R325, pACYC177 lub pKN410.

Zalecanym gospodarzem jest E. coli szczep W3110, ponieważ jest on szczepem gospodarza powszechnie stosowanym w procesach fermentacyjnych prowadzonych w celu otrzymania zrekombinowanego DNA. Zalecana komórka gospodarza powinna wydzielać minimalne tylko ilości enzymów proteolitycznych. I tak, na przykład, szczep W3110 można zmodyfikować tak, aby uzyskać mutację genetyczną w genach kodujących białka, przy czym do przykładowych gospodarzy tego rodzaju należą: E. coli W3110 szczep 1A2, posiadający kompletny genotyp tonAΔ (znany także jako ΔΜυΑ); E. coli W3110 szczep 9E4, posiadający kompletny genotyp tonAΔ ptr3; E. coli szczep 27C7 (ATCC 55244), który posiada kompletny genotyp tonAA ptr3 phoAΔE15 &(argF-lać)169 ompTΔ degP41kan^r; E. coli W3110 szczep 37D6, który posiada kompletny genotyp tonAA ptr3 phoAΔE15 ĄargF-lac)169 ompTΔ degP41kan^r rbs7.-\ilvG: E. coli W3110 szczep 40B4, który jest szczepem 37D6 z mutacją delecyjną oporności na kanamycynę degP; E. coli W3110 szczep 33D3, który posiada kompletny genotyp tonA ptr3 laclq LacL8 ompT degP kan^r: E. coli W3110 szczep 36F8, który posiada kompletny genotyp tonA phoA A(argF-lac) ptr3 degP kan^r ilvG+ i jest termooporny w 37°C; E. coli szczep zawierający zmutowaną periplazmatyczną proteazę (proteazy), ujawniony w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4946783, wydanym 7 sierpnia 1990 r.: E. coli W3110 szczep 52A7, który posiada pełny genotyp toηΑΔ (ΑύυΑΔ) lon.-\ galE rpoHts (htpRts) ΔΰρΡ laclq; E. coli W3110 szczep 54C2, który posiada kompletny genotyp fhyA(tonA)lon galE rpoHts(htpRTs) clpP lacIq: oraz E. coli W3110 szczep 59B9, który posiada kompletny genotyp fluiA.b (tonAΔ)lonΔgalE rpoHts (htpRts) AclpP lacIq ΔompT A(npmc-fepE) .MacY.

Transformacja oznacza wprowadzenie DNA do organizmu w taki sposób, że DNA jest zdolny do replikacji, albo jako element pozachromosomowy, albo jako część składowa (integrant) chromosomu. W zależności od rodzaju użytej komórki gospodarza, transformacji dokonuje się z zastosowaniem typowych sposobów postępowania odpowiednich do danych komórek. W przypadku komórek prokariotycznych posiadających zasadnicze bariery ścian komórkowych, na ogół stosuje się obróbkę wapniową przy użyciu chlorku wapnia tak, jak to opisano w paragrafie 1.82 podręcznika Sambrooka i in. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nowy Jork, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]. Inny sposób przeprowadzania transformacji polega na zastosowaniu układu glikol polietylenowy/DMSO, jak to opisali Chung i Miller [Nucleic Acids Res., 16, 3580 (1988)]. Jeszcze inna metoda polega na wykorzystaniu techniki nazywanej elektroporacją. Komórki gospodarza transformuje się powyżej opisanymi wektorami według niniejszego wynalazku i hoduje w typowych pożywkach odżyw14

PL 208 884 B1 czych zmodyfikowanych odpowiednio do, ewentualnego, indukowania promotorów. Odpowiednie w tym zastosowaniu pożywki opisane są ogólnie, na przykład, w: Sambrook i in., supra. Można również włączyć dowolne inne niezbędne dodatki, albo jako takie, albo jako mieszaniny z innymi dodatkami lub pożywkami, takimi jak kompleksowe źródło azotu. Wartość pH pożywki może być dowolna w zakresie od około 5 do 9 i zależy głównie od rodzaju organizmu gospodarza.

Ekspresję genu można zmierzyć w próbce w jakikolwiek sposób, włącznie z metodami pośrednimi lub bezpośrednimi, na przykład typową techniką Northern blot, w celu oceny ilościowej transkrypcji mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5201 - 5205 (1980)]. Można użyć rozmaitych znaczników, przy czym najczęściej stosuje się izotopy promieniotwórcze, w szczególności ³²P. Jednakże, jeśli chodzi o wprowadzanie do polinukleotydów można posłużyć się też innymi metodami, takimi jak zastosowanie nukleotydów modyfikowanych biotyną. Biotyna służy jako miejsce wiązania awidyny lub przeciwciał, które mogą być znakowane najrozmaitszymi znacznikami, takimi jak radionuklidy, wskaźniki fluorescencyjne, enzymy itp.

Sposoby postępowania służące obserwacji czy wydzielany jest ulegający ekspresji lub nadekspresji produkt genu są łatwo dostępne dla specjalisty w tej dziedzinie. Po oddzieleniu pożywki hodowlanej od komórek gospodarza, na przykład za pomocą wirowania lub sączenia, produkt genu można poddać detekcji w pożywce bez komórek, lub w hodowli komórkowej, wykorzystując znane właściwości charakterystyczne dla produktu genu. Do właściwości takich należą odmienne właściwości immunologiczne, enzymatyczne lub fizyczne produktu genu.

I tak, na przykład, w przypadku gdy powstały w wyniku nadekspresji produkt genu wykazuje unikalną aktywność enzymatyczną, można poddać badaniu pod względem tej aktywności pożywkę hodowlaną wykorzystywaną przez komórki gospodarza, albo wyekstrahowany osad komórek. Ponadto, gdy dostępne są przeciwciała przeciw danemu produktowi genu, można ich użyć do detekcji produktu genu w jakimkolwiek znanym teście immunologicznym [na przykład tak, jako to opisali Harlowe i in. w: „Antibodies: A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press: Nowy Jork, 1988)].

W przypadku wydzielania produktu genu można go wykryć także przy użyciu testów umożliwiających rozróżnianie polipeptydów na podstawie charakterystycznych właściwości fizycznych, takich jak masa cząsteczkowa. W celu przeprowadzenia detekcji właściwości fizycznych produktu genu wszystkie polipeptydy nowo zsyntetyzowane przez komórkę gospodarza można oznakować, na przykład izotopem promieniotwórczym. Do zwykłych izotopów promieniotwórczych, których można używać do znakowania polipeptydów syntetyzowanych w komórkach gospodarza należy tryt (³H), węgiel 14 (¹⁴C), siarka 35 (³⁵S) itp.

I tak, na przykład, można przeprowadzić hodowlę komórki gospodarza w pożywce z ³⁵S-metioniną lub ³⁵S-cysteiną, przy czym znaczna ilość znacznika ³⁵S zostanie w ten sposób włączona do nowo syntetyzowanego polipeptydu, włącznie z polipeptydem heterologicznym utworzonym w wyniku nadekspresji. Następnie, zawierające ³⁵S pożywkę usuwa się i komórki przemywa, po czym umieszcza w świeżej, nieradioaktywnej pożywce hodowlanej. Po przetrzymaniu komórek w świeżej pożywce w czasie i w warunkach wystarczających do umożliwienia wydzielenia się znakowanego ³⁵S, powstałego w wyniku ekspresji polipeptydu heterologicznego, pożywkę hodowlaną zbiera się i oddziela od komórek gospodarza. Następnie oznacza się, w znany sposób, masę cząsteczkową wydzielonego, znakowanego polipeptydu obecnego w pożywce hodowlanej lub związanego z komórkami w osadzie komórek, z zastosowaniem znanych metod, na przykład elektroforezy w żelu poliakryloamidowym. Sposoby takie i/lub inne sposoby postępowania służące detekcji wydzielonych produktów genów, podał, na przykład D.V. Goeddel (red.) w „Gene Expression Technology”, Methods in Enzymology, tom 185 (1990) (Academic Press), oraz Sambrooka i in., supra.

W celu wydzielenia produktu genu powstałego w wyniku ekspresji lub nadekspresji, komórkę gospodarza hoduje się w warunkach dostatecznych do wydzielenia produktu genu. Warunki takie obejmują, na przykład, warunki temperaturowe, żywieniowe i dotyczące gęstości komórek, umożliwiające wydzielanie przez komórkę. Ponadto, warunkami takimi są te warunki, w których komórka może pełnić podstawowe funkcje komórki odnoszące się do transkrypcji, translacji i przemieszczania białek z jednego przedziału komórkowego do innego, co jest dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie techniki.

Jeżeli elementy wydzielnicze są właściwe, polipeptyd będący przedmiotem zainteresowania wyodrębnia się z periplazmy lub pożywki hodowlanej jako wydzielony polipeptyd. W celu otrzymania preparatów zasadniczo jednorodnych pod względem polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania często zalecane jest oczyszczenia polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania z rekombinacyjnych białek komórkowych lub polipeptydów i z czynnika antyterminacyjnego, lub białka

PL 208 884 B1

GreA lub GreB. W pierwszym etapie, pożywkę hodowlaną, lub lizat hodowli, można poddać wirowaniu z usunięciem drobnoziarnistych szczątek komórkowych. Następnie, jeżeli jest to potrzebne, można oddzielić frakcje błonowe i frakcje białek rozpuszczalnych. Następnie, polipeptyd można oczyścić z frakcji białek rozpuszczalnych i z frakcji błonowej lizatu hodowli, w zależności od tego, czy polipeptyd jest związany z błoną, czy jest rozpuszczalny, czy też obecny w postaci zagregowanej. Następnie, polipeptyd rozpuszcza się i (jeżeli to konieczne) fałduje, po czym oczyszcza z zanieczyszczających białek rozpuszczalnych i polipeptydów.

Jeden ze sposobów wyodrębniania egzogennego polipeptydu ze złożonej mieszaniny biologicznej, zawierającej polipeptydy i związki nie będące peptydami, zawartej w brzeczce fermentacyjnej, polega na kontaktowaniu odczynników z komórkami, dogodnie z hodowlą komórkową zawierającą polipeptyd w konformacji nienatywnej tak, że może zajść ekstrakcja/izolacja wodna. Dogodnie, sposób ten przewiduje bezpośrednie dodanie odczynników do naczynia fermentacyjnego po rekombinacyjnym wytworzeniu polipeptydu, co pozwala uniknąć dodatkowych etapów zbierania, homogenizacji i wirowania, w innych metodach koniecznych do uzyskania polipeptydu. Podczas gdy pozostałe substancje drobnoziarniste można usunąć z zastosowaniem podanej przez Gaulina metody homogenizacji, ponownego zawieszenia, sączenia lub ich kombinacji, w przytoczonym powyżej sposobie, do oczyszczenia rekombinowanych polipeptydów z pozostałych substancji drobnoziarnistych stosuje się wielofazowy system ekstrakcyjny.

Następujące sposoby postępowania są przykładowymi, odpowiednimi sposobami oczyszczania: frakcjonowanie na kolumnach immunopowinowactwa lub jonitowych; wytrącanie etanolem; HPLC z odwróconymi fazami; chromatografia na krzemionce lub na żywicy kationowymiennej, takiej jak DEAE; chromatoogniskowanie; SDS-PAGE; strącanie siarczanem amonu; oraz filtracja żelowa przy użyciu, na przykład, SEPHADEX™ G-75 medium z firmy Amersham Bioscences.

Wynalazek stanie się bardziej zrozumiały przez odniesienie się do następujących przykładów. Jednakże, nie należy ich interpretować jako ograniczających zakres wynalazku. Wszystkie przytoczone tu cytaty literaturowe i patentowe są włączone do niniejszego opisu jako odnośniki.

P r z y k ł a d 1

Wpływ systemu antyterminacji λΝ na wytwarzanie TPO (kolby do wytrząsania)

Materiały i metody.

Opis i konstrukcja wektorów ekspresyjnych E. coli.

Wszystkie plazmidy pMP331, pMP843, pMP871, pMP931, pMP951, pMP982, pMP945, pMP1016, pMP1086, pMP1099, pMP1201 i pMP1217 przeznaczone są do ekspresji dojrzałej TPO o pełnej długości [deSauvage i in., Nature, 369, 533 - 538 (1994)] w cytoplazmie E. coli przy użyciu wektora opartego na pBR.322 [Bolivar i in., Gene, 2, 95 - 113 (1977)]. Sekwencja kodująca TPO o 332 aminokwasach poprzedzana jest we wszystkich plazmidach przez sekwencję liderową złożoną z siedmiu pierwszych aminokwasów sekwencji sygnałowej termoopornej enterotoksyny II [Picken i in., Infect. Immun., 42, 269 - 275 (1983)], z następującymi po niej ośmioma resztami histydyny, a w końcu z miejscem cięcia trombiny IEPR (Nr identyfikacyjny sekw.: 6). Transkrypcja w plazmidach pMP331, pMP843, pMP871, pMP931, pMP945, pMP951, pMP982 i pMP1217 odbywa się pod kontrolą promotora trp [Yanofsky i in., Nucleic Acids Res., 9, 6647 - 6668 (1981)], podczas gdy plazmidy pMP1016, pMP1086, pMP1099, pMP1201 wykorzystują promotor AP [Kikuchi i in., Nucleic Acids Res., 9, 5671 5678 (1981)]. Bezpośrednio poniżej sekwencji kodującej TPO usytuowany jest terminator transkrypcyjny λΤ₀ [Scholtissek i in., Nucleic Acids Res., 15, 3185 (1987)].

Do dodatkowych elementów genetycznych na plazmidach pMP843, pMP871, pMP931 i pMP945 należy częściowe miejsce nutR kasety B λ (lub kaseta B), podczas gdy plazmidy pMP951, pMP982, pMP1086, pMP1201 i pMP1217 mają kompletne miejsce nutR kasety A i kasety B λ [Olson i in., Cell, 31, 61 - 70 (1982)] w miejscu, w którym rozpoczyna się informacja kodująca TPO. Plazmidy pMP871, pMP931, pMP945, pMP951, pMP982, pMP1086, pMP1201 i pMP1217 zawierają także gen dla białka λΝ [Franklin, J. Biol. Chem., 181, 75 - 84 (1984)]. W końcu, plazmidy pMP982, pMP1086, pMP1099 i pMP1201 zawierają sekwencję dla rzadko spotykanego argininowego tRNA, genu argU, (genu dnaY) [Garcia i in., Cell, 45, 453 - 459 (1986)].

Plazmid pDR1 przeznaczony jest do ekspresji białka GreB (Borukhov i in., Cell, supra) pod kontrolą promotora tacll [DeBoer i in. supra). Szkielet tego plazmidu tworzy pACYC177 [Chang i in.,

J. Bacteriol., 134, 1141 - 1156 (1978); Rose, Nucleic Acids Res., 16, 356 (1988)], umożliwiający zgodne utrzymywanie go w tej samej komórce E. coli z plazmidami opartymi na pBR322.

PL 208 884 B1

Plazmid pMP331.

Plazmid pMP331 jest pochodną plazmidu ekspresyjnego TPO, pMP202, (dokument patentowy WO 95/18858, opublikowany 13.07.1995). Mówiąc krótko, pMP202 przeznaczony jest do ekspresji pierwszych 155 aminokwasów TPO poniżej sekwencji liderowej obejmującej siedem aminokwasów sekwencji sygnałowej STII, osiem histydyn i miejsce cięcia trombiny. Plazmid pMP331 rozciąga sekwencję kodującą TPO od 155 do 332 aminokwasów.

Trzy fragmenty DNA zligowano ze sobą z utworzeniem pmP331, jak to przedstawiono na fig. 1, przy czym pierwszym z nich był duży fragment wektora pdh108 poprzednio przeciętego Xbal i Stul. Wektor pdh108 pochodzi od wektora pHGH207-1 [DeBoer i in., „Promoters: Structure and Function” (Praeger: Nowy Jork, 1982), str. 462 - 481)] i zawiera transkrypcyjny terminator Xto poniżej promotora trp. Drugą część stanowił złożony z 431 par zasad fragment XbaI-BamHI plazmidu pMP202 kodujący pierwsze 122 aminokwasy TPO. Trzecią częścią był zawierający w przybliżeniu 669 par zasad fragment BamHI-Rsal z phmp11 [deSauvage i in., Nature, 369, 353 - 558 (1994)], kodujący drugą połowę genu TPO.

Plazmid pMP843.

Plazmid pMP843 stanowi wynik dodania kasety λ nutB (nutR kasety B) poniżej promotora trp w plazmidzie pMP331. Dwa fragmenty zligowano ze sobą z utworzeniem pMP843, jak to przedstawiono na fig. 2, przy czym pierwszym z nich był pMP331, z którego usunięto mały fragment Spel-SacI. Drugi stanowił fragment Spel-SacI o 642 parach zasad, otrzymany przez zligowanie syntetycznego dupleksu (syntetycznego dwuniciowego) DNA z pochodzącym od pMP331 fragmentem Xbal-SacI o 582 parach zasad. Syntetyczny dupleks DNA miał następującą sekwencję:

5'-CTAGTTAACTAGTACGCATTCCAGCCCTGAAAAAGGGCAAAGTTCACGTAAAAAGGATAT

AATTGATCATGCGTAAGGTCGGGACTTTTTCCCGTTTCAAGTGCATTTTTCCTATAGATC-5' (Nr identyfikacyjny sekw.: (odpowiednio) 7 i 8).

Plazmid pMP871.

Plazmid pMP871 pochodzi od pMP843 i zawiera gen dla białka λN policistronowo sprzężony poniżej sekwencji kodującej TPO.

Plazmid pMP871 skonstruowano sposobem przedstawionym na fig. 3, za pomocą zligowania ze sobą trzech fragmentów DNA, przy czym pierwszym z nich był wektor pMP843, z którego usunięto mały fragment Sacl-Nhel. Drugi stanowił fragment SacI-FokI, zawierający w przybliżeniu 500 par zasad, otrzymany za pomocą wstępnego zligowania syntetycznego dupleksu DNA z zawierającym 459 par zasad fragmentem SacI-AlwNI z pMP843 kodującym aminokwasy 174 - 327 TPO. Syntetyczny dupleks DNA miał następującą sekwencję:

5'-CTGTCTCAGGAAGGGTAAGCTTTTATGGATGCACAAACAC

TTAGACAGAGTCCTTCCCATTCGAAAATACCTACGTGTTTGTGCGGC-5' (Nr identyfikacyjny sekw.: (odpowiednio) 9 i 10).

Końcową część produktu ligowania stanowił zawierający w przybliżeniu 657 par zasad fragment Fokl-Nhel pochodzący z dostępnego w handlu wektora pPL-8 (Pharmacia Biotech Inc.), kodujący aminokwasy 7 - 107 białka Ż-N.

Plazmid pMP931.

Plazmid pMP931 jest pochodną plazmidu pMP843, w którym umieszczony jest gen ŻN pod kontrolą promotora tacll. Jak to przedstawiono na fig. 4, pMP931 skonstruowano przez zligowanie ze sobą trzech fragmentów DNA. Pierwszym z nich był wektor pMP843, z którego usunięto mały fragment Clal-Nhel. Drugi stanowił zawierający w przybliżeniu 100 par zasad fragment HinPI-Hindlll z plazmidu pKMTacII [deBoer i in., (1983) supra] zawierający promotor tacll. Trzecią część użytą do ligacji stanowił zawierający 684 par zasad fragment H/ndlll-Nhel z pMP871, kodujący gen ŻN.

Plazmid pMP945.

Plazmid pMP945 stanowi pochodną pMP931, w którym ekspresji genu ŻN z promotora tacll towarzyszy pełna sekwencja Shine-Dalgarno w celu uzyskania wyższego poziomu translacji. Jak to przedstawiono na fig. 5, plazmid ten skonstruowano za pomocą zligowania ze sobą trzech fragmentów DNA, przy czym pierwszym z nich był duży fragment wektora otrzymany przez strawienie pMP931 przy użyciu H/ndlll i Nhel. Drugi fragment stanowił syntetyczny dupleks DNA o następującej sekwencji: 5'-AGCTTAGGATTCTAGAATTATGGATGCACAAACAC

ATCCTAAGATCTTAATACCTACGTGTTTGTGCGGC-5' (Nr identyfikacyjny sekw.: (odpowiednio) 11 i 12).

PL 208 884 B1

Ostatnią częścią był zawierający 657 pz fragment Fokl-Nhel, zastosowany do konstrukcji pMP871. Plazmid pMP951.

Plazmid pMP951 pochodzi od pMP931 i dodatkowo zawiera kompletne miejsce nut (zarówno kasety A, jak i kasety B). Jak to przedstawiono na fig. 6, pMP951 skonstruowano za pomocą zligowania ze sobą dwóch fragmentów DNA. Pierwszym z nich był wektor pMP931, z którego usunięto mały fragment AatII-XbaT. Drugi otrzymano za pomocą wstępnego zligowania syntetycznego dupleksu DNA z zawierającym 322 pary zasad fragmentem Aatll-Spel z pMP931. Syntetyczny dupleks DNA miał następującą sekwencję:

5'-CTAGTTAACTAGTACGCAACGCTCTTACACATTCCAGCCAATTGATCATGCGTTGCGAGAATGTGTAAGGTCGG-CTGAAAAAGGGCAAAGTTCACGTAAAAAGGATAT (Nr identyfikacyjny sekw.: 13)

-GACTTTTTCCCGTTTCAAGTGCATTTTTCCTATAGATC-5' (Nr identyfikacyjny sekw.: 14)

Plazmid pMP982.

Plazmid pMP982 jest pochodną pMP951 z dodaniem genu argU na plazmidzie poniżej genu λΝ. Jak to przedstawiono na fig. 7, plazmid ten skonstruowano za pomocą zligowania ze sobą dwóch fragmentów DNA. Pierwszym z nich był wektor pMP951, z którego usunięto mały fragment Nhel-SphI, i w którym miejsce Nhel stępiono przez potraktowanie polimerazą I DNA (Klenow). Drugą część stanowił zawierający 440 par zasad fragment Clal-SphI z pST141, w którym miejsce ClaI stępiono przez potraktowanie polimerazą I DNA (Klenow). pST41 jest pochodną plazmidu pHGH207-1 [DeBoer i in., (1983), supra)] przy czym fragment ten koduje tylko gen argU [Garcia i in., Cell, 45, 453 - 459 (1986)]. Plazmid pMP1016.

Plazmid pMP1016 jest pochodną pMP331, w którym promotor trp został zastąpiony promotorem AP. Plazmid ten skonstruowano sposobem przedstawionym na fig. 8 za pomocą zligowania ze sobą dwóch fragmentów DNA. Pierwszym z nich był wektor pST182, z którego usunięto mały fragment Xbal-Sphl. Plazmid pST182 jest pochodną phGH1 [Chang i in., Gene, 55, 189 - 196 (1987)], przy czym ten ostatni wektor sam mógł być wykorzystany zamiast generowania wspomnianego fragmentu DNA. Drugą część użytą do ligacji stanowił zawierający 1791 par zasad fragment Xbal-SphI z pMP331, kodujący gen TPO i terminator transkrypcyjny XtoPlazmid pMP1086.

Plazmid pMP1086 pochodzi z pMP982, w którym zamiast promotora trp występuje promotor AP. Zligowano ze sobą trzy fragmenty DNA w celu skonstruowania pMP1086, jak to przedstawiono na fig. 9. Pierwszym z nich był wektor pST182, z którego usunięto mały fragment Spel-SphI. Plazmid pST182 jest pochodną phGH1 (Chang i in., Gene, supra) i ten ostatni wektor sam mógł być wykorzystany zamiast generowania wspomnianego fragmentu. Drugą część użytą do ligacji stanowi zawierający 647 par zasad fragment Spel-SacI z pMP982 kodujący miejsce nut i 173 pierwszych aminokwasów TPO. Trzecią częścią był zawierający 1809 par zasad fragment Sacl-Sphl z pMP982 kodujący aminokwasy 174 - 332 TPO i zawierający terminator Xto, gen λΝ i gen argU.

Plazmid pMP1099.

Plazmid pMP 1099 pochodzi z pMP1016 i dodatkowo zawiera gen argU poniżej terminatora transkrypcyjnego λν Jak to przedstawiono na fig. 10, skonstruowano go za pomocą zligowania ze sobą dwóch fragmentów DNA. Pierwszym z nich był wektor pMP1016, z którego usunięto mały fragment Sacl-Sphl. Drugi stanowił zawierający 1020 par zasad fragment SacI-SphI z plazmidu pMP591, kodujący ostatnie 159 aminokwasów TPO, terminator transkrypcyjny λ^ i gen argU. Plazmid pMP591 stanowi pochodną pMP331 z dodaniem genu argU bezpośrednio poniżej terminatora transkrypcyjnego λν Plazmid pMP1201.

Plazmid pMP1201 jest pochodną pMP1086, w której ekspresji genu λΝ z promotora tacll towarzyszy pełna sekwencja Shine-Dalgarno w celu uzyskania wyższego poziomu translacji. Jak to przedstawiono na fig. 11, plazmid ten skonstruowano za pomocą zligowania ze sobą trzech fragmentów DNA, przy czym pierwszym z nich był duży fragment wektora otrzymany za pomocą strawienia pMP1086 przy użyciu SacI i SphI. Drugi stanowił zawierający 1007 par zasad fragment Sacl-Clal z pMP945, zawierający promotor tacll z pełną sekwencją Shine-Dalgarno i większość genu λΝ. Ostatnim elementem był zawierający 814 par zasad fragment Clal-SphI, otrzymany za pomocą całkowitego strawienia pMP1086 przy użyciu SphI i częściowego przy użyciu ClaI.

PL 208 884 B1

Plazmid pMP1217.

Plazmid pMP1217 jest pochodną pMP951, i w tym przypadku ekspresji genu λN z promotora tacll towarzyszy pełna sekwencja Shine-Dalgarno w celu uzyskania wyższego poziomu translacji. Jak to przedstawiono na fig. 12, plazmid ten skonstruowano za pomocą zligowania ze sobą dwóch fragmentów DNA. Pierwszy z nich stanowił duży fragment wektora z pMP951 po trawieniu z udziałem Hindlll i HincII. Drugim był zawierający 696 par zasad fragment Hindlll-Nhel z pMP945 kodujący pełną sekwencję Shine-Dalgarno poprzedzającą gen Ż-N.

Plazmid pJJ142.

Plazmid pJJ142 jest produktem pośrednim w konstruowaniu pDR1 i otrzymano go za pomocą zligowania ze sobą dwóch fragmentów DNA, jak to przedstawiono na fig. 13. Pierwszym z nich był plazmid pACYC177, z którego usunięto mały fragment Aatll-HincII. Drugą część użytą do ligacji stanowił zawierający 1021 par zasad fragment Aatll-Clal z pJJ41 (patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5639635), w którym miejsce Clal stępiono przez potraktowanie polimerazą I DNA (Klenow). Ten ostatni fragment koduje promotor tacll poprzedzający gen dsbC.

Plazmid pDR1.

Plazmid pDR1 przeznaczony jest do ekspresji GreB pod kontrolą promotora tacll. pDR1 skonstruowano, jak to przedstawiono na fig 14, za pomocą zligowania dwóch fragmentów DNA. Pierwszym z nich był wektor pJJ142, z którego usunięto mały fragment Xbal-Pstl. Drugą część stanowił zawierający 488 par zasad fragment Xbal-Pstl, zawierający gen greB. Fragment ten wytworzono za pomocą, wpierw, amplifikacji sekwencji kodującej greB metodą PCR z zastosowaniem chromosomowego DNA E. coli, a następnie trawienia otrzymanej mieszaniny przy użyciu Xbal i Pstl. Do przeprowadzenia tego etapu użyto następujących starterów:

5'-CCCCCCCCCTCTAGAAAAATGAAAACTCCTCTGGTAACGCGGGAAGGG (Nr identyfikacyjny sekw.: 15)

5'-CCCCCCCCCCTGCAGTTACGGTTTCACGTACTCGATAGC (Nr identyfikacyjny sekw.: 16) Plazmid pDR3.

Plazmid pDR3 przeznaczony jest do ekspresji GreA pod kontrolą promotora tacll. pDR3 skonstruowano sposobem przedstawionym na fig. 15, za pomocą zligowania dwóch fragmentów DNA. Pierwszym z nich był wektor pJJ142, z którego usunięto mały fragment Xbal-Pstl. Drugą część stanowił zawierający 491 par zasad fragment Xbal-Pstl zawierający gen greA. Fragment ten wytworzono za pomocą, wpierw, amplifikacji sekwencji kodującej greA metodą PCR z zastosowaniem chromosomowego DNA E. coli, a następnie trawienia otrzymanej mieszaniny przy użyciu Xbal i Pstl. Do przeprowadzenia tego etapu użyto następujących starterów:

5'-CCCCCCCCCTCTAGAATTCTATGCAAGCTATTCCGATGACCTTA (Nr identyfikacyjny sekw.: 17)

5'-CCCCCCCCCCTGCAGTTACAGGTATTCCACCTTAAT (Nr identyfikacyjny sekw.: 18)

Szczep gospodarza E. coli.

W doświadczeniach nad transformacją użyto szczepu 52A7, będącego pochodną szczepu W3110 (ATCC 27325), o następującym genotypie:

ΟηΑΔ (fhuAA) ΙοηΔ galE rpoHts (htpRts) .\clpP lacIq.

Transformacja i hodowla.

W celu stwierdzenia, czy antyterminacja ŻN wywiera jakikolwiek wpływ na skrócenie TPO i znakowanie jej 10Sa, do szczepu 52A7 transformowano wektor ekspresyjny pMP331 trp i plazmidy antyterminacyjne z niskim (pMP951) i wysokim (pMP1217) poziomem ekspresji N, z zastosowaniem typowych sposobów postępowania. Wszystkie tak otrzymane transformanty hodowano w pożywce Luria Broth (LB) z ampicyliną, przez noc, w temperaturze 30°C, po czym hodowlę rozcieńczono 20x w pożywkach M9 z Casamino Acids, zawierających także ampicylinę. Po upływie mniej więcej 6 godzin w temperaturze 30°C, z wytrząsaniem, gęstość optyczna hodowli (600 nm) mieściła się w zakresie od 2 do 2,5. Do dwu hodowli antyterminacyjnych pMP951 i pMP1217 wprowadzono 1 mM izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Następnie, wszystkie hodowle prowadzono jeszcze przez 15 godzin, przy wytrząsaniu, w temperaturze 30°C, po czym pobrano z nich próbki, przygotowano je do badania sposobem opisanym przez Yansure i in. [Methods in Mol. Biol., 62, 44 - 62 (1997)] i poddano analizie metodą SDS-PAGE.

Następnie, przetestowano ekspresję zachodzącą z udziałem promotora AP, aby zbadać, czy podobne wyniki otrzyma się z antyterminacją ŻN. Wpierw, plazmid ekspresyjny AP, pMP1099, i plazmidy antyterminacyjne o niskim (pMP1086) i wysokim (pMP1201) poziomie ekspresji N transformoPL 208 884 B1 wano do E. coli szczep 52A7. Transformanty z początku rosły w pożywkach LB zawierających ampicylinę, P przez noc, w temperaturze 30°C, po czym rozcieńczano je 100x w pożywkach limitujących fosforany, nazywanych C.R.A.P., także zawierających ampicylinę [pożywka C.R.A.P. zawiera 3,57 g (NH4)2SO4, 0,71 g cytrynianu sodu.2 H2O, 1,07 g KCl, 5,36 g ekstraktu drożdżowego (Certified), 5,36 g kazeiny (HY-CASE^® SF refined acid-hydrolysed casein, Quest International), 110 ml kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS) pH 7,3, 11 ml 50 % roztworu glukozy i 7 ml 1M MgSO4, w końcowej objętości 1 litra]. Po zakończeniu mniej więcej 6-godzinnej hodowli w temperaturze 30°C, hodowle osiągnęły wartość absorbancji (gęstości optycznej, O.D.) przy 600 nm mieszczącą się w zakresie od 1,5 do 2,0. Do dwu plazmidów antyterminacyjnych dodano IPTG. Następnie, wszystkie hodowle prowadzono jeszcze przez 15 godzin, przy wytrząsaniu, w temperaturze 30°C, po czym pobrano z nich próbki, przygotowano je do badania sposobem opisanym odnośnie wektorów trp i poddano analizie metodą SDS-PAGE.

Wyniki

Wytwarzanie TPO przy użyciu plazmidów kontrolnych pMP331 i pMP1099.

Ekspresja TPO [de Sauvage i in., Nature, 369, 533 - 538 (1994)] zachodziła w cytoplazmie E. coli szczepu 52A7 pod kontrolą obu promotorów, tak trp (pMP331), jak i AP (pMP1099) z niewielką N-końcową sekwencją liderową polihis, dla zapewnienia łatwiejszego oczyszczania. Zaindukowanie tak promotora trp jak i promotora AP prowadziło do wytwarzania białka pokrewnego TPO, które można było wykrywać przy wykorzystaniu ekstraktów z pełnych komórek barwionych barwnikiem Coomassie, oddzielanych metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z siarczanem dodecylu sodu (SDSPAGE), jak to pokazano na fig. 16A.

Oprócz pasma oczekiwanego białka, TPO o pełnej długości, w przypadku liderowej sekwencji polihis, przy 37 kD, stwierdzono obecność szeregu innych zaindukowanych białek o mniejszej masie cząsteczkowej. Najbardziej godne zauważenia są białka o masie cząsteczkowej wynoszącej, w przybliżeniu 25, 18 i 14 kD. W celu ustalenia, czy te pasma o niższej masie cząsteczkowej były pokrewne TPO, ekstrakty pełnych komórek ponownie rozdzielono metodą SDS-PAGE, przeniesiono na nitrocelulozę i sondowano przy użyciu środka wiążącego się z motywem polihis na sekwencji liderowej [„INDIA™ metal-chelated histidine probe bound to HRP” (HisProbe-HRP) oferowana przez firmę Pierce Chemical Company], jak to przedstawiono na fig. 16B. Otrzymane wyniki potwierdziły, że poprzednio zanotowane pasma o niższej masie cząsteczkowej rzeczywiście były pokrewne TPO, a także potwierdziły, że o wiele poważniejsze problemy związane ze skracaniem występują na C-końcu białka.

W celu upewnienia się co do tego, czy te wielokrotne skrócone formy TPO są wynikiem rozkładu białka o pełnej długości zawierającego liderową sekwencję poliHis, czy też może są od początku syntetyzowane w tej właśnie formie, wykonano analizę z wprowadzaniem i wypieraniem znacznika promieniotwórczego (ang. pulse-chase analysis) przy użyciu tego samego konstruktu plazmidowego. Nie wiążąc się jakąkolwiek teorią można powiedzieć, że otrzymane wyniki nasuwają sugestię, iż najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem była ta druga możliwość. Powstawanie skróconych form TPO można wyraźnie zaobserwować dzięki temu, że pojawiają się one w bardzo wczesnym czasie wprowadzania i wypierania znacznika, mieszczącym się w zakresie od 0,5 do 1 minuty i utrzymują w trakcie eksperymentu do 6 minut. Nie stwierdzono żadnego oczywistego ruchu białka pokrewnego TPO od pełnej długości do postaci skróconych lub na odwrót, co sugeruje, że postacie o niższej masie cząsteczkowej były wytwarzane bezpośrednio w trakcie syntezy białka. Jednym z możliwych wytłumaczeń, które należało wykluczyć, była nietrwałość plazmidu, a w szczególności delecje w sekwencji kodującej TPO. Tak więc, wyodrębniono DNA plazmidowe za pomocą hodowli z indukcją i otrzymany DNA, po trawieniu z udziałem szeregu endonukleaz restrykcyjnych, poddano analizie metodą PAGE. Oprócz tego, w podobny sposób przebadano pojedyncze kolonie z hodowli z indukcją. We wszystkich przypadkach nie znaleziono dowodu na jakiekolwiek zmiany plazmidu, w szczególności w sekwencji kodującej TPO.

W końcu, przebadano możliwość wytwarzania fragmentów skróconego TPO na drodze translacji skróconego mRNA. Poprzednio wykazano, że takie fragmenty białka zawierają C-końcowy, 11-aminokwasowy znacznik kodowany przez małą ramkę odczytu w 10Sa RNA (Tu i in., supra; Keller i in., supra). Do sondowania ekstraktów pełnych komórek z hodowli z indukcją TPO zastosowano poliklonalne przeciwciało przeciw chemicznie zsyntetyzowanemu znacznikowi. Wyniki uwidocznione na fig. 16C jasno pokazują, że większość fragmentów skróconego TPO zawierała 10Sa, 11-aminokwasowy znacznik, i można powiedzieć (bez wiązania się jakąkolwiek teorią), że sugeruje to, iż mRNA TPO jest skrócony lub uszkodzony.

PL 208 884 B1

Wytwarzanie TPO przy użyciu systemu antyterminacyjnego i wpływ na naznaczanie 10Sa.

Aczkolwiek ekspresja TPO o pełnej długości przy użyciu N-końcowej sekwencji liderowej poliHis była względnie wysoka, tak dla promotora trp jak i promotora AP, nagromadzanie się skróconych form TPO w znacznym stopniu przeszkadzało oczyszczaniu białka. Ponieważ wszystkie formy skrócone zawierają N-końcową sekwencję liderową poliHis, zostają one oczyszczone razem z białkiem o pełnej długości na kolumnie do chromatografii z chelatacją metalu. Toteż, eliminacja tych skróconych postaci staje się ważnym czynnikiem przy oczyszczaniu i wytwarzaniu białka takiego jak TPO.

Pomimo niepowodzenia przeprowadzenia antyterminacji rrnB do tego celu (Makrides, supra), w przykładzie tym użyto odmiennego środka antyterminacji transkrypcji, ŻN, w celu zminimalizowania lub wyeliminowania skrócenia i znakowania TPO 10Sa, za pomocą stymulowania transkrypcji poza wewnątrzgenowe sygnały terminacji w obrębie sekwencji kodującej TPO.

Włączenie antyterminacji ŻN.

W celu włączenia antyterminacji ŻN do systemów ekspresyjnych trp i AP dla TPO, wpierw wstawiono do plazmidów sekwencję wykorzystania N (nutL), w położeniach odpowiadających początkowi mRNA TPO. Aktualny wzór tych sekwencji, włącznie z promotorami powyżej („w górę”) i sekwencją liderową polihis poniżej, przedstawiono na fig. 17. Następnie, do plazmidów tych wstawiono gen ŻN poniżej sekwencji kodującej TPO i terminatora transkrypcyjnego Żto. Ekspresję N umieszczono pod kontrolą promotora tacll [deBoer i in., 1983), supra], i skonstruowano plazmidy z sekwencjami ShineDalgarno tacll, lub bez nich. Taka odmiana translacji N zapewniała łatwy sposób obserwacji dwóch różnych poziomów ekspresji N i ich następczych oddziaływań na ekspresję TPO. Częściowe sekwencje pokazujące promotor tacll z sekwencją Shine-Dalgarno i bez niej przedstawiono na fig. 18.

Wpływ antyterminacji ŻN na ekspresję TPO.

Barwienie barwnikiem Coomassie żelów SDS w przypadku plazmidów ekspresyjnych trp pMP331, pMP951 i pMP1217 potwierdziło przede wszystkim zwiększenie ekspresji TPO o pełnej długości, zarówno w przypadku niskiego (pMP951) jak i wysokiego (pMP1217) poziomu ekspresji, w porównaniu z kontrolą (pMP331), jak to przedstawiono na fig. 19A. Analiza żelu SDS, po przeniesieniu na nitrocelulozę i sondowaniu sondą HisProbe-HRP, wykazała nie tylko zwiększenie ekspresji TPO o pełnej długości, ale także znaczący spadek tworzenia się skróconych form TPO dla obu plazmidów antyterminacyjnych (fig. 19B). W końcu, analiza żelu po przeniesieniu na nitrocelulozę i sondowaniu przeciwciałem przeciw znacznikowi 10Sa także wykazała znaczący spadek nagromadzania się skróconych i znakowanych 10Sa form TPO dla obu plazmidów antyterminacyjnych (fig. 19C).

Barwienie barwnikiem Coomassie żelów SDS dla plazmidów ekspresyjnych AP pMP1099, pMP1086 i pMP1201 potwierdziło podwyższenie się poziomu TPO o pełnej długości dla obu plazmidów antyterminacyjnych w porównaniu z plazmidem kontrolnym pMP1099, jak było to widoczne w przypadku plazmidów trp (fig. 20A). Po przeniesieniu na nitrocelulozę i sondowaniu sondą HisProbe-HRP można było zaobserwować wzrost poziomu TPO o pełnej długości, jak również znaczące zmniejszenie ekspresji skróconych form TPO (fig. 20B). W podobnej analizie, sondowanie z zastosowaniem przeciwciała anty-10Sa wykazało, dla obu plazmidów antyterminacyjnych, zmniejszenie nagromadzania się skróconych i znakowanych 10Sa form TPO (fig. 20C).

Wnioski.

Na podstawie przedstawionych powyżej wyników doświadczeń w kolbach do wytrząsania staje się oczywiste, że obecność antyterminacji ŻN, tak w przypadku dużej, jak i niewielkiej ilości białek N, przy użyciu każdego promotora, powoduje zwiększenie miana polipeptydu. Następnie, obecność systemu antyterminacyjnego białka ŻN, tak w przypadku dużej, jak i niewielkiej ilości każdego promotora, powoduje zmniejszenie ilości białka znakowanego 10Sa wytwarzanego przez komórki.

P r z y k ł a d 2

Wpływ systemu antyterminacyjnego ŻN na wytwarzanie TPO (fermentor)

Materiały i metody.

Transformacja.

Szczep 52A7 transformowano każdym spośród plazmidów pMP331, pMP951, pMP1099 lub pMP1086 (przy czym wszystkie one są opisane w powyższym przykładzie 1) z zastosowaniem typowych sposobów postępowania, z udziałem, gdy jest to właściwe, ampicyliny lub tetracykliny.

Hodowla komórek transformowanych.

Przykład dla pMP331 i pMP951.

PL 208 884 B1

Przeprowadzono fermentację w skali 10 litrów przy użyciu pożywki o następującym składzie, z zaznaczonymi modyfikacjami. Zestaw soli odpowiedni dla fermentacji w skali 10 litrowej składał się z następujących soli:

Sól Gramy

Siarczan (VI) amonu 50,0

Wodorofosforan (V) potasu 60,0

Dihydrat monowodorofosforanu (V) sodu 30,0

Dihydrat cytrynianu sodu 10,0

Oprócz soli, do fermentora wprowadzono 5 g L-izoleucyny i 3 ml 25% roztworu przeciwpieniącego poliolu PLURONIC^® L-61 (BASF Corporation). Fermentor wyjałowiono wraz z zawartością i dodano 5 - 6,5 litra wody dejonizowanej. Po schłodzeniu fermentora i zawartości dodano składniki wprowadzane po wyjaławianiu (tak zwane „posterylne”). Do składników posterylnych należały: 15 ml 50% roztworu glukozy, 70 ml 1 M siarczanu magnezu, 5 ml pierwiastków śladowych (receptura poniżej), 250 ml 20% roztworu kazeiny poddanej hydrolizie kwasowej HY-CASE^®, 250 ml 20% roztworu ekstraktu drożdżowego i 250 ml roztworu 2 mg/ml ampicyliny. Po inokulacji, wyjściowa objętość zawartości fermentora wynosiła zazwyczaj 8,5 litra.

Fermentor inokulowano 500 ml 16 - 20-godzinnej hodowli prowadzonej w pożywce LB, przy mieszaniu, w temperaturze 30°C. Hodowla LB rozwijała się w obecności ampicyliny. 10-litrową hodowlę mieszano przy 750 obr/min i napowietrzano przy 10 slpm. Wartość pH hodowli utrzymywano na poziomie 7,0 - 7,3 za pomocą automatycznego dodawania wodorotlenku amonu. Temperaturę utrzymywano na poziomie 30°C. Po wyczerpaniu początkowej zawartości glukozy w hodowli, rozpoczynano zasilanie jej glukozą i utrzymywano je na takim poziomie, aby zapobiegać wygłodzeniu komórek, a zarazem unikać nagromadzania się glukozy w pożywce.

Wzrost hodowli monitorowano przez pomiar absorbancji (gęstości optycznej, O.D.) przy długości fali 550 nm. Gdy O.D. hodowli osiągała poziom 25 - 35, dodawano 25 ml 25 mg/ml roztworu kwasu 3-e-indoloakrylowego (IAA) i 2 - 50 ml 200 mM roztworu IPTG (tylko w przypadku pMP951). Pastę komórek zebrano za pomocą odwirowania po upływie 14 - 18 godzin od dodania IAA.

Pierwiastki śladowe	Ilość
Kwas chlorowodorowy	100 ml
Heksahydrat chlorku żelaza (III)	27 g/litr
Heptahydrat siarczanu (VI) cynku	8 g/litr
Heksahydrat chlorku kobaltu (II)	7 g/litr
Molibdenian (VI) sodu	7 g/litr
Pentahydrat siarczanu (VI) miedzi (II)	8 g/litr
Kwas borowy	2 g/litr
Monohydrat siarczanu (VI) manganu (II)	5 g/litr
Woda dejonizowana	do 1 litra

Przykład dla pMP1099 i pMP1086.

Sól Gramy

Siarczan (VI) amonu 50,0

Wodorofosforan (V) potasu 26,0

Dihydrat monowodorofosforan (V) sodu 13,0

Dihydrat cytrynianu sodu 10,0

Chlorek potasu 15,0

Oprócz soli, do fermentora wprowadzono 5 g L-izoleucyny i 3 ml 25% roztworu przeciwpieniącego poliolu PLURONIC^® L-61 (BASF Corporation). Fermentor wyjałowiono wraz z zawartością i dodano 5 - 6,5 litra wody dejonizowanej. Po schłodzeniu fermentora i zawartości dodano składniki wpro22

PL 208 884 B1 wadzane po wyjaławianiu (tak zwane „posterylne”). Do składników posterylnych należało 15 ml 50% roztworu glukozy, 70 ml 1 M siarczanu magnezu, 5 ml pierwiastków śladowych (receptura poniżej), 250 ml 20% roztworu kazeiny poddanej hydrolizie kwasowej HY-CASE^®, 250 ml 20% roztworu ekstraktu drożdżowego i 250 ml roztworu 2 mg/ml ampicyliny. Po inokulacji, wyjściowa objętość zawartości fermentora wynosiła zazwyczaj 8,5 litra.

Fermentor inokulowano 500 ml 16 - 20-godzinnej hodowli prowadzonej na pożywce LB, przy mieszaniu, w temperaturze 30°C. Hodowla LB rozwijała się w obecności ampicyliny. 10-litrową hodowlę mieszano przy 750 obr/min i napowietrzano przy 10 slpm. Wartość pH hodowli utrzymywano na poziomie 7,0 - 7,3 za pomocą automatycznego dodawania wodorotlenku amonu. Temperaturę utrzymywano na poziomie 30°C. Po wyczerpaniu początkowej zawartości glukozy w hodowli, rozpoczynano zasilanie jej glukozą i utrzymywano je na takim poziomie, aby zapobiegać wygłodzeniu komórek, a zarazem unikać nagromadzania się glukozy w pożywce.

Wzrost hodowli monitorowano przez pomiar O.D. przy długości fali 550 nm. Gdy O.D. hodowli osiągnęła poziom 25 - 35, dodawano 2 - 50 ml 200 mM roztworu IPTG (tylko w przypadku pMP1086). Pastę komórek zebrano za pomocą odwirowania po upływie 20 - 30 godzin od inokulacji IAA.

Pierwiastki śladowe	Ilość
Kwas chlorowodorowy	100 ml
Heksahydrat chlorku żelaza (III)	27 g/litr
Heptahydrat siarczanu (VI) cynku	8 g/litr
Heksahydrat chlorku kobaltu (II)	7 g/litr
Molibdenian (VI) sodu	7 g/litr
Pentahydrat siarczanu (VI) miedzi (II)	8 g/litr
Kwas borowy	2 g/litr
Monohydrat siarczanu (VI) manganu (II)	5 g/litr
Woda dejonizowana	do1 litra

Tworzenie poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał przeciw peptydowi 10Sa.

W celu utworzenia przeciwciał zsyntetyzowano następujący peptyd: CAANDENYALAA (Nr identyfikacyjny sekw.: 19). Obecna jest tu N-końcowa cysteina aby umożliwić sprzęganie peptydu, albo z KLH albo z inhibitorem trypsyny z soi, albo z innym odpowiednim partnerem sprzęgania. Pozostałe reszty kodowane są przez gen ssrA z E. coli i ulegają translacji, w wyniku czego otrzymuje się peptyd 10Sa. Powyższy peptyd został zsyntetyzowany i sprzężony z KLH przez Zymed Corporation i zastosowany jako antygen dla wzbudzenia przeciwciał tak u królików, jak i u myszy.

Przeciwciała swoiste wobec peptydu 10Sa otrzymano z udziałem albo surowicy pobranej od królików z wstrzykniętym antygenem, albo płynu puchlinowego pobranego od myszy. Surowicę lub płyn puchlinowy przepuszczono przez kolumnę do chromatografii powinowactwa, ze związanym na niej syntetycznym peptydem 10Sa. Swoiste przeciwciała wyeluowano z kolumny do chromatografii powinowactwa 10Sa stosując niskie wartości pH.

Ocena ilościowa TPO znakowanej 10Sa i o pełnej długości.

Białka fuzyjne TPO otrzymane przy użyciu plazmidów pMP331, pMP951, pMP1099 i pMP1086 ekstrahowano z osadów pełnych komórek przy użyciu buforu zawierającego 7,5 M chlorowodorku guanidyny, 0,1 M siarczanu (IV) sodu, 0,02 M tetrationianu sodu i 50 mM buforu Tris, pH 8,0. Ekstrakcje te kontynuowano przez 1 - 16 godzin przy mieszaniu w temperaturze pokojowej. Otrzymany w wyniku ekstrakcji roztwór sklarowano za pomocą wirowania i supernatant poddawano dializie przez 1 - 16 godzin w temperaturze 4°C wobec buforu zawierającego 6 M GuHCl i 20 mM bufory Tris, pH 7,5. Zawierające poliHis białka z dializatu poddano oczyszczaniu z zastosowaniem kolumny do chromatografii z chelatacją (Talon Metal Affinity Resins, Clontech). Białko wyeluowane z kolumny poddano SDS-PAGE, przeniesiono na nitrocelulozę i sondowano przeciwciałem poliklonalnym wzbudzonym albo przeciw TPO153 (dokument patentowy WO 95/18858, opublikowany 13.07.1995), albo przeciw peptydowi 10Sa. Następnie, bloty skanowano przy użyciu densytometru laserowego ze wzmocnioną

PL 208 884 B1 optyką (PDI Inc., model 325oe). Oznaczano obszar maksimum dla TPO o pełnej długości, jak również innych form TPO reagujących krzyżowo z poliklonalnym przeciwciałem z TPO154.

Wyniki.

Wyniki tych analiz zamieszczono w poniższej tabeli 1. Obliczono wzajemny stosunek ilościowy TPO o pełnej długości do wszystkich innych form TPO i wynik podano jako % TPO. Oprócz tego, obliczono także całkowite pole pod pikiem wykryte na blocie sondowanym przeciwciałem poliklonalnym wzbudzonym przeciw peptydowi 10Sa i wyniki podano jako 10Sa tag.

T a b e l a 1

Wpływ konstruktu plazmidowego na akumulację TPO332 i znakowanie 10Sa

Plazmid	Miejsce Nut	Białko N	% TPO	10Sa Tag
pMP331	-	-	4,5	11,5
pMP951	+	+	49,0	2,6
pMP1099	-	-	50,0	4,6
pMP1086	+	+	73,0	1,6

Dane zamieszczone w powyższej tabeli 1 pokazują, że ekspresja TPO z plazmidu z systemem antyterminacyjnym ŻN prowadziła do zwiększenia procentowego udziału TPO, to znaczy TPO o pełnej długości, i zmniejszenia nagromadzonego TPO znakowanej 10Sa. Obserwuje się to niezależnie od tego, czy do kontroli ekspresji TPO został użyty promotor AP, czy promotor trp.

P r z y k ł a d 3

Wpływ GreA lub GreB na wytwarzanie TPO (kolba do wytrząsania)

Materiały i metody.

Transformacie.

Szczep 59B9 [W3110 fhuĄtonAĄ lonAgalE rpoHts(htpRts) AclpP laclq ΔompT A(nmpc-fepE) AlacY] transformowano każdym spośród plazmidów pMP331, pMP951, pMP1217, pMP1099, pMP1086 lub mMP1201, albo jako takim, albo w kombinacji z pDR1 lub pDR3 (przy czym wszystkie z nich opisano w powyższym przykładzie 1) z zastosowaniem typowych sposobów postępowania. Hodowla komórek transformowanych.

Komórki transformowane hodowano w pożywkach LB z ampicyliną i kanamycyną (jedynie w przypadku kotransformacji z pDR1 lub pDR3), w temperaturze 30°C, przy wytrząsaniu, przez noc, po czym rozcieńczono 50x do pożywki hodowlanej w kolbach do wytrząsania zawierającej ampicylinę i hodowano w temperaturze 30°C przy wytrząsaniu. Transformanty zawierające plazmidy pMP331, pMP951 lub pMP1217 hodowano w pożywce THCD w obecności odpowiedniego antybiotyku, aż do osiągnięcia wartości O.D. (550 nm) 1 - 2, i w tym momencie do hodowli dodano IAA (w końcowym stężeniu 50 μg/ml) i IPTG (w końcowym stężeniu 1 mM) (jedynie w przypadku pMP951 i pMP1217). Wszystkie hodowle prowadzono przez, ogółem, 24 godziny. Pobierano próbki i poddawano je analizie metodą SD3-PAGE.

Pożywka THCD zawiera: 1,86 g Na2HPO4, 0,93 g NaH2PO4.H2O, 3,57 g (NH4)2SO4, 0,71 g cytrynianu sodu.2 H2O, 1,07 g KCl, 5,36 g ekstraktu drożdżowego (Difco^® Bacto^® brand, # 0127-01-7), 5,36 Casamino Acids (Disco^® Bacto^® brand, #0230-17-3), 7 ml 1M MgSO4, 11 ml 50% roztworu glukozy i 110 ml 1 M MOPS, pH 7,3, w końcowej objętości 1 litra.

Transformanty zawierające plazmidy pMP1099, pMP1086 lub pMP1201, z pDR1 lub pDR3, albo bez nich, hodowano w pożywce C.R.A.P. z odpowiednimi antybiotykami, aż do osiągnięcia wartości O.D. (550 nm) 1 - 2 i w tym momencie do wszystkich hodowli (z wyjątkiem hodowli zawierającej sam pMP1099) wprowadzono IPTG (w końcowym stężeniu 1 mM). Wszystkie hodowle prowadzono przez, ogółem, 24 godziny. Pobierano próbki i poddawano je analizie metodą SDS-PAGE.

Ocena ilościowa TPO znakowanej 10Sa i o pełnej długości.

Sporządzono próbki hodowli w kolbach do wytrząsania i poddano je analizie metodą SDSPAGE, po czym przeniesiono na nitrocelulozę i sondowano przeciwciałem poliklonalnym wzbudzonym albo przeciw TPO153, albo przeciw peptydowi 10Sa. Następnie, bloty skanowano przy użyciu densytometru laserowego ze wzmocnioną optyką (PDI Inc., model 325oe). Oznaczano obszary maksimów dla TPO o pełnej długości, jak również innych form TPO reagujących krzyżowo z poliklonalnym przeciwciałem z TPO154. Ten sam komplet próbek z hodowli w kolbach do wytrząsania poddano analizie

PL 208 884 B1 metodą SDS-PAGE i zabarwiono Coomassie Blue. Żele skanowano przy użyciu densytometru laserowego ze wzmocnioną optyką (PDI Inc., model 325oe). Obliczono procent TPO o pełnej długości w całkowitym białku komórkowym i wynik podano jako % białka całkowitego.

Wyniki.

Wyniki tych analiz zamieszczono w poniższej tabeli 2, w której SD oznacza sekwencje ShineDalgarno. Obliczono wzajemny stosunek ilościowy TPO o pełnej długości i wszystkich innych form TPO i wynik podano jako % TPO. Oprócz tego, obliczono także całkowity obszar maksimum wykryty na blocie sondowanym przeciwciałem poliklonalnym wzbudzonym przeciw peptydowi 10Sa i wyniki podaje się jako znacznik 10Sa (Tag 10Sa). Obliczono procent TPO o pełnej długości w całkowitym białku komórkowym i wynik podano jako % białka całkowitego.

T a b e l a 2

Wpływ konstruktu plazmidowego na akumulację TPO322 i znakowanie 10Sa

Plazmid (plazmidy)	Miejsce Nut	Białko N	% Białka całkowitego	% TPO	Tag10Sa
pMP331	-	-	5,8	11,3	7,6
pMP951	+	+, brak SD	5,8	30,9	2,5
pMP1217	+	+, pełna SD	5,0	33,0	1,7
pMP1099	-	-	6,1	17,8	3,3
pMP1099/pDR1	-	-	8,2	21,2	4,2
pMO1099/pDR3	-	-	8,2	21,2	4,8
pMP1086	+	+, brak SD	7,3	27,6	2,3
pMP1086/pDR1	+	+, brak SD	7,7	37,5	2,0
pMP1086/pDR3	+	+, brak SD	8,5	32,0	2,9
pMP1201	+	+, pełna SD	6,8	43,7	1,6

Dane zamieszczone w powyższej tabeli 2 pokazują, że ekspresja TPO z plazmidu z systemem antyterminacyjnym λΝ prowadziła do drastycznego zmniejszenia ilości TPO znakowanej 10Sa, co odzwierciedla rubryka znacznik 10Sa (Tag 10Sa). Także, udział procentowy TPO obecnej jako TPO o pełnej długości zwiększał się w przypadku systemu antyterminacyjnego λΝ (kolumna „% TPO” w tabeli 2).

Należy zauważyć, że użycie plazmidu kontrolnego z promotorem AP (pMP1099), ale nie z promotorem trp (pMP331), prowadziło do wytworzenia większej ilości (procentowo) TPO w fermentorze niż w kolbach do wytrząsania (porównaj wyniki z tabeli 1 z wynikami w tabeli 2). Warunki procesu prowadzonego w fermentorze zapewniają bardziej stałe zasilanie glukozą i kontrolowanie pH, wraz z okresem indukcji dłuższym niż w warunkach hodowli w kolbach do wytrząsania, dzięki czemu więcej białka tworzy się w fermentorze z udziałem promotora AP. Jednakże, dla systemu antyterminacyjnego wyniki wykazują stałą polepszoną tendencję pod względem % TPO, niezależnie od tego, czy TPO wytwarzane jest w kolbach do wytrząsania, czy w fermentorze, i niezależnie od tego, czy promotorem jest trp czy AP. Ponadto, znakowanie znacznikiem 10Sa jest we wszystkich przypadkach słabsze w przypadku systemu antyterminacyjnego.

Ponadto, z przedstawionych danych widać wyraźnie, że koekspresja TPO i albo GreA, albo GreB, z systemem antyterminacyjnym λ^ lub bez niego, zapewnia wzrost wytwarzania TPO (rubryka „% białka całkowitego” w tabeli 2). Stwierdza się także zwiększenie się procentowego udziału TPO obecnego jako TPO o pełnej długości, gdy dochodzi do koekspresji albo GreA albo GreB razem z TPO.

P r z y k ł a d 4

Wpływ systemu antyterminacyjnego λN na wytwarzanie FGF-5 (fermentor)

Materiały i metody.

Opis i konstrukcja plazmidów ekspresyjnych białka FGF-5.

PL 208 884 B1

Plazmid pFGFSIT.

Plazmid ekspresyjny hFGF-5 E. coli, pFGF5IT, skonstruowano wykorzystując podstawowy szkielet plazmidu pBR322 [Sutcliffe, Cold Spring Harb Symp Quant Biol., 43, 77 - 90 (1978)]. Promotor trp dostarcza sekwencji transkrypcyjnej potrzebnej do wydajnej ekspresji genu FGF-5 w E. coli [Yanofsky i in., Nucleic Acids Res., 9, 6647 - 6668 (1981)]. Translację mRNA FGF-5 ułatwiały dwie sekwencje Shine-Dalgarno, trp Shine-Dalgarno i druga sekwencja Shine-Dalgarno [Yanofsky i in., Nucleic Acids Res., 9, 6647 - 6668 (1981); Ringquist i in., Molecular Microbiol., 6, 1219 - 1229 (1992)]. Sekwencja kodująca dojrzałe FGF-5 (bez sekwencji sygnałowej typu dzikiego) znajduje się poniżej promotora i sekwencji Shine-Dalgarno, i poprzedzona jest kodonem inicjatorowym metioniny. Wektor użyty do skonstruowania pFGF5IT utworzono przez wyodrębnienie największego fragmentu po trawieniu pRelCIII z udziałem Xbal i BamHI. Wektor ten zawiera promotor trp i sekwencję trp ShineDalgarno. Drugi fragment potrzebny do tej konstrukcji wyodrębniono za pomocą, wpierw, strawienia pFGF5I z udziałem Hindlll, a następnie potraktowanie polimerazą DNA (fragment Klenowa) z utworzeniem tępego końca. Następnie, mieszaninę reakcyjną poddano trawieniu przy użyciu Xbal, w wyniku czego otrzymano fragment o około 770 pz z jednym lepkim końcem i jednym tępym końcem (Hindlll Pol). Fragment ten zawiera sekwencje Shine-Dalgarno, kodon inicjatorowy metioniny i sekwencję kodującą dojrzałe hFGF-5. Końcowy fragment potrzebny do tej konstrukcji wyodrębniono z pdh108. Fragment ten, o około 420 pz, zawiera sekwencję kodującą terminatora transkrypcyjnego Żt_o [Scholtissek i in., Nucleic Acids Res., 15 (7), 3185 (1987)] oraz mniej więcej 375 pierwszych par zasad pBR322 (Sutcliffe, supra). Te trzy fragmenty zligowano ze sobą, jak to pokazano na fig. 21, w celu skonstruowania pFGF5IT.

Plazmid pFGF5IT-AT.

Plazmid pFGF5IT-AT po prostu umieszcza sekwencję kodującą FGF-5 w ekspresyjnym plazmidzie antyterminacyjnym ŻN. Wektor używany do tej konstrukcji utworzono przez wyodrębnienie największego fragmentu po trawieniu pMP951 przy użyciu Xbal i BamHI. Wektor ten zawiera promotor trp i miejsce nut (kaseta A + kaseta B). Drugi fragment potrzebny do tej konstrukcji wyodrębniono po trawieniu pFGF5IT-PhoA z udziałem Xbal i HincII. Plazmid pFGF5lT-PhoA jest pochodną pFGF5IT, w której promotor trp zastąpiony został promotorem AP (Kikuchi i in., supra). Fragment ten, o około 810 pz, zawiera sekwencje Shine-Dalgarno, kodon inicjacyjny metioniny, sekwencję kodującą dojrzałe hFGF-5 i sekwencję dla terminatora transkrypcyjnego Żto. Końcowy fragment potrzebny do ligacji wyodrębniono za pomocą trawienia pMP931 przy użyciu Sspl i BamHI. Trawienie z udziałem Sspl było trawieniem jedynie częściowym i w wyniku dawało fragment o około 900 pz. Ten ostatni fragment zawiera promotor tacll (bez sekwencji Shine-Dalgarno), po którym poniżej następuje sekwencja kodująca białko ŻN. Te trzy fragmenty zligowano ze sobą, jak to pokazano na fig. 22, w celu skonstruowania pFGF5IT-AT.

Transformacja.

Szczep 54C2 (E. coli W3110 fhuA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts) clpP laclq) transformowano każdym z plazmidów pFGF5IT lub pFGF5IT-AT z zastosowaniem typowych sposobów postępowania, z udziałem ampicyliny.

Hodowla komórek transformowanych.

Transformowane komórki hodowano w fermentorze w warunkach opisanych w powyższym przykładzie 2 w odniesieniu do plazmidów trp pMP331 i pMP951, z tą różnicą, że roztworu IPTG użyto tylko zamiast pFGFSIT, a nie zamiast pFGF5IT. Lizaty pełnych komórek z próbek fermentacyjnych przygotowano do analizy metodą SDS-PAGE.

Wyniki.

Plazmid pFGF5IT do wewnątrzkomórkowej ekspresji FGF-5 zapewniał otrzymanie znaczącej ilości białka o pełnej długości (fig. 23A, ścieżka 2). Pomimo tych obiecujących wyników, oprócz białka o pełnej długości zbierały się także skrócone formy FGF-5 (fig. 23B, ścieżka 2), przy czym większość tych produktów znakowana była 10Sa (fig. 23C, ścieżka 2). Wyniki te implikują, że (bez wiązania się jakąkolwiek teorią) prawdopodobnym źródłem problemów związanych ze skracaniem jest przedwczesna terminacja transkrypcji.

Biorąc pod uwagę ten problem, przeprowadzono koekspresję systemu antyterminacyjnego ŻN z genem FGF-5. Produkcja FGF-5 o pełnej długości była w przybliżeniu równoważna dla obu plazmidów, z antyterminacją ŻN lub bez niej (fig. 23A, ścieżki 2 i 3). Jednakże, nagromadzanie się rodzajów skróconych ulegało zmniejszeniu o około 50%, w przypadku koekspresji systemu antyterminacyjnego ŻN i genu kodującego FGF-5 (fig/fig. 23B i 23C). Zmniejszenie ilości tych skróconych postaci nie tylko

PL 208 884 B1 umożliwia uproszczenie oczyszczania białka FGF-5 o pełnej długości, ale minimalizuje także produkcję tych mniejszych fragmentów FGF-5, co prowadzi do polepszenia skuteczności fałdowania, ponieważ mniejsze rodzaje mogą przyczyniać się do agregacji w reakcjach fałdowania. Oprócz tego, jakiekolwiek skrócone formy, które fałdują się i pozostają w roztworze mogą skomplikować ocenę bioaktywności, a to w wyniku interferencji w wiązanie się białka o pełnej długości z receptorem. Toteż, zalecane jest zredukowanie poziomu przedwczesnej terminacji transkrypcji celem zapobiegania powstawaniu tych potencjalnych problemów.

P r z y k ł a d 5

Wpływ antyterminacji λN i GreA/B na wytwarzanie FGF-5 (kolba do wytrząsania)

Materiały i metody.

Doświadczenia w kolbach trzęsawkowych z koekspresją FGF-5 i GreA lub GreB.

Szczep 59B9 [W3110 fhuAA(tonAA) lonAgalE rpoHts (htpRts) AclpP laclg ΔompT A(nmpc-fepE) AlacY transformowano pGFG5IT-PhoA (opisanym w powyższym przykładzie 4) lub pFGF5ITPhoAAT, albo jako takim, albo w kombinacji z pDR1 lub pDR3 (przy czym wszystkie z nich opisano w powyższej części niniejszego opisu). Plazmid pFGF5IT-PhoAAT jest pochodną pFGF5IT, w której obecny jest ten sam element antyterminacyjny co w pFGF5IT-AT opisanym w powyższym przykładzie 4, i w którym promotor trp zastąpiony jest promotorem AP (Kikuchi i in., supra).

Hodowla komórek transformowanych.

Komórki transformowane hodowano w pożywkach LB z ampicyliną i kanamycyną (jedynie w przypadku kotransformacji z pDR1 lub pDR3), w temperaturze 30°C, przy wytrząsaniu, przez noc, po czym rozcieńczono 50x w pożywce C.R.A.P. zawierającej odpowiednie antybiotyki i hodowano w temperaturze 30°C przy wytrząsaniu. Transformanty hodowano w tej pożywce aż do osiągnięcia wartości O.D. (550 nm) 1 - 2, i w tym momencie do wszystkich hodowli (z wyjątkiem hodowli zawierającej sam pFGF5IT-PhoA) dodano IPTG (w końcowym stężeniu 1 mM). Wszystkie hodowle prowadzono przez, ogółem, 24 godziny. Pobierano próbki i poddawano je analizie metodą SDS-PAGE. Ocena ilościowa FGF-5 znakowanego 10Sa i o pełnej długości.

Sporządzono próbki hodowli w kolbach do wytrząsania opisanych powyżej i poddano je analizie metodą SDS-PAGE, po czym przeniesiono na nitrocelulozę i sondowano przeciwciałem poliklonalnym wzbudzonym albo przeciw FGF-5 (R&D Systems), albo przeciw peptydowi 10Sa. Następnie, bloty skanowano przy użyciu densytometru laserowego ze wzmocnioną optyką (PDI Inc., model 325oe). Oznaczano obszary maksimum dla FGF-5 o pełnej długości, jak również innych form FGF-5 reagujących krzyżowo z poliklonalnym przeciwciałem FGF-5.

Wyniki.

Wyniki tych analiz zamieszczono w poniższej tabeli 3. Obliczono wzajemny stosunek ilościowy FGF-5 o pełnej długości do wszystkich innych form FGF-5 i wynik podano jako % FGF-5. Oprócz tego, obliczono także całkowite obszary maksimum wykryte na blocie sondowanym przeciwciałem poliklonalnym wzbudzonym przeciw peptydowi 10Sa i wyniki podaje się jako Tag 10Sa.

T a b e l a 3

Plazmid (plazmidy)	% FGF-5	10Sa Tag
pFGF5IT-PhoA	15	10,6
pFGF5IT-PhiA/pDR1	16	11,3
pFGF5IT0PhoA/pDR3	21	7,6
pFGF5IT-PhoAAT	40	3,0
pFGF5IT-PhoAAT/pDR1	52	1,7
pFGF5IT-PhoAAT/pDR3	45	3,4

Dane zamieszczone w powyższej tabeli 3 pokazują, że ekspresja FGF-5 z plazmidu z systemem antyterminacyjnym λN prowadziła do drastycznego zmniejszenia ilości FGF-5 znakowanego 10Sa, jak to przedstawiono za pomocą danych ze skanowania białek znakowanych 10Sa w tabeli 3. Także, udział procentowy FGF-5 obecnego jako FGF-5 o pełnej długości zwiększał się przy zastosowaniu systemu antyterminacyjnego Ż-N.

PL 208 884 B1

Ponadto, z przedstawionych danych widać wyraźnie, że koekspresja FGF-5 i albo GreA, albo

GreB, z systemem antyterminacyjnym λΝ, lub bez niego, zapewnia zwiększenie udziału procentowego

FGF-5 o pełnej długości, jak to uwidaczniają dane zamieszczone w rubryce zatytułowanej „% FGF-5”.

jista sekwencji <110> Genentech, Inc.

<120> Wektor do wytwarzania polipeptydu heterologicznego oraz sposoby zwiększania wytwarzania pełnej długości polipeptydu heterologicznego

<130>	pl732RlPCT
<140>	PCT/U302/05069
<141>	22-02-2002
<150>	US 60/274384
<151>	09-03-2001
<160>	19
<210>	1
<211>	80
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztu
<220>
<223>	Konstrukt eksp
<400>	1

ttaactagta cgcaacgctc ttacacattc cagccctgaa aaagggcaaa 50 gttcacgtaa aaaggatatc tagaattatg 80

<210>	2
<211>	114
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

PL 208 884 B1 <220>

<223> Konstrukt ekspresyjny <400> 2 tatagtcgct ttgtttttat tttttaatgt atttgtaact agtacgcaac 50 gctcttacac attccagccc tgaaaaaggg caaagttcac gtaaaaagga 100 tatctagaat tatg 114 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Fragment faga lambda N <400> 3

Met Asp Ala Gin Thr 1 5 <210> 4 <211> 56 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Fuzja E. coli i fragmentu faga lambda N <400> 4 tttaatgtgt ggaattgtga gcggataaca attaagcttt tatggangca 50 caaaca 56 <210> 5 <211> 68 <212> DNA

PL 208 884 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Fuzja E. coli i fragmentu faga lambda N <400> 5 tttaatgtgt ggaattgtga gcggataaca attaagctta ggattctaga 50 attatggatg cacaaaca 68 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 6 ile Glu Pro Arg <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Fragment dla konstrukcji plazmidu <400> 7 ctagttaact agtacgcatt ccagccctga aaaagggcaa agttcacgta 50 aaaaggatat 60 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

PL 208 884 B1 <223> Fragment dla konstrukcji plazmidu <400> 8 ctagatatcc tttutacgtg aactttgccc trtttcaggg ctggaatgcg 50 tactagttaa 60 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Fragment dla konstrukcji plazmidu <400> 9 ctgtctcagg aagggtaagc ttttatggat gcacaaacac 40 <210> 10 <211> 47 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Fragment dla konstrukcji plazmidu <400> 10 cggcgtgttt gtgcatccat aaaagcttac ccttcctgag acagatt 47 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Fragment dla konstrukcji plazmidu

PL 208 884 B1 <400> 11 agcttaggat tctagaatta tggatgcaca aacac 35

<210>	12
<211>	35
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

<220
<223>	Fragment dla konstrukcji plazmidu
<400>	12

cggcgtgttt gtgcatccat aattctagaa tccta 35

<210>	13
<211>	73
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>
<223>	Fragment dla konstrukcji plazmidu
<400	13

ctagttaact agtacgcaac gctcttacac attccagccc tgaaaaaggg 50 caaagttcac gtaaaaagga tat 73

<210>	14
<211>	73
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>
<223>	Fragment dla konstrukcji plazmzdu

<400> 14 ctagatatcc tttttacgtg aactttgccc tctttcaggg ctggaatgtg 5C

PL 208 884 B1 taagagcgtt gcgtactagt taa 73

<210>	15
<211>	48
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>
<223>	Starter
<400>	15

ccccccccct ctagaaaaat gaaaactcct ctggtaacgc gggaaggg 48

<210>	16
<211>	39
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>
<223>	Starter
<400>	16

cccccccccc tgcagttacg gtttcacgta ctcgatagc 39

<210>	17
<211>	44
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna

<220>
<223>	Starter
<400>	17

ccccccccct ctagaattct atgcaagcta ttccgatgac ctta 44 <210> 18

PL 208 884 B1 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Starter <400> 18 cccccccccc tgcagttaca ggtattccac cttaat 36 <210> 19 <211> 12 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Peptyd dla wytwarzania przeciwciał <400> 19

Cys Ala Ala Asn Asp Glu Asn Tyr Ala Leu Ala Ala 15 10

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wektor do wytwarzania polipeptydu heterologicznego dla komórek prokariotycznych, znamienny tym, że zawiera (1) antyterminacyjny kwas nukleinowy hamujący wewnątrzgenową terminację transkrypcji wraz z promotorem nie-lambda do niego; (2) DNA kodujący polipeptyd wraz z promotorem nie-lambda do niego, w którym miejsce rozpoznawania RNA dla wiązania białka antyterminacyjnego wytwarzanego z tego kwasu nukleinowego znajduje się w położeniu 5' DNA kodującego polipeptyd; i (3) kwas nukleinowy kodujący białko GreA albo GreB z promotorem do niego.
2. Wektor według zastrz. 1, znamienny tym, że komórki prokariotyczne stanowią komórki bakteryjne.
3. Wektor według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd stanowi polipeptyd ssaczy.
4. Wektor według zastrz. 1, znamienny tym, że promotor nie-lambda stanowi promotor trp lub promotor fosfatazy alkalicznej, albo oba te promotory.
5. Sposób zwiększania wytwarzania pełnej długości polipeptydu heterologicznego jako odsetka ogółu takiego polipeptydu heterologicznego w prokariotycznych komórkach gospodarza, znamienny tym, że:

(a) hoduje się komórki gospodarza zawierające 1) antyterminacyjny kwas nukleinowy hamujący wewnątrzgenową terminację transkrypcji z promotorem nie-lambda do niego; i (2) RNA kodujący polipeptyd, przy czym RNA jest eksprymowany z genu z promotorem nie-lambda do niego, w którym

PL 208 884 B1 miejsce rozpoznawania RNA dla wiązania białka antyterminacyjnego wytwarzanego z tego kwasu nukleinowego znajduje się w położeniu 5' RNA kodującego polipeptyd, i przy czym antyterminacyjny kwas nukleinowy jest eksprymowany w czasie ekspresji tego RNA; i (b) odzyskuje się polipeptyd heterologiczny z komórek lub z pożywki do hodowli komórkowej, przez co ilość pełnej długości polipeptydu heterologicznego wytwarzanego w tym sposobie jest zwiększona jako odsetek ogółu takiego wytwarzanego polipeptydu heterologicznego.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako polipeptyd heterologiczny stosuje się polipeptyd eukariotyczny.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako polipeptyd heterologiczny stosuje się polipeptyd ssaczy.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako polipeptyd ssaczy stosuje się polipeptyd ludzki.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako polipeptyd ssaczy stosuje się ludzką trombopoetynę (TPO) lub ludzki czynnik wzrostu fibroblastów 5 (FGF-5).
10. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako promotor nie-lambda stosuje się promotor trp lub promotor fosfatazy alkalicznej, albo oba te promotory.
11. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że RNA i antyterminacyjny kwas nukleinowy obejmują policistronową jednostkę genetyczną obejmującą pierwszy cistron kodujący polipeptyd heterologiczny i drugi cistron poniżej pierwszego cistronu, który jest antyterminacyjnym kwasem nukleinowym z pojedynczym promotorem kontrolującym transkrypcję tej policistronowej jednostki genetycznej.
12. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że ekspresja RNA i antyterminacyjnego kwasu nukleinowego odbywa się pod kontrolą osobnych promotorów.
13. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako komórki prokariotyczne stosuje się komórki bakteryjne.
14. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że polipeptyd odzyskuje się z cytoplazmy albo z periplazmy komórek.
15. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że polipeptyd odzyskuje się z pożywki do hodowli komórkowej.
16. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako antyterminacyjny kwas nukleinowy stosuje się gen N albo Q bakteriofaga.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako antyterminacyjny kwas nukleinowy stosuje się gen lambda N.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako miejsce rozpoznawania RNA stosuje się miejsce nut.
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że jako miejsce rozpoznawania RNA stosuje się lambda nutL, nutR, Kasetę B, mutanta nut lub nut z faga lambdoidalnego innego niż fag lambda.
20. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się komórki gospodarza zawierające ponadto kwas nukleinowy kodujący białko GreA lub GreB z promotorem do nich.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że eksprymowany jest kwas nukleinowy kodujący GreB.
22. Sposób zwiększania wytwarzania pełnej długości polipeptydu heterologicznego jako odsetka ogółu takiego polipeptydu heterologicznego w prokariotycznych komórkach gospodarza, znamienny tym, że:

(a) hoduje się komórki gospodarza zawierające kwas nukleinowy kodujący białko GreA albo białko GreB, kwas nukleinowy kodujący polipeptyd heterologiczny, oraz jeden, lub większą ilość promotorów dla tych kwasów nukleinowych; i (b) odzyskuje się polipeptyd heterologiczny z komórek albo z pożywki do hodowli komórkowej, przez co ilość pełnej długości polipeptydu heterologicznego wytwarzanego w tym sposobie jest zwiększona jako odsetek ogółu takiego wytwarzanego polipeptydu heterologicznego.
23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że eksprymowany jest kwas nukleinowy kodujący białko GreB.
24. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako komórki stosuje się komórki bakteryjne.
25. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako polipeptyd heterologiczny stosuje się polipeptyd ssaczy.
26. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako polipeptyd ssaczy stosuje się polipeptyd ludzki.

PL 208 884 B1
27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że jako polipeptyd ludzki stosuje się ludzką trombopoetynę (TPO) lub ludzki czynnik wzrostu fibroblastów 5 (FGF-5).
28. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako promotor stosuje się promotor trp lub promotor fosfatazy alkalicznej, albo oba te promotory.
29. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że polipeptyd izoluje się z cytoplazmy lub periplazmy komórek.
30. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że polipeptyd izoluje się z pożywki do hodowli komórkowej.