ES2397282T3 - Células modificadas mediante ingeniería genética desde el punto de vista metabólico para la producción de resveratrol o un derivado del mismo oligomérico o con unión glucosídica - Google Patents

Abstract

Un microorganismo que produce resveratrol, y dicho microorganismo tiene una ruta metabólica operativa queproduce ácido 4-cumárico y que produce resveratrol a partir suyo, o un derivado oligomérico o con unión glicosídicadel mismo, en cuya ruta se produce ácido 4-cumárico a partir de L-fenilalanina por la acción de una L-fenilalaninaamoniaco liasa y una cinamato 4-hidroxilasa expresadas en dicho microorganismo, o a partir de tirosina por la acciónde una L-fenilalanina amoniaco liasa o de una tirosina amoniaco liasa expresadas en dicho microorganismo, seforma 4-cumaroil-CoA a partir de dicho ácido cumárico en una reacción catalizada por una 4-cumarato-CoA ligasaexpresada en dicho microorganismo, y se produce resveratrol a partir de dicho 4-cumaroil-CoA en una reacción en la que el malonil-CoA endógeno es unsustrato mediante una resveratrol sintasa expresada en dicho microorganismo.

Description

Células modificadas mediante ingeniería genética desde el punto de vista metabólico para la producción de resveratrol o un derivado del mismo oligomérico o con unión glucosídica

Campo de la Invención

Esta invención se refiere en general a la producción del polifenol resveratrol o un derivado oligomérico o con unión glicosídica del mismo, tal como su R-glucósido piceido, mediante el uso de células microbianas. Además, se describen microorganismos naturales o recombinantes que producen resveratrol o dicho derivado para la producción de alimentos, piensos y bebidas.

Antecedentes de la Invención

La producción de productos químicos a partir de microorganismos ha sido una aplicación importante de la biotecnología. En general, las etapas en el desarrollo de tal método de bio-producción pueden incluir 1) la selección de un microorganismo hospedador adecuado, 2) la eliminación de las rutas metabólicas que conducen a subproductos, 3) la desregulación de rutas deseadas tanto a nivel de la actividad enzimática como a nivel transcripcional, y 4) la sobreexpresión de las enzimas adecuadas en las rutas deseadas. En un aspecto preferido, la presente invención ha empleado combinaciones de las etapas anteriores para redirigir el flujo de carbono desde fenilalanina o tirosina por medio de enzimas de la ruta fenilpropanoide vegetal que suministra el precursor necesario para la biosíntesis deseada de resveratrol.

El resveratrol (o 3,4,5-trihidroxiestilbeno) es un fitofenol que pertenece al grupo de estilbeno fitoalexinas, que son metabolitos secundarios de masa molecular baja que constituyen el mecanismo de defensa activa en plantas en respuesta a infecciones u otros sucesos relacionados con agresiones. Las estilbeno fitoalexinas contienen el esqueleto de estilbeno (trans-1,2-difeniletileno) como estructura básica común: también se puede complementar mediante la adición de otros grupos (Hart y Shrimpton, 1979, Hart, 1981). Los estilbenos se han hallado en ciertos árboles (angiospermas, gimnospermas), pero también en ciertas plantas herbáceas (en especies de las familias Myrtaceae, Vitaceae y Leguminosae). Dichos compuestos son tóxicos para las plagas, en especial para hongos, bacterias e insectos. Solamente unas cuantas plantas tienen la capacidad de sintetizar estilbenos, o de producirlos en una cantidad que les proporciona una resistencia suficiente hacia las plagas.

La síntesis del esqueleto de estilbeno básico es llevada a cabo por las estilbeno sintasas. Hasta ahora, se han designado dos enzimas como estilbeno sintasas; la pinosilvina sintasa y la resveratrol sintasa. Hasta la fecha, la resveratrol sintasa de cacahuete (Arachis hypogaea) se ha caracterizado con más detalle, de forma que se conocen la mayoría de las propiedades (Schoppner y Kindl, 1984). Los sustratos que usan las estilbeno sintasas son malonil-CoA, cinamoil-CoA o cumaroil-CoA. Estas sustancias se dan en todas las plantas, debido a que se usan en la biosíntesis de otros constituyentes vegetales importantes, así como flavonoides, pigmentos florales y lípidos.

El resveratrol (Fig. 1, forma trans) consiste en dos anillos de fenol conectados a poca distancia, y por lo tanto pertenece a los polifenoles. Aunque está presente en otras plantas, tales como eucalipto, pícea, y lirio, y en otros alimentos tales como moras y cacahuetes, las fuentes naturales más abundantes de resveratrol son las uvas de Vitis vinifera, -labrusca, y -muscadine (rotundifolia), que se usan para producir vinos. El compuesto se da en las vides, raíces, semillas, y tallos, pero su concentración más alta está en la piel (Celotti et al., 1996), que contiene 50-100 μg/g. (Jang et al. 1997). Durante la vinificación del vino tinto, las pieles de las uvas se incluyen en el mosto, en contraste con la vinificación del vino blanco, y por lo tanto el resveratrol se halla en pequeñas cantidades solamente en el vino tinto. El resveratrol se ha reconocido, además de por sus propiedades antifúngicas, por sus actividades cardioprotectoras y quimiopreventivas del cáncer; actúa como un fitoestrógeno, un inhibidor de la agregación plaquetaria (Kopp et al, 1998; Gehm et al 1997; Lobo et al 1995), y un antioxidante (Jang et al., 1997; Huang 1997). Estas propiedades explican la denominada paradoja francesa, es decir, los franceses que beben vino tienen una incidencia baja de cardiopatía coronaria a pesar de una dieta elevada en grasas y poco ejercicio. Recientemente se ha demostrado que el resveratrol puede activar también el gen SIR2 en levadura, y el gen humano análogo SIRT1, que desempeñan un papel clave en prolongar la vida. Desde entonces se ha centrado la atención en gran medida en las propiedades de prolongación de la vida de resveratrol (Hall, 2003, Couzin, 2004).

Las asociaciones sanitarias americanas, tales como la Life Extension Foundation, están promocionando los amplios efectos beneficiosos de este fármaco, y por lo tanto están impulsando las condiciones ideales para una comercialización favorable. Los procedimientos de producción actuales dependen en gran medida de la extracción de resveratrol, de la piel de las uvas o de plantas del género Polygonum. Este es un procedimiento muy laborioso y genera un rendimiento bajo que, por tanto, da lugar a un estímulo para el desarrollo de procesos de producción nuevos, más eficaces y de alto rendimiento.

En las plantas, la ruta fenilpropanoide es responsable de la síntesis de una amplia diversidad de compuestos metabólicos secundarios, que incluyen ligninas, salicilatos, cumarinas, amidas hidroxicinámicas, pigmentos, flavonoides y fitoalexinas. De hecho, la formación de resveratrol en las plantas se desarrolla por medio de la ruta fenilpropanoide. El aminoácido L-fenilalanina se convierte en ácido trans-cinámico por medio de la desaminación nooxidativa mediante la L-fenilalanina amoniaco liasa (PAL) (Fig. 2). A continuación, el ácido trans-cinámico se hidroxila en la posición para hasta ácido 4-cumárico (ácido 4-hidroxicinámico) mediante la cinamato-4-hidroxilasa (C4H), una enzima citocromo P450 monooxigenasa, junto con la NADPH:citocromo P450 reductasa (CPR). El ácido 4-cumárico se activa posteriormente hasta 4-cumaroil-CoA mediante la acción de la 4-cumarato-CoA ligasa (4CL). Finalmente, la resveratrol sintasa (VST) cataliza la condensación de una unidad de fenilpropano de 4-cumaroil-CoA con malonil CoA, lo que da como resultado la formación de resveratrol.

Recientemente, se describió una levadura que podía producir resveratrol a partir de ácido 4-cumárico que se halla en pequeñas cantidades en el mosto de la uva (Becker et al. 2003). La producción de 4-cumaroil-CoA, y el resveratrol concomitante, en las cepas de laboratorio de S. cerevisiae, se consiguió mediante la co-expresión de un gen heterólogo de coenzima-A ligasa, de álamo híbrido, junto con el gen de resveratrol sintasa de vid (vstl). El otro sustrato para la resveratrol sintasa, malonil-CoA, ya se produce de forma endógena en levadura y está implicado en la biosíntesis de novo de ácidos grasos. El estudio demostró que las células de S. cerevisiae podrían producir cantidades diminutas de resveratrol, en forma libre o en la forma con unión de glucósido, cuando se cultivan en un medio sintético que se complementó con ácido 4-cumárico.

Sin embargo, dicha levadura no sería adecuada para una aplicación comercial, ya que tiene un bajo rendimiento de resveratrol, y requiere la adición de ácido 4-cumárico, que está presente solamente en unos pocos medios industriales. Para facilitar y ampliar la aplicación de resveratrol como producto farmacéutico y nutracéutico, es por tanto sumamente deseable obtener una levadura que pueda producir resveratrol directamente a partir de glucosa, sin la adición de ácido 4-cumárico.

Un estudio reciente (Ro y Douglas, 2004) describe la reconstitución del punto de entrada de la ruta fenilpropanoide en S. cerevisiae mediante la introducción de PAL, C4H y CPR de álamo. El propósito fue determinar si los complejos multienzimáticos (MECs) que contienen PAL y C4H son funcionalmente importantes en este punto de entrada en el metabolismo fenilpropanoide. Alimentando a la levadura recombinante con [3H]-fenilalanina, se descubrió que la mayoría de la [3H]-fenilalanina metabolizada se incorporó en el ácido 4-[3H]-cumárico, y que el metabolismo de la fenilalanina se redujo en gran medida inhibiendo la actividad de C4H. Además, las levaduras que expresaron solamente PAL metabolizaron muy poca fenilalanina hasta ácido cinámico. Cuando se alimenta [3H]-fenilalanina y ácido [14C]-trans-cinámico de manera simultánea a las levaduras que expresaron los tres, no se descubrió ninguna prueba de la canalización del ácido [3H]-trans-cinámico sintetizado de forma endógena hasta ácido 4-cumárico. Por lo tanto, el flujo de carbono eficaz desde fenilalanina hasta ácido 4-cumárico por medio de reacciones catalizadas mediante PAL y C4H no parece requerir la canalización por medio de un MEC en levadura, y el puro acoplamiento bioquímico de PAL y C4H parece ser suficiente para controlar el flujo de carbono hasta la ruta fenilpropanoide. En otro estudio (Hwang et al., 2003) se llevó a cabo la producción de flavanonas específicas de plantas mediante Escherichia coli por medio de la expresión de un agrupamiento de genes artificial que contuvo tres genes de una ruta fenil propanoide de diversos orígenes heterólogos; PAL de la levadura Rhodotorula rubra, 4CL del actinomiceto Streptomyces coelicolor, y calcona sintasa (CHS) de la planta de regaliz Glycyrrhiza echinata. Estas rutas evitaron C4H, debido a que la enzima 4CL bacteriana ligó coenzima A tanto a ácido trans-cinámico como a ácido 4-cumárico. Además, la PAL de Rhodotorula rubra usa tanto fenilalanina como tirosina como sustratos. Por lo tanto, las células de E. coli que contenían los agrupamientos de genes y que se cultivaron con glucosa, produjeron cantidades pequeñas de dos flavanonas, pinocembrina (0,29 g/l) a partir de fenilalanina y naringenina (0,17 g/l) a partir de tirosina. Además, se acumularon grandes cantidades de sus precursores, ácido 4-cumárico y ácido trans-cinámico (0,47 y 1,23 mg/litro respectivamente). Además, los rendimientos de estos compuestos se pudieron incrementar mediante la adición de fenilalanina y tirosina.

Mientras la enzima de plantas dicotiledóneas utiliza solamente fenilalanina eficazmente, varios estudios indican que PAL de las plantas monocotiledóneas, y ciertos microorganismos, utiliza también tirosina (Rösler et al., 1997). En tales reacciones, la actividad enzimática se denomina tirosina amoniaco liasa (TAL, figura 3). La conversión de tirosina mediante TAL da como resultado la formación directa de ácido 4-cumárico sin la intermediación de C4H y CPR. En su mayor parte, ambas actividades residen en el mismo polipéptido y tienen eficacias catalíticas muy similares, a pesar de grandes diferencias en Km y número de recambio. Sin embargo, la mayoría de las enzimas PAL/TAL de plantas prefieren fenilalanina en vez de tirosina. El nivel de actividad TAL es en su mayor parte inferior que la actividad PAL, pero la magnitud de esta diferencia varía a lo largo de un amplio intervalo. Por ejemplo, la enzima de perejil tiene una Km para fenilalanina de 15-25 μM y para tirosina 2,0-8,0 mM, con números de recambio 22 s-1 y 0,3 s-1, respectivamente. En contraste, la enzima de maíz tiene una Km para fenilalanina solamente 15 veces mayor que para tirosina, y números de recambio alrededor de 10 veces mayores. Además, en las levaduras rojas, Rhodotorula glutinis (Rhodosporidium toruloides) y -rubra, la actividad catalítica TAL es cercana a la actividad catalítica PAL, con una proporción de TAL/PAL de aproximadamente 0,58. Se cree que la enzima PAL de estas levaduras degrada la fenilalanina como una función catabólica, y el ácido trans-cinámico formado se convierte en benzoato y otros materiales celulares, mientras en las plantas se cree que es simplemente una enzima reguladora en la biosíntesis de lignina, isoflavonoides y otros fenilpropanoides.

Recientemente, se descubrió un marco de lectura abierto en la bacteria Rhodobacter capsulatus que codifica una tirosina amoniaco liasa (TAL) biosintética hipotética que está implicada en la biosíntesis del cromóforo de la proteína amarilla fotoactiva (Kyndt et al., 2002). Esta fue la primera vez que se descubrió un gen homólogo a PAL en bacterias. El gen TAL se aisló y se produjo en gran cantidad en Escherichia coli. Los valores de Km y kcat para la conversión de tirosina en ácido 4-cumárico fueron 15,6 μM y 27,7 s-1 respectivamente, y para la conversión de Lfenilalanina en ácido trans-cinámico fueron 1277 μM y 15,1 s-1, respectivamente. Como consecuencia de la Km más pequeña y una kcat ligeramente más grande, la enzima muestra una preferencia intensa por la tirosina sobre la Lfenilalanina, con una eficacia catalítica (Km/kcat) por la tirosina aproximadamente 150 veces mayor que por la fenilalanina. Los estudios cinéticos establecieron que la tirosina, y no la L-fenilalanina, es el sustrato natural de la enzima en condiciones fisiológicas. Muy recientemente, un estudio describió la coexpresión heteróloga de fenilalanina amoniaco liasa, cinamato-4-hidroxilasa, 4-cumarato-CoA-ligasa y calcona sintasa, para la producción de flavonoides en E. coli (Watts et al., 2004). La expresión simultánea de los cuatro genes, sin embargo, no fue eficaz debido a una cinamato-4-hidroxilasa no funcional. La sustitución de la fenilalanina amoniaco liasa y cinamato-4hidroxilasa por una nueva tirosina amoniaco liasa que se clonó a partir de Rhodobacter sphaeroides, pudo resolver, sin embargo, el problema y condujo a la producción de nivel elevado de la flavonona naringenina. Además, dicha tirosina amoniaco liasa de Rhodobacter sphaeroides se usa también para la producción heteróloga de ácido 4cumárico (es decir, ácido para-hidroxicinámico) en Escherichia coli (documento US-A-2004059103). Además, se describen métodos adicionales para el desarrollo de un biocatalizador para la conversión de glucosa en ácido 4cumárico. El documento US-A-2004023357 describe una tirosina amoniaco liasa de la levadura Trichosporon cutaneum para la producción de ácido cumárico en Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae. El documento USA-2001053847 describe la incorporación de PAL de tipo natural de la levadura Rhodotorula glutinis en E. coli, subrayando la capacidad de la PAL de tipo natural de convertir la tirosina directamente en ácido 4-cumárico. Además, también se ejemplifica la incorporación de PAL de tipo natural de la levadura Rhodotorula glutinis, más una C4H y CPR vegetal en E. coli y S. cerevisiae. También se describe el desarrollo de un biocatalizador por medio de la mutagénesis de la PAL de la levadura de tipo natural Rhodotorula glutinis con actividad TAL aumentada (documento US-A-6521748). Ninguna de las patentes anteriormente mencionadas reivindica la incorporación de 4CL y VST para la producción de resveratrol.

Recientemente, se han mostrado pruebas de que los hongos filamentosos A. oryzae contienen la enzima calcona sintasa (CHS) que está implicada normalmente en la biosíntesis de flavonoides, tales como naringenina, en plantas (Seshime et al., 2005). De hecho, también se demostró que A. oryzae contenía el grupo principal de genes responsables del metabolismo fenilpropanoide-flavonoide, es decir, PAL, C4H y 4CL. Sin embargo, no hay pruebas de que A. oryzae contenga una estilbeno sintasa, tal como la resveratrol sintasa.

La presente invención proporciona ahora un microorganismo que produce resveratrol, y dicho microorganismo tiene una ruta metabólica operativa que produce ácido 4-cumárico y produce resveratrol a partir suyo, o un derivado oligomérico o con unión glicosídica del mismo, en cuya ruta se produce ácido 4-cumárico a partir de L-fenilalanina por la acción de una L-fenilalanina amoniaco liasa y una cinamato 4-hidroxilasa expresadas en dicho microorganismo, o a partir de tirosina por la acción de una L-fenilalanina amoniaco liasa o a partir de una tirosina amoniaco liasa expresadas en dicho microorganismo, se forma 4-cumaroil-CoA a partir de dicho ácido cumárico en una reacción catalizada por una 4-cumarato-CoA ligasa expresada en dicho microorganismo, y se produce resveratrol a partir de dicho 4-cumaroil-CoA en una reacción en la que el malonil-CoA endógeno es un sustrato mediante una resveratrol sintasa expresada en dicho microorganismo. Un microorganismo descrito en la presente memoria se puede dar de manera natural, y se puede aislar mediante procedimientos de cribado adecuados, pero más preferiblemente se modifica mediante ingeniería genética.

Dicho resveratrol se produce preferiblemente a partir de 4-cumaroil-CoA mediante una resveratrol sintasa que se expresa preferiblemente en dicho microorganismo a partir de un ácido nucleico que codifica dicha enzima que no es nativa en el microorganismo.

En general en la presente memoria, a menos que el contexto implique lo contrario, las referencias a resveratrol incluyen la referencia a los derivados oligoméricos o con unión glicosídica del mismo, que incluyen en particular piceido.

Así, en ciertas realizaciones preferidas, dicha resveratrol sintasa es una resveratrol sintasa (EC 2.3.1.95) de una planta que pertenece al género Arachis, p.ej. A. glabatra, A. hypogaea, una planta que pertenece al género Rheum, p.ej. R. tataricum, una planta que pertenece al género Vitus, p.ej. V. labrusca, V. riparaia, V. vinifera, o cualquiera de los géneros Pinus, Piceea, Lilium, Eucalyptus, Parthenocissus, Cissus, Calochortus, Polygonum, Gnetum, Artocarpus, Nothofagus, Phoenix, Festuca, Carex, Veratrum, Bauhinia o Pterolobium.

Según la invención, una opción es que en dicha ruta se produzca ácido 4-cumárico a partir de L-fenilalanina por la acción de una L-fenilalanina amoniaco liasa y una cinamato 4-hidroxilasa expresadas en dicho microorganismo. Así, dicho ácido 4-cumárico se produce a partir de ácido trans-cinámico, mediante una enzima en una reacción catalizada por dicha enzima en la que el oxígeno es un sustrato, NADH o NADPH es un cofactor y NAD+ o NADP+ es un producto.

Dicho ácido 4-cumárico se puede producir así a partir de ácido trans-cinámico mediante una cinamato 4-hidroxilasa, que se expresa preferiblemente en dicho microorganismo a partir de un ácido nucleico que codifica dicha enzima que no es nativa en el microorganismo.

En ciertas realizaciones preferidas, que incluyen las mencionadas en los párrafos anteriores, dicha cinamato-4hidroxilasa es una cinamato-4-hidroxilasa (EC 1.14.13.11) de una planta o un microorganismo. La planta puede pertenecer al género Arabidopsis, p.ej. A. thaliana, una planta que pertenece al género Citrus, p.ej. C. sinensis, C. x paradisi, una planta que pertenece al género Phaseolus, p.ej. P. vulgaris, una planta que pertenece al género Pinus, p.ej. P. taeda, una planta que pertenece al género Populus, p.ej. P. deltoides, P. tremuloides, P. trichocarpa, una planta que pertenece al género Solanum, p.ej. S. tuberosum, una planta que pertenece al género Vitus, p.ej. Vitus vinifera, una planta que pertenece al género Zea, p.ej. Z. mays, u otros géneros vegetales, p.ej. Ammi, Avicennia, Camellia, Camptotheca, Catharanthus, Glycine, Helianthus, Lotus, Mesembryanthemum, Physcomitrella, Ruta, Saccharum, Vigna. El microorganismo podría ser un hongo que pertenece al género Aspergillus, p.ej. A. oryzae.

De manera alternativa, dicho ácido 4-cumárico se produce a partir de tirosina mediante una L-fenilalanina amoniaco liasa o una tirosina amoniaco liasa, p.ej. tirosina amoniaco liasa (EC 4.3.1.5) de levadura o bacteria. Esta es una reacción en la que se produce amoniaco. De manera adecuada, la tirosina amoniaco liasa es de la levadura Rhodotorula rubra o de la bacteria Rhodobacter capsulatus.

Opcionalmente, dicha tirosina amoniaco liasa se expresa en dicho microorganismo a partir de un ácido nucleico que codifica dicha enzima que no es nativa en el microorganismo.

Se puede producir ácido trans-cinámico a partir de L-fenilalanina en una reacción en la que se produce amoniaco mediante una fenilalanina amoniaco liasa.

En ciertas realizaciones preferidas, dicha L-fenilalanina amoniaco liasa es una L-fenilalanina amoniaco liasa (EC 4.3.1.5) de una planta o de un microorganismo. La planta puede pertenecer al género Arabidopsis, p.ej. A. thaliana, una planta que pertenece al género Brassica, p.ej. B. napus, B. rapa, una planta que pertenece al género Citrus, p.ej. C. reticulata, C. clementinus, C. limon, una planta que pertenece al género Phaseolus, p.ej. P. coccineus, P. vulgaris, una planta que pertenece al género Pinus, p.ej. P. banksiana, P. monticola, P. pinaster, P. sylvestris, P. taeda, una planta que pertenece al género Populus, p.ej. P. balsamifera, P. deltoides, P. Canadensis, P. kitakamiensis, P. tremuloides, una planta que pertenece al género Solanum, p.ej. S. tuberosum, una planta que pertenece al género Prunus, p.ej. P. avium, P. persica, una planta que pertenece al género Vitus, p.ej. Vitus vinifera, una planta que pertenece al género Zea, p.ej. Z. mays u otros géneros vegetales, p.ej. Agastache, Ananas, Asparagus, Bromheadia, Bambusa, Beta, Betula, Cucumis, Camellia, Capsicum, Cassia, Catharanthus, Cicer, Citrullus, Coffea, Cucurbita, Cynodon, Daucus, Dendrobium, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Eucalyptus, Gallus, Ginkgo, Glycine, Hordeum, Helianthus, Ipomoea, Lactuca, Lithospermum, Lotus, Lycopersicon, Medicago, Malus, Manihot, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Olea, Oryza, Pisum, Persea, Petroselinum, Phalaenopsis, Phyllostachys, Physcomitrella, Picea, Pyrus, Quercus, Raphanus, Rehmannia, Rubus, Sorghum, Sphenostylis, Stellaria, Stylosanthes, Triticum, Trifolium, Triticum, Vaccinium, Vigna, Zinnia. El microorganismo puede ser un hongo que pertenece al género Agaricus, p.ej. A. bisporus, un hongo que pertenece al género Aspergillus, p.ej. A. oryzae, A. nidulans, A. fumigatus, un hongo que pertenece al género Ustilago, p.ej. U. maydis, una bacteria que pertenece al género Rhodobacter, p.ej. R. capsulatus, una levadura que pertenece al género Rhodotorula, p.ej. R. rubra. De forma adecuada, dicha L-fenilalanina amoniaco liasa se expresa en dicho microorganismo a partir de un ácido nucleico que codifica dicha enzima que no es nativa en el microorganismo.

Se forma 4-cumaroil-CoA en una reacción catalizada por una 4-cumarato-CoA ligasa en la que ATP y CoA son sustratos y ADP es un producto.

Dicha 4-cumarato-CoA ligasa puede ser una 4-cumarato-CoA ligasa (EC 6.2.1.12) de una planta, un microorganismo

o un nemátodo. La planta puede pertenecer al género Abies, p.ej. A. beshanzuensis, B. firma, B. holophylla, una planta que pertenece al género Arabidopsis, p.ej. A. thaliana, una planta que pertenece al género Brassica, p.ej. B. napus, B. rapa, B. oleracea, una planta que pertenece al género Citrus, p.ej. C. sinensis, una planta que pertenece al género Larix, p.ej. L. decidua, L. gmelinii, L. griffithiana, L. himalaica, L. kaempferi, L. laricina, L. mastersiana, L. occidentalis, L. potaninii, L. sibirica, L. speciosa, una planta que pertenece al género Phaseolus, p.ej. P. acutifolius,

P.

coccineus, una planta que pertenece al género Pinus, p.ej. P. armandii P. banksiana, P. pinaster, una planta que pertenece al género Populus, p.ej. P. balsamifera, P. tomentosa, P. tremuloides, una planta que pertenece al género Solanum, p.ej. S. tuberosum, una planta que pertenece al género Vitus, p.ej. Vitus vinifera, una planta que pertenece al género Zea, p.ej. Z. mays, u otros géneros vegetales, p.ej. Agastache, Amorpha, Cathaya, Cedrus, Crocus, Festuca, Glycine, Juglans, Keteleeria, Lithospermum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Malus, Medicago, Mesembryanthemum, Nicotiana, Nothotsuga, Oryza, Pelargonium, Petroselinum, Physcomitrella, Picea, Prunus, Pseudolarix, Pseudotsuga, Rosa, Rubus, Ryza, Saccharum, Suaeda, Thellungiella, Triticum, Tsuga. El microorganismo podría ser un hongo filamentoso que pertenece al género Aspergillus, p.ej. A. flavus, A. nidulans, A. oryzae, A. fumigatus, un hongo filamentoso que pertenece al género Neurospora, p.ej. N. crassa, un hongo que pertenece al género Yarrowia, p.ej. Y. lipolytica, un hongo que pertenece al género Mycosphaerella, p.ej. M. graminicola, una bacteria que pertenece al género Mycobacterium, p.ej. M. bovis, M. leprae, M. tuberculosis, una bacteria que pertenece al género Neisseria, p.ej. N. meningitidis, una bacteria que pertenece al género Streptomyces, p.ej. S. coelicolor, una bacteria que pertenece al género Rhodobacter, p.ej. R. capsulatus, un nemátodo que pertenece al género Ancylostoma, p.ej. A. ceylanicum, un nemátodo que pertenece al género Caenorhabditis, p.ej. C. elegans, un nemátodo que pertenece al género Haemonchus, p.ej. H. contortus, un nemátodo que pertenece al género Lumbricus, p.ej. L. rubellus, un nemátodo que pertenece al género Meilodogyne, p.ej. M. hapla, un nemátodo que pertenece al género Strongyloidus, p.ej. S. rattii, S. stercoralis, un nemátodo que pertenece al género Pristionchus, p.ej. P. pacificus.

Opcionalmente, se ha introducido de forma recombinante una NADPH:citocromo P450 reductasa (CPR) en dicho microorganismo. Esta puede ser una CPR vegetal introducida en un microorganismo no vegetal. De manera alternativa, se ha sobreexpresado una NADPH:citocromo P450 reductasa (CPR) nativa en dicho microorganismo.

En ciertas realizaciones preferidas, que incluyen las mencionadas en los párrafos anteriores, dicha NADPH:citocromo P450 reductasa es una NADPH:citocromo P450 reductasa (EC 1.6.2.4) de una planta que pertenece al género Arabidopsis, p.ej. A. thaliana, una planta que pertenece al género Citrus, p.ej. C. sinensis, C. x paradisi, una planta que pertenece al género Phaseolus, p.ej. P. vulgaris, una planta que pertenece al género Pinus, p.ej. P. taeda, una planta que pertenece al género Populus, p.ej. P. deltoides, P. tremuloides, P. trichocarpa, una planta que pertenece al género Solanum, p.ej. S. tuberosum, una planta que pertenece al género Vitus, p.ej. Vitus vinifera, una planta que pertenece al género Zea, p.ej. Z. mays, u otros géneros vegetales, p.ej. Ammi, Avicennia, Camellia, Camptotheca, Catharanthus, Glycine, Helianthus, Lotus, Mesembryanthemum, Physcomitrella, Ruta, Saccharum, Vigna.

Aunque el microorganismo descrito en la presente memoria se puede dar de manera natural, preferiblemente al menos una copia de al menos una secuencia genética que codifica una enzima respectiva en dicha ruta metabólica se ha introducido de manera recombinante en dicho microorganismo.

Adicionalmente o alternativamente a la introducción de secuencias codificantes que codifican dicha enzima, se puede proporcionar una o más señales de expresión, tales como secuencias promotoras, que no están asociadas de manera nativa a dicha secuencia codificante en dicho organismo. Así, opcionalmente, al menos una copia de una secuencia genética que codifica una tirosina amoniaco liasa se une de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa a dicha secuencia genética en dicho organismo, y/o al menos una copia de una secuencia genética que codifica una L-fenilalanina amoniaco liasa se une de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa a dicha secuencia genética en dicho organismo.

Opcionalmente, al menos una copia de una secuencia genética que codifica una cinamato 4-hidroxilasa, sea nativa o no, se une de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa a dicha secuencia genética en dicho organismo. Opcionalmente, al menos una copia de una secuencia genética que codifica una 4cumarato-CoA ligasa, sea nativa o no, se une de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa a dicha secuencia genética en dicho organismo.

Opcionalmente, al menos una copia de una secuencia genética que codifica una resveratrol sintasa, sea nativa o no, se une de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa a dicha secuencia genética en dicho organismo.

Las señales de expresión incluyen secuencias de nucleótidos localizadas en dirección 5' (secuencias no codificantes de 5'), dentro, o en dirección 3' (secuencias no codificantes de 3') de una secuencia codificante, y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia codificante asociada. Tales secuencias pueden incluir promotores, secuencias líder de traducción, intrones, y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.

Lo anterior se puede considerar como ejemplificante del concepto de un microorganismo modificado metabólicamente que tiene una ruta metabólica operativa en la que un primer metabolito se transforma en un segundo metabolito en una reacción catalizada por una primera enzima, y dicha etapa de reacción produce amoniaco, y en la que dicho segundo metabolito se transforma en un tercer metabolito en una reacción catalizada por una segunda enzima, en la que el oxígeno es un sustrato, NADPH o NADH es un cofactor y NADP+ o NAD+ es un producto, y en la que dicho tercer metabolito se transforma en un cuarto metabolito en una reacción catalizada por una tercera enzima en la que ATP y CoA son un sustrato, y ADP es un producto, y en la que dicho cuarto metabolito se transforma en un quinto metabolito en una reacción catalizada por una cuarta enzima en la que el malonil-CoA endógeno es un sustrato.

Lo anterior se puede considerar también como ejemplificante del concepto de un microorganismo modificado metabólicamente que tiene una ruta metabólica operativa en la que un primer metabolito se transforma en dicho tercer metabolito catalizado por una primera enzima, y dicha etapa de reacción produce amoniaco, sin la implicación de dicha segunda enzima, y en la que dicho tercer metabolito se transforma en dicho cuarto metabolito en una reacción catalizada por dicha tercera enzima en la que ATP y CoA es un sustrato, y ADP es un producto, y en la que dicho cuarto metabolito se transforma en dicho quinto metabolito en una reacción catalizada por dicha cuarta enzima en la que el malonil-CoA endógeno es un sustrato.

Los microorganismos descritos anteriormente incluyen los que contienen una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica fenilalanina amoniaco liasa asociada de forma operable con una señal de expresión, y que contienen una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica cinamato-4-hidroxilasa asociada de forma operable con una señal de expresión, y que contienen una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica 4-cumarato-CoA-ligasa asociada de forma operable con una señal de expresión, y que contienen una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica resveratrol sintasa asociada de forma operable con una señal de expresión.

También incluyen los que carecen de actividad cinamato-4-hidroxilasa, y que contienen una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica tirosina amoniaco liasa asociada de forma operable con una señal de expresión, y que contienen una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica 4-cumarato-CoAligasa asociada de forma operable con una señal de expresión, y que contienen una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica resveratrol sintasa asociada de forma operable con una señal de expresión.

En el presente contexto, el término "microorganismo" se refiere a organismos microscópicos, que incluyen bacterias, hongos microscópicos, que incluyen levadura.

De manera más específica, el microorganismo puede ser un hongo, y de manera más específica un hongo filamentoso que pertenece al género Aspergillus, p.ej. A. niger, A. awamori, A. oryzae, A. nidulans, una levadura que pertenece al género Saccharomyces, p.ej. S. cerevisiae, S. kluyveri, S. bayanus, S. exiguus, S. sevazzi, S. uvarum, una levadura que pertenece al género Kluyveromyces, p.ej. K. lactis K. marxianus var. marxianus, K. thermotolerans, una levadura que pertenece al género Candida, p.ej. C. utilis C. tropicalis, C. albicans, C. lipolytica, C. versatilis, una levadura que pertenece al género Pichia, p.ej. P. stipidis, P. pastoris, P. sorbitophila, u otros géneros de levadura, p.ej. Cryptococcus, Debaromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, Zygosaccharomyces o Schizosaccharomyces. Con respecto a otros microorganismos, se suministra una lista no exhaustiva de hongos filamentosos adecuados: una especie que pertenece al género Penicillium, Rhizopus, Fusarium, Fusidium, Gibberella, Mucor, Mortierella, Trichoderma.

Con respecto a las bacterias, se proporciona una lista no exhaustiva de bacterias adecuadas a continuación: una especie que pertenece al género Bacillus, una especie que pertenece al género Escherichia, una especie que pertenece al género Lactobacillus, una especie que pertenece al género Lactococcus, una especie que pertenece al género Corynebacterium, una especie que pertenece al género Acetobacter, una especie que pertenece al género Acinetobacter, una especie que pertenece al género Pseudomonas, etc.

Los microorganismos preferidos de la invención pueden ser S. cerevisiae, A. niger, A. oryzae, E. coli, L. lactis o B. subtilis.

El microorganismo construido y modificado se puede cultivar mediante el uso de procedimientos conocidos normalmente, que incluyen los cultivos en quimiostato, por lotes, por lote alimentado, etc.

Así, la invención incluye un método para la producción de resveratrol o un derivado oligomérico o con unión glicosídica del mismo que comprende poner en contacto una célula no vegetal con un sustrato de carbono en ausencia sustancial de una fuente externa de ácido 4-cumárico, y dicha célula tiene la capacidad de producir resveratrol o un derivado oligomérico o con unión glicosídica del mismo en condiciones en las que el microorganismo se puede seleccionar del grupo que consiste en hongos y bacterias, en especial levadura.

Dicho sustrato de carbono se selecciona opcionalmente del grupo de sustratos de carbono fermentables que consiste en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos, p.ej. glucosa, fructosa, galactosa, xilosa, arabinosa, manosa, sacarosa, lactosa, eritrosa, treosa, y/o ribosa. Dicho sustrato de carbono se puede seleccionar además o de manera alternativa del grupo de sustratos de carbono no fermentables que incluye etanol, acetato, glicerol, y/o lactato. Dicho sustrato de carbono no fermentable se puede seleccionar además o de manera alternativa del grupo de aminoácidos, y puede ser fenilalanina y/o tirosina.

En un aspecto alternativo, la invención incluye un método para la producción de resveratrol o un derivado oligomérico o con unión glicosídica del mismo por medio de la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos que codifican la fenilalanina amoniaco liasa, cinamato 4-hidroxilasa, 4-cumarato-CoA ligasa y resveratrol sintasa, y también un método para la producción de resveratrol por medio de la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos que codifican tirosina amoniaco liasa, 4-cumarato-CoA ligasa y resveratrol sintasa.

El resveratrol o un derivado oligomérico o con unión glicosídica del mismo así producido se puede usar como un producto nutracéutico en un producto lácteo o una bebida, tal como cerveza.

El resveratrol producido según la invención puede ser cis-resveratrol o trans-resveratrol, pero se espera que la forma trans predomine normalmente.

Breve Descripción de los Dibujos

Para ayudar a entender fácilmente la descripción anterior de la invención, se ha hecho referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra la estructura química de trans-resveratrol;

La Figura 2 muestra la ruta fenilpropanoide que utiliza fenilalanina amoniaco liasa que actúa sobre la L-fenilalanina; y

La Figura 3 muestra la ruta alternativa que utiliza la fenilalanina amoniaco liasa que actúa sobre la L-tirosina.

La Figura 4 muestra los cromatogramas de HPLC de extractos de las cepas de S. cerevisiae FSSCPALC4H4CLVST, FSSC-TAL4CLVST, cultivadas con 100 g/l de galactosa. Se incluye un cromatograma de 60 nanogramos de resveratrol puro.

La Figura 5 muestra el espectro de absorción UV para trans-resveratrol puro y trans-resveratrol producido mediante la cepa de S. cerevisiae FSSC-PALC4H4CLVST, cultivada con 100 g/l de galactosa.

5 La Figura 6 muestra los cromatogramas de HPLC de extractos de las cepas de E. coli FSEC-TAL4CLVST y FSECcontrol, cultivadas con 50 g/l de glucosa.

La Figura 7 muestra los cromatogramas de HPLC de extractos de las cepas de E. coli FSEC-TAL4CLVST y FSECcontrol, cultivadas con 50 g/l de glucosa con la adición de 20 mg/l de ácido cumárico. Se incluye el espectro de absorción UV para el trans-resveratrol producido en la cepa FSEC-TAL4CLVST.

10 La invención se describirá y se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1

Aislamiento de los genes que codifican PAL, TAL, C4H, CPR, 4CL, y VST

La fenilalanina amoniaco liasa (PAL2) (Cochrane et al., 2004; SEQ ID Nº: 1, 2), cinamato 4-hidroxilasa (C4H)

15 (Mizutani et al., 1997; SEQ ID Nº: 3, 4) y 4-cumarato:CoenzimaA ligasa (4CL1) (Hamberger y Hahlbrock 2004; Ehlting et al., 1999; SEQ ID Nº: 5, 6) se aislaron por medio de PCR de cADN de A. thaliana (BioCat, Heidelberg, Alemania) mediante el uso de los cebadores de la tabla 1. PAL2 y 4CL1 se eligieron entre varios homólogos de A. thaliana debido a los parámetros cinéticos favorables hacia ácido cinámico y cumaroil-CoA, respectivamente (Cochrane et al.,, 2004; Hamberger y Hahlbrock 2004; Ehlting et al., 1999).

20 La secuencia codificante de la resveratrol sintasa (VST) de Rheum tataricum (Samappito et al., 2003; SEQ ID Nº: 7, 8) y tirosina amoniaco liasa (TAL) de Rhodobacter capsulatus (Kyndt et al., 2002; SEQ ID Nº: 11, 12) se optimizó con respecto a los codones para la expresión en S. cerevisiae mediante el uso la herramienta de traducción inversa del servicio en línea de www.entelechon.com, lo que produjo la secuencia SEQ ID Nº: 9, 10 y SEQ ID Nº: 13, 14 respectivamente. Los oligonucleótidos para el ensamblaje del gen sintético se construyeron en MWG Biotech, y el

25 gen sintético se construyó mediante PCR con el uso de un protocolo de un método ligeramente modificado del de Martin et al. (2003) descrito más adelante.

Tabla 1. Cebadores y sitios de restricción para la amplificación de genes

Cebador para la amplificación del gen* (los sitios de restricción están subrayados)

Gen Sitio de restricción: cebador Sitio de restricción: vector

5’-CGGAATTCTCATGGATCAAATCGAAGCAATGTT

PAL2 EcoR1 EcoR1

5’-CGACTAGTTTAGCAAATCGGAATCGGAGC

PAL2 Spe1 Spe1

5’-CGCTCGAGAT ATGGACCTCCTCTTGCTGGA

C4H Xho1 Xho1

5’-CGGGTACCTTAACAGTTCCTTGGTTTCATAAC

C4H Kpn1 Kpn1

5’-GCTCTAGACCT ATGGCGCCACAAGAACAAGCAGTTT

4CL1 Xba1 Spe1

5’-GCGGATCCCCT TCACAATCCATTTGCTAGTTT TGCC

4CL1 BamH1 BglII

5’-CC GGATCCAAATGGCCCCAGAAGAGAGCAGG

VST BamH1 BamH1

5’-CG CTCGAGTTAAGTGATCAATGGAACCGAAGACAG

VST Xho1 Xho1

5’-CCGAATTCCCATGACCCTGCAATCTCAAACAGCTAAAG

TAL EcoR1 EcoR1

5’-CCACTAGTTTAAGCAGGTGGATCGGCAGCT

TAL Spe1 Spe1

5’-CCCTCGAGATCATGCCGTTTGGAATAGACAACACCGA

CPR1 Xho1 Xho1

5’-CCAAGCTTATCGGGCTGATTACCAGACATCTTCTTG

CPR1 HindIII HindIII

5’-CCGGATCCCCATGTCCTCTTCTTCTTCTTCGTCAAC

AR2 BamH1 BamH1

5’-CCCTCGAGGTGAGTGTGTGGCTTCAATAGTTT CG

AR2 Xho1 Xho1

Cebador para la amplificación del gen* (los sitios de restricción están subrayados)

Gen Sitio de restricción: cebador Sitio de restricción: vector

* SEQ ID Nºs 19-32

Los cebadores de MWG para el ensamblaje del gen sintético se disolvieron en agua milliQ a una concentración de 100 pmoles/μl. Se combinó una alícuota de 5 μl de cada cebador en Totalmix y después se diluyó 10 veces con agua milliQ. El gen se ensambló por medio de PCR mediante el uso de 5 μl de Totalmix diluida por 50 μl como molde para la ADN polimerasa de fusión (Finnzymes). El programa de PCR fue como sigue: Inicialmente 98 °C durante 30 s., y después 30 ciclos con 98 °C durante 10 s., 40 °C durante 1 min. y 72 °C a 1 min./1000 pares de bases, y finalmente 72 °C durante 5 min. De la reacción de PCR resultante, se purificaron 20 μl en un gel de agarosa del 1 %. El resultado fue una mancha de PCR, y las regiones de alrededor del tamaño deseado se cortaron del gel de agarosa y se purificaron mediante el uso del equipo de extracción de geles QiaQuick (Qiagen). Una PCR final con los cebadores externos (para TAL y VST) de la tabla 1 proporcionó los genes TAL y VST necesarios. Las mutaciones puntuales se corrigieron mediante el uso del equipo de mutagénesis dirigida Quick-change II (Stratagene, La Jolla, CA), o mediante el uso de PCR de tramos de ADN sin errores solapantes de diversos subclones de E. coli diferentes. La NADPH:Citocromo P450 reductasa (CPR) de A. thaliana (AR2) (Mizutani y Ohta, 1998; SEQ ID Nº: 17, 18) y de S. cerevisiae (CPR1) (Aoyama et al., 1978; SEQ ID Nº: 15, 16), se aislaron de cADN de A. thaliana (BioCat, Heidelberg, Alemania) y ADN genómico de S. cerevisiae, respectivamente, mediante el uso de los cebadores de la tabla 1.

Ejemplo 2

Construcción de un vector de levadura para la expresión de PAL

El gen que codifica PAL, aislado como se describió en el ejemplo 1, se volvió a amplificar mediante PCR con el uso de los cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contenían sitios de restricción EcoR1 y Spe1 (tabla 1). El producto de PCR de PAL amplificado se digirió con EcoR1/Spe1 y se ligó en un vector pESC-URA digerido con EcoR1/Spe1 (Stratagene), lo que dio como resultado el vector pESC-URA-PAL. La secuencia del gen se verificó mediante secuenciación de dos clones diferentes.

Ejemplo 3

Construcción de un vector de levadura para la expresión de PAL y C4H

El gen que codifica C4H, aislado como se describió en el ejemplo 1, se amplificó mediante PCR con el uso de los cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contenían sitios de restricción Xho1 y Kpn1. El producto de PCR de C4H amplificado se digirió con Xho1/Kpn1 y se ligó en un vector pESC-URA-PAL digerido de forma similar. El plásmido resultante, pESC-URA-PAL-C4H, contenía los genes que codifican PAL y C4H bajo control del promotor GAL1/GAL10 divergente. La secuencia del gen que codifica C4H se verificó mediante secuenciación de dos clones diferentes.

Ejemplo 4

Construcción de un vector de levadura para la expresión de 4CL

El gen que codifica 4CL se aisló como se describió en el ejemplo 1. El producto de PCR de 4CL amplificado se digirió con Xba1/BamH1 y se ligó en un vector pESC-TRP digerido con Spe1/BglII (Stratagene), lo que dio como resultado el vector pESC-TRP-4CL.

Se secuenciaron dos clones diferentes de pESC-TRP-4CL para verificar la secuencia del gen clonado.

Ejemplo 5

Construcción de un vector de levadura para la expresión de 4CL y VST

El gen que codifica VST se aisló como se describió en el ejemplo 1. El gen VST sintético amplificado se digirió con BamH1/Xho1 y se ligó en pESC-TRP-4CL digerido con BamH1/Xho1 (ejemplo 4). El plásmido resultante, pESC-TRP-4CL-VST, contuvo los genes que codifican 4CL y VST bajo control del promotor GAL1/GAL10 divergente. La secuencia del gen que codifica VST se verificó mediante secuenciación de dos clones diferentes de pESC-TRP-4CL-VST.

Ejemplo 6

Construcción de un vector de levadura para la expresión de TAL

El gen que codifica TAL se aisló como se describió en el ejemplo 1. El gen TAL sintético amplificado se digirió con EcoR1/Spe1 y se ligó en el vector pESC-URA digerido con EcoR1/Spe1. El plásmido resultante, pESC-URA-TAL, contuvo el gen que codifica TAL bajo control del promotor GAL1/GAL10 divergente. La secuencia se verificó mediante la secuenciación de dos clones diferentes de pESC-URA-TAL.

Ejemplo 7

Construcción de un vector de levadura para la sobreexpresión de CPR endógeno de S. cerevisiae

El gen que codifica CPR de S. cerevisiae (CPR1) se aisló como se describió en el ejemplo 1. El gen CPR1 amplificado se digirió con Xho1/HindIII y se ligó en el vector pESC-LEU digerido con Xho1/HindIII (Stratagene), lo que dio como resultado el vector pESC-LEU-CPR1. La secuencia se verificó mediante la secuenciación de dos clones diferentes de pESC-LEU-CPR1.

Ejemplo 8

Construcción de un vector de levadura para la sobreexpresión de CPR de A. thaliana (AR2)

El gen que codifica CPR de A. thaliana (AR2) se aisló como se describió en el ejemplo 1. El gen AR2 amplificado se digirió con BamH1/Xho1 y se ligó en el vector pESC-LEU digerido con BamH1/Xho1 (Stratagene), lo que dio como resultado el vector pESC-LEU-AR2. La secuencia se verificó mediante la secuenciación de dos clones diferentes de pESC-LEU-AR2.

Ejemplo 9

Expresión de la ruta hasta resveratrol en la levadura S. cerevisiae mediante el uso de PAL, C4H, 4CL y VST

Las cepas de levadura que contenían los marcadores genéticos adecuados se transformaron con los vectores descritos en los ejemplos 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8, por separado o en combinación. La transformación de la célula de levadura se llevó a cabo de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de células competentes o mediante electroporación (véase, p.ej., Sambrook et al., 1989). Los transformantes se seleccionaron en un medio que carecía de uracilo y/o triptófano, y se purificaron mediante siembra en estrías en el mismo medio.

La cepa de S. cerevisiae CEN.PK 113-5D (MATa ura3) se transformó por separado con el vector pESC-URA-PAL (ejemplo 2), lo que proporcionó la cepa FSSC-PAL, y con pESC-URA-PAL-C4H (ejemplo 3), lo que dio como resultado la cepa FSSC-PALC4H. La cepa de S. cerevisiae FS01267 (MATa trp1 ura3) se co-transformó con pESC-URA-PAL-C4H y pESC-TRP-4CL (ejemplo 4), y la cepa transformada se denominó FSSC-PALC4H4CL. La misma cepa se co-transformó también con pESC-URA-PAL-C4H y pESC-TRP-4CL-VST (ejemplo 5), lo que dio como resultado la cepa FSSC-PALC4H4CLVST.

Ejemplo 10

Expresión de la ruta hasta resveratrol en S. cerevisiae mediante el uso de TAL, 4CL y VST.

La cepa de S. cerevisiae CEN.PK 113-5D (MATa ura3) se transformó por separado con el vector pESC-URA-TAL (ejemplo 6), lo que proporcionó la cepa FSSC-TAL. La cepa de S. cerevisiae FS01267 (MATa trp1 ura3) se cotransformó con pESC-URA-TAL (ejemplo 6) y pESC-TRP-4CL (ejemplo 4), y la cepa transformada se denominó FSSC-TAL4CL. La misma cepa se co-transformó también con pESC-URA-TAL y pESC-TRP-4CL-VST (ejemplo 5), lo que dio como resultado la cepa FSSC-TAL4CLVST. Los transformantes se seleccionaron en un medio que carecía de uracilo y/o triptófano, y se purificaron mediante siembra en estrías en el mismo medio.

Ejemplo 11

Expresión de la ruta hasta resveratrol en S. cerevisiae con CPR endógeno sobreexpresado.

La cepa de S. cerevisiae FS01277 (MATa ura3 leu2 trp1) se co-transformó con los vectores pESC-URA-PAL-C4H (ejemplo 3), pESC-TRP-4CL (ejemplo 4), y pESC-LEU-CPR1 (ejemplo 7). La cepa transformada se denominó FSSC-PALC4H4CLVSTCPR. Los transformantes se seleccionaron en un medio que carecía de uracilo y/o triptófano, y se purificaron mediante siembra en estrías en el mismo medio.

Ejemplo 12

Expresión de la ruta hasta resveratrol en S. cerevisiae con CPR de A. thaliana (AR2) sobreexpresado.

La cepa de S. cerevisiae FS01277 (MATa ura3 leu2 trp1) se co-transformó con los vectores pESC-URA-PAL-C4H (ejemplo 3), pESC-TRP-4CL (ejemplo 4), y pESC-LEU-AR2 (ejemplo 8). La cepa transformada se denominó FSSC-PALC4H4CLVSTAR2. Los transformantes se seleccionaron en un medio que carecía de uracilo y/o triptófano, y se purificaron mediante siembra en estrías en el mismo medio.

Ejemplo 13

Fermentación con cepas de levadura recombinantes en matraces de agitación

Las cepas de levadura recombinantes se inocularon a partir de placas de agar con un asa de inoculación estéril y se cultivaron en 200 ml de medio mineral definido (Verduyn et al, 1992) que contenía vitaminas, oligoelementos, 5 g/l de glucosa y 40 g/l o 100 g/l de galactosa. Los matraces de agitación de 500 ml taponados se incubaron durante tres días a 30 °C y 160 rpm.

Ejemplo 14

Extracción de resveratrol

Las células se recogieron mediante centrifugación a 5000 g durante 5 minutos. Se extrajo una alícuota de 50 ml de sobrenadante una vez con 20 ml de acetato de etilo. El acetato de etilo se liofilizó y el producto seco se redisolvió en 0,7 ml de metanol y se filtró en viales de HPLC.

El sedimento celular de 200 ml de medio se disolvió en 1 a 2 ml de agua y se dividió en 3 tubos FastPrep y se rompió con esferas de vidrio. Los extractos brutos de los tres tubos se mezclaron en 10 ml de metanol del 100 % en un tubo Sartorius de 50 ml, y se extrajo en una cámara rotatoria durante 48 horas en una sala de refrigeración oscura a 4 °C. Después de 48 horas, los restos celulares se eliminaron por medio de centrifugación durante 5 min. a 5000 g, y el metanol se eliminó mediante liofilización durante la noche. El residuo seco se redisolvió en 1 ml de tampón fosfato-citrato de pH 5,4, y se añadieron 10 unidades de beta-glucosidasa de almendra (Sigma) para liberar el resveratrol de las supuestas formas con unión de glucósido. La mezcla se incubó durante tres horas a 37 °C y después se extrajo dos veces con 1 ml de acetato de etilo. El acetato de etilo combinado se liofilizó y el residuo seco se redisolvió en 0,7 ml de metanol y se filtró en viales de HPLC.

Ejemplo 15

Análisis de resveratrol

Cromatografía en capa fina

Se desarrolló un método basado en la cromatografía en capa fina que permitió la separación rápida de ácido cinámico, ácido cumárico y resveratrol en la misma placa de CCF para el análisis de cribado rápido. Se extrajo una alícuota de 1 ml de cultivo que contenía tanto células como sobrenadante con 500 microlitros de acetato de etilo y se centrifugó durante 30 s. a 13000 rpm con una microcentrífuga. El acetato de etilo se secó, y se redisolvió en metanol. Los extractos se analizaron en placas de Sílice G (0,2 mm Alugram SIL G/UV254, Macherey-Nagel) que contenían un indicador fluorescente. La fase móvil fue una mezcla de cloroformo, acetato de etilo y ácido fórmico (25:10:1).

HPLC

Para el análisis cuantitativo de ácido cinámico, ácido cumárico, y resveratrol, las muestras se sometieron a separación mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), sistema Agilent Series 1100 (Hewlett Packard) antes de la detección mediante matriz de diodos UV a A = 306 nm. Se usó una columna Phenomenex (Torrance, CA, EE.UU.) Luna de C18 de 3 micras (100 X 2,00 mm) a 40 °C. Como fase móvil, se usó un gradiente de acetonitrilo y agua milliQ (que contenían ambos 50 ppm de ácido trifluoroacético) a un caudal de 0,4 ml/min. El perfil del gradiente fue lineal desde un 15 % de acetonitrilo hasta un 100 % de acetonitrilo a lo largo de 20 min. Los tiempos de elución fueron de aproximadamente 3,4 min. para ácido cumárico, 5,5 min. para trans-resveratrol libre y 6,8 min. para ácido cinámico.

El patrón de resveratrol puro se adquirió de Cayman Chemical Company, mientras los patrones de ácido cumárico y de ácido cinámico puros se adquirieron de Sigma.

Resultados

Las cepas FSSC-PALC4H4CLVST y FSSC-TAL4CLVST se cultivaron en 100 g/l de galactosa como se describió en el ejemplo 13, y se analizó su contenido de resveratrol intracelular según los ejemplos 14 y 15. Además, se incluyó una cepa de control FSSC-control que contenía solamente los vectores vacíos pESC-URA y pESC-TRP. El análisis mediante HPLC demostró que las cepas FSSC-PALC4H4CLVST y FSSC-TAL4CLVST contenían un componente con un tiempo de retención de 5,5 min. que fue idéntico a trans-resveratrol (figura 4). Dicho resultado se confirmó mediante los espectros de absorción UV, que también fueron similares al espectro de absorción de trans-resveratrol puro (figura 5), con una Amax de aproximadamente 306 nm.

Los resultados, por lo tanto, demostraron la presencia de una ruta fenil-propanoide activa en S. cerevisiae que condujo a la producción in vivo de trans-resveratrol. La producción de resveratrol se puede mejorar probablemente cultivando las cepas en condiciones de cultivo bien definidas en cultivos por lotes y continuos, y/o optimizando la expresión/actividades de las enzimas individuales.

Ejemplo 16

Construcción de un vector bacteriano para la expresión de TAL en Escherichia coli.

El gen que codifica TAL, aislado como se describió en el Ejemplo 1, se reamplificó mediante PCR del plásmido pESC-URA-TAL (ejemplo 6) mediante el uso del cebador directo 5'-CCG CTCGAG CGG ATG ACC CTG CAA TCT CAA ACA GCT AAA G-3' SEQ ID Nº 33 y el cebador inverso 5'-GC GGATCC TTA AGC AGG TGG ATC GGC AGC T-3' SEQ ID Nº 34 con salientes en 5' que contenían los sitios de restricción XhoI y BamHI, respectivamente. La introducción de los sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del gen permitió la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en un vector pET16b (Novagen), digerido con XhoI y BamHI para proporcionar pET16b-TAL. El vector pET16b contuvo tanto el gen de resistencia a ampicilina como el promotor de T7. Por lo tanto, el procedimiento anterior dio como resultado un vector con un marcador de selección por antibiótico que contenía el gen que codifica TAL bajo control del promotor de T7. La secuencia del gen que codifica TAL se verificó mediante secuenciación de un clon de pET16b-TAL.

Ejemplo 17

Construcción de un vector bacteriano para la expresión de 4CL y VST en Escherichia coli.

El gen que codifica VST, aislado como se describió en el ejemplo 1, se cortó con las enzimas de restricción BamHI y XhoI del plásmido digerido pESC-TRP-4CL-VST (ejemplo 5), que contenía los genes que codifican 4CL y VST. El gen VST se ligó en un vector pET26b (Novagen), que contenía el gen de resistencia a kanamicina, y se digirió con BamHI y SalI para proporcionar pET26b-VST. Las enzimas de restricción XhoI y SalI tienen extremos compatibles, que permitieron una ligadura adecuada. El vector pET26b contuvo tanto el gen de resistencia a kanamicina como el promotor de T7. Por lo tanto, el procedimiento anterior dio como resultado un vector con un marcador de selección por antibiótico que contenía el gen que codifica VST bajo control del promotor de T7.

El gen que codifica 4CL, aislado como se describió en el ejemplo 1, se reamplificó mediante PCR del plásmido pESC-URA-4CL-VST (ejemplo 5) mediante el uso del cebador directo 5'-TG CCATGG CA ATGGCGCCAC AAGAACAAGC AGTTT-3' SEQ ID Nº 35 y el cebador inverso 5'-GC GGATCC CCT TCA CAA TCC ATT TGC TAG TTT TGCC-3' SEQ ID Nº 36 con salientes en 5' que contenían los sitios de restricción NcoI y BamHI, respectivamente. La introducción de sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del gen permitió la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en un vector pET16b (Novagen) digerido con NcoI y BamHI. El plásmido resultante, pET16b-4CL, contuvo el gen que codifica 4CL bajo control del promotor de T7. Tanto el promotor de T7 como el gen que codifica 4CL se reamplificaron en forma de un fragmento mediante PCR del plásmido pET16b-4CL con el uso del cebador directo 5'-TT GCGGCCGC AAA TCT CGA TCC CGC GAA ATT AAT ACG-3' SEQ ID Nº 37 y el cebador inverso 5'-CG CTCGAG CCT TCA CAA TCC ATT TGC TAG TTT TGCC-3' SEQ ID Nº 38 con salientes en 5', que contenían los sitios de restricción NotI y XhoI, respectivamente. La introducción de sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del fragmento de ADN permitió la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en el plásmido pET26b-VST que se digirió con NotI y XhoI antes de la ligadura. El plásmido resultante, pET26b-VST-4CL, contuvo los dos genes 4CL y VST que estuvieron cada uno bajo control de un promotor de T7 individual.

Ejemplo 18

Expresión de la ruta hasta resveratrol en Escherichia coli, mediante el uso de TAL, 4CL y VST.

La transformación de la célula bacteriana se llevó a cabo de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de células competentes o mediante electroporación (véase, p.ej., Sambrook et al., 1989). La cepa de E. coli BL21 (DE3) (Novagen) se co-transformó con los dos vectores pET16b-TAL (ejemplo 16) y pET26b-VST-4CL (Ejemplo 17), lo que dio como resultado la cepa FSEC-TAL4CLVST. Además, la cepa de E. coli BL21 (DE3) se co-transformó con los dos vectores vacíos pET16b (Novagen) y pET26b (Novagen), lo que dio como resultado la cepa FSEC-control, que se usó como cepa de control. Los transformantes se seleccionaron en medio Luria-Bertani (LB) con 100 μg/ml de ampicilina y 60 μg/ml de kanamicina.

Ejemplo 19

Fermentación con cepas de Escherichia coli recombinantes en matraces de agitación.

Se cultivaron pre-cultivos de Escherichia coli BL21 (DE3) en tubos de vidrio a 160 rpm y 37 °C en 7 ml de medio LB que contenía 100 μg/ml de ampicilina y 60 μg/ml de kanamicina. Se usaron los precultivos en crecimiento exponencial para la inoculación de matraces de agitación con deflectores de 500 ml que contenían 200 ml de medio LB complementado con 50 g/l de glucosa, 5 g/l de K2HPO4, 80 μg/ml de ampicilina y 50 μg/ml de kanamicina, y se incubaron a 160 rpm y 37 °C. Después de 5 horas, se añadió R-tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) a una concentración final de 1 mM, como inductor del promotor de T7 que estaba al principio de cada uno de los tres genes TAL, 4CL y VST. Después de un periodo de incubación de 48 horas a 37 °C, las células se recogieron y se sometieron a procedimientos de extracción y se analizó la presencia del resveratrol producido.

Ejemplo 20

Extracción y análisis de resveratrol en Escherichia coli.

La extracción y el análisis se llevaron a cabo mediante el uso de los métodos descritos en los ejemplos 14 y 15.

Resultados

Las cepas FSEC-TAL4CLVST y FSEC-control se cultivaron con 50 g/l de glucosa como se describió en el ejemplo 19, y se analizó su contenido de resveratrol intracelular según los ejemplos 14 y 15. El análisis mediante HPLC demostró que la cepa FSEC-TAL4CLVST contuvo cantidades considerables de un componente con un tiempo de retención de 3,4 min., que es idéntico al ácido cumárico (figura 6). Sin embargo, el extracto no contuvo un componente que eluyese en el mismo tiempo del trans-resveratrol. Dicho resultado, por lo tanto, indica que la tirosina amoniaco liasa (TAL) fue activa, de hecho, pero no condujo a la producción de cantidades detectables de resveratrol. La ausencia de formación de resveratrol, sin embargo, pudo ser el resultado de; i) una cumarato-CoA ligasa (4CL) no funcional; ii) una resveratrol sintasa (VST) no funcional; iii) niveles demasiado bajos de ácido cumárico, provocados por condiciones de cultivo que no fueron óptimas, o expresión/actividad de TAL que no fueron óptimas, o ramificación del ácido cumárico hacia otros productos. Para estudiar dichas hipótesis, las cepas se cultivaron en un medio similar al descrito en el ejemplo 19, pero ahora en presencia de 20 mg/l de ácido cumárico. El análisis mediante HPLC posterior de los extractos de FSEC-TAL4CLVST, de hecho, mostró un agrupamiento de picos alrededor del mismo tiempo de retención del trans-resveratrol, que no se observó en los extractos de FScontrol (figura 6). De hecho, el espectro de absorción UV del pico con un tiempo de retención de 5,5 min. fue similar al espectro de trans-resveratrol puro (figura 7), mientras no se pudo obtener dicho espectro para los picos en la cepa de control. Los resultados, por lo tanto, indican claramente la presencia de una ruta fenilpropanoide activa en Escherichia coli, que puede conducir a la producción de resveratrol. Lo más probablemente, la producción de resveratrol sin la adición de ácido cumárico se puede conseguir cultivando las cepas en condiciones de cultivo bien definidas en cultivos por lotes y continuos, y/o optimizando la expresión/actividades de las enzimas individuales.

Ejemplo 21

Construcción de un vector bacteriano para la expresión de PAL y C4H en Lactococcus lactis.

El plásmido pSH71, y los derivados del mismo, que se usa en los ejemplos siguientes, es un vector lanzadera bifuncional con múltiples orígenes de replicación de Escherichia coli y Lactococcus lactis. Con él, la especificidad de la serie de hospedadores abarca Escherichia coli y otras especies de bacterias de ácido láctico. Aunque las transformaciones en Lactoccus lactis normalmente tienen lugar sin problemas, las supuestas transformaciones difíciles en otras especies de bacterias de ácido láctico se pueden superar, por tanto, mediante el uso de Escherichia coli como hospedador intermedio para la construcción de plásmidos recombinantes. El plásmido contiene uno o más genes marcadores para permitir que el microorganismo que lo alberga se seleccione de los que no lo albergan. El sistema de selección que se usa para Lactococcus lactis se basa en marcadores dominantes, p.ej. resistencia hacia eritromicina y cloranfenicol, pero también se han descrito sistemas basados en genes implicados en el metabolismo de carbohidratos, peptidasas y marcadores de grado alimentario. Además, el plásmido contiene secuencias promotoras y terminadoras que permiten la expresión de los genes recombinantes. Los promotores adecuados se adquieren de genes de Lactococcus lactis, p.ej. lacA. Además, el plásmido contiene sitios de restricción únicos adecuados para facilitar la clonación de fragmentos de ADN y la identificación posterior de los recombinantes.

En los ejemplos siguientes, el plásmido contiene el gen de resistencia a eritromicina, denominado pSH71-ERYr, o el gen de resistencia a cloranfenicol, denominado pSH71-CMr.

El gen que codifica PAL, aislado como se describió en el ejemplo 1, se reamplifica mediante PCR del plásmido pESC-URA-PAL-C4H (ejemplo 3), mediante el uso de cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contienen sitios de restricción adecuados. La introducción de dichos sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del gen permite la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en un vector pSH71-ERYr digerido que contiene el promotor lacA de Lactococcus lactis. El plásmido resultante, pSH71-ERYr-PAL, contiene el gen que codifica PAL bajo control del promotor lacA de Lactococcuss lactis.

El gen que codifica C4H, aislado como se describió en el ejemplo 1, se reamplifica mediante PCR del plásmido pESC-URA-PAL-C4H (ejemplo 3), mediante el uso de cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contienen sitios de restricción adecuados. La introducción de dichos sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del gen permite la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en un vector pSH71-CMr digerido para proporcionar pSH71-CMr-C4H. El promotor lacA y el gen que codifica C4H se reamplifican en forma de un fragmento mediante PCR del plásmido pSH71-CMr-C4H con el uso de cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contienen sitios de restricción adecuados. La introducción de dichos sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del fragmento de ADN permite la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en el plásmido digerido pSH71ERYr-PAL. El plásmido resultante, pSH71-ERYr-PAL-C4H, contiene los genes que codifican PAL y C4H que están cada uno bajo control de un promotor lacA individual. La secuencia de los genes que codifican PAL y C4H se verifica mediante secuenciación de dos clones diferentes de pSH71-ERYr-PAL-C4H.

Ejemplo 22

Construcción de un vector bacteriano para la expresión de TAL en Lactococcus lactis.

El gen que codifica TAL, aislado como se describió en el ejemplo 1, se reamplifica mediante PCR del plásmido pESC-URA-TAL (ejemplo 6), mediante el uso de cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contienen sitios de restricción adecuados. La introducción de dichos sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del gen permite la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en un vector pSH71-ERYr digerido. El plásmido resultante, pSH71-ERYr-TAL, contiene el gen que codifica TAL bajo control del promotor lacA de Lactococcus lactis. La secuencia del gen que codifica TAL se verifica mediante secuenciación de dos clones diferentes de pSH71-ERYr-TAL.

Ejemplo 23

Construcción de un vector bacteriano para la expresión de 4CL y VST en Lactococcus lactis.

El gen que codifica 4CL, aislado como se describió en el ejemplo 1, se reamplifica mediante PCR del plásmido pESC-TRP-4CL-VST (ejemplo 5), mediante el uso de cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contienen sitios de restricción adecuados. La introducción de dichos sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del gen permite la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en un vector pSH71-CMr digerido. El plásmido resultante, pSH71-CMr-4CL, contiene el gen que codifica 4CL bajo control del promotor lacA de Lactobacillus lactis.

El gen que codifica VST, aislado como se describió en el ejemplo 1, se reamplifica mediante PCR del plásmido pESC-TRP-4CL-VST (ejemplo 5), mediante el uso de cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contienen sitios de restricción adecuados. La introducción de dichos sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del gen permite la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en un vector pSH71-ERYr digerido. El plásmido resultante, pSH71-ERYr-VST, contiene el gen que codifica VST bajo control del promotor lacA de Lactococcus lactis. El promotor lacA y el gen que codifica VST se reamplifican en forma de un fragmento mediante PCR del plásmido pSH71-ERYr-VST con el uso de cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contienen sitios de restricción adecuados. La introducción de dichos sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del fragmento de ADN permite la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en el plásmido digerido pSH71-CMr-4CL. El plásmido resultante, pSH71-CMr-4CL-VST, contiene los genes que codifican 4CL y VST que están cada uno bajo control de su promotor lacA individual. La secuencia de los genes que codifican 4CL y VST se verifica mediante la secuenciación de dos clones diferentes de pSH71-CMr-4CL-VST.

Ejemplo 24

Expresión de la ruta hasta resveratrol en Lactococcus lactis

Las cepas de Lactococcus lactis se transforman con los vectores descritos en los ejemplos 21, 22 y 23, por separado

o en combinación. La transformación de la célula bacteriana se lleva a cabo de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de células competentes o mediante electroporación (véase, p.ej., Sambrook et al., 1989). Los transformantes se seleccionan en un medio que contiene los antibióticos eritromicina y cloranfenicol, y se purifican mediante siembra en estrías en el mismo medio.

La cepa de Lactococcus lactis MG1363 se transforma por separado con el vector pSH71-ERYr-TAL (ejemplo 22), lo que produce la cepa FSLL-TAL; con pSH71-ERYr-PAL-C4H (ejemplo 21), lo que produce la cepa FSLL-PALC4H y con pSH71-CMr-4CL-VST (ejemplo 23), lo que produce la cepa FSLL-4CLVST. Además, la cepa de Lactococcus lactis MG1363 se co-transforma con pSH71-ERYr-TAL (ejemplo 22) y pSH71-CMr-4CL-VST (ejemplo 23), y la cepa transformada se denomina FSLL-TAL4CLVST. La misma cepa se co-transforma también con pSH71-ERYr-PAL-C4H (ejemplo 21), y pSH71-CMr-4CL-VST (ejemplo 23), lo que da como resultado la cepa FSLL-PALC4H4CLVST.

Ejemplo 25

Fermentación con cepas de Lactococcus lactis recombinantes en fermentadores.

Las cepas de levadura recombinantes se pueden cultivar en fermentadores que funcionan por lotes, por lote alimentado o cultivos en quimiostato.

Cultivos por Lotes y por Lote Alimentado

El microorganismo se cultiva en un biorreactor con deflectores con un volumen de trabajo de 1,5 litros en condiciones anaerobias, aerobias o microaerobias. Todos los cultivos se incuban a 30 °C, a 350 rpm. Se mantiene un pH constante de 6,6 mediante la adición automática de KOH 10 M. Las células se cultivan con lactosa en un medio MS10 definido complementado con los siguientes componentes para permitir el cultivo en condiciones aerobias: MnSO4 (1,25 x 10-5 g/l), tiamina (1 mg/l), y ácido DL-6,8-tióctico (2,5 mg/l). La concentración de lactosa es, por ejemplo, 50 g/l. Los biorreactores se inoculan con células de precultivos cultivados a 30 °C en matraces de agitación con el medio descrito anteriormente tamponado con concentraciones tres veces mayores de K2HPO4 y KH2PO4. Las condiciones anaerobias se aseguran purgando el medio con N2 (99,998% puro) antes de la inoculación, y manteniendo un flujo constante de 50 ml/min de N2 a través del espacio de aire del biorreactor durante el cultivo. Los biorreactores usados para el cultivo microaerobio y aerobio están equipados con sensores de oxígeno polarográficos que se calibran con aire (DOT, 100%) y N2 (DOT, 0%). Las condiciones aerobias se obtienen inyectando en el biorreactor aire a una velocidad de 1 vvm para asegurar que el DOT es mayor del 80%. Durante los experimentos microaerobios, el DOT se mantiene constantemente en un 5% inyectando en el reactor gas compuesto de una mezcla de N2 y aire atmosférico, a una velocidad de 0,25 vvm.

Cultivos en quimiostato

En los cultivos en quimiostato, las células se pueden cultivar, por ejemplo, en fermentadores de laboratorio Applikon de un volumen de trabajo de 1 L a 30 °C y 350 rpm. La velocidad de dilución (D) se puede ajustar a diferentes valores, p.ej. a 0,050 h-1, 0,10 h-1, 0,15 h-1, o 0,20 h-1. El pH se mantiene constante, p.ej. a 6,6, mediante la adición automática de KOH 5 M, mediante el uso del medio de cultivo descrito anteriormente, complementado con un antiespumante (50 1l/l). La concentración de lactosa se puede ajustar a diferentes valores, p.ej. es 3,0 g/l, 6,0 g/l, 12,0 g/l, 15,0 g/l o 18,0 g/l. El biorreactor se inocula a una concentración de biomasa inicial de 1 mg/l, y la bomba de alimentación se enciende al final de la fase de crecimiento exponencial.

Se obtiene un estado estacionario anaerobio mediante la introducción de 50 ml/min de N2 (99,998% puro) en el espacio de aire del biorreactor. Se pueden obtener diferentes estados estacionarios anóxicos mediante la inyección en el reactor de 250 ml/min de gas compuesto de N2 (99,998% puro) y aire atmosférico a diversas proporciones. El electrodo de oxígeno se calibra inyectando en el biorreactor aire (DOT del 100%) y N2 (DOT del 0%).

Para todas las condiciones, el gas se esteriliza mediante filtración antes de introducirlo en el biorreactor. El gas de salida se conduce a través de un condensador enfriado a menos de -8 °C y se analiza su contenido volumétrico de CO2 y O2 por medio de un analizador de gases acústico.

Se considera que los cultivos están en estado estacionario después de al menos 5 tiempos de residencia, y si las concentraciones de biomasa y productos finales de la fermentación permanecen sin cambios (menos del 5% de desviación relativa) a lo largo de los dos últimos tiempos de residencia.

Ejemplo 26

Extracción y análisis de resveratrol en Lactococcus lactis

La extracción y el análisis se llevan a cabo mediante el uso de los métodos descritos en los ejemplos 14 y 15.

Ejemplo 27

Construcción de un vector fúngico para la expresión de PAL y C4H en una especie que pertenece al género Aspergillus.

El plásmido que se usa en los siguientes ejemplos deriva de pARp1 que contiene la secuencia de iniciación de la replicación AMA1 de Aspergillus nidulans, que también mantiene la replicación autónoma del plásmido en A. niger y

A. oryzae (Gems et al., 1991). Además, el plásmido es un vector lanzadera, que contiene la secuencia de replicación de Escherichia coli, y las transformaciones difíciles inherentes en Aspergillus niger y Aspergillus oryzae se podrían superar, por tanto, mediante el uso de Escherichia coli como hospedador intermedio para la construcción de plásmidos recombinantes. El plásmido contiene uno o más genes marcadores para permitir que el microorganismo que lo alberga se seleccione de los que no lo albergan. El sistema de selección se puede basar en marcadores dominantes, p.ej. resistencia hacia higromicina B, fleomicina y bleomicina, o marcadores heterólogos, p.ej. aminoácidos y el gen pirG. Además, el plásmido contiene secuencias promotoras y terminadoras que permiten la expresión de los genes recombinantes. Los promotores adecuados se toman de genes de Aspergillus nidulans, p.ej. alcA, glaA, amy, niaD,y gpdA. Además, el plásmido contiene sitios de restricción únicos adecuados para facilitar la clonación de fragmentos de ADN y la identificación posterior de los recombinantes.

El plásmido usado en los ejemplos siguientes contiene el promotor constitutivo fuerte gpdA y marcadores auxotrópicos, todos originarios de Aspergillus nidulans; el plásmido que contiene el gen methG que está implicado en la biosíntesis de metionina se denomina pAMA1-MET; el plásmido que contiene el gen hisA que está implicado en la biosíntesis de histidina se denomina pAMA1-HIS.

El gen que codifica PAL, aislado como se describió en el ejemplo 1, se reamplifica mediante PCR del plásmido pESC-URA-PAL-C4H (ejemplo 3), mediante el uso de cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contienen sitios de restricción adecuados. La introducción de dichos sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del gen permite la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en un vector pAMA1-MET digerido que contiene el promotor gpdA de Aspergillus nidulans. El plásmido resultante, pAMA1-MET-PAL, contiene el gen que codifica PAL bajo control del promotor gpdA de Aspergillus nidulans.

El gen que codifica C4H, aislado como se describió en el ejemplo 1, se reamplifica mediante PCR del plásmido pESC-URA-PAL-C4H (ejemplo 3), mediante el uso de cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contienen sitios de restricción adecuados. La introducción de dichos sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del gen permite la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en un vector pAMA1-HIS digerido para proporcionar pAMA1-HIS-C4H. El promotor gpdA y el gen que codifica C4H se reamplifican en forma de un fragmento mediante PCR del plásmido pAMA1-HIS-C4H con el uso de cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contienen sitios de restricción adecuados. La introducción de dichos sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del fragmento de ADN permite la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en el plásmido digerido pAMA1-MET-PAL. El plásmido resultante, pAMA1-MET-PAL-C4H, contiene los genes que codifican PAL y C4H que están cada uno bajo control de un promotor pgdA individual de Aspergillus nidulans. La secuencia de los genes que codifican PAL y C4H se verifica mediante secuenciación de dos clones diferentes de pAMA1-MET-PAL-C4H.

Ejemplo 28

Construcción de un vector fúngico para la expresión de TAL en una especie que pertenece al género Aspergillus.

El gen que codifica TAL, aislado como se describió en el ejemplo 1, se reamplifica mediante PCR del plásmido pESC-URA-TAL (ejemplo 6), mediante el uso de cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contienen sitios de restricción adecuados. La introducción de dichos sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del gen permite la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en un vector pAMA1-MET digerido. El plásmido resultante, pAMA1-MET-TAL, contiene el gen que codifica TAL bajo control del promotor gpdA de Aspergillus nidulans. La secuencia del gen que codifica TAL se verifica mediante secuenciación de dos clones diferentes de pAMA1-MET-TAL.

Ejemplo 29

Construcción de un vector fúngico para la expresión de 4CL y VST en una especie que pertenece al género Aspergillus.

El gen que codifica 4CL, aislado como se describió en el ejemplo 1, se reamplifica mediante PCR del plásmido pESC-TRP-4CL-VST (ejemplo 5), mediante el uso de cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contienen sitios de restricción adecuados. La introducción de dichos sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del gen permite la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en un vector pAMA1-HIS digerido que contiene el promotor gpdA de Aspergillus nidulans. El plásmido resultante, pAMA1-HIS-4CL, contiene el gen que codifica 4CL bajo control del promotor gpdA de Aspergillus nidulans.

El gen que codifica VST, aislado como se describió en el ejemplo 1, se reamplifica mediante PCR del plásmido pESC-TRP-4CL-VST (ejemplo 5), mediante el uso de cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contienen sitios de restricción adecuados. La introducción de dichos sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del gen permite la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en un vector pAMA1-MET digerido para proporcionar pAMA1-MET-VST. El promotor gpdA y el gen que codifica VST se reamplifican en forma de un fragmento mediante PCR del plásmido pAMA1-MET-VST con el uso de cebadores directos e inversos, con salientes en 5' que contienen sitios de restricción adecuados. La introducción de dichos sitios de restricción en los extremos 5' y 3' del fragmento de ADN permite la ligadura del producto de PCR sometido a restricción en el plásmido digerido pAMA1-HIS-4CL. El plásmido resultante, pAMA1-HIS-4CL-VST, contiene los genes que codifican 4CL y VST que están cada una bajo control de un promotor pgdA individual de Aspergillus nidulans. La secuencia de los genes que codifican 4CL y VST se verifica mediante la secuenciación de dos clones diferentes de pAMA1-HIS-4CL-VST.

Ejemplo 30

Expresión de la ruta hasta resveratrol en Aspergillus niger.

Las cepas de Aspergillus niger se transforman con los vectores descritos en los ejemplos 27, 28 y 29, por separado

o en combinación. La transformación de la célula fúngica se lleva a cabo de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante electroporación o mediante conjugación (véase, p.ej., Sambrook et al., 1989). Los transformantes se seleccionan en medio mínimo que carece de metionina y/o histidina.

Una cepa de Aspergillus niger que es auxotrófica para histidina y metionina, por ejemplo, la cepa FGSC A919 (véase http://www.fgsc.net), se transforma por separado con el vector pAMA1-MET-TAL (ejemplo 28), lo que produce la cepa FSAN-TAL; con pAMA1-MET-PAL-C4H (ejemplo 27), lo que produce la cepa FSAN-PALC4H, y con pAMA1-HIS-4CL-VST (ejemplo 29), lo que produce la cepa FSAN-4CLVST. Además, la cepa de Aspergillus niger FGSC A919 se co-transforma con pAMA1-MET-TAL (ejemplo 28) y pAMA1-HIS-4CL-VST (ejemplo 29), y la cepa transformada se denomina FSAN-TAL4CLVST. La misma cepa se co-transforma también con pAMA1-MET-PAL-C4H (ejemplo 27), y pAMA1-HIS-4CL-VST (ejemplo 29), lo que da como resultado la cepa FSAN-PALC4H4CLVST.

Ejemplo 31

Expresión de la ruta hasta resveratrol en Aspergillus oryzae.

Una cepa de Aspergillus oryzae que contiene un grupo de genes nativos que codifican PAL, C4H y 4CL (Seshime et al., 2005) y que es auxotrófica para metionina, se transforma con el vector pAMA1-MET-VST (ejemplo 29), lo que produce la cepa FSAO-VST. La transformación de la célula fúngica se lleva a cabo de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante electroporación o mediante conjugación (véase, p.ej., Sambrook et al., 1989). Los transformantes se seleccionan en medio mínimo que carece de metionina.

Ejemplo 32

Fermentación con cepas recombinantes de Aspergillus niger y Aspergillus oryzae en fermentadores.

Las cepas de levadura recombinantes se pueden cultivar en fermentadores que funcionan por lotes, por lote alimentado o cultivos en quimiostato.

Cultivos por Lotes y por Lote Alimentado

El microorganismo se cultiva en un biorreactor con deflectores con un volumen de trabajo de 1,5 litros en condiciones aerobias. Todos los cultivos se incuban a 30 °C, a 500 rpm. Se mantiene un pH constante de 6,0 mediante la adición automática de KOH 10 M, y se obtienen las condiciones aerobias inyectando en el biorreactor aire a una velocidad de 1 vvm para asegurar que el DOT es mayor del 80%. Las células se cultivan con glucosa en medio definido que consiste en los siguientes componentes para permitir el crecimiento en los cultivos por lotes: 7,3 g/l de (NH4)2SO4, 1,5 g/l de KH2PO4, 1,0 g/l de MgSO4.7H2O, 1,0 g/l de NaCl, 0,1 g/l de CaCl2.2H2O, 0,1 ml/l de antiespumante de Sigma, 7,2 mg/l de ZnSO4.7H2O, 1,3 mg/l de CuSO4.5H2 0,3 mg/l de NiCl2.6H2O, 3,5 mg/l de MnCl2.4H2O y 6,9 mg/l de FeSO4.7H2O. La concentración de glucosa es, por ejemplo, 10, 20, 30, 40 ó 50 g/l. Para permitir el crecimiento en los cultivos por lote alimentado, el medio está compuesto de: 7,3 g/l de (NH4)2SO4, 4,0 g/l de KH2PO4, 1,9 g/l de MgSO4.7H2O, 1,3 g/l de NaCl, 0,10 g/l de CaCl2.2H2O, 0,1 ml/l de antiespumante de Sigma, 7,2 mg/l de ZnSO4.7H2O, 1,3 mg/l de CuSO4.5H2O, 0,3 de mg/l NiCl2.6H2O, 3,5 mg/l de MnCl2.4H2O y 6,9 mg/l de FeSO4.H2O en la fase del lote. El reactor se alimenta después, por ejemplo, con 285 g/kg de glucosa y 42 g/kg de (NH4)2SO4.

Se usa el micelio libre de un pre-cultivo por lotes para incubar los cultivos por lotes y por lote alimentado. Se usa una concentración de esporas de 2,109 esporas/l para la inoculación del pre-cultivo por lotes a pH 2,5. Las esporas se obtienen mediante la propagación de esporas liofilizadas en 29 g de arroz al cual se le añaden los siguientes componentes: 6 ml de 15 g/l de sacarosa, 2,3 g/l de (NH4)2SO4, 1,0 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de MgSO4.7H2O, 0,50 g/l de NaCl, 14,3 mg/l de ZnSO4.7H2O, 2,5 mg/l de CuSO4.5H2O, 0,50 mg/l de NiCl2.6H2O, y 13,8 mg/l de FeSO4.7H2O. Las esporas se propagan a 30 °C durante 7-14 días para proporcionar una capa negra de esporas sobre los granos de arroz, y se recogen añadiendo 100 ml de Tween 20 del 0,1 % en agua estéril. Para todas las condiciones, el gas se esteriliza mediante filtración antes de introducirlo en el biorreactor. El gas de salida se conduce a través de un condensador enfriado a menos de -8 °C y se analiza su contenido volumétrico de CO2 y O2 por medio de un analizador de gases acústico.

Cultivos en quimiostato

En los cultivos en quimiostato, las células se pueden cultivar, por ejemplo, en fermentadores de laboratorio Biostat B de un volumen de trabajo de 1,5 L a 30 °C y 500 rpm. Se mantiene un pH constante de 6,0 mediante la adición automática de KOH 10 M, y se obtienen las condiciones aerobias inyectando en el biorreactor aire a una velocidad de 1 vvm para asegurar que el DOT es mayor del 80%. La velocidad de dilución (D) se puede ajustar a diferentes valores, p.ej. a 0,050 h-1, 0,10 h-1, 0,15 h-1, o 0,20 h-1. El pH se mantienen constante, p.ej. a 6,6, mediante la adición automática de KOH 10 M, mediante el uso de un medio de cultivo mínimo con los componentes siguientes: 2,5 g/l de (NH4)2SO4, 0,75 g/l de KH2PO4, 1,0 g/l de MgSO4.7H2O, 1,0 g/l de NaCl, 0,1 g/l de CaCl2.2H2O, 0,1 ml/l de antiespumante de Sigma, 7,2 mg/l de ZnSO4.7H2O, 1,3 mg/l de CuSO4.5H2O, 0,3 mg/l de NiCl2.6H2O, 3,5 mg/l de MnCl2.4H2O y 6,9 mg/l de FeSO4.7H2O. La concentración de glucosa se puede ajustar a diferentes valores, p.ej. es 3,0 g/l, 6,0 g/l, 12,0 g/l, 15,0 g/l o 18,0 g/l. El biorreactor se inocula con micelio libre de un pre-cultivo por lotes como se describió anteriormente, y la bomba de alimentación se enciende al final de la fase de crecimiento exponencial.

Para todas las condiciones, el gas se esteriliza mediante filtración antes de introducirlo en el biorreactor. El gas de salida se conduce a través de un condensador enfriado a menos de -8 °C y se analiza su contenido volumétrico de CO2 y O2 por medio de un analizador de gases acústico.

Se considera que los cultivos están en estado estacionario después de al menos 5 tiempos de residencia, y si las concentraciones de biomasa y glucosa y la composición del gas de salida permanecen sin cambios (menos del 5% de desviación relativa) a lo largo de los dos últimos tiempos de residencia.

Ejemplo 33

Extracción y análisis de resveratrol en Aspergillus niger y Aspergillus oryzae

La extracción y el análisis se llevan a cabo mediante el uso de los métodos descritos en los ejemplos 14 y 15.

REFERENCIAS Patente nº US-A-6521748 Patente nº US-A-2001053847 Patente nº US-A-2004059103 Patente nº US-A-2004023357 Aoyama, Y., Yoshida, Y., Kubota, S., Kumaoka, H. y Furumichi, A. (1978). NADPH-cytochrome P-450 reductase of

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Lo siguiente es un resumen de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos que aparecen en la presente memoria:

SEQ ID Nº: 1 es una secuencia de nucleótidos de Arabidopsis thaliana que codifica una fenilalanina amoniaco liasa (PAL2).

SEQ ID Nº: 2 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID Nº: 1.

SEQ ID Nº: 3 es una secuencia de nucleótidos de Arabidopsis thaliana que codifica una cinamato 4-hidroxilasa (C4H).

SEQ ID Nº: 4 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID Nº: 3.

SEQ ID Nº: 5 es una secuencia de nucleótidos de Arabidopsis thaliana que codifica una 4-cumarato:CoenzimaA

ligasa (4CL1). SEQ ID Nº: 6 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID Nº: 5. SEQ ID Nº: 7 es una secuencia de nucleótidos de Rheum tataricum que codifica una resveratrol sintasa (VST). SEQ ID Nº: 8 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID Nº: 7.

5 SEQ ID Nº: 9 es una secuencia de nucleótidos de Rheum tataricum que codifica una resveratrol sintasa (VST), que tiene optimizados los codones para la expresión en S. cerevisiae.

SEQ ID Nº: 10 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID Nº: 9. SEQ ID Nº: 11 es una secuencia de nucleótidos de Rhodobacter capsulatus que codifica una tirosina amoniaco liasa (TAL).

10 SEQ ID Nº: 12 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID Nº: 11.

SEQ ID Nº: 13 es una secuencia de nucleótidos de Rhodobacter capsulatus que codifica una tirosina amoniaco liasa (TAL), que tiene optimizados los codones para la expresión en S. cerevisiae. SEQ ID Nº: 14 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID Nº: 13. SEQ ID Nº: 15 es una secuencia de nucleótidos de S. cerevisiae que codifica una NADPH:citocromo P450 reductasa

15 (CPR1). SEQ ID Nº: 16 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID Nº: 15. SEQ ID Nº: 17 es una secuencia de nucleótidos de Arabidopsis thalianus que codifica una NADPH:citocromo P450

reductasa (AR2). SEQ ID Nº: 18 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID Nº: 17.

20 SEQ ID Nºs 19-32 son las secuencias de los cebadores que aparecen en la Tabla 1, Ejemplo 1. SEQ ID Nºs 33-34 son las secuencias de los cebadores que aparecen en el Ejemplo 16. SEQ ID Nºs 35-38 son las secuencias de los cebadores que aparecen en el Ejemplo 17

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Fluxome Sciences A/S

<120> CÉLULAS MODIFICADAS MEDIANTE INGENIERÍA GENÉTICA DESDE EL PUNTO DE VISTA

METABÓLICO PARA LA PRODUCCIÓN DE RESVERATROL O UN DERIVADO DEL MISMO OLIGOMÉRICO O 5 CON UNIÓN GLUCOSÍDICA

<130> PJS/P10686WO

<150> GB0503657.9

<151> 10 <160> 38

<170> Patent In versión 3.3

<210> 1

<211> 2154

<212> ADN 15 <213> Arabidopsis thaliana

<400>

1

<400>

12

5

<210><211><212><213> 2 717 PRT Arabidopsis thaliana

<400>

2

5

<210><211><212><213> 3 1518 ADN Arabidopsis thaliana

<400>

3

5

<210><211><212><213> 4 505 PRT Arabidopsis thaliana

<400>

4

5

<210><211><212><213> 5 1686 ADN Arabidopsis thaliana

<400>

5

5

<210><211><212><213> 6 561 PRT Arabidopsis thaliana

<400>

6

5

<210><211><212><213> 7 1176 ADN Rheum tataricum

<400>

7

5

<210><211><212><213> 8 391 PRT Rheum tataricum

<400>

8

5

<210><211><212><213> 9 1176 ADN Rheum tataricum

<400>

9

5

<210><211><212><213> 10 391 PRT Rheum tataricum

<400>

10

<210>

11

<211>

1596

37

<212>

ADN

<213>

Rhodobacter capsulatus

<400>

11

5

<210> 12

<211>

531

<212>

PRT

<213>

Rhodobacter capsulatus

5

<210><211><212><213> 13 1596 ADN Rhodobacter capsulatus

<400>

13

5

<210><211><212><213> 14 531 PRT Rhodobacter capsulatus

<400>

14

5

<210><211><212><213> 15 2076 ADN Saccharomyces cerevisiae

<400>

15

5

<210><211><212><213> 16 691 PRT Saccharomyces cerevisiae

<400>

16

5

<210><211><212><213> 17 2136 ADN Arabidopsis thaliana

<400>

17

5

<210><211><212><213> 18 711 PRT Arabidopsis thaliana

<400>

18

5

<210><211><212><213> 19 33 ADN Arabidopsis thaliana

<400>

19

cggaattctc atggatcaaa tcgaagcaat gtt

33

10

<210><211><212><213> 20 29 ADN Arabidopsis thaliana

<400>

20

cgactagttt agcaaatcgg aatcggagc

29

<210><211><212><213>

21 30 ADN Arabidopsis thaliana

<400>

21

cgctcgagat atggacctcc tcttgctgga

30

<210><211><212><213>

22 32 ADN Arabidopsis thaliana

<400>

22

cgggtacctt aacagttcct tggtttcata ac

32

<210><211><212><213>

23 36 ADN Arabidopsis thaliana

<400>

23

gctctagacc tatggcgcca caagaacaag cagttt

36

<210><211><212><213>

24 36 ADN Arabidopsis thaliana

<400>

24

gcggatcccc ttcacaatcc atttgctagt tttgcc

36

<210><211><212><213>

25 31 ADN Rheum tataricum

<400>

25

ccggatccaa atggccccag aagagagcag g

31

<210><211><212><213>

26 35 ADN Rheum tataricum

<400>

26

cgctcgagtt aagtgatcaa tggaaccgaa gacag

35

<210><211><212><213>

27 38 ADN Rhodobacter capsulatus

<400>

27

ccgaattccc atgaccctgc aatctcaaac agctaaag

38

<210><211><212><213>

28 30 ADN Rhodobacter capsulatus

<400>

28

ccactagttt aagcaggtgg atcggcagct

30

<210><211><212><213>

29 37 ADN Saccharomyces cerevisiae

<400>

29

ccctcgagat catgccgttt ggaatagaca acaccga

37

<210><211><212><213>

30 36 ADN Saccharomyces cerevisiae

<400>

30

ccaagcttat cgggctgatt accagacatc ttcttg <210> 31 <211> 36 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana

36

<400>

31

ccggatcccc atgtcctctt cttcttcttc gtcaac

36

<210><211><212><213>

32 34 ADN Arabidopsis thaliana

<400>

32

ccctcgaggt gagtgtgtgg cttcaatagt ttcg

34

<210><211><212><213>

33 40 ADN Rhodobacter capsulatus

<400>

33

ccgctcgagc ggatgaccct gcaatctcaa acagctaaag

40

<210><211><212><213>

34 30 ADN Rhodobacter capsulatus

<400>

34

gcggatcctt aagcaggtgg atcggcagct

30

<210><211><212><213>

35 35 ADN Arabidopsis thaliana

<400>

35

tgccatggca atggcgccac aagaacaagc agttt

35

<210><211><212><213>

36 36 ADN Arabidopsis thaliana

<400>

36

gcggatcccc ttcacaatcc atttgctagt tttgcc 36

<210> 37

<211> 37

<212> ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<400> 37 ttgcggccgc aaatctcgat cccgcgaaat taatacg 37

<210> 38

<211> 36 10 <212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 38 cgctcgagcc ttcacaatcc atttgctagt tttgcc 36

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un microorganismo que produce resveratrol, y dicho microorganismo tiene una ruta metabólica operativa que produce ácido 4-cumárico y que produce resveratrol a partir suyo, o un derivado oligomérico o con unión glicosídica del mismo, en cuya ruta se produce ácido 4-cumárico a partir de L-fenilalanina por la acción de una L-fenilalanina amoniaco liasa y una cinamato 4-hidroxilasa expresadas en dicho microorganismo, o a partir de tirosina por la acción de una L-fenilalanina amoniaco liasa o de una tirosina amoniaco liasa expresadas en dicho microorganismo, se forma 4-cumaroil-CoA a partir de dicho ácido cumárico en una reacción catalizada por una 4-cumarato-CoA ligasa expresada en dicho microorganismo,

   y se produce resveratrol a partir de dicho 4-cumaroil-CoA en una reacción en la que el malonil-CoA endógeno es un sustrato mediante una resveratrol sintasa expresada en dicho microorganismo.

2. 2.

   Un microorganismo según la reivindicación 1, en el que dicha resveratrol sintasa se expresa en dicho microorganismo a partir de un ácido nucleico que codifica dicha enzima que no es nativa en el microorganismo.

3. 3.

   Un microorganismo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha cinamato 4-hidroxilasa se expresa en dicho microorganismo a partir de un ácido nucleico que codifica dicha enzima que no es nativa en el microorganismo.

4. 4.

   Un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se expresa una tirosina amoniaco liasa en dicho microorganismo a partir de un ácido nucleico que codifica dicha enzima que no es nativa en el microorganismo.

5. 5.

   Un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se expresa una L-fenilalanina amoniaco liasa en dicho microorganismo a partir de un ácido nucleico que codifica dicha enzima que no es nativa en el microorganismo.

6. 6.

   Un microorganismo según cualquier reivindicación precedente, en el que una NADPH:citocromo P450 reductasa (CPR) nativa se ha sobreexpresado en dicho microorganismo, o en el que una NADPH:citocromo P450 reductasa (CPR) se ha introducido de manera recombinante en dicho microorganismo.

7. 7.

   Un microorganismo según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una copia de una secuencia genética que codifica una tirosina amoniaco liasa está unida de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa con dicha secuencia genética en dicho organismo.

8. 8.

   Un microorganismo según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una copia de una secuencia genética que codifica una L-fenilalanina amoniaco liasa está unida de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa con dicha secuencia genética en dicho organismo.

9. 9.

   Un microorganismo según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una copia de una secuencia genética que codifica una cinamato 4-hidroxilasa está unida de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa con dicha secuencia genética en dicho organismo.

10. 10.

    Un microorganismo según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una copia de una secuencia genética que codifica una 4-cumarato-CoA ligasa está unida de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa con dicha secuencia genética en dicho organismo.

11. 11.

    Un microorganismo según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una copia de una secuencia genética que codifica una resveratrol sintasa está unida de forma operable a una señal de expresión que no está asociada de manera nativa con dicha secuencia genética en dicho organismo.

12. 12.

    Un microorganismo según cualquier reivindicación precedente, que es un hongo o bacteria.

13. 13.

    Un microorganismo según la reivindicación 12, que es una levadura.

14. 14.

    Un microorganismo según la reivindicación 13, que es una Saccharomyces cerevisiae.

15. 15.

    Un microorganismo según la reivindicación 1, que contiene una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica L-fenilalanina amoniaco liasa asociada de forma operable con una señal de expresión, y que contiene una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica cinamato-4-hidroxilasa asociada de forma operable con una señal de expresión, y que contiene una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica 4-cumarato CoA-ligasa asociada de forma operable con una señal de expresión, y que contiene una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica resveratrol sintasa asociada de forma operable con una señal de expresión.

16. 16.

    Un microorganismo según la reivindicación 1, que carece de actividad cinamato-4-hidroxilasa, y que contiene una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica tirosina amoniaco liasa asociada de forma operable con una señal de expresión o L-fenilalanina amoniaco liasa asociada de forma operable con una señal de

    expresión, y que contiene una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica 4-cumarato CoAligasa asociada de forma operable con una señal de expresión, y que contiene una o más copias de una secuencia de ADN heteróloga que codifica resveratrol sintasa asociada de forma operable con una señal de expresión.

17. 17.

    Un método para la producción de resveratrol o un derivado oligomérico o con unión glicosídica del mismo que

    5 comprende poner en contacto un microorganismo según cualquier reivindicación precedente con un sustrato de carbono.
18. 18. Un método según la reivindicación 15, llevado a cabo en ausencia sustancial de una fuente externa de ácido 4cumárico.
19. 19. Un método según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que dicho sustrato de carbono se selecciona 10 del grupo de sustratos de carbono fermentables que consiste en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.

20. 20.

    Un método según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que dicho sustrato de carbono se selecciona del grupo de sustratos de carbono no fermentables que consiste en etanol, acetato, glicerol, lactato y aminoácidos.

21. 21.

    Un método según la reivindicación 18, en el que dicho sustrato de carbono no fermentable se selecciona del grupo que consiste en fenilalanina y tirosina.

    15 22. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, que incluye además el uso de dicho resveratrol producido o un derivado oligomérico o con unión glicosídica del mismo como un producto nutracéutico en un producto lácteo o una bebida.

    ácido cumárico

    ácido cinámico

    patrón de resveratrol forma cis y trans 60 nanogramos en total

    cepa de S. cerevisiae: FSSC-control (vectores vacíos)

    cepa de S. cerevisiae: FSSC-PALC4H4CLVST (ruta de PAL)

    cepa de S. cerevisiae: FSSC-TALC4CLVST (ruta de TAL)

    espectro UV de transresveratrol puro 60 nanogramos en total

    espectro UV de transresveratrol en extracto de la cepa de S. cerevisiae FSSC-PALC4H4CLVST (ruta de PAL)

    espectro UV de transresveratrol en extracto de la cepa de S. cerevisiae FSSC-TAL4CLVST (ruta de TAL)

    ácido cumárico

    ácido cumárico

    cepa de E. coli: FSEC-control (vectores vacíos) + 20 mg/l de ácido cumárico

    cepa de E. coli: FSEC-TAL4CLVST (ruta de TAL) + 20 mg/l de ácido cumárico

    espectro UV de transresveratrol en extracto de la cepa de E. coli FSEC-TAL4CLVST (ruta de TAL)