ES2400988T3 - Utilización de inhibidores peptídicos permeables celulares de la vía de transducción de señales JNK para el tratamiento de diversas enfermedades - Google Patents

Utilización de inhibidores peptídicos permeables celulares de la vía de transducción de señales JNK para el tratamiento de diversas enfermedades Download PDF

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Abstract

Utilización de un péptido inhibidor de JNK consistente en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 2 o de un péptido quimérico consistente en un primer dominio y un segundo dominio unidos mediante un enlace covalente, comprendiendo el primer dominio una secuencia de tráfico y consistiendo el segundo dominio en una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2, estando el primer dominio unido al extremo C-terminal del segundo dominio, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias seleccionadas de entre asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), neumonía, inflamación pulmonar, fibrosis pulmonar, fibrosis quística, meningitis, esclerosis múltiple, hepatitis, endometriosis, meningoencefalitis primavero-estival (ESME), encefalitis japonesa, poliomielitis, reacciones de rechazo al injerto o de rechazo al transplante.

Description

Utilizacion de inhibidores peptidicos permeables celulares de la via de transduccion desenales JNK para el tratamiento de diversas enfermedades.
La presente invencion se refiere a la utilizacion de inhibidores de proteina quinasa y mas especificamente al uso de inhibidores de la proteina quinasa amino terminal c-Jun, de secuencias inhibidoras de JNK, de peptidos quimericos o composiciones farmaceuticas que los contienen, para el tratamiento de diverass enfermedades o trastornos relacionados con la senalizacion de JNK, seleccionandose dichas enfermedades o transtornos de entre enfermedades inflamatorias.
La quinasa amino terminal c-Jun (JNK) es un miembro del grupo activado por estres de las proteina quinasas activadas por mitogeno (MAP). Estas quinasas estan implicadas en el control del crecimiento y la diferenciacion celular y, en general, en la respuesta celular a estimulos ambientales. La via de transduccion de las senales JNK es activada en respuesta al estres ambiental y por la union de varias clases de receptores de la superficie celular. Estos receptores pueden incluir receptores citocina, receptores serpentina y tirosinquinasas receptoras. En las celulas de mamifero, la JNK esta implicada en procesos biologicos como la transformacion oncogenica y en respuestas mediadoras de adaptacion al estres ambiental. La JNK tambien se asocia a la respuesta inmunomoduladora, incluyendo a la maduracion y diferenciacion de celulas inmunitarias, ademas Para llevar a cabo la muerte celular programada en aquellas celulas identificadas para su destruccion por el sistema inmunitario. Esta propiedad excepcional convierte a la senalizacion JNK en un objetivo prometedor para desarrollar una intervencion farmacologica. Entre otros trastornos neurologicos, la senalizacion de JNK esta particularmente implicada en la apoplejia isquemica y en la enfermedad de Parkinson, pero tambien en otras enfermedades que se mencionaran a continuacion. Ademas, la proteina quinasa activada por mitogeno (MAPK) p38alfa se ha demostrado que regula negativamente la proliferacion celular mediante la antagonizacion de la via JNK-cJun. Por tanto, la proteina quinasa activada por mitogeno (MAPK) p38alfa parece ser activa en la supresion de la proliferacion de celulas normales y cancerosas y, ademas se ha demostrado la implicacion de JNK en enfermedades cancerosas (ver por ejemplo, Hui y col., Nature Genetics, Vol 39, No. 6, Junio 2007). Tambien se ha demostrado que la quinasa N-terminal c-Jun (JNK) esta involucrada en el dolor neuropatico producido por ligacion del nervio espinal (SNL), donde la SNL induce una activacion lenta y persistente de JNK, en particular JNK1, mientras que la activacion de la proteina quinasa activada por mitogeno p38 se hallo en microgliocitos espinales despues de la SNL, cayendo a un nivel casi basal a los 21 dias (Zhuang y col., The Journal of Neuroscience, 29 de marzo de 2006, 26(13): 3551-3560)).
Asi, la inhibicion o interrupcion de la via de senalizacion JNK, particularmente la provision de inhibidores de la via de senalizacion JNK, parece una potencial via para combatir trastornos estrechamente relacionados con la senalizacion de JNK. Sin embargo, actualmente solo se conocen unos pocos inhibidores de la via de senalizacion JNK.
Como es sabido de la tecnica anterior, los inhibidores de la via de senalizacion JNK incluyen particularmente, por ejemplo, inhibidores quinasa aguas arriba (por ejemplo, CEP-1347), inhibidores quimicos pequenos de JNK (SP600125 y AS601245), que afectan directamente a la actividad quinasa, por ejemplo compitiendo con el sitio de adhesion ATP de la proteina quinasa, e inhibidores de peptidos de la interaccion entre JNK y sus sustratos (D-JNKI e I-JIP) (ver por ejemplo Kuan y col., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, febrero 2005, vol. 4, no. 1, pp. 63-67(5)).
El inhibidor de quinasa aguas arriba CEP-1347 (KT7515) es un inhibidor semi-sintetico de la familia quinasa de linaje mixto. CEP-1347 (KT7515) promueve la supervivencia neuronal en dosis que inhiben la activacion de las quinasas amino-terminales c-Jun (JNKs) en cultivos embrionicos primarios y celulas PC12 diferenciadas despues de retirada trofica y en ratones tratados con 1-metil-4-feniltetrahidropiridina. Ademas, CEP-1347 (KT7515) puede promover la supervivencia a largo plazo de neuronas motoras y ciliares del ganglio simpatico de la espina dorsal embrionica del pollo (ver, por ejemplo, Borasioy col., Neuroreport, 9(7): 1435-1439, 11 de Mayo de 1998).
El inhibidor quimico pequeno JNK SP600125 demostro reducir los niveles de fosforilacion de c-Jun para proteger las neuronas dopaminergicas contra la apoptosis y para restaurar parcialmente el nivel de dopamina en PD inducido por MPTP en ratones C57BLl6N (Wang y col., Neurosci Res. 2004 Feb; 48(2); 195-202). Estos resultados indican ademas que la via JNK es el mediador principal de los efectos neurotoxicos de MPTP in vivo y que la inhibicion de la actividad de JNK puede representar una estrategia nueva y eficaz para tratar el parkinson.
Otro ejemplo de inhibidores quimicos pequenos es el inhibidor JNK AS601245 arriba mencionado. El AS601245 inhibe la via de senalizacion JNK y promueve la supervivencia celular despues de isquemia cerebral. In vivo, AS601245proporciono proteccion significativa contra la perdida tardia de neuronas CA1 del hipocampo en un modelo de jerbo con isquemia global transitoria. Este efecto es mediado por la inhibicion de JNK y, por tanto, por la expresion y fosforilacion de c-Jun(ver por ejemplo Carboni y col., J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jul; 310(1):25-32. Epub 26 de febrero de 2004).
Una tercera clase de inhibidores de la via de senalizacion JNK es la representada por los inhibidores peptidicos de la interaccion entre JNK y sus sustratos, tal como se ha mencionado anteriormente. Como punto de partida para la construccion de dichos peptidos inhibidores JNK, puede empelarse una alineacion de secuencias de la proteina JNK natural. Tipicamente estas proteinas comprenden dominios de JNK (JBDs) y ocurren en varias proteinas de adhesion a insulina (IB) tales como IB1 o IB2. El resultado de dicha alineacion de secuencia iliustrativa es, por ejemplo, una alineacion de secuencia entre los dominios de adhesion JNQ de IB1 [SEC ID NO: 13], IB2 [SEC ID NO: 14], c-Jun [SEC ID NO: 15] y ATF2 [SECID NO: 16] (ver las FIG. 1A-1C). Dicha alineacion revela una secuencia de ocho aminoacidos parcialmente conservada (ver por ejemplo FIG. 1A). Una comparacion de los JBDs de IB1 e IB2 revela ademas dos bloques de siete y tres aminoacidos altamente conservados entre las dos secuencias.
Secuencias construidas en base a dicha alineacion se han descrito por ejemplo en WO 01l27268 o WO 2007l031280. WO 2007l031280 y WO 01l27268 describen peptidos de fusion permeables de celulas pequenas, que comprenden la secuencia de permeabilidad celular denominada TAT, derivada de la secuencia basica de trafico de la proteina HIV-TAT, y una secuencia inhibidora minima de 20 aminoacidos de IB1. Ambos componentes estan unidos covalentemente uno al otro. Ejemplos (actualmente el unico) de inhibidores de la via de senalizacion MAPK-JNK descritos tanto en la WO 2007l031280 como en la WO 01l27268 son L-JNKI1 (peptido inhibidor de JNK compuesto por aminoacidos-L) o los peptidos D-JNKI1 resistentes a proteasa (peptido inhibidor de JNK compuesto por aminoacidos-D no naturales). Estos peptidos inhibidores de JNK (JNKI) son especificos para JNK (JNK1, JNK2 y JNK3). En contraste con aquellos inhibidores de compuestos de celulas pequenas que se discutieron anteriormente, las secuencias inhibidoras de WO 2007l031280 o WO 01l27268, por ejemplo JNKI1, inhiben mas bien la interaccion entre JNK y su sustrato. Mediante esta secuencia de trafico derivada de TAT, el peptido de fusion es transportado eficientemente a las celulas. Debido a las nuevas propiedades obtenidas por el componente de trafico, los peptidos de fusion son transportados activamente a las celulas, donde mantienen sus efectos hasta la degradacion proteolitica.
Sin embargo, los peptidos segun WO 2007l031280 o WO 01l27268 demuestran ser activos solo para un numero de enfermedades particularmente limitado, en particular enfermedades proliferativas de celulas no malignas o proliferativas de celulas inmunologicamente relacionadas.
Asi, un objeto de la presente invencion consiste en identificar otras enfermedades que pueden combatirse con los peptidos inhibidores de JNK. Otro objeto de la presente invencion es proporcionar (el uso de) peptidos inhibidores de JNK y derivados de los mismos para el tratamiento de dichas enfermedades, asi como de enfermedades que todavia no son conocidas o son ya conocidas por su estrecha relacion con la senalizacion de JNK.
Este objeto se resuelve mediante la utilizacion de una secuencia inhibidora de JNK tal como la definida aqui para la preparacion de una composicion farmaceutica para tratar diversas enfermedades estrechamente relacionadas con la senalizacion de JNK en un sujeto, seleccionandose las enfermedades o trastornos estrechamente relacionados con la senalizacion de JNK en un sujeto entre enfermedades inflamatorias.
De acuerdo con otra realizacion preferente, las enfermedades inflamatorias se seleccionan de entre inflamacion pulmonar, incluyendo fibrosis pulmonar, fibrosis quistica, meningitis y reacciones de rechazo al injerto o rechazo al transplante.
De acuerdo con otra realizacion preferente, las enfermedades se seleccionan de entre inflamacion pulmonar, incluyendo asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), neumonia y fibrosis pulmonar.
De acuerdo con una realizacion preferente, las enfermedades se seleccionan de entre esclerosis multiple y meningitis.
De acuerdo con otra realizacion preferente, la enfermedad es hepatitis o endometriosis.
De acuerdo con otra realizacion preferente, las enfermedades se seleccionan de entre meningoencefalitis primaveroestival (ESME), hepatitis, encefalitis Japonesa y polio (poliomielitis).
Debido a que las secuencias inhibidoras de JNK conocidas en la tecnica solo han demostrado ser utiles en una cantidad limitada de enfermedades, resulta sorprendente que las secuencias inhibidoras de JNK aqui definidas puedan usarse y ser apropiadas para el tratamiento de enfermedades o trastornos estrechamente relacionados con la senalizacion de JNK, tal como se menciono anteriormente. Esto no era obvio ni se ha sugerido en la tecnica anterior, a pesar de que las secuencias inhibidoras de JNK son de conocimiento general en la tecnica.
De acuerdo con una realizacion particular, una secuencia inhibidora de JNK tal como se usa aqui tipicamente une JNK ylo inhibe la activacion de al menos un factor de transcripcion activado por JNK, por ejemplo c-Jun o ATF2 (ver por ejemplo las SEC ID NO: 15 y 16, respectivamente) o Elk1.
De acuerdo con otra realizacion preferente, las secuencias inhibidoras de JNK tal como se usan aqui pueden estar compuestas en parte o exclusivamente por aminoacidos-D como se ha indicado anteriormente. En especial, estas secuencias inhibidoras de JNK compuestas por aminoacidos-D son secuencias D-retro-inversas no nativas de secuencias inhibidoras de JNK nativas. El termino quot;secuencia retro-inversaquot; se refiere a un isomero de una secuencia peptidica lineal donde la direccion de la secuencia esta invertida, inviertiendose la quiralidad de cada residuo aminoacido (ver por ejemplo Jameson y col., Nature, 368,744-746 (1994); Brady y col., Nature, 368, 692-693 (1994)). La ventaja de combinar enantiomeros-D y la sintesis inversa es que las posiciones de los grupos carbonilo y amino en cada enlace amida estan intercambiadas, mientras que la posicion de los grupos de la cadena lateral de cada carbono alfa esta preservada. A menos que se indique especificamente lo contrario, se entiende que cualquier peptido o secuencia de aminoacido-L determinada a utilizar de acuerdo con la presente invencion pueden convertirse a un petido o secuencia retroinversa D mediante sintesis de una secuencia inversa de la secuencia o peptido para la correspondiente secuencia o peptido de aminoacido-L nativo correspondiente.
5 Las secuencias retroinversas-D tal como se usan aqui y como se han definido anteriormente presentan muy diversas propiedades utiles. Por ejemplo, las secuencias retroinversas-D tal como se usan aqui entran en las celulas de forma tan eficiente como las secuencias de aminoacidos-L empleadas aqui, mientras que las secuencias retroinversas-D tal como se usan aqui son mas estables que las correspondientes secuencias de aminoacidos-L.
Las secuencias inhibidoras de JNK tal como se iusan aqui consisten en al menos una secuencia retroinversa-D de 10 acuerdo con la secuencia de aminoacidos NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH (D-IB1(s)) [SEC ID NO: 2].
Las secuencias inhibidoras de JNK comparativas que se usan aqui y que se han descrito anteriormente se muestran en la Tabla 1 (SEC ID NO: 1, 3, 4, 13-20 y 33-100). La tabla muestra el nombre de la secuencia inhibidora de JNK que se usa aqui, asi como tambien el numero identificador de secuencia, su longitud y la secuencia de aminoacidos. Ademas, la Tabla 1 muestra las secuencias asi como sus formulas genericas, por ejemplo para las SEC ID NO: 1, 2, 5, 6, 9 y 11 y 15 SEC ID NO: 3, 4, 7, 8, 10 y 12, respectivamente. La Tabla 1 describe ademas las secuencias quimericas SEC ID NO: 912 y 23-32 (ver a continuacion), L-IB1 las secuencias SEC ID NO: 33 a 66 y las secuencias D-IB1 SEC ID NO: 67 a 100.
Tabla�1
NOMBRE PEPTIDOl SEQ.
SEC ID NO AA SECUENCIA
L-IB1(s)
1 19 RPKRPTTLNLFPQVPRSQD (NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
D-IB1(s)
2 19 DQSRPVQPFLNLTTPRKPR (NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH)
L-IB(generico)(s)
3 19 NH2-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH
D-IB(generico) (s)
4 19 NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-COOH
L-TAT
5 10 GRKKRRQRRR (NH2-GRKKRRQRRR-COOH)
D-TAT
6 10 RRRQRRKKRG (NH2-RRRQRRKKRG-COOH)
L-generico-TAT (s)
7 11 NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-COOH
D-generico-TAT (s)
8 11 NH2-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH
L-TAT-IB1(s)
9 31 GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD (NH2-GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
L-TAT-IB (generico) (s)
10 29 NH2-Xn b-RKKRRQRRR-Xn b-Xn a-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xn b-COOH
D-TAT-IB1(s)
11 31 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG (NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH)
D-TAT-IB (generico) (s)
12 29 NH2-Xn b-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xn a-Xn b-RRRQRRKKR-Xn b-COOH
IB1-largo
13 29 PGTGCGDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT (NH2- PGTGCGDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT -COOH)
IB2-largo
14 27 IPSPSVEEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS (NH2- IPSPSVEEPHKHRPTTLRLTTLGAQDS -COOH)
c-Jun
15 29 GAYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGNLKPH (NH2- GAYGYSNPKILKQSMTLNLADPVGNLKPH-COOH)
ATF2
16 29 TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV (NH2- TNEDHLAVHKHKHEMTLKFGPARNDSVIV -COOH)
L-IB1
17 23 DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT (NH2- DTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT -COOH)
D-IB1
18 23 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD (NH2- TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTD -COOH)
L-IB (generico)
19 19 XRPTTLXLXXXXXXXQDSlTX (NH2- XRPTTLXLXXXXXXXQDSlTX -COOH)
D-IB (generico)
20 19 XSlTDQXXXXXXXLXLTTPRX (NH2- XSlTDQXXXXXXXLXLTTPRX -COOH)
L-generico-TAT
21 17 XXXXRKKRRQRRRXXXX (NH2- XXXXRKKRRQRRRXXXX -COOH)
D-generico-TAT
22 17 XXXXRRRQRRKKRXXXX (NH2- XXXXRRRQRRKKRXXXX -COOH)
L-TAT-IB1
23 35 GRKKRRQRRRPPDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT (NH2- GRKKRRQRRRPPDTYRPKRPTTLNLFPQVPRSQDT -COOH)
L-TAT-IB (generico)
24 42 XXXXXXXRKKRRQRRRXXXXXXXXRPTTLXLXXXXXXXQDSlTX (NH2-XXXXXXXRKKRRQRRRXXXXXXXXRPTTLXLXXXXXXXQDSlTX-COOH)
D-TAT-IB1
25 35 TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTDPPRRRQRRKKRG (NH2- TDQSRPVQPFLNLTTPRKPRYTDPPRRRQRRKKRG -COOH)
D-TAT-IB (generico)
26 42 XTlSDQXXXXXXXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX (NH2-XTlSDQXXXXXXXLXLTTPRXXXXXXXXRRRQRRKKRXXXXXXX -COOH)
L-TAT-IB1(s1)
27 30 RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD (NH2-RKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
L-TAT-IB1(s2)
28 30 GRKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD (NH2-GRKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
L-TAT-IB1(s3)
29 29 RKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD (NH2-RKKRRQRRRXn cRPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH)
D-TAT-IB1(s1)
30 30 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKR (NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKR-COOH)
D-TAT-IB1(s2)
31 30 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKRG (NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKRG-COOH)
D-TAT-IB1(s3)
32 29 DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKR (NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRXn cRRRQRRKKR-COOH)
L-IB1(s1)
33 13 TLNLFPQVPRSQD (NH2-TLNLFPQVPRSQD-COOH)
L-IB1(s2)
34 13 TTLNLFPQVPRSQ (NH2-TTLNLFPQVPRSQ-COOH)
L-IB1(s3)
35 13 PTTLNLFPQVPRS (NH2-PTTLNLFPQVPRS-COOH)
L-IB1(s4)
36 13 RPTTLNLFPQVPR (NH2-RPTTLNLFPQVPR-COOH)
L-IB1(s5)
37 13 KRPTTLNLFPQVP (NH2-KRPTTLNLFPQVP-COOH)
L-IB1(s6)
38 13 PKRPTTLNLFPQV (NH2-PKRPTTLNLFPQV-COOH)
L-IB1(s7)
39 13 RPKRPTTLNLFPQ (NH2-RPKRPTTLNLFPQ-COOH)
L-IB1(s8)
40 12 LNLFPQVPRSQD (NH2-LNLFPQVPRSQD-COOH)
L-IB1(s9)
41 12 TLNLFPQVPRSQ (NH2-TLNLFPQVPRSQ-COOH)
L-IB1(s10)
42 12 TTLNLFPQVPRS (NH2-TTLNLFPQVPRS-COOH)
L-IB1(s11)
43 12 PTTLNLFPQVPR (NH2-PTTLNLFPQVPR-COOH)
L-IB1(s12)
44 12 RPTTLNLFPQVP (NH2-RPTTLNLFPQVP-COOH)
L-IB1(s13)
45 12 KRPTTLNLFPQV (NH2-KRPTTLNLFPQV-COOH)
L-IB1(s14)
46 12 PKRPTTLNLFPQ (NH2-PKRPTTLNLFPQ-COOH)
L-IB1(s15)
47 12 RPKRPTTLNLFP (NH2-RPKRPTTLNLFP-COOH)
L-IB1(s16)
48 11 NLFPQVPRSQD (NH2-NLFPQVPRSQD-COOH)
L-IB1(s17)
49 11 LNLFPQVPRSQ (NH2-LNLFPQVPRSQ-COOH)
L-IB1(s18)
50 11 TLNLFPQVPRS (NH2-TLNLFPQVPRS-COOH)
L-IB1(s19)
51 11 TTLNLFPQVPR (NH2-TTLNLFPQVPR-COOH)
L-IB1(s20)
52 11 PTTLNLFPQVP (NH2-PTTLNLFPQVP-COOH)
L-IB1(s21)
53 11 RPTTLNLFPQV (NH2-RPTTLNLFPQV-COOH)
L-IB1(s22)
54 11 KRPTTLNLFPQ (NH2-KRPTTLNLFPQ-COOH)
L-IB1(s23)
55 11 PKRPTTLNLFP (NH2-PKRPTTLNLFP-COOH)
L-IB1(s24)
56 11 RPKRPTTLNLF (NH2-RPKRPTTLNLF-COOH)
L-IB1(s25)
57 10 LFPQVPRSQD (NH2-LFPQVPRSQD-COOH)
L-IB1(s26)
58 10 NLFPQVPRSQ (NH2-NLFPQVPRSQ-COOH)
L-IB1(s27)
59 10 LNLFPQVPRS (NH2-LNLFPQVPRS-COOH)
L-IB1(s28)
60 10 TLNLFPQVPR (NH2-TLNLFPQVPR-COOH)
L-IB1(s29)
61 10 TTLNLFPQVP (NH2-TTLNLFPQVP-COOH)
L-IB1(s30)
62 10 PTTLNLFPQV (NH2-PTTLNLFPQV-COOH)
L-IB1(s31)
63 10 RPTTLNLFPQ (NH2-RPTTLNLFPQ-COOH)
L-IB1(s32)
64 10 KRPTTLNLFP (NH2-KRPTTLNLFP-COOH)
L-IB1(s33)
65 10 PKRPTTLNLF (NH2-PKRPTTLNLF-COOH)
L-IB1(s34)
66 10 RPKRPTTLNL (NH2-RPKRPTTLNL-COOH)
D-IB1(s1)
67 13 QPFLNLTTPRKPR (NH2-QPFLNLTTPRKPR-COOH)
D-IB1(s2)
68 13 VQPFLNLTTPRKP (NH2-VQPFLNLTTPRKP-COOH)
D-IB1(s3)
69 13 PVQPFLNLTTPRK (NH2-PVQPFLNLTTPRK-COOH)
D-IB1(s4)
70 13 RPVQPFLNLTTPR (NH2-RPVQPFLNLTTPR-COOH)
D-IB1(s5)
71 13 SRPVQPFLNLTTP (NH2-SRPVQPFLNLTTP-COOH)
D-IB1(s6)
72 13 QSRPVQPFLNLTT (NH2-QSRPVQPFLNLTT-COOH)
D-IB1(s7)
73 13 DQSRPVQPFLNLT (NH2-DQSRPVQPFLNLT-COOH)
D-IB1(s8)
74 12 PFLNLTTPRKPR (NH2-PFLNLTTPRKPR-COOH)
D-IB1(s9)
75 12 QPFLNLTTPRKP (NH2-QPFLNLTTPRKP-COOH)
D-IB1(s10)
76 12 VQPFLNLTTPRK (NH2-VQPFLNLTTPRK-COOH)
D-IB1(s11)
77 12 PVQPFLNLTTPR (NH2-PVQPFLNLTTPR-COOH)
D-IB1(s12)
78 12 RPVQPFLNLTTP (NH2-RPVQPFLNLTTP-COOH)
D-IB1(s13)
79 12 SRPVQPFLNLTT (NH2-SRPVQPFLNLTT-COOH)
D-IB1(s14)
80 12 QSRPVQPFLNLT (NH2-QSRPVQPFLNLT-COOH)
D-IB1(s15)
81 12 DQSRPVQPFLNL (NH2-DQSRPVQPFLNL-COOH)
D-IB1(s16)
82 11 FLNLTTPRKPR (NH2-FLNLTTPRKPR-COOH)
D-IB1(s17)
83 11 PFLNLTTPRKP (NH2-PFLNLTTPRKP-COOH)
D-IB1(s18)
84 11 QPFLNLTTPRK (NH2-QPFLNLTTPRK-COOH)
D-IB1(s19)
85 11 VQPFLNLTTPR (NH2-VQPFLNLTTPR-COOH)
D-IB1(s20)
86 11 PVQPFLNLTTP (NH2-PVQPFLNLTTP-COOH)
D-IB1(s21)
87 11 RPVQPFLNLTT (NH2-RPVQPFLNLTT-COOH)
D-IB1(s22)
88 11 SRPVQPFLNLT (NH2-SRPVQPFLNLT-COOH)
D-IB1(s23)
89 11 QSRPVQPFLNL (NH2-QSRPVQPFLNL-COOH)
D-IB1(s24)
90 11 DQSRPVQPFLN (NH2-DQSRPVQPFLN-COOH)
D-IB1(s25)
91 10 DQSRPVQPFL (NH2-DQSRPVQPFL-COOH)
D-IB1(s26)
92 10 QSRPVQPFLN (NH2-QSRPVQPFLN-COOH)
D-IB1(s27)
93 10 SRPVQPFLNL (NH2-SRPVQPFLNL-COOH)
D-IB1(s28)
94 10 RPVQPFLNLT (NH2-RPVQPFLNLT-COOH)
D-IB1(s29)
95 10 PVQPFLNLTT (NH2-PVQPFLNLTT-COOH)
D-IB1(s30)
96 10 VQPFLNLTTP (NH2-VQPFLNLTTP-COOH)
D-IB1(s31)
97 10 QPFLNLTTPR (NH2-QPFLNLTTPR-COOH)
D-IB1(s32)
98 10 PFLNLTTPRK (NH2-PFLNLTTPRK-COOH)
D-IB1(s33)
99 10 FLNLTTPRKP (NH2-FLNLTTPRKP-COOH)
D-IB1(s34)
100 10 LNLTTPRKPR (NH2-LNLTTPRKPR-COOH)
Las secuencias inhibidoras de JNK tal como se usan aqui pueden consistir ademas en un derivadode secuencias de aminoacido (no nativo) de acuerdo con la SEC ID NO: 2 definida anteriormente. En este contexto un quot;derivado de unasecuencia de aminoacidos (nativa o no nativa) de acuerdo con las SEC ID NO: 2quot; preferiblemente es una secuencia de aminoacidos derivada de la SEC ID NO: 2 donde el derivado comprende al menos un aminoacido-D modificado (fomando aminoacidos no nativos),de 1 a 20, en especial de 1 a 10 y en particular de1 a 5 aminoacidos-D modificados.
quot;Un aminoacido modificadoquot; en este sentido puede ser cualquier aminoacido que esta alterado, por ejemplo diferentes glicosilaciones en varios organismos, por fosforilacion o por marcado especifico de aminoacidos. Este marcador se selecciona entonces tipicamente de entre el grupo que comprende:
(i)
marcadores radioactivos, es decir, de fosforilacion radioactiva o marcado radioactivo con azufre, hidrogeno, carbono, nitrogeno, etc.;
(ii)
tintes colorantes (por ejemplo, digoxigenina, etc.);
(iii) grupos fluorescentes (por ejemplo. fluoresceina, etc.);
(iv)
grupos quimioluminiscentes;
(v)
grupos para la inmovilizacion en fase solida (por ejemplo, His-tag, biotina, strep-tag, flag-tag, anticuerpos, antigeno, etc.); y
(vi)
una combinacion de dos o mas de los marcadores mencionados en (i) a (v).
Las secuencias inbibidoras de JNK tal como se usan de acuerdo con la presente invencion y que se han definido anteriormente pueden obtenerse o producirse por metodos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo por sintesis quimica, tal como se discute a continuacion. Por ejemplo, puede sintetizarse un peptido que corresponde a una parte de una secuencia inhibidora de JNK tal como se usa aqui que incluye una region deseada de dicha secuencia inhibidora de JNK, o que media entre la actividad deseada in vitro o in vivo, mediante el uso de un sintetizador peptidico.
La secuencia inhibidora de JNK tal como se usa aqui y se ha definido anteriormente puede modificarse ademas con una secuencia de trafico,permitiendo que la secuencia inhibidora de JNK aqui usada y definida sea transportada eficazmente al interior de las celulas. Preferentemente, dicha secuencia inhibidora de JNK modificada se proporciona y usa como secuencia quimerica.
Asi, de acuerdo con un segundo aspecto la presente invencion, se proporciona el uso de un peptido quimerico, que consiste en un primer dominio y un segundo dominio, para la preparacion de una composicion farmaceutica para tratar enfermedades o transtornos estrechamente relacionados con la senalizacion de JNK, tal como se definio anteriormente, en un sujeto, comprendiendo el primer dominio del peptido quimerico una secuencia de trafico y comprendiendo el segundo dominio del peptido quimerico una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2 o un derivado de la misma, estando ligado el primer dominio al extremo C-terminal del segundo dominio..
Habitualmente, los peptidos quimericos tal como se usan de acuerdo con la presente invencion tienen una longitud de al menos 25 residuos de aminoacido, por ejemplo de 25 a 250, en especial de 25 a 200, con especial preferencia de 25 a 150, 25 a 100 y en particular de 25 a 50 residuos de aminoacido.
Como primer dominio, el peptido quimerico aqui empleado comprende preferentemente una secuencia de trafico tipicamente seleccionada de entre cualesquiera secuencias de aminoacidos que dirigen peptidos (en las cuales esta presente) a un destino celular deseado. Por tanto, la secuencia de trafico tal como se usa aqui dirige tipicamente el peptido a traves de la membrana plasmatica, por ejemplo desde el exterior de la celula, atravesando la membrana plasmatica,hasta el interior del citoplasma. Alternativamente, o adicionalmente, la secuencia de trafico puede dirigir al peptido a un punto deseado dentro de la celula, por ejemplo al nucleo, al ribosoma, al reticulo endoplasmico (ER), a un lisosoma o peroxisoma, por ejemplo combinando dos componentes (un componente para la permeabilidad celular y otro para la localizacion nuclear) o mediante un solo componente que, por ejemplo, presenta propiedades de transporte en la membrana celular y dirigido a una diana, esto es de transporte intranuclear. La secuencia de trafico puede comprender adicionalmente otro componente capaz de unir un componente citoplasmico o cualquier otro componente o compartimiento celular (por ejemplo reticulo endoplasmico, mitocondria, aparato de Golgi, vesiculas lisosomales). Asi, por ejemplo, la secuencia de trafico del primer dominio y la secuencia inhibidora de JNK del segundo dominio pueden estar localizadas en el citoplasma o en cualquier otro compartimiento celular. Esto permite localizar el peptido quimerico en la celula por absorcion.
Preferentemente, la secuencia de trafico (incluida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se usa aqui) tiene una longitud de secuencia de 5 a 150 aminoacidos, en especial de 5 a 100 y con especial preferencia de 5 a 50, 5 a 30
o incluso 5 a 15 aminoacidos.
En particular, la secuencia de trafico (contenida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se usa aqui) puede existir como una extension de secuencia de aminoacidos continua en el primer dominio. Alternativamente, la secuencia de trafico del primer dominio puede segmentarse en dos o mas fragmentos de forma que la totalidad de estos fragmentos refleja la secuencia de trafico entera y estos fragmentos pueden estar separados uno de otro por 1 a 10, preferentemente por 1 a 5 aminoacidos, con la condicion de que la secuencia de trafico como tal mantenga sus propiedades de transporte tal como se ja iondicado anteriormente. Estos aminoacidos que separan los fragmentos de la secuencia de trafico pueden seleccionarse, por ejemplo,de entre secuencias de aminoacido que difieren de la secuencia de trafico. Alternativamente, el primer dominio puede contener una secuencia de trafico compuesta por mas de un componente, cada componente con su propia funcion para el transporte de la secuencia de carga inhibidora de JNK del segundo dominio a un compartimiento especifico de la celula, por ejemplo.
La secuencia de trafico definida anteriormente puede estar compuesta de aminoacidos-L, aminoacidos-D o una combinacion de ambos. Preferentemente, la secuencia de trafico (incluida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se usa aqui) puede comprender al menos 1 o incluso 2, preferiblemente al menos 3, 4 o 5, en especialal menos 6, 7, 8 o 9 e incluso mas preferentemente al menos 10 o mas aminoacidos D ylo L, donde los aminoacidos D ylo L pueden estar dispuestos en la secuencia de trafico de JNK a modo de bloque, no en bloque o de forma alternada.
De acuerdo con una realizacion alternativa, la secuencia de trafico del peptido quimerico que se usa aqui puede estar compuesta exclusivamente de aminoacidos-L. Preferentemente, la secuencia de trafico del peptido quimerico tal como se usa aqui comprende o consiste en al menos una secuencia de trafico quot;nativaquot; tal como se ha indicado anteriormente. En este contexto, el termino quot;nativoquot; se refiere a secuencias de trafico no alteradas compuestas enteramente por aminoacidos-L.
De acuerdo con otra realizacion alternativa, la secuencia de trafico del peptido quimerico aqui empleada puede estar compuesta exclusivamente poraminoacidos-D. Preferentemente, la secuencia de trafico del peptido quimerico tal como se usa aqui puede comprender un peptido D retroinverso de las secuencias indicadas anteriormente.
La secuencia de trafico del primer dominio del peptido quimerico tal como se usa aqui puede obtenerse a partir de fuentes naturales o producirse mediante tecnicas de ingenieria genetica o sintesis quimica (ver, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual. 2a edicion. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Las fuentes que pueden emplearse para la secuencia de trafico del primer dominio incluyen, por ejemplo, proteinas naturales tales como proteina TAT (tal como se describe en las Patentes US 5.804.604 y 5.674.980, por ejemplo, incorporadas aqui por referencia), VP22 (descrita por ejemplo en WO 97l05265; Elliott y O'Hare, Cell 88: 223-233 (1997)), proteinas no virales (Jackson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10691-10695 (1992)), secuencias de trafico derivadas de Antennapedia (por ejemplo la secuencia portadora antennapedia) o a partir de peptidos basicos, por ejemplo peptidos con una longitud de 5 a 15 aminoacidos, preferentemente de 10 a 12 aminoacidos, y que comprenden al menos un 80%, en especial un 85% o incluso un 90% de aminoacidos basicos tales como arginina, lisina ylo histidina. Ademas, aqui se describen variantes, fragmentos y derivados de una de las proteinas nativas usadas como secuencias de trafico. Con respecto a estas variantes, fragmentos y derivados, se hace referencia a la definicion dada anteriormente para las secuencias inhibidoras de JNK tal como se usan aqui. Las variantes, fragmentos, asi como tambien los derivados estan correspondientemente definidos tal como se ha indicado anteriormente para las secuencias inhibidoras de JNK aqui empleadas. En particular, en el contexto de la secuencia de trafico, una variante o fragmento o derivado puede definirse como una secuencia que comparte una identidad de secuencia con una de las proteinas nativasdefinidas anteriormente usadas como secuencia de trafico de al menos aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, o incluso un 99%.
En una realizacion preferente del peptido quimerico tal como se usa aqui, la secuencia de trafico del primer dominio comprende o consiste en una secuencia derivada de la proteina TAT del virus de inmunodeficiencia humana (HIV)1, en particular parte o todos los 86 aminoacidos que constituyen la proteina TAT.
Para una secuencia de trafico (incluida en el primer dominio del peptido quimerico aqui empleado), pueden usarse secuencias parciales de la proteina TAT de longitud total formando una fragmento funcionalmente efectivo de la proteina TAT, es decir, un peptido TAT que incluye la region que media la entrada y la absorcion en las celulas. Puede determinarse si dicha secuencia es un fragmento funcionalmente efectivo de la proteina TAT usando tecnicas conocidas (ver por ejemplo Franked y col., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86: 7397-7401 (1989)). Por tanto, la secuencia de trafico del primer dominio del peptido quimerico tal como se usa aqui puede derivarse de un fragmento o parte funcionalmente efectivos de una secuencia de proteina TAT que comprende menos de 86 aminoacidos y que es capaz de absorberse en las celulas, opcionalmente dentro del nucleo celular. Con especial preferencia, las secuencias parciales (fragmentos) de TAT que se usan como portador para mediar en la permeabilidad del peptido quimerico a traves de la membrana celular estan disenadas para comprender la region basica (aminoacidos 48 a 57 o 49 a 57) de la TAT de longitud total.
De acuerdo con una realizacion especialmente preferente, la secuencia de trafico (incluida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se usa aqui) puede comprender o consistir en una secuencia de aminoacidos que contiene los residuos 48-57 o 49 a 57 de TAT, en particular una secuencia TAT generica NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-COOH (Lgenerico-TAT(s)) [SEC ID NO: 7] ylo XXXXRKKRRQ RRRXXXX (L-generico-TAT) [SEC ID NO: 21], siendo X o Xnb como se han definido anteriormente. Ademas, la cantidad de residuos quot;Xnbquot; en la SEC ID NO: 8 no esta limitada a la descrita, puediendo variar tal como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, la secuencia de trafico inclida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se usa aqui puede comprender o consistir en un peptido que contiene, por ejemplo, la secuencia de aminoacidos NH2-GRKKRRQRRR-COOH (L-TAT) [SEC ID NO: 5].
De acuerdo con otra realizacion especialmente preferente, la secuencia de trafico (inclida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se usa aqui) puede comprender un peptido D retroinverso de las secuencias mostradas anteriormente, es decir la secuencia D retroinversa de la secuencia TAT generica cuya secuencia es NH2-XnbRRRQRRKKR-Xnb-COOH (D-generico-TAT(s)) [SEC ID NO: 8] ylo XXXXRRRQRRKKRXXXX (D-generico-TAT) [SEC ID NO: 22]. Tambien en este caso Xnb es como se ha definido anteriormente (preferiblemente representa D aminoacidos). Ademas, la cantidad de residuos quot;Xnbquot; en la SEC ID NO: 8 no esta limitada a la descrita, puediendo variar tal como se ha indicado anteriormente. Con particular preferencia, la secuencia de trafico tal como se usa aqui puede comprender la secuencia retroinversa D NH2-RRRQRRKKRG-COOH (D-TAT) [SEC ID NO: 6].
De acuerdo con otra realizacion, la secuencia de trafico incluida en el primer dominio del peptido quimerico aqui empleado puede comprender o consistir en variantes de las secuencias de trafico definidas anteriormente. Preferentemente, una quot;variante de una secuencia de traficoquot; es una secuencia derivada de una secuencia de trafico tal como se ha definido, comprendiendo la variante una modificacion, por ejemplo por adicion, delecion (interna) (dando fragmentos) ylo por sustitucion de al menos un aminoacido presente en la secuencia de trafico definida anteriormente. Dichas modificaciones comprenden tipicamente de 1 a 20, preferentemente de 1 a 10 y en especial de 1 a 5 sustituciones, adiciones ylo deleciones de aminoacidos. Ademas, preferentemente la variante tiene una identidad de secuencia con la secuencia de trafico definida, en particular con cualquiera de las SEC ID NO: 5 a 8 o 21-22, de al menos aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%,90%, 95%, 98% o incluso un 99%.
Preferiblemente, dicha modificacion de la secuencia de trafico incluida en el primer dominio del peptido quimerico tal como se usa aqui conduce a una secuencia de trafico con mayor o menor estabilidad. Alternativamente, se pueden disenar variantes de la secuencia de trafico con el fin de modular la localizacion intracelular del peptido quimerico tal como se usa aqui. Cuando se agregan exogenamente,tales variantes definidas anteriormente se disenan tipicamente de forma que la capacidad de la secuencia de trafico de penetrar en las celulas se mantiene (es decir, la absorcion de la variante de la secuencia de trafico en el interior de la celula es esencialmente similar a la de la proteina nativaempleada como secuencia de trafico). Por ejemplo, la alteracion de la region basica relevante para la localizacion nuclear (vease por ejemplo Dang y Lee, J. Biol. Chem. 264: 18019-18023 (1989); Hauber y col.,J. Virol. 63: 1181-1187 (1989); y col., J. Virol. 63: 1-8 (1989)) puede resultar en una localizacion citoplasmica o parcialmente citoplasmica de la secuencia de trafico y, por tanto, de la secuencia inhibidora de JNK como componente del peptido quimerico aqui empleado. Ademas, pueden introducirse otras modificaciones en la variante, por ejemplo mediante union de por ejemplo colesterol u otros residuos lipidicos en la secuencia de trafico con el fin de obtener una secuencia de trafico con mayor solubilidad de membrana. Cualquiera de las variantes descritas anteriormente de las secuencias de trafico incluidas en el primer dominio del peptido quimerico aqui mepleado puede producirse mediante tecnicas bien conocidas por el experto en la materia (vease por ejemplo Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual. 2nda edicion. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)
Como un segundo dominio, el peptido quimerico aqui empleado comprende tipicamente una secuencia inhibidora de JNK, seleccionada de entre cualquiera de las secuencias inhibidoras de JNK definidas anteriormente, incluyendo variantes, fragmentos ylo derivados de las mismas.
Ambos dominios, esto es el primer y el segundo dominio, del peptido quimerico aqui empleado pueden estar unidos de manera que forman una unidad funcional. Para unir ambos dominiospuede aplicarse cualquier metodo conocido en la tecnica.
De acuerdo con una realizacion, preferentemente el primer y segundo dominios del peptido quimerico aqui empleado esta unidomediante enlace covalente. Un enlace covalente tal como se define aqui puede ser, por ejemplo, un enlace peptidico. Sin embargo, ambos dominios pueden estar unidos tambien mediante cadenas laterales o mediante un conector (quot;linkerquot;) quimico.
El primer ylo el segundo dominio del peptido quimerico aqui empleado estan presentes en una copia unica, el primer dominio unido al extremo C-terminal del segundo dominio.
Preferentemente, el primer y segundo dominios pueden unirse directamente uno al otro sin ningun conector. Alternativamente, pueden estar ligados uno al otro a traves de una secuencia conectora que comprende de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 5 aminoacidos. Los aminoacidos que forman la secuencia conectorase seleccionan preferentemente de entre glicina o prolina como residuos aminoacidos. En especial, el primer y segundo dominios pueden estar separados uno del otro mediante una bisagra de dos, tres o mas residuos prolina entre el primer y segundo dominio.
De acuerdo con una realizacion especifica alternativa, el peptido quimerico aqui usado consiste en peptidos quimericos de aminoacidos-D de acuerdo con el peptido TAT-IB1 NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH (DTAT-IB1(s)) [SEC ID NO: 11].
El primer y segundo dominios del peptido quimerico tal como se ha definido anteriormente pueden estar unidos uno a otro por acoplamiento quimico o bioquimico,el cual se realiza de cualquier forma apropiada conocida en la tecnica, por ejemplo estableciendo un enlace peptidico entre el primer y el segundo dominio, por reticulacion del primer y segundo dominio del peptido quimerico tal como se ha definido anteriormente.
Muchos de los metodos conocidos apropiados para la reticulacion quimica delos dominios primero y segundo del peptido quimerico definido son no especificos, es decir el punto de acoplamiento no esta dirigido a ningun sitio particular del polipeptido de transporte o de la macromolecula de cargo. Como resultado, el uso de agentes de reticulacion no especificos puede atacar sitios funcionales o bloquear estericamente sitios activos, convirtiendo a las proteinas conjugadas en biologicamente inactivas. Por tanto, preferentemente se usan metodos de reticulacion que permitan un acoplamiento mas especifico delos dominios primero y segundo.
En este contexto, una forma de aumentar la especificidad del acoplamiento es un acoplamiento quimico directo a un grupo funcional presente unicamente una vez o pocas veces en uno de los dominios a reticular o en ambos. Por ejemplo, la cisteina, que es el unico aminoacido de proteina que contiene un grupo tiol, solo esta presente en muchas proteinas unas pocas veces. Igualmente, por ejemplo si un polipeptido no contiene residuos lisina, un reactivo de reticulacion especifico para aminas primarias sera selectivo para el terminal amino de ese polipeptido. El exito del uso de esta realizacion para aumentar la especificidad del acoplamiento requiere que el polipeptido tenga los residuos adecuados raros y reactivos en zonas de la molecula que puedan ser alteradas sin que se pierda su actividad biologica. Pueden reemplazarse los residuos cisteina cuando ocurren en partes de una secuencia polipeptidica donde su participacion en una reaccion de reticulacionpodria interferir probablemente en la actividad biologica. Cuando se reemplaza un residuo cisteina, tipicamente es deseable minimizar los cambios resultantes en el plegamiento polipeptidico. Estos cambios se minimizan cuando el reemplazo es por una especie quimica y estericamente similar a la cisteina. Por estas razones, para reemplazar la cisteina es preferente la serina. Tal como se demuestra en los ejemplos siguientes, con el fin de la reticulacion puede introducirse un residuo cisteina en la secuencia de aminoacidos del polipeptido. Cuando se introduce un residuo cisteina, preferentemente la introduccion se lleva a cabo en o cerca del terminal amino o carboxi. Se pueden emplear metodos convencionales para dichas modificaciones de la secuencia de aminoacidosdonde el polipeptido de interes se produce por sintesis quimica.
El acoplamiento del primer y segundo dominios del peptido quimerico definido anteriormente y usado aqui puede realizarse tambien mediante un agente de acoplamiento o conjugacion. Existen diversos reactivos de reticulacion intermolecular que pueden utilizarse (ver por ejemplo Means y Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43). Entre estos reactivos estan, por ejemplo, propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP) o N,N'-(1,3-fenilen)bismaleimida (ambos altamente especificos para los grupos sulfhidrilo y formadoresde enlaces irreversibles); N,N'-etilen-bis(yodo acetamida) u otros reactivos que tienen puentes metileno de 6 a 11 carbonos (relativamente especificos para los grupos sulfhidrilo); y 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (que forma enlaces irreversibles con los grupos amina y tirosina). Otros reactivos de reticulacion utiles para este proposito incluyen p,p'-difluoro-m,m'dinitrodifenilsulfona, que forman enlaces de reticulacion irreversibles con grupos amino y fenolicos); adipimidato de dimetilo (especifico para grupos amino); fenol-1,4-disulfonilcloruro (que reacciona principalmente con grupos amino); hexametilen-diisocianato o diisotiocianato o azofenil-p-diisocianato (reaccionan principalmente con grupos amino); glutaraldehido (que reacciona con varias cadenas laterales diferentes) y disdiazobenzidina (que reacciona principalmente con tirosina e histidina).
Los reactivos de reticulacionempleados para reticular el primer dominio y el segundo dominio del peptido quimerico definido pueden ser homobifuncionales, es decir tener dos grupos funcionales que participan en la misma reaccion. Un reactivo de reticulacion homobifuncional preferente es bismaleimidohexano (BMH). El BMH contiene dos grupos funcionales maleimida, que reaccionan especificamente con compuestos que contienen sulfhidrilo bajo condiciones suaves (pH 6,5-7,7). Los dos grupos maleimida estan unidos por una cadena hidrocarburo, por tanto BMH es util para la reticulacion irreversible de polipeptidos que contienen residuos cisteina.
Los reactivos de reticulacionempleados para reticular el primer y el segundo dominio del peptido quimerico definido pueden ser tambien heterobifuncionales. Los agentes de reticulacion heterobifuncionales tienen dos grupos funcionales diferentes, por ejemplo un grupo amina-reactivo y un grupo tiol-reactivo que reticulara dos proteinas que tienen aminas y tioles libres, respectivamente. Ejemplos de agentes de reticulacion heterobifuncionales son 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), m-maleimidobenzoil ester de N-hidroxisuccinimida (MBS) y 4(p-maleimidofenil)butirato de succinimida (SMPB), un analogo de cadena extendida de MBS. El grupo succinimidilo de estos agentes de reticulacion reacciona con una amina primaria, formando la maleimida tiol-reactiva un enlace covalente con el tiol de un residuo cisteina.
Reactivos de reticulacion apropiados para la reticulacion del primer y segundo dominios del peptido quimerico definido a menudo tienen una baja solubilidad en agua. Por ello, puede anadirse una parte hidrofilica, tal como un grupo sulfonato, al reactivo de reticulacioncon el fin de mejorar su solubilidad en agua. En este sentido, Sulfo-MBS y Sulfo-SMCC son ejemplos de reactivos de reticulacion modificados para ser solubles en agua que pueden usarse de acuerdo con la presente invencion.
Asimismo, muchos reactivos de reticulacionresultan en un conjugado que es esencialmente no disociable bajo condiciones celulares. Sin embargo, algunos reactivos de reticulacion particularmente apropiados para la reticulacion del primer y segundo dominios del peptido quimerico definidopresentan un enlace covalente, tal como disulfuro, disociable bajo condiciones celulares. Por ejemplo, el reactivo de Traut, ditiobis(succinimidilpropionato) (DSP) y el 3-(2piridilditio)propionato de N-succinimidilo(SPDP) son reticulantes disociables bien conocidos. El uso de un reactivo de reticulacion disociable permite que la prte de carga se separe del polipeptido de transporte despues de su liberacion en la celula diana. El enlace disulfuro directo tambien puede ser util.
Numerosos reactivos de reticulacion, incluyendo aquellos citados anteriormente, son comerciales. Las instrucciones detalladas de uso son facilmente asequibles de los proveedores comerciales. Una referencia general sobre lareticulacion de proteinas y la preparacion de conjugados es Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press (1991).
Lareticulacion quimica del primer y segundo dominios del peptido quimerico aqui definido puede incluir el uso de brazos espaciadores. Los brazos espaciadores dotan de flexibilidad intramolecular o ajustan las distancias intramoleculares entre partes conjugadas y, por ello, pueden ayudar a preservar la actividad biologica. Un brazo espaciador puede tener la forma de un residuo polipeptidico que incluye aminoacidos espaciadores, por ejemplo prolina. Alternativamente un brazo espaciador puede ser parte del reactivo de reticulacion, tal como en quot;SPDP de cadena largaquot; (Pierce Chem. Co., Rockford, IL., cat. No. 21651 H).
Finalmente, el peptido quimerico tal como se usa aqui comprende tambien derivados de los peptidos quimericos antes descritos, en particular de las secuencias de los peptidos quimericos de SEC ID NO: 11.
La secuencia inhibidora de JNK ylo los peptidos quimericos definidos aqui, asi como tambien sus fragmentos, variantes
o derivados, pueden utilizarse como inmunogenos para generar anticuerpos que se unen inmunoespecificamente a estos componentes peptidicos. Dichos anticuerpos incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab policlonales, monoclonales, quimericos, de cadena unica y una genoteca de Fab. Para la produccion de estos anticuerpos pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la tecnica.
A modo de ejemplo, pueden inmunizarse animales huesped para que produzcan anticuerpos policlonales mediante inyeccion con cualquier peptido quimerico o secuencia inhibidora de JNK definidos anteriormente. Pueden usarse varios coadyuvantes para incrementar asi la respuesta inmunologica, incluyendo pero sin limitarse a, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales (por ejemplo hidroxido de aluminio), sustancias tensioactivas (por ejemplo lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, peptidos, emulsiones oleosas, dinitrofenoles, etc.), CpG, polimeros, Pluronics y adyuvantes humanos tales como bacillus de Calmette-Guerin y Corynebacterium parvum.
Para la preparacion de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia el peptido quimerico o a una secuencia inhibidora de JNK tal como se ha definido, puede utilizarse cualquier tecnica que provea la produccion de moleculas de anticuerpos mediante cultivo continuo de un linaje celular. Dichas tecnicas incluyen, pero no estan limitadas a, tecnicas de hibridoma (ver Kohler y Milstein, 1975. Nature 256: 495-497); tecnicas de trioma; tecnicas de hidridoma de celulas B humanas (ver Kozbor y col., 1983, Immunol Today 4: 72) y tecnicas de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (ver Cole y col., 1985. En: Monoclonal Antibodies y Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Los anticuerpos monoclonales humanos pueden utilizarse en la practica de la presente invencion y pueden producirse mediante el uso de hibridomas humanos (ver Cole y col., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o mediante transformacion de celulas B humanas con el virus de Epstein Barr in vitro (ver Cole y col.,1985. En: Monoclonal Antibodies y Cancer Therapy (Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)).
Las tecnicas pueden adaptarse para la produccion de anticuerpos de cadena unica especificos para las secuencias inhibidoras de JNK y los peptidos quimericos tal como se definen aqui (ver por ejemplo la Patente US 4.946.778). Ademas, pueden adaptarse metodos para la construccion de genotecas de expresion Fab (ver por ejemplo Huse y col., 1989. Science 246: 1275-1281) con el fin de permitir una identificacion rapida y eficaz de los fragmentos Fab monoclonales de especificidad deseada para estas secuencias inhibidoras de JNK ylo peptidos quimericos. Los anticuerpos no humanos pueden ser quot;humanizadosquot; mediante tecnicas bien conocidas (ver por ejemplo la Patente US 5.225.539). Los fragmentos de anticuerpos que contienen los idiotipos para una secuencia inhibidora de JNK ylo peptido quimerico tal como se define aqui pueden obtenerse por tecnicas conocidas, incluyendo por ejemplo (i) un fragmento F(ab')2 producido por digestion de pepsina de una molecula de anticuerpo; (ii) un fragmento Fab generado por reduccion de los puentes disulfuro de un fragmento F(ab')2 ; (iii) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molecula de anticuerpo con papaina y un agente reductor y (iv) fragmentos Fv.
Metodos que pueden utilizarse para rastrear(quot;screeningquot;) anticuerpos que poseen la especificidad deseada incluyen, pero no estan limitados a, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y otras tecnicas mediadas inmunologicamente conocidas. En una realizacion especifica, la seleccion de anticuerpos especificos para un epitopo particular de una secuencia inhibidora de JNK ylo un peptido quimerico tal como se define aqui (por ejemplo, un fragmento del mismo que comprende tipicamente una longitud de 5 a 20, preferiblemente de 8 a 18 y en especial de 8 a 11 aminoacidos) es facilitada por la generacion de hibridomas que se unen al fragmento que posee dicho epitopo de una secuencia inhibidora de JNK ylo un peptido quimerico tal como el definido aqui. Aqui tambien se proporcionan estos anticuerpos que son especificos para un epitopo tal como el definido anteriormente.
Los anticuerpos aqui definidos pueden aplicarse a metodos conocidos en la tecnica en referencia a la localizacion ylo cuantificacion de una secuencia inhibidora de JNK (ylo correspondientemente a un peptido quimerico tal como se ha definido anteriormente), por ejemplo para su uso en la medida de los niveles de peptido en muestras fisiologicas apropiadas, en metodos de diagnostico o en la formacion de imagenes del peptido y similares.
Las secuencias inhibidoras de JNK, los peptidos quimericos ylo anticuerpos definidos de acuerdo con la invencion pueden formularse en una composicion farmaceutica, la cual puede aplicarse en la prevencion o tratamiento de cualquiera de las enfermedades definidas aqui, particularmente en la prevencion o tratamiento de enfermedades o trastornos estrechamente relacionados con la senalizacion de JNK, tal como se ha indicado. Tipicamente, dicha composicion farmaceutica usada de acuerdo con la presente invencion incluye como componente activo, por ejemplo, (i) cualquiera de una o mas de las secuencias inhibidoras de JNK ylo peptidos quimericos como los definidos anteriormente ylo sus variantes, fragmentos o derivados, en particular secuencias inhibidoras de JNK de acuerdo con la secuencia SEC ID NO: 2 ylo peptidos quimericos de acuerdo con la SEC ID NO: 11 ylo secuencias inhibidoras de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2 que comprenden una secuencia de trafico segun cualquiera de las SEC ID NO: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de la misma dentro de las definiciones anteriores.
De acuerdo con una realizacion preferente, dicha composicion farmaceutica tal como se usa de acuerdo con la presente invencion comprende tipicamente una cantidad segura y eficaz de un componente tal como el definido anteriormente, preferentemente de al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la secuencia de la SEC ID NO: 2 ylo al menos un peptido quimerico de acuerdo con la SEC ID NO: 11, ylo al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2 que comprende una secuencia de trafico de acuerdo con cualquiera de las SEC ID NO: 58 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de la misma dentro de las definiciones anteriores.
Los inventores de la presente invencion han descubierto ademas que la secuencia inhibidora de JNK y el peptido quimerico, respectivamente, tal como se definen aqui, presentan una tasa de absorcion particularmente alta en las celulas implicadas en las enfermedades de la presente invencion. Por ello, la cantidad de secuencia inhibidora de JNK y de peptido quimerico, respectivamente, en la composicion farmaceutica a administrar a un sujeto puede consistir en una dosis muy baja, aunque sin limitarse a ello. Por consiguiente, la dosis puede ser muy inferior a la correspondiente en el caso de los farmacos peptidicos conocidos en la tecnica, como DTS-108 (Florence Meyer-Losic y col., Clin Cancer Res., 2008, 2145-53). Esto tiene varios aspectos positivos, por ejemplo una disminucion de las reacciones secundarias potenciales y del coste.
Preferentemente, la dosis (por kg de peso corporal) esta en un rango de hasta 10 mmollkg, preferentemente de hasta 1 mmollkg, de forma especialmente preferente de hasta 100 Imollkg, de forma mas preferente de hasta 10 Imollkg, de forma particularmente preferente de hasta 1 Imollkg, incluso de hasta 100 nmollkg y de forma totalmente preferente de hasta 50 nmollkg.
Asi, preferentemente el intervalo de dosis puede serde entre aproximadamente 1 pmollkg y aproximadamente 1 mmollkg, entre aproximadamente 10 pmollkg y aproximadamente 0,1 mmollkg, entre aproximadamente 10 pmollkg y aproximadamente 0,01 mmollkg, entre aproximadamente 50 pmollkg y aproximadamente 1 Imollkg, entre aproximadamente 100 pmollkg y aproximadamente 500 nmollkg, entre aproximadamente 200 pmollkg y aproximadamente 300 nmollkg, entre aproximadamente 300 pmollkg y aproximadamente 100 nmollkg, entre aproximadamente 500 pmollkg y aproximadamente 50 nmollkg, entre aproximadamente 750 pmollkg y aproximadamente 30 nmollkg, entre aproximadamente 250 pmollkg y aproximadamente 5 nmollkg, entre aproximadamente 1 nmollkg y aproximadamente 10 nmollkg, o una combinacion de dos cualesquiera de estos valores.
En este contexto, la prescripcion de tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosis, etc, cuando se usa la composicion farmaceutica anterior cae dentro de la responsabilidad del facultativo y otros doctores en medicina, tipicamente teniendo en cuenta el trastorno a tratar, el estado de cada paciente individual, el sitio de liberacion, la via de administracion y otros factores conocidos. Ejemplos de las tecnicas y protocolos mencionados anteriormente pueden hallarse en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980. Por consiguiente, quot;una cantidad segura y eficazquot; tal como se ha indicado anteriormente para los componentes de las composiciones farmaceuticas a usar de acuerdo con la presente invencion significa una cantidad de cada una o de todos estos componentes suficiente para inducir una modificacion positiva significativa de enfermedades o trastornos estrechamente relacionados con la senalizacion de JNK, tal como se ha definido aqui. Al mismo tiempo, sin embargo, la quot;cantidad segura y eficazquot; es lo suficientemente pequena para evitar efectos secundarios graves, esto es permite una relacion adecuada entre ventajas y riesgos. La determinacion de estos limites cae dentro del alcance del juicio medico. La quot;cantidad segura y eficazquot; de dicho componente variara segun la enfermedad particular a tratar y tambien segun la edad y el estado fisico del paciente, la gravedad de la enfermedad, la duracion del tratamiento, la naturaleza de terapias coadyuvantes, delos vehiculos farmaceuticamente aceptables empleados y de factores similares dentro del conocimiento y experiencia del medico. Las composiciones farmaceuticas segun la invencion pueden usarse, de acuerdo con la invencion, en humanos y tambien con propositos medicos veterinarios.
La composicion farmaceutica tal como se usa de acuerdo con la presente invencion puede comprender, ademas de una de estas sustancias, un vehiculo farmaceuticamente aceptable (compatible), excipientes, tampones, estabilizantes u otros materiales bien conocidos por los expertos en la materia.
En este contexto, la expresion quot;vehiculo farmaceuticamente aceptable (compatible)quot; incluye preferentemente la base liquida o no liquida de la composicion. El termino quot;compatiblequot; significa que los constituyentes de la composicion farmaceutica tal como se usa aqui pueden mezclarse con el componente farmaceuticamente activo definido anteriormente y con otros componentessin que se produzca una interaccion que pueda reducir sustancialmente la eficacia farmaceutica de la composicion bajo las condiciones de uso normales.
Los vehiculos farmaceuticamente aceptables deben tener una pureza lo suficientemente elevada y una toxicidad lo suficientemente baja apropiadas como para ser administrados a una persona a tratar.
Cuando la composicion farmaceutica aqui empleada se prorciona en forma liquida, el vehiculos farmaceuticamente aceptable comprendera tipicamente uno o mas vehiculos liquidos farmaceuticamente aceptables (compatibles). Como vehiculos liquidos farmaceuticamente aceptables (compatibles), la composicion puede comprender, por ejemplo, agua libre de pirogenos, soluciones salinas isotonicas o tamponadas (acuosas) rales como soluciones tampon fosfato, citrato, etc, aceites vegetales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de maiz y aceite de teobroma, polioles como polipropilenglicol, glicerol, sorbitol, manitol y polietilenglicol, acido alginico, etc. En particular, para la inyeccion de la composicion farmaceutica aqui empleada puede usarse un tampon, preferentemente acuoso.
Cuando la composicion farmaceutica aqui empleada se proporciona en forma solida, el vehiculo farmaceuticamente aceptable comprendera tipicamente uno o mas vehiculos solidos farmaceuticamente aceptables (compatibles). Como vehiculos solidos farmaceuticamente aceptables (compatibles), la composicion puede comprender, por ejemplo, uno o mas cargas o diluyentes solidos o liquidos compatibles o pueden usarse tambien compuestos encapsulantes apropiados para la administracion a una persona. Ejemplos de tales vehiculos solidos farmaceuticamente aceptables (compatibles) son azucares como lactosa, glucosa y sacarosa, almidones como almidon de maiz o almidon de patata, celulosa y sus derivados, como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa, acetato de celulosa, tragacanto en polvo, malta, gelatina, sebo; agentes deslizantes solidos como acido estearico, estearato de magnesio, sulfato de calcio, etc.
La naturaleza precisa del vehiculo farmaceuticamente aceptable (compatible) o de otro material puede depender de la via de administracion. Asi, la seleccion de un vehiculo farmaceuticamente aceptable (compatible) puede decidirse en principio de acuerdo a laforma de administracion de la composicion farmaceutica empleada de acuerdo con la invencion. La composicion farmaceutica empleada de acuerdo con la invencion puede administrarse, por ejemplo, sistemicamente. Las vias de administracion incluyen, por ejemplo, vias parenterales (por ejemplo por inyeccion), tales como vias intravenosas, intramusculares, subcutaneas, intradermicas o transdermicas, etc., vias entericas como vias orales o rectales, etc., vias topicas como nasales o intranasales, etc., u otras vias como las vias epidermica o la liberacion desde parches.
La cantidad apropiada de la composicion farmaceutica empleada puede determinarse mediante experimentos rutinarios en modelos animales. Dichos modelos incluyen, sin implicar ninguna limitacion, conejos, ovejas, ratones, ratas, perros y modelos de primates no humanos. Las formas de dosificacion unitaria preferentes para la inyeccion incluyen soluciones esteriles acuosas, en solucion fisiologica salina o mezclas de las mismas. El pH de estas soluciones debe ajustarse a aproximadamente 7,4. Vehiculos apropiados para la inyeccion incluyen hidrogeles, dispositivos de liberacion controlada
o retardada, acido polilactico y matrices de colageno. Vehiculos farmaceuticamente aceptables apropiados para la aplicacion topica incluyen aquellos adecuados en lociones, cremas, geles y similares. Si el compuesto debe administrarse via peroral, son preferentes las tabletas, capsulas y similares, siendo estas formas de dosificacion unitarias preferentes. Los vehiculos farmaceuticamente aceptables para la preparacion de dosis unitarias que pueden usarse en la administracion oral son bien conocidos en la tecnica anterior. La seleccion de los mismos dependera de consideraciones secundarias tales como el sabor, el coste y la estabilidad de almacenamiento, que no son criticas para los propositos de la presente invencion y que pueden determinarse sin dificultad por un experto en la materia.
Las composiciones farmaceuticas para la administracion oral pueden estar en forma de tabletas, capsulas, polvos o liquidos. Una tableta puede incluir un vehiculo solido tal como se ha definido anteriormente, por ejemplo gelatina, y opcionalmente un coadyuvante. Las composiciones farmaceuticas liquidas para la administracion oral generalmente incluyen un vehiculo liquido tal como se ha definido anteriormente,port ejemplo agua, petroleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintetico. Tambien pueden incluirse soluciones salinas fisiologicas, dextrosa u otras soluciones de sacaridos, o glicoles como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
Para la inyeccion intravenosa, cutanea o subcutanea o en el sitio relevante, el ingrediente activo estara en forma de solucion acuosa parenteralmente aceptable libre de pirogenos y con pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la materia podran preparar soluciones apropiadas usando por ejemplo vehiculos isotonicos tales como Inyeccion de Cloruro de Sodio, Inyeccion de Ringer, Inyeccion de Ringer lactada. Si es necesario pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes ylu otros aditivos. Tanto si es un polipeptido, un peptido o una molecula de acido nucleico u otros compuestos farmaceuticamente utiles de acuerdo con la presente invencion que deben ser administrados a un individuo, preferentemente la administracion es de una cantidad quot;profilacticamente efectivaquot; o de una quot;cantidad terapeuticamente efectivaquot; (segun sea el caso) que sea suficiente para beneficiar al individuo. La cantidad real administrada, asi como el regimen y la duracion de la administracion dependeran de la naturaleza y gravedad del sujeto a tratar.
La prevencion ylo el tratamiento de una enfermedad tal como se ha definido aqui incluyen tipicamente la administracion de una composicion farmaceutica como la definida anteriormente. El termino quot;modularquot; incluye suprimir la expresion de JNK cuando esta hiperexpresada en cualquiera de las enfermedades anteriores. Tambien incluye suprimirla fosforilacion de c-jun, ATF2 o NFAT4 en cualquiera de las enfermedades anteriores, por ejemplo mediante el uso de al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2 ylo de al menos un peptido quimerico de acuerdo con la SEC ID NO: 11 ylo de al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2 que comprende una secuencia de trafico segun cualquiera de las SEC ID NO: 5 a 8 y 21 a 22, o variantes o fragmentos de la misma dentro de las definiciones anteriores, como inhibidor competitivo del sitio de union de c-jun, ATF2 y NFAT4 naturales en una celula. El termino quot;modularquot; incluye tambien suprimir complejos hetero-y homomericos de los factores de transcripcion integrados por c-jun, ATF2 o NFAT4, sin limitarse a los mismos, y sus pares relacionados, por ejemplo el complejo AP-1 que esta integrado por c-jun, AFT2 y c-fos. Cuando una enfermedad o trastorno estrechamente relacionado con la senalizacion de JNK como se ha definido anteriormente estan asociadosa la hiperexpresion de JNK, dichas secuencias inhibidoras de JNK supresoras pueden ser introducidas en una celula. En algunos casos quot;modularquot; puede incluir aumentar la expresion de JNK, por ejemplo usando un anticuerpo especifico de peptido IB que bloquea la union de un peptido IB a JNK, evitando asi la inhibicion de JNK mediante un peptido relacionado con IB.
La prevencion ylo el tratamiento de un sujeto con la composicion farmaceutica descrita anteriormente se lleva a cabo tipicamente mediante la administracion (in vivo) de una cantidad (quot;terapeuticamente efectivaquot;) de dicha composicion farmaceutica a un sujeto, siendo el sujeto,por ejemplo, cualquier mamifero como seres humanos, primates, raton, rata, perro, gato, vaca, caballo o cerdo. El termino quot;terapeuticamente efevticaquot; significa que el componente activo de la composicion farmaceutica esta en cantidad suficiente para mejorar la enfermedad o el trastorno estrechamente relacionado con la senalizacion de JNK definida anteriormente.
Por consiguiente, cualquier peptido tal como el definido anteriormente, por ejemplo al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2 ylo al menos un peptido quimerico de acuerdo con la SEC ID NO: 11 ylo al menos una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2 que comprende una secuencia de trafico segun cualquiera de las SEC ID NO: 5 a 8 y 21 a 22, o sus variantes o fragmentos dentro de las definiciones anteriores, pueden utilizarse en una realizacion especifica de la presente invencion para tratar enfermedades o trastornos estrechamente relacionados con la senalizacion de JNK tal como se ha definido anteriormente, por ejemplo modulando las vias de senalizacion de JNK activadas.
Para tratar enfermedades tales como las aqui citadas, pueden aplicarse terapias dirigidas para liberar las secuencias inhibidoras de JNK ylo los peptidos quimericos definidos anteriormente mas especificamente a ciertos tipos de celulas, usando sistemas diana tales como anticuerpos (diana) o ligandos especificos celulares. Los anticuerpos para dirigirse a unadiana son tipicamente especificos para las proteinas de la superficie de las celulas asociadas a cualquiera de las enfermedades definidas a continuacion. A modo de ejemplo, estos anticuerpos pueden dirigirse a anticuerpos de la superficie celular tales como proteinas de superficie asociadas a celulas B,por ejemplo proteinas DR de MHC clase II, CD18 (LFA-1 cadena beta), CD45RO, CD40 o Bgp95, proteinas de superficie de las celulas seleccionadas de entre por ejemplo CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD13, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD39, CD4, CD43, CD45, CD52, CD56, CD68, CD71, CD138, etc. Los constructosdiana pueden prepararse tipicamente uniendo de forma covalente las secuencias inhibidoras de JNK y los peptidos quimericos definidos aqui, de acuerdo con la invencion, a un anticuerpo especifico para una proteina de la superficie celular o mediante su union a un ligando celular especifico. Por ejemplo, las proteinas pueden enlazarse a dicho anticuerpo o pueden unirse al mismo mediante un enlace peptidico o por acoplamiento quimico, reticulacion, etc. La terapia dirigida, puede llevarse a cabo administrando el constructo diana en una cantidad farmaceuticamente efectiva para un paciente mediante cualquiera de las vias de administracion definidas a continuacion, por ejemplo las vias intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral y de liberacion desde parche. Preferentemente, las secuencias inhibidoras de JNK o los peptidos quimericos aqui definidos de acuerdo con la invencion que estan unidos a los anticuerpos diana o a ligandos celulares especificos tales como los definidos anteriormente pueden liberarsein vitro o in vivo, por ejemplo por hidrolisis del enlace covalente, mediante peptidasas o por cualquier otro metodo apropiado. Alternativamente, si las secuencias inhibidoras de JNK o los peptidos quimericos aqui definidos de acuerdo con la invencion se unen a un ligando especifico de celulas pequenas, puede no llevarse a cabo la liberacion del ligando. Si estan presentes en la superficie de la celula, los peptidos quimericos pueden entrar en esta por la actividad de su secuencia de trafico. La direccion a una diana puede ser deseable por diversas razones; por ejemplo, si las secuencias inhibidoras de JNK y los peptidos quimericos aqui definidos de acuerdo con la invencion son inaceptablemente toxicos o si, por otra parte, requeririan una dosis demasiado elevada.
Alternativamente, las secuencias inhibidoras de JNK ylo los peptidos quimericos aqui definidos podrian administrarse en una forma precursora mediante el uso de un anticuerpo o un virus. Estas secuencias inhibidoras de JNK ylo peptidos quimericos pueden convertirse luego a su forma activa mediante un agente activador producido en o dirigido a las celulas atratar. Este tipo de realizacion se conoce a veces como ADEPT (terapia enzimatica de pro-farmacodirigido al anticuerpo), que implica dirigir el agente activador a las celulas por conjugacion con un anticuerpo celular especifico.
De acuerdo con otra realizacion, las secuencias inhibidoras de JNK, los peptidos quimericos o los anticuerpos para las secuencias inhibidoras de JNK o para los peptidos quimericos aqui definidos, por ejemplo una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2 ylo un peptido quimerico de acuerdo con la SEC ID NO: 11 ylo una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2 que comprende una secuencia de trafico segun cualquiera de las SEC ID NO: 5 a 8 y 21 a 22 o sus variantes o fragmentos dentro de las definiciones anteriores, pueden utilizarse en ensayos (in vitro) (por ejemplo inmunoensayos), para detectar, pronosticar, diagnosticar o controlardiversas afecciones y estados de enfermedad seleccionados de entre enfermedades o trastornos estrechamente relacionados con la senalizacion de JNK definida anteriormente, o para monitorear su tratamiento. El inmunoensayo puede llevarse a cabo mediante un metodo que comprende poner en contacto una muestra de un paciente con un anticuerpo para una secuencia inhibidora de JNK o para un peptido quimerico como los definidos anteriormente bajo las condiciones que permitan la union inmunoenspecifica y entonces la deteccion o medida de la cantidad de cualquier union inmunoespecifica mediante el anticuerpo. En una realizacion especifica, puede emplearse un anticuerpo especifico para una secuencia inhibidora de JNK o un peptido quimerico para analizar una muestra de tejido o suero de un paciente con el fin de determinar la presencia de JNK o de una secuencia inhibidora de JNK; siendo un nivel aberrante de JNK indicativo de enfermedad. Los inmunoensayos a utilizar incluyen, pero no estan limitados a, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos con tecnicas tales como Western Blot, radioimmunoensayos (RIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayos quot;sandwichquot;, ensayos de inmunoprecipitacion, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina con difusion en gel, ensayo de inmunodifusion, ensayos de aglutinacion, inmunoensayos fluorescentes, ensayos de fijacion de complemento, ensayos inmunorradiometricos e inmunoensayos de proteina A, etc. Alternativamente, pueden llevarse a cabo ensayos (in vitro) mediante la liberacion de las secuencias inhibidoras de JNK, peptidos quimericos o anticuerpos para secuencias inhibidoras de JNK o para peptidos quimericos, tal como se han definido anteriormente, para llegar a celulas diana, tipicamente seleccionadas de entre, por ejemplo, celulas animales, humanas o microorganismos cultivados, y para controlar la respuesta de las celulas por metodos biofisicos bien conocidos por los expertos en la materia. Las celulas diana habitualmente empleadas pueden ser celulas cultivadas (in vitro) o celulas in vivo, es decir celulas que componen organos o tejidos de animales o seres humanos vivos, o microorganismos que se encuentran en animales o seres humanos vivos.
La presente invencion adicionalmente proporciona el uso de kitsde diagnostico o con fines terapeuticos, en particular para el tratamiento, prevencion o control de enfermedades o trastornos estrechamente relacionados con la senalizacion de JNK tal como se definio anteriormente, incluyendo dicho kit uno o mas recipientes que contienen secuencias inhibidoras de JNK, peptidos quimericos ylo anticuerpos para estas secuencias inhibidoras de JNK o para peptidos quimericos tal como se han descrito anteriormente, por ejemplo un anticuerpo de la secuencia inhibidora anti-JNK para una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2, para un peptido quimerico de acuerdo con la SEC ID NO: 11, para una secuencia inhibidora JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2 que comprende una secuencia de trafico segun cualquiera de las SEC ID NO: 5 a 8 y 21 a 22, o para sus variantes o fragmentos dentro de las definiciones anteriores o tales como un anticuerpo de la secuencia inhibidora de anti-JNK y opcionalmente un par de unionmarcado para el anticuerpo. El marcador incorporado en el anticuerpo puede incluir, pero no esta limitado a, un grupo quimioluminiscente, enzimatico, fluorescente, colorimetrico o radioactivo.
El kit puede comprender opcionalmente ademas una cantidad predeterminada de una secuencia inhibidora de JNK purificada tal como la definida anteriormente o un peptido quimerico tal como el definido anteriormente para su uso como diagnostico, modelo o control en los ensayos para los propositos anteriores.
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos que se usan aqui tienen el mismo significado que habitualmente entendido por un experto en la materia a la cual pertenece esta invencion. Aunque pueden usarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aqui en la practica o ensayo de la presente invencion, a continuacion se describiran metodos y materiales apropiados. En caso de conflicto, la presente especificacion incluyendo las definiciones sera la referencia. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son unicamente ilustrativos y no limitativos. Otras caracteristicas y ventajas de la invencion resultaran aparentes de la siguiente descripcion detallada y de las reivindicaciones.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Fig. 1A-C:
diagramas que muestran las alineaciones de regiones de dominio JBD conservadas en los factores de transcripcion indicados. Las secuencias inhibidoras de JNK aqui usadas fueron identificadas por alineaciones de secuencia. Los resultados de esta alineacion son los ejemplos que se muestran en las Fig. 1A-1C. La Figura 1A describe la region de mayor homologia entre los JBD de IB1, IB2, c-Jun y ATF2. El Panel B describe la secuencia de aminoacidos de las JBD de L-IB1(s) y L-IB1 con fines comparativos. Los residuos totalmente conservados se indican con asteriscos, mientras que los residuos cambiados a Ala en el vector GFP-JBD23Mutse indicancon circulos abiertos. La Figura 1C muestra las secuencias de aminoacidos de proteinas quimericas que incluyen una secuencia inhibidora de JNK y una secuencia de trafico. En el ejemplo, la secuencia de trafico se deriva del polipeptido TAT del virus de inmunodeficiencia humana (HIV) y la secuencia inhibidora de JNK de un polipeptido IB1(s). Las secuencias humanas, de raton y rata son identicas en los paneles B y C.
Fig. 2:
diagrama que muestra las secuencias de los peptidos de fusion generica TAT-IB de ser humano, raton y rata.
Fig. 3:
muestra los resultados de la inhibicion de la actividad de JNK endogena en celulas HepG2 con los peptidos de fusion segun las SEC ID NO: 9 y 11 en una realizacion de un solo pocillo. Tal como puede observarse en la Fig. 3, particularmente el Panel D, D-TAT-IB1(s) de la SEC ID NO: 11 (abreviada aqui como D-JNKI) inhibe eficazmente la actividad de JNK, incluso mejor que la L-TAT-IB1(s) de SEC ID NO: 9 (abreviada aqui como L-JNKI).
Fig. 4:
muestra el resultado del ensayo de citotoxicidad con una secuencia inhibidora de JNK de SEC ID NO: 11, denominada tambien XG-102 (ver Ejemplo 12). Tal como puede observarse, XG-102 (SEC ID NO: 11) no es citotoxica para HFFs. Se sembraron HFFs en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Se anadio DMSO conteniendo medio (mismo nivel que el medicamento, 5 !M) o XG-102 a 1, 2, y 5 !M durante 24 h. Se agrego brevemente Red Neutro, las celulas se fijaron y se extrajo el colorante. Se midio la absorbancia a 540nm. No se observo diferencia entre DMSO y 1 !M XG-102.
Fig. 5:
muestra los resultados del ensayo de reduccion de placas llevado a cabo para ensayar la actividad de una secuencia quimerica de JNK de SEC ID NO: 11, denominada tambien XG-102, contra el virus de Varizella Zoster (VZV) (ver Ejemplo 12). Tal como puede observarse, XG-102 (SEC ID NO: 11) es un potente inhibidor del virus de la varicela Zoster (VZV), en particulara concentraciones de 0,5 IM y 1 IM.
Fig. 6:
muestra los resultados de la inhibicion del virus de la varicela Zoster (VZV) en fibroblastos humanos cultivados usando una secuencia quimerica inhibidora de JNK de SEC ID NO: 11, denominada tambien XG-102 (ver Ejemplo 12). Tal como puede observarse, VZV muestra una sensibilidad significativa a XG-102 (SEC ID NO: 11). La replicacion de VZV fue normal en presencia del control negativo (XG-100, el peptido Tat solo). XG-102 (SEC ID NO: 11) evita por tanto la replicacion de VZV que esta ya en el nivel de concentracion mas bajo ensayado de 0,25 !M.
Fig. 7:
muestra la actividad de XG-102 (SEC ID NO: 11) sobre el reclutamiento de celulas en pulmon usando MPO en homogenado de pulmon en el tratamiento de la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Cronica (EPOC) en un modelo animal de inflamacion aguda de pulmon inducida por Bleomicina. Tal como puede observarse, MPO no fue inducido significativamente despues de la administracion de bleomicina. XG-102 (SEC ID NO: 11), tenia por tanto muy poco efecto sobre los niveles pulmonares de MPO.
Fig. 8:
muestra la actividad de XG-102 (SEC ID NO: 11) sobre los niveles de TNF en el tratamiento de la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Cronica (EPOC) en un modelo animal de fibrosis pulmonar aguda inducida por Bleomicina. Cuando se miden los niveles de TNF, se observa una tendencia a la reduccion del nivel de TNF en BALF despues de la administracion de XG-102 (SEC ID NO: 11) en el modelo BLM. Los niveles de TNF son muy bajos despues de BLM.
Fig. 9:
muestra la actividad de XG-102 (SEC ID NO: 11) sobre el reclutamiento de celulas en el espacio de lavado broncoalveolar en el tratamiento de Enfermedad Pulmonar Obstructiva Cronica (EPOC) en un modelo animal de fibrosis aguda inducida por Bleomicina. A 0,1 mglkg, XG-102 (SEC ID NO: 11) reduce significativamente el reclutamiento de linfocitos y la cantidad de celulas totales reclutadas durante la etapa inflamatoria caracterizada en este punto por el reclutamiento de linfocitos. A 0,1 mglkg, XG-102 (SEC ID NO: 11) mejora el reclutamiento de linfocitos o la cantidad de celulas totales en el espacio broncoalveolar (n= 5 ratones por grupo; *p lt; 0,05; **p lt; 0,001).
Fig. 10;
muestra los resultados histologicosdel tratamiento de la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Cronica (EPOC) en un modelo animal de fibrosis pulmonar aguda inducida por Bleomicina. Se tineron secciones de 3 Im de pulmon con hematoxilina y eosina. 10 dias despues de la administracion de BLM, se observo la acumulacion de celulas inflamatorias, las areas fibroticas, la perdida de
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arquitectura pulmonar. Tal como puede verse, se observo una disminucion de estos parametros despues de la administracion de XG-102 a dosis bajas (0,001 mglkg), pero no a dosis altas (0,1 mglkg).
Fig. 11:
muestra los efectos del tratamiento con XG-102 (SEC ID NO: 11) en los niveles cerebrales de Ar1-40 y Ar1-42determinados por ELISA. Los graficos representan los niveles Ar1-40 (izquierda) y Ar1-42 (derecha) determinados por ELISA en diferentes fracciones de homogeneizado de cerebro con Triton 40 y Triton 42. Los datos se representancon graficos de puntos dispersos en valores individuales (negro) y el promedio±SEM. Se marcan el nivel de significacion con asteriscos (*plt;0,05; **plt;0,01). Se observaron diferencias significativas unicamente en la fraccion de Triton X-100 para AS1-42.
Fig. 12:
muestra los efectos del tratamiento con XG-102 (SEC ID NO: 11) en los niveles CSF de Ar1-40 y Ar1-42 determinados por ELISA. Los graficos representan los niveles Ar1-40 (izquierda) y Ar1-42 (derecha) determinados por ELISA en CSF. Los datos se representan como un grafico de puntos dispersos en valores individuales (negro) y el promedio±SEM. Se marcan los niceles de significacion con asteriscos (*plt;0,05; **plt;0,01). El tratamiento con XG-102 (SEC ID NO: 11) a ambas dosis condujo a una disminucion significativa de Ar1-40 y Ar1-42 en CSF.
Fig. 13:
muestra los efectos del tratamiento en el numero de placas en ratones hAPP Tg visualizados con tincion de Tioflavina S. Los graficos representan el numero de placas tenidas con tioflavinas por milimetro cubico en la corteza y el hipocampo. El tratamiento con XG-102 (SEC ID NO: 11) redujo la cantidad de placas de forma no dosis dependiente en el hipocampo. Los datos se representan como la media±SEM. N = 8 por grupo. *plt;0,05; **plt; 0,01.
Fig. 14:
muestra los efectos del tratamiento sobre el area de placas [%] en hAPP Tg de ratones con Tioflavinas: los graficos representan el area de placa [%] de las placas positivas a Tioflavinas en la corteza y el hipocampo. XG-102 (SEC ID NO: 11) redujo significativamente el area en las placas del hipocampo. Los datos se representan como media±SEM. N = 8 por grupo.
Fig. 15:
muestra los resultados de la administracion de XG-102 (SEC ID NO: 11) en los niveles de glucosa en sangre, en ayunas (absoluta y relativa) en un modelo animal de diabetes de tipo 2. La glucosa en sangre en ayunas se midio cada tres dias hasta el dia 68 y en una base regular hasta finalizar en el dia 111 en los grupos A y C. Se observo una disminucion clara y significativa (plt;0,001) en el nivel de glucosa en sangre en ayunas en ratones diabeticos dbldb tratados con XG-102 (SEC ID NO: 11) (10 mglkg) en comparacion con el vehiculo control. Los niveles de glucosa en sangre en ayunas de los ratones tratados con XG-102 (SEC ID NO: 11) (10 mglkg) alcanzaron una meseta baja de aprox. 5 mmolll. Este efecto fue evidente despues de 14 dias de dosificacion y persistio durante todo el estudio, por tanto durante el periodo entero que seria desde el dia 21 hasta el dia 111. En contraste, no se observo ningun efecto de dosis baja de XG-102 (SEC ID NO: 11) (1 mglkg) durante los 28 dias de dosificacion.
Fig. 16:
muestra los resultados de la administracion de XG-102 (SEC ID NO: 11), 10 mglkg de peso corporal, en un modelo animal de diabetes de tipo 2. Se observa una prevencion clara y significativa (plt;0,001) del aumento de peso corporal en ratones tratados con XG-102 (SEC ID NO: 11) (10 mglkg) en comparacion con el vehiculo control. Este efecto fue evidente desde el dia 28 de dosificacion y permanecio hasta el dia de finalizacion 111. En contraste, no observamos ningun efecto de dosis baja de XG-102 (SEC ID NO: 11) (1 mglkg) en el peso corporal durante 28 dias de dosificacion.
Fig. 17, 18:
muestran el efecto del vehiculo o de XG-102 (SEC ID NO: 11) (10 mglkg) en el modelo animal para diabetes de tipo 2 con ingesta de agua y comida las 24 horas, con medida de orina y heces, en jaulas metabolicas, en el dia de estudio 68, de las Figuras 17 (g) y 18 (normalizadas a g de peso corporal). No observamos ningun efecto significativo de XG-102 (SEC ID NO: 11) (10 mglkg) en ninguno de los parametros medidos comparados con el vehiculo control con una tendencia a la disminucion en la ingesta de comida y produccion de orina.
Fig. 19, 20:
muestra el efecto del vehiculo o XG-102 (SEC ID NO: 11) (10 mglkg) en el modelo animal para diabetes de tipo 2, a los dias 57, 77 y 108, de los niveles de insulina en plasma, MCP-1 y IL-6 en la Fig. 19 y de los niveles en plasma de tPAI-1, TNF y resistina en la Fig. 20; no se observan efectos significativos de XG-102 (SEC ID NO: 11) (10 mglkg) en ninguno de los parametros medidos en comparacion con el vehiculo control, excepto los niveles de resistina en plasma, que fueron significativamente mas elevados en los animales tratados con XG-102 (SEC ID NO: 11) el dia 77 y 108.
Fig. 21:
muestra el efecto del vehiculo o XG-102 (SEC ID NO: 11) (10 mglkg) en el modelo animal para diabetes tipo 2 sobre el peso del tejido de grasa epididimal, inguinal subcutanea y retroperitoneal en
ratas. Se observo una disminucion significativa de masa grasa epididimal (plt;0,05) y retroperitoneal (plt;0,01) en ratones tratados con XG-102 en comparacion con el vehiculo control.
Fig. 22:
muestra el efecto del vehiculo o XG-102 (SEC ID NO: 11) (10 mglkg) en el modelo animal para diabetes tipo 2 sobre el peso del tejido de cerebro, bazo y corazon. No se observa ningun efecto significativo sobre XG-102 (SEC ID NO: 11) (10 mglkg) en estos parametros en comparacion con el vehiculo control.
Fig. 23:
muestra el efecto del vehiculo o XG-102 (SEC ID NO: 11) (10 mglkg) en el modelo animal para diabetes de tipo 2 sobre el peso de los tejidos de rinon e higado. Se observa una disminucion significativa de masa en el rinon (plt;0,05) e higado (plt;0,01) en ratones tratados con XG-102 (SEC ID NO: 11) en comparacion con el vehiculo control.
Fig. 24:
Se incubaron macrofagos cultivados primarios con XG-102 (SEC ID NO: 11) y se lavaron a fondo. La presencia de XG-102 (SEC ID NO: 11) se revelo utilizando un anticuerpo especifico contra XG-102. XG-102 esta en gran medida incorporado en macrofagos primarios.
Fig. 25:
Se trataron ratones por tres vias de administracion diferentes (s.c., i.v., i.p.) con peptidos C14-madiomarcados (1 mglkg). Los animales fueron sacrificados 72 horas despues de la inyeccion y procesados para inmunorradiografia. Se expusieron secciones sagitales que revelaron la acumulacion de peptidos XG-102 en el higado, bazo y medula osea predominantemente (XG-102: SEC ID NO: 11).
Fig. 26:
inmunotincion contra XG-102 (SEC ID NO: 11) en el higado de ratas que habian recibido una inyeccion i.v. de 1 mglkg de XG-102. Los animales fueron sacrificados 24 horas despues de la inyeccion. Se revelo cabo utilizando un sustrato DAB. Esta figura muestra de nuevo la acumulacion pronunciada de XG-102 en el higado, y especialmente en las celulas de Kupffer (macrofagos).
Fig. 27:
muestra la inhibicion de la liberacion de citoquina y quimiocina en dos lineas celulares. El XG-102 (SEC ID NO: 11) inhibe la liberacion de citoquina en lineas celulares tanto mieloideas como linfoides, reduciendo la liberacion de TNFa, IL-6 y MCP-1 inducida por LPS en celulas THP-1 (Paneles A-C) y la produccion de IFNg, IL-6 e IL-2 inducida por PMA y ionomicina en celulas Jurkat (Paneles D-F). El control (XG-101) es menos eficaz debido a su menor estabilidad.
Fig. 28:
muestra la inhibicion de la liberacion de citoquina en celulas primarias. La XG-102 (SEC ID NO: 11) tambien inhibe la liberacion de citoquina en celulas primarias mieloideas y linfoides, reduciendo la liberacion de TNFa, IL-6 y Rantes inducida por LPS en macrofagos murinos (Paneles A-C) y la produccion de TNFa e IFNg inducida por PMA y ionomicina en celulas T murinas (Paneles D-E). Se producen efectos a concentraciones no toxicas de XG-102 (Panel F).
Fig. 29:
muestra la secuencia de ADNc IB1 de rata y su secuencia de aminoacidos prevista (SEC ID NO: 102).
Fig. 30:
muestra la secuencia de proteina IB1 de rata codificada por el limite exon-intron del donante de corte y empalme de gen rIB1 (SEC ID NO: 103).
Fig. 31:
muestra la secuencia de la proteina IB1 de Homo sapiens (SEC ID NO: 104).
Fig. 32:
muestra la secuencia de ADNc IB1 de Homo sapiens (SEC ID NO: 105).
EJEMPLOS
Ejemplo�1: Identificaci6n�de�secuencias�iniibidoras�de�NN�
Se identificaron secuencias de aminoacido importantes para una interaccion eficiente con JNK mediante alineaciones de secuencia entre JBDs de dominio de union a JNK conocidos. Una comparacion de secuencia entre JBDs de IB1 [SEC ID NO: 13], IB2 [SEC ID NO: 14], c-Jun [SEC ID NO: 15] y ATF2 [SEC ID NO: 16] definio una secuencia de 8 aminoacidos debilmente conservados (ver Fig. 1A). Debido a que las JBDs de IB1 e IB2 son aproximadamente 100 veces tan eficientes como las c-Jun o ATF2 en la union de JNK (Dickens y col., Science 277: 693 (1997), se llego al razomiento de que los residuos conservados entre IB1 e IB2 deben ser importantes para permitir la maxima union. La comparacion entre las JBDs de IB1e IB2 definio dos bloques de siete y tres aminoacidos altamente conservados entre las dos secuencias.
Estos dos bloques estan contenidos en la secuencia peptidica de 19 aminoacidos en L-IB1(s) [SEC ID NO: 1] y se muestran tambien por razones comparativas en una secuencia peptidica de 23 aa derivada de IB1 [SEC ID NO: 17]. Estas secuencias se muestran en la Fig. 1B, los trazos en las secuencias L-IB1 indican un hueco en la secuencia con el proposito de alinear los residuos conservados con L-IB1(s).
Ejemplo 2: Preparaci6n de�Proteinas �de Fusi6n �Iniibidoras de�NN�
Las proteinas de fusion inhibidoras de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 9 se sintetizaron por union covalentedel extremo C-terminal de la SEC ID NO: 1 al peptido portador largo de 10 aminoacidos N-terminal derivado de HIV-TAT4g 57 (Vives y col., J Biol. Chem. 272: 16010 (1997)) de acuerdo con SEC ID NO: 5 mediante un ligante consistente en dos residuos de prolina. Este ligante se uso para proporcionar una flexibilidad maxima y para prevenir cambios estructurales secundarios no deseados. Tambien se prepararon los constructos basicos, denominandose L-IB1(s) (SEC ID NO: 1) y L-TAT [SEC ID NO: 5], respectivamente.
Todos los peptidos retroinversos D de acuerdo con la SEC ID NO: 11 fueron consecuentemente sintetizados. Se prepararon tambien los constructos basicos y se designaron D-IB1(s) [SEC ID NO: 2] y D-TAT [SEC ID NO: 6], respectivamente.
Todos los peptidos de fusion D y L de acuerdo con las SEC ID NO: 9, 10, 11 y 12 se produjeron por sintesis Fmock clasica y ademas se analizaron por Espectrometria de Masas. Finalmente, se purificaron mediante HPLC. Para determinar los efectos del ligante de prolina, se produjeron dos tipos de peptidos TAT, uno sin y otro con dos prolinas. La adicion de las dos prolinas no parecio modificar la entrada o la localizacion del peptido TATenel interior de las celulas. La Fig. 2 muestra peptidos genericos con los residuos aminoacidos conservados.
Ejemplo 3: Iniibici6n�de la Muerte �Celular por�NDD1�
Se estudiaron los efectos de la secuencia JBD de 19 aa de longitud de IB1(s) sobre la actividad biologica de JNK. La secuencia de 19 aa se ligo al N-terminal de la Proteina de Fluorescencia Verde (constructo GFP JBD19) y se evaluo el efecto del constructo sobre la apoptosis de celulas beta-pancreaticas inducida por IL1. Previamente se mostro que este modo de apoptosis era bloqueado por transfeccion con JBD1-280 mientras que inhibidores especificos de ERK1l2 o p38 conocidos en la materia no lo protegieron.
Los oligonucleotidos correspondientes a JBD19 y que comprenden una secuencia conservada de 19 aminoacidos asi como tambien una secuencia mutada en las regiones completamente conservadas fueron sintetizados e insertados direccionalmente en los sitios EcoRI y SalI del vector pEGFP-N1 que codifica para la Proteina Fluorescente Verde (GFP) (de Clontech). Las celulas TC-3 productoras de insulina fueron cultivadas en un medio RPMI 1640 suplementado con 10% de Suero Bovino Fetal, 100 Iglml de estreptomicina, 100 unidadeslml de penicilina y 2 mM de glutamina. Las celulas TC-3 productoras de insulina fueron transfectadas con los vectores indicados y se agrego IL-1 (10 nglml) al medio de cultivo. La cantidad de celulas apoptoticas se conto 48 horas despues de la adicion de IL-1 con un microscopio de fluorescencia invertido. Las celulas apoptoticas fueron discriminadas de las celulas normales por el caracteristico quot;burbujeoquot; del citoplasma y se contaron despues de dos dias.
GFP es el vector de expresion de Proteina Fluorescente Verde que se usa como control. JBD19 es el vector que expresa un GFP quimerico ligado a la secuencia de 19 aa derivada del JBD de IB1; JBD19Mut es el mismo vector que GFP-JBD19, pero con un JBD mutado de cuatro residuos conservados que se muestran en la Fig.; y JBD1-280 es el vector GFP ligado al JBD entero (aa 1-280). El GFP-JBD19 que expresa el constructo previno la apoptosis de celulas pancreaticas inducida por IL-1 tan eficientemente como JBD1-280 entero.
Como controles adicionales, las secuencias mutadas en IB1(s) completamente conservadas presentaban una capacidad enormemente disminuida para evitar la apoptosis.
Ejemplo 4: Importaci6n�Celular�de�Peptidos�T�T-ID1(s)
Se evaluo la capacidad de las formas enantiomericas L-y D- de TAT y los peptidos TAT-IB1(s) (quot;peptidos TAT-IBquot;) para entrar en las celulas. L-TAT, D-TAT, L-TAT-IB1(s) y los peptidos D-TAT-IB1(s) [SEC ID NO: 5, 6, 9 y 12, respectivamente] fueron marcados por adicion N-terminal de un residuo de glicina conjugado con fluoresceina. Se agregaron los peptidos marcados (1 IM) a cultivos de celulas TC-3, que se mantuvieron tal como se describio en el Ejemplo 3. En tiempos predeterminados, las celulas se lavaron con PBS y se fijaron durante cinco minutos en metanolacetona enfriada con hielo (1:1) antes de ser examinadas bajo un microscopio de fluorescencia. Como control se uso BSA marcado con fluoresceina (1 IM, 12 mollmol BSA). Los resultados demostraron que todos los peptidos anteriores marcados con fluoresceina habian entrado en las celulas de forma eficiente y muy rapida (en menos de cinco minutos) una vez agregados al medio de cultivo. A la inversa, la seroalbumina bovinamarcada con fluoresceina (1 IM BSA, 12 mol fluoresceinalmol BSA) no penetro en las celulas.
Un estudio temporal indico que la intensidad de la senal fluorescente para los peptidos L-enantiomericos disminuye en un 70% despues de un periodo de 24 horas. A las 48 h habia poca o ninguna senal. Por el contrario, D-TAT y D-TATIB1(s) eran extremadamente estables en el interior de las celulas.
Las senales fluorescentes de estos peptidos retroinversos todos D fueron aun mas fuertes una semana despues, disminuyendo la senal ligeramente solo a las dos semanas tras el tratamiento.
Ejemplo 5: Iniibici6n in vitro �de�c-NUN, Fosforilaci6n�de �TF2 y �El�1
Se investigaron in vitro los efectos de los peptidos sobre la fosforilacion mediada por JNK de sus factores de transcripcion diana. Los JNK1, JNK2 y JNK3 recombinantes y no activados se produjeron mediante un kit de lisado de reticulocitos de conejo TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (Promega) y se usaron ensayos de quinasa en fase solida con c-Jun, ATF2 y Elk1 como sustratos, solos o fusionados con glutation-S-transferasa (GST). Se llevaron a cabo estudios dosis-respuesta donde se mezclaron L-TAT o los peptidos L-TAT-IB1(s) (0-25 IM) con las quinasas JNK1, JNK2 o JNK3 recombinantes en un tampon de reaccion (20 mM de Tris-Acetato, 1 mM de EGTA, 10 mM de fosfato de p-nitrofenilo (pNPP), 5 mM de pirofosfato de sodio, 10 mM de p-glicerofosfato, 1 mM de ditiotreitol) durante 20 minutos. Las reacciones de quinasa se iniciaron luego mediante la adicion de MgCl2 10 mM y 5 pCi 33P-y-dATP y 1 Ig de cualquiera de GST-Jun (aa 1-89), GST-AFT2 (aa 1-96) o GST-ELK1 (aa 307-428). Las proteinas de fusion GST se adquirieron de Stratagene (La Jolla, CA).
Tambien se agregaron a la mezcla 10 Il de granulado de glutation-agarosa. Luego se separaron los productos de reaccion por SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 10% desnaturalizado. Los geles fueron secados y entonces expuestos a peliculas de rayos X (Kodak). Se observo una inhibicion temprana completa de la fosforilacion de c-Jun, ATF2 y Elk1 mediante JNK con dosis de peptidos TAT-IB(s) tan bajas como de 2,5 IM. Sin embargo, una notable excepcion fue la ausencia de la inhibicion de TAT-IB(s) de la fosforilacion JNK3 de Elk1. En general, los peptidos TATIB1(s) mostraron buenos efectos para inhibir la fosforilacion en la familia JNK de sus factores de transcripcion diana. La capacidad de los peptidos D-TAT, D-TAT-IB1(s) y L-TAT-IB1(s) (estudio de dosificacion 0-250 IM) para inhibir la fosforilacion de GST-Jun (aa 1-73) mediante JNK1, JNK2, y JNK3 recombinante fueron analizados tal como se describio anteriormente. En general, el peptido D-TAT-IB1(s) disminuyo la fosforilacion intermediada por JNK de c-Jun, pero a niveles aproximadamente 10-20 veces menos eficientes que L-TAT-IB1(s).
Ejemplo 6: Iniibici6n�de la Fosforilaci6n �c-NUN�mediante �NN��activados
Los efectos de los peptidos L-TAT o L-TAT-IB1(s) tal como se definen aqui sobre JNK activados por estimulos de estres fueron evaluados usando GST-Jun para disminuir el JNK en celulas HeLa irradiadas con luz UV o en celulas PTC tratadas con IL-1. Las celulas PTC fueron cultivadas tal como se describio anteriormente. Las celulas HeLa fueron cultivadas en un medio de DMEM suplementado con 10% de Suero de Ternera Fetal, 100 Iglml de estreptomicina, 100 unidades lml de penicilina y 2 mM de glutamina. Una hora antes de usar la preparacion de extracto celualr, las celulas PTC fueron activadas con IL-1 tal como se describio anteriormente, mientras que las celulas HeLa fueron activadas con luz UV (20 Jlm2). Se prepararon extractos celulares a partir del control, de las celulas HeLa irradiadas con luz UV y de las celulas TC-3 tratadas con IL-1 medainte raspado de los cultivos en un tampon de lisis (20 mM de Tris-acetato, 1 mM de EGTA, 1% de Triton X-100, 10 mM de p-fosfato de nitrofenilo, 5 mM de pirofosfato de sodio, 10 mMP de glicerofosfato, 1 mM de ditiotreitol). Los residuos se retiraron por centrifugacion durante 5 minutos a 15.000 rpm en un rotor Beckman SS-34. Se incubaron extractos de 100 Ig durante una hora a temperatura ambiente con 1 Ig de GST-jun (aminoacidos 1-89) y 10 Il de granulado de glutation-agarosa (Sigma). Despues de cuatro lavados con el tampon de raspado, el granulado se resuspendio en el mismo tampon suplementado con peptidos L-TAT o peptidos L-TAT-IB1(s) (25 IM) durante 20 minutos. Luego se iniciaron reacciones quinasa por adicion de 10 mM de MgCl2 y 5 pCi 33P-gammadATP y se incubaron durante 30 minutos a 30°C.
Entonces se separaron los productos de reaccion mediante SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida desnaturalizado al 10%. Los geles se secaron y se expusieron a peliculas de rayos X (Kodak). Los peptidos TAT-IB(s) evitaron eficientemente la fosforilacion de c-Jun mediante la activacion de JNK activado en estos experimentos.
Ejemplo 7: Iniibici6n In vivo de la fosforilaci6n c-NUN mediante los peptidos T�T-ID(s) tal como se define aqui
Para determinar si los peptidos permeables a las celulas aqui definidos podrian bloquear la senalizacion de JNK in vivo, se uso un sistema GAL4 heterologo. Celulas HeLa cultivadas tal como se ha descrito anteriormente fueron cotransfectadas con el vector reporter 5xGAL-LUC junto con el constructo de expresion GAL-Jun (Stratagene) que comprende el dominio de activacion de c-Jun (aminoacidos 1-89) ligados al dominio de union GAL4 ADN. La activacion de JNK se logro mediante co-transfeccion de vectores que expresan las quinasas MKK4 y MKK7 aguas arriba (ver Whitmarsh y col., Science 285: 1573 (1999)). Resumiendo, se transfectaron 3 x 105 celulas con los plasmidos en placas de 3,5-cm usando DOTAP (Boehringer Mannheim) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Para los experimentos que implican GAL-Jun, se transfectaron 20 ng del plasmido con 1 Ig del plasmido reporter pFR-Luc (Stratagene) y 0,5 Ig de cualquiera de los plasmidos de expresion MKK4 o MKK7. Tres horas despues de la transfeccion, se cambiaron los medios celulares y se agregaron los peptidos TAT y TAT-IB1(s) (1 IM). Se midio la actividad de luciferasa 16 horas despues utilizando el quot;Sistema Informante Dualquot; de Promega despues de normalizacion del contenido en proteina. La adicion del peptido TAT-IB1(s) bloqueo la activacion de c-Jun tras la activacion intermediada por MKK4 y MKK7 de JNK. Debido a que las celulas HeLa expresan las isoformas JNK1 y JNK2 pero no la JNK3, se transfectaron celulas con JNK3. Nuevamente el peptido TAT-IB(s) inhibio la activacion de c-Jun mediada por JNK2.
Ejemplo�8: Sintesisde�los�peptidosID(s)�retroinversos,�todos�D�yvariantes�de�los�mismos
Los peptidos de la invencion pueden ser peptidos todo aminoacido-D sintetizados a la inversa para evitar la proteolisis natural (es decir, peptidos retroinversos todo D). Un peptido retroinverso todo D de la invencion proporcionara un peptido con propiedades funcionales similares a las del peptido naivo, correspoendiendo los grupos secundarios de los aminoacidos componentes a la alineacion del peptido nativo pero reteniendo una estructura resistente a la proteasa.
Los peptidos retroinversos de la invencion son analogos sintetizados mediante el uso de aminoacidos-D por union de los aminoacidos en una cadena peptidica de forma que la secuencia de aminoacidos del analogo peptidico retroinverso es exactamente la opuesta a la del peptido seleccionado que sirve como modelo. Con propositos ilustrativos: si la proteina TAT que ocurre en forma nativa (formada por aminoacidos-L) tiene la secuencia GRKKRRQRRR [SEC ID NO: 5], el analogo peptifico retroinverso de este peptido (formado por aminoacidos-D) tendria la secuencia RRRQRRKKRG [SEC ID NO: 6]. Los procedimientos para sintetizar una cadena de aminoacidos-D para formar peptidos retroinversos son conocidos en la tecnica (ver por ejemplo Jameson y col., Nature, 368,744-746 (1994); Brady y col., Nature, 368,692-693 (1994); Guichard y col., J. Med. Chem. 39, 2030-2039 (1996)). Especificamente, los retropeptidos de acuerdo con las SEC ID NO 2, 4, 6, 8, 11-12, 18, 20, 22 y 25-26 se obtuvieron por sintesis F-mock clasica y fueron luego analizados por espectrometria de masas. Finalmente se purificaron por HPLC.
Debido a que un problema inherente a los peptidos nativos es la degradacion por las proteasas naturales e inmunogenicidad, los compuestos heterodivalentes o heteromultivalentes de esta invencion se prepararan de manera que incluyen el quot;isomero retroinversoquot; del peptido deseado. Asi, protegiendo el peptido de la proteolisis natural, deberia incrementarse la eficacia del compuesto heterodivalente o heteromultivamente, tanto prolongando la vida media como disminuyendo la respuesta inmunitaria que apunta a destruir activamente los peptidos.
Ejemplo�9: �ctividad�Diol6gica�alargo�plazo�de�los�Peptidos�ID(s)�retroinversos�todo�D�ysus�variantes
La actividad biologica a largo plazo se calcula para el heteroconjugado peptidico que contiene D-TAT-IB(s) retroinverso (ver las secuencias quimericas anteriores) en comparacion con el analogo de aminoacido-L nativo debido a la proteccion del peptido D-TAT-IB(s) contra la degradacion causada por las proteasas naturales, tal como se muestra en el Ejemplo 5.
Se analizo la inhibicion de IL-1 inducida por la muerte de celulas beta pancreaticas mediante el peptido D-TAT-IB1(s). Se incubaron celulas TC-3 tal como se describio anteriormente durante 30 minutos con una sola adicion de los peptidos indicados (1 IM) y luego se agrego IL-1 (10 nglml).
Se contaron las celulas apoptoticas despues de dos dias de incubacion con IL-1 empelando yoduro de propidio y tincion nuclear Hoechst 33342. Se contaron como minimo 1.000 celulas para cada experimento. Se indica el error standard de la media (SEM), n=5. El peptido D-TAT-IB1 disminuyo la apoptosis inducida por IL-1 hasta un grado similar al de los peptidos L-TAT-IB.
Se analizo tambien la inhibicion a largo plazo de la muerte celular inducida por IL-1 mediante el peptido de D-TAT-IB1. Se incubaron celulas TC-3 como anteriormente durante 30 minutos con una sola adicion de los peptidos indicados (1 IM) y luego se agrego IL-1 (10 nglml), seguido de adicion de citoquina cada dos dias. Se contaron las celulas apoptoticas despues de 15 dias de incubacion con IL-1 empleando yoduro de propidio y tincion nuclear con Hoechst 33342. Cabe observar que una sola adicion del peptido TAT-IB1 no confiere proteccion a largo plazo. Se contaron como minimo 1.000 celulas para cada experimento. Como resultado, D-TAT-IB1(s), pero no L-TAT-IB1(s), fueron capaces de conferir proteccion a largo plazo (15 dias).
Ejemplo 10: Supresi6n de los Factores de Transcripci6n de NN� mediante los peptidos L-T�T-ID1(s) tal como�se�usa�en la�presente �invenci6n
Se llevaron a cabo ensayos de retardo de gel con una sonda AP-1 doblemente marcada (5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3' (SEC ID NO: 101). Se trataron o no extractos nucleares de celulas HeLa durante una hora con 5 nglmlTNF-a, tal como se ha indicado. Los peptidos TAT y L-TAT-IB1(s) usados de acuerdo con la presente invencion se agregaron 30 minutos antes de TNF-alfa. Se muestra unicamente la parte del gel con el complejo especifico AP-1 ADN (tal como se demuestra con experimentos competitivos con competidores no especificos y especificos no marcados).
Los peptidos L-TAT-IB1(s) usados de acuerdo con la presente invencion disminuyeron la formacion del complejo de union AP-1 ADN en presencia de TNF-alfa.
Ejemplo 11: Iniibici6n de la actividad de NN� end6geno en celulas HepG2 usando una realizaci6n quot;todo en un�pocilloquot;�(ver�Figura�3)
Se sembraron celulas HepG2 a razon de 3.000 celulaslpocillo el dia anterior al experimento. Luego, (a) se agregaron concentraciones crecientes de cualquiera de interleucina-1 [IL-1 beta �)] o del factor de necrosis tumoral [TNFalfa ( )] para activar JNK durante 30 minutos. Se lisaron celulas en 20 mM de Hepes, 0,5% de Tween, pH 7,4 y se procesaron por AlfaScreen JNK; (b) Z' para medir la actividad de JNK inducida por 10 nglml de IL-1 en una placa de 384 pocilloslplaca (n=96); (c) inhibicion de la actividad endogena de JNK inducida por IL-1beta con inhibidores JNK quimicos [estaurosporina (°) y SP600125 ( )]; (d) efecto de los inhibidores peptidicos L-TAT-IB1(s) de acuerdo con la SEC ID NO: 9 [aqui abreviado como L-JNKi (�)) y D-TAT-IB1(s) de acuerdo con la SEC ID NO: 11 (abreviada aqui como D-JNKi (�)) y JBDs ( ) (corresponde a L-JNKI sin la secuencia TAT)] en actividad JNK-dependiente de IL-1. Todos los paneles son representativos de tres experimentos independientes (n=3). Metodos: Ensayo de quinasa Alphascreen
Principio: AlphaScreen es una tecnologia a base de granulado no radioactivo que se usa para estudiar las interacciones biomoleculares en formato de microplaca. El acronimo ALPHA significa Ensayo Homogeneo de Proximidad de Luminiscencia Amplificada. Implica una interaccion biologica que lleva a un granulado quot;dadorquot; y uno quot;aceptorquot; en proximidad y luego se produce una cascada de reacciones quimicas para generar una senal amplificada. Mediante excitacion laser a 680 nm, un fotosensibilizador (ftaloxianina) en el granulado quot;dadorquot; convierte el oxigeno ambiental a un estado de singlete excitado. Durante su vida media de 4 Is, la molecula de oxigeno singlete puede difundirse hasta aproximadamente 200 nm en la solucion y si, hay un granulado aceptor en la proximidad, el oxigeno singlete reacciona con un derivado tioxeno del granulado quot;aceptorquot;, generando una quimioluminiscencia a 370 nm que activa adicionalmente los fluoroforos contenidos en el mismo granulado quot;aceptorquot;. Los fluoroforos excitados emiten luz a 520 -620 nm. En ausencia de un granulado aceptor, el oxigeno singlete baja hasta un estado base y no se produce ninguna senal.
Los reactivos quinasa (B-GST-cJun, anticuerpo anti-P-cJun y JNK3 activo) fueron diluidos primero en tampon quinasa (20 mM de Tris-HCl pH 7,6, 10 mM de MgCl2, 1 mM DTT, 100 IM de Na3VO4, 0,01% Tween-20) y fueron agregados a los pocillos (15 Il). Luego las reacciones se incubaron en presencia de 10 IM de ATP durante 1h a 23°C. La deteccion se llevo a cabo mediante adicion de 10 Il de una mezcla de granulos (aceptor Proteina A 20 Iglml y dador estreptavidina 20 Iglml), diluida en tampon de deteccion (20 mM de Tris-HCl pH 7,4, 20 mM de NaCl, 80 mM de EDTA, 0,3% BSA), seguido de una hora mas de incubacion a 23°C en oscuridad. Para medir la actividad endogena de JNK, se llevaron a cabo ensayos con quinasa tal como se describieron anteriormente, excepto que se reemplazaron los JNK 3 activos por lisados de celulas y los componentes de quinasa de reaccion se agregaron despues de la lisis celular. Se usaron anticuerpos B-GST-cjun y P-cJun a estas mismas concentraciones, mientras que para el ATP se uso 50 IM en lugar de 10 IM. La senal AlphaScreen fue analizada directamente en el aparato Fusion o En Vision.
Ejemplo 12: Determinaci6n de la actividad de los peptidos ID(s) retroinversos todo D y sus variantes en el tratamiento �de infecciones�virales por�el�virus�de la varicela�ooster�(ZoZ)
La determinacion de la actividad de los peptidos IB(s) y todos los peptidos IB(s) retroinversos todos D que se usan con la presente invencion fueron ensayados con el peptido inhibidor XG102 de JNK (SEC ID NO: 11) como compuesto de ensayo en celulas huesped cultivadas (fibroblastos de prepucio humano (HFFs)). Los virus son parasitos intracelulares estrictos que requieren un ambiente celular funcional para completar su ciclo de vida; las celulas que mueren no apoyan la replicacion de virus. Adicionalmente, los inhibidores de las funciones celulares pueden ser toxicos para las celulas, y podrian bloquear no especificamente el crecimiento viral. Por tanto, las celulas huesped enfermas o moribundas podrian exhibir valores virales no especificamente reducidos. Debido a que esto podria falsificar los resultados, primero se llevo a cabo un ensayo de citotoxicidad para determinar la tolerancia de las celulas cultivadas a un compuesto de ensayo. Entonces se llevo a cabo un ensayo de reduccion en placas y se ensayo la actividad del peptido XG-102 inhibidor de JNK (SEC ID NO: 11) con respecto al Virus Zoster Viral (VZV) en celulas infectadas.
A) Determinacion de la citotoxidad de los peptidos IB(s) retroinversos todos D:
Para determinar la toxicidad, se sembraron celulas cultivadas (fibroblastos de prepucio humano (HFFs)) en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Se agrego un medio que contenia DMSO (mismo nivel que 5 !M XG-102 (SEC ID NO: 11)),
o XG-102 (SEC ID NO: 11), a varias concentraciones (1, 2, y 5 !M) durante 24 h. Entonces se llevo a cabo un ensayo Rojo Neutro. Los ensayos colorimetricos Rojo Neutro para los ensayos de citotoxidad (en grupos de 6 replicas) se usaron para establecer la dosis maxima para los ensayos de eficiencia subsiguientes (que se llevan a cabo en Taylor y col., 2004, J. Virology, 78:2853-2862). Las celulas vivas absorben el rojo neutro y, por consiguiente, el nivel de absorbancia es una medida cuantitativa de la viabilidad y del numero de celulas. La absorcion de Rojo Neutro es directamente proporcional a la cantidad de celulas y refleja tambien una endocitosis normal. Por tanto, se agrego una pizca de Rojo Neutro al medio a las 0 o 24 horas. Despues de fijacion y extraccion, se agrego el tinte y la cantidad de tinte de cada muestra se midio en un vector de placas ELISA a 540 nm (ver Fig. 4). No se observo toxicidad con ninguna cantidad de XG-102 (SEC ID NO: 11) y el crecimiento de celulas no se restringio en comparacion con el diluyente DMSO solo (control). Por tanto, la concentracion standard de 1 !M no tuvo efectos evidentes sobre las celulas HFF y serian bien toleradas dosis mas altas.
B) Ensayo de reduccion de placas para evaluar los efectos antivirales de XG-102 (SEC ID NO: 11) contra el virus de la varicela-zoster (VZV)
Para determinar si XG-102 (SEC ID NO: 11) tenia un efecto antiviral dependiente de la dosis, se ensayo un rango de
concentraciones cercanas a la dosis standard de 1 !M. En este ensayo de reduccion de placas, se inocularon
fibroblastos de prepucio humano confluentes (HFFs) en placas de 24 pocillos con HFFs infectados con VZV en una
relacion de 1:100 (multiplicidad de infeccion MOI = 0,01) y se absorbieron en las celulas durante 2 horas. El exceso de
5 virus se elimino y se agrego medio que contenia 0 (DMSO unicamente), 0,5, 1, o 2 !M XG-102 (SEC ID NO: 11). Se
recogio una muestra en ese momento para medir el nivel inicial de infeccion; donde cada pocillo contenia -150 pfu.
Despues de 24 horas, se tripsinizaron los pocillos por duplicado y luego se valoraron las suspensiones de celulas en
monocapas de celulas MeWo por triplicado para determinar la cantidad de celulas infectadas con VZV en cada muestra.
Durante el crecimiento no restringido, VZV usualmente aumento 10 veces durante un dia debido a que se propago por 10 diseminacion celula-celula. Esto es lo que se observo para los cultivos tratados con DMSO solamente, que
proporcionaron 1200 ± 430 pfu (Fig. 5). Los resultados de la determinacion fueron los siguientes:
XG-102 (SEC ID NO: 11)
Diseminacion de VZV (pfu) ± SD
0 !M (DMSO)
1233 ± 432
0,5 !M
260 ± 53
1,0 !M
212 ± 48
2,0!M
312 ± 79
Asi, XG-102 (SEC ID NO: 11) tenia un fuerte efecto antiviral en todas las concentraciones ensayadas con VZV en rendimientos cercanos a 200-300 pfu. Usando el grafico de estos resultados para interpolar la EC50, se calculo que
15 aproximadamente 0,3 !M XG-102 (SEC ID NO: 11) hacian que disminuyera el VZV en un 50%.
En base a los datos de citotoxicidad y eficacia, se calculo un indice preliminar selectivo (ToxlEC50) de 5,0 !Ml0,3 !M que proporciono un valor de -17, donde el verdadero SI se considero aun superior debido a que la concentracion de XG-102 (SEC ID NO: 11) ni siquiera se acerco a aquel de la muerte del 50% de las celulas.
C) Medida de la replicacion de virus varicela zoster (VZV) en fibroblastos de prepucio humano (HFFs) con XG-102 20 (SEC ID NO: 11)
Para determinar la dosis eficaz minima de XG-102 que evita la replicacion del virus de la varicela-zoster (VZV) en fibroblastos de prepucio humano (HFFs) con XG-102 (SEC ID NO: 11), se inocularon monocapas confluentes de HFFs con la cepa VZV-BAC-Luc durante 2h y luego se trataron durante 24 horas con XG-102 (SEC ID NO: 11) a concentraciones de 0,25, 0,5, o 1,0 !M o con el control negativo (XG-100, 1,0 !M). Se midio la produccion viral
25 mediante un ensayo de luciferasa. Las muestras estaban por triplicado y se muestra la luminiscencia promedio; las barras de error representan la desviacion standard del promedio.
Como resultado, la replicacion de VZV fue normal en presencia del control negativo (el peptido Tat solo). XG-102 (SEC ID NO: 11) evito la replicacion de VZV en la concentracion mas baja ensayada de 0,25 !M. La dosis efectiva minima no pudo ser determinada en este experimento. Aunque no se sabe todavia por que VZV depende de la actividad de JNK 30 durante la infeccion, parece ser un requisito critico para esta enzima. Una baja concentracion, de 0,25 !M, de XG-102 (SEC ID NO: 11) es por tanto suficiente para bloquear completamente la diseminacion de VZV en el cultivo. Una posible explicacion para este efecto es que esta cantidad de XG-102 (SEC ID NO: 11) se une a todas las moleculas de JNK en las celulas infectadas. Alternativamente, 0,25 !M XG-102 (SEC ID NO: 11) puede reducir la actividad de JNK por debajo de un nivel de umbral que es optimo para la replicacion de VZV. Los resultados de este experimento se resumen en la
35 Fig. 6.
Ejemplo 13: Determinaci6n de la actividad de los peptidos ID(s) RetroInversos todo D y sus variantes en el tratamiento �de la Enfermedad �Pulmonar�Obstructiva�Cr6nica�(EPOC)
Para determinar la actividad de los ejemplos de los XG-102 peptidicos IB(s) todo D (SEC ID NO: 11) en el tratamiento de la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Cronica (EPOC) se uso XG-102 (SEC ID NO: 11) en un modelo animal de
40 fibrosis e inflamacion pulmonar aguda inducida por bleomicina. El protocolo de la fibrosis e inflamacion inducida por bleomicina ya ha sido descrito en la literatura. El proposito del experimento fue investigar el efecto de XG-102 (SEC ID NO: 11) via subcutanea (s.c.) sobre el reclutamiento de neutrofilos en el lavado broncoalveolar (BAL) y fibrosis e inflamacion inducida por bleomicina:
-
en el dia 1 despues de una sola administracion de bleomicina (10 mglkg),
45 -y en el dia 10 con el desarrollo de fibrosis
1) Metodo y realizaci6n experimental
El compuesto de ensayo XG-102 (SEC ID NO: 11) a dos dosis y un control de vehiculo se administraron s.c. con una unica administracion intranasal de bleomicina y se analizaron los ratones despues de 1 y 10 dias. Los animales que se usaron en el modelo eran ratones 10 C57BLl6 (de 8 semanas de vida) por grupo. Los grupos experimentales incluyeron vehiculo, 0,001 mglkg XG-102 (SEC ID NO: 11) y 0,1 mglkg XG-102 (SEC ID NO: 11), y el tratamiento consistia en una administracion subcutanea repetida de XG-102 (SEC ID NO: 11) antes de la administracion de bleomicina y luego cada 3 dias. Se monitoreo la inflamacion pulmonar aguda a las 24 horas mediante lavado con BAL, citologia, recuento cerlular y actividad de mieloperoxidasa pulmonar. El efecto del compuesto se comparo con los vehiculos control. La fibrosis pulmonar se verifico histologicamente usando una tincion de hematoxilina y eosina a los 10 dias despues de la dosis unica de bleomicina.
1.1) Administraci6n de bleomicina
Se administro sulfato de bleomicina en solucion salina (10 mglkg de peso corporal) de Bellon Laboratories (Montrouge, Francia) a traves de las vias respiratorias por instilacion nasal a un volumen de 40 Il bajo ligera anestesia de cetaminaxilasina. Los grupos de administracion de bleomicina tanto para la inflamacion inducida por bleomicina como para la fibrosis incluian: vehiculo, 0,001 mglkg XG-102 (SEC ID NO: 11) y 0,1 mglkg XG-102 (SEC ID NO: 11). La via para la inflamacion inducida por bleomicina era la via subcutanea (s.c.) y la administracion se efectuo en una dosis unica. La via para fibrosis inducida por bleomicina era subcutanea (s.c.) y la administracion se efectuo 3 veces en 10 dias.
1.2) Lavado broncoalveolar fluido (BALF)
Despues de una incision en la traquea, se inserto una canula plastica y los espacios aereos se lavaron usando 0,3 ml de solucion de PBS calentada a 37°C. Las muestras recogidas se dispensaron en dos fracciones: la primera (1 ml que correspondia a los dos primeros lavados) se uso para medir el mediador y la segunda para determinar las celulas (4ml). La primera fraccion se centrifugo (600 g durante 10 min) y el sobrenadante se fracciono y se mantuvo a -80°C hasta la determinacion del mediador. El granulado de celulas se resuspendio luego en 0,4 ml de NaCl esteril al 0,9%, y se reunio con la segunda fraccion y se uso para el recuento de celulas.
1.3) Homogeneizaci6n Pulmonar
Despues de BAL, se extrajo el pulmon entero y se coloco en el interior de un microtubo (Lysing matrix D, Q Bio Gene, Illkrich, Francia) con 1 ml de PBS, se preparo un extracto total de tejido de pulmonar usando un sistema Fastprep® (FP120, Q Bio Gene, Illkrich, Francia), luego se centrifugo el extracto y el sobrenadante se almaceno a -80°C antes de la medicion del mediador y del ensayo de colageno en Ensayo Sircol Collagen (Francia Biochem Division, Francia).
1..) Recuento y determinaci6n de celulas
El recuento total de celulas se determino en fluido de BAL usando un hemocitometro Malassez. Se efectuaron recuentos diferenciales de celulas en preparaciones de citospina (Cytospin 3, Thermo Shandon) despues de tincion con MGG Diff-quick (Dade Behring AG). Se efectuaron recuentos diferenciales de celulas en 200 celulas usando criterios morfologicos convencionales.
1.5) Medici6n de TNF
El nivel de TNF en BALF se determino usando equipos de ensayo ELISA (sistema Mouse DuoSet, R&D system, Minneapolis, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se dan en pglml.
1.6) Medici6n de MPO
Los niveles de MPO se midieron por administracion de XG-102. El MPO no fue inducido significativamente despues de la bleomicina en este experimento. Ademas, el XG-102 no tuvo ningun efecto sobre los niveles de MPO en el pulmon.
1..) Histologfa
Despues de BAL y perfusion de pulmon, el lobulo grande se fijo en formaldehido a pH tamponado al 4% para analisis microscopicos convencionales. Se tineron secciones de 3-Im con hematoxilina y eosina (H&E).
2) Resultados
A) Primer Estudio: La Bleomicina (BLM) indujo inflamaci6n aguda en el pulm6n
Grupos: Vehiculo, XG-102 (SEC ID NO: 11) 0,001 mglkg y XG-102 (SEC ID NO: 11) 0,1 mglkg
Via: via s.c., dosis unica
a) Reclutamiento celular en el espacio broncoalveolar lavado
A 0,1 mglkg, XG-102 (SEC ID NO: 11) reduce significativamente el reclutamiento de neutrofilos y la cantidad total de celulas reclutadas durante la etapa inflamatoria. A 0,001 mglkg, XG-102 (SEC ID NO: 11) no tiene ningun efecto sobre el reclutamiento de neutrofilos u otros tipos de celulas en el espacio broncoalveolar (un experimento representativo con n = 5 ratones por grupo; *p lt; 0,05; **p lt; 0,001).
b) Reclutamiento de celulas en pulm6n usando MPO en homogeneizado de pulm6n
La mieloperoxidasa (MPO) cumple una funcion importante en los sistemas de defensa del huesped. Esta proteina de 140 kDa, compuesta por dos cadenas pesadas de 53 kDa y dos cadenas ligeras de 15 kDa, fue descubierta en 1960. La liberacion de MPO a partir de granulos de neutrofilos y monocitos en respuesta a la activacion de leucocitos permite la conversion de peroxido de hidrogeno e iones cloruro a acido hipocloroso (HOCl), que es un fuerte agente oxidante. Aunque la MPO cumple una importante funcion en el sistema de defensa, varios estudios demuestran que la MPO cumple tambien una funcion en varios trastornos inflamatorios, donde se ha informado de un nivel elevado de MPO, por ejemplo en enfermedades de la arteria coronaria. Ademas, los niveles de MPO en los tejidos revelan el estado de activacion de los neutrofilos y proveen una indicacion sobre la infiltracion de neutrofilos en el tejido.
En el presente experimento, la MPO no fue inducida singificativamente despues de la administracion de bleomicina. XG-102 (SEC ID NO: 11) no tuvo por tanto ningun efecto sobre los niveles de MPO en el pulmon (ver Fig. 7).
c) Medici6n de TNF
Al medir los niveles de TNF se observo una tendencia a la reduccion del nivel de TNF en BALF despues de la administracion de XG-102 (SEC ID NO: 11), aunque los niveles de TNF fueron muy bajos despues de administracion de BLM (ver Fig. 8).
d) Conclusi6n
Pudo observarse que a 0,1 mglkg, XG-102 (SEC ID NO: 11) disminuye el reclutamiento de neutrofilos y de celulas totales en el espacio broncoalveolar y se induce una tendencia a disminuir el nivel de TNF. Ademas, el estudio de las platinas histologicas mostro una disminucion de la acumulacion de celulas inflamatorias en el espacio peri-bronquial. Por tanto puede llegarse a la conclusion de que el XG-102 (SEC ID NO: 11) reduce la inflamacion inducida por Bleomicina.
De acuerdo con los resultados el experimento se llevo a cabo adicionalmente en un modelo de fibrosis.
B) Segundo estudio: Bleomicina (BLM) inducida por fibrosis pulmonar
Grupos: Vehiculo, XG-102 (SEC ID NO: 11) 0,001 mglkg y XG-102 (SEC ID NO: 11) 0,1 mglkg
Via: via s.c. 3 veces en 10 dias.
a) Reclutamiento de celulas en el espacio broncoalveolar lavado
A 0,001 mglkg, XG-102 (SEC ID NO: 11) se redujeron significativamente el reclutamiento de linfocitos y la cantidad de celulas totales reclutadas durante la etapa inflamatoria caracterizada en ese punto por el reclutamiento de linfocitos. A 0,1 mglkg, XG-102 (SEC ID NO: 11) no tuvo ningun efecto (n= 5 ratones por grupo; *p lt; 0,05; **p lt; 0,001) (ver Fig. 9).
b) Histologfa
Secciones de 3 Im de pulmones se tineron con hematoxilina y eosina. La acumulacion de celulas inflamatorias, las areas fibroticas, la perdida de arquitectura pulmonar se observaron 10 dias despues de la administracion de BLM. Se observo una disminucion de estos parametros despues de la administracion de XG-102 en dosis bajas (0,001 mglkg) pero no con la dosis mas alta (0,1 mglkg) (ver Figura 10).
c) Conclusi6n
Puede llegarse a la conclusion de que XG-102 (SEC ID NO: 11) administrada 3 veces en dosis bajas de 0,001 mglkg disminuye la inflamacion posterior inducida por Bleomicina, en particular el reclutamiento de linfocitos observado en ese momento. Ademas, la sustancia de ensayo administrada tres veces en esta dosis atenua la fibrosis inducida por bleomicina. Pudieron observarse areas fibroticas menos extendidas con una estructura pulmonar mas conservada.
Ejemplo 14: Determinaci6n de la actividad de los peptidos ID(s) retroinversos todo D y sus variantes en el tratamiento �de la�enfermedad�de��lzieimer
Para determinar la actividad del peptido XG-102 IB(s) retroinverso todo-D (SEC ID NO: 11) en la enfermedad de Alzheimer, se evaluo XG-102 (SEC ID NO: 11) en el modelo de raton transgenico hAPP que hiperexpresa APP751 con mutaciones London y Swedish usando el ensayo de Laberinto de Agua Morris sobre conductismo, asi como tambien ensayos inmuno-histologicos que miden la carga de placas y ensayos ELISA para medir los niveles r-amiloides1-40 y ramiloides1-42 en el cerebro de ratones.
a) METODOS
i) Introduccion
El estudio fue disenado para evaluar la eficacia de la sustancia de ensayo (XG-102, SEC ID NO: 11) en marcadores de conductismo, bioquimicos e histologicos, usando ratones hembra hAPP Tg de 5 meses (±2 semanas) de vida. Asi, los ratones fueron tratados cada dos o tres semanas hasta los cuatro meses y al finalizar el periodo de tratamiento se evaluo el comportamiento mediante el Laberinto de Agua Morris. Al sacrificar el cerebro, se recogieron CSF y sangre. Los niveles de Ar40 y Ar42 se determinaron en cuatro fracciones diferentes de homogeneizado de cerebro, asi como tambien en CSF de ratones Tg. La carga de placa se cuantifico en la corteza y en el hipocampo de 8 animales Tg por grupo de tratamiento.
ii) Animales
Ratones Tg hembra de origen C57BLl6xDBA y una edad de 5 meses (± 2 semanas) fueron asignados aleatoriamente a grupos de tratamiento 1 a 3 (n = 12). Los animales fueron sometidos a administracion de vehiculo o XG-102 (SEC ID NO: 11) en dos concentraciones diferentes a partir de los 5 meses de vida y se continuo hasta 4 meses con aplicaciones subcutaneas (s.c.) cada segunda o tercera semana. Todos los animales que se usaron para el presente estudio tenian ojos oscuros y probablemente eran susceptibles de percibir los hitos fuera de la pileta de MWM. Sin embargo, hubo que excluir que las capacidades visuales de un animal fueran malas, lo cual fue controlado en la plataforma de entrenamiento visible, en lo que se denomina pre-ensayo, antes de iniciar el tratamiento para todos los animales, incluyendo los de reserva comprendidos en el estudio. En caso de detectar un defecto de vision en un animal especifico, el raton habria sido excluido del estudio.
iii) Identificacion y Alojamiento del Animal
Los ratones fueron identificados individualmente por marcas en las orejas. Fueron alojados en jaulas individuales ventiladas (IVCs) en lechos para roedores standardizados, provistos por Rettenmaier®. Cada jaula contenia un maximo de cinco ratones. Los ratones se mantuvieron siguiendo los procedimientos de JSW Standard Operating Procedures (SOP GEN011) que estan escritos en base a modelos Internacionales. Cada jaula fue identificada con una tarjeta de un color que indicaba el numero del estudio, el sexo, los numeros de registro individuales (IRN) de los animales, la fecha de nacimiento, asi como tambien la fecha de clasificacion y la adjudicacion al grupo de tratamiento. La temperatura durante el estudio se mantuvo a aproximadamente 24°C y la humedad relativa se mantuvo a aproximadamente 40-70%. Los animales fueron alojados bajo un ciclo de luz constante (12 horas de luzloscuridad). Se dispuso agua corriente normal ad libitum para los animales.
iv) Tratamiento
Se trataron cuarenta ratones transgenicos hAPP hembra con 0,1 mglkg de peso cada dos semanas o 10 mglkg de peso cada tres semanas de la sustancia de ensayo XG-102 (SEC ID NO: 11) a dos dosis diferentes (n=12lgrupos) o se trataron con el vehiculo (n=12) s.c. una vez cada tres semanas durante cuatro meses.
v) Laberinto de Agua Morris (MWM)
El trabajo en el Laberinto de Agua Morris (MWM) se llevo a cabo en una pileta circular negra de un diametro de 100 cm. Se lleno con agua corriente a una temperatura de 22±1°C y la pileta se dividio virtualmente en cuatro sectores. Se coloco una plataforma transparente (de 8 cm de diametro) aproximadamente a 0,5 cm por debajo de la superficie del agua. Durante toda la sesion de ensayo, excepto en el pre-ensayo, la plataforma estaba situada en el cuadrante sudoeste de la pileta. Un dia antes de los cuatro dias que dura la sesion de entrenamiento, los animales fueron sometidos al denominado quot;pre-ensayoquot; (pruebas de una duracion de 60 segundos), para confirmar que las capacidades visuales de cada animal eran normales. Unicamente los animales que cumplieron con este trabajo fueron incluidos en el ensayo MWM. En el trabajo MWM cada raton tenia que llevar a cabo tres pruebas durante cuatro dias consecutivos. Cada prueba unica duraba un maximo de un minuto. Durante este tiempo, el raton tenia la oportunidad de encontrar un objetivo escondido, diafano. Si el animal no podia encontrar un quot;caminoquot; para salir del agua, el investigador guiaba o colocaba al raton en la plataforma. Despues de cada prueba se dejaba descansar a los ratones en la plataforma durante 10-15 segundos. Durante este tiempo, los ratones tenian la posibilidad de orientarse acerca de los alrededores. Las investigaciones se llevaron a cabo bajo condiciones de luz tenue para evitar influencias negativas en el sistema de seguimiento (Kaminski; PCS, Biomedical Research Systems). En las paredes que rodeaban la pileta se fijaron posters con simbolos geometricos negros (por ejemplo un circulo y un cuadrado) para que los ratones pudieran usar los simbolos como senales para su orientacion. Un grupo de natacion por grupo consistia en 5 o 6 ratones, de manera que se tomaron medidas para asegurar un tiempo de interprueba de aproximadamente cinco a diez minutos. Para cuantificar la latencia de escape (el tiempo [segundos] que necesitaba el raton para encontrar la plataforma escondida y por tanto para escapar del agua), el trayecto (la longitud de la trayectoria en [metros] hasta alcanzar el objetivo) y el cumplimiento en el cuadrante senalado, se uso un sistema de rastreo computarizado. La computadora se conecto con una camara colocada por arriba del centro de la pileta. La camara detecto la senal del diodo emisor de luz (LED), el cual estaba fijado con una pequena horquilla en la cola del raton. Una hora despues de la ultima prueba en el dia 4 el raton tenia que cumplir con el denominado examen probatorio. En ese tiempo, la plataforma fue retirada de la pileta y durante el examen probatorio de 1 minuto el investigador conto la cantidad de cruces sobre la posicion objetivo anterior. Adicionalmente, se calculo el cumplimiento en este cuadrante asi como tambien en los tres otros cuadrantes. Con esta prueba, los ratones no podian obtener un indicio de ninguna naturaleza de la plataforma.
vi) Muestreo de Tejidos
Al finalizar el periodo de tratamiento y despues de todos los ensayos de conductismo, todos los ratones restantes (n = 28) fueron sacrificados. Para ello, todos los ratones fueron sedados con anestesia convencional por inhalacion (Isofluran, Baxter) tal como se describio en SOP MET030. Se obtuvo fluido cerebroespinal (CSF) mediante diseccion cerrada y exposicion del foramen magnum. Al quedar expuesto se inserto una pipeta Pasteur a una profundidad de aproximadamente 0,3 -1 mm dentro del foramen magnum. Se recogio CSF por succionamiento y accion capilar hasta que ceso completamente el flujo. Dos alicuotas de cada muestra se congelaron inmediatamente y se mantuvieron a 80°C hasta estar listas para analisis adicional con tecnica ELISA. Despues de cada muestreo de CSF, cada raton fue colocado en reclinacion dorsal, se les abrio el torax y se inserto una aguja de calibre 26 unida a una jeringa de 1 cc en la cavidad ventricular cardiaca derecha. Se aplico una ligera succion a la aguja y se recogio sangre dentro del EDTA, que se uso para obtener plasma. Para obtener el plasma, se centrifugaron muestras de sangre de cada uno de los ratones a
1.750 rpm (700 g) durante 10 minutos en una centrifugadora (GS -6R Beckman) usando un rotor con cubos giratorios (GH -3.8 Beckman). Se congelo el plasma y se almaceno a -20°C hasta analisis adicional. Despues del muestreo de sangre, los ratones transgenicos fueron perfusionados via intracardiaca con 0,9% de cloruro de sodio. Se retiraron rapidamente los cerebros y se corto el cerebelo. Los hemisferios derechos de todos los ratones se fijaron por inmersion en paraformaldehidolPBS al 4% recien producido (pH 7,4) durante una hora a temperatura ambiente. A continuacion los cerebros fueron transferidos a una solucion de PBS en sacarosa al 15% durante 24 para asegurar la crioproteccion. Al dia siguiente se congelaron los cerebros en isopentano y se almacenaron a -80°C, hasta que se usaron para investigaciones histologicas (SOP MET0.2). Se pesaron los hemisferios izquierdos y se congelaron en nitrogeno liquido y se almacenaron a -80°C para analisis bioquimico.
vii) Determinacion de Ar1-40 y Ar1-42
En cuatro fracciones diferentes de homogeneizado de cerebro de cada raton Tg asi como tambien en muestras de CSF, se evaluaron los niveles de Ar1-40 y Ar1-42 con tecnicas ELISA. Los equipos de ensayo ELISA Ar1-40 y Ar1-42 altamente sensibles se adquirieron en The Genetics CompanyT, Suiza (SOP MET058). Se preparo CSF tal como se describio anteriormente. Para los homogeneizados de cerebro, los hemisferios congelados fueron homogeneizados en solucion salina de pH regulado con tampon TRIS (TBS) (5 ml) que contenia un coctel inhibidor de proteasa. 1,25 ml de este homogeneizado inicial de TBS de cerebro se almacenaron a -80°C y se estudiaron otros 1,25 ml. El homogeneizado de cerebro restante (2,5 ml) fue centrifugado y el sobrenadante resultante (= fraccion TBS) fue dividido en alicuotas y se mantuvo a -20°C hasta la determinacion ELISA. El granulado se suspendio en Triton X-100 (2,5 ml), se centrifugo y el sobrenadante (= Triton fraccion X-100) se dividio en alicuotas y se mantuvo a -20°C. Estas etapas se repitieron con SDS (2,5 ml). El granulado de la fraccion SDS se suspendio en acido formico al 70% (0,5ml) antes de posterior centrifugacion.
El sobrenadante obtenido se neutralizo con TRIS 1M (9,5 ml), se dividio en alicuotas y se mantuvo a -20°C (= fraccion FA). Las muestras de las cuatro fracciones de homogeneizado de cerebro (TBS, Triton X-100, SDS, y FA) se usaron para la determinacion de Ar1-40 y Ar1-42 con tecnicas ELISA. Los equipos de ensayo ELISA se adquirieron en The Genetics CompanyT, Suiza (SOP MET062). Pudo asumirse que TBS y Triton X-100 solubilizan las estructuras monomericas a oligomericas. Los polimeros tales como protofibrilas y las fibrilas insolubles en agua pudieron disolverse en SDS y FA. En este sentido la investigacion de las cuatro fracciones proveen tambien estados de polimerizacion A.
viii) Evaluacion de la Morfologia de Cerebro
Se manipulo tejido cerebral de todos los animales Tg investigados exactamente de la misma manera para evitar derivaciones debidas a variaciones de este procedimiento. De las mitades de cerebro de 24 ratones Tg (8 de cada grupo) 20 crio-secciones por capa (en total 5 capas), cada una de un espesor de 10 !m (Leica CM 3050S) fueron cortadas sagitalmente y 5 (una de cada capa) fueron procesadas y evaluadas para cuantificar la carga de las placas. Las cinco capas sagitales se correspondian con las Fig. 104 a 105, 107 a 108, 111 a 112, 115 a 116 y 118 a 119 de acuerdo con la morfologia atlas quot;The Mouse Brainquot; de Paxinos y Franklin (2a edicion). La primera capa fue especificada por el requerimiento de incluir el hipocampo completo con sus regiones CA1, CA2, CA3, GDlb y GDmb. La inmunorreactividad se evaluo cuantitativamente en el hipocampo y en la corteza usando el anticuerpo especifico Armonoclonal humano 6E10 (Signet) asi como tambien tincion con Tioflavina S. Los hemisferios cerebrales remanentes o los tejidos no usados se guardaron y almacenaron en JSW CNS hasta el final del proyecto.
b) EVALUACION
i) Conductismo En las pruebas del Laberinto de Agua Morris la longitud del trayecto de natacion, las latencias de escape, la velocidad de natacion y, en el examen probatorio, los cruces sobre la posicion de la plataforma anterior y el tiempo que transcurre en cada cuadrante de la pileta se midieron para cada animal Tg con un software de computadora especial.
ii) Evaluacion Bioquimica
De todos los ratones Tg, se analizaron las muestras de CSF, asi como tambien las preparaciones de cerebro con Ar1-40 y Ar1-42 de ELISA comerciales. Se llevaron a cabo mediciones de modelos adecuados. Se analizaron muestras de preparaciones de cerebro por duplicado. Debido a la pequena cantidad de muestras, las muestras de CSF fueron analizadas en una unica medicion.
iii) Histologia
i1) Medicion de Deposiciones Amiloides y Carga de Placas
Para la inmunohistoquimica de 6E10 se uso el procedimiento de evaluacion siguiente:
aa)
Contrastado de la imagen para visualizar los bordes sin aplicar contraste a la imagen.
bb)
Trazado interactivo de los contornos corticales y la medida del area cortical (= area de region).
cc)
Trazado interactivo del area de interes (AOI), en la cual se detectaron objetos tenidos superiores a un nivel
umbral basado en cierta intensidad (igual para cada imagen) y de tamano superior a 8 !m2.
dd) Medicion del area de cada objeto, la suma de area tenida en el AOI asi como tambien la cantidad de objetos despues de contrastado suave para mejorar la relacion senallruido (lo mismo para cada imagen).
ee) Repeticion de aa)-dd) para el hipocampo.
ff) Calculo del tamano promedio de placa (= quot;area total de placasl cantidad de placasquot;), la cantidad diaria de placas relativa (= quot;cantidad de placasl area de la regionquot; y quot;area total de placasl area de la region * 100quot;).
gg) Datos automaticos exportados a una hoja Excel extendida que incluye los parametros quot;titulo de imagen, area de la region, cantidad de placas, suma del area de placas, cantidad de placas relativa, area de placa relativas y tamano promedio de placasquot;. Se uso un campo para notas de registro de calidad de imagen y criterios de exclusion, respectivamente. Los criterios de exclusion fueron partes no presentes de lso bordes, arrugas, imperfecciones dominantes o inconsistencias de tincion (por ejemplo debido a pandeo, que puede impedir la reaccion completa del reactivo bloqueador)
hh) Cierre de imagen sin salvar (para mantener los datos en bruto).
c) RESULTADOS
i) Observaciones Generales
En total 40 ratones hAPP Tg hembra fueron incluidos en el estudio. De estos ratones, 12 animales murieron debido a razones desconocidas antes de terminar el periodo de tratamiento.
ii) Resultados de Conductismo
El aprendizaje espacial en el MWM se mantuvo sin verse influenciado influenciado por el tratamiento XG-102 (SEC ID NO: 11). Los ratones tratados con 0,1 mglkg mostraron tendencia a empeorar en el rendimiento de aprendizaje en el dia 1 y el dia 4. Un ANOVA de dos vias del rendimiento promedio en el dia 1 y 4 revelo un aprendizaje sumamente significativo para todos los grupos (plt;0,001), pero tambien una influencia significativa del factor de tratamiento (p = 0,045). Sin embargo, los post-ensayos de Bonferroni no tuvieron significancia.
iii) Resultados Bioquimicos
aa) Niveles Ar en las Fracciones de Homogeneizado de Cerebro
El tratamiento con el compuesto de ensayo XG-102 (SEC ID NO: 11) no afecto los niveles Ar1-40 de homogeneizado de cerebro (ver Fig. 11). Las diferencias de grupo en los niveles Ar1-42 aparecieron unicamente en las fracciones Triton X
100. Alli, los animales tratados con la dosis baja del compuesto de ensayo XG-102 (SEC ID NO: 11) (0,1 mglkg) mostraron una reduccion significativa en comparacion con el grupo vehiculo (plt;0,05) asi como tambien en comparacion con el grupo de dosis alta (plt;0,01).
bb) Niveles de Ar en CSF Despues del tratamiento con la sustancia de ensayo XG-102 (SEC ID NO: 2), los niveles de Ar1-40 y Ar1-42 disminuyeron significativamente en CSF en comparacion con el grupo vehiculo. Para ambos, los valores p Ar1-40 y Ar1-42 fueron plt;0,01 para la dosis alta (10 mglkg) y plt;0,05 para la dosis de perdida de XG-102 (SEC ID NO: 2) (ver Fig. 12).
iv) Resultados de Histologia de Cerebro e Inmunohistoquimica
aa) Deposicion de Amiloides y Carga de Placas
La carga de la placa se cuantifico con dos metodos diferentes. Por una parte se efectuo una tincion de un IHC con 6E10 primario dirigido contra AA1-17 del peptido amiloide humano, por otra parte se llevo a cabo una tincion con Thioflavina S marcando estructuras de laminas-beta y nucleos de placas neuriticas maduras. Ante todo, las areas de region medidas, la corteza y el hipocampo fueron altamente constantes en todos los grupos, lo cual indica que pueden excluirse problemas en los procedimiento de corte de IHC y hasta cierto grado tambien una atrofia inducida por tratamiento (cambios de gt;5% serian detectables con este metodo). Las cuantificaciones de 6E10 y TioflavinaS revelaron una reduccion selectiva de estructuras de laminas beta en el centro de las placas despues del tratamiento con XG-102 (SEC ID NO: 11), mientras que el amiloide humano no se vio influenciado por el tratamiento o aumento ligeramente. En detalle, la carga de placa cortical 6E10 IR se incremento frente al vehiculo en los ratones tratados con 10 mglkg de XG102 (SEC ID NO: 11), pero se alcanzo un nivel de significancia para la cantidad de placas del hipocampo. Por el contrario, las Fig. 13 y 14 muestran con 6E10 IHC que el tratamiento con XG-102 (SEC ID NO: 11) condujo a una reduccion dependiente negativamente de la dosis, de la cantidad de placas positivas de TioflavinaS de hipocampo, asi como tambien el tratamiento de porcentaje de area (cantidad de placas plt;0,05 para 10mglkg, plt;0,01 para 0,1 mglkg XG-102 (SEC ID NO: 11)). 0,1mglkg XG-102 (SEC ID NO: 11) redujo tambien el tamano medio de las placas, pero este efecto no alcanzo un nivel de significancia en ANOVA (ensayo T de dos colas, no apareado: p = 0,074). Estos efectos no se vieron para placas corticales, una circunstancia que muy probablemente se debe al posterior desencadenamiento de la patologia de placas en el hipocampo mas que en la corteza. El inicio del tratamiento a los 5 meses de edad acierta exactamente con el momento de la deposicion de placas en el hipocampo, mientras que las placas corticales comienzan a ser visibles al aumento empleado para la cuantificacion a la edad de 3 meses. Cualitativamente, la proporcion de 6E10 a placas tenidas con TioflavinaS aumenta y los nucleos de las placas de laminas beta, tal como se observan en los bordes marcados doblemente, se tornan de tamano mas pequeno. Resumiendo, estos datos apoyan el hecho de que el tratamiento con XG-102 (SEC ID NO: 11) actua contra la formacion de laminas beta en la fase precoz de deposicion de placas y en la formacion de laminas beta en nucleos de placas, respectivamente.
d) SUMARIO DE EFECTOS Y CONCLUSIONES
La navegacion espacial medida en el laberinto de agua de Morris no ve vio influenciada por el tratamiento. El tratamiento con 0,1 mglkg de XG-102 (SEC ID NO 11) dio como resultado un rendimiento de aprendizaje ligeramente mas pobre entre el primer y el ultimo dia de entrenamiento. Excepto una disminucion en la fraccion de Triton X-100 en el grupo 0,1 mglkg XG-102 (SEC ID NO: 11), los niveles de Ar1-40 y Ar1-42 en el cerebro permanecieron estables. Una disminucion de los niveles Ar fue detectable en CSF para ambas dosis y fragmentos. El tratamiento con XG-102 (SEC ID NO: 11) condujo a una tendencia incremental de beta amiloide humano en el grupo de dosis mas alta en las cuantificaciones 6E10, lo cual esta de acuerdo con los datos obtenidos en Ar ELISA. En contraste a la carga de lamina beta de hipocampo detectada con tincion con Tioflavina S que disminunia de forma dosis-dependiente despues del tratamiento con XG-102 (SEC ID NO: 11), a un grado superior a la dosis mas baja de 0,1 mglkg XG-102 (SEC ID NO: 11), la carga de placa cortical permanecio sin cambios. De acuerdo con el inicio dependiente de la edad de la deposicion de placas en el hipocampo al comienzo del tratamiento, esto sugiere una accion precoz sobre la formacion de laminas beta en la fase precoz de deposicion de placas.
Ejemplo 15: Determinaci6n de la actividad de los peptidos ID(s) retroinversos todo D y sus variantes en el tratamiento �de la�diabetes�tipo2
El Ejemplo 15 esta disenado para determinar la actividad de los peptidos IB(s) y retroinversos todo D y sus variantes en el tratamiento de la diabetes de Tipo 2, particularmente para determinar el efecto del tratamiento cronico con XG-102 (SEC ID NO: 11) en un modelo de ratones dbldb de diabetes de tipo 2 mediante la evaluacion de los niveles de glucosa en sangre en ayunas cada tercer dia (28 dias).
a) Materiales y metodos
i) Animales
Se obtuvieron un total de veinte (20) ratones Charles River macho dbldb (de 8 semanas de vida) (0Alemania). Al llegar, los animales se alojaron en grupos (n = 6-7lgrupo) y se les ofrecio comida comun para roedores (Altromin standard #1324 chow; C. Petersen, Ringsted, Dinamarca) y agua ad libitum a menos que se indicara lo contrario.
Los ratones fueron alojados bajo un ciclo de 12:12 LlD (luz a las 4:00 y luces apagadas a las 16:00) y en ambientes de temperatura y humedad controlados.
ii) Grupos y aleatoriedad
En el dia 4, los ratones fueron distribuidos de acuerdo con el nivel de glucosa en sangre (en ayunas, glucosa en sangre medida en un analizador en linea Biosen S (EKF diagnostic, Alemania) para participar en uno de los siguiente grupos de tratamiento con farmaco (n=6):
1) Vehiculo de control, S.C. (solucion fisiologica salina)
2) XG-102 (SEC ID NO: 11); 1 mglkg; s.c.
3) XG-102 (SEC ID NO: 11); 10 mglkg; s.c
Todas las dosis cutadas se calcularon para la base libre. Pureza de la droga: 95,28%, contenido de peptido: 78,0%. Todos los compuestos se administraron subcutaneamente (s.c.) a un volumen de 3 mllkg. Las instrucciones para la formulacion del vehiculo control y XG-102 (SEC ID NO: 11) fueron:
Primero, se disolvio XG-102 (SEC ID NO: 11) en el vehiculo. Las formulaciones (concentraciones de 0,33 y 3,3 mglml, que corresponden a las dosis de 1 y 10 mglkg, respectivamente) se prepararon de acuerdo con el procedimiento que se detalla a continuacion. Las concentraciones se calcularon y expresaron teniendo en cuenta los items de ensayo, la pureza y el contenido de peptidos (el coeficiente multiplicador era 1,346).
•
Preparacion de una solucion de carga: el compuesto XG-102 secado por congelacion (SEC ID NO: 11) se descongelo durante al menos una hora y se preparo de acuerdo con una solucion de carga en el vehiculo a 1 mM (que correspondia a 3,823 mglml). Se prepararon alicuotas para cada dia de tratamiento y se almacenaron aproximadamente a -80°C. Las diluciones de esta solucion de carga a las concentraciones requeridas se llevaron a cabo cada dia del tratamiento.
•
Almacenamiento de la solucion de carga: aproximadamente a -80°C.
•
Almacenamiento de las preparaciones diluidas: a temperatura ambiente durante 24 horas como maximo.
Antes de la solubilizacion, el polvo se almaceno a -20°C. La estabilidad de la solucion de carga es de 3 meses a aproximadamente -80°C; la estabilidad de las formulaciones diluidas para la dosis a animales es de 24 horas a temperatura ambiente. El material diluido no usado podria almacenarse hasta 7 dias con la condicion de mantenerlo a 4-8°C.
c) Procedimiento Experimental
Despues de 8 dias de aclimatacion, los ratones fueron tratados diariamente a las 08:00 AM durante 21 dias con una dosis SC 8 horas antes de apagar la luz a las 04:00 PM de acuerdo con los grupos senalados. En el estudio del dia 21, la dosis de la concentracion mas elevada de XG-102 (SEC ID NO: 2) (10 mglkg) se interrumpio mientras que la dosis diaria del vehiculo de control y XG-102 (SEC ID NO: 2) (1 mglkg) se continuo hasta el dia de estudio 28. Desde el dia 28 hasta terminar en el dia 111 los ratones tratados con vehiculo y XG-102 (SEC ID NO: 2) (10 mglkg) fueron observados en un periodo sin accion (sin dosificacion) mientras que el tratamiento de los ratones tratados con XG-102 (SEC ID NO: 2) (1 mglkg) termino despues de 28 dias de tratamiento.
i) Glucosa en sangre
Se midio la glucosa en sangre en animales con un ayuno de 7 horas, 6 horas post-dosificacion, por recoleccion de 10 Il de muestras de sangre de la vena de la cola en tubos hematocriticos y subsiguiente analisis en un analizador Biosen sline (EKF-diagnostic; Alemania).
ii) Jaulas Metabolicas
Grupos de 1+3: Se colocaron ratones macho en jaulas metabolicas para registrar la ingestion de comida y agua durante las 24 horas, asi como tambien la produccion de orina y heces durante 24 horas. Los ratones fueron estratificados en dos subgrupos de n = 6-7 y se llevo a cabo la caracterizacion metabolica en los dias de estudio 71-72.
iii) Panel de Adipocina
Grupos 1+3: En tres ocasiones (estudio de los dias 57, 66 y 108) se recogio sangre de la vena de la cola usando tubos de hematocrito recubiertos con EDTA (100 Il). Despues de centrifugar la sangre, el plasma se recogio y almaceno a 20°C hasta el momento de la medicion. Se determino el panel siguiente de adipoquinaslcitoquinas usando 7-plex basado en Luminex: leptina, resistina, MCP-1, PAI-1, TNF, insulina e interleucina-6 (IL-6).
iv) Terminacion Grupos 1+3 (dia 111): Los siguientes organos fueron extirpados y pesados: grasa subcutanea inguinal, grasa epididimal, grasa retroperitoneal, cerebro, higado, rinon, bazo y corazon. Se guardaron muestras de los organos indicados en 4% de PFA para posibles futuros examenes histopatologicos. Asimismo se tomaron muestras del pancreas (en bloque) para posibles analisis estereologicos e inmunohistoquimicos y muestras de los ojos para un posible analisis posterior de retinopatia. Grupo 2 (dia 28): No se recogieron ni tejidos ni plasma.
c) Resultados
i) Observaciones Generales
Durante el periodo de dosis aguda los animales mostraron niveles de alerta y actividad y no hubo signos de sedacion en los animales tratados con medicamentos. La ingestion de agua y comida estaba dentro de los rangos normales entre los animales tratados con vehiculo. Sin embargo despues de aproximadamente 2 semanas de dosis, se observo fibrosis nodular en el tejido subcutaneo como reaccion al compuesto XG-102 (SEC ID NO: 2) en dosis altas, y estas progresaron en heridas abiertas en todos los ratones del Grupo C. En el grupo B se observo fibrosis nodular leve. En consecuencia, se usaron sitios alternados para la inyeccion. Despues de finalizar la administracion de dosis a los animales, se curaron y la fibrosis nodular desaparecio gradualmente. No se observaron efectos clinicos en los animales tratados con vehiculo.
ii) Glucosa en la sangre
Los niveles de glucosa en sangre, en ayunas (absoluta y relativa) se muestran en la Fig. 15. La glucosa en sangre en ayunas se midio cada tercer dia hasta el dia 68 y regularmente hasta terminar el dia 111 en los Grupos A y C. Se observo una disminucion clara y significativa (plt;0,001) en el nivel de glucosa en ayunas en la sangre de los ratones diabeticos dbldb tratados con XG-102 (SEC ID NO: 2) (10 mglkg) en comparacion con el vehiculo control. Los niveles de glucosa en sangre en ayunas de los ratones tratados con XG-102 (SEC ID NO: 2) (10 mglkg) alcanzaron una meseta baja de aproximadamente 5 mmolll. Este efecto fue evidente despues de 14 dias de dosificacion y persistio durante el estudio, por tanto durante todo el periodo de descanso desde el dia 21 hasta el dia 111. En contraste, no observamos ningun efecto de dosis bajas de XG-102 (SEC ID NO: 2) (1 mglkg) durante los 28 dias de administracion de dosis.
iii) Peso Corporal
Las determinaciones del peso corporal (absoluta y relativa) se muestran en la Fig. 16. Se observo una prevencion clara y significativa (plt;0,001) del aumento de peso corporal en ratones tratados con XG-102 (SEC ID NO: 2) (10 mglkg) en comparacion con el vehiculo control. Este efecto fue evidente desde dia 28 de dosificacion y permanecio hasta el dia de finalizacion 111. En contraste, no se observo ningun efecto de dosis bajas de XG-102 (SEC ID NO: 2) (1 mglkg) en el peso corporal durante 28 dias de administracion de dosis.
iv) Jaulas Metabolicas
El efecto del vehiculo o XG-102 (SEC ID NO: 2) (10 mglkg) en las 24 horas de ingestion de comida y agua, la produccion de orina y heces medidas en jaulas metabolicas en el estudio del dia 68 se muestran en la Fig. 17 (g) y 18 (normalizada a g de peso corporal). No se observaron efectos significativos de XG-102 (SEC ID NO: 2) (10 mglkg) en ninguno de los parametros medidos, en comparacion con la observacion control del vehiculo, sino una tendencia a una disminucion en la ingesta de alimento y en la produccion de orina.
v) Adipoquinas
El efecto del vehiculo o XG-102 (SEC ID NO: 2) (10 mglkg) medido en el dia 57, 77 y 108 sobre los niveles de insulina en plasma, MCP-1 y IL-6 se muestran en la Fig. 19; los niveles de plasma de tPAI-1, TNF y resistina en la Fig. 20. No se observaron efectos significativos de XG-102 (SEC ID NO: 2) (10 mglkg) en ninguno de los parametros medidos en comparacion con el vehiculo control, excepto en los niveles de resistina en plasma, que fueron significativamente mas elevados en los animales tratados con XG-102 (SEC ID NO: 2) en el dia 77 y 108.
vi) Peso del tejido en la finalizacion
El efecto del vehiculo o XG-102 (SEC ID NO: 2) (10 mglkg) sobre el peso del tejido epididimal, inguinal, subcutaneo y acumulaciones grasas retroperitoneales se muestra en la Fig. 21. Se observo una disminucion significativa de la masa grasa epididimal (plt;0,05) y retroperitoneal (plt;0,01) en los ratones tratados con XG-102 en comparacion con el vehiculo control. El efecto del vehiculo o XG-102 (SEC ID NO: 2) (10 mglkg) en el peso del tejido de cerebro, bazo y corazon se muestra en la Fig. 22. No se observaron efectos significativos de XG-102 (SEC ID NO: 2) (10 mglkg) en estos parametros en comparacion con el vehiculo control. Finalmente, el efecto del vehiculo o XG-102 (SEC ID NO: 2) (10 mglkg) sobre el peso de los tejidos de rinon e higado se muestran en la Fig. 23. Se observo una disminucion significativa de masa renal (plt;0,05) y hepatica (plt;0,01) en los ratones tratados con XG-102 (SEC ID NO: 2) en comparacion con el vehiculo control.
Resumiendo los resultados, la administracion de XG-102 (SEC ID NO: 11), 10 mglkg, parece conducir a una disminucion significativa de los niveles de glucosa en sangre y, por tanto, XG-102 (SEC ID NO: 11) parece ser una nueva herramienta prometedora para el tratamiento de la diabetes y de niveles elevados de glucosa en sangre.
5 LISTADO DE SECUENCIAS
lt;110gt; Xigen S.A.
lt;120gt; Utilizacion de inhibidores peptidicos permeables a celulas de la via de transduccion de senales JNK para el tratamiento de diversas enfermedades
lt;130gt; CX01P022WO 10 lt;160gt; 105
lt;170gt; PatentIn version 3.3
lt;210gt; 1
lt;211gt; 19
lt;212gt; PRT 15 lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido L-IB1(s) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 1
lt;210gt; 2
lt;211gt; 19
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial 25 lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido D-IB1(s) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(19) 30 lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 2 lt;210gt; 3
lt;211gt; 19
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido L-IB (generico) (s) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; misc feature
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Descripcion de la secuencia: formula general : NH2-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-COOH (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (1)..(1)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (1)..(1)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnb
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (2)..(2)
lt;223gt; Xaa es Xna tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo) excepto serina y treonina
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (2)..(2)
lt;223gt; Xaa es Xna tal como se define en la formula general, donde n es 0 o 1
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (8)..(8)
lt;223gt; Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (natural);
lt;220>
5 lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (10)..(16)
lt;223gt; Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (natural);
lt;220gt;
10 lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (19)..(19)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnb
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE 15 lt;222gt; (19)..(19)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (natural);
lt;400gt; 3
20 lt;210gt; 4
lt;211gt; 19
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt; 25 lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido D-IB (generico) (s) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; misc feature
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: formula general: NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-COOH,
30 lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(19)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (1)..(11)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (1)..(1)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnb
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
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lt;223gt; Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (12)..(12)
lt;223gt; Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
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lt;223gt; Xaa es Xna tal como se define en la formula general, donde n es 0 o 1
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (18)..(18)
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lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (18)..(18)
lt;223gt; Xaa es Xna tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (natural) excepto serina y treonina
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION 5 lt;222gt; (19)..(19)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnb
lt;220gt; 10 lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (19)..(19)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (natural);
lt;400gt; 4
lt;210gt; 5
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT 20 lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido L-TAT (ver Tabla 1)
25 lt;400gt; 5
lt;210gt; 6
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT 30 lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido D-TAT (ver Tabla 1) lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(10)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 6
lt;210gt; 7
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido L-generico-TAT (s) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; misc feature
lt;223gt; Formula general: NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-COOH (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (1)..(1)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (1)..(1)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnb
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (11)..(11)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (natural);
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION lt;222gt; (11)..(11)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnb
lt;400gt; 7
lt;210gt; 8
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido D-generico-TAT (s) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; misc feature
lt;223gt; Formula general: NH2-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(10)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (1)..(1)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (natural);
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (1)..(1)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnb
lt;220gt; lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (11)..(11)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (11)..(11)
lt;223gt; Xaa rs Xnb tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para 10 Xnb
lt;400gt; 8
15 lt;210gt; 9
lt;211gt; 31
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
20 lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-TAT-IB1 (s) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 9
25 lt;210gt; 10
lt;211gt; 29
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
30 lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido L-TAT (generico) (s) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; misc feature
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Formula general: NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-COOH
lt;220gt;
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lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
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lt;223gt; Xaa rs Xnb tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnb
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lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (11)..(11)
lt;223gt; Xaa rs Xnb tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (11)..(11)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnb
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (12)..(12)
lt;223gt; Xaa es Xna tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo) excepto serina y treonina
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (12)..(12)
lt;223gt; Xaa es Xna tal como se define en la formula general, donde n es 0 o 1 lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (18)..(18)
5 lt;223gt; Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE 10 lt;222gt; (20)..(26)
lt;223gt; Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
lt;220gt; 15 lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (29)..(29)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
20 lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (29)..(29)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnb
lt;400gt; 10
lt;210gt; 11
lt;211gt; 31 30 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptid D-TAT-IB1 (s) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(31)
lt;223gt; todos los aminoacidos son D-aminoacidos
lt;400gt; 11
lt;210gt; 12 10 lt;211gt; 29
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
15 lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido: D-TAT (generico) (s) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; misc feature
lt;223gt; Formula general: NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH,
lt;220gt;
20 lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(19)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;220gt;
25 lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (1)..(1)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
30 lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (1)..(1)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnb
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (4)..(10)
lt;223gt; Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (12)..(12)
lt;223gt; Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (18)..(18)
lt;223gt; Xaa es Xna tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo) excepto serina y treonina
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (18)..(18)
lt;223gt; Xaa es Xna tal como se define en la formula general, donde n es 0 o 1
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (19)..(19)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (19)..(19)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnb
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (29)..(29)
lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde Xaa representa un residuo aminoacido, 5 preferiblemente seleccionado de cualquier residuo aminoacido (nativo);
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (29)..(29)
10 lt;223gt; Xaa es Xnb tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnb
lt;400gt; 12
lt;210gt; 13 15 lt;211gt; 29
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt; 20 lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido IB1-largo (ver Tabla 1)
lt;400gt; 13
25 lt;210gt; 14
lt;211gt; 27
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido IB2-largo (ver Tabla 1)
lt;400gt; 14
lt;210gt; 15
lt;211gt; 29
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial 10 lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido derivado de c-Jun (ver Tabla 1)
lt;400gt; 15
15 lt;210gt; 16
lt;211gt; 29
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
20 lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido derivado de ATF2 (ver Tabla 1)
lt;400gt; 16
25 lt;210gt; 17
lt;211gt; 23
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido L-IB1 (ver Tabla 1)
lt;400gt; 17
10 lt;210gt; 18
lt;211gt; 23
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
15 lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido D-IB1 (ver Tabla 1)
lt;220gt; 20 lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(23)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 18
lt;210gt; 19
lt;211gt; 19
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido L-IB (generico) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (1)..(1)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de cualquier residuo aminoacido,
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (7)..(7)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de cualquier residuo aminoacido,
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (9)..(15)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de cualquier residuo aminoacido,
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (18)..(18)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de serina o treonina,
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (19)..(19)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de cualquier residuo aminoacido,
lt;400gt; 19
lt;210gt; 20
lt;211gt; 19
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido D-IB (generico) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(19)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (1)..(1)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de cualquier residuo aminoacido
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (2)..(2)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de serina o treonina,
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (5)..(11)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de cualquier residuo aminoacido
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (13)..(13)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de cualquier residuo aminoacido
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (19)..(19)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de cualquier residuo aminoacido
lt;400gt; 20
lt;210gt; 21
lt;211gt; 17 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido L-generico-TAT (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (1)..(17)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de cualquier residuo aminoacido
lt;400gt; 21
lt;210gt; 22 20 lt;211gt; 17
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt; 25 lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido D-generico-TAT (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(17) 30 lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (1)..(17)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de cualquier residuo aminoacido
lt;400gt; 22
lt;210gt; 23 10 lt;211gt; 35
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt; 15 lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido L-TAT-IB1 (ver Tabla 1)
lt;400gt; 23
lt;210gt; 24 20 lt;211gt; 42
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
25 lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido L-TAT IB (generico) (ver Tabla 1)
lt;220gt; lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (1)..(40)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de cualquier residuo aminoacido
5 lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (41)..(41)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de serina o treonina,
10 lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (42)..(42)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de cualquier residuo aminoacido
15 lt;400gt; 24
lt;210gt; 25
lt;211gt; 35
lt;212gt; PRT 20 lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido D-TAT-IB1 (ver Tabla 1)
25 lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(35)
lt;223gt; todos los aminoacidos son D-aminoacidos
lt;400gt; 25
lt;210gt; 26
lt;211gt; 42
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Peptido D-TAT IB (generico) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(42)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (1)..(1)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de cualquier residuo aminoacido
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (2)..(2)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de serina o treonina,
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt; (3)..(42)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de cualquier residuo aminoacido
lt;400gt; 26
lt;210gt; 27
lt;211gt; 30 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: secuencia peptidica quimerica L-TAT-IB1(s1) 10 (ver Tabla 1)
lt;400gt; 27 lt;220gt;
15
lt;210gt; 28 lt;211gt; 30 lt;212gt; PRT lt;213gt; Artificial
20
lt;220gt; lt;223gt; Descripcion de la secuencia: secuencia peptidica quimerica L-TAT-IB1(s2) (ver Tabla 1)
25
lt;220gt; lt;221gt; VARIANTE lt;222gt; (11)..(11) lt;223gt; Xaa esta seleccionado de glicina o prolina
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (11)..(11)
lt;223gt; Xaa es Xnc tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnc
lt;400gt; 28
lt;210gt; 29 10 lt;211gt; 29
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt; 15 lt;223gt; Descripcion de la secuencia: secuencia peptidica quimerica L-TAT-IB1(s3) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; VARIANTE
lt;222gt;
(10)..(10) 20 lt;223gt; Xaa esta seleccionado de glicina o prolina
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt;
(10)..(10) 25 lt;223gt; Xaa es Xnc tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnc
lt;400gt; 29
5
lt;210gt; 30 lt;211gt; 30 lt;212gt; PRT lt;213gt; Artificial lt;220gt; lt;223gt; Descripcion de la secuencia: secuencia peptidica quimerica D-TAT-B1(s1) (ver Tabla 1)
10
lt;220gt; lt;221gt; MUTAGEN lt;222gt; (1)..(30) lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 30
20
lt;210gt; 31 lt;211gt; 30 lt;212gt; PRT lt;213gt; Artificial lt;220gt; lt;223gt; Descripcion de la secuencia: secuencia peptidica quimerica D-TAT-B1(s2) (ver Tabla 1)
25
lt;220gt; lt;221gt; MUTAGEN lt;222gt; (1)..(30) lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
30
lt;220gt; lt;221gt; VARIANTE lt;222gt; (20)..(20) lt;223gt; Xaa esta seleccionado de glicina o prolina
lt;220gt;
lt;221gt; REPETICION
lt;222gt; (20)..(20)
lt;223gt; Xaa es Xnc tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnc
lt;400gt; 31
10 lt;210gt; 32
lt;211gt; 29
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
15 lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: secuencia peptidica quimerica D-TAT-B1(s3) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt;
MUTAGEN 20 lt;222gt; (1)..(29)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;220gt;
lt;221gt;
VARIANTE 25 lt;222gt; (20)..(20)
lt;223gt; Xaa esta seleccionado de glicina o prolina
lt;220gt;
lt;221gt;
REPETICION 30 lt;222gt; (20)..(20)
lt;223gt; Xaa es Xnc tal como se define en la formula general, donde n es 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 o mas para Xnc
lt;400gt; 32
lt;210gt; 33
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s1) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 33
lt;210gt; 34
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s2) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 34
lt;210gt; 35
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s3) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 35
lt;210gt; 36
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s4) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 36
lt;210gt; 37
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s5) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 37
lt;210gt; 38
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s6) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 38 lt;210gt; 39
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s7) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 39
lt;210gt; 40
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s8) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 40
lt;210gt; 41
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s9) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 41 lt;210gt; 42
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s10) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 42
lt;210gt; 43
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s11) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 43
lt;210gt; 44
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s12) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 44
lt;210gt; 45
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s13) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 45
lt;210gt; 46
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s14) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 46
lt;210gt; 47
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s15) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 47
lt;210gt; 48
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s16) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 48
lt;210gt; 49
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s17) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 49
lt;210gt; 50
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s18) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 50
lt;210gt; 51
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s19) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 51
lt;210gt; 52
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s20) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 52
lt;210gt; 53
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s21) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 53
lt;210gt; 54
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s22) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 54
lt;210gt; 55
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s23) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 55
lt;210gt; 56
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s24) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 56
lt;210gt; 57
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s25) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 57
lt;210gt; 58
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s26) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 58
lt;210gt; 59
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s27) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 59
lt;210gt; 60
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s28) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 60
lt;210gt; 61
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s29) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 61
lt;210gt; 62
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s30) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 62
lt;210gt; 63
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s31) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 63
lt;210gt; 64
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s32) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 64 lt;210gt; 65
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s33) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 65
lt;210gt; 66
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: L-IB1(s34) (ver Tabla 1)
lt;400gt; 66
lt;210gt; 67
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s1) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(13)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 67
lt;210gt; 68
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s2) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(13)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 68
lt;210gt; 69
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s3) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(13)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 69 lt;210gt; 70
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s4) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(13)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 70
lt;210gt; 71
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s5) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(13)
lt;223gt; todos los aminoacidos son D-aminoacidos
lt;400gt; 71
lt;210gt; 72
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s6) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(13)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 72
lt;210gt; 73
lt;211gt; 13
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s7) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(13)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 73
lt;210gt; 74
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s8) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(12)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 74
lt;210gt; 75
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s9) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(12)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 75
lt;210gt; 76
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s10) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(12)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 76
lt;210gt; 77
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s11) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(12)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 77
lt;210gt; 78
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s12) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(12)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 78 lt;210gt; 79
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s13) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(12)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 79
lt;210gt; 80
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s14) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(12)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 80
lt;210gt; 81
lt;211gt; 12
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s15) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(12)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 81
lt;210gt; 82
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s16) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(11)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 82
lt;210gt; 83
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s17) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(11)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 83
lt;210gt; 84
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s18) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(11)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 84
lt;210gt; 85
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s19) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(11)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 85
lt;210gt; 86
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s20) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(11)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 86
lt;210gt; 87
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s21) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(11)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 87 lt;210gt; 88
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s22) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(11)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 88
lt;210gt; 89
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s23) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(11)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 89
lt;210gt; 90
lt;211gt; 11
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s24) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(11)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 90
lt;210gt; 91
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s25) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(10)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 91
lt;210gt; 92
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s26) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(10)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 92
lt;210gt; 93
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s27) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(10)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 93
lt;210gt; 94
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s28) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(10)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 94
lt;210gt; 95
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s29) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(10)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 95
lt;210gt; 96
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s30) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(10)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 96 lt;210gt; 97
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s31) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(10)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 97
lt;210gt; 98
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s32) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(10)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 98
lt;210gt; 99
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s33) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(10)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 99
lt;210gt; 100
lt;211gt; 10
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: D-IB1(s34) (ver Tabla 1)
lt;220gt;
lt;221gt; MUTAGEN
lt;222gt; (1)..(10)
lt;223gt; todos los aminoacidos son aminoacidos-D
lt;400gt; 100
lt;210gt; 101
lt;211gt; 21
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: ap-1 sonda doblemente marcada (ver pagina 66)
lt;400gt; 101
lt;210gt; 102
lt;211gt; 2953 5 lt;212gt; ADN
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: secuencia de ADNc de rata IB1 y su secuencia de aminoacidos pronosticada (ver 10 Fig. 1)
lt;220gt;
lt;221gt; CDS
lt;222gt; (108)..(2252)
lt;400gt; 102
lt;210gt; 103
lt;211gt; 714 5 lt;212gt; PRT
lt;213gt; Artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: Proteina codificada por Exon-Intron Boundary del Gen rIB1 - Splice donor
lt;400gt; 103
lt;210gt; 104
lt;211gt; 711
lt;212gt; PRT
lt;213gt; Homo sapiens
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: secuencia de proteina humana IB1
lt;400gt; 104
lt;210gt; 105
lt;211gt; 2136
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Homo sapiens
lt;220gt;
lt;223gt; Descripcion de la secuencia: secuencia de acido nucleico que codifica la proteina humana IB1
lt;400gt; 105

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Utilizacion de un peptido inhibidor de JNK consistente en una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEC ID NO: 2 o de un peptido quimerico consistente en un primer dominio y un segundo dominio unidos mediante un enlace covalente, comprendiendo el primer dominio una secuencia de trafico y consistiendo el segundo dominio en una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2, estando el primer dominio unido al extremo C-terminal del segundo dominio, para la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias seleccionadas de entre asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), neumonia, inflamacion pulmonar, fibrosis pulmonar, fibrosis quistica, meningitis, esclerosis multiple, hepatitis, endometriosis, meningoencefalitis primavero-estival (ESME), encefalitis japonesa, poliomielitis, reacciones de rechazo al injerto o de rechazo al transplante.
  2. 2.
    Utilizacion segun la reivindicacion 1, caracterizada porque la secuencia de trafico del peptido quimerico comprende la secuencia de aminoacidos de un polipeptido TAT del virus de la inmunodeficiencia humana.
  3. 3.
    Utilizacion segun las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque la secuencia de trafico del peptido quimerico consiste o comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID NO: 5, 6, 7, 8, 21 o 22.
  4. 4.
    Utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la secuencia de trafico del peptido quimerico aumenta la absorcion celular del peptido ylo dirige la localizacion nuclear del peptido.
  5. 5.
    Utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el peptido quimerico consiste en la secuencia de aminoacidos de SEC ID NO: 11.
  6. 6.
    Utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composicion farmaceutica se administra mediante una via de administracion seleccionada de entre el grupo consistente en vias parenterales, incluyendo intravenosa, intramuscular, subcutanea, intradermica, transdermica, vias enterales, incluyendo oral, rectal, vias topicas, incluyendo nasal, intranasal, y otras vias, incluyendo epidermica y liberacion desde parches.
  7. 7.
    Utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la dosis (por kg de peso corporal) del peptido inhibidor de JNK o del peptido quimerico oscila en el intervalo de hasta 10 mmollkg, preferentemente de hasta 1 mmollkg, de forma especialmente preferente de hasta 100 Imollkg, de forma todavia mas preferente de hasta 10 Imollkg, de forma particularmente preferente de hasta 1 Imollkg, de forma todavia mas preferente de hasta 100 nmollkg y de forma totalmente preferente de hasta 50 nmollkg.
  8. 8.
    Utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la dosis del peptido inhibidor de JNK o del peptido quimerico esta en el intervalo de aproximadamente 1 pmollkg a aproximadamente 1 mmollkg, entre aproximadamente 10 pmollkg a aproximadamente 0,1 mmollkg, entre aproximadamente 10 pmollkg a aproximadamente 0,01 mmollkg, entre aproximadamente 50 pmollkg a aproximadamente 1 Imollkg, entre aproximadamente 100 pmollkg a aproximadamente 500 nmollkg, entre aproximadamente 200 pmollkg a aproximadamente 300 nmollkg, entre aproximadamente 300 pmollkg a aproximadamente 100 nmollkg, entre aproximadamente 500 pmollkg a aproximadamente 50 nmollkg, entre aproximadamente 750 pmollkg a aproximadamente 30 nmollkg, entre aproximadamente 250 pmollkg a aproximadamente 5 nmollkg, entre aproximadamente 1 nmollkg a aproximadamente 10 nmollkg, o una combinacion de dos cualesquiera de estos valores.
  9. 9.
    Peptido inhibidor de JNK consistente en una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la SEC ID NO: 2 o peptido quimerico consistente en un primer dominio y un segundo dominio unidos mediante un enlace covalente, comprendiendo el primer dominio una secuencia de trafico y consistiendo el segundo dominio en una secuencia inhibidora de JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 2, estando el primer dominio unido al extremo C-terminal del segundo dominio, para su uso en un metodo de tratamiento de una enfermedad inflamatoria seleccionada de entre asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), neumonia, inflamacion pulmonar, fibrosis pulmonar, fibrosis quistica, meningitis, esclerosis multiple, hepatitis, endometriosis, meningoencefalitis primavero-estival (ESME), encefalitis japonesa, poliomielitis, reacciones de rechazo al injerto o de rechazo al transplante.
  10. 10.
    Peptido quimerico para su uso segun la reivindicacion 9, caracterizado porque la secuencia de trafico comprende la secuencia de aminoacidos de un polipeptido TAT del virus de la inmunodeficiencia humana.
  11. 11.
    Peptido quimerico para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, caracterizado porque la secuencia de trafico consiste o comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID NO: 5, 6, 7, 8, 21 o 22.
  12. 12.
    Peptido quimerico para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la secuencia de trafico aumenta la absorcion celular del peptido ylo dirige la localizacion nuclear del peptido.
  13. 13.
    Peptido quimerico previsto para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque el peptido quimerico consiste en la secuencia de aminoacidos de SEC ID NO: 11.
  14. 14.
    Peptido inhibidor de JNK para su uso segun la reivindicacion 9 o peptido quimerico segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizado porque el peptido inhibidor de JNK o el peptido quimerico se administra
    5 mediante una via de administracion seleccionada de entre el grupo consistente en vias parenterales, incluyendo intravenosa, intramuscular, subcutanea, intradermica, transdermica, vias enterales, incluyendo oral, rectal, vias topicas, incluyendo nasal, intranasal, y otras vias, incluyendo epidermica y liberacion desde parches.
  15. 15. Peptido inhibidor de JNK para su uso segun la reivindicacion 9 o 14, o peptido quimerico segun cualquiera de
    10 las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque una dosis (por kg de peso corporal) del peptido inhibidor de JNK o del peptido quimerico oscila en el intervalo de hasta 10 mmollkg, preferentemente de hasta 1 mmollkg, de forma especialmente preferente de hasta 100 Imollkg, de forma todavia mas preferente de hasta 10 Imollkg, de forma todavia mas preferente de hasta 1 Imollkg, de forma todavia mas preferente de hasta 100 nmollkg, y de forma totalmente preferente de hasta 50 nmollkg.
    15 16. Peptido inhibidor de JNK para su uso segun la reivindicacion 9, 14 o 15 o peptido quimerico segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, caracterizado porque una dosis del peptido inhibidor de JNK o del peptido quimerico oscila entre aproximadamente 1 pmollkg y aproximadamente 1 mmollkg, entre aproximadamente 10 pmollkg y aproximadamente 0,1 mmollkg, entre aproximadamente 10 pmollkg y aproximadamente 0,01 mmollkg, entre aproximadamente 50 pmollkg y aproximadamente 1 Imollkg, entre aproximadamente 100
    20 pmollkg y aproximadamente 500 nmollkg, entre aproximadamente 200 pmollkg y aproximadamente 300 nmollkg, entre aproximadamente 300 pmollkg y aproximadamente 100 nmollkg, entre aproximadamente 500 pmollkg y aproximadamente 50 nmollkg, entre aproximadamente 750 pmollkg y aproximadamente 30 nmollkg, entre aproximadamente 250 pmollkg y aproximadamente 5 nmollkg, entre aproximadamente 1 nmollkg y aproximadamente 10 nmollkg, o una combinacion de dos cualesquiera de estos valores.
    ���������������
    Secuencias�de�peptidos,�iumano,�rat6n�y�rata
    Señal AlphaScreen (cps)
    Señal AlphaScreen (cps)
    número de pocillos Citoquinas (ng/ml)
    Señal AlphaScreen (cps)
    Estaurosporina
    Señal AlphaScreen (cps)
    -
    Log inhibidores (M) -Log inhibidores (M)
    Ensayo de Reducción de Placa VZV
    TNF en BALF por grupos después de BLM en D1
    veiiculo veiiculo
    veiiculo veiiculo
    Cambio de
    Peso�
    Ingesti6n�de�comidaIngesti6n�de� agua24�i�(g)
    Producci6n�de�ieces� 24�i�(g)
    Ingesti6n�de�comida �24�i�(g g)
    Producci6n �de�
    ieces� 24�i �(g g)
    Gramos
    Macrófago
    rata
    Liberación de TNF en células THP1 Liberación de IL-6 en células THP1 Liberación de MCP-1 en células THP1
    Producción de TNF enProducción de IL-6 enProducción de RANTES enmacrófagos derivados de médula ósea
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