ES2401645T3 - Uso de agentes moduladores de la conversión de priones - Google Patents

Abstract

Uso de apolipoproteína B en un ensayo para la detección de la formación de PrPSc en una muestra.

Description

Uso de agentes moduladores de la conversión de priones

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de la apolipoproteína B o apolipoproteína E o fragmentos o miméticos de la misma para el diagnóstico, la detección, el pronóstico y la identificación de moduladores de la replicación de la proteína priónica. Más específicamente, la invención proporciona el uso de moduladores de la apolipoproteína B o fragmentos de la misma para modular la replicación de la proteína priónica que está implicada en la patogénesis de encefalopatías espongiformes transmisibles y otras enfermedades priónicas.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) en seres humanos y la tembladera y la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en animales son algunas de las enfermedades que pertenecen al grupo de las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET), también conocidas como enfermedades priónicas (Prusiner, 1991). Estas enfermedades se caracterizan por un periodo de incubación extremadamente largo, seguido de una patología clínica breve e invariablemente fatal (Roos y col., 1973). Hasta la fecha no existe tratamiento.

Aunque estas enfermedades son relativamente raras en los seres humanos, el riesgo de transmisibilidad de la EEB a los seres humanos a través de la cadena alimentaria ha llamado la atención de las autoridades de salud pública y de la comunidad científica (Soto y col., 2001). La ECJ variante (ECJv) es una nueva enfermedad, descrita por primera vez en marzo de 1996 (Will y col., 1996). A diferencia de los casos típicos de ECJ esporádica (ECJe), esta forma variante afecta a pacientes jóvenes (edad media 27 años) y presenta un curso relativamente largo de la enfermedad (promedio de 14 meses frente a 4,5 meses en la ECJ tradicional). La primera hipótesis que se planteó fue que podía existir una relación entre la ECJv y la EEB debido a la coincidencia de estas dos EET en espacio y tiempo (Bruce, 2000). Las evidencias más recientes y convincentes provienen de estudios que muestran que las características de transmisión de la EEB y la ECJv a ratones son siempre idénticas, indicando claramente que se deben al mismo agente causante (Bruce y col., 1997). Además, se ha demostrado ahora que los ratones transgénicos que portan un gen humano o bovino son susceptibles a la EEB y la ECJv (Scott y col., 1999). Tampoco se ha propuesto ninguna otra hipótesis plausible para la aparición de la ECJv, y la intensa vigilancia de la ECJ en cinco países europeos con una baja exposición al agente de la EEB no ha identificado casos adicionales. En conclusión, la causa más probable de la ECJv es la exposición al agente de la EEB, probablemente por contaminación de la dieta con tejido afectado del sistema nervioso central bovino.

La naturaleza del agente transmisible ha sido objeto de una apasionada controversia. Investigaciones adicionales han indicado que el agente de las EET difiere significativamente de los virus y otros agentes convencionales en que no parece contener ácidos nucleicos (Prusiner, 1998). Además, los procedimientos fisicoquímicos que inactivan la mayoría de los virus, como la alteración de ácidos nucleicos, han resultado ineficaces para reducir la infectividad del patógeno de las EET. Por el contrario, se ha descubierto que los procedimientos que degradan proteínas inactivan el patógeno (Prusiner, 1991). Por consiguiente, la teoría que propone que el agente transmisible no es un virus ni otro agente infeccioso previamente conocido, sino un agente no convencional formado únicamente por una proteína, cuenta recientemente con una amplia aceptación (Prusiner, 1998). Esta nueva clase de patógenos se denominó "prión", que es la abreviatura para "partícula proteica infecciosa" (proteinaceous infectious particle). En las EET los priones se componen principalmente de una proteína mal plegada denominada PrPSc (por "scrapie" PrP), que es una versión modificada después de la traducción de una proteína normal llamada PrPC (Cohen y col., 1998). No se han detectado diferencias químicas que distingan a estas dos isoformas de la PrP, y la conversión parece implicar un cambio conformacional por medio del cual disminuye el contenido de hélices a en la proteína normal y aumenta la cantidad de hojas 1 (Pan y col., 1993). Los cambios estructurales preceden a alteraciones en las propiedades bioquímicas: la PrPC es soluble en detergentes no desnaturalizantes, la PrPSc es insoluble; la PrPC es digerida fácilmente por proteasas (denominada también proteína priónica sensible a proteasas) mientras que la PrPSc es parcialmente resistente, dando lugar a la formación de un fragmento truncado en el extremo N-terminal, conocido como PrPres (proteína priónica resistente a proteasas) (Cohen y col., 1998).

Experimentos en los que se silenció el gen endógeno de la PrP cuando los animales eran tanto resistentes a la enfermedad priónica como incapaces de generar nuevas partículas infecciosas apoyan la idea de que la PrPC endógena está involucrada en el desarrollo de la infección (Bueler y col., 1993). Además, está claro que en el tiempo transcurrido entre la inoculación con la proteína infecciosa y la aparición de los síntomas clínicos se produce un drástico aumento en la cantidad de PrPSc.

Estos hallazgos sugieren que la PrPC endógena adquiere la conformación de la PrPSc por acción de una forma infecciosa de la molécula PrP (Soto y col., 2001). Se supone que los priones se replican cuando la PrPSc del inóculo infeccioso interactúa específicamente con la PrPC del hospedador, catalizando su conversión en la forma patógena de la proteína. La especificidad por la secuencia primaria en la transmisión de priones (Telling y col., 1994) y la generación in vitro de moléculas similares a la PrPSc al mezclar PrPC purificada con PrPSc (Saborio y col., 2001) sugieren la existencia de una asociación física entre las dos isoformas durante el proceso infeccioso. Sin embargo, no se conoce el mecanismo exacto subyacente a la conversión.

Las investigaciones con transgenes quiméricos han demostrado que es probable que la PrPC y la PrPSc interactúen en un dominio central delimitado por los codones 96 y 169 (Prusiner, 1996), y se ha probado que péptidos sintéticos de la PrP que abarcan la región 109-141 son capaces de unirse a la PrPC y de competir con la interacción de la PrPSc (Chabry y col., 1998).

En base a los datos obtenidos con animales transgénicos se ha propuesto que para la propagación de los priones son esenciales otros factores cerebrales adicionales presentes en el hospedador (Telling y col., 1995). Se ha demostrado previamente que la conversión de los priones no se produce en condiciones experimentales cuando se mezclan e incuban PrPC purificada y PrPSc (Saborio y col., 1999), pero que la actividad de conversión se recupera cuando se vuelven a añadir las demás proteínas celulares a la muestra (Saborio y col., 1999). Este hallazgo proporciona evidencias directas de que son esenciales otros factores presentes en el cerebro para catalizar la propagación de los priones.

La observación de que la reducción de colesterol reduce la formación de PrPSc mientras que la reducción de esfingolípidos aumenta la formación de PrPSc ha sugerido que las "balsas lipídicas" (dominios lipídicos en las membranas que contienen esfingolípidos y colesterol) pueden ser el lugar de la reacción de conversión de PrPC en PrPSc, que implica bien una proteína asociada a las balsas o bien lípidos seleccionados de las balsas (Fantini y col., 2002). Sin embargo, el papel de las balsas lipídicas en la infectividad de los priones sigue sin estar claro.

Se han desarrollado varios métodos de detección de priones in vitro en una muestra. El conjunto de métodos de detección conocidos incluye métodos de detección de la PrPSc mediante portadores de ligandos específicos seleccionados entre aminoglucanos, fibronectina y apolipoproteína A (documento WO 02/065133); métodos en los que se usan los anticuerpos monoclonales seleccionados entre Gö138, 3B5 y 12F10 (Schulz y col., 2000); métodos basados en la formación de un complejo entre la PrPSc y la apolipoproteína H (documento WO 03/005037); o métodos basados en la amplificación de PrPSc in vitro denominada amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA, por sus siglas en inglés), descrita en Saborio y col., 2001 y Lucassen y col., 2003.

La apolipoproteína B es el componente proteico principal de las dos lipoproteínas aterogénicas conocidas, las lipoproteínas de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés) y los remanentes de lipoproteínas ricas en triglicéridos. Se considera que la concentración de apolipoproteína B refleja directamente el número de partículas aterogénicas en la sangre y se ha propuesto como parámetro para determinar el riesgo de aterosclerosis. Se cree que la biogénesis de la apolipoproteína B muestra regulación por translocación (Lingappa y col., 1997).

La apolipoproteína E es un componente de varias lipoproteínas plasmáticas, tales como quilomicrones, lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL, por sus siglas en inglés) y lipoproteínas de alta densidad (HDL, por sus siglas en inglés) (Lehninger y col., 1993).

Recientemente, la apolipoproteína E ha surgido como factor de riesgo genético principal para la enfermedad de Alzheimer, un trastorno neurodegenerativo (documento US 6,022,683), y está regulada por incremento en el líquido cerebroespinal de pacientes con la ECJ variante y la enfermedad de Alzheimer en comparación con pacientes con la ECJ esporádica (Choe y col., 2002). El fenotipo 4/4 de la apolipoproteína E está asociado a un mayor riesgo de desarrollo de cardiopatías coronarias y de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (Golaz y col., 1995). Se ha descubierto que la expresión del gen de la apolipoproteína E está aumentada en los astrocitos asociados a las lesiones neuropatológicas en un modelo animal de tembladera (Dietrich y col., 1991).

Se ha descubierto que la apolipoproteína E reconoce un motivo estructural compartido de amiloides y priones que, una vez inducido, puede acelerar la adopción de una conformación de hoja beta (Baumann y col., 2000).

Las apolipoproteínas B y E son ligandos para el receptor de LDL y son conocidas por su papel destacado en el transporte de colesterol y el metabolismo de lipoproteínas plasmáticas a través de interacciones con el receptor de LDL. La apolipoproteína B es especialmente capaz de formar un complejo con un receptor de LDL. (Segrest y col., 2001; Clavey y col., 1991).

Un planteamiento para el tratamiento y la prevención de enfermedades priónicas ha consistido en el desarrollo de agentes para bloquear la transformación de PrPC en PrPSc. Algunos agentes propuestos fueron el colorante Rojo Congo (documento US 5,276,059), péptidos de crecimiento nervioso (documento US 5,134,121), fragmentos de proteínas priónicas (documento US 6,355,610), compuestos que reducen la liberación de apolipoproteína E en el tejido cerebral (documento US 2002/0155426), agentes terapéuticos que impiden la interacción de la apolipoproteína E4 con la proteína relacionada con el receptor de LDL neuronal (documento WO 97/14437), compuestos que aumentan los niveles de apolipoproteína E (documento WO 99/15159) y péptidos que rompen las hojas beta (documento US 5,948,763).

Sería deseable desarrollar nuevos métodos para identificar e inhibir el/los factor(es) de conversión de priones.

Resumen de la invención

Un objetivo de la invención consiste en proporcionar el uso de péptidos o proteínas en un ensayo para la detección de la formación de PrPSc en una muestra.

Asimismo es un objetivo de la invención proporcionar el uso de péptidos o proteínas en un ensayo de cribado para identificar compuestos que modulan la conversión de PrPC en PrPSc.

Otro objetivo de la invención consiste en proporcionar una sustancia que sea adecuada para tratar y/o prevenir y/o retrasar la progresión de los trastornos relacionados con priones, especialmente la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ).

En un primer aspecto, la invención proporciona el uso de la apolipoproteína B en un ensayo para la detección de la formación de PrPSc en una muestra.

En un segundo aspecto, la invención proporciona el uso de la apolipoproteína B en un ensayo de cribado para la identificación de compuestos que modulan la conversión de PrPC en PrPSc.

En un tercer aspecto, la invención proporciona el uso de un modulador, preferentemente un inhibidor o un antagonista, de la apolipoproteína B para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad priónica, especialmente la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) y la enfermedad de Creutzfelt-Jakob (ECJ).

En un cuarto aspecto, la invención proporciona un método para el diagnóstico o la detección de una enfermedad priónica en un sujeto que se sospecha sufre de una enfermedad de este tipo, que comprende (i) poner una muestra de dicho sujeto en contacto con la apolipoproteína B, (ii) poner la muestra obtenida en la etapa (i) en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC, como homogenados cerebrales, lisados celulares, preparaciones de balsas lipídicas; y (iii) determinar la presencia y/o cantidad de PrPSc en dicha muestra.

En un quinto aspecto, la invención proporciona un método para la determinación de un marcador que predisponga a un sujeto a una enfermedad priónica, que comprende (i) medir el nivel de apolipoproteína B y (ii) correlacionar dicho nivel de proteína obtenido en dicha etapa de medición con la presencia de una enfermedad priónica.

En un sexto aspecto, la invención proporciona un método para la detección de la formación de PrPSc en una muestra, comprendiendo el ensayo (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B, (ii) poner la muestra obtenida en la etapa (i) en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC, como homogenados cerebrales, lisados celulares, preparaciones de balsas lipídicas; y (iii) determinar la presencia y/o cantidad de PrPSc en dicha muestra.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona un método para la identificación de un compuesto que modula, preferentemente inhibe o antagoniza, la transición de PrPC a PrPSc, que comprende: (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B (a) en presencia de dicho compuesto y (b) en ausencia de dicho compuesto; (ii) poner la muestra obtenida en las etapas (i)a y (i)b en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC, como homogenados cerebrales, lisados celulares, preparaciones de balsas lipídicas; y (iii) determinar la cantidad de PrPSc (a) en presencia de dicho compuesto y (b) en ausencia de dicho compuesto.

En un octavo aspecto, la invención proporciona un ensayo para la detección de la formación de PrPSc en una muestra, comprendiendo el ensayo (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B; (ii) poner la muestra obtenida en la etapa (i) en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC, como homogenados cerebrales, lisados celulares, preparaciones de balsas lipídicas; y (iii) determinar la presencia y/o cantidad de PrPSc en dicha muestra.

En un noveno aspecto, la invención proporciona un ensayo de selección para la identificación de un compuesto que modula, preferentemente inhibe o antagoniza, la transición de PrPC a PrPSc, que comprende: (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B (a) en presencia de dicho compuesto y (b) en ausencia de dicho compuesto; (ii) poner la muestra obtenida en las etapas (i)a y (i)b en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC, como homogenados cerebrales, lisados celulares, preparaciones de balsas lipídicas; y (iii) determinar la cantidad de PrPSc (a) en presencia de dicho compuesto y (b) en ausencia de dicho compuesto.

Descripción detallada de la invención

Los párrafos siguientes proporcionan definiciones de diferentes términos con la intención de que se apliquen uniformemente a toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones, salvo que una definición que indique expresamente lo contrario proporcione una definición diferente.

La expresión "enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker", abreviada con "GSS", se refiere a una forma de la enfermedad priónica humana hereditaria. La enfermedad se produce por un trastorno autosómico dominante. Los miembros de la familia que heredan el gen mutante sucumben a la GSS.

El término "prión" hace referencia a una partícula transmisible conocida por causar un grupo de enfermedades conformacionales transmisibles (encefalopatías espongiformes) en seres humanos y animales. El término "prión" es una contracción de las palabras "proteína" e "infección", y las partículas se componen mayoritaria, si no exclusivamente, de moléculas PrPSc.

Los "priones" son distintos de bacterias, virus y viroides. Los priones conocidos incluyen aquellos que infectan animales para causar tembladera, una enfermedad degenerativa transmisible del sistema nervioso de ovejas y cabras, así como encefalopatías espongiformes bovinas (EEB), o la enfermedad de las vacas locas, y encefalopatías espongiformes felinas en gatos. Cuatro enfermedades priónicas conocidas por afectar a seres humanos son el kuru, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), la enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker (GSS) y el insomnio familiar fatal (IFF) (Prusinier, 1991). Como se usa en la presente memoria, el término prión incluye todas las formas de priones que causen todas o cualquiera de estas u otras enfermedades en cualquier animal usado, en particular en seres humanos y animales domésticos y de granja.

La expresión "balsas lipídicas" se refiere a pequeñas plataformas, revisadas recientemente (Simons y col., 2000), compuestas por esfingolípidos y colesterol en la cara exoplasmática externa y conectadas a colesterol en la cara citoplasmática interna de la bicapa. Las balsas lipídicas se pueden aislar por ser insolubles en ciertos detergentes, como Triton X-100, a 4ºC. Por lo tanto, las balsas se pueden purificar en forma de membranas insolubles en detergentes (MID)

o membranas resistentes a detergentes (MRD) por ultracentrifugación en gradientes de sacarosa. Las balsas están enriquecidas en proteínas ancladas a GPI, así como en proteínas implicadas en la transducción de señales y el tráfico intracelular. En las neuronas, las balsas lipídicas actúan de plataformas para la transducción de señales iniciada por varias clases de factores neurotróficos (Tsui-Pierchala y col., 2002). En el ejemplo nº 2, apartado c, se proporciona un ejemplo de la extracción de balsas lipídicas.

La expresión "factor de conversión de priones" se refiere a un factor que comprende proteínas, lípidos, enzimas o receptores y que actúa de cofactor o factor auxiliar implicado en el proceso de conversión de PrPC en PrPSc y favorece el inicio y/o la progresión de la enfermedad priónica.

Las expresiones "preparación normalizada de priones", "preparación de priones" y similares se usan en la presente memoria indistintamente para describir una composición que contiene priones, obteniéndose la composición, por ejemplo, a partir de tejido cerebral de mamíferos que contiene sustancialmente el mismo material genético que el relacionado con las proteínas PrP, por ejemplo de tejido cerebral de un conjunto de mamíferos que presentan signos de enfermedad priónica o, por ejemplo, una composición que se obtiene a partir de células infectadas de forma crónica por priones.

Las expresiones "sensible a infección", "sensible a infección por priones" y similares se usan para un material procedente de un mamífero, incluidas las células, que se puede infectar con una cantidad y tipo de prión que se espera cause una enfermedad priónica o síntomas de la misma.

Por analogía, las expresiones "resistente a infección", "resistente a infección por priones" y similares se usan para un material de un mamífero, incluidas las células, que presenta la característica de ser resistente cuando se infecta con una cantidad y tipo de prión que se espera cause una enfermedad priónica o síntomas de la misma y de permanecer sin infectar incluso después de varias inoculaciones de material priónico infeccioso.

El término "muestra" se refiere a un extracto biológico de un mamífero, que incluye muestras de células, líquido corporal, material genético tal como homogenado cerebral, células, balsas lipídicas o péptidos y proteínas purificados.

La expresión "tiempo de incubación" hace referencia al tiempo transcurrido desde la inoculación de un animal con un prión hasta que el animal desarrolle los primeros síntomas detectables de la enfermedad como resultado de la infección, así como al tiempo transcurrido desde la inoculación de material de un mamífero, por ejemplo homogenado cerebral, células, balsas lipídicas de células, con un prión hasta que la infección por priones sea detectable, por ejemplo a través de la conversión de PrPc en PrPSc. Un experto en la técnica conoce varios métodos de detección de infecciones por priones y de conversión de PrP.

El término "fracción" o "fragmento" se refiere a cualquier fragmento de la cadena polipeptídica del compuesto propiamente dicho, solo o en combinación con moléculas o restos relacionados unidos a él, por ejemplo restos de azúcares o fosfatos, o agregados del polipéptido o péptido original. Tales moléculas también pueden ser el resultado de otras modificaciones que normalmente no alteran la secuencia primaria, por ejemplo la derivatización química in vivo o in vitro de péptidos (acetilación o carboxilación), las realizadas por modificación del patrón de fosforilación (introducción de restos fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina) o de glucosilación (por exposición del péptido a enzimas que afectan a la glucosilación, por ejemplo enzimas glucosilantes o desglucosilantes) de un péptido durante su síntesis y procesamiento o en etapas de procesamiento posteriores.

Los términos "modulador" o "compuesto modulador" se refieren a moléculas que modifican las funciones y/o propiedades (como la unión al receptor, la afinidad lipídica, la interacción enzimática, la organización estructural, la síntesis, el metabolismo) de la proteína natural. Los "moduladores" o "compuestos moduladores" incluyen "agonistas" y "antagonistas". Los "moduladores" incluyen péptidos, proteínas o fragmentos de los mismos, peptidomiméticos, compuestos orgánicos y anticuerpos.

El término "miméticos" se refiere a moléculas que mimetizan las funciones y/o propiedades (como la unión al receptor, la afinidad lipídica, la interacción enzimática, la organización estructural, la síntesis, el metabolismo) de una proteína natural. Estos compuestos poseen, por ejemplo, la propiedad de potenciar una propiedad de la proteína natural (es decir, de producir, cuando el compuesto se añade a la proteína natural, la misma actividad que la que se obtiene aumentando la concentración de la proteína natural) o de mostrar la misma propiedad que la proteína natural (es decir, de producir la misma actividad cuando el compuesto sustituye a la proteína natural). Los "miméticos" incluyen péptidos, proteínas o fragmentos de los mismos, peptidomiméticos y compuestos orgánicos. En los documentos US 2002028175 y WO 2004043403 se describen ejemplos de miméticos de la apolipoproteína E.

Los términos "inhibidor" o "antagonista" se refieren a moléculas que alteran parcialmente o reducen las funciones y/o propiedades (como la unión al receptor, la afinidad lipídica, la interacción enzimática, la organización estructural, la síntesis, la secreción, el metabolismo) de la proteína natural. Los "inhibidores" o "antagonistas" incluyen péptidos, proteínas o fragmentos de los mismos, peptidomiméticos, compuestos orgánicos y anticuerpos. En Choi y col., 1997 y Wang y col., 2000 se describen ejemplos de anticuerpos de la apolipoproteína B. Ejemplos de antagonistas de la apolipoproteína pueden ser antagonistas que alteran o reducen la función de las apolipoproteínas B en la ruta de transporte de colesterol. En los documentos US 6,369,075, US 6,197,972, WO 03002533 y WO 03045921 se describen ejemplos de compuestos que alteran la secreción o síntesis de apolipoproteína B. Otros "moduladores" o "antagonistas" pueden ser moduladores del receptor de LDL, preferentemente antagonistas del receptor de LDL, tales como anticuerpos contra el receptor de LDL. En el documento WO 0168710 se proporcionan ejemplos de anticuerpos monoclonales contra el receptor de LDL.

La expresión "ensayo de amplificación cíclica de proteínas mal plegadas", o "ensayo PMCA", es un ensayo para el diagnóstico o la detección de enfermedades conformacionales que comprende un sistema de amplificación cíclica para incrementar los niveles del confórmero patógeno, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 02/04954.

El término "marcador" para una enfermedad se refiere a un parámetro o valor biológico que incluye un carácter genético, mutación(es) proteica(s) hereditaria(s), el nivel de una proteína o una enzima en sangre que difiere del valor medio en una población heterogénea de individuos y cuya presencia se correlaciona con la presencia de dicha enfermedad con una significación estadística. Un "marcador" para una enfermedad o afección se define típicamente como un cierto nivel de corte de dicha variable biológica. Un "marcador" proporciona la base para determinar el riesgo (probabilidad de aparición) de una enfermedad en un sujeto.

El término "complejo" incluye la formación de una entidad por interacción de varias moléculas, varias proteínas, varios péptidos entre sí o con un receptor. Estas interacciones pueden ser reversibles y/o transitorias. Estas interacciones pueden inducir cambios en las propiedades de las moléculas, proteínas, péptidos o receptores que interactúan.

Por "cantidad eficaz" se entiende una concentración de péptido(s) que es capaz de ralentizar o inhibir la formación de depósitos de PrPSc o de disolver depósitos preformados. Estas concentraciones pueden ser determinadas de forma rutinaria por los expertos en la materia. Los expertos en la materia también apreciarán que la dosis puede depender de la estabilidad del péptido administrado. Un péptido menos estable puede requerir una administración en múltiples dosis.

La preparación de anticuerpos es conocida por el experto en la materia. Se denomina "anticuerpo" a un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo anti-anti-Id o un fragmento del mismo que reconozca y se una específicamente a la Apo B o Apo E y a fragmentos de la misma. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se obtienen mediante la generación de líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales capaces de reconocer y unirse específicamente a la Apo B y/o a fragmentos de la misma. Más específicamente, estos anticuerpos monoclonales son capaces de reconocer y unirse específicamente a la Apo B. Un anticuerpo monoclonal se puede preparar de manera convencional, por ejemplo cultivando un hibridoma clonado que comprenda células de bazo de un mamífero inmunizado con ApoBh y una célula linfoide homogénea o heterogénea en medio líquido o abdomen de mamífero para permitir que el hibridoma produzca y acumule el anticuerpo monoclonal. Preferentemente, el anticuerpo reconoce y se une específicamente a fragmentos que reconocen Apo B-LDL.

La presente invención proporciona compuestos capaces de controlar, es decir, incrementar y/o inhibir la conversión de PrPC en PrPSc en enfermedades priónicas.

La actividad de los compuestos de la invención de controlar la conversión de PrPC en PrPSc en enfermedades priónicas se puede detectar usando, por ejemplo, un ensayo in vitro, como el que se describe en Saborio y col., 2001, que mide la capacidad de los compuestos de la invención para modular la conversión de PrPC en PrPSc. Los resultados se indican en los ejemplos.

En una realización, la invención proporciona el uso de la apolipoproteína B en un ensayo para la detección de la formación de PrPSc en una muestra.

En otra realización de la invención, la apolipoproteína B usada en un ensayo para la detección de la formación de PrPSc en una muestra se une y/o forma un complejo con el receptor de LDL.

En otra realización, la invención proporciona el uso de la apolipoproteína B en un ensayo de cribado para la identificación de compuestos que modulan la conversión de PrPC en PrPSc.

En otra realización más de la invención, la apolipoproteína B usada en un ensayo de cribado para la identificación de compuestos que modulan la conversión de PrPC en PrPSc se une y/o forma un complejo con el receptor de LDL.

En otra realización más de la invención, el ensayo es un ensayo de amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA).

En una realización preferida de la invención, el ensayo de amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA) usa homogenado cerebral normal como fuente de PrPC normal y factor de conversión de priones.

En una realización preferida de la invención, el ensayo de amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMAC) usa lisados celulares o balsas lipídicas extraídas de células de neuroblastoma sensibles a la infección por priones, como la línea N2a, descrita en el ejemplo 2, y equivalentes, como una fuente de PrPC normal y un factor de conversión de priones. Las fracciones de balsas lipídicas también se pueden purificar directamente a partir del cerebro y servir como fuente de sustrato para la PMCA.

En una realización preferida, la invención proporciona el uso de la apolipoproteína B en un ensayo para la detección de PrPC en una muestra, en el que el ensayo es un ensayo de amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA) que usa balsas lipídicas procedentes de la línea celular de neuroblastoma N2a sensible a infección como una fuente de PrP normal y sustrato.

En otra realización, la invención proporciona el uso de un modulador, preferentemente un inhibidor o un antagonista, de la apolipoproteína B para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad priónica, especialmente la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) y la enfermedad de Creutzfelt-Jakob (ECJ). El modulador modifica, por ejemplo, las funciones y/o propiedades de la apolipoproteína B o de un fragmento de la misma.

En otra realización de la invención, el modulador, preferentemente un inhibidor o un antagonista, de la apolipoproteína B modifica, preferentemente inhibe, la unión y/o la formación de un complejo entre la apolipoproteína B y el receptor de LDL. Un ejemplo de tal modulador puede ser un modulador del receptor de LDL, como un antagonista del receptor de LDL, tal como un anticuerpo del receptor de LDL.

En una realización preferida de la invención, el modulador es un antagonista de la apolipoproteína B.

En otra realización preferida de la invención, el modulador es un anticuerpo producido contra la apolipoproteína B.

En otra realización preferida de la invención, el modulador es un anticuerpo producido contra la apolipoproteína B.

En una realización de la invención, la invención proporciona un método para el diagnóstico o la detección de una enfermedad priónica en un sujeto que se sospecha sufre de una enfermedad de este tipo, que comprende (i) poner una muestra de dicho sujeto en contacto con apolipoproteína B, (ii) poner la muestra obtenida en la etapa (i) en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC, como homogenados cerebrales, lisados celulares, preparaciones de balsas lipídicas; y (iii) determinar la presencia y/o cantidad de PrPSc en dicha muestra. La muestra del sujeto incluye un extracto biológico de un mamífero, tal como una muestra de células, material genético, líquido corporal, homogenado cerebral, células y balsas lipídicas.

En otra realización de la invención, la invención proporciona un método para la determinación de un marcador que predisponga a un sujeto a una enfermedad priónica, que comprende (i) medir el nivel de apolipoproteína B en dicha muestra; (ii) poner la muestra obtenida en la etapa (i) en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC, como homogenados cerebrales, lisados celulares, preparaciones de balsas lipídicas; y (iii) correlacionar dicho nivel de proteína obtenido en dicho paso de medición con la presencia de una enfermedad priónica. El marcador incluye un parámetro o valor biológico, tal como un carácter genético, mutación(es) proteica(s) hereditaria(s), el nivel de una proteína o enzima en sangre.

En otra realización de la invención, la invención proporciona un método para la detección de la formación de PrPSc en una muestra, comprendiendo el ensayo (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B, (ii) poner la muestra obtenida en la etapa (i) en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC, como homogenados cerebrales, lisados celulares, preparaciones de balsas lipídicas; y (iii) determinar la presencia y/o cantidad de PrPSc en dicha muestra. La muestra puede ser una preparación biológica en la cual se ha de detectar la presencia de priones por razones de control de calidad y/o una muestra extraída de un sujeto que se sospecha sufre de una enfermedad de este tipo, que incluye un extracto biológico de un mamífero, tal como una muestra de células, material genético, líquido corporal, homogenado cerebral, células y balsas lipídicas.

En otra realización de la invención, la invención proporciona un método para identificar en una muestra un compuesto que modula, preferentemente inhibe o antagoniza, la transición de PrPC a PrPSc, que comprende: (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B, (ii) poner en contacto la muestra obtenida en la etapa (i) (a) en presencia de dicho compuesto y (b) en ausencia de dicho compuesto; (iii) poner la muestra obtenida en las etapas (ii)a y (ii)b en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC, como homogenados cerebrales, lisados celulares, preparaciones de balsas lipídicas; y (iv) determinar la cantidad de PrPSc (a) en presencia de dicho compuesto y (b) en ausencia de dicho compuesto. El modulador incluye anticuerpos, inhibidores de la unión de apolipoproteínas B que incluye la unión al receptor de LDL, y/o su secreción y/o síntesis.

Otra realización más de la presente invención consiste en un método para el tratamiento o la prevención de una enfermedad priónica, tal como la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) y la enfermedad de Creutzfelt-Jakob (ECJ), en la que el método comprende la administración de una dosis eficaz del modulador antes mencionado de un péptido o una proteína, seleccionándose el péptido o la proteína de la apolipoproteína B, a un sujeto que lo necesite, y en la que el sujeto puede ser un ser humano o un animal.

En un método de uso preferido de los moduladores, preferentemente inhibidores, la administración de los moduladores se realiza por inyección o infusión a intervalos periódicos. La administración de un compuesto de la invención puede comenzar antes de detectarse cualquier síntoma en el paciente y deberá continuar después.

Los compuestos moduladores antes mencionados de la presente invención pueden administrarse por cualquier medio que logre la finalidad pretendida. Por ejemplo, la administración se puede realizar por numerosas vías diferentes que incluyen, sin limitación, la subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intratecal, intranasal, oral, rectal, transdérmica, intranasal o bucal. Preferentemente, los compuestos de la invención se administran por inyección o infusión subcutánea, intramuscular o intravenosa.

La administración parenteral se puede realizar por inyección en bolo o por perfusión gradual a lo largo del tiempo. Un régimen típico para prevenir, suprimir o tratar los trastornos relacionados con priones comprende (1) la administración de una cantidad eficaz en una o dos dosis de alta concentración de modulador en el intervalo de 0,5 a 10 mg de péptido, más preferentemente de 0,5 a 10 mg de péptido, o (2) la administración de una cantidad eficaz del péptido en múltiples dosis de menor concentración de compuestos moduladores en el intervalo de 10 a 1000 !g, más preferentemente de 50 a 500 !g, a lo largo de un periodo de tiempo de hasta e inclusive varios meses a varios años. Se entiende que la dosis administrada dependerá de la edad, el sexo, la salud y el peso del paciente, en su caso del tratamiento concurrente, la frecuencia de tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. La dosis total requerida para cada tratamiento se puede administrar mediante múltiples dosis o en una dosis única.

Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas que pueden contener agentes auxiliares o excipientes conocidos en la materia. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble, por ejemplo sales hidrosolubles. Además se pueden administrar suspensiones del compuesto activo en forma de suspensiones oleosas apropiadas para inyección.

En otra realización de la invención, se proporciona un ensayo para la detección de la formación de PrPSc en una muestra, comprendiendo el ensayo (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B; (ii) poner en contacto la muestra obtenida en la etapa (i); (iii) poner la muestra obtenida en la etapa (ii) en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC, como homogenados cerebrales, lisados celulares, preparaciones de balsas lipídicas; y (iv) determinar la presencia y/o cantidad de PrPSc en dicha muestra. La muestra puede ser una preparación biológica en la cual se ha de detectar la presencia de priones por razones de control de calidad y/o una muestra extraída de un sujeto que se sospecha sufre de una enfermedad de este tipo, que incluye un extracto biológico de un mamífero, tal como una muestra de células, material genético, líquido corporal que incluye sangre, suero, plasma, homogenado cerebral, células y balsas lipídicas.

En otra realización de la invención se proporciona un ensayo de cribado para la identificación de un compuesto que modula, preferentemente inhibe o antagoniza, la transición de PrPC a PrPSc, que comprende: (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B (a) en presencia de dicho compuesto y (b) en ausencia de dicho compuesto modulador;

(ii) poner la muestra obtenida en las etapas (i)a y (i)b en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC, como homogenados cerebrales, lisados celulares, preparaciones de balsas lipídicas; y (iii) determinar la cantidad de PrPSc (a) en presencia de dicho compuesto y (b) en ausencia de dicho compuesto modulador. El modulador incluye anticuerpos, inhibidores de la apolipoproteína B y/o de su secreción y/o síntesis.

En una realización preferida, la enfermedad priónica es la encefalopatía espongiforme bovina (EEB).

En una realización preferida, la enfermedad priónica es la enfermedad de Creutzfelt-Jakob (ECJ) esporádica, variante, familiar o iatrogénica.

La presente invención se ha descrito con referencia a las realizaciones específicas, pero el contenido de la descripción comprende todas las modificaciones y sustituciones que pueda aportar un experto en la materia sin extenderse más allá del significado y el propósito de las reivindicaciones.

La invención se describirá ahora mediante los siguientes ejemplos, los cuales no deben interpretarse como que limitan de alguna manera la presente invención. Los ejemplos hacen referencia a las figuras especificadas a continuación.

Breve descripción de los dibujos:

La figura 1 muestra la replicación de priones in vitro en homogenado cerebral de hámster mediante el ensayo de PMCA en presencia y ausencia de un agente reductor de colesterol (ejemplo 1, apartado b). Las muestras contienen homogenado cerebral normal de hámster al 5% incubado durante 30 min a 4ºC con metil-1-ciclodextrina (M1CD) 0,5, 10

o 20 mM (concentración final). Se añaden alícuotas de homogenado cerebral de tembladera para obtener una dilución de 3.200 (panel superior) y 12.800 veces (panel inferior). La mitad de las muestras se congela inmediatamente como control sin amplificación (PMCA "-") y la otra mitad se somete a 10 ciclos de PMCA (PMCA "+"). La replicación de los priones se evalúa mediante inmunotransferencia después de tratar las muestras con PK (100μg/ml durante 60 min). Los primeros carriles de cada transferencia corresponden al homogenado de cerebro normal no tratado con PK.

La figura 2 muestra el efecto de las apolipoproteínas B, E y J in vitro sobre la replicación de priones en homogenado cerebral de hámster mediante el ensayo de PMCA (ejemplo 1, apartado c). Las muestras que contienen homogenado cerebral normal de hámster al 5% se incuban durante 30 min a 40ºC con diferentes cantidades de apolipoproteína B humana (2A), apolipoproteína E humana (2B) o apolipoproteína J murina (2C). Se añaden alícuotas de homogenado cerebral de tembladera para obtener una dilución de 3.200 (panel izquierdo) o 12.800 veces (panel derecho). La mitad de las muestras se congela inmediatamente como control sin amplificación (PMCA "-") y la otra mitad se somete a 10 ciclos de PMCA (PMCA "+"). La replicación de los priones se evalúa mediante inmunotransferencia después de tratar las muestras con PK (100μg/ml durante 60 min). Los primeros carriles de cada transferencia corresponden al homogenado de cerebro normal no tratado con PK.

La figura 3 representa las diferentes sensibilidades de los subclones de N2a a la infección por tembladera reveladas por exposición a anticuerpos monoclonales anti-PrP 6H4 (ejemplo 2, apartado b). La exposición a la proteinasa K (PK) muestra dónde se encuentra la isoforma PrPSc (resistente a proteinasa K). Los dos subclones destacados, nº23 y nº60, se eligen respectivamente como representativos de células resistentes y sensibles a la infección por priones. 'N2a' muestra células N2a sin infectar procesadas en paralelo. Los controles para la inmunotransferencia y la digestión con PK presentan 1 !l de extracto cerebral normal o de tembladera diluido en 80 !l de tampón de lisis y se procesan en paralelo.

La figura 4 muestra la caracterización de la PrP en balsas lipídicas procedentes de subclones de N2a resistentes (nº23) y sensibles (nº60) a la infección por priones (ejemplo 2, apartado c). La figura 4A muestra la cuantificación de la PrP por inmunotransferencia en balsas lipídicas extraídas de células resistentes (nº23) y sensibles (nº60) a la infección por priones. Se representa la distribución de PrP en el extracto total (carga 25 !g) (1), la capa de muestra en sacarosa después de la centrifugación (carga 25 !g) (2) y la fracción flotante de balsas lipídicas (carga 4 !g) (3). La figura 4B muestra el contenido y el patrón de glucosilación de la PrP en los dos subclones nº23 y nº60 mediante inmunotransferencia con anti-PrP. Se analizaron tres preparaciones independientes de balsas lipídicas de células resistentes (nº23) y sensibles (nº60) a la infección por priones. Se analizaron en cada caso cantidades iguales (4 !g) de proteínas de balsas. La figura 4C muestra la misma membrana después de eliminar los anticuerpos y de volver a incubarla con anti-actina, lo que confirma la similitud en la carga de proteínas.

La figura 5 representa la actividad de conversión in vitro de las balsas lipídicas procedentes de subclones de N2a resistentes (nº23) y sensibles (nº60) a la infección por priones usando la PMCA (ejemplo 2, apartado d). Panel superior: Se aíslan balsas lipídicas de células resistentes (nº23) y sensibles (nº60) a la infección por priones. Las preparaciones se mezclan en una relación 100:1 con homogenado cerebral de RML al 10% y las alícuotas se congelan inmediatamente, se incuban durante 15 h a 37ºC o se someten a 15 ciclos de PMCA. Carriles 1: mezcla inicial sin digestión con PK; carriles 2: mezcla inicial digerida con 10 !g/ml de PK durante 1 h a 37ºC; carriles 3: mezcla incubada a 37ºC y digerida con PK como en el carril 2; carriles 4: 15 ciclos de PMCA seguidos de una digestión con PK como en el carril 2. El carril 5 muestra la migración y la reactividad cruzada de la PK sola con anti-PrP. Panel inferior: Después de la inmunotransferencia se tiñe la membrana con azul de Coomassie para confirmar que la digestión con la PK ha sido completa.

La figura 6 muestra el efecto inhibidor inducido por un anticuerpo policlonal anti-ApoBh sobre la replicación de priones en células sensibles a la infección por priones (ejemplo 2, apartado e).

Se cultivaron células sensibles nº60 infectadas de forma crónica en placas de cultivo de 24 pocillos en presencia de cantidades crecientes (0 a 2 mg/ml) de un anticuerpo policlonal de cabra contra la ApoB humana (Chemicon) o contra una serie correspondiente de IgG vírgenes de cabra. El nivel de replicación de la PrP se determinó mediante transferencia cuantitativa en mancha y se expresó como intensidad quimioluminiscente/mg de proteína. En el gráfico se expresa la intensidad quimioluminiscente para cada concentración de anticuerpo en porcentaje del valor obtenido sin el anticuerpo. Concentraciones más altas del anticuerpo anti-ApoBh presentan un efecto inhibidor sobre la replicación de PrP.

La figura 7 muestra separaciones bidimensionales de proteínas de balsas lipídicas procedentes de células N2a (ejemplo 3). Se aíslan balsas lipídicas de células sensibles a la infección por priones (nº60) y se precipitan 2 alícuotas de 25 !g con acetona y se procesan para el análisis bidimensional en la primera dimensión que abarca los intervalos de pH 3-10 (7A) o 6-11 (7B). Tras la separación por SDS-PAGE en la segunda dimensión se tiñeron los geles usando el kit "silver express" (Invitrogen). La flecha indica la misma proteína en ambos geles (7A y 7B) Se comparan las proteínas dentro del rectángulo mostrado en B de las balsas lipídicas del subclon sensible a la infección por priones nº60 (C) con las del subclon resistente nº23 (D). Las flechas indican proteínas que abundan más en las células resistentes.

Abreviaturas:

Apo B (apolipoproteína B); Apo E (apolipoproteína E); Apo J (apolipoproteína J); BCA (ácido bicinconínico); CHAPS (1propanosulfonato de 3-((3-colamidopropil)dimetilamonio)); SNC (sistema nervioso central); EEB (encefalopatía espongiforme bovina); ECJ (enfermedad de Creutzfeldt-Jakob); Dil (perclorato de 1,1-dioctadecil-3,3,3,3tetrametilindocarbocianina); MID (membrana insoluble en detergentes); DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco); MRD (membrana resistente a detergentes); DTT (1,4-ditio-D,L-treitol); IPG (gradiente de pH inmovilizado); IEF (isoelectroenfoque); SFB (suero fetal bovino); IFF (insomnio familiar fatal); GSS (enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker); h (hora); HRP (peroxidasa de rábano picante); kDa (kilodalton); LDL (lipoproteína de baja densidad); !g (microgramo); !l (microlitro); min (minuto); MBCD (metil-1-ciclodextrina); mM (milimolar); EM (espectrometría de masa); PBS (sulfato tamponado con fosfato); PK (proteína K); PMCA (amplificación cíclica de proteínas mal plegadas); PMSF (fluoruro de fenilmetanosulfonilo); PrP (proteína priónica); PrPC (confórmero normal no patógeno de la PrP); PrPSc (isoforma patógena o "tembladera" de la PrP, que también es el marcador de enfermedades priónicas); PVDF (poli(difluoruro de vinilideno)); RPM (revoluciones por minuto); RML (Rocky Mountain Laboratory); RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa); SDS (dodecilsulfato sódico); V (voltios); vol. (volumen).

EJEMPLOS

La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

Los siguientes ejemplos ilustran compuestos y métodos preferidos para determinar sus actividades biológicas. La PrP de la tembladera usada como inóculo infeccioso es la cepa RML (Rocky Mountain Laboratory). Los anticuerpos monoclonales anti-PrP 6H4 se adquirieron de Prionics.

La proteinasa K se obtuvo de Boehringer Ingelheim y la metil-1-ciclodextrina, de Sigma.

La apolipoproteína B (Apo B) y la apolipoproteína E (Apo E) humanas purificadas y exentas de lípidos se obtuvieron de Chemicon. Anti-apo B y anti-apo E son anticuerpos policlonales de cabra contra la Apo B humana y la Apo E humana,

respectivamente, obtenidos de Chemicon y dializados contra PBS para eliminar la azida sódica. La IgG total de cabra se adquirió de Pierce y se dializó contra PBS. La línea celular de neuroblastoma de ratón N2a se obtuvo de la ATCC. La Apo J murina (Apo J) se obtuvo internamente como se describe en el documento PCT/EP2004/05037. La LDL marcada con Dil se obtuvo de Molecular Probes (L-3482).

EJEMPLO 1: Replicación de priones in vitro en homogenado cerebral mediante el ensayo de PMCA:

La influencia del colesterol y de algunas de las apolipoproteínas sobre la replicación de priones in vitro se analiza mediante un ensayo de amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA) (Saborio y col., 2001) en el que se usa homogenado cerebral de hámster como fuente de PrPC y factores de conversión como sigue.

a) Preparación del cerebro:

Tras la decapitación se obtienen cerebros de hámsteres dorados de Siria sanos o infectados con la cepa de la tembladera adaptada 263 K que se congelan inmediatamente en hielo seco y se conservan a -80ºC hasta su uso. Los cerebros se homogeneizan en PBS que contiene inhibidores de proteasas (mezcla CompleteTM de Boehringer Mannheim) a una concentración final de 1x. Se añaden detergentes (Triton X-100 al 0,5%, SDS al 0,05%, concentraciones finales) y las muestras se clarifican por centrifugación a baja velocidad (10.000 g) durante 1 min usando una centrífuga de Eppendorf (modelo 5415).

Se añaden diluciones (3.200 veces y 12.800 veces) del homogenado cerebral de tembladera directamente al homogenado cerebral sano para desencadenar la replicación de priones. 60 !l de estas mezclas se congelan inmediatamente y otros 60 !l se incuban a 37ºC con agitación. Cada hora se realiza un ciclo de sonicación (5 pulsos de 1 s cada uno) usando un microsonicador (Bandelin Electronic, modelo Sonoplus) en el que la sonda se sumerge en la muestra y el nivel de energía se fija al 40%. Estos ciclos se repiten 10 veces.

b) Señal de PMCA en presencia y ausencia de un agente reductor de colesterol:

En estas condiciones se observa un drástico aumento en la intensidad de la señal de PrPSc después de 10 ciclos de PMCA (figura 1, carriles 2 y 3). Cuando se trata homogenado cerebral normal durante 30 min con metil-1-ciclodextrina (M1CD) 10 y 20 mM (pero no 5 mM), se observa una inhibición completa de la replicación de priones (figura 1, carriles 69), como se obtiene en modelos de ratón, en cultivos celulares e in vitro, lo que indica que la reducción de colesterol ejerce un efecto perjudicial sobre la replicación de los priones (Taraboulos y col., 1995).

c) Señal de PMCA en presencia de apolipoproteínas

A la preparación de PMCA sin ciclodextrina se añaden respectivamente Apo B humana (figura 2A) y Apo E humana (figura 2B) purificadas y exentas de lípidos a diferentes concentraciones (8 y 16 !g de ApoBh, 1 y 10 !g de ApoEh). Las muestras se incuban durante 15 min a 4ºC, y a continuación se congela la mitad de cada muestra y la otra mitad se somete a ciclos de PMCA.

Se observa un aumento de la replicación de priones in vitro tanto en la dilución del homogenado cerebral de tembladera de 3.200 veces como en la de 12.800 veces y tanto con Apo B como con Apo E.

Por el contrario, la adición de apolipoproteína J (a concentraciones de 1, 2 y 4 !g), un componente apolipoproteico de HDL, no presenta ningún efecto sobre la señal de PMCA (figura 2C).

Estos datos muestran el efecto de las apolipoproteínas B y E implicadas en la conversión de priones.

EJEMPLO 2: Replicación de priones in vitro en balsas lipídicas de células sensibles a la infección por priones mediante PMCA:

Se usa la línea celular de neuroblastoma de ratón N2a por su susceptibilidad a ser infectada con PrPSc. Baron y col., 2002 y Enari y col., 2001 han demostrado que existen sublíneas de N2a sensibles a la infección por priones y resistentes a la infección por priones. Se aíslan balsas lipídicas de la línea sensible a la infección por priones y se usan como sustrato para el ensayo de PMCA. El efecto de un antagonista de la apolipoproteína B en la conversión de priones se estudia a través de la capacidad que posee el antagonista de la apolipoproteína B para inhibir la capacidad de replicación de priones que presentan las líneas celulares N2a sensibles a la infección por priones.

a) Preparación de células N2a:

Se derivan subclones de la línea celular de neuroblastoma de ratón parental N2a a partir de células individuales mediante dilución límite. Un cultivo en crecimiento (medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM Gibco nº 41966-029) que contiene un 10% de suero fetal bovino (SFB) y está suplementado con L-glutamato 2 mM y antibióticos convencionales (penicilina y estreptomicina)) se diluye a una densidad de 5 células/ml, y se transfieren 100 !l a los pocillos individuales de una placa de 96 pocillos y se cultivan durante 1 semana.

Los cultivos individuales se examinan bajo microscopio para determinar aquellos pocillos que contienen un solo foco de células en crecimiento. Los cultivos derivados de una sola célula se transfieren después a placas de 24 pocillos y se someten cada 3 o 4 días a pases seriados a una dilución de 1:15 para conservar cultivos madre. Se aísla un total de 63 cultivos, y todos se ensayan respecto a su sensibilidad a la infección por la cepa RML de PrPSc. Para ello se añaden 4 !l de un extracto de cerebro al 10% infectado en fase tardía por pocillo de células recién sometidas a un pase y los cultivos se dejan durante otros 4 días para que alcancen una confluencia del 100%. A continuación, las células se someten a pases seriados en ausencia de PrPSc. Los ensayos muestran que toda traza del inóculo inicial desaparece tras el pase

4.

Los cultivos individuales se ensayan respecto a la presencia de PrPSc en este pase y en pases posteriores.

b) Aislamiento de células resistentes a la infección por priones mediante transferencia en mancha de cultivos celulares:

La presencia de PrPSc en los 63 cultivos de células individuales se ensaya mediante el procedimiento de transferencia en mancha de cultivos celulares, en el que la lisis y la digestión con proteinasa K (PK) se realizan directamente en la placa de cultivo. La PrPSc resistente a PK se detecta mediante transferencia en mancha a membranas de PVDF y exposición a un anticuerpo anti-PrP de la siguiente manera:

Las células infectadas se cultivan durante 3 o 4 días en placas de 24 pocillos y se lavan una vez con PBS. Se añaden a cada pocillo 40 !l de DNasa I (1.000 U/ml en H2O) a temperatura ambiente durante 5 min y, seguidamente, 40 !l de una solución de proteinasa K (20 !g/ml en Tris/HCl 100 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, 1% de Triton X-100, 1% de desoxicolato sódico). Las placas se incuban durante 1 h a 37ºC con agitación suave. La digestión con proteinasa K se detiene mediante la adición de 2 !l de una solución que contiene 80 !g/ml de PMSF, Tris-HCl 10 mM, pH 8,8, y 1 mg/ml de azul de bromofenol. Se aplican alícuotas de 20 !l en manchas sobre membranas de PVDF equilibradas con una solución desgasificada que contiene glicina 192 mM, Tris 25 mM, 20% de metanol. Después, las membranas se transfieren durante 10 min a tiocianato de guanidina 3 M, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, para desnaturalizar las proteínas, se lavan en agua y se procesan como para la inmunotransferencia usando anti-PrP 6H4 (Prionics). Las uniones inespecíficas se bloquean por incubación durante 1 h con leche disuelta al 5% en PBS. La membrana se expone después al anticuerpo primario específico anti-PrP 6H4 y, seguidamente, a un anticuerpo secundario conjugado con HRP, diluido cada uno de forma apropiada en PBS, 0,3% de Tween 20. Las inmunotransferencias se revelan mediante ECLTM (Amersham) según las instrucciones del proveedor.

La señal de quimioluminiscencia de las membranas se analiza después directamente usando Kodak Imagestation 440CF. La señal de luminiscencia se normalizó en cada condición por posibles diferencias en el crecimiento celular. El contenido total de proteínas en un lisado paralelo no tratado con proteinasa K se determina usando el ensayo BCA (Biorad), y los resultados se expresan como intensidad/!g de proteína.

De los 63 subclones analizados, 9 resultaron ser capaces de replicar la PrPSc, si bien con diferentes eficacias (figura 3). Los 54 subclones restantes eran resistentes a la infección. Se seleccionaron las líneas celulares más sensibles a la infección por priones para estudiarlas adicionalmente junto con varios subclones resistentes a la infección por priones con morfologías y tiempos de duplicación similares. Los autores han seleccionado dos de estas líneas celulares: nº23, un clon resistente a la infección por priones, y nº60, un clon sensible a la infección por priones.

Estas dos líneas celulares se han mantenido en cultivo durante más de un año y se han infectado con RML en muchas ocasiones diferentes a lo largo de este periodo: en cada ocasión, el subclon nº60 era altamente infectable mientras que el subclon nº23 era totalmente resistente. Los subclones sensibles a la infección por priones se pueden mantener como cultivo celular infectado de forma crónica mediante pases seriados a diluciones de 1:15 o 1:20 cada 3 o 4 días respectivamente.

No se han observado por microscopía diferencias morfológicas evidentes entre células resistentes o sensibles, ni entre células no infectadas e infectadas.

Para validar la relevancia clínica de este modelo celular de la replicación de PrP se inyectaron mediante inyección estereotáctica extractos de células N2a infectadas de forma crónica o tampón solo en el hipocampo de ratones normales. La inyección de extractos de N2a dio como resultado el inicio de los síntomas clínicos de la tembladera al cabo de 140 días y la muerte prematura, mientras que la inyección del testigo no tuvo efecto alguno sobre la fisiología o la supervivencia. Esto indica que el modelo basado en células para la replicación de priones usando células N2a sensibles a la infección por priones genera tembladera por PrP infecciosa, lo que confirma que la conversión de PrP en células es un buen modelo para el proceso que ocurre in vivo.

c) Aislamiento de balsas lipídicas:

Numerosos laboratorios (Simons y col., 2000; Hooper y col., 1999) han descrito procedimientos para el aislamiento de balsas lipídicas basados en la resistencia a la solubilización en Triton X-100 frío seguido de la flotación en gradientes de sacarosa. El aislamiento de balsas lipídicas de las dos líneas celulares seleccionadas anteriormente se realiza de la siguiente manera:

Se lavan cultivos subconfluentes de células N2a en PBS y se recogen por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min. Típicamente se combinan placas de 3 x 15 cm, lo que equivale a aproximadamente 8 x 107 células. Las células sedimentadas se resuspenden en 1 ml de tampón de balsas enfriado en hielo (Triton X-100 al 1% en PBS que contiene sulfato de cobre 10 !M y una mezcla de inhibidores de proteasas Complete (Boehringer)). Las células se rompen mediante siete pasadas a través de una aguja 22G y seguidamente se incuban durante 30 min a 4ºC con agitación suave. Se añaden 2 volúmenes de sacarosa al 60% en PBS y el lisado se transfiere a un tubo de centrífuga SW41. El lisado se cubre cuidadosamente con 7 ml de sacarosa al 35% y 1 ml de sacarosa al 15% en PBS y se centrifuga durante 20 h a 35.000 rpm. Las balsas lipídicas se recuperan en el 1 ml superior del gradiente. Las membranas se concentran por adición de 10 volúmenes de PBS frío y centrifugación a 100.000 g durante 2 h. De forma alternativa, para la electroforesis bidimensional en gel, las proteínas de la fracción de balsas lipídicas se recuperan en presencia de 5 vol. de acetona durante 2 h a -80ºC. Los precipitados de acetona se recogen por centrifugación a 14.000 g durante 20 min y se lavan dos veces en etanol al 70%.

Tanto en las células sensibles como en las resistentes, alrededor del 1 al 2% de las proteínas del lisado total se recupera en la fracción de balsa flotante. Como muestra la inmunotransferencia (figura 4A), mientras que la PrP es apenas detectable en el extracto celular total, está muy enriquecida en las balsas, dejando la capa de muestra totalmente exenta de PrP después de la centrifugación.

El clon nº60 sensible a la infección por priones y el clon nº23 resistente a la infección por priones se comparan mediante inmunotransferencia con anti-PrP (figura 4B). Se vuelven a incubar tres pares independientes diferentes de preparaciones de balsas que contienen cada una 50 !g de proteínas totales de balsa con un anticuerpo anti-actina, lo que confirma la uniformidad de la carga de proteína PrP (figura 4C).

Los resultados indican que el nivel de PrP en las preparaciones de balsas lipídicas procedentes de los dos tipos celulares es indistinguible. Además, la distribución entre las isoformas no glucosiladas, mono- y diglucosiladas, así como la segregación hacia la fracción de membrana resistente a detergentes mostrada en la figura 4A, es idéntica, lo que sugiere que ninguno de estos factores parece responsable de los fenotipos diferentes.

El ADNc de la PrP de ambas líneas celulares se amplificó por RT-PCR de la siguiente manera:

Se prepara ARN total de células N2a usando Trizol (Gibco) y el ADNc de la PrP de ratón se transcribe inversamente con Omniscript (Qiagen) usando el protocolo suministrado por el fabricante. El cebador específico para la síntesis de ADNc es 5' TCAATTGAAAGAGCTACAGGTG 3'. El ADNc priónico se amplifica usando las condiciones de PCR normales en presencia de los cebadores 5’ ACCAGTCCAATTTAGGAGAGCC 3’ (hebra superior) y 5’ AGACCACGAGAATGCGAAGG 3’ (hebra inferior). El producto de la PCR se secuenció por completo en el ABI3700 automático usando los reactivos y el protocolo suministrados por el fabricante.

Estos datos revelan que el ARNm de la PrP es el natural en ambos casos y que ambas llevan una metionina en la posición 129, que en los seres humanos es el sitio de polimorfismo frecuente.

Por lo tanto, los niveles de expresión, los patrones de glucosilación, la localización intracelular y las secuencias primarias de la PrPC en ambos tipos celulares son indistinguibles y, por consiguiente, son otros factores celulares los responsables de la diferente respuesta a la PrPSc.

d) Amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA) in vitro en balsas lipídicas de células sensibles a la infección por priones:

Las balsas lipídicas obtenidas en el apartado c se aíslan de los subclones sensibles a la infección por priones (subclones nº60), se recogen por centrifugación como se ha descrito anteriormente y se resuspenden en tampón de conversión para PMCA a una concentración de 2 a 2,5 mg/ml (PBS que contiene una concentración final de NaCl 300 mM, 0,5% de Triton X-100, 0,05% de SDS).

Un homogenado cerebral de ratón al 10% infectado con RML se añade directamente a la preparación de balsas a una dilución de 1:100, respecto al contenido de proteína, y alícuotas de la mezcla se congelan inmediatamente, se incuban durante 15 h a 37ºC o se someten a 15 ciclos de PMCA (5 pulsos de sonicación de 0,1 s, seguidos de una incubación de 1 h a 37ºC).

Después se tratan alícuotas de 20 !l de muestra con 10 !g/ml de proteinasa K durante 1 h a 37ºC. Los lípidos se eliminan precipitando las proteínas resistentes a PK con 5 vol. de acetona durante 2 h a -80ºC. Los precipitados de acetona se recogen por centrifugación a 14.000 g durante 20 min, se lavan dos veces en etanol al 70% y se analizan por inmunotransferencia con anti-PrP 6H4 (figura 5).

En comparación con la mezcla no tratada con PK (carriles 1 y 5), todas las muestras digeridas muestran una modificación del peso molecular característico de la forma truncada en el extremo terminal y resistente a la PK, PrP27-30. Cabe señalar que el anticuerpo 6H4 también presenta poca reactividad cruzada con la PK, que migra a 30 kDa, próxima a la forma diglucosilada de la PrP digerida con la PK. Teniendo esto en cuenta, el análisis de los datos muestra que el nivel inicial de la PrP resistente a PK procedente del extracto cerebral diluido, que está presente en las mezclas no amplificadas, es apenas detectable en estas condiciones (carriles 2).

Se observa un ligero aumento de la señal cuando la MRD sensible a la infección por priones (nº60) se incuba a 37ºC durante 15 h (carril 3 del nº60), aunque el mayor incremento de la PrP resistente a PK se observa cuando esta muestra se somete a 15 ciclos de PMCA (carril 4 del nº60). Esto indica que todos los factores necesarios para la conversión de PrPC en PrPSc residen en las balsas lipídicas de las células N2a sensibles a la infección por priones. Curiosamente, en el análisis paralelo en el que se usó la MRD de la línea celular nº23 resistente a la infección por priones, no se observó ninguna amplificación in vitro (carril 4 del nº23), lo que indica que la capacidad de las balsas lipídicas para convertir la proteína priónica in vitro refleja la actividad observada en las células intactas.

e) Efecto de un anticuerpo producido contra la apolipoproteína B sobre la replicación de priones en células N2a sensibles a la infección por priones:

Se cultivaron células sensibles infectadas de forma crónica en placas de 24 pocillos en presencia de un anticuerpo policlonal de cabra producido contra la Apo B humana (Chemicon) a concentraciones crecientes de 0 a 2 mg/ml en DMEM (Gibco nº 41966-029) que contenía los suplementos 1 x B27 (Gibco nº 17504-044) y antibióticos convencionales (penicilina y estreptomicina)

Se incubó una serie paralela de cultivos en presencia del mismo intervalo de concentraciones de IgG total de una cabra virgen. Los resultados muestran que concentraciones de anticuerpo anti-ApoBh superiores a 0,5 mg/ml dan lugar a una inhibición progresiva de la replicación de PrP, como lo revela la transferencia cuantitativa en mancha (figura 6).

Estos datos demuestran el papel de la apolipoproteína B en la conversión de priones.

EJEMPLO 3: Análisis proteómico de balsas lipídicas de células resistentes y sensibles a la infección por priones:

Puesto que las dos preparaciones celulares son indistinguibles en cuanto a su contenido en PrP, se realizó una comparación de proteínas más completa usando la electroforesis bidimensional en gel para mostrar diferencias en otras proteínas que pudieran subrayar la diferencia en la actividad de conversión entre los dos subclones.

Las preparaciones para el gel bidimensional se prepararon de la siguiente manera:

Las proteínas precipitadas con acetona (véase el apartado c) se resuspenden en 20 μl de SDS al 1%, DTT al 0,23% y se calientan a 95ºC durante 5 min. Una vez enfriada la preparación a temperatura ambiente, se añaden 25 !l de una solución (urea 9 M, CHAPS 4%, DTT 65 mM, base Tris 35 mM).

Quince minutos más tarde se añaden a la mezcla 85 !l de una solución que contiene urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS 4%, DTT 100 mM. Al cabo de otros 15 min, se elimina el material no solubilizado por centrifugación a 14.000 rpm durante 5 min y el sobrenadante se aplica directamente sobre una tira de IPG de 7 cm y se deja que se rehidrate durante la noche. Para el IEF se incrementa el voltaje progresivamente de 300 V a 3,5 kV y la electroforesis se realiza a un total de 20 kVh. Las proteínas se separan en la segunda dimensión usando geles de un solo pocillo con gradiente de 4-12% (Novex) y se tiñen con el kit Silver Express (Invitrogen) según las instrucciones suministradas.

El análisis mediante geles bidimensionales revela la fracción de proteínas que se recupera en las balsas lipídicas (aproximadamente 1-2% de proteína en el lisado de células N2a) como un subconjunto reproducible de proteínas celulares totales en el que se pueden visualizar varios cientos de especies por tinción con plata (figura 7A y B).

Se comparan los patrones bidimensionales de las preparaciones aisladas de células sensibles y resistentes a la infección por priones. El análisis se centra en varias proteínas identificadas en el intervalo básico del gel que abundan más en las MRD de células resistentes a la infección por priones (flechas en las figuras 7C y D).

Después de una electroforesis a escala preparativa, las dos proteínas señaladas con flechas se escindieron y se procesaron para la secuenciación mediante EM. Se obtuvo un péptido tríptico idéntico de ambas proteínas con una masa monisotópica de 1234,6. La secuencia N-terminal de este péptido tríptico es: ENFAGEATLQR (SEC ID Nº: 3). Todos los aminoácidos del péptido se identifican en el espectro de EM/EM de iones precursores de doble carga a m/z 618,30

y mediante su análisis Mascot.

La búsqueda en la base de datos identificó esta proteína sin lugar a dudas como apolipoproteína B (Apo B). Puesto que el peso molecular de la Apo B de longitud completa excede de los 500 kDa mientras que estas dos manchas migran con pesos moleculares estimados de 40 kDa y 30 kDa, los autores suponen que estos últimos son fragmentos generados en la célula o durante la preparación de las muestras. La secuencia corresponde a los aminoácidos 3548-3558 de la proteína Apo B humana, que solo están presentes en la ApoB-100 pero no en la forma truncada ApoB-48.

Estos datos sugieren que los fragmentos con un peso molecular de o aproximadamente de 30 a 40 kDa que comprenden la SEC ID Nº: 3 pueden desempeñar un papel en la ruta de conversión de priones.

EJEMPLO 4: Unión e internalización del receptor de LDL fluorescente en células resistentes y sensibles:

Los subclones de N2a nº23 (sensibles a la infección por priones) y nº 60 (resistentes a la infección por priones) se cultivaron durante 2 días en placas de 24 pocillos en medio DMEM convencional que contenía 10% de SFB y después se transfirieron durante 1 h al mismo medio (300 μl) que contenía 1% de SFB. Para visualizar la unión a la superficie celular, las placas se colocaron en hielo para inhibir la endocitosis y se añadieron 3 !l de Dil-LDL fluorescente (Molecular Probes) durante 30 min. La unión de LDL se visualizó mediante microscopía de fluorescencia. Para estudiar la captación de LDL en cada uno de los subclones, las células se incubaron antes del examen microscópico con 3 !l de Dil-LDL durante 2 h a 37ºC.

En paralelo se incubaron cultivos de control con LDL acetilada acoplada a Dil, que no se une al receptor de LDL, o con Hoechst para visualizar los núcleos celulares.

La unión o captación de Dil-LDL fluorescente es similar en las células resistentes a la infección por priones y en las sensibles a la infección por priones, lo que sugiere que el nivel del receptor de LDL es similar en estos dos tipos celulares.

Referencias

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Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Uso de apolipoproteína B en un ensayo para la detección de la formación de PrPSc en una muestra.

2. 2.

   Uso de apolipoproteína B en un ensayo de cribado para la identificación de compuestos que modulan la conversión de PrPC en PrPSc.

3. 3.

   Uso según las reivindicaciones 1 o 2, en el que la apolipoproteína B forma un complejo con el receptor de LDL.

4. 4.

   Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ensayo es un ensayo de amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA).

5. 5.

   Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ensayo es un ensayo de amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA) en el que se usa homogenado cerebral normal como fuente de PrPC normal y sustrato.

6. 6.

   Uso según las reivindicaciones de la 1 a la 5, en el que el ensayo es un ensayo de amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA) en el que se usan balsas lipídicas de la línea celular de neuroblastoma N2a sensible a infección como fuente de PrPC normal y sustrato.

7. 7.

   Uso de un anticuerpo producido contra la apolipoproteína B para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad priónica.

8. 8.

   Uso según la reivindicación 7, en el que la enfermedad priónica es la encefalopatía espongiforme bovina (EEB).

9. 9.

   Uso según la reivindicación 7, en el que la enfermedad priónica es la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ).

10. 10.

    Método para el diagnóstico o la detección de una enfermedad priónica en un sujeto que se sospecha sufre una enfermedad de este tipo, que comprende (i) poner una muestra de dicho sujeto en contacto con apolipoproteína B;

    (ii) poner la muestra obtenida en la etapa (i) en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC; y (iii) determinar la presencia y/o cantidad de PrPSc en dicha muestra.

11. 11.

    Método para la determinación de un marcador que predisponga a un sujeto a una enfermedad priónica, que comprende (i) medir el nivel de apolipoproteína B en una muestra; y (ii) correlacionar dicho nivel de proteína obtenido en dicha etapa de medición con la presencia de una enfermedad priónica.

12. 12.

    Método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11, en el que la enfermedad priónica es la encefalopatía espongiforme bovina (EEB).

13. 13.

    Método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11, en el que la enfermedad priónica es la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.

14. 14.

    Método para la detección de PrSc en una muestra, comprendiendo el ensayo (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B; (ii) poner la muestra obtenida en (i) en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPc; y

    (iii) determinar la presencia y/o cantidad de PrPSc en dicha muestra.

15. 15.

    Método para identificar en una muestra un compuesto que modula la transición de PrPC a PrPSc, que comprende: (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B (a) en presencia de dicho compuesto modulador y (b) en ausencia de dicho compuesto; (ii) poner las mezclas obtenidas en las etapas (i)a y (i)b en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC; y (iii) determinar la cantidad de PrPSc (a) en presencia de dicho compuesto modulador y (b) en ausencia de dicho compuesto modulador.

16. 16.

    Método para la detección de PrSc en una muestra, comprendiendo el ensayo (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B; (ii) poner la mezcla obtenida en la etapa (i) en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC; y (iii) determinar la presencia y/o cantidad de PrPSc en dicha muestra.

17. 17.

    Ensayo de cribado para identificar un compuesto que modula la transición de PrPC a PrPSc, que comprende: (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B (a) en presencia de dicho compuesto modulador y (b) en ausencia de dicho compuesto modulador; (ii) poner las mezclas obtenidas en las etapas (i)a y (i)b en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC; y (iii) determinar la cantidad de PrPSc (a) en presencia de dicho compuesto y

    (b) en ausencia de dicho compuesto modulador.

    Figura 7