ES2625529T3 - Biomarcador para trastornos neurológicos asociados a beta-amiloide - Google Patents
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Abstract
Método para diagnosticar enfermedad de Alzheimer, que comprende medir el nivel de una proteína MFG-E8 en una muestra de sangre, suero o plasma que va a obtenerse a partir de un sujeto humano o animal y comparar el valor medido resultante con respecto a un valor medido que va a obtenerse a partir de un control sano, en el que el valor medido del sujeto mayor que el del control indica que el sujeto tiene una alta posibilidad de presentar enfermedad de Alzheimer.
Description
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DESCRIPCION
Biomarcador para trastornos neurologicos asociados a beta-amiloide Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un metodo para diagnosticar enfermedad de Alzheimer y al uso de un reactivo de diagnostico y de un kit de prueba para este metodo.
Antecedentes de la tecnica
La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa progresiva y se caracteriza por la acumulacion de una protema fibrosa insoluble denominada p-amiloide en el cerebro. Se proponen diversos metodos para diagnosticar enfermedad de Alzheimer, incluyendo la deteccion de una protema particular en el lfquido cefalorraqmdeo, la deteccion de una protema o lipoprotema particular en la sangre o la deteccion de una mutacion genetica tal como polimorfismo genetico. Sin embargo, no se ha puesto en uso practico todavfa un metodo de diagnostico sencillo y eficaz que use sangre periferica.
El documento no de patentes 1: J Neuroimmune Pharmacol (2008) 3: 246-256. Silvestre et al., Nature Medicine, 11 (2005), 499 - 506 da a conocer composiciones que comprenden un anticuerpo anti-MFG-E8 y un reactivo para detectar una protema MFG-E8 unida al anticuerpo anti-MFG-E8.
Descripcion de la invencion
Un objeto de la presente invencion es proporcionar un biomarcador novedoso para diagnosticar neuropatfa asociada a p-amiloide tal como enfermedad de Alzheimer.
Los presentes inventores han llevado a cabo el examen de un grupo de protemas presentes en un sobrenadante de cultivo de un cultivo primario de celulas nerviosas de raton, que son un modelo de demencia, usando nanoliposomas magneticos que imitan a una biomembrana cerebral, y han identificado una protema MFG-E8 que se une a fosfatidilserina de manera dependiente de Ca2+. Los presentes inventores hallaron ademas que el nivel de la protema MFG-E8 esta aumentado en pacientes con enfermedad de Alzheimer y, por tanto, MFG-E8 puede representar un biomarcador para enfermedad de Alzheimer.
Por tanto, la presente invencion proporciona un metodo para diagnosticar enfermedad de Alzheimer que comprende medir el nivel de una protema MfG-E8 en una muestra de sangre, suero o plasma obtenida a partir de un sujeto humano o animal, en el que el valor medido se usa como marcador para el diagnostico de enfermedad de Alzheimer. Preferiblemente, el diagnostico de enfermedad de Alzheimer se realiza en un estadio en el que no se ha avanzado a una acumulacion de una protema p-amiloide. Preferiblemente, se mide el nivel de la protema MFG-E8 con un anticuerpo anti-MFG-E8.
La presente invencion proporciona tambien el uso de un reactivo de diagnostico para enfermedad de Alzheimer que comprende un anticuerpo anti-MFG-E8. La presente invencion proporciona ademas el uso de un kit de prueba para detectar enfermedad de Alzheimer que comprende un anticuerpo anti-MFG-E8 y un reactivo para detectar una protema MFG-E8 unida al anticuerpo anti-MFG-E8.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para seleccionar una sustancia candidata para un agente terapeutico para enfermedad de Alzheimer. El metodo comprende las etapas de administrar una sustancia de prueba a una celula modelo o un animal modelo de enfermedad de Alzheimer; medir la cantidad de una protema MFG-E8 en un medio de cultivo de la celula modelo o una muestra obtenida a partir del animal modelo; y seleccionar la sustancia de prueba como sustancia candidata para un agente terapeutico para enfermedad de Alzheimer cuando la cantidad de la protema MFG-E8 disminuye con la administracion de la sustancia de prueba en comparacion con la cantidad de la misma sin administracion.
Segun la presente invencion, la aparicion de enfermedad de Alzheimer puede diagnosticarse mediante un metodo sencillo.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra las estructuras de MFG-E8 murina y humana;
la figura 2 muestra los resultados de SDS-PAGE de una fraccion de un sobrenadante de cultivo que se une a nanoliposomas de manera dependiente de Ca2+;
la figura 3 muestra los resultados de la medicion del nivel de expresion de MFG-E8 mediante inmunotransferencia de tipo Western; y
la figura 4 muestra una curva ROC de concentracion de MFG-E8 en plasma para sujetos ancianos sanos frente a pacientes con EA.
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Realizaciones preferidas de la invencion
La presente invencion presenta un metodo para diagnosticar enfermedad de Alzheimer midiendo el nivel de expresion de MFG-E8 en una muestra de un sujeto tal como sangre de un sujeto humano.
MFG-E8 (factor EGF de globulos de grasa lactea 8) es una protema secretora tambien denominada lactoadherina, P47, Mfgm o SED1 (n.° GenBank NP_032620.2. n.° IPI, IPI00788387.1) y tiene dos dominios funcionales (dominio EGF N-terminal y dominio C2 C-terminal). Existen isoformas de tipo L (72 kDa, 61 kDa) y de tipo S (56 kDa, 48 kDa) y se notifica que el tipo L es una forma secretora (figura 1).
MFG-E8 contribuye a la fagocitosis de celulas apoptoticas en muchos tejidos. Se sabe que MFG-E8 es un factor regulador importante para la fagocitosis de celulas apoptoticas, que transmite la senal “eat-me” (fagocitosis) de celulas apoptoticas a macrofagos, fomenta la accion fagocitotica de macrofagos e inhibe completamente la accion fagocitotica a una cantidad en exceso en la sangre periferica. MFGE8 se une a PS en celulas apoptoticas asf como a integrina en macrofagos, y participa en la eliminacion de celulas apoptoticas por macrofagos, la involucion de las glandulas mamarias despues del periodo de lactancia, la fagocitosis de membranas de segmentos externos de fotorreceptores despues del desprendimiento de epitelios pigmentarios de la retina, y el aclaramiento de residuos de celulas apoptoticas intravasculares ateroescleroticas. Tambien se sabe que MFG-E8 fomenta interacciones intercelulares y participa en la union de espermatozoides y ovulos, el mantenimiento de epitelios epididimarios, la reparacion de epitelios intestinales, el fomento de ramificacion de conductos, la angiogenesis y el fomento de la funcion del exosoma de las celulas dendnticas.
Fuller et al. (J Neuroimmune Pharmacol (2008) 3: 246-256) estudiaron la cinetica de MFG-E8 usando una lmea celular derivada de la microglia y notificaron que las celulas de la microglia producen MFG-E8 en el cerebro y que MFG-E8 puede reconocer posiblemente celulas de neuroblastoma apoptoticas y desempenar un papel en la fagocitosis. Esto puede corresponder a la funcion en la que los macrofagos producen MFG-E8 en la sangre periferica y MFG-E8 reconoce celulas apoptoticas y transmite la informacion a macrofagos. Fullers et al. llevaron a cabo ademas experimentos y hallaron que ratones TG (ratones modelo de Alzheimer) que tienen los genes APP de la enfermedad de Alzheimer familiar humana tienen un nivel disminuido de MFG-E8 en el cerebro en comparacion con ratones normales. En este contexto, se interpreta que la perturbacion del control de MFG-E8 puede desempenar algun papel en la progresion de la enfermedad de Alzheimer. De manera similar, Boddaert J et al. (Am J Pathol (2007) l70: 921-929) tambien mostraron la expresion disminuida de ARNm de MFG-E8 en el cerebro de sujetos con enfermedad de Alzheimer en comparacion con el cerebro de sujetos de edad coincidente.
Por el contrario, los presentes inventores han hallado en un experimento de inmunotincion que no se observaba acumulacion de Ap y MFG-E8 en el cerebro de ratones normales (12 meses de edad) y MFG-E8 se acumulaba en el mismo sitio que el sitio de acumulacion de Ap en el cerebro de ratones modelo con enfermedad de Alzheimer (12 meses de edad). Esto significa que los resultados de los presentes inventores se oponen completamente a los resultados de Fuller et al. y Boddaert et al., cuyo motivo puede ser la diferencia en los anticuerpos usados; sin embargo los detalles no estan claros. Antes de este hallazgo, los presentes inventores tambien hallaron que el nivel de MFG-E8 en la sangre periferica tambien era significativamente alto en pacientes con enfermedad de Alzheimer, tal como se muestra espedficamente en los ejemplos a continuacion en el presente documento. MFG-E8 observado en la sangre periferica tambien puede ser posiblemente MFG-E8 que se ha acumulado en el mismo sitio que el sitio de acumulacion de Ap y se ha escapado. Algunos estudios sugirieron que se eleva la permeabilidad desde la sangre al cerebro en la barrera hematoencefalica en pacientes con enfermedad de Alzheimer; sin embargo la extension esta limitada. La permeabilidad desde el cerebro a la sangre sigue sin estar clara. Por tanto, es poco probable que MFG- E8 observado en el sitio de acumulacion de Ap contribuya directamente a la concentracion de MFG-E8 en la sangre mas alla de la barrera hematoencefalica. El mecanismo detallado de la correlacion entre el nivel aumentado de MFG-E8 y la enfermedad de Alzheimer hallada en la presente invencion todavfa no esta claro.
La muestra de sujeto que va a analizarse para determinar el nivel de la protema MFG-E8 puede incluir lfquido corporal, sangre, suero y plasma obtenidos a partir de un sujeto humano o animal. Por el motivo descrito anteriormente, el lfquido cefalorraqrndeo no es adecuado como muestra.
La cantidad de la protema MFG-E8 en la muestra obtenida a partir del sujeto puede medirse mediante inmunoensayos bien conocidos en la tecnica usando un anticuerpo anti-MFG-E8. El anticuerpo anti-MFG-E8 puede ser monoclonal o policlonal. Diversos anticuerpos anti-MFG-E8 monoclonales y policlonales estan disponibles comercialmente y pueden usarse para la presente invencion. Alternativamente, el anticuerpo puede prepararse segun un metodo bien conocido en la tecnica.
La protema MFG-E8 en la muestra obtenida a partir de un sujeto humano o animal se mide mediante un inmunoensayo que usa el anticuerpo anti-MFG-E8. La medicion puede ser cualitativa o cuantitativa. El nivel de expresion de MFG-E8 en la muestra obtenida a partir de un sujeto puede someterse a ensayo de manera inmunologica mediante, por ejemplo, radioinmunoensayo, ensayo ELISA, inmunocromatograffa,
inmunoprecipitacion, inmunoaglutinacion e inmunotransferencia de tipo Western. Alternativamente, la medicion puede llevarse a cabo con un biosensor utilizando el fenomeno de resonancia de plasmones superficiales.
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Como ejemplo tipico, puede llevarse a cabo un ensayo ELISA tipo sandwich tal como sigue. Se anade plasma preparado a partir de sangre periferica ex^da de un sujeto a una placa o un chip sobre el que se ha inmovilizado un anticuerpo anti-MFG-E8 y se incuba durante un periodo de tiempo apropiado. Se lava la placa o el chip para retirar los componentes no unidos seguido por la adicion de un segundo anticuerpo anti-MFG-E8. El segundo anticuerpo puede marcarse con un marcador detectable, tal como una enzima, un colorante fluorescente, una sustancia quimioluminiscente, biotina, una sustancia radiactiva. Despues de incubacion durante un periodo de tiempo apropiado, se lava la placa o el chip y se mide la fluorescencia, luminiscencia o radiactividad para detectar el marcador. Alternativamente, despues de la union del anticuerpo anti-MFG-E8, puede anadirse un anticuerpo secundario (por ejemplo, anticuerpo de cabra anti-raton) con el fin de potenciar la senal. El anticuerpo secundario puede marcarse con un marcador detectable, tal como una enzima, un colorante fluorescente, una sustancia quimioluminiscente, biotina, una sustancia radiactiva. De esta manera, puede medirse la cantidad de la protema MFG-E8 en el plasma obtenido a partir de un sujeto.
En otro aspecto, la protema MFG-E8 puede detectarse mediante un metodo de deteccion que utiliza una reaccion de aglutinacion. En el metodo, puede unirse un anticuerpo anti-MFG-E8 a un portador, por ejemplo partmulas de latex para detectar MFG-E8. Las partmulas de latex que portan el anticuerpo anti-MFG-E8 se mezclan con una muestra y se incuban durante un determinado periodo de tiempo. Las partmulas se aglutinaran cuando la muestra contenga MFG-E8. El grado de aglutinacion puede observarse visualmente o cuantificarse con un espectrofotometro para detectar MFG-E8 en la muestra.
La presente invencion proporciona tambien un reactivo de diagnostico para enfermedad de Alzheimer que comprende un anticuerpo anti-MFG-E8. El reactivo de diagnostico para enfermedad de Alzheimer de la presente invencion puede proporcionarse en forma de un kit de prueba. El kit de prueba comprende un reactivo para detectar MFG-E8, por ejemplo el anticuerpo anti-MFG-E8 como sustancia activa. El kit tambien puede comprender reactivos apropiados requeridos para las mediciones, por ejemplo, tampones, diluyentes, disoluciones de terminacion de la reaccion, disoluciones de lavado y patrones de control.
En la presente invencion, la cantidad de la protema MFG-E8 asf medida puede usarse como marcador para enfermedad de Alzheimer. Espedficamente, se mide la cantidad de la protema MFG-E8 en una muestra obtenida a partir de un sujeto humano o animal, el valor medido resultante se compara con un valor medido obtenido a partir de un control sano. Cuando el valor medido del sujeto es mayor que el del control, se diagnostica que el sujeto humano o animal tiene una alta posibilidad de presentar enfermedad de Alzheimer. El desarrollo de la enfermedad de Alzheimer tambien puede monitorizarse con el metodo de la presente invencion. La cantidad de la protema MFG-E8 se mide en muestras obtenidas a partir de un sujeto humano o animal en multiples puntos de tiempo, y un aumento de los valores medidos resultantes con el tiempo indica la progresion de la enfermedad de Alzheimer y una disminucion indica la mejora de la enfermedad de Alzheimer. El transcurso del tratamiento puede monitorizarse mediante el metodo con el fin de determinar la eficacia terapeutica.
Segun el metodo de la presente invencion, puede diagnosticarse enfermedad de Alzheimer basandose en el nivel de la protema MFG-E8 en la sangre como marcador sin extraer lfquido cefalorraqrndeo. Tal como se muestra en los ejemplos a continuacion en el presente documento, el nivel de expresion de MFG-E8 en el plasma de pacientes con enfermedad de Alzheimer esta aumentado significativamente en comparacion con sujetos de control sanos. El metodo diagnostico de la presente invencion es util para un diagnostico precoz de enfermedad de Alzheimer (diagnostico en un estadio inicial en el que no se ha avanzado a una acumulacion de la protema p-amiloide), un diagnostico definitivo de la aparicion, una monitorizacion del transcurso de la enfermedad, una determinacion de la eficacia terapeutica y un pronostico.
En otro aspecto de la presente invencion, puede seleccionarse una sustancia candidata para un agente terapeutico para enfermedad de Alzheimer basandose en el nivel de expresion de la protema MFG-E8 como marcador. El examen se lleva a cabo administrando una sustancia de prueba a una celula modelo o un animal modelo para detectar enfermedad de Alzheimer, por ejemplo un cultivo primario de celulas nerviosas de raton o un raton TG al que se le administra el peptido AP42 citotoxico, y midiendo el nivel de la protema MFG-E8 en un medio de cultivo de la celula modelo o una muestra obtenida a partir del animal modelo. La sustancia de prueba usada para el examen puede incluir diversos anticuerpos y productos qrnmicos sinteticos. La sustancia de prueba puede obtenerse a partir de, por ejemplo, bibliotecas tales como diversas bibliotecas de productos qrnmicos naturales o sinteticos, bibliotecas combinatorias, bibliotecas de oligonucleotidos y bibliotecas de peptidos. La sustancia de prueba pueden ser extractos de sustancias naturales tales como bacterias, hongos, algas, plantas y animales o productos parcialmente purificados de los mismos. La sustancia de prueba puede seleccionarse como sustancia candidata para un agente terapeutico para enfermedad de Alzheimer cuando el nivel de la protema MFG-E8 disminuye con la administracion de la sustancia de prueba en comparacion con el nivel de la misma sin administracion. Por tanto, el metodo de prueba de la presente invencion proporciona una plataforma para el desarrollo de metodos terapeuticos novedosos de la enfermedad de Alzheimer.
La presente invencion se describira en detalle a continuacion por medio de los ejemplos, sin embargo la invencion no esta limitada por estos ejemplos.
Ejemplo 1
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Investigacion de biomarcadores para neuropatia asociada a p-amiloide (Ap)
Se administro el peptido AP42 citotoxico a un raton y se uso un cultivo primario de celulas nerviosas de raton como modelo de demencia. Se examinaron los candidatos a biomarcadores para la neuropatfa asociada a p-amiloide usando nanoliposomas magneticos que imitan a una biomembrana cerebral. AP42 es uno de los productos finales generados despues de la escision de la protema precursora de amiloide (APP; 150 kD) con tres enzimas, que tiene la citotoxicidad mas intensa y se ha usado para diversos estudios.
Se estimularon celulas de cultivo primario de telencefalo de raton (5 x 106 / placa de 10 ml) con AP42 (0,1 pM) durante 24 horas. Las condiciones seleccionadas fueron a baja concentracion durante un corto tiempo con el fin de proporcionar citotoxicidad leve asf como con la suposicion del estado del estadio inicial de la enfermedad de Alzheimer. Concretamente, se seleccionaron la concentracion de 0,1 pM y un periodo de 24 horas de modo que se evitase la apoptosis o necrosis celular. Se usaron celulas sin estimulacion con Ap42 como control. Se trato el sobrenadante de cultivo de celulas con EGTA (concentracion final: 5 mM) y se combino una determinada cantidad del mismo, que luego se concentro desde 10 ml hasta 1 ml mediante ultrafiltracion con un filtro Amicon Ultra-15 de LPMN de 3.000. Se le anadio al sobrenadante concentrado 1 mg de nanoliposomas y CaCl2 (concentracion final: 10 mM), se ajusto el pH con HEPES 0,5 M (pH 7,5) y se permitio que reaccionase en un rotor a 4°C durante 1,5 horas. Despues de la reaccion, se quelo Ca2+ con EGTA, se separaron las protemas de los nanoliposomas para obtener una fraccion que se unio a un fosfolfpido acido (fosfatidilserina) de manera dependiente de Ca2+.
El principio y procedimientos detallados para el metodo de mezclado de una muestra y liposomas en presencia de iones de calcio y separacion de una protema de union a liposomas con un agente quelante se dan a conocer en la solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el publico n.° 2008-020383. Los nanoliposomas son partmulas finas magneticas modificadas en la superficie con un polfmero termosensible y un fosfolfpido y que pueden formar una estructura de tipo liposoma en una disolucion acuosa. El principio y la estructura de los nanoliposomas se ilustran espedficamente en la solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el publico n.° 2010-066200. Cuando se mezclan los nanoliposomas con una muestra en una disolucion acuosa, un componente de union a fosfolfpidos en la muestra se unira a los nanoliposomas, que luego se recogen con ayuda de variacion de la temperatura y magnetismo para permitir la recogida simplificada del componente de union a fosfolfpidos.
El fosfolfpido usado en el presente documento fue fosfatidilserina. La fosfatidilserina es uno de los lfpidos que constituyen la membrana celular. Habitualmente se ubica internamente en la membrana celular mientras que se exponen de manera externa a las celulas cuando las celulas experimentan apoptosis. Por tanto, se cree que las protemas asociadas a apoptosis pueden identificarse mediante el examen de protemas que se unen a fosfatidilserina.
Se separo la fraccion asf obtenida a partir del sobrenadante de cultivo que se unio a nanoliposomas de manera dependiente de Ca2+, mediante SDS-PAGE unidimensional y tincion con plata. Se muestran los resultados en la figura 2.
A continuacion, se dividio el gel en 10 secciones en las posiciones mostradas con las flechas en la figura 2 y se sometieron a una digestion en gel con tripsina para recoger peptidos, que luego se analizaron mediante espectrometna de masas. Entre las 100 mejores protemas de union a nanoliposomas identificadas, se analizaron las que teman un nivel de expresion aumentado despues de estimulacion con Ap, y se identifico MFG-E8 (isoforma 1 de protema de factor EGF de globulos de grasa lactea 8) como protema marcadora candidata.
Ejemplo 2
Analisis de inmunotransferencia de tipo Western
Se analizo la diferencia en el nivel de expresion de MFG-E8 a nivel de protema mediante inmunotransferencia de tipo Western.
El material usado fue una fraccion de union a nanoliposomas al 100% de PS obtenida a partir de un sobrenadante de cultivo que procedfa de un lote diferente del lote usado para el analisis mediante espectrometna de masas. Se separo la fraccion mediante electroforesis (gel Ready de Bio Rad (del 5 al 15%)) y se transfirio a una membrana de PVDF (9 V, 16,5 horas (aproximadamente 150 Vh)). Se uso un anticuerpo de hamster anti-MFG-E8 de raton (MBL International Corporation) como anticuerpo primario para la reaccion a 1 pg/ml durante 2 horas (temperatura ambiente) y se uso una IgG de cabra anti-hamster conjugada con HRP (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) a una dilucion en 1000 veces como anticuerpo secundario para la reaccion durante 1 hora (temperatura ambiente). Se llevo a cabo la deteccion con un agente de exposicion de PIERCE durante un periodo de exposicion de 3 minutos.
Se muestran los resultados en la figura 3. Se considero que la senal obtenida correspondfa a la forma larga de MFG- E8 (isoforma 1) basandose en su peso molecular. Tambien se observo la diferencia significativa a nivel de protema, en el que la banda detectada en el carril para la muestra estimulada con AP42 (0,1 pM) era mas intensa que la banda detectada para el control (sin estimulacion).
Ejemplo 3
Medicion de la concentracion de MFG-E8 en plasma de pacientes con enfermedad de Alzheimer.
Se midio la concentracion de MFG-E8 mediante ensayo ELISA en el plasma de pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA) y sujetos ancianos sanos a las edades correspondientes.
5 Se preparo el plasma de 20 sujetos ancianos sanos y 20 pacientes con EA y se llevo a cabo el ELISA con un anticuerpo anti-MFG-E8 y un kit para ELISA para el factor EGF de globulos de grasa lactea humano 8 (USCN Life Science Inc.) siguiendo los procedimientos segun las instrucciones adjuntas al kit. Se diluyeron las muestras 10 veces. Despues de medirse la concentracion, se llevo a cabo el analisis estadfstico con JMP.
La figura 4 muestra la curva ROC de la concentracion de MFG-E8 en el plasma de sujetos ancianos sanos frente a 10 pacientes con EA (positivo: EA). El area bajo la curva ROC fue de 0,72000, lo que indica una diferencia significativa.
Estos resultados demuestran que MFG-E8 estaba presente en el medio de cultivo de las celulas nerviosas cerebrales de raton estimuladas con AP42 y se detecto a un nivel mayor en el plasma de pacientes con EA que en los de sujetos sanos.
Aplicabilidad industrial
15 La presente invencion es util para el diagnostico de enfermedad de Alzheimer.
Claims (5)
- REIVINDICACIONES1. Metodo para diagnosticar enfermedad de Alzheimer, que comprende medir el nivel de una protema MFG-E8 en una muestra de sangre, suero o plasma que va a obtenerse a partir de un sujeto humano o animal y comparar el valor medido resultante con respecto a un valor medido que va a obtenerse a partir de un5 control sano, en el que el valor medido del sujeto mayor que el del control indica que el sujeto tiene una altaposibilidad de presentar enfermedad de Alzheimer.
- 2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que se realiza el diagnostico de enfermedad de Alzheimer en un estadio en el que no se ha avanzado a una acumulacion de una protema p-amiloide.
- 3. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que se mide el nivel de la protema MFG-E8 con un anticuerpo anti-10 MFG-E8.
- 4. Uso de un reactivo de diagnostico que comprende un anticuerpo anti-MFG-E8 para un metodo segun la reivindicacion 1.
- 5. Uso de un kit de prueba que comprende un anticuerpo anti-MFG-E8 y un reactivo para detectar una protema MFG-E8 unida al anticuerpo anti-MFG-E8 para un metodo segun la reivindicacion 1.15 6. Metodo para seleccionar una sustancia candidata para un agente terapeutico para enfermedad deAlzheimer, que comprende las etapas de:administrar una sustancia de prueba a una celula modelo o un animal modelo de enfermedad de Alzheimer;medir la cantidad de una protema MFG-E8 en un medio de cultivo de la celula modelo o una muestra obtenida a partir del animal modelo; y20 seleccionar la sustancia de prueba como sustancia candidata para un agente terapeutico para enfermedadde Alzheimer cuando la cantidad de la protema MFG-E8 disminuye con la administracion de la sustancia de prueba en comparacion con la cantidad de la misma sin administracion.
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