ES2415760T3 - Supresión de cáncer - Google Patents

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Philip Lecane
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Keith Foster
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Abstract

Un polipéptido para su uso en la supresión o tratamiento de cáncer mediante la inhibición de lasecreción de una célula cancerosa en un paciente, en el que el polipéptido comprende: (i) una proteasa no citotóxica, proteasa que puede escindir una proteína SNARE expresada en dicha célulacancerosa; (ii) un resto que elige diana (TM) que puede unirse a un sitio de unión sobre una célula cancerosa, sitio de unión quepuede someterse a endocitosis para incorporarse en un endosoma dentro de la célula cancerosa; y (iii) un dominio de translocación que puede translocar la proteasa de dentro de un endosoma, a través de lamembrana endosómica y en el citosol de la célula cancerosa; en el que el polipéptido carece de la función de unión natural de un dominio HCC de neurotoxina clostridial quepermite que la neurotoxina clostridial se una a terminaciones nerviosas en la unión neuromuscular; con la condición de que la célula cancerosa no sea una célula tumoral neuroendocrina; y con la condición de que el polipéptido no sea una molécula de neurotoxina clostridial que se produce naturalmente.

Description

Supresión de cáncer
5 [0001] La presente invención se refiere a la supresión de cáncer.
[0002] Los cánceres están constituidos por células que dividen e invaden y sobreviven de un modo anómalo en el cuerpo. Los cánceres se desarrollan cuando alteraciones al ADN dentro de células afectan el control de la división celular y otros procesos relevantes para la supervivencia de las células. A medida que crecen los tumores 10 cancerosos, invaden los tejidos del cuerpo que los rodean. Esto es peligroso para el cuerpo, ya que daña tejidos normales circundantes y tiene un efecto significativo sobre las respuestas fisiológicas. Además, los cánceres pueden diseminarse a otras partes del cuerpo y desarrollar tumores secundarios. La evaluación del cáncer puede realizarse usando una variedad de pruebas que incluyen TAC, RMN, TEP, tomografía de TEP-TAC combinado y pruebas de ultrasonidos. Generalmente, cuando más pronto se detecte y confirme un cáncer, mejor será el pronóstico global
15 para el paciente.
[0003] Está disponible una amplia gama de tratamientos para pacientes diagnosticados con cáncer. Estos incluyen una variedad de intervenciones quirúrgicas, radioterapia, quimioterapia y terapias con hormonas. Estos tratamientos pueden usarse en aislamiento, pero más comúnmente se usan en combinación entre sí. El uso de una 20 combinación de terapias depende del tipo de cáncer diagnosticado, requiriendo comúnmente ciertos cánceres (tales como cáncer de mama) múltiples intervenciones terapéuticas. Hay una variedad de nuevos enfoques terapéuticos en desarrollo que utilizan productos biológicos que incluyen anticuerpos, inmunoterapias y técnicas de vacunación para tratar cáncer. Están en desarrollo enfoques de tratamiento adicionales que incluyen el uso de terapéuticos novedosos diseñados para bloquear la angiogénesis. Los enfoques novedosos que incluyen el uso de terapia génica
25 también están siendo investigados como posibles terapéuticos. Sin embargo, a pesar de los significativos esfuerzos científicos y el enorme compromiso financiero por desarrollar nuevas terapias contra el cáncer, el pronóstico para muchos pacientes sigue siendo extremadamente malo.
[0004] El cáncer de mama es el cáncer más común en el Reino Unido y cada año son diagnosticadas más de
30 44.000 mujeres con este tipo de cáncer. En el mundo, más de un millón de mujeres son diagnosticadas con cáncer de mama cada año. En el Reino Unido, aproximadamente el 80% de las pacientes sobrevivirán durante 5 años o más.
[0005] El cáncer de pulmón es el 2º cáncer más común en el Reino Unido y más de 37.000 personas fueron
35 diagnosticadas con cáncer de pulmón en el Reino Unido en 2003. Para pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón, solo aproximadamente el 20% sobrevivirán durante al menos 1 año después del diagnóstico, y solo aproximadamente el 6% vivirá durante 5 años o más después del diagnóstico.
[0006] El cáncer colorrectal es el 3º tipo de cáncer más común en general y es el 2º más común que afecta a
40 las mujeres (después del cáncer de mama). Precisamente más de 35.000 personas fueron diagnosticadas con cáncer colorrectal en el Reino Unido en 2003. De aquellos diagnosticados con cáncer intestinal y rectal en Inglaterra y Gales, el 46% sobrevivirá durante al menos 5 años después de su diagnóstico.
[0007] El cáncer pancreático es la cuarta causa más común de muerte por cáncer en el mundo occidental y
45 más de 7000 casos se diagnostican en el Reino Unido cada año. A pesar de los avances terapéuticos, solo el 3-4% de aquellos diagnosticados con cáncer pancreático sobreviven durante 5 años o más y la intervención terapéutica satisfactoria está limitada a cirugía que solo es aplicable al 15% de los pacientes.
[0008] El cáncer renal es el 9º tipo de cáncer más común en general con más de 7000 nuevos casos
50 diagnosticados y más de 3500 muertes en el Reino Unido cada año. Aproximadamente 208.500 nuevos casos de cáncer renal son diagnosticados en el mundo cada año, representando precisamente menos del 2% de todos los cánceres. Es más común en hombres que en mujeres, con una relación de hombres con respecto a mujeres de 1,5:1. El treinta por ciento de los pacientes con cáncer renal muestra signos de carcinoma de células renales avanzado en el diagnóstico inicial, con metástasis detectadas en el 15-25% de los pacientes en la actualidad.
55 [0009] El cáncer representa un problema mundial que se predice que crecerá significativamente. En el año 2000, los tumores malignos fueron responsables del 12 por ciento de los casi 56 millones muertes informadas en el mundo de todas las causas. En algunos países, más de un cuarto de las muertes podría atribuirse al cáncer. En 2000, 5,3 millones de hombres y 4,7 millones de mujeres desarrollaron un tumor maligno y en total 6,2 millones murieron de la enfermedad. Se predice que las tasas de cáncer podrían aumentar adicionalmente el 50% a 15 millones de nuevos casos en el año 2020, (WHO World Cancer Report (IARC, Ed B.W. Stewart y P. Kleihues, 2003).
[0010] Para un gran número de cánceres se cree que la señalización autocrina (definida como un modo de
5 acción de hormonas en el que una hormona se une a receptores y afecta la función del tipo de célula que la produjo) y/o la señalización paracrina (definida como un modo de acción de hormonas en el que la hormona liberada de células endocrinas o similares a endocrinas se une a receptores sobre células próximas y afecta su función) desempeñan una función significativa en el desarrollo del estado de enfermedad. Para un cáncer dado, múltiples bucles de señalización autocrina pueden participar en el desarrollo y mantenimiento del estado de cáncer. Además
10 de proporcionar un estímulo para la división celular, la señalización autocrina puede potenciar la supervivencia de células, actuando para proteger las células de mecanismos de apoptosis y necrosis y aumentar el potencial metastásico de la célula cancerosa.
[0011] Por tanto, existe la necesidad en la materia de nuevas terapias/terapéuticos que puedan tratar
15 específicamente cáncer. Esta necesidad es tratada por la presente invención, que resuelve uno o más de los problemas anteriormente mencionados.
[0012] El documento WO 2008/105901 describe toxinas clostridiales modificadas con capacidad de translocación potenciada y actividad de elección de diana potenciada.
20 [0013] El documento WO 2006/026780 describe toxinas clostridiales degradables.
[0014] El documento US 2008/161543 describe toxinas clostridiales modificadas con capacidades de elección de diana alteradas para células diana de toxina clostridial.
25 [0015] El documento WO 2004/076634 describe la translocación de la membrana celular de inhibidores de SNARE regulados, composiciones para los mismos y procedimientos para el tratamiento de enfermedad.
[0016] El documento US 2005/031648 describe procedimientos para tratar diversos cánceres.
30 [0017] El documento WO 2006/094539 describe procedimientos y composiciones para el tratamiento de cáncer.
[0018] El documento WO 02/09743 describe procedimientos para tratar una neoplasia.
35 [0019] El documento WO 2009/150469 describe la supresión de enfermedades neuroendocrinas.
[0020] El documento WO 2009/150470 describe la supresión de cánceres.
40 [0021] La presente invención proporciona polipéptidos, y usos de los mismos, como se define en las reivindicaciones.
[0022] El polipéptido de la presente invención no es una molécula de neurotoxina clostridial que se produce naturalmente (también conocida como holotoxina clostridial). La holotoxina clostridial es una de las neurotoxinas
45 más letales conocidas para el hombre y, como tal, tiene limitaciones significativas como molécula terapéutica. Por tanto, en el contexto del cáncer, la holotoxina clostridial está asociada a elección como diana fuera del emplazamiento no deseable (es decir, elección de diana de no células cancerosas), por ejemplo, a la unión neuromuscular.
50 [0023] En uso, un polipéptido de la invención se une a una célula cancerosa. Después, el componente de translocación efectúa el transporte del componente de proteasa en el citosol de la célula cancerosa. Finalmente, una vez dentro, la proteasa inhibe el proceso de fusión exocítica de la célula cancerosa escindiendo la proteína SNARE presente en el citosol de la célula cancerosa. Así, inactivando el aparato de fusión exocítica de la célula cancerosa, el polipéptido de la invención inhibe la secreción (por ejemplo, de TNF-alfa, acetilcolina, factor de crecimiento
55 fibroblástico, péptido liberador de gastrina, interleucina-6, VEGF y/o factor de movilidad autocrino) de las mismas. Por consiguiente, cuando dichos péptidos de secreción, por ejemplo, participan en la señalización autocrina o paracrina, el polipéptido de la invención reduce el accionamiento de la señalización que de otro modo el bucle autocrino/paracrino proporcionaría a la célula cancerosa. Por consiguiente, los polipéptidos de la presente invención pueden suprimir o tratar cáncer.
[0024] La memoria descriptiva describe un procedimiento correspondiente para suprimir cáncer, comprendiendo dicho procedimiento administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de la presente invención a un paciente. La presente invención proporciona así un medio eficaz para tratar cáncer tal como
5 renal, de mama, de pulmón, pancreático y colorrectal (por ejemplo, de colon).
[0025] Los polipéptidos de la presente invención proporcionan una ventaja distinta con respecto a otros terapéuticos porque tienen el potencial para inhibir la secreción de múltiples péptidos autocrinos y paracrinos de una célula cancerosa elegida como diana usando una única molécula terapéutica. Esto reduce significativamente la
10 capacidad de un cáncer para adaptarse a una pauta de tratamiento específica cambiando a y usando rutas de señalización autocrina alternativas. Así, la presente invención proporciona una terapia más eficaz bloqueando múltiples rutas simultáneamente.
[0026] La principal célula diana de la presente invención es una célula cancerosa, por ejemplo, una célula
15 cancerosa que secreta una o más hormonas (u otras moléculas bioactivas) que, una vez secretadas, se unen a un receptor y afectan la función de dicha célula cancerosa. Ejemplos de células cancerosas elegidas como diana por la presente invención incluyen: de mama, pulmón, pancreáticas, colorrectales (por ejemplo, de colon), adrenales, esofágicas, de linfoma (por ejemplo, linfocitos B; célula del manto), de leucemia (por ejemplo, mieloma múltiple), de leucemia aguda, de vejiga, hueso, tumores cerebrales, de intestino, cuello uterino, de leucemia linfocítica crónica,
20 linfoma de Hodgkin, renales, de hígado, piel (por ejemplo, basales, escamosas, de melanoma), orofaríngeas, de mieloma, próstata (por ejemplo, sarcoma de tejidos blandos), gástricas, testiculares y uterinas.
[0027] En una realización, la célula diana de la presente invención es una célula cancerosa en la que el nivel de expresión de proteínas SNARE es no deseable.
25 [0028] Por ejemplo, la expresión de SNARE no deseable puede producirse cuando la expresión de una proteína SNARE está regulada por incremento cuando se compara con el mismo tipo de células (o muy similar) cuando está en un estado no canceroso. En una realización, el ARNm que codifica una proteína SNARE está regulado por incremento en una célula cancerosa diana. En otra (o la misma) realización, la concentración celular de
30 proteína de una proteína SNARE (también) disminuye en la célula cancerosa diana. Cuando se miden niveles de ARNm o de proteína SNARE, un valor de 'uno' puede asignarse a la concentración de ARNm o proteína SNARE en una célula no cancerosa de un individuo normal, célula que es de otro modo la misma (o muy similar) al tipo de célula de la célula cancerosa en cuestión - este valor de podría describirse como un 'nivel de expresión basal ', y es normalmente un promedio de los valores del nivel de expresión obtenidos de varias células (del mismo tipo o muy
35 similar) y/o de individuos normales diferentes. Por ejemplo, una célula de pulmón (por ejemplo, una célula de pulmón neuroectodérmica, o una célula de epitelio de pulmón) en un individuo normal puede usarse para la comparación con una célula de cáncer de pulmón de células pequeñas. Así, regulado por incremento en el contexto de la presente invención significa que el nivel de ARNm o de proteína SNARE es 'superior a 1' cuando se compara con el mismo tipo de célula en un estado no canceroso en un individuo normal. En una realización, el nivel de proteína o de
40 ARNm SNARE está regulado por incremento por más de 2 o 3 veces, o por más de 4 o 5 veces, o por más de 6 o 7 veces. En otra realización, el nivel de proteína o de ARNm SNARE está regulado por incremento por más de 8 o 9 veces, o por más de 10 o 12 veces, o por más de 15 o 20 veces. En otra realización, el nivel de proteína o de ARNm SNARE está regulado por incremento por más de 40 o 50 veces, o por más de 60 o 70 veces, o por más de 90 o 100 veces.
45 [0029] Alternativamente, la expresión de SNARE no deseable puede producirse cuando el nivel de expresión de ARNm y/o de proteína SNARE en una célula cancerosa es sustancialmente normal (es decir, sustancialmente el mismo) que cuando se compara con el de un tipo de célula no cancerosa correspondiente idéntico o muy similar. En este escenario, sin embargo, por ejemplo, cuando un paciente padece un [carcinoma de próstata, vejiga o de cuello
50 uterino], incluso un nivel bajo o normal de expresión de proteína SNARE puede soportar una secreción de las células cancerosas de este tipo que es de función paracrina o autocrina, y en consecuencia, en el contexto del cáncer, la proteína SNARE está soportando una secreción no deseable. En este escenario, los polipéptidos de la presente invención pueden suprimir la secreción de dichas células cancerosas, y así tratar esta necesidad en la materia.
55 [0030] A este respecto, los presentes inventores han identificado expresión de SNARE no deseable en una gama de tipos de células cancerosas. Estos datos se presentan como diagramas de cajas en las Figuras 3-47. En resumen, los presentes inventores han confirmado que la expresión de SNARE no deseable tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-1a, sintaxina-2) y VAMP (por ejemplo, VAMP-1) se observa en células de cáncer de
pulmón de células pequeñas (por ejemplo, cuando se compara con células de pulmón normales); que la expresión de SNARE no deseable tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-2), VAMP (por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2, VAMP-3) se observa en células carcinoides de pulmón; que la expresión de SNARE no deseable tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-2), VAMP (por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2) se observa en células 5 carcinoides de pulmón (por ejemplo, cuando se compara con células de pulmón normales); que la expresión de SNARE no deseable tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-2, sintaxina-3) y VAMP (por ejemplo, VAMP-1, VAMP-3) se observa en células de carcinoma de vejiga; que la expresión de SNARE no deseable tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-1a) y VAMP (por ejemplo, VAMP-2) se observa en células de cáncer de mama; que la expresión de SNARE no deseable tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-1a, sintaxina10 1b, sintaxina-2, sintaxina-3) y VAMP (por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3) se observa en células de adenocarcinoma pancreático (por ejemplo, cuando se compara con células pancreáticas normales); que la expresión de SNARE no deseable tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-1a, sintaxina-1b, sintaxina-3) y VAMP (por ejemplo, VAMP-2, VAMP-3) se observa en células de carcinoma de próstata (por ejemplo, cuando se compara con células de próstata benignas); que la expresión de SNARE no deseable tal como SNAP-25, sintaxina (por 15 ejemplo, sintaxina-2) y VAMP (por ejemplo, VAMP-3) se observa en células de cáncer de cuello uterino (por ejemplo, cuando se compara con células de cuello uterino normales); que la expresión de SNARE no deseable tal como sintaxina (por ejemplo, sintaxina 3) y VAMP (por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2, VAMP-3) se observa en células de leucemia de linfocitos B (por ejemplo, cuando se compara con linfoma de linfocitos B normales); que la expresión de SNARE no deseable tal como sintaxina (por ejemplo, sintaxina-1a, sintaxina-3) y VAMP (por ejemplo, VAMP-1) se 20 observa (por ejemplo, regulada por incremento) en células de cáncer de ovario (por ejemplo, cuando se compara con células de ovario normales); que la expresión de SNARE no deseable tal como SNAP-25 y VAMP (por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2, VAMP-3) se observa en células carcinoides gastrointestinales (GI) (por ejemplo, cuando se compara con células GI normales); y que la expresión de SNARE no deseable tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-1a, sintaxina-2) y VAMP (por ejemplo, VAMP-3) se observa (por ejemplo, regulada por 25 incremento) en células de cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, cuando se compara con células de cabeza y cuello normales). Además, los presentes inventores han identificado que la expresión de SNARE no deseable tal como SNAP-25 y VAMP (por ejemplo, VAMP-2) se observa en células de cáncer de colon; que la expresión de SNARE no deseable tal como SNAP-25 se observa en células de cáncer adrenal; que la expresión de SNARE no deseable tal como sintaxina (por ejemplo, sintaxina-2) se observa en células de cáncer de piel (por ejemplo, 30 melanoma); que la expresión de SNARE no deseable tal como sintaxina (por ejemplo, sintaxina-3) se observa en células cancerosas de leucemia (por ejemplo, melanoma múltiple); que la expresión de SNARE no deseable tal como sintaxina (por ejemplo, sintaxina-1a) y VAMP (por ejemplo, VAMP-1) se observa en células de adenocarcinoma de pulmón; que la expresión de SNARE no deseable tal como VAMP (por ejemplo, VAMP-1) se observa en células de cáncer de hígado; que la expresión de SNARE no deseable tal como VAMP (por ejemplo,
35 VAMP-2) se observa en células de cáncer de esófago; y que la expresión de SNARE no deseable tal como VAMP (por ejemplo, VAMP-3) se observa en células de cáncer de linfoma (por ejemplo, linfoma de linfocitos B y célula del manto).
[0031] El componente 'bioactivo' de los polipéptidos de la presente invención se proporciona por una proteasa
40 no citotóxica. Este grupo distinto de proteasas actúa escindiendo proteolíticamente proteínas de transporte intracelular conocidas como proteínas SNARE (por ejemplo, SNAP-25, VAMP o sintaxina) - véase Gerald K (2002) “Cell and Molecular Biology” (4ª edición) John Wiley & Sons, Inc. El acrónimo SNARE se deriva del término receptor de unión a NSF soluble (“Soluble NSF Attachment Receptor), en el que NSF significa factor sensible a Netilmaleimida (N-ethylmaleimide-Sensitive Factor). Las proteínas SNARE son esenciales para la formación de
45 vesículas intracelulares y así para la secreción de moléculas mediante el transporte de vesículas de una célula. Por consiguiente, una vez administrada a una célula diana deseada, la proteasa no citotóxica puede inhibir la secreción celular de la célula diana.
[0032] Las proteasas no citotóxicas son una clase discreta de moléculas que no destruyen células; en su
50 lugar, actúan inhibiendo procesos celulares distintos de la síntesis de proteínas. Las proteasas no citotóxicas se producen como parte de una molécula de toxina mayor mediante una variedad de plantas, y mediante una variedad de microorganismos tales como Clostridium sp. y Neisseria sp.
[0033] Las neurotoxinas clostridiales representan un grupo importante de moléculas de toxina no citotóxicas y
55 comprenden dos cadenas de polipéptidos unidas juntas por un enlace disulfuro. Las dos cadenas se llaman la cadena pesada (cadena H), que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y la cadena ligera (cadena L), que tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa. Es la cadena L, que posee una función proteasa y presenta una alta especificidad de sustrato por vesículas y/o proteínas asociadas a la membrana plasmática (SNARE) que participan en el proceso exocítico (por ejemplo, sinaptobrevina, sintaxina o SNAP-25).
Estos sustratos son componentes importantes de la maquinaria neurosecretora.
[0034] Neisseria sp., las más importantes de las especies N. gonorrhoeae, y Streptococcus sp., los más importantes de las especies S. pneumoniae, producen moléculas de toxina no citotóxicas funcionalmente similares.
5 Un ejemplo de una proteasa no citotóxica tal es proteasa de IgA (véase el documento WO99/58571). Así, la proteasa no citotóxica de la presente invención es preferentemente una proteasa de neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA.
[0035] Volviendo ahora al componente de resto que elige diana (TM) de la presente invención, éste es el
10 componente que une el polipéptido de la presente invención a una célula cancerosa. El TM es preferentemente un péptido.
[0036] El TM se une a un sitio de unión sobre la célula cancerosa, proporcionando así selectividad del polipéptido por esta especie de célula diana con respecto a otras células. A modo de ejemplo, en cáncer gástrico, el 15 TM se une preferentemente a células de cáncer gástrico en vez de a otras células del estómago, tales como aquellas que no son cancerosas y/o a otras células no cancerosas (o cancerosas) en el cuerpo. A este respecto, realizaciones de TM preferidas de la presente invención incluyen anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos tales como Fab, F(ab)'2, Fv, ScFv, etc., y péptidos de dominios de anticuerpos), además de andamiajes de unión, que se unen a los receptores identificados más adelante. Por
20 consiguiente, los polipéptidos de la presente invención pueden incluir anticuerpos o andamiajes de unión comercialmente disponibles que han sido diseñados para lograr la unión específica a la célula diana o receptor en cuestión. Alternativamente, TM preferidos incluyen ligandos de péptido tales como citocinas, factores de crecimiento, neuropéptidos y lectinas.
25 [0037] Un TM de la presente invención se une a un receptor sobre una célula cancerosa. A modo de ejemplo, un TM de la presente invención se une a un receptor sobre una célula cancerosa seleccionada del grupo que comprende: un receptor de hormona liberadora de hormona de crecimiento (GHRH, aka GHRF/GRF); un receptor de factor de crecimiento similar a la insulina (por ejemplo, un receptor de IGF-1); un receptor de factor liberador de corticotropina (por ejemplo, CRHR-2); un receptor de péptido liberador de gastrina (GRP); un receptor de péptido de
30 bombesina (BB) tal como BRS-1, BRS-2 o BRS-3; un receptor de hormona de crecimiento (GH); un receptor de interleucina (por ejemplo, IL8RA o IL13RA1); un receptor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); un receptor de acetilcolina (ACH); un receptor de somatostatina (SST) tal como SST1, SST2, SST3, SST4 o SST5; un receptor de cortistatina (CST); un receptor de quimiocinas (motivo C-X-C) tal como CXCR4; un receptor de neurofilina; un receptor de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH); un receptor de la superfamilia de VIP
35 glucagón-GRF-secretina tal como un receptor de PAC (por ejemplo, PAC1) o un receptor de péptido intestinal vasoactivo VPAC (por ejemplo, VPAC-1 o VPAC-2); o un receptor de miembros de la familia de ErbB tal como un receptor de EGF. Todos estos receptores están expresados en exceso en células cancerosas.
[0038] En una realización de la presente invención, el TM se une a un receptor sobre una célula cancerosa
40 seleccionada del grupo que comprende: FLT tal como FLT1, FLT4, FLT3, BRS tal como BRS3; CHRN tal como CHRNA1, CHRND o CHRNE; EPHA tal como EPHA7, EPHA4, EPHA5, EPHA3, EPHA1, EPHA2; EFN tal como EFNB3, EFNA1, EFNB2, EFNA3, EFNB1; ErbB tal como ERBB2, ERBB4; DLK1, DLL3, FGF tal como FGFR1, FGFR3, FGFR2; GRPR; GNRHR; GRPR; GnRHR; JAG tal como JAG1 (CD339) o JAG2, IFGR tal como IGF1R; receptor de factor inhibidor de leucemia (LIFR); NMBR; NOTCHR tal como NOTCH3 o NOTCH4; VIPR tal como
45 VIPR1; VEGFR tal como VEGFR2; SSTR tal como SSTR1; NMBR; o PDGFR tal como PDGFRA o PDGFRB. Todos estos receptores están expresados en exceso en células cancerosas.
[0039] En una realización, el TM está seleccionado de: un péptido adrenomedulina (ADM), un péptido AM, un péptido factor de motilidad autocrina (AMF), un péptido anfiregulina, un péptido APRIL (un ligando inductor de 50 proliferación), un péptido artemina, un péptido betacelulina, un péptido bombesina, un péptido de unión de receptor de calcitonina (CTR), un péptido ErbB tal como un péptido EGF, un péptido endotelina, un péptido eritropoyetina (EPO), un péptido factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) tal como un péptido FGF-5, un péptido FGF-18, un péptido bFGF, FGF8 o FGF17, un péptido hormona estimulante del folículo (FSH), un péptido gastrina, un péptido liberador de gastrina (GRP), un péptido factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF), un péptido 55 grelina (GHRL), un péptido hormona liberadora de hormona de crecimiento (GHRH), un péptido factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), un péptido hormona de crecimiento (GH), un péptido factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina (HB-EGF), un péptido factor de crecimiento de hepatocitos/factor de dispersión (HGF/SF), una interleucina (IL) tal como un péptido IL-1alfa, un péptido IL-6, un péptido IL-8 o un péptido IL-10, un péptido IGF-1, una péptido factor 1 derivado de células del estroma (SDF-1), un péptido factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), un péptido proepitelina/granulina, un péptido leptina (LEP), un péptido LIF, un péptido alfamelanotropina, un péptido MGSA/GRO-alfa, beta o gamma, un péptido NRG-1alfa, un péptido oxitocina, un péptido osteopontina (OPN), un péptido neuregulina-1, un péptido PACAP, un péptido PDGF tal como un péptido PDGF-alfa, un péptido PDGF-beta, un péptido PDGF-C o un péptido PDGF-D, un péptido prolactina, un péptido SCF, un péptido 5 somatostatina, un péptido factor de necrosis tumoral (TNF) tal como un péptido TNF-alfa, un péptido TGF-beta, un péptido TGF-beta1, un péptido VEGF tal como un péptido VEGF-C o un péptido VEGF-D, un péptido vasopresina, un péptido VIP, un péptido angiopoyetina tal como un péptido angiopoyetina-1 o péptido angiopoyetina-2, un péptido B-CLL, un péptido BCGF-12KD, un péptido BAFF, un péptido galanina, un péptido GDNF, un péptido GnRH, un péptido IGF-II, un péptido LH, un péptido neurotropina, un péptido sustancia P o un péptido TGF-alfa; además de
10 truncaciones y análogos de péptidos de los mismos.
[0040] En una realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de leptina. Ejemplos adecuados de tales TM incluyen: péptidos leptina tales como un péptido leptina de longitud completa (por ejemplo, leptina167), y truncaciones o análogos de péptidos de los mismos tales como leptina22-167, leptina70-95 y leptina116-122.
15 [0041] En otra realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de grelina. Ejemplos de TM adecuados a este respecto incluyen: péptidos grelina tales como grelina de longitud completa (por ejemplo, grelina117) y truncaciones o análogos de péptidos de los mismos tales como grelina24-117 y grelina52-117; [Trp3, Arg5]grelina (1-5), des-Gln-grelina, cortistatina-8, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2, péptido liberador de hormona de
20 crecimiento (por ejemplo, GHRP-6), o hexarelina.
[0042] En una realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de somatostatina (SST). A modo de ejemplo, TM adecuados incluyen: péptidos SST y péptidos cortistatina (CST), además de análogos de péptidos de los mismos tales como D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2 (BIM 23052), D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp
25 Lys-Val-Phe-D-Nal-NH2 (BIM 23056) o c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (BIM-23268). Otros ejemplos incluyen los péptidos SST SST-14 y SST-28; además de péptido y análogos de péptidos tales como: octeotrida, lanreotida, BIM23027, vapreotida, seglitida y SOM230. Estos TM son TM preferidos para unirse a receptores de SST, en particular a receptores de sst1, sst2, sst3, sst4 y sst5.
30 [0043] En otra realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). GnRH también se conoce como hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH). Ejemplos de TM de receptores de GnRH adecuados incluyen: péptidos GnRHI, péptidos GnRHII y péptidos GnRHIII, por ejemplo, el polipéptido de precursores de GnRH de 92 aminoácidos de longitud completa y truncaciones del mismo tales como el decapéptido: piroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly CONH2.
35 [0044] En una realización, un TM de la presente invención se une a receptor de factor de crecimiento similar a la insulina (IGF). Ejemplos adecuados incluyen, por ejemplo, péptidos IGF-1 y péptidos IGF-2.
[0045] En una realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de la superfamilia de VIP40 glucagón-GRF-secretina, tal como a un receptor de PAC (por ejemplo, PAC1) o uno de VPAC (por ejemplo, VPAC-1
o VPAC-2). Ejemplos adecuados de tales TM incluyen péptidos activadores de la adenilato ciclasa pituitaria (PACAP), péptidos intestinales vasoactivos (VIP), además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos.
[0046] En una realización, el TM es un péptido VIP que incluye péptidos VIP-1 y VIP-2, por ejemplo, VIP(1
45 28), o una truncación o análogo de péptido de los mismos. Estos TM demuestran una unión selectiva a VPAC-1. Alternativamente puede emplearse un TM que demuestra una unión selectiva a VPAC2 tal como, por ejemplo, mROM (véase Yu y col., Peptides 27 (6) p1359-66 (2006), que se incorpora por este documento por referencia a la misma). En otra realización, el TM puede ser un péptido PACAP, por ejemplo, PACAP(1-38) o PACAP(1-27), o una truncación de análogo de péptido del mismo. Estos TM son TM preferidos para unirse a receptores de PAC (por
50 ejemplo, PAC-1).
[0047] En una realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de interleucina. Ejemplos de TM adecuados incluyen: péptidos IL-1 (por ejemplo, péptidos IL-1α, IL-β, IL-18) y truncaciones o análogos de péptidos de los mismos, péptidos IL-2 (por ejemplo, péptidos IL-2, IL-3, IL-12, IL-23) y truncaciones o análogos de
55 péptidos de los mismos, péptidos IL-6 y IL-8 y truncaciones o análogos de péptidos de los mismos, y péptidos IL-17 (por ejemplo, péptidos IL-17A, IL-17C) y truncaciones o análogos de péptidos de los mismos.
[0048] En otra realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de NGF. Ejemplos de TM adecuados incluyen NGF de longitud completa, y truncaciones o análogos de péptidos de los mismos.
[0049] En una realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de factor de crecimiento epidérmico vasoactivo (VEGF). Ejemplos de TM adecuados incluyen: péptido VEGF (por ejemplo, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D o VEGF-E y variantes de corte y empalme asociadas) y truncaciones o análogos de péptidos de
5 los mismos, y factor de crecimiento placentario (PIGF) y truncaciones o análogos de péptidos de los mismos.
[0050] En otra realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de ErbB. A modo de ejemplo, el TM está seleccionado de péptidos EGF, péptidos factor de crecimiento transformante α (TGF-α), quimeras de EGF y TGF-α, péptidos anfiregulina, péptidos betacelulina, péptidos epigen, péptidos epiregulina, péptidos EGF de
10 unión a heparina (HB-EGF), péptidos neuregulina (NRG) tales como NRG1α, NRG1β, NRG2α, NRG2β, NRG3, NRG4 y variantes de corte y empalme de neuroregulina, péptidos tomoregulina 1 y 2, péptidos neuroglicano-C, péptidos lin-3, péptidos vein, péptidos gurken, péptidos spitz o péptidos keren; además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Hay 4 clases de receptor de ErbB (llamados ErbB1, erbB2, erbB3 y erbB4), que también se denominan receptores HER. Existen varias variantes de estos receptores, que se producen a partir de corte y
15 empalme alternativo y/o escisión del receptor de longitud completa (por ejemplo, la traducción de EGFR v1 empieza en aa543; deleción de EGFR vII de aa521-603; deleción de EGFR vIII de aa 6-273; deleción de EGFRvIII/L12-13 de aa 6-273 y 409-520; deleción de EGFR vIV de aa 959-1030; truncación de EGFR vV en el residuo 958; duplicación en tándem de EGFR TDM/2-7 de 6-273; duplicación en tándem de EGFR TDM/18-25 de 664-1030; duplicación en tándem de EGFR-TDM/18-26 de 664-1014). Además, hay cuatro isoformas de receptores de ErbB4 llamadas erbB4
20 JM-a, erbB4 JM-b, erbB4 CYT-1 y erbB4 CYT-1.
[0051] TM preferidos se unen a receptores de ErbB (por ejemplo, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4) y variantes de corte y empalme de los mismos, en particular el receptor ErbB1. TM de ErbB también pueden incluir proteínas que contienen motivos de EGF con un sitio de corte y empalme entre la cuarta y quinta cisteínas dentro del módulo de
25 EGF de seis cisteínas en el que este módulo está dispuesto en estrecha proximidad a la región transmembrana del posible ligando. Por ejemplo, proteoglicano-2 de matriz de interfotorreceptor (IMP-2), meprina (MEP)1α, MEP1β, mucina (MUC)3, MUC4, MUC12 y MUC17, además de proteínas con un andamiaje de nudo en T tales como inhibidor de carboxipeptidasa de patata, y anticuerpos para receptores de ErbB tales como cetuximab, ABX-EGF, trastuzumab o EMD72000. Otros ejemplos incluyen quimeras generadas intercambiando dominios (secuencias de
30 bucle y/o aminoácidos de conexión) de diferentes ligandos de ErbB tales como un ligando de receptor de erbB de mamífero en el que la secuencia del bucle B ha sido sustituida con aquellas presentes en los ligandos de ErbB de insecto (Drosophila), un ligando de ErbB en el que la secuencia del bucle C de EGF ha sido sustituida con la de TGFα (44-50), ligandos de EGF en los que uno o más dominios han sido sustituidos con secuencias correspondientes en TGFα para crear quimeras de EGF/TGFα (por ejemplo, quimeras de E3T, T3E, E4T, T4E,
35 T3E4T, T6E y E3T4E, y EGF en las que la secuencia de TGFα del extremo N (WSHFND) o la secuencia de neuregulina (SHLVK) se ha usado para sustituir el extremo C de la secuencia de EGF del extremo N del primer residuo de cisteína (NSDSE), T1E y biregulina. Todavía más quimeras incluyen EGF en el que un dominio ha sido sustituido con un dominio similar a EGF de otra proteína, tal como una proteína de coagulación de la sangre, desarrollo neural o de adhesión a células (por ejemplo, receptores Notch 3, Delta 1, EMR1, F4/80, EMR3 y EMR4).
40 [0052] En otra realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de hormona liberadora de hormona de crecimiento (GHRH). GHRH también se conoce como factor liberador de hormona de crecimiento (GRF
o GHRF) o somatocrinina. Ejemplos de TM adecuados de la presente invención incluyen el péptido de longitud completa GHRH (1-44), y truncaciones o análogos de péptidos de los mismos tales como GHRH(1-29), GHRH(1-37),
45 hGHRH(1-40)-OH, [MeTyr1,Ala15,22,Nle27]-hGHRH(1-29)-NH2 [MeTyr1,Ala8,9,15,22,28,Nle 27]-hGHRH(1-29)-NH2 ciclo(25-29)[MeTyr1,Ala15,DAsp25,Nle27,Orn29+++]-hGHRH(1-29)-NH2 (D-Tyr1)-GHRH (1-29)-NH2
50 (D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2 (D-Asp3)-GHRH (1-29)-NH2 (D-Ala4)-GHRH (1-29)-NH2 (D-Thr7)-GHRH (1-29)-NH2 (D-Asn8)-GHRH (1-29)-NH2
55 (D-Ser9)-GHRH (1-29)-NH2 (D-Tyr10)-GHRH (1-29)-NH2 (Phe4)-GHRH (1-29)-NH2 (pCl-Phe6)-GHRH (1-29)-NH2 (N-Ac-Tyr1)-GHRH (1-29)-NH2
(N-Ac-Tyr1, D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2 (N-Ac-D-Tyr1, D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2 (N-Ac-D-Tyr1, D-Ala 2, D-Asp3)-GHRH (1-29)-NH2 (D-Ala2, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2
5 (His1, D-Ala2, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2 (N-Ac-His1, D-Ala2, N-Leu27)-GHRH (1-29)-NH2 (His1, D-Ala 2, D-Ala 4, Nleu27)-GHRH (1-29)-NH2 (D-Ala2, D-Asp3, D-Asn8, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2 (D-Asp3, D-Asn8, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2
10 [His1, NLeu27]-hGHRH(1-29)-NH2 [NLeu27]-hGHRH(1-29)-NH2 H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2 H-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile
15 Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2 H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-AspIle-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2 H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-r-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2 His-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys
20 Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg His-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala.
[0053] En otra realización, el TM se une a un receptor de bombesina (por ejemplo, BRS-1, BRS-2 o BRS-3). TM para su uso en la presente invención que se unen a un receptor de bombesina incluyen: bombesina - un péptido
25 de 14 aminoácidos originariamente aislado de la piel de una rana (pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2); y los dos homólogos conocidos en mamíferos, concretamente neuromedina B y péptido liberador de gastrina (GRP) tal como GRP porcino - Ala-Pro-Val-Ser-Val-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Ala-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2, y GRP humano - Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Thr-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2. TM adicionales incluyen bombesina,
30 neuromedina B y truncaciones de GRP correspondientes, además de análogos de péptidos de los mismos.
[0054] En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de pulmón (por ejemplo, una célula de cáncer de pulmón de células pequeñas, una célula de cáncer de pulmón de no células pequeñas, o una célula de cáncer de pulmón carcinoide). Los presentes inventores han confirmado que la expresión de SNARE no deseable se
35 observa en células de cáncer de pulmón. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor sobre la célula de cáncer de pulmón, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de eritropoyetina (EPO), un receptor de VEGF tal como un receptor de VEGF-3, un receptor de ErbB tal como un receptor de EGF, un receptor de ErbB2 o 3, un receptor de GRP, un receptor de ET(A), un receptor de CCK tal como un receptor de CCK-A o CCK-B, un receptor de FLT tal como un receptor de FLT 3 o FLT4, un receptor de CHRND, un receptor de EPHA tal como un
40 receptor de EPHA7, EPHA4 o EPHA5, un receptor de EFNA tal como un receptor de EFNA3 o EFNB3, un receptor de DLK1, un receptor de FGF tal como un receptor de FGF1, o un receptor de JAG tal como un receptor de JAG1 (CD339) o JAG2. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Ejemplos incluyen: eritropoyetina (EPO), VEGF tal como VEGF-B, VEGF-C, acetilcolina, péptidos efrina tales como efrina-A1, A2, A3, A4 o A5, péptidos pro
45 neuregulina tales como pro-neuregulina-2, péptidos neuregulina tales como neuregulina o NTAK, EGF, TGF tal como TGF-beta, GRP, péptido similar a bombesina, endotelina, PGF, TNF tal como TNF-alfa, IL tal como IL-6, IL-8, oxitocina, vasopresina, NRG tal como NRG-1alfa, bradiquinina, HGF, GHRH, FGF tal como bFGF, aFGF, FGF-1, FGF-2, ligandos del péptido NOTCH, citocina FLT3 o gastrina; además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos.
50 [0055] En otra realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de vejiga. Los presentes inventores han confirmado que la expresión de SNARE no deseable se observa en células de cáncer de vejiga. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor sobre la célula de cáncer de vejiga, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de IGF tal como un receptor de IGF1, un receptor de G-CSF, un receptor de VEGF tal
55 como un receptor de VEGF-2, un receptor de ErbB tal como un receptor de EGF, un receptor de HGF o un receptor de FGF tal como un receptor de bFGF de alta/baja afinidad. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente a dichos receptores, además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Ejemplos incluyen: G-CSF, VEGF, HB-EGF, IGF tal como IGF-1 o IGF-2, anfiregulina, betacelulina, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), ErbB tal como EGF, TGF tal como TGF-alfa, IL tal como IL-6, péptido granulina tal como granulina-4, o FGF tal como bFGF; además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos.
[0056] En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de mama. Los presentes inventores han confirmado que la expresión de SNARE no deseable se observa en células de cáncer de mama. En esta 5 realización, el ligando de TM se une a un receptor sobre la célula de cáncer de mama, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de IGF tal como un receptor de IGF1, un receptor de VIP tal como VIPR-1, un receptor de GRP, un receptor de NMB, un receptor de CXC tal como CXCR4, un receptor de TNF tal como receptor de TNF 1
o 2, un receptor de VEGF tal como VEGFR-2 o VEGFR-3, un receptor de neurofilina tal como NRP-1 o NRP-2, un receptor de integrina tal como receptor de integrina alfa9beta1, un receptor de OB, un receptor de ET tal como ET10 RA o ET-RB, un receptor de eritropoyetina (EpoR), un receptor de TGF-beta, un receptor de AMF, o un receptor de prolactina. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente a dichos receptores, además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Ejemplos incluyen: TNF tal como TNF-alfa, VEGF tal como VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, IL tal como IL-6, anfiregulina, leptina, endotelina tal como ET-1, ET-2, ET-3, FGF tal como FGF-2, GHRH, péptido granulina tal como granulina-4, eritropoyetina, péptidos neuromedina tales
15 como neuromedina C de GRP, neuromedina B, factor de motilidad autocrina (AMF), prolactina, hormona de crecimiento tal como hGH, IGF tal como IGF-1 o IGF-2, péptidos VIP, o péptidos PACAP tales como PACAP-27 o PACAP-38; además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos.
[0057] En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer pancreático. Los presentes inventores
20 han confirmado que la expresión de SNARE no deseable se observa en células de adenocarcinoma pancreático. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor sobre la célula de cáncer pancreático, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de VIP tal como un receptor de VIP1, un receptor de VEGF tal como un receptor de VEGF-1 o VEGF2, un receptor de SST tal como un receptor SST1, un receptor de CHRN tal como CHRNG, CHRNE, CHRNA1 o CHRND, un receptor de IGF tal como IGF1R, un receptor de BRS tal como BRS3, un receptor de GnRH,
25 un receptor de GRP, un receptor de NMB, un receptor de factor de crecimiento de tipo-1, un receptor de ErbB tal como EGFR, un receptor de CCK tal como CCKB o CCKC, un receptor de PDGF tal como PDGF-alfa, un receptor de ADM, un receptor de factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) tal como FGFR2b, un receptor de FGF de tipo I, un receptor de GnRH, un receptor de GFRalfa3/RET, o un receptor de GDNF. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente a dichos receptores, además de truncaciones y análogos de péptidos de
30 los mismos. Ejemplos incluyen: ErbB tal como EGF, TGF tal como TGF-alfa, gastrina, PDGF, adrenomedulina, VEGF, KGF, FGF tal como FGF-5 o FGF (a/b), VIP, péptidos SST tales como SST-14 o SST-28, acetilcolina, péptidos neuromedina tales como neuromedina C de GRP, neuromedina B, péptidos PACAP tales como PACAP-27
o PACAP-38, IL tal como IL-1a, GnRH, bombesina, artemina, GDNF, o IGF tal como IGF-1 o IGF-2; además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos.
35 [0058] En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de próstata. Los presentes inventores han confirmado que la expresión de SNARE no deseable se observa en células de carcinoma de próstata. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor sobre la célula de cáncer de próstata, tal como a un receptor seleccionado de: un CHRN tal como un receptor de CHRNG o CHRNE, un receptor de IGF tal como un receptor de
40 IGF1, un receptor de VIP tal como un receptor de VIP1, un receptor de CT, un receptor de ErbB tal como EGFR (MR2), un receptor de [p75(NTR)] o TrkA, un receptor de CC tal como CCR2, un receptor de FGF tal como receptor FGFR-1 a -4, un receptor de KGF, un receptor de FSH, un receptor de GHS tal como GHS-R 1a, un receptor de CXC tal como CXCR2, un VPAC o PAC tal como VPAC1 o PAC1, un receptor de CRL, un receptor de c-Met/HGF o un receptor de GH. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente a dichos
45 receptores, además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Ejemplos incluyen: calcitonina (CT), TGF tal como TGF-alfa, adrenomedulina, acetilcolina, prolactina, IL tal como IL-6 o IL-8, NGF, PDF, MCP tal como MCP-1, somatostatina, FGF tal como FGF1 (FGF ácido), FGF2 (FGF básico), FGF6 o FGF8, EPO, VEGF, KGF, FSH, grelina, FGF17, TNF tal como TNF-alfa, VIP, péptidos PACAP tales como PACAP-27 o PACAP-38, AM, HGF, GH, GM-CSF o IGF tal como IGF-1 o IGF-2; además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos.
50 [0059] En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de cuello uterino o uterino. Los presentes inventores han confirmado que la expresión de SNARE no deseable se observa en células de cáncer de cuello uterino. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor sobre la célula de cáncer de cuello uterino
o uterino, tal como a un receptor seleccionado de: receptor de EPHA tal como receptor de EPHA5, EPHA7, EPHA4,
55 EPHA3, un receptor de PDGF tal como PDGFRA, un receptor de EFNA tal como EFNA1, un receptor de SST tal como SSTR1, un receptor de ErbB tal como un EGFR, un receptor de FLT tal como un receptor de FLT-1, un receptor de FLK tal como un receptor de FLK-1, un receptor de VEGF tal como VEGFR-3, un receptor de ET tal como ET(A)R, un receptor de IGF tal como IGF-1R, o un receptor de LIF tal como LIFR. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente a dichos receptores, además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Ejemplos incluyen: ErbB tal como EGF, TGF tal como TGF-alfa, G-CSF, péptidos PDGF tales como PDGFA o PDGFC, péptidos SST tales como SST-14 o SST-28, IGF tal como IGF-1 o IGF-2, péptidos efrina tales como efrina-A1, A2, A3, A5 o A5, VEGF tal como VEGF-C o VEGF-D, péptido granulina tal como granulina-4, endotelina tal como ET-1, o IL tal como IL-6 o IL-1; además de truncaciones y análogos de péptidos de
5 los mismos.
[0060] En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de leucemia. Los presentes inventores han confirmado que la expresión de SNARE no deseable se observa en células de leucemia. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor sobre la célula de leucemia, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor 10 de FLT tal como un receptor de FLT1 o 3, un receptor de FGF tal como FGFR1, 2 o 3, un receptor de EFN tal como un receptor de EFNB1 o EFNB3, un receptor de JAG tal como un receptor de JAG1 (cd339), un receptor de PDGF tal como PDGFRA o B, EPHA1, EPHA2, un receptor de NOTCH tal como un receptor de NOTCH3 o 4, un receptor de EPHA tal como un receptor de EPHA7, un receptor de LIF, un receptor de EFN tal como un receptor de EFNA1 o 3, un receptor de DLL tal como un receptor de DLL3, un receptor de ErbB tal como un receptor de ErbB2 o 3, un 15 receptor de KDR, un receptor de GHS tal como tipo 1 a de GHS-R, un receptor de IL tal como tipo II de receptor de IL-1, o un receptor de IGF tal como un IGF1R. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente a dichos receptores, además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Ejemplos incluyen: IGF tal como IGF-1 o IGF-2, péptidos VEGF tales como VEGFB, grelina, APRIL, péptidos pro-neuregulina tales como pro-neuregulina-2, péptidos neuregulina, NTAK, FGF tal como bFGF, aFGF o FGF-1, péptidos NOTCH
20 tales como NOTCH1, 2 o 3, péptidos PGF, péptidos PDGF tales como PDGFA, PDGFB o PDGFD, péptidos efrina tales como efrina-A (1-5), LIF, ligando GP30, eritropoyetina, péptidos JAG tales como JAG-1 o JAG-2, Delta-1, IL tal como IL1-alfa, o GM-CSF; además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos.
[0061] En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de ovario. Los presentes inventores
25 han confirmado que la expresión de SNARE no deseable se observa en células de cáncer de ovario. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor sobre la célula de cáncer de ovario, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de ErbB tal como un receptor de ErbB2, 3 o 4, un receptor de FGF tal como FGFR3, un receptor de JAG tal como un receptor de JAG2, un receptor de EPH tal como un receptor de EPHA1 o 2, un receptor de IGF tal como un IGF1R, un receptor de GRP, un receptor de EFN tal como un receptor de EFNB3, A1 o B2, o un
30 receptor de GNRH. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente a dichos receptores, además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Ejemplos incluyen: péptidos NRG tales como NRG-2 o NRG-3, o péptidos factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina; péptidos neuregulina, péptido GP30, péptidos NOTCH, péptidos granulina tales como granulina-4, péptidos efrina-A tales como efrina A1-A5, péptidos IGF tales como IGF-1 o IGF-2, NTAK, GRP, o GnRH; además de truncaciones y análogos de péptidos
35 de los mismos.
[0062] En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de huesos. Los presentes inventores han confirmado que la expresión de SNARE no deseable se observa en células de cáncer de huesos. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor sobre la célula de cáncer de huesos, tal como a un receptor
40 seleccionado de: un receptor de IGF tal como un IGF-IR, un receptor de GHRH, o un receptor de FGF tal como un receptor de bFGF. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente a dichos receptores, además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Ejemplos incluyen: PDGF tal como PDGF-alfa o PDGF-beta, TGF tal como TGFbeta1, IGF tal como IGF-1, GHRH, FGF tal como bFGF, G-CSF, o IL tal como IL-6; además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos.
45 [0063] En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer cerebral. Los presentes inventores han confirmado que la expresión de SNARE no deseable se observa en células de cáncer cerebral. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor sobre la célula de cáncer cerebral, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de EPO, receptor de glicoproteína de 78 kDa (gp78), un receptor de ErbB tal como EGFR, un receptor de
50 PDGF tal como PDGFR-alfa, un receptor de CRL tal como CRLR/RAMP2 o CRLR/RAMP3, un receptor de neurofilina tal como NRP-1 o NRP-2, un receptor de CXC tal como CXCR4, un VEGFR tal como VEGFR-1, un IGFR tal como IGF1R, un receptor de GDNF tal como GDNFR-alfa 1, o un receptor de MET. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente a dichos receptores, además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Ejemplos incluyen: péptidos eritropoyetina (EPO), péptidos IGF, péptidos factor de motilidad
55 autocrino (AMF), péptidos GDNF, péptidos HB-EGF, péptidos TGF tales como TGF-alfa, péptidos PDGF tales como PDGFA, PDGF-B, PDGF-C o PDGF-D, péptidos neuregulina tales como neuregulina-1, adrenomedulina, péptidos IL tales como IL-6, péptidos factor de dispersión/factor de crecimiento de hepatocitos (SF/HGF), péptidos granulina tales como granulina-4, péptidos VEGF tales como VEGF-A, o péptidos TGF tales como TGF beta 1 o TGF beta 2; además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos.
[0064] En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer colorrectal. Los presentes inventores han confirmado que la expresión de SNARE no deseable se observa en células de cáncer colorrectal En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor sobre la célula de cáncer colorrectal, tal como a un receptor 5 seleccionado de: un receptor de IGF tal como IGF-R1, un receptor de ErbB tal como EGFR, un receptor de GRP, un receptor de IL tal como IL6-R, un receptor de CCK tal como receptor de CCK-B, o un receptor de prolactina. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente a dichos receptores, además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Ejemplos incluyen: FGF tal como FGF18, IGF tal como IGF-1, TGF tal como TGF-alfa, GRP, IL tal como IL6, ErbB tal como EGF, gastrina, o prolactina; además de truncaciones y
10 análogos de péptidos de los mismos.
[0065] En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de hígado. Los presentes inventores han confirmado que la expresión de SNARE no deseable se observa en células de cáncer de hígado. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor sobre la célula de cáncer de hígado, tal como a un receptor 15 seleccionado de: un receptor de TrkA (NGF), un receptor de IGF tal como IGF-IR, un receptor de HGF tal como un receptor de HGF-Met, un receptor de c-met, un receptor de gp78 o un receptor de ErbB tal como un EGFR. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente a dichos receptores, además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Ejemplos incluyen: NGF, IL tal como IL-6 o IL-8, IGF tal como IGF-1 o IGF-2, HGF, SF/HGF, hepatopoyetina (HPO), AMF, TGF tal como TGF-beta o TGF-alfa, LIF o PDGF;
20 además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos.
[0066] En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de piel. Los presentes inventores han confirmado que la expresión de SNARE no deseable se observa en células de cáncer de piel. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor sobre la célula de cáncer de piel (por ejemplo, basal, de melanoma, escamosa) 25 tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de FGF tal como FGFR-1, un receptor de c-kit, un receptor de VEGF tal como VEGFR-2, un receptor de c-Met o un receptor de melanocortina tal como un receptor de melanocortina-1. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente a dichos receptores, además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Ejemplos incluyen: IL tal como IL8 o IL-10, FGF tal como bFGF, SCF, VEGF tal como VEGF-A, ErbB tal como EGF, EPO, osteopontina (OPN), TGF tal como TGF-beta,
30 MGSA/GRO tal como MGSA/GRO alfa, beta o gamma, HGF/SF, alfa-melanotropina, anfiregulina, o AMF; además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos.
[0067] En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de sarcoma de Kaposi. Los presentes inventores han confirmado que la expresión de SNARE no deseable se observa en células de cáncer de sarcoma de 35 Kaposi. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor sobre la célula de sarcoma de Kaposi, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de PDGF tal como PDGFRA, un receptor de c-kit, un receptor de TGF-beta tal como TGFR-1, un receptor de endotelina tal como ETA-R, un receptor de quimiocinas tal como CXCR3 o CCRL2, un receptor de VEGF tal como VEGFR-2, un receptor de IGF tal como IGF-IR, o un receptor de angiopoyetina tal como TIE2. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente a dichos receptores,
40 además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Ejemplos incluyen: PDGFa, IGF-1, Ang2, IL tal como IL6, VEGF tal como VEGF-A, endotelina-1, TGF tal como TGF-beta, CXCL11, CCL8/14; además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos.
[0068] En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer renal. En esta realización, el ligando de
45 TM se une a un receptor sobre la célula de cáncer renal, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de IGF tal como IGF-IR, un receptor de VEGF, un receptor de CXC o un receptor de ErbB tal como un EGFR. TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente a dichos receptores, además de truncaciones y análogos de péptidos de los mismos. Ejemplos incluyen: IL tal como IL-6 o IL-8, IGF tal como IGF-1 o IGF-2, TGF tal como TGF-beta o TGF-alfa, VEGF tal como VEGF-A, quimiocinas tales como CXCL12; además de truncaciones y
50 análogos de péptidos de los mismos.
[0069] Las realizaciones anteriores describen cánceres particulares en los que los presentes inventores han demostrado expresión de SNARE no deseable (por ejemplo, expresión de SNARE regulada por incremento). Sin embargo, la presente invención no se limita a dichos tipos de cáncer específicos, y engloba todos los tipos de cáncer
55 en los que se produce expresión de SNARE.
[0070] La expresión de SNARE no deseable anteriormente descrita (por ejemplo, regulación por incremento) en células cancerosas puede opcionalmente ligarse a una regulación por incremento de uno o más tipos de receptores específicos presentes sobre las células cancerosas en cuestión. A este respecto, los presentes inventores han identificado tipos de receptores particulares (anteriormente detallados) que están regulados por incremento en las mismas células en las que se observa expresión de SNARE no deseable (por ejemplo, regulada por incremento).
5 Preparación de polipéptidos
[0071] Los polipéptidos de la presente invención comprenden 3 componentes principales: uno 'bioactivo' (es decir, una proteasa no citotóxica); un TM; y un dominio de translocación. La tecnología general asociada a la preparación de tales proteínas de fusión se denomina frecuentemente tecnología de toxina re-elegida como diana. A
10 modo de ejemplificación, los presentes inventores se refieren a: documentos WO94/21300; WO96/33273; WO98/07864; WO00/10598; WO01/21213; WO06/059093; WO00/62814; WO00/04926; WO93/15766; WO00/61192; y WO99/58571.
[0072] En más detalle, el componente de TM de la presente invención puede fusionarse con tanto el
15 componente de proteasa como el componente de translocación de la presente invención. Dicha fusión es preferentemente a modo de un enlace covalente, por ejemplo, tanto un enlace covalente directo como mediante una molécula de separador/ligador. El componente de proteasa y el componente de translocación se ligan preferentemente juntos mediante un enlace covalente, por ejemplo, tanto un enlace covalente directo como mediante una molécula de separador/ligador. Las moléculas de separador/ligador adecuadas son muy conocidas en
20 la técnica, y normalmente comprenden una secuencia basada en aminoácidos de entre 5 y 40, preferentemente entre 10 y 30 residuos de aminoácidos de longitud.
[0073] En uso, los polipéptidos tiene una conformación de di-cadena en la que el componente de proteasa y el componente de translocación están ligados juntos, preferentemente mediante un enlace disulfuro.
25 [0074] Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse por técnicas de conjugación química convencionales, que son muy conocidas para un experto habitual. A modo de ejemplo se hace referencia a Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, y a Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press, Nagy y col., PNAS 95 p1794-99 (1998). Metodologías más detalladas
30 para unir TM sintéticos a un polipéptido de la presente invención se proporcionan en, por ejemplo, el documento EP0257742.
[0075] Alternativamente, los polipéptidos pueden prepararse por preparación recombinante de una proteína de fusión de un único polipéptido (véase, por ejemplo, el documento WO98/07864). Esta técnica se basa en el
35 mecanismo bacteriano in vivo por el que se prepara la neurotoxina clostridial nativa (es decir, holotoxina), y produce una proteína de fusión que tiene la siguiente disposición estructural 'simplificada':
NH2 - [componente de proteasa] - [componente de translocación] - [TM] - COOH
40 [0076] Según WO98/07864, el TM está dispuesto hacia el extremo C de la proteína de fusión. La proteína de fusión se activa entonces mediante tratamiento con una proteasa, que se escinde en un sitio entre el componente de proteasa y el componente de translocación. Así se produce una proteína de di-cadena que comprende el componente de proteasa como una cadena de un único polipéptido covalentemente unida (mediante un puente disulfuro) a otra cadena de un único polipéptido que contiene el componente de translocación más TM.
45 [0077] Alternativamente, según el documento WO06/059093, el componente de TM de la proteína de fusión está localizado hacia el centro de la secuencia de la proteína de fusión lineal, entre el sitio de escisión por proteasa y el componente de translocación. Esto garantiza que el TM esté unido al dominio de translocación (es decir, como se produce con holotoxina clostridial nativa), aunque en este caso los dos componentes se invierten en orden con
50 relación a la holotoxina nativa. La posterior escisión en el sitio de escisión por proteasa expone la porción del extremo N del TM, y proporciona la proteína de fusión de polipéptidos de di-cadena.
[0078] La(s) secuencia(s) de escisión por proteasa anteriormente mencionada(s) puede(n) introducirse (y/o eliminarse cualquier secuencia de escisión inherente) al nivel de ADN mediante medios convencionales tales como
55 por mutagénesis dirigida a sitio. El cribado para confirmar la presencia de secuencias de escisión puede realizarse manualmente o con la ayuda de software informático (por ejemplo, el programa MapDraw de DNASTAR, Inc.). Aunque puede emplearse cualquier sitio de escisión por proteasa (es decir, clostridial, o no clostridial), se prefieren las siguientes: Enterocinasa (DDDDKL) Factor Xa (IEGRL / DGRL) VGT (virus del grabado del tabaco) (ENLYFQLG) Trombina (LVPRLGS) PreScission (LEVLFQLGP).
[0079] Sitios de escisión por proteasa adicionales incluyen secuencias de reconocimiento que se escinden por una proteasa no citotóxica, por ejemplo, por una neurotoxina clostridial. Éstas incluyen las secuencias de
5 reconocimiento de proteínas SNARE (por ejemplo, SNAP-25, sintaxina, VAMP) que se escinden por proteasas no citotóxicas tales como neurotoxinas clostridiales. Ejemplos particulares se proporcionan en el documento US2007/0166332
[0080] También está englobado por el término sitio de escisión por proteasa una inteína, que es una
10 secuencia de auto-escisión. La reacción de auto-corte y empalme es controlable, por ejemplo, variando la concentración de agente reductor presente. Los sitios de escisión por 'activación' anteriormente mencionados también pueden emplearse como sitio de escisión 'destructiva' (tratado más adelante) en caso de que uno deba incorporarse en un polipéptido de la presente invención.
15 [0081] En una realización preferida, la proteína de fusión de la presente invención puede comprender una o más marcas de purificación localizadas en el extremo N y/o extremo C. Aunque puede emplearse cualquier marca de purificación, se prefieren las siguientes:
marca de His (por ejemplo, 6 × histidina), preferentemente como una marca del extremo C y/o extremo N
20 marca de MBP (proteína de unión a maltosa), preferentemente como una marca del extremo N marca de GST (glutatión-S-transferasa), preferentemente como una marca del extremo N marca de His-MBP, preferentemente como una marca del extremo N marca de GST-MBP, preferentemente como una marca del extremo N marca de tiorredoxina, preferentemente como una marca del extremo N
25 marca de CBD (dominio de unión a quitina), preferentemente como una marca del extremo N.
[0082] Una o más moléculas de separador / ligador de péptido pueden incluirse en la proteína de fusión. Por ejemplo, un separador de péptido puede emplearse entre una marca de purificación y el resto de la molécula de la proteína de fusión.
30 [0083] Así, un tercer aspecto de la presente invención proporciona una secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) que codifica un polipéptido como se ha descrito anteriormente (es decir, el segundo aspecto de la presente invención).
35 [0084] Dicho ácido nucleico puede incluirse en forma de un vector, tal como un plásmido, que opcionalmente puede incluir uno o más de un origen de replicación, un sitio de integración de ácido nucleico, un promotor, un terminador y un sitio de unión a ribosoma.
[0085] La presente invención también incluye un procedimiento para expresar la secuencia de ácidos
40 nucleicos anteriormente descrita (es decir, el tercer aspecto de la presente invención) en una célula huésped, en particular en E. coli.
[0086] La presente invención también incluye un procedimiento para activar un polipéptido de la presente invención, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto el polipéptido con una proteasa que escinde el
45 polipéptido en un sitio de reconocimiento (sitio de escisión) localizado entre el componente de proteasa no citotóxica y el componente de translocación, convirtiendo así el polipéptido en un polipéptido de di-cadena en el que los componentes de proteasa no citotóxica y de translocación se unen juntos por un enlace disulfuro. En una realización preferida, el sitio de reconocimiento no es nativo para una neurotoxina clostridial que se produce naturalmente y/o para una proteasa de IgA que se produce naturalmente.
50 [0087] Los polipéptidos de la presente invención pueden modificarse adicionalmente para reducir o prevenir efectos secundarios no deseados asociados a la dispersión en áreas no elegidas como diana. Según esta realización, el polipéptido comprende un sitio de escisión destructiva. El sitio de escisión destructiva es distinto del sitio de 'activación' (es decir, formación de di-cadena), y es escindible por una segunda proteasa y no por la proteasa no citotóxica. Además, cuando se escinde así en el sitio de escisión destructiva por la segunda proteasa, el polipéptido tiene potencia reducida (por ejemplo, capacidad de unión reducida a la célula diana prevista, actividad de translocación reducida y/o actividad de proteasa no citotóxica reducida). Para completitud, cualquiera de los sitios de escisión 'destructivos' de la presente invención puede emplearse por separado como un sitio de 'activación' en un
5 polipéptido de la presente invención.
[0088] Así, según esta realización, la presente invención proporciona un polipéptido que puede inactivarse y/o destruirse controlablemente en una localización fuera del emplazamiento.
10 [0089] En una realización preferida, el sitio de escisión destructiva es reconocido y escindido por una segunda proteasa (es decir, una proteasas destructiva) seleccionada de una proteasa en circulación (por ejemplo, una proteasa extracelular, tal como una proteasa del suero o una proteasa de la cascada de coagulación de la sangre), una proteasa asociada a tejido (por ejemplo, una metaloproteasa de matriz (MMP), tal como una MMP de músculo), y una proteasa intracelular (preferentemente una proteasa que está ausente de la célula diana).
15 [0090] Así, en uso, si un polipéptido de la presente invención se dispersa lejos de su célula diana prevista y/o es capturado por una célula no diana, el polipéptido se inactivará por la escisión del sitio de escisión destructiva (por la segunda proteasa).
20 [0091] En una realización, el sitio de escisión destructiva es reconocido y escindido por una segunda proteasa que está presente dentro de un tipo de célula fuera del emplazamiento. En esta realización, la célula fuera del emplazamiento y la célula diana son preferentemente tipos diferentes de células. Alternativamente (o además), el sitio de escisión destructiva es reconocido y escindido por una segunda proteasa que está presente en una localización fuera del emplazamiento (por ejemplo, distal a la célula diana). Por consiguiente, cuando la escisión
25 destructiva se produce extracelularmente, la célula diana y la célula fuera del emplazamiento pueden ser tanto los mismos tipos de células como diferentes. A este respecto, la célula diana y la célula fuera del emplazamiento pueden cada una poseer un receptor al que se une el mismo polipéptido de la invención.
[0092] El sitio de escisión destructiva de la presente invención proporciona inactivación/destrucción del
30 polipéptido cuando el polipéptido está dentro de o en una localización fuera del emplazamiento. A este respecto, la escisión en el sitio de escisión destructiva minimiza la potencia del polipéptido (cuando se compara con un polipéptido idéntico que carece del mismo sitio de escisión destructiva, o que posee el mismo sitio destructivo, pero en una forma sin escindir). A modo de ejemplo, potencia reducida incluye: unión reducida (a un receptor de célula de mamífero) y/o translocación reducida (a través de la membrana endosómica de una célula de mamífero en la
35 dirección del citosol) y/o escisión de proteína SNARE reducida.
[0093] Cuando se selecciona(n) sitio(s) de escisión destructiva en el contexto de la presente invención, se prefiere que el (los) sitio(s) de escisión destructiva no sea(n) sustratos para cualquier proteasa que pueda usarse por separado para la modificación postraduccional del polipéptido de la presente invención como parte de su 40 procedimiento de fabricación. A este respecto, las proteasas no citotóxicas de la presente invención emplean normalmente un evento de activación por proteasa (mediante un sitio de escisión por proteasa por 'activación' separado, que es estructuralmente distinto del sitio de escisión destructiva de la presente invención). El fin del sitio de escisión por activación es escindir un enlace peptídico entre la proteasa no citotóxica y los componentes de translocación o de unión del polipéptido de la presente invención, proporcionando así un polipéptido de di-cadena
45 'activado' en el que dichos dos componentes están ligados juntos mediante un enlace disulfuro.
[0094] Así, para ayudar a garantizar que el (los) sitio(s) de escisión destructiva de los polipéptidos de la presente invención no afecten adversamente el sitio de escisión por 'activación' y posterior formación de enlaces disulfuro, los primeros se introducen preferentemente en el polipéptido de la presente invención en una posición de
50 al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, y más preferentemente al menos 60, al menos 70, al menos 80 residuos de aminoácidos (contiguos) lejos del sitio de escisión por 'activación'.
[0095] El (los) sitio(s) de escisión destructiva y el sitio de escisión por activación son preferentemente exógenos (es decir, manipulados/artificiales) con respecto a los componentes nativos del polipéptido. En otras 55 palabras, dichos sitios de escisión son preferentemente no inherentes a los componentes nativos correspondientes del polipéptido. A modo de ejemplo, una proteasa o componente de translocación basado en cadena L o cadena H de BoNT/A (respectivamente) puede manipularse según la presente invención para incluir un sitio de escisión. Sin embargo, dicho sitio de escisión no estaría presente en la cadena L o cadena H nativa de BoNT correspondiente. Similarmente, si el componente de resto que elige diana del polipéptido se manipula para incluir un sitio de escisión
por proteasa, dicho sitio de escisión no estaría presente en la secuencia nativa correspondiente del resto que elige diana correspondiente.
[0096] En una realización preferida de la presente invención, el (los) sitio(s) de escisión destructiva y el sitio
5 de escisión por 'activación' no son escindidos por la misma proteasa. En una realización, los dos sitios de escisión se diferencian entre sí en que al menos uno, más preferentemente al menos dos, particularmente preferentemente al menos tres, y lo más preferentemente al menos cuatro, de los aminoácidos tolerados dentro de las secuencias de reconocimiento respectivas es/son diferente/s.
10 [0097] A modo de ejemplo, en el caso de una quimera de polipéptidos que contiene un sitio de 'activación' de factor Xa entre la cadena L clostridial y los componentes de HN, se prefiere emplear un sitio de escisión destructiva que sea un sitio distinto de un sitio de factor Xa, que puede insertarse en cualquier parte en la cadena L y/o componente(s) de HN y/o TM. En este escenario, el polipéptido puede modificarse para acomodar un sitio de 'activación' alternativo entre la cadena L y componentes de HN (por ejemplo, un sitio de escisión por enterocinasa),
15 en cuyo caso un sitio de escisión por factor Xa separado puede incorporarse en cualquier parte en el polipéptido como el sitio de escisión destructiva. Alternativamente, el sitio de 'activación' por el factor Xa existente entre la cadena L y los componentes HN puede retenerse e incorporarse un sitio de escisión alternativo tal como un sitio de escisión por trombina como sitio de escisión destructiva.
20 [0098] Cuando se identifican sitios adecuados dentro de la secuencia primaria de cualquiera de los componentes de la presente invención para la inclusión de sitio(s) de escisión, es preferible seleccionar una secuencia primaria que se corresponda estrechamente con el sitio de escisión propuesto que va a insertarse. Haciendo esto se introducen cambios estructurales mínimos en el polipéptido. A modo de ejemplo, los sitios de escisión normalmente comprenden al menos 3 residuos de aminoácidos contiguos. Así, en una realización preferida,
25 se selecciona un sitio de escisión que ya posee (en la(s) posición (posiciones) correcta(s)) al menos uno, preferentemente al menos dos de los residuos de aminoácidos que se requieren con el fin de introducir el nuevo sitio de escisión. A modo de ejemplo, en una realización puede introducirse el sitio de escisión por caspasa 3 (DMQD). A este respecto, se identifica una posición de inserción preferida que ya incluye una secuencia primaria seleccionada de, por ejemplo, Dxxx, xMxx, xxQx, xxxD, DMxx, DxQx, DxxD, xMQx, xMxD, xxQD, DMQx, xMQD, DxQD y DMxD.
30 [0099] Similarmente, se prefiere introducir los sitios de escisión en regiones expuestas a la superficie. Dentro de las regiones expuestas a la superficie se prefieren regiones de bucle existentes.
[0100] En una realización preferida de la presente invención, el (los) sitio(s) de escisión destructiva se
35 introduce(n) en una o más de la(s) siguiente(s) posición (posiciones), que se basan en la secuencia de aminoácidos primaria de BoNT/A. Mientras se identifican las posiciones de inserción (por comodidad) por referencia a BoNT/A, las secuencias de aminoácidos primarias de dominios de proteasa alternativos y/o dominios de translocación pueden alinearse fácilmente con dichas posiciones de BoNT/A.
40 [0101] Para el componente de proteasa se prefiere una o más de las siguientes posiciones: 27-31, 56-63, 7375, 78-81, 99-105, 120-124, 137-144, 161-165, 169-173, 187-194, 202-214, 237-241, 243-250, 300-304, 323-335, 375-382, 391-400 y 413-423. La numeración anterior empieza preferentemente a partir del extremo N del componente de proteasa de la presente invención.
45 [0102] En una realización preferida, el (los) sitio(s) de escisión destructiva se localiza(n) en una posición superior a 8 residuos de aminoácidos, preferentemente superior a 10 residuos de aminoácidos, más preferentemente superior a 25 residuos de aminoácidos, particularmente preferentemente superior a 50 residuos de aminoácidos del extremo N del componente de proteasa. Similarmente, en una realización preferida, el (los) sitio(s) de escisión destructiva se localizan en una posición superior a 20 residuos de aminoácidos, preferentemente
50 superior a 30 residuos de aminoácidos, más preferentemente superior a 40 residuos de aminoácidos, particularmente preferentemente superior a 50 residuos de aminoácidos del extremo C del componente de proteasa.
[0103] Para el componente de translocación se prefiere una o más de las siguientes posiciones: 474-479, 483-495, 507-543, 557-567, 576-580, 618-631, 643-650, 669-677, 751-767, 823-834, 845-859. La numeración
55 anterior admite preferentemente una posición de inicio de 449 para el extremo N del componente del dominio de translocación de la presente invención y una posición de terminación de 871 para el extremo C del componente del dominio de translocación.
[0104] En una realización preferida, el (los) sitio(s) de escisión destructiva se localiza(n) en una posición superior a 10 residuos de aminoácidos, preferentemente superior a 25 residuos de aminoácidos, más preferentemente superior a 40 residuos de aminoácidos, particularmente preferentemente superior a 50 residuos de aminoácidos del extremo N del componente de translocación. Similarmente, en una realización preferida, el (los) sitio(s) de escisión destructiva se localiza(n) en una posición superior a 10 residuos de aminoácidos,
5 preferentemente superior a 25 residuos de aminoácidos, más preferentemente superior a 40 residuos de aminoácidos, particularmente preferentemente superior a 50 residuos de aminoácidos del extremo C del componente de translocación.
[0105] En una realización preferida, el (los) sitio(s) de escisión destructiva se localizan en una posición
10 superior a 10 residuos de aminoácidos, preferentemente superior a 25 residuos de aminoácidos, más preferentemente superior a 40 residuos de aminoácidos, particularmente preferentemente superior a 50 residuos de aminoácidos del extremo N del componente de TM. Similarmente, en una realización preferida, el (los) sitio(s) de escisión destructiva se localiza(n) en una posición superior a 10 residuos de aminoácidos, preferentemente superior a 25 residuos de aminoácidos, más preferentemente superior a 40 residuos de aminoácidos, particularmente
15 preferentemente superior a 50 residuos de aminoácidos del extremo C del componente de TM.
[0106] El polipéptido de la presente invención puede incluir uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más) sitios de escisión destructiva por proteasa. Si se incluye más de un sitio de escisión destructiva, cada sitio de escisión puede ser igual o diferente. A este respecto, el uso de más de un sitio de escisión destructiva proporciona
20 inactivación fuera del emplazamiento mejorada. Similarmente, el uso de dos o más sitios de escisión destructiva diferentes proporciona flexibilidad de diseño adicional.
[0107] El (los) sitio(s) de escisión destructiva puede(n) manipularse en cualquiera del (de los) siguiente(s) componente(s) del polipéptido: el componente de proteasa no citotóxica; el componente de translocación; el resto
25 que elige diana; o el péptido separador (si está presente). A este respecto, el (los) sitio(s) de escisión destructiva se elige(n) para garantizar un efecto adverso mínimo sobre la potencia del polipéptido (por ejemplo, teniendo efecto mínimo sobre las regiones que eligen diana / de unión y/o dominio de translocación, y/o sobre el dominio de proteasa no citotóxica) mientras que se asegura que el polipéptido es lábil lejos de su sitio diana / célula diana.
30 [0108] Sitios de escisión destructiva preferidos (más las segundas proteasas correspondientes) se enumeran en la tabla inmediatamente a continuación. Los sitios de escisión enumerados son puramente ilustrativos y no pretenden ser limitantes para la presente invención.
Segunda proteasa
Secuencia de reconocimiento de sitios de escisión destructiva Tolerado de la varianza de la secuencia de reconocimiento P4-P3-P2-P1-T-P1'-P2'-P3'
P4
P3 P2 P1 P1' P2' P 3'
Trombina
LVPRTGS A,F,G,I, A,F,G P R No <D No --
L,T,V o M
,I, L, T, V, W o A o E D o E -
Trombina
GRTG G R G
Factor Xa
IEGRT A,F,G,I, L,T,V o M D o E G R --- --- ---
ADAM 17
PLAQATVRSSS
Proteasa similar a trombina de las vías respiratorias humanas (HAT)
SKGRTSLIGRV
ACE (peptidildipeptidasa A)
--- --- --- --- No P No D o E N /A
Elastasa (leucocito)
MEATVTY M, R E A, H V, T V, T, H Y -
Furina
RXR/KRT R X R o K R
Granzima
IEPDT I E P D --- --- ---
Caspasa 1
F,W,Y, L. - H, A,T D No P,E.D. Q.K o R --- ---
Caspasa 2
DVADT D V A D No P,E.D. Q.K o R --- ---
Caspasa 3
DMQDT D M Q D No P,E.D. Q.K o R --- ---
Caspasa 4
LEVDT L E V D No P,E.D. Q.K o R --- ---
Caspasa 5
L o W E H D --- --- ---
Caspasa 6
V E H o I D No P,E.D. Q.K o R --- ---
Caspasa 7
DEVDT D E V D No P,E.D. Q.K o R --- ---
Caspasa 8
I o L E T D No P,E.D. Q.K o R --- ---
Caspasa 9
LEHDT L E H D --- --- ---
Caspasa 10
IEHDT I E H D --- --- ---
[0109] Las metaloproteasas de matriz (MMP) son un grupo preferido de proteasas destructivas en el contexto de la presente invención. Dentro de este grupo, ADAM17 (EC 3.4.24,86, también conocida como TACE) se prefiere y 5 escinde una variedad de proteínas de la superficie celular ancladas a membrana para “deshacerse de” los dominios extracelulares. Adicionalmente, MMP preferidas incluyen adamalisinas, serralisinas y astacinas.
[0110] Otro grupo de proteasas destructivas preferidas es una de proteasa de sangre de mamífero, tal como trombina, factor de coagulación VIIa, factor de coagulación IXa, factor de coagulación Xa, factor de coagulación XIa, 10 factor de coagulación Xlla, calicreína, proteína C y serina proteasa asociada a MBP.
[0111] En una realización de la presente invención, dicho sitio de escisión destructiva comprende una secuencia de reconocimiento que tiene al menos 3 o 4, preferentemente 5 o 6, más preferentemente 6 o 7, y particularmente preferentemente al menos 8 residuos de aminoácidos contiguos. A este respecto, cuanto más larga 15 (en términos de residuos de aminoácidos contiguos) sea la secuencia de reconocimiento, menos probablemente es
que se produzca la escisión no específica del sitio destructivo mediante una segunda proteasa no intencionada.
[0112] Se prefiere que el sitio de escisión destructiva de la presente invención se introduzca en el componente de proteasa y/o el resto que elige diana y/o en el componente de translocación y/o en el péptido separador. De estos 5 cuatro componentes se prefiere el componente de proteasa. Por consiguiente, el polipéptido puede inactivarse rápidamente por destrucción directa de la proteasa no citotóxica y/o componente de unión y/o de translocación.
Administración de polipéptidos
10 [0113] En uso, la presente invención emplea una composición farmacéutica que comprende un polipéptido, junto con al menos un componente seleccionado de un vehículo, excipiente, adyuvante, propulsor y/o sal farmacéuticamente aceptable.
[0114] Los polipéptidos de la presente invención pueden formularse para administración oral, parenteral,
15 infusión continua, implante, inhalación o tópica. Composiciones adecuadas para inyección pueden estar en forma de disoluciones, suspensiones o emulsiones, o polvos secos que se disuelven o suspenden en un vehículo adecuado antes de uso.
[0115] Los medios de administración local pueden incluir un aerosol u otro espray (por ejemplo, un
20 nebulizador). A este respecto, una formulación de aerosol de un polipéptido permite la administración a los pulmones y/u otras vías nasales y/o bronquiales o respiratorias.
[0116] La vía de administración preferida está seleccionada de: sistémica, laparoscópica y/o inyección localizada (por ejemplo, inyección directamente en el tumor).
25 [0117] En el caso de formulaciones para inyección, es opcional incluir una sustancia farmacéuticamente activa para ayudar en la retención en o reducir la eliminación del polipéptido del sitio de administración. Un ejemplo de una sustancia farmacéuticamente activa tal es un vasoconstrictor tal como adrenalina. Una formulación tal confiere la ventaja de aumentar el tiempo de residencia del polipéptido tras la administración y así aumentar y/o potenciar su
30 efecto.
[0118] Los intervalos de dosificación para administración de los polipéptidos de la presente invención son aquellos que producen el efecto terapéutico deseado. Se apreciará que el intervalo de dosificación requerido depende de la naturaleza precisa del polipéptido o composición, la vía de administración, la naturaleza de la
35 formulación, la edad del paciente, la naturaleza, grado o gravedad de la afección del paciente, contraindicaciones, si las hay, y el criterio del médico adjunto. Variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse usando rutinas empíricas convencionales para optimización.
[0119] Dosificaciones diarias adecuadas (por kg de peso de paciente) están en el intervalo 0,0001-1 mg/kg,
40 preferentemente 0,0001-0,5 mg/kg, más preferentemente 0,002-0,5 mg/kg, y particularmente preferentemente 0,0040,5 mg/kg. La dosificación unitaria puede variar de menos de 1 microgramo a 30 mg, pero normalmente estará en la región de 0,01 a 1 mg por dosis, que puede administrarse diariamente o preferentemente menos frecuentemente, tal como semanalmente o semestralmente.
45 [0120] Una pauta de dosificación particularmente preferida se basa en 2,5 ng de polipéptido como 1X dosis. A este respecto, dosificaciones preferidas están en el intervalo 1X-100X (es decir, 2,5-250 ng).
[0121] Las formas de dosificación fluidas se preparan normalmente utilizando el polipéptido y un vehículo estéril libre de pirógenos. El polipéptido, dependiendo del vehículo y la concentración usada, puede estar tanto 50 disuelto como suspenso en el vehículo. En la preparación de disoluciones, el polipéptido puede disolverse en el vehículo, haciéndose la disolución isotónica si fuera necesario mediante la adición de cloruro sódico y esterilizándose por filtración a través de un filtro estéril usando técnicas asépticas antes de envasar en viales o ampollas estériles adecuados y sellar. Alternativamente, si la estabilidad en disolución es adecuada, la disolución en sus recipientes sellados puede esterilizarse en autoclave. Ventajosamente, aditivos tales como agentes de
55 tamponamiento, solubilizantes, estabilizantes, conservantes o bactericidas, de suspensión o emulsionantes y o agentes anestésicos locales pueden disolverse en el vehículo.
[0122] Pueden prepararse polvos secos, que se disuelven o suspenden en un vehículo adecuado antes de uso, envasando componentes previamente esterilizados en un recipiente estéril usando técnica aséptica en un área estéril. Alternativamente, los componentes pueden disolverse en recipientes adecuados usando técnica aséptica en un área estéril. El producto se liofiliza luego y los recipientes se tapan asépticamente.
[0123] Se preparan suspensiones parenterales, adecuadas para inyección intramuscular, subcutánea o
5 intradérmica, en sustancialmente el mismo modo, excepto que los componentes estériles se suspendan en el vehículo estéril en lugar de disolverse y la esterilización no puede llevarse a cabo por filtración. Los componentes pueden aislarse en un estado estéril o alternativamente pueden esterilizarse después del aislamiento, por ejemplo, por irradiación gamma.
10 [0124] Ventajosamente, un agente de suspensión, por ejemplo, polivinilpirrolidona se incluye en la/s composición/s para facilitar la distribución uniforme de los componentes.
[0125] La administración según la presente invención puede aprovecharse de una variedad de tecnologías de administración que incluyen encapsulación en micropartículas, sistemas de administración viral o impacto de aerosol
15 a alta presión.
Sección de definiciones
[0126] Resto que elige diana (TM) significa cualquier estructura química que interaccione funcionalmente con
20 un sitio de unión para producir una asociación física entre el polipéptido de la invención y la superficie de una célula diana. En el contexto de la presente invención, la célula diana es una célula cancerosa, por ejemplo, una en la que la estimulación autocrina está accionando la proliferación, supervivencia, potencial metastásico o angiogénesis. El término TM engloba cualquier molécula (es decir, una molécula que se produce naturalmente, o una variante químicamente/físicamente modificada de la misma) que puede unirse a un sitio de unión sobre la célula diana, sitio
25 de unión que es capaz de internalización (por ejemplo, formación de endosoma) - también denominado endocitosis mediada por receptor. El TM puede poseer una función de translocación de membrana endosómica, en cuyo caso los componentes de TM y del dominio de translocación separados no necesitan estar presentes en un agente de la presente invención. En toda la descripción precedente se han descrito TM específicos. Referencia a dichos TM es simplemente a modo de ejemplo, y la presente invención engloba todas las variantes y derivados de los mismos,
30 que retienen la capacidad de unión básica (es decir, elección como diana) de los TM ejemplificados.
[0127] En una realización, la célula cancerosa diana de la presente invención puede ser una célula cancerosa que no secreta hormona de crecimiento (es decir, ninguna hormona de crecimiento significativa o detectable es secretada por la misma).
35 [0128] Como se ha mencionado previamente, TM preferidos incluyen anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos) y andamiajes de unión; especialmente anticuerpos/fragmentos comercialmente disponibles y andamiajes diseñados con el fin de unión (por ejemplo, específicamente) a células cancerosas.
40 [0129] Los andamiajes de proteínas representan una nueva generación de regiones estructurales de unión universales para complementar el repertorio de expansión de anticuerpos monoclonales terapéuticos y derivados tales como scFv, moléculas de Fab, dAb (anticuerpos de un único dominio), diacuerpos y minicuerpos, cada uno de los cuales puede emplearse como TM de la presente invención. Los sistemas de andamiaje crean o modifican dominios de reconocimiento de proteínas conocidos tanto mediante la creación de andamiajes novedosos como la
45 modificación de dominios de unión de proteínas conocidos. Tales andamiajes incluyen, pero no se limitan a:
(i) andamiajes basados en proteína A - aficuerpos (Nord, K. y col. 1997 “Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain”. Nat Biotechnol 15, 772-777);
50 (ii) andamiajes basados en lipocalina - anticalinas (Skerra 2008 “Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities”. FEBS J. 275:2677-83);
(iii) andamiajes basados en fibronectina - adnectina (Dineen y col. 2008 “The Adnectin CT-322 is a novel VEGF
receptor 2 inhibitor that decreases tumor burden in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer”. BMC Cancer 55 8:352);
(iv)
avímeros (Silverman y col. 2005 “Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains”. Nat Biotechnol 23:1556-61);
(v)
andamiajes basados en anquirina - darpinas (Zahnd y col. 2006 “Selection and characterization of Her2 bindingdesigned ankyrin repeat proteins”. J Biol Chem. 281:35167-75); y
(vi)
andamiajes de centirina - basados en un pliegue de proteína que tiene homología estructural significativa a
5 dominios de Ig con bucles que son análogos a CDR. Los dominios de Ig son un módulo común en proteínas humanas y se han aplicado ampliamente como proteínas de andamiaje alternativas.
[0130] Los andamiajes de unión pueden usarse para elegir como diana tipos de células particulares mediante la interacción con proteínas de la superficie celular específicas, receptores u otros epítopes de la superficie celular
10 tales como grupos de azúcar. Tales andamiajes modificados pueden manipularse sobre polipéptidos basados en proteasa no citotóxica recombinante de la presente invención para elegir como diana tipos de células cancerosas específicas de interés.
[0131] El TM de la presente invención se une (preferentemente se une específicamente a) a la célula diana en
15 cuestión. El término “se une específicamente a” significa preferentemente que un TM dado se une a la célula diana con una afinidad de unión (Ka) de 106 M-1 o superior, preferentemente 107 M-1 o superior, más preferentemente 108 M-1 o superior, y lo más preferentemente, 109 M-1 o superior.
[0132] Referencia a TM en la presente memoria descriptiva engloba fragmentos y variantes de los mismos
20 que retienen la capacidad para unirse a la célula diana en cuestión. A modo de ejemplo, una variante puede tener al menos el 80%, preferentemente al menos el 90%, más preferentemente al menos el 95%, y lo más preferentemente al menos el 97 o al menos el 99% de homología de secuencias de aminoácidos con el TM de referencia. Así, una variante puede incluir uno o más análogos de un aminoácido (por ejemplo, un aminoácido no natural), o un enlace sustituido. Por tanto, a modo de ejemplo, el término fragmento, cuando se usa en relación con un TM, significa un
25 péptido que tiene al menos diez, preferentemente al menos veinte, más preferentemente al menos treinta, y lo más preferentemente al menos cuarenta residuos de aminoácidos del TM de referencia. El término fragmento también se refiere a las variantes anteriormente mencionadas. Así, a modo de ejemplo, un fragmento de la presente invención puede comprender una secuencia de péptidos que tiene al menos 10, 20, 30 o 40 aminoácidos, en el que la secuencia de péptidos tiene al menos el 80% de homología de secuencias con respecto a una secuencia de
30 péptidos correspondiente de aminoácidos (contiguos) del péptido de referencia.
[0133] A modo de ejemplo, los TM del péptido ErbB pueden modificarse para generar ligandos de ErbB de muteína con propiedades mejoradas tales como estabilidad elevada. A modo de ejemplo, muteínas de TM de ErbB incluyen péptidos ErbB que tienen modificaciones de aminoácidos tales como un residuo de valina en la posición 46 35 o 47 (EGFVal46 o 47), que confiere estabilidad a proteasas celulares. TM de ErbB también pueden tener aminoácidos delecionados o aminoácidos adicionales insertados. Esto incluye, pero no se limita a, EGF que tiene una deleción de los dos aminoácidos del extremo C y una sustitución de aminoácidos neutros en la posición 51 (particularmente EGF51Gln51; véase el documento US20020098178A1), y EGF con aminoácidos delecionados (por ejemplo, rEGF2-48; rEGF3-48 y rEGF4-48). Fragmentos de TM de ErbB pueden incluir fragmentos de TGFα que
40 contienen regiones de giro β predichas (por ejemplo, un péptido de la secuencia Ac-C-H-S-G-Y-V-G-A-R-C-O-OMe), fragmentos de EGF tales como [Ala20]EGF(14-31), y el péptido YHWYGYTPQNVI o GE11.
[0134] A modo de otro ejemplo, la somatostatina (SST) y la cortistatina (CST) tienen alta homología estructural, y se unen a todos los receptores de SST conocidos. La SST de longitud completa tiene la secuencia de
45 aminoácidos:
[0135] La CST de longitud completa tiene la secuencia de aminoácidos:
[0136] Referencia a estos TM incluyen los siguientes fragmentos (y variantes correspondientes) de los mismos:
10 [0137] Con respecto a las secuencias anteriores en las que se facilita un (P o G) alternativo, P se prefiere en el caso de un TM de CST, mientras que G se prefiere en el caso de un TM de SST. Si se facilita un (R o K) alternativo, R se prefiere en el caso de un TM de CST, mientras que K se prefiere en el caso de un TM de SST. Si se facilita un (S o T) alternativo, S se prefiere en el caso de un TM de CST, mientras que T se prefiere en el caso de un TM de SST.
15 [0138] Fragmentos preferidos comprenden al menos 7 o al menos 10 residuos de aminoácidos, preferentemente al menos 14 o al menos 17 residuos de aminoácidos, y más preferentemente al menos 28 o 29 residuos de aminoácidos. A modo de ejemplo, secuencias preferidas incluyen: [0139] El TM puede comprender un secuencia de aminoácidos más larga, por ejemplo, al menos 30 o 35 residuos de aminoácidos, o al menos 40 o 45 residuos de aminoácidos, mientras que el TM pueda unirse a una
5 célula secretora de GH normal, preferentemente a un receptor de SST o de CST sobre una célula secretora de GH normal. A este respecto, el TM es preferentemente un fragmento de SST o CST de longitud completa, aunque incluye al menos la secuencia central “NFFWKTF” o una de las secuencias de aminoácidos primarias anteriormente definidas.
10 [0140] Es rutina confirmar que un TM se une a la célula diana seleccionada. Por ejemplo, puede emplearse un simple experimento de desplazamiento radiactivo en el que tejido o células representativas de una célula secretora de hormona de crecimiento se exponen a TM marcado (por ejemplo, tritiado) en presencia de un exceso de TM sin marcar. En un experimento tal, las proporciones relativas de unión no específica y específica pueden evaluarse, permitiendo así la confirmación de que el TM se une a la célula diana. Opcionalmente, el ensayo puede incluir uno o
15 más antagonistas de unión, y el ensayo puede comprender además observar una pérdida de unión de TM. Ejemplos de este tipo de experimento pueden encontrarse en Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pág. 303-311, en Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford Universidad Press.
[0141] En el contexto de la presente invención, referencia a un TM de péptido (por ejemplo, péptido GHRH, o
20 péptido leptina) engloba análogos de péptidos de los mismos, mientras que el análogo se una al mismo receptor que el TM de 'referencia' correspondiente. Dichos análogos pueden incluir residuos sintéticos tales como:
β-Nal = β-naftilalanina
β-Pal = β-piridilalanina
25 hArg(Bu) = N-guanidino-(butil)-homoarginina hArg(Et)2 = N, N'-guanidino-(dimetil)-homoarginina hArg(CH2CF3)2 = N, N'-guanidino-bis-(2,2,2,-trifluoroetil)-homoarginina hArg(CH3, hexil) = N, N-guanidino-(metil,hexil)-homoarginina Lys(Me) = Ne-metillisina
30 Lys(iPr) = Ne-isopropillisina AmPhe = aminometilfenilalanina AChxAla = aminociclohexilalanina Abu = ácido α-aminobutírico Tpo = 4-tiaprolina
35 MeLeu = N-metil-leucina Orn = ornitina Nle - norleucina Nva = norvalina Trp(Br) = 5-bromo-triptófano
40 Trp(F) = 5-fluoro-triptófano Trp(NO2) = 5-nitro-triptófano Gaba = ácido γ-aminobutírico
Bmp = β-mercaptopropionilo Ac = acetilo Pen - penicilamina
5 [0142] A modo de ejemplo, el aspecto de análogos de péptidos anterior se describe en más detalle con referencia a TM de péptidos específicos tales como péptidos SST, péptidos GHRH, péptidos bombesina, péptidos GnRH y péptidos grelina, aunque los mismos principios se aplican a todos los TM de la presente invención.
[0143] Los análogos de somatostatina que pueden usarse para poner en práctica la presente invención
10 incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en las siguientes publicaciones, que se incorporan por este documento por referencia: Van Binst, G. y col. Peptide Research 5: 8 (1992); Horvath, A. y col. Abstract, “Conformations of Somatostatin Analogs Having Antitumor Activity”, 22º Simposio europeo de péptidos, 13-19 de septiembre de 1992, Interlaken, Suiza; documentos US5.506.339; EP0363589; US4.904.642; US4.871.717; US4.725.577; US4.684.620; US4.650.787; US4.585.755; US4.725.577; US4.522.813; US4.369.179; US4.360.516;
15 US4.328.214; US4.316.890; US4.310.518; US4.291.022; US4.238.481; US4.235.886; US4.211.693; US4.190.648; US4.146.612; US4.133.782; US5.506.339; US4.261.885; US4.282.143; US4.190.575; US5.552.520; EP0389180; EP0505680; US4.603.120; EP0030920; US4.853.371; WO90/12811; WO97/01579; WO91/18016; WO98/08529 y WO98/08528; WO/0075186 y WO00/06185; WO99/56769; y FR 2.522.655.
20 [0144] Los procedimientos para sintetizar análogos están bien documentados como se ilustra, por ejemplo, por las patentes citadas anteriormente. Por ejemplo, la síntesis de H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2 puede lograrse siguiendo el protocolo expuesto en el Ejemplo 1 del documento EP0395417A1. Similarmente, la síntesis de análogos con un extremo N sustituido puede lograrse, por ejemplo, siguiendo el protocolo expuesto en los documentos WO88/02756, EP0329295 y US5.240.561.
25 [0145] El uso de análogos de SST lineales también está incluido dentro del alcance de la presente invención, por ejemplo: H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-p-NO2-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H-D-*Nal-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; HD-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; y H-D-Phe-Ala
30 Tyr-D-Trp-Lys-Val-Ala-D-beta-Nal-NH2.
[0146] Uno o más restos químicos, por ejemplo, un derivado de azúcar, grupos mono o poli-hidroxialquilo (C212), mono o poli-hidroxiacilo (C2-12), o un derivado de piperazina, pueden unirse a un análogo de SST, por ejemplo, al aminoácido del extremo N – véanse los documentos WO88/02756, EP0329295 y US5.240.561.
35 [0147] Análogos de péptidos GHRH se remontan a los años 90 e incluyen el 'antagonista convencional' [Ac-Tyr', D-Arg2jhGH-RH (1-29) Nha. La patente de EE.UU. 4.659.693 desvela análogos de antagonistas de GH-RH que contienen ciertos residuos de N,N'-dialquil-omega-guanidino-alfa-aminoacilo en la posición 2 de la secuencia de GH-RH (1-29). Ejemplos adicionales se proporcionan en los documentos WO91/16923, US 5.550.212, US5.942.489,
40 US6.057.422 US5.942.489, US6.057.422, WO96/032126, WO96/022782, WO96/016707, WO94/011397, WO94/011396.
[0148] Ejemplos de análogos de bombesina adecuados para su uso en la presente invención incluyen TM que comprenden: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 (código llamado BIM-26218), D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly
45 His-Leu-Leu-NH2 (código llamado BIM-26187); D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-L [CH2NH]-Phe-NH2 (código llamado BIM-26159) y D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-L [CH2NH]-Cpa-NH2 (código llamado BIM-26189); D-PheGln-Trp-Ala-Val-N-metil-D-Ala-His-Leu-éster metílico y D-F9-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-éster metílico.
[0149] Análogos de bombesina incluyen péptidos derivados de los péptidos estructuralmente relacionados
50 que se produce naturalmente, concretamente, bombesina, neuromedina B, neuromedina C, litorina y GRP. Las secuencias de aminoácidos relevantes de estos péptidos de TM que se producen naturalmente se enumeran a continuación:
Bombesina (10 últimos aa): Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
55 Neuromedina B: Gly-Asn-Leu-Trp-Ala-Thr-Gly-His-Phe-Met-NH2 Neuromedina C: Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 Litorina: pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Met-NH2 GRP humana (10 últimos aa): Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
[0150] Análogos adecuados para su uso en la presente invención se describen en el documento de EE.UU. número de serie 502.438 presentado el 30 marzo de 1990, documento de EE.UU. número de serie 397.169 presentado el 21 de agosto de 1989, documento de EE.UU. número de serie 376.555 presentado el 7 de julio de 1989, documento de EE.UU. número de serie 394.727 presentado el 16 de agosto de 1989, documento de EE.UU. 5 número de serie 317.941 presentado el 2 de marzo de 1989, documento de EE.UU. número de serie 282.328 presentado el 9 de diciembre de 1988, documento de EE.UU. número de serie 257.998 presentado el 14 de octubre de 1988, documento de EE.UU. número de serie 248.771 presentado el 23 de septiembre de 1988, documento de EE.UU. número de serie 207.759 presentado el 16 de junio de 1988, documento de EE.UU. número de serie
204.171 presentado el 8 de junio de 1988, documento de EE.UU. número de serie 173.311 presentado el 25 de
10 marzo de 1988, documento de EE.UU. número de serie 100.571 presentado el 24 de septiembre de 1987; y documento de EE.UU. número de serie 520.225 presentado el 9 de mayo de 1990, documento de EE.UU. número de serie 440.039 presentado el 21 de noviembre de 1989. Todas estas solicitudes se incorporan por este documento por referencia. Los análogos de bombesina también se describen en Zachary y col., Proc. Nat. Aca. Sci. 82:7616 (1985); Heimbrook y col., “Synthethic Peptides: Approaches to Biological Problems”, UCLA Symposium on Mol. And
15 Cell. Biol. New Series, vol. 86, ed. Tarn y Kaiser; Heinz-Erian y col., Am. J. Physiol. G439 (1986); Martinez y col., J. Mend. Chem. 28:1874 (1985); Gargosky y col., Biochem. J. 247:427 (1987); Dubreuil y col., Drug Design and Delivery, vol 2:49, Harwood Academic Publisher, GB (1987); Heikkila y col., J. Biol. Chem. 262:16456 (1987); Caranikas y col., J. Med. Chem. 25:1313 (1982); Saeed y col., Peptides 10:597 (1989); Resell y col., Trends in Pharmacological Sciences 3:211 (1982); Lundberg y col., Proc. Nat. Aca. Sci. 80:1120, (1983); Engberg y col.,
20 Nature 293:222 (1984); Mizrahi y col., Euro. J. Pharma. 82:101 (1982); Leander y col., Nature 294:467 (1981); Woll y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 155:359 (1988); Rivier y col., Biochem. 17:1766 (1978); Cuttitta y col., Cancer Surveys 4:707 (1985); Aumelas y col., Int. J. Peptide Res. 30:596 (1987).
[0151] Los análogos pueden prepararse por técnicas convencionales tales como aquellas descritas en los
25 documentos WO92/20363 y EP0737691. Análogos de bombesina adicionales se describen en, por ejemplo, los documentos WO89/02897, WO91/17181, WO90/03980 y WO91/02746.
[0152] Ejemplo de análogos de grelina adecuados para su uso como un TM de la presente invención comprenden: Tyr-DTrp-DLys-Trp-DPhe-NH2, Tyr-DTrp-Lys-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DLys-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp30 DLys-Phe-DTrp-NH2, His-DTrp-DArg-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DLys-Trp-DPhe-Lys-NH2, DesaminoTyr-DTrp-Ala-TrpDPhe-NH2, DesaminoTyr-DTrp-DLys-Trp-DPhe-NH2, DesaminoTyr-DTrp-Ser-Trp-DPhe-Lys-NH2, DesaminoTyrDTrp-Ser-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DTrp-Phe-Met-NH2, Tyr-DTrp-CTrp-Phe-Phe-NH2, GlyΨ[CH2NH]-DβNal-Ala-TrpDPhe-Lys-NH2, GlyΨ[CH2NH]-DbetaNal-DLyS-TrP-DPhe-Lys-NH2, DAla-DbetaNal-DLys-DTrp-Phe-Lys-NH2, HisDbetaNal-DLys-Trp-DPhe-Lys-NH2, Ala-His-DTrp-DLys-Trp-DPhe-Lys-NH2, AlaL[CH2NH]-DbetaNal-Ala-Trp-DPhe35 Lys-NH2, DbetaNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-NH2, DAla-DciclohexilAla-Ala-Phe-DPhe-Nle-NH2, DciclohexilAla-Ala-PheDTrp-Lys-NH2, DAla-DbetaAla-Thr-DThr-Lys-NH2, DciclohexilAla-Ala-Trp-DPhe-NH2, DAla-DbetaNal-Ala-Ala-DAla-Lys-NH2, DbetaNal-Ala-Trp-DPhe-Leu-NH2, His-DTrp-Phe-Trp-DPhe-Lys-NH2, DAla-DbetaNal-DAla-DTrp-Phe-Lys-NH2, pAla-Trp-DAla-DTrp-Phe-NH2, His-Trp-DAla-DTrp-Phe-LysNH2, DLys-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, DAlaDbetaNal-DLys-DTrp-Phe-Lys-NH2, Tyr-DAla-Phe-Aib-NH2, Tyr-DAla-Sar-NMePhe-NH2, αγAbu-DTrp-DTrp-Ser-NH2, 40 αγAbu-DTrp-DTrp-lys-NH2, αγAbu-DTrp-DTrp-Orn-NH2, αAbu-DTrp-DTrp-Orn-NH2, DThr-DαNal-DTrp-DPro-Arg-NH2, DAla-Ala-DAla-DTrp-Phe-lys-NH2, AlaΨ[CH2NH]His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, Lys-DHis-DTrp-Phe-NH2, γAbu-DTrp-DTrp-Orn-NH2, inip-Trp-Trp-Phe-NH2, Ac-DTrp-Phe-DTrp-Leu-NH2, Ac-DTrp-Phe-DTrp-Lys-NH2, AcDTrp-DTrp-Lys-NH2, DLys-Tyr-DTrp-DTrp-Phe-Lys-NH2, Ac-DbetaNal-Leu-Pro-NH2, pAla-Trp-DTrp-DTrp-Orn-NH2, DVal-DαNal-DTrp-Phe-Arg-NH2, DLeu-DαNal-DTrp-Phe-Arg-NH2, CiclohexilAla-DαNal-DTrp- Phe-Arg-NH2, DTp
45 DαNal-DTrp-Phe-Arg-NH2, DAla-DβNal-DPro-Phe-Arg-NH2, Ac-DαNal-DTrp-Phe-Arg-NH2, DαNal-DTrp-Phe-Arg-NH2, His-DTrp-DTrp-Lys-NH2, Ac-DpNal-DTrp-NH2, αAib-DTrp-DciclohexilAla-NH2, αAib-DTrp-DAla-ciclohexilAla-NH2, DAla-DciclohexilAla-Ala-Ala-Phe-DPhe-Nle-NH2, DPhe-Ala-Phe-DPal-NH2, DPhe-Ala-Phe-DPhe-Lys-NH2, DLys-Tyr-DTrp-DTrp-Phe-NH2, Ac-DLys-Tyr-DTrp-DTrp-Phe-NH2, Arg-DTrp-Leu-Tyr-Trp-Pro(cíclico Arg-Pro), AcDβNal-PicLys-ILys-DPhe-NH2, DPal-Phe-DTrp-Phe-Met-NH2, DPhe-Trp-DPhe-Phe-Met-NH2, DPal-Trp-DPhe-Phe
50 Met-NH2, pAla-Pal-DTrp-DTrp-Orn-NH2, αγAbu-Trp-DTrp-DTrp-Orn-NH2, βAla-Trp-DTrp-DTrp-Lys-NH2, γAbu-TrpDTrp-DTrp-Orn-NH2, Ava-Trp-DTrp-DTrp-Orn-NH2, DLys-Tyr-DTrp-Ala-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DArg-Trp-DPhe-NH2, <Glu-His-Trp-DSer-DArg-NH2, DPhe-DPhe-DTrp-Met-DLys-NH2, O-(2-metilalil)benzofenona-oxima, (R)-2amino-3-(1H-indol-3-il)-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-1-ona, N-((R)-1-((R)-1-((S)-3-(1H-indol-3-il)-1-oxo-1-(4fenilpiperidin-1-il)propan-2-ilamino)-6-amino-1-oxohexan-2-ilamino)-3-hidroxi-1-oxopropan-2-il)benzamida, (S)-N-((S)
55 3-(1H-indol-3-il)-1-oxo-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-2-il)-6-acetamido-2-((S)-2-amino-3(benciloxi)propanamido)hexanamida, (S)-N-((R)-3-(1H-indol-3-il)-1-oxo-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-2-il)-2-((S)-2acetamido-3-(benciloxi)propanamido)-6-aminohexanamida, (R)-N-(3-(1H-indol-3-il)-1-(4-(2-metoxifenil)piperidin-1-il)1-oxopropan-2-il)-4-aminobutanamida, (R)-N-(3-(1H-indol-3-il)-1-(4-(2-metoxifenil)piperidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)-2amino-2-metilpropanamida, 3-(p-tolilcarbamoil)-2-naftoato de metilo, 3-(4-(2-metoxifenil)piperidina-1-carbonil)-2naftoato de etilo, 3-(2-metoxifenilcarbamoil)-2-naftoato, (S)-2,4-diamino-N-((R)-3-(naftalen-2-ilmetoxi)-1-oxo-1-(4fenilpiperidin-1-il)propan-2-il)butanamida, naftaleno-2,3-diilbis((4-(2-metoxifenil)piperazin-1-il)metanona), (R)-2amino-N-(3-(benciloxi)-1-oxo-1-(4-fenilpiperazin-1-il)propan-2-il)-2-metilpropanamida o (R)-2-amino-3-(benciloxi)-1
5 (4-fenilpiperazin-1-il)propan-1-ona.
[0153] Ejemplos de análogos de GnRH adecuados para su uso como un TM en la presente invención incluyen aquellos conocidos de, por ejemplo, los documentos EP171477, WO96/033729, WO92/022322, WO92/013883 y WO91/05563. Ejemplos específicos comprenden:
10 (NAcDQaI1,DPtf2,DPAl3,cjsPzACAla5,DPicLys6,DAla10)LHRH; (NAcDNaI1,DpClPhe2,DPaI3,cjsPzACAla5,DNicLys6,ILys8,DAla10)LHRH; (NAcDNaI1,DpClPhe2,DPaI3,Thr4,PicLys5,DPicLys6,ILys8,DAla10)LHRH; (NAcDNaI1,DpClPhe2,DPaI3,PicLys5,DPicLys6,Thr7,ILys8,DAla10)LHRH;
15 (NapDThr1,DpClPhe2,DPaI3,PicLys5,DPicLys6,ILys8,DAla10)LHRH; (NAcDNaI1,DpClPhe2,DPaI3,NicLys5,DNicLys6,Thr7,ILys8,DAla10)LHRH; (NAcDNaI1,DpClPhe2,DPaI3,Thr4NicLys5,DNicLys6,Thr7,ILys8,DAla10)LHRH; (NAcDNaI1,DpClPhe2,DPaI3,PicLys5,D(PicSar)Lys6,ILys8,DAla10)LHRH' (NAcDNaI1,DpClPhe2,DPaI3,D(PicSar)Lys6,ILys8,DAla10)LHRH;
20 (NAcDNa1,DpClPhe2,DPaI3,PicLys5,D(6ANic)Lys6,ILys8,DAla10)LHRH; (NAcDNal1,DpClPhe2,DPaI3,PicLys5,D(6ANic)Orn6,ILys8,DAla10)LHRH; (NAcDQaI1,DCpa2,DPal3,cisPzACAla5,DPicLys6,NLeu7,ILys8,DAla10)LHRH; (NAcDNaI1,DCpa2,DPal3DPicLys5,DAPhe(PicSar)β,ILys8,DAla10)LHRH; (NAcDQaI1,DCpa2,DPaI3,PicLys5,DPaI6,ILys8,DAla10)LHRH;
25 (NAcDNaI1,DCpa2,DPaI3,PicLys5,DOm(ACyp)6,ILys8,DAla10)LHRH; N-acetil-O-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(ciclo-pentil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-ø-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(ciclopentil)-Phe-Lys(ciclopentil)-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-(isopropil)D-Lys-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(bencil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe
30 Ser-Tyr-D-Lys(Cl-bencil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(heptil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-(t-butilmetil)-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-Dbeta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-(4-metil-bencil)-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-(bencil)-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-p-NH2-Phe-Phe(isopropil)Lys-ProD-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(heptil)-Phe-Lys-(heptil)-Pro-D-Ala
35 NH2; N-acetil-D-3-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(1-butilpentil)-Phe-Lys(1-butilpentil)-Arg-Pro-D-Ala-NH2.
[0154] Los polipéptidos de la presente invención carecen de un dominio HC funcional de una neurotoxina clostridial. Por consiguiente, dichos polipéptidos no pueden unirse a membranas sinaptosómicas de rata (mediante un componente HC clostridial) en ensayos de unión como se describen en Shone y col. (1985) Eur. J. Biochem. 151,
40 75-82. En una realización preferida, los polipéptidos carecen preferentemente de los 50 últimos aminoácidos del extremo C de una holotoxina de neurotoxina clostridial. En otra realización, los polipéptidos carecen preferentemente de los 100 últimos, preferentemente los 150 últimos, más preferentemente los 200 últimos, particularmente preferentemente los 250 últimos, y lo más preferentemente los 300 últimos residuos de aminoácidos del extremo C de una holotoxina de neurotoxina clostridial. Alternativamente, la actividad de unión de Hc puede
45 invalidarse/reducirse por mutagénesis - a modo de ejemplo, con referencia a BoNT/A por comodidad, la modificación de una o dos mutaciones de residuos de aminoácido (W1266 a L y Y1267 a F) en el sitio de unión a gangliósido hace que la región HC pierda su función de unión a receptor. Pueden hacerse mutaciones análogas a componentes de péptidos clostridiales de no serotipo A, por ejemplo, una construcción basada en botulina B con mutaciones (W1262 a L y Y1263 a F) o botulina E (W1224 a L y Y1225 a F). Otras mutaciones al sitio activo consiguen la misma
50 ablación de actividad de unión a receptor de HC, por ejemplo, Y1267S en toxina botulínica tipo A y el residuo altamente conservado correspondiente en las otras neurotoxinas clostridiales. Detalles de estas y otras mutaciones se describen en Rummel y col. (2004) (Molecular Microbiol. 51:631-634).
[0155] En otra realización, los polipéptidos de la presente invención carecen de un dominio HC funcional de
55 una neurotoxina clostridial y también carecen de cualquier TM funcionalmente equivalente. Por consiguiente, dichos polipéptidos carecen de la función de unión natural de una neurotoxina clostridial y no pueden unirse a membranas sinaptosómicas de rata (mediante un componente HC clostridial, o mediante cualquier TM funcionalmente equivalente) en ensayos de unión como se describen en Shone y col. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82.
[0156] El péptido HC de una neurotoxina clostridial nativa comprende aproximadamente 400-440 residuos de aminoácidos y consiste en dos dominios funcionalmente distintos de aproximadamente 25 kDa cada uno, concretamente la región del extremo N (comúnmente denominada el péptido o dominio HCN) y la región del extremo C (comúnmente denominada el péptido o dominio HCC). Este hecho se confirma por las siguientes publicaciones, 5 cada una de las cuales se incorpora en el presente documento en su totalidad por referencia a la misma: Umland TC (1997) Nat. Struct. Biol. 4: 788-792; Herreros J (2000) Biochem. J. 347: 199-204; Halpern J (1993) J. Biol. Chem.
268: 15, pág. 11188-11192; Rummel A (2007) PNAS 104: 359-364; Lacey DB (1998) Nat. Struct. Biol. 5: 898-902; Knapp (1998) Am. Cryst. Assoc. Abstract Papers 25: 90; Swaminathan y Eswaramoorthy (2000) Nat. Struct. Biol. 7: 1751-1759; y Rummel A (2004) Mol. Microbiol. 51(3), 631-643. Además, se ha documentado bien que la región del 10 extremo C (HCC), que constituye 160-200 residuos de aminoácidos del extremo C, es responsable de la unión de una neurotoxina clostridial a sus receptores de células naturales, concretamente a terminaciones nerviosas en la unión neuromuscular - este hecho también se confirma por las publicaciones anteriores. Así, referencia en toda esta memoria descriptiva a una cadena pesada clostridial que carece de un péptido HC de la cadena pesada funcional (o dominio) de forma que la cadena pesada sea incapaz de unirse a receptores de la superficie celular con los que una
15 neurotoxina clostridial nativa se une significa que la cadena pesada clostridial simplemente carece de un péptido HCC funcional. En otras palabras, la región de péptido HCC está tanto parcialmente como completamente delecionada, o de otro modo modificada (por ejemplo, mediante tratamiento químico o proteolítico convencional) para inactivar su capacidad de unión nativa a terminaciones nerviosas en la unión neuromuscular.
20 [0157] Así, en una realización, un péptido HN clostridial de la presente invención carece de parte de una porción de péptido del extremo C (HCC) de una neurotoxina clostridial y así carece de la función de unión de HC de neurotoxina clostridial nativa. A modo de ejemplo, en una realización, el péptido HN clostridial extendido del extremo C carece de 40 residuos de aminoácidos del extremo C, o 60 residuos de aminoácidos del extremo C, u 80 residuos de aminoácidos del extremo C, o 100 residuos de aminoácidos del extremo C, o 120 residuos de aminoácidos del
25 extremo C, o 140 residuos de aminoácidos del extremo C, o 150 residuos de aminoácidos del extremo C, o 160 residuos de aminoácidos del extremo C de una cadena pesada de neurotoxina clostridial. En otra realización, el péptido HN clostridial de la presente invención carece de la porción de péptidos del extremo C (HCC) entera de una neurotoxina clostridial y así carece de la función de unión de HC de neurotoxina clostridial nativa. A modo de ejemplo, en una realización, el péptido HN clostridial carece de 165 residuos de aminoácidos del extremo C, o 170
30 residuos de aminoácidos del extremo C, o 175 residuos de aminoácidos del extremo C, o 180 residuos de aminoácidos del extremo C, o 185 residuos de aminoácidos del extremo C, o 190 residuos de aminoácidos del extremo C, o 195 residuos de aminoácidos del extremo C de una cadena pesada clostridial de neurotoxina. A modo de otro ejemplo, el péptido HN clostridial de la presente invención carece de una secuencia de referencia de HCC clostridial seleccionada del grupo constituido por:
35 Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (Y1111-L1296) Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (Y1098-E1291) Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (Y1112-E1291) Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (Y1099-E1276)
40 Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (Y1086-K1252) Neurotoxina botulínica tipo F -residuos de aminoácidos (Y1106-E1274) Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (Y1106-E1297) Neurotoxina tetánica - residuos de aminoácidos (Y1128-D1315).
45 [0158] Las secuencias de referencia anteriormente identificadas deben considerarse una guía, ya que pueden producirse ligeras variaciones según subserotipos.
[0159] La proteasa de la presente invención engloba todas las proteasas no citotóxicas que pueden escindir una o más proteínas del aparato de fusión exocítico en células eucariotas.
50 [0160] La proteasa de la presente invención es preferentemente una proteasa bacteriana (o fragmento de la misma). Más preferentemente, la proteasa bacteriana está seleccionada de los géneros Clostridium o Neisseria/ Streptococcus (por ejemplo, una cadena L clostridial, o una proteasa de IgA de Neisseria, preferentemente de N. gonorrhoeae o S. pneumoniae).
55 [0161] La presente invención también engloba proteasas no citotóxicas de variante (es decir, variantes de moléculas de proteasa que se producen naturalmente), mientras que las proteasas de variante todavía demuestran la actividad de proteasa requerida. A modo de ejemplo, una variante puede tener al menos el 70%, preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 90%, y lo más preferentemente al menos el 95 o al menos el 98% de homología de secuencias de aminoácidos con una secuencia de proteasa de referencia. Así, el término variante incluye proteasas no citotóxicas que tienen actividad de endopeptidasa potenciada (o disminuida) – aquí se hace mención particular a las elevadas Kcat/Km de mutantes de BoNT/A Q161A, E54A, y K165L, véase Ahmed, S.A. (2008) Protein J. DOI 10.1007/s10930-007-9118-8, que se incorpora por referencia a la misma. El término
5 fragmento, cuando se usa en relación con una proteasa, normalmente significa un péptido que tiene al menos 150, preferentemente al menos 200, más preferentemente al menos 250, y lo más preferentemente al menos 300 residuos de aminoácidos de la proteasa de referencia. Al igual que con el componente de 'fragmento' de TM (tratado anteriormente), 'fragmentos' de proteasa de la presente invención engloban fragmentos de proteasas de variante basadas en una secuencia de referencia.
10 [0162] La proteasa de la presente invención demuestra preferentemente una actividad de serina o metaloproteasa (por ejemplo, actividad de endopeptidasa). La proteasa es preferentemente específica para una proteína SNARE (por ejemplo, SNAP-25, sinaptobrevina/VAMP o sintaxina).
15 [0163] Se hace mención particular a los dominios de proteasa de neurotoxinas, por ejemplo, los dominios de proteasa de neurotoxinas bacterianas. Así, la presente invención engloba el uso de dominios de neurotoxina que se producen en la naturaleza, además de versiones recombinantemente preparadas de dichas neurotoxinas que se producen naturalmente.
20 [0164] Neurotoxinas a modo de ejemplo se producen por clostridios, y el término neurotoxina clostridial engloba neurotoxinas producidas por C. tetani (TeNT) y por los serotipos A-G de C. botulinum (BoNT), además de las neurotoxinas similares a BoNT estrechamente relacionadas producidas por C. baratii y C. butyricum. Las abreviaturas anteriormente mencionadas se usan en toda la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, la nomenclatura BoNT/A indica la fuente de neurotoxina BoNT (serotipo A). Nomenclatura correspondiente se aplica a
25 otros serotipos de BoNT.
[0165] BoNT son las toxinas más potentes conocidas, con valores de la mediana de la dosis letal (DL50) para ratones que oscilan de 0,5 a 5 ng/kg dependiendo del serotipo. Las BoNT son adsorbidas en el tubo gastrointestinal, y, después de entrar en la circulación general, se unen a la membrana presináptica de terminaciones nerviosas
30 colinérgicas y previenen la liberación de su neurotransmisor acetilcolina. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G escinden proteína de membrana asociada a sinaptobrevina/vesículas (VAMP); BoNT/C, BoNT/A y BoNT/E escinden proteína asociada al sinaptosoma de 25 kDa (SNAP-25); y BoNT/C escinde sintaxina.
[0166] Las BoNT comparten una estructura común, siendo proteínas de di-cadena de ~150 kDa constituidas
35 por una cadena pesada (cadena H) de ~100 kDa covalentemente unida por un único enlace disulfuro a una cadena ligera (cadena L) de ~50 kDa. La cadena H consiste en dos dominios, cada uno de ~50 kDa. El dominio del extremo C (HC) se requiere para la unión neuronal de alta afinidad, mientras que el dominio del extremo N (HN) se propone que participa en la translocación de la membrana. La cadena L es una metaloproteasa dependiente de cinc responsable de la escisión de la proteína SNARE del sustrato.
40 [0167] El término fragmento de cadena L significa un componente de la cadena L de una neurotoxina, fragmento que demuestra una actividad de metaloproteasa y puede escindir proteolíticamente una proteína asociada a vesículas y/o membrana plasmática que participa en exocitosis celular.
45 [0168] Ejemplos de secuencias de proteasa (referencia) adecuadas incluyen:
Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (1-448) Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (1-440) Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (1-441) Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (1-445) Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (1-422) Neurotoxina botulínica tipo F - residuos de aminoácidos (1-439) Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (1-441) Neurotoxina tetánica - residuos de aminoácidos (1-457) Proteasa de IgA - residuos de aminoácidos (1-959)*
* Pohlner, J. y col. (1987). Nature 325, pág. 458-462.
[0169] La secuencia de referencia anteriormente identificada debe considerarse una guía, ya que pueden producirse ligeras variaciones según subserotipos. A modo de ejemplo, el documento US 2007/0166332 cita algo diferentes secuencias clostridiales:
Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (M1-K448) Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (M1-K441) Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (M1-K449) Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (M1-R445) Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (M1-R422) Neurotoxina botulínica tipo F - residuos de aminoácidos (M1-K439) Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (M1-K446) Neurotoxina tetánica - residuos de aminoácidos (M1-A457)
[0170] Una variedad de fragmentos de toxinas clostridiales que comprenden la cadena ligera pueden ser
5 útiles en aspectos de la presente invención con la condición de que estos fragmentos de la cadena ligera puedan elegir específicamente como diana los componentes centrales del aparato de liberación de neurotransmisores y así participar en la ejecución del mecanismo celular global por el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Las cadenas ligeras de toxinas clostridiales tienen aproximadamente 420-460 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio enzimático. La investigación ha mostrado que la longitud entera de una cadena ligera de
10 toxina clostridial no es necesaria para la actividad enzimática del dominio enzimático. Como ejemplo no limitante, no se requieren los ocho primeros aminoácidos de la cadena ligera de BoNT/A para actividad enzimática.
[0171] Como otro ejemplo no limitante, los ocho primeros aminoácidos de la cadena ligera de TeNT no se requieren para actividad enzimática. Asimismo, el extremo carboxilo de la cadena ligera no es necesario para la 15 actividad. Como ejemplo no limitante, los últimos 32 aminoácidos de la cadena ligera de BoNT/A (residuos 417-448) no se requieren para actividad enzimática. Como otro ejemplo no limitante, los últimos 31 aminoácidos de la cadena ligera de TeNT (residuos 427-457) no se requieren para actividad enzimática. Así, aspectos de esta realización pueden incluir cadenas ligeras de toxina clostridial que comprenden un dominio enzimático que tiene una longitud de, por ejemplo, al menos 350 aminoácidos, al menos 375 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos, al menos 425
20 aminoácidos y al menos 450 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización pueden incluir cadenas ligeras de toxina clostridial que comprenden un dominio enzimático que tiene una longitud de, por ejemplo, como máximo 350 aminoácidos, como máximo 375 aminoácidos, como máximo 400 aminoácidos, como máximo 425 aminoácidos y como máximo 450 aminoácidos.
25 [0172] Los polipéptidos de la presente invención, especialmente el componente de proteasa de los mismos, puede PEGilarse – esto puede ayudar a aumentar la estabilidad, por ejemplo, duración de la acción del componente de proteasa. La PEGilación es particularmente preferida cuando la proteasa comprende una proteasa BoNT/A, B o C1. La PEGilación incluye preferentemente la adición de PEG al extremo N del componente de proteasa. A modo de ejemplo, el extremo N de una proteasa puede extenderse con uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo,
30 cisteína), que pueden ser iguales o diferentes. Uno o más de dichos residuos de aminoácidos pueden tener su propia molécula de PEG unida (por ejemplo, covalentemente unida) al mismo. Un ejemplo de esta tecnología se describe en el documento WO2007/104567.
[0173] Un dominio de translocación es una molécula que permite la translocación de una proteasa en una
35 célula diana de forma que se produzca una expresión funcional de la actividad de proteasa dentro del citosol de la célula diana. Si cualquier molécula (por ejemplo, una proteína o péptido) posee o no la función de translocación requerida de la presente invención puede confirmarse por uno cualquiera de varios ensayos convencionales.
[0174] Por ejemplo, Shone C. (1987) describe un ensayo in vitro empleando liposomas, que se exponen a una
40 molécula de prueba. La presencia de la función de translocación necesaria se confirma por la liberación de los liposomas de K+ y/o NAD marcada, que puede monitorizarse fácilmente [véase Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pág. 175-180].
[0175] Otro ejemplo se proporciona por Blaustein R. (1987), que describe un simple ensayo in vitro empleando
45 membranas bicapa de fosfolípidos planos. Las membranas se exponen a una molécula de prueba y la función de translocación requerida se confirma por un aumento en la conductancia través de dichas membranas [véase Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, nº 1: pág. 115-120].
[0176] Metodología adicional para permitir la evaluación de la fusión de membranas y así la identificación de
50 dominios de translocación adecuados para su uso en la presente invención se proporcionan mediante procedimientos en Enzymology, vol. 220 y 221, Membrane Fusion Techniques, Partes A y B, Academic Press 1993.
[0177] La presente invención también engloba dominios de translocación de variantes, en tanto que los dominios de variantes todavía demuestren la actividad de translocación requerida. A modo de ejemplo, una variante puede tener al menos el 70%, preferentemente al menos el 80%, más preferentemente al menos el 90%, y lo más 5 preferentemente al menos el 95% o al menos el 98% de homología de secuencias de aminoácidos con un dominio de translocación de referencia. El término fragmento, cuando se usa en relación con un dominio de translocación, significa un péptido que tiene al menos 20, preferentemente al menos 40, más preferentemente al menos 80, y lo más preferentemente al menos 100 residuos de aminoácidos del dominio de translocación de referencia. En el caso de un dominio de translocación clostridial, el fragmento tiene preferentemente al menos 100, preferentemente al
10 menos 150, más preferentemente al menos 200, y lo más preferentemente al menos 250 residuos de aminoácidos del dominio de translocación de referencia (por ejemplo, dominio HN). Al igual que con el componente de 'fragmento' de TM (tratado anteriormente), los 'fragmentos' de translocación de la presente invención engloban fragmentos de dominios de translocación de variantes basados en las secuencias de referencia.
15 [0178] El dominio de translocación es preferentemente capaz de formar poros permeables a iones en membranas lipídicas en condiciones de bajo pH. Preferentemente se ha encontrado usar solo aquellas porciones de la molécula de proteína que puedan formar poros dentro de la membrana endosómica.
[0179] El dominio de translocación puede obtenerse de una fuente de proteínas microbianas, en particular de
20 una fuente de proteínas bacterianas o virales. De ahí, en una realización, el dominio de translocación es un dominio de translocación de una enzima, tal como una toxina bacteriana o proteína viral.
[0180] Está bien documentado que ciertos dominios de moléculas de toxina bacteriana pueden formar tales poros. También se sabe que ciertos dominios de translocación de proteínas de fusión de membranas viralmente
25 expresadas pueden formar tales poros. Tales dominios pueden emplearse en la presente invención.
[0181] El dominio de translocación puede ser de un origen clostridial, tal como el dominio HN (o un componente funcional del mismo). HN significa una parte o fragmento de la cadena H de una neurotoxina clostridial aproximadamente equivalente a la mitad del extremo amino de la cadena H, o el dominio correspondiente a ese 30 fragmento en la cadena H intacta. La cadena H carece de la función de unión natural del componente HC de la cadena H. A este respecto, la función HC puede eliminarse por deleción de la secuencia de aminoácidos de HC (tanto al nivel de síntesis de ADN como al nivel de post-síntesis por tratamiento con nucleasa o proteasa). Alternativamente, la función de HC puede inactivarse por tratamiento químico o biológico. Así, la cadena H es incapaz de unirse al sitio de unión sobre una célula diana con la que se une la neurotoxina clostridial nativa (es decir,
35 holotoxina).
[0182] Ejemplos de dominios de translocación (referencia) adecuados incluyen:
Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (449-871) Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (441-858) Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (442-866) Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (446-862) Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (423-845) Neurotoxina botulínica tipo F - residuos de aminoácidos (440-864) Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (442-863) Neurotoxina tetánica - residuos de aminoácidos (458-879)
40 [0183] La secuencia de referencia anteriormente identificada debe considerarse una guía, ya que pueden producirse ligeras variaciones según subserotipos. A modo de ejemplo, el documento US 2007/0166332 cita secuencias clostridiales ligeramente diferentes:
Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (A449-K871) Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (A442-S858) Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (T450-N866) Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (D446-N862) Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (K423-K845) Neurotoxina botulínica tipo F - residuos de aminoácidos (A440-K864) Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (S447-S863) Neurotoxina tetánica - residuos de aminoácidos (S458-V879)
[0184] En el contexto de la presente invención, una variedad de regiones HN de toxina clostridial que comprenden un dominio de translocación pueden ser útiles en aspectos de la presente invención con la condición de que estos fragmentos activos puedan facilitar la liberación de una proteasa no citotóxica (por ejemplo, una cadena L 5 clostridial) de vesículas intracelulares en el citoplasma de la célula diana y así participar en la ejecución del mecanismo celular global por el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Las regiones HN de las cadenas pesadas de toxinas clostridiales tienen aproximadamente 410-430 aminoácidos de longitud y comprenden un dominio de translocación. La investigación ha mostrado que la longitud entera de una región HN de una cadena pesada de la toxina clostridial no es necesaria para la actividad de translocación del dominio de 10 translocación. Así, aspectos de esta realización pueden incluir regiones HN de toxina clostridial que comprenden un dominio de translocación que tiene una longitud de, por ejemplo, al menos 350 aminoácidos, al menos 375 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos y al menos 425 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización pueden incluir regiones HN de toxina clostridial que comprenden dominio de translocación que tiene una longitud de, por ejemplo, como máximo 350 aminoácidos, como máximo 375 aminoácidos, como máximo 400 aminoácidos y como
15 máximo 425 aminoácidos.
[0185] Para más detalles sobre la base genética de la producción de toxinas en Clostridium botulinum y C. tetani, los presentes inventores se refieren a Henderson y col. (1997) en The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic Press.
20 [0186] El término HN engloba porciones HN de neurotoxina que se producen naturalmente, y porciones HN modificadas que tienen secuencias de aminoácidos que no se producen en la naturaleza y/o residuos de aminoácidos sintéticos, en tanto que las porciones de HN modificadas todavía demuestren la función de translocación anteriormente mencionada.
25 [0187] Alternativamente, el dominio de translocación puede ser de un origen no clostridial. Ejemplos de orígenes de dominios de translocación no clostridiales (referencia) incluyen, pero no se limitan a, el dominio de translocación de toxina diftérica [O=Keefe y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman y col.,
J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532; y London, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pág. 25-51], el dominio
30 de translocación de exotoxina de Pseudomonas tipo A [Prior y col. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559], los dominios de translocación de toxina del carbunco [Blanke y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442], una variedad de péptidos fusogénicos o hidrófobos de función de translocación [Plank y col. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924; y Wagner y col. (1992) PNAS, 89, pág. 7934-7938] y péptidos anfifílicos [Murata y col. (1992) Biochem., 31, pág. 1986-1992]. El dominio de translocación puede reflejar el dominio de translocación presente en
35 una proteína que se produce naturalmente, o puede incluir variaciones de aminoácidos en tanto que las variaciones no destruyan la capacidad de translocación del dominio de translocación.
[0188] Ejemplos particulares de dominios de translocación virales (referencia) adecuados para su uso en la presente invención incluyen ciertos dominios de translocación de proteínas de fusión de membranas viralmente
40 expresadas. Por ejemplo, Wagner y col. (1992) y Murata y col. (1992) describen la función de translocación (es decir, fusión de membranas y vesiculación) de varios péptidos fusogénicos y anfifílicos derivados de la región del extremo N de la hemaglutinina del virus de la gripe. Otras proteínas de fusión de membranas viralmente expresadas conocidas por tener la actividad de translocación deseada son un dominio de translocación de un péptido fusogénico del virus del bosque de Semliki (VBS), un dominio de translocación de la glicoproteína G del virus de la estomatitis
45 vesicular (VEV), un dominio de translocación de la proteína F del virus SER y un dominio de translocación de la glicoproteína de la envuelta del virus espumoso. Proteínas Aspike viralmente codificadas tienen aplicación particular en el contexto de la presente invención, por ejemplo, la proteína E1 de VBS y la proteína G de la proteína G de VEV.
[0189] El uso de los dominios de translocación (referencia) enumerados en la tabla (más adelante) incluye el
50 uso de variantes de secuencia de los mismos. Una variante puede comprender una o más sustituciones de ácidos nucleicos conservativas y/o deleciones o inserciones de ácidos nucleicos, con la condición de que la variante posea la función de translocación requerida. Una variante también puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos y/o deleciones o inserciones de aminoácidos, en tanto que la variante posea la función de translocación requerida.
Fuente del dominio de translocación
Residuos de aminoácidos Referencias
Toxina diftérica
194-380 Silverman y col., 1994, J. Biol. Chem. 269, 22524-22532 London E., 1992, Biochem. Biophys. Acta., 1113, 25-51
Dominio II de exotoxina de Pseudomonas
405-613 Prior y col., 1992, Biochemistry 31,3555-3559 Kihara & Pastan, 1994, Bioconj Chem. 5, 532-538
Hemaglutinina del virus de la gripe
GLFGAIAGFIENGWE GMIDGWYG, y variantes de los mismos Plank y col., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924 Wagner y col., 1992, PNAS, 89, 7934-7938 Murata y col., 1992, Biochemistry 31, 1986-1992
Proteína fusogénica del virus del bosque de Semliki
Dominio de translocación Kielian y col., 1996, J Cell Biol. 134(4), 863-872
Glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular
118-139 Yao y col., 2003, Virología 310(2), 319-332
Proteína F del virus SER
Dominio de translocación Seth y col., 2003, J Virol 77(11) 6520-6527
Glicoproteína de la envuelta del virus espumoso
Dominio de translocación Picard-Maureau y col., 2003, J Virol. 77(8), 4722-4730
[0190] Los polipéptidos de la presente invención pueden comprender además un dominio que facilita la translocación. Dicho dominio facilita la administración de la proteasa no citotóxica en el citosol de la célula diana y se 5 describe, por ejemplo, en los documentos WO 08/008803 y WO 08/008805.
[0191] A modo de ejemplo, dominios que facilitan la translocación adecuados incluyen un dominio de péptido fusogénico de virus envuelto, por ejemplo, dominios de péptidos fusogénicos adecuados incluyen dominio de péptido fusogénico del virus de la gripe (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del virus de la gripe A de 23 10 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de alfavirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del virus del bosque de Semliki de 26 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de vesiculovirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del virus de la estomatitis vesicular de 21 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de respirovirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del virus de Sendai de 25 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de morbillivirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del virus del moquillo canino de 25 15 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de avulavirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del virus de la enfermedad de Newcastle de 25 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de henipavirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del virus de Hendra de 25 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de metapneumovirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del metapneumovirus humano de 25 aminoácidos) o dominio de péptido fusogénico de espumavirus tal como dominio de péptido fusogénico del virus espumoso del
20 simio; o fragmentos o variantes de los mismos.
[0192] A modo de otro ejemplo, un dominio que facilita la translocación puede comprender un dominio HCN de la toxina clostridial o un fragmento o variante del mismo. En más detalle, un dominio que facilita la translocación de HCN de toxina clostridial puede tener una longitud de al menos 200 aminoácidos, al menos 225 aminoácidos, al
25 menos 250 aminoácidos, al menos 275 aminoácidos. A este respecto, un dominio que facilita la translocación de HCN de toxina clostridial tiene preferentemente una longitud de como máximo 200 aminoácidos, como máximo 225 aminoácidos, como máximo 250 aminoácidos, o como máximo 275 aminoácidos. Ejemplos específicos (referencia) incluyen:
Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (872-1110) Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (859-1097) Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (867-1111) Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (863-1098) Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (846-1085) Neurotoxina botulínica tipo F - residuos de aminoácidos (865-1105) Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (864-1105) Neurotoxina tetánica - residuos de aminoácidos (880-1127)
[0193] Las posiciones de secuencia anteriores pueden variar un poco según el serotipo/subtipo, y otros ejemplos de dominios HCN de toxina clostridial (referencia) adecuados incluyen:
5 Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (874-1110) Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (861-1097) Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (869-1111) Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (865-1098) Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (848-1085) Neurotoxina botulínica tipo F - residuos de aminoácidos (867-1105) Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (866-1105) Neurotoxina tetánica - residuos de aminoácidos (882-1127)
[0194] Cualquiera de los dominios que facilitan anteriormente descritos puede combinarse con cualquiera de los péptidos de dominios de translocación previamente descritos que son adecuados para su uso en la presente invención. Así, a modo de ejemplo, un dominio que facilita no clostridial puede combinarse con péptido de dominio
10 de translocación no clostridial o con péptido de dominio de translocación clostridial. Alternativamente, un dominio que facilita la translocación HCN de toxina clostridial puede combinarse con un péptido de dominio de translocación no clostridial. Alternativamente, un dominio que facilita la translocación HCN de toxina clostridial puede combinarse o con un péptido de dominio de translocación clostridial, ejemplos de los cuales incluyen:
Neurotoxina botulínica tipo A
- residuos de aminoácidos (449-1110)
Neurotoxina botulínica tipo B
- residuos de aminoácidos (442-1097)
Neurotoxina botulínica tipo C
- residuos de aminoácidos (450-1111)
Neurotoxina botulínica tipo D
- residuos de aminoácidos (446-1098)
Neurotoxina botulínica tipo E
- residuos de aminoácidos (423-1085)
Neurotoxina botulínica tipo F
- residuos de aminoácidos (440-1105)
Neurotoxina botulínica tipo G
- residuos de aminoácidos (447-1105)
Neurotoxina tetánica
- residuos de aminoácidos (458-1127)
15
Homología de secuencias:
[0195] Puede usarse cualquiera de una variedad de procedimientos de alineamiento de secuencias para determinar la identidad en porcentaje que incluye, sin limitación, procedimientos globales, procedimientos locales y 20 procedimientos híbridos tales como, por ejemplo, procedimientos de aproximación de segmentos. Protocolos para determinar la identidad en porcentaje son procedimientos rutinarios dentro del alcance de un experto en la. Los procedimientos globales alinean secuencias desde el principio hasta el fin de la molécula y determinan el mejor alineamiento añadiendo hasta puntuaciones de pares de residuos individuales e imponiendo penalizaciones por huecos. Procedimientos no limitantes incluyen, por ejemplo, CLUSTAL W, véase, por ejemplo, Julie D. Thompson y 25 col., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); y refinamiento iterativo, véase, por ejemplo, Osamu Gotoh, Osamu Gotoh, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996). Los procedimientos locales alinean secuencias identificando uno o más motivos conservados compartidos por todas las secuencias de entrada. Los procedimientos no limitantes incluyen, por ejemplo, Match-box, véase, por 30 ejemplo, Eric Depiereux y Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992); muestreo de Gibbs, véase, por ejemplo, C.
E. Lawrence y col., A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 252(5131) Science 208-214 (1993); Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004).
[0196] Así, el porcentaje de identidad de secuencias se determina mediante procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul y col., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992. Brevemente, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar las puntuaciones de alineamiento usando una penalización por apertura de hueco de 10, una penalización por extensión de hueco de
5 1 y la matriz de puntuación “blosum 62” de Henikoff y Henikoff (véase arriba) como se muestra más adelante (los aminoácidos se indican por los códigos convencionales de una letra).
Puntuaciones de alineamiento para determinar la identidad de secuencias
10 [0197]
[0198] La identidad en porcentaje se calcula entonces como:
15 [0199] Polipéptidos sustancialmente homólogos se caracterizan por tener una o más sustituciones, deleciones
o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferentemente de menor naturaleza, es decir, sustituciones de aminoácidos conservativas (véase más adelante) y otras sustituciones que no afectan significativamente el plegamiento o actividad del polipéptido; deleciones pequeñas, normalmente de uno a aproximadamente 30
5 aminoácidos; y extensiones del extremo amino o carboxilo pequeñas tales como un residuo de metionina del extremo amino, un péptido ligador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una marca de afinidad.
Sustituciones de aminoácidos conservativas
10 [0200]
Básicos: arginina lisina histidina
Ácidos: ácido glutámico ácido aspártico
Polares: glutamina asparagina
Hidrófobos: leucina isoleucina valina
Aromáticos: fenilalanina triptófano tirosina
Pequeños: glicina alanina serina treonina metionina
[0201] Además de los 20 aminoácidos convencionales, residuos de aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención pueden estar sustituidos con aminoácidos no convencionales (tales como 4-hidroxiprolina, 6-N
15 metil-lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y α-metilserina). Residuos de aminoácidos de polipéptido clostridial pueden estar sustituidos con un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético y aminoácidos no naturales. Los polipéptidos de la presente invención también puede comprender residuos de aminoácidos que no se producen naturalmente.
20 [0202] Aminoácidos que no se producen naturalmente incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4metano-prolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metil-treonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomo-cisteína, nitro-glutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, terc-leucina, norvalina, 2azafenilalanina, 3-azafenil-alanina, 4-azafenil-alanina y 4-fluorofenilalanina. En la técnica se conocen varios procedimientos para incorporar los residuos de aminoácidos que no se producen naturalmente en proteínas. Por
25 ejemplo, puede emplearse un sistema in vitro en el que mutaciones terminadoras se suprimen usando ARNt supresores químicamente aminoacilados. Procedimientos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar ARNt se conocen en la técnica. La transcripción y traducción de plásmidos que contienen mutaciones terminadoras se lleva a cabo en un sistema sin células que comprende un extracto de S30 de E. coli y enzimas comercialmente disponibles y otros reactivos. Las proteínas se purifican por cromatografía. Véanse, por ejemplo, Robertson y col., J. Am. Chem.
30 Soc. 113:2722, 1991; Ellman y col., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung y col., Science 259:806-9, 1993; y Chung y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). En un segundo procedimiento, la traducción se lleva a cabo en ovocitos de Xenopus por microinyección de ARNm mutado y ARNt supresores químicamente aminoacilados (Turcatti y col., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). Dentro de un tercer procedimiento, células de E. coli se cultivan en ausencia de un aminoácido natural que va a sustituirse (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia del (de los)
35 aminoácido(s) que no se produce(n) naturalmente deseado(s) (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido que no se produce naturalmente se incorpora en el polipéptido en lugar de su homólogo natural. Véase, Koide y col., Biochem. 33:7470-6, 1994. Residuos de aminoácidos que se producen naturalmente pueden convertirse en especies que no se producen naturalmente por modificación química in vitro. La modificación química puede combinarse con mutagénesis dirigida a sitio para expandir adicionalmente el
40 intervalo de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).
[0203] Residuos de aminoácidos de polipéptidos de la presente invención pueden sustituirse con un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético, aminoácidos que no se producen naturalmente y aminoácidos no naturales.
5 [0204] Aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención pueden identificarse según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis por barrido con alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-5, 1989). También pueden determinarse sitios de interacción biológica por análisis físico de la estructura, como se ha determinado por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica o marcado por fotoafinidad, conjuntamente con mutación de
10 aminoácidos de sitios de contacto putativos. Véanse, por ejemplo, de Vos y col., Science 255:306-12, 1992; Smith y col., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver y col., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Las identidades de aminoácidos esenciales también pueden deducirse del análisis de homologías con componentes relacionados (por ejemplo, los componentes de translocación o de proteasa) de los polipéptidos de la presente invención.
15 [0205] Pueden hacerse y probarse múltiples sustituciones de aminoácidos usando procedimientos conocidos de mutagénesis y cribado, tales como los desvelados por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241:53-7, 1988) o Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Brevemente, estos autores desvelan procedimientos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionando polipéptido funcional, y luego secuenciación de los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada
20 posición. Otros procedimientos que pueden usarse incluyen expresión en fago (por ejemplo, Lowman y col., Biochem. 30:10832-7, 1991; Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.223.409; Huse, publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire y col., Gene 46:145, 1986; Ner y col., DNA 7:127, 1988).
[0206] Pueden hacerse y probarse múltiples sustituciones de aminoácidos usando procedimientos conocidos
25 de mutagénesis y cribado, tales como los desvelados por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241:53-7, 1988) o Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Brevemente, estos autores desvelan procedimientos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionando polipéptido funcional, y luego secuenciación de los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros procedimientos que pueden usarse incluyen expresión en fago (por ejemplo, Lowman y col.,
30 Biochem. 30:10832-7, 1991; Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.223.409; Huse, publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire y col., Gene 46:145, 1986; Ner y col., DNA 7:127, 1988).
[0207] Ahora sigue una breve descripción de las figuras, que ilustran aspectos y/o realizaciones de la presente invención.
35 Figura 1 - Purificación de la proteína de fusión de LHN/D-CT-CST28
[0208] Usando la metodología brevemente explicada en el Ejemplo 3, una proteína de fusión de LHN/D-CT-CST28 se purificó de células BL21 (DE3) de E. coli. Brevemente, los productos solubles obtenidos tras la rotura de 40 las células se aplicaron a una columna de captura por afinidad cargada con níquel. Las proteínas unidas se eluyeron con imidazol 200 mM, se trataron con enterocinasa para activar la proteína de fusión y luego se volvieron a aplicar a una segunda columna de captura por afinidad cargada con níquel. Las muestras del procedimiento de purificación se evaluaron por SDS-PAGE. Carril 1: Eluyente de la primera columna Sepharose quelante de níquel, Carril 2: Eluyente de la segunda columna Sepharose quelante de níquel bajo condiciones no reductoras, Carril 3: Eluyente de la
45 segunda columna Sepharose quelante de níquel bajo condiciones reductoras, Carril 4: Marcadores de masa molecular (kDa).
Figura 2 - Purificación de la proteína de fusión de LHN/A-CT-SST14
50 [0209] Usando la metodología brevemente explicada en el Ejemplo 3, una proteína de fusión de LHN/A-CT-SST14 se purificó de células BL21 (DE3) de E. coli. Brevemente, los productos solubles obtenidos tras la rotura de las células se aplicaron a una columna de captura por afinidad cargada con níquel. Las proteínas unidas se eluyeron con imidazol 200 mM, se trataron con factor Xa para activar la proteína de fusión y luego se volvieron a aplicar a una segunda columna de captura por afinidad cargada con níquel. Las muestras del procedimiento de purificación se
55 evaluaron por SDS-PAGE. Carril 1: Eluyente de la primera columna Sepharose quelante de níquel, Carril 2: Marcadores de masa molecular (kDa), Carriles 3-4: Eluyente de la segunda columna Sepharose quelante de níquel bajo condiciones no reductoras, Carriles 5-6: Eluyente de la segunda columna Sepharose quelante de níquel bajo condiciones reductoras.
Figuras 3-47 - Diagramas de cajas que muestran la regulación por incremento de ARNm de proteínas SNARE en células cancerosas
[0210] El análisis estadístico de las diferencias en la expresión de SNARE entre tejidos normales y
5 cancerosos primarios se completó mediante el uso de algoritmos Oncomine (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI, EE.UU.) y herramienta de análisis de micromatrices génicas. La expresión de ARNm de SNARE se comparó con la mediana de la expresión de todos los otros genes en el estudio respectivo, para la que se generó un valor de expresión normalizada. Solo se ilustran estudios con resultados de análisis con P<0,05. En más detalle, las Figuras 3-10 ilustran perfiles de expresión de SNAP-25 en células cancerosas frente a no cancerosas diferentes. Las Figuras
10 11-16 ilustran perfiles de expresión de sintaxina-1 en células cancerosas frente a no cancerosas diferentes. Las Figuras 17-20 ilustran perfiles de expresión de sintaxina-2 en células cancerosas frente a no cancerosas diferentes. Las Figuras 21-24 ilustran perfiles de expresión de sintaxina-3 en células cancerosas frente a no cancerosas diferentes. Las Figuras 25-32 ilustran perfiles de expresión de VAMP-1 en células cancerosas frente a no cancerosas diferentes. Las Figuras 33-38 ilustran perfiles de expresión de VAMP-2 en células cancerosas frente a
15 no cancerosas diferentes. Las Figuras 39-45 ilustran perfiles de expresión de VAMP-3 en células cancerosas frente a no cancerosas diferentes. En todos los casos, los datos ilustran regulación por incremento de proteínas SNARE en células cancerosas. La Figura 46 ilustra una diferencia estadísticamente significativa en el nivel de expresión de ARNm de sintaxina-1 entre pacientes con cáncer de mama ductal invasivo recurrente a los 5 años después del diagnóstico y aquellos pacientes sin reaparición. La Figura 47 ilustra una diferencia estadísticamente significativa en
20 el nivel de expresión de ARNm de sintaxina-1 en pacientes con cáncer de mama en los que un evento metastásico se ha producido a los 5 años después del diagnóstico frente a aquellos sin metástasis. Los datos se presentan en forma de diagramas de cajas (véase la Figura 3 para la explicación) y/o como histograma, en el que cada barra representa el nivel de expresión génica normalizada en cada muestra de tejido de paciente.
25 Figura 48 - Perfilado del receptor de la superficie celular y expresión de proteínas SNARE en líneas de carcinoma de células renales por análisis de transferencia Western.
[0211] Extractos de proteína de ocho líneas de carcinoma de células renales (RCC) humanas cultivadas in vitro se prepararon en tampón de muestra Laemmli estándar (carriles 3-10). Los extractos de proteína preparados a 30 partir de cultivos primarios de neuronas de la médula espinal de rata y ganglios de la raíz dorsal se incluyeron como controles. Las proteínas se separaron sobre 10% de geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear la membrana se usaron antisueros primarios para sondar cada proteína específica y la detección se permitió por un anticuerpo dirigido contra IgG de especie conjugada con peroxidasa. Las proteínas de receptor detectadas fueron receptor de ErbB (receptor de factor
35 de crecimiento epidérmico, EGF) y receptor de hormona liberadora de hormona de crecimiento (GHRHR). Las proteínas SNARE probadas fueron SNAP-25, sintaxina-2 y sintaxina-3. Se usó gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control de carga de proteína.
Figura 49 - Detección de la escisión de proteína SNAP-25 en una línea de carcinoma de células renales por 40 análisis de transferencia Western después de 24 h de tratamiento con una fusión de EGF-LHA.
[0212] La Figura 49 muestra el efecto del tratamiento de 24 horas de células de RCC humano 786-0 con varias moléculas de proteínas de fusión ligadas a EGF. En más detalle, EGF-LHA, a dosis entre 1 y 100 nM, generó especies de SNAP-25 escindida, pero no las moléculas de control, específicamente EGF-LHB (que no eligen como
45 diana SNAP-25), una forma catalíticamente inactiva de EGF-LHA, EGF-LH-DE-A (denominada 'EGF-0' de aquí en adelante) y el ligando de EGF 'libre'. Las concentraciones indicadas son en nM.
Figura 50 - Inhibición de la proliferación in vitro de una línea de carcinoma de células renales por una fusión de EGF-LHA.
[0213] Células 786-0 sembradas en un recipiente de cultivo celular se contaron en una región predefinida a las 24 y 48 horas después del tratamiento con 25 nM de proteínas de fusión ligadas a EGF.
Figura 51 - Inhibición de la secreción de FGF-2 de una línea de carcinoma de células renales por una fusión 55 de EGF-LHA.
[0214] Medios de cultivo de células 786-0 tratadas durante 24 horas con proteínas de fusión ligadas a EGF se analizaron para factor de crecimiento de fibroblastos-2 mediante procedimientos convencionales. En más detalle, EGF-LHA, a dosis entre 1 y 50 nM, demostró una disminución dependiente de la dosis en niveles de FGF-2 presentes en el medio de cultivo, pero no las moléculas de control, específicamente la forma catalíticamente inactiva de EGF-LHA, EGF-0, y ligando de EGF 'libre'. Las concentraciones indicadas son en nM.
Figura 52 - Inhibición de la proliferación in vitro de la línea de carcinoma de células renales A498 por una 5 fusión de EGF-LHA.
[0215] La Figura 52 muestra el efecto de una proteína de fusión ligada a EGF (EGFv3-LHA, 300 nM) sobre la proliferación celular de la línea celular A498 después de 48 horas. Las células se tiñeron usando la sal de tetrazolio WST según protocolos convencionales. La molécula sin ligar LHA se incluyó como control.
Figura 53 - Inhibición de la proliferación in vitro de la línea de carcinoma de células renales ACHN por una fusión de EGF-LHA.
[0216] La Figura 53 muestra el efecto de una proteína de fusión ligada a EGF (EGFv3-LHA, a 300 nM) sobre 15 la proliferación celular de la línea celular ACHN después de 48 horas. Las células se tiñeron usando la sal de
tetrazolio WST según protocolos convencionales. La molécula sin ligar LHA se incluyó como control.
[0217] La Figura 54 muestra el efecto de una proteína de fusión ligada a EGF (EGFv3-LHA, a 150 nM) sobre
la secreción de GRP de la línea celular DMS-53 después de tratamiento durante 24 h. El medio extraído de las
células se analizó 48 horas después de la extracción de las proteínas de fusión. La forma catalíticamente inactiva de
EGF-LHA, EGF-0, se incluyó como control, ya que fue cicloheximida, un inhibidor general de la síntesis de proteínas.

Figura 54 - Inhibición de la secreción in vitro de péptido liberador de gastrina (GRP) de la línea de células de cáncer de pulmón de células pequeñas DMS-53 por una fusión de EGF-LHA.
25
Nomenclatura
[0218]
SST
somatostatina
TGF(A)
factor de crecimiento transformante (alfa)
GHRL
grelina
LEP
leptina
ET(A)
endotelina-1
FLT
receptor del factor de crecimiento endotelial vascular
CHRN(D)
receptor de acetilcolina (subunidad delta)
EPHA
receptor de efrina tipo A
EFNA
efrina-A
DLK1
proteína 1 similar a delta
JAG
proteína jagged
NRG
neuregulina
G-CSF
factor estimulante de colonias de granulocitos
AMF
factor de motilidad autocrina
NMB
neuromedina-B
CCK
colecistoquinina
PDGF
factor de crecimiento derivado de plaquetas
ADM
adrenomedulina
GDNF
factor neurotrófico derivado de la línea celular glial
TrkA
factor de crecimiento nervioso de alta afinidad
FSH
hormona estimulante del folículo
CXCR
receptor de quimiocinas C-X-C
CRLR
receptor similar a receptor de calcitonina
PDF
factor de diferenciación de la próstata
MCP
proteína quimiotáctica de monocitos
KGF
factor de crecimiento de queratinocitos
FLK1
receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular
PDGFR
receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas
NOTCH
proteína homóloga a notch de locus neurogénico
DLL
proteína similar a delta
GHS secretagogo de la hormona de crecimiento c-MET factor de crecimiento de hepatocitos c-kit factor de crecimiento de mastocitos/citoblastos MGSA/GRO actividad estimulante del crecimiento de melanoma / gen relacionado con el crecimiento BCGF factor de crecimiento de linfocitos B GnRH receptor de hormona liberadora de gonadotropina Ang-2 angiopoyetina-2 FGF factor de crecimiento de fibroblastos ErbB miembro de la familia del receptor de factor de crecimiento epidérmico VIPR receptor de polipéptido intestinal vasoactivo BRS subtipo de receptor de bombesina GRP péptido liberador de gastrina LIF factor inhibidor de leucemia GHRH hormona liberadora de hormona de crecimiento IGF factor de crecimiento similar a la insulina CRHR-2 receptor 2 de factor liberador de corticotropina BB bombesina GH hormona de crecimiento IL interleucina VEGF factor de crecimiento endotelial vascular ACH acetilcolina CST cortistatina VPAC receptor de péptido intestinal vasoactivo GRPR receptor de péptido liberador de gastrina CTR receptor de unión a calcitonina EPO eritropoyetina HB-EGF factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina HGF/SF factor de crecimiento de hepatocitos/factor de dispersión SDF-1 factor 1 derivado de células del estroma CXCL12 ligando 12 de quimiocinas (motivo C-X-C) (SDF-1) TNF factor de necrosis tumoral PGF factor de crecimiento placentario Gran4 granulina-4 TIE2 receptor 2 de angiopoyetina LH hormona luteinizante CCL ligando de quimiocinas CC NT neurotrofina NTAK neuregulina-2 BAFF factor activador de linfocitos B GM-CSF factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos NGF factor de crecimiento nervioso PACAP péptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria OB leptina NRP receptor de neurofilina
Resumen de los ejemplos
[0219]
5 Ejemplo 1 Preparación de una construcción de esqueleto de LHA Ejemplo 2 Construcción de LHD-CT-CST28 Ejemplo 3 Expresión y purificación de una proteína de fusión de LHD-CT-CST28 Ejemplo 4 Construcción de LHA-CP-EGF
10 Ejemplo 5 Expresión y purificación de una proteína de fusión de LHA-CP-EGF Ejemplo 6 Conjugación química de LHN/A a TM de GnRH Ejemplo 7 Procedimiento para tratar cáncer colorrectal Ejemplo 8 Procedimiento para tratar cáncer de mama Ejemplo 9 Procedimiento para tratar cáncer de próstata
15 Ejemplo 10 Procedimiento para tratar tumores carcinoides de pulmón
Ejemplo 11 Procedimiento para tratar cáncer de vejiga Ejemplo 12 Procedimiento para tratar cáncer de pulmón de células pequeñas Ejemplo 13 Procedimiento para tratar cáncer de próstata Ejemplo 14 Procedimiento para tratar cáncer de cuello uterino
5 Ejemplo 15 Procedimiento para tratar leucemia Ejemplo 16 Procedimiento para tratar cáncer de pulmón de células pequeñas Ejemplo 17 Procedimiento para tratar cáncer pancreático Ejemplo 18 Procedimiento para tratar cáncer de huesos metastásico Ejemplo 19 Procedimiento para tratar cáncer de pulmón de células pequeñas metastásico en el cerebro
10 Ejemplo 20 Procedimiento para tratar cáncer intestinal Ejemplo 21 Procedimiento para tratar leucemia linfocítica crónica Ejemplo 22 Procedimiento para tratar cáncer de hígado Ejemplo 23 Procedimiento para tratar linfoma de Hodgkin Ejemplo 24 Procedimiento para tratar cáncer renal
15 Ejemplo 25 Procedimiento para tratar cáncer de piel Ejemplo 26 Procedimiento para tratar cáncer orofaríngeo Ejemplo 27 Procedimiento para tratar cáncer de mieloma Ejemplo 28 Procedimiento para tratar cáncer de sarcoma de tejidos blandos Ejemplo 29 Procedimiento para tratar cáncer gástrico
20 Ejemplo 30 Procedimiento para tratar cáncer testicular Ejemplo 31 Procedimiento para tratar cáncer uterino Ejemplo 32 Procedimiento para tratar sarcoma de Kaposi Ejemplo 33 Procedimiento para tratar cáncer cerebral primario Ejemplo 34 Procedimiento para tratar cáncer rectal
25 Ejemplo 35 Evaluación de cambios de la proliferación, inhibición de la secreción celular y escisión de SNARE concomitante después del tratamiento de líneas de células de cáncer renal cultivadas in vitro con un polipéptido de la presente invención.
Resumen de SEQ ID Nº
30 [0220] Si un residuo de aminoácido de Met inicial o un codón inicial correspondiente se indica en cualquiera de las siguientes SEQ ID Nº, dicho residuo/codón es opcional.
1. Secuencia de ADN de LHN/A
35 2. Secuencia de ADN de LHN/B
3.
Secuencia de ADN de LHN/C
4.
Secuencia de ADN de LHN/D
5.
Secuencia de ADN del ligador de CT-CST28
6.
Secuencia de ADN de la fusión de LHD-CT-CST28
40 7. Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-CST28
8.
Secuencia de ADN del ligador de CP-EGF
9.
Secuencia de ADN de la fusión de LHA-CP-EGF
10.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CP-EGF
11.
Secuencia de proteínas de LHN/A 45 12. Secuencia de proteínas de LHN/B
13.
Secuencia de proteínas de LHN/C
14.
Secuencia de proteínas de LHN/D
15.
Péptido GnRH sintetizado
16.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHB-CT-SST28 50 17. Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CP-SST28
18.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-EGF
19.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-VIP
20.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-IGF1
21. Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-IGF1 55 22. Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-VIP
23.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-GnRH
24.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-GnRH
25.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-GRP
26.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHB-CT-GRP
27.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-LIF
28.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHB-CP-LIF
29.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-FGF1
30.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-FGF1
5 31. Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CT-FGF9
32.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CP-FGF9
33.
Secuencia de proteínas de la fusión de IgA-HNtet-CT-SST14
34.
Secuencia de proteínas de la fusión de IgA-HNtet-CP-SST14
35.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CT-SST14 10 36. Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CT-EGFv3
37.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHE-CT-IL6
38.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHB-CT-IL8
39.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHF-CP-GRAN4
40.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CP-TGFa 15 41. Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CP-TGFb
42.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHB-CT-TNFa
43.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-SDF1
44.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-VEGF
20 Ejemplos
Ejemplo 1 Preparación de una construcción de esqueleto de LHN/A
[0221] El siguiente procedimiento crea un clon para su uso como un esqueleto de expresión para la expresión
25 de proteínas de múltiples dominios. Este ejemplo se basa en la preparación de un clon basado en el serotipo A (SEQ ID1), aunque los procedimientos son igualmente aplicables a todos los serotipos de LHN tales como serotipo B (SEQ ID2), serotipo C (SEQ ID3) y serotipo D (SEQ ID4) y otra proteasa o dominios de translocación usando la secuencia publicada apropiada para síntesis.
30 Preparación de vectores de clonación y de expresión
[0222] pCR 4 (Invitrogen) es el vector de clonación estándar elegido debido a la falta de secuencias de restricción dentro del vector y sitios de cebadores de secuenciación adyacentes para la fácil confirmación de la construcción. El vector de expresión se basa en el vector de expresión pET (Novagen) que ha sido modificado para
35 contener el sitio de clonación múltiple NdeI-BamHI-SalI-PstI-XbaI-HindIII para la inserción de la construcción, un fragmento del vector de expresión se ha eliminado para crear un plásmido no movilizable, una variedad de diferentes marcas de fusión han sido insertadas para aumentar las opciones de purificación y un sitio XbaI existente en el esqueleto del vector ha sido eliminado para simplificar la subclonación.
40 Preparación de LC/A
[0223] La secuencia de ADN se diseña por retro-traducción de la secuencia de aminoácidos de LC/A (obtenida de fuentes de bases de datos libremente disponibles tales como GenBank (número de acceso P10845) usando una de una variedad de herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, la herramienta 45 Backtranslation v2.0 (Entelechon)). Las secuencias de reconocimiento de BamHI/SalI se incorporan en los extremos 5' y 3' respectivamente de la secuencia manteniendo el correcto marco de lectura. La secuencia de ADN se criba (usando software tal como SeqBuilder, DNASTAR Inc.) para secuencias de escisión con enzimas de restricción incorporadas durante la retro-traducción. Cualquier secuencia de escisión que se encuentre que es común a aquellas requeridas por el sistema de clonación se elimina por la herramienta Backtranslation de la secuencia 50 codificante propuesta, asegurando que se mantiene el uso de codones de E. coli común. El uso de codones de E. coli se evalúa por referencia a programas de software tales como Graphical Codon Usage Analyser (GeneArt), y el % de contenido de GC y la relación del uso de codones se evalúan por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank edición 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada que contiene el marco de lectura abierto (ORF) de LC/A se sintetiza entonces comercialmente (por ejemplo, por
55 Entelechon, GeneArt o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Preparación del inserto de HN/A
[0224] La secuencia de ADN se diseña por retro-traducción de la secuencia de aminoácidos de HN/A
(obtenida de fuentes de bases de datos libremente disponibles tales como GenBank (número de acceso P10845) usando una de una variedad de herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)). Una secuencia de restricción de PstI se añadió al extremo N y XbaI-codón de terminación-HindIII al extremo C, asegurando que se mantuviera en el marco de lectura correcto. La secuencia de 5 ADN se criba (usando software tal como SeqBuilder, DNASTAR Inc.) para secuencias de escisión con enzimas de restricción incorporadas durante la retro-traducción. Cualquier secuencia que se encuentre que es común a aquellas requeridas por el sistema de clonación se elimina por la herramienta Backtranslation de la secuencia codificante propuesta asegurando que se mantiene el uso de codones de E. coli común. El uso de codones de E. coli se evalúa por referencia a programas de software tales como Graphical Codon Usage Analyser (GeneArt), y el % de contenido
10 de GC y la relación del uso de codones se evalúan por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank edición 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada se sintetiza entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, GeneArt o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
15 Preparación del interdominio (ligador de LC-HN)
[0225] El ligador de LC-HN puede diseñarse a partir del primer principio, usando la información de secuencias existente para el ligador como molde. Por ejemplo, el ligador de serotipo A (en este caso definido con la región de polipéptidos entre dominios que existe entre las cisteínas del puente disulfuro entre LC y HN) tiene la secuencia 20 VRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDL. Esta información de secuencia está libremente disponible de fuentes de base de datos disponibles tales como GenBank (número de acceso P10845). Para la generación de un sitio de escisión por proteasa específico, la secuencia de reconocimiento nativa para el factor Xa puede usarse en la secuencia modificada VDGIITSKTKSLIEGRNKALNLQ o una secuencia de reconocimiento de enterocinasa se inserta en el bucle de activación para generar la secuencia VDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQ. Usando una de una variedad de 25 herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)) se determina la secuencia de ADN que codifica la región de ligador. Las secuencias de la enzima de restricción BamHI/SaII y PstI/XbaI/codón de terminación/HindIII se incorporan en cualquier extremo, en los marcos de lectura correctos. La secuencia de ADN se criba (usando software tal como Seqbuilder, DNASTAR Inc.) para secuencias de escisión con enzimas de restricción incorporadas durante la retro-traducción. Cualquier secuencia que se encuentre 30 que es común a aquellas requeridas por el sistema de clonación se elimina por la herramienta Backtranslation de la secuencia codificante propuesta, asegurando que se mantiene el uso de codones de E. coli común. El uso de codones de E. coli se evalúa por referencia a programas de software tales como Graphical Codon Usage Analyser (GeneArt), y el % de contenido de GC y la relación del uso de codones se evalúan por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank edición 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN
35 optimizada se sintetiza entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, GeneArt o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Ensamblaje y confirmación del clon de esqueleto
40 [0226] Debido al pequeño tamaño, el ligador de activación debe transferirse usando un procedimiento de dos etapas. El vector de ligador pCR-4 se escinde con enzimas de restricción de combinación BamHI + SalI y el vector de ligador escindido sirve entonces de receptor para el ADN de LC escindido con la enzima de restricción BamHI + SalI. Una vez se inserta el ADN que codifica LC en la dirección 5' del ADN de ligador, el fragmento de ADN de LCligador completo puede entonces aislarse y transferirse al vector de expresión de pET MCS. El LC-ligador se corta
45 del vector de clonación pCR 4 usando digestiones con enzimas de restricción BamHI/PstI. El vector de expresión pET se digiere con las mismas enzimas, pero también se trata con fosfatasa antártica como una precaución adicional para evitar la re-circularización. El LC-ligador y el esqueleto del vector pET se purifican en gel y el inserto purificado y el esqueleto del vector se ligan juntos usando T4 ADN ligasa. El producto se transforma con células TOP10 que luego se criban para LC-ligador usando digestión con restricción BamHI/PstI. El procedimiento se repite
50 entonces para la inserción de HN en los sitios de restricción PstI/HindIII de la construcción de pET-LC-ligador.
[0227] El cribado con enzimas de restricción es suficiente para garantizar que el esqueleto final es correcto, ya que todos los componentes ya se han confirmado por secuenciación durante la síntesis. Sin embargo, durante la subclonación de algunos componentes en el esqueleto, si están eliminándose e insertándose fragmentos de tamaño
55 similar, se requiere secuenciación de una pequeña región para confirmar la correcta inserción.
Ejemplo 2 Construcción de LHN/D-CT-CST28
[0228] El siguiente procedimiento crea un clon para su uso como una construcción de expresión para la expresión de fusión de múltiples dominios cuando el resto que elige diana (TM) se presenta en el extremo C con respecto al dominio de translocación. Este ejemplo se basa en la preparación de la fusión de LHN/D-CT-CST28 (SEQ ID6), aunque los procedimientos son igualmente aplicables a crear otras fusiones de proteasa, translocación y TM en las que el TM está en el extremo C con respecto al dominio de translocación. En este ejemplo, un separador
5 de glicina-serina de 15 aminoácidos flanqueante se manipula en la secuencia entre dominios para garantizar la accesibilidad del ligando a su receptor, pero son aplicables otros separadores.
Preparación del inserto de separador-CST28
10 [0229] Para la presentación de una secuencia de CST28 en el extremo C del dominio HN, una secuencia de ADN se diseña para flanquear las regiones de separador y resto que elige diana (TM) que permiten la incorporación en el clon de esqueleto (SEQ ID4). La secuencia de ADN puede disponerse como BamHI-SalI-PstI-XbaI-separadorCST28-codón de terminación-HindIII (SEQ ID5). La secuencia de ADN puede diseñarse usando una de una variedad de herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, EditSeq, mejor traducción inversa de E.
15 coli (DNASTAR Inc.), o la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)). Una vez se ha diseñado el ADN de TM, el ADN adicional requerido para codificar el separador preferido se crea por ordenador. Se prefiere garantizar que el marco de lectura correcto se mantiene para el separador, TM y las secuencias de restricción y que la secuencia de XbaI no está precedida por las bases TC, que produciría metilación de DAM. La secuencia de ADN se criba para secuencias de restricción incorporadas y cualquier secuencia adicional se elimina manualmente de la secuencia
20 restante asegurando que se mantiene el uso de codones de E. coli común. El uso de codones de E. coli se evalúa por referencia a programas de software tales como Graphical Codon Usage Analyser (GeneArt), y el % de contenido de GC y la relación del uso de codones se evalúan por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank edición 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada se sintetiza entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, GeneArt o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector
25 pCR 4.
Ensamblaje y confirmación del clon del esqueleto
[0230] Con el fin de crear una construcción de LHN/D-CT-CST28 (SEQ ID6) usando la construcción de
30 esqueleto (SEQ ID4) y el vector pCR 4-separador-TM recientemente sintetizado que codifica el TM de CST28 (SEQ ID5), puede usarse un procedimiento de una o dos etapas; normalmente se usa el procedimiento de dos etapas cuando el ADN de TM tenga menos 100 pares de bases. Usando el procedimiento de una etapa, el TM puede insertarse directamente en la construcción de esqueleto cortando el vector pCR 4-separador-TM con las enzimas de restricción XbaI y HindIII e insertando el fragmento de ADN que codifica TM en una construcción de esqueleto de
35 pET similarmente cortada. Usando el procedimiento de dos etapas, el dominio LHN se escinde del clon de esqueleto usando las enzimas de restricción BamHI y XbaI y se liga en el vector pCR 4-separador-TM similarmente digerido. Esto crea un ORF de LHN-separador-TM en pCR 4 que puede escindirse del vector usando las enzimas de restricción BamHI y HindIII para la posterior ligación en la construcción de expresión de pET similarmente escindida. La construcción final contiene el ADN de LC-ligador-HN-separador-CST28 (SEQ ID6) que producirá una proteína de
40 fusión que contiene la secuencia ilustrada en SEQ ID7.
Ejemplo 3 Expresión y purificación de una proteína de fusión de LHN/D-CT-CST28
[0231] Este ejemplo se basa en la preparación de una proteína de LHN/D que incorpora un polipéptido de TM
45 de CST28 en el extremo carboxilo del dominio HN (SEQ ID7), codificando también el ORF del vector de expresión pET una marca de purificación de histidina. Estos procedimientos son igualmente aplicables a secuencias de proteínas de fusión como se muestran en SEQ ID 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 42, 43 o 44. Cuando corresponda, la enzima de activación debe seleccionarse para ser compatible con el sitio de activación por proteasa dentro de cada secuencia.
50 Expresión de LHN/D-CT-CST28
[0232] La expresión de la proteína de LHN/D-CT-CST28 se logra usando el siguiente protocolo. Inocular 100 ml de TB modificado que contiene 0,2% de glucosamina y 30 µg/ml de kanamicina en un matraz de 250 ml con una
55 única colonia de la cepa de expresión de LHN/D-CT-CST28. Cultivar el cultivo a 37 ºC, 225 rpm durante 16 horas. Inocular 1 l de TB modificado que contiene 0,2% de glucosamina y 30 µg/ml de kanamicina en un matraz de 2 l con 10 ml de cultivo durante la noche. Cultivar los cultivos a 37 ºC hasta que se alcance una DO600 nm aproximada de 0,5, momento en el que se reduce la temperatura a 16 ºC. Después de 1 hora, inducir los cultivos con IPTG 1 mM y cultivar a 16 ºC durante otras 16 horas.
Purificación de la proteína de LHN/D-CT-CST28
[0233] Descongelar el tubo Falcon que contiene 35 ml de HEPES 50 mM a pH 7,2, NaCl 200 mM y
5 aproximadamente 10 g de pasta de células BL21 (DE3) de E. coli. Homogeneizar la pasta de células (20 psi (0,14 MPa)) asegurando que la muestra siga fría. Centrifugar las células lisadas a 18.000 rpm, 4 ºC durante 30 minutos. Cargar el sobrenadante sobre una columna quelante cargada con NiSO4 0,1 M (es suficiente una columna de 20-30 ml) equilibrada con HEPES 50 mM a pH 7,2, NaCl 200 mM. Usar una gradiente de etapas de imidazol 10, 40 y 100 mM, lavar la proteína unida no específica y eluir la proteína de fusión con imidazol 200 mM. La proteína de fusión
10 eluida se dializa contra 5 l de HEPES 50 mM a pH 7,2, NaCl 200 mM a 4 ºC durante la noche y se mide la DO280 nm para establecer la concentración de proteína. Añadir 3,2 µl de enterocinasa (New England Biolabs) por mg de proteína de fusión e incubar estáticamente durante la noche a 25 ºC. Cargar sobre una columna quelante cargada con NiSO4 0,1 M (es suficiente una columna de 20-30 ml) equilibrada con HEPES 50 mM a pH 7,2, NaCl 200 mM. Lavar la columna hasta el nivel inicial con HEPES 50 mM a pH 7,2, NaCl 200 mM. Usar un gradiente de etapas de
15 imidazol de 10, 40 y 100 mM, lavar la proteína unida no específica y eluir la proteína de fusión con imidazol 200 mM. Dializar la proteína de fusión eluida contra 5 l de HEPES 50 mM a pH 7,2, NaCl 150 mM a 4 ºC durante la noche y concentrar la fusión a aproximadamente 2 mg/ml, tomar alícuotas de muestra y congelar a -20 ºC. Probar la proteína purificada usando DO280, BCA y análisis de pureza. Las Figuras 1 y 2 demuestran la purificación de proteínas de fusión siguiendo este procedimiento como se ha analizado por SDS-PAGE.
Ejemplo 4 Construcción de LHN/A-CP-EGF
[0234] El siguiente procedimiento crea un clon para su uso como una construcción de expresión para la expresión de fusión de múltiples dominios cuando el resto que elige diana (TM) se presenta centralmente entre la
25 proteasa y el dominio de translocación. Este ejemplo se basa en la preparación de la fusión de LHN/A-CP-EGF (SEQ ID9), aunque los procedimientos son igualmente aplicables a crear otras fusiones de proteasa, translocación y TM en las que el TM está en el extremo N con respecto al dominio de translocación. En este ejemplo, un separador helicoidal flanqueante se manipula en la secuencia entre dominios para garantizar la accesibilidad del ligando a su receptor, pero son aplicables otros separadores.
Preparación del inserto de separador-EGF humano
[0235] La región de ligador de polipéptidos entre dominios LC-HN existe entre las cisteínas del puente disulfuro entre LC y HN. Para la inserción de un sitio de escisión por proteasa, separador y una región de resto que 35 elige diana (TM) en el bucle de activación se usa una de una variedad de herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)) para determinar la secuencia de ADN que codifica la región de ligador. Para la presentación central de una secuencia de TM en el extremo N del dominio HN se diseña una secuencia de ADN para las regiones de separador y de resto que elige diana (TM) que permite la incorporación en el clon de esqueleto (SEQ ID1). La secuencia de ADN puede disponerse como BamHI-SalI40 separador-sitio de activación por proteasa-EGF-separador-PstI-XbaI-codón de terminación-HindIII (SEQ ID8). Una vez se ha diseñado el ADN de TM, el ADN adicional requerido para codificar el separador preferido se crea por ordenador. Se prefiere garantizar que el marco de lectura correcto se mantiene para el separador, TM y las secuencias de restricción y que la secuencia de XbaI no está precedida por las bases TC, que produciría metilación de DAM. La secuencia de ADN se criba para secuencias de restricción incorporadas y cualquier sitio adicional se 45 elimina manualmente de la secuencia restante asegurando que se mantiene el uso de codones de E. coli común. El uso de codones de E. coli se evalúa por referencia a programas de software tales como Graphical Codon Usage Analyser (GeneArt), y el % de contenido de GC y la relación del uso de codones se evalúan por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank edición 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada se sintetiza entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, GeneArt o Sigma-Genosys) y
50 se proporciona en el vector pCR 4.
Ensamblaje y confirmación del clon de esqueleto
[0236] Con el fin de crear una construcción de LC-separador-sitio de activación-EGF-separador-HN (SEQ ID9)
55 usando la construcción de esqueleto (SEQ ID1) y el vector pCR 4-separador-sitio de activación-TM-separador recientemente sintetizado que codifica el TM de EGF (SEQ ID8), puede usarse un procedimiento de una o dos etapas; normalmente se usa el procedimiento de dos etapas cuando el ADN de TM tenga menos de 100 pares de bases. Usando el procedimiento de una etapa, la región de ligador de TM puede insertarse directamente en la construcción de esqueleto cortando el vector pCR 4-separador-sitio de activación-TM-separador con enzimas de restricción SalI y PstI e insertando el fragmento de ADN que codifica TM en una construcción de esqueleto de pET similarmente cortada. Usando el procedimiento de dos etapas, el dominio de LC se escinde del clon de esqueleto usando las enzimas de restricción BamHI y SalI y se liga en el vector pCR 4-separador-sitio de activación-TMseparador similarmente digerido. Esto crea un ORF de LC-separador-sitio de activación-TM-separador en pCR 4 que
5 puede escindirse del vector usando las enzimas de restricción BamHI y PstI para la posterior ligación en la construcción de expresión de pET similar. La construcción final contiene el ADN de LC-separador-sitio de activaciónEGF-separador-HN (SEQ ID9) que producirá una proteína de fusión que contiene la secuencia ilustrada en SEQ ID10.
10 Ejemplo 5 Expresión y purificación de una proteína de fusión de LHN/A-CP-EGF
[0237] Este ejemplo se basa en la preparación de una proteína de LHN/A que incorpora un polipéptido de TM de EGF en la región de ligador entre dominios (SEQ ID10), codificando también el ORF del vector de expresión pET una marca de purificación de histidina. Estos procedimientos son igualmente aplicables a la otra proteína de fusión
15 mostrada en SEQ ID 17, 28, 30, 32, 34, 39, 40 o 41. Cuando corresponda, la enzima de activación debe seleccionarse para ser compatible con el sitio de activación por proteasa dentro de cada secuencia.
Expresión de LHN/A-CP-EGF
20 [0238] La expresión de la proteína de LHN/A-CP-EGF se logra usando el siguiente protocolo. Inocular 100 ml de TB modificado que contiene 0,2% de glucosamina y 30 µg/ml de kanamicina en un matraz de 250 ml con una única colonia de la cepa de expresión de LHA-CP-EGF. Cultivar el cultivo a 37 ºC, 225 rpm durante 16 horas. Inocular 1 l de TB modificado que contiene 0,2% de glucosamina y 30 µg/ml de kanamicina en un matraz de 2 l con 10 ml de cultivo durante la noche. Cultivar los cultivos a 37 ºC hasta que se alcance una DO600 nm aproximada de
25 0,5, momento en el que se reduce la temperatura a 16 ºC. Después de 1 hora, inducir los cultivos con IPTG 1 mM y cultivar a 16 ºC durante otras 16 horas.
Purificación de la proteína de LHN/A-CP-EGF
30 [0239] Descongelar el tubo Falcon que contiene 35 ml de HEPES 50 mM a pH 7,2, NaCl 200 mM y aproximadamente 10 g de pasta de células BL21 (DE3) de E. coli. Homogeneizar la pasta de células (20 psi (0,14 MPa)) asegurando que la muestra siga fría. Centrifugar las células lisadas a 18.000 rpm, 4 ºC durante 30 minutos. Cargar el sobrenadante sobre una columna quelante cargada con NiSO4 0,1 M (es suficiente una columna de 20-30 ml) equilibrada con HEPES 50 mM a pH 7,2, NaCl 200 mM. Usar un gradiente de etapas de imidazol 10, 40 y 100
35 mM, lavar la proteína unida no específica y eluir la proteína de fusión con imidazol 200 mM. La proteína de fusión eluida se dializa contra 5 l de HEPES 50 mM a pH 7,2, NaCl 200 mM a 4 ºC durante la noche y se mide la DO280 nm para establecer la concentración de proteína. Añadir 3,2 µl de enterocinasa (New England Biolabs) por mg de proteína de fusión e incubar estáticamente durante la noche a 25 ºC. Cargar sobre una columna quelante cargada con NiSO4 0,1 M (es suficiente una columna de 20-30 ml) equilibrada con HEPES 50 mM a pH 7,2, NaCl 200 mM.
40 Lavar la columna hasta el nivel inicial con HEPES 50 mM a pH 7,2, NaCl 200 mM. Usar un gradiente de etapas de imidazol 10, 40 y 100 mM, lavar la proteína unida no específica y eluir la proteína de fusión con imidazol 200 mM. Dializar la proteína de fusión eluida contra 5 l de HEPES 50 mM a pH 7,2, 150 mM NaCl a 4 ºC durante la noche y concentrar la fusión a aproximadamente 2 mg/ml, tomar alícuotas de muestra y congelar a -20 ºC. Probar la proteína purificada usando DO280, BCA y análisis de pureza.
Ejemplo 6 Conjugación química de LHN/A con TM de GnRH
[0240] El siguiente procedimiento crea una molécula químicamente conjugada que contiene la secuencia de aminoácidos de LHN/A (SEQ ID11), preparada a partir de SEQ ID1 usando el procedimiento de producción
50 brevemente explicado en el Ejemplo 3, y un péptido GnRH que ha sido sintetizado químicamente (SEQ ID15). Sin embargo, los procedimientos son igualmente aplicables a la conjugación de otros péptidos con otras proteínas de dominios de proteasa/translocación tales como aquellas que contienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID12, 13 y 14.
55 [0241] La proteína de LHN/A se cambió de tampón de HEPES 50 mM-sal 150 mM a PBSE (14,2 g de Na2HPO4 100 mM, 5,85 g de NaCl 100 mM, EDTANa2 1 mM a pH 7,5 con HCl 1 M) usando la columna Bio-rad PD10. Esto se hizo lavando un volumen de columna de PBSE a través de la columna PD10, luego se añadió la proteína a la columna hasta que no salieron más gotas al final de la columna PD10. Entonces se añadieron 8 ml de PBSE y se recogieron fracciones de 0,5 ml. Entonces, las fracciones recogidas se miden usando la lectura de A280 y las fracciones que contienen la proteína se reúnen. Se obtuvo una concentración de 1,55 mg/ml de LHN/A de la etapa de cambio de tampón y ésta se usó para fijar las siguientes reacciones:
LHN/A 1,55 mg/ml
SPDP 20 mM o sulfo-LC-SPDP
A 200 µl
0
B 200 µl
Aumento de 4 veces 0,62 µl
C 200 µl
Aumento de 8 veces 1,24 µl
[0242] La muestra se dejó caer a TA durante 3 horas antes de pasarse a otra columna PD10 para cambiar el tampón a PBSE y las fracciones que contenían la proteína se reunieron. Entonces se añadió una concentración final 5 de DTT 25 mM a la proteína derivatizada y luego las muestras se dejaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las lecturas de A280 y A343 se tomaron entonces para calcular la relación de la interacción de SPDP:LHN/A y la reacción que produjo una relación de derivatización de entre 1 y 3 se usó para la conjugación de péptidos. El reactivo SPDP se une a las aminas primarias de la LHN/A mediante un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), dejando que la porción reactiva con sulfhidrilo formara un enlace disulfuro con el grupo SH libre sobre la cisteína libre sobre
10 el péptido sintetizado. En este caso, la secuencia de péptidos es GnRH, que ha sido sintetizada con una cisteína contenida dentro del péptido para permitir la conjugación, a la vez que se permite que el extremo N y el extremo C de la GnRH interaccionen con su receptor (SEQ ID15). La LHN/A derivatizada con SPDP se mezcló con un exceso de 4 veces del ligando de GnRH y luego se dejó la reacción a TA durante 90 minutos mientras caía. El exceso de GnRH se eliminó luego usando cualquier columna PD10 dejando la molécula conjugada de LHN/A-GnRH.
Ejemplo 7 - Procedimiento para tratar cáncer colorrectal
[0243] Un hombre de 62 años de edad presenta un cáncer colorrectal en estadio II. Para reducir y/o para prevenir metástasis recibe una inyección directa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, proteasa
20 de neurotoxina botulínica tipo A y dominio de translocación y un péptido VIP). En el plazo de 4 semanas se observa un encogimiento significativo del tumor sin aparición de metástasis en ninguna parte. El tratamiento se realiza opcionalmente en combinación con quimioterapia, y se repite 2 meses después y 4 semanas después ya no es observable el tumor con las herramientas de detección usuales (colonoscopia, TAC, TEP, etc.) y el nivel de antígeno carcinoembriónico (CEA) volvió al normal.
Ejemplo 8 - Procedimiento para tratar cáncer de mama
[0244] Una mujer de 61 años de edad presenta un cáncer de mama en estadio II. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección IV de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de
30 neurotoxina botulínica tipo C, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C y un péptido GnRH), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En el plazo de 4 semanas se observa un encogimiento significativo del tumor sin aparición de metástasis en ninguna parte. El tratamiento se repite 2 meses después y 6 semanas después ya no es observable el tumor con las herramientas de detección usuales (RMN, ultrasonidos, tomografía de emisión de positrones específica para mama, mamografía, escintigrafía, etc.).
Ejemplo 9 - Procedimiento para tratar cáncer de próstata
[0245] Un hombre de 77 años de edad presenta un cáncer de próstata en estadio II. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una
40 proteasa de neurotoxina botulínica tipo C, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C y un péptido IGF-1), opcionalmente en combinación con terapia hormonal. En el plazo de 4 semanas se observa un encogimiento significativo del tumor sin aparición de metástasis en ninguna parte. El tratamiento se repite 2 meses después y 8 semanas después ya no es observable el tumor con las herramientas de detección usuales (rayos X, gammagrafía con ProstaScint, RMN, ultrasonografía transrectal, TAC, etc.) y los niveles de PSA volvieron a normales.
Ejemplo 10 - Procedimiento para tratar tumores carcinoides de pulmón
[0246] Una mujer de 66 años de edad presenta tumores carcinoides de pulmón. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección IV de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de
50 neurotoxina botulínica tipo A, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo A y un péptido bFGF-1), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En el plazo de 4 semanas se observa una disminución significativa en el tamaño del tumor sin aparición de metástasis en ninguna parte. El tratamiento se repite 1 mes después y 4 semanas después ya no es observable el tumor con las herramientas de detección usuales (rayos X, TAC, broncoscopia, etc.) o usando los análisis de sangre usuales recomendados para este cáncer.
Ejemplo 11 - Procedimiento para tratar cáncer de vejiga
[0247] Un hombre de 56 años de edad presenta un cáncer de vejiga en estadio II. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección directa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una
5 proteasa de IgA, un dominio de translocación de neurotoxina tetánica y un péptido IGF-1), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En el plazo de 2 semanas se observa un encogimiento significativo del tumor sin aparición de metástasis en ninguna parte. El tratamiento se repite 2 meses después y 4 semanas después ya no es observable el tumor con las herramientas de detección usuales (colonoscopia, TAC, TEP, etc.).
10 Ejemplo 12 - Procedimiento para tratar cáncer de pulmón de células pequeñas
[0248] Un hombre de 79 años de edad es diagnosticado con un cáncer de pulmón de células pequeñas en estadio I. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo A, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica
15 tipo A y un péptido ERBB3 de neuregulina), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En el plazo de 3 semanas se observa un aumento significativo en el tamaño del tumor sin aparición de metástasis en ninguna parte. El tratamiento se repite 2 meses después y 5 semanas después ya no es observable el tumor con las herramientas de detección usuales (rayos X, TAC, RMN, TEP, gammagrafía, broncoscopia, etc.) o usando los análisis de sangre usuales recomendados para este cáncer.
Ejemplo 13 - Procedimiento para tratar cáncer de próstata
[0249] Un hombre de 72 años de edad es diagnosticado con un cáncer de próstata en estadio II. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por 25 ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C, un ligador GS20 y un péptido IGF-1), opcionalmente en combinación con tratamiento de privación de andrógenos. En el plazo de 10 días se observa un encogimiento significativo del tumor sin aparición de metástasis en ninguna parte. El tratamiento se repite 2 meses después y 5 semanas después ya no es observable el tumor con las herramientas de detección usuales (rayos X, gammagrafía con ProstaScint, RMN, ultrasonografía transrectal, TAC,
30 etc.) y los niveles de PSA volvieron a normales.
Ejemplo 14 - Procedimiento para tratar cáncer de cuello uterino
[0250] Una mujer de 60 años de edad diagnosticada con cáncer de cuello uterino en un estadio limitado se
35 trata con cirugía. Para mejorar los efectos del tratamiento y para prevenir metástasis recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo D, un ligador GS20 y un péptido somatostatina-14). En el plazo de 6 semanas no se observa reaparición del tumor. El tratamiento se repite 3 meses después y 8 semanas después ya no es observable el tumor con las herramientas de detección usuales (rayos X, TAC, RMN, TEP,
40 gammagrafía, broncoscopia, etc.) o usando los análisis de sangre usuales recomendados para este cáncer.
Ejemplo 15 - Procedimiento para tratar leucemia
[0251] Un hombre de 42 años de edad es diagnosticado con un cáncer de leucemia de células pilosas en
45 estadio II. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo D, un ligador GS20 y un péptido FGF-1), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En el plazo de 10 días se observa una reducción significativa en la carga tumoral sin aparición de metástasis. El tratamiento se repite 1 mes después y 3 semanas después ya no es observable el tumor con las herramientas de
50 detección usuales (RMN, hemograma completo, etc.).
Ejemplo 16 - Procedimiento para tratar cáncer de pulmón de células pequeñas
[0252] Un hombre de 56 años de edad es diagnosticado con un cáncer de pulmón de células pequeñas en un
55 estadio extenso. Para tratar y/o para prevenir metástasis en cualquier parte recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C y un péptido EGF), opcionalmente en combinación con quimioterapia y radioterapia. En el plazo de 3 semanas se observa un encogimiento significativo del tumor y una diminución en el tamaño de las metástasis sin aparición de nuevas metástasis en ninguna parte. El tratamiento se repite dos veces después de 2 meses y 5 meses. El paciente murió 11 meses después, 6 meses después de lo esperado con este tipo de tratamiento y este estadio de la enfermedad.
Ejemplo 17 - Procedimiento para tratar cáncer pancreático
5 [0253] Una mujer de 48 años de edad es diagnosticada con cáncer pancreático en un estadio avanzado. Recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C y un péptido EGF), opcionalmente en combinación con el agente quimioterapéutico gemcitabina. En el plazo de 3 semanas se observa
10 una reducción significativa en el crecimiento del tumor primario y una diminución en el tamaño de las metástasis sin aparición de nuevas metástasis en ninguna parte. El tratamiento se repite dos veces después de 2 meses y 5 meses. La paciente murió 12 meses después, 6 meses después de lo esperado con este tipo de tratamiento y este estadio de la enfermedad.
15 Ejemplo 18 - Procedimiento para tratar cáncer de huesos metastásico
[0254] Un hombre de 71 años de edad es diagnosticado con un cáncer de próstata en estadio IV. Para tratar el crecimiento metastásico en su hueso recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica
20 tipo D y un péptido TGF-beta), opcionalmente en combinación con radiación con haces externos más terapia hormonal. En el plazo de 4 semanas se observa un encogimiento significativo del tumor en los sitios metastásicos sin aparición de metástasis en ninguna parte. El tratamiento se repite 2 y 4 meses después. Después de 6 meses ya no es observable ningún aumento detectable en la carga tumoral con las herramientas de detección usuales (rayos X, gammagrafía con ProstaScint, RMN, TAC, etc.).
Ejemplo 19 - Procedimiento para tratar cáncer de pulmón de células pequeñas metastásico en el cerebro
[0255] Un hombre de 65 años de edad diagnosticado con un cáncer de pulmón de células pequeñas en un estadio avanzado también presenta múltiples metástasis cerebrales. Para el tratamiento, un polipéptido de la 30 presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo A, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo A y un péptido SDF-1) se administra en su cerebro por administración potenciada por convección, opcionalmente en combinación con quimioterapia y radiación del cerebro completo. En el plazo de 4 semanas se observa un encogimiento significativo de los sitios metastásicamente tumorales sin aparición de metástasis en ninguna parte. El tratamiento se repite a los 2 meses y 8 semanas después ya no observable tumor
35 metastásico con las herramientas de detección usuales (rayos X, TAC, RMN, TEP, gammagrafía, etc.) o usando los análisis de sangre usuales recomendados para este cáncer.
Ejemplo 20 - Procedimiento para tratar cáncer intestinal
40 [0256] Un hombre de 76 años de edad es diagnosticado con un cáncer del intestino delgado en estadio II. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección directa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo A y dominio de translocación y un péptido EGF), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En el plazo de 4 semanas se observa un encogimiento significativo del tumor sin aparición de metástasis en ninguna parte y entonces se realiza cirugía para eliminar el tumor.
Ejemplo 21 - Procedimiento para tratar leucemia linfocítica crónica
[0257] Un hombre de 54 años de edad es diagnosticado con leucemia linfocítica crónica recurrente. Para el tratamiento recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa
50 de neurotoxina botulínica tipo B, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo B y un péptido LIF-1), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En el plazo de 2 semanas se observa una reducción significativa en el recuento de células tumorales en la sangre del paciente, que sigue estable durante un periodo de tiempo prolongado como se determina por examen microscópico y análisis de citometría de flujo de la sangre del paciente.
55 Ejemplo 22 - Procedimiento para tratar cáncer de hígado
[0258] Una mujer de 55 años de edad es diagnosticada con un cáncer hepático en estadio IV. Para el tratamiento recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo D y un péptido TGFalfa), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En el plazo de 2 semanas se observa un encogimiento significativo del tumor en estudios de TEP-TAC junto con una reducción de alfa-fetoproteína en la sangre, que era elevada antes del tratamiento.
5 Ejemplo 23 - Procedimiento para tratar linfoma de Hodgkin
[0259] Un hombre de 24 años de edad es diagnosticado con linfoma de Hodgkin en estadio IVA. Para el tratamiento recibe inyecciones intravenosas repetidas de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo B, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo B y un péptido
10 VEGF), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En el plazo de 2 semanas se observa una reducción significativa en el volumen tumoral y la circulación sanguínea tumoral usando las herramientas de detección usuales (RMN, TAC) y conduce a remisión completa en el plazo de 2 meses.
Ejemplo 24 - Procedimiento para tratar cáncer renal
15 [0260] Un hombre de 54 años de edad es diagnosticado con carcinoma de células renales avanzado. Para el tratamiento recibe una administración intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo A, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C y un péptido VEGF), opcionalmente en combinación con el terapéutico antiangiogénico sunitinib, un inhibidor de tirosina cinasas
20 (TKI) de molécula pequeña. En el plazo de 14 días se observa un encogimiento significativo del tumor por encima del esperado con TKI solo usando las herramientas de detección usuales (CT, RMN, análisis de sangre).
Ejemplo 25 - Procedimiento para tratar cáncer de piel
25 [0261] Una mujer de 31 años de edad es diagnosticada con un melanoma facial. Para el tratamiento recibe administración directa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C, un ligador GS20 y un péptido VEGF), opcionalmente en combinación con quimioterapia y inmunoterapia. En el plazo de 21 días se observa un encogimiento significativo del tumor por encima del esperado con quimio- e inmunoterapia solo, permitiendo la
30 resección quirúrgica con márgenes claros, pero más reducidos.
Ejemplo 26 - Procedimiento para tratar cáncer orofaríngeo
[0262] Un hombre de 63 años de edad es diagnosticado con un cáncer de cabeza y cuello en estadio III. Para
35 el tratamiento recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo D y un péptido TGF-alfa), opcionalmente en combinación con radioterapia y quimioterapia. En el plazo de 4 semanas es evidente una mejora significativa en la capacidad del paciente para tragar alimentos que se mantiene más de lo que cabría esperar con la terapia de combinación sola.
Ejemplo 27 - Procedimiento para tratar cáncer de mieloma
[0263] Una mujer de 73 años de edad diagnosticada con lesiones óseas osteolíticas e hipercalcemia asociados a mieloma múltiple se trata con la quimioterapia convencional. Para mejorar los efectos de los
45 tratamientos recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C y un péptido IL-6). En el plazo de 4 semanas se observa una reducción significativa en el tamaño de las lesiones óseas y gravedad de la hipercalcemia sin aparición de nuevas lesiones en ninguna parte usando las herramientas de detección usuales (RMN, rayos X, análisis de sangre).
Ejemplo 28 - Procedimiento para tratar cáncer de sarcoma de tejidos blandos
[0264] Una mujer de 51 años de edad diagnosticada con un fibrosarcoma de la pierna se trata con radioterapia en un intento por reducir el tamaño del tumor antes de la resección quirúrgica. Para mejorar los efectos
55 del tratamiento con radiación recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C, un ligador GS20 y un péptido bFGF). En el plazo de 14 días se observa un encogimiento significativo del tumor por encima del esperado con la radioterapia sola, permitiendo la resección quirúrgica con claros márgenes.
Ejemplo 29 - Procedimiento para tratar cáncer gástrico
[0265] Un hombre de 84 años de edad diagnosticado con cáncer gástrico avanzado e incapaz de someterse a resección quirúrgica se trata con radioterapia para aliviar el bloqueo asociado al tumor. Para mejorar los efectos del
5 tratamiento recibe múltiples inyecciones directas de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo A, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo A, un ligador GS20 y un péptido GRP). En el plazo de 5 días se observa un encogimiento significativo del tumor con las herramientas de detección usuales (examen gastroscópico y TAC). El tratamiento se repite 1 mes después y 4 meses después no ha vuelto a aparecer el bloqueo tumoral.
Ejemplo 30 - Procedimiento para tratar cáncer testicular
[0266] Un hombre de 32 años de edad es diagnosticado con un cáncer de seminoma en estadio I. Para tratar y/o para prevenir la reaparición recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por
15 ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C, un ligador GS20 y un péptido VEGF), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En el plazo de 14 días se observa un encogimiento significativo del tumor. El tratamiento se repite 1 mes después y 6 semanas después ya no es observable el tumor con las herramientas de detección usuales (análisis de sangre y TAC).
20 Ejemplo 31 - Procedimiento para tratar cáncer uterino
[0267] Una mujer de 76 años de edad diagnosticada con un cáncer endometrial en estadio IIA se trata con quimioterapia y radioterapia usual. Para mejorar los efectos del tratamiento y para prevenir metástasis recibe una inyección directa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica
25 tipo A y dominio de translocación y un péptido EGF). En el plazo de 6 semanas se observa un encogimiento significativo del tumor con la visualización directa de la cavidad uterina por histeroscopia sin aparición de metástasis en ninguna parte.
Ejemplo 32 - Procedimiento para tratar sarcoma de Kaposi
30 [0268] Un hombre de 48 años de edad es diagnosticado con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y presenta múltiples lesiones por sarcoma de Kaposi. Para el tratamiento recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo A, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo A y un péptido IL-6), opcionalmente en combinación con interferón alfa.
35 En el plazo de 3 semanas se observa una reducción significativa en el tamaño de la lesión sin aparición de nuevas lesiones en ninguna parte. El tratamiento se repite dos veces después de 1 mes y 3 meses que detiene eficazmente la progresión del sarcoma de Kaposi.
Ejemplo 33 - Procedimiento para tratar cáncer cerebral primario
40 [0269] Una mujer de 45 años de edad es diagnosticada con glioblastoma. Para tratar y/o para prevenir más metástasis recibe una administración intracraneal de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo C, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C y un péptido VEGF), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En el plazo de 4 semanas se observa una disminución
45 significativa en el tamaño del tumor sin aparición de metástasis en ninguna parte. El tratamiento se repite 1 mes después y 4 semanas después ya no es observable el tumor con las herramientas de detección usuales (rayos X, TAC, etc.).
Ejemplo 34 - Procedimiento para tratar cáncer rectal
50 [0270] Un hombre de 77 años de edad diagnosticado con un cáncer rectal en estadio II se trata con un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, proteasa de neurotoxina botulínica tipo A y un fragmento F(ab)'2 de anticuerpo anti-EGFR), opcionalmente en combinación con radioterapia y cirugía. Recibe inyecciones localizadas del polipéptido (por ejemplo, 3 días antes de una pauta estándar de radiación fraccionada) y en el plazo de 2
55 semanas se observa un encogimiento significativo del tumor que permite la completa resección quirúrgica. 12 meses después no es observable reaparición del tumor con las herramientas de detección usuales (colonoscopia, TAC, TEP, etc.) y el nivel de antígeno carcinoembriónico (CEA) volvió al normal.
Ejemplo 35 - Evaluación de cambios de la proliferación, inhibición de la secreción celular y escisión de SNARE concomitante después del tratamiento de líneas de células de cáncer renal cultivadas in vitro con un polipéptido de la presente invención.
Procedimientos: Análisis de proliferación:
[0271] Un volumen apropiado que contiene 1000 células de una línea de células de cáncer renal adecuada, por ejemplo, A498, ACHN o 786-0, se siembra en los pocillos de una placa de cultivo celular de 9 pocillos en un 10 medio de crecimiento adecuado complementado con 10% de suero bovino fetal y se incuba a 37 ºC en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Se deja que las células se adhieran durante la noche, después de lo cual se inicia el tratamiento con una molécula de LHA ligada a EGF, tal como una molécula de LHA con un ligando de EGF presentado en el extremo C. Después de 24 horas, el medio de tratamiento se elimina, las monocapas de células se lavan para eliminar trazas de LHA-EGF y se aplica medio fresco a células. Después de otras 24 horas se realiza un
15 ensayo de proliferación colorimétrica convencional (basado en la determinación de la escisión de la sal de tetrazolio WST-1 en formazan por enzimas celulares). Específicamente, WST-1 se añade al medio de cultivo durante 4 horas, después de lo cual la densidad óptica a 440 nm se determina para cada tratamiento. Las Figuras 50-52 demuestran la inhibición de la proliferación in vitro de una línea de carcinoma de células renales por una fusión de EGF-LHA.
20 Análisis de secreción celular:
[0272] 10.000 células de una línea de células de cáncer renal adecuada (por ejemplo, 786-0, A498 o ACHN) se siembran en los pocillos de una placa de 24 pocillos en un medio de cultivo apropiado que contiene 10% de suero bovino fetal. Las placas se incuban durante la noche en una estufa de incubación a 37 ºC en una atmósfera 25 humidificada con 5% de CO2 para permitir que las células se adhieran. Los cultivos celulares se tratan entonces con un polipéptido apropiado de la presente invención que elige como diana un receptor específico sobre las células de interés (para las líneas celulares detalladas anteriormente una molécula apropiada sería un LHA ligado a EGF ya que estas 3 líneas celulares expresan todas receptores de EGF, Figura 48). Después de 24 horas, el medio de tratamiento se elimina, las monocapas de células se realimentan con medio de cultivo fresco y 24-48 horas después
30 muestras del medio de cultivo se cambian a tubos de microcentrífuga frescos que posteriormente se centrifugan a 1500 rpm durante 5 minutos para eliminar células en flotación. Los sobrenadantes resultantes se cambian a tubos frescos y entonces se usan alícuotas para la cuantificación de analitos específicos (por ejemplo, VEGF, TNF-alfa) por enzimoinmunoanálisis de adsorción o ELISA (Figura 53). Un ejemplo de análisis de inhibición de una secreción (GRP) de una línea celular de carcinoma de pulmón de células pequeñas se proporciona en la Figura 54.
35 Análisis de transferencia Western para detectar la escisión de SNARE debido a la captación celular de polipéptidos de la presente invención:
[0273] Se tratan cultivos celulares con polipéptidos como se ha detallado anteriormente para el análisis de
40 secreciones celulares. Después de extraer el medio de cultivo para posteriores análisis de ELISA, las monocapas de células en cada pocillo se lavan tres veces con solución salina tamponada con fosfato y los extractos de proteína se preparan por lisis celular en tampón de muestra Laemmli estándar. La proteína celular se separa sobre 12% de geles de SDS-poliacrilamida y se transfiere electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear la membrana se usan antisueros primarios para sondar la proteína SNARE de interés y se permite la
45 detección de formas de longitud completa y/o escindidas por un anticuerpo dirigido contra IgG de especie conjugada con peroxidasa. En el caso de tratamiento de la línea celular renal 786-0 con una molécula de LHA-EGF se observa la escisión de SNARE SNAP-25 (véase Figura 49).
SEQ ID Nº
[0274]
1.
Secuencia de ADN de LHN/A
2.
Secuencia de ADN de LHN/B
3.
Secuencia de ADN de LHN/C
4.
Secuencia de ADN de LHN/D
5. Secuencia de ADN del ligador de CT-CST28
6.
Secuencia de ADN de la fusión de LHD-CT-CST28
7.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-CST28
8. Secuencia de ADN del ligador de CP-EGF
9.
Secuencia de ADN de la fusión de LHA-CP-EGF
10.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CP-EGF
11. Secuencia de proteínas de LHN/A
12.
Secuencia de proteínas de LHN/B
13.
Secuencia de proteínas de LHN/C
14. Secuencia de proteínas de LHN/D
15. Péptido GnRH sintetizado
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Cys-Arg-Pro-Gly-NH2
16. Secuencia de proteínas de la fusión de LHB-CT-SST28
15 17. Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CP-SST28
18.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-EGF
19.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-VIP
20.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-IGF1
21. Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-IGF1
22.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-VIP
23.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-GnRH
24. Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-GnRH
25.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-GRP
26.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHB-CT-GRP
27. Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-LIF
28.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHB-CP-LIF
29.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-FGF1 65
30.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CP-FGF1
10 31. Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CT-FGF9 32. Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CP-FGF9
33.
Secuencia de proteínas de la fusión de IgA-HNtet-CT-SST14
34.
Secuencia de proteínas de la fusión de IgA-HNtet-CP-SST14
35.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CT-SST14
36.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CT-EGFv3
37.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHE-CT-IL6
38. Secuencia de proteínas de la fusión de LHB-CT-IL8
39. Secuencia de proteínas de la fusión de LHF-CP-GRAN4 40. Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CP-TGFa
5 41. Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CP-TGFb
42. Secuencia de proteínas de la fusión de LHB-CT-TNFa
43. Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-SDF1
44. Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-VEGF
10 SEQ ID Nº
[0275]
1.
Secuencia de ADN de LHN/A
2.
Secuencia de ADN de LHN/B
3.
Secuencia de ADN de LHN/C
4.
Secuencia de ADN de LHN/D
5.
Secuencia de ADN del ligador de CT-CST28
6.
Secuencia de ADN de la fusión de LHD-CT-CST28
7.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-CST28
8. Secuencia de ADN del ligador de CP-EGF
9.
Secuencia de ADN de la fusión de LHA-CP-EGF
10.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CP-EGF
11. Secuencia de proteínas de LHN/A
12.
Secuencia de proteínas de LHN/B
13.
Secuencia de proteínas de LHN/C
15. Péptido GnRH sintetizado
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Cys-Arg-Pro-Gly-NH2
16.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHB-CT-SST28
17.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CP-SST28
18. Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-EGF
19.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-VIP
20.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-IGF1
21. Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-IGF1
22.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-VIP
23.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-GnRH
24. Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-GnRH
25.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-GRP
26.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHB-CT-GRP
27. Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-LIF
28.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHB-CP-LIF
29.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-FGF1
30. Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CP-FGF1
31. Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CT-FGF9 32. Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CP-FGF9
5 33. Secuencia de proteínas de la fusión de IgA-HNtet-CT-SST14
34.
Secuencia de proteínas de la fusión de IgA-HNtet-CP-SST14
35.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CT-SST14
36. Secuencia de proteínas de la fusión de LHA-CT-EGFv3
37.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHE-CT-IL6
38.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHB-CT-IL8
39. Secuencia de proteínas de la fusión de LHF-CP-GRAN4
40.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CP-TGFa
41.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CP-TGFb
43.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHD-CT-SDF1
44.
Secuencia de proteínas de la fusión de LHC-CT-VEGF

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polipéptido para su uso en la supresión o tratamiento de cáncer mediante la inhibición de la secreción de una célula cancerosa en un paciente, en el que el polipéptido comprende:
    (i)
    una proteasa no citotóxica, proteasa que puede escindir una proteína SNARE expresada en dicha célula cancerosa;
    (ii)
    un resto que elige diana (TM) que puede unirse a un sitio de unión sobre una célula cancerosa, sitio de unión que puede someterse a endocitosis para incorporarse en un endosoma dentro de la célula cancerosa; y
    (iii) un dominio de translocación que puede translocar la proteasa de dentro de un endosoma, a través de la membrana endosómica y en el citosol de la célula cancerosa;
    en el que el polipéptido carece de la función de unión natural de un dominio HCC de neurotoxina clostridial que permite que la neurotoxina clostridial se una a terminaciones nerviosas en la unión neuromuscular;
    con la condición de que la célula cancerosa no sea una célula tumoral neuroendocrina;
    y con la condición de que el polipéptido no sea una molécula de neurotoxina clostridial que se produce naturalmente.
  2. 2.
    Un polipéptido para su uso según la reivindicación 1, en el que la célula cancerosa está seleccionada del grupo constituido por: una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer renal, una célula de cáncer cerebral, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer colorrectal, una célula de cáncer de las glándulas suprarrenales, una célula de cáncer esofágico, una célula de cáncer de linfoma (por ejemplo, linfocito B; célula del manto), una célula de cáncer de leucemia (por ejemplo, mieloma múltiple), una célula de cáncer de leucemia aguda, una célula de cáncer de vejiga, una célula de cáncer de huesos, una célula de cáncer intestinal, una célula de cáncer de cuello uterino, una célula de leucemia linfocítica crónica, una célula de linfoma de Hodgkin, una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer de piel de melanoma, una célula de cáncer orofaríngeo, una célula de mieloma, una célula de cáncer de próstata, una célula de sarcoma de tejidos blandos, una célula de cáncer gástrico, una célula de cáncer testicular, una célula de cáncer uterino o una célula de cáncer de sarcoma de Kaposi.
  3. 3.
    Un polipéptido para su uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el TM se une a un receptor seleccionado del grupo que comprende: un receptor de ErbB tal como un receptor de EGF; un receptor de hormona liberadora de hormona de crecimiento (GHRH); un receptor de factor de crecimiento similar a la insulina (IGFR); un receptor de péptido liberador de gastrina (GRP); un receptor de péptido de bombesina (BB); un receptor de hormona de crecimiento (GH); un receptor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); un receptor de acetilcolina (ACH); un receptor de somatostatina (SST); un receptor de cortistatina (CST); un receptor de quimiocinas (motivo C-X-C) tal como CXCR4; un receptor de neurofilina; un receptor de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH); un receptor de la superfamilia de VIP-glucagón-GRF-secretina tal como un receptor de PAC
    o un receptor de VPAC; un receptor de FLT; un receptor de CHRN; un receptor de EPH tal como un receptor de EPHA; un receptor de EFN; un receptor de DLK1, un receptor de DLL3, un receptor de FGF; un receptor de JAG; un receptor de LIF; un receptor de NMB; un receptor de NOTCH; un receptor de PDGF; un receptor de c-kit; un receptor de TGF; un receptor de endotelina; un receptor de quimiocinas; o un receptor de angiopoyetina.
  4. 4.
    Un polipéptido para su uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el TM está seleccionado del grupo que comprende: un péptido ErbB tal como un péptido EGF, un péptido adrenomedulina (ADM), un péptido AM, un péptido AMF, un péptido anfiregulina, un péptido APRIL, un péptido artemina, un péptido betacelulina, un péptido bombesina, un péptido CTR, un péptido endotelina, un péptido eritropoyetina, un péptido FGF, un péptido FSH, un péptido gastrina, un péptido liberador de gastrina (GRP), un péptido GDNF, un péptido grelina, un péptido GHRH, un péptido G-CSF, un péptido hormona de crecimiento, un péptido HB-EGF, un péptido factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un péptido IL, un péptido factor de crecimiento de queratinocitos, un péptido leptina, un péptido LIF, un péptido alfa-melanotropina, un péptido MGSA/GRO, un péptido NRG, un péptido oxitocina, un péptido osteopontina (OPN), un péptido neuregulina-1, un péptido VIP o péptido PACAP, un péptido PDGF, un péptido prolactina, un péptido SCF, un péptido somatostatina (SST), un péptido cortistatina (CST), un péptido TNF, un péptido TGF, un péptido VEGF, un péptido vasopresina, un péptido angiopoyetina, un péptido B-CLL, un péptido BCGF-12KD, un péptido BAFF, un péptido galanina, un péptido GDNF, un péptido GnRH, un péptido IGF-II, un péptido LH, un péptido neurotrofina, un péptido sustancia P, un péptido TGF-alfa; un péptido IGF,
    un péptido angiopoyetina, un péptido CXC, un péptido CCL, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un receptor como se define en la reivindicación 3.
  5. 5.
    Un polipéptido para su uso según cualquier reivindicación precedente, en el que la proteasa no citotóxica comprende una cadena L de neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA.
  6. 6.
    Un polipéptido para su uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el dominio de translocación comprende un dominio de translocación de neurotoxina clostridial.
  7. 7.
    Un polipéptido que comprende:
    (i)
    una proteasa no citotóxica, proteasa que puede escindir una proteína SNARE expresada en una célula cancerosa, en el que dicha proteína SNARE es responsable de la secreción de la célula cancerosa;
    (ii)
    un resto que elige diana (TM) que puede unirse a un sitio de unión sobre una célula cancerosa, sitio de unión que puede someterse a endocitosis para incorporarse en un endosoma dentro de la célula cancerosa; y
    (iii) un dominio de translocación que puede translocar la proteasa de dentro de un endosoma, a través de la membrana endosómica y en el citosol de la célula cancerosa;
    en el que el polipéptido carece de la función de unión natural de un dominio HCC de neurotoxina clostridial que permite que la neurotoxina clostridial se una a terminaciones nerviosas en la unión neuromuscular;
    con la condición de que la célula cancerosa no sea una célula tumoral neuroendocrina;
    y con la condición de que el polipéptido no sea una molécula de neurotoxina clostridial que se produce naturalmente;
    en el que el TM se une a un receptor seleccionado del grupo que comprende: un receptor de hormona de crecimiento (GH); un receptor de acetilcolina (ACH); un receptor de quimiocinas (motivo C-X-C) tal como CXCR4; un receptor de neurofilina; un receptor de FLT; un receptor de CHRN; un receptor de EPH tal como un receptor de EPHA; un receptor de EFN; un receptor de DLK1, un receptor de DLL3, un receptor de FGF; un receptor de JAG; un receptor de LIF; un receptor de NMB; un receptor de PDGF; un receptor de c-kit; un receptor de endotelina; un receptor de quimiocinas; o un receptor de angiopoyetina.
  8. 8.
    Un polipéptido según la reivindicación 7, en el que el TM está seleccionado del grupo que comprende: un péptido adrenomedulina (ADM), un péptido AM, un péptido factor de motilidad autocrina (AMF), un péptido APRIL, un péptido artemina, un péptido CTR, un péptido endotelina, un péptido eritropoyetina, un péptido FGF, un péptido FSH, un péptido gastrina, un péptido GDNF, un péptido G-CSF, un péptido hormona de crecimiento, un péptido factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un péptido IL, un péptido factor de crecimiento de queratinocitos, un péptido LIF, un péptido alfa-melanotropina, un péptido MGSA/GRO, un péptido oxitocina, un péptido osteopontina (OPN), un péptido PDGF, un péptido prolactina, un péptido SCF, un péptido TNF, un péptido vasopresina, un péptido angiopoyetina, un péptido B-CLL, un péptido BCGF-12KD, un péptido BAFF, un péptido galanina, un péptido GDNF, un péptido LH, un péptido NT, un péptido sustancia-P, un péptido angiopoyetina, un péptido CXC, un péptido CCL, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un receptor como se define en la reivindicación 7.
  9. 9.
    Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en el que la proteasa no citotóxica comprende una proteasa de neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA.
  10. 10.
    Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que el dominio de translocación comprende un dominio de translocación de neurotoxina clostridial.
  11. 11.
    Un polipéptido según la reivindicación 7, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90-92%, o al menos el 95-97%, o al menos el 98-99% de identidad de secuencias con una cualquiera de SEQ ID Nº: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 42 o 43.
  12. 12.
    Un ácido nucleico que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 7-11.
  13. 13.
    Uso de un polipéptido para la fabricación de un medicamento para suprimir o tratar un cáncer
    inhibiendo la secreción de una célula cancerosa en un paciente, en el que el polipéptido comprende:
    (i)
    una proteasa no citotóxica, proteasa que puede escindir una proteína SNARE expresada en dicha célula cancerosa;
    (ii)
    un resto que elige diana (TM) que puede unirse a un sitio de unión sobre una célula cancerosa, sitio de unión que puede someterse a endocitosis para incorporarse en un endosoma dentro de la célula cancerosa; y
    (iii) un dominio de translocación que puede translocar la proteasa de dentro de un endosoma, a través de la membrana endosómica y en el citosol de la célula cancerosa;
    en el que el polipéptido carece de la función de unión natural de un dominio HCC de neurotoxina clostridial que permite que la neurotoxina clostridial se una a terminaciones nerviosas en la unión neuromuscular;
    con la condición de que la célula cancerosa no sea una célula tumoral neuroendocrina;
    y con la condición de que el polipéptido no sea una molécula de neurotoxina clostridial que se produce naturalmente.
  14. 14.
    El uso según la reivindicación 13, en el que la célula cancerosa está seleccionada del grupo constituido por: una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer renal, una célula de cáncer cerebral, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer colorrectal, una célula de cáncer de las glándulas suprarrenales, una célula de cáncer esofágico, una célula de cáncer de linfoma (por ejemplo, linfocito B; célula del manto), una célula de cáncer de leucemia (por ejemplo, mieloma múltiple), una célula de cáncer de leucemia aguda, una célula de cáncer de vejiga, una célula de cáncer de huesos, una célula de cáncer intestinal, una célula de cáncer de cuello uterino, una célula de leucemia linfocítica crónica, una célula de linfoma de Hodgkin, una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer de piel de melanoma, una célula de cáncer orofaríngeo, una célula de mieloma, una célula de cáncer de próstata, una célula de sarcoma de tejidos blandos, una célula de cáncer gástrico, una célula de cáncer testicular, una célula de cáncer uterino o una célula de cáncer de sarcoma de Kaposi.
  15. 15.
    El uso según la reivindicación 13 o reivindicación 14, en el que el TM se une a un receptor seleccionado del grupo que comprende: un receptor de ErbB tal como un receptor de EGF; un receptor de hormona liberadora de hormona de crecimiento (GHRH); un receptor de factor de crecimiento similar a la insulina (IGFR); un receptor de péptido liberador de gastrina (GRP); un receptor de péptido de bombesina (BB); un receptor de hormona de crecimiento (GH); un receptor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); un receptor de acetilcolina (ACH); un receptor de somatostatina (SST); un receptor de cortistatina (CST); un receptor de quimiocinas (motivo C-X-C) tal como CXCR4; un receptor de neurofilina; un receptor de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH); un receptor de la superfamilia de VIP-glucagón-GRF-secretina tal como un receptor de PAC o un receptor de VPAC; un receptor de FLT; un receptor de CHRN; un receptor de EPH tal como un receptor de EPHA; un receptor de EFN; un receptor de DLK1, un receptor de DLL3, un receptor de FGF; un receptor de JAG; un receptor de LIF; un receptor de NMB; un receptor de NOTCH; un receptor de PDGF; un receptor de c-kit; un receptor de TGF; un receptor de endotelina; un receptor de quimiocinas; o un receptor de angiopoyetina.
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