ES2630080T5 - Supresión del cáncer - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Supresión del cáncer
La presente invención se refiere a la supresión del cáncer.
Los cánceres están compuestos por células que se dividen, invaden y sobreviven de una manera aberrante en el cuerpo. Los cánceres se desarrollan cuando las alteraciones en el ADN en el interior de las células afectan el control de la división celular y otros procesos relevantes para la supervivencia celular. Al crecer los tumores cancerosos, invaden los tejidos corporales alrededor de ellos. Esto es nocivo para el cuerpo ya que daña los tejidos normales circundantes y tiene un efecto significativo en las respuestas fisiológicas. Además, los cánceres pueden diseminarse a otras partes del cuerpo y desarrollarse en tumores secundarios. La evaluación del cáncer puede emprenderse usando una variedad de ensayos incluyendo escaneo CT, formación de imágenes MRI, escaneos PET, escaneo combinado PET-CT y ensayos con ultrasonidos. Generalmente, cuanto antes se detecte y confirme un cáncer, mejor será el pronóstico global para el paciente.
Está disponible un amplio rango de tratamientos para pacientes diagnosticados con cáncer. Éstos incluyen una variedad de intervenciones quirúrgicas, radioterapia, quimioterapia y terapias hormonales. Estos tratamientos pueden usarse solos pero lo más comúnmente se usan en combinación entre sí. El uso de una combinación de terapias depende del tipo de cáncer diagnosticado requiriendo comúnmente determinados cánceres (tal como cáncer de mama) múltiples intervenciones terapéuticas. Existe una variedad de nuevas estrategias terapéuticas en desarrollo que utilizan productos biológicos incluyendo anticuerpos, inmunoterapias y técnicas de vacunación para tratar cáncer. Las estrategias de tratamiento adicionales incluyendo el uso de nuevos terapéuticos diseñados para bloquear la angiogénesis están en desarrollo. Las nuevas estrategias incluyendo el uso de terapia génica también están siendo investigadas como terapéuticos potenciales. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos científicos significativos y el enorme compromiso financiero para desarrollar nuevas terapias para el cáncer, el pronóstico para muchos pacientes permanece extremadamente malo.
El cáncer de mama es el cáncer más común en el Reino Unido y cada año más de 44.000 mujeres son diagnosticadas con este tipo de cáncer. En todo el mundo, más de un millón de mujeres son diagnosticadas con cáncer de mama cada año. En el Reino Unido, aproximadamente el 80% de los pacientes sobrevivirá durante 5 años o más.
El cáncer de pulmón es el 2° cáncer más común en el Reino Unido y más de 37.000 personas fueron diagnosticadas con cáncer de pulmón en el Reino Unido en 2003. Para los pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón, sólo aproximadamente el 20% sobrevivirá durante al menos 1 año después del diagnóstico y sólo aproximadamente el 6% vivirá durante 5 años o más después del diagnóstico.
El cáncer colorrectal es el 3er tipo de cáncer más común en total y es el 2° más común que afecta a las mujeres (después del cáncer de mama). Poco más de 35.000 personas fueron diagnosticadas con cáncer colorrectal en el Reino Unido en 2003. De las diagnosticadas con cáncer de intestino y rectal en Inglaterra y Gales, el 46% sobrevivirá durante al menos 5 años después de su diagnóstico.
El cáncer pancreático es la cuarta causa más común de muerte de cáncer en el mundo occidental y más de 7.000 casos se diagnostican en el Reino Unido cada año. A pesar de los avances terapéuticos, sólo el 3-4% de los diagnosticados con cáncer pancreático sobreviven durante 5 años o más y la intervención terapéutica exitosa está limitada a cirugía que sólo es aplicable al 15% de los pacientes.
El cáncer renal es el 9° tipo de cáncer más común en total con más de 7.000 nuevos casos diagnosticados y más de 3.500 muertes en el Reino Unido cada año. Alrededor de 208.500 nuevos casos de cáncer renal son diagnosticados en el mundo cada año, lo que representa poco menos del 2% de todos los cánceres. En más común en hombres que en mujeres, con una relación hombre a mujer de 1,5:1. El treinta por ciento de los pacientes con cáncer renal muestra signos de carcinoma de células renales avanzado en el diagnóstico inicial, con metástasis detectadas en el 15-25% de los pacientes en ese momento.
El cáncer representa un problema mundial que se predice que va a crecer significativamente. En el año 2000, los tumores malignos fueron responsables del 12 por ciento de los casi 56 millones de muertes reportadas en el mundo de todas las causas. En algunos países, más de un cuarto de las muertes podría atribuirse a cáncer. En 2000, 5,3 millones de hombres y 4,7 millones de mujeres desarrollaron un tumor maligno y conjuntamente 6,2 millones murieron de la enfermedad. Se predice que las tasas de cáncer podrían incrementarse adicionalmente en un 50% a 15 millones de nuevos casos en el año 2020, (WHO World Cancer Report (IARC, Ed B. W. Stewart y P. Kleihues, 2003).
Para un gran número de cánceres, se cree que la señalización autocrina (definida como un modo de acción hormonal en la que una hormona se une a receptores en y afecta la función del tipo celular que la produce) y/o señalización paracrina (definida como un modo de acción hormonal en la que la hormona liberada de células endocrinas o semejantes a endocrinas se une a receptores en células cercanas y afecta su función), juega un papel significativo en el desarrollo del estado de enfermedad. Para un cáncer dado, múltiples bucles de señalización autocrina pueden estar implicados en el desarrollo y mantenimiento del estado de cáncer. Además de proporcionar un estímulo para la división celular, la señalización autocrina puede potenciar la supervivencia celular actuando para proteger a las células de mecanismos de apoptosis y necrosis e incrementar el potencial metastásico de la célula cancerosa.
Existe, por lo tanto, una necesidad en la técnica de nuevas terapias/terapéuticos capaces de abordar específicamente el cáncer. Esta necesidad se aborda por la presente invención, que resuelve uno o más de los problemas mencionados anteriormente.
US 2008/0161543 describe toxinas clostridiales modificadas con capacidades de direccionamiento alteradas para células diana de toxina clostridial.
WO 02/09743 describe métodos para tratar un neoplasma usando toxina botulínica. WO 2004/076634 describe la translocación en la membrana celular de inhibidores de SNARE regulados, composiciones de éstos y métodos para el tratamiento de enfermedad. WO 2006/026780 describe toxinas clostridiales degradables. WO 2006/094539 describe métodos y composiciones para el tratamiento del cáncer usando toxina botulínica. US 2005/0031648 describe métodos para tratar diversos cánceres usando toxina botulínica. WO 2008/105901 describe toxinas clostridiales modificadas con capacidad de translocación potenciada y actividad de direccionamiento potenciada. WO 2009/150469 describe la supresión de enfermedades neuroendocrinas usando proteasas no citotóxicas. WO 2009/150470 describe la supresión de cánceres usando proteasas o citotóxicas.
Con más detalle, un primer aspecto de la presente invención proporciona un polipéptido para uso en la supresión o tratamiento del cáncer, mediante la inhibición de la secreción autocrina de una célula cancerosa en un paciente en el que el polipéptido comprende:
(i) una proteasa no citotóxica, proteasa que es capaz de escindir una proteína SNARE en una célula cancerosa;
(ii) un Resto de Direccionamiento (TM) que es capaz de unirse a un Sitio de Unión en una célula cancerosa, Sitio de Unión que es capaz de experimentar endocitosis para incorporarse en un endosoma en la célula cancerosa, y en el que dicha célula cancerosa expresa dicha proteína SNARE; y
(iii) un dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa desde el interior de un endosoma, a través de la membrana endosomal y en el citosol de la célula cancerosa; en el que el polipéptido carece de la función de unión natural de una neurotoxina clostridial, dominio Hcc, que permite que la neurotoxina clostridial se una a terminales nerviosas en la unión neuromuscular;
y con la condición de que la célula cancerosa no es una célula tumoral neuroendocrina;
y con la condición de que el polipéptido no es una molécula de neurotoxina clostridial (holotoxina); y en el que la expresión de dicha proteína SNARE está regulada al alza en el tipo de célula cancerosa cuando se compara con la expresión de la proteína SNARE en el mismo tipo celular en un estado no canceroso.
El polipéptido de la presente invención no es una molécula de neurotoxina clostridial natural (también conocida como holotoxina clostridial). La holotoxina clostridial es una de las neurotoxinas más letales conocidas por el hombre, y, como tal, tiene limitaciones significativas como una molécula terapéutica. También, en el contexto del cáncer, la holotoxina clostridial se asocia con direccionamiento fuera de sitio indeseable (es decir, dirigida a células no cancerosas), por ejemplo, a la unión neuromuscular.
En el uso, un polipéptido de la invención se une a una célula cancerosa. Posteriormente, el componente de translocación efectúa el transporte del componente proteasa en el citosol de la célula cancerosa. Finalmente, una vez en el interior, la proteasa inhibe el proceso de fusión exocítica de la célula cancerosa mediante la escisión de la proteína SNARE presente en el citosol de la célula cancerosa. Así, mediante la inactivación del aparato de fusión exocítica de la célula cancerosa, el polipéptido de la invención inhibe la secreción (por ejemplo, de TNF-alfa, acetilcolina, factor de crecimiento fibroblástico, péptido liberador de gastrina, interleuquina-6, VEGF, y/o factor de movilidad autocrina) de éste. De acuerdo con esto, cuando dichos péptidos de secreción están, por ejemplo, implicados en la señalización autocrina o paracrina, el polipéptido de la invención reduce la dirección de la señalización que de otra manera proporcionaría el bucle autocrino/paracrino a la célula cancerosa. De acuerdo con esto, los polipéptidos de la presente invención son capaces de suprimir o tratar el cáncer.
El primer aspecto también describe un método correspondiente para suprimir el cáncer, comprendiendo dicho método administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la presente invención a un paciente. La presente invención proporciona de esta manera un medio efectivo para tratar el cáncer tal como renal, de mama, de pulmón, pancreático, y colorrectal (por ejemplo, de colon). Los polipéptidos de la presente invención proporcionan una ventaja clara sobre otros terapéuticos ya que tienen el potencial de inhibir la secreción de múltiples péptidos autocrinos y paracrinos de una célula cancerosa diana usando una única molécula terapéutica. Esto reduce significativamente la capacidad de un cáncer de adaptarse a un régimen de tratamiento específico cambiando a y usando rutas de señalización autocrinas alternativas. Así, la presente invención proporciona una terapia más eficaz mediante el bloqueo de múltiples rutas simultáneamente.
La célula diana principal de la presente invención es una célula cancerosa, por ejemplo, una célula cancerosa que secreta una o más hormones (u otras moléculas bioactivas), que, una vez secretadas, se unen a un receptor en y afectan la función de dicha célula cancerosa. Los ejemplos de células cancerosas tomadas como diana por la presente invención incluyen: de mama, de pulmón, pancreáticas, colorrectales (por ejemplo, de colon), adrenales, esofágicas, de linfoma (por ejemplo, de células B; célula de manto), de leucemia (por ejemplo, mieloma múltiple), de leucemia aguda, de vejiga, óseas, de tumores cerebrales, de intestino, cervicales, de leucemia linfocítica crónica, de linfoma de Hodgkin, renales, hepáticas, de la piel (por ejemplo, basales, escamosas, melanoma), orofaríngeas, de mieloma, de próstata (por ejemplo, sarcoma de tejido blando), gástricas, testiculares, y uterinas.
En una realización, la célula diana de la presente invención es una célula cancerosa en la que el nivel de expresión de proteína SNARE es indeseable.
Por ejemplo, la expresión indeseable de SNARE puede ocurrir cuando la expresión de una proteína SNARE está regulada al alza cuando se compara con el mismo (o muy similar) tipo celular en un estado no canceroso. En una realización, el ARNm que codifica una proteína SNARE está regulado al alza en una célula cancerosa diana. En otra (o la misma) realización, la concentración de proteína celular de una proteína SNARE está (también) incrementada en la célula cancerosa diana. Cuando se miden los niveles de ARNm o proteína SNARE, se puede asignar un valor de 'uno' a la concentración de ARNm o proteína SNARE en una célula no cancerosa de un individuo normal, célula que de otra manera es la misma (o muy similar) que el tipo celular de la célula cancerosa en cuestión - este valor podría describirse como un 'nivel de expresión basal', y es típicamente un promedio de los valores del nivel de expresión obtenidos de varias células (del mismo tipo o uno muy similar) y/o de diferentes individuos normales. Por ejemplo, una célula de pulmón (por ejemplo, una célula de pulmón neuroectodérmica, o una célula de epitelio pulmonar) en un individuo normal puede usarse para comparación con una célula de cáncer de pulmón de células pequeñas. Así, regulado al alza en el contexto de la presente invención significa que el nivel de ARNm o proteína SNARE es 'mayor de 1' cuando se compara con el mismo tipo celular en un estado no canceroso en un individuo normal. En una realización, el nivel de proteína o ARNm SNARE está regulado al alza más de 2 ó 3 veces, o más de 4 ó 5 veces, o más de 6 ó 7 veces. En otra realización, el nivel de proteína o ARNm SNARE está regulado al alza más de 8 ó 9 veces, o más de 10 ó 12 veces, o más de 15 ó 20 veces. En otra realización, el nivel de proteína o ARNm SNARE está regulado al alza más de 40 ó 50 veces, o más de 60 ó 70 veces, o más de 90 ó 100 veces.
Alternativamente, la expresión indeseable de SNARE puede ocurrir cuando el nivel de expresión del ARNm y/o proteína SNARE en una célula cancerosa es sustancialmente normal (es decir, sustancialmente el mismo) cuando se compara con el de un tipo celular no canceroso idéntico o muy similar correspondiente. En este escenario, sin embargo, por ejemplo, cuando un paciente padece un [carcinoma de próstata, de vejiga o cervical], incluso un nivel bajo o normal de expresión de proteína SNARE puede apoyar una secreción desde las células cancerosas de este tipo que es paracrina o autocrina en función, y de esta manera, en el contexto del cáncer, la proteína SNARE está apoyando una secreción indeseable. En este escenario, los polipéptidos de la presente invención son capaces de suprimir la secreción de dichas células cancerosas, y de esta manera abordar esta necesidad en la técnica.
A este respecto, los presentes inventores han identificado expresión indeseable de SNARE en un rango de tipos de células cancerosas. Estos datos se presentan como Representaciones en Cajas en las Figuras 3-47. En resumen, los presentes inventores han confirmado que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-1a, sintaxina-2), y VAMP (por ejemplo, VAMP-1) en células de cáncer de pulmón de células pequeñas (por ejemplo, cuando se compara con células de pulmón normales); que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-2), VAMP (por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2, VAMP-3) en células carcinoides de pulmón; que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-2), VAMP (por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2) en células carcinoides de pulmón (por ejemplo, cuando se compara con células de pulmón normales); que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-2, sintaxina-3), y VAMP (por ejemplo, VAMP-1, VAMP-3) células de carcinoma de vejiga; que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-1a), y VAMP (por ejemplo, VAMP-2) en células de cáncer de mama; que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-1a, sintaxina-1b, sintaxina-2, sintaxina-3), y VAMP (por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2, y VAMP-3) en células de adenocarcinoma pancreático (por ejemplo, cuando se compara con células pancreáticas normales); que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-1a, sintaxina-1b, sintaxina-3), y VAMP (por ejemplo, VAMP-2, VAMP-3) en células de carcinoma de próstata (por ejemplo, cuando se compara con células de próstata benignas); que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-2), y VAMP (por ejemplo, VAMP-3) en células de cáncer del cuello uterino (por ejemplo, cuando se compara con células de cuello uterino normales); que se observa la expresión indeseable de SNARe tal como sintaxina (por ejemplo, sintaxina 3) y VAMP (por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2, VAMP-3) en células de leucemia de células B (por ejemplo, cuando se compara con linfocitos células B normales); que se observa la expresión indeseable de SNARe tal como sintaxina (por ejemplo, sintaxina-1a, sintaxina-3) y VAMP (por ejemplo, VAMP-1) (por ejemplo, regulada al alza) en células de cáncer de ovario (por ejemplo, cuando se compara con células de ovario normales); que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como SNAP-25 y VAMP (por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2, VAm P-3) en células carcinoides gastrointestinales (GI) (por ejemplo, cuando se compara con células GI normales); y que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como SNAP-25, sintaxina (por ejemplo, sintaxina-1a, sintaxina-2) y VAMP (por ejemplo, VAMP-3) (por ejemplo, regulada al alza) en células de cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, cuando se compara con células de cabeza y cuello normales). Además, los presentes inventores han identificado que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como SNAP-25 y VAMP (por ejemplo, VAMP-2) en células de cáncer de colon; que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como SNAP-25 en células de cáncer adrenal; que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como sintaxina (por ejemplo, sintaxina-2) en células de cáncer de piel (por ejemplo, melanoma); que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como sintaxina (por ejemplo, sintaxina-3) en células de cáncer de leucemia (por ejemplo, melanoma múltiple); que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como sintaxina (por ejemplo, sintaxina-1a) y VAMP (por ejemplo, VAMP-1) en células de adenocarcinoma de pulmón; que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como VAMP (por ejemplo, VAMP-1) en células de cáncer de hígado; que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como VAMP (por ejemplo, VAMP-2) en células de cáncer de esófago; y que se observa la expresión indeseable de SNARE tal como v A m P (por ejemplo, VAMP-3) en células de cáncer de linfoma (por ejemplo, linfoma de células B y células del manto).
El componente 'bioactivo' de los polipéptidos de la presente invención se proporciona por una proteasa no citotóxica. Este grupo distinto de proteasas actúa escindiendo proteolíticamente proteínas de transporte intracelular conocidas como proteínas SNAr E (por ejemplo, SNAP-25, Va Mp , o Sintaxina)— véase Gerald K (2002) “Célula and Molecular Biology” (4a edición) John Wiley & Sons, Inc. El acrónimo SNARE deriva del término Receptor de Unión de NSF Soluble (Soluble NSF Attachment Receptor), en el que NSF significa Factor Sensible a N-etilmaleimida (N-ethylmaleimide-Sensitive Factor). Las proteínas SNARE son esenciales para la formación de vesículas intracelulares, y así para la secreción de moléculas a través del transporte de vesículas desde una célula. De acuerdo con esto, una vez administrada a una célula diana deseada, la proteasa no citotóxica es capaz de inhibir la secreción celular desde la célula diana.
Las proteasas no citotóxicas son una clase discreta de moléculas que no matan a las células; en su lugar, actúan inhibiendo los procesos celulares distintos de la síntesis de proteínas. Las proteasas no citotóxicas son producidas como parte de una molécula de toxina mayor por una variedad de plantas, y por una variedad de microorganismos tal como Clostridium sp. y Neisseria sp.
Las neurotoxinas clostridiales representan un grupo principal de moléculas de toxina no citotóxicas, y comprenden dos cadenas polipeptídicas unidas entre sí por un enlace disulfuro. Las dos cadenas se denominan la cadena pesada (cadena H), que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y la cadena ligera (cadena L), que tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa. Es la cadena L, la que posee una función proteasa y presenta una alta especificidad de sustrato para proteínas asociadas a vesícula y/o membrana plasmática (SNARE) implicadas en el proceso exocítico (por ejemplo, sinaptobrevina, sintaxina o SNAP-25). Estos sustratos son componentes importantes de la maquinaria neurosecretora.
Neisseria sp., de forma lo más importante de la especie N. gonorrhoeae, y Streptococcus sp., de forma lo más importante de la especie S. pneumoniae, producen moléculas de toxina no citotóxicas funcionalmente similares. Un ejemplo de dicha proteasa no citotóxica es la proteasa de IgA (véase WO99/58571).
Así, la proteasa no citotóxica de la presente invención es preferiblemente una proteasa neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA.
Prestando ahora atención al componente Resto de Direccionamiento (TM) de la presente invención, es este componente el que une el polipéptido de la presente invención a una célula cancerosa. El TM es preferiblemente un péptido.
El TM se une a un Sitio de Unión en la célula cancerosa, proporcionando de esta manera selectividad del polipéptido a esta especie de célula diana sobre otras células. Como ejemplo, en cáncer gástrico, el TM preferiblemente se une a células de cáncer gástrico preferentemente respecto a otras células del estómago, tal como aquellas que no son cancerosas y/o a otras células no cancerosas (o cancerosas) en el cuerpo. A este respecto, las realizaciones de TM preferidas de la presente invención incluyen anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpo tal como Fab, F(ab)2, Fv, ScFv, etc., y péptidos de dominio de anticuerpo), así como soportes de unión, que se unen a los receptores identificados más adelante. De acuerdo con esto, los polipéptidos de la presente invención pueden incluir anticuerpos o soportes de unión disponibles comercialmente, que se han diseñado para conseguir unión específica a la célula o receptor diana en cuestión. Alternativamente, los TM preferidos incluyen ligandos peptídicos, tal como citoquinas, factores de crecimiento, neuropéptidos, y lectinas.
Un TM de la presente invención se une a un receptor en una célula cancerosa. Como ejemplo, un TM de la presente invención se une a un receptor en una célula cancerosa seleccionado del grupo que comprende: un receptor de hormona liberadora de hormona del crecimiento (GHRH, también conocido como GHRF/GRF); un receptor de factor de crecimiento semejante a insulina (por ejemplo, un receptor de IGF-1); un receptor de factor de liberación de corticotropina (por ejemplo, CRHR-2); un receptor de péptido liberador de gastrina (GRP); un receptor de péptido bombesina (BB) tal como BRS-1, BRS-2, o b RS-3; un receptor de hormona del crecimiento (GH); un receptor de interleuquina (por ejemplo, IL8RA o IL13RA1); un receptor de factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGf ); un receptor de acetilcolina (ACH); un receptor de somatostatina (SST), tal como SSTi, SST2 , SST3 , SST4 o SST5; un receptor de cortistatina (CST); un receptor de quimioquina (resto C-X-C) tal como CXCR4; un receptor de neuropilina; un receptor de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH); un receptor de la superfamilia VlP-glucagón-GRF-secretina, tal como un receptor de PAC (por ejemplo, PACi) o un receptor de péptido intestinal vasoactivo VPAC (por ejemplo, VPAC-1 o VPAC-2); o un receptor miembro de familia ErbB tal como un receptor de EGF. Todos estos receptores están sobre-expresados en células cancerosas.
En una realización de la presente invención, el TM se une a un receptor en una célula cancerosa seleccionado del grupo que comprende: f Lt tal como FLT1, FLT4, FLT3, BRS tal como BRS3; CHRN tal como CHRNA1, CHRND o CHRNE; EPHA tal como EPHA7, EPHA4, EPHA5, EPHA3, EPHA1, EPHA2; EFN tal como EFNB3, EFNA1, EFNB2, EFNA3, EFNB1; ErbB tal como ERBB2, ERBB4; DLK1, DLL3, FGF tal como FGFR1, FGFR3, FGFR2; GRPR; GNRHR; GRPR; GnRHR; JAG tal como JAG1 (CD339) o JAG2, IFGR tal como IGF1R; receptor del factor inhibidor de leucemia (LIFR); NMBR; NOTCHR tal como NOTCH3 o NOTCH4; VIPR tal como VIPR1; VEGFR tal como VEGFR2; SSTR tal como SSTR1; NMBR; o PDGFR tal como PDGFRA o PDGFRB. Todos estos receptores están sobre-expresados en células cancerosas.
En una realización, el TM se selecciona de: un péptido adrenomedulina (ADM), un péptido AM, un péptido de factor de motilidad autocrino (AMF), un péptido anfiregulina, un péptido APRIL (un ligando que induce proliferación), un péptido artemina, un péptido betacelulina, un péptido bombesina, un péptido de unión al receptor de calcitonina (CTR), un péptido ErBtal como un péptido EGF, un péptido endotelina, un péptido eritropoyetina (EPO), un péptido factor de crecimiento de fibroblastos (f Gf ) tal como un péptido FGF-5, un péptido FGF-18, un péptido bFGF, FGF8 o FGF17, un péptido de la hormona estimuladora del folículo (FSH), un péptido de gastrina, un péptido liberador de gastrina (GRP), un péptido de factor neutrófico definido de línea celular glial (GDNF), un péptido de grelina (GHRL), un péptido de hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH), un péptido de factor estimulador de las colonias de granulocitos (G-CSF), un péptido de la hormona del crecimiento (GH), un péptido del factor de crecimiento semejante a EGF que une heparina (HB-EGF), un péptido del factor de crecimiento de hepatocitos/factor de dispersión (HGF/SF), una interleuquina (IL) tal como un péptido de IL-1 alfa, un péptido de IL-6, un péptido de IL-8 o un péptido de IL-10, un péptido de IGF-1, un péptido de factor derivado de células estromales 1 (SDF-1), un péptido de factor de crecimiento de queratinocitos (k Gf ), un péptido de proepitelina/granulina, un péptido de leptina (LEP), un péptido de LIF, un péptido de alfa-melanotropina, un péptido de MGSA/GRO-alfa, beta o gamma, un péptido de NRG-1 alfa, un péptido de oxitocina, un péptido de osteopontina (OPN), un péptido de neuregulina-1, un péptido de PACAP, un péptido de PDGF tal como un péptido de PDGF-alfa, un péptido de PDGF-beta, un péptido de PDGF-C o un péptido de PDGF-D, un péptido de prolactina, un péptido de SCF, un péptido de somatostatina, un péptido de factor de necrosis tumoral (TNF) tal como un péptido de TNF-alfa, un péptido de TGF-beta, un péptido de TGF-beta1, un péptido de VEGF tal como un péptido de VEGF-C o un péptido de VEGF-D, un péptido de vasopresina, un péptido VIP, un péptido de angiopoyetina tal como un péptido de angiopoyetina-1 o un péptido de angiopoyetina-2, un péptido de B-CLL, un péptido de BCGF-12KD, un péptido de BAFF, un péptido de galanina, un péptido de GDNF, un péptido de GnRH, un péptido de IGF-II, un péptido de LH, un péptido de neurotrofina, un péptido de sustancia P, o un péptido de TGF-alfa; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de leptina. Los ejemplos adecuados de dichos TM incluyen: péptidos de leptina tal como un péptido de leptina de longitud completa (por ejemplo, leptinaw), y truncamientos o análogos peptídicos de éste tal como leptina22-167, leptina70-95, y leptinan6-122.
En otra realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de grelina. Los ejemplos de TM adecuados a este respecto incluyen: péptidos de grelina tal como grelina de longitud completa (por ejemplo, grelinan7) y truncamientos o análogos peptídicos de éste tal como grelina24-117, y grelina52-117; [Trp3, Arg5]-grelina (1-5), des-Gln-Grelina, cortistatina-8, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2 , péptido liberador de hormona del crecimiento (por ejemplo, GHRP-6), o hexarelina.
En una realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de somatostatina (SST). Como ejemplo, los TM adecuados incluyen: péptidos de SST y péptidos de cortistatina (CST), así como análogos peptídicos de éstos tal como D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2 (BIM 23052), D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-D-Nal-NH2 (BIM 23056) o c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (BIM-23268). Los ejemplos adicionales incluyen los péptidos de SST s ST-14 y SST-28; así como péptido y análogos peptídicos tal como: octreótido, lanreótido, BIM23027, vapreótido, seglitide, y SOM230. Estos TM son TM preferidos para unión a receptores SST, en particular a receptores sst1, sst2 , sst3, sst4 y sst5.
En otra realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). GnRH también se conoce como Hormona Liberadora de Hormona Luteinizante (LHRH). Los ejemplos de TM de receptor GnRH adecuados incluyen: péptidos de GnRHI, péptidos de GnRHII y péptidos de GnRHIII, por ejemplo, el polipéptido precursor de GnRH de longitud completa de 92 aminoácidos y truncamientos de éste tal como el decapéptido: piroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly CONH2 (SEQ ID NO: 45).
En una realización, un TM de la presente invención se une a un receptor del factor de crecimiento semejante a insulina (IGF). Los ejemplos adecuados incluyen, por ejemplo, péptidos de IGF-1 y péptidos de IGF-2.
En una realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de la superfamilia VIP-glucagón-GRF-secretina, tal como a un receptor PAC (por ejemplo, PAC1) o a un receptor VPAC (por ejemplo, VPAC-1 o VPAC-2). Los ejemplos adecuados de dichos TM incluyen péptidos activadores de adenilato ciclasa de la pituitaria (PACAP), péptidos intestinales vasoactivos (VIP), así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización el TM es un péptido VIP incluyendo péptidos VIP-1 y VIP-2, por ejemplo, VIP(1-28), o un truncamiento o análogo peptídico de éstos. Estos t M demuestran una unión selectiva a VPAC-1. Alternativamente, puede emplearse un TM que demuestra una unión selectiva a VPAC2, tal como, por ejemplo, mROM (véase Yu et al., Peptides 27 (6) p1359-66 (2006)).
En otra realización, el TM puede ser un péptido PACAP, por ejemplo, PACAP(1-38) o PACAP(1-27), o truncamiento o análogo peptídico de éstos. Estos TM son TM preferidos para unión a receptores PAC (por ejemplo, PAC-1).
En una realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de interleuquina. Los ejemplos de TM adecuados incluyen: péptidos IL-1 (por ejemplo, péptidos IL-1a, IL-p, IL-18) y truncamientos o análogos peptídicos de éstos, péptidos IL-2 (por ejemplo, péptidos IL-2, IL-3, IL-12, IL-23 péptidos) y truncamientos o análogos peptídicos de éstos, péptidos IL-6 e IL-8 y truncamientos o análogos peptídicos de éstos, y péptidos IL-17 (por ejemplo, péptidos IL-17A, IL-17C) y truncamientos o análogos peptídicos de éstos.
En otra realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de NGF. Los ejemplos de TM adecuados incluyen NGF de longitud completa, y truncamientos o análogos peptídicos de éste.
En una realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de factor de crecimiento epidérmico vasoactivo (VEGF). Los ejemplos de TM adecuados incluyen: péptido VEGF (por ejemplo, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D o VEGF-E y variantes de corte y empalme asociadas) y truncamientos o análogos peptídicos de éstos, y factor de crecimiento placentario (PIGF) y truncamientos o análogos peptídicos de éste.
En otra realización, un TM de la presente invención se une a un receptor ErbB. Como ejemplo, el TM se selecciona de péptidos EGF, péptidos del factor de crecimiento transformante a (TGF-a), quimeras de e Gf y TGF-a, péptidos de anfiregulina, péptidos de betacelulina, péptidos de epigen, péptidos de epiregulina, péptidos de EGF de unión a heparina (HB-EGF), péptidos de neuregulina (NRG) tal como NRG1a, NRG1p, NRG2a, NRG2p, NRG3, NRG4 y variantes de corte y empalme de neuroregulina, péptidos de tomoregulina 1 y 2, péptidos de neuroglicano-C, péptidos de lin-3, péptidos de vena, péptidos gurken, péptidos spitz, o péptidos keren; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos. Hay 4 clases de receptor ErbB (denominadas ErbBI, erbB2, erbB3 y erbB4), que también se refieren como receptores HER. Existen varias variantes de estos receptores, que surgen de corte y empalme alternativo y/o escisión del receptor de longitud completa (por ejemplo, la traducción de EGFR v i empieza en aa543; EGFR vil deleción de aa521-603; EGFR vIII deleción de aa 6-273; EGFRvNI/A12-13 deleción de aa 6-273 y 409-520; EGFR vIV deleción de aa 959-1030; EGFR vV truncamiento en el residuo 958; EGFR TDM/2-7 duplicación en tándem de 6-273; EGFR TDM/18-25 duplicación en tándem de 664-1030; EGFR-TDM/18-26 duplicación en tándem de 664­ 1014). Además, hay cuatro isoformas del receptor ErbB4 denominadas erbB4 JM-a, erbB4 JM-b, erbB4 CYT-1 y erbB4 CYT-1.
Los TM preferidos se unen a receptores ErbB (por ejemplo, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4) y variantes de corte y empalme de éstos, en particular el receptor ErbB1. Los t M de ErbB también pueden incluir proteínas que contienen restos de EGF con un sitio de corte y empalme entre la cuarta y quinta cisteínas en el módulo de EGF de seis cisteínas, en el que este módulo se sitúa muy cerca de la región transmembrana del ligando potencial. Por ejemplo, proteoglicano 2 de matriz de interfotoreceptor (IMP-2), meprina (MEP)1a, MEP1p, mucina (m Uc )3, MUC4, MUC12. y MUC17, así como proteínas con un soporte nudo T tal como inhibidor de carboxipeptidasa de patata, y anticuerpos frente a receptores ErbB tal como cetuximab, ABX-EGF, trastuzumab, o EMD72000. Los ejemplos adicionales incluyen quimeras generadas cambiando dominios (secuencias de bucle y/o aminoácidos conectores) de diferentes ligandos de ErbB, tal como un ligando de receptor erbB de mamífero en el que la secuencia de bucle B se ha reemplazado con las presentes en los ligandos de ErbB de insecto (Drosophila), un ligando de ErbB en el que la secuencia de bucle C de EGF se ha reemplazado con la de TGFa(44-50), ligandos EGF en los que uno o más dominios se han reemplazado con secuencias correspondientes en TGFa para crear quimeras EGF/TGFa (por ejemplo, quimeras E3T, T3E, E4T, T4E, T3E4T, T6E y E3T4E, y EGF en las que la secuencia de TGFa N-terminal (WSHFND) (SEQ ID NO: 46)) o la secuencia de neuregulina (SHLVK (SEQ ID NO:47)) se ha usado para reemplazar la secuencia de EGF N-terminal que es C-terminal respecto al primer residuo de cisteína (NSDSE (SEQ ID n O:48)), T1E, y Biregulina. Las quimeras adicionales incluyen EGF en el que un dominio se ha reemplazado con un dominio semejante a EGF de otra proteína, tal como una proteína de coagulación de la sangre, desarrollo neural o de adhesión celular (por ejemplo, receptores Notch 3, Delta 1, EMR1, F4/80, EMR3 y EMR4).
En otra realización, un TM de la presente invención se une a un receptor de hormona liberadora de hormona del crecimiento (GHRH). GHRH también es conocida como factor liberador de hormona del crecimiento (GRF o GHRF) o somatocrinina. Los ejemplos de TM adecuados de la presente invención incluyen el péptido GHRH de longitud completa (1-44), y truncamientos o análogos peptídicos de éste tal como GHRH(1-29); GHRH(1-37); hGHRH(1-40)-OH,
[MeTyr1,Ala15,22,Nle27]-hGHRH(1-29)-NH2
[MeTyr1,Ala8,9,15,22,28,Nle 27]-hGHRH(1-29)-NH2
ciclo(25-29)[MeTyr1,Ala15,DAsp25,Nle27,Orn29+++]-hGHRH(1-29)-NH2.
(D-Tyr1)-GHRH (1-29)-NH2
(D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2
(D-Asp3)-GHRH (1-29)-NH2
(D-Ala4)-GHRH (1-29)-NH2
(D-Thr7)-GHRH (1-29)-NH2
(D-Asn8)-GHRH (1-29)-NH2
(D-Ser9)-GHRH (1-29)-NH2
(D-Tyr10)-GHRH (1-29)-NH2
(Phe4)-GHRH (1-29)-NH2
(pCI-Phe6)-GHRH (1-29)-NH2
(N-Ac-Tyrl)-GHRH (1-29)-NH2
(N-Ac-Tyr1, D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2
(N-Ac-D-Tyr1, D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2
(N-Ac-D-Tyr1, D-Ala 2, D-Asp3)-GHRH (1-29)-NH2
(D-Ala2, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2
(His1, D-Ala2, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2
(N-Ac-His1, D-Ala2, N-Leu27)-GHRH (1-29)-NH2
(His1, D-Ala 2, D-Ala 4, Nleu27)-GHRH (1-29)-NH2
(D-Ala2, D-Asp3, D-Asn8, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2
(D-Asp3, D-Asn8, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2
[His1, NLeu27]-hGHRH(1-29)-NH2
[NLeu27]-hGHRH(1-29)-NH2
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-GIn-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-lle-Met-Ser-Arg-GIn-GIn-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 (SEQ ID NO: 49)
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-GIn-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-NH2 (SEQ ID NO: 50) H-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-GIn-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-NH2
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-lle-Leu-Gly-GIn-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-lle-Met-Asn-Arg-GIn-GIn-Gly-Glu-Arg-Asn-GIn-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2 (SEQ ID NO: 51)
H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-GIn-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-lle-Met-Asn-Arg-GIn-GIn-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2 (SEQ ID NO: 52)
His-Val-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-GIn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-GIn-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-lle-Leu-Asn-Arg (SEQ ID NO: 53) His-Val-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-GIn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-GIn-Leu-Ser-
Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-lle-Leu-Asn-Arg-GIn-GIn-Gly-Glu-Arg-Asn-GIn-
Glu-GIn-Gly-Ala. (SEQ ID NO: 54)
En una realización adicional, el TM se une a un receptor de bombesina (por ejemplo, BRS-1, BRS-2, o BRS-3). Los TM para uso en la presente invención que se unen a un receptor de bombesina incluyen: bombesina - un péptido de 14 aminoácidos aislado originalmente de la piel de una rana (pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 55)); y los dos homólogos conocidos en mamíferos, concretamente neuromedina B, y péptido liberador de gastrina (Gr P) tal como GRP porcino -Ala-Pro-Val-Ser-Val-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Ala-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 56), y GRP humano -Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Thr-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 57). Los TM adicionales incluyen truncamientos correspondientes de bombesina, neuromedina B y GRP así como análogos peptídicos de éstos.
En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de pulmón (por ejemplo, una célula de cáncer de pulmón de células pequeñas, una célula de cáncer de pulmón de células no pequeñas, o una célula de cáncer de pulmón carcinoide). Los presentes inventores han confirmado que se observa expresión indeseable de SNARE en células de cáncer de pulmón. En esta realización, el ligando de Tm se une a un receptor en una célula de cáncer de pulmón, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de eritropoyetina (EPO), un receptor de VEGF tal como un receptor de VEGF-3, un receptor ErbB tal como un receptor de EGF, un receptor ErbB2 ó 3, un receptor de GRP, un receptor de ET(A), un receptor de CCK tal como un receptor de CCK-A o CCK-B, un receptor de FLT tal como un receptor de FLT 3 o FLT4, un receptor de CHRND, un receptor de EPHA tal como un receptor de EPHA7, EPHA4 o EPHA5, un receptor de EFNA tal como un receptor de EFNA3 o EFNB3, un receptor de DLK1, un receptor de FGF tal como un receptor de FGF1, o un receptor de jAg tal como un receptor de JAG1 (CD339) o un receptor de JAG2. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: eritropoyetina (EPO), VEGF tal como VEGF-B, VEGF-C, acetilcolina, péptidos de efrina tal como efrina-A1, A2, A3, A4 o A5, péptidos de pro-neuregulina tal como pro-neuregulina-2, péptidos de neuregulina tal como neuregulina o NTAK, EGF, TGF tal como TGF-beta, GRP, péptido semejante a bombesina, endotelina, PGF, TNF tal como TNF-alfa, IL tal como IL-6, IL-8, oxitocina, vasopresina, NRG tal como NRG-1 alfa, bradiquinina, HGF, GHRH, FGF tal como bFGF, aFGF, FGF-1, FGF-2, ligandos del péptido NOTCH, citoquina FLT3, o gastrina; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En otra realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de vejiga. Los presentes inventores han confirmado que se observa expresión indeseable de SNARE en células de cáncer de vejiga. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor en la célula de cáncer de vejiga, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de IGF tal como un receptor de IGF-1, un receptor de G-CSF, un receptor de VEGF tal como un receptor de VEGF-2, un receptor ErbB tal como un receptor de EGF, un receptor de HGF, o un receptor de FGF tal como un receptor de bFGF de alta/baja afinidad. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: G-CSF, VEGF, HB-EGF, IGF tal como IGF-1 o IGF-2, anfiregulina, betacelulina, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), ErbB tal como EGF, TGF tal como TGF-alfa, IL tal como IL-6, péptido de granulina tal como granulina-4, o FGF tal como bFGF; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de mama. Los presentes inventores han confirmado que se observa expresión indeseable de SNARE en células de cáncer de mama. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor en la célula de cáncer de mama, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de IGF tal como un receptor de IGF-1, un receptor de VIP tal como VIPR-1, un receptor de GRP, un receptor de NMB, un receptor de CXC tal como CXCR4, un receptor de TNF tal como un receptor de TNF 1 ó 2, un receptor de VEGF tal como VEGFR-2 o VEGFR-3, un receptor de neuropilina tal como NRP-1 o NRP-2, un receptor de integrina tal como un receptor de integrina alfa9beta1, un receptor de OB, un receptor de ET tal como ET-RA o ET-RB, un receptor de eritropoyetina (EpoR), un receptor de TGF-beta, un receptor de AMF, o un receptor de prolactina. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: TNF tal como TNF-alfa, VEGF tal como VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, IL tal como IL-6, anfiregulina, leptina, endotelina tal como ET-1, ET-2, ET-3, FGF tal como FGF-2, GHRH, péptido de granulina tal como granulina-4, eritropoyetina, péptidos de neuromedina tal como GRP neuromedina C, neuromedina B, factor de motilidad autocrino (AMF), prolactina, hormona del crecimiento tal como hGH, IGF tal como IGF-1 o IGF-2, péptidos VIP, o péptidos PACAP tal como PACAP-27 o PACAP-38; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer pancreático. Los presentes inventores han confirmado que se observa expresión indeseable de SNARE en células de adenocarcinoma pancreático. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor en una célula de cáncer pancreático, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de VIP tal como un receptor de VIP1, un receptor de VEGF tal como un receptor de VEGF-1 o VEGF2, un receptor de SST tal como un receptor de SST1, un receptor de CHRN tal como CHRNG, CHRNE, CHRNA1 o CHRND, un receptor de IGF tal como IGF1R, un receptor de BRS tal como BRS3, un receptor de GnRH, un receptor de GRP, un receptor de NMB, un receptor de factor de crecimiento tipo 1, un receptor ErbB tal como EGFR, un receptor de CCK tal como CCKB o CCKC, un receptor de PDGF tal como PDGF-alfa, un receptor de ADM, un receptor de factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) tal como FGFR2b, un receptor de FGF tipo I, un receptor de GnRH, un receptor de GFRalfa3/RET, o un receptor de GDNF. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: ErbB tal como EGF, TGF tal como TGF-alfa, gastrina, PDGF, adrenomedulina, VEGF, KGF, FGF tal como FGF-5 o FGF (a/b), VIP, péptidos de SST tal como SST-14 o SST-28, acetilcolina, péptidos de neuromedina tal como GRP neuromedina C, neuromedina B, péptidos de PACAP tal como PACAP-27 o pAc AP-38, IL tal como IL-1a, GnRH, bombesina, artemina, GDNF, o IGF tal como IGF-1 o IGF-2; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de próstata. Los presentes inventores han confirmado que se observa expresión indeseable de SNARE en células de carcinoma de próstata. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor en la célula cancerosa de próstata, tal como a un receptor seleccionado de: un CHRN tal como un receptor CHRNg o CHRNE, un receptor de iGf tal como un receptor de IGF-1, un receptor de VIP tal como un receptor de VIP1, un receptor de CT, un receptor ErbB tal como un receptor EGFR (MR2), [p75(NTR)] o TrkA, un receptor de CC tal como un receptor CCR2, un receptor de FGF tal como FGFR-1 a -4, un receptor de KGF, un receptor de FSH, un receptor de GHS tal como GHS-R 1a, un receptor de CXC tal como CXCR2, un receptor de VPAC 0 pAc tal como VPAC1 o PAC1, un receptor de CRL, un receptor de c-Met/HGF, o un receptor de GH. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: calcitonina (CT), TGF tal como TGF-alfa, adrenomedulina, acetilcolina, prolactina, IL tal como IL-6 o IL-8, NGF, PDF, MCP tal como MCP-1, somatostatina, FGF tal como FGF1 (FGF ácido), FGF2 (FGF básico), FGF6 o FGF8, EPO, VEGF, KGF, FSH, grelina, FGF17, TNF tal como TNF-alfa, VIP, péptidos de PACAP tal como PACAP-27 o PACAP-38, AM, HGF, GH, GM-CSF, o IGF tal como IGF-1 o IGF-2; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de cuello uterino o uterino. Los presentes inventores han confirmado que se observa expresión indeseable de SNARE en células de cáncer de cuello uterino. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor en la células de cáncer de cuello uterino o uterino, tal como a un receptor seleccionado de: receptor de EPHA tal como receptor de EPHA5, EPHA7, EPHA4, EPHA3, un receptor de PDGF tal como PDGFRA, un receptor de EFNA tal como EFNA1, un receptor de SST tal como SSTR1, un receptor de ErbB tal como un EGFR, un receptor de FLT tal como un receptor de FLT-1, un receptor de FLK tal como un receptor de FLK-1, un receptor de VEGf tal como VEGFR-3, un receptor de ET tal como ET(A)R, un receptor de IGF tal como IGF-1R, o un receptor de LIF tal como LIFR. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: ErbB tal como EGF, TGF tal como TGF-alfa, G-CSF, péptidos de PDGF tal como PDGFA o PDGFC, péptidos de SST tal como SST-14 o SST-28, IGF tal como IGF-1 o Ig F-2, péptidos de efrina tal como efrina-A1, A2, A3, A5 o A5, VEGF tal como VEGF-C o VEGF-D, péptido granulin tal como granulina-4, endotelina tal como ET-1, o IL tal como IL-6 o IL-1; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de leucemia. Los presentes inventores han confirmado que se observa expresión indeseable de SNARE en células de leucemia. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor en la célula de leucemia, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de: un receptor de FLT tal como un receptor de FLT1 o 3, un receptor de FGF tal como FGFR1, 2 ó 3, un receptor de EFN tal como un receptor de EFNB1 o EFNB3, un receptor de jAg tal como un receptor de JAG1 (cd339), un receptor de PDGF tal como un receptor PDGFRA o B, EPHA1, EPHA2, un receptor de No Tc H tal como un receptor de NOTCH3 ó 4, un receptor de EPHA tal como un receptor de EPHA7, un receptor de LIF, un receptor de EFN tal como un receptor de EFNA1 ó 3, un receptor de DLL tal como un receptor de DLL3, un receptor ErbB tal como un receptor ErbB2 ó 3, un receptor de KDR, un receptor de GHS tal como GHS-R tipo 1a, un receptor de IL tal un receptor de IL-1 tipo II, o un receptor de IGF tal como un IGF1R. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: IGF tal como iGf -1 o IGF-2, péptidos de VEGF tal como VEGFB, grelina, APRIL, péptidos de pro-neuregulina tal como pro-neuregulina-2, péptidos de neuregulina, NTAK, FGF tal como bFGF, aFGF o FGF-1, péptidos de NOTCH tal como NOTCH1, 2 ó 3, péptidos de PGF, péptidos de PDGF tal como PDGFA, PDGFB o PDGf D, péptidos de efrina tal como efrina-A (1-5), LlF, ligando GP30, eritropoyetina, péptidos de JAG tal como JAG-1 o JAG-2, Delta-1, IL tal como IL1-alfa, o GM-CSF; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de ovario. Los presentes inventores han confirmado que se observa expresión indeseable de SNARE en células de cáncer de ovario. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor en la célula de cáncer de ovario, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de ErbB tal como un receptor de ErbB2, 3 ó 4, un receptor de FGF tal como FGFR3, un receptor de JAG tal como un receptor de JAG2, un receptor de EPH tal como un receptor de EPHA1 ó 2, un receptor de IGF tal como un IGF1R, un receptor de GRP, un receptor de EFN tal como un receptor de EFNB3, A1 o B2, o un receptor de GNRH. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: péptidos de NRG tal como n Rg -2 o NRG-3, o péptidos del factor de crecimiento semejante a EGF de unión a heparina; péptidos de neuregulina, péptido GP30, péptidos de NOTCH, péptidos de granulinatal como granulina-4, péptidos de efrina-A tal como efrina A1-A5, péptidos de IGF tal como IGF-1 o IGF-2, NTAK, GRP, o GnRH; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de hueso. Los presentes inventores han confirmado que se observa expresión indeseable de SNARE en células de cáncer de hueso. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor en la célula de cáncer de hueso, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de IGF tal como un IGF-IR, un receptor de GHRH, o un receptor de FGF tal como un receptor de bFGF. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: PDGF tal como PDGF-alfa o PDGF-beta, TGF tal como TGFbeta1, iGf tal como IGF-1, GHRH, Fg F tal como bFGF, G-CSF, o IL tal como IL-6; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de cerebro. Los presentes inventores han confirmado que se observa expresión indeseable de SNARE en células de cáncer de cerebro. En esta realización, el ligando de Tm se une a un receptor en la célula de cáncer de cerebro, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de EPO, glicoproteína receptora de 78 kDa (gp78), un receptor de ErbB tal como EGFR, como un receptor de PDGF tal como PDGFR-alfa, un receptor de CRL tal como CRLR/RAMP2 o CRLR/RAMP3, un receptor de neuropilina tal como NRP-1 o NRP-2, un receptor de CXC tal como CXCR4, un VEGFR tal como VEGFR-1, un IGFR tal como IGF1R, un receptor de GDNF tal como GDNFR-alfa 1, o un receptor de MET. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: péptidos de eritropoyetina (EPO), péptidos de IGF, péptidos de factor de motilidad autocrino (AMF), péptidos de GDNF, péptidos de HB-e Gf , péptidos de TGF tal como TGF-alfa, péptidos de PDGF tal como PDGfA, PDGF-B, PDGF-C o PDGF-D, péptidos de neuregulina tal como neuregulina-1, adrenomedulina, péptidos de IL tal como IL-6, péptidos de factor de dispersión/factor de crecimiento de hepatocitos (SF/HGF), péptidos de granulina tal como granulina-4, péptidos de VEGF tal como VEGF-A, o péptidos de TGF tal como TGF beta 1 o TGF beta 2; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer colorrectal. Los presentes inventores han confirmado que se observa expresión indeseable de SNARE en células de cáncer colorrectal. En esta realización, el ligando de Tm se une a un receptor en la célula de cáncer colorrectal, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de IGF tal como IGF-R1, un receptor de ErbB tal como EGFR, un receptor de GRP, un receptor de IL tal como IL6-R, un receptor de CCK tal como un receptor de CCK-B, o un receptor de prolactina. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: FGF tal como FGF18, IGF tal como IGF-1, TGF tal como TGF-alfa, GRP, IL tal como IL6, ErbB tal como EGF, gastrina, o prolactina; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de hígado. Los presentes inventores han confirmado que se observa expresión indeseable de SNARE en células de cáncer de hígado. En esta realización, el ligando de Tm se une a un receptor en la célula de cáncer de hígado, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de TrkA (NGF), un receptor de IGF tal como IGF-IR, un receptor de HGF tal como un receptor de HGF-Met, un receptor de c-met, un receptor de gp78, o un receptor de ErbB tal como un EGFR. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: Ng F, IL tal como IL-6 o IL-8, IGF tal como IGF-1 o IGF-2, HGF, SF/HGF, hepatopoyetina (HPO), AMF, TGF tal como TGF-beta o TGF-alfa, LIF o PDGF; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de la piel. Los presentes inventores han confirmado que se observa expresión indeseable de SNARE en células de cáncer de la piel. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor en la célula de cáncer de la piel (por ejemplo, basal, melanoma, escamoso), tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de FGF receptor tal como FGFR-1, un receptor de c-kit, un receptor de VEGF tal como VEGFR-2, un receptor de c-Met, o un receptor de melanocortina tal como un receptor de melanocortina-1. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: IL tal como IL8 o IL-10, FGF tal como bFGF, SCF, VEGF tal como VEGF-A, ErbB tal como EGF, EPO, osteopontina (OPN), TGF tal como TGF-beta, MGSA/GRO tal como MGSA/GRO alfa, beta o gamma, HGF/SF, alfa-melanotropina, anfiregulina, o AMF; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer de sarcoma de Kaposi. Los presentes inventores han confirmado que se observa expresión indeseable de SNARE en células de cáncer de sarcoma de Kaposi. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor en la célula de sarcoma de Kaposi, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de PDGF tal como PDGFRA, un receptor de c-kit, un receptor de TGF-beta tal como TGFR-1, un receptor de endotelina tal como ETA-R, un receptor de quimioquina tal como CXCR3 o CCRL2, un receptor de VEGF tal como VEGFR-2, un receptor de IGF tal como IGF-IR, o un receptor de angiopoyetina tal como TIE2. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: PDGFa, IGF-1, Ang2, IL tal como IL6, VEGF tal como VEGF-A, endotelina-1, TGF tal como TGF-beta, Cx Cl 11, CCL8/14; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
En una realización, la célula cancerosa es una célula de cáncer renal. En esta realización, el ligando de TM se une a un receptor en la célula de cáncer renal, tal como a un receptor seleccionado de: un receptor de IGF tal como IGF-IR, un receptor de VEGF, un receptor de CXC, o un receptor de ErbB tal como un EGFR. Los TM preferidos en esta realización incluyen el ligando natural correspondiente para dichos receptores, así como truncamientos y análogos peptídicos de éste. Los ejemplos incluyen: IL tal como IL-6 o IL-8, IGF tal como IGF-1 o IGF-2, TGF tal como TGF-beta o TGF-alfa, VEGF tal como VEGF-A, quimioquinas tal como CXCL12; así como truncamientos y análogos peptídicos de éstos.
Las realizaciones anteriores describen cánceres particulares en los que los presentes inventores han demostrado expresión indeseable de SNARE (por ejemplo, expresión de SNARE regulada al alza). La presente invención no está, sin embargo, limitada a dichos tipos de cáncer específicos, y engloba todos los tipos de cáncer en los que ocurre la expresión de SNARE.
La expresión indeseable de SNARE descrita anteriormente (por ejemplo, regulación al alza) en células cancerosas puede estar opcionalmente ligada a una regulación al alza de uno o más tipos de receptores específicos presentes en las células cancerosas en cuestión. A este respecto, los presentes inventores han identificado tipos de receptores particulares (detallados anteriormente), que están regulados al alza en las mismas células en las que se observa una expresión indeseable de SNARE (por ejemplo, regulada al alza).
Preparación de polipéptidos
Los polipéptidos de la presente invención comprenden 3 componentes principales: un 'bioactivo' (es decir, una proteasa no citotóxica); un TM; y un dominio de translocación. La tecnología general asociada con la preparación de dichas proteínas de fusión se refiere frecuentemente como tecnología de toxinas re-dirigidas. Como ejemplificación, nos referimos a: WO94/21300; WO96/33273; WO98/07864; WO00/10598; WO01/21213; WO06/059093; WO00/62814; WO00/04926; WO93/15766; WO00/61192; y WO99/58571.
Con más detalle, el componente TM de la presente invención puede fusionarse bien con el componente proteasa o el componente de translocación de la presente invención. Dicha fusión es preferiblemente mediante un enlace covalente, por ejemplo, bien un enlace covalente directo o a través de una molécula espaciadora/conectora. El componente proteasa y el componente de translocación están unidos entre sí preferiblemente a través de un enlace covalente, por ejemplo, bien un enlace covalente directo o a través de una molécula espaciadora/conectora.
Las moléculas espaciadoras/conectoras adecuadas son muy conocidas en la técnica, y típicamente comprenden una secuencia basada en aminoácidos de entre 5 y 40, preferiblemente entre 10 y 30 residuos de aminoácidos de longitud.
En el uso, los polipéptidos tienen una conformación di-cadena, en la que el componente proteasa y el componente de translocación están unidos entre sí, preferiblemente a través de un enlace disulfuro.
Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse por técnicas de conjugación química convencional, que son muy conocidas para un experto en la técnica. Como ejemplo, se hace referencia a Hermanson, G. T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, y a Wong, S. S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press, Nagy et al., PNAS 95 p 1794-99 (1998). Las metodologías detalladas adicionales para unir TM sintéticos a un polipéptido de la presente invención se proporcionan, por ejemplo, en EP0257742.
Alternativamente, los polipéptidos pueden prepararse por preparación recombinante de una única proteína de fusión de polipéptido (véase, por ejemplo, WO98/07864). Esta técnica se basa en el mecanismo bacteriano in vivo mediante el cual se prepara la neurotoxina clostridial nativa (es decir, holotoxina), y resulta en una proteína de fusión que tiene la organización estructural 'simplificada' siguiente:
NH2-[componente proteasa]-[componente de translocación]-[TM]-COOH
Según WO98/07864, el TM se pone hacia el extremo C-terminal de la proteína de fusión. La proteína de fusión se activa entonces por tratamiento con una proteasa, que escinde en un sitio entre el componente proteasa y el componente de translocación. Se produce así una proteína di-cadena, que comprende el componente proteasa como una única cadena polipeptídica unida covalentemente (a través de un puente disulfuro) a otra única cadena polipeptídica que contiene el componente de translocación más TM.
Alternativamente, según WO06/059093, el componente TM de la proteína de fusión está localizado hacia la mitad de la secuencia lineal de la proteína de fusión, entre el sitio de escisión de proteasa y el componente de translocación. Esto asegura que el TM está unido al dominio de translocación (es decir, como ocurre con la holotoxina clostridial nativa), aunque en este caso los dos componentes están invertidos en orden frente a la holotoxina nativa. La escisión posterior en el sitio de escisión de proteasa expone la parte N-terminal del TM, y proporciona la proteína de fusión de polipéptido di-cadena.
La o las secuencias de escisión de proteasa mencionadas anteriormente pueden introducirse (y/o eliminarse cualquier secuencia de escisión inherente) a nivel de ADN por medios convencionales, tal como por mutagénesis dirigida a sitio. El cribado para confirmar la presencia de secuencias de escisión puede llevarse a cabo manualmente o con la ayuda de software informático (por ejemplo, el programa MapDraw por DNASTAR, Inc.). Aunque puede emplearse cualquier sitio de escisión de proteasa (es decir, clostridial. o no clostridial), se prefieren los siguientes:
Enteroquinasa (DDDDKi) (SEQ ID NO: 58)
Factor Xa (IEGR4¿/IDGR¿) (SEQ ID NOS: 59 y 60)
TEV (virus de grabado de tabaco) (ENLYFQ^G) (SEQ ID NO: 61)
Trombina (LVPR^GS) (SEQ ID NO: 62)
PreScission (LEVLFQ^GP) (SEQ ID NO: 63)
Los sitios de escisión de proteasa adicionales incluyen secuencias de reconocimiento que se escinden por una proteasa no citotóxica, por ejemplo, por una neurotoxina clostridial. Éstas incluyen las secuencias de reconocimiento de la proteína SNARE (por ejemplo, SNAP-25, sintaxina, VAMP) que se escinden por proteasas no citotóxicas tal como neurotoxinas clostridiales. Los ejemplos particulares se proporcionan en US2007/0166332.
También englobado por el término sitio de escisión de proteasa está una inteína, que es una secuencia de autoescisión. La reacción de auto-escisión es controlable, por ejemplo, variando la concentración de agente reductor presente. Los sitios de escisión 'de activación' mencionados anteriormente también pueden emplearse como un sitio de escisión 'destructivo' (discutido más adelante) si uno se incorporara en un polipéptido de la presente invención. En una realización preferida, la proteína de fusión de la presente invención puede comprender una o más etiquetas de purificación localizadas en N-terminal y/o C-terminal. Aunque puede emplearse cualquier etiqueta de purificación, se prefieren las siguientes:
Etiqueta His (por ejemplo, 6 x histidina) (SEQ ID NO: 64), preferiblemente como una etiqueta C-terminal y/o N-terminal Etiqueta MBP (proteína de unión a maltosa), preferiblemente como una etiqueta N-terminal
Etiqueta GST (glutatión-S-transferasa), preferiblemente como una etiqueta N-terminal
Etiqueta His-MBP, preferiblemente como una etiqueta N-terminal
Etiqueta GST-MBP, preferiblemente como una etiqueta N-terminal
Etiqueta tioredoxina, preferiblemente como una etiqueta N-terminal
Etiqueta CBD (Dominio de Unión a Quitina), preferiblemente como una etiqueta N-terminal.
Pueden incluirse una o más moléculas peptídicas espaciadoras/conectoras en la proteína de fusión. Por ejemplo, un espaciador peptídico puede emplearse entre una etiqueta de purificación y el resto de la molécula de proteína de fusión.
Así, un tercer aspecto de la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifica un polipéptido como se ha descrito anteriormente (es decir, el segundo aspecto de la presente invención). Dicho ácido nucleico puede incluirse en la forma de un vector, tal como un plásmido, que puede incluir opcionalmente uno o más de un origen de replicación, un sitio de integración de ácido nucleico, un promotor, un terminador, y un sitio de unión a ribosoma.
La presente invención también incluye un método para expresar la secuencia de ácido nucleico descrita anteriormente (es decir, el tercer aspecto de la presente invención) en una célula huésped, en particular en E. coli.
La presente invención también incluye un método para activar un polipéptido de la presente invención, comprendiendo dicho método poner en contacto el polipéptido con una proteasa que escinde el polipéptido en un sitio de reconocimiento (sitio de escisión) localizado entre el componente proteasa no citotóxica y el componente de translocación, convirtiendo de esta manera el polipéptido en un polipéptido di-cadena en el que los componentes proteasa no citotóxica y de translocación están unidos entre sí por un enlace disulfuro. En una realización preferida, el sitio de reconocimiento no es nativo para una neurotoxina clostridial natural y/o para una proteasa de IgA natural. Los polipéptidos de la presente invención pueden modificarse adicionalmente para reducir o prevenir efectos secundarios no deseados asociados con la dispersión en áreas no diana. Según esta realización, el polipéptido comprende un sitio de escisión destructivo. El sitio de escisión destructivo es distinto del sitio de 'activación' (es decir, formación de di-cadena), y es escindible por una segunda proteasa y no por la proteasa no citotóxica. Además, cuando se escinde en el sitio de escisión destructivo por la segunda proteasa, el polipéptido tiene una potencia reducida (por ejemplo, capacidad de unión reducida a la célula diana pretendida, actividad de translocación reducida y/o actividad de proteasa no citotóxica reducida). Para compleción, cualquiera de los sitios de escisión 'destructivos' de la presente invención pueden emplearse separadamente como un sitio de 'activación' en un polipéptido de la presente invención. Así, según esta realización, la presente invención proporciona un polipéptido que puede inactivarse y/o destruirse de forma controlable en una localización fuera del sitio.
En una realización preferida, el sitio de escisión destructivo es reconocido y escindido por una segunda proteasa (es decir, una proteasa destructiva) seleccionada de una proteasa circulante (por ejemplo, una proteasa extracelular, tal como una proteasa sérica o una proteasa de la cascada de coagulación de la sangre), una proteasa asociada a tejido (por ejemplo, una metaloproteasa de matriz (MMP), tal como una MMP de músculo), y una proteasa intracelular (preferiblemente una proteasa que está ausente de la célula diana).
Así, en el uso, si un polipéptido de la presente invención se dispersa fuera de su célula diana pretendida y/o es captado por una célula no diana, el polipéptido se inactivará por escisión del sitio de escisión destructivo (por la segunda proteasa).
En una realización, el sitio de escisión destructivo es reconocido y escindido por una segunda proteasa que está presente en un tipo celular fuera del sitio. En esta realización, la célula fuera del sitio y la célula diana son preferiblemente tipos celulares diferentes. Alternativamente (o además), el sitio de escisión destructivo es reconocido y escindido por una segunda proteasa que está presente en una localización fuera del sitio (por ejemplo, distal a la célula diana). De acuerdo con esto, cuando la escisión destructiva ocurre extracelularmente, la célula diana y la célula fuera del sitio pueden ser bien tipos celulares iguales o diferentes. A este respecto, la célula diana y la célula fuera del sitio pueden poseer cada una un receptor al que se une el mismo polipéptido de la invención.
El sitio de escisión destructivo de la presente invención proporciona la inactivación/destrucción del polipéptido cuando el polipéptido está en o a una localización fuera del sitio. A este respecto, la escisión en el sitio de escisión destructivo minimiza la potencia del polipéptido (cuando se compara con un polipéptido idéntico que carece del mismo sitio de escisión destructivo, o que posee el mismo sitio destructivo, pero en una forma no escindida). Como ejemplo, la potencia reducida incluye: unión reducida (a un receptor de célula de mamífero) y/o translocación reducida (a través de la membrana endosomal de una célula de mamífero en la dirección del citosol), y/o escisión reducida de la proteína SNARE.
Cuando se selecciona el o los sitios de escisión destructivos en el contexto de la presente invención, se prefiere que el o los sitios de escisión destructivos no sean sustratos para ninguna proteasa que pueda usarse separadamente para modificación posterior a la traducción del polipéptido de la presente invención como parte de su proceso de fabricación. A este respecto, las proteasas no citotóxicas de la presente invención típicamente emplean un evento de activación de proteasa (a través de un sitio de escisión de 'activación' separado de proteasa, que es estructuralmente distinto del sitio de escisión destructivo de la presente invención). El propósito del sitio de escisión de activación es escindir un enlace peptídico entre la proteasa no citotóxica y los componentes de translocación o unión del polipéptido de la presente invención, proporcionando de esta manera un polipéptido di-cadena 'activado' en el que dichos dos componentes están unidos entre sí a través de un enlace di-sulfuro.
Así, para ayudar a asegurar que el o los sitios de escisión destructivos de los polipéptidos de la presente invención no afectan adversamente el sitio de escisión de 'activación' y la formación posterior de enlace di-sulfuro, los primeros se introducen preferiblemente en el polipéptido de la presente invención en una posición de al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, y más preferiblemente al menos 60, al menos 70, al menos 80 residuos de aminoácidos (contiguos) lejos del sitio de escisión de 'activación'.
El o los sitios de escisión destructivos y el sitio de escisión de activación son preferiblemente exógenos (es decir, preparados por ingeniería/artificiales) respecto a los componentes nativos del polipéptido. En otras palabras, dichos sitios de escisión son preferiblemente no inherentes a los componentes nativos correspondientes del polipéptido. Como ejemplo, un componente proteasa o de translocación basado en la cadena L o cadena H BoNT/A (respectivamente) pueden prepararse por ingeniería según la presente invención para incluir un sitio de escisión. Dicho sitio de escisión no estaría, sin embargo, presente en la cadena L o cadena H BoNT nativa correspondiente. De forma similar, cuando el componente Resto de Direccionamiento del polipéptido se prepara por ingeniería para incluir un sitio de escisión de proteasa, dicho sitio de escisión no estaría presente en la secuencia nativa correspondiente del Resto de Direccionamiento correspondiente.
En una realización preferida de la presente invención, el o los sitios de escisión destructivos y el sitio de escisión de 'activación' no se escinden por la misma proteasa. En una realización, los dos sitios de escisión se diferencian entre sí en que al menos uno, más preferiblemente al menos dos, particularmente preferiblemente al menos tres, y lo más preferiblemente al menos cuatro de los aminoácidos tolerados en las secuencias de reconocimiento respectivas es/son diferentes.
Como ejemplo, en el caso de una quimera de polipéptido que contiene un sitio de 'activación' de Factor Xa entre los componentes clostridiales cadena L y Hn, se prefiere emplear un sitio de escisión destructivo que es un sitio distinto de un sitio de Factor Xa, que puede insertarse en cualquier lugar en el o los componentes cadena L y/o Hn y/o TM. En este escenario, el polipéptido puede modificarse para acomodar un sitio de 'activación' alternativo entre los componentes cadena L y Hn (por ejemplo, sitio de escisión de enteroquinasa), en cuyo caso puede incorporarse un sitio de escisión de Factor Xa separado en cualquier lugar en el polipéptido como el sitio de escisión destructivo. Alternativamente, el sitio de 'activación' de Factor Xa existente entre los componentes cadena L y Hn puede retenerse, e incorporarse un sitio de escisión alternativo tal como un sitio de escisión de trombina como el sitio de escisión destructivo.
Cuando se identifican sitios adecuados en la secuencia primaria de cualquiera de los componentes de la presente invención para inclusión de sitio(s) de escisión, es preferible seleccionar una secuencia primaria que concuerde de cerca con el sitio de escisión propuesto que se va a insertar. Haciendo esto, se introducen cambios estructurales mínimos en el polipéptido. Como ejemplo, los sitios de escisión típicamente comprenden al menos 3 residuos de aminoácidos contiguos. Así, en una realización preferida, se selecciona un sitio de escisión que ya posee (en la o las posiciones correctas) al menos uno, preferiblemente al menos dos de los residuos de aminoácidos que se requieren con el fin de introducir el nuevo sitio de escisión. Como ejemplo, en una realización, puede introducirse el sitio de escisión de la Caspasa 3 (DMQD) (SEQ ID NO: 65)). A este respecto, se identifica una posición de inserción preferida que ya incluye una secuencia primaria seleccionada, por ejemplo, de Dxxx, xMxx, xxQx, xxxD, DMxx, DxQx, DxxD, xMQx, xMxD, xxQD, DMQx, xMQD, DxQD, y DMxD.
De forma similar, se prefiere introducir los sitios de escisión en regiones expuestas a la superficie. Dentro de las regiones expuestas a la superficie, se prefieren las regiones de bucle existentes.
En una realización preferida de la presente invención, el o los sitios de escisión destructivos se introducen en una o más de las posiciones siguientes, que se basan en la secuencia primaria de aminoácidos de BoNT/A. Aunque las posiciones de inserción se identifican (por conveniencia) por referencia a BoNT/A, las secuencias primarias de aminoácidos de dominios de proteasa y/o dominios de translocación alternativos pueden alinearse fácilmente con dichas posiciones de BoNT/A.
Para el componente proteasa, se prefiere una o más de las posiciones siguientes: 27-31, 56-63, 73-75, 78-81, 99-105, 120-124, 137-144, 161-165, 169-173, 187-194, 202-214, 237-241, 243-250, 300-304, 323-335, 375-382, 391-400, y 413-423. La numeración anterior preferiblemente empieza en el extremo N del componente proteasa de la presente invención.
En una realización preferida, el o los sitios de escisión destructivos están localizados en una posición mayor de 8 residuos de aminoácidos, preferiblemente mayor de 10 residuos de aminoácidos, más preferiblemente mayor de 25 residuos de aminoácidos, particularmente preferiblemente mayor de 50 residuos de aminoácidos desde el extremo N del componente proteasa. De forma similar, en una realización preferida, el o los sitios de escisión destructivos están localizados en una posición mayor de 20 residuos de aminoácidos, preferiblemente mayor de 30 residuos de aminoácidos, más preferiblemente mayor de 40 residuos de aminoácidos, particularmente preferiblemente mayor de 50 residuos de aminoácidos desde el extremo C del componente proteasa.
Para el componente de translocación, se prefiere una o más de las posiciones siguientes: 474-479, 483-495, 507-543, 557-567, 576-580, 618-631, 643-650, 669-677, 751-767, 823-834, 845-859. La numeración anterior preferiblemente acepta una posición de partida de 449 para el extremo N del componente del dominio de translocación de la presente invención, y una posición final de 871 para el extremo C del componente del dominio de translocación.
En una realización preferida, el o los sitios de escisión destructivos están localizados en una posición mayor de 10 residuos de aminoácidos, preferiblemente mayor de 25 residuos de aminoácidos, más preferiblemente mayor de 40 residuos de aminoácidos, particularmente preferiblemente mayor de 50 residuos de aminoácidos desde el extremo N del componente de translocación. De forma similar, en una realización preferida, el o los sitios de escisión destructivos están localizados en una posición mayor de 10 residuos de aminoácidos, preferiblemente mayor de 25 residuos de aminoácidos, más preferiblemente mayor de 40 residuos de aminoácidos, particularmente preferiblemente mayor de 50 residuos de aminoácidos desde el extremo C del componente de translocación.
En una realización preferida, el o los sitios de escisión destructivos están localizados en una posición mayor de 10 residuos de aminoácidos, preferiblemente mayor de 25 residuos de aminoácidos, más preferiblemente mayor de 40 residuos de aminoácidos, particularmente preferiblemente mayor de 50 residuos de aminoácidos desde el extremo N del componente TM. De forma similar, en una realización preferida, el o los sitios de escisión destructivos están localizados en una posición mayor de 10 residuos de aminoácidos, preferiblemente mayor de 25 residuos de aminoácidos, más preferiblemente mayor de 40 residuos de aminoácidos, particularmente preferiblemente mayor de 50 residuos de aminoácidos desde el extremo C del componente TM.
El polipéptido de la presente invención puede incluir uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más) sitios de escisión destructivos de proteasas. Cuando se incluye más de un sitio de escisión destructivo, cada sitio de escisión puede ser el mismo o diferente. A este respecto, el uso de más de un sitio de escisión destructivo proporciona inactivación fuera de sitio mejorada. De forma similar, el uso de dos o más sitios de escisión destructivos diferentes proporciona una flexibilidad adicional en el diseño.
El o los sitios de escisión destructivos pueden prepararse por ingeniería en cualquiera del o de los componentes del polipéptido siguientes: el componente proteasa no citotóxica; el componente de translocación; el Resto de Direccionamiento; o el péptido espaciador (si está presente). A este respecto, el o los sitios de escisión destructivos se eligen para asegurar un efecto adverso mínimo en la potencia del polipéptido (por ejemplo, teniendo un efecto mínimo en las regiones de direccionamiento/unión y/o dominio de translocación, y/o en el dominio de proteasa no citotóxica) mientras se asegura que el polipéptido es lábil fuera de su sitio diana/célula diana.
Los sitios de escisión destructivos preferidos (más las segundas proteasas correspondientes) se listan en la Tabla inmediatamente a continuación. Los sitios de escisión listados son puramente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes para la presente invención.
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Las metaloproteasas de matriz (MMP) son un grupo preferido de proteasas destructivas en el contexto de la presente invención. En este grupo, ADAM17 (EC 3.4.24.86, también conocido como TACE), se prefiere y escinde una variedad de proteínas de la superficie celular ancladas a la membrana para “desprender” los dominios extracelulares. Las MMP preferidas adicionales incluyen adamalisinas, serralisinas, y astacinas.
Otro grupo de proteasas destructivas preferidas es una proteasa de sangre de mamífero, tal como Trombina, Factor de Coagulación VIIa, Factor de Coagulación IXa, Factor de Coagulación Xa, Factor de Coagulación XIa, Factor de Coagulación XIIa, Calicreína, Proteína C, y proteasa de serina asociada a MBP.
En una realización de la presente invención, dicho sitio de escisión destructivo comprende una secuencia de reconocimiento que tiene al menos 3 ó 4, preferiblemente 5 ó 6, más preferiblemente 6 ó 7, y particularmente preferiblemente al menos 8 residuos de aminoácidos contiguos. A este respecto, cuanto mayor (en términos de residuos de aminoácidos contiguos) es la secuencia de reconocimiento, menos probable es que ocurra una escisión no específica del sitio destructivo a través de una segunda proteasa no pretendida.
Se prefiere que el sitio de escisión destructivo de la presente invención se introduzca en el componente proteasa y/o el Resto de Direccionamiento y/o en el componente de translocación y/o en el péptido espaciador. De estos cuatro componentes, se prefiere el componente proteasa. De acuerdo con esto, el polipéptido puede inactivarse rápidamente por destrucción directa de los componentes proteasa no citotóxica y/o de unión y/o de translocación.
Adm inistración de polipéptidos
En el uso, la presente invención emplea una composición farmacéutica, que comprende un polipéptido, junto con al menos un componente seleccionado de un vehículo, excipiente, adyuvante, propelente y/o sal farmacéuticamente aceptables.
Los polipéptidos de la presente invención pueden formularse para aplicación oral, parenteral, infusión continua, implante, inhalación o tópica. Las composiciones adecuadas para inyección pueden estar en la forma de disoluciones, suspensiones o emulsiones, o polvos secos que se disuelven o suspenden en un vehículo adecuado antes del uso.
Los medios de administración local pueden incluir un aerosol, u otro pulverizador (por ejemplo, un nebulizador). A este respecto, una formulación en aerosol de un polipéptido permite la administración a los pulmones y/o otros conductos nasales y/o bronquiales o de vías aéreas.
La ruta preferida de administración se selecciona de: sistémica, laparoscópica y/o inyección localizada (por ejemplo, inyección directamente en el tumor).
En el caso de formulaciones para inyección, es opcional incluir una sustancia farmacéuticamente activa para ayudar en la retención en o reducir la eliminación del polipéptido del sitio de administración. Un ejemplo de dicha sustancia farmacéuticamente activa es un vasoconstrictor tal como adrenalina. Dicha formulación confiere la ventaja de incrementar el tiempo de residencia del polipéptido después de la administración y así incrementar y/o potenciar su efecto.
Los intervalos de dosificación para la administración de los polipéptidos de la presente invención son aquellos para producir el efecto terapéutico deseado. Se apreciará que el intervalo de dosificación requerido depende de la naturaleza precisa del polipéptido o composición, la ruta de administración, la naturaleza de la formulación, la edad del paciente, la naturaleza, magnitud o gravedad de la afección del paciente, contraindicaciones, si existen, y el criterio del médico responsable. Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse usando rutinas empíricas estándar para la optimización.
Las dosificaciones diarias adecuadas (por kg de peso del paciente) están en el intervalo 0,0001-1 mg/kg, preferiblemente 0,0001-0,5 mg/kg, más preferiblemente 0,002-0,5 mg/kg, y particularmente preferiblemente 0,004-0,5 mg/kg. La dosificación unitaria puede variar de menos de 1 microgramo a 30 mg, pero típicamente estará en la región de 0,01 a 1 mg por dosis, que puede administrarse diariamente o preferiblemente menos frecuentemente, tal como semanalmente o cada seis meses.
Un régimen de dosificación particularmente preferido se basa en 2,5 ng de polipéptido como la 1X dosis. A este respecto, las dosificaciones preferidas están en el intervalo 1X-100X (es decir, 2,5-250 ng).
Las formas de dosificación fluidas se preparan típicamente utilizando el polipéptido y un vehículo estéril sin pirógenos. El polipéptido, dependiendo del vehículo y concentración usados, puede bien disolverse o suspenderse en el vehículo. En la preparación de disoluciones, el polipéptido puede disolverse en el vehículo, haciéndose la disolución isotónica si es necesario por la adición de cloruro de sodio y esterilizando por filtración a través de un filtro estéril usando técnicas asépticas antes de utilizarlo para rellenar viales o ampollas estériles adecuados y sellar. Alternativamente, si la estabilidad de la disolución es adecuada, la disolución en sus contenedores sellados puede esterilizarse mediante autoclave. Ventajosamente, pueden disolverse en el vehículo aditivos tales como agentes tamponadores, solubilizadores, estabilizadores, conservantes o bactericidas, de suspensión o emulsionantes y o agentes anestésicos locales.
Los polvos secos, que se disuelven o suspenden en un vehículo adecuado antes del uso, pueden prepararse utilizando ingredientes pre-esterilizados para rellenar un contenedor estéril usando técnica aséptica en un área estéril. Alternativamente, los ingredientes pueden disolverse en contenedores adecuados usando técnica aséptica en un área estéril. El producto se liofiliza y los contenedores se sellan asépticamente.
Las suspensiones parenterales, adecuadas para inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica, se preparan sustancialmente de la misma manera, excepto que los componentes estériles se suspenden en el vehículo estéril, en lugar de disolverse y la esterilización no puede conseguirse por filtración. Los componentes pueden aislarse en un estado estéril o alternativamente pueden esterilizarse después del aislamiento, por ejemplo, por irradiación gamma.
Ventajosamente, se incluye un agente de suspensión, por ejemplo, polivinilpirrolidona en la composición o composiciones para facilitar la distribución uniforme de los componentes.
La administración según la presente invención puede aprovechar una variedad de tecnologías de administración incluyendo encapsulación en micropartículas, sistemas de administración virales o impacto de aerosol de alta presión.
Sección de definiciones
Resto de Direccionamiento (TM) significa cualquier estructura química que interacciona funcionalmente con un Sitio de Unión para causar una asociación física entre el polipéptido de la invención y la superficie de una célula diana. En el contexto de la presente invención, la célula diana es una célula cancerosa, por ejemplo, una en la que la estimulación autocrina está dirigiendo la proliferación, supervivencia, potencial metastásico o angiogénesis. El término TM engloba cualquier molécula (es decir, una molécula natural, o una variante de ésta químicamente/físicamente modificada) que es capaz de unirse a un Sitio de Unión en la célula diana, Sitio de Unión que es capaz de internalización (por ejemplo, formación de endosomas)— también referido como endocitosis mediada por receptor. El TM puede poseer una función de translocación de membrana endosomal, en cuyo caso los componentes TM y Dominio de Translocación separados no necesitan estar presentes en un agente de la presente invención. A lo largo de la descripción precedente, se han descrito TM específicos. La referencia a dichos t M es meramente ejemplar, y la presente invención engloba todas las variantes y derivados de éstos, que retienen la capacidad de unión básica (es decir, direccionamiento) de los TM ejemplificados.
En una realización, la célula cancerosa diana de la presente invención puede ser una célula cancerosa que no secreta hormona del crecimiento (es decir, no secreta hormona del crecimiento significativa o detectable).
Como se ha mencionado anteriormente, los TM preferidos incluyen anticuerpos (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo) y soportes de unión; especialmente anticuerpos/fragmentos y soportes disponibles comercialmente diseñados para el propósito de unión (por ejemplo, específicamente) a células cancerosas.
Los soportes proteicos representan una nueva generación de marcos de unión universales para complementar el repertorio en expansión de anticuerpos monoclonales terapéuticos y derivados tales como scFv, moléculas Fab, dAb (anticuerpos de dominio único), fragmentos divalentes y minicuerpos, cada uno de los cuales puede emplearse como un TM de la presente invención. Los sistemas de soporte crean o modifican dominios de reconocimiento de proteína conocidos bien a través de la creación de nuevos soportes o modificación de dominios de unión de proteína conocidos. Dichos soportes incluyen, pero no están limitados a:
(i) soportes basados en proteína A— affibodies (Nord, K. et al 1997 “Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain”. Nat Biotechnol 15, 772-777);
(ii) soportes basados en lipocalina— anticalinas (Skerra 2008 “Alternative binding proteins: anticalins— harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities”. FEBS J. 275:2677-83);
(iii) soportes basados en fibronectina— adnectina (Dineen et al 2008 “The Adnectin CT-322 is a novel VEGF receptor 2 inhibitor that decreases tumor burden in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer”. BMC Cancer 8:352);
(iv) avímeros (Silverman et al 2005 “Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains”. Nat Biotechnol 23:1556-61);
(v) soportes basados en anquirina— darpinas (Zahnd et al 2006 “Selection and characterization of Her2 bindingdesigned ankyrin repeat proteins”. J Biol Chem. 281:35167-75); y
(vi) soportes de centirina— basados en un plegamiento de proteína que tiene una homología estructural significativa con dominios Ig con bucles que son análogos a CDR. Los dominios Ig son un módulo común en las proteínas humanas y se han aplicado ampliamente como proteínas de soporte alternativas.
Los soportes de unión pueden usarse para tomar como diana tipos celulares particulares a través de la interacción con proteínas de la superficie celular específicas, receptores u otros epítopos de la superficie celular tales como grupos azúcar. Dichos soportes modificados pueden prepararse por ingeniería en polipéptidos basados en proteasa no citotóxica recombinantes de la presente invención para tomar como diana tipos de células cancerosas de interés.
El TM de la presente invención se une (preferiblemente se une específicamente) a la célula diana en cuestión. El término “se une específicamente” preferiblemente significa que un TM dado se une a la célula diana con una afinidad de unión (Ka) de 106 M-1 o mayor, preferiblemente 107 M-1 o mayor, más preferiblemente 108 M-1 o mayor, y lo más preferiblemente, 109 M-1 o mayor.
La referencia a TM en la presente especificación engloba fragmentos y variantes de éste, que retienen la capacidad de unirse a la célula diana en cuestión. Como ejemplo, una variante puede tener al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, y lo más preferiblemente al menos 97 o al menos 99% de homología en la secuencia de aminoácidos con el TM de referencia. Así, una variante puede incluir uno o más análogos de un aminoácido (por ejemplo, un aminoácido no natural), o una unión sustituida. También, como ejemplo, el término fragmento, cuando se usa en relación con un TM, significa un péptido que tiene al menos diez, preferiblemente al menos veinte, más preferiblemente al menos treinta, y lo más preferiblemente al menos cuarenta residuos de aminoácidos del TM de referencia. El término fragmento también se refiere a las variantes mencionadas anteriormente. Así, como ejemplo, un fragmento de la presente invención puede comprender una secuencia peptídica que tiene al menos 10, 20, 30 ó 40 aminoácidos, en el que la secuencia peptídica tiene al menos 80% de homología de secuencia sobre una secuencia peptídica correspondiente (de contiguos) aminoácidos del péptido de referencia.
Como ejemplo, los TM de péptido ErbB pueden modificarse para generar ligandos muteína de ErbB con propiedades mejoradas tales como estabilidad incrementada. Como ejemplo, las muteínas de TM ErbB incluyen péptidos de ErbB que tienen modificaciones de aminoácidos tales como un residuo de valina en la posición 46 ó 47 (EGFVal46 ó47), que confiere estabilidad frente a proteasas celulares. Los TM ErbB también pueden tener aminoácidos delecionados o aminoácidos adicionales insertados. Esto incluye, pero no está limitado a EGF que tiene una deleción de dos aminoácidos C-terminales y una sustitución de aminoácido neutro en la posición 51 (particularmente EGF51Gln51; véase US20020098178A1), y EGF con aminoácidos delecionados (por ejemplo, rEGF2-48; rEGF3-48 y rEGF4-48). Los fragmentos de los Tm ErbB pueden incluir fragmentos de TGFa que contienen regiones de giro p predichas (por ejemplo, un péptido de la secuencia Ac-C-H-S-G-Y-V-G-A-R-C-O-OMe) (SEQ ID NO: 76)), fragmentos de EGF tales como [Ala20]EGF(14-31), y el péptido YHWYGYTPQNVI (SEQ ID NO: 77) o GE11.
Como ejemplo adicional, somatostatina (SST) y cortistatina (CST) tienen una alta homología estructural, y se unen a todos los receptores SST conocidos. La SST de longitud completa tiene la secuencia de aminoácidos:
MLSCRLQCALAALSIVLALGCVTGAPSDPRLRQFLQKSLAAAAGKQELAKYF
LAELLSEPNQTENDALEPEDLSQAAEQDEMRLELQRSANSNPAMAPRERKA
GCKNFFWKTFTSC (SEQ ID NO: 78)
La CST de longitud completa tiene la secuencia de aminoácidos:
MYRHKNSWRLGLKYPPSSKEETQVPKTLISGLPGRKSSSRVGEKLQSAHKM
PLSPGLLLLLLSGATATAALPLEGGPTGRDSEHMQEAAGIRKSSLLTFLAWW
FEWTSQASAGPLIGEEAREVARRQEGAPPQQSARRDRMPCRNFFWKTFSS
CK (SEQ ID NO: 79)
La referencia a estos TM incluye los fragmentos siguientes (y variantes correspondientes) de éstos:
NFFWKTF (SEO ID NO: SO);
ÍRO K)NFFWKTF(SEQ ID NO: 81);
C(R o K)NFFWKTF(SEQ ID NO' 82);
(Po G)C(R o K)NFFWKTF[SEQ ID NO: 83);
NFFWKTF(S o T) (SEQ ID NO; 84);
N FFW KTF($o T)S($EQ ID NO: 85);
NFFWKTF(S a T)SC($EQ ID NO: 86);
(R or K)NFFWKTF(S o T) (SEQ ID NO: 87);
(R or K)NFFWKTF(S a T)S(SEQ ID NO: 88);
(R or K)NFFWKTF(S o T)$C(5EQ ID NO: 39);
C(R o K)NFFWKTF(S o T) (SEQ ID NO: 90);
C(R o K)NFFWKTF(Sq T)S(SEQ ID NO: 91);
C(R o K)NFFWKTF(So T)SC(SEO ID NO: 92):
(Po G)C(R o K)NFFWKTF(Sü T) (SEQ ID NO: 93);
(P o G)C(R o K)NFFWKTF($ o T)S{$EQ ID NO; 94); o
(Po G)C(R o K)NFFWKTF(S o T)C(SEQ ID NO: 95).
Respecto a las secuencias anteriores, cuando se proporciona una (P o G) alternativa, se prefiere una P en el caso de un TM CST, mientras se prefiere una G en el caso de un TM SST. Cuando se proporciona una (R o K) alternativa, se prefiere una R en el caso de un TM CST, mientras se prefiere una K en el caso de un TM SST. Cuando se proporciona una (S o T) alternativa, se prefiere una S en el caso de un TM CST, mientras se prefiere una T en el caso de un TM SST.
Los fragmentos preferidos comprenden al menos 7 o al menos 10 residuos de aminoácidos, preferiblemente al menos 14 o al menos 17 residuos de aminoácidos, y más preferiblemente al menos 28 ó 29 residuos de aminoácidos. Como ejemplo, las secuencias preferidas incluyen:
SANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC (SST-2B) (SEQ ID NO: 96);
AGCKNFFWKTFTSC (SST-14) (SEQ ID NO: 97);
QEGAPPQQSARRDRMPCRNFFWKTFSSCK (CST-29) (SEQ ID NO' 98) QeRPPlqQPphRDKKRCKn FFWKTFSsCK (CST-29) (SEQ ID NO: 99);
QERPPPQQPPHLDKKPCKNFFWKTFSSCK (CST-29) (SEQ ID NO: 100)
DRMPCRNFFWKTFSSCK (CST-17) (SEQ ID NO: 101);
PCRNFFWKTFSSCK (CST-14) (SEQ ID NG: 102); y
PCKNFFWKTFSSCK (CST-14) (SEQ ID NO: 103)
El TM puede comprender una secuencia de aminoácidos más larga, por ejemplo, al menos 30 ó 35 residuos de aminoácidos, o al menos 40 ó 45 residuos de aminoácidos, siempre que el TM sea capaz de unirse a una célula que secreta GH normal, preferiblemente a un receptor SST o CST en una célula que secreta GH normal. A este respecto, el TM es preferiblemente un fragmento de SST o CST de longitud completa, aunque incluyendo al menos la secuencia central “NFFWKTF” (SEQ ID NO: 80) o una de las secuencias primarias de aminoácidos definidas anteriormente. Es rutinario confirmar que un TM se une a la célula diana seleccionada. Por ejemplo, puede emplearse un experimento de desplazamiento radiactivo simple en el que se exponen tejido o células representativas de una célula secretora de hormona del crecimiento a TM marcado (por ejemplo, tritiado) en presencia de un exceso de TM no marcado. En dicho experimento, pueden evaluarse las proporciones relativas de unión no específica y específica, permitiendo de esta manera la confirmación de que el TM se une a la célula diana. Opcionalmente, el ensayo puede incluir uno o más antagonistas de unión, y el ensayo puede comprender además observar una pérdida de unión de TM. Los ejemplos de este tipo de experimento pueden encontrarse en Hulme, E. C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, p.
303-311, En Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E. C. Hulme, Oxford University Press.
En el contexto de la presente invención, la referencia a un péptido TM (por ejemplo, péptido de GHRH, o péptido de leptina) engloba análogos peptídicos de éste, siempre que el análogo se una al mismo receptor que el TM de 'referencia' correspondiente. Dichos análogos pueden incluir residuos sintéticos tales como:
p-Nal = p-naftilalanina
p-Pal = p-piridilalanina
hArg(Bu) = N-guanidino-(butil)-homoarginina
hArg(Et)2 = N,N-guanidino-(dimetil)-homoarginina
hArg(CH2CF3)2 = N,N'-guanidino-bis-(2,2,2,-trifluoroetil)-homoarginina
hArg(CH3, hexil) = N,N'-guanidino-(metil, hexil)-homoarginina
Lys(Me) = Ne-metillisina
Lys(iPr) = Ne-isopropillisina
AmPhe = aminometilfenilalanina
AChxAla = aminociclohexilalanina
Abu = ácido a-aminobutírico
Tpo = 4-tiaprolina
MeLeu = N-metilleucina
Orn = ornitina
Nle - norleucina
Nva = norvalina
Trp(Br) = 5-bromo-triptófano
Trp(F) = 5-fluoro-triptófano
Trp(NO2) = 5-nitro-triptófano
Gaba = ácido Y-aminobutírico
Bmp = J-mercaptopropionilo
Ac = acetilo
Pen - pencilamina
Como ejemplo, el aspecto del análogo peptídico anterior se describe con más detalle con referencia a péptidos TM específicos, tal como péptidos de SST, péptidos de GHRH, péptidos de bombesina, péptidos de GnRH, y péptidos de grelina, aunque se aplica el mismo principio a todos los TM de la presente invención.
Los análogos de somatostatina, que pueden usarse para llevar a la práctica la presente invención incluyen, pero no están limitados a, aquellos descritos en las publicaciones siguientes: Van Binst, G. et al. Peptide Research 5: 8 (1992); Horvath, A. et al. Resumen, “Conformations of Somatostatin Analogs Having Antitumor Activity”, 22nd European peptide Symposium, Sep. 13-19, 1992, Interlaken, Suiza; US5.506.339; EP0363589; US4.904.642; US4.871.717; US4.725.577; US4.684.620; US 4.650.787; US 4.585.755; US4.725.577; US4.522.813; US4.369.179; US4.360.516; US4.328.214; US4.316.890; US4.310.518; US4.291.022; US4.238.481; US4.235.886; US4.211.693; US4.190.648; US4.146.612; US4.133.782; US5.506.339; US4.261.885; US4.282.143; US4.190.575; US5.552.520; EP0389180; EP0505680; US4.603.120; EP0030920; US4.853.371; WO90/12811; WO97/01579; WO91/18016; WO98/08529 y WO98/08528; WO/0075186 y WO00/06185; WO99/56769; y FR 2.522.655.
Los métodos para sintetizar análogos están bien documentados, como se ilustra, por ejemplo, por las patentes citadas anteriormente. Por ejemplo, la síntesis de H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2, puede conseguirse siguiendo el protocolo mostrado en el Ejemplo 1 de EP0395417A1. De forma similar, la síntesis de análogos con un extremo N sustituido puede conseguirse, por ejemplo, siguiendo el protocolo mostrado en WO88/02756, EP0329295, y US5.240.561.
El uso de análogos de SST lineales también está incluido en el alcance de esta invención, por ejemplo: H-D-Phe-pcloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-p-N02-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H-D-*Nal-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; y H-D-Phe-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Ala-D-beta-Nal-NH2.
Uno o más restos químicos, por ejemplo, un derivado de azúcar, grupos mono o poli-hidroxialquilo (C2-12), mono o poli-hidroxiacilo (C2-12), o un derivado piperazina, pueden unirse a un análogo de SST, por ejemplo, al aminoácido N-terminal-véase WO88/02756, EP0329295, y US5.240.561.
Los análogos de péptido de GHRH existen desde los años 90, e incluyen el 'antagonista estándar' [Ac-Tyr', D-Arg2jhGH-RH (1-29) Nha. La Patente U.S. No. 4.659.693 describe análogos antagonistas de GH-RH que contienen determinados residuos N,N'-dialquil-omega-guanidino alfa-amino acilo en la posición 2 de la secuencia de GH-RH (1­ 29). Los ejemplos adicionales se proporcionan en WO91/16923, Us 5.550.212, US5.942.489, US6.057.422, US5.942.489, US6.057.422, WO96/032126, WO96/022782, WO96/016707, WO94/011397, WO94/011396.
Los ejemplos de análogos de bombesina adecuados para uso en la presente invención incluyen TM que comprenden: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 (código denominado BIM-26218), D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Leu-NH2 (código denominado BIM-26187); D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- 9 [CH2NH]-Phe-NH2 (código denominado BIM-26159), y D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- 9 [CH2NH]-Cpa-NH2 (código denominado BIM-26189); D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-N-metil-D-Ala-His-Leu-metiléster, y D-Fg-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leumetiléster.
Los análogos de bombesina incluyen péptidos derivados de los péptidos naturales estructuralmente relacionados, concretamente, bombesina, neuromedina B, neuromedina C, litorina, y GRP. Las secuencias de aminoácidos relevantes de estos péptidos TM naturales se listan a continuación:
Bombesina (últimos 10 aa): Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 104)
Neuromedina B: Gly-Asn-Leu-Trp-Ala-Thr-Gly-His-Phe-Met-NH2 (SEQ ID NO: 105)
Neuromedina C: Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 106)
Litorina: Glu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Met-NH2 (SEQ ID NO: 107)
GRP humana (últimos 10 aa): Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 (SEQ ID NO: 108)
Los análogos adecuados para uso en la presente invención se describen en U.S. Número de Serie 502.438, presentado el 30 de marzo, 1990, U.S. No. de Serie 397.169, presentado el 21 de agosto, 1989, U.S. No. de Serie 376.555, presentado el 7 de julio, 1989, U.S. No. de Serie 394.727, presentado el 16 de agosto, 1989, U.S. No. de Serie 317.941, presentado el 2 de marzo, 1989, U.S. No. de Serie 282.328, presentado el 9 de diciembre, 1988, U.S. No. de Serie 257.998, presentado el 14 de octubre, 1988, U.S. No. de Serie 248.771, presentado el 23 de septiembre, 1988, U.S. No. de Serie 207.759, presentado el 16 de junio, 1988, U.S. No. de Serie 204.171, presentado el 8 de junio, 1988, U.S. No. de Serie 173.311, presentado el 25 de marzo, 1988, U.S. No. de Serie 100.571, presentado el 24 de septiembre, 1987; y U.S. No. de Serie 520.225, presentado el 9 de mayo, 1990, U.S. No. de Serie 440.039, presentado el 21 de noviembre, 1989.
Los análogos de bombesina también se describen en Zachary et al., Proc. Nat. Aca. Sci. 82:7616 (1985); Heimbrook et al., “Synthetic Peptides: Approaches to Biological Problems”, UCLA Symposium on Mol. and Cell. Biol. New Series, Vol. 8 6 , ed. Tam y Kaiser; Heinz-Erian et al., Am. J. Physiol. G439 (1986); Martinez et al., J. Med. Chem. 28:1874 (1985); Gargosky et al., Biochem. J. 247:427 (1987); Dubreuil et al., Drug Design and Delivery, Vol 2:49, Harwood Academic Publishers, GB (1987); Heikkila et al., J. Biol. Chem. 262:16456 (1987); Caranikas et al., J. Med. Chem.
25:1313 (1982); Saeed et al., Peptides 10:597 (1989); Rosell et al., Trends in Pharmacological Sciences 3:211 (1982); Lundberg et al., Proc. Nat. Aca. Sci. 80:1120, (1983); Engberg et al., Nature 293:222 (1984); Mizrahi et al., Euro. J. Pharma. 82:101 (1982); Leander et al., Nature 294:467 (1981); Woll et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 155:359 (1988); Rivier et al., Biochem. 17:1766 (1978); Cuttitta et al., Cancer Surveys 4:707 (1985); Aumelas et al., Int. J. Peptide Res. 30:596 (1987).
Los análogos pueden prepararse por técnicas convencionales, tales como aquellas descritas en WO92/20363 y EP0737691. Los análogos de bombesina adicionales se describen, por ejemplo, en WO89/02897, WO91/17181, WO90/03980 y WO91/02746.
Los ejemplos de análogos de grelina adecuados para uso como un TM de la presente invención comprenden: Tyr-DTrp-DLys-Trp-DPhe-NH2, Tyr-DTrp-Lys-Trp-DPhe-NH2 , His-DTrp-DLys-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DLys-Phe-DTrp-NH2 , His-DTrp-DArg-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DLys-Trp-DPhe-Lys-NH2 , DesaminoTyr-DTrp-Ala-Trp-DPhe-NH2, DesaminoTyr-DTrp-DLys-Trp-DPhe-NH2 , DesaminoTyr-DTrp-Ser-Trp-DPhe-Lys-NH2, DesaminoTyr-DTrp-Ser-Trp-DPhe-NH2 , His-DTrp-DTrp-Phe-Met-NH2 , Tyr-DTrp-DTrp-Phe-Phe-NH2, Gly9 [CH2NH]-Dpal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, GlyY[CH2NH]-DbetaNal-DLyS-TrP-DPhe-Lys-NH2 , DAla-DbetaNal-DLys-DTrp-Phe-Lys-NH2, His-DbetaNal-DLys-Trp-DPhe-Lys-NH2 , Ala-His-DTrp-DLys-Trp-DPhe-Lys-NH2, Ala9 [CH2NH]-DbetaNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 , DbetaNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-NH2 , DAla-DciclohexilAla-Ala-Phe-DPhe-Nle-NH2 , DciclohexilAla-Ala-Phe-DTrp-Lys-NH2 , DAla-DbetaAla-Thr-DThr-Lys-NH2 , DciclohexilAla-Ala-Trp-DPhe-NH2 , DAla-DbetaNal-Ala-Ala-DAla-Lys-NH2, DbetaNal-Ala-Trp-DPhe-Leu-NH2 , His-DTrp-Phe-Trp-DPhe-Lys-NH2 , DAla-DbetaNal-DAla-DTrp-Phe-Lys-NH2 , pAla-Trp-DAla-DTrp-Phe-NH2 , His-Trp-DAla-DTrp-Phe-LysNH2, DLys-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, DAla-DbetaNal-DLys-DTrp-Phe-Lys-NH2 , Tyr-DAla-Phe-Aib-NH2, Tyr-DAla-Sar-NMePhe-NH2, aYAbu-DTrp-DTrp-Ser-NH2 , aYAbu-DTrp-DTrp-Lys-NH2, aYAbu-DTrp-DTrp-Orn-NH2 , aAbu-DTrp-DTrp-Orn-NH2, DThr-DaNal-DTrp-DPro-Arg-NH2, DAla-Ala-DAla-DTrp-Phe-Lys-NH2, Ala^[CH2NH]His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, Lys-DHis-DTrp-Phe-NH2, YAbu-DTrp-DTrp-Orn-NH2 , inip-Trp-Trp-Phe-NH2, Ac-DTrp-Phe-DTrp-Leu-NH2, Ac-DTrp-Phe-DTrp-Lys-NH2 , Ac-DTrp-DTrp-Lys-NH2, DLys-Tyr-DTrp-DTrp-Phe-Lys-NH2, Ac-DbetaNal-Leu-Pro-NH2 , pAla-Trp-DTrp-DTrp-Orn-NH2 , DVal-DaNal-DTrp-Phe-Arg-NH2, DLeu-DaNal-DTrp-Phe-Arg-NH2, CiclohexilAla-DaNal-DTrp-Phe-Arg-NH2, DTp-DaNal-DTrp-Phe-Arg-NH2 , DAla-DpNal-DPro-Phe-Arg-NH2, Ac-DaNal-DTrp-Phe-Arg-NH2 , DaNal-DTrp-Phe-Arg-NH2, His-DTrp-DTrp-Lys-NH2, Ac-DpNal-DTrp-NH2, aAib-DTrp-DciclohexilAla-NH2, aAib-DTrp-DAla-ciclohexilAla-NH2 , DAla-DciclohexilAla-Ala-Ala-Phe-DPhe-NIe-NH2, DPhe-Ala-Phe-DPal-NH2 , DPhe-Ala-Phe-DPhe-Lys-NH2 , DLys-Tyr-DTrp-DTrp-Phe-NH2, Ac-DLys-Tyr-DTrp-DTrp-Phe-NH2, Arg-DTrp-Leu-Tyr-Trp-Pro(Arg-Pro cíclico), Ac-DpNal-PicLys-ILys-DPhe-NH2 , DPal-Phe-DTrp-Phe-Met-NH2, DPhe-Trp-DPhe-Phe-Met-NH2, DPal-Trp-DPhe-Phe-Met-NH2 , pAla-Pal-DTrp-DTrp-Orn-NH2 , aYAbu-Trp-DTrp-DTrp-Orn-NH2, pAla-Trp-DTrp-DTrp-Lys-NH2, YAbu-Trp-DTrp-DTrp-Orn-NH2 , Ava-Trp-DTrp-DTrp-Orn-NH2, DLys-Tyr-DTrp-Ala-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DArg-Trp-DPhe-NH2 , Glu-His-Trp-DSer-DArg-NH2, DPhe-DPhe-DTrp-Met-DLys-NH2, 0-(2-metilalil) benzofonona oxima, (R)-2-amino-3-(1H-indol-3-il)-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-1-ona, N-((R)-1-((R)-1-((S)-3-(1H-indol-3-il)-1-oxo-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-2-ilamino)-6-amino-1-oxohexan-2-ilamino)-3-hidroxi-1-oxopropan-2-il)benzamida, (S)-N.((S)-3-(1H-indol-3-il)-1-oxo-1-(4-fenillpiperidin-1-il)propan-2-il)-6-acetamido-2-((S)-2-amino-3-(benciloxi)propanamido)hexanamida, (S)-N-((R)-3-(1H-indol-3-il)-1-oxo-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-2-il)-2-((S)-2-acetamido-3-(benciloxi)propanamido)-6-aminohexanamida, (R)-N-(3-(1H-indol3-il)-1-(4-(2-metoxifenil)piperidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)-4-aminobutanamida, (R)-N-(3-(1H-indol-3-il)-1-(4-(2-metoxifenil)piperidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)-2-amino-2-metilpropanamida, 3-(p-tolilcarbamoil)-2-naftoato de metilo, 3-(4-(2-metoxifenil)piperidina-1-carbonil)-2-naftoato de etilo, 3-(2-metoxifenilcarbamoil)-2-naftoato, (S)-2,4-diamino-N-((R)-3-(naftalen-2-ilmetoxi)-1-oxo-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-2-il)butanamida, naftalen-2,3-diilbis((4-(2-metoxifenil)piperazin-1-il)metanona), (R)-2-amino-N-(3-(benciloxi)-1-oxo-1-(4-fenilpiperazin-1-il)propan-2-il)-2-metilpropanamida, o (R)-2-amino-3-(benciloxi)-1-(4-fenilpiperazin-1-il)propan-1-ona.
Los ejemplos de análogos de GnRH adecuados para uso como un TM en la presente invención incluyen aquellos conocidos a partir de, por ejemplo, EP171477, WO96/033729, WO92/022322, WO92/013883, y WO91/05563. Los ejemplos específicos comprenden: NAcDQal1,DPtf2,DPAl3 ,cjsPzACAla5 ,DPicLys6 ,DAla10)LHRH; (NAcDNal1,DpClPhe2,DPal3 ,cjsPzACAla5,DNicLys6,ILys8,DAla10)LHRH;
(NAcDNal1,DpClPhe2,DPal3 ,Thr4,PicLys5,DPicLys6,ILys8,DAla10)LHRH;
(NAcDNal1,DpClPhe2,DPal3 ,PicLys5 ,DPicLys6 ,Thr7,ILys8,DAla10)LHRH;
(NapDThr1,DpClPhe2,DPal3 ,PicLys5 ,DPicLys6,ILys8 ,DAla10)LHRH;
(NAcDNal1,DpClPhe2,DPal3 ,NicLys5 ,DNicLys6 ,Thr7,ILys8,DAla10)LHRH;
(NAcDNal1,DpClPhe2,DPal3 ,Thr4,NicLys5,DNicLys6,Thr7 ,ILys8,DAla10)LHRH;
(NAcDNal1,DpClPhe2,DPal3 ,PicLys5 ,D(PicSar)Lys6 ,ILys8 ,DAla10)LHRH;
(NAcDNal1,DpClPhe2,DPal3 ,D(PicSar)Lys6,ILys8,DAla10)LHRH;
(NAcDNal1,DpClPhe2,DPal3 ,PicLys5 ,D(6 ANic)Lys6,ILys8,DAla10)LHRH;
(NAcDNal1,DpClPhe2,DPal3 ,PicLys5 ,D(6ANic)0rn6,ILys8,DAla10)LHRH;
(NAcDQal1,DCpa2,DPal3 ,cisPzACAla5 ,DPicLys6 ,NLeu7 ,ILys8 ,DAla10)LHRH;
(NAcDNal1,DCpa2,DPal3 DPicLys5 ,DAPhe(PicSar)p,ILys8 ,DAla10)LHRH;
(NAcDQal1,DCpa2,DPal3 ,PicLys5 ,DPal6,ILys8,DAla10)LHRH;
(NAcDNal1,DCpa2,DPal3 ,PicLys5,DOrn(ACyp)6,ILys8,DAla10)LHRH;
N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(ciclo-pentil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH2 ; N-acetil-D-0 -Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(ciclopentil)-Phe-Lys(ciclopentil)-Pro-D-Ala-NH2 ; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-(isopropil)D-Lys-Pro-D-Ala-NH2 ; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(bencil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH2 ; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(Cl-bencil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH2 ; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(heptil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH2 ; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-(tbutilmetil)-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-(4 -metil-bencil)-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-(bencil)-Pro-D-Ala-NH2 ; N-acetil-D-beta-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-p-NH2-Phe-Phe-(isopropil)Lys-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(heptil)-Phe-Lys-(heptil)-Pro-D-Ala-NH2; N-acetil-D-3-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(1-butilpentil)-Phe-Lys(1-butilpentil)-Arg-Pro-D-Ala-NH2.
Los polipéptidos de la presente invención carecen de un dominio He funcional de una neurotoxina clostridial. De acuerdo con esto, dichos polipéptidos no son capaces de unirse a membranas sinaptosomales de rata (a través de un componente He clostridial) en ensayos de unión como se describe en Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75­ 82. En una realización preferida, los polipéptidos preferiblemente carecen de los últimos 50 aminoácidos C-terminales de una holotoxina neurotoxina clostridial. En otra realización, los polipéptidos preferiblemente carecen de los últimos 100, preferiblemente los últimos 150, más preferiblemente los últimos 200, particularmente preferiblemente los últimos 250, y lo más preferiblemente los últimos 300 residuos de aminoácidos C-terminales de una holotoxina neurotoxina clostridial. Alternativamente, la actividad de unión He puede negarse/reducirse por mutagénesis-como ejemplo, en referencia a BoNT/A para conveniencia, la modificación de una o dos mutaciones de residuos de aminoácidos (W1266 a L e Y1267 a F) en el bolsillo de unión de gangliósido causa que la región He pierda su función de unión a receptor. Pueden hacerse mutaciones análogas a componentes de péptido clostridial no de serotipo A, por ejemplo, una construcción basada en botulinum B con mutaciones (W1262 a L e Y1263 a F) o botulinum E (W1224 a L e Y1225 a F). Otras mutaciones en el sitio activo consiguen la misma ablación de la actividad de unión a receptor de He, por ejemplo, Y1267S en la toxina botulínica tipo A y el residuo altamente conservado correspondiente en las otras neurotoxinas clostridiales. Los detalles de éstas y otras mutaciones se describen en Rummel et al (2004) (Molecular Microbiol. 51:631-634).
En otra realización, los polipéptidos de la presente invención carecen de un dominio He funcional de una neurotoxina clostridial y también carecen de cualquier TM funcionalmente equivalente. De acuerdo con esto, dichos polipéptidos carecen de la función de unión natural de una neurotoxina clostridial y no son capaces de unirse a membranas sinaptosomales de rata (a través de un componente He clostridial, o a través de cualquier TM funcionalmente equivalente) en ensayos de unión como se describe en Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82.
El péptido He de una neurotoxina clostridial nativa comprende aproximadamente 400-440 residuos de aminoácidos, y consiste en dos dominios funcionalmente distintos de aproximadamente 25 kDa cada uno, concretamente la región N-terminal (referida comúnmente como el péptido o dominio Hcn) y la región e-terminal (referida comúnmente como el péptido o dominio Hcc). Este hecho se confirmó por las publicaciones siguientes:
Umland T C (1997) Nat. Struct. Biol. 4: 788-792; Herreros J (2000) Biochem. J. 347: 199-204; Halpem J (1993) J. Biol. Chem. 268: 15, pp. 11188-11192; Rummel A (2007) PNAS 104: 359-364; Lacey DB (1998) Nat. Struct. Biol. 5: 898­ 902; Knapp (1998) Am. Cryst. Assoc. Abstract Papers 25: 90; Swaminathan y Eswaramoorthy (2000) Nat. Struct. Biol.
7: 1751-1759; y Rummel A (2004) Mol. Microbiol. 51(3), 631-643. Además, se ha documentado bien que la región Cterminal (Hcc), que constituye los 160-200 residuos de aminoácidos C-terminales, es responsable de la unión de una neurotoxina clostridial a sus receptores celulares naturales, concretamente a terminales nerviosas en la unión neuromuscular-este hecho también se confirmó por las publicaciones anteriores. Así, la referencia a lo largo de esta especificación a una cadena pesada clostridial que carece de un péptido (o dominio) Hc de cadena pesada funcional de manera que la cadena pesada es incapaz de unirse a receptores de la superficie celular a los que se une una neurotoxina clostridial nativa significa que la cadena pesada clostridial simplemente carece de un péptido Hcc funcional. En otras palabras, la región del péptido Hcc está bien parcialmente o totalmente delecionada, o modificada de otra manera (por ejemplo, a través de tratamiento químico o proteolítico convencional) para inactivar su capacidad de unión nativa para terminales nerviosas en la unión neuromuscular.
Así, en una realización, un péptido Hn clostridial de la presente invención carece de parte de una parte de péptido C-terminal (Hcc) de una neurotoxina clostridial y así carece de la función de unión Hc de una neurotoxina clostridial nativa. Como ejemplo, en una realización, el péptido Hn clostridial extendido en C-terminal carece de 40 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 60 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 80 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 100 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 120 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 140 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 150 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 160 residuos de aminoácidos C-terminales de una cadena pesada de neurotoxina clostridial. En otra realización, el péptido Hn clostridial de la presente invención carece de la parte de péptido C-terminal completa (Hcc) de una neurotoxina clostridial y así carece de la función de unión Hc de una neurotoxina clostridial nativa. Como ejemplo, en una realización, el péptido Hn clostridial carece de los 165 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 170 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 175 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 180 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 185 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 190 residuos de aminoácidos C-terminales, o los 195 residuos de aminoácidos C-terminales de una cadena pesada de neurotoxina clostridial. Como ejemplo adicional, el péptido Hn clostridial de la presente invención carece de una secuencia de referencia Hcc clostridial seleccionada del grupo que consiste en:
Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (Y1111-L1296)
Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (Y1098-E1291)
Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (Y1112-E1291)
Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (Y1099-E1276)
Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (Y1086-K1252)
Neurotoxina botulínica tipo F - residuos de aminoácidos (Y1106-E1274)
Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (Y1106-E1297)
Neurotoxina del tétano - residuos de aminoácidos (Y1128-D1315).
Las secuencias de referencia identificadas anteriormente deben considerarse como una guía ya que pueden ocurrir ligeras variaciones según los sub-serotipos.
La proteasa de la presente invención engloba todas las proteasas no citotóxicas que son capaces de escindir una o más proteínas del aparato de fusión exocítica en células eucariotas.
La proteasa de la presente invención es preferiblemente una proteasa bacteriana (o fragmento de ésta). Más preferiblemente, la proteasa bacteriana se selecciona de los géneros Clostridium o Neisseria/Streptococcus (por ejemplo, una cadena L clostridial, o una proteasa de IgA neisserial preferiblemente de N. gonorrhoeae o S. pneumoniae).
La presente invención también engloba proteasas no citotóxicas variantes (es decir, variantes de moléculas de proteasa naturales), siempre que las proteasas variantes todavía demuestren la actividad proteasa requerida. Como ejemplo, una variante puede tener al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferiblemente al menos 95 o al menos 98% de homología en la secuencia de aminoácidos con una secuencia de proteasa de referencia. Así, el término variante incluye proteasas no citotóxicas que tienen actividad endopeptidasa potenciada (o disminuida)-se hace mención particular aquí a la Kcat/Km incrementada de los mutantes BoNT/A Q161A, E54A, y K165L véase Ahmed, S. A. (2008) Protein J. DOI 10.1007/s10930-007-9118-8.
El término fragmento, cuando se usa en relación con una proteasa, típicamente significa un péptido que tiene al menos 150, preferiblemente al menos 200, más preferiblemente al menos 250, y lo más preferiblemente al menos 300 residuos de aminoácidos de la proteasa de referencia. Como con el componente 'fragmento' TM (discutido anteriormente), los 'fragmentos' de proteasa de la presente invención engloban fragmentos de proteasas variantes sobre la base de una secuencia de referencia.
La proteasa de la presente invención preferiblemente demuestra una actividad serina o metaloproteasa (por ejemplo, actividad endopeptidasa). La proteasa es preferiblemente específica para una proteína SNARE (por ejemplo, SNAP25, sinaptobrevina/VAMP, o sintaxina).
Se hace mención particular a los dominios de proteasa de neurotoxinas, por ejemplo, los dominios de proteasa de neurotoxinas bacterianas. Así, la presente invención engloba el uso de dominios de neurotoxina, que aparecen en la naturaleza, así como versiones preparadas recombinantemente de dichas neurotoxinas naturales.
Las neurotoxinas ejemplares son producidas por clostridia, y el término neurotoxina clostridial engloba neurotoxinas producidas por C. tetani (TeNT), y por C. botulinum (BoNT) serotipos A-G, así como las neurotoxinas semejantes a BoNT muy relacionadas producidas por C. baratii y C. butyricum. Las abreviaturas mencionadas anteriormente se usan a lo largo de la presente especificación. Por ejemplo, la nomenclatura BoNT/A indica la fuente de neurotoxina como BoNT (serotipo A). La nomenclatura correspondiente se aplica a otros serotipos BoNT.
Las BoNT son las toxinas más potentes conocidas, con valores de dosis letal media (LD50) para ratones que varían de 0,5 a 5 ng/kg dependiendo del serotipo. Las BoNT se adsorben en el tracto gastrointestinal, y, después de entrar en la circulación general, se unen a la membrana presináptica de terminales nerviosas colinérgicas y evitan la liberación de su neurotransmisor, acetilcolina. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G escinden sinaptobrevina/proteína asociada a vesícula (VAMP); BoNT/C, BoNT/A y BoNT/E escinden la proteína asociada a sinaptosoma de 25 kDa (SNAP-25); y BoNT/C escinde sintaxina.
Las BoNT comparten una estructura común, siendo proteínas di-cadena de ~150 kDa, que consisten en una cadena pesada (cadena H) de ~100 kDa unida covalentemente por un único enlace disulfuro a una cadena ligera (cadena L) de ~50 kDa. La cadena H consiste en dos dominios, cada uno de ~50 kDa. El dominio C-terminal (Hc) se requiere para la unión neuronal de alta afinidad, mientras se propone que el dominio N-terminal (Hn) está implicado en la translocación en la membrana. La cadena L es una metaloproteasa dependiente de cinc responsable de la escisión de la proteína SNARE sustrato.
El término fragmento de cadena L significa un componente de la cadena L de una neurotoxina, fragmento que demuestra una actividad metaloproteasa y es capaz de escindir proteolíticamente una proteína asociada a vesícula y/o membrana plasmática implicada en exocitosis celular.
Los ejemplos de secuencias de proteasas adecuadas (referencia) incluyen:
Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (1-448)
Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (1-440)
Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (1-441)
Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (1-445)
Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (1-422)
Neurotoxina botulínica tipo F - residuos de aminoácidos (1-439)
Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (1-441)
Neurotoxina de tétano - residuos de aminoácidos (1-457)
Proteasa de IgA- residuos de aminoácidos (1-959)*
*Pohlner, J. et al. (1987). Nature 325, pp. 458-462, que se incorpora en la presente memoria por referencia a ella. La secuencia de referencia identificada anteriormente debe considerarse una guía ya que pueden ocurrir ligeras variaciones según los sub-serotipos. Como ejemplo, US 2007/0166332 cita secuencias clostridiales ligeramente diferentes:
Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (M1-K448)
Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (M1-K441)
Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (M1-K449)
Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (M1-R445)
Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (M1-R422)
Neurotoxina botulínica tipo F - residuos de aminoácidos (M1-K439)
Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (M1-K446)
Neurotoxina de tétano - residuos de aminoácidos (M1-A457)
Una variedad de fragmentos de toxina clostridial que comprenden la cadena ligera pueden ser útiles en aspectos de la presente invención con la condición de que estos fragmentos de cadena ligera puedan específicamente tomar como diana los componentes centrales del aparato de liberación de neurotransmisores y así participar en la ejecución del mecanismo celular global mediante el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Las cadenas ligeras de toxinas clostridiales tienen una longitud de aproximadamente 420-460 aminoácidos y comprenden un dominio enzimático. La investigación ha mostrado que la longitud completa de una cadena ligera de toxina clostridial no es necesaria para la actividad enzimática del dominio enzimático. Como un ejemplo no limitativo, los primeros ocho aminoácidos de la cadena ligera de BoNT/A no se requieren para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no limitativo, los primeros ocho aminoácidos de la cadena ligera de TeNT no se requieren para la actividad enzimática. Asimismo, el extremo carboxi de la cadena ligera no es necesario para la actividad. Como un ejemplo no limitativo, los últimos 32 aminoácidos de la cadena ligera de BoNT/A (residuos 417-448) no se requieren para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no limitativo, los últimos 31 aminoácidos de la cadena ligera de TeNT (residuos 427-457) no se requieren para la actividad enzimática. Así, los aspectos de esta realización pueden incluir cadenas ligeras de toxina clostridial que comprenden un dominio enzimático que tiene una longitud de, por ejemplo, al menos 350 aminoácidos, al menos 375 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos, al menos 425 aminoácidos y al menos 450 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización pueden incluir cadenas ligeras de toxina clostridial que comprenden un dominio enzimático que tiene una longitud de, por ejemplo, como máximo 350 aminoácidos, como máximo 375 aminoácidos, como máximo 400 aminoácidos, como máximo 425 aminoácidos y como máximo 450 aminoácidos.
Los polipéptidos de la presente invención, especialmente el componente proteasa de éstos, pueden estar PEGiladosesto puede ayudar a incrementar la estabilidad, por ejemplo, duración de la acción del componente proteasa. La PEGilación se prefiere particularmente cuando la proteasa comprende una proteasa BoNT/A, B o C1. La PEGilación incluye preferiblemente la adición de PEG al extremo N del componente proteasa. Como ejemplo, el extremo N de una proteasa puede prolongarse con uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, cisteína), que pueden ser el mismo o diferentes. Uno o más de dichos residuos de aminoácidos pueden tener su propia molécula de PEG unida (por ejemplo, unida covalentemente) a ellos. Un ejemplo de esta tecnología se describe en WO2007/104567.
Un Dominio de Translocación es una molécula que permite la translocación de una proteasa en una célula diana de manera que se produce una expresión funcional de actividad proteasa en el citosol de la célula diana. Si cualquier molécula (por ejemplo, una proteína o péptido) posee la función de translocación requerida de la presente invención puede confirmarse por uno cualquiera de varios ensayos convencionales.
Por ejemplo, Shone C. (1987) describe un ensayo in vitro que emplea liposomas, que se pulsan con una molécula de ensayo. La presencia de la función de translocación requerida se confirma por la liberación de los liposomas de K+ y/o NAD marcado, que puede monitorizarse fácilmente [véase Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): p. 175-180].
Un ejemplo adicional se proporciona por Blaustein R. (1987), que describe un ensayo in vitro simple que emplea membranas de bicapa de fosfolípidos plana. Las membranas se pulsan con una molécula de ensayo y la función de translocación requerida se confirma por un incremento en la conductancia a través de dichas membranas [véase Blaustein (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: p. 115-120].
La metodología adicional para permitir la evaluación de fusión de membranas y así la identificación de Dominios de Translocación adecuados para uso en la presente invención se proporcionan por Methods in Enzymology Vol 220 y 221, Membrane Fusion Techniques, Partes A y B, Academic Press 1993.
La presente invención también engloba dominios de translocación variantes, siempre que los dominios variantes demuestren todavía la actividad de translocación requerida. Como ejemplo, una variante puede tener al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferiblemente al menos 95% o al menos 98% de homología en la secuencia de aminoácidos con un dominio de translocación de referencia. El término fragmento, cuando se usa en relación con un dominio de translocación, significa un péptido que tiene al menos 2 0 , preferiblemente al menos 40, más preferiblemente al menos 80, y lo más preferiblemente al menos 100 residuos de aminoácidos del dominio de translocación de referencia. En el caso de un dominio de translocación clostridial, el fragmento preferiblemente tiene al menos 100, preferiblemente al menos 150, más preferiblemente al menos 200, y lo más preferiblemente al menos 250 residuos de aminoácidos del dominio de translocación de referencia (por ejemplo, dominio Hn). Como con el componente 'fragmento' de TM (discutido anteriormente), los 'fragmentos' de translocación de la presente invención engloban fragmentos de dominios de translocación variantes sobre la base de las secuencias de referencia.
El Dominio de Translocación es preferiblemente capaz de formar poros permeables a iones en membranas lipídicas en condiciones de bajo pH. Preferiblemente, se ha encontrado el uso sólo de aquellas partes de la molécula de proteína capaces de formación de poros en la membrana endosomal.
El Dominio de Translocación puede obtenerse a partir de una fuente de proteína microbiana, en particular a partir de una fuente de proteína bacteriana o viral. Por lo tanto, en una realización, el Dominio de Translocación es un dominio de translocación de una enzima, tal como una toxina bacteriana o proteína viral.
Está bien documentado que determinados dominios de moléculas de toxina bacteriana son capaces de formar dichos poros. También se sabe que determinados dominios de translocación de proteínas de fusión de membrana viralmente expresadas son capaces de formar dichos poros. Dichos dominios pueden emplearse en la presente invención. El Dominio de Translocación puede ser de origen clostridial, tal como el dominio Hn (o un componente funcional de éste). Hn significa una parte o fragmento de la cadena H de una neurotoxina clostridial aproximadamente equivalente a la mitad amino-terminal de la cadena H, o el dominio correspondiente a ese fragmento en la cadena H intacta. La cadena H carece de la función de unión natural del componente Hc de la cadena H. A este respecto, la función de Hc puede eliminarse por deleción de la secuencia de aminoácidos de Hc (bien al nivel de síntesis de ADN, o a nivel posterior a la síntesis por tratamiento con nucleasa o proteasa). Alternativamente, la función de Hc puede inactivarse por tratamiento químico o biológico. Así, la cadena H es incapaz de unirse al Sitio de Unión en una célula diana a la que se une la neurotoxina clostridial nativa (es decir, holotoxina).
Los ejemplos de Dominios de Translocación adecuados (referencia) incluyen:
Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (449-871)
Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (441-858)
Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (442-866)
Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (446-862)
Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (423-845)
Neurotoxina botulínica tipo F - residuos de aminoácidos (440-864)
Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (442-863)
Neurotoxina de tétano - residuos de aminoácidos (458-879)
La secuencia de referencia identificada anteriormente debe considerarse una guía ya que pueden ocurrir ligeras variaciones según los sub-serotipos. Como ejemplo, US 2007/0166332 cita secuencias clostridiales ligeramente diferentes:
Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (A449-K871)
Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (A442-S858)
Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (T450-N866)
Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (D446-N862)
Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (K423-K845)
Neurotoxina botulínica tipo F - residuos de aminoácidos (A440-K864)
Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (S447-S863)
Neurotoxina de tétano - residuos de aminoácidos (S458-V879)
En el contexto de la presente invención, una variedad de regiones Hn de toxina Clostridial que comprenden un dominio de translocación pueden ser útiles en aspectos de la presente invención con la condición de que estos fragmentos activos puedan facilitar la liberación de una proteasa no citotóxica (por ejemplo, una cadena L clostridial) de vesículas intracelulares en el citoplasma de la célula diana y así participar en la ejecución de mecanismos celulares globales mediante los cuales una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Las regiones Hn de las cadenas pesadas de toxinas Clostridiales tienen una longitud de aproximadamente 410-430 aminoácidos y comprenden un dominio de translocación. La investigación ha mostrado que la longitud completa de una región Hn de una cadena de toxina Clostridial no es necesaria para la actividad de translocación del dominio de translocación. Así, aspectos de esta realización pueden incluir regiones Hn de toxina clostridial que comprenden un dominio de translocación que tiene una longitud de, por ejemplo, al menos 350 aminoácidos, al menos 375 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos y al menos 425 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización pueden incluir regiones Hn de toxina clostridial que comprenden dominios de translocación que tienen una longitud de, por ejemplo, como máximo 350 aminoácidos, como máximo 375 aminoácidos, como máximo 400 aminoácidos y como máximo 425 aminoácidos.
Para detalles adicionales sobre la base genética de la producción de toxinas en Clostridium botulinum y C. tetani, hacemos referencia a Henderson et al (1997) en The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press. El término Hn engloba partes Hn de neurotoxina naturales, y partes Hn modificadas que tienen secuencias de aminoácidos que no aparecen en la naturaleza y/o residuos de aminoácidos sintéticos, siempre que las partes Hn modificadas todavía demuestren la función de translocación mencionada anteriormente.
Alternativamente, el Dominio de Translocación puede ser de origen no clostridial. Los ejemplos de orígenes no clostridiales (referencia) del Dominio de Translocación incluyen, pero no están restringidos a, el dominio de translocación de la toxina de la difteria [O=Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532; y London, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, p. 25-51], el dominio de translocación de la exotoxina tipo A de Pseudomonas [Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559], los dominios de translocación de la toxina del ántrax [Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442], una variedad de péptidos fusogénicos o hidrofóbicos con función de translocación [Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918­ 12924; y Wagner et al (1992) PNAS, 89, p. 7934-7938], y péptidos anfílicos [Murata et al (1992) Biochem., 31, p. 1986­ 1992]. El Dominio de Translocación puede asemejarse al Dominio de Translocación presente en una proteína natural, o puede incluir variaciones de aminoácidos siempre que las variaciones no destruyan la capacidad de translocación del Dominio de Translocación.
Los ejemplos particulares de Dominios de Translocación virales (referencia) adecuados para uso en la presente invención incluyen determinados dominios de translocación de proteínas de fusión de membrana expresadas viralmente. Por ejemplo, Wagner et al. (1992) y Murata et al. (1992) describen la función de translocación (es decir, función de membrana y vesiculación) de un número de péptidos fusogénicos y anfílicos derivados de la región N-terminal de hemaglutinina del virus influenza. Otras proteínas de fusión de membrana expresadas viralmente que se sabe que tienen la actividad de translocación deseada son un dominio de translocación de un péptido fusogénico del Virus del Bosque de Semliki (SFV), un dominio de translocación de la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV), un dominio de translocación de la proteína F del virus SER y un dominio de translocación de la glicoproteína de la cubierta de Espumavirus. Las proteínas Aspike codificadas viralmente tienen una aplicación particular en el contexto de la presente invención, por ejemplo, la proteína El de SFV y la proteína G de VSV.
El uso de los Dominios de Translocación (referencia) listados en la Tabla (a continuación) incluye el uso de variantes de secuencia de éstos. Una variante puede comprender una o más sustituciones conservativas de ácido nucleico y/o deleciones o inserciones de ácido nucleico, con la condición de que la variante posea la función de translocación requerida. Una variante también puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos y/o deleciones o inserciones de aminoácidos, siempre que la variante posea la función de translocación requerida.
Figure imgf000028_0001
Los polipéptidos de la presente invención pueden comprender además un dominio facilitador de la translocación. Dicho dominio facilita la administración de la proteasa no citotóxica en el citosol de la célula diana y se describen, por ejemplo, en WO 08/008803 y WO 08/008805.
Como ejemplo, los dominios facilitadores de la translocación adecuados incluyen un dominio de péptido fusogénico de virus con cubierta, por ejemplo, los dominios de péptido fusogénico adecuados incluyen dominio de péptido fusogénico del virus influenza (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del virus influenza A de 23 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de alfavirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del virus del Bosque de Semliki de 26 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de vesiculovirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del virus de la estomatitis vesicular de 21 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de respirovirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del virus Sendai de 25 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de morbiliivirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del virus del moquillo canino de 25 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de avulavirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del virus de la enfermedad de Newcastle de 25 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de henipavirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico del virus Hendra de 25 aminoácidos), dominio de péptido fusogénico de metapneumovirus (por ejemplo, dominio de péptido fusogénico de metapneumovirus humano de 25 aminoácidos) o dominio de péptido fusogénico de espumavirus tal como dominio de péptido fusogénico del espumavirus de simio; o fragmentos o variantes de éstos.
Como ejemplo adicional, un dominio facilitador de la translocación puede comprender un dominio Hcn de toxina Clostridial o un fragmento o variante de éste. Con más detalle, un dominio Hcn de una toxina Clostridial facilitador de la translocación puede tener una longitud de al menos 200 aminoácidos, al menos 225 aminoácidos, al menos 250 aminoácidos, al menos 275 aminoácidos. A este respecto, un dominio Hcn facilitador de la translocación de una toxina Clostridial preferiblemente tiene una longitud de como máximo 200 aminoácidos, como máximo 225 aminoácidos, como máximo 250 aminoácidos, o como máximo 275 aminoácidos. Los ejemplos específicos (referencia) incluyen: Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (872-1110)
Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (859-1097)
Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (867-1111)
Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (863-1098)
Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (846-1085)
Neurotoxina botulínica tipo F - residuos de aminoácidos (865-1105)
Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (864-1105)
Neurotoxina de tétano - residuos de aminoácidos (880-1127)
Las posiciones de secuencia anteriores pueden variar un poco según el serotipo/subtipo, y los ejemplos adicionales de dominios Hcn de una toxina Clostridial adecuados (referencia) incluyen:
Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (874-1110)
Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (861-1097)
Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (869-1111)
Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (865-1098)
Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (848-1085)
Neurotoxina botulínica tipo F - residuos de aminoácidos (867-1105)
Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (866-1105)
Neurotoxina de tétano - residuos de aminoácidos (882-1127)
Cualquiera de los dominios facilitadores descritos anteriormente puede combinarse con cualquiera de los péptidos de dominios de translocación descritos previamente que son adecuados para uso en la presente invención. Así, como ejemplo, un dominio facilitador no clostridial puede combinarse con un péptido de dominio de translocación péptido no clostridial o con un péptido de dominio de translocación clostridial. Alternativamente, un dominio Hcn facilitador de la translocación de toxina Clostridial puede combinarse con un péptido de dominio de translocación no clostridial. Alternativamente, un dominio Hcn facilitador de toxina Clostridial puede combinarse o con un péptido de dominio de translocación clostridial, ejemplos de los cuales incluyen:
Neurotoxina botulínica tipo A - residuos de aminoácidos (449-1110)
Neurotoxina botulínica tipo B - residuos de aminoácidos (442-1097)
Neurotoxina botulínica tipo C - residuos de aminoácidos (450-1111)
Neurotoxina botulínica tipo D - residuos de aminoácidos (446-1098)
Neurotoxina botulínica tipo E - residuos de aminoácidos (423-1085)
Neurotoxina botulínica tipo F - residuos de aminoácidos (440-1105)
Neurotoxina botulínica tipo G - residuos de aminoácidos (447-1105)
Neurotoxina de tétano - residuos de aminoácidos (458-1127)
Homología de secuencia:
Puede usarse cualquiera de una variedad de métodos de alineamiento de secuencias para determinar el porcentaje de identidad, incluyendo, sin limitación métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tal como, por ejemplo, métodos de aproximación de segmento. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procedimientos rutinarios en el alcance de un experto en la técnica. Los métodos globales alinean secuencias desde el principio hasta el final de la molécula y determinan el mejor alineamiento sumando puntuaciones de parejas de residuos individuales e imponiendo penalizaciones por hueco. Los métodos no limitativos incluyen, por ejemplo, CLUSTAL W, véase, por ejemplo, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); y refinamiento iterativo, véase, por ejemplo, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996). Los métodos locales alinean secuencias identificando uno o más restos conservados compartidos por todas las secuencias de entrada. Los métodos no limitativos incluyen, por ejemplo, Match-box, véase, por ejemplo,, Eric Depiereux y Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992); muestreo de Gibbs, véase, por ejemplo, C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993); Align-M, véase, por ejemplo, Ivo Van Walle et al., Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004).
Así, el porcentaje de identidad de secuencia se determina por métodos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992. Brevemente, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar las puntuaciones de alineamiento usando una penalización por apertura de hueco de 1 0 , una penalización por extensión de hueco de 1 , y la matriz de puntuación “blosum 62” de Henikoff y Henikoff (ibid.) como se muestra a continuación (los aminoácidos se indican por los códigos de una letra estándar).
Puntuación de alineamiento para determinar la identidad de secuencia
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V
A 4
R-1 5
N-2 0 6
D-2-2 1 6
C 0 -3 -3 -3 9
Q-1 1 0 0 - 35
E -1 0 0 2 -4 2 5
G 0-2 0 -1 -3 -2 -2 6
H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4-3 2 4
K -1 2 0 -1 -3 1 1-2-1 -3 -2 5
M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2-1 5
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3-3 -1 0 0-3 0 6
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
S 1 -1 1 0 -1 0 0 0-1 -2-2 0-1 -2-1 4
T 0 -1 0-1-1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 - 2 - 11 5
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -211
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0-3-1 4
El porcentaje de identidad se calcula entonces como:
Número total de concordancias idénticas _________________________________________ x 100
[longitud de la secuencia más larga más el
número de huecos introducidos en la secuencia
más larga con el fin de alinear las dos secuencias]
Los polipéptidos sustancialmente homólogos se caracterizan como que tienen una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de naturaleza menor, esto es, las sustituciones de aminoácidos conservativos (véase a continuación) y otras sustituciones que no afectan significativamente el plegamiento o actividad del polipéptido; deleciones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales pequeñas, tales como un residuo de metionina amino-terminal, un pequeño péptido conector de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una etiqueta de afinidad. Sustituciones de aminoácidos conservativos
Básicos: arginina
lisina
histidina
Ácidos: ácido glutámico
ácido aspártico
Polares: glutamina
asparagina
Hidrofóbicos: leucina
isoleucina
valina
Aromáticos: fenilalanina
triptófano
tirosina
Pequeños: glicina
alanina
serina
treonina
metionina
Además de los 20 aminoácidos estándar, los aminoácidos no estándar (tales como 4-hidroxiprolina, 6 -W-metil lisina, ácido 2 -aminoisobutírico, isovalina y a-metil serina) pueden sustituirse para residuos de aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención. Un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético, y aminoácidos no naturales pueden sustituirse para residuos de aminoácidos de polipéptido clostridial. Los polipéptidos de la presente invención también pueden comprender residuos de aminoácidos no naturales.
Los aminoácidos no naturales incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metano-prolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metil-treonina, hidroxi-etilcisteína, hidroxietilhomo-cisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenil-alanina, 4-azafenilalanina, y 4-fluorofenilalanina. En la técnica se conocen varios métodos para incorporar residuos de aminoácidos no naturales en proteínas. Por ejemplo, puede emplearse un sistema in vitro en el que se suprimen mutaciones sin sentido usando ARNt supresores químicamente aminoacilados. Los métodos para sintetizar aminoácidos y ARNt aminoacilados se conocen en la técnica. La transcripción y traducción de plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se lleva a cabo en un sistema sin células que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas y otros reactivos disponibles comercialmente. Las proteínas se purifican por cromatografía. Véase, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Métodos Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993; y Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en oocitos de Xenopus por microinyección de ARNm mutado y ARNt supresores químicamente aminoacilados (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). En un tercer método, se cultivan células de E. coli en ausencia de un aminoácido natural que quiere reemplazarse (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia del o de los aminoácidos no naturales deseados (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, ó 4-fluorofenilalanina). El aminoácido no natural se incorpora en el polipéptido en lugar de su equivalente natural. Véase, Koide et al., Biochem.
33:7470-6, 1994. Los residuos de aminoácidos naturales pueden convertirse en especies no naturales por modificación química in vitro. La modificación química puede combinarse con mutagénesis dirigida a sitio para expandir adicionalmente el rango de sustituciones (Wynn y Richards, Proteína Sci. 2:395-403, 1993).
Un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético, aminoácidos no naturales, y aminoácidos innaturales pueden sustituirse por residuos de aminoácidos de polipéptidos de la presente invención.
Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención pueden identificarse según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis de escaneo de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Los sitios de interacción biológica también pueden determinarse por análisis físicos de estructura, como se determina por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica o marcaje por fotoafinidad, conjuntamente con mutación de aminoácidos del sitio de contacto putativos. Véase, por ejemplo, de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Las identidades de aminoácidos esenciales también pueden inferirse a partir del análisis de homologías con componentes relacionados (por ejemplo, los componentes de translocación o proteasa) de los polipéptidos de la presente invención.
Pueden hacerse múltiples sustituciones de aminoácidos y ensayarse usando métodos conocidos de mutagénesis y cribado, tales como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241:53-7, 1988) o Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Brevemente, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar para polipéptido funcional, y entonces secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que pueden usarse incluyen exposición en fago (por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991; Ladner et al., Patente U.S. No. 5.223.409; Huse, Publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988).
Pueden hacerse múltiples sustituciones de aminoácidos y ensayarse usando métodos conocidos de mutagénesis y cribado, tales como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241:53-7, 1988) o Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989). Brevemente, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar para polipéptido funcional, y entonces secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que pueden usarse incluyen exposición en fago (por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991; Ladner et al., Patente U.S. No. 5.223.409; Huse, Publicación WIPO WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988).
Ahora sigue una descripción breve de las Figuras, que ilustran aspectos y/o realizaciones de la presente invención.
Figura. I-Purificación de la proteína de fusión LHn/D-CT-CST28
Usando la metodología indicada en el Ejemplo 3, se purificó una proteína de fusión LHn/D-CT-CST28 de células de E. coli BL21 (DE3). Brevemente, los productos solubles obtenidos después de la disrupción de las células se aplicaron a una columna de captura de afinidad cargada con níquel. Las proteínas unidas se eluyeron con 200 mM de imidazol, se trataron con enteroquinasa para activar la proteína de fusión y después se re-aplicó a una segunda columna de captura de afinidad cargada con níquel. Las muestras del procedimiento de purificación se evaluaron por SDS-PAGE. Carril 1: Primer eluyente de la columna de Sefarosa quelante de níquel, Carril 2: Segundo eluyente de la columna de Sefarosa quelante de níquel en condiciones no reductoras, Carril 3: Segundo eluyente de la columna de Sefarosa quelante de níquel en condiciones reductoras, carril 4: Marcadores de masa molecular (kDa).
Figura. 2-Purificación de la proteína de fusión LHn/A-CT-SST14
Usando la metodología indicada en el Ejemplo 3, se purificó una proteína de fusión LHA//A-CT-SST14 de células de E. coli BL21 (DE3). Brevemente, los productos solubles obtenidos después de la disrupción de las células se aplicaron a una columna de captura de afinidad cargada con níquel. Las proteínas unidas se eluyeron con 200 mM de imidazol, se trataron con Factor Xa para activar la proteína de fusión y después se re-aplicó a una segunda columna de captura de afinidad cargada con níquel. Las muestras del procedimiento de purificación se evaluaron por SDS-PAGE. Carril 1: Primer eluyente de la columna de Sefarosa quelante de níquel, Carril 2: Marcadores de masa molecular (kDa), Carriles 3-4: Segundo eluyente de la columna de Sefarosa quelante de níquel en condiciones no reductoras, Carriles 5-6: Segundo eluyente de la columna de Sefarosa quelante de níquel en condiciones reductoras.
Figuras 3-47-Representaciones en cajas que muestran la regulación al alza de ARNm de proteína SNARE en células cancerosas
El análisis estadístico de las diferencias en la expresión de SNARE entre tejidos normales y de cáncer primario se completaron a través del uso de algoritmos Oncomine (Compendia Bioscience, Ann Arbor, Mich., EEUU) y herramienta de análisis de micromatrices génicas. La expresión del ARNm de SNARE se comparó con la expresión media de todos los demás genes en el estudio respectivo, para el que se generó un valor de expresión Normalizado. Sólo se ilustran los estudios con resultados de análisis con P<0,05. Con más detalle, las Figuras 3-10 ilustran los perfiles de expresión de SNAP-25 en diferentes células cancerosas frente a no cancerosas. Las Figuras 11-16 ilustran los perfiles de expresión de sintaxina-1 en diferentes células cancerosas frente a no cancerosas. Las Figuras 17-20 ilustran los perfiles de expresión de sintaxina-2 en diferentes células cancerosas frente a no cancerosas. Las Figuras 21-24 ilustran los perfiles de expresión de sintaxina-3 en diferentes células cancerosas frente a no cancerosas. Las Figuras 25-32 ilustran los perfiles de expresión de VAMP-1 en diferentes células cancerosas frente a no cancerosas. Las Figuras 33-38 ilustran los perfiles de expresión de VAMP-2 en diferentes células cancerosas frente a no cancerosas. Las Figuras 39-45 ilustran los perfiles de expresión de VAMP-3 en diferentes células cancerosas frente a no cancerosas. En todos los casos, los datos ilustran la regulación al alza de proteínas SNARE en células cancerosas. La Figura 46 ilustra una diferencia estadísticamente significativa en el nivel de expresión del ARNm de sintaxina-1 entre pacientes con cáncer de mama ductal invasivo recurrente a los 5 años después del diagnóstico y aquellos pacientes sin recurrencia. La Figura 47 ilustra una diferencia estadísticamente significativa en el nivel de expresión del ARNm de sintaxina-1 en pacientes con cáncer de mama en los que un evento metastásico ha ocurrido a los 5 años después del diagnóstico frente a aquellos sin metástasis. Los datos se presentan en forma de representación en cajas (véase la Figura 3 para explicación) y/o como un histograma, en el que cada barra representa el nivel de expresión génica normalizada en cada muestra de tejido del paciente.
Figura 48-Perfilado de receptor de la superficie celular y expresión de la proteína SNARE en líneas de carcinoma de Células Renales por análisis de transferencia Western.
Se prepararon extractos de proteínas de ocho líneas de carcinoma de células renales (RCC) humanos crecidos in vitro en tampón de muestra Laemmli estándar (carriles 3-10). Los extractos de proteínas preparados a partir de cultivos primarios de neuronas de médula espinal de rata y ganglios de la raíz dorsal se incluyeron como controles. Las proteínas se separaron en geles de SDS-poliacrilamida al 10% y se transfirieron por electroforesis a una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear la membrana, se usaron antisueros primarios para ensayar cada proteína específica y la detección se permitió por una IgG anti-especie conjugada con peroxidasa. Las proteínas receptoras detectadas fueron receptor ErbB (receptor del factor de crecimiento epidérmico, EGF) y receptor de la hormona liberadora de hormona del crecimiento (GHRHR). Las proteínas SNARE ensayadas fueron SNAP-25, sintaxina-2 y sintaxina-3. La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se usó como un control de la carga de proteínas.
Figura 49-Detección de la escisión de la proteína SNAP-25 en una línea de carcinoma de Células Renales por análisis de transferencia Western después de 24 hr de tratamiento con una fusión EGF-LHA.
La Figura 49 muestra el efecto de un tratamiento de 24 horas de células RCC humanas 786-0 con un número de moléculas de proteína de fusión con ligando EGF. Con más detalle, EGF-LHA, a dosis entre 1 y 100 nM, generó especies de SNAP-25 escindidas mientras las moléculas control, específicamente EGF-LHB (no dirigida a SNAP-25), una forma catalíticamente inactiva de EGF-LHA, EGF-LH-DE-A (referida como 'EGF-0' de aquí en adelante) y el ligando EGF 'libre', no lo hicieron. Las concentraciones indicadas están en nM.
Figura 50-Inhibición de la proliferación in vitro de una línea de carcinoma de Células Renales por una fusión EGF-LHA.
Se contaron células 786-0 sembradas en un recipiente de cultivo celular en una región pre-definida a las 24 y 48 horas después de tratamiento con 25 nM de proteínas de fusión con ligando EGF.
Figura 51-Inhibición de la secreción de FGF-2 de una línea de carcinoma de Células Renales por una fusión EGF-LHA.
Se analizaron los medios de cultivo de células 786-0 tratadas durante 24 horas con proteínas de fusión con ligando EGF para Factor de Crecimiento de Fibroblastos-2 por métodos estándar. Con más detalle, EGF-LHA, a dosis entre 1 y 50 nM, demostró una disminución dependiente de la dosis en los niveles de FGF-2 presentes en el medio de cultivo mientras las moléculas control, específicamente la forma catalíticamente inactiva de EGF-LHA, EGF-0, y ligando EGF 'libre', no lo hicieron. Las concentraciones indicadas están en nM.
Figura 52-Inhibición de la proliferación in vitro de la línea de carcinoma de Células Renales A498 por una fusión EGF-LHA.
La Figura 52 muestra el efecto de una proteína de fusión con ligando EGF (EGFv3-LHA, 300 nM) en la proliferación celular de la línea celular A498 después de 48 horas. Las células se tiñeron usando la sal de tetrazolio WST según protocolos estándar. La molécula sin ligando LHA se incluyó como un control.
Figura 53-Inhibición de la proliferación in vitro de la línea de carcinoma de Células Renales ACHN por una fusión EGF-LHA.
La Figura 53 muestra el efecto de una proteína de fusión con ligando EGF (EGFv3-LHA, a 300 nM) en la proliferación celular de la línea celular ACHN después de 48 horas. Las células se tiñeron usando la sal de tetrazolio WST según protocolos estándar. La molécula sin ligando LHA se incluyó como un control.
Figura 54-Inhibición de la secreción in vitro de péptido liberador de gastrina (GRP) de la línea celular de cáncer de pulmón de células pequeñas DMS-53 por una fusión EGF-LHA.
La Figura 54 muestra el efecto de una proteína de fusión con ligando EGF (EGFv3-LHA, a 150 nM) en la secreción de GRP de la línea celular DMS-53 después de tratamiento durante 24 hr. El medio retirado de las células se analizó 48 horas después de la retirada de las proteínas de fusión. La forma catalíticamente inactiva de EGF-LHA, EGF-0, se incluyó como un control, como se hizo con cicloheximida, un inhibidor general de la síntesis de proteínas.
Nomenclatura
SST somatostatina
TGF(A) factor de crecimiento transformante (alfa)
GHRL grelina
LEP leptina
ET(A) endotelina-1
FLT receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular
CHRN(D) receptor de acetilcolina (subunidad delta)
EPHA receptor de efrina tipo-A
EFNA efrina-A
DLK1 proteína semejante a delta 1
JAG proteína jagged
NRG neuregulina
G-CSF factor estimulador de colonias de granulocitos
AMF factor de motilidad autocrino
NMB neuromedina-B
CCK colecistoquinina
PDGF factor de crecimiento derivado de plaquetas
ADM adrenomedulina
GDNF factor neurotrófico derivado de línea celular glial
TrkA factor de crecimiento nervioso de alta afinidad
FSH hormona estimuladora de folículo
CXCR receptor de quimioquina C-X-C
CRLR receptor semejante a receptor de calcitonina
PDF factor de diferenciación de la próstata
MCP proteína quimiotáctica de monocitos
KGF factor de crecimiento de queratinocitos
FLK1 receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular 2
PDGFR receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas
NOTCH proteína homóloga a locus notch neurogénico
DLL proteína semejante a delta
GHS secretagogo de la hormona del crecimiento
c-MET factor de crecimiento de hepatocitos
c-kit factor de crecimiento de mastocitos/células madre
MGSA/GRO actividad estimuladora del crecimiento de melanoma/gen relacionado con el crecimiento BCGF factor de crecimiento de células B
GnRH receptor de la hormona liberadora de gonadotropina
Ang-2 angiopoyetina-2
FGF factor de crecimiento de fibroblastos
ErbB miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico
VIPR receptor del polipéptido intestinal vasoactivo
BRS subtipo de receptor de bombesina
GRP péptido liberador de gastrina
LIF factor inhibidor de leucemia
GHRH hormona liberadora de hormona del crecimiento
IGF factor de crecimiento semejante a insulina
CRHR-2 receptor de factor liberador de corticotropina 2
BB bombesina
GH hormona del crecimiento
IL interleuquina
VEGF factor de crecimiento del endotelio vascular
ACH acetilcolina
CST cortistatina
VPAC receptor el péptido intestinal vasoactivo
GRPR receptor del péptido liberador de gastrina
CTR receptor de unión a calcitonina
EPO eritropoyetina
HB-EGF factor de crecimiento semejante a EGF de unión a heparina
HGF/SF factor de crecimiento de hepatocitos/factor de dispersión
SDF-1 factor derivado de célula estromal 1
CXCL12 ligando quimioquina 12 (resto C-X-C) (SDF-1)
TNF factor de necrosis tumoral
PGF factor de crecimiento de placenta
Gran4 granulina-4
TIE2 receptor de angiopoyetina 2
LH hormona luteinizante
CCL ligando quimioquina CC
NT neurotrofina
NTAK neuregulina-2
BAFF factor activador de células B
GM-CSF factor estimulador de las colonias de granulocitos-macrófagos
NGF factor de crecimiento nervioso
PACAP péptido activador de adenilato ciclasa de la pituitaria
OB leptina
NRP receptor de neuropilina
Resumen de Ejemplos
Ejemplo 1 Preparación de una construcción central LHA
Ejemplo 2 Construcción de LHD-CT-CST28
Ejemplo 3 Expresión y purificación de una proteína de fusión LHD-CT-CST28
Ejemplo 4 Construcción de LHA-CP-EGF
Ejemplo 5 Expresión y purificación de una proteína de fusión LHA-CP-EGF
Ejemplo 6 Conjugación química de LHn/A a GnRH TM
Ejemplo 7 Método para tratar cáncer colorrectal
Ejemplo 8 Método para tratar cáncer de mama
Ejemplo 9 Método para tratar cáncer de próstata
Ejemplo 10 Método para tratar tumores carcinoides de pulmón
Ejemplo 11 Método para tratar cáncer de vejiga
Ejemplo 12 Método para tratar cáncer de pulmón de células pequeñas
Ejemplo 13 Método para tratar cáncer de próstata
Ejemplo 14 Método para tratar cáncer de cuello uterino
Ejemplo 15 Método para tratar leucemia
Ejemplo 16 Método para tratar cáncer de pulmón de células pequeñas
Ejemplo 17 Método para tratar cáncer pancreático
Ejemplo 18 Método para tratar cáncer óseo metastásico
Ejemplo 19 Método para tratar cáncer de pulmón de células pequeñas metastásico en el cerebro
Ejemplo 20 Método para tratar cáncer de intestino
Ejemplo 21 Método para tratar leucemia linfocítica crónica
Ejemplo 22 Método para tratar cáncer de hígado
Ejemplo 23 Método para tratar linfoma de Hodgkin
Ejemplo 24 Método para tratar cáncer renal
Ejemplo 25 Método para tratar cáncer de piel
Ejemplo 26 Método para tratar cáncer orofaríngeo
Ejemplo 27 Método para tratar cáncer mieloma
Ejemplo 28 Método para tratar cáncer sarcoma de tejidos blandos
Ejemplo 29 Método para tratar cáncer gástrico
Ejemplo 30 Método para tratar cáncer testicular
Ejemplo 31 Método para tratar cáncer uterino
Ejemplo 32 Método para tratar sarcoma de Karposi
Ejemplo 33 Método para tratar cáncer de cerebro primario
Ejemplo 34 Método para tratar cáncer rectal
Ejemplo 35 Evaluación de cambios en la proliferación, inhibición de la secreción celular y escisión de SNARE concomitante después de tratamiento de líneas celulares de cáncer renal cultivadas in vitro con un polipéptido de la presente invención.
Resumen de SEQ ID NOs
Cuando se indica un residuo de aminoácido Met inicial o un codón inicial correspondiente en cualquiera de las SEQ ID NOs siguientes, dicho residuo/codón es opcional.
1. Secuencia de ADN de LHn/A
2. Secuencia de ADN de LHn/B
3. Secuencia de ADN de LHn/C
4. Secuencia de ADN de LHn/D
5. Secuencia de ADN del conector CT-CST28
6. Secuencia de ADN de la fusión LHD-CT-CST28
7. Secuencia de proteína de la fusión LHD-CT-CST28
8. Secuencia de ADN del conector CP-EGF
9. Secuencia de ADN de la fusión LHA-CP-EGF
1 0. Secuencia de proteína de la fusión
Figure imgf000037_0001
1 1. Secuencia de proteína de LHn/A
1 2. Secuencia de proteína de LHn/B
13. Secuencia de proteína de LHn/C
14. Secuencia de proteína de LHn/D
15. Péptido GnRH sintetizado
16. Secuencia de proteína de la fusión
17. Secuencia de proteína de la fusión
18. Secuencia de proteína de la fusión
19. Secuencia de proteína de la fusión
2 0. Secuencia de proteína de la fusión
2 1. Secuencia de proteína de la fusión
2 2. Secuencia de proteína de la fusión
23. Secuencia de proteína de la fusión
24. Secuencia de proteína de la fusión
25. Secuencia de proteína de la fusión
26. Secuencia de proteína de la fusión
27. Secuencia de proteína de la fusión
28. Secuencia de proteína de la fusión
29. Secuencia de proteína de la fusión
30. Secuencia de proteína de la fusión
31. Secuencia de proteína de la fusión
Figure imgf000037_0002
32. Secuencia de proteína de la fusión
33. Secuencia de proteína de la fusión IgA-HNtet-CT-SST14
34. Secuencia de proteína de la fusión IgA-HNtet-CP-SST14
35. Secuencia de proteína de la fusión LHA-CT-SST14
36. Secuencia de proteína de la fusión
37. Secuencia de proteína de la fusión LHE-CT-IL6
38. Secuencia de proteína de la fusión LHB-CT-IL8
39. Secuencia de proteína de la fusión LHF-CP-GRAN4
40. Secuencia de proteína de la fusión LHD-CP-TGFa
41. Secuencia de proteína de la fusión LHD-CP-TGFb
42. Secuencia de proteína de la fusión LHB-CT-TNFa
43. Secuencia de proteína de la fusión LHD-CT-SDF1
44. Secuencia de proteína de la fusión
Ejemplos
Ejemplo 1 Preparación de una construcción central LHn/A
El procedimiento siguiente crea un clon para uso como una parte central de expresión para la expresión de proteínas multidominio. Este ejemplo se basa en la preparación de un clon basado en serotipo A (SEQ ID1), aunque los procedimientos y métodos son igualmente aplicables a todos los serotipos LHn tales como serotipo B (SEQ ID2), serotipo C (SEQ ID3) y serotipo D (SEQ ID4) y otros dominios de proteasa o de translocación usando la secuencia publicada apropiada para la síntesis.
Preparación de vectores de clonación y expresión
pCR 4 (Invitrogen) es el vector de clonación estándar elegido debido a la ausencia de secuencias de restricción en el vector y sitios de cebador de secuenciación adyacentes para la confirmación sencilla de la construcción. El vector de expresión se basa en el vector de expresión pET (Novagen) que se ha modificado para contener el sitio de clonación múltiple NdeI-BamHI-SaN-PstI-XbaI-HindIN para la inserción de la construcción. un fragmento del vector de expresión se ha eliminado para crear un plásmido no movilizable, una variedad de diferentes etiquetas de fusión se ha insertado para incrementar las opciones de purificación y un sitio XbaI existente en la parte central del vector se ha eliminado para simplificar la sub-clonación.
Preparación de LC/A
La secuencia de ADN se diseña por retro traducción de la secuencia de aminoácidos de LC/A (obtenida de fuentes de bases de datos disponibles libremente tales como GenBank (número de acceso P10845) usando una de una variedad de herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)). Las secuencias de reconocimiento de BamHI/SaII se incorporan en los extremos 5' y 3' respectivamente de la secuencia manteniendo el marco de lectura correcto. La secuencia de ADN se criba (usando software tal como SeqBuilder, DNASTAR Inc.) para secuencias de escisión de enzimas de restricción incorporadas durante la retro traducción. Cualesquiera secuencias de escisión que se encuentre que sean comunes a las requeridas por el sistema de clonación se eliminan por la herramienta Backtranslation de la secuencia codificadora propuesta asegurando que se mantiene un uso de codones de E. coli común. El uso de codones de E. coli se evalúa por referencia a programas de software tales como Graphical Codon Usage Analyser (GeneArt), y la relación de % de contenido de GC y uso de codones se evalúa por referencia a tables de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre 2004). Esta secuencia de ADN optimizada que contiene el marco de lectura abierto (ORF) de LC/A se sintetiza entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, GeneArt o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Preparación del inserto Hn/A
La secuencia de ADN se diseña por retro traducción de la secuencia de aminoácidos de Hn/A (obtenida de fuentes de bases de datos disponibles libremente tales como GenBank (número de acceso P10845) usando una de una variedad de herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)). Se añade una secuencia de restricción PstI al extremo N y XbaI-codón de parada-HindlII al extremo C asegurando que se mantiene el marco de lectura correcto. La secuencia de ADN se criba (usando software tal como SeqBuilder, DNASTAR Inc.) para secuencias de escisión de enzimas de restricción incorporadas durante la retro traducción. Cualesquiera secuencias que se encuentre que sean comunes a las requeridas por el sistema de clonación se eliminan por la herramienta Backtranslation de la secuencia codificadora propuesta asegurando que se mantiene un uso de codones de E. coli común. El uso de codones de E. coli se evalúa por referencia a programas de software tales como Graphical Codon Usage Analyser (GeneArt), y la relación de % de contenido de GC y uso de codones se evalúa por referencia a tables de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre 2004). Esta secuencia de ADN optimizada se sintetiza entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, GeneArt o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Preparación del interdominio (conector LC-Hn)
El conector LC-Hn puede diseñarse desde el principio, usando la información de secuencia existente para el conector como el molde. Por ejemplo, el conector de serotipo A (en este caso, definido como la región de polipéptido inter­ dominio que existe entre las cisteínas del puente disulfuro entre LC y Hn) tiene la secuencia VRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDL (SEQ ID NO: 110). Esta información de secuencia está disponible libremente a partir de fuentes de bases de datos disponibles tales como GenBank (número de acceso P10845). Para la generación de un sitio de escisión de proteasa específico, la secuencia de reconocimiento nativa para el Factor Xa puede usarse en la secuencia modificada VDGIITs Kt KSLIEGRNKALNLQ (SEQ ID NO: 111) o una secuencia de reconocimiento de enteroquinasa se inserta en el bucle de activación para generar la secuencia VDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQ (SEQ ID NO: 112). Usando una de una variedad de herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, herramienta Backtranslation tool v2.0 (Entelechon), se determina la secuencia de ADN que codifica la región conectora. Se incorporan secuencias de enzimas de restricción BamHI/SaII y PstI/XbaI/codón de parada/HindIII en cualquier extremo, en los marcos de lectura correctos. La secuencia de ADN se criba (usando software tal como Seqbuilder, DNASTAR Inc.) para secuencias de escisión de enzimas de restricción incorporadas durante la retro traducción. Cualesquiera secuencias que se encuentre que sean comunes a las requeridas por el sistema de clonación se eliminan por la herramienta Backtranslation de la secuencia codificadora propuesta asegurando que se mantiene un uso de codones de E. coli común. El uso de codones de E. coli se evalúa por referencia a programas de software tales como Graphical Codon Usage Analyser (GeneArt), y la relación de % de contenido de GC y uso de codones se evalúa por referencia a tables de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre 2004). Esta secuencia de ADN optimizada se sintetiza entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, GeneArt o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Ensamblaje y confirmación del clon de la parte central
Debido al pequeño tamaño, el conector de activación debe transferirse usando un proceso de dos etapas. El vector conector pCR-4 se escinde con una combinación de enzimas de restricción BamHI+SaII y el vector conector escindido sirve entonces como el receptor para el ADN de LC escindido con las enzimas de restricción BamHI+SaIII. Una vez el ADN que codifica LC se inserta en 5' respecto al ADN del conector, el fragmento completo de ADN de conector LC puede aislarse y transferirse al vector de expresión pET MCS. El conector LC se corta del vector de clonación pCR 4 usando digestiones con las enzimas de restricción BamHI/PstI. El vector de expresión pET se digiere con las mismas enzimas, pero también se trata con fosfatasa antártica como una precaución extra para evitar la re-circularización. El conector Lc y la parte central del vector pET se purifican en gel y el inserto y parte central del vector purificados se ligan entre sí usando ADN ligasa T4. El producto se transforma con células TOP10 que se criban para el conector LC usando digestión de restricción con BamHI/PstI. El proceso se repite entonces para la inserción de Hn en los sitios de restricción de Pstl/HindlII de la construcción pET-conector LC.
El cribado con enzimas de restricción es suficiente para asegurar que la parte central final es correcta ya que todos los componentes ya se han confirmado en secuenciación durante la síntesis. Sin embargo, durante la sub-clonación de algunos componentes en la parte central, en la que los fragmentos de tamaño similar se eliminan e insertan, se requiere la secuenciación de una pequeña región para confirmar la inserción correcta.
Ejemplo 2 Construcción de LHn/D-CT-CST28
El procedimiento siguiente crea un clon para uso como una construcción de expresión para la expresión de fusión multidominio en la que el resto de direccionamiento (TM) se presenta en C-terminal respecto al dominio de translocación. Este ejemplo se basa en la preparación de la fusión LHn/D-CT-CST28 (SEQ ID6 ), aunque los procedimientos y métodos son igualmente aplicables para crear otras fusiones de proteasa, translocación y TM, en las que el TM es C-terminal respecto al dominio de translocación. En este ejemplo, se prepara por ingeniería un espaciador flanqueante glicina-serina de 15 aminoácidos en la secuencia interdominio para asegurar a accesibilidad del ligando a su receptor, pero son aplicables otros espaciadores.
Preparación de espaciador-inserto CST28
Para la presentación de una secuencia CST28 en el extremo C del dominio Hn, se diseña una secuencia de ADN para flanquear las regiones de espaciador y resto de direccionamiento (TM) permitiendo la incorporación en el clon de la parte central (SEQ ID4). La secuencia de ADN puede disponerse como BamHI-Sa/I-PstI-XbaI-espaciador-CST28-codón de parada-HindIII (SEQ ID5). La secuencia de ADN puede diseñarse usando una de una variedad de herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, EditSeq mejor traducción inversa E. coli (DNASTAR Inc.), o la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)). Una vez se ha diseñado el ADN de TM, el ADN adicional requerido para codificar el espaciador preferido se crea in silico. Se prefiere asegurar que el marco de lectura correcto se mantiene para las secuencias del espaciador, TM y restricción y que la secuencia XbaI no está precedida por las TC, lo que resultaría en metilación DAM. La secuencia de ADN se criba para secuencias de restricción incorporadas y cualesquiera secuencias adicionales se eliminan manualmente de la secuencia remanente para asegurar que se mantiene un uso de codones de E. coli común. El uso de codones de E. coli se evalúa por referencia a programas de software tales como Graphical Codon Usage Analyser (GeneArt), y la relación de % de contenido de GC y uso de codones se evalúa por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre 2004). Esta secuencia de ADN optimizada se sintetiza entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, GeneArt o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Ensamblaje y confirmación del clon de la parte central
Con el fin de crear una construcción LHn/D-CT-CST28 (SEQ ID6 ) usando la construcción de la parte central (SEQ ID4) y el vector recién sintetizado pCR 4-espaciador-TM que codifica el TM CST28 (SEQ ID5), puede usarse un método de una o dos etapas; típicamente se usa el método de dos etapas cuando el ADN de TM es menor de 100 pares de bases. Usando el método de una etapa, el TM puede insertarse directamente en la construcción de la parte central cortando el vector pCR 4-espaciador-TM con las enzimas de restricción XbaI y HindIII e insertando el fragmento de ADN que codifica el TM en una construcción de parte central pET cortada de forma similar. Usando el método de dos etapas, el dominio LHn se escinde del clon de la parte central usando las enzimas de restricción BamHI y XbaI y ligando en un vector pCR 4-espaciador-TM cortado de forma similar.
Esto crea un ORF LHN-espaciador-TM en pCR 4 que puede escindirse del vector usando las enzimas de restricción BamHI y HindIII para la ligación posterior en la construcción de expresión pET escindida de forma similar. La construcción final contiene el ADN de LC-conector-HN-espaciador-CST28 (SEQ ID6 ) que resultará en una proteína de fusión que contiene la secuencia ilustrada en SEQ ID7.
Ejemplo 3 Expresión y purificación de una proteína de fusión LHn/D-CT-CST28
Este ejemplo se basa en la preparación de una proteína LHn/D que comprende un polipéptido TM CST28 en el extremo carboxilo del dominio Hn (Se Q ID7), en el que el ORF del vector de expresión pET también codifica una etiqueta de histidina para la purificación. Estos procedimientos y métodos son igualmente aplicables a secuencias de proteínas de fusión mostradas en SEQ ID 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 31, 33, 35, 36, 37, 38, 42, 43 ó 44. Cuando sea apropiado, la enzima de activación debe seleccionarse para ser compatible con el sitio de activación de la proteasa en cada secuencia.
Expresión de LHn/D-CT-CST28
La expresión de la proteína LHn/D-CT-CST28 se consigue usando el protocolo siguiente. Inocular 100 ml de TB modificado que contiene 0,2% glucosamina y 30 pg/ml kanamicina en un matraz de 250 ml con una única colonia de la cepa de expresión LHn/D-CT-CST28. Crecer el cultivo a 37°C, 225 rpm durante 16 horas. Inocular 1 L de TB modificado que contiene 0,2% glucosamina y 30 pg/ml kanamicina en un matraz de 2 L con 10 ml de cultivo de toda la noche. Crecer los cultivos a 37°C hasta que se alcanza una DO600 nm aproximada de 0,5, punto en el que se reduce la temperatura hasta 16°C. Después de 1 hora, inducir los cultivos con 1 mM IPTG y crecer a 16°C durante 16 horas adicionales.
Purificación de la proteína LHn/D-CT-CST28
Descongelar un tubo falcon que contiene 35 ml 50 mM HEPES pH 7,2 200 mM NaCI y aproximadamente 10 g de pasta de células de E. coli BL21 (DE3). Homogenizar la pasta de células (20 psi) asegurando que la muestra permanece fría. Centrifugar las células lisadas a 18.000 rpm, 4°C durante 30 minutos. Cargar el sobrenadante en una columna quelante cargada con 0,1 M NiSO4 (una columna de 20-30 ml es suficiente) equilibrada con 50 mM HEPES pH 7,2200 mM NaCl. Usando un gradiente en etapas de 10, 40 y 100 mM imidazol, retirar por lavado la proteína unida de forma no específica y eluir la proteína de fusión con 200 mM imidazol. La proteína de fusión eluida se dializa frente a 5 L de 50 mM HEPES pH 7,2 200 mM NaCl a 4°C toda la noche y la DO280 nm se mide para establecer la concentración de proteína. Añadir 3,2 pl de enteroquinasa (New England Biolabs) por mg de proteína de fusión e incubar en estático toda la noche a 25°C. Cargar en una columna quelante cargada con 0,1 M NiSO4 (una columna de 20-30 ml es suficiente) equilibrada con 50 mM HEPES pH 7,2200 mM NaCl. Lavar la columna hasta la línea base con 50 mM HEPES pH 7,2200 mM NaCl. Usando un gradiente en etapas de 10, 40 y 100 mM imidazol, retirar por lavado la proteína unida de forma no específica y eluir la proteína de fusión con 200 mM imidazol. Dializar la proteína de fusión eluida frente a 5 L de 50 mM HEPEs pH 7,2 150 mM NaCl a 4°C toda la noche y concentrar la fusión hasta aproximadamente 2 mg/ml, alicuotar en muestras y congelar a -20°C. Ensayar la proteína purificada usando DO280, BCA y análisis de pureza. Las Figuras 1 y 2 demuestran la purificación de proteínas de fusión según este método como se analiza por SDS-PAGE.
Ejemplo 4 Construcción de LHn/A-CP-EGF
El procedimiento siguiente crea un clon para uso como una construcción de expresión para expresión de fusión multidominio en el que el resto de direccionamiento (TM) se presenta centralmente entre el dominio de proteasa y translocación. Este ejemplo se basa en la preparación de la fusión LHn/A-CP-EGF (SEQ ID9), aunque los procedimientos y métodos son igualmente aplicables para crear otras fusiones de proteasa, translocación y TM, en las que el TM es N-terminal respecto al dominio de translocación. En este ejemplo, se prepara por ingeniería un espaciador helicoidal flanqueante en la secuencia interdominio para asegurar la accesibilidad del ligando a su receptor, pero son aplicables otros espaciadores.
Preparación de inserto espaciador-EGF humano
La región conectora polipéptido inter-dominio LC-Hn existe entre las cisteínas del puente disulfuro entre LC y Hn. Para la inserción de un sitio de escisión de proteasa, espaciador y una región de resto de direccionamiento (TM) en el bucle de activación, se usan una de una variedad de herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon) para determinar la secuencia de ADN que codifica la región conectora. Para la presentación central de una secuencia de TM en el extremo N del dominio Hn, se diseña una secuencia de ADN para las regiones de espaciador y resto de direccionamiento (TM) permitiendo la incorporación en el clon de la parte central (SEQ ID1). La secuencia de ADN puede disponerse como SamHI-Sa/I-espaciador-sitio de activación de proteasa-EGF-espaciador-PstI-XbaI-codón de parada-HindlII (SEQ ID8 ). Una vez se ha diseñado el ADN de TM, el ADN adicional requerido para codificar el espaciador preferido se crea in silico. Se prefiere asegurar que se mantiene el marco de lectura correcto para las secuencias de espaciador, TM y restricción y que la secuencia Xbal no está precedida por las bases TC, lo que resultaría en metilación DAM. La secuencia de a Dn se criba para secuencia de restricción incorporada y cualesquiera sitios adicionales se eliminan manualmente de la secuencia remanente asegurando que se mantiene el uso de codones de E. coli común. El uso de codones de E. coli se evalúa por referencia a programas de software tales como Graphical Codon Usage Analyser (GeneArt), y la relación % de contenido GC y uso de codones se evalúa por referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre 2004). Esta secuencia de ADN optimizada se sintetiza entonces comercialmente (por ejemplo, por Entelechon, GeneArt o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Ensamblaje y confirmación del clon de la parte central
Con el fin de crear una construcción LC-espaciador-sitio de activación-EGF-espaciador-HN (SEQ ID9) usando la construcción de la parte central (SEQ ID1) y el vector recién sintetizado pCR 4-espaciador-sitio de activación-TM-espaciador que codifica el TM EGF (SEQ ID8 ), puede usarse un método de una o dos etapas; típicamente se usa el método de dos etapas cuando el ADN de TM es menor de 100 pares de bases. Usando el método de una etapa, la región conectora de TM puede insertarse directamente en la construcción de la parte central cortando el vector pCR 4-espaciador-sitio de activación-TM-espaciador con las enzimas de restricción Sa/I y PstI e insertando el fragmento de ADN que codifica el TM en una construcción de parte central pET cortada de forma similar. Usando el método de dos etapas, el dominio LC se escinde del clon de la parte central usando las enzimas de restricción SamHI y Sa/I y se liga en un vector pCR 4-espaciador-sitio de activación-TM-espaciador cortado de forma similar. Esto crea un ORF LC-espaciador-sitio de activación-TM-espaciador en pCR 4 que puede escindirse del vector usando las enzimas de restricción SamHI y PstI para ligación posterior en una construcción de expresión pET de forma similar. La construcción final contiene el ADN de LC-espaciador-sitio de activación-EGF-espaciador-HN (SEQ ID9) que resultará en una proteína de fusión que contiene la secuencia ilustrada en SEQ ID10.
Ejemplo 5 Expresión y purificación de una proteína de fusión LH n /A-CP-EGF
Este ejemplo se basa en la preparación de una proteína LHn/A que incorpora un polipéptido TM EGF en la región conectora interdominio (SEQ ID10), en la que el ORF del vector de expresión pET también codifica una etiqueta de histidina para la purificación. Estos procedimientos y métodos son igualmente aplicables a las otras proteínas de fusión mostradas en SEQ ID 17, 28, 30, 32, 34, 39, 40 ó 41. Cuando sea apropiado, las enzimas de activación deben seleccionarse para ser compatibles con el sitio de activación de proteasa en cada secuencia.
Expresión de LHn/A-CP-EGF
La expresión de la proteína LHn/A-CP-EGF se consigue usando el protocolo siguiente. Inocular 100 ml de TB modificado que contiene 0,2% glucosamina y 30 pg/ml kanamicina en un matraz de 250 ml con una única colonia de la cepa de expresión LHA-CP-EGF. Crecer el cultivo a 37°C, 225 rpm durante 16 horas. Inocular 1 L de TB modificado que contiene 0,2% glucosamina y 30 pg/ml kanamicina en un matraz de 2 L con 10 ml cultivo de toda la noche. Crecer los cultivos a 37°C hasta que se consigue una DO600 nm aproximada de 0,5, punto en el cual se reduce la temperatura hasta 16°C. Después de 1 hora, inducir los cultivos con 1 mM IPTG y crecer a 16°C durante 16 horas adicionales.
Purificación de la proteína LHn/A-CP-EGF
Descongelar un tubo falcon que contiene 35 ml 50 mM HEPES pH 7,2 200 mM NaCl y aproximadamente 10 g de pasta de células de E. coli BL21 (DE3). Homogenizar la pasta de células (20 psi) asegurando que la muestra permanece fría. Centrifugar las células lisadas a 18.000 rpm, 4°C durante 30 minutos. Cargar el sobrenadante en una columna quelante cargada con 0,1 M NiSO4 (una columna de 20-30 ml es suficiente) equilibrada con 50 mM HEPES pH 7,2200 mM NaCl. Usando un gradiente en etapas de 10, 40 y 100 mM imidazol, retirar por lavado la proteína unida de forma no específica y eluir la proteína de fusión con 200 mM imidazol. La proteína de fusión eluida se dializa frente a 5 L de 50 mM HEPES pH 7,2 200 mM NaCl a 4°C toda la noche y la DO280 nm se mide para establecer la concentración de proteína. Añadir 3,2 pl de enteroquinasa (New England Biolabs) por mg de proteína de fusión e incubar en estático toda la noche a 25°C. Cargar en una columna quelante cargada con 0,1 M NiSO4 (una columna de 20-30 ml es suficiente) equilibrada con 50 mM HEPES pH 7,2200 mM NaCl. Lavar la columna hasta la línea base con 50 mM HEPES pH 7,2200 mM NaCl. Usando un gradiente en etapas de 10, 40 y 100 mM imidazol, retirar por lavado la proteína unida de forma no específica y eluir la proteína de fusión con 200 mM imidazol. Dializar la proteína de fusión eluida frente a 5 L de 50 mM HEPEs pH 7,2 150 mM NaCl a 4°C toda la noche y concentrar la fusión hasta aproximadamente 2 mg/ml, alicuotar en muestras y congelar a -20°C. Ensayar la proteína purificada usando DO280, BCA y análisis de pureza.
Ejemplo 6 Conjugación química de LHn/A a TM GnRH
El procedimiento siguiente crea una molécula conjugada químicamente que contiene la secuencia de aminoácidos de LHn/A (SEQ ID11), preparada a partir de SEQ 1D1 usando el método de producción indicado en el ejemplo 3, y un péptido de GnRH que se ha sintetizado químicamente (SEQ ID15). Sin embargo, los procedimientos y métodos son igualmente aplicables para la conjugación de otros péptidos a otras proteínas con dominio proteasa/de translocación tales como las que contienen las secuencias de aminoácidos SEQ lD12, 13 y 14.
La proteína LHn/A se sometió a un intercambio de tampón de 50 mM Hepes 150 mM sal a PBSE (100 mM 14,2 g NA2HPO4, 100 mM 5,85 g NaCl, 1 mM EDTANa2 pH 7,5 con 1M HCl) usando la columna Bio-rad PD10. Esto se hizo lavando un volumen de columna de PBSE a través de la columna PD10, la proteína se añadió entonces a la columna hasta que no salieron más gotas del final de la columna PD10. Se añadieron entonces 8 mls de PBSE y se recogieron fracciones de 0,5 ml. Las fracciones recogidas se miden usando la lectura A280 y las fracciones que contienen proteína se combinan. Se obtuvo una concentración de 1,55 mg/ml de LHn/A de la etapa de intercambio de tampón y esto se usó para establecer las reacciones siguientes:
Figure imgf000041_0001
La muestra se dejó voltear a RT durante 3 horas antes de pasarla a través de otra columna PD10 para intercambiar el tampón a PBSE y las fracciones que contenían proteína se combinaron. Se añadió entonces una concentración final de 25 mM DTT a proteína derivatizada y entonces las muestras se dejaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se tomaron entonces las lecturas a A280 y A343 para descubrir la relación de la interacción SPDP:LHn/A y la reacción que resultó en una relación de derivatización de entre 1 y 3 se usó para la conjugación del péptido. El reactivo SPDP se une a las aminas primarias del LHn/A a través de un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), dejando la parte reactiva sulfhidrilo para formar un enlace disulfuro con el grupo SH libre en la cisteína libre en el péptido sintetizado.
En este caso, la secuencia del péptido es GnRH que se ha sintetizado con una cisteína contenida en el péptido para permitir la conjugación mientras se deja que el extremo N y el extremo C del GnRH interaccionen con su receptor (SEQ ID15). El LHn/A derivatizado con SPDP se mezcló con un exceso de 4 veces del ligando GnRH y la reacción se dejó entonces a RT durante 90 minutos mientras se volteaba. El exceso de GnRH se retiró entonces usando una columna PD10 dejando la molécula conjugada LHNA-GnRH.
Ejemplo 7 - Método para tratar cáncer colorrectal
Un hombre de 62 años de edad se presenta con un cáncer colorrectal en estadio II. Para reducir y/o para prevenir metástasis recibe una inyección directa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, proteasa de neurotoxina botulínica tipo A y dominio de translocación y un péptido VIP). En 4 semanas, se observa un encogimiento significativo del tumor sin la aparición de metástasis en otro lugar. El tratamiento se realiza opcionalmente en combinación con quimioterapia, y se repite 2 meses después y 4 semanas después ya no es observable tumor con las herramientas de detección habituales (colonoscopia, escaneo CT, escaneo PET, etc.) y el nivel de antígeno carcinoembrionario (CEA) volvió al nivel normal.
Ejemplo 8 - Método para tratar cáncer de mama
Una mujer de 61 años de edad se presenta con un cáncer de mama en estadio II. Para tratar y/o prevenir metástasis recibe una inyección IV de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo C, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C y un péptido GnRH), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En 4 semanas, se observa un encogimiento significativo del tumor sin la aparición de metástasis en otro lugar. El tratamiento se repite 2 meses después y 6 semanas después ya no es observable tumor con las herramientas de detección habituales (MRI, ultrasonidos, tomografía de emisión de positrones específica de mama, mamografía, escintigrafía, etc).
Ejemplo 9 - Método para tratar cáncer de próstata
Un hombre de 77 años de edad se presenta con un cáncer de próstata en estadio II. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo C, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C y un péptido de IGF-1), opcionalmente en combinación con terapia hormonal. En 4 semanas, se observa un encogimiento significativo del tumor sin la aparición de metástasis en otro lugar. El tratamiento se repite 2 meses después y 8 semanas después ya no es observable tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, escaneo ProstaScint, m R i, ultrasonografía transrectal, escaneo CT, etc.) y los niveles de PSA volvieron al nivel normal.
Ejemplo 10 - Método para tratar tumores carcinoides de pulmón
Una mujer de 66 años de edad se presenta con tumores carcinoides de pulmón. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección IV de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo A, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo A y un péptido de bFGF-1), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En 4 semanas, se observa una disminución significativa del tamaño del tumor sin la aparición de metástasis en otro lugar. El tratamiento se repite 1 mes después y 4 semanas después ya no es observable tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, escaneo CT, broncoscopia, etc.) o usando los ensayos de sangre habituales recomendados para este cáncer.
Ejemplo 11 - Método para tratar cáncer de vejiga
Un hombre de 56 años de edad se presenta con un cáncer de vejiga en estadio II. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección directa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de IgA, un dominio de translocación de neurotoxina de tétano y un péptido de IGF-1), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En 2 semanas, se observa un encogimiento significativo del tumor sin la aparición de metástasis en otro lugar. El tratamiento se repite 2 meses después y 4 semanas después ya no es observable tumor con las herramientas de detección habituales (colonoscopia, escaneo CT, escaneo PET, etc.).
Ejemplo 12 - Método para tratar cáncer de pulmón de células pequeñas
Un hombre de 79 años de edad está diagnosticado con un cáncer de pulmón de células pequeñas en estadio I. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo A, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo A y un péptido de neuregulina ERBB3), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En 3 semanas, se observa una disminución significativa del tamaño del tumor sin la aparición de metástasis en otro lugar. El tratamiento se repite 2 meses después y 5 semanas después ya no es observable tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, escaneo CT, MRI, escaneo p Et , formación de imágenes con radionúclidos, broncoscopia, etc.) o usando los ensayos de sangre habituales recomendados para este cáncer.
Ejemplo 13 - Método para tratar cáncer de próstata
Un hombre de 72 años de edad está diagnosticado con un cáncer de próstata en estadio II. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C, un conector GS20, y un péptido de IGF-1), opcionalmente en combinación con tratamiento de privación de andrógenos. En 10 días, se observa un encogimiento significativo del tumor sin la aparición de metástasis en otro lugar. El tratamiento se repite 2 meses después y 5 semanas después ya no es observable tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, escaneo ProstaScint, MRI, ultrasonografía transrectal, escaneo CT, etc.) y los niveles de PSA volvieron al nivel normal.
Ejemplo 14 - Método para tratar cáncer de cuello uterino
Una mujer de 60 años de edad diagnosticada con cáncer de cuello uterino en un estadio limitado se trata con cirugía. Para mejorar los efectos del tratamiento y para prevenir metástasis recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo D, un conector GS20, y un péptido de somatostatina-14). En 6 semanas no se observa reaparición del tumor. El tratamiento se repite 3 meses después y 8 semanas después ya no es observable tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, escaneo CT, MRI, escaneo PET, formación de imágenes con radionúclidos, broncoscopia, etc.) o usando los ensayos de sangre habituales recomendados para este cáncer
Ejemplo 15 - Método para tratar leucemia
Un hombre de 42 años de edad está diagnosticado con un cáncer de leucemia de células pilosas en estadio II. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo D, un conector GS20, y un péptido de FGF-1), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En 10 días, se observa una reducción significativa en la carga tumoral sin la aparición de metástasis. El tratamiento se repite 1 mes después y 3 semanas después ya no es observable tumor con las herramientas de detección habituales (MRI, recuento de sangre completo, etc).
Ejemplo 16 - Método para tratar cáncer de pulmón de células pequeñas
Un hombre de 56 años de edad está diagnosticado con un cáncer de pulmón de células pequeñas en un estadio extensivo. Para tratar y/o para prevenir metástasis en otro lugar recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C, y un péptido de EGF), opcionalmente en combinación con quimioterapia y terapia de radiación. En 3 semanas, se observa un encogimiento significativo del tumor y una disminución del tamaño de las metástasis sin la aparición de nuevas metástasis en otro lugar. El tratamiento se repite dos veces después de 2 meses y 5 meses. Los pacientes murieron 11 meses después, 6 meses después de lo esperado con este tipo de tratamiento y este estadio de la enfermedad.
Ejemplo 17 - Método para tratar cáncer pancreático
Una mujer de 48 años de edad está diagnosticada con cáncer pancreático en un estadio avanzado. Recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C, y un péptido de EGF), opcionalmente en combinación con el agente quimioterapéutico, Gemcitabina. En 3 semanas, se observa una reducción significativa del crecimiento del tumor primario y una disminución en el tamaño de las metástasis sin la aparición de nuevas metástasis en otro lugar. El tratamiento se repite dos veces después de 2 meses y 5 meses. El paciente murió 12 meses después, 6 meses después de lo esperado con este tipo de tratamiento y este estadio de la enfermedad.
Ejemplo 18 - Método para tratar cáncer óseo metastásico
Un hombre de 71 años de edad está diagnosticado con un cáncer de próstata en estadio IV. Para tratar el crecimiento metastásico en su hueso recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo D, y un péptido de TGF-beta), opcionalmente en combinación con radiación de haz externa más terapia hormonal. En 4 semanas, se observa un encogimiento significativo del tumor en los sitios metastásicos sin la aparición de metástasis en otro lugar. El tratamiento se repite 2 y 4 meses después. Después de 6 meses, ya no es observable un incremento detectable en la carga tumoral con las herramientas de detección habituales (rayos X, escaneo ProstaScint, MRI, escaneo CT, etc.).
Ejemplo 19 - Método para tratar cáncer de pulmón de células pequeñas metastásico en el cerebro
Un hombre de 65 años de edad diagnosticado con un cáncer de pulmón de células pequeñas en un estadio avanzado también presenta múltiples metástasis en el cerebro. Para tratar, un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo A, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo A, y un péptido de SDF-1) se administra en su cerebro por administración potenciada por convección, opcionalmente en combinación con quimioterapia y radiación de cerebro completo. En 4 semanas, se observa un encogimiento significativo de los sitios tumorales metastásicos sin la aparición de metástasis en otro lugar. El tratamiento se repite a los 2 meses y 8 semanas después ya no es observable tumor metastásico con las herramientas de detección habituales (rayos X, escaneo CT, MRI, escaneo PET, formación de imágenes con radionúclidos, etc.) o usando los ensayos de sangre habituales recomendados para este cáncer.
Ejemplo 20 - Método para tratar cáncer de intestino
Un hombre de 76 años de edad está diagnosticado con un cáncer de intestino delgado en estadio II. Para tratar y/o para prevenir metástasis recibe una inyección directa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa y dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo A y un péptido EGF), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En 4 semanas, se observa un encogimiento significativo del tumor sin la aparición de metástasis en otro lugar y se lleva a cabo entonces cirugía para eliminar el tumor.
Ejemplo 21 - Método para tratar leucemia linfocítica crónica
Un hombre de 54 años de edad está diagnosticado con leucemia linfocítica crónica con recidiva. Para tratar, recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo B, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo B, y un péptido de LIF-1), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En 2 semanas, se observa una reducción significativa del recuento de células tumorales en la sangre del paciente que permanece estable durante un periodo de tiempo prolongado como se determina por examen microscópico y análisis de citometría de flujo de la sangre del paciente.
Ejemplo 22 - Método para tratar cáncer de hígado
Una mujer de 55 años de edad está diagnosticada con un cáncer hepático en estadio IV. Para tratar, recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo D, y un péptido de TGF-alfa), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En 2 semanas, se observa un encogimiento significativo del tumor en estadios de formación de imágenes PET-CT junto con una reducción alfa-fetoproteína en la sangre, que estaba elevado antes del tratamiento.
Ejemplo 23 - Método para tratar linfoma de Hodgkin
Un hombre de 24 años de edad está diagnosticado con linfoma de Hodgkin en estadio IVA. Para tratar, recibe inyecciones intravenosas repetidas de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo B, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo B, y un péptido de VEGF), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En 2 semanas, se observa una reducción significativa del volumen tumoral y flujo de sangre en el tumor usando las herramientas de detección habituales (MRI, escaneos CT) y da lugar a remisión completa en 2 meses.
Ejemplo 24 - Método para tratar cáncer renal
Un hombre de 54 años de edad está diagnosticado con carcinoma de células renales avanzado. Para tratar, recibe una administración intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo A, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C, y un péptido de VEGF), opcionalmente en combinación con el terapéutico anti-angiogénico, Sunitinib, un inhibidor de tirosina quinasa (TKI) que es una molécula pequeña. En 14 días, se observa un encogimiento significativo del tumor sobre y por encima de lo esperado con TKI solo usando las herramientas de detección habituales (CT, escaneos MRI, ensayos de sangre).
Ejemplo 25 - Método para tratar cáncer de piel
Una mujer de 31 años de edad está diagnosticada con un melanoma facial. Para tratar, recibe administración directa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C, un conector GS20, y un péptido de VEGF), opcionalmente en combinación con quimioterapia e inmunoterapia. En 21 días, se observa un encogimiento significativo del tumor sobre y por encima de lo esperado con quimio e inmunoterapia solo, permitiendo la resección quirúrgica con márgenes claros pero muy reducidos.
Ejemplo 26 - Método para tratar cáncer orofaríngeo
Un hombre de 63 años de edad está diagnosticado con un cáncer de cabeza y cuello en estadio III. Para tratar, recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo D, y un péptido de TGF-alfa), opcionalmente en combinación con radioterapia y quimioterapia. En 4 semanas, es aparente una mejoría significativa en la capacidad del paciente de tragar alimento que se mantiene durante más tiempo de lo que se esperaría con la terapia de combinación sola.
Ejemplo 27 - Método para tratar cáncer de mieloma
Una mujer de 73 años de edad diagnosticada con lesiones óseas osteolíticas asociadas con mieloma múltiple e hipercalcemia se trata con la quimioterapia estándar. Para mejorar los efectos de los tratamientos recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C, y un péptido de IL-6). En 4 semanas, se observa una reducción significativa del tamaño de las lesiones óseas y gravedad de hipercalcemia sin la aparición de lesiones nuevas en otro lugar usando las herramientas de detección habituales (MRI, rayos X, ensayos de sangre).
Ejemplo 28 - Método para tratar cáncer de sarcoma de tejido blando
Una mujer de 51 años de edad diagnosticada con un fibrosarcoma de la pierna se trata con terapia de radiación en un intento de reducir el tamaño tumoral antes de la resección quirúrgica. Para mejorar los efectos del tratamiento con radiación recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C, un conector GS20, y un péptido de bFGF). En 14 días, se observa un encogimiento significativo del tumor sobre y por encima de lo esperado con la terapia de radiación sola, permitiendo la resección quirúrgica con márgenes claros.
Ejemplo 29 - Método para tratar cáncer gástrico
Un hombre de 84 años de edad diagnosticado con cáncer gástrico avanzado y que no puede ser sometido a resección quirúrgica se trata con terapia de radiación para mitigar el bloqueo asociado al tumor. Para mejorar los efectos del tratamiento recibe múltiples inyecciones directas de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo A, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo A, un conector GS20, y un péptido de GRP). En 5 días, se observa un encogimiento significativo del tumor con las herramientas de detección habituales (examen gastroscópico y escaneo CT). El tratamiento se repite 1 mes después y 4 meses después el bloqueo del tumor no ha recurrido.
Ejemplo 30 - Método para tratar cáncer testicular
Un hombre de 32 años de edad está diagnosticado con un cáncer de seminoma en estadio I. Para tratar y/o para prevenir recurrencia recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo D, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C, un conector GS20, y un péptido VEGF), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En 14 días, se observa un encogimiento significativo del tumor. El tratamiento se repite 1 mes después y 6 semanas después ya no es observable el tumor con las herramientas de detección habituales (ensayos de sangre y escaneos CT).
Ejemplo 31 - Método para tratar cáncer uterino
Una mujer de 76 años de edad diagnosticada con un cáncer endometrial en estadio IIA se trata con quimioterapia y radioterapia habituales. Para mejorar los efectos del tratamiento y para prevenir metástasis recibe una inyección directa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa y un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo A y un péptido de EGF). En 6 semanas, se observa un encogimiento significativo del tumor en visualización directa de la cavidad uterina por histeroscopia sin la aparición de metástasis en otro lugar.
Ejemplo 32 - Método para tratar sarcoma de Karposi
Un hombre de 48 años de edad está diagnosticado con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y se presenta con múltiples lesiones de sarcoma de Karposi. Para tratar, recibe una inyección intravenosa de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo A, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo A, y un péptido de IL-6), opcionalmente en combinación con interferón alfa. En 3 semanas, se observa una reducción significativa del tamaño de la lesión sin la aparición de lesiones nuevas en otro lugar. El tratamiento se repite dos veces después de 1 mes y 3 meses lo que detiene efectivamente la progresión del sarcoma de Kaposi.
Ejemplo 33 - Método para tratar cáncer de cerebro primario
Una mujer de 45 años de edad está diagnosticada con glioblastoma. Para tratar y/o para prevenir metástasis adicionales recibe una aplicación intracraneal de un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo C, un dominio de translocación de neurotoxina botulínica tipo C, y un péptido de VEGF), opcionalmente en combinación con quimioterapia. En 4 semanas, se observa una disminución significativa del tamaño del tumor sin la aparición de metástasis en otro lugar. El tratamiento se repite 1 mes después y 4 semanas después ya no es observable el tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, escaneo Ct , etc.).
Ejemplo 34 - Método para tratar cáncer rectal
Un hombre de 77 años de edad diagnosticado con un cáncer rectal en estadio II se trata con un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, una proteasa de neurotoxina botulínica tipo A y un fragmento F(ab)'2 de anticuerpo anti-EGFR), opcionalmente en combinación con radioterapia y cirugía. Recibe inyecciones localizadas de polipéptido (por ejemplo, 3 días antes de un régimen estándar de radiación fraccionada) y en 2 semanas, se observa un encogimiento significativo del tumor lo que permite la resección quirúrgica completa. 12 meses después no es observable recurrencia del tumor con las herramientas de detección habituales (colonoscopia, escaneo CT, escaneo PET, etc.) y el nivel de antígeno carcinoembrionario (CEA) volvió al nivel normal.
Ejemplo 35 - Evaluación de cambios en la proliferación, inhibición de secreción celular y escisión concomitante de SNARE después de tratamiento de líneas celulares de cáncer renal cultivadas in vitro con un polipéptido de la presente invención.
Métodos:
Análisis de proliferación:
Un volumen apropiado que contiene 1.000 células de una línea celular de cáncer renal adecuada, por ejemplo, A498, ACHN ó 786-0, se siembra en los pocillos de una placa de cultivo celular de 96 pocillos en un medio de crecimiento adecuado suplementado con 10% Suero Fetal Bovino y se incuba a 37°C en una atmósfera humidificada con 5% CO2. Se deja que las células se adhieran toda la noche después de lo cual se inicia el tratamiento con una molécula LHA con ligando EGF, tal como una molécula LHA con un ligando EGF presentado en C-terminal. Después de 24 horas, el medio de tratamiento se retira, las monocapas de células se lavan para eliminar trazas de LHA-EGf y se aplica medio fresco a las células. Después de 24 horas más, se realiza un ensayo colorimétrico convencional (basado en la determinación de la escisión de la sal de tetrazolio WST-1 a formazán por enzimas celulares). Específicamente, se añade WST-1 al medio de cultivo durante 4 horas después de lo cual se determina la densidad óptica a 440 nm para cada tratamiento. Las Figuras 50-52 demuestran la inhibición de la proliferación in vitro de una línea de carcinoma de células renales por una fusión EGF-LHA.
Análisis de secreción celular:
Se siembran 10.000 células de una línea celular de cáncer renal adecuada (por ejemplo 786-0, A498 o ACHN) en los pocillos de una placa de 24 pocillos en un medio de cultivo apropiado que contiene 10% suero fetal bovino. Las placas se incuban toda la noche en un incubador a 37°C en una atmósfera humidificada con 5% CO2 para permitir que las células se adhieran. Los cultivos celulares se tratan entonces con un polipéptido apropiado de la presente invención que está dirigido a un receptor específico en las células de interés (para las líneas celulares detalladas anteriormente una molécula apropiada sería un LHA con ligando EGF ya que estas 3 líneas celulares expresan todas receptores de EGF, Figura 48). Después de 24 horas, el medio de tratamiento se retira, las monocapas de células se vuelven a alimentar con medio de cultivo fresco y 24-48 horas después se retiran muestras del medio de cultivo a tubos de microfuga frescos que se centrifugan posteriormente a 1.500 rpm durante 5 minutos para retirar las células que flotan. Los sobrenadantes resultantes se retiran a tubos frescos y se usan entonces alicuotas para la cuantificación de analitos específicos (por ejemplo, VEGF, TNF-alfa) por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima o ELISA (Figura 53). Un ejemplo de análisis de inhibición de una secreción (GRP) de una línea celular de carcinoma de pulmón de células pequeñas se proporciona en la Figura 54.
Análisis de transferencia Western para detectar escisión de SNARE debida a la captación celular de polipéptidos de la presente invención:
Los cultivos celulares se tratan con polipéptidos como se ha detallado anteriormente para el análisis de secreciones celulares. Después de la retirada de medio de cultivo para análisis por ELISA posterior, las monocapas de células en cada pocillo se lavan tres veces con disolución salina tamponada con fosfato y se preparan extractos de proteínas por lisis celular en tampón de muestra Laemmli estándar. Las proteínas celulares se separan en geles de SDS-poliacrilamida al 12% y se trasfieren electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear la membrana, se usan antisueros primarios para ensayar la proteína SNARE de interés y la detección de formas de longitud completa y/o escindidas se permite por una IgG anti-especie conjugada con peroxidasa. En el caso de tratamiento de la línea celular renal 786-0 con una molécula LHA-EGF, se observa la escisión de SNARE SNAP-25 (véase la Figura 49).
SEQ ID NOs
1. Secuencia de ADN de LHn/A
ggatccATGGAGTTCGTTAACAAACAGTTCAACTATAAAGACCCAGTTAACGGTGTTGACATTGCTTAC ATCAAAATCCCGAACGCTGGCCAGATGCAGCCGGTAAAGGCATTCAAAATCCACAACAAAATCTGGGTT ATCCCGGAACGTGATACCTTTACTAACCCGGAAGAAGGTGACCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAACAG GTGCCGGTATCTTACTATGACTCCACCTACCTGTCTACCGATAACGAAAAGGACAACTACCTGAAAGGT GTTACTAAACTGTTCGAGCGTATTTACTCCACCGACCTGGGCCGTATGCTGCTGACTAGCATCGTTCGC GGTATCCCGTTCTGGGGCGGTTCTACCATC GATACCGAACT GAAAGTAAT CGACACTAACT GCATCAAC GTTATTCAGCCGGACGGTTCCTATCGTTCCGAAGAACTGAACCTGGTGATCATCGGCCCGTCTGCTGAT ATCATCCAGTTCGAGTGTCTGAGCTTTGGTCACGAAGTTCTGAACCTCACCCGTAACGGCTACGGTTCC ACTCAGTACATCCGTTTCTCTCCGGACTTCACCTTCGGTTTTGAAGAATCCCTGGAAGTAGACACGAAC CCACTGCTGGGCGCTGGTAAATTCGCAACTGATCCTGCGGTTACCCTGGCTCACGAACTGATTCATGCA GGCCACCGCCTGTACGGTATCGCCATCAATCCGAACCGTGTCTTCAAAGTTAACACCAACGCGTATTAC GAGATGTCCGGTCTGGAAGTTAGCTTCGAAGAACTGCGTACTTTTGGCGGTCACGACGCTAAATTCATC GACTCTCTGCAAGAAAACGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAGTTCAAAGATATCGCATCCACCCTG AACAAAGCGAAATCCATCGTGGGTACCACT GCTT CTCTCCAGTACATGAAGAACGTTTTTAAAGAAAAA TACCTGCTCAGC GAAGACACCTC CGGCAAATTCT CTGTAGACAAGTTGAAATTCGATAAACTT TACAAA ATGCTGACTGAAATTTACACCGAAGACAACTTCGTTAAGTTCTTTAAAGTTCTGAACCGCAAAACCTAT CTGAACTTCGACAAGGCAGTATTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTTAACTACACTAT CTACGATGGT TTCAACCTGCGTAACACCAAC CT GGCTGCTAATTTTAACGGCCAGAACAC GGAAATCAACAACATGAAC TTCACAAAACTGAAAAACTTCACTGGTCTGTTCGAGTTTTACAAGCTGCTGTGCGTCGACGGCATCATT ACCTCCAAAACTAAATCTGACGATGACGATAAAAACAAAGCGCTGAACCTGCAGTGTATCAAGGTTAAC AACTGGGATTTATTCTTCAGCCC GAGTGAAGACAACTTCACCAACGACCT GAACAAAGGTGAAGAAATC ACCTCAGATACTAACATCGAAGCAGCCGAAGAAAACATCTCGCTGGACCTGATCCAGCAGTACTACCTG ACCTTTAATTTC GACAACGAGCC GGAAAACATTT CTATCGAAAACCTGAGCT CTGATAT CATCGGCCAG CTGGAACTGATGCCGAACATCGAACGTTTCCCAAACGGTAAAAAGTACGAGCTGGACAAATATACCATG TTCCACTACCTGCGCGCGCAGGAATTTGAACACGGCAAATCCCGTATCGCACTGACTAACTCCGTTAAC GAAGCTCTGCTCAACCCGTCCCGTGTATACACCTTCTTCTCTAGCGACTACGTGAAAAAGGTCAACAAA GCGACTGAAGCTGCAATGTTCTTGGGTTGGGTTGAACAGCTTGTTTATGATTTTACCGACGAGACGTCC GAAGTATCTACTAC CGACAAAATTGCGGATAT CACTATCAT CATCCCGTACATCGGTCC GGCTCTGAAC ATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGACTTCGTTGGCGCACTGATCTTCTCCGGTGCGGTGATCCTGCTG GAGTTCATCCCGGAAATCGCCATCCCGGTACTGGGCACCTTTGCTCTGGTTTCTTACATTGCAAACAAG GTTCTGACTGTACAAACCATCGACAACGCGCTGAGCAAACGTAACGAAAAATGGGATGAAGTT TACAAA TATATCGTGACCAACTGGCTGGCTAAGGTTAATACTCAGATCGACCTCATCCGCAAAAAAATGAAAGAA GCACTGGAAAACCAGGCGGAAGCTACCAAGGCAATCATTAACTACCAGTACAACCAGTACACCGAGGAA GAAAAAAACAACATCAACTTCAACATCGACGATCTGTCCTCTAAACTGAACGAATCCATCAACAAAGCT ATGATCAACATCAACAAGTTCCTGAACCAGTGCTCTGTAAGCTATCTGATGAACTCCATGATCCCGTAC GGTGTTAAACGTCTGGAGGACTTCGATGCGTCTCTGAAAGACGCCCTGCTGAAATACATTTACGACAAC CGTGGCACTCTGATCGGTCAGGTTGATCGTCTGAAGGACAAAGTGAACAATACCTTATCGACCGACATC CCTTTTCAGCTCAGTAAATATGTCGATAACCAACGCCTTTTGTCCACTctagaataatgaaagctt . Secuencia de ADN de LHn/B
GGATCCATGCCGGTTACCATCAACAACTTCAACTACAACGACCCGATCGACAACAACAACATCATTATG ATGGAACCGCCGTTCGCACGTGGTACCGGACGTTACTACAAGGCTTTTAAGATCACCGACCGTATCTGG ATCATCCCGGAACGTTACACCTTCGGTTACAAACCTGAGGACTTCAACAAGAGTAGCGGGATTTTCAAT CGTGACGTCTGC GAGTACTAT GATCCAGATTATCTGAATAC CAACGATAAGAAGAACATATTC CTTCAG ACTATGATTAAACTCTTCAACCGTATCAAAAGCAAACCGCTCGGTGAAAAACTCCTCGAAATGATTATC AACGGTATCCCGTACCTCGGTGACCGTCGTGTCCCGCTTGAAGAGTTCAACACCAACATCGCAAGCGTC ACCGTCAACAAACTCATCAGCAACCCAGGTGAAGTCGAACGTAAAAAAGGTATCTTCGCAAACCTCATC ATCTTCGGTCCGGGTCCGGTCCTCAACGAAAACGAAACCATCGACATCGGTATCCAGAACCACTTCGCA AGCCGTGAAGGTTTCGGTGGTATCATGCAGATGAAATTCTGCCCGGAATACGTCAGTGTCTTCAACAAC GTCCAGGAAAACAAAGGTGCAAGCATCTTCAACCGTCGTGGTTACTTCAGCGACCCGGCACTCATCCTC ATGCATGAACTCATCCACGTCCTCCACGGTCTCTACGGTATCAAAGTTGACGACCTCCCGATCGTCCCG AACGAGAAGAAATTCTTCATGCAGAGCACCGACGCAATCCAGGCTGAGGAACTCTACACCTTCGGTGGC CAAGAC CCAAGTAT CATAACC CC GTCCACC GACAAAAGCAT CTACGACAAAGTCCTC CAGAACTTCAG G GGTATCGTGGACAGACTCAACAAAGTCCTCGTCTGCATCAGCGACCCGAACATCAATATCAACATATAC AAGAACAAGTTCAAAGACAAGTACAAATTCGTCGAGGACAGCGAAGGCAAATACAGCATCGACGTAGAA AGTTTCGACAAGCTCTACAAAAGCCTCATGTTCGGTTTCACCGAAACCAACATCGCCGAGAACTACAAG ATCAAGACAAGGGCAAGTTACTTCAGCGACAGCCTCCCGCCTGTCAAAATCAAGAACCTCTTAGACAAC GAGATTTACACAATTGAAGAGGGCTTCAACATCAGTGACAAAGACATGGAGAAGGAATACAGAGGTCAG AACAAGGCTATCAACAAACAGGCATACGAGGAGATCAGCAAAGAACACCTCGCAGTCTACAAGATCCAG ATGTGCGTCGACGGCATCATTACCTCCAAAACTAAATCTGACGATGACGATAAAAACAAAGCGCTGAAC CTGCAGTGCATCGACGTTGACAACGAAGACCTGTTCTTCATCGCTGACAAAAACAGCTTCAGTGACGAC CTGAGCAAAAACGAACGTATCGAATACAACACCCAGAGCAACTACATCGAAAACGACTTCCCGATCAAC GAACTGATCCTGGACACCGACCTGATAAGTAAAATCGAACTGCCGAGCGAAAACACCGAAAGTCTGACC GACTTCAACGTTGACGTTCCGGTTTACGAAAAACAGCCGGCTATCAAGAAAATCTTCACCGACGAAAAC ACCATCTTCCAGTACCTGTACAGCCAGACCTTCCCGCTGGACATCCGTGACATCAGTCTGACCAGCAGT TTCGACGACGCTCTGCTGTTCAGCAACAAAGTTTACAGTTTCTTCAGCATGGACTACATCAAAACCGCT AACAAAGTTGTTGAAGCAGGGCTGTTCGCTGGTTGGGTTAAACAGATCGTTAACGACTTCGTTATCGAA GCTAACAAAAGCAACACTATGGACAAAATCGCTGACATCAGTCTGATCGTTCCGTACATCGGTCTGGCT CTGAACGTTGGTAACGAAACCGCTAAAGGTAACTTTGAAAACGCTTTCGAGATCGCTGGTGCAAGCATC CTGCTGGAGTTCATCCCGGAACTGCTGATCCCGGTTGTTGGTGCTTTCCTGCTGGAAAGTTACATCGAC AACAAAAACAAGATCATCAAAACCATCGACAACGCTCTGAC CAAACGTAACGAAAAATGGAGT GATATG TACGGTCTGATCGTTGCTCAGTGGCTGAGCACCGTCAACACCCAGTTCTACACCATCAAAGAAGGTATG TACAAAGCTCTGAACTACCAGGCTCAGGCTCTGGAAGAGATCATCAAATACCGTTACAACATCTACAGT GAGAAGGAAAAGAGTAACATCAACATCGACTTCAACGACATCAACAGCAAACTGAACGAAGGTATCAAC CAGGCTATCGACAACATCAACAACTTCATCAACGGTTGCAGTGTTAGCTACCTGATGAAGAAGATGATC CCGCTGGCTGTTGAAAAACTGCTGGACTTCGACAACACCCTGAAAAAGAACCTGCTGAACTACATCGAC GAAAACAAGCTGTACCTGATCGGTAGTGCTGAATACGAAAAAAGTAAAGTGAACAAATACCTGAAGACC ATCATGCCGTTCGACCTGAGTATCTACACCAACGACACCATCCTGATCGAAATGTTCAACAAATACAAC TCtctagaataatgaaagctt
. Secuencia de ADN de LHn/C
ggat ccATGCCGATCACCATCAACAACTTCAACTACAGCGATCCGGTGGATAACAAAAACATCCTGTAC CTGGATACCCATCTGAATACCCTGGCGAACGAACCGGAAAAAGCGTTTCGTATCACCGGCAACATTTGG GTTATTCCGGATCGTTTTAGCCGTAACAGCAACCCGAATCTGAATAAACCGCCGCGTGTTACCAGCCCG AAAAGCGGTTATTACGATCCGAACTATCTGAGCACCGATAGCGATAAAGATACCTTCCTGAAAGAAATC ATCAAACTGTTCAAACGCATCAACAGCCGTGAAATTGGCGAAGAACTGATCTATCGCCTGAGCACCGAT ATTCCGTTTCCGGGCAACAACAACACCCCGATCAACACCTTTGATTTCGATGTGGATTTCAACAGCGTT GATGTTAAAACCCGCCAGGGTAACAATTGGGTGAAAACCGGCAGCATTAACCCGAGCGTGATTATTACC GGTCCGCGCGAAAACATTATTGATCCGGAAACCAGCACCTTTAAACTGACCAACAACACCTTTGCGGCG CAGGAAGGTTTTGGCGCGCTGAGCATTATTAGCATTAGCCCGCGCTTTATGCTGACCTATAGCAACGCG ACCAACGATGTTGGTGAAGGCCGTTTCAGCAAAAGCGAATTTTGCATGGACCCGATCCTGATCCTGATG CATGAACTGAACCATGCGATGCATAACCTGTATGGCATCGCGATTCCGAACGATCAGACCATTAGCAGC GTGACCAGCAACATCTTTTACAGCCAGTACAACGTGAAACTGGAATATGCGGAAATCTATGCGTTTGGC GGTCCGACCATTGATCTGATTCCGAAAAGCGCGCGCAAATACTTCGAAGAAAAAGCGCTGGATTACTAT CGCAGCATTGCGAAACGTCTGAACAGCATTACCACCGCGAATCCGAGCAGCTTCAACAAATATATCGGC GAATATAAACAGAAACTGATCCGCAAATATCGCTTTGTGGTGGAAAGCAGCGGCGAAGTTACCGTTAAC CGCAATAAATTCGT GGAACTGTACAACGAACT GACCCAGAT CTTCACCGAATTTAACTATGCGAAAAT C TATAACGTGCAGAACCGTAAAATCTACCTGAGCAACGTGTATACCCCGGTGACCGCGAATATTCTGGAT GATAACGTGTACGATATCCAGAACGGCTTTAACATCCCGAAAAGCAACCTGAACGTTCTGTTTATGGGC CAGAACCTGAGCCGTAATCCGGCGCTGCGTAAAGTGAACCCGGAAAACATGCTGTACCTGTTCACCAAA
TTTTGCGTCGACGCGATTGATGGTCGTAGCCTGTACAACAAAACCCTGCAGTGTCGTGAACTGCTGGTG AAAAACACCGATCTGCCGTTTATTGGCGATATCAGCGATGTGAAAACCGATATCTTCCTGCGCAAAGAT ATCAACGAAGAAACCGAAGTGATCTACTACCCGGATAACGTGAGCGTTGATCAGGTGATCCTGAGCAAA AACAC CAGCGAACATGGTCAGCTGGATCTGCT GTATCCGAGCATTGATAGCGAAAGCGAAATT CTGCC G GGCGAAAACCAGGTGTTTTACGATAACCGTACCCAGAACGTGGATTACCTGAACAGCTATTACTACCTG GAAAGCCAGAAACTGAGCGATAACGTGGAAGATTTTACCTTTACCCGCAGCATTGAAGAAGCGCTGGAT AACAGCGCGAAAGTTTACACCTATTTTCCGACCCTGGCGAACAAAGTTAATGCGGGTGTTCAGGGCGGT CTGTTTCTGATGTGGGCGAACGATGTGGTGGAAGATTTCACCACCAACATCCTGCGTAAAGATACCCTG GATAAAATCAGC GATGTTAGCGC GATTATT CCGTATATTGGTCCGGCGCT GAACATTAGCAATAGCGT G CGTCGTGGCAATTTTACCGAAGCGTTTGCGGTTACCGGTGTGACCATTCTGCTGGAAGCGTTTCCGGAA TTTACCATTCCGGCGCTGGGTGCGTTTGTGATCTATAGCAAAGTGCAGGAACGCAACGAAATCATCAAA ACCATCGATAACTGCCTGGAACAGCGTATTAAACGCTGGAAAGATAGCTATGAATGGATGATGGGCACC TGGCTGAGCCGTATTATCACCCAGTTCAACAACATCAGCTACCAGATGTACGATAGCCTGAACTATCAG GCGGGTGCGATTAAAGCGAAAATCGATCTGGAATACAAAAAATACAGCGGCAGCGATAAAGAAAACATC AAAAGCCAGGTTGAAAACCTGAAAAACAGCCTGGATGTGAAAATTAGCGAAGCGATGAATAACATCAAC AAATTCATCCGCGAATGCAGCGTGACCTACCTGTTCAAAAACATGCTGCCGAAAGTGATCGATGAACTG AACGAATTTGAT CGCAACACCAAAGCGAAACT GATCAACCTGATCGATAGCCACAACATTATT CTGGT G GGCGAAGTGGATAAACTGAAAGCGAAAGTTAACAACAGCTTCCAGAACACCATCCCGTTTAACATCTTC AGCTATAC CAACAACAGCCTGCT GAAAGATAT CATCAAC GAATACTTCAAt ctagaataatgaaagctt . Secuencia de ADN de LHn/D
ggatccATGACGTGGCCAGTTAAGGATTTCAACTACTCAGATCCTGTAAATGACAACGATATTCTGTAC CTTCGCATTCCACAAAATAAACTGATCACCACACCAGTCAAAGCATTCATGATTACTCAAAACATTTGG GTCATTCCAGAACGCTTTTCTAGTGACACAAATCCGAGTTTATCTAAACCTCCGCGTCCGACGTCCAAA TATCAGAGCTATTACGATCCCTCATATCTCAGTACGGACGAACAAAAAGATACTTTCCTTAAAGGTATC ATTAAACTGTTTAAGCGTATTAATGAGCGCGATATCGGGAAAAAGTTGATTAATTATCTTGTTGTGGGT TCCCCGTTCATGGGCGATAGCTCTACCCCCGAAGACACTTTTGATTTTACCCGTCATACGACAAACATC GCGGTAGAGAAGTTTGAGAACGGATCGTGGAAAGTCACAAACATCATTACACCTAGCGTCTTAATTTTT GGTCCGCTGCCAAACATCTTAGATTATACAGCCAGCCTGACTTTGCAGGGGCAACAGTCGAATCCGAGT TTCGAAGGTTTTGGTACCCTGAGCATTCTGAAAGTTGCCCCGGAATTTCTGCTCACTTTTTCAGATGTC ACCAGCAACCAGAGCTCAGCAGTATTAGGAAAGTCAATTTTTTGCATGGACCCGGTTATTGCACTGATG CACGAACTGACGCACTCTCTGCATCAACTGTATGGGATCAACATCCCCAGTGACAAACGTATTCGTCCC CAGGTGTCTGAAGGATTTTTCTCACAGGATGGGCCGAACGTCCAGTTCGAAGAGTTGTATACTTTCGGA GGCCTGGACGTAGAGATCATTCCCCAGATTGAGCGCAGTCAGCTGCGTGAGAAGGCATTGGGCCATTAT AAGGATATTGCAAAACGCCTGAATAACATTAACAAAACGATTCCATCTTCGTGGATCTCGAATATTGAT AAATATAAGAAAATTTTTAGCGAGAAATATAATTTTGATAAAGATAATACAGGTAACTTTGTGGTTAAC ATTGACAAATTCAACTCCCTTTACAGTGATTTGACGAATGTAATGAGCGAAGTTGTGTATAGTTCCCAA TACAACGTTAAGAATCGTACCCATTACTTCTCTCGTCACTACCTGCCGGTTTTCGCGAACATCCTTGAC GATAATATTTACACTATTCGTGACGGCTTTAACTTGACCAACAAGGGCTTCAATATTGAAAATTCAGGC CAGAACATTGAACGCAACCCGGCCTTGCAGAAACTGTCGAGTGAATCCGTGGTTGACCTGTTTACCAAA GTCTGCGTCGACAAAAGCGAAGAGAAGCTGTACGATGACGATGACAAAGATCGTTGGGGATCGTCCCTG CAGTGTATTAAAGTGAAAAACAATCGGCTGCCTTATGTAGCAGATAAAGATAGCATTAGTCAGGAGATT TTCGAAAATAAAATTATCACTGACGAAACCAATGTTCAGAATTATTCAGATAAATTTTCACTGGACGAA AGCATCTTAGATGGCCAAGTTCCGATTAACCCGGAAATTGTTGATCCGTTACTGCCGAACGTGAATATG GAACCGTTAAACCTCCCTGGCGAAGAGATCGTATTTTATGATGACATTACGAAATATGTGGACTACCTT AATTCTTATTACTATTTGGAAAGCCAGAAACTGTCCAATAACGTGGAAAACATTACTCTGACCACAAGC GTGGAAGAGGCTTTAGGCTACTCAAATAAGATTTATACCTTCCTCCCGTCGCTGGCGGAAAAAGTAAAT AAAGGTGTGCAGGCTGGTCTGTTCCTCAACTGGGCGAATGAAGTTGTCGAAGACTTTACCACGAATATT ATGAAAAAGGATACCCTGGATAAAATCTCCGACGTCTCGGTTATTATCCCATATATTGGCCCTGCGTTA AATATCGGTAATAGTGCGCTGCGGGGGAATTTTAACCAGGCCTTTGCTACCGCGGGCGTCGCGTTCCTC CTGGAGGGCTTTCCTGAATTTACTATCCCGGCGCTCGGTGTTTTTACATTTTACTCTTCCATCCAGGAG CGTGAGAAAATTATCAAAACCATCGAAAACTGCCTGGAGCAGCGGGTGAAACGCTGGAAAGATTCTTAT CAATGGATGGTGTCAAACTGGTTATCTCGCATCACGACCCAATTCAACCATATTAATTACCAGATGTAT GATAGTCTGTCGTACCAAGCTGACGCCATTAAAGCCAAAATTGATCTGGAATATAAAAAGTACTCTGGT AGCGATAAGGAGAACATCAAAAGCCAGGTGGAGAACCTTAAGAATAGTCTGGATGTGAAAATCTCTGAA GCTATGAATAACATTAACAAATTCATTCGTGAATGTTCGGTGACGTACCTGTTCAAGAATATGCTGCCA AAAGTTATTGATGAACTGAATAAATTTGATCTGCGTACCAAAACCGAACTTATCAACCTCATCGACTCC CACAACATTATCCTTGTGGGCGAAGTGGATCGTCTGAAGGCCAAAGTAAACGAGAGCTTTGAAAATACG ATGCCGTTTAATATTTTTTCATATACCAATAACTCCTTGCTGAAAGATATCATCAATGAATATTTCAAT
ctagattaataagctt
. Secuencia de ADN del conector CT-CST28
GGATCCGTCGACCTGCAGGGTCTAGAAGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGT AGCGGCGGTGGCGGTAGCGCACTAGTGCAGGAAAGACCTCCATTACAACAACCTCCACATCGCGATAAG AAACCATGTAAGAATTTCTTTTGGAAAACATTTAGCAGTTGCAAATGATAAAAGCTT
. Secuencia de ADN de la fusión LHD-CT-CST28
GGATCCATGACGTGGCCAGTTAAGGATTTCAACTACTCAGATCCTGTAAATGACAACGATATTCTGTAC CTTCGCATTCCACAAAATAAACTGATCACCACACCAGTCAAAGCATTCATGATTACTCAAAACATTTGG GTCATTCCAGAACGCTTTTCTAGTGACACAAATCCGAGTTTATCTAAACCTCCGCGTCCGACGTCCAAA TATCAGAGCTATTACGATCCCTCATATCTCAGTACGGACGAACAAAAAGATACTTTCCTTAAAGGTATC ATTAAACTGTTTAAGCGTATTAATGAGCGCGATATCGGGAAAAAGTTGATTAATTATCTTGTTGTGGGT TCCCCGTTCATGGGCGATAGCTCTACCCCCGAAGACACTTTTGATTTTACCCGTCATACGACAAACATC GCGGTAGAGAAGTTTGAGAACGGATCGTGGAAAGTCACAAACATCATTACACCTAGCGTCTTAATTTTT GGTCCGCTGCCAAACATCTTAGATTATACAGCCAGCCTGACTTTGCAGGGGCAACAGTCGAATCCGAGT TTCGAAGGTTTTGGTACCCTGAGCATTCTGAAAGTTGCCCCGGAATTTCTGCTCACTTTTTCAGATGTC ACCAGCAACCAGAGCT CAGCAGTAT TAGGAAAGTCAATTTTTT GCATGGACCCGGTTATTGCACTGATG CACGAACTGACGCACTCTCTGCATCAACTGTATGGGATCAACATCCCCAGTGACAAACGTATTCGTCCC CAGGTGTCTGAAGGATTTTTCTCACAGGATGGGCCGAACGTCCAGTTCGAAGAGTTGTATACTTTCGGA GGCCTGGACGTAGAGATCATTCCCCAGATTGAGCGCAGTCAGCTGCGTGAGAAGGCATTGGGCCATTAT AAGGATATTGCAAAACGCCTGAATAACATTAACAAAACGATTCCATCTTCGTGGATCTCGAATATTGAT AAATATAAGAAAATTTTTAGCGAGAAATATAATTTTGATAAAGATAATACAGGTAACTTTGTGGTTAAC ATTGACAAATTCAACTCCCTTTACAGTGATTTGACGAATGTAATGAGCGAAGTTGTGTATAGTTCCCAA TACAACGTTAAGAATCGTACCCATTACTTCTCTCGTCACTACCTGCCGGTTTTCGCGAACATCCTTGAC GATAATATTTACACTATTCGT GACGGCTTTAACTTGACCAACAAGGGCTT CAATATT GAAAAT TCAGG C CAGAACATTGAACGCAACCCGGCCTTGCAGAAACTGTCGAGTGAATCCGTGGTTGACCTGTTTACCAAA GTCTGCGTCGACAAAAGCGAAGAGAAGCTGTACGATGACGATGACAAAGATCGTTGGGGATCGTCCCTG CAGTGTATTAAAGTGAAAAACAATCGGCTGCCTTATGTAGCAGATAAAGATAGCATTAGTCAGGAGATT TTCGAAAATAAAATTATCACTGACGAAACCAATGTTCAGAATTATTCAGATAAATTTTCACTGGACGAA AGCATCTTAGATGGCCAAGTTCCGATTAACCCGGAAATTGTTGATCCGTTACTGCCGAACGTGAATATG GAACCGTTAAACCTCCCTGGCGAAGAGATCGTATTTTATGATGACATTACGAAATATGTGGACTACCTT AATTCTTATTACTATTTGGAAAGCCAGAAACTGTCCAATAACGTGGAAAACATTACTCTGACCACAAGC GTGGAAGAGGCTTTAGGCTACTCAAATAAGATTTATACCTTCCTCCCGTCGCTGGCGGAAAAAGTAAAT AAAGGTGTGCAGGCTGGTCTGTTCCTCAACTGGGCGAATGAAGTTGTCGAAGACTTTACCACGAATATT ATGAAAAAGGATACCCTGGATAAAATCTCCGACGTCTCGGTTATTATCCCATATATTGGCCCTGCGTTA AATATCGGTAATAGTGCGCTGCGGGGGAATTTTAACCAGGCCTTTGCTACCGCGGGCGTCGCGTTCCTC CTGGAGGGCTTTCCTGAATTTACTATCCCGGCGCTCGGTGTTTTTACATTTTACTCTTCCATCCAGGAG CGTGAGAAAATTATCAAAACCATCGAAAACTGCCTGGAGCAGCGGGTGAAACGCTGGAAAGATTCTTAT CAATGGATGGTGTCAAACTGGTTATCTCGCATCACGACCCAATTCAACCATATTAATTACCAGATGTAT GATAGTCTGTCGTACCAAGCTGACGCCATTAAAGCCAAAATTGATCTGGAATATAAAAAGTACTCTGGT AGCGATAAGGAGAACATCAAAAGCCAGGTGGAGAACCTTAAGAATAGTCTGGATGTGAAAATCTCTGAA GCTATGAATAACATTAACAAATTCATTCGTGAATGTTCGGTGACGTACCTGTTCAAGAATATGCTGCCA AAAGTTATTGATGAACTGAATAAATTTGATCTGCGTACCAAAACCGAACTTATCAACCTCATCGACTCC CACAACATTATCCTTGTGGGCGAAGTGGATCGTCTGAAGGCCAAAGTAAACGAGAGCTTTGAAAATACG ATGCCGTTTAATATTTTTTCATATACCAATAACTCCTTGCTGAAAGATATCATCAATGAATATTTCAAT CTAGAAGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGTAGCGCACTAGTGCAGGAAAGA CCTCCATTACAACAACCTCCACATCGCGATAAGAAACCATGTAAGAATTTCTTTTGGAAAACATTTAGC AGTTGGAAAtaataagctt
. Secuencia de proteína de la fusión LHD-CT-CST28
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVTPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGK5IFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWI3NIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWWIDK FNSLYSDLTNVMSEWY5SQYNVKNRTHYF3RHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPMVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNIMKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVQERPPL QQPPHRDKKPCKNFFWKTFSSCK
. Secuencia de ADN del conector CP-EGF
ggatccGTCGACaacaacaataacaacaacaataacaacaacgacgatgacgataaaAATTCAGATAGC GAATGTCCACTTAGTCACGACGGGTACTGTTTGCATGATGGTGTGTGTATGTATATAGAAGCACTAGAC AAATACGCTTGCAATTGCGTAGTTGGCTATATAGGAGAGCGATGCCAATATAGAGATCTGAAGTGGTGG GAGTTAAGGGCAgaagcggcagccaaagaagcagccgctaaggcgctgcagagtctagaataataagct
. Secuencia de ADN de la fusión LHA-CP-EGF
ggatccATGGAGTTCGTTAACAAACAGTTCAACTATAAAGACCCAGTTAACGGTGTTGACATTGCTTAC ATCAAAATCCCGAACGCTGGCCAGATGCAGCCGGTAAAGGCATTCAAAATCCACAACAAAATCTGGGTT ATCCCGGAACGTGATACCTTTACTAACCCGGAAGAAGGTGACCTGAACCCGCCACCGGAAGCGAAACAG GTGCCGGTATCTTACTATGACTCCACCTACCTGTCTACCGATAACGAAAAGGACAACTACCTGAAAGGT GTTACTAAACTGTTCGAGCGTATTTACTCCACCGACCTGGGCCGTATGCTGCTGACTAGCATCGTTCGC GGTATCCCGTTCTGGGGCGGTTCTACCATCGATACCGAACTGAAAGTAATCGACACTAACTGCATCAAC GTTATTCAGCCGGACGGTTCCTATCGTTCCGAAGAACTGAACCTGGTGATCATCGGCCCGTCTGCTGAT ATCATCCAGTTCGAGTGTCTGAGCTTTGGTCACGAAGTTCTGAACCTCACCCGTAACGGCTACGGTTCC ACTCAGTACATCCGTTTCTCTCCGGACTTCACCTTCGGTTTTGAAGAATCCCTGGAAGTAGACACGAAC CCACT GCTGGGCGCTGGTAAATT CGCAACT GATCCTGCGGTTACCCTGGCTCACGAACT GATT CATGCA GGCCACCGCCTGTACGGTATCGCCATCAATCCGAACCGTGTCTTCAAAGTTAACACCAACGCGTATTAC GAGATGTCCGGTCTGGAAGTTAGCTTCGAAGAACTGCGTACTTTTGGCGGTCACGACGCTAAATTCATC GACTCTCTGCAAGAAAACGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAGTTCAAAGATATCGCATCCACCCTG AACAAAGCGAAATCCATCGTGGGTACCACTGCTTCTCTCCAGTACATGAAGAACGTTTTTAAAGAAAAA TACCTGCTCAGCGAAGACACCTCCGGCAAATTCTCTGTAGACAAGTTGAAATTCGATAAACTTTACAAA ATGCTGACTGAAATTTACACCGAAGACAACTTCGTTAAGTTCTTTAAAGTTCTGAACCGCAAAACCTAT CTGAACTTCGACAAGGCAGTATTCAAAATCAACATCGTGCCGAAAGTTAACTACACTATCTACGATGGT TTCAACCTGCGTAACACCAACCTGGCTGCTAATTTTAACGGCCAGAACACGGAAATCAACAACATGAAC TTCACAAAACTGAAAAACTTCACTGGTCTGTTCGAGTTTTACAAGCTGCTGTGCGTCGACaacaacaat aacaacaacaataacaacaacgacgatgacgataaaAATTCAGATAGCGAATGTCCACTTAGTCACGAC GGGTACTGTTTGCATGATGGTGTGTGTATGTATATAGAAGCACTAGACAAATACGCTTGCAATTGCGTA GTT GGCTATATAGGAGAGCGATGCCAATATAGAGATCTGAAGT GGTGGGAGTTAAGGGCAg aagcggca gccaaagaagcagccgctaaggcgCTGCAGTGTATCAAGGTTAACAACTGGGATTTATTCTTCAGCCCG AGTGAAGACAACTTCACCAACGACCTGAACAAAGGTGAAGAAATCACCTCAGATACTAACATCGAAGCA GCCGAAGAAAACATCTCGCTGGACCTGATCCAGCAGTACTACCTGACCTTTAATTTCGACAACGAGCCG GAAAACATTTCTATCGAAAACCTGAGCTCTGATATCATCGGCCAGCTGGAACTGATGCCGAACATCGAA CGTTTCCCAAACGGTAAAAAGTACGAGCTGGACAAATATACCATGTTCCACTACCTGCGCGCGCAGGAA TTTGAACACGGCAAATCCCGTATCGCACTGACTAACTCCGTTAACGAAGCTCTGCTCAACCCGTCCCGT GTATACACCTTCTTCTCTAGCGACTACGTGAAAAAGGTCAACAAAGCGACTGAAGCTGCAATGTTCTTG GGTTGGGTTGAACAGCTTGTTTATGATTTTACCGACGAGACGTCCGAAGTATCTACTACCGACAAAATT GCGGATATCACTAT CATCATCCCGTACATCGGTC CGGCTCTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGAC GACTT CGTTGGC GCACTGATCTT CTCCGGT GCGGTGATCCT GCTGGAGTT CATCCCGGAAATCGCCAT C CCGGTACTGGGCACCTTTGCT CTGGTTTCTTACATTGCAAACAAGGTT CTGACTGTACAAACCATCGAC AACGCGCTGAGCAAACGTAACGAAAAATGGGATGAAGTTTACAAATATATCGTGACCAACTGGCTGGCT AAGGTTAATACTCAGATCGACCTGATCCGCAAAAAAATGAAAGAAGCACTGGAAAACCAGGCGGAAGCT ACCAAGGCAATCATTAACTACCAGTACAACCAGTACACCGAGGAAGAAAAAAACAACATCAACTTCAAC ATCGACGATCTGTCCTCTAAACTGAACGAATCCATCAACAAAGCTATGATCAACATCAACAAGTTCCTG AACCAGT GCTCT GTAAGCTAT CTGATGAACTCCATGATCCCGTACGGT GTTAAACGTCT GGAGGACTT C GAT GCGTCTCTGAAAGACGCCCT GCTGAAATACATTTACGACAACCGT GGCACTCTGAT CGGT CAGGTT GATCGTCTGAAGGACAAAGTGAACAATACCTTATCGACCGACATCCCTTTTCAGCTCAGTAAATATGTC GATAACCAACGC CTTTTGTCCACTctagaataatgaaagctt
0. Secuencia de proteína de la fusión LHA-CP-EGF
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPV SYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQ PDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECLSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLL GAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAIHPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSL QENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLT EIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTK LKNFTGLFEFYKLLCVDNNNNNNNNNNDDDDKNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCWGY IGERCQYRDLKWWELRAEAAAKEAAAKALQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEE NISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEH GKSRIALTNSWEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADI TIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNAL SKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNIMFWIDD LSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRL KDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLST
1. Secuencia de proteína de LHn/A
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPV SYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPF/ÍGGSTIDTELKVIDTNCINVTQ PDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLL GAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSL QENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLT EIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRKTNLAANFNGQNTEINNMNFTK LKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSD TNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHY LRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVS TTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLT VQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKN NINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGT LIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLST
. Secuencia de proteína de LHn/B
PVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDV CEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVN KLISNPGEVERKKGIEANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQE NKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDP SIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFD KLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKA INKQAYEEISKEHLAVYKIQMCVDEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNER IEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYL YSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKWEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNT MDAIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPWGAFLLESYIDNKNKII KTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSN INIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYL IGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNS
13. Secuencia de proteína de LHn/C
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSG YYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVK TRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALS11SIS PRFMLTYSNATND VGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPT IDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFWESSGEVTVNRNK FVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNL SRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINE ETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQ KLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDWEDFTTNILRKDTLDKI SDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTID NCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQ VENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEV
DKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
14. Secuencia de proteína de LHn/D
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIMYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPIHPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
15. Péptido de GnRH sintetizado
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Cys-Arg-Pro-Gly-NH2:
16. Secuencia de proteína de la fusión LHB-CT-SST28
PVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDV CEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVN KLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQE NKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDP SIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFD KLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKA INKQAYEEISKEHLAVYKIQMCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSK NERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIF QYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKWEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANK SNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPWGAFLLESYIDNKN KIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQMLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYS EKE KSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENK LYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSLEGGGGSGGGGSGGGGSALDSANSN PAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC
17. Secuencia de proteína de la fusión LHA-CP-SST28
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPV SYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQ PDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECLSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLL GAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSL QENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLT EIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTK LKN FTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKSANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSCALAGGGGSGG GGSGGGGSALVLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFD NEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLN PSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNML YKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTN WLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININ KFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLS KYVDNQRLLST
18. Secuencia de proteína de la fusión LHD-CT-EGF
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE
KFENGSWKVTWIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLMNIMKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMS E W Y S SQYNVKNRTHYFS RHYL PVFANILDDNIYTIRDGFN LTN KGFNI ENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNMVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVHKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGMSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVNSDSEC PLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCWGYIGERCQYRDLKWWELR
19. Secuencia de proteína de la fusión LHD-CT-VIP
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTMIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMS E W Y SSQYNVKNRTHYFS RHYL PVFAN ILDDN IYTIRDGFNLTN KGFN IENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK
11KTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLS RITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVHSDAVF TDNYT RLRKQMAVKKYLNSILN
0. Secuencia de proteína de la fusión LHC-CT-IGF1
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSG YYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVK TRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATND VGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPT IDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLN SITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFWESSGEVTVNRNK FVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNL SRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINE ETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQ KLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDWEDFTTNILRKDTLDKI SDVSAIIPYIGPALWISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTID NCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQ VENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEV DKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIIN EY FNLEGGGGSGGGGS GGGGSALVGP ETLCGAELVD ALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA
1. Secuencia de proteína de la fusión LHD-CT-IGF1
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPIMPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAI KAKIDLEYKKYSGSDK
ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVGPETLC GAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA
2. Secuencia de proteína de la fusión LHC-CT-VIP
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSG YYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVK TRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATND VGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPT IDLI PKSARKYFEEKALDYYRS IAKRLNS ITTANPSSFNKYI GEYKQKLI RKYRFWESSGEVTVNRNK FVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNL SRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYMKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINE ETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQ KLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDWEDFTTNILRKDTLDKI SDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTID NCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQ VENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEV DKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVHSDAVFTDNYTR LRKQMAVKKYLNSILN
3. Secuencia de proteína de la fusión LHC-CT-GnRH
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSG YYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVK TRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATND VGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPT IDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFWESSGEVTVNRNK FVELYNELTQI FTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNL SRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINE ETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQ KLS DNVED FTFT RSIEEALDN SAKVYTYFPTLAN KVNAGVQGGL FLMWAN D W E D FTTNILRKDTLDKI SDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGWFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTID NCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQ VENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEV DKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVMKPIQKLLAGLI LLTWCVEGCSSQHWSYGLRPGGKRDAENLIDSFQEIVKEVGQLAETQRFECTTHQPRSPLRDLKGALES LIEEETGQKKI
4. Secuencia de proteína de la fusión LHD-CT-GnRH
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK DTLDKIS DVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFT FYS SIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAHNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVM KPIQKLLAGLILLTV7CVEGCSSQHWSYGLRPGGKRDAENLIDSFQEIVKEVGQLAETQRFECTTHQPRS PLRDLKGALESLIEEETGQKKI
5. Secuencia de proteína de la fusión LHD-CT-GRP
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE
KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDPWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLP KVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNES FENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVGNHWAV GHLM
6. Secuencia de proteína de la fusión LHB-CT-GRP
PVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDV CEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVN KLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQE NKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDP SIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFD KLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKA INKQAYEEISKEHLAVYKIQMCVDEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNER IEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYL YSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKWEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNT MDAIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPWGAFLLESYIDNKNKII KTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSN INIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYL IGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSLEGGGGSGGGGSGGGGSALVGNHWAVGH LM
7. Secuencia de proteína de la fusión LHC-CT-LIF
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSG YYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVK TRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALS11 SISPRFMLTYSNATND VGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSMIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPT IDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFWESSGEVTVNRNK FVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNL SRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINE ETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQ KLS DNVED FTFT RSIEEALDNSAKVYT YFPTLANKVNAGVQGGL FLMWANDWED FTTNILRKDTLDKI SDVSAIIPYIGPALWISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTID NCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQ VENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEV DKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVSPLPITPVNATC AIRHPCHNNLMNQIRSQLAQLNGSANA1FILYYTAQGEPFPNNLDKLCGPNVTDFPPFHANGTEKAKLV ELYRIWYLGTSLGNITRDQKILNPSALSLHSKLNATADILRGLLSNVLCRLCSKYHVGHVDVTYGPDT SGKDVFQKKKLGCQLLGKYKQIIAVLAQAF
8. Secuencia de proteína de la fusión LHB-CP-LIF
PVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDV CEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVN KLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQE NKGASIFNRRG YFS DPALIIMHELIHVLHGL YGIKVDDLPIVPNEKKFFMQ STDAIQAEELYT FGGQDP SIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFD KLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKA INKQAYEEISKEHLAVYKIQMCVDNNNNNNNNNNDDDDKSPLPITPVNATCAIRHPCHNNLMNQIRSQL AQLNGSANAL FILYYTAQGEP FPNNLDKLCGPNVTDFPP FHAN GTEKAKLVEL YRIWYLGT SLGNIT R DQKILNPSALSLHSKLNATADILRGLLSNVLCRLCSKYHVGHVDVTYGPDTSGKDVFQKKKLGCQLLGK
YKQIIAVLAQAFAEAAAKEAAAKALQCIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPI NELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTS SFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKWEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGL ALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPWGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSD MYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGI NQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLK TIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNS
9. Secuencia de proteína de la fusión LHC-CT-FGF1
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSG YYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVK TRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATND VGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPT IDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFWESSGEVTVNRNK FVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNL SRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINE ETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQ KLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDWEDFTTNILRKDTLDKI SDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTID KCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQ VENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEV DKLKAKVNNSFQNTIPENIFSYTNHSLLKDIINEYFHLEGGGGSGGGGSGGGGSALVMFNLPPGNYKKP KLLYCSNGGHFLRILPDGTVDGTRDRSDQHIQLQLSAESVGEVYIKSTETGQYLAMDTDGLLYGSQTPN EECLFLERLEENHYNTYISKKHAEKNWFVGLKKNGSCKRGPRTHYGQKAILFLPLPVSSD
0. Secuencia de proteína de la fusión LHA-CP-FGF1
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFK1HNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPV SYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQ PDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECLSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLL GAGK FATDPAVT LAHEL1HAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSL QENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLT EIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTK LKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKMFl'JLPPGNYKKPKLLYCSNGGHFLRILPDGTVDGTRDR SDQHIQLQLSAESVGEVYIKSTETGQYLAMDTDGLLYGSQTPNEECLFLERLEENHYNTYISKKHAEKN WFVGLKKNGSCKRGPRTHYGQKAILFLPLPVSSDGGGGSGGGGSGGGGSALVLQCIKVNNWDLFFSPSE DNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERF PNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGW VEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPV LGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATK AIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDA SLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLST
1. Secuencia de proteína de la fusión LHA-CT-FGF9
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPV SYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQ PDGSYRSEELNLVTIGPSADIIQFECLSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLL GAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSL QENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLT EIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTK LKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSD TNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHY LRAQEFEHGKS RIALTN SVNEALLN PSRVYTFFS SDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYD FTDETS EVS TTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLT VQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEAT KAI INYQYNQYTEEEKN NINFHIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGT LIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVDHLGQSEA GGLPRGPAVTDLDHLKGILRRRQLYCRTGFHLEIFPNGTIQGTRKDHSRFGILEFISIAVGLVSIRGVD SGLYLGMNEKGELYGSEKLTQECVFREQFEENWYNTYSSNLYKHVDTGRRYYVALNKDGTPREGTRTKR
HQKFTHFLPRPVDPDKVPELYKDILSQS
32. Secuencia de proteína de la fusión LHC-CP-FGF9
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSG YYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVK TRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATND VGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPT IDLIPKSARKYFEEKALDYYR5IAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFWES5GEVTVNRNK FVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNL SRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDNNNNNNNNNNDDDDKDHLGQSEAGGLPRGPAVTDLDHLKGILRRR QLYCRTGFHLEIFPNGTIQGTRKDHSRFGILEFISIAVGLVSIRGVDSGLYLGMNEKGELYGSEKLTQE CVFREQFEENWYNTYSSNLYKHVDTGRRYYVALNKDGTPREGTRTKRHQKFTHFLPRPVDPDKVPELYK DILSQSAEAAAKEAAAKALQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVI LSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEE ALDNSAKVYTYFPTLAKKVNAGVQGGLFLMWANDWEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNIS NSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWM MGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMN NINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNS FQNTIPF NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
33. Secuencia de proteína de la fusión IgA-HNtet-CT-SST14
ESNQPEKNGTATKPENSGNTTSENGQTEPEKKLELRNVSDIELYSQTNGTYRQHVSLDGIPENTDTYFV KVKSSAFKDVYIPVASITEEKRNGQSVYKITAKAEKLQQELENKYVDNFTFYLDKKAKEENTNFTSFSN LVKAINQNPSGTYHLAASLHANEVELGPDERSYIKDTFTGRLIGEKDGKNYAIYNLKKPLFENLSGATV EKLSLKNVAISGKNDIGSLANEATNGTKIKQVHVDGCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKIKNEDL TFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKS NAASTIE1HNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFL QWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGWLLLEYIPEITL PVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDA IKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEF DTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVLEGGGGSGGG GSGGGGSALVAGCKNFFWKTFTSC
34. Secuencia de proteína de la fusión IgA-HNtet-CP-SST14
ESNQPEKNGTATKPENSGNTTSENGQTEPEKKLELRNVSDIELYSQTNGTYRQHVSLDGIPENTDTYFV KVKSSAFKDVYIPVASITEEKRNGQSVYKITAKAEKLQQELENKYVDNFTFYLDKKAKEENTNFTSFSN LVKAINQNPSGTYHLAASLNANEVELGPDERSYIKDTFTGRLIGEKDGKNYAIYNLKKPLFENLSGATV EKLSLKNVAISGKNDIGSLANEATNGTKIKQVHVDGCVDGIITSKTKSDDDDKAGCKNFFWKTFTSCAL AGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIV DYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIE1HNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVD DALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNI VKQGYEGNFIGALETTGWLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKI IKTIDNFLEKRYEKWIEVYKL VKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAM ININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPI PFSYSKNLDCWVDNEEDIDV
35. Secuencia de proteína de la fusión LHA-CT-SST14
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFK1HNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPV SYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQ PDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECLSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLL GAGKFATDPAVTLAHEL1HAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSL QENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLT EIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTK LKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSD TNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPEMISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHY LRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVS TTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLT VQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKN NIHFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGT LIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEGGGGSGGGGSGGGGSALVAGCKNFFWKTFTS
C
36. Secuencia de proteína de la fusión LHA-CT-EGFv3
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPV SYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQ PDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECLSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLL GAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSL QENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLT EIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTK LKNFTGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSD TMIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHY LRAQEFEHGKS RIALTNSVNEALLNP SRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYD FTDETSEVS TTDKIADITIIIPYIGPALMIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLT VQTIDNA1SKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKN NINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGT LIGGVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVDNSDPKCP LSHEGYCLNDGVCMYIGTLDRYACN CWGYVGERCQYRDLKLAELR
37. Secuencia de proteína de la fusión LHE-CT-IL6
PKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYD PNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNG SQHILLPNVIIMGAEPDLFETMSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSINEFIQDPAL TLMHEL1HSLHGLYGAKGITTTCIITQQQNPLITNRKGINIEEFLTFGGNDLNIITVAQYNDIYTNLLN DYRKIASKLSKVQVSNPQLNPYKDIFQEKYGLDKDASGIYSVNINKFDDILKKLYSFTEFDLATKFQVK CRETYIGGYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIIKPITGRGLVKKIIRFCVDG IITSKTKSLIEGRNKALNLQCIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILN FNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDT ALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIWPYIGLALNI GNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEV YSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQK VSIAMNNIDRFLTESSISYLMKIINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTL NNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKLEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVPPGEDSKDVAAPHRQPLT SSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIIT GLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWL QDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM
38. Secuencia de proteína de la fusión LHB-CT-IL8
PVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDV CEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVN KLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQE NKGASIFNRRGYFSDPALILMHEL1HVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDP SIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFD KLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKA INKQAYEEISKEHLAVYKIQMCVDGIITSKTKSLIEGRNKALNLQCIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSK NERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIF QYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKWEAGLFAGWVKQIWDFVIEANK SNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPWGAFLLESYIDNKN KIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKE KSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENK LYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSLEGGGGSGGGGSGGGGSALVAKELR CQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRWEKFLKRAENS
39. Secuencia de proteína de la fusión LHF-CP-GRAN4
PVAINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSS AYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGKVLLQEISYAKPYLGNDHTPIDEFSPVTRTTSVNI KLSTNVESSMLLNLLVLGAGPDIFESCCYPVRKLIDPDWYDPSNYGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISG GHNSSTESFIADPAISLAHEL1HALHGLYGARGVTYEETIEVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNI ITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYK KLYSFTESDLANKFKVKARNTYFIKYEFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQSIKLNPKIIDS IPDKGLVEKIVKFAVENNNNNNNNNNLGCVDGIITSKTKSLIEGRDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAW GCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEALAGGGGSGGGGSGGGGSALVLQCIEVNNSELFFVAS ESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYENNLDEVILDYNSQTIPQISNIENLNTLVQDNSYVPEYDSNGTS EIEEYDWDFNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALLEESKDIFFSSEFIDTINKPVNAALFIDWIS KVIRDFTTEATQKSTVDKIADISLIVPYVGLALNIIIEAEKGNFEEAFELLGVGILLEFVPELTIPVIL VFTIKSYIDSYENKNKAIKAINNSLIEREAKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAI KTAIEYKYNNYTSDEKNRLESEYNINNIEEELNKKVSLAMKNIERFMTESSISYLMKLINEAKVGKLKK YDNHVKSDLLNYILDHRSILGEQTNELSDLVTSTLNSSIPFELSSYTNDKILIIYFNRLYKT
40. Secuencia de proteína de la fusión LHD-CP-TGFa
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQ5 YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGGGGSGGGGSADDDDKWSHFNDCPDSHTQFCFHGTCRFLVQEDK PACVCHSGYVGARCEHADLLALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENK IITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYY YLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKD TLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKI IKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKE NIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNII LVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
41. Secuencia de proteína de la fusión LHD-CP-TGFb
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNP SFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYHFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVMSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLSSESWDLFTKVCVDGGGGSGGGGSADDDDKALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLG WKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKV EQLSNMIVRSCKCSALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDET NVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQK LSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKKDTLDKIS DVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIEN CLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQV ENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVD RLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
42. Secuencia de proteína de la fusión LHB-CT-TNFa
PVTINNFNYNDPIDMNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDV CEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVN KLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQE NKGASIFNRRGYFSDPALILMHEL1HVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDP SIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFD KLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKA INKQAYEEISKEHLAVYKIQMCVDEEKLYDDDDKDRWGS SLQCIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNER
IEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYL YSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKWEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNT MDAIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPWGAFLLESYIDNKNKII KTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSN INIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYL IGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSLEGGGGSGGGGSGGGGSALVRSSSRTPS DKPVAHWANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLWPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTH TISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAES GQVYFGIIAL
43. Secuencia de proteína de la fusión LHD-CT-SDF1
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQS YYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVE KFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSN QSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLD VEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFWNIDK FNSLYSDLTNVHSEWYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNI ERNPALQKLS SESWDL FTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRffGS SLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSY YYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEWEDFTTNIMKK DTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREK IIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKV1DELNKFDLRTKTELINLIDSHNI ILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALKPVSLSY RCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNKRFKM
44. Secuencia de proteína de la fusión LHC-CT-VEGF
PITINNFMYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSG YYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVK TRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALS11SIS PRFMLTYSNATND VGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPT IDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFWESSGEVTVNRNK FVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNL SRNPALRKVNPENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINE ETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQ KLSDNVED FTFTRSIEEALDNSAKVYT YFPTLANKVNAGVQGGL FLMWANDWED FTTNILRKDTLDKI SDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTID NCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQ VENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEV DKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALAPMAEGGGQNHHE WKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMR IKPHQGQHIGEMS FLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVYVGARCCLMPWS LPGPHPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
Cláusulas
1. Un polipéptido, para uso en la supresión de una célula cancerosa que expresa una proteína SNARE responsable de la secreción de dicha célula cancerosa, en el que el polipéptido comprende:
(i) una proteasa no citotóxica, proteasa que es capaz de escindir dicha proteína SNARE expresada en dicha célula cancerosa;
(ii) un Resto de Direccionamiento (TM) que es capaz de unirse a un Sitio de Unión en una célula cancerosa, Sitio de Unión que es capaz de experimentar endocitosis para ser incorporado en un endosoma en la célula cancerosa; y
(iii) un dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa desde dentro de un endosoma, a través de la membrana endosomal y en el citosol de la célula cancerosa;
con la condición de que la célula cancerosa no es una célula tumoral neuroendocrina;
y con la condición de que el polipéptido no es una neurotoxina clostridial (holotoxina).
2. Un polipéptido para uso según la reivindicación 1, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer adrenal, cáncer esofágico, linfoma (por ejemplo, de células B, de células del manto), leucemia (por ejemplo, mieloma múltiple), leucemia aguda, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, cáncer de intestino, cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica, linfoma de Hodgkin, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer orofaríngeo, mieloma, cáncer de próstata (por ejemplo, sarcoma de tejido blando de próstata), cáncer gástrico, cáncer testicular, cáncer uterino, o sarcoma de Kaposi.
3. Un polipéptido para uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que la célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en: una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer renal, una célula de cáncer de cerebro, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer colorrectal, una célula de cáncer adrenal, una célula de cáncer esofágico, una célula de cáncer de linfoma (por ejemplo, de células B, de células del manto), una célula de cáncer de leucemia (por ejemplo, mieloma múltiple), una célula de cáncer de leucemia aguda, una célula de cáncer de vejiga, una célula de cáncer de hueso, una célula de cáncer de intestino, una célula de cáncer de cuello uterino, una célula de leucemia linfocítica crónica, una célula de linfoma de Hodgkin, una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer de piel melanoma, una célula de cáncer orofaríngeo, una célula de mieloma, una célula de cáncer de próstata, una célula de sarcoma de tejido blando, una célula de cáncer de gástrico, una célula de cáncer testicular, una célula de cáncer uterino o una célula de cáncer de sarcoma de Kaposi.
4. Un polipéptido para uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el TM se une a un receptor seleccionado del grupo que comprende: un receptor ErbB; un receptor de EGF; un receptor de hormona liberadora de hormona del crecimiento (GHRH); un receptor de factor de crecimiento semejante a insulina (IGFR); un receptor de péptido liberador de gastrina (GRP); un receptor de péptido bombesina (BB); un receptor de hormona del crecimiento (GH); un receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF); un receptor de acetilcolina (ACH); un receptor de somatostatina (SST); un receptor de cortistatina (CST); un receptor de quimioquina (resto C-X-C) tal como CXCR4; un receptor de neuropilina; un receptor de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH); un receptor de la superfamilia VIP-glucagón-GRF-secretina tal como un receptor de PAC o un receptor de VPAC; un receptor de FLT; un receptor de CHRN; un receptor de EPH tal como un receptor de EPHA; un receptor de EFN; un receptor de DLK1, un receptor de DLL3, un receptor de FGF; un receptor de jAG; un receptor de LIF; un receptor de NMB; un receptor de NOTCH; un receptor de p Dg F; un receptor de c-kit; un receptor de TGF; un receptor de endotelina; un receptor de quimioquina; o un receptor de angiopoyetina.
5. Un polipéptido para uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el TM se selecciona del grupo que comprende: un péptido de ErB, un péptido de EGF, un péptido de adrenomedulina (ADM), un péptido de AM, un péptido de AMF, un péptido de anfiregulina, un péptido de ApRIL, un péptido de artemina, un péptido de betacelulina, un péptido de bombesina, un péptido de CTR, un péptido de endotelina, un péptido de eritropoyetina, un péptido de FGF, un péptido de FSH, un péptido de gastrina, un péptido liberador de gastrina (GRP), un péptido de g Dn F, un péptido de grelina, un péptido de GHRH, un péptido de G-CSF, un péptido de hormona del crecimiento, un péptido de HB-EGF, un péptido de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un péptido de IL, un péptido de factor de crecimiento de queratinocitos, un péptido de leptina, un péptido de LIF, un péptido de alfa-melanotropina, un péptido de MGSA/GRO, un péptido de NRG, un péptido de oxitocina, un péptido de osteopontina (OPN), un péptido de neuregulina-1, un péptido de VIP o PACAp, un péptido de PDGF, un péptido de prolactina, un péptido de SCF, un péptido de somatostatina (SST), un péptido de cortistatina (CST), un péptido de TNF, un péptido de TGF, un péptido de VEGF, un péptido de vasopresina, un péptido de angiopoyetina, un péptido de B-CLL, un péptido de BCGF-12KD, un péptido de BAFF, un péptido de galanina, un péptido de GDNF, un péptido de GnRH, un péptido de IGF-II, un péptido de LH, un péptido de neurotrofina, un péptido de sustancia P, un péptido de TGF-alfa; un péptido de IGF, un péptido de angiopoyetina, un péptido de CXC, un péptido de CCL, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un receptor como se ha definido en la reivindicación 4.
6. Un polipéptido para uso según cualquier reivindicación precedente, en el que la proteasa no citotóxica comprende una cadena L de neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA.
7. Un polipéptido para uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el dominio de translocación comprende un dominio de translocación de neurotoxina clostridial.
8. Un polipéptido que comprende:
(i) una proteasa no citotóxica, proteasa que es capaz de escindir una proteína SNARE expresada en una célula cancerosa, en el que dicha proteína SNARE es responsable de secreción de la célula cancerosa;
(ii) un Resto de Direccionamiento (TM) que es capaz de unirse a un Sitio de Unión en la célula cancerosa, Sitio de Unión que es capaz de experimentar endocitosis para ser incorporado en un endosoma en la célula cancerosa; y
(iii) un dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa desde dentro de un endosoma, a través de la membrana endosomal y en el citosol de la célula cancerosa
con la condición de que la célula cancerosa no es una célula tumoral neuroendocrina;
y con la condición de que el polipéptido no es una neurotoxina clostridial (holotoxina).
9. Un polipéptido según la reivindicación 8, en el que el TM se une a un receptor seleccionado del grupo que comprende: un receptor ErbB tal como un receptor de EGF; un receptor de hormona liberadora de hormona del crecimiento (GHRH); un receptor de factor de crecimiento semejante a insulina (IGFR); un receptor de péptido liberador de gastrina (GRP); un receptor de péptido bombesina (BB); un receptor de hormona del crecimiento (GH); un receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF); un receptor de acetilcolina (ACH); un receptor de somatostatina (SST); un receptor de cortistatina (CST); un receptor de quimioquina (resto C-X-C) tal como CXCR4; un receptor de neuropilina; un receptor de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH); un receptor de la superfamilia VIP-glucagón-GRF-secretina tal como un receptor de PAC o un receptor de VPAC; un receptor de FLT; un receptor de CHRN; un receptor de EPH tal como un receptor de EPHA; un receptor de EFN; un receptor de DLK1, un receptor de DLL3, un receptor de FGF; un receptor de jAG; un receptor de LIF; un receptor de NMB; un receptor de NOTCH; un receptor de p Dg F; un receptor de c-kit; un receptor de TGF; un receptor de endotelina; un receptor de quimioquina; o un receptor de angiopoyetina.
10. Un polipéptido según la reivindicación 8 o reivindicación 9, en el que el TM se selecciona del grupo que comprende: un péptido de ErB tal como un péptido de EGF, un péptido de adrenomedulina (ADM), un péptido de AM, un péptido de factor de motilidad autocrino (AMF), un péptido de anfiregulina, un péptido de APRIL, un péptido de artemina, un péptido de factor de motilidad autocrino (AMF), un péptido de betacelulina, un péptido de bombesina, un péptido de CTR, un péptido de endotelina, un péptido de eritropoyetina, un péptido de FGF, un péptido de FSH, un péptido de gastrina, un péptido liberador de gastrina (GRP), un péptido de g Dn F, un péptido de grelina, un péptido de GHRH, un péptido de G-CSF, un péptido de hormona del crecimiento, un péptido de HB-EGF, un péptido de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un péptido de IL, un péptido de factor de crecimiento de queratinocitos, un péptido de leptina, un péptido de LIF, un péptido de alfa-melanotropina, un péptido de MGSA/GRO, un péptido de NRG, un péptido de oxitocina, un péptido de osteopontina (OPN), un péptido de neuregulina-1, un péptido de VIP o PACAP, un péptido de PDGF, un péptido de prolactina, un péptido de SCF, un péptido de somatostatina (SST), un péptido de cortistatina (CST), un péptido de TNF, un péptido de TGF, un péptido de VEGF, un péptido de vasopresina, un péptido de angiopoyetina, un péptido de B-CLl , un péptido de BCGF-12KD, un péptido de BAFF, un péptido de galanina, un péptido de GDNF, un péptido de GnRH, un péptido de IGF-II, un péptido de LH, un péptido de NT, un péptido de sustancia P, un péptido de TGF-alfa; un péptido de IGF, un péptido de angiopoyetina, un péptido de CXC, un péptido de CCL, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un receptor como se ha definido en la reivindicación 9.
11. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en el que la proteasa no citotóxica comprende una proteasa de neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA.
12. Un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en el que el dominio de translocación comprende un dominio de translocación de neurotoxina clostridial.
13. Un polipéptido según la reivindicación 8, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90-92%, o al menos 95-97%, o al menos 98-99% de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID Nos: 7, 10, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, ó 44.
14. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 8-13.
15. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido según la reivindicación 8, en el que dicho ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 90-94%, o al menos 95-97%, o al menos 98-99% de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NOs: 6, ó 9.
16. Un método para suprimir un cáncer en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido, para uso en la supresión o tratamiento del cáncer mediante la inhibición de la secreción autocrina de una célula cancerosa en un paciente, en el que el polipéptido comprende:
(i) una proteasa no citotóxica, proteasa que es capaz de escindir una proteína SNARE expresada en dicha célula cancerosa;
(ii) un Resto de Direccionamiento (TM) que es capaz de unirse a un Sitio de Unión en una célula cancerosa, Sitio de Unión que es capaz de experimentar endocitosis para ser incorporado en un endosoma en la célula cancerosa; y
(iii) un dominio de translocación que es capaz de translocar la proteasa desde dentro de un endosoma, a través de la membrana endosomal y en el citosol de la célula cancerosa;
en el que el polipéptido carece de la función de unión natural de un dominio Hcc de neurotoxina clostridial que permite a la neurotoxina clostridial unirse a terminales nerviosas en la unión neuromuscular;
con la condición de que la célula cancerosa no es una célula tumoral neuroendocrina;
y con la condición de que el polipéptido no es una molécula de neurotoxina clostridial natural;
y en el que dicha expresión de la proteína SNARE está regulada al alza en el tipo de célula cancerosa cuando se compara con la expresión de la proteína SNARE en el mismo tipo celular en un estado no canceroso.
2. Un polipéptido para uso según la reivindicación 1, en el que dicha expresión de la proteína SNARE está regulada al alza más de dos veces cuando se compara con la expresión de la proteína SNARE en el mismo tipo celular en un estado no canceroso de un individuo normal.
3. Un polipéptido para uso según la reivindicación 1 o 2, en el que
a) el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, leucemia aguda, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, cáncer de intestino, cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica, linfoma de Hodgkin, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer orofaríngeo, mieloma, cáncer gástrico, cáncer testicular, o sarcoma de Kaposi; y/o
b) la célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste en: una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer colorrectal, una célula de cáncer de leucemia aguda, una célula de cáncer de vejiga, una célula de cáncer de hueso, una célula de cáncer de intestino, una célula de cáncer de cuello uterino, una célula de leucemia linfocítica crónica, una célula de linfoma de Hodgkin, una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer de piel melanoma, una célula de cáncer orofaríngeo, una célula de mieloma, una célula de cáncer gástrico, una célula de cáncer testicular, o una célula de cáncer de sarcoma de Kaposi.
4. Un polipéptido para uso según cualquier reivindicación precedente, en el que:
a) la proteasa no citotóxica comprende una cadena L de neurotoxina clostridial o una proteasa de IgA; y/o b) el dominio de translocación comprende un dominio de translocación de neurotoxina clostridial.
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