ES2425291A1

ES2425291A1 - Método para la producción de hidroxiectoína

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Publication number: ES2425291A1
Application number: ES201200263A
Authority: ES
Inventors: Javier RODRÍGUEZ DE MOYA VERA; Montserrat ARGANDOÑA BERTRÁN; Joaquín José NIETO GUTIÉRREZ; Carmen VARGAS MACÍAS
Original assignee: Universidad de Sevilla
Current assignee: Universidad de Sevilla
Priority date: 2012-03-08
Filing date: 2012-03-08
Publication date: 2013-10-14
Anticipated expiration: 2032-03-08
Also published as: WO2013132118A1; ES2425291B1

Abstract

Método para la producción de hidroxiectoína. La presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende los genes de producción de ectoína e hidroxiectoína, preferiblemente con al menos dos copias del gen que codifica para la enzima ectoína hidroxilasa, y cuya expresión está dirigida por al menos un promotor activo en condiciones de baja salinidad y temperatura. Además, la presente invención se refiere al vector y la célula que comprende dicho polinucleótido, y a un método de producción de ectoína e hidroxiectoína basado en dicha célula. Preferiblemente, dicha célula es de la especie Chromohalobacter salexigens y es incapaz de expresar los genes ectA, ectB, ectC y ectD nativos.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE HIDROXIECTOÍNA

La presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende los

genes de producción de ectoína e hidroxiectoína, preferiblemente con al menos

5: dos copias del gen que codifica para la enzima ectoína hidroxilasa, y cuya

expresión está dirigida por al menos un promotor activo en condiciones de baja

salinidad y temperatura. Además, la presente invención se refiere al vector y la

célula que comprende dicho polinucleótido, y a un método de producción de

ectoína e hidroxiectoína basado en dicha célula. Por tanto, la invención se podría

1 O: encuadrar en el campo de la Biotecnología.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los microorganismos halófilos y halotolerantes se adaptan a las altas

15: concentraciones salinas mediante cambios en la composición lipídica de sus

membranas y la acumulación en su citoplasma de solutos con bajo peso

molecular. Así, las arqueas aerobias halófilas extremas de la familia

Halobacteriaceae, la bacteria halófila extrema Salinibacter ruber, así como serie

de bacterias halófilas moderadas Gram positivas, acetogénicas y sulfato

20: reductoras, del orden Ha/anaerobia/es acumulan concentraciones muy elevadas

de iones inorgánicos, principalmente K+ y cr, hasta niveles que se asemejan a los

de la concentración salina del medio externo. Sin embargo, el resto de

microorganismos halófilos, en especial aquellos con mayor adaptación a las

concentraciones salinas elevadas, acumulan en su citoplasma grandes

25: cantidades de compuestos orgánicos específicos, solubles, que actúan como

osmolitos para equilibrar la presión osmótica externa. Se trata de moléculas

orgánicas de bajo peso molecular, muy solubles y generalmente de carga neutra.

Se han denominado quot;solutos compatiblesquot; porque no interfieren con el

metabolismo celular, y pueden acumularse hasta alcanzar concentraciones muy

30: elevadas, del orden de 1 mol/kg de agua. Además de su función como

osmoprotectores, los solutos compatibles pueden ejercer otras funciones de

protección, por lo que poseen un gran potencial desde el punto de vista aplicado.

Es de gran interés la aplicación industrial de estos compuestos en la tecnología

de enzimas (biosensores, PCR, entre otros), en la fabricación y diseño de nuevos

fármacos útiles en cosmética y dermofarmacia, en agricultura, en medicina y, en

general, como agentes que favorecen la conservación de biomoléculas, células

completas y tejidos.

5

Entre los solutos compatibles que se han investigado, las ectoínas son las que

han mostrado las mayores propiedades estabilizantes. Las aplicaciones de las

ectoínas han sido ampliamente revisadas por (Pastor y col., 2010 Biotechnology

Advances 6:782-801 ), entre otras, se ha demostrado que pueden proteger

1 O: enzimas, ADN y la estructura de las proteínas frente a distintos tipos de estrés.

Así mismo, se han postulado como potenciales moléculas protectoras frente a

diferentes enfermedades por su capacidad estabilizadora de las proteínas. Por

último, son ampliamente empleadas en preparaciones dermatológicas pos su

capacidad protectora de la piel.

15

El término ectoínas engloba a dos compuestos tetrahidropirimidínicos cíclicos: la

ectoína (ácido 1 ,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-pirimidinocarboxílico) y su derivado

hidroxilado, la hidroxiectoína (ácido 1 ,4,5,6-tetrahidro-5-hidroxi-2-metil-4-

pirimidinocarboxílico). Ambas, ectoína e hidroxiectoína, son junto con la betaína,

20: los solutos compatibles mayoritariamente sintetizados por bacterias halófilas

Gram negativas heterótrofas y también por un amplio número de bacterias Gram

positivas halófilas moderadas y halotolerantes. La ruta biosintética de la ectoína

se elucidó a nivel bioquímico por primera vez en Halomonas elongata y consta de

tres etapas enzimáticas que se originan a partir del aspartato semialdehído,

25: intermediario en el metabolismo de aminoácidos, siendo el diaminobutirato (DA) y

el Ny-acetildiaminobutirato (NADA) compuestos intermediarios de la ruta. El

aspartato semialdehído proviene de la fosforilación del L-aspartato y su posterior

reducción a aspartato semialdehído. El aspartato semialdehído es convertido en

ácido diaminobutírico (DA) mediante la enzima diaminobutirato transaminasa. A

30: continuación, este compuesto es acetilado hasta Ny-acetildiaminobutirato (NADA),

interviniendo la enzima diaminobutirato acetiltransferasa. Finalmente, mediante la

condensación del NADA por acción de la ectoína sintasa, se obtiene la ectoína.

La región genética implicada en la síntesis de ectoína comprende tres genes, ectA, ectB y ectC, que codifican las enzimas ácido diaminobutírico acetiltransferasa, ácido diaminobutírico transaminasa y ectoína sintasa, respectivamente. Estos tres genes se encuentran habitualmente en un mismo operón, aunque existen excepciones donde encontramos clústeres incompletos o incluso microorganismos que sólo poseen el gen ectC. La principal ruta biosintética para la hidroxiectoína implica la hidroxilación directa de la ectoína, mediante una reacción catalizada por la enzima ectoína hidroxilasa (EctD o ThpD), que fue caracterizada en Chromohalobacter salexigens (García-Estepa y col., 2006 J. Bacteriol. 188:3774-84) y Streptomyces chrysomallus. Además, se ha sugerido una ruta secundaria para la síntesis de hidroxiectoína en C. salexigens que partiría del precursor NADA. Este soluto compatible es más común en bacterias halófilas Gram positivas como Brevibacterium linens o Marinococcus halophilus, aunque frecuentemente es sintetizado en cantidades menores junto a la ectoína en microorganismos productores de la misma. A pesar de que su estructura química es muy parecida a la de la ectoína, la hidroxiectoína confiere mayor protección frente a los choques térmicos (García-Estepa y col., 2006 J. Bacteriol. 188:3774-84) y la desecación. Estas propiedades adicionales han propiciado la aparición de estudios sobre procesos industriales orientados a la producción específica del derivado hidroxilado de la ectoína (Pastor y col., 2010 Biotechnology Advances 6:782-801).

En el caso concreto de la producción de ectoínas por C. salexigens, las concentraciones de ectoína e hidroxiectoína alcanzan su máximo en la fase estacionaria de crecimiento y la acumulación de ectoína se produce principalmente en respuesta a una elevada salinidad (14,5% (p/v) NaCI, 37 °C), mientras que la de hidroxiectoína se produce frente a una elevada salinidad y temperatura (14,5% (p/v) NaCI, 45 °C) (García-Estepa y col., 2006 J. Bacteriol. 188:3774-84). La transcripción de los genes responsables de la síntesis de ectoína (ectABC) implica a múltiples promotores (PectA 1-4, PectB) que permiten que el sistema sea regulado por diversos factores ambientales como la salinidad, la temperatura, la presencia de osmoprotectores o el hierro. La expresión de fusiones transcripcionales PectA-IacZ y PectB-IacZ es máxima en fase

estacionaria a elevada salinidad, aunque mantiene unos niveles mínimos a baja

salinidad (0,75 M NaCI), especialmente la fusión PectA-IacZ, lo que sugiere que el

sistema ectABC es semiconstitutivo.

5: El creciente interés comercial de las ectoínas ha posibilitado el desarrollo de

muchas estrategias para su producción biotecnológica. La principal ventaja de los

procesos de producción biológica de ectoínas frente a su síntesis química reside

en su mayor especificidad y su menor complicación al ser un proceso con menos

etapas de separación de los productos y con menor generación de productos

1O: secundarios. Entre las posibles desventajas que ofrecen los procesos

biotecnológicos se encuentran la gran cantidad de nutrientes necesarios y el

control exhaustivo a que deben someterse las condiciones de fermentación (pH,

aireación, etc). Además, la elevada concentración salina del medio de cultivo es

un problema importante en estos procesos, al ser la causante de la corrosión de

15: los equipos, además de limitar la tasa de crecimiento, provocando una

disminución en la producción de ectoínas. Aun así, los procesos de fermentación

son actualmente el método de elección para la producción de ectoínas (Pastor y

col., 2010 Biotechnology Advances 6:782-801). El proceso más utilizado

actualmente para la producción de ectoína es conocido como quot;bacteria/ milkingquot;, e

20: implica el cultivo aerobio de H. elongata a 25°C en un medio salino con 15 % (p/v)

de NaCI (2,57 M NaCI) hasta conseguir una gran densidad celular. Cuando el

cultivo alcanza la densidad óptica adecuada se induce el shock hipoosmótico

reemplazando el 80% del medio con agua destilada. Transcurrida una hora se

retira el 80% del volumen (que contiene las ectoínas excretadas) y se añade

25: medio salino nuevo, empezando así un nuevo ciclo de síntesis de ectoínas.

También se han usado para la producción de ectoína microorganismos del género

Brevibacterium. El proceso es similar al seguido para H. elongata, aunque los

shocks hipoosmóticos se realizan mediante la centrifugación de las células y

posterior suspensión de las mismas en agua destilada. Sin embargo, este proceso

30: obtuvo una productividad inferior a otros donde no se realizan shocks

hipoosmóticos continuos, sino una extracción final usando agua destilada y etanol

a una concentración 1 M de NaCI. Otro modo de evitar el uso de medios con

elevadas concentraciones salinas es el empleo de microorganismos que

sintetizan estos solutos en condiciones de menor salinidad. Así, algunos estudios

postulan la utilización de una cepa de H. e/ongata secretora de ectoína cuando se

cultiva con 0,5 M de NaCI y glutamato monosódico.

5: Los problemas para la síntesis química de la hidroxiectoína son aún mayores que

en el caso de la ectoína, dado que el grupo hidroxilo añade otro centro quiral a la

molécula, haciendo más interesante su producción biotecnológica. El proceso

utilizado actualmente para la producción industrial de hidroxiectoína con H.

elongata es el anteriormente mencionado quot;bacteria/ milkingquot; o mejoras de dicho

1O: procedimiento que emplean fermentaciones continuas de dicho microorganismo

en las que se eleva la concentración salina y la temperatura para aumentar la

producción de hidroxiectoína (Seip y col., 2011 Appl Enviran Microbio!.

77(4):1368-74). Otros estudios con microorganismos muy relacionados con H.

elongata como H. bo/iviensis (Van-Thuoc y col., 2010 Journal of Biotechnology

15: 147:46-51) o C. salexigens (Vargas y col., 2008 Saline Systems 4:14; Fallet y col.,

2010 Biotechnol Bioeng. 107:124-33) parecen confirmar que en la familia

Halomonadaceae siempre se produce una combinación de ectoína e

hidroxiectoína, aumentando la proporción de la segunda con la temperatura. Así,

Van Thuoc y col. (2010 Journal of Biotechnology 147:46-51), utilizando

20: fermentaciones en dos etapas con la bacteria H. boliviensis, consiguieron

aumentar la producción de hidroxiectoína, combinada con la producción de

ectoína y PHB (polihidroxibutirato). Otro microorganismo utilizado para la síntesis

de este soluto compatible es Marinococcus M52, consiguiéndose grandes

cantidades de hidroxiectoína a partir de ectoína durante la fase estacionaria del

25: cultivo en un medio con 10% (p/v) de NaCI, con el inconveniente de que este

microorganismo no puede ser sometido a procesos de quot;bacteria/ milkingquot; basados

en una simple dilución del medio de cultivo (Frings y col., 1995 Journal of

Biotechnology 43:53-61). En el método descrito por Schiraldi y col. (2006

Research in Microbiology 157:693-699) se optimiza la concentración de oxígeno

30: disuelto y la composición del medio, con un 1O % (p/v) de NaCI. Además,

emplearon un nuevo método de extracción que combina el shock hipoosmótico

con una permeabilización térmica para recuperar el producto de la biomasa,

mejorando la extracción del producto y, por tanto, la productividad del proceso,

aunque impide la reutilización de las células en nuevos ciclos de producción/extracción. Una desventaja de Marinococcus spp. es su producción de compuestos inhibidores del crecimiento como el acetato, que le hacen ser menos adecuado para la producción en fermentadores. Esta desventaja puede evitarse utilizando sistemas de reactores con diálisis o técnicas de microfiltración (Schiraldi y col., 2006 Research in Microbiology 157:693-699). Estas técnicas de fermentación requieren una avanzada tecnología y por ello no han sido aplicadas a la producción industrial de hidroxiectoína. Uno de los últimos estudios publicados sobre producción de hidroxiectoína emplea el microorganismo Pseudomonas stutzeri (Seip y col., 2011 Appl Environ Microbio!. 77(4):1368-74), presentando la ventaja de una producción casi exclusiva de hidroxiectoína (con pequeñas cantidades de trehalosa y NAGGN (N-y-acetilglutaminil glutamina 1-amida), en medio de crecimiento con un 5% (p/v) de NaCI y a una temperatura de 37 °C, obteniendo una producción de hidroxiectoína similar a la de otros estudios. Este mismo estudio de Seip y col., 2011 Appl Environ Microbio!. 77(4):1368-74) ensaya la producción heteróloga de hidroxiectoína con una cepa de Escherichia coli DH5a portadora de un plásmido con el operón ectABCD-ask de P. stutzeri, consiguiendo una producción de hidroxiectoína sin contaminación de otros solutos con una producción y una productividad superiores a otros estudios y empleando un medio de cultivo con 2% (p/v) de NaCI. La producción heteróloga de hidroxiectoína es útil para evitar los problemas que se derivan de la elevada salinidad de los medios empleados en la producción industrial de ectoínas. La mayoría de estudios anteriores sobre producción heteróloga de ectoína y/o hidroxiectoína se centran en la obtención de la primera, no alcanzando ninguno una producción y excreción de ectoína superior a la obtenida con los microorganismos que la producen de forma natural (Pastor y col., 2010 Biotechnology Advances 6:782-801 ). Una excepción es el trabajo realizado por Prabhu y col. (2004) para conseguir una mejora del proceso de quot;bacteria/ mi/kingquot; aplicado a la producción biológica de ectoínas, donde se clonó y expresó el gen que codifica para la ectoína hidroxilasa de S. crysomallus, thpD, en C. salexigens, consiguiendo la transformación de toda la ectoína que se sintetiza de manera natural en hidroxiectoína (Prabhu y col., 2004 Appl. Environ. Microbio!. 70:3130-3132), lo que permite la síntesis de hidroxiectoína a una salinidad menor (1 ,7 M

de NaCI).

5 1 O: En el único estudio publicado hasta el momento sobre producción de ectoína e hidroxiectoína utilizando C. sa/exigens como microorganismo productor se empleó un sistema de dos reactores continuos acoplados: el primero se utiliza para obtener una masa celular muy elevada y el segundo, para inducir un shock hipoosmótico en esa masa celular (Fallet y col., 2010 Biotechnol Bioeng. 107:124-33). Este método alcanzó una producción de ectoína e hidroxiectoína, 540 mg y 400 mg por gramo de peso seco, en un mismo proceso, lo que supone una mayor producción que la obtenida en otros procesos que emplean otros microorganismos (Pastor y col., 2010 Biotechnology Advances 6:782-801).

15 20: En W002077254 se expone la producción de ectoína y/o hidroxiectoína en organismos que dispongan de la información genética para dicha producción, centrándose sobre todo en evitar la limitación impuesta por los llamados cuellos de botella metabólicos y la regulación que producen los sistemas de transporte. En W00138500 y en W02009059783 se describe el uso del gen de la tetrahidropirimidina dioxigenasa de S. chrysomallus para la obtención de hidroxiectoína.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

25: En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende:

30: (a) la secuencia codificante del gen ectA, donde dicho gen codifica para el enzima diaminobutirato acetiltransferasa; (b) la secuencia codificante del gen ectB, donde dicho gen codifica para el enzima diaminobutirato transaminasa; (e) la secuencia codificante del gen ectC, donde dicho gen codifica para el enzima ectoína sintasa; y

(d) la secuencia codificante del gen ectD, donde dicho gen codifica para el enzima

ectoína hidroxilasa.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una construcción génica que comprende el polinucleótido del primer aspecto de la invención.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una célula que comprende el polinucleótido del primer aspecto de la invención o la construcción génica del segundo aspecto de la invención.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de ectoína e hidroxiectoína que comprende las siguientes etapas:

(a): cultivar la célula del tercer aspecto de la invención, y

(b): purificar la ectoína y la hidroxiectoína a partir del cultivo de (a).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención permite conseguir una mayor producción de hidroxiectoína a una temperatura y salinidad menores que lo conseguido hasta la fecha, lo que supone una gran ventaja, dado que tanto la elevada temperatura como la salinidad aumentan los costes de cualquier proceso industrial de producción en fermentadores.

Los autores de la presente invención han encontrado que el uso de una construcción génica que comprende los genes de síntesis de ectoína e hidroxiectoína, dirigidos por un promotor activo a baja salinidad y temperatura, para la producción de dichas sustancias, es sorprendentemente ventajoso cuando dicha construcción se introduce en una bacteria halófila donde los genes nativos de síntesis de ectoína e hidroxiectoína han sido inactivados.

Más aún, los autores de la presente invención han encontrado que cuando la construcción génica comprende una segunda copia del gen de síntesis de

hidroxiectoína (ectD), la cantidad de hidroxiectoína y la tasa de producción específicas se ven muy incrementadas, sin afectar a la tasa de crecimiento.

5: Por tanto, en un primer aspecto, polinucleótido aislado que comprende: la presente invención se refiere a un

1 O 15: (a) la secuencia codificante del gen ectA, donde dicho gen codifica para el enzima diaminobutirato acetiltransferasa; (b) la secuencia codificante del gen ectB, donde dicho gen codifica para el enzima diaminobutirato transaminasa; (e) la secuencia codificante del gen ectC, donde dicho gen codifica para el enzima ectoína sintasa; y (d) la secuencia codificante del gen ectD, donde dicho gen codifica para el enzima ectoína hidroxilasa. Preferiblemente, dichas secuencias codificantes están ordenadas de manera consecutiva.

20: El enzima diaminobutirato acetiltransferasa convierte el diaminobutirato en Ny-acetildiaminobutirato (NADA). El enzima diaminobutirato transaminasa convierte el aspartato semialdehído en diaminobutirato, y viceversa. El enzima ectoína sintasa convierte el NADA en ectoína. El enzima ectoína hidroxilasa convierte la ectoína en hidroxiectoína.

25: En una realización preferida del primer aspecto de la invención, el polinucleótido comprende al menos dos copias de la secuencia codificante del gen ectD que codifica para el enzima ectoína hidroxilasa. ,

30: Preferiblemente, el polinucleótido además comprende al menos un promotor. Más preferiblemente, el promotor permite la expresión en condiciones ambientales de salinidad entre 2 y 6% peso/volumen, aún más preferiblemente el promotor permite la expresión en condiciones ambientales de salinidad entre 3 y 5% peso/volumen. Preferiblemente, el promotor permite la expresión en condiciones

ambientales de temperatura entre 32 y 40 °C, aún más preferiblemente el

promotor permite la expresión en condiciones ambientales de temperatura entre

34 y 38 °C. Más preferiblemente, el promotor permite la expresión en condiciones

ambientales de salinidad entre 2 y 6% peso/volumen y temperatura entre 32 y 40

5: °C. Aún más preferiblemente, el promotor permite la expresión en condiciones

ambientales de salinidad entre 3 y 5% peso/volumen y temperatura entre 34 y 38

oc.

El término quot;promotorquot;, tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere

1O: a una secuencia de ADN que regula la expresión del (o de los) gen(es) que se

localiza(n) quot;corriente abajoquot;. Dicha secuencia permite la unión de factores de

transcripción, proteínas que van a modular la transcripción del (o de los) gen(es)

que regula(n) dicho promotor, así como de la ARN polimerasa.

15: En una realización preferida del primer aspecto de la invención, al menos uno de

los promotores es la secuencia nucleotídica promotora del gen ectA.

Preferiblemente, la secuencia nucleotídica promotora del gen ectA es SEQ ID NO:

5.

20: La regulación de la transcripción de los genes ectABC fusionados con el gen

ectD, por el promotor del gen ectA (pectA o ectAp, es decir, SEQ ID NO: 5) es

importante para el efecto técnico de la presente invención. Aunque en otros

microorganismos existen los genes de síntesis de ectoína e hidroxiectoína, en

cada uno la regulación de dichos genes es distinta. Los promotores originales de

25: C. sa/exigens tienen una expresión semiconstitutiva, siendo la expresión basal

bastante elevada. La región localizada en 5' de ectA está compuesta por 4

promotores, y en su conjunto se denomina pectA. La región localizada delante de

ectB contiene solo un promotor, que además de la secuencia entre ectA y ectB,

comprende parte del final de la secuencia codificante del gen ectA.

30

La ventaja de emplear el promotor pectA es que dicho promotor no se activa

únicamente a elevada salinidad y temperatura. El uso de promotores más fuertes

o activos a salinidades aún menores presentaría algunas desventajas: en el caso

de un promotor muy fuerte hay que tener en cuenta que la síntesis de ectoínas es

un proceso con un elevado coste energético. Esto hace que métodos descritos y

que consiguen obtener elevadas cantidades de ectoína lo hagan a costa de una

tasa de crecimiento del microorganismo muy baja, lo que es un inconveniente

5: importante para su aplicación industrial. Se necesita llegar a un compromiso entra

las cantidades de hidroxiectoína obtenidas y una tasa de crecimiento razonable,

dado que las ectoínas están asociadas a biomasa. En el caso de promotores

activos a salinidades aún más bajas, supone un inconveniente para su aplicación

en bacterias halófilas, que a salinidades muy bajas presentan un crecimiento

1 O: deficiente con producción y excreción de metabolitos inhibidores del crecimiento.

La ventaja de emplear bacterias halófilas es que presentan mecanismos de

transporte y excreción exclusivos que permiten aplicar técnicas del tipo del

quot;bacteria/ milkingquot;, que aumentan tanto la producción como la productividad de

solutos. Es importante tener en cuenta que la producción heteróloga en bacterias

15: no halófilas no se aplica en la producción industrial de ectoínas, por no resultar

ventajosa. Además, actualmente existen fermentadores fabricados de materiales

no corrosibles por la sal, aunque es preferible usar el menor porcentaje de sal

posible para simplificar y abaratar el proceso.

20: En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la secuencia

codificante del gen ectA para la enzima diaminobutirato acetiltransferasa es SEQ

ID NO: 1. La enzima diaminobutirato acetiltransferasa es la enzima E.C.

2.3.1.178. El gen ectA de C. salexigens tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 y

codifica la proteína con SEQ ID NO: 7.

25

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la secuencia

codificante del gen ectB para la enzima diaminobutirato transaminasa es SEQ ID

NO: 2. La enzima diaminobutirato transaminasa es la enzima E.C. 2.6.1.76. El gen

ectB de C. sa/exigens tiene la secuencia SEQ ID NO: 2 y codifica la proteína con

30: SEQ ID NO: 8.

En una realización preferida del primer aspecto de la invención, donde la

secuencia codificante del gen ectC para la enzima ectoína sintasa es SEQ ID NO:

3. La enzima ectoína sintasa es la enzima E.C. 4.2.1.108. El gen ectC de C.

sa/exigens tiene la secuencia SEQ ID NO: 3 y codifica para la proteína con SEQ

ID NO: 9.

5: En una realización preferida del primer aspecto de la invención, la secuencia

codificante del gen ectD para la enzima ectoína hidroxilasa es SEQ ID NO: 4. El

gen ectD de C. sa/exigens tiene la secuencia SEQ ID NO: 4 y codifica la proteína

con SEQ ID NO: 10.

1O: Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una construcción

génica que comprende el polinucleótido del primer aspecto de la invención.

Preferiblemente, la construcción génica es un vector de expresión. Más

preferiblemente, el vector de expresión comprende un origen de replicación de la

familia Halomonadaceae y un origen de replicación de enterobacterias.

15

El término quot;vector de expresiónquot;, tal y como se emplea en la presente descripción,

se refiere a una molécula de ácido nucleico usada para transferir material

genético a una célula. Aparte de dicho material genético, un vector también puede

contener diferentes elementos funcionales que incluyen elementos de control de

20: la transcripción, como promotores u operadores, regiones o potenciadores de la

unión a factores de transcripción, y elementos de control para iniciar y terminar la

traducción. Los vectores incluyen, pero no se limitan a: plásmidos, cósmidos,

virus, fagos, casetes de expresión recombinantes y transposones. Algunos

vectores son capaces de replicarse o dividirse autónomamente una vez que son

25: introducidos en la célula huésped, como los vectores bacterianos con un origen

de replicación bacteriano o los vectores episomales de mamíferos. Otros vectores

pueden integrarse en el genoma de la célula huésped y replicarse así junto con el

genoma celular. Un vector de expresión es aquel capaz de dirigir la expresión de

genes a los que se ha ligado de manera operativa. Un vector de expresión se usa

30: para la transcripción y la traducción de un gen de interés, normalmente controlado

por un promotor. El promotor está operativamente unido al gen de interés.

quot;Operativamente unidoquot; se refiere a la relación funcional y a la localización de la

secuencia del promotor con respecto al gen de interés, por ejemplo, un promotor

o potenciador está operativamente unido a un secuencia codificante si afecta a la

transcripción de la secuencia. En general, un promotor operativamente unido está

contiguo a la secuencia de interés. Sin embargo, un potenciador no tiene que ser

contiguo a la secuencia de interés para controlar su expresión. El término quot;origen

5: de replicaciónquot;, tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a una

secuencia de nucleótidos donde se forma una horquilla de replicación y donde se

inicia la replicación del ADN.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a una célula que comprende

1O: el polinucleótido del primer aspecto de la invención o la construcción génica del

segundo aspecto de la invención. Preferiblemente, dicha célula es de la especie

es Chromohalobacter sa/exigens. Dicha especie es una bacteria halófila de la

familia Halomonadaceae, orden Oceanospirillales, clase Gamma Proteobacteria,

filum Proteobacteria, reino Bacteria. C. salexigens no crece bien en medios donde

15: la salinidad es inferior a 0,6 M de NaCI y su crecimiento empieza a ser óptimo a

partir de 0,75 M (4.35%).

En la célula de la invención, los genes de síntesis de ectoína e hidroxiectoína

están en trans, es decir, en una construcción independiente del genoma de la

20: célula, en un vector híbrido entre un plásmido nativo de bacterias halófilas y un

replicón de E. coli, por lo que al menos es capaz de replicar en enterobacterias y

bacterias de la familia Halomonadaceae.

Los inventores de la presente invención han probado las construcciones de la

25: presente invención en E. coli para intentar producir el soluto a menor salinidad (1-

3%) y, aunque se obtienen cantidades apreciables de hidroxiectoína, no son lo

suficientemente grandes como para considerarlo ventajoso (ver ejemplo 7). En

cultivos de E. co/i con la construcción génica de la invención, se produce ectoína

e hidroxiectoína pero no en cantidad suficiente. En E. coli la producción de

30: ectoína se ve limitada por cuellos de botella metabólicos como el de la aspartato

quinasa. En otras palabras, no es sólo que las bacterias halófilas del tipo C.

salexigens poseen una ruta específica para la producción de ectoínas, es que

todo su metabolismo está consagrado y altamente especializado en la producción

de ectoínas, y ha evolucionado de forma que los flujos metabólicos están derivados hacia la producción de estos compuestos, que pueden constituir hasta el 70-80% de la fracción soluble en los procesos de extracción.

En la presente memoria, el término quot;solutoquot; se refiere a la ectoína o hidroxiectoína.

En una realización preferida del tercer aspecto de la invención, la célula es incapaz de expresar los genes ectA, ectB, ectC y ectD nativos. Preferiblemente, dicha célula es de la estirpe CHR137 de C. salexigens.

La expresión quot;incapaz de expresar los genes ectA, ectB, ectC y ectD nativosquot;, tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a que dichos genes en el genoma de la bacteria están alterados, bien están ausentes porque han sido delecionados, o bien han sido interrumpidos por la inserción de una secuencia que impide la correcta expresión de los mismos, o bien han sido mutados de cualquier forma conocida por un experto en la materia para impedir que se expresen las enzimas para las que codifican. Cuando una célula es incapaz de expresar dichos genes, se entiende que dichos genes han sido inactivados. La estirpe CHR137 ha sido descrita en García-Estepa, et al. 2006. J. Bacteriol.

188:3774-84. Las características esenciales de dicha célula son que pertenece a la especia C. salexigens y que es incapaz de expresar los genes ectA, ectB, ectC y ectD nativos. La forma en que se altera el genoma de la célula para que esta sea incapaz de expresar los genes ectA, ectB, ectC y ectD nativos es irrelevante, ya que el experto en la materia conoce multitud de técnicas para lograr la inactivación de dichos genes.

La célula de la presente invención es más eficaz en la producción de ectoínas, especialmente hidroxiectoína, que otros microorganismos salvajes descritos hasta la fecha y que la estirpe mutante (donde los genes de síntesis de ectoína/hidroxiectoína han sido inactivados) sin la construcción. El hecho de combinar los cuatro genes ectABCD en una misma construcción, controlados por el promotor pectA, sumado al hecho de emplear la bacteria halófila C. salexigens

5: ya hace muy eficiente la producción de ectoína e hidroxiectoína, pero cuando realmente se favorece sorprendentemente la producción, especialmente de hidroxiectoína, es cuando se emplea además una copia adicional del gen ectD y, sobre todo, una estirpe donde se han inactivado los genes nativos de síntesis de ectoína/hidroxiectoína.

Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un método para producción de ectoína e hidroxiectoína que comprende las siguientes etapas:: la

1 O: (a) cultivar la célula del tercer aspecto de la invención, y (b) purificar la ectoína y la hidroxiectoína a partir del cultivo de (a).

15: En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención, la etapa (a) se lleva a cabo en condiciones de salinidad de entre 2 y 7% peso/volumen. Preferiblemente, la etapa (a) se lleva a cabo en condiciones de salinidad de entre el 3 y 5% peso/volumen.

20: En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención, la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura de entre 30 y 50° C. Preferiblemente, la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura de entre 34 y 40° C.

25: Preferiblemente, el cultivo de la etapa (a) se lleva a cabo en un medio mínimo. Dicho medio es preferido para la posterior purificación de los solutos y su composición es conocida en el estado de la técnica. Un ejemplo no limitante de dicho medio mínimo podría ser el medio M63 descrito en Csonka, 1982 J Bacteriol. 151:1433-43.

30: A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra quot;comprendequot; y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se

proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la

presente invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Muestra un esquema de las construcciones pHS15ABCD y pHS15DD. Las secuencias promotoras son ectAp (1-4) y ectBp, y las secuencias codificantes son ectA, ectB, ectC y ectD. A ambos lados de la construcción génica hay dianas del enzima de restricción EcoR l. La secuencia de la construcción génica de arriba es SEQ ID NO: 11 y la de la de abajo es SEQ ID NO: 12.

FIG. 2. Representa el vector pHS15. Se muestran los puntos de corte de diversas enzimas de restricción, así como los genes de resistencia a ampicilina (amp) o a estreptomicina y espectinomicina (Sm/Spc), el origen de replicación en

E. coli, CoiE1 ori y el origen de replicación oriT.

FIG. 3. Representa la construcción del vector pHS15ABCD. Se muestran las distintas etapas de la construcción descritas en los ejemplos. A. Construcción del vector pME2.2. B. Construcción del vector pHS15ABCD.

FIG. 4. Representa la construcción del vector pHS15DD. Se muestran las distintas etapas de la construcción descritas en los ejemplos.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la eficacia del método para la producción de ectoína e hidroxiectoína de la presente invención.

Ejemplo 1: construcciones génicas. Se planteó la fusión de los genes responsables de la síntesis de ectoína (ectABC) e hidroxiectoína (ectD) de C. salexigens de manera que el gen ectD quede bajo el control de las zonas promotoras existentes en el operón ectABC. Posteriormente

esa fusión se clonó en el plásmido pHS15 (ver figura 2 y Vargas y col., 1995 Mol

Gen Genet. 246:411-8), vector de clonación y expresión en bacterias halófilas

moderadas con múltiples sitios de restricción únicos útiles para la clonación de

ADN. El plásmido pHS15 contiene el plásmido pHE1, autóctono de H. elongata, el

5: gen de resistencia a la estreptomicina y la espectinomicina, el plásmido

pBiuescript KS (incluyendo el gen de resistencia a la ampicilina y el origen de

replicación de E. cofl) y una región de 3,1 kb de la región oriT.

Se plantearon dos construcciones diferentes: una primera con una sola copia del

1O: gen ectD y una segunda con dos copias de este gen con el fin de comprobar el

efecto de aumentar la dosis génica sobre la producción de hidroxiectoína.

Como muestra la figura 3, en primer lugar, a partir del plásmido pME2 (plásmido

pSK Bluescript que contenía el operón ectABC completo, es decir, SEQ ID NO: 6),

15: se introdujo, mediante mutagénesis dirigida por PCR, un punto de corte BamHI

entre el gen ectC y el terminador transcripcional existente detrás de éste,

resultando el plásmido pME2.1. A continuación, sobre el plásmido pME2.1 se

eliminó, mediante mutagénesis dirigida por PCR, el punto de corte BamHI

presente en el sitio de multiclonación del pSK Bluescript, dando como resultado el

20: plásmido pME2.2. Posteriormente a partir del plásmido pEctD (plásmido pSK

Bluescript que contenía el gen ectD (SEQ ID NO: 4)) se introdujo, mediante

mutagénesis dirigida por PCR, un punto de corte Bc/1 en la zona intergénica

posterior al gen ectD, obteniéndose el plásmido pEctD.1. Se digirió el plásmido

pME2.2 con BamH 1 y el plásmido pEctD.1 con Bc/1 (que extrae el gen ectD). Se

25: procedió a la ligación de ambas construcciones digeridas obteniéndose el

plásmido pEctABCD (que contiene la construcción ectABCD, es decir, SEQ ID

NO: 11 ). Esta construcción pEctABCD se digirió con EcoRI para extraer la fusión

ectABCD (SEQ ID NO: 11), así como el plásmido pHS15 con el mismo enzima,

para a continuación proceder a la ligación de la fusión con pHS 15, obteniéndose

30: el plásmido pHS15ABCD (Figuras 1 y 3).

Por otro lado, como muestra la figura 3A, partiendo del plásmido pEctABCD, se

introdujo, mediante mutagénesis dirigida por PCR, un punto de corte BamHI entre

el gen ectC (SEQ ID NO: 3) y el gen ectD (SEQ ID NO: 4), obteniéndose el

plásmido pEctABCD.1. Esta construcción resultante se utilizó para eliminar un

punto de corte BamHI interno del gen ectD, mediante mutagénesis dirigida por

PCR e introduciendo una mutación silenciosa, obteniéndose el plásmido

5: pEctABCD.2. Se digirió el plásmido pEctD.1 con Bc/1 (que extrae el gen ectD) y

pEctABCD.2 con la enzima BamHI. Se procedió a la ligación de ambas

construcciones digeridas obteniéndose el plásmido pEctDD. Esta construcción

pEctDD se digirió con EcoRI para extraer la fusión ectABCDD (SEQ ID NO: 12),

así como el plásmido pHS15 con la mismo enzima, para a continuación proceder

1O: a la ligación de la fusión con pHS15 (Figura 2), obteniéndose el plásmido

pHS15DD (Figuras 1, 3 y4).

Ejemplo 2: estirpes receptoras y cultivos.

Todos los porcentajes de NaCI se refieren a% (p/v).

15

Como estirpes receptoras de las construcciones se escogieron la estirpe silvestre

de C. salexigens, un mutante de C. salexigens incapaz de producir ectoína ni

hidroxiectoína (CHR137) y E. coli DH5a.

20: Ambas construcciones, pHS15ABCD y pHS15DD, se introdujeron en E. coli

DH5a, la estirpe silvestre de C. salexigens y en el mutante CHR137.

La estirpe CHR61, un mutante espontáneo de C. sa/exigens DSM3043 resistente

a la rifampicina, fue empleado como estirpe silvestre. CHR61 reproduce el

25: fenotipo de la estirpe silvestre a todas las condiciones ensayadas. Las estirpes de

C. salexigens se cultivaron de forma rutinaria en medio complejo SW-2 que

contenía un 2% de sales totales (Vargas y col., 1997). E. coli fue cultivada

aeróbicamente en medio complejo Luria-Bertani (LB) (Miller, 1992). Como medio

mínimo para todas las estirpes se empleó el medio M63 (Csonka, 1982 J

30: Bacteriol. 151:1433-43) a diferentes salinidades: 4,35%, 8,7% y 14,5% de NaCI en

el caso de las estirpes de C. sa/exigens y 1%, 2% y 3% de NaCI para E. coli. La

fuente de carbono utilizada fue glucosa a una concentración 20 mM. El pH de

todos los medios se ajustó a 7,2 mediante la adición de KOH. Los cultivos fueron

incubados a 37 °C en un agitador orbital a 200 rpm. En caso de ser necesarios, se

añadieron antibióticos previamente esterilizados por filtración a las siguientes

concentraciones (IJg ml-1): ampicilina (Ap), 150 para E. coli; kanamicina (Km), 50

para E. coli y 75 para C. salexigens; rifampicina (Rf), 25 para E. coli y C.

5: salexigens; estreptomicina (Sm), 20 para E. coli y 50 para C. sa/exigens. El

crecimiento se monitorizó mediante la medición de la densidad óptica de los

cultivos a 600 nm con un espectrofotómetro Perkin-Eimer Lambda 25 UVNis.

Ejemplo 3: transferencia de las construcciones.

1O: Los plásmidos fueron transferidos de E. coli a C. sa/exigens mediante conjugación

triparental en medio SW-2, utilizando pRK600 como plásmido ayudante (quot;helper'),

tal y como está descrito en Vargas y col., 1997 System Appl Microbio! 20:173-181.

Ejemplo 4: determinación de la concentración de ectoínas.

15: Para la determinación de la concentración de ectoína e hidroxiectoína, las células

se obtuvieron por centrifugación de los cultivos en fase estacionaria temprana y

fueron congeladas. Estas células fueron sometidas a un extracción mediante una

modificación del método de Bligh y Dyer, tal y como describen Kraegeloh y Kunte

(2002 Extremophiles 6:453-462). La concentración de ectoína e hidroxiectoína se

20: midió por cromatografía líquida y espectrometría de masas (HPLC-MS). Esta

concentración siempre corresponde a una producción a punto final en cultivos en

matraz (no corresponde a procesos de quot;bacteria/ milkingquot; ni a cultivos en

fermentadores y/o de elevada densidad celular).

25: Ejemplo 5: la estirpe CHR137 con la construcción pHS15DD produce

mayores cantidades de hidroxiectoína con menor salinidad y temperatura.

Todas las estirpes fueron cultivadas en medio mínimo M63 a las salinidades

expuestas anteriormente. Una vez alcanzada la fase estacionaria, las células

fueron centrifugadas, sometidas a un proceso de extracción y se midió por HPLC-

30: MS su contenido en ectoína e hidroxiectoína. En la tabla 1 se muestran las

producciones de ectoínas de las diferentes estirpes así como su tasa de

crecimiento específica y las tasas específicas de producción resultantes. Como la

producción de ectoínas está directamente relacionada con la biomasa cuando la

salinidad es constante, la tasa específica de producción [IJmol/(g peso seco hora)]

(IJmol/(g PS h) es una función simple del contenido en hidroxiectoína y la tasa de

crecimiento (Seip y col., 2011Appl Enviran Microbio!. 77:1368-74).

5 Tabla1. Producción de ectoína e hidroxiectoína en la estirpe silvestre de C. salexigens y en las estirpes silvestre y CHR137 portando las construcciones pHS15ABCD y pHS15DD a 37 oc y diferentes salinidades.

Estirpe: Salinidad (% p/v) Tasa crecimiento (IJ) (h-1) Ectoína Hidroxiectoína Tasa Cantidad producción (!Jmollg específica DBM) (IJmollg DBM·h)

Cantidad (¡.Jmollg PS): Tasa producción específica (!Jmollg PS·h)

C. salexigens wt: 4,35 0,24 393 94,3 59 14,1

8,7: 0,33 654 215,8 202 66,6

14,5: 0,21 725 152,2 324 68

14,5*A: 0,15 381 57,21 942 141

C. salexigens wt pHS15ABCD: 4,35 0,14 220 30,8 483 67,62

8,7: 0,25 156 39 424 106

C. salexigens wt pHS15DD: 4,35 0,18 68 12,2 384 69,12

8,7: 0,29 108 31,3 361 104,6

C. salexigens CHR137 pHS15ABCD: 4,35 0,14 81 11,3 598 83,72

8,7: 0,1 170 17 632 63,2

C. salexigens CHR137 pHS15DD: 4,35 0,14 93 13 883 123,62

8,7: 0,1 286 28,6 967 96,7

*A indica a 45 °C.

10 Como ya fue comentado anteriormente, la estirpe silvestre de C. salexigens alcanza un contenido máximo de ectoína a una salinidad de 14,5% NaCI y 37 °C, con 725 ¡Jmol/g peso seco de ectoína y observándose una tasa de crecimiento de 0,21, lo que arroja una tasa de producción de 152,2 ¡Jmol/(g PS hora). En cambio,

15 el máximo contenido intracelular de hidroxiectoína se alcanza a una salinidad de

5: 14,5% NaCI y 45 °C., con 942 IJmol/g peso seco de hidroxiectoína, una tasa de crecimiento de O, 15 y una tasa de producción de 141 IJmol/(g PS hora). Cuando se analizan los datos de producción de ectoínas para las estirpes portadoras de las fusiones transcripcionales lo primero que se observa es una mayor producción de hidroxiectoína en todas ellas que en la estirpe silvestre cuando se cultivaron a las mismas salinidades (4,35% y 8, 7% NaCI) (ver tabla 1 ).

1O: No se pudo analizar el contenido intracelular de ectoínas de estas estirpes cultivadas a una salinidad de 14,5% porque mostraron un crecimiento muy retrasado o fueron incapaces de crecer.

15 20: Es destacable como esta mayor producción de hidroxiectoína se produce a costa de una disminución en el contenido de ectoína, aunque esta última no llega a desaparecer en ninguno de los casos. Este mayor contenido en hidroxiectoína está acompañado por una disminución de las tasas de crecimiento en comparación con las observadas para la estirpe silvestre. Esta disminución en la tasa de crecimiento puede ser explicada por la mayor concentración de hidroxiectoína en detrimento de la ectoína, como ya se ha expuesto anteriormente la ectoína posee una función eminentemente osmoprotectora mientras su derivado hidroxilado posee funciones termoprotectoras adicionales y no es tan eficaz como agente osmoprotector.

25: También es destacable la diferencia de producción de ectoínas entre la estirpe silvestre y la estirpe mutante cuando ambas portan las construcciones con las fusiones transcripcionales. Aunque en ambas, sea cual sea la construcción, el equilibrio ectoína/hidroxiectoína se encuentra desplazado hacia la segunda, este desplazamiento es mucho mayor cuando la estirpe portadora es CHR137.

30: Otra diferencia es el funcionamiento de las dos construcciones en ambas estirpes, mientras en la estirpe silvestre se alcanza una mayor producción y productividad de hidroxiectoína cuando porta el plásmido pHS15ABCD, sorprendentemente en la estirpe CHR137 se obtienen mejores resultados con la construcción pHS15DD.

Las mayores producciones de hidroxiectoína se obtuvieron con la estirpe CHR137

que portaba el plásmido pHS15DD. Esta estirpe tuvo una producción de 883 ¡Jmol

hidroxiectoína/g peso seco y una productividad de 123,6 ¡Jmol hidroxiectoína/(g

PS h) a una salinidad de 4,35% NaCI y 37 °C, es decir, una producción y una

5: productividad del mismo orden que las de la estirpe silvestre a una salinidad de

14,5% y 45 °C.

Cuando se cultiva CHR137 portando la construcción pHS15DD a una salinidad de

8, 7% y 37 oc se obtiene una cantidad de hidroxiectoína (967 ¡Jmol

1 O: hidroxiectoína/g PS) similar a la de la estirpe silvestre a 14,5% y 45 °C. Sin

embargo, esta producción de hidroxiectoína lleva asociada una drástica caída de

la tasa de crecimiento (0, 1) que hace que la productividad de esta estirpe sea

menor (96,7 ¡Jmol hidroxiectoína/g PS).

15: Ejemplo 6: la estirpe CHR137 con la construcción pHS15DD produce

mayores cantidades de hidroxiectoína que otros ensayos anteriores.

En la tabla 2 encontramos las producciones de hidroxiectoína obtenidas en

diferentes estudios anteriores y en la presente invención, así como las salinidades

a las que se obtuvieron y las tasas específicas de producción resultantes.

20

Podemos destacar que con la estrategia de la presente invención se obtienen

cantidades de hidroxiectoína superiores a otros sistemas propuestos,

manteniendo una productividad del mismo orden que muchos de los estudios

comparados. Todo ello a una de las salinidades inferiores ensayadas para la

25: producción de hidroxiectoína {4,35%). Aunque Seip y col. (2011 Appl Environ

Microbio!. 77:1368-74) prueban un 2% de salinidad en producción heteróloga en

E. coli, la producción de hidroxiectoína es sustancialmente menor.

Como se comentó anteriormente, el proceso que actualmente se emplea para la

30: producción industrial de hidroxiectoína emplea el método conocido como

quot;bacteria/ milkingquot; con la bacteria H. elongata (filogenéticamente muy cercana a C.

salexigens) a temperaturas y salinidades superiores a las empleadas para la

producción de ectoína (por encima del14% de NaCI).

Una ventaja adicional de la presente invención frente al estado de la técnica es que a diferencia de Marinococcus spp., C. salexigens puede ser sometido a choques hipoosmóticos por dilución simple del medio de cultivo liberando la mayor parte de sus solutos internos y sin perder viabilidad de las células (Fallet y col., 2010 Biotechnol Bioeng. 107:124-33).

Tabla2. Comparación de distintos estudios sobre producción de hidroxiectoína

Estirpe: Salinidad Tasa crecimiento (IJ) (h-1) Contenido (IJmol/g PS) Tasa producción específica (¡.Jmol/g PS·ht Referencia

Marinococcus sp. M 52: 10% 0,258 860 215 Frings et al., 1995c

Marinococcus sp. M52: 10% 0,20 670 134 Schiraldi et al., 2006°

Marinococcus sp. M 52: 10% 0,03 603 18 Schiraldi et al., 2006°

H. boliviensis: 18,5% proceso en múltiples etapas 950 169 Van Thuoc et ai.,2010E

P. stutzeri DSM190T: 5% 0,16 480 76,8 Seip et al., 2011

E. coli DH5a/pSB01: 2% 0,35 500 175 Seip et al., 2011

C. salexigens DSM3043 salvaje: 10,75% 0,3 2.528 76 Fallet et al., 2010F

C. salexigens CHR137/DD: 4,35% 0,14 883 123,62 la presente invención

A. Tasas de producción específica calculadas en función del contenido, la tasa de crecimiento y la biomasa.

B. Máxima.

C. El microorganismo no crece exponencialmente, y la máxima tasa de

15 crecimiento es únicamente observada al inicio de la fermentación, la hidroxiectoína es retenida en las células tras el shock hipoosmótico.

D. Las células fueron cultivadas en un fermentador con una tasa de crecimiento de 0,2 para posteriormente ser sometidas a diálisis continua para retirar compuestos inhibidores del crecimiento (tasa de crecimiento de 0,03).

E. En una primera etapa las células fueron cultivadas a salinidad óptima para la

5 producción de biomasa, y posteriormente se transfirieron a un medio con mayor salinidad para la producción de solutos. El tiempo necesario para la etapa 1 (24 horas), así como un periodo de adaptación de 3 horas al principio de la etapa 2 no han sido tenidos en cuenta para el cálculo de la tasa específica de producción.

F. Cálculos para una biomasa máxima de 61 g/L. La fermentación está optimizada

1 O para la producción simultánea de ectoína e hidroxiectoína, Cantidad de ectoína: 3797 ~mol/g.

La estrategia de la presente invención puede ser aplicada en la producción industrial de hidroxiectoína a menores salinidades y temperaturas de las que se 15 emplean actualmente y supone una gran ventaja para dicho proceso.

Ejemplo 7: producción de hidroxiectoína en E. co/i con las construcciones pHS15ABCD o pHS15DD.

Las construcciones pHS 15ABCD y pHS 1500 se probaron en E. co/i para intentar

20 producir el soluto a menor salinidad (1-3%). Sin embargo, aunque se obtienen cantidades apreciables de hidroxiectoína, estas no son lo suficientemente grandes como para considerar ventajoso un método que emplee esta bacteria (tabla 3).

Tabla 3. Producción de ectoína e hidroxiectoína E. co/i DH5a portando las · 25 construcciones pHS15ABCD o pHS15DD a 37 oc y diferentes salinidades.

Tasa

Estirpe: Salinidad crecimiento Ectoína Hidroxiectoína

(IJ) (h-1)

Tasa

Cantidad: Tasa producción Cantidad producción

(¡Jmol/g: específica (¡Jmol/g (¡Jmol/g específica

DBM): DBM·h) DBM) (¡Jmol/g

: DBM·h)

E. coli: 1% 0,35 0,48 0,168 80,1 28

DH5a/pHS15ABCD: 2% 0,32 0,84 0,268 124,1 39,7

3%: 0,2 0,82 0,164 30 6

E. coli: 1% 0,4 0,045 0,018 6,56 2,6

DH5a/pHS15DD: 2% 0,35 0,255 0,089 10,4 3,64

3%: 0,15 0,19 0,028 3,04 0,45