JPH01503674A - ２，４‐ジクロルフエノキシ酢酸（２，４‐ｄ）‐モノオキシゲナーゼ形成用の微生物及びプラスミド並びにこれらのプラスミド及び菌株の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２．４−ジクロルフェノキク酢酸（２゜４−Ｄ）−モノオキシゲナーゼ形成用 の微生物及びプラスミド並びにこれら のプラスミド及び菌株の製法 本発明は、遺伝子ｔｆｄＡ又は基本的にｔｌＡと同等の遺伝子を、正確に特徴付 けることのできる翅いＤＮＡ断片上に含有するプラスミド及び細菌株の遺伝子工 学的製造に関する。この新しいプラスミド及び微生物は、２．４−Ｄ−モノオキ シゲナーゼの製造に並びにこの酵素の２．、ｉ−Ｄ分解特性を種々の生物に遺伝 子工学的に転移させるための出発物質として特に好適である（遺伝的に形質転換 された植物ではこれにエリ達成される２、４−ｒ）耐性を含む）。

２．４−Ｄ−モノオ午りデナーゼは、２．４−Ｄを分解する多数の生物中で、２ ．４−ジクロルフェノキク酢酸（２，４−Ｄ）の物質代謝の第一工程を触媒する 酵素である。２．４−Ｄ分解生物には、特に、例えばアキネトバクタ（Ａｃ１ｎ ｅｔｏｂａｃｔｅｒ　）　、アＡ／　ｆ２１Ｊデネス（Ａ：Ｌｃａｌｌｇｅｎｅ ａ　）、アルトロバクタ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウＡ　 （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）及びプソイドモナス（Ｐａｅｕｌｏｍｏ ｎａｓ　）のような土壌細菌が含まれる（　Ｇ、　Ｒ，Ｂａ１ｌ、Ｃａｎ、　Ｊ 、　ＭｉｃｒｏｂｉＯｌ、　３　：　８’ｌ　ｉ（１９５７）　：　Ｊ、　Ｍ、 　Ｂｏｌｌａｇ及びその他、Ｊ、　Ａｇｒｉｃ。

Ｆｏｏｄ　Ｃｈａｚ、、　１　６　：　８２６　（１９６８）　；Ｒ，Ｈ，Ｄｏ ｎ及びその他、Ｊ、　Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、１４５：　６８１％（１９８１）　 ：　Ｗ、　Ｃ，Ｒｖａｎｓ及びその他、Ｐｒｏｃ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｃ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、５７巻：　４（１９５４）：Ｗ 、　Ｃ，Ｅｖａｎｃｅ及びその他、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、１２２：５４３　 （１９７１）　：　Ｒ，Ｐ、　Ｆｉｓｈｅｒ及びその他、”　Ｊ、　Ｂａｃｔｓ ｒｉｏｌ、　”、１３５ニア９８（１９７８）：Ｔ、　１．８ｔｅｅｎｓＯｎ及 びその他、Ｊ、　Ｇ＝ｎ、　ＭｉｅｒＯｂｉＯｌ、、１６　：　１４６　（１９ ５７）　：　Ｊ、　Ｍ、　Ｔｉｅｄｊｅ及びその他、Ｊ、　Ａｇｒｉｃ、　Ｆｏ ｏｄ　Ｃｈａｍ、　１７　：　１０８０（１９６９）　：　Ｊ、　ｇ、　Ｔｙｌ ｅｒ及びその他、Ａｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ、、　２８、１８１（１９７４）：Ｊ、Ｍ。

Ｔｉｅｄｊｅ及びその他、Ｊ、　Ａｇｒｉｃ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ、、１７：１ ０２１（１９６９）参照〕。これらの細菌は土壌及そ び廃水を、農業で使われる殺／７剤及び除草剤で見られる工うなハｃｘｒン化芳 香朕化合物を除去して解毒する際に著しく重要である。

２．４−Ｄを分解する野性型細菌の計知では菌株アルカリ２ネス・オイトロ７ス （ＡｌｃａｌｉｇｅｎθＢｅ１１ｔｒｏｐｈｕｓ　）　ＪＭＰ　１３４が最も良 く知られておシかり最もその特性が明らかにされている。この菌株は２゜４−ｒ ）の分解に重要な遺伝子全部を含有する大きさ約４　Ｑ　ｋｂのプラスミドｐ、 ｙｐ　Ａを含有する（　Ｒ，Ｈ，Ｄｏｎ及びその他の前記文献〕。最近、プラス ミドｐＪＰ４は単離されかつ特徴が解明された（　Ｒ，Ｈ，Ｄｏｎ及びその他、 Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１６１　：　４６５（１９８５））。

ｔｌＢ　、　ｔｆｄｃ　、　ｔｆｄＤ　、　ｔｆａＥ及びｔｆｄｐ’として表わ される２、４−ｎ分解に関与する５個の遺伝子はトランスポゾン突然変異にエリ 局在化されかつＥ、コリ（ｃｏｌｉ　）中でクローン化された。その際に、Ｒ， Ｈ。

ｎｏｎ及びその他（Ｊ、　Ｂａｃｔａｒｌｏｌ、、１６１：８５（１９８５）） の生化学的研究にニジ４個の遺伝子に酵素機能をもたらすことができた。

しかしながら従来は、遺伝子ｔｆｄＡをプラスミド１）、ＴＰ　４又はそのサブ フラグメント上に局在化し、単離しかつその構造を解明することに成功していな い。

ところで不発明にエリ、彷めて遺伝子ｔｆａＡｋ単離し、クローン化しかつ特徴 を明らかにすることができた。それ故、この遺伝子を他の生物上に転移するため に使用することが可能であり、その目的はｔｆｄＡに工りコード化された２、４ −Ｄ−モノオキシゲナーゼを他の生物中で発現させるためである。その際に微生 物が該当し、しかしまた例えば植物のような高等生物も該当する。

ｔｆｄＡを他の微生物に転移することによって、これらの生物によって分解可能 な物質の範囲を拡大することができる。全体的な２．４−ｎ分解の遺伝子の転移 及び発現は細菌に関しては既に記載されている〔Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１４５　：　６８１　（１９８１）及びＡｒｃｈ。

）、（ｉｃｒｏｂｌｏｌ、１３４：９２頁（１９８３））。しかし単離したｔｆ ｄＡ遺伝子をプソイドモナス又はアルカＩＪ　’７”ネスの工うなグラム陰性１ 中で発現させる研究はまだ行なわれなη為った。このような研究は植物に関して も知られていなかった。数種の植物による２、４−りの代謝は報告されている（ 　Ｗｅｅｄ　５ｃｉｅｎｃｅ　’ｌ　４　：５５７（１９７（５）及びＺ、　Ｐ ｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓ＋ｉｎ１．１１０　：３９５（１９８３））。この物質 は、低濃度でオーキシンに似た植物ホルモンとして作用し、それ故細胞培養技術 で使用し、高濃度では植物の細胞並びに植物全体に対して生長抑制物質として作 用し、こｎが除草剤としてのその使用の理由である。＝チアナ・シルベストリス （Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｇ　）の−缶体細胞懸濁液培養では ２．４−ｒ）の高まる濃度に合わせてこの合成生長物質に対して、高められた代 謝出に基づく耐性が達成される（Ｍ、　Ｈ，Ｚａｎｋ、１９７４、Ｈａｐｌｏｉ ｄｓ　ｉｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈθｍ１ｃａｌ　ｒ θ５ｅａｒｃｈ、　ＩｎＨａｐｌｏｉｄｓ　ｉｎ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ 、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ａｎｄｐＯｔｅｎ１＋ｉ＆　１．７　Ｐｒ　Ｏ（！　ｅ　 ｅ　（１ｉｎｇａ　Ｏｆ　ｔｈ　＠Ｉ　Ｆ　Ｌ　ｒ　ａ　１−　Ｉ　ｎｔＱ　ｒ ｎａ　ｔ戟h’ ｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　、３３９頁、カナダ国、０ｎｔａｒｉＯ。

Ｇｕｅｌｐｈ　〕。

遺伝子ｔｌＡが２．４−ｒ）の側鎖の脱離を仲介するので、２．４−Ｄ’に失活 化するその能力を細菌から得られた遺伝子を用いて、このＬうな遺伝子工学操作 が可能であるすべての植物に転移させることができるはずである。異種遺伝子を 植物及びその子孫に転移する方法は今日まで既に数種の植物について実験され（ Ｍ、　Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ　、　Ｌ、　Ｈｅｒｒｅｒａ　Ｅａ℃ｒｅｌｌａ　、　 Ｍ、　ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ　、　Ｊ、　５ｃｈｅｏｌ及びｐ、　Ｚ５Ｌ社ｔｌ ｒ７１ｉｋｉ　、１９８４、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｆｏｒｅｉｇｎ　ｇ ｅｎｅｓ　ｉｎ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｐｌａｎｔｌｉ　ａｎｄ　ｉｎ　ｔｈ ｅｉｒ　’ｐｒｏｇｅｎｙ、　１１ｉｉＭＢＯＪ、　、３　：１６８１並びにＲ ，Ｄ、　５ｈｉｌｌｉ℃ｏ　、　Ｍ、　Ｗ、　５ａｉｌ、Ｊ、　Ｐａｅｚｋｏｗ ａｋｉ、Ｍ、　’ＭｕｅｌｌＡｒ及びＪ、　Ｐｏｔｒｉｋｕｅ、１９８５、Ｈｌ ｇｈ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｄｉｒｅｃｔ　ｇｏｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒｔｏ 　ｐｌａｎｔｇ　５ｓｉｏ　／　ｔｅｃｈｎ０１０ｇ７　、３　：　１０９９　 ）、かつ近いうちに広範な通用可能性を達成することになる。

植物の遺伝的形質転ｉ［ｆｌして大きな希望を託すことになり、特に人間にとっ て重要な新種の有用哨物の開発に関してである（Ｊ、　Ｌ、Ｍａｒｘ、　１９８ ５、Ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｂｅｃｏｍｅｓ　ａ　ｆｅｒｔ ｉｌｅ　ｆｉｅｌｄ。

５ｃｉｅｎｃｅ　２３０　：　１１４８　）。遺伝子ｔｆｄＡ　Ｋ　工り、新し い遺伝的に転移可能で生体内で選択可能な性質を、従来は僅かな抗生物質−もし くは除草剤耐性に関してだけ仰られているような、生長抑制物質に対する耐性の 形で適用し得たであろう（Ｒ，Ｔ、　Ｆｒａｌｅｙ及びその他、１９８３、Ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｇｅｎｅｓ　１ｎｐｌａｎｔ　 ｃｅｌｌｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０　 ：４８０３及びＮａｔｕｒｅ　３１７　：　７４１　（１９８’５　）　）。

初めは本発明は、公知の突然変異法の通用ドに例えばアルカリゲネス・オイトロ フスＪＭＰ　１３４のような２．４−Ｄを生長基質として使用し得る細菌株から ２．４−Ｄ−モノオキシゲナーゼの撰造遺伝子が失活化されでいる従来公知では なかった突然変異体を製造することであった。この突然変異体は試験管内でのＤ ＮＡ組み換え、組み換えＤＮＡによる形質転換及びｔｆｄＡ又はｔｆａＡとほぼ 同一の遺伝子を含有する組み換えＤＮＡを選択するための傾合的なｒ１ＮＡ転移 という公知方法の通用ドに使用する。

本発明の目的は、遺伝子ｔｆａＡ又はｔｆｄＡと基本的に同等の遺伝子を含有す るプラスミド、並びにプロモータ領域を含めてこの遺伝子の一部を含有するプラ スミドである。

本発明によるシラスミドは、２．４−Ｄ又は２，４−Ｄ類縁化合物の代謝用の遺 伝子を有する野生型細菌からのＤＮＡ　’ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化し、 かつ生成したＤＮＡフラグメン）”ｔ　ＤＮＡ＋）ガーゼを用いて、予め同じ制 限酵素によりその直線型に変換されているプラスミドベクターと連結することに より製造することができる。

このように生成した組み換えプラスミドでは、本発明によるｔｆｄＡ含宵プラス ミドを、該プラスミドを細菌株中に導入し、その菌株から直接ｔｆｄＡに工り仲 介される話力に基づいてｔｆ＋ｉＡ含有クローンが選択され得ることに工す同定 することができる。

その工うな細菌株は、生体内での酵素的反応において２．４−Ｄ−モノオ卆ノデ ナーゼにニジ形成された生成物（その基質ではない）を炭素源及びエネルギー源 として使用することができるという性質を有する。

前記の性質を有する菌株の例は、すべての遺伝子が２．４−ザクロルフェノール の分解に関して活性である本発明によるｔｆａＡ突然変異体、更にフェノールの 分解経路を有する菌株アルカリゲネス・オイトロフスＪＭＰ　２２２　、並びに ４−クロルフェノールを利用スルことのできるメンイドモナス（Ｐ日８′ｕｄｏ ｍｏｎａθ）　ｓｐ、　Ｂ１３である。槌々の置換基を有するフェノールを分解 することができかつ主にグラム陰性菌群に含まれる他の一連の菌株全クローン化 ｔｌＡ遺伝子の選択及び同定のための宿主として生成することができる。

クローン化ベクターとしては、Ｅ、コリ以外の他の菌株中でも複製増殖する状態 の広範な宿主域のプラスミドを使用すると優れている。

前記の菌株の細胞中にＤＮＡを導入する方法として、１つには、方法が公知であ る場合にはこれらの菌株の直接的な形質転換が好適である。例えば、シンイドモ ナス菌及び類縁のグラム陰性菌の形質転換法がある（　Ａ、　Ａ、　Ｍｅｒｅｅ ｒ及びＪ、　Ｓ、　Ｌｏｕｔｉｔ　、　１９７９、Ｔｒａｒｓｆｏｒｍａｔｉｏ ｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｅｃｌＪｏＨｏｆ　Ｐａｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕ ｇｌｎｏｅａ　：　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｏｅｔａｌ　１ｏｎｓ　、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４０　：　３７−４２　；　Ａ、Ｍ、　Ｃｈａｋｒａ ｂａｒｔｙｌＪ、　Ｒ，ＭｙｌｒＯｌＪ　、　Ｄ、　Ａ、　Ｆｒ１ｅｌｌｏ及び Ｊ、　Ｇ、　Ｖａｃｃａ　。

ｉ　９　７５　、　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｅｅｕｄｏｍｏｎ ａａ　ｐｕｔｉｄａ＋ｉｒｕｇ　−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｓ　ｆａｃｔｏｒ　ｒ） ＮＡ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ＋Ａｃａｄ。

８ｃｉ、　ＵＳＡ　７２　：　３６４７−３６５１　）。これに対して、文献公 知の方法にＬ＃）Ｅ、コリ菌株の形質転換はすべてのグラム陰性菌に関して適用 可能でありかつ極めて効果的であり、引続いてプラスミドを該当する菌株中に接 合に工す転移する。クローン化ｒｌＮＡの接合性転移には可動性プラスミドベク ターを使用すると優れている。その際に、転移のために必要な遺伝子は、所謂介 助シラスミドあるいハ特別にそのために偶成された運動性菌株から得られる。

直接好適な生長基質上での選択にニジ得られる前記の菌株か又は前記の方法又は 他の公知の試験系にニジｔｌＡの発現に関して同定されるＥ、コリのクローンか ら、ｔｆｄＡ含有プラスミドを公知方法により明瞭に規定し得る化学物質を単離 し得る。

とりわけ、ｔｆｄＡ菌株を生長試験により直接選択するという利点は、すべてが 相対的に経費のかかる酵素試験をベースとする従来公知の方法に比べて、ｔｆａ Ａ含有プラスミドの同定を、殊に遺伝子銀行の製造の際に、即ちｒツムＤＮＡの ＤＮＡ断片の任意のクローン化の際に生じる非常に多数の種々のプラスミドでも 可能にするという点である。それ故、利点はこの方法を広範に通用し得ることで ある。それというのもｔｆｄＡ遺伝子のクローン化が、遺伝子ｔｆｄＡを良好に 単離し得るプラスミド上に有する野性型株に限定されるばかシでなく、はぼすべ ての野性型株からも、また該遺伝子を入手し難いプラスミド又は染色体上に含有 するものでも可能だからである。

本発明によるプラスミドは、例えばアルカリゲネス・オイトロフスＪＭＰ　１３ ４から由来し、２．４−Ｄの分解用遺伝子を含有するシラスミドｐ、ＴＰ　４　 ’に制限エンドヌクレアーゼＨ１ｎａ　Ｉで切断し、生成したｒｌＮＡフラグメ ントを電気泳動により分離し、かつそれぞれの単離した７ラグメントｔｗ　Ｈｉ ＨｄＩで切断しかつ脱リン酸化したベクターｐＶＫ　１０１と連結する。可動性 Ｅ、コＩＪ　Ｓ　１７−１　’ｔ−該組み換えＤＮＡで形質転換しかつプラスミ ド含有菌株をテトラサイクリン含有培地上で選択する。制限分析にエリ同定され た組み換えプラスミドを含有する菌株ρλらそのプラスミドｒ）ＮＡ　ｉ接合に より前記のｔｆｄＡ突然変異体、ｙｈ（ｐ　１３４　：　Ｔｎ　５−２上に転移 させ、２１１１つクローン化ｔｆｄＡ遺伝子の発現全２．４−Ｄ含有最少培地上 での野性菌株の生長にニジ検出する。このようにして、ｐＪＰ４から由来する２ １ｋｂのＨｌｎｄ　［フラグメント上に遺伝子ｔｆｄＡ　’ｉ金含有るプラスミ ドｐＶＪＨ２１ｔ−同定することができる。プラスミドの単離および引続く制限 分析によりクローン化フラグメントの同一性が確認される。

更に、本発明によるプラスミドは、遺伝子ｔｆａＡｋ含有する組み換えプラスミ ドからサブクローン化（Ｓｕｂ　−ｋｌｏｎｉθｒｅｎ）に工り製造することが できる。

そのために、リプラスミドを制限エンドヌクレアーゼ１種又は数種で消化し、た つ生成した断片をｒ）ＮＡ　ＩＪが一ゼを用いて、同じ制限エンドヌクレアーゼ でその直線形に変換さルているベクタープラスミドと連結する。

生成したプラスミドからｔｆａＡ含有分を前記のようにして選択することができ る。

例えば、Ｓａｃ　Ｉにより生成したプラスミド］）ＶＪＨ２１のＤＮＡフラグメ ン）　ｋ　Ｓａｃ　ｌで切断したベクタープラスミドｐＧ３８５３と結合するこ とによυプラスミドｐＧ、Ｔｓ３’ｒ製造することができる。若干の新しく組み 換えられたプラスミドから、完全、なｔｌＡ遺伝子を含有するものを、初めに組 み候えプラスミドｒ’ｌＮＡ　’ｉ可動性菌株Ｅ、コＵ　Ｓ　１７−１中に形質 転換し、その後その菌株から接合によりｔｆｄＡ突然変異体ＪＭＰ　１３４　： Ｔｎ　５−　’ｌ中に転移することにｘ９選択することができる。２．４−Ｄ含 有培地上での選択に工り、制限分析にｘｇ明らかにｐＶＪＨ２１カらの２ｉｋｂ のＨｌｎｄ　１フラグメントに、それ故ｐＪＰ　４に由来する判別する３　ｋｂ のＳａｃ　ｌ挿入断片を含有するプラスミドが確認さｎる。

ｔｆｄＡ含有ＤＮＡ断片のサブクローン化により、用途に応じて、使用されるプ ラスミドベクターのａ類という点て異なる工うな本発明によるプラスミドを製造 することもできる。

例えば、ｐＧＪｓ３からの３　ｗｂ　Ｓａ（！　ＩフラグメントをベクターｐＫ Ｔ　２３１中に再クローン化することができ、その際にプラスミドｐＫＪｓ　３ １及びｐＫＪｓ　３２が生成しこれらはｐＧＪＳ３に比べて、有利な制限地図及 び多くのグラム陰性菌中に良好に発現されるカナマイシン耐性にニジｔｆｄＡの 他の特徴付けの利点を提供する。次に記載されているようなｐＫＴ　２３１から 誘導されたプラスミドによるｔｆｄＡ発現の検出法として、Ｅ、コリ８１７−１ から菌株アルカリｒネス・オイトロブスＪＭＰ　２２２への接合転移が優れてお り、引続いて生長基質としての７二ノキシ酢酸の利用に関して試験する。

このシステムは、ｔｆａＡ突然変異体に比べて、この受容菌株では接合転移が高 い効率で行なわれかつカナマイシン耐性によって他の選択可能なマーカーを使え るという利点を提供する。

サブクローン化により、ｔｆｄＡ含有ＤＮＡ　７ラグメントを発現ベクター中に 組み込むこともでき、該ベクター上でｔｆｄＡ遺伝子が異種プロモータにＪ：＃ ）発現される。

例えば、２，８　ｋｂのＳａｃ　Ｉ　／　Ｓａｄ　Ｉ　７ラグメント、２．０　 ｋｂのＢａｍＨＸ　／　Ｓａｌ　Ｉフラグメント及び１，４ｋｂのＸｂａＩ　／ 　Ｓａｄ　Ｉフラグメントを発現ベクターｐＴ　７−５及びｐＴ　７−６中にフ ァージプロモータに直接組み込むことがでも、このプロモータにより遺伝子発現 がプロモータ特異性ＡＮＡポリメラーゼによシ目的通シに開始される。新しく組 換えられたプラスミドｐＴＪｓｓ’　０３５、ｐＴＪｓ’Ｂ　４５及びｐＴ、Ｔ ｓ’Ｘ　５３５　（これらの製造は例８．９及び１０に記載されている）により 発現されたｔｆｄＡ遺伝子生成物は放射性メチオニンによる特異的標識及び引続 くｒルミ気泳動にニジ同定することができる。更に、このシステムは、Ｅ、コリ 菌株中で多量の２．４−Ｄ−モノオキシデナーゼを製造するのに使用することが でき、このことにより遺伝子生成物のｎＩ製及び引続く蛋白質化学的及び酵素的 特徴付けが野性型株からその重刷に比べて簡便になシ、それにより他の生物工学 的な適用可能性が初めて研究し得る。

ｔｆｄＡ含有ＤＮＡフラグメントのＭ１３ファージ型のファージベクター中での サブクローン化に工ｐ一本鎖ＤＮＡの製造が可能である。これはサンジャー（Ｓ ａｎｇｅｒ　）法による塩基配列の測定に使用することができＣＦ、　Ｓａｎｇ ｅｒ　、　Ｓ、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ及びＡ、　Ｒ。

ｃｏｕｌｓｏｎ　ｓ　１９７７１）　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｔｎｇ　ｗｔｔｈ 　ｃｈａｔｎ　−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒａ、　Ｐｒｏｃ ＋Ｎａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ７４：５４６３）、更にオリゴヌクレオチドを用いて各塩基の所望の突然 変異誘発に使用することができ、遺伝子中の制限サイトの形成及びアミノ酸配列 の変化を可能にする１つの公知方法である。遺伝子中への制限サイト導入はその 使用可能性を拡大する。それというのもそのことによって異種プロモータを組み 込むための制限サイト及び融合蛋白質を形成するための遺伝子フラグメントラ連 結するための制限サイトが形成されるからであり、これは例えば原核遺伝子を真 核生物中で発現するのに必要である。

ｐＫＪＳ　３２　Ｅ−らの２．８　ｋｂのＳａｃ　Ｉ　／　Ｓａｌ　Ｉ　７ラグ メントのファージベクターＭ１３ｔｇ１３０及びＭ１３ｔｇ１３１中へのサブク ローン化（例１６に記載されている工うに）は、遺伝子ｔｆａＡｋ配列決定に利 用できるようにするための可能性を示す。組換え７ア一ジＭＪＳＳ’　０５０及 びＭ、ＴＳＳ’０３１の二本鎖ｒ）ＮＡ　Ｏ修飾により挿入断片ＤＮＡで更に変 化させることができる。

更に、本発明によるプラスミドはｔｆｄＡ含有プラスミドからの修飾に工り生成 することができる。そのようなシラスミドを制限エンドヌクレアーゼ１種又は数 種で処理することにょシ、場合に工りエキソヌクレアーゼで処理しかつ引続いて ＤＮＡ末端を環状分子に再連結することにより、欠失した、即ち特定のＤＮＡ断 片だけ短かくなった、更に完全なｔｆｄＡ遺伝子を含有し得るプラスミドが得ら れる。

例えば、シラスミドｐＫＪ８３１及びｐＫＪｓ　３２から一定のｌ’）ＮＡ７ラ グメントを除去することにより、その中に包含されている３　ｋｂの挿入断片を 一方の側ではＸｂａ　１制限サイトまでかつ他方の側ではＳａｌ　Ｐ制限サイト まで短縮することができ、その際にｔｌＡの活性は失なわれない。この工うに生 成した、例４．５及び７に記載のプラスミドｐＫ、ＴＳＢ　３３０、ｐＫＪＳ（ ｘ）６３０及びｐＫＪＳ　３２　ＦＩＲ△ダは、ｔｆｄＡ遺伝子活性を発現する ことができる。このようにしてこの遺伝子の位置を１．４ｋｔ）のＸｂａＩ　／ 　Ｓａｄ　Ｘフラグメントに制限することができる。

例１６に記載されている↓うに、組換え７ア一ジＭ、ＴＳＳ’　０３０及びＭ、 ｒｓｓ’　０５１の二本鎖形からエキンヌクレアーゼＩ″’ｃ用いて種々の長さ のＤＮＡ断片を欠失することにニジ、その都度異なるクローン化ＤＮＡの領域が 配列決定のための開始点の最も近くに位置する一連の７７−ゾが生成される。２ ｋｂのＢａｒｎＨＩ　／　８ａｌ　Ｘフラグメントの配列をオーバーラツプして 配列された部分領域から組合わせることができる。塩基配列の認識からｔｆｄＡ を含有するＤＮＡの他の性質、例えばコード領域の位置と長さ及び制限サイトの 位＆’に’誘導することができ、このことはｔｌＡを更に利用するのに極めて有 用なはずである。

ｒ、ｆｄＡ含有プラスミドからのｒ）ＮＡフラグメントの欠失にエリもしくはＤ ＮＡフラグメントのサブクローン化に工り、ｔｆ（ＬＡ遺伝子の断片を含有する 他の本発明のプラスミドも得られる。例えば、ｐＫＪｓ３２からの１．５ｋｌ） の’ＥｃＯＲＩ　／　Ｂａｍ　ＨＩＸフラグメントｐＫＴ２３１中でサブクロー ン化することによりシラスミドｐＫＪＥΔＢ１３０が生じ、このプラスミドはｔ ｆｄＡの５′末端、即ちプロモータとＮ末端をコードする配列とを含有し、かつ 酵素的に活性な遺伝子生成物を発現する能力をもはや持っていない。遺伝子の断 片を、同じ解読わく中のゾロ七−夕を含めてコード付けｒｌＮＡの５′末端が他 のコード付けｒｌＮＡの６′末端と連結しておりかつそれ故その都度のゾロモー タを認識する有機体中の所謂融合蛋白質を発現させるプラスミドの構成に使用す ることができる。

本発明によるプラスミドの他の修飾の可能性は、異種ＤＮＡセグメントの挿入で ある。挿入は新しい機能ＤＮＡ配列、例えば制限サイト、プロモータ、耐性遺伝 子、翻訳−及び転写終止フグナルの導入に通用することができる。異種遺伝子配 列の一部の挿入により融合蛋白質も形成され得る。

異３ＤＮＡの挿入の例は、オメガフラグメントをｔｆｔｌＡのコード付は領域の 真中に位置するプラスミドｐＴＪＳ’　Ｘ　５３５のＢｇ　［制限サイト中に挿 入することである（例１１）。このフラグメントに工りすべての解読わく中の翻 訳終止コドン及び転写終止シグナルが選択可能な抗生物質耐性と一緒に組み込ま れる。遺伝子生成物の特異的な放射性標識により並びに２．４−Ｄ−モノオキシ デナーゼに関する生体内酵素試験にニジ（例１５）立証することができるように 、組換えプラスミド１）ＴＪ８’Ｘ　５３５オメガに工り、短縮されたもはや酵 素活性ではない蛋白質の発現かも九らされる。

ｔｆａＡ又はｔｆｄＡの部分を含有するクローン化７ラグメントは相同ｒ）ＮＡ 配列の検出に、それ故地の生体中のｔｆｄＡ遺伝子を見出すのに利用することが できる。そのために、この７ラグメントを本発明によるプラスミドから好適な制 限酵素を用いて切断し、単離し−Ｄエク文献公知の方法に工す、例えば放射性核 種の組み込みにより標識する。公知の雑種形成法にエリ、ある有機体の全ｎＮＡ 中で又はそこから製造した遺伝子銀行において、ｔｌＡとの相同性を有するフラ グメントを同定することができる。この工うにして、種々の生物の集団下でも、 ｔｆｄＡと相同の配列を含有するものを認識することができる。この方法は、新 しい２．４−Ｄ分解生成物を見つけ出し７１ｃシかつ該生物中のｔｆｄＡ遺伝子 を検出するのに使用することができる０ ｔｆｄＡ遺伝子は、好適であれば直接本発明によるシラスミドを用いであるいは 公知の遺伝子工学法を用いて変化させた後で他の生物に転移させることができる 。

転移に工５、ｔｆａＡでコード付けされた２、４−Ｄ−モノオキシデナーゼを該 生物中で発現させ、それに工り２．４−Ｄ又は２．４−ｒ）Ｔｈ似動物質分解し 得る性質を生物に付与するという目的を追求することができる。

例えば、広範な宿主域を有するｔｆｄＡ含有プラスミドを種々のグラム陰性菌中 に例１４に記載した工うに接合転移することにより、２．４−Ｄ又は２．４−Ｄ 類似物質を相応するフェノールに変換する能力をこれらの細菌に付与することが できる。その都度の菌株に固有の分解能力と関連して、前記のことにニジこの菌 株にニジ分解可能な化付物の範囲の拡大がもたらされる。例えば、菌株アルカリ ゲネス・オイトロフスＪＭＰ２２２はフェノール代謝の遺伝子を有する。それ故 、ｔｆａＡの発現はその菌株にフェノキシ酢酸を生長基質として使用する全く新 しい可能性を介助する。菌株プソイドモナス８１３はフェノール並びに４−クロ ルフェノールを代謝することができ、かつｔｆｄＡに工り同様にフェノキク酢酸 及び４−クロルフェノキシ酢酸ニ基づく生長性を獲得する。ｔｆｄＡを含有しか つ相応するフェノールを変換し得る生物による４−クロル−２−メチルフェノキ シ酢酸、２，４．５−）リクロルフエノキシ酢酸及び類縁化合物の工うな種々の 置換基を有するフェノキシ酢酸の分解も同様に考えられる。それに工っで達成さ れる生物の分解能範囲の拡大に工り、従来自然界では実現されな〃）つた新しい 性質の開示がいずれにせよなされなかったとしても、それによって野性桑株に比 べて高い分解能を有する菌株あるいは場合により毒性である基質又は分解経路の 生成物に対する工り高い耐性を有するような菌株が形成されるという点で定性的 な改良がもたらされ得る。特に、その工うな菌株は、自然環境の中ではなく、例 えば工業廃水を浄化する浄化装置のような人工的なシステム中の工うな条件丁で 有用なはずである。従来　／％ロデン化芳香族化合物を微生物分解する分野で新 規に形成された菌株を用いて達成された成果の概要が最近公表された（　Ｄ、　 Ｇｈｏｓａｌ、１．−　Ｓ、　Ｙｏｕ、　ｎ、　Ｋ、　Ｃｈａｔｔａｒｊｅｓ、 Ａ、　Ｍ、　Ｃｈａｋｒａｂａｒｔ７．１９８５゜Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｅｇｒ ａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈａｌ、ａｇｅｎｔｅｄ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、　Ｓｃ １θｎｃｅ２２８：　１３５−１４２３゜ 遺伝子ｔｆｄＡの他の使用可能性は、植物へのその転移でちる。異種ｒｌＮＡに ：り植物を形質転換する方法は文献公知であり〃）つ試験されている。従来は、 主に２つの１５ｆ：が類別される：１つはアグロバクテリウム・ツメファチェン ス（ＡｇｒｏｂＢｃｔ、ｅｒｉｕｍ　ｔｕｃｏｅｆａｃｉＪｎａ　）からのＴ１ プラスミドの機能ヲ利用し、もう１つはエレクトロポレーション（Ｅｌｅｋｔｒ ｏｐｏｒａｔｌｏｎ　）、ヒートショック（Ｈ１℃ｚ８θｃｈｏｃｋ　）　、塩 化カルシウム処理又はポリエチレングリコール処理の工うな物理的及び化学的手 段の通用ＦＫＩ物のプロトプラス）ｋ形質転換することをペースとする。植物細 胞ｔ＠記の一方か又は他方の方法にエリ形質転換するのは原則的に常に可能であ るが、いずれにせ工各細胞又は細胞組織〃・ら植物全体９を再生することはでき ない。現在このことが単子葉植物の遺伝子工学操作に関する主９な障害となって いる。

植物ｉ　ｔｆｄＡで形質転換することの優れた目的は、遺伝子特性、即ち形質転 換された植物中で２．４−Ｄ−モノオ千７デナーゼ活性の発現である。これに工 つて植物は、低濃度でオーキシル類縁植物ホルモンとして作用しかつ高濃度で生 長抑制物質として作用するフェノキシ酢酸誘導体を植物化学的に作用のないフェ ノールに分解することができるはずである。従って、この特性には、遺伝的に形 質転換さルた植物の選択可能なマー刀−とじての意味がある。

ｔｆｄＡの工うな原核遺伝子を植物細胞中で発現し得る工うにするために、この 遺伝子を転写及び翻訳に必要な植物特異的シグナル配列と連結しなければならな い。この連結が、これによって形質転換される植物のゲノム中に遺伝子が偶然的 に組み込まれることにより行なわれるという指摘が知られている。し〃≧しみ核 遺転子は有利に試鱗管内で好適な植物特異性発現シグナルと組み合わさる。例え ば、一般的に通用可能な方法は、構造遺伝子（これに属する植物のプロモータを 含めて）の５′ｘ端を、植物蛋白のＮ末端アミノ酸と原核蛋白質の主成分と刀） ら成りかつ基本特性において原核蛋白と同じである０合蛋白質が形質転換された 植物細胞中で台底される工うに原核遺伝子のコード付は配列と連結することであ る（　Ｒ−Ｔｏ　Ｆｒａｌθｙ及びその他、１９８３゜ＥｘｐｒｅｓｓｉｏＨｏ ｆ　ｂａｃｔｓｒｉａｌ　ｇｅｎｅ８１ｎｐ１ａｎｔ　ｃｅ’ｌｌｓ、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａａ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８Ｑ　：４８０６、Ｊ、　 ｐａｓｚｋｏＷｓｋｉ、及びＭ、　Ｗ、５ａｕｌ、１９８６゜Ｄｉｒｅｃｔ　ｇ ｏｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｔｏ　ｐｌａｎｌ＋、　Ｉｎ　Ｓ。

Ｐ、　Ｃｏｌｏｗｉｃｋ　Ｆ；ＬびＮ、　Ａ、　Ｋａｐｌａｎ　（ａｄ　）、Ｍ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｌｌＩＩｏｌｏｇ７１１８　：　６６８　）。１つ の類似方法は、転写されｆｔ−ｍ　−ＲＮＡの翻訳されていない５′領域の一部 を含めて植物プロモータを使用するだけでありかつ植物遺伝子のコード付は領域 の５′末抱放葉する。植物中での発現では、原核遺伝子部分のＡＴＧコドンが翻 訳の開始点として有用である。同様にして、植物ウィルスの発現シグナルを使用 することができる（Ｎ、　５ｒ１ｓｓｏｎ。

及びＴ、　Ｈｏｈｎ、　１９８６、Ｐｌａｎｔ　ｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒｓ　 ：ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ、　Ｉｎ　Ｓ、　Ｐ、　 Ｃｏｌｏｗｉｃｋ及びＮ、　Ｏ，Ｋａｐｌａｎ　（ｓａ、）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｘｏｇｙ　ｉ　１８：６５９：）。植物中で原核遺伝子を発 現するためのベクターは文献公知でありかつ一般的に自由に使える。

前記のベクタープラスミドを用いて、植物中で発現可能な原核遺伝子からの遺伝 子を形成するための前提条件は、遺伝子ｔｆｄＡに関して存在するように塩基配 列を認識することである。これが制限サイトの正確な局在化を可能にし、かつこ れによって種々のｒ）ＮＡ上セグメント塩基に整合する連結を可能にする。更に 、例えば新しい制限サイトの導入の工うに機能的に重要な新しいＤＮＡ配列を展 開するための目的に応じた突然変異生成を初めて可能にする。

以Ｆ１本発明を図面及び実施例に基づき詳説する。

実施例では当業界で一般に公知のかつ行なわれている遺伝子工学の方法ｔ−使用 した。遺伝子のクローン化及び遺伝子構造の分析は、既にｇ、　Ｌ、ヴイ／ナツ カーＣＬ　Ｌ、　Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ　％ｇｏｎｅ　ａｎａ　ＫＩＯｎｅ　、Ｖ ａｒｌａｇｃｈｅｍｌａ　、　Ｗａｉｎｈａｉｍ　、　１９８５　”ｌ及びＲ， Ｗ、　、ｄ−−ル）’−（ｏｘａ　）及びＳ、　Ｂ、プリＡＨ−ズ（Ｐｒｉｍｒ ｏｓｅ　）（Ｐｒ１ｎｃｉｐｌＱ８　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏ ｎ　、　Ｂｌａｃｋｗθ１１Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌ、、０ｘｆｏｒｄ 、　１９８５　）の教科書に記載されている遺伝子工学の像画的方法に工り実施 した。例えば、１．　Ｋ、セトロウ（５ａｔｌＯＷ　）及びＡ、Ｉレンダ（Ｈｏ １ｌａｎｄｅｒ　）　（ＧｅＨｅｔｉｃ　ｅｎｇｌｎｅｅｒｌｎｇ　：Ｐｒ１ｎ Ｃ１ｐＨ１ｌｌｉ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏａａ、ｐｌｅａｕｍ　Ｐｕｂｌ　Ｃ０ｒ ｐ８、Ｎ、　Ｙ、　）では方法及び技術をそれぞれ最新の水醜までもっていって いる。特別な刊行物と共に、しばしば実験ハンドブックの形の一般的な操作規定 も利用した（　Ｒ，’Ｗ、　Ｄａｖｉａ及びその他、Ａａｖａｎｃｓａ　ｂａｃ ｔａｒｉａｌｇｅＨｅｔｉ（！θ：　ａ　ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉ ｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　：Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｇ及びその他、Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　ａｔｏｎｉｎｇ　：Ｔ、　Ｊ、　５ｉｌｈａｖｙ及びその他、Ｅｘ ｐｓｒｌｍｅＨｔｓ　ｗｉｔｈｇｏｎｅ　ｆｕｓｉｏｎｓ、全部Ｃｏ１ａＳｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｉ、５１ｂから、Ｎ、　Ｙ、　；　Ａ、　Ｐｕｅｈｌ ｅｒ　ａｎａ　Ｋ、　Ｎ、　Ｔｉｍｍ１ｓ　、　Ａｄｖａｎｃｅｄｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　５Ｂｅｒｌｉｎ　。

１９’８４　；　Ｄ、　Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ　％ＤＮＡ　ｃｒａｎｉｎｇ　：　 ａｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　、　ＪＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　、０ｘｆ ｏｒｄ　。

Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　、　ｎ、　ｃ、、１９８５］。

１．９８６年８月２８日に、ドイツ微生物保存機関西ドイツ国、デツチンデル在 ）に次の微生物が寄託されｆｃ（寄託番号）： Ｅ、コ　リ　（ｇ、ｃｏｌｉ））！’Ｌ４Ｓ　１７４（ｐＴ７−５）　（ＤＳＭ 　３８２９）９、ｙ　リ　（Ｅ、ｃｏｌｌ））Ｉｓ　１７４（ｐＴ７−６）　（ ＤｓＭ　３８３０）Ｅ、コ　リ　（Ｅ、ｃｏｌｌ）　ＪＡ　２２１（ｐＧｓｓ３ ３）　（ＤｓＭ　３８３１）Ｅ、コ　リ　（Ｅ、ｅｏｘｔ）Ｌｇ　３９２（ｐＴ Ｊｓｓ’　０３５）　（ＤＳＭ　３８３２）’ｆｉ、コ　リ　（Ｒ，（！０１ｉ ））！Ｂ　１０１（］）ＶＫ１０１）　（ＤＳＭ　３８３！ｌ）Ｅ、コ　リ　（ Ｅ、ｃｏｌｔ）ＳＫ　１５９２（ｐＫＴ２３１）　（ＤＳＭ　３８３４）Ｅ、コ リ（ｇ、ｃｏｌｌ）８１７−１　（ｐＫＪｓ　３１）　（ＤＳＭ　３８３５）Ｅ 、：ｌ　ＩＪ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）８１７−１　（ｐＫ、Ｔｓ３２　ＦｔＩ（、と Ｓヨ’　）　（ＤＳＭ　３８３６）Ｌコ　＋）　（Ｅ、ｃｏｌｌ）３１７−１（ ｐＫＪｓ（Ｘ）６５０）　（ＤＳＭ　３８３７）Ｅ、コリ（ｇ、ｃｏｌｉ）ＳＢ Ｃ１０１０７（ｐＲ１）　ＣＤ５Ｍ　３８３８）Ｅ、コ　リ　（Ｅ、ｃｏｌｌ） Ｋ２Ｓ（ｐｏＴｌ−２／ｐＴＪｓ’Ｘ５３５）　（ＤｓＭ　３８３９）アルカリ ゲネス・オイトロフス（Ａｌｃａｌｉ３ｅＨｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）　ＪＭＰ 　１３４（ｐＪＰ　４）　（ＤＳＭ　３８４０）アルカリゲネス・オイトロフス （Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓａｕｔｒｏｐｈｕｅ　）　ＪＭＰ　２２２　（ＤＳＭ 　３８４１）アルカリゲネス・オイトロフス（、ｆ’−１ｃａｌｉｇｅＨθＢａ ｕｔｒｏｐｈｕｓ　）、Ｔｙ、Ｐ１３４：Ｔｎ５−２（ｐＪＰ４：Ｔｎ５−２） 　（ＤＳＭ　３８４２）アルカリゲネス・オイトロ７ス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ ｓａｕｔｒｏｐｈｕｅ）ＪＭＰ１３４：Ｔｎ５−４　（ｐＪＰ４：Ｔｎ５−４） 　（ＤＳＭ　３８４３）■面の説明 略　語： Ａｐ　アンビアリン耐性 Ｋｍ　カナマイシン耐性 ｋｏ　キロベース Ｍ　分子量マーカー ｋＤ　キロダルトン 図　面　： 第１図は、ｐＪＰ　４　Ｅ’らクローン化した２１ｋｂのＨｌｎｄ　ｌフラグメ ント（例１）及びこれから誘導されたサブフラグメント（例３〜７）の由来及び 制限地図、並びに広範な宿主域を有するシラスミドによるアルカリゲネス・オイ トロフスＪＭＰ　２２２中でのフェノキシ酢酸分解の発現（例１４）を示す。矢 印はプラスミドｐ、ｙｐ４中のｔｆａＡの正確な位ｍｔ−表示する。

第２□□□、第３図、第４図は、ｐＫＴ　２３１から誘導された、ＥｆｄＡ又は ｔｆｄＡの一部を含有するプラスミド（例３〜７）を示す。細線はベクタープラ スミドから由来する部分を表わし、太線はＤＪＰ　４から由来する挿入断片を表 わす。

第５図、第６図、第７図は、Ｔｙ−ゾロモータゾラスミドｐＴ　７−５及びｐＴ 　７−６がら誘導された、ｔｆｄＡ含有挿入フラグメントを有するプラスミド（ 例８〜１１）を示す。細線はベクタープラスミドから由来する部分を表わし、太 線はｐＪＰ　４　ｖ−ら由来する挿入断片を表わす。

第７ｂ図、はプラスミドｐＴＪ８’Ｘ　５３５中へのオメガフラグメントの挿入 を示す（例１１）。

第８図は、ポリアクリルアミドデルのオートラジオグラム上の、特異的に放射性 標識し丸缶白質を示し、これらの蛋白質はｔｆａＡ’に含有するプラス゛ミドか らＴｙ−プロモータによｐ高収率で発現される（例１５）。

１　：　ｐＴＪｓｓ’　０３５．２　：　ｐＴＪｓ’Ｂ　４３５．３　：　ｐＴ Ｊｓ’ｘ５３５．４　：　ｐＴＪｓｓ’　０３６．５　：　ｐＴＪｓ’Ｂ　４３ ６．６　：　ｐＴＪｓ’Ｘ　５３６゜ａは完全標識した全細胞蛋白質を表わし、 ｂｔｉＴ７−プロモータの誘導後に特異的に標識した蛋白質を表わす。

第９図、はプラスミドｐＴＪｓ’Ｘ　５　！＋　５（’ｌカラＴ　７−プロモー タに工り発現された短縮されたｔｆｄＡ遺伝子生成物（２ｂ）’１−ｐＴＪｓ’ Ｘ５３５から発現さｔ’Ｌり短縮されていない蛋白質（３ｂ）及び挿入断片を含 まないベクタープラスミドｐＴ７−５（１ｂ）と比較して示す。ａは完全に標識 した全細胞蛋白質を表わし、ｂはＴｙ−プロモータの誘導後に特異的に標識した 蛋白質を表わす。

第１０図は、塩基２０５８個のＢａｍ　ＨＩ　／　Ｓａｌ　Ｉ　７ラグメントの 塩基配列を示し、このフラグメント上で遺伝子ｔｆｄＡは５′末端から６′末端 に転写される。矢印はｔｆｄＡのコード付領域の開始と終止を表わす（例１６） 。

例１ニブラスミドｐＶＪＨ２１の製造 ａ）プラスミドｐＪｐ４及びｐＶＫ　１０１の単離アルカリゲネス・オイトロ７ ス、ＴＭＰ　１３４　’ｉ　ＰＹＦ培地Ｃプトン５１１／ｌ、酵母エキス３１／ ／ｌ、フラクトース２１１／Ｊ）２５０ｄ中で６０℃１６時間培養する。遠心分 離した細胞からプラスミドｐＪＰ４’ｉ単難する（Ｊ。

ＢａｅｔｅｒｉＯｌ、１３５：　２２７（１９７Ｂ）Ｐらの方法に工り〕。プラ スミドｐＶＫ　１０１　（ｖ、　ｃ、　Ｋｎａｕｆ及びその他、Ｐｌａｓｍｉｄ 　８　：　４５　（１９Ｂ　２　）　：ｌは、Ｅ、コ１７　ＨＢ　１０１２）） ら一般に公知のＴ、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｆｌ　）及びその他によるアル カリ性溶菌法（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ａ　１ａｂｏｒａｔ １０ｒｙ　ｍａｎｕａｌ。

Ｃ０１１１８ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｃｏ１ａ 　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｉ　９８．２］に工り 単離ｆる。

ｂ）　ｐＪＰ　４　’７ｊ’ら２１　ｋｂ　Ｈｌｎｄ　ｌフラグメントのクロー ニング ｐＪＰ、４　２０＃ｊ　（５ＱＯ＃）、ＴＡＳ緩衝液（０，３３Ｍトリス−アセ テ−）、０．６５Ｍ酢酸カリウム、０．１Ｍ酢酸マグネシウム、５１ｍＨｖＩジ チオトレイトール（ＤＴＴ　）、３　Ｑ　、ｎＭスペルミジン、ｐ）ｌ　７．９ 　）　２．５μＥ及び稀Ｈ１ｎｄ　ＩＩ　溶液２．５　ｐｇ　（１単位）を３７ ℃で１２０分間恒温保持する。ｐＶｌ　１０１　５０　μｌ　（ｔ４　ｐｉ）、 ＴＡＳ緩衝液５．５ｐｌ及び未稀釈のＨｌｎｄ　［溶液ｉ　ｐｇ（２０単位）Ｌ Ｄ成る他の反応混合物を３７℃で９０分間恒温保持し、その後、子牛の腸内アル カリ性ホスファターゼ（Ｃａ１ｆ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ＡｌｃａｌｉｎｓＰ ｈｏｇｐｈａｔａｓｓ　：　ｎ工ｐ、　Ｂｏｓｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ　）　１　ｔｔｌ（６０単位）全添加しかつ更に６ｏ分間恒温株持すム両方の 反応混合物のそれぞれ９０μｌを０．７％ロウ・メルティング・アがロース・デ ル（Ｌｏｗ　−Ｍｏｌｔｉｎｇ−ＡｇａｒＯｓθ−Ｇｅｌ　）上で電気泳動ｌＣ Ｌり分離する。引続いてこのデルを臭化エチジウム溶液（５μｇ／Ｗｉｔ）中１ ５分間で着色し〃１つＵｖ３００’ｎｍのＤＮＡバンドを可視化する。ｐＶＫ　 １０１制限のそれぞれの２０　ｋ’ｂバンド及びｐＪＰ　４　制限の２番目に大 きいバンド（２１ｋｂ）をデルρ）ら切断し、それら両方を合し、〃）つｒ）Ｎ ＡをＴ、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｇ　）及びその他の方法（Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｎａｌ、、　ｃ ｏｌａＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｃｏ１ｄ　 ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、１９８２　）にエリア がロースから単離する。エタノールで沈殿させたＤＮＡを連結緩衝ｆｉ（６６ｍ Ｍ）リスー皿、（５，ｔ５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０　ｍＭＤＴ’：ｌ’　１ｍ Ｍ　ＡＴＰ、　ｐＨ７，５）　１０μｅ中に取り、稀Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ１μ Ｊ　（０，１単位）を加え、〃≧つ１４°Ｃで１６時間恒温林持する（＝連結バ ッチ）。Ｅ、コリＳ　１７−１　ＣＢｉｏ℃ｅｃｈｎｏｌｏｇ７１　：　７８４ 　（１９８３）　）のコンビテン）ｆｌ胞’ｉＴ、、Ｔ、シルヘイビー（５ｉｌ ｈａｖｙ　）及びその他の方法（ＥｘｐｅｒｍｅＨｔａ　ｗｉ℃ｈｇａｎｅ　ｆ ｕｇｉｏｎａ、　Ｃ０１ａ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８４　 ）に工り製造する。このようにして祷られたコンピテント細胞０．２１ｄ”ｅ連 結バッチ５μｌと混合し、氷上に４０分間放置し、その後４２℃に６分間加熱し く＝形質転換）弓ト続いてＴ、マニアチス及びその他によるＬＢ培地（＠記診照 ）２！！Ｌｔで稀釈しかつ５０°Ｃで６０分間恒温保持する（＝表現型発現）。

その後、テトラサイクリン１０μｌ／１ｒｒｔｆ含有するＬＢ−寒天プレート上 にそれぞれ０．２１ｔｆ：塗布する。プレートを３７°Ｃで１６時間培養する。

数回のテトラサイクリン耐性コロニーが認められる。

ｃ）ｐＶＪＨ２１の同定 この工うしてして得られたテトラサイクリン耐性のコロニーからアルカリ性溶菌 法によりプラスミドＤＮＡの迅速詞製を、Ｔ、マニアチス及びその他により記載 されている工うに実施する。前記のアルカリ性ホスファターゼを用いる処理法に より、それぞれのテトラサイクリン耐性クローンが所望の挿入断片を含有するこ とが保証される。Ｅｃｏ　ＲＩによる制限酵素消化及び引続いてＴ、マニアチス 及びその他（前記参照）に工９０．７％アガロースデル中でＤＮＡフラグメント を電気泳動にニジ分離することに工り組換えＤＮＡが同定される。

得られたＥｃｏ　ＲＩフラグメントの大きさｆ　、ｐＪＰ　４及び１）ＶＫ　１ ０１のＥｃｏ　ＲＩ及びＨｌｎｄ　Ｉに関して文献から公知である大きさく　Ｒ ，Ｈ，ｎｏｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　ｉ６１：４６６（１９８５）及 び”？　Ｃ−Ｋｎａｕｆ及びその他、ｐｌａｓｎｏｉａ　８　：　４５　（１９ ８２）　］と比較することによりベクタープラスミドｐＶＫ　１０１中の挿入Ｄ ＮＡ並びにその配列の正確な同定が達成される。

ａ）ｐＶＪＨ２ｉ中のＨｌｎｄ　＊挿入断片の制限地図この工うにして祷られた 、プラスミドｐＶＪＨ２１を含有する菌株をテトラサイクリン２０μ９　／　ｒ ａｔ、　ｆ含有するＬＢ培地４００１１Ｌｔ中３７°Ｃで１６時間培養する。

遠心分離した細胞から、プラスミドｎＮＡ　ｉ　Ｔ、マニアチス及びその他（＠ 記参照）のアルカリ性溶菌法に工り単離する。単離したｐＶＪＨ２１のプラスミ ドＤＮＡ　ｉそれぞれ酵素Ｅｃｏ　ＲＩ、Ｂａｍ　ＨＩ及びＳａｃ　Ｉ並びに次 に挙げる数個の酵素の組合せ９個：　Ｅｃｏ　ＲＩ　／　Ｂａｍ　ＨＩ（１）、 Ｅｃｏ　ＲＩ　／　Ｓａｃ　Ｉ　（２）、Ｂａｍ　ＨＩ　／　Ｓａｃ　Ｉ（３） 、Ｈｌｎｄ　［／　Ｅｃｏ　ＲＩ　（４）、ＨｌｎｃＬ　［／　Ｂａｔｏ　ＨＩ 　（５）、Ｈｌｎｄ　Ｉ　／　Ｓａｃ　Ｉ　（６）、Ｈｌｎｄ　Ｉ［／　ＥｃＯ ＲＩ　／　Ｂａｍ　ＨＩ（７）、Ｈｌｎ（１＠　／　ｇｃｏ　ＲＩ　／　Ｓａｃ 　Ｉ　（８）及びＨｌｎｄ　［／Ｂａ■Ｈ，Ｉ　／　Ｓａｃ　Ｉ　（９）　を含 有する種々のバッチで消化させる。ｎＮＡフラグメントヲＴ、マニアチス及びそ の他（前記参照）により０．７％アガロースデル中で分離しかつフラグメントの 大きさ＠　Ｈｌｎｄ　Ｉで切断したラムダｒ）ＮＡと比較して確定する。このよ うにして得られたデータを用いてシラスミドｐ、Ｔｐ　４　（Ｒ，Ｈ，Ｄｏｎ　 。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｏｌ　１６１　：　４６６　（１９８５）及びｐＶＫｌＱ　 ｉ　（Ｖ、　Ｃ，Ｋｎａｕｆ　ａｔ　ａｌ、　Ｐｌａｓｔｏｉｄ　３　：　４５ （１９８２））についてＥｃｏ　ＲＩ　、Ｒａｍ　ＨＩ及びＨｌｎｄＩに関して 公知の大きさの比土と一緒に制限地図を作成する。

例２ニブラスミドｐ（）ＪＳ　３の製造ａ）プラスミドｐＶＪＨ２１及びｐ（） ８８３３　Ｏｉ離例１で製造したプラスミドｐＶＪＨ２１を含有する組換え菌株 Ｅ、コＩＪ　Ｓ　１７−１及びベクタープラスミドｐＧｓ８３３を含有するＥ、 コリＪＡ２２１（ｏ、ｓ。

５ｈａｒｐｅ　ｏａｎａ　２９　：　９３　（１９８４）　）　ｋテトラサイク リン２０μ９／Ｉｌｔ′ｔ−含有するＬＢ培地各６００１Ｌ！、中３７℃で１６ 時間培養する。遠心分離した細胞から両方のデラスミドヲＴ、マニアチス２及び その他（＠記参照）のアルカリ性溶菌法により単離する。

ｂ）ＳａｃＩフラグメントをｐＶＪＨ２１からクローン化ｐＶＪＨ２１１０ｔｒ ｌ　（５ｔｔ９　）、１）ＧＳＳ　３３　１０μＪ（１μｇ）、ＴＡＳ　Ｗｔ　 面９４　μｍ　ｓ水１６ｔｔｌ及びＳａｃ　ｌ００５μｔ、＜１ｏｓ位）より成 る反応混合物を６７℃で９０分間恒温株持する。引続いて、制限酵素４１−６８ °Ｃに１５分間加熱することにニジ失活化する。ＤＮＡ　’ｉＴ、マニアチス及 びその他の方法（＠記診照）によりエタノールで沈殿させ、かつ乾燥した沈殿を 連結緩衝液４０μｌ中に取る。Ｔ　４−　ＤＮＡリガーゼ１μｌ（１単位）のふ 加後、１４℃で１６時間恒温保持する。Ｅ、１コリＬＥ　３９２（Ｎ、　Ｂ、　 Ｍｕｒｒａｙ及びその他、Ｍｏｌ。

Ｇ−ｅｎ、Ｇｏｎｅｔ、１５０：５３（１９７７））ｔ＝Ｔ、Ｊ、シル５イビー 及びその他の方法（ＥｘｐｅｒｉｍＱｌｎｔｓ　Ｗｉｔｈｇｏｎｅ　ｆｕｓｉｏ ｎｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）（ａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　、ｉｅｗ　Ｙｏｒｋ　、。

１９８４）１７ｍよりＤＮＡの摩り込みに対してコンビテントであるように処理 し、コンピテント細胞０．２１Ｌｔｔ連結バツチ５μＥと混合し、氷上に４０分 間放置し、かつ４２℃に６分間加熱することにより形質転換する。

ＬＢ培地２１Ｉｔで稀釈しかつ３０℃で恒温保持した後で、５０μｊから２０μ ｌまでの部分量を、クロラムフェニコール２０４　／　ｒａｔを含有するＬＢ− Ｑ天プレート上に塗布する。プレートを３７°Ｇで１６時間恒温保持する。

Ｃ）組み換えシラスミドの同定 このようにして得られたクロラムフェニコール耐性クローンを平行して２つのＬ Ｂ−寒天プレート上に塗布し、そのうちの一方はストレプトマイシン２５μｇ／ −を含有し、他方はクロラムフェニコール２０μｇ／ｌを含有する。この試験で ストレプトマイシン感受性が明らかであるクローンからプラスミドＤＮＡ　’ｉ 　Ｔ　、マニアチス及びその他のアルカリ性溶菌迅速法（前記参１１［＠）によ り単離する。単離したプラスミド’ｚｓａｅＩで制限し、ＤＮＡフラグメン）ｔ （１，７％アガロースデル上で電気泳動にエフ分離したつＴＪＶ　３　Ｑ　Ｑ　 ｎｍで観察し得るバンドをラムダファージＤＮＡのＨｌｎｄ　Ｉ制限の公知フラ グメントと比較することにエリベクター〇ＶＫ１０１中に含まれる挿入断片の大 きさを確定する。プラスミドｐＧＪｓ　３はｐ（）８８３３と３　ｋｂのＤＮＡ 　７ラグメントとからの組み換えプラスミドである。プラスミドｐＶＫ１０１は Ｓａｃ　Ｉの郁」限すイトヲ有していないので、明らかにクローン化ＤＮＡ　７ ラグメントはｐＪＰ　４の２１ｋｂの、Ｈｌｎｄ　［フラグメントカら由来する 。

例３＝プラスミドｐＫＪ８３１及びｐＫ、ＴＳ　３２の製造ａ）プラスミドｐ（ ）ＪＳ　３及びｐＫＴ　２３１の単離例２にニジ製造した、組換えシラスミドｐ ＧＪｓ　３を含有するＥ、コリＩ、Ｅ３９２菌株を、クロラムフエニコ−に２０ 　μｇ／ｒｎｔｋｔＡ加しりＬＢ培地４００戯中、６７°Ｃで１６時間培養する 。ベクタープラスミドｐＫＴ　２３１を含有するＥ、コリＳＫ　ｉ　５９２　（ Ｍ、　Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ及びその他、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉ ａ　ＭｉｃｒｏｂｉＯ１０ｇ７　ａｎｄＩのｍｕｎｏｌｏｇ７９６　：　４７　 （１９８２）　］を、カナマイシン５０μ９７Ｎ’を添加したＬＢ培地４００ｍ １中で同じ条件ドに培養する。遠心分離した細胞から両方のプラスミドヲＴ、マ ニアチス及びその他のアルカリ性溶菌法（＠記参照）に工９単離する。

ｂ）ｐＫＴ２３１中のｐＧＪｓ　３からのＳａｃ　Ｉフラグメントの再クローン 化 ｐｏ、ｒｓ３４０μ１（４００■）、ｐＫＴ　２３１　４μ！（１００η）、Ｔ ＡＳ緩衝液６μＥ１水９μ！及び稀Ｓａｃ　Ｉ溶液１μＪ（１単位）工り成る反 応混合物を３７℃で１２０分間恒温株持する。引続いて反応混合物を６８°Ｃに １５分間加熱することに工り、制限酵素を失活化する。このバッチに水６９μ１ １１０倍濃縮した連結緩衝液１０μｌ及びＴ　４−　ｒ）ＮＡ　Ｕガーゼ１μｌ （０，１単位）を加え、かつこの連結バッチを１４℃で１６時間恒温保持する。

Ｔ、　Ｊ、シルヘイビー及びその他の方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ 　ｇｏｎｅ　ｆｕＩＩＩｉｏｎｓ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｓ　ｃｏｘａ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　、Ｎｅｗ 　ＹＯｒｋ　、ｉ　９８４　）に工り製造したＥ。

コリＩＪ　５９２コンピテント紬胞０．２鱈を連結バッチ１０μｅと混合し、氷 上で４０分間放置し、４２°Ｃで３　分間加Ｐｈ　Ｌ、、ＬＢ培地２１１ＩＬと 混合し、３７°Ｃ？６０分間恒温株持する。５０μｌ〜２００μｌの部分量を、 カナマイク７５０μｇ／　ｒｎＡ全含有する訪−寒天−プレート上に塗布する。

プレートを３７°Ｃで１６時間恒温保持する。

Ｃ）組み換えプラスミドの同定 この工うにして得られたカナマイシン耐性クローンを、１つはストレプトマイシ ン２５μｇ／”　、２つ目はクロラムフェニコール２０μ９７ｍ１．及び６つ目 はカナマイシン５０μｇ／Ｌｔｔ含有する６つの異なる団−寒天プレート上に平 行して塗布する。一般に、この試験でストレプトマイシン及びクロラムフェニコ ールに感受性だがカナマイシン耐性であることが明らかなりローンがベクターｐ ＫＴ　２３１　（カナマイクン耐性）とｐＧＪｓ　３からの３　ｋｂの５ａｃ７ ラグメン）　２１−らの組み換えプラスミドを含有する。このプラスミドＤＮＡ 　ｔ　Ｔ　−マニアチス及びその他の公知の迅速法（前記参照）により単離し、 ｒ）ＮＡをＳａｃ　Ｉ″？ｌ’？ｌ’制限引続いてフラグメン）　ｔ　０．７％ アガロースｒデルで電気泳動で分析することに工り、単離したＤＮＡの大きさを 測定する。

同じ工うにＥｃｏ　ＲＩを用いて行なった制限分析に工り、ベクタープラスミド に対する挿入断片の向きが異なっているプラスミドが同定される。プラスミドｐ ＫＪｓ３２では、挿入断片のＥｃｏ　ＲＩ部位がベクター分のＥｃｏ　ＲＩの直 近に存在する、両方の可能性の形が該当する。このシラスミドはＱ、９１ｃｂ及 びｉ、５　ｋｂの２つのＥ（！ＯＲＩ　７ラグメントを生成する。プラスミドｐ Ｋ、Ｔｓ　３１は挿入断片の反対向きの嘴造を有し、２．３ｋｂ及び１３．５　 ｋｂの２つのｇｃｏ　ＲＩフラグメントを供給する。

例４ニブラスミドｐＫＪ８８３３０の製造ａ）プラスミドｐＫＪｓ　３１の単離 例６で得られた、新規の組み換えプラスミドｐＫＪ　Ｓ３１を含有するＥ、コリ ＬＥ３９２のクローンを、カナマイシン５０１４／Ｉｄを添加したＬＢ培地４０ ０鮮中６７９Ｃで１６時間培養し、かつ遠心分離した細胞がらＴ、マニアチス及 びその他のアルカリ性溶菌（前記参照）によりシラスミドｎＮＡ　ｉ単離する。

ｂ）ｐＫＪｓ３１からエリ小さいＢａｎ　ＨＩフラグメントの欠失 ｐＫＪｓ３１　１０μ１（５００＃）、水７μＪ、ＴＡｓ緩衝液２　ｔｔｌ及び 稀Ｂａｍ　ＨＩ溶液１μＪ（１単位）工り成る反応混合物を３７℃で６０分間恒 温保持し、引続いて酵素反応を６８℃に１５分間加熱することに工り停止する。

この制限バッチに水５０μｊ１１０倍に濃縮した連結緩衝液８　μｍ及ＣｕＴ　 ４−　ＤＮＡ　−ＩＪ　ｉｆ−セ２　ｔｔｌ（２単位）を加えかつ１４°Ｃで１ ６時間恒温ｆｆ１Ｍする。

Ｔ、Ｊ、ゾルヘイビー及びその他の公知方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｉｔ ｈ　ｇｅｎｅ　ｆｕｇｉｏｎθ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｃｏ１＋ｉ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　、　Ｎ ｅｗＹｏｒｋ、１９８４　）にエリ製造し九Ｅ、コリ５１７−１のコンピテント 細胞Ｑ、２ｍｊを連結バンチ１０μｌと混合し、氷上で４０分間放置し、４２° Ｃに６分間加熱し、」培地２戯と混合しかつ３７°Ｃで６０分間恒温保持する。

５０μｅ〜２００μｅの部分量をカナマイシン５０４／ｍｔｋ含有する」−寒天 −プレート上に塗布する。このプレートを３７６Ｃで１６時間恒温保持する。

Ｃ）小さくなったシラスミドの同定 このようにして得られたカナマイシン耐性クローンから、Ｔ、マニアチス及びそ の他の公知のアルカリ性溶菌の迅速法（前記参照）にニジ単離する。プラスミド ｆＢｇ、１■で制限し−Ｄ）つｒ’ｌＮＡフラグメントヲ０．７％アガロースｒ デルで電気泳動で分離することに工す小さなりａｍ　ＨＩフラグメントがｐＫＪ ｓ　３１　Ｅ−ら消失したシラスミドが同定される。該プラスミドは唯一のＢｇ ｌ　ＩＩ　制限サイトラ有し、それ故１３．２ｋｂのＢｇＩＩｆ　ｆ供給する。

それ故、元のプラスミドｐＫＪｓ　３１とは明ら〃・に異なっておりかつｐＫ、 ＴＳＢ　３３０と表わされる。

例５ニブラスミドｐＫＪ８３２　ＲＨ△Ｓ′の製造ａ）プラスミドｐＫＪＳ　３ ２及びｐＲＭＥ　１の単離例３で得られた、新規組み換えプラスミドｐＫＪｓ３ ２ヲ含有するＥ、コリＬＥ３９２のクローン並びにＥ、コリＳＢＣ１０７（ｐＲ ＭＥｌ）を、カナマイシン５０μ９／鯰を砒加したＬＢ培地それぞれ４ｏｏＩＲ ｚ中、３７°Ｃで１６時間培養する。遠心分離した細胞からプラスミドヲＴ、マ ニアチス及びその他のアルカリ性溶菌（前記参照）にエリ単離する。

ｂ　）　ＤＫＪＳ　３２１にらの）（ｉｎｄ　ｉ　／　Ｓａｌ　Ｉ　−７ラグメ ントの欠失及び引続＜　ｐＲＭＥ　ｉからのＨｌｎｄ　［／Ｓａｄ　Ｉ−７ラグ メントの挿入 ｐＫＪｓ３２１０μＡ（５００■）、ｐＲＭＥ１１０μＩ（１μ９　）、水ｉｓ μｇ、’ｒＡｓｇ衝ｍ４ｔｔｌ、稀Ｈ１ｎｄ　Ｉ溶液０．５μｌ（１単位）及び 稀Ｓεユニ溶液０．５μｌ（１単位）エリ族る反応混合物を３７°Ｃで１２０分 間恒温株持しかつこの酵素反応を６８°Ｃに１５分間加熱することにより停止す る。引続いてこの電１】限バッチ１０μｅに水２５μ１１１０倍濃度の連結緩衝 蔽４μｅ及びＴ４−　ｒ）ＮＡ−リガーゼ１　ｐｌ　（１単位）を加えかつ１４ °Ｃで１６時間恒温保持する。Ｔ、Ｊ、シルヘイビーの公知方法（Ｅｘｐｅｒｉ ｍ＠ｎｔＢｗｉｔｈ　ｇｏｎｅ　ｆｕｓｉｏｎｓ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｕｒ　Ｔ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｃｏｌ＋ｉ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒ ｂｏｕｒ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　１９８１）にＸＶ受容性にしたＥ、コ’ ＪＳ１７−１の細胞を連結バッチ１０μｌと混会し、４０分間氷上に放置し、４ ２°Ｃに６分間加熱し、かつＬＢ培培地２ｍ色６０分間混合した後で、カナマイ クン５０μ９　／　ｍＡ　ｆ含有するＬＢ−寒天−プレートに塗布する。このプ レート’ｅ３７°Ｃで１６時間恒温保持する。

Ｃ）組み換えプラスミドの同定 このようにして得られたカナマイシン耐性クローンから、シラスミドＩ’）ＮＡ 　ｉ公知のＴ、マニアチス及びその他のアルカリ性溶菌迅速法（前記参照）を用 いて単離する。Ｂａ、ｍ　ＨＩで制限しかつ得られたＤＮＡフラグメントを電気 泳動に工９分離することにより、ｐＫＪｓ６２から畠発して小さなりＮＡ断片が ベクタ一部分上のカナマイシン耐性遺伝子の真中に位置するＨｌｎｄ　＠制限サ イトと挿入断片上に位置するＳａｌ　Ｉ　制限サイトとの間で除去されていてか つカナマイシン耐性遺伝子のコード領域の５末４’に有するｐＲＭＢ　１　：Ｃ ’らのＨ１ｎ＋ｉ　［／Ｓａｌ　Ｉ−７ラグメントにエリ代えられているプラス ミドが同定される。該シラスミドは長さ１６．６及び２．０　ｋｂの２つのＢａ ｍ　ＨＩフラグメントヲ供給し、それ放間らかに出発物質及び他の可能な連結副 生成物とは異なる。ｐＫ、Ｔｓ　３２り）らの３．Ｑ　ｋｔ＋の挿入断片の０． ２ｋｂのＤＮＡ断片が除去されかつカナマイクン耐性遺伝子の一部が同じ遺伝子 的由来の他の遺伝子フラグメントに代えられた構造１示す。このプラスミドがｐ ＫＪｓ　３２冊△６′と表わされる。

例６：プラスミドｐＫ、ｆＥ△Ｂ１３０の製造ａ）シラスミドｐＫＴ　２５１及 びｐＫ、ＴＳ　５２　Ｏｊｌ離ｐＫＴ　２３１の単離については例３に、ｐＫＪ ｓ　３２の単離については例５に記載されている。

ｂ）　ｐＫＪｓ　５２からのｌトさい方のｇｃｏ　ＲＩ　／　Ｂａｍ　ＨＩ−フ ラグメントをｐＫＴ　２３１中でクローン化−７１ｉカｐＫＪｓ　３２　１　Ｃ Ｌ　ｐｉ　（５ＤＪｒｒｋｇ　）、水ｓμｇ。

ＴＡＳ緩衝液２　ｔｔｌ並びに酵素ｐｃｏ　ＲＩ、Ｂａｔｏ　ＨＩ及びＰθｔＩ の托溶液各１μｌ（１単位）工り成シ、かつ他方がｐＫＴ　２３１　１０μ１（ ２５０■）、水６μ１１ＴＡＳ緩衝液２μｌ並びに酵素ｇｃｏ　ＲＩ及び９Ｈｍ 　ＨＩの稀溶液各１μｌ（１単位）ニジ成る反応混合物２種を３７°Ｃで１２０ 分間恒温株持し、反応を停止させるために１５分間６８°Ｇに加熱する。引続い て、両方の制限バッチ各１０μｌを混合し、水５０μ１１１０倍濃度の連結緩衝 液８μｅ及びＴ　４−　ＤＮ八−りが−ゼ２μＥＣ２単位）を加えかつツ４°Ｃ で１６時間恒温保持すムＴ、　Ｊ、シルヘイビー及びその他の文献公知の方法（ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｇｏｎｅ　ｆｕｓｉｏｎｓ、　Ｃｏ１ｄ　 ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　、　ＮｅｗＹＯｒｋ％１９８４）により製造したＥ、コリ ＬＥ　５９２のコンピテント細胞０．２　ｄ　を連結バンチと混合し、氷上に４ ０分間放置し、４２°Ｃに３分間加熱し、ＬＢＢ地２−と混合し、〃）つ３７° Ｃで６０分間恒温保持する。

５０μｌ〜２００μＥの部分量をカナマイ７ノ５０μｇ／ｄを含有するＬＢ　− 寒天−プレート上に塗布する。プレートを３７℃で１６時間恒温保持する。

Ｃ）組み換えプラスミドの同定 このようにして得られたカナマイシン耐性クローンを、一方はストレプトマイク ン２５μｇ／Ｎｔを、他方はカナマイシン５０μ９７ｍ？−含有する２つのＬＢ −寒天−プレート上に平行して塗る。この試験でストレプトマイシン耐性である ことが明ら〃・であるクローンからプラスミド［）ＮＡ’（（Ｔ、マニアナス及 びその他の迅速法（前記参照）に工り単離する。そのＤＮＡをＸｈｏ　Ｉで制限 しかつ引続いてＤＮＡ断片ヲ０．７％アガロースデル中で電気泳動で分離するこ とにより、３．Ｑｋｂ及び９．７　ｋｋ＋の２個のＸｈＯＩフラグメントを与え る組み換えプラスミドの同定を行なうことができる。同じプラスミドを同時にＥ ＣＯＲＩ及びＲａｍ　ＨＩで切断する場合、電気泳動分析に工り１．５ｋｋ＋及 び１１．２　ｉｃｂの２つの断片が生じる。この工うにして同定されたプラスミ ドは、ｐＫＴ２３１のＥｃｏ　ＲＩ　／　Ｂａｍ　ＨＩ−フラグメントとプラス ミドｐＫＪＳ　３２の挿入ｒ）ＮＡに由来する１、５ｋｋ＋のＥｃｏ　ＲＩ／Ｂ ａｍ　ＨＩ−フラグメントとより成る組み換え体である。これをｐＫ、ＴＥ△Ｂ １３０と表わす。

例７：プラスミドｐＫＪｓ（Ｘ）　６３０　（Ｄ　製ｍａ）プラスミドｐＫＪＳ Ｂ　５３０の単離例４で得られた組み換えプラスミド１）ＫＪＳＢ　３３０　′ ！１ｌ−１６時間培養し、かつ遠心分離した細胞ρ１らプラスミドＤＮＡ　ｆ　 Ｔ、マニアナス及びその他のアルカリ性浴菌にエリ（前記参照）単離する。

ｂ）プラスミドｐＫ、ｙｓｓ　３３０　ｙｖｈらＢａｍ　ＨＩ　／　Ｘｂａ　Ｉ −７ラグメントの除去 ｐＫＪＳＢ　３３０　２０μｌ（１μｇ）、水１５μ１１ＴＡＳ緩衝液４μｌ、 稀Ｘｂａ　Ｉ　ｆａ　Ｏ，５ｔｔｌ　（２単位）及びｆｆｄ　Ｂａｍ　）（Ｉ浴 液０．５μｌＣ２単位）工す収る反応混合物を３７℃で１２０分間恒温保持する 。引続いて、Ｔ。

マニアナス及びその他（前記参照）にエフ緩衝させたファノール２０μｌを加え 、混合し、クロロホルム：インアミルアルコール（２４：１）２０μＥの冷加後 再度混合しかつ遠心分離する。上方の水相を取りかつ一２０℃のエタノール１２ ０μｊと混合する。混合物を一２０°Ｃで６０分間株存し、その後で遠心分離す る。

沈殿ｒ）ＮＡ　’ｉ冷い７０％エタノールで洗い、真空乾燥しかつフレノウ反応 浴液Ｃ２０ｍＭ　）　’）スーＨＣｚ、ｐｌ”１８．０．７　ｍＭ　ＭｇｆＪ　 ２．１０Ｕ／ａｔｒｌＮＡポリメラーゼ■（＝フレノウ酵素）〕２０μｌ中に取 る。３７９Ｃで５分間予備恒温保持した後で、４種のすべてのデオキクヌクレオ チド三り７　Ｕ　（ＡＴＰ　Ｏ，１２５ｍＭ　、ＣＴＰｏ、１２５ｍＭ、（）Ｔ ＰＯ，１２５ｍＭ、ＴＴＰｏ、１２５ｍＭ。

Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）の溶液２μｌを加え、更に５分間恒温保持する。その後 、このバッチ’ｉ　Ｔ　４−１’）ＮＡ　−ＩＪが−ゼ２５　Ｕ　／　ｍ／、を 含有する連結緩衝液８０μｌと混合しかつ室温で６時間放置する。引続いて１４ ８Ｃで１６時間恒温株持する。Ｔ、　Ｊ、クルヘイピー及びその他の方法（Ｅｘ ｐｅ’ｒｉｍｓｎｔｓ　Ｗｉｔｈ　ｇｅＱｅ　ｆｕｓｉｏｎｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｕｒ　、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８４）により製造したＥ、コリ８１７ −１のコンぎテント細胞の懸濁液０．２１Ｌｔを連結パッチ１０μｌ、！：混合 し、氷上で４０分間恒温抹持持後熱処理（４２°Ｃ，３分間）に工り形質転換し 、ＬＢ培地２ｊ！Ａを混合しかつ３７°Ｃで６０分間恒温保持する。細胞懸濁液 から５０〜２００μｌの部分量をカナマイシン５０μ９／ｌ’ｆｃ含有するＬＢ −寒天−プレート上に塗布する。プレートを３７°Ｃで１６時間恒温保持する。

Ｃ）小型プラスミドの同定 このようにして祷られたカナマイシン耐性クローンからプラスミドＤＮＡ　’ｉ ｚ公知のＴ、マニアナス及びその他のアルカリ性溶菌迅速法（前記参照）に工り 単離する。プラスミドｆ　Ｓｍａ　Ｉで制限しかつ次いでｒ’ｌＮＡ断片を０． ７％アガロースデル中で電気泳動により分離することに工り、：０ＫＪＳＢ　３ ３０の挿入断片上のＢａｍ　ＨＩ制限サイトとＸｂａ　Ｉ制限サイトとの間のＤ ＮＡ断片を失っているプラスミドが同定される。このプラスミドは制限分析にお いて２．６　ｋｋ＋及び９．９ｋｂのＳｍａ　Ｉフラグメント２種を生成し、こ れをｐＫＪｓ（Ｘ）　６３０と表わす。

それ故、これは明らりλに出発生成物ｐＫＪｓ８３３０とは区別される。

例　８ニア′ラスミド］）ＴＪＳＳ′’　０３５及びｐＴＪｓダ０６６の製造 ａ）プラスミドｐＴ７−５　、　ｐＴ７−６及びｐＫＪｓ　３２の単能 一方はプラスミドｐ’ｒ’７−ｓ　ｌ他方はプラスミドｐ’ｒ７−６を含有する Ｅ、コリＨＭＳ　１７４の２種の菌株をアンビンリン５０μ＆　／　ｒｕ　ｋ　 添加してＴ、マニアナス及びその他（前記参照）によりＬＢ培地それぞれ４００ 紅中、６７°０で１６時間培養する。遠心分離しｆｃ細胞からプラスミドＤＮＡ 　’ｉ全公知Ｔ、マニアナスのアルカリ性溶菌法により単能する。ｐＫＪｓ　３ ２の単能は例５に記載さルている。

ｂ）　ｐＫＪｓ　３２からのＳａｃ　ｌ　／　５ａｔｌ−フラグメン）　、’ｚ 　ｐＴ７−５及びｐＴ７−６中でクローン化ｐＫＪｓ　３２　２０μｌ（１μｙ ）、水１５μＪ　、　ＴＡＳ緩衝液４μｌ及び酵素Ｓａｃ　ｌ及び５ａｔｌそれ ぞれ０．５μｌ（２単位）Ｌり成る反応混合物（ｌｋ３７℃で１２０分間恒温保 狩保持。ｐＴ７−５　２μｌ（１μ＆）（Ｂ）か又ＶｉｐＴ７−６　２μＪ（１ μ＆）　（Ｃ）、水１５μｌ　、　ＴＡＳ緩衝液２μｌ及び酵素Ｓａｃ　ｌ及び ５ａｔｌそれぞれ０．５μｌ（２単位）より成る他の２棟の反応混合物を同じ条 汁下で恒温保持する。３つすべての反応に６８°Ｃに１５分間加熱することＫｊ り停止する。制限バッチＡ（ｐＫＪｓ　３２）各１６μｌを制限バッチＢ　（ｐ Ｔ７−５）７μｌもしくは制限バッチＣ（ｐＴ７−６　）　７μｌと混合する両 方の混合物にそｎぞれ水５０μｌ、１０倍濃度の連結緩衝液８μｌ及びＴ　４− 　ＤＮＡ−リガーゼ２μｌ（２単位）を加える。両方の連結バッチｔ−１４℃で １６時間恒温保持する。Ｔ−、Ｌシルヘイビー及びその他の方法（Ｅｘｐｅｒｉ ｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｊｏｎｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｈａｒｂｏｕ ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　＊　 Ｎｐｗ　Ｙｏｒｋ　。

１９８４）により製造したＥ、コリｔ、ｇ３９２のコンピテントｍ胞子ｎぞれ０ ．２　ＪＩＪ　’に連結バッチそれぞれ１０μｊと混合し、氷上で４０分間放置 し、４２℃に６分間加熱し、ＬＢ培地２紅と混合しかつ３７°Ｃで６０分恒温保 狩する。５０〜２００μｊの部分１°を、アンピシリン５０μ、＆／ｕｋ含有す るＬＢ−寒天−プレート上に塗る。このグレートｔ６７℃で１６時間恒温保持す る。

Ｃ）組み洪えプラスミドの同定 このようにして得られたアンビンリン耐性クローンから、グラスミドＤＮＡ　ｋ 　Ｔ−マニアチス及びその他の公知のアルカリ性溶菌迅速法（前記参照）によシ 単能する。グラスミドｋ　Ｂａｔ　ＩＩ及び８６ｍ　ＨＩで制限しかつＢａｍ　 ＨＩ及びＨｉｎａ　ｍで二重制限（ｄｏｐｐｅｌｔｅ　Ｒｅ５ｔｒｊｋ−ｔｊｏ ｎ　）　（、、かつ引吐いて７ラグメントｔ０．７％アガロースｒデルで電気泳 動で分離することにより、両方のベクタープラスミドｐＴ　７−５か又はｐ’ｒ 　７−６の１つとｐＫＪＳ　３２の小型Ｓａｃ　ｌ　／　Ｓａｔ　Ｉ−フラグメ ントヨり成るプラスミドが同定さｎる。該組み換えグラスミドは出発生成物とし てのｐ’ｒ　７−５の場合には３−Ｏｘｂ及２．２　ＫｂのＢｇｔｌフラグメン ト２個、５−２　ｘｂのＢａｎＨＩフラグメント並ひに３．２　Ｋｂ及び２．０ 　ｋｂのＢａｍ　ＨＩ／Ｈｊｎａｌ−フラグメント２個會供給しかつこれをｐＴ Ｊｓｓ’　０３５と表わす。出発生成物がｐＴ　７−６の場合には２−８　ｋｂ 及び２．２　ｋｂのＢｇｔＩｌフラグメント２弧５Ｊ］　ｋｌ）のＢａｍ　ＨＩ フラグメント及び３−Ｑ　ｌｃｂ及び２−ＯｋｂのＢａｍＨ工／　Ｈｉｎａ　＊ −フラグメント２個が生じ、それｋ　ｐＴＪｓｓ’　０３６と表わす。そｎ故、 該組み換えグラスミドは明らかに七ｎらの出発生成物ｐＫＪｓ　３２　、　ｐＴ 　７−５もしくはｐＴ　７−６とは異なっている。

例　９ニゲラスミドｐＴＪｓ’Ｂ　４３５及びｐＴＪＳ’Ｂ　４３６の製造 ａ）プラスミドｐ’ｒ　７−５　、　ｐ’ｒ　７−６及びｐＫＪｓＢ６６０の単 離 ｐ’ｒ　７−５及びｐＴ　７−６の単離については既に例８に、ｐＫＪｓＢ　３ ３　Ｄの単離については例７に記載されている。

ｂ）　ｐＫＪｓＢ　３３０からの小型５ａｔｌ　／　Ｂａｎ　ＨＩ　−７ラグメ ントｋｐＴ　７−５及びｐ’ｒ　７−６中でクローン化 ｐＫＪｓＢ　３３０　４０μ！！（２μｇ）、ＴＡＳ緩衝液５μｌ並ひに＃累５ ａｔｌ及びＢａｍ　ＨＩの稀溶液それぞれ２．５μｌ（４単位）よシ成る反応混 合物（Ａｌ’に３７°Ｃで１２０分間恒邑保持する。ｐＴ　７−５　（Ｂ　）　 ２μｌ（１μｇ〕もしくはｐ’ｒ　７−６　（Ｃ）　２μＪ（１μｇ）、水２０ μＡ！、ＴＡＳ緩衝液３　ｔｔｌ並びに酵素Ｓａｔ及びＢａｍＨｌの稀溶液それ ぞれ２．５μｌ（４単位）よシ成る他の２＆の反応混合物上回じ条件下に恒温保 持する。これらの反応を６８℃に１５分間加熱することにより停止する。制限バ ッチＡ　（ｐＫＪｓＢ　３３０　）全部をアガロースゲル（Ｔ、マニアテス及び その他（前記参照）によりエチジワムブロミド０．５μｇ／ＩＬｔｋ含有するＴ 、マニアチス及びその他（前記参照）により　ＴＢＥ緩衝液中の０．７チアガロ ース〕中で電気泳動で分離する。ＵＶ線（３００ｎｍ　）で観察可能な両方のＤ ＮＡバンドのうち小型の２．ＯｋｂのバンドｔＤＥＡＥ膜溶離法によりグルから 次の工９にして単離する：好適な可法のＤＥＡＥ膜片（５ｃｈｌｅｊｃｂｅｒ　 ｕｎｄ　５Ｃｈｕｅ１１Ｓ　＆　ＳＮＡ　−４５）　ｆ溶離すべきバンドの下方 の切欠き１〜２１ｍｌ甲に配置する。

該当するバンドが全く膜によって吸着されるまで電気泳動紮継続する。引続いて 膜勿グルから取り出しかつＮＥＴ緩衝液（１５Ｑ　ｍＭ　ＮａＣｔ、　０．１　 ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　２０　ｍＭトリス−ＨＣｔ、　ＰＨ８−０）　１０ＩＬｔ で１０分間洗う。洗浄した膜’（（ＨＮＥＴ緩責液（Ｉ　Ｍ　ＮａＣＬ　、　０ ．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　。

２０　ｍＭ　）リス−ＨＣｌ　、ｐＨ８，０）　１５Ｄｐｌ中８０℃で３Ｄ分間 恒温保持する。この溶液？除いて、膜を更に１′０分間淋ＥＴ緩衝液５０μｌで 恒温保狩する。合しに溶離溶液（２００μｌ）を水２００μｌで稀釈し、次に（ −２０°Ｃ）エタノール８００μｌと混合しかつ一２０°Ｃで３０分間保存する 。沈殿したＤＮＡ　ｉ遠心分離しかつこの沈殿を水９０μｌ中に取る。Ｔ、マニ アチス及びその他（前記参照）によ９３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１０μ！の添加後 、冷いエタノール２００μ！で再び沈殿させ（−２０℃、６０分間）、遠心分離 し、沈殿を冷い７０チエタノールで洗い、真空乾燥させかつ連結緩衝液８０μ！ 中に取る。そのうちの各４０μｊに制限バッチＢ　（ｐＴ　７−５　）　３　ｔ ｔｌ　（１００ｎｇ）もしくは制限バッチＣ（ｐＴ　７−６　）　３　ｔｔｌ　 （１００ｎｇ）及びＴ４−　ＤＮＡ−リガーゼ２μＪ（１単位）を加えかつ１４ °Ｇで１６時間恒温保持する。Ｔ、　Ｊ、シルヘイビー及びその他の方法（Ｅｘ ｐｅｒｊｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｊｏｎｓ　。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　＊　Ｃｏ１ ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　＋　１９８４　）に より製造したＥ。

コＩＪ　Ｌ　Ｅ　３９２のコンピテント細胞０．２’＃Ｌｌ一連結バッチ１５μ ノと混合し、氷上に４０分間放置し、４２℃に３分間加熱し、ＬＢ培地２１ｉＬ と混合しかつ３７℃で６０分間恒邑保持する。５０μｌ〜２００μｌの部分量を 、アンピシリン５０μ９／ｇ’ｒ含有するＬＢ−寒天−プレート上に塗る。該グ レー）ｋ３７℃で１６時間恒温保持する。

Ｃ）組み換えプラスミドの同定 このようにして得られたアンピシリン耐性クローンからＤＮＡ　’ｉ公知である Ｔ、マニアチス及びその他のアルカリ性溶菌迅速法（前記参照ンにより単離する 。デラスミドｆ　ＥｃｏＲＩで制限しかつ引続いてフラグメントラ０．フチアガ ロースｒル中で電気泳動で分離することにより、ｐＫＪｓＢ　３３０からの小型 ５ａｔｌ　／　Ｂａｎ　ＨＩ　−フラグメントラ両方のベクターグラスミドの一 方に含有するプラスミドが同定される。出発生成物としてのｐＴ　７−５との組 み換えプラスミドでは３．Ｑ　ｋ’ｂ及び１．５ｋｂの２つのＥｃｏＲＩフラグ メントが得られ、かつこれｉ　ｐＴＪｓ’Ｂ　４３５と表わし、出発生成物とし てのｐ’ｒ　７−６との−ｌ″ラスミドでは２．８　ｋｂ及びｉ、５　ｋｂの２ つのＥｃｏＲＩ　７ラグメントが生じ、これｔ−ｐ’ｒ、ｒｓ’　Ｂｉ１２と表 わす。

例１０：デラスミド］）ＴＪＳ’Ｘ　５３５及びｐＴＪＳ′’Ｘ　５３６の製造 ａ）プラスミドｐ’ｒ　７−５　、　ｐＴ　７−６及びｐＴＪｓｓ’　０３５の 単離 例８で製造したプラスミドｐＴＪｓｓ′０３５　’に含有するＥ、コリＬｇ３９ ２ａ”アンピンリン５０μｇ　／　Ｉ”ｌ　ｋ　ＴｊＡ加含有するＬＢ培地４０ ０μ甲６７℃で１６時間培養する。遠心分離した細胞からプラスミドＤＮＡ　ｋ 　Ｔ−マニアラス及びその他（前記参照）により単離する。ｐＴ７−５及びｐ’ ｒ　７−６の＃Ｌ脂は例８に記載されている。

ｂ）　ｐＴＪｓｓ′０３５からの小型５ａｔＩ　／　Ｘｂａ　１−フラグメント をｐ’ｒ　７−５及びｐ’ｒ　７−６中でクローン化 ｐＴＪｓｓ”０３５　６ｔｔｌ　（３ｔｔＥ／）　、水１５ｐｌ　、　ＴＡＳ緩 衝液３　ｐｌ並びに酵素Ｘｂａ　ｌ　、　５ａｔＩ及びＢａｎ　ＨＩの稀溶液そ れぞれ２μＪ（５単位）よｐ成る反応混合物（Ａ）ｔ−３７°Ｃで１２０分間恒 温保持する。ｐ’ｒ７−ｓ（Ｂ）２μｌ！（１μｙ）か又はｐＴ　７−６　（Ｃ ）　２μ！（１μｇ）、水２３μｌ　、　ＴＡＳ緩衝液６μ！並びに酵素Ｘｂａ 　ｌ及び５ａｔｌの稀溶液各１μｌ　（２−５単位〕よシ厄る他の２種の反応混 合物を同じように恒温保持する。

反応を６８℃に１５分間加熱することに停止させる。

２種の異なる連結バッチにおいて、制限バッチＡ（ｐＴ、ｒｓｓ’０３５　）各 ５　μＡ’　（５００ｎ、ｌｉ’　）　ｔ−制限バッチＢ　（ｐＴ　７−５　） 　１５μｌ又は制限バッチＣ（ｐ’ｒ　７−６）１５紅、水５０μ！、連結緩衝 液８μｌ及びＴ　４−　ＤＮＡ−リガーゼ２μｌ（２単位）と混合し、かつ１４ ℃で１６時間恒温保持する。Ｔ、　Ｊ、シルヘイビー及びその他の方法（Ｅｘｐ ｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｉｏｎｓ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｕｒ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　＊　１９８４　）により製造したＥ、コリＬＥ ３９２のコンピテント細胞０．２１１７　’に連結バッチ１５μノと混合し、氷 上に４０分間放飯し、４２℃に６分間加熱し、ＬＢ培地２都と混合しかつ３７℃ で６０分間恒温保持する。部分倉５０μｌ〜２００μｌをアンピンリン５０μｉ ／ｒＬｔｋ含有するＬＢ−４天−プレート上に塗布する。このプレートを３７℃ で１６時間恒温保持する。

Ｃ）組み換えプラスミドの同定 このようにして得られたアンピシリン耐性クローンから、プラスミドＤＮＡ　ｔ −τ、マニアチス及びその他（前記参照ンにより単離する。酵素Ｓｍａ　Ｉ及び ＥｃｏＲＩによる制限並びにＥｃｏＲＩ及び５ａｔＩによる二重制限により、ｐ ＴＪｓｓ’　Ｏ３５からの１．４ｋｂの小型５ａｔｌ　／　Ｘｂａ　ｌ　−フラ グメント’ｔ−画方のベクタープラスミドｐＴ　７−５もしくはｐ’ｒ　７−６ 中に含有するプラスミドが同定される。出発生成物としてのｐ’ｒ　７−５との 組み換えプラスミドは３．Ｑ　ｋｂ及び０．８ｋｂのｇｃｏＲＩフラグメント２ 個、　２．４　ｋｂ及び１．４１ｃｂのＳｍａ　Ｉフラグメント２個及び２．４ 　ｋｂ　、　０．８　ｋｂ及びＱ、（５ｋｂのＥｃｏＲＩ　／　５ａｔ１−フラ グメント６個を生成し、そ％　ｆ　ｐＴＪｓ’　Ｘ　５３５と表わす。出発生成 物としてのｐ’ｒ　７−６との組み換えプラスミドは２．８　ｋｂ及びＱ、８ｋ ｂのＥｃｏＲＩフラグメント２個、　２．２ｋｂ及びｉ、４ｋｂのＳｍａ　Ｉフ ラグメント２個並びに２．２　ｋｂ　、　Ｑ、８ｋｂ及び０−（Ｓ　ｋｂのＥｃ ｏＲＩ　／５ａｔｌ−７；ｙグメ７）３個を供給し、こし’１（ｐＴＪｓ′Ｘ５ ３６と表わす。それ故、組み俟えプラスミドは明らかにその出発生成物とは異な っている。

例１１ニブラスミドｐＴＪｓ′’Ｘ　５３５　、オメガの製造ＰＬ）　プラスミ ドｐＴＪｓ’　Ｘ　５３５及びｐＤＯｃ　３７の単離 一方が例１０で製造したプラスミドｐ’ｒ、ｙｓ’ｘ　５３５を、他方のプラス ミドｐＤＯｃ　３７と含有する菌株Ｅ、コリＬｇ３９２　２種をアンピシリン５ ０μ９７ＨＬｋ添加　含有するＬＢ培地各４００酩中、３７℃で１６時間培養す る。遠心分離した細胞からグラスミドラＴ。

マニアラス及びその他（前記参照）によシ単離する。

プラスミドｐＤＯｃ　３７はＥｃｏＲＩ制限サイト２個の間にオメガフラグメン トラ含有する。ｐＤＯＣ３７の代りにプラスミドｐＨＰ　４５オメガ（Ｐｒｅｎ ｚｋｉ及びＫｒ１ｓｃｈ　ｅｌ　９８４　、　Ｇｅｎｅ　、　２９　：　１０３ に記載）を同じようにオフガフ２グメント源として使用することができる。

１）、＋　ｐＤｏｃ　３７からのオメガ７ラグメントをｐＴＪｓ’　Ｘ　５３５ のＢｇＬ　■サイト中にクローン化 一方がｐＴＪｓ’Ｘ５３５　２ｆｉｌ　（１１１＆）　、水１４　ｔ’ｌ＊ＴＡ Ｓ緩衝液２μｌ及びＢｇｔ　ｎ　２μＪ（３単位）よシ成シかつ他方がｐＤＯｃ 　３７　２μｌｃ２μｙ）、水１４μｌ。

ＴＡＳ緩衝液２　μｉ及び稀Ｂａｍ　ＨＩ溶液２μ／＜４単位）より成る反応混 合物２種を６７°Ｇで１２０分間恒温保持する。反応を、６８℃に１５分間加熱 することによシ停止する。両方の制限バッチ各１０μｌｋ合つしかつそれに連結 緩衝液８０μｌ及びＴ　４−　ＤＮＡ　−＋）ガーゼ１μｌ（１単位）ｋ加える 。連結バッチ全１４℃で１６時間恒温保持する。Ｔ、　Ｊ、シルヘイビー及びそ の他（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｉｏｎｓ、　Ｃｏ ’ｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　＊　ＮｅｗＹｏｒｋ　、　１９８４　）によシ製造 したＥ、＝＋すＬＥ３９２のコンピテント細胞０．２１Ｌｔｔ一連結バッチ１０ μｌと混合し、氷上に４０分間放置し、４２℃に６分間加熱しＬＢ培地２紅と混 合しかつ３７℃で６０分間恒温保持する。５０〜２００μｌの部分子ｒｋ、アン ピシリン５０μｇ／ＩＬｔ及びスペクチノマイシン８０μｇ／ｊＬｌ含有するＬ Ｂ−寒天−プレート上に塗布する。スペクチノマインンで選択することによシ、 すべての生長クローンがオメガフラグメントを有するシラスミドを含有すること が明らかである。それというのもこのフラグメントがスペクチノマインン耐性発 現遺伝子を含有するからでおる。

Ｃ）組み換えプラスミドの同定 このようにして得られたアンピンリン−及びスペクチノマイシン耐性のクローン からプラスミドＤＮＡ　ｋ　Ｔ−マニアチス及びその他（前記参照）により単離 する。

Ｈｊ、、ｎｄ　ｌで制限することにより組み換えプラスミド全同定する。その際 に、０．６　ｋｂ　、　２．０　ｋｂ及び３−２　ｋｔ＋のＨｉ、ｎｄ　ｍフラ グメントろ種が生じ、これは前回のＢｇｔ■サイトにオメガフラグメント奮起み 込んだｐＴＪｓ″ｘ５３５の誘導体である。ＢｇｔＨ−及びＢａｍ　ＨＩフラグ メントの適合性ｌ複末端の連結によシ、制限サイトＢｇｔ　１１及びＢ（１ｍＨ Ｉは連結サイトで失なわれる。この組み侠えプラスミドｉ　ｐＴＪＳ’χ５６５ オメガと表わす。

例１２：ファージＭＪＳＳ’　Ｑろ０及びＭＪＳＳ’０３１の製造 ａＪ　７″′ラスミドｐＫＪＳ　３２並びに２本鎖形のファージＭ１３ｔｇ１３ ０及びＭ　ｉ　３　ｔｇ１６１の単離 菌株Ｅ、コリＪ　Ｍ　１０１　（Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ及びその他、Ｎｕｃｌ　 Ａｃｊｄｓ　Ｒｅｓ、　９　：　３０９　（１９８１）　）並びにベクターＭ１ ３ｔｇ１３０及びＭ　１３　ｔｇ　１３１　ＣＭ。

Ｐ−Ｋｊｅｎｙ及びその他、　Ｃ）ｅｎｅ　２６　：　９１　（１９８３））の 二本鎖ＤＮＡはアマーンヤム・プフラー（ＡｍｅｒＳｈａｍＢｕｃｈｌｅｒ　（ ）ｍｂ　Ｈ＆　Ｃｏ−Ｋ　Ｏ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｖｒｅｊｇ在】から入手し得る 。二本鎖ＤＮＡは仄の方法でも得られる：Ｔ＋Ｊ、ンルヘイビー及びその他（Ｅ ｘｐｅｒｊｍｅｎｔｓ　ｗｌｔｈｇｅｎｅ　ｆｕｓｊｏｎｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｊｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａ ｒｂｏｕｒ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　１９８４　）により製造したＥ、コリ ＪＭ１０１のコンピテント細胞０．２　ｊｌｊｆ文献公知の方法によ！１１Ｍ１ ３ベクターの一本鎖一又は二本鎖ＤＮＡで形質転換し、溶融（４５℃）Ｈ−Ｔｏ ｐ−寒天（１０ｇ／ｌ！　）リゾトン、　８１！／ｌＮａＣ１、８ｇ　／　ｌ　 寒天）３ｄと混合し、Ｈ−寒天−７’レー　ト　＜１０９／ｌ　ト　＋）　プ　 ）　ン　、８９／　ｌｌ　ＮａＣ１、１２ｇ１ＩＮ天ン上に注ぐ。冷却したプレ ー）’！Ｉ：３７°Ｃで１６時間恒温保持する。ＴＹ培地＜１６ｊ９／ｌト１） デトン、１　Ｇｇ／ｌ酵母エキス、５９／１Ｎａｃｌ）　２ｍにＴＹ培地中のＥ 、コリＪＭ１０１の一晩培養物（６７℃。

１６時間）２０μｌ及びＨ−寒天−グレートの各溶菌斑會接種する。６７°Ｃで １６時間生長はせた後で、ファージ感染細胞’（Ｅ−コ！ｊＪＭ１０１の新しい 一晩培養物２μと一緒にＴＹ培地ｄＱＱｄ中に移種し、６７°Ｃで１６時間培養 する。遠心分離した細胞から二本鎖ＤＮＡ　奮Ｔ−マニアテス及びその他（前記 参照〕により単離する。プラスミドｐＫＪＳ　３２の単離は例５に既に記載され ている。

ｂ）　ｐＫＪＳ　３２からのＳａｃ　Ｉ　／　５ａｔＩ−フラグメントをＭ１３ ｔｇ１３０及びＭ１３ｔｇ１３１中にクローン化 ｐＫＪｓ　３２　３０μｌ（１，５μｇ）、水２０μｌ　、　ＴＡＳ緩衝液６μ ｌ及び酵素Ｓａｃ　Ｉ及び５ａｔｌの稀溶液それぞれ２μＪ（４単位）より成る 反応混合物（Ａ）ｔ−３７℃で１２０分間恒温保持する。ｙ１３ｔｇ１３０ＣＢ ）又はＭ１３ｔｇ１３１（Ｃ）の二本銭ＤＮＡ　１０ｐｉ　（３００ｎ＆　）　 、水２５　μｌ　、　ＴＡＳ緩衝液４　ｔｔｌ並びに酵素Ｓａ　ｃ　Ｉ及び５ａ ｔｌの稀溶液各０．５μｌ（１単伽より成る他の反応混合物２種を同じように恒 温保持し、かつ反応を停止するために１５分間６８°Ｃに加熱する。

全制限バンチＡｆアがロースグル〔アガロース０．７％。

ＴＢＥ緩伽液中のエチゾウムブロミド０．５μｇ／戯、Ｔ。

マニアチス及びその他〔前記参照）により〕中で電気泳動により分離する。ＵＶ 線で観察さｎるＤＮＡバンドのうち２．８　ｋｌ）の小型Ｓａｃ　１　／　５ａ ｔＩ−バンドを例９で２．０　ｋｂのバンドに関して記載したようにデルからＤ ＲＡｇ膜を用いて単離する。最後に、ＤＮＡ？水８０μ！中に取シ、そのうちの それぞれ４０μｌに制限バンチＢ（Ｍ１３ｔｇ１３０）もしくはｃ　（Ｍ１３　 ｔｇ１３１）２０μ！及び水４０μｌｋ加え、緩衝したフェノール／クロロホル ム１００μｌとＴ、マニアテス及びその他（前記＃Ｈ，）によジ混合し、かつ遠 心処理する。水性上相を取り、Ｔ、マニアチス及びその他（前記参ＰｆＡ）によ ５３Ｍ酢酸ナトリウム溶液１０μｌの添加後冷い（−２０’ＣＥ）エタノールそ れぞれ２００μｌと混合する。混合物を一２０°Ｃで６０分間放置し、引続いて 遠心処理し、沈殿を冷い７０チエタノールで洗い、真空乾燥しかつ連結緩衝液４ ０μｌ中に取る。両方のパンチにＴ　４−　ＤＮＡ−リガーゼ各１μ！（１単位 ）を加えかつ１４°Ｃで１６時間恒温保持する。Ｔ−Ｊ、シルヘイビー及びその 他（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｊｏｎｓ＋Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　１９８４　）によシ製造し たＥ。

コ！ＪＪＭ１０１のコンピテント細胞それぞれ０−２１１一連結バッチ１０μｌ と混合し、氷上で４０分間放置し、４２℃に３分間加熱し、かつ溶融（４５°Ｃ ）　Ｈ−Ｔｏｐ−寒天それぞれ３鮭と混合する。混合物にそれぞれＩＰＴＧ　４ 　Ｑ　ｔｔｌ　（１０Ｑ　ｍＭ　）及びｘ　−ＧａＡ　４０　ｔｔｌ　（ジメチ ルホルムアミド中２％）を加えかつＨ−寒天−グレート上に注ぐ。冷却したプレ ート上３７°Ｃで１６時間恒温保持する。

Ｃ）組み換えファージの同定 このようにして得られた溶菌斑のうち、宵に着色していないものが組み換えファ ージから由来する。更に同定するために、二本鎖−及び−重鎖ＤＮＡ　’ｉ無色 の溶菌斑から文献公知の方法（Ａｍｅｒ８ｈａｍの＠Ｍ１３Ｃ１ｏｎｊｎｇａｎ ｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｈａｎｄｂｏｏｋに総括されている）により単離す る。二本鎖ＤＮＡ　ｆ　Ｅｇｌ　ｌで制限しかつ引続いてＤＮＡ　７ラグメント ヲ電気泳動で分離することによシ、ｐＫＪＳ　３２からの小型Ｓａｃ　Ｉ　／　 ５ａｔｌ−７ラグメントを含有するＭ１３ｔｇ１３０もしくはＭ　１３　ｔｇ１ ６１の誘導体が同定される。ベクターとしての）１１６ｔｇ１３０との組み換え ファージは０．７　ｋｂ　、　２．２　ｋｋ＋及び７−１ｋｂのＢｇｔ　ｌｌフ ラグメント３個を示し、これ１ｙ、ｒｓｓ’０３０と表わすａ　Ｍ　１３　ｔｇ ｌ　３１とのものは［＋、６　ｋｂ　Ｔ　Ｏ，７ｋｂ　、　２．２　ｋｂ及び６ ．６　ｋｂのＢｇｔ　ｌ［フラグメント４個を示し、これ１（ＭＪＳＳ’　Ｄ　 ３１と表わす。

それらは、明らかにその出発生成物とは異なっている。

例ｉ　３　：　ｔｆｄＡ−突然変異体アルカリゲネス・オイトロフスＪＭＰ　１ ３４　：　Ｔｎ　５−２及びＪＭＰ１３４：　Ｔｎ　５−４ ａ）アルカリゲネス・オイトロフスＪＭＰ１３４のトランスポゾン突然変異誘発 ＰＹＥ培地（ペプトン５９／１．酵母エキス３９／１）１０μにアルカリゲネス ・オイトロフスＪＭＰ　１３４（Ｒ，Ｈ，Ｄｏｎ及びその他、　Ｊ、Ｂａｃｔｅ ｒｊｏｌ　１４５　：６８１（１９８１）：］の−晩培養物（１６時間、３０° Ｃ）マニアチス及びその他（前記参照）によるＬＢ培地１０紅は、プラスミドｐ ＳＶＰ　２０２１　’ｃ金含有ルＥ。

コ　リ　Ｓ　１　７　−　１　（Ｂｊｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１　：　７　８ 　４　（１９８３））の−晩培養物Ｑ、１ｉＡｉ接種し、かつ３７℃で５時間振 盪する。引続いて、両方の培養物について光度計で改良６００　ｎｍで光学密度 を測定する。培養物をその光学密度に関連して比１：１で混合しかつ混合物１． ５１’ｉ　ＰＹＥ　−４天−プレート［Ｒ，Ｈ，Ｄｏｎ及びその他、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４５　：　６８１　（１９８１）　］上に分散さぜる 。プレートを３０°Ｃで１６時間恒織保持する。

引続いて、細菌全滅Ｍ　Ｏ，７チＮａＣ１溶液１．５μでプレートから洗浄しか つ細菌懸濁液奮２工程で０．７チＮａ　ＣＬ浴液を用いてその都度１　：　１０ 　（０，ＩＩｕ＋０．９ｍＬ）に稀釈する。それぞれの稀釈液から部分量５０μ ａ、ｉｏｏμ７．２００μ！及び４００μｌを付加的にフラクトース２９／ｌ及 びカナマイノン３８０μム１．６９／１．−硫酸二水素カリウムＤ−４９／１． 硫酸アンモニウム１ｊ？／１．ｍｅＲマグネシウム・７　Ｈ２Ｏ０、０５＆／１ ．硫酸鉄（■）・７　Ｈ２Ｏ　０．０　１　ｆ；ｌ／ｌ　。

寒天１５Ｅ／ｌ）上に塗る。プレートを６０℃で３〜７日間恒温保持する。

ｂ）トランス？シン含有菌株による２，４−Ｄ分解試験 このようにして得られたカナマイシン耐性クローンは、トランスポゾンＴｎ５’ ｉそのｒツム中に安定的に組み込んだ菌株ＪＭＰ　１　３　４の子孫である。こ れを一方は２．４−ジクロルフェノキン酢酸・ナトリウム塩（２．４−Ｄ）１ｍ Ｍを含有し、他方はフラクトース２１７１及びカナマイシン３８０μＦ　／　！ Ａ　ｋ含有する２つの最少寒天プレート上に平行して塗布する。プレートを３０ ℃で６日間恒温保持する。２．４−Ｄ分解ｔｍ発する遺伝子の１つにおいて突然 変異を示す菌株は２．４−Ｉｎ生長基質として使用することはできない（２．４ −Ｄ陰性す。それはトランスボ・ｌン含有カナマイシン耐性クローン全体に対し て０．１〜１チの頻度で坑われる。

ｃ）２．４−Ｄ陰性突然変異体の遺伝子欠失の同定 このようにして得られ７’ｃ２，４−Ｄ陰性突然変異体を、一方け３−クロル安 息香酸・ナトリウム塩（６−ＣＢ）２　ｍＭ　ｋ含有し、他方はフラクトース２ ９／１及びカナマイシン６８０μＦ／ｊｌｊ’に官有する最少寒天プレート２つ に平行して塗布する。プレートを６０°Ｇで６日間恒温保持する。２．４−Ｄ分 解の遺伝子？，ｆｄＣ　、　ｔｆｄ　Ｄ及びｔｆｄ　Ｅ中に突然変異を有する菌 株ＪＭＰ１６４の２．４−Ｄ陰性トランスポゾン突然変異体は、トンＣ　Ｄｏｎ 　）及びその他Ｃ　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１　６　１　：８５（１９８５ ））が示すことができたように３−ＣＢを生長基質として使用することはできな い。これに対して遺伝子ｔｆｄ　Ａ及びｔｆｄ　Ｂにおける突然変異体が唯一の 炭素源としての３−ＣＢ上で生長し得る（３−ＣＢ陽性）。それ故、この試験に おいて更に３−ＣＢ陽性が明らかになるトランスメゾン突然変異体を＃素試験に よシ遺転子ｔ，ｆｄ　Ａ又はｔｆｄ　Ｂ　Ｋおける欠失について試験する。その ために菌株をピルビン酸ナトリウム７５　ｍＭ及び３−ＣＢ１ｍＭｋ添加含有す る最少培地（前記のような、寒天を含まない）２５０Ｍ中６０６Ｃで１６時間培 養する。細胞上４°Ｃの遠心処理によｐ採取し、冷い（４°Ｃ）最少培地（炭素 源含まず）１０ム中で３回洗い、再び遠心処理し、かつ最後に４　２　０　ｎｍ で光学密度３０’に有するような童の最少培地中に懸濁サセル。２　、４−Ｄ− モノオキシゲナーゼもしくは２、４−ジクロルフェノールヒドロキシラーゼの酵 素試験に関して、細胞懸濁液１容普部を酵素でｔｌ！和した最少培地９容量部と 混合して、４　２　０　ｎｍの光学密度が３であるようにする。市販の酸素電極 を用いて１０分間にわたって基質添加せずに酸素吸収全追跡する。

引続いて、２．４−Ｄ’に最終濃度ｉｍＭ又ａ２．４ーゾクロルフェノールを最 終濃度０．２　ｍＭまで添加しかつ酸素濃度の低下′ｆ２０分間にわたつ工追跡 する。この試験によシ、ｔ，ｆｄＡ突然変異体ｔ′ｊべての他の突然変異型並び に野性型菌株ＪＭＰ　１　３　４から区別することができる。七ｎは２．４−Ｄ の添加後に酸素消費の上昇を示さず、２，４−ジクロルフェノールの添加後に酸 素°吸収の有意な上昇が起る。野性型菌株並びにｔｆｄＢ突然変異体は基質とし て２．４−Ｄの添加後に高まった酸素消費を示し、それ故完全な２．４−Ｄ−モ ノオキシゲナーゼである。両方のトランス？シン突然変異体ＪＭＰ　１３６　： 　Ｔｎ　５−２及びＪＭＰ　１３４　：　Ｔｎ　５−４では検出可能な２，４− ジクロルフェノールヒドロキシダーゼを有するが、検出可能な２　、４−Ｄ−モ ノオキシゲナーゼを有していない２．４−Ｄ陰性で６−ＣＢ陽性突然変異体２種 が該当する。それ故ｔｆｄ　Ａ突然変異体として同定することができる。この整 理の仕方は更に以下の実施例に記載の実際によって確認される。

例１４：クローン化されたｔｆｄ　Ａ遺伝子の、Ｅ、コリ以外の他のグラム陰性 菌中での発現 ａＪｔｆｄＡ含有プラスミドを接合転移するための供与菌株の製造 ｐＶＫ　１０１　Ｃｖ、　ｃ、　Ｋｎａｕｆ及びその他ｚ　Ｐｌａｓｍｌｄ　３ ：　４５　（１９８２）　］　、　ｐＧｓｓ　３３　ＣＯ−Ｓ、　５ｈａｒｐｅ 　。

（）ｅｎｅ　２９　：　９３　（１９８４）　）及びｐＫＴ　２３１　ＣＭ。

Ｂａｇｄａｓａｒｊ　ａｎ及びその他＊　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｊｃｓ　ｊｎ 　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　９６　：　４ ７　（１９８２）　）のような広範な宿主域を有する可動性ベクターをペースと して形成されたプラスミド（これらの製造は例１〜７に記載さ扛ている）を、可 動性菌株Ｅ、コ！ＪＳ１７−１　〔Ｂｊｏｔ、ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１　：　７ ８４　（１９８３）　）から例えばアルカリゲネス・オイトロ７ス及びプソイド モナス・プチダのような他のグラム陰性菌への接合により転移させることができ る。−七のために、プラスミドがＥ、コリ３１７−１中でクローン化されていな い場合には初めに形質転換によりこの菌株中に導入しなければならない。このた めに、該当するプラスミド？含有するＥ、コリＬＥ３９２のクローンからプラス ミドＤＮＡ　’ｉ　Ｔ、マニアチス及びその他（前記参照ンにより単陥し、Ｔ、 　Ｊ、ンルヘイビー及びその他（Ｆ：ｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｉｔｈ　ｇｅｎｅ 　ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏ−ｒｙ　、Ｃｏ’ｌｄ　ＳｐｒｊｎｇＨａｒｂｏｕｒ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｌ ｃ　、　１９８４〕によｔ）製造したＥ、コリＬｇ３９２のコンピテント細胞０ ．２　Ｍ　ｋ年子したプラスミドＤＮＡ　１μｌと混合し、氷上に４０分間放重 し、４２°Ｃに６分間加熱し、ＬＢ培地２ａと混合し、６７°Ｃで６０分間恒温 保持する。

５０〜２００μｊの部分音を、選択に好適な抗生物質を含有するＬＢ−Ｑ天−プ レート上に塗布する。プレー）’に３７℃で１６時間恒恒温持する。

ｂ）接合転移 このようにして得られた、例１〜７に記載のプラスミドを含有する菌株Ｅ、コｙ 　ｓ　１７−１　ｋ選択するのに好適な抗生物／ｊ［？含有するＬＢ培地５紅中 ３７°Ｃで１６時間培饗する。受容菌として、例１３で都嘔したｔｆｄ　Ａ突然 変異体のいずれか１つ（Ａ）、ｐＪＰ　４を含まない菌株アルカリゲネス・オイ トロフス、ｎＡＰ２２２［Ｒ，Ｈ，Ｄｏｎ及びその他、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｊ ｏｌ、　１４５　：６８１　（１９８１））（Ｂ）又はシンイドモナスｇｐｃ。

Ｂ　１３　（Ｅ、　Ｄｏｒｎ及びその他”　Ａｒｃｈ、　Ｍｊｃｒｏｂｉｏｌ、 　９９：６１　（１９７４））（Ｃ）をＰＹＥ培地（ペプトン６＆／ｌ　、酵母 エキス３ｊ；ｌ／ｌ　）５ｕ中、３０℃テ１６時間培養する。供与菌株の細胞を 遠心分触しかつ２倍容童のｐｙＥ培地中に慇濁させる。供与細胞の懸濁液及び受 容菌の培養物上回鎗部で混合する。混合物１００μｌｙｐｙＥ−ｇ天−プレート の表面上に配置した膜フイルタ−（Ｍｉｌｌｊｐｏｒｅ　ＨＡ　０．４５μｍ） 上にピペット装入する。引続いて、プレー）？１″３０℃で６時間恒温保持する 。その後で、細胞を〇、７チＮａ　Ｃ１溶液１ｍｇでフィルターから洗出し、か つ細抱懸濁敢を７段階で０．７チＮａＣ１溶液を用いてその都度１：１０（０， １ｇ＋０．９１Ｊ　）に稀釈する。各稀釈液のうち１００μｌを次の生長基質を 含有する最少球入プレート上に塗布する：　Ａ　（ｔ、ｆｄ　Ａ突然変異体）で は２　、４−　Ｄ　１　ｍＭ　、　Ｂ（アルカリゲネス・オイトロフス、、ＴＭ Ｐ　２２２　）ではフェノキン酢酸−ＮＢ　４　ｍＭあるいはＣ（プソイドモナ スＢ１３ンでは４−クロルフェノキシ酢酸−ＮａｌｌｌｎＭ０プレートをＡでは １４日間、Ｂ及びＣでは４日間３０’Ｃで恒温保持する。

Ｃ）新規に形成した菌株の特性 完全ｔｆｄ　Ａ遺伝子を含有する前記の計知からの、広範な宿主域を有する可動 性プラスミドによシ、それぞれの受容菌株への接合転移後に機能性の２．４−Ｄ −モノオキシゲナーゼ全合成することができる。これはＡ　（ｔｆｄ　Ａ突然変 異体）の場合には突然変異の相補性、それ故２．４−Ｄの利用に関して野性型特 性の再現をもたらし、りま、ｊｌ）２．４−Ｄ最少寒天プレート上で２．４−Ｄ 陽性菌株が生じる。更に、ｔｆｄ　Ａによシコード付けさルた２、４−Ｄ−モノ オキシゲナーゼは、２．４−Ｄと共に２．４−Ｄと化学的に類縁の化合物フェノ キシ酢酸及び４−クロルフェノキシ酢酸會も酵素的に変洪することかでき、その 際に生成物としてフェノールもしく１″１１４−クロルフェノールが形成される 。

菌株アルカリゲネス・オイトロフスＪＭＰ　２２２１ｄフ工ノール？完全代謝す る遺伝子？有するので、Ｂの場合ｔｆｄ　Ａ含有プラスミドの接合転移後に、フ ェノキシ酢酸を生長基質として利用するという新しい％性？有する菌株が生じる 。同じように、それと−緒に準備しｌｃｓフェノール及び４−クロルフェノール の元金分解経路【有するｔｆｄ　Ａ含有プラスミドのシンイドモナス８１３が基 質フェノキシ酢酸及び４−クロルフェノキシ酢酸上で生長することができる（Ｃ ，ｌ。特に、前記のような一定の基質の利用に閃する試験は、可動性広範な宿主 域ベクター（Ｂｒｏａｄ　−Ｈｏ５ｔ　−Ｒａｎｇｅ　−Ｖｅｋｔｏｒｅｎ　） 中でクローン化されたＤＮＡフラグメント及びその小型誘導物（それらの製造は 例１〜７に記載）によりｔｆｄＡ遺伝子の発現を検出するのに好適でおる。その 際に、プラスミドｐＶＪＨ２１、ｐＧＪｓ　３　、　ｐｘ、ｒｓ　３１　、　ｐ ＫＪｓ３２゜ｐＫＪｓｇ　３３０　、　ｐＫ、ｒｓ　３２　ＲＨ△ｇ及びｐＫＪ ｓ（Ｘ）　６３０はすべて完全なｔｆｄ　Ａ遺伝子音含有するが、プラスミドｐ ＫＪ衣１３０は機能性の遺伝子生成をコードしないことが明らかである。

例１５　：　Ｅ−コリ甲のｔｆｄ　Ａコード付け２．４−Ｄ−モノオキシゲナー ゼの富化 ａ）高生産性Ｅ、コリ菌株の製造 Ｔａｂｏｒにより構成されたベクターｐ’ｒ　７−５及びｐ’ｒ７−６をペース として製造した組み換えプラスミド（例８．９．１０及び１１に記載）は、ファ ージＴ７の強力なプロモータに続いてクローン化ＤＮＡフラグメント？官有する 。完全なｔｆ（ｉ　Ａ遺伝子をプロモータに対して正しい向きで含有するこの計 知からのプラスミドは、プラスミドｐ（）Ｐ　１−２　ＣＳ、　Ｔａｂｏｒ及び その他。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ−ＡＣａａ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２　：　１０７４　 （１９８５）：１からの発境Ｔ７−ＲＮＡ−ポリメラーゼの作用下にＥ。

コリに３８中で多蓋の２．４−Ｄ−モノオキシゲナーゼｒ生産し得る。デロモー クＦ′ｉ特異的にＴ７−囲Ａ−，１？　ＩＪメラーゼによってのみ認識され、か つこのポリメラーゼはプラスミドｐＧＰ　１−２上に感熱性ラムダリプレッサー の制御下に位置するので、遺伝子生成物の合成は熱により＠発される。更に、リ ファンビンンの添加により、細菌性ＲＮＡポリメラーゼを抑制することが得られ たプラスミド官有菌株Ｅ、コ！ｊ　Ｌ　Ｅ　３９２からプラスミドＤＮＡ　ｋ　 Ｔ、マニアチス及びその他（前記参照ンによｐ単離する。プラスミドｐＧＰ　１ −２　ｋ含有するＥ、コリに３８ｋ、ｐＧＰｌ−２の選択のためにカナマイシン ５０μ、ｆｉ＋／ １６時間培養する。生長した培養物からコンピテント細胞ｉＴ．Ｊ．ンルヘイビ ー及びその他の方法（　Ｅｘｐｅ−ｒｊｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅ　ｆｕ ｓｉｏｎｓ．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ 　、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　。

１９８４）Ｋよジ製造する。コンピテント細胞０．２　ＩＬｔを単離したＤＮＡ 　１μノと混合し、氷上に４０分間放置し、３７℃に５分間加熱し、ＬＢ培地２ ａと混合しかつ６０°Ｇで６０分間恒温保持する。５０〜２００μｌの部分量を アンピンリン５０μｇ／ｌｌ１ｔ及びカナマイシン５０μ９／μを含有するＬＥ −寒天プレート上に塗布する。グレー）’（ｒ３０℃で１６時間恒温保持する。

ｂ）誘発された製造及びｔｆｄ　Ａ遺伝子生成物の放射性標識 このようにして得られたアンピンリン−及びカナマイシン耐性クローンはプラス ミドｐ（）Ｐ　１　−　２及び組み換えｐＴ　７誘導体の１つ全含有する。これ を、アンぎシリン５０μ９／酩及びカナマイシン５Ｄμ＆　／　Ｉ’Ｌ　ｋ　添 加含有するＬＢ培地１０μ中、６０°Ｃで培養する。

５　９　０　ｎｍで測定した光学密度０．５で培養物０．２μを遠心分難する。

細胞’ｔＭ９培地５紅中でＴ，マニアチス及びその他（前記βｐ＠）によシ洗浄 し、再び遠心分離し、最後に、チアミン２０μｍ１／ＩＬＩ＝並びにメチオニン 及びシスティン以外のすべてのプロテイノグン（　ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎ　） アミノ酸（全部で１８）各Ｃ１．０　１　％を含有するＭ９培地１１ｎｔ中に懸 濁させる。細胞懸燭液ｋ　’５　０　０Ｃで６０分間振盪し、次に温度上４２℃ に高める。１５分後に、リファンピンン溶液（メタノール中２０■／舵）１０μ ｌを添加しかつノ（ツチを史に４２°Ｃで１０分間放置する。その後、＠度？再 び３０°Ｇに低下させ、２０分後にパッチはＬ　−　（　３５Ｓ　）メチオニン （　Ａｍｅｒｓｈａｍ　、　ｃｅｌｌ　１ａｂｅｌｊｎｇ　ｇｒａｄｅ　）　１ ０　μ　Ｃｊｔ−　加えかつ室温で５分間放置する。引続いて、細胞全遠心分離 し、担′ｒｆ緩衝液（トリス−ＨＣｌ　（５　３　ｍＭ　、　ｐＨ　６．１３。

ラウリル硫酸ナトリウム１チ．２−メルカプトエタノール１％，グリセリン１０ ％．ブロムフェノールブルー０．０１　％）　１　２０ｐｌＣＰＩＩＣＭ濁し、 かつ９５℃に６分間加熱する。

Ｃ）％異的に放射性標識したｔｆｄ　Ａ遺伝子生成物の同定 このようにして得られた試料’ａー１２．５％ーポリアクリルアミドｐｙ’ル［ 　Ｕ．　Ｋ．　Ｌａｅｍｍｌｉ　、　Ｎａｔｕｒｅ　２　２　７　：６８０（１ ９７０））上に負荷しかつ全細菌性蛋白質を前記の文献公知の方法により電気泳 動により分離する。電気泳動の終結後、グル全セルバ・プラウ（　５ＥＲＶＡＢ ｌａｕ　）　Ｇ　２−５　９　ｐメタノール４　５　４　ｍ　、酢Ｍ９２ＩＬｔ 及び水４５４μからの混合物中で３０分間着色させ、引続いてメタノール５ＯＮ ，酢散７５μ及び水８７５ｉＬからの混合物中で２４時間脱色する。デルを濾紙 （　Ｗｈａｔｍａｎ　３　Ｍ　Ｍ　）上で市販のグル乾燥機を用いて乾燥させ、 引続いてＴ．マニアチス及びその他（前記参照〕によりＸ線フィルム（　Ｋｏｄ ａｋ　ＩｎｄｕｓｔｒｅｘＡＸ　）でオートラジオグラフィを実施しかつフィル ムを現像する。オートラジオグラム上に個々の標識蛋白質が、ｐＧＰ　ｉ　−　 ２と共にプラスミドｐＴＪｓｓ’　０　３　５　。

ｐＴＪｓ’　Ｂ　４　３　５　、　ｐＴＪＳ’Ｘ　５　３　５又はｐＴＪＳ’　 Ｘ　５　３　５オメガの１つ？含有する菌株で同定される。こｎらのすべての相 同シラスミドには、クローン化フラグメントがＴ　７　−　ＲＮＡ−ポリメラー ゼにより　５ａｔｌ末端に転写されることが共通している。逆向きの挿入断片含 有するプラスミド（　ｐＴＪｓｓ’０　３　６　、　ｐＴＪＳ’Ｂ　４　３　５ 及びｐＴＪｓ’Ｘ　５　３　５　）では特異的に標識された蛋白質は見出でれな い。公知の犬ぎさの標準蛋白質との比較により、標識蛋白質の分子量が決定され る。その際に、ｐＴＪｓｓ’　Ｏ　３　５　、　ｐＴＪＳ’　Ｂ　４　３　５及 び１）ＴＪＳ’Ｘ　５　３　５　Ｋ　ヨり発現された遺伝子生成物に関しては分 子量３　２０００が明らかであυ、ｐＴＪＳ’　ｘ　５　３　５オメガによ９発 現さｄ）誘導されｆｃ製造と、酵素活性の検出前記で得られた、ｐＧＰｉ−２並 びにデ２スミドｐ’ｒ、ｒｓｓ’　０３５　、　ｐＴＪｓ’Ｂ　４３５　、　ｐ ’ｒ、ｒｓ’ｘ　５３５又はｐＴＪｓ’Ｘ　５３５オメガの１つを含有するＥ、 コリに３８の菌株を、アンピシリン５０μｊｉ　／　ｒｔｔ＆及びカナマイシン ５０μｍ１／ＩＬｔｋ添加したＬＢ培地中、３０℃で培養する。５９０　ｎｍの 光学密度１．０で温度を４２°Ｃに高めかつ坩養物’ｔ−２５分間振盪させる。

その後、リファンピシン溶液（メタノール中２０■／ｍ）１００μｌを添加しか つ培養物を３７℃で２時間振盪する。Ｅ。

コリ中の２．４−Ｄ−モノオキシグナーゼの＃素活性の検出は、アミ−（Ａｍｙ 　）及びその他（Ａｐｐ：Ｌ、　Ｅｎｖ。

Ｍｊｃｒｏｂｊｏｌ　４９　：　１２３７　（１９８５）　）により記載された 放射性酵素試験法により次のように変更して行なう：誇導された２０ｕ培養物の 細胞を遠心処理により採取し、８Ｍ培地１０紅で洗浄し、Ｐ＋度遠心分離し、最 後にＥＭｆ＠地１０地中０紅中させる。この細胞懸濁液を２５０紅−ワールプル ク（ｗａｒｂｕｒｇ　）フラスコ中で形質転換緩衝液１０ＩＩＬと混合し、未標 識の２゜４−Ｄ２００μｙ及び２，４−ジクロルフェノキシ（２−１４（）酢酸 （Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｒ　５５　ｍ　Ｃｉ　／　ｍｍｏｔ）　０−１μＣｊを加 えかつ閉じたフラスコ中２１°Ｃで４時間振盪サセる。引続いて、ｐ−フェニル エチルアミンＱ、５酩をワールブルクフラスコの中央の容器中にピペット装入し かつ１Ｍ−硫酸２紅を細胞懸濁液中に注入する。

２１′Ｇで１時間振盪後、β−フェニルエチルアミンを計数液体（Ｚｉｉｈｌｆ ｌｕｓｓｊｇｋｅｊｔ　、　ｒｏｔｉｓｚｊｎｔ　２２　。

Ｒｏｔｈ　）　５１２中に採取し、かつ試料の放射能をシンチレーションカウン タ中で測定する。ｐＧＰ　１−２と共にプラスミドｐＴＪｓＧ’　０３５　、　 ｐ’ｒ、ｙｓ’　Ｂ　４３５又はｐＴＪｓ’Ｘ５３５の１つを含有するＥ、コＩ Ｊ　Ｋ　３８菌株はこの試験で高い酵素活性を示すが、プラスミドｐＴＪｓ’　 Ｘ　５３５オメガ？含有するものは酵素活性全発現しない。

例１６：Ｍ１３中でクローン化され７（ＤＮＡの塩基配列ａＪ　ＭＪＳＳ’　０ ３０及びＭＪ８Ｓ’　０３１から欠失ファージの製造 組み換えファージの２　ｋｂのＢａｎ　ＨＩ　／　５ａｔｌ−フラグメントをサ ンシャー（Ｓａｎｇｅｒ　）法により配列するためにＣＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４　：　５４６３（１９７７））、初めに文 献公知の方法［（）、　Ｈｅｎｊｋｏｆｆ。

Ｇｅｎｅ　２８　：　３５１　（１９８４）　）による調節欠失によシ、その都 度２００〜６００の塩基の重複配列により塩基配列全体を確定するのを可能にす る一連の種々の短いファージを製造する。そのために、例１２で製造したファー ジＭＪＳＳ’　０３０もしくはＭＪＳＳ’　０３１　’！ｒ含有するＥ、コＩＪ ＪＭ１０１の菌株から、ファージベクターＭ１３ｔｇ１３０及びＭ１３ｔｇ１３ １に関して記載した方法によシ二重鎖ＤＮＡを単離する。ファージＭＪＳＳ’　 ０３０の二本鎖ＤＮＡ　１０μｙを＃￥累Ｐｓｔ　Ｉ及び５ａｔＩで切断し、フ ァージＭＪＳＳ’［］３ｉの二本＠　ＤＮＡ１０μｇを酵素Ｂａｍ　ＨＩ及びＳ ａｃ　Ｉで切断する。制限バッチをフェノールで抽出しかつ切断ＤＮＡ　’ｉエ タノールで沈殿させる。引続いて行なうＤＮＡのエキソヌクレアーゼｌ及びＳ１ ヌクレアーゼによる消化、突出したＤＮＡ末端のフレノウ充填及び連結は次のよ うに変更してヘニコク（Ｈｅｎｊ　ｋｏｆｆ　）によシ記載された方法によシ行 なう：８１ヌクレアーゼの代りにムング・ビーン・ヌクレアーゼ（ＭｕｎｇＢｅ ａｎ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ　：　Ｐｈａｒｍａ＋ｊａ）を使用する。Ｔ−Ｊ、シル ヘイビー及びその他の方法（ｇｘｐｅｒｊｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｅ　ｆ ｕｓｉｏｎｓ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　、　ＮｅｗＹｏｒｋ　、　１ ９８４　）によ＃）製造したＥ、コリＪＭ１０１（ｉ　Ｍｅｓｓｊｎｇ及びその 他、　Ｎｕｃ’１．　Ａｃｊ、ｄｓ　Ｒｅｓ、　９　：３０９（１９８１））の 部分量のコンピテント細胞０．２紅にそれぞれ連結パッチ２０μｌｋ加え、氷上 に４０分間放置し、４２℃に６分間加熱し、溶融（４５℃）Ｈ−Ｔｏｐ　−’１ １天（例１２）それぞれ６紅と混合しかつＨ，］］天−プレート例１２）上に注 ぐ。プレートを３７℃で１６時間恒昌保持する。

ｂ）欠失ファージの同定 Ｅ、コリＪＭ１０１ｋＴＹ培地（例１２）２ＩＬＬ中、３７℃で１６時間培養す る。この培養物ｉａ５七ＴＹ培地１００紅で稀釈しかつ稀釈した細胞懸濁液中２ μ七で５時間振盪させ、その後遠心処理する。遠心処理のＭ　ｉ　３　ｃｌｏｎ ｉｎｇ　ａｎｄ　ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＨａｎｄｂｏｏｋ　＃　１９８４：］に よす記載された方法によシ取得する。遠心分難した細胞からは二本鎖ＤＮＡ　’ ｌ（Ｔ、マニアテス及びその他（前記参照ンにより単離する。ＭＪＳダ０３０か ら由来スル短い７アージの二軍鎖ＤＮＡ　ｆ　Ｂｇｔ　ｌで、ＭＪＳＳ’０６１ から白米するファージのそれｋ　ＢｃｏＲ工及びＳａｔ！で消化する。引続いて Ｔ、マニアテス及びその他（ＮＵ記参ＰＮ、　）により２チアガロースグル上で 断片を電気泳動にニジ分解することに工ってそれぞれの欠失の大きさを決定する 。

Ｃ）−重鎖ＤＮＡの配列決定 前記で得らＩした短いファージの一本鎖ＤＮＡ　、！ひに例１２で製造ＬｆｃＭ ＪＳＳ’　０３０及びＭＪｓＳ′ｏ３１の一本鎖ＤＮＡについて塩基配列を文献 公知のジデオキシヌクレオチド配列決定法ＣＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　５ｃｊ−ＵＳＡ　７４二５４６３（１９７７））により決定する。その際に 、アマ−ジャムによる方法（：　Ｍ　Ｂ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅａｕｅ ｎ−ｃｉｎｇＨａｎｄｂｏｏｋ　、　１０９４　］で行なう。ＤＮＡフラグメン トを分離するに当り、増加する厚さ０．１〜０．４ｎの長さ５５（１１１１のデ ルを使用する。同定さｎ尺短いファージのＤＮＡ配列をコンピュータグログラム （Ｃ，Ｑｕｅｅｎ及びその他、　Ｎｕｃｌ　Ａｃｊｄｓ　Ｒｅｓ、　１２　：　 ５８１　（１９８４Ｊ）によ夕１複領域で、Ｍ１３ｔｇ１３０もしくはＭ１３ｔ ｇ　１３１中でクローン化した押入断片のＢａｍ　Ｈ工！ｉＪ限サイトとＢａｌ 　ｌ制限サイトとの間に全断片を包含するＤＮＡ配列に接合する。このようにし て得ら扛た両方の相補性ＤＮＡ鎖の比較により塩基配列が確認さｎる。

ｄ）Ｉ！Ｉｃタリ決定ｉ　ｎ　ｆｃ　ＤＮＡ　（７）　％性前記のコンピュータ プログラムによシ、直接塩基配列から明らかであるＤＮＡのすべての性質が確定 する。

その中で最も１女なものとして挙げることができる：制限エンドヌクレアーゼの 認識部位の位置、遺伝子の可能なコード付は領域としての転写解読わくの位置と 長さ、−足の塩基のＨ度とその分布、及び一定の磯籠的なりＮＡ配列の出椀。Ｄ ＮＡ配列の分析は、転写解読わくｔ示し、その位置、長さ及び転写方向は例１４ 及び１５に記載し７’Ｃｔｆｄ　Ａ遺伝子の性質と一致する。解読わくは塩基査 号７４８のＧＴＧド始コドンで開始しかつＴＡＧ終止コドンの前塩基査号１６０ ８で終止し、従って塩基８６１個の長さを有し、こねはｔｆｄ　Ａでコードし′ ｆｃ蛋白質の長で（例１５）と一致する。オメガフラグメントのｐＴＪＳ’　Ｘ 　５３５中へのクローン化が示すように（例１１　）、Ｅ列決定きγしたフラグ メントの唯一のＢｇｔ　Ｉｔ　ｆｔｉ！Ｉ限プイト甲への転換−及び翻訳終止シ グナルの挿入はこの転写掛肌わくｔ計算上７６８個の塩基に短かくし、こ′ｎは グラスミド−ｐＴＪｓ’　ｘ　５３５オメガ（例１５）による、目動さＩＬかつ 酵素的に不活性な遺伝子生成物の発埃と一致する。

１２７０　１２８０　１２’ｊＯ１３００１コ１０　１３２０（：ａＧＣＧＣＧ ＣＡＣＧＣＧＡＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＡＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＣＧＡＡ ＧＧＣＣＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＴＧＣＣ１４５０１４Ｇ０１４７０　１４８０　 １４！１０　１５００ＣＧＴＡＧＣＣＴＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＡＣＣＴＴ（：Ｇ ＣＧＣＡにＣＧＣＧＴＣＣＴＴＣＧ　ＡＧＣＧＧＣＧにＧＣＧＧＣＣＴＧＧＣＧ Ｈ ｐＫＪＳ（Ｘ）６３０ １２．６　ｋｂ Ａｂｂ、４ ト→ ρＴＪＳ’Ｘ５３５Ω ５．８ｋｂ Ａｂｂ、７ｂ ０フ 補正音の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成１年２月２８日 特許庁長官　吉　１）　文　毅　殿 １、国際出願番号 ＰＣＴ／ＤＥ　６７１０○３９２ ２、発明の名称 ３、特許出願人 名　称　シェージング　アクチェンゲゼルシャフト４、代理人 住所　〒１００東京都千代田区丸の内３丁目３番１号５、補正音の提出年月日 昭和６３年８月１６日 請　求　の　範　囲 １、ｔｆｄＡ　−２、４−Ｄ−モノオキシデナーゼ遺転子突然変異体アルカリデ ネス・オイトロフスＪλＴ１３４：Ｔｎ　５−２゜ ２、ｔｆｄＡ　−２、４−Ｄ−モ）；Ｆ＊’／’ｆす一セａ転子突然変異体アル カリｒネス・オイトロフスＪＭＰ　１３４　：Ｔｎ　５−４゜ ３、ｔｆｄＡ遺伝子を含有するプラスミドの同定及び単離にｔｆｄＡ−突然変異 体アルカリゲネス・オイトロフスＪＭＰ　１３４　：　Ｔｎ　５−２及びＪＭＰ 　１３４　：　Ｔｎ　５−４の使用。

４．２．４−Ｄを分解する、記載のアミノ酸配列１〜２８７の蛋白質をコード付 けする塩基配列１〜８６１又は遺伝コードにより同じアミノ酸配列をコード付け するそれと等価のものを含有することを特徴とする組み換えＤＮＡ。

５、請求の範囲第４項による遺伝子又はそのサブフラグメントを含有するプラス ミド。

６、　プラスミドｐＪＰ４とｐＶＫ　１０１とから製造されたプラスミドｐＶＪ Ｈ２１゜ ７　；ｙ’；ｒＸミｌ’ｐＶＪＨ２１とＤＯ８Ｓ　３３とから製造されたプラス ミドｐＧＪｓ　３゜ ８、　プラスミドｐｏＪｓ　３とｐＫ’ｒ　２３１とから製造されたプラスミド １：１ＫＪＳ　３１　（寄託、Ｅ、コリ８１７−１中、ＤＳＭ　３８３５　）。

９　シラスミドｐｏ、ｙｓ３とｐＫＴ　２３１とから製造されたプラスミドｐＫ ＪＳ　３２゜ １０　プラスミドｐＫＪｓ　３１から製造されたプラスミドｐＫＪＳＢ　３３０ ゜ １１、請求の範囲第１０項によるプラスミドから製造されたプラスミドｐＫＪ　 Ｓ　（χ）６３０（寄託、Ｅ、コリ８１７−１中、ＤＳＭ３８３７）。

１２、プラスミドｐＫＴ　２３１及びｐＫＪｓ　３２とから製造されたプラスミ ドｐＫＪＥΔＢ１３０゜１３、プラスミドｐ’ｒ　７−５とｐＫＪＳＢ３３０と から製造されたプラスミドＩ）ＴＪＳ’　Ｂ　４３５゜１４、プラスミドｐＴ　 ７−６とｐＫＪＳＢ　３３０とから製造されたシラスミドｐＴＪＳ’　Ｂ　４３ ６゜、１５．　プラスミドｐＫＪｓ　３２とｐＲ■１とから製造されたプラスミ ドｐＫＪｓ　３２ＲＨΔＳ／　（寄託、Ｅ、ニアす５１７−１中、ＤＳＭ３８３ ６）。

１６、プラスミドｐＴ　７−５とｐＫＪＳ　３２とから製造されたプラスミドｎ ＴＪｓｓ’Ｄ　３５　（寄託、Ｅ、コリＬＥ３９２中、ＤＳＭ３８３２）。

１Ｚ　プラスミドｐＴ　７−６とｐＫ、ＴＳ　３２とから製造されたシラスミド ｐＴＪｓｓ’０３６゜ １８、ｐＴ７−５とｐＴ、Ｔｓｓ’　Ｏ３５とから製造されたプラスミドｐＴＪ Ｓ’　５３５　〔寄託、Ｅ、コリＫ　３８（ｐｃ）Ｔ　ｉ−２／　１）ＴＪＳＸ 　５３５　）として、ＤＳＭ３８３９）。

１９　プラスミドｐＴ　７−６とＴＩＴＪＳＳ’　Ｏ３５とがら製造されたプラ スミドｐＴＪｓ’Ｘ　５３６゜２０、プラスミド１）ＴＪＳ’Ｘ　５３５とｐＤ Ｏｃ　３７とから製造されたプラスミドｐＴＪｓ’Ｘ　５３５オメガ。

２１、ファージＭ１３ｔｇ１３０とプラスミドｐＫ、７８３２とから製造された ファージＭＪＳＳ’　０３　Ｑ。

２２．７７一ジＭ１３ｔｇ１３１とプラスミドｐＫＪｓ　３２とから製造された ファージＭＪＳＳ’　０３１゜２３、野性型細萌からのＤＮＡフラグメント又は サブフラグメントとプラスミドベクターとを相互に連結し、かつｔｆｄＡ遺伝子 を含有するプラスミドを、相応するフェノールを利用し得る菌株中の置換されて いないフェノキシ酢酸の分解の発現を介して単離することにより得られた。　ｔ ｆｄＡ遺伝子を含有するプラスミド。

２、特許請求の範囲第２３項によシ得られたプラスミドから、完全なｔｆｄＡ遺 伝子又はこの遺伝子の断片を含有するす′プ７ラグメントをベクタープラスミド と連結することを特徴とする、ｔｆｄＡ遺伝子又はこの遺伝子の断片を含有する シラスミドの製法。

２５、請求の範囲第５項及び第２３項のシラスミドを含有するＥ、コリ菌株。

２６．４−クロルフェノキシ酢酸を利用し得ることを特徴とする請求の範囲第５ 項及び第２３項のプラスミドを含有するプソイドモナス菌株。

２Ｚ梢求の範囲第５項及び第２６項のプラスミドを含有するアルカリテネス菌株 。

２８、該当する菌株を公知方法により請求の範囲第５項又は第２３項のシラスミ ドＤＮＡで形質転換することを特徴とする、ｔｆｄＡ遺伝子又はこの遺伝子の断 片を含有する新規の細菌株の製法。

２、特許請求の範囲第２８項によシ得られた菌株からプラスミドを接合によシ他 の菌株に転移させることを特徴とするｔｆｄＡ遺伝子又はこの遺伝子の断片を含 有する新規の細菌株の製法。

３０．２．４−Ｄの生長抑制作用に対して抵抗性であることを特徴とする２、４ −Ｄを分解する植物を製造するための出発生成物として、ｔｆｄＡ遺伝子又はこ の遺伝子の断片を含有するプラスミドの使用。

国際調査報告 −内吻−＾−一−＋１ｉＬ　ＰＣＴ／ＤＥ　８７１００３９２

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．ｔｆｄＡ−２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼ遺伝子突然変異体アルカリゲネ ス・オイトロフスＪＭＰ１３４：Ｔｎ５−２。
2. ２．ｔｆｄＡ−２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼ遺伝子突然変異体アルカリゲネ ス・オイトロフスＪＭＰ１３４：Ｔｎ５−４。
3. ３．ｔｆｄＡ遺伝子を含有するプラスミドの同定及び単離にｔｆｄＡ−突然変異 体アルカリゲネス・オイトロフスＪＭＰ１３４：Ｔｎ５−２及びＪＭＰ１３４： Ｔｎ５−４の使用。
4. ４．２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼのｔｆｄＡ遺伝子又はｔｆｄＡと基本的に 同等の遺伝子を含有するプラスミド。
5. ５．２，４−Ｄを分解する、記載のアミノ酸配列１〜２８７の蛋白質をコード付 けする塩基配列１〜８６１【配列があります】 又は遺伝コードにより同じアミノ酸配列をコード付けするそれと等価のものを含 有することを特徴とする組み換えＤＮＡ。
6. ６．プラスミド　ｐＶＪＨ２１。
7. ７．プラスミド　ｐＧＪＳ３。
8. ８．プラスミド　ｐＫＪＳ３１。
9. ９．　プラスミド　ｐＫＪＳ３２。
10. １０．プラスミド　ｐＫＪＳＢ３３０。
11. １１．プラスミド　ｐＫＪＳ（Ｘ）６３０。
12. １２．プラスミド　ｐＫＪＥΔＢ１３０。
13. １３．プラスミド　ｐＴＪＳ′Ｂ４３５。
14. １４．プラスミド　ｐＴＪＳ′Ｂ４３６。
15. １５．プラスミド　ｐＫＪＳ３２ＲＨΔＳ′。
16. １６．プラスミド　ｐＴＪＳＳ′０３５。
17. １７．プラスミド　ｐＴＪＳＳ′０３６。
18. １８．プラスミド　ｐＴＪＳ′Ｘ　５３５。
19. １９．プラスミド　ｐＴＪＳ′Ｘ５３６。
20. ２０．プラスミド　ｐＴＪＳ′Ｘ５３５オメガ。
21. ２１．フアージ　ＭＪＳＳ′０３０。
22. ２２．フアージ　ＭＪＳＳ′０３１。
23. ２３．野性型細菌からのＤＮＡフラグメントとプラスミドとを相互に連結し、か つｔｆｄＡ遺伝子を含有するプラスミドを、相応するフエノールを利用し得る菌 株中の置換されたか又は置換されていないフエノキシ酢酸の分解の発現を介して 単離することを特徴とする、ｔｆｄＡ遺伝子含有プラスミドの製法。
24. ２４．請求の範囲第２３項により得られたプラスミドから、完全なｔｆｄＡ遺伝 子又はこの遺伝子の断片を含有するサブフラグメントをベクタープラスミドと連 結することを特徴とする、ｔｆｄＡ遺伝子又はこの遺伝子の断片を含有するプラ スミドの製法。
25. ２５．ｔｆｄＡ遺伝子又はこの遺伝子の断片を有するプラスミドを含有するＥ． コリ菌株。
26. ２６．ｔｆｄＡ遺伝子又はこの遺伝子の断片を有するプラスミドを含有するプソ イドモナス菌株。
27. ２７．ｔｆｄＡ遺伝子又はこの遺伝子の断片を有するプラスミドを含有するアル カリゲネス菌株。
28. ２８．該当する菌株を公知方法により請求の範囲第４項記載のプラスミドＤＮＡ で形質転換することを特徴とする、ｔｆｄＡ遺伝子又はこの遺伝子の断片を含有 する新規の細菌株の製法。
29. ２９．請求の範囲第２８項により得られた菌株からプラスミドを接合により他の 菌株に転移させることを特徴とするｔｆｄＡ遺伝子又はこの遺伝子の断片を含有 する新規の細菌株の製法。
30. ３０．ｔｆｄＡ遺伝子又はこの遺伝子の断片を含有する細菌株を２，４−Ｄ−モ ノオキシゲナーゼの製造に使用。
31. ３１．２，４−Ｄを分解する生きた有機体を製造するための出発生成物として、 ｔｆｄＡ遺伝子又はこの遺伝子の断片を含有するプラスミドの使用。