ES2440791T3 - Compuestos antibacterianos - Google Patents

Abstract

Compuestos de la siguiente fórmula I;**Fórmula** en la que R >= H, alquilo, alquilcarbonilo, (HO)2PO-, alquil-OPO(OH)-, (alquil-O)2PO-, cicloalquilo, cicloalquilcarbonilo,arilo, arilcarbonilo, heterociclilo y heterociclil carbonilo; o estereoisómeros o tautómeros o sales farmacéuticamenteaceptables de los mismos.

Description

Compuestos antibacterianos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] Esta invención se refiere a un compuesto novedoso PM181104, que tiene actividad antibacteriana, que se obtiene por la fermentación del microorganismo perteneciente a la especie Kocuria (ZMA B-1/MTCC 5269). La invención también incluye todas las formas estereoisoméricas y todas las formas tautoméricas de PM181104 y sales y derivados farmacéuticamente aceptables de las mismas. La presente invención se refiere adicionalmente a los procedimientos para la producción del compuesto o compuestos antibacterianos novedosos, a la producción del microorganismo perteneciente a la especie Kocuria (ZMA B-1/MTCC 5269), y a composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto o compuestos novedosos como un ingrediente activo, y a su uso en medicinas para el tratamiento y la prevención de enfermedades causadas por infecciones bacterianas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La aparición de resistencia bacteriana a varios agentes antimicrobianos, tales como antibióticos betalactámicos, macroluros, quinolonas y vancomicina se está convirtiendo en un problema de salud fundamental en todo el mundo (Trends in Microbiology, 1994, 2, 422-425). El problema más significativo en la práctica clínica es el aumento en la incidencia de infecciones por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA). Actualmente, el único tratamiento eficaz para infecciones múltiples por MRSA es la vancomicina. Sin embargo, existen varios informes sobre la aparición de resistencia a la vancomicina en algunas cepas de MRSA aisladas (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1998, 42, 2188-2192). Otro grupo de bacterias resistentes a múltiples fármacos clínicamente relevantes que ha surgido recientemente son los enterococos, algunos de los cuales también muestran resistencia a la vancomicina. La aparición de infecciones por enterococos resistentes a la vancomicina (VRE) ha forzado un dilema entre los médicos. Las combinaciones de linezolida, un compuesto de oxazolidinona y estreptogramina son los nuevos fármacos de elección para el tratamiento de infecciones por MRSA. Sin embargo, la resistencia a estas combinaciones de oxazolidinonas (Clinical Infectious Diseases, 2003, 36, suplemento 1, S11-S23; Annals of Pharmacotherapy, 2003, 37, 769-74) y estreptograminas (Current Drug Targets Infectious Disorders, 2001, 1, 215-25) y diversos glicopéptidos (Clinical Infectious Disorders 2003, 36, suplemento 1, S11-S23) requieren el desarrollo expandido de agentes con dianas o modos de acción alternativos. La creciente resistencia del patógeno adquirido en la comunidad importante Streptococcus pneumoniae a la penicilina y otros antibacterianos se está convirtiendo en un problema de salud global. Han surgido en varios países cepas resistentes a múltiples fármacos de Mycobacterium tuberculosis. La aparición y la proliferación de patógenos resistentes nosocomiales y adquiridos en la comunidad se está convirtiendo en una gran amenaza para la salud pública global. El documento WO-A-94/14 838 se refiere a los antibióticos GE 37468 A, B y C.

[0003] Existe una necesidad urgente de descubrir nuevos compuestos que puedan usarse como fármacos para tratar pacientes infectados con bacterias, particularmente las bacterias resistentes a múltiples fármacos, tales como MRSA y VRE.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0004] La presente invención se refiere a un compuesto purificado novedoso (designado en el presente documento como PM181104), aislado a partir del caldo fermentado del microorganismo perteneciente a la especie Kocuria (ZMA B-1/MTCC 5269), que tiene actividad antibacteriana.

[0005] La invención también se refiere a todas las formas estereoisoméricas y todas las formas tautoméricas de PM181104 y una sal o sales farmacéuticamente aceptables, y un derivado o derivados de éster y éter del mismo, representado por la fórmula I (como se describe en el presente documento).

[0006] El compuesto PM181104, e isómeros, sal o sales farmacéuticamente aceptables y derivado o derivados del éster y éter del mismo, son útiles para el tratamiento y prevención de enfermedades causadas por bacterias, particularmente bacterias resistentes a múltiples fármacos, tales como MRSA y VRE.

[0007] La invención se refiere adicionalmente a composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto novedoso PM181104, un isómero, las sales farmacéuticamente aceptables, y los derivados éster y éter del mismo, como un ingrediente activo para el tratamiento de afecciones medicas causadas por bacterias, particularmente las bacterias resistentes a múltiples fármacos, tales como MRSA y VRE.

[0008] La presente invención se refiere adicionalmente a procedimientos para la producción del compuesto PM181104 y/o sus isómeros a partir del microorganismo perteneciente a la especie Kocuria (ZMA B-1/MTCC 5269).

[0009] La presente invención también se refiere a los procedimientos para la producción del microorganismo perteneciente a la especie Kocuria (ZMA B-1/MTCC 5269), que en el cultivo produce el compuesto PM181104 y sus isómeros.

5 [0010] La presente invención también se refiere a los procedimientos para la producción de los derivados de éster y éter del compuesto PM181104.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS 10

[0011]

La figura 1 muestra el espectro de absorción ultravioleta (UV) de PM181104. La figura 2 muestra el espectro de absorción de infrarrojo (IR) de PM181104. 15 La figura 3 muestra el espectro de RMN de 1H (500 MHz) de PM181104 en DMSO-d6. La figura 4 muestra el espectro de RMN de 13C (125 MHz) de PM181104 en DMSO-d6.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

20 [0012] La presente invención proporciona un novedoso compuesto antibacteriano PM181104 y también incluye todas las formas estereoisoméricas y todas las formas tautoméricas de PM181104 y las sales farmacéuticas aceptables y derivados, tales como los esteres y éteres del mismo.

[0013] Por consiguiente, la presente invención se refiere a compuestos antibacterianos novedosos de la siguiente 25 fórmula I;

en la que R = H (PM181104), alquilo, alquilcarbonilo, (HO)2PO-, alquil-OPO(OH)-, (alquil-O)2PO-, cicloalquilo, 30 cicloalquilcarbonilo, arilo, arilcarbonilo, heterociclilo y heterociclil carbonilo.

[0014] Como se usa en el presente documento, el término "alquilo" ya sea usado solo o como parte de un grupo

sustituyente, se refiere al radical de los grupos alifáticos saturados, incluyendo grupos alquilo de cadena lineal o

ramificada. Además, a menos que se indique de otra forma, el término "alquilo" incluye grupos alquilo no sustituidos, 35 así como grupos alquilo, que están sustituidos con uno o más sustituyentes diferentes. En realizaciones preferidas,

un alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada tiene 20 o menos átomos de carbono en su estructura (por

ejemplo, C1-C20 para la cadena lineal, C3-C20 para la cadena ramificada). Ejemplos de residuos alquilo que contienen

de 1 hasta 20 átomos de carbono son: metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo,

undecilo, dodecilo, tetradecilo, heptadecilo y eicosilo, los n-isómeros de todos estos residuos; isopropilo, isobutilo, 140 metilbutilo, isopentilo, neopentilo, 2,2-dimetilbutilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, isohexilo, 2,3,4-trimetilhexilo,

isodecilo, sec-butilo o terc-butilo. Un alquilo sustituido se refiere a un residuo alquilo en el que uno o más, átomos de

hidrógeno, por ejemplo 1, 2, 3, 4 ó 5 átomos de hidrógeno se remplazan por sustituyentes, por ejemplo, halógeno,

hidroxilo, sulfonilo, alcoxilo, cicloalquilo, ciano, azido, amino, aciloxilo, heterociclo, aralquilo, arilo o grupos

fluorescentes, tales como NBD [N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino] o el grupo BODIPY [4,4-difluoro-5,7

dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno].

[0015] Como se usa en el presente documento, el término "cicloalquilo" se refiere a un sistema anular saturado mono- o bicíclico que contiene de 3 a 10 átomos de carbono, y más preferiblemente que tiene 3, 4, 5, 6 ó 7 átomos de carbono en la estructura anular. Ejemplos de residuos cicloalquilo que contienen 3, 4, 5, 6 ó 7 átomos de carbono en el anillo son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo o cicloheptilo. Además, a menos que se indique lo contrario, el término "cicloalquilo" incluye cicloalquilo no sustituido y cicloalquilo que está sustituido con uno o más grupos idénticos o diferentes seleccionados entre halógeno, hidroxilo, alcoxilo, alquilo, cicloalquilo, ciano, amino, aminoalquilo, aciloxilo, heterociclo, aralquilo y/o un grupo arilo.

[0016] Como se usa en el presente documento, el término "arilo" se refiere a un grupo hidrocarburo monocíclico o policíclico que tiene hasta 10 átomos de carbono en el anillo, en los que se encuentra presente al menos un anillo carbocíclico que tiene un sistema conjugado de electrones π. Ejemplos adecuados de residuos arilo C6-C10 incluyen fenilo, naftilo o bifenilo, especialmente fenilo y el naftilo. Los residuos arilo, por ejemplo fenilo o naftilo, en general pueden sustituirse opcionalmente con uno a más sustituyentes, hasta cinco sustituyentes idénticos o diferentes seleccionados entre los grupos que consisten en halógeno, alquilo, hidroxilo, aciloxilo, amino, amino sustituido y ciano.

[0017] El término "heterociclilo" se refiere a un sistema anular saturado, parcialmente insaturado o aromático, heterocíclico monocíclico o policíclico que contiene 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 átomos en el anillo de los cuáles 1, 2 ó 3 son heteroátomos idénticos o diferentes seleccionados entre: nitrógeno, oxígeno y azufre. Ejemplos adecuados de dichos grupos heterociclilos son piridinilo, piperazinilo, piperidinilo, imidazolilo, pirrolidinilo y morfilinilo. En el sistema anular policíclico heterocíclico, el heterociclilo puede comprender anillos condensados, en los que dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes, o anillos puenteados, en los que los anillos se encuentran unidos a través de átomos no adyacentes. En el sistema anular heterocíclico policíclico, el heterociclilo preferiblemente comprende dos anillos condensado (bicíclico), al menos uno de los cuales es un anillo heterocíclico de 5 a 6 miembros. Grupos ejemplares bicíclicos heterocíclicos incluyen benzoxazolilo, quinolilo, isoquinolilo, carbazolilo, indolilo, isoindolilo, fenoxazinilo, benzotiazolilo, benzimidazolilo, benzoxadiazolilo y benzofurazanilo. Los residuos heterociclilos, en general pueden sustituirse opcionalmente con uno o más sustituyentes idénticos o diferentes seleccionados entre los grupos que consisten en halógeno, alquilo, hidroxilo, alcoxilo, aciloxilo, amino, amino sustituido y ciano.

[0018] De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el grupo R en la fórmula I puede representar H, CH3CH2CO, CH3(CH2)15CH2CO o

[0019] De acuerdo con una realización más preferida, el compuesto novedoso PM181104 representado por la fórmula I anterior (en la que R = H) se aísla a partir del caldo fermentado del microorganismo perteneciente a la especie Kocuria (ZMA B-1/MTCC 526 9) y se purifica adicionalmente.

[0020] El compuesto novedoso PM181104 tiene la fórmula molecular C69H66N18O13S5 (peso molecular 1514) y se puede caracterizar por cualquiera de una o más de sus propiedades fisicoquímicas y espectrales, tales como datos espectroscópicos de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), espectro de masas (EM), ultra violeta (UV), infrarrojo (IR) y resonancia magnética nuclear (RMN) como se analizará a continuación en el presente documento.

[0021] La estructura del compuesto novedoso PM181104 se ha elucidado y su caracterización completa se hace mediante datos espectroscópicos de HPLC, EM, UV, IR y RMN. La estructura se confirmó por medio de un estudio tridimensional (3D) de RMN del bioactivo PM181104 marcado con 15N y 13C.

[0022] El compuesto PM181104 y sus derivados de éster y éter son nuevos antibióticos activos contra bacterias, particularmente las bacterias resistentes a múltiples fármacos, tales como MRSA y VRE.

[0023] El microorganismo, que puede usarse para la producción del compuesto PM181104, es una cepa de la especie Kocuria (ZMA B-1/MTCC 5269), en lo sucesivo en el presente documento denominado como el cultivo Nº ZMA B-1, aislado a partir de una muestra marina recogida en Palk Bay, en la costa de Tamil Nadu, India.

[0024] La presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento para la producción del compuesto PM181104 a partir del cultivo ZMA B-1, sus mutantes y variantes, que comprende las etapas de: hacer crecer el

cultivo Nº ZMA B-1 en condiciones aerobias sumergidas en un medio nutritivo que contiene una o más fuentes de carbono y una o más fuentes de nitrógeno y opcionalmente sales nutrientes inorgánicas y/o elementos traza; aislar el compuesto PM181104 del caldo de cultivo; y purificar el compuesto PM181104 usando procedimientos de purificación usados generalmente en la técnica relacionada.

[0025] Como se usa en el presente documento, el término "mutante" se refiere a un organismo o célula que porta una mutación, que es un fenotipo alternativo al tipo natural.

[0026] Como se usa en el presente documento, el término "variante" se refiere a un organismo individual que se reconoce como diferente de un tipo estándar arbitrario en esta especie.

[0027] La identificación preliminar del cultivo Nº ZMA B-1, que es el productor de PM181104, se realizó mediante el examen de la morfología de su colonia, observación de cantidad de humedad y la reacción de tinción de Gram. Los estudios microscópicos de la cepa del cultivo aislado Nº ZMA B-1 se realizaron en el caldo Zobell Marine Broth 2216 (caldo marino 2216), que contenía agar al 1,5% y se hicieron observaciones a los 1, 2 y 3 días de incubación a 25 ºC.

[0028] El crecimiento en el caldo Zobell Marine Broth 2216 (caldo marino 2216), que contiene agar al 1,5%, genera colonias de 2 mm de diámetro con una superficie lisa, de pigmentación de color naranja amarillo, un margen regular y una consistencia suave. No se observan pigmentos difusibles en este medio. Bajo un microscopio de luz de contraste de fase, se observan cocos en una ampliación de 400x. Los cocos se separan bien y se aíslan. Son Gram positivos y sin movimiento. La morfología observada clasifica a este organismo como un miembro de la familia Micrococcaceae. La identificación de los aislados se realizó comparando su reacción en cadena de polimerasa 16S ARNr (PCR) con las secuencias existentes disponibles en el sitio web del Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI) (URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). El cultivo Nº ZMA B-1 se depositó en la Colección de Cultivos Tipo Microbiano (MTCC), en el Institute of Microbial Technology, Sector 39-A, Chandigarh -160 036, India una Agencia de Depósito Internacional (IDA) reconocida por la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (OMPI) y se le otorgó el número de acceso MTCC 5269.

[0029] Además del microorganismo específico descrito en el presente documento, ha de apreciarse que los mutantes, tales como los producidos por el uso de mutágenos químicos o físicos incluyendo rayos X, rayos UV, y organismos cuya estructura genética se ha modificado con técnicas de biología molecular, también se pueden cultivar para producir el compuesto PM181104.

[0030] La búsqueda de los mutantes adecuados y las variantes que pueden producir el compuesto de acuerdo con la invención puede confirmarse por medio de HPLC y/o la determinación de actividad biológica de los compuestos activos acumulados en el caldo de cultivo, por ejemplo probando los compuestos en busca de actividad antibacteriana.

[0031] El medio y/o medio nutritivo usados para el aislamiento y la purificación del cultivo Nº ZMA B-1, que produce el compuesto PM181104, contiene preferiblemente fuentes de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas nutritivas. Las fuentes de carbono son, por ejemplo, una o más de almidón, glucosa, sacarosa, dextrina, fructosa, melazas, glicerol, lactosa o galactosa. Una fuente de carbono preferida es la glucosa. Las fuentes de nitrógeno son, por ejemplo, una o más de harina de soja, harina de cacahuete, extracto de levadura, extracto de carne de res, peptona, extracto de malta, licor de maíz fermentado, gelatina o ácidos casaminoicos. Las fuentes preferidas de nitrógeno son peptona y el extracto de levadura. Las sales inorgánicas de nutrientes son, por ejemplo, una o más de cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, cloruro de magnesio, cloruro de estroncio, bromuro potásico, fluoruro sódico, fosfato ácido sódico, fosfato ácido potásico, fosfato disódico, carbonato cálcico, bicarbonato sódico, silicato sódico, nitrato amónico, nitrato potásico, sulfato sódico, sulfato amónico, sulfato de magnesio, citrato férrico o ácido bórico. Se prefieren carbonato cálcico, cloruro sódico y cloruro de magnesio.

[0032] Se puede mantener el cultivo Nº ZMA B-1 a una temperatura que varía de 21 ºC a 35 ºC y un pH de aproximadamente 6,5 a 8,5. Típicamente, el cultivo Nº ZMA B-1 se mantiene a 27 ºC-29 ºC y un pH de aproximadamente 7,4-7,8. Los cultivos que ya han crecido se pueden conservar en el frigorífico a 4 ºC-8 ºC.

[0033] El cultivo de las semillas de cultivo del cultivo Nº ZMA B-1 puede realizarse a una temperatura que varía de 25 ºC a 35 ºC y un pH de aproximadamente 6,5 a 8,5, durante 20-55 horas a 200-280 rpm. Típicamente, la semilla del cultivo Nº ZMA B-1 se cultiva a 29 ºC-31 ºC y un pH de aproximadamente 7,4-7,8, durante 24-48 horas a 230250 rpm.

[0034] La producción del compuesto PM181104 se puede realizar cultivando el cultivo Nº ZMA B-1 por fermentación a una temperatura que varía de 26 ºC a 36 ºC y un pH de aproximadamente 6,5 a 8,5, durante 24-96 horas a 60-140 rpm y 100 a 200 lpm de aireación. Típicamente, el cultivo Nº ZMA B-1 se incuba a 30 ºC-32 ºC y a un

pH 7,4-7,8 durante 40-72 horas a 90-110 rpm y 140-160 lpm de aireación.

[0035] La producción del compuesto PM181104 se puede realizar cultivando el cultivo Nº ZMA B-1 en un caldo nutritivo adecuado en las condiciones que se describen en el presente documento, preferiblemente en condiciones aerobias sumergidas, por ejemplo en matraces de agitación, así como en fermentadores de laboratorio. El avance de la fermentación y la producción del compuesto PM181104 puede detectarse por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y midiendo la bioactividad del caldo de cultivo frente a especies estafilococos y/o enterococos con el procedimiento de ensayo de difusión en placa de agar microbiano conocido. El cultivo preferido es Staphylococcus aureus 3066, que es una cepa resistente a la meticilina, un antibiótico β-lactámico indicado en la bibliografía, y Enterococcus faecium R2 (VRE), que es resistente a la vancomicina. En el caldo de cultivo resultante, el compuesto PM181104 está presente en el filtrado de cultivo, así como en la masa celular y se puede aislar usando técnicas de separación conocidas, tales como extracción con disolvente y cromatografía en columna. Por lo tanto, el compuesto PM181104 puede recuperarse del filtrado de cultivo por extracción a un pH de aproximadamente 5 a 9 con un disolvente inmiscible en agua, tal como éter de petróleo, diclorometano, cloroformo, acetato de etilo, éter dietílico o butanol, o por cromatografía de interacción hidrófoba usando resinas poliméricas, tales como "Diaion HP-20®" (Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japón), "Amberlite XAD®" (Rohm and Haas Industries, Estados Unidos), carbón activado, o por cromatografía de intercambio iónico a pH 5-9. El material activo se puede recuperar de la masa celular por extracción con un disolvente miscible en agua, tal como metanol, acetona, acetonitrilo, npropanol o iso-propanol, o con un disolvente inmiscible en agua, tal como éter de petróleo, diclorometano, cloroformo, acetato de etilo o butanol. Otra opción es extraer el caldo completo con un disolvente seleccionado entre éter de petróleo, diclorometano, cloroformo, acetato de etilo, metanol, acetona, acetonitrilo, n-propanol, iso-propanol

o butanol. Típicamente, el material activo se extrae con acetato de etilo del caldo completo. La concentración y liofilización de los extractos produce el material activo en bruto.

[0036] El compuesto PM181104 de la presente invención puede recuperarse del material en bruto por fraccionamiento utilizando cualquiera de las siguientes técnicas: cromatografía de fase normal (utilizando alúmina o gel de sílice como fase estacionara; eluyentes tales como éter de petróleo/acetato de etilo, diclorometano, acetona, cloroformo, metanol o combinaciones de los mismos; y las adiciones de aminas, tales como NEt3); cromatografía de fase inversa (utilizando gel de sílice de fase inversa tal como gel de dimetiloctadecilsilil sílice, (RP-18) o gel de dimetiloctilsilil sílice (RP-8) como fase estacionara; y eluyentes tales como agua, tampones (por ejemplo, fosfato, acetato, citrato (pH 2-8)), y disolventes orgánicos (por ejemplo, metanol, acetonitrilo, acetona, tetrahidrofurano o combinaciones de estos disolventes); cromatografía de permeación en gel (utilizando resinas tales como Sephadex LH-20® (Pharmacia Chemical Industries, Suecia), TSKgel® Toyopearl HW (TosoHaas, Tosoh Corporation, Japón) en disolventes tales como metanol, cloroformo, acetona, acetato de etilo, o sus combinaciones, o Sephadex® G-10 y G-25 en agua); o por cromatografía a contracorriente (utilizando un sistema de eluyente bifásico hecho de dos o más disolventes tales como agua, metanol, etanol, iso-propanol, n-propanol, tetrahidrofurano, acetona, acetonitrilo, cloruro de metileno, cloroformo, acetato de etilo, éter de petróleo, benceno y tolueno). Estas técnicas se pueden utilizar repetidamente, solas o en combinación. Un procedimiento típico es la cromatografía sobre gel de sílice de fase inversa (RP-18).

[0037] El compuesto PM181104 e isómeros del mismo, se pueden convertir en sus sales farmacéuticamente aceptables, las cuáles se contemplan en su totalidad por la presente invención. Las sales se pueden preparar por procedimientos estándares conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, sales como las sales de sodio y de potasio, se pueden preparar al tratar el compuesto PM181104 e isómeros del mismo, con una base adecuada de sodio o potasio, por ejemplo hidróxido sódico, hidróxido potásico.

[0038] Los esteres y éteres del compuesto PM181104 representados por la fórmula I pueden prepararse por los métodos que se describen en la bibliografía (Advanced Organic Chemistry, 1992, 4ª Edición, J. March, John Wiley & Sons). Los esteres también pueden prepararse por el procedimiento descrito en la bibliografía (J. Med. Chemistry, 1992, 35, 145-151). En una realización preferida de la invención, los compuestos de la fórmula I, en la que R es alquilo, cicloalquilo, arilo o heterociclilo, se preparan haciendo reaccionar el PM181104 con un ácido apropiado que tenga la fórmula RCOOH; en la que R es alquilo, cicloalquilo, arilo o heterociclilo, en presencia de un agente de acoplamiento, tal como diciclohexil carbodiimida (DCC) y cantidades catalíticas de una base tal como la dimetilaminopiridina (DMAP).

[0039] Los esteres del fosfato se pueden preparar por un procedimiento indicado en la bibliografía (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1994, vol. 4, Nº 21, 2567-2572). Los éteres se pueden preparar por el procedimiento como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 7.022.667.

[0040] El compuesto PM181104 tiene actividad antibacteriana contra una gran variedad de cepas bacterianas. El compuesto PM181104, los estereoisómeros, las sales farmacéuticamente aceptables y derivados tales como los esteres y éteres del mismo, solos o juntos, se pueden administrar a animales, tales como mamíferos, incluyendo

seres humanos, como productos farmacéuticos y en forma de composiciones farmacéuticas. Por consiguiente, la presente invención también se refiere al compuesto PM181104, sus estereoisómeros, sus sales farmacéuticamente aceptables y sus derivados de éster y éteres para usarse como productos farmacéuticos y para el uso del compuesto PM181104, los estereoisómeros, las sales farmacéuticamente aceptables y sus derivados de éter para la producción de medicamentos que tienen actividad antibacteriana.

[0041] La presente invención se refiere adicionalmente a composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del compuesto PM181104 y/o estereoisómeros y/o una o más sales farmacéuticamente aceptables y/o derivados, particularmente los esteres y éteres del mismo, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La cantidad eficaz del compuesto PM181104, o sus estereoisómeros, o sus sales farmacéuticamente aceptables o sus derivados, como ingrediente activo en las preparaciones farmacéuticas normalmente es desde 0,01 mg a 100 mg.

[0042] La presente invención también se refiere a un procedimiento para la preparación de un medicamento que contiene el compuesto PM181104 y/o estereoisómeros y/o una o más sales farmacéuticamente aceptables y/o éster y éter derivados del mismo, para el tratamiento y prevención de enfermedades causadas por infecciones bacterianas.

[0043] Los compuestos de la presente invención son especialmente útiles como agentes antibacterianos. La presente invención igualmente se refiere al uso del compuesto PM181104 y/o estereoisómeros y/o una o más sales farmacéuticamente aceptables y/o derivados del mismo para la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades causadas por infecciones bacterianas. Las infecciones bacterianas para cuyo tratamiento se usan los compuestos de la presente invención, pueden ser causados por bacterias pertenecientes a las especies estafilococos, estreptococos, enterococos y bacilos.

[0044] La expresión "especie Staphylococcus" se refiere a una bacteria Gram-positiva, la cual aparece como cúmulos en forma de uvas cuando se ven a través de un microscopio y como colonias grandes, redondas, colonias doradas-amarillas, frecuentemente con β-hemolisis, cuando crecen en placas de agar de sangre. El Staphylococcus aureus que pertenece a la especie estafilococo causa una diversidad de infecciones que supuran (forman pus) tales como lesiones superficiales de la piel como furúnculos, orzuelos y furunculosis; infecciones más serias como la neumonía, mastitis, flebitis, meningitis e infecciones del tracto urinario; e infecciones arraigadas, tales como osteomielitis y endocarditis. El Staphylococcus aureus es la principal causa de infecciones adquiridas en el hospital (nosocomio) de las heridas quirúrgicas e infecciones asociadas con la manipulación de aparatos médicos. El Staphylococcus aureus provoca el envenenamiento de alimentos al liberar enterotoxinas en el alimento, y síndrome de shock tóxico por la liberación de superantígenos hacia el torrente sanguíneo.

[0045] La expresión "especie Streptococcus" se refiere a un género de bacterias esféricas, Gram positivas y a un miembro de la división Firmicutes. Los estreptococos son bacterias del ácido láctico. La especie Staphylococcus es responsable de enfermedades infecciosas tales como meningitis, neumonía bacteriana, endocarditis, erisipelas y fascitis necrotizante (las infecciones bacterianas que se "comen la carne").

[0046] La expresión "especie Enterococcus" se refiere a un género de bacteria ácido láctica de la división Firmicutes. Son cocos Gram positivos que frecuentemente se encuentran en pares (diplococos). Los enterococos son organismos facultativos anaerobios. Los enterococos se encuentran entre las causas más frecuentes de infecciones adquiridas en los hospitales. Los enterococos desarrollan resistencia a los antibióticos tales como la gentamicina y la vancomicina.

[0047] La expresión "especie Bacillum" se refiere a un gran número de diversas bacterias en forma de bastón, Gram positivas, que tienen movimiento por flagelas perítrocas y son aeróbicas. Es también un miembro de la división Firmicutes. Los miembros de este género son capaces de producir endoesporas que son altamente resistentes a condiciones ambientales desfavorables. El Bacillus cereus que pertenece a la especie Bacillum provoca dos tipos de intoxicaciones por consumo de alimentos. Un tipo está caracterizado por síntomas de náuseas, vómitos y contracciones abdominales. El segundo tipo se manifiesta principalmente por contracciones abdominales y diarrea. Las infecciones atribuidas al Bacillus subtilis que pertenece a la especie Bacillum, incluyen bacteremia, endocarditis, neumonía, y septicemia en pacientes con sistema inmunológico comprometido.

[0048] Los compuestos de la presente invención se pueden administrar por vía oral, nasal, tópica, subcutánea, intramuscular, intravenosa o por otros modos de administración.

[0049] Las composiciones farmacéuticas que contienen PM181104 o un estereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable o un derivado de éster o éter del mismo, con otras sustancias farmacéuticamente activas se pueden preparar mezclando los compuestos activos con uno o más auxiliares farmacológicamente

aceptables tolerados y/o excipientes, tales como agentes humectantes, solubilizadores tales como tensioactivos, vehículos, agentes de tonicidad, cargas, colorantes, enmascaradores del sabor, lubricantes, disgregantes, diluyentes, aglutinantes, plastificantes, emulgentes, bases para ungüentos, emolientes, agentes espesantes, polímeros, lípidos, aceites, codisolventes, agentes complejantes o sustancias tamponantes, y convirtiendo la mezcla en una forma farmacéutica adecuada, tal como, por ejemplo, comprimidos, comprimidos recubiertos, cápsulas, gránulos, polvos, cremas, ungüentos, geles, jarabes, emulsiones, suspensiones o soluciones adecuadas para la administración parenteral.

[0050] Ejemplos de auxiliares y/o excipientes que pueden mencionarse son cremofor, poloxámero, cloruro de benzalconio, laurilsulfato sódico, dextrosa, glicerina, estearato de magnesio, polietilenglicol, almidón, dextrina, lactosa, celulosa, carboximetilcelulosa sódica, talco, agar-agar, aceite mineral, aceite animal, aceite vegetal, ceras orgánicas y minerales, parafina, geles, propilenglicol, alcohol bencílico, dimetilacetamida, etanol, poliglicoles, tween 80, solutol HS 15 y agua.

[0051] También es posible administrar las sustancias activas tal cuales, sin vehículos o diluyentes, en una forma adecuada, por ejemplo, en cápsulas.

[0052] Como es habitual, la formulación galénica y el procedimiento de administración, así como el intervalo de dosificación son adecuados en un caso específico dependen de la especie que se va a tratar y del estado de la afección o enfermedad respectiva, y se puede optimizar usando procedimientos conocidos en la técnica. Como promedio, la dosis diaria del compuesto activo en un paciente es de 0,0005 mg a 15 mg por kg, normalmente 0,001 mg a 7,5 mg por kg.

[0053] Los siguientes ejemplos se proporcionan como ejemplos ilustrativos de la presente invención:

Ejemplo 1

Aislamiento del cultivo Nº ZMA B-1 de la fuente marina

a) Composición del medio de aislamiento:

Caldo marino Zobell 2216 (agarificado con agar-agar al 1,5%)

[0054] 5,0 g de digesto péptico de tejido animal, 1,0 g de extracto de levadura, 0,1 g de citrato férrico, 19,45 g de cloruro sódico, 8,8 g de cloruro de magnesio, 3,24 g de sulfato sódico, 1,8 g de cloruro cálcico, 0,55 g de cloruro potásico, 0,16 g de bicarbonato sódico, 80,0 mg de bromuro potásico, 34,0 mg de cloruro de estroncio, 22,0 mg de ácido bórico, 4,0 mg de silicato sódico, 2,4 mg de fluorato sódico, 1,6 mg de nitrato de amonio, 8,0 mg de fosfato disódico, 15,0 mg de polvo de agar, 1,0 l de agua bidestilada, pH final (a 25 ºC) 7,4 a 7,8.

b) Procedimiento

[0055] La muestra de esponja, Spirastrella inconstans var. digitata (Dendy) se recogió de Palk Bay en la costa de Tamil Nadu, India, mediante buceo a una profundidad de tres metros. La muestra de esponja se aclaró en agua marina estéril e inmediatamente se transfirió a recipientes estériles de polietileno. Los recipientes se almacenaron a 20 ºC y se transportaron manteniendo la temperatura por debajo de 0 ºC, al laboratorio para estudios posteriores. Al llegar al laboratorio, las muestras de esponja se almacenaron a menos de 0 ºC y más tarde se descongelaron a temperatura ambiente (25 ± 2 ºC) justo antes del aislamiento del cultivo. La muestra de esponja se cortó asépticamente en piezas de 2 x 2 cm y se suspendió en 5 ml de agua marina estéril en un tubo de ensayo esterilizado de 25 ml. El tubo de ensayo se agitó vorticialmente durante 30 segundos; el agua marina se drenó y se añadió agua de mar limpia. Se repitió el mismo proceso tres veces. Finalmente, el agua de mar se drenó y la pieza de esponja se puso sobre placas de petri que contenían el medio aislante que se ha mencionado anteriormente [caldo Zobell Marine Broth 2216 (agarificado con agar-agar al 1,5%); HiMedia]. La placa de petri se incubó a temperatura ambiente (25 ± 2 ºC) hasta que se observó crecimiento en las placas. Las colonias que crecieron en las placas se aislaron en base a las características de la colonia y se sembraron por estriado en placas de petri que contenían el medio de aislamiento que se ha mencionado anteriormente [caldo Zobell Marine Broth 2216 (agarificado con agar-agar al 1,5%); HiMedia], Los aislados se subcultivaron repetidamente hasta que se obtuvo el cultivo puro Nº ZMA B-1. Por lo tanto, el cultivo Nº ZMA B-1 se aisló de entre los microorganismos cultivados en forma de un único aislado.

Ejemplo 2

Purificación del cultivo Nº ZMA B-1 a) Composición del medio de asilamiento:

Caldo Marino Zobel 2216 (agarificado con agar agar al 1,5%)

5 [0056] 5,0 g de peptona, 1,0 g de extracto de levadura, 0,1 g de citrato férrico, 19,45 g de cloruro sódico, 8,8 g de cloruro de magnesio, 3,24 g de sulfato sódico, 1,8 g de cloruro cálcico, 0,55 g de cloruro potásico, 0,16 g de bicarbonato sódico, 0,08 g de bromuro potásico, 34,0 mg de cloruro de estroncio, 22,0 mg de ácido bórico, 4,0 mg de silicato sódico, 2,4 mg de fluorato sódico, 1,6 mg de nitrato de amonio, 8,0 mg de fosfato disódico, 15,0 g de agar,

10 1,0 l de agua desmineralizada, pH 7,4-7,8.

b) Procedimiento:

[0057] El cultivo estuvo disponible en caldo Zobell Marine Broth 2216 (agarificado con agar agar al 1,5%) en una

15 placa de petri de 15 mm de diámetro. El cultivo de la placa de petri se sembró por estriado sobre un cultivo inclinado de caldo Zobel Marine Broth 2216 (agarificado con agar agar al 1,5%). El cultivo inclinado se incubó durante 2 días a 25 ºC. Una de las colonias individuales de la parte superior del lecho inclinado se transfirió a nuevas placas inclinadas. Las placas inclinadas se incubaron durante 2 días a 25 ºC. Después, se usaron para fermentación en matraces de agitación con el fin del primer cribado anti-infeccioso.

20 Ejemplo 3

Mantenimiento de la cepa productora - cultivo Nº ZMA B-1

25 [0058]

a) Composición del medio (caldo Zobel Marine Broth 2216): 5,0 g de peptona, 1,0 g de extracto de levadura, 0,1 g de citrato férrico, 19,45 g de cloruro sódico, 8,8 g de cloruro de magnesio, 3,24 g de sulfato sódico, 1,8 g de cloruro cálcico, 0,55 g de cloruro potásico, 0,16 g de

30 bicarbonato sódico, 0,08 g de bromuro potásico, 34,0 mg de cloruro de estroncio, 22,0 mg de ácido bórico, 4,0 mg de silicato sódico, 2,4 mg de fluorato sódico, 1,6 mg de nitrato de amonio, 8,0 mg de fosfato disódico, agar 15.0 mg, 1,0 l de agua desmineralizada, pH 7,4-7,8. b) Después de disolver los ingredientes completamente por calentamiento, la solución resultante se distribuyó en tubos de ensayo y se esterilizó a 121 ºC durante 30 min. Los tubos de ensayo se enfriaron y

35 se les dejó solidificar en posición inclinada. Los inclinados de agar se sembraron por estriado con el cultivo ZMA B-1 por medio de un asa de alambre y se incubaron a 27-29 ºC hasta que se observó un crecimiento bueno. Los cultivos que crecieron bien se almacenaron en el refrigerador a 4-8 ºC.

Ejemplo 4 40 Fermentación del cultivo Nº ZMA B-1 en matraces de agitación

[0059]

45 a) Composición del medio semilla (caldo Zobel Marine Broth 2216): 5,0 g de peptona, 1,0 g de extracto de levadura, 0,1 g de citrato férrico, 19,45 g de cloruro sódico, 8,8 g de cloruro de magnesio, 3,24 g de sulfato sódico, 1,8 g de cloruro cálcico, 0,55 g de cloruro potásico, 0,16 g de bicarbonato sódico, 0,08 g de bromuro potásico, 34,0 mg de cloruro de estroncio, 22,0 mg de ácido bórico, 4,0 mg de silicato sódico, 2,4 mg de fluorato sódico, 1,6 mg de nitrato de amonio, 8,0 mg de fosfato

50 disódico, 1,0 l de agua desmineralizada, pH 7,4-7,8. b) El medio anterior se distribuyó en porciones de 40 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml y se esterilizó en autoclave a 121 ºC durante 30 min. Los matraces se enfriaron a temperatura ambiente y cada matraz se inoculó con una colonia de la cepa productora de buen crecimiento (cultivo Nº ZMA B-1) en el medio inclinado y se agitó en un agitador rotatorio durante 24-48 horas a 230-250 rpm a 30 ºC (±1 ºC) para

55 proporcionar el cultivo semilla. c) Composición del medio de producción: 5,0 g de peptona, 1,0 g de extracto de levadura, 0,1 g de citrato férrico, 19,45 g de cloruro sódico, 8,8 g de cloruro de magnesio, 3,24 g de sulfato sódico, 1,8 g de cloruro cálcico, 0,55 g de cloruro potásico, 0,16 g de bicarbonato sódico, 0,08 g de bromuro potásico, 34,0 mg de cloruro de estroncio, 22,0 mg de ácido bórico,

60 4,0 mg de silicato sódico, 2,4 mg de fluorato sódico, 1,6 mg de nitrato de amonio, 8,0 mg de fosfato disódico, 1,0 l de agua desmineralizada, pH 7,4-7,8. d) Se esterilizaron en autoclave 40 ml del medio de producción en matraces Erlenmeyer de 500 ml de

capacidad a 121 ºC durante 30 min, se enfriaron a 29 ºC-30 ºC y se sembraron con 2 ml del cultivo semilla que se ha mencionado en el ejemplo 4b. e) Parámetros de fermentación Temperatura 29 ºC-30 ºC; agitación 230-250 rpm; tiempo de cosecha 48-72 horas.

5 [0060] La producción del compuesto PM181104 en el caldo de fermentación se determinó probando la bioactividad frente a Enterococcus faecium R2 (VRE) y/o la cepa de S. aureus 3066 MRSA usando el procedimiento de difusión en agar. El pH de cosecha del caldo de cultivo fue de 7,0-8-0. El caldo de cultivo se cosechó y el total del caldo se utilizó para pruebas de bioactividad, lo que es indicativo de la presencia del compuesto PM181104 en el caldo

10 fermentado.

Ejemplo 5

Preparación del cultivo semilla en los matraces de agitación para la fermentación 15

[0061]

a) Composición del medio: 5,0 g de peptona, 1,0 g de extracto de levadura, 0,1 g de citrato férrico, 19,45 g de cloruro sódico, 8,8 g de

20 cloruro de magnesio, 3,24 g de sulfato sódico, 1,8 g de cloruro cálcico, 0,55 g de cloruro potásico, 0,16 g de bicarbonato sódico, 0,08 g de bromuro potásico, 34,0 mg de cloruro de estroncio, 22,0 mg de ácido bórico, 4,0 mg de silicato sódico, 2,4 mg de fluorato sódico, 1,6 mg de nitrato de amonio, 8,0 mg de fosfato disódico, 1,0 l de agua desmineralizada, pH 7,4-7,8. b) El medio anterior se distribuyó en cantidades de 200 ml en matraces Erlenmeyer de 1 l y se esterilizó en

25 autoclave a 121 ºC durante 30 min. Los matraces se enfriaron hasta temperatura ambiente y cada matraz se inoculó con una colonia de la cepa productora que ya había crecido (cultivo Nº ZMA B-1) en los medios inclinados y se agitó sobre un agitador rotatorio durante 24-48 horas a 230-250 rpm a 29 ºC-31 ºC para dar un cultivo semilla.

30 Ejemplo 6

Cultivo del cultivo Nº ZMA B-1 en el fermentador

[0062]

35 a) Composición del medio de producción: 50,0 g de glucosa, 11,0 g de extracto de levadura, 4,0 g de peptona, 4,0 g de extracto de carne de res, 5 g de carbonato cálcico, 2,5 g de cloruro sódico, 1 l de agua desmineralizada, pH 7,6 (antes de la esterilización).

40 b) Se esterilizaron in situ 250 l del medio de producción en un fermentador de 300 l junto con 80 ml de desmofeno como agente antiespumante, durante 30 min a 121 ºC, se enfriaron a 29 ºC-31 ºC y se sembraron con 6 l del cultivo semilla que se ha mencionado en el ejemplo 5b. c) Parámetros de fermentación: Temperatura 30 ºC-32 ºC, agitación 100 rpm; aireación 150 lpm, tiempo de cosecha 44-66 horas.

45 [0063] La producción del compuesto PM181104 en el caldo de fermentación se determinó probando la bioactividad contra S. aureus 3066 (cepa MRSA) y/o Enterococcus faecium R2 (VRE) usando el procedimiento de difusión en agar. El pH de cosecha del caldo de cultivo fue de 7,0-8,0. El caldo de cultivo se cosechó y el caldo íntegro se usó para aislar y purificar el compuesto PM181104.

50 Ejemplo 7

Aislamiento y purificación del compuesto PM181104

55 [0064] El caldo completo (240 l) del Ejemplo 6 se cosechó y se extrajo usando acetato de etilo (240 l) mediante agitación en un recipiente de vidrio. La fase orgánica se separó usando un separador de pila de discos (Alfa-laval, modelo Nº LAPX404) y se concentró para obtener el extracto en bruto (296 g). El material en bruto obtenido se agitó y se sónico durante 30 min usando éter de petróleo (3 x 1 l) y se filtró para obtener el residuo insoluble (38 g), que se sometió a cromatografía por cromatografía líquida al vacío usando el siguiente procedimiento.

60 [0065] El residuo insoluble (35,5 g) se disolvió en una mezcla de metanol y acetonitrilo (3:1, 400 ml) y se preadsorbió sobre LiChroprep RP-18 [25-40 μ, 40 g] y se aplicó a un embudo de filtro sinterizado (calidad G-4; 10 cm

x 10,5 cm) rellenado con adsorbente LiChroprep RP-18 (25-40 μ, 110 g). Se realizó la elución usando una red de vacío (100-120 mm) inicialmente con agua (4 l) seguida de agua:metanol (1:1, 5 l), metanol (3 l), metanol:acetonitrilo (2,5 l) y acetonitrilo. El control de la purificación se realizó mediante bioensayo contra Ent. faecium R2 y/o S. aureus 3066 y/o HPLC analítica. El compuesto PM181104 se detectó en las fracciones de metanol, metanol:acetonitrilo y acetonitrilo. Tales fracciones se combinaron y se concentraron para obtener el material semipuro (1,826 g).

[0066]

La purificación final se realizó mediante HPLC preparativa repetida usando las siguientes condiciones:

Columna Eluyente Caudal Detección (UV) Tiempo de retención

: Eurospher RP-18 (10 μ, 32 x 250 mm) : acetonitrilo:agua (56:44) : 50 ml/min : 220 nm : 12-14 min

[0067]

La pureza de las fracciones se comprobó mediante bioensayo contra Ent. faecium R2 y/o S. aureus 3066

y/o HPLC analítica. Los eluatos que contenían el compuesto PM181104 se combinaron y se concentraron a presión reducida para eliminar el disolvente para obtener 600 mg del compuesto puro.

[0068] Propiedades fisicoquímicas y espectrales del compuesto PM181104

Apariencia : sólido amorfo de color blanco

Punto de fusión : >300 ºC (se descompone)

Solubilidad : Metanol, DMSO

HPLC : Tr 5,61 min

Columna : Kromasil C18 (5 μ; 150 x 4,6 mm de D.I.) (temperatura de la columna 40 ºC)

Fase móvil : agua:acetonitrilo (1:1)

Volumen de : 10 μl (concentración 0,1 mg/ml en la fase móvil)

inyección

Caudal : 1 ml/min

Detección : 220 nm

HR-IEN(+)EM m/z : 1515,3733 (M+H)

Fórmula Molecular : C69H66N18O13S5

Peso Molecular : 1514

UV (MeOH) : 205,2, 220,6 y 306,2 nm (véase la figura 1)

IR (KBr) : 3368, 2981, 1654, 1516, 1429, 1314, 1199, 1269, 1074, 1034, 805, 580 cm -1 (véase la figura 2)

RMN 1H : véase la Tabla 1 y la figura 3

RMN 13C : véase la Tabla 2 y la figura 4

Tabla 1: RMN 1H del compuesto PM181104 en DMSO-d6

Pico

δ Pico δ Pico δ

1

1,33-1,34 (d, 3H) 21 5,33 (m, 1H) 41 8,57-8,58 (d, 1H)

2

1,94 (m, 4H) 22 5,52 (s, 1H) 42 8,65 (s, 1H)

3

2,05-2,06 (m a,1H) 23 5,63 (s, 1H) 43 8,81 (t, 2H)

4

2,12 (m a, 1H) 24 5,83 (s, 1H) 44 9,07 (s, 1H)

5

2,25-2,28 (d a, 1H) 25 5,92 (s, 1H) 45 9,16 (s, 1H)

6

2,40-2,42 (m a,1H) 26 6,07 (s, 1H) 46 9,48 (s, 1H)

7

2,68 (s, 3H) 27 6,50 (s, 1H) 47 10,03 (s, 1H)

8

2,76-2,82 (m, 2H) 28 6,59-6,61 (d, 2H)

9

2,97-2,99 (d, 1H) 29 6,86 (s, 1H)

10

3,17-3,21 (m, 1H) 30 7,04-7,06 (d, 2H)

11

3,24-3,26 (m, 1H) 31 7,17-7,18 (m, 1H)

12

3,62 (t, 2H) 32 7,26 (d, 4H)

13

3,69 (m, 1H) 33 7,30 (s, 1H)

14

3,77 (s, 2H) 34 7,33-7,35 (d, 1H)

15

4,49-4,50 (d, 1H) 35 7,53 (s, 1H)

16

4,69-4,71 (t, 1H) 36 7,69 (s, 1H)

17

4,80 (m, 1H) 37 7,90 (s, 1H)

18

4,89 (m, 1H) 38 7,95 (s, 1H)

19

4,93-4,97 (t, 1H) 39 8,27-8,29 (d, 2H)

20

5,23 (t, 1H) 40 8,49-8,50 (d, 1H)

Tabla 2: RMN 13C del compuesto PM181104 en DMSO-d6

señal

δ señal δ señal δ

1

12,04 22 115,46* 43 151,04

2

16,88 23 116,92 44 152,08

3

25,16* 24 118,77 45 153,43

4

29,42 25 122,84 46 154,20

5

33,09 26 123,39 47 156,27

6

36,67 27 124,33 48 156,45

7

37,00 28 127,08 49 159,06

8

38,62 29 127,36 50 161,27

9

38,73 30 128,71* 51 161,54*

10

47,22 31 129,18 52 162,79

11

47,76 32 129,76* 53 163,35

12

47,88 33 130,11 54 165,58

13

48,88 34 130,99* 55 167,95

14

52,69 35 133,99 56 169,68

15

54,43 36 135,17 57 170,39

16

59,92 37 136,87 58 171,03

17

60,56 38 137,67 59 171,77

18

77,80 39 140,92 60 171,96

19

103,89 40 147,97 61 173,51

20

104,94 41 149,73 62 174,14

21

107,52 42 150,83 63 174,90

* dos carbonos

EVALUACIÓN BIOLÓGICA DEL COMPUESTO PM181104 5 Ensayo in vitro

Ejemplo 8

10 [0069] La potencia in vitro se estableció con determinaciones de la concentración inhibitoria mínima (CIM) del compuesto PM181104 frente a cepas bacterianas, usando el método de dilución Macro-caldo según las directrices del National Committee for Clinical Laboratory Standard (2000) [Journal of Anti-microbial Chemotherapy, 2002, 50, 125-128 (Referencia cruzada 8: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically-Fifth Edition: Approved Standard M7-A5. NCCLS, Wayne, PA, Estados Unidos)]. A menos que se indique

15 otra cosa, se uso caldo Mueller-Hilton como medio nutritivo para el ensayo. Se utilizó Linezolid (elaborada por Glenmark Pharma Ltd; Lote Nº K2005028) como estándar conocido en todos los experimentos in vitro. Para la preparación de la solución madre se disolvió el compuesto PM181104 en cloroformo (5% del volumen total requerido) y se diluyó usando metanol (95% del volumen total requerido).

20 Resultado:

[0070] Los resultados obtenidos se muestran Tabla 3 a continuación, y demuestran que el compuesto PM181104 es útil en el tratamiento de infecciones bacterianas.

25 Tabla 3: CIM del compuesto PM181104 frente a cepas bacterianas

Organismo de prueba

CIM ( g/ml) Organismo de prueba CIM ( g/ml)

S. aureus KEM-MRSA1

0,03125 S. epidermidis 32965 0,03125

S. aureus KEM-MRSA2

0,03125 S. haemolytica 809 0,0625

S. aureus KEM-MRSA7

0,01563 Enterococci KEM-VRE26 0,00781

S. aureus KEM-MRSA8

0,01563 Enterococci KEM-VRE27 0,00391

S. aureus KEM-MRSA11

0,0625 Enterococci KEM-VRE28 0,00781

S. aureus KEM-MRSA12

0,01563 Enterococci KEM-VRE29 0,00391

S. aureus KEM-MRSA18

0,01563 E. faecium (R-2) 0,00781

S. aureus KEM-MRSA19

0,00781 E. faecium (VR-1) 0,00781

S. aureus KEM-MRSA20

0,01563 E. faecium D-59 0,00781

S. aureus KEM-MRSA21

0,01563 E. faecium D 18F 0,00781

S. aureus KEM-MRSA22

0,00781 E. faecium (02-D3IP1) 0,00391

S. aureus KEM-MRSA23

0,01563 E. faecium 4045H 0,00781

S. aureus KEM-MRSA24

0,00781 E. faecalis (FH-1) 0,00391

S. aureus KEM-MRSA25

0,01563 E. faecalis (uD.8b) 0,00391

S. aureus Lilavati-MRSA3

0,01563 E. faecalis 4073H 0,00781

S. aureus Rehaja-MRSA1

0,03125 E. faecium ATCC 51559 0,00781

S. aureus Bom-MRSA2

0,0625 E. faecalis, ATCC 51299 0,01563

Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 33591

0,03125 E. faecalis ATCC 51575 0,03125

S. aureus (789)

0,00781 E. faecalis ATCC BAA 472 0,01563

S. aureus (20666)

0,01563 B. cereus 0,00391

S. aureus (3066)

0,03125 B. subtilis ATCC 6633 0,00781

S. aureus SG511

0,0625 B. subtilis 0,01563

S. aureus wien 8

0,01563 B. megaterium FH 1127 0,00781

S. aureus wien 13

0,0625 B. firmus 0,01563

S. aureus C1 3184

0,0625 Streptococcus hirae 55 0,00391

S. aureus (E710)

0,03125 Streptococcus equinus 02 D5 Gr1 0,01563

S. aureus ATCC29213

0,03125 Streptococcus durans 4939 (1) H 0,00781

S. epidermidis 5744IW

0,01563 Streptococcus durans 0,00781

S. epidermidis Pat 01 IV

0,0625 Salmonella typhi Para A >1

S. epidermidis 823

0,03125 Pse.aeruginosa (M-35) >1

S. epidermidis 6098

0,0625 Klebsiella pneumoniae >1

S. epidermidis 6493II(2) W

0,0625 Citrobacterdiversus 2046E >1

S. epidermidis 10221II W

0,00781 E. coli SS >1

Las abreviaturas usadas en la tabla 3 son: S: Staphylococcus E: Enterococci B: Bacillus

Ensayo in vivo

[0071] Se estableció la potencia in vivo por medio de determinaciones de dosis de protección (PD) del compuesto 5 PM181104 para su actividad antibiótica en tres modelos animales usando ratones Balb/C, tanto machos como hembras.

[0072] Los modelos usados fueron los modelos de prueba de eficacia con fines generales y otros modelos de prueba de eficacia específica en órganos/tejidos. Los modelos de prueba de eficacia con fines generales que se

10 utilizaron fueron el modelo de infección sistémica (septicemia), el modelo de infección localizada (modelo de muslo neutropénico). Los modelos de infección específica Órgano/Tejido que se utilizaron para la prueba de eficacia fueron modelo de riñón, de infección de pulmón, de absceso dérmico.

Ejemplo 9

15 Modelo de infección sistémica

[0073] Los animales se infectaron por vía intraperitoneal con ~10a a 109 cfu de un cultivo durante una noche de Staphylococcus aureus E710 (MRSA) resistente a la meticilina, suspendido en solución salina normal (0,85% de

20 cloruro sódico). La solución de PM181104 se preparó en una formulación cremofor-etanol, según se describe en el ejemplo 14. La solución se administró por vía intravenosa en dosis de 5 mg, 2,5 mg y 1,25 mg/kg, inmediatamente después de la infección. Cada grupo experimental consistía en diez animales. Se determinó que el PD100 del PM181104 para el modelo de septicemia es de 5 mg/kg en comparación con el antibiótico estándar Linezolid (fabricado por Glenmark Pharma Ltd; Lote Nº K2005028) cuyo PD100 fue de 25 mg/kg.

25 Ejemplo 10

Modelo Neutropénico en muslo

30 [0074] Los ratones se hicieron neutropénicos con ciclofosmamida (150 mg y 100 mg/kg) a 96 y 24 horas, respectivamente, antes de la infección con S. aureus E-710. Se infectaron los animales en los músculos por vía intramuscular con ~107 cfu de un cultivo cultivado durante una noche de S. aureus E-710, suspendido en salmuera normal (cloruro sódico al 0,85%). Cada grupo experimental consistió en seis animales. Se preparó el PM181104 en

una formulación de cremofor-etanol según se describe en el ejemplo 14. La solución se administró por vía intravenosa en dosis de 5 mg/kg, después de dos horas de la infección. Se sacrificó a los animales en varios puntos del tiempo y el tejido del músculo se cosechó para determinar el recuento de microorganismos viables. Se observó una disminución aproximadamente de 1 log con PM181104 en dosis de 5 mg/kg, en el punto de tiempo de 6 horas, que fue comparable con el antibiótico estándar utilizado viz. Linezolid (fabricado por Glenmark Pharma Ltd; Lote Nº K2005028) con dosis de 25 mg/kg.

Ejemplo 11

Modelo de infección en riñon

[0075] Se administraron por vía intravenosa 0,2 ml de λ carragenano al 2% a ratones Balb/C siete días posteriores a la infección. Se inyectó por vía intravenosa un cultivo en crecimiento durante una noche en fase log de Enterococcus faecium ATCC 47077 ajustado aproximadamente a 109 cfu/ml, a los ratones a un volumen de 0,2 ml. Se administró a los ratones la solución de PM181104, preparada en una formulación de cremofor-etanol según se describe en el ejemplo 14, por vía intravenosa a las 4 horas, 24 horas y 48 horas después de la infección. A las 72 horas después de la infección, se sacrificaron los animales y los riñones se recolectaron para determinar la carga bacteriana. Se observó una disminución en el recuento bacteriano de aproximadamente 1 Log con dosis de 5 mg/kg de PM181104, que fue comparable con el antibiótico estándar utilizado viz. Linezolid (fabricado por Glenmark Pharma Ltd; Lote Nº K2005028) en 25 mg/kg y clorhidrato de vancomicina (fabricado por HiMedia; Catálogo Nº RM217-500 mg; Lote Nº 06-0350) en dosis de 150 mg/kg.

Ejemplo 12

Modelo de infección en pulmón

[0076] Se hicieron neutropénicos los ratones Balb/C mediante administración por vía intraperitoneal de 200 mg/kg de ciclofosmamida cuatro y dos días antes de la infección. El día de la infección, los ratones se anestesiaron y se infectaron con un cultivo en suspensión en fase log de S. aureus E-710 con densidad bacteriana de aproximadamente 106 a 107 cfu/ml. A las 24 y 36 horas posteriores a la infección, se administraron por vía intravenosa las primera y segunda dosis respectivas del medicamento. A las 48 horas posteriores a la infección se practicó la eutanasia a los ratones y sus pulmones se colectaron asépticamente para determinar el recuento de bacterias viables. En este modelo, el PM181104 se probó en dosis de 5 mg/kg preparado en una formulación en cremofor-etanol como se describe en el ejemplo 14. Se utilizaron como controles positivos dos antibióticos estándares viz. Linezolid (una sola dosis de 80 mg/kg a las 24 horas posteriores a la infección) y Vancomicina (dos dosis de 110 mg/kg a las 24 y 48 horas posteriores a la infección). El PM181104 mostró tener actividad bacteriostática, que fue comparable con la del estándar Linezolid (fabricado por Glenmark Pharma Ltd; Lote Nº K2005028). El clorhidrato de vancomicina estándar (fabricado por HiMedia; catalogo Nº RM217-500 mg; Lote Nº 060350) mostró un perfil bacteriano. Había aproximadamente 2 Log de diferencia en el recuento bacteriano en los pulmones de animales tratados con PM181104 en comparación con los de los animales de control no tratados.

Ejemplo 13

Modelo de absceso en la piel

[0077] Se infectaron ratones Balb/C por vía subcutánea con aproximadamente 108 cfu de un cultivo en crecimiento durante una noche de S. aureus E710 (MRSA) resistente a la meticilina. Las bacterias se suspendieron en una mezcla 1:1 de perlas de citodex al 2% en solución salina normal (cloruro sódico al 0,85%). Se preparó PM181104 en una formulación de cremofor-etanol como se describe en el ejemplo 14. Se administró la solución por vía intravenosa en dosis de 2,5 mg, 5 mg y 10 mg/kg, dos horas después de la infección. Cada grupo experimental contenía seis animales. Después de la formación de abscesos, los animales se sacrificaron y se cosecharon los abscesos para determinar las cuentas viables. Se observó una disminución en el recuento bacteriano de aproximadamente 1 Log con la dosis de 5 mg/kg de PM181104, que fue comparable con el antibiótico estándar utilizado viz. Linezolid (fabricado por Glenmark Pharma Ltd; Lote Nº K2005028) en dosis de 50 mg/kg.

FORMULACIÓN DEL COMPUESTO PM181104

Ejemplo 14

[0078] Se prepararon formulaciones inyectables mediante el siguiente procedimiento general:

Se mezclaron etanol y cremofor EL en una proporción 1:1 (en peso). A esto se le añadió PM181104 y se agitó vorticialmente. Esta mezcla se sónico a 25 ºC. Esta mezcla (considerándola como constituyente al 10%) se diluyó añadiendo agua (90%) y se agitó vorticialmente para obtener la formulación inyectable.

DERIVADOS DEL COMPUESTO PM181104 5 Ejemplo 15

Derivado del éster del ácido butírico de PM181104

10 [0079] A una solución de PM181104 (0,13 g, 0,085 mmol) en diclorometano (2 ml) se le añadieron ácido butírico (0,008 μl, 0,085 mmol), DCC (0,018 g, 0,085 mmol) y una cantidad catalítica de DMAP (0,002 g, 0,016 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 18 h en una atmósfera de nitrógeno. A la mezcla de reacción se le añadió agua fría y la fase orgánica se separó; la fase acuosa se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml), los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con agua (2 x 30 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro y se concentró.

15 El producto en bruto se purificó usando cromatografía en columna [gel de sílice (malla 60-120), metanol al 4% en cloroformo] para obtener el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco. Rendimiento: 0,11 g (81%); EM m/z (IEN): 1585 (M+H)

[0080] El derivado del éster del ácido butírico de PM181104 mostró un valor de CIM de 2,5 μg/ml frente a E. 20 faecium R-2, cepa bacteriana (VRE).

Ejemplo 16

Derivado del ácido esteárico de PM181104

25 [0081] A una solución de PM181104 (0,12 g, 0,079 mmol) en diclorometano (2 ml) se le añadieron ácido esteárico (0,022 μl, 0,079 mmol), DCC (0,016 g, 0,079 mmol) y una cantidad catalítica de DMA (0,002 g, 0,016 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 6 h en una atmósfera de nitrógeno. A la mezcla de reacción se le añadió agua fría y la fase orgánica se separó; la fase acuosa se extrajo con diclorometano, (3 x 50 ml), los extractos orgánicos se

30 combinaron y se lavaron con agua (2 x 3 0 ml). La fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro y se concentró. El producto en bruto se purificó usando cromatografía en columna [gel de sílice (malla 60-120), metanol al 4% en cloroformo] para obtener el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco. Rendimiento 0,1 g (71%); EM m/z (IEN): 1781 (M+H).

35 [0082] El derivado del éster del ácido esteárico de PM181104 mostró un valor de CIM del 1,25 μg/ml frente a la cepa bacteriana (VRE) E. faecium R-2.

Ejemplo 17

40 Derivado del éster del ácido nicotínico de PM181104

[0083] A una solución de PM181104 (0,02 g, 0,013 mmol) en N,N-dimetilformamida (1 ml) se le añadieron ácido nicotínico (0,008 g, 0,065 mmol), DCC (0,014 g, 0,065 mmol) y una cantidad catalítica de DMAP (0,0008 g, 0,0065 mol) y la mezcla de reacción se agitó durante 18 h en una atmósfera de nitrógeno. El disolvente se eliminó y al

45 residuo se le añadieron 10 ml de diclorometano. La urea sin disolver se filtró y el filtrado se lavó con agua (2 x 10 ml). La fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro y se concentró a sequedad. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna [columna de fase inversa C-18 (Euroesfera, 20 nm), acetonitrilo al 55% en agua] para obtener el compuesto del título en forma un sólido de color blanco. Rendimiento 0,011 g (56%); EM m/z (IEN): 1621 (M+H).

50 [0084] El derivado del éster del ácido nicotínico de PM181104 se probó frente a cepas bacterianas. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 4 que se indica a continuación, y demuestran que el derivado del éster del ácido nicotínico de PM181104 es útil en el tratamiento de infecciones bacterianas.

55 Tabla 4. CIM del derivado del éster del ácido nicotínico del PM181104 frente a cepas bacterianas.

Organismo de prueba

CIM ( g/ml) Organismo de prueba CIM ( g/ml)

E. faecalis ATCC 51299

0,312 E. faecium R-2 (VRE) 0,312

E. faecalis ATCC 51575

0,312 S. aureus MRSA ATCC 33591 >10

E. faecalis ATCC BAA472

0,312 S. aureus MRSA E710 >10

E. faecium ATCC 51559

0,156

en la que R = H, alquilo, alquilcarbonilo, (HO)2PO-, alquil-OPO(OH)-, (alquil-O)2PO-, cicloalquilo, cicloalquilcarbonilo,

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Compuestos de la siguiente fórmula I;

   arilo, arilcarbonilo, heterociclilo y heterociclil carbonilo; o estereoisómeros o tautómeros o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

2. 2.

   El compuesto como se ha indicado en la reivindicación 1, en el que en los compuestos de fórmula I, R es H; dicho compuesto se designa como PM181104; o un estereoisómero o un tautómero o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

3. 3.

   El compuesto designado como PM181104 como se ha indicado en la reivindicación 2, o un estereoisómero o un tautómero del mismo, cuyo compuesto se aísla del caldo fermentado del microorganismo perteneciente a la especie Kocuria (ZMA B-1/MTCC 5269) y está caracterizado por:

   (a)

   peso molecular de 1514,

   (b)

   fórmula molecular C69H66N18O13S5,

   (c)

   absorbancias de espectro de UV (MeOH) a 205,2, 220,6 y 306,2 nm,

   (d)

   absorbancias del espectro IR (KBr) a 3368, 2981, 1654, 1516, 1429, 1314, 1199, 1269, 1074, 1034, 805, 580 cm-1,

   (e)

   espectro RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6): δ 10,03 (s, 1 H), 9,48 (s, 1 H), 9,16 (s, 1 H), 9,07 (s, 1 H), 8,81 (t, 2H), 8,65 (s, 1 H), 8,57-8,58 (d, 1 H), 8,49-8,50 (d, 1 H), 8,27-8,29 (d, 2H), 7,95 (s, 1 H), 7,90 (s, 1 H), 7,69 (s, 1 H), 7,53 (s, 1 H), 7,33-7,35 (d, 1H), 7,30 (s, 1 H), 7,26 (d, 4H), 7,17-7,18 (m, 1 H), 7,04-7,06 (d, 2H), 6,86 (s, 1 H), 6,59-6,61 (d, 2H), 6,50 (s, 1H), 6,07 (s, 1 H), 5,92 (s, 1H), 5,83 (s, 1 H), 5,63 (s, 1 H), 5,52 (s, 1 H), 5,33 (m, 1 H), 5,23 (t, 1 H), 4,93-4,97 (t, 1 H), 4,89 (m, 1 H), 4,80 (m, 1 H), 4,69-4,71 (t, 1 H), 4,49-4,50 (d, 1 H), 3,77 (s, 2H), 3,69 (m, 1 H), 3,62 (t, 2H), 3,24-3,26 (m, 1 H), 3,17-3,21 (m, 1 H), 2,97-2,99 (d, 1 H), 2,76-2,82 (m, 2H), 2,68 (s, 3H), 2,40-2,42 (m a, 1 H), 2,25-2,28 (d a, 1 H), 2,12 (m a, 1 H), 2,052,06 (m a, 1 H), 1,94 (m, 4H) y 1,33-1,34 (d, 3H),

   (f)

   espectro RMN 13C (125 MHz, DMSO-d6): δ 174,90, 174,14, 173,51, 171,96, 171,77, 171,03, 170,39, 169,68, 167,95, 165,58, 163,35, 162,79, 161,54 (2C), 161,27, 159,06, 156,45, 156,27, 154,20, 153,43, 152,08, 151,04, 150,83, 149,73, 147,97, 140,92, 137,67, 136,87, 135,17, 133,99, 130,99 (2C), 130,11, 129,76 (2C), 129,18, 128,71 (2C), 127,36, 127,08, 124,33, 123,39, 122,84, 118,77, 116,92, 115,46 (2C), 107,52, 104,94, 103,89, 77,80, 60,56, 59,92, 54,43, 52,69, 48,88, 47,88, 47,76, 47,22, 38,73, 38,62, 37,00, 36,67, 33,09, 29,42, 25,16 (2C), 16,88 y 12,04.

4. 4.

   Un procedimiento para la producción del compuesto designado como PM181104 como se ha indicado en la reivindicación 2 o la reivindicación 3, que comprende las etapas de:

   (a) cultivar el microorganismo de la especie Kocuria (ZMA B-1/MTCC 5269) o una de sus variantes o mutantes en condiciones aerobias sumergidas en un medio nutritivo que contiene fuentes de carbono y nitrógeno para producir el compuesto PM181104,

   (b)

   aislar el compuesto PM181104 del caldo fermentado, y 5 (c) purificar el compuesto PM 181104.

5. 5. Un procedimiento como se ha indicado en la reivindicación 4, que comprende adicionalmente la etapa de convertir el compuesto designado como PM181104 en su sal farmacéuticamente aceptable.

   10 6. El procedimiento como se ha indicado en la reivindicación 4, que comprende adicionalmente la etapa de hacer reaccionar el compuesto designado como PM181104 con un ácido que tiene la fórmula RCOOH; en la que R es alquilo, cicloalquilo, arilo o heterociclilo, para obtener el compuesto de fórmula I como se ha indicado en la reivindicación 1, en la que R = alquilo, cicloalquilo, arilo y hetericiclilo.

   15 7. El compuesto como se ha indicado en la reivindicación 1, en el que R = CH3CH2CH2CO, CH3(CH2)15CH2CO o

6. 8. Una composición farmacéutica, que comprende una cantidad eficaz de un compuesto como se ha indicado en la

   reivindicación 1, con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable o un aditivo o un auxiliar. 20
7. 9. La composición farmacéutica como se ha indicado en la reivindicación 8, en la que la composición farmacéutica está en forma de un comprimido, comprimido recubierto, cápsula, gránulo, polvo, crema, pomada, gel, emulsión, suspensión o solución para inyección.

   25 10. La composición farmacéutica como se ha indicado en la reivindicación 8, en la que dicha composición está adaptada para el tratamiento de una infección bacteriana.
8. 11. La composición farmacéutica como se ha indicado en la reivindicación 10, en la que dicha infección bacteriana

   está provocada por bacterias pertenecientes a la especie Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus o Bacillus. 30
9. 12. La composición farmacéutica como se ha indicado en la reivindicación 11, en la que dichas bacterias pertenecen a la especie Staphylococcus o Enterococcus.
10. 13. La composición farmacéutica como se ha indicado en la reivindicación 12, en la que dicha bacteria perteneciente 35 a la especie Staphylococcus es resistente a la meticilina.
11. 14. La composición farmacéutica como se ha indicado en la reivindicación 12, en la que dicha bacteria perteneciente a la especie Staphylococcus es resistente a la vancomicina.

    40 15. La composición farmacéutica como se ha indicado en la reivindicación 12, en la que dicha bacteria perteneciente a la especie Enterococcus es resistente a la vancomicina.
12. 16. Uso de los compuestos como se ha indicado en la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento para

    el tratamiento de una infección bacteriana. 45