ES2449719T3

ES2449719T3 - Formulaciones farmacéuticas, procedimientos y pautas de dosificación para el tratamiento y prevención de síndromes coronarios agudos

Info

Publication number: ES2449719T3
Application number: ES04795901.0T
Authority: ES
Inventors: Charles L. Bisgaier; Wendi V. Rodrigueza; Narendra D. Lalwani; Daniel Hartman; Jan Johansson
Original assignee: Esperion Therapeutics Inc
Current assignee: Esperion Therapeutics Inc
Priority date: 2003-10-20
Filing date: 2004-10-19
Publication date: 2014-03-20
Anticipated expiration: 2024-10-19
Also published as: KR20060080227A; NO20062110L; KR20100101710A; EA010134B1; ECSP066516A; OA13272A; PA8615301A1; CA2542726C; EP1677597B1; AU2011202014B2; IL174301A0; PE20050438A1; EP1677597A4; WO2005041866A3; GEP20094601B; IL174301A; CO5690611A2; HK1093869A1; EA200600548A1; NO339456B1

Abstract

Complejo Apolipoproteína A-I Milano:1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (complejo Apo A-IM:POPC) parasu uso en un procedimiento para el tratamiento de síndromes coronarios agudos en sujeto en necesidad de losmismos, en el que dicho complejo Apo A-IM:POPC se administra en una dosis de 1 mg de proteína/kg a 100 mg deproteína/kg.

Description

Formulaciones farmacéuticas, procedimientos y pautas de dosificación para el tratamiento y prevención de síndromes coronarios agudos

1. Campo técnico

La invención proporciona nuevas formulaciones y procedimientos para tratar o prevenir síndromes coronarios agudos. En una realización preferida, las formulaciones son dosis unitarias únicas que tienen un pH, osmolalidad y pureza especificadas. En un procedimiento preferido, la formulación se administra semanalmente, mensualmente o anualmente en un intervalo de dosis de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg por administración. Además, se describen dosis y pautas de administración así como enfermedades específicas para las cuales se pretenden usar las dosis o pautas de dosificación. Las formulaciones y procedimientos emplean un complejo de Apolipoproteína A-I Milano:fosfolípido.

2. Antecedentes de la invención

La gestión y tratamiento de infarto de miocardio ha cambiado drásticamente desde la primera mitad del siglo veinte, progresando desde una era de reposo en cama y observación hasta un énfasis en tecnología, incluyendo monitorización hemodinámica y catéteres de globo, hasta una mayor atención en la terapia trombolítica. (Antman and Braunwald, “Acute Myocardial Infarction” en Heart Disease, A Textbook of Cardiovascular Medicine, 6ª edición, volumen 2, Braunwald et al., eds, 2001, W. B. Saunders Company, Filadelfía). Los enfoques terapéuticos para tratar enfermedades cardiovasculares han evolucionado en los últimos 100 años acompañados por un mayor conocimiento de la patología subyacente.

Casi todos los infartos de miocardio se originan por aterosclerosis coronaria, por lo general con trombosis coronaria superpuesta. Las placas que se acumulan lentamente pueden ser asintomáticas debido al desarrollo de vasos colaterales. No obstante, las placas ateroscleróticas, en especial las ricas en lípidos, son propensas a una ruptura de la placa abrupta. La ruptura de la placa y la lesión endotelial asociada causa la liberación de mediadores tales como A2, serotonina, difosfato de adenosina, trombina, factor activador de las plaquetas, factor tisular y radicales libres derivados del oxígeno. Estos mediadores promueven la agregación plaquetaria y la obstrucción mecánica conduciendo a formación de trombos que interfieren con el flujo sanguíneo y el aporte de oxígeno. Las interferencias persistentes y severas con el aporte de oxígeno al miocardio conducen al infarto agudo de miocardio. (Véase, Rioufol et al., 2002, Circulation 106: 804, Timmis, 2003, Heart 89: 1268-72).

La razón de ser de la farmacoterapia aterosclerótica ha sido el tratamiento crónico para prevenir o ralentizar el desarrollo de placas ateroscleróticas fundamentalmente centrándose en reducir el LDL o “colesterol malo” como objetivo terapéutico. Por ejemplo, la terapia con estatinas, ha contribuido enormemente a mejorar la salud cardiovascular; no obstante, los efectos adversos tales como rabdomiolisis, siguen siendo un impedimento. Además, las estatinas tienen poco efecto en una situación aguda, por ejemplo, reducir la placa aterosclerótica vulnerable inestable durante un episodio isquémico. El tratamiento agudo se ha basado desde hace tiempo en los trombolíticos (tales como tPA) y la intervención quirúrgica tal como angioplastia coronaria percutánea transluminal (PTCA) e injerto de revascularización aortocoronaria (CABG). Aunque los trombolíticos proporcionan un alivio reduciendo o eliminando un trombo, estos no alteran la patología subyacente. Intervenciones tales como PTCA tienen sus propios riesgos y con frecuencia no son adecuadas para pacientes con patologías agudas. Por ello, las terapias farmacológicas actuales hacen poco para ayudar a pacientes una vez que la placa inestable se presenta como un riesgo. (Véase, Newton and Krause 2002, Atherosclerosis S3: 31-38).

La terapia con HDL está emergiendo como un nuevo paradigma de tratamiento para la dislipidemia y aterosclerosis. Ello, la Apolipoproteína A-I Milano (Apo A-I Milano) ha suscitado interés debido al hallazgo paradójico de que los portadores de la forma variante de esta apolipoproteína tienen bajos niveles de HDL (“colesterol bueno”) y menor riesgo de enfermedad cardiovascular. (Véase, Franceschini et al., 1980, J. Clin. Invest. 66: 892-900, Weisgraber et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 2508-2513, Franceschini et al., 1985, Atherosclerosis 58: 159-174, Franceschini et al., 1987, Arteriosclerosis 7: 426-435). Se encontró que los homodímeros de Apo A-I Milano reducían el engrosamiento de la íntima en conejos alimentados con colesterol (Ameli et al., 1994, Circulation, 90: 1935-41 y Soma et al., 1995, Cir. Res. 76: 405-11). En ratones con deficiencia de ApoE las lesiones ateroscleróticas se redujeron por varias dosis bajas y por una dosis única alta de complejos Apo A-I Milano: lípidos (Shah et al., 1998, Circulation 97: 780-85 y (Shah et al., 2001, Circulation 103: 3047-50). La regresión de la placa en conejos también se demostró con infusiones locales aisladas de complejos de Apo A-I Milano:fosfolípido en dosis de 500 mg y 1000 mg de proteína por conejo. (Chiesa et al., 2002, Cir. Res. 90: 974-80). Las lesiones inducidas en el modelo de conejo están formadas en su mayor parte de macrófagos y no son representativas de las lesiones más complejas en seres humanos. Por tanto, no está determinado si los tratamientos análogos serían eficaces para las placas complicadas encontradas en aterosclerosis humana. (Li et al., 1999, Arterioscler Thromb Vasc Biol 19: 378-383 y (Shah et al., 2001, Circulation 103: 3047-50). Klaus et al.,; Circulation, vol. 107, 1 de enero de 2003 páginas 2551-2554, describe la administración de un complejo Apo A-IM:POP recombinante en una proporción de aproximadamente 1:1 en peso; dicho complejo también se identifica como ETC-216. Esto se hace para evitar o prevenir estenosis o restenosis después de la implantación de endoprótesis coronaria. ETC-216 se administra durante 28 días a una dosis de 100

mg/kg de peso corporal.

Todavía a pesar de la mejora en la comprensión de la patofisiología del infarto de miocardio y de los desarrollos en la terapia con HDL, se desean dosis y pautas de dosificación y formulaciones farmacéuticas eficaces y seguras para el uso profiláctico y terapéutico de Apo A-I Milano o complejos Apo A-I Milano: lípidos en seres humanos todavía.

3. Sumario de la invención

La invención describe procedimientos y formulaciones farmacéuticas para el tratamiento y prevención de síndromes agudos coronarios y la reducción o estabilización de la placa aterosclerótica, la reducción de la placa en vasos ocluidos y la promoción de la salida de colesterol. La invención incluye así dosis y pautas de dosificación para el uso de complejo Apo A-I Milano:fosfolípido y formulaciones farmacéuticas de complejo Apo A-I Milano:fosfolípido para tratar síndromes agudos coronarios. El procedimiento y las formulaciones descritas en la presente memoria causan una reducción o estabilización rápida de las placas ateroscleróticas inestables que, si se deja sin tratar o se tratan por procedimientos convencionales, pueden romperse y conducir a sucesos isquémicos que incluyen síndromes agudos coronarios.

Los solicitantes han determinado que un mimético de HLD producido de forma exógena, tal como Apo A-I Milano, preferiblemente como un complejo Apo A-I Milano:fosfolípido, ofrece un enfoque único al tratamiento y prevención de enfermedades cardiovasculares o trastornos relacionados; tales trastornos incluyen aterosclerosis, síndromes agudos coronarios, isquemia, lesión por reperfusión isquémica, angina e infarto de miocardio, o la reducción o estabilización de la placa aterosclerótica en vasos estrechados u ocluidos. Los procedimientos que incluyen las dosis y pautas de dosificación y formulaciones farmacéuticas de la invención proporcionan un tratamiento seguro, eficaz y no quirúrgico que promueve rápidamente la salida de colesterol y la movilización de las placas ateroscleróticas. La promoción de la rápida salida de colesterol reduce el volumen de ateroma en uno o más vasos afectados. Los ateromas reducidos (la masa de placa de íntima arterial engrosada degenerada que aparece en los vasos ateroscleróticos) permiten un mayor flujo sanguíneo y reduce el riesgo de isquemia, incluyendo angina inestable, infartos de miocardio y síndromes agudos coronarios.

Antes de esta invención que proporciona formulaciones farmacéuticas de Apo A-I M y dosis específicas para el tratamiento y prevención de síndromes agudos coronarios, la terapia aterosclerótica convencional se ha centrado en reducir el LDL o “colesterol malo” como objetivo terapéutico. Estas terapias convencionales de LDL, por ejemplo, el tratamiento con estatinas, pueden requerir meses de tratamiento antes de que los niveles séricos de LDL se reduzcan en un sujeto. En trastornos agudos o cardiovasculares emergentes, la terapia convencional se ha basado desde hace tiempo en la intervención quirúrgica tal como angioplastia coronaria percutánea transluminal (PTCA) e injerto de revascularización aortocoronaria (CABG). No obstante, la intervención quirúrgica está contraindicada frecuentemente en algunos pacientes en una situación emergente, en particular pacientes con mal estado de salud general. Por otro lado, estos procedimientos convencionales no proporcionan un tratamiento farmacológico eficaz no quirúrgico en una situación aguda. Por otro lado, las terapias convencionales se han centrado en el tratamiento de síntomas de enfermedad cardiovascular y síndromes agudos coronarios en especial en el sistema circulatorio. Las terapias convencionales como las que se describen anteriormente y en mayor detalle más adelante se han centrado en reducir el colesterol LDL, reducir la formación de coágulos sanguíneos y reducir la tensión arterial lo cual no trata

o previene la causa subyacente de la enfermedad cardiovascular y síndromes agudos coronarios, la estabilización, reducción y modificación de la placa en la pared del vaso.

Las formulaciones farmacéuticas y procedimientos farmacéuticos, incluyendo las dosis y pautas de dosificación proporcionadas en la presente memoria son seguras, eficaces y actúan rápidamente para reducir o estabilizar la placa aterosclerótica. Las dosis descritas en la presente memoria son de acción rápida, proporcionan una reducción de la placa aterosclerótica en tan solo unas pocas semanas promoviendo la movilización del colesterol. En ciertas realizaciones, las dosis descritas en la presente memoria se pueden usar para tratar un sujeto afectado por síndromes agudos coronarios o trastornos asociados con isquemia u oclusión de vasos. En ciertas realizaciones, la dosis descrita en la presente memoria se puede usar para prevenir la progresión de la enfermedad una vez que las placas ateroscleróticas presentan un riesgo para el sujeto. La progresión de la enfermedad prevenida puede ser la posterior oclusión de un vaso o prevenir la ruptura de una placa aterosclerótica inestable que puede conducir a estados isquémicos incluyendo síndromes agudos coronarios y lesión por reperfusión isquémica.

Los procedimientos y formulaciones farmacéuticas proporcionados en la presente memoria son tan eficaces que una única dosis de 45 mg/kg puede estimular la movilización de colesterol de una placa aterosclerótica. En ciertas realizaciones, una única dosis elevada, por ejemplo aproximadamente 45 mg/kg, del complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o de una de sus formulaciones farmacéuticas, se puede administrar a un sujeto. En ciertas realizaciones, se puede administrar una o más dosis altas del complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o una de sus formulaciones farmacéuticas, a un sujeto seguido por una o más de la misma dosis (45 mg/kg) o dosis inferiores, por ejemplo, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 15 mg/kg. Por ejemplo, se pueden administrar a un sujeto dos dosis de 45 mg/kg y luego dosis adicionales de 10 mg/kg. Además, se puede usar la pauta de administración opuesta de baja dosis seguida de alta dosis. Naturalmente, para un estado de enfermedad agudo se usan primero preferiblemente las dosis mayores. En ciertas realizaciones, se puede tratar un sujeto una vez a la semana durante varias semanas con el complejo Apo

A-I Milano:fosfolípido o una de sus formulaciones farmacéuticas y luego tratarse de un modo intermitente, por ejemplo, dos veces al año, una vez al año o cada dos años según sea necesario para mantener los vasos abiertos y no ocluidos y para reducir el riesgo de ruptura de la placa y sucesos vasculares adversos.

En ciertas realizaciones, los procedimientos para el tratamiento o prevención de síndromes agudos coronarios comprenden administrar complejos Apo A-I Milano:fosfolípido o una de sus formulaciones farmacéuticas aproximadamente cada día, aproximadamente un día sí y otro no, aproximadamente cada 3 días, aproximadamente cada 4 días, aproximadamente cada 5 días, aproximadamente cada 6 días, aproximadamente cada 7 días, aproximadamente cada 8 días a 10 días o aproximadamente cada 11 a 14 días a un sujeto que lo necesite. En una realización preferida, los complejos Apo A-I Milano: fosfolípido o sus formas farmacéuticas se pueden administrar aproximadamente cada 7 días. En ciertas realizaciones, la administración de los complejos Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas puede ser una administración de una vez. En ciertas realizaciones, la administración puede continuar durante aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7-12 semanas, aproximadamente 13-24 semanas o aproximadamente 25-52 semanas. En ciertas realizaciones preferidas, la administración de los complejos Apo A-I Milano:fosfolípido o de sus formulaciones farmacéuticas es aproximadamente cada 7 días durante aproximadamente 5 semanas. En ciertas realizaciones, la administración puede ser intermitente después de, por ejemplo, aproximadamente 5 semanas. Por ejemplo, se puede tratar un sujeto una vez a la semana durante aproximadamente 5 semanas y luego tratarlo aproximadamente 3 a 4 veces durante el año siguiente. En ciertas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente memoria se pueden administrar a un sujeto de forma intermitente para mantener la permeabilidad de un vaso. Por ejemplo, se puede administrar una dosis de aproximadamente 15 mg/kg a la administración de formulación farmacéutica aproximadamente cada 10 días durante aproximadamente 7 semanas y luego tratar, por ejemplo, aproximadamente 26 semanas después o aproximadamente 52 semanas después. En la presente memoria se describen más adelante otras realizaciones que incluyen pautas de dosificación y uso de los procedimientos en combinación con terapia farmacológica convencional e intervenciones quirúrgicas.

La invención proporciona formulaciones farmacéuticas para la administración de Apolipoproteína A-I Milano (Apo A-I Milano) para el tratamiento o prevención de síndromes agudos coronarios y lesión por reperfusión isquémica. La Apo A-I Milano está complejada con un lípido para los procedimientos descritos en la presente memoria. El lípido es 1palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (también denominado 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina o POPC). En una realización preferida, el complejo Apo A-I Milano: POPC es una formulación farmacéutica. El complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o una de sus formulaciones farmacéuticas se puede administrar en una dosis de aproximadamente 1 mg de proteína/kg a aproximadamente 100 mg de proteína/kg a un sujeto que lo necesite.

En ciertas descripciones, los procedimientos pueden comprender administrar dosis de complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o formulaciones farmacéuticas líquidas o inyectables del mismo para el tratamiento de síndromes agudos coronarios. Los complejos Apo A-I M:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas se pueden administrar en una dosis de aproximadamente 1 mg (proteína)/kg a aproximadamente 100 mg (proteína)/kg a un sujeto que lo necesite. El procedimiento puede comprender tratamiento o prevención de síndromes agudos coronarios mediante la administración de complejos Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas en una infusión intravenosa. En ciertas realizaciones, los procedimientos pueden comprender la administración como una infusión de choque intravenosa. Por infusión de choque, se pretende indicar que los complejos Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas se administran intravenosamente durante un corto período de tiempo tal como hasta 5 minutos, por ejemplo, de 2-5 minutos. En ciertas realizaciones, la administración de los complejos Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas puede comprender una infusión intravenosa continua. Infusión intravenosa continua quiere decir que los complejos Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas se administran de forma continua durante un período de tiempo mayor que 2-5 minutos, por ejemplo, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 3 horas. Las infusiones intravenosas continuas se pueden administrar con la ayuda de una bomba o dispositivo de infusión. En ciertas realizaciones, la administración del Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas puede ser una combinación de infusiones intravenosas continuas e infusiones de choque intravenosas (“dosis intravenosas de gran tamaño rápidas”) de los complejos Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas. Las dosis intravenosas de gran tamaño se pueden administrar antes, después o durante la infusión continua. En ciertas realizaciones la administración de Apo A-I Milano o complejos lipídicos o sus formulaciones farmacéuticas puede ser en combinación con otros fármacos que tratan o previenen enfermedad cardiovascular, enfermedades concomitantes o comórbidas o proporcionan un alivio sintomático. La administración de otros fármacos puede ser concurrente o secuencial.

Los procedimientos proporcionan la infusión intravenosa de las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente memoria. Se puede usar cualquier vaso adecuado para infusión, incluyendo vasos periféricos tales como los vasos en la fosa antecubital del brazo o una línea central en el tórax. En otras realizaciones preferidas, la formulación farmacéutica se infunde en el vaso cefálico o cubital medio en la fosa antecubital del brazo de un sujeto.

En ciertas realizaciones, los procedimientos pueden comprender la administración de una formulación farmacéutica del complejo Apo A-I Milano:fosfolípido en dosis altas o bajas o una combinación de las mismas. Como se describe en la presente memoria más adelante, una dosis elevada de la formulación farmacéutica durante un corto intervalo de dosificación puede reducir de forma segura y eficaz el volumen de ateroma en sujetos con vasos ocluidos total o parcialmente. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica se puede administrar antes, durante o después de una intervención quirúrgica tal como PTCA para desbloquear un vaso ocluido. En ciertas realizaciones, se pueden administrar una o más dosis intermitentes al sujeto para mantener la permeabilidad de un vaso previamente

5 ocluido (“dosis de mantenimiento”).

Esta invención describe un nuevo enfoque para el tratamiento o prevención de lesión por reperfusión isquémica, es decir, el uso de las formulaciones farmacéuticas o dosis de complejo Apo A-I Milano descrito en la presente memoria para el tratamiento de reperfusión isquémica. Dosis útiles para este tratamiento incluyen dosis de hasta 100 mg/kg del complejo Apo A-I Milano:fosfolípido administrado a un sujeto que lo necesita. Los procedimientos comprenden la 10 administración de una composición farmacéutica del complejo Apo A-I Milano:fosfolípido en una dosis de 1 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del sujeto. En realizaciones particulares, los procedimientos pueden comprender la administración de una composición farmacéutica del complejo Apo A-I Milano:fosfolípido en una dosis de 10 mg/kg a 50 mg/kg. En una realización preferida, los procedimientos pueden comprender la administración de una composición farmacéutica del complejo Apo A-I Milano:fosfolípido en una dosis específica de 15 mg/kg. En otra

15 realización preferida, los procedimientos pueden comprender la administración de una composición farmacéutica del complejo Apo A-I Milano:fosfolípido en una dosis específica 45 mg/kg. La invención incluye también preferiblemente el uso de la dosis de 15 mg/kg sola o en combinación con la dosis de 45 mg/kg. De igual modo, la dosis de 45 mg/kg se puede usar sola o en combinación con la dosis de 15 mg/kg para el tratamiento o prevención de lesión por reperfusión isquémica.

20 La formulación farmacéutica proporcionada en la presente memoria comprende un complejo Apo A-I Milano:fosfolípido de pH, osmolalidad, tonicidad, pureza y esterilidad que permite la administración segura a un sujeto. Las formulaciones farmacéuticas se pueden formular para un uso único de una vez o se pueden formular para que contengan excipientes antimicrobianos, como se describe más adelante, haciendo las formulaciones farmacéuticas adecuadas para dosis múltiples. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica puede estar en

25 jeringas prellenadas estériles o bolsas prellenadas estériles que se pueden congelar o refrigerar. En una realización preferida, el complejo Apo A-I Milano: lípido es un complejo de Apo A-I Milano:fosfolípido. En realizaciones más preferidas, el complejo Apo A-I Milano:fosfolípido es Apo A-I Milano: POPC.

En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica puede estar en envases de dosis unitaria o de unidades de uso. Como es bien conocido por los expertos en la técnica, un envase de dosis unitaria proporciona la liberación de

30 una dosis única de fármaco a un sujeto. Los procedimientos de la invención proporcionan un envase de dosis unitaria de formulación farmacéutica que comprende, por ejemplo, 1050 mg de proteína Apo A-I Milano por envase. Por ejemplo, los 1050 mg de proteína Apo A-I Milano es una cantidad que administra 15 mg/kg de Apo A-I Milano a un sujeto de 70 kg. La unidad puede ser, por ejemplo, un vial de un solo uso estéril, una jeringa prellenada estéril, bolsas prellenadas estériles (es decir, prefabricadas).

35 En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica puede ser un envase de unidades de uso. Como es conocido por los expertos en la técnica, un envase de unidades de uso es una unidad lista para el paciente con el tamaño de prescripción conveniente etiquetado para la distribución directa por el personal sanitario. Un envase de unidades de uso contiene una formulación farmacéutica en una cantidad necesaria para un intervalo de tratamiento y duración típicos para una indicación dada. Los procedimientos de la invención proporcionan un envase de unidades de uso de

40 una formulación farmacéutica que comprende, por ejemplo, complejo Apo A-I Milano:fosfolípido en una cantidad suficiente para tratar un adulto medio varón o hembra con 15 mg/kg de proteína Apo A-I Milano por vía intravenosa una vez a la semana durante 5 semanas. Así un envase de unidades de uso como el que se describe antes tendría cinco dosis de complejo Apo A-I Milano:fosfolípido (disponibles en un vial o jeringas prellenadas). En una realización, el envase de unidades de uso puede comprender una formulación farmacéutica que comprende el complejo Apo A-I

45 Milano:fosfolípido en una cantidad suficiente para tratar un adulto medio varón o hembra con una dosis de 15 mg/kg

o 45 mg/kg una vez a la semana durante 6 semanas. Será evidente para los expertos en la técnica que las dosis descritas en la presente memoria se basan en el peso corporal del sujeto.

Las formulaciones farmacéuticas se pueden etiquetar e irán provistas de un etiquetado adjunto para identificar la formulación contenida en las mismas y cualquier otra información útil para el personal sanitario y sujetos en el

50 tratamiento de síndromes agudos coronarios, incluyendo, instrucciones de uso, dosis, intervalo de dosificación, duración, indicación, contraindicaciones, advertencias, precauciones, instrucciones de manejo y almacenamiento.

4. Breve descripción de las figuras

La FIG. 1 proporciona el efecto agudo de una dosis única de ETC-216 sobre el HDL sérico en sujetos varones normales;

55 La FIG. 2(A) proporciona una extracción motorizada del catéter de visualización IVUS comenzando en una rama fiduciaria distal (sitio C) y terminando en una rama proximal (sitio A). El trayecto del catéter se ilustra en el angiograma;

La FIG. 2(B) proporciona una sección transversal representativa del vaso obtenida cada 0,5 mm hasta que se

alcanza una rama proximal; La FIG. 2(C) proporciona una sección transversal intermedia del vaso; La FIG. 2(D) proporciona la rama distal en la imagen IVUS; La FIG. 3(A) proporciona una sección transversal para análisis; La FIG. 3(B) proporciona la membrana elástica externa (EEM); La FIG. 3(C) proporciona el área de la luz; La FIG. 3(D) proporciona el cálculo del grosor máximo de ateroma medido restando el área transversal de la luz del

área de EEM; La FIG. 4(A) proporciona una imagen basal de un vaso en un paciente antes de recibir ETC-216; y La FIG. 4(B) proporciona una imagen de seguimiento en un paciente después de recibir ETC-216. El área de

ateroma se redujo desde 8,1 a 5,35 mm3 prácticamente sin cambios en el área de la luz.

La FIG. 5 proporciona un ejemplo de un protocolo en el que se trataron corazones de conejo aislados con vehículo o un complejo proteína/lípido de la invención (ETC-216) antes de iniciarse la isquemia: La FIG. 6 proporciona la actividad creatina cinasa en efluente venoso coronario; La FIG. 7 proporciona la monitorización en tiempo real de la función cardíaca obtenida de un corazón de conejo

aislado tratado con vehículo y ETC-216 en el aparato de Langendorff; La FIG. 8 proporciona los cambios temporales en la presión desarrollada ventricular izquierda (LVDP) en corazones

de conejo aislados antes, durante y después de 30 minutos de la parada isquémica total y 60 minutos de reperfusión; La FIG. 9 proporciona los cambios temporales en la presión telediastólica ventricular izquierda (LVEDP) en

corazones de conejo aislados antes, durante y después de 30 minutos de la parada isquémica total y 60 minutos de

reperfusión; La FIG. 10 proporciona los cambios temporales en la presión de perfusión coronaria (CPP) en corazones de conejo aislados antes, durante y después de 30 minutos de la parada isquémica total y 60 minutos de reperfusión;

La FIG. 11 proporciona el contenido en hidroperóxido lipídico en homogeneizados de tejido de corazones de conejo tratados con vehículo y ETC-216 sometidos a parada isquémica total durante 30 minutos seguida por 60 minutos de reperfusión;

La FIG. 12 proporciona imágenes de microscopio electrónico de muestras de músculo cardíaco de corazones de

conejo tratados con vehículo y ETC-216; La FIG. 13 proporciona un protocolo adicional de la presente invención en el que se administró un tratamiento previo antes del inicio de la isquemia en el grupo de administración aguda y se administraron dos tratamientos previos antes del inicio de la isquemia en el grupo de administración crónica;

La FIG. 14 proporciona un protocolo para la determinación del tamaño del infarto; La FIG. 15 proporciona un porcentaje de infarto del área en riesgo, porcentaje de infarto del ventrículo izquierdo y

área en riesgo porcentual del ventrículo izquierdo en conejos tratados una vez (es decir, tratamiento agudo) o tratados dos veces (es decir, tratamiento crónico) con ETC-216 (100 mg/kg) o un volumen equivalente de vehículo; La FIG. 16 proporciona un protocolo adicional de la presente invención en el que se trataron previamente conejos

antes del inicio de la isquemia con vehículo (Grupo 1) o 10, 3 o 1 mg/kg de ETC-216 (Grupo 2); La FIG. 17 proporciona el porcentaje de infarto del área en riesgo, porcentaje de infarto del ventrículo izquierdo y área en riesgo porcentual del ventrículo izquierdo determinados en conejos tratados una vez (es decir, tratamiento

agudo) con 10, 3 o 1 mg/kg de ETC-216 o con un volumen equivalente de vehículo de sacarosa-manitol para cada grupo; La FIG. 18 proporciona los cambios temporales en colesterol no esterificado con lipoproteínas; La FIG. 19 proporciona un protocolo adicional de la presente invención en el que se administró un tratamiento único

de vehículo de ETC-216 durante los últimos 5 minutos del período isquémico de 30 minutos; y La FIG. 20 proporciona el porcentaje de infarto del área en riesgo, porcentaje de infarto del ventrículo izquierdo y

área en riesgo porcentual del ventrículo izquierdo determinados en conejos.

5. Descripción detallada de la invención

5.1. Definiciones

Tal como se usa en la presente memoria, los siguientes términos tendrán los siguientes significados:

Los términos “trato” “tratar” o “tratamiento” se refieren a un procedimiento para aliviar o anular una enfermedad, trastorno y/o sus síntomas.

El término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad de Apo A-I Milano o complejo lipídico o formulación farmacéutica de los mismos suficiente para aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas de la patología o trastorno que se trata.

Los términos “previene”, “prevenir” o “prevención” se refieren a un procedimiento de impedir que un sujeto adquiera una enfermedad, trastorno y/o sus síntomas. En ciertas realizaciones, los términos “previene”, “prevenir” o “prevención” se refieren a un procedimiento para reducir el riesgo de adquirir una enfermedad, trastorno y/o sus síntomas.

El término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad de Apo A-I Milano o complejo lipídico o formulación farmacéutica de los mismos suficiente para dar lugar a la prevención, inicio o la recurrencia de uno o más de los síntomas de la patología o trastorno que se trata.

El término “síndromes agudos coronarios” se refiere a trastornos isquémicos tales como angina inestable, infarto de miocardio con onda Q y sin onda Q o se proporcionan por la Clasificación Internacional de Enfermedades, versión 9ª (ICD-9) que será sustituida por la versión 10ª (ICD-10). El infarto de miocardio puede presentarse con o sin elevación del segmento ST en el electrocardiograma.

El término “isquemia” se refiere a anemia local debida a mecanismos o espasmos, trombosis, obstrucción por estenosis (fundamentalmente estrechamiento o alteración arterial) inducidos mecánica o biológicamente del aporte sanguíneo. El término “isquemia de miocardio” se refiere a una circulación inadecuada de sangre al miocardio, normalmente como resultado de cardiopatía coronaria.

El término “reperfusión isquémica” se refiere al restablecimiento de una cantidad incrementada de sangre oxigenada al tejido.

El término “enfermedades cardiovasculares” se refiere a las enfermedades del corazón, los vasos sanguíneos y la circulación sanguínea tales como infarto de miocardio, síndrome agudo coronario, aterosclerosis, angina, lesión por reperfusión isquémica y trastornos relacionados.

El término “intervención quirúrgica” tal y como se usa en la presente memoria se refiere a procedimientos manuales, no farmacológicos u operativos. La intervención quirúrgica puede realizarse con fines diagnósticos, radiológicos, profilácticos o de tratamiento.

El término “angina inestable” se refiere a un cambio en la frecuencia, gravedad o duración de los síntomas de angina estable crónica, tal como dolor pectoral que puede radiarse hacia las mandíbulas y brazos o dolor epigástrico. La angina estable crónica es un dolor pectoral, que puede radiarse hacia las mandíbulas y brazos de un sujeto que viene inducido por ejercicio, comer y/o estrés y que se alivia con reposo sin cambios recientes en la frecuencia o intensidad de la actividad necesaria para producir los síntomas.

El término “formulación farmacéutica” se refiere bien a una composición que comprende Apo A-I Milano o bien a un complejo Apo A-I Milano: lípido y un diluyente, vehículo, portador o excipientes adecuados para la administración a un sujeto. Este término incluye composiciones orales, parenterales y tópicas, como se describen más adelante.

El término “aproximadamente” se refiere a un término relativo que indica una aproximación de más o menos el 20 % del valor nominal al que se hace referencia. Para esta descripción, este nivel de aproximación se considera apropiado a no ser que el valor que se expresa de modo específico requiera un intervalo más estrecho.

El término “etiqueta” se refiere a una presentación de forma escrita, impresa o gráfica sobre el envase inmediato de un artículo, por ejemplo, el material escrito presente en un vial que contiene un agente farmacéuticamente activo.

El término “etiquetado” se refiere a todas las etiquetas y otras formas escritas, impresas o gráficas sobre cualquier artículo o cualquiera de sus envases o envoltorios o cualquiera otro objeto que acompañe dicho artículo, por ejemplo, un prospecto, cintas de video de instrucciones o DVD de instrucciones que acompañen o vayan asociados con un envase de un agente farmacéuticamente activo.

5.2. Procedimientos de tratamiento

La invención describe procedimientos y formulaciones para el tratamiento o prevención de síndromes agudos coronarios, incluyendo angina inestable, infarto de miocardio con elevación del segmento ST e infarto de miocardio con onda Q. Se han determinado por los solicitantes dosis seguras y eficaces para las formulaciones descritas en la presente memoria para el tratamiento y prevención de síndromes agudos coronarios.

Basándonos en los conocimientos actuales, se ha creado un marco de trabajo que ha reorganizado las presentaciones clínicas, ahora denominados síndromes agudos coronarios (“ACS”). Igualmente los síndromes agudos coronarios comprenden angina inestable, infarto de miocardio con onda Q y sin elevación del segmento ST y son una causa principal de morbididad y mortalidad, en especial en las primeras 24 horas después de presentarse. (Schoenhagen et al., 2000, Circulation 101: 598-603). El ACS es una molestia isquémica que se presenta sin elevación del segmento ST en un electrocardiograma. La isquemia se desarrolla frecuentemente a angina inestable, infarto de miocardio con onda Q y sin onda Q. (Antman and Braunwald, “Acute Myocardial Infarction” en Heart Disease, A Textbook of Cardiovascular Medicine, 6ª edición, volumen 2, Braunwald et al., eds, 2001, W. B. Saunders Company, Filadelfia).

Los procedimientos y formulaciones de la presente invención describen un enfoque único y eficaz al tratamiento de aterosclerosis y síndromes agudos coronarios. En los procedimientos de la descripción, los complejos Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas proporcionan una terapia no quirúrgica que neutraliza la base patofisiológica de la enfermedad en lugar de proporcionar un alivio sintomático. Los procedimientos de la descripción proporcionan la administración de Apo A-I Milano, complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas que proporcionan terapia de HDL que promueve la salida de colesterol, neutralizan el transporte de colesterol y reducen la placa aterosclerótica. Sin pretender estar limitados por ninguna teoría, se cree que el Apo A-I Milano, complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas imitan un HDL funcional que promueve la salida de colesterol y neutraliza el transporte de colesterol, reduce el volumen de ateroma y puede estabilizar la placa aterosclerótica.

La descripción proporciona procedimientos para el tratamiento de síndromes agudos coronarios. En realizaciones preferidas, los complejos Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas, que se describen más adelante, se pueden administrar en una dosis de 1 mg (proteína)/kg a 100 mg (proteína)/kg, preferiblemente una dosis de 1 mg (proteína)/kg a 50 mg (proteína)/kg; lo más preferible, de 15 mg/kg o 45 mg/kg. Los solicitantes han demostrado que estas dosis son seguras, eficaces y son bien toleradas por los sujetos que padecen o tienen riesgo de síndromes agudos coronarios como se describe con detalle en la presente invención.

La descripción proporciona procedimientos para el tratamiento o prevención de síndromes agudos coronarios que incluyen el alivio o mejora de los signos o síntomas de síndromes agudos coronarios. En ciertas realizaciones, los procedimientos proporcionan el tratamiento o reducción de aterosclerosis coronaria. En ciertas realizaciones, los procedimientos proporcionan la promoción de la salida de colesterol de los vasos afectados. En ciertas descripciones, los procedimientos proporcionan la promoción de la neutralización del transporte de colesterol. En una descripción, los procedimientos proporcionan la reducción del volumen de ateroma en un vaso afectado. En ciertas realizaciones, el vaso afectado es una arteria coronaria. El volumen de ateroma se puede determinar, como se describe en la presente memoria, por ecografía intravascular (IVUS). En ciertas descripciones, los procedimientos proporcionan una reducción en el volumen total de placa de un vaso afectado. En ciertas descripciones, los procedimientos proporcionan una reducción en el grosor máximo medio en un vaso afectado. En ciertas descripciones, los procedimientos proporcionan una reducción en el grosor máximo medio de ateroma. En ciertas descripciones, los procedimientos proporcionan una reducción en el volumen de placa en el área porcentual mínima de placa. En ciertas descripciones, los procedimientos proporcionan una reducción en el volumen de placa en la área porcentual máxima de placa. En ciertas descripciones, los procedimientos proporcionan un incremento en el diámetro luminal coronario medio en un vaso afectado. En ciertas descripciones, el sujeto que recibe los procedimientos y formulaciones de la invención puede padecer lesiones angiográficas reducidas al compararlo con sujetos que no reciben los procedimientos y formulaciones de la invención. En ciertas descripciones, los procedimientos proporcionan una regresión en lesiones ya existentes. En ciertas descripciones, los procedimientos y formulaciones farmacéuticas proporcionan conseguir la permeabilidad de un vaso ocluido o mantener la permeabilidad de un vaso ocluido.

En ciertas realizaciones, dosis de complejo Apo A-I Milano:fosfolípido de 15 mg/kg a 45 mg/kg proporcionan una reducción media porcentual en el volumen de ateroma del 2 %, del 1 % o del 0,05 %. En ciertas realizaciones dosis de complejo Apo A-I Milano:fosfolípido de 15 mg/kg a 45 mg/kg proporcionan una reducción en el volumen de ateroma de 20 mm3, 15 mm3, 10 mm3 o 5 mm3. En ciertas realizaciones, dosis de complejo Apo A-I Milano:fosfolípido de 15 mg/kg a 45 mg/kg proporcionan una reducción media porcentual en el grosor máximo de ateroma de -0,039 mm, -0,044 mm.

En una descripción, los procedimientos proporcionan el tratamiento de síndromes agudos coronarios en sujetos con signos o síntomas de síndromes agudos coronarios. En una descripción, los sujetos pueden tener signos y/o síntomas de isquemia de miocardio, por ejemplo, dolor pectoral, en mandíbulas, brazos o región epigástrica, palpitaciones, falta de aliento, diaforesis, nauseas y/o vómitos. En otra realización los procedimientos proporcionan el tratamiento de síndromes agudos coronarios en sujetos que presentan signos y síntomas de síndromes agudos coronarios en combinación con cambios en el electrocardiograma (“ECG” o “EKG”), tales como elevaciones del

segmento ST, cambios en la onda T tales como inversiones, aumentos en la fracción de creatina cinasa, troponina I

o proteína C reactiva.

En una realización, los procedimientos proporcionan la prevención de síndromes agudos coronarios en sujetos que tienen riesgo de desarrollar síndromes agudos coronarios. Los sujetos con riesgo incluyen, sujetos de edades variables (por ejemplo, 18-24, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80 o aproximadamente 90 años), sujetos con una historia familiar de enfermedad cardiovascular o predisposición genética a enfermedad cardiovascular, sujetos que padecen diabetes, hipertensión, afección de varios vasos o del tronco común izquierdo o que han sufrido un infarto de miocardio previo.

Se sobreentiende por los expertos en la técnica que la dosis real de las formulaciones de la invención puede variar con la altura, peso, edad, gravedad de la enfermedad del sujeto, la presencia de patologías concomitantes y similares. Por ejemplo, un sujeto anciano con la función renal o hepática comprometida se puede tratar con una dosis de complejo Apo A-I Milano:lípido que está en el intervalo inferior de la dosis de aproximadamente 1 mg/kg (por ejemplo, 0,8 mg/kg o 0,9 mg/kg). Un sujeto con síndromes agudos coronarios graves que es obeso con buena función renal y hepática se puede tratar con una dosis de complejo Apo A-I Milano: lípido que está, por ejemplo, en el intervalo superior de la dosis de aproximadamente 100 mg/kg (por ejemplo, 120 mg/kg, 119 mg/kg, 118 mg/kg, 115 mg/kg y similares). La dosificación de las formulaciones descritas en la presente memoria ha demostrado ser eficaz para conseguir el propósito deseado. Estas dosis alcanzan un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la dosis eficaz con un perfil aceptable de riesgo frente a beneficios.

La invención describe procedimientos para tratar o prevenir síndromes agudos coronarios con una pauta de administración de dosis suficiente para tratar síndromes agudos coronarios en un sujeto que necesite dicho tratamiento. En ciertas realizaciones, el complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o una de sus formulaciones farmacéuticas, como se describe más adelante, se puede administrar cada día, en días alternos, cada 3 días, cada 4 días, cada 5 días, cada 6 días, cada 7 días, cada 8-10 días o cada 11-14 días. A este período de tiempo se hace referencia también como intervalo de dosificación o intervalo. En ciertas realizaciones el intervalo de dosificación puede ser cada mes, cada seis meses, cada 12 meses, cada 18 meses o cada 24 meses. En realizaciones preferidas, el complejo Apo A-I Milano:lípido o una de sus formulaciones farmacéuticas se puede administrar cada 7 días. En ciertas realizaciones, la administración de complejos Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas puede ser una administración de una vez. En ciertas realizaciones, la administración puede prolongarse durante 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7-12 semanas, 13-24 semanas, 52 semanas o prolongarse durante la vida del sujeto. A este período de tiempo también se le denomina duración de dosificación, duración del tratamiento o duración. Así, una pauta de administración de dosis puede ser, por ejemplo, una formulación farmacéutica de un complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o una de sus formulaciones farmacéuticas administrada cada 7 días durante 6 semanas. En ciertas realizaciones, el intervalo de dosificación puede continuar de forma intermitente después de aproximadamente 52 semanas. Por ejemplo, se puede tratar un sujeto una vez a la semana durante 52 semanas y luego tratarlo 3 a 4 veces durante el año siguiente. En ciertas realizaciones preferidas, la administración de una formulación farmacéutica que comprende complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o de sus formulaciones farmacéuticas es cada 7 días durante 5 semanas. Dentro del alcance de la invención se encuentran otras pautas de administración de dosis que usan diversos intervalos de dosificación y duraciones como se describe en la presente memoria.

La dosis de complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o una de sus formulaciones farmacéuticas puede variar durante la duración del tratamiento. Por ejemplo, se puede tratar un sujeto con 45 mg/kg de una formulación farmacéutica de un complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o una de sus formulaciones farmacéuticas una vez a la semana durante 3 semanas y luego tratarse con 15 mg/kg de una formulación farmacéutica de un complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o una de sus formulaciones farmacéuticas una vez cada cuatro meses o una vez al año durante el resto de la vida del sujeto. Dichas dosis intermitentes se pueden administrar para mantener la permeabilidad de un vaso. Dosis intermitentes durante la vida del sujeto para mantener un volumen de ateroma reducido y una mayor luz del vaso están dentro del alcance de la invención.

Los procedimientos y formulaciones de la presente descripción se pueden usar en combinación con intervención quirúrgica, es decir, antes, durante o después de cirugía. La intervención quirúrgica puede incluir angioplastia, ecografía intravascular, injerto de revascularización aortocoronaria (CABG), angiografía coronaria, implantación de endoprótesis vasculares (“stents”), intervención coronaria percutánea (PCI) y/o estabilización de placas. En ciertas descripciones los procedimientos proporcionan la dosificación de complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas antes o después de la intervención quirúrgica para abrir el vaso ocluido, o reducir la placa aterosclerótica en un vaso. Intervención quirúrgica se refiere a procedimientos manuales, no farmacológicos u operativos usados para diagnóstico, visualización (radiología), prevenir o tratar la enfermedad o una patología. Por ejemplo la ecografía intravascular (IVUS) y la angiografía coronaria son procedimientos que pueden proporcionar una valoración cuantitativa de la placa (fines diagnósticos), la angiografía puede proporcionar imágenes de los vasos (fines radiológicos) y la angioplastia puede abrir un vaso ocluido (fines de tratamiento). Todos están incluidos como intervenciones quirúrgicas tal y como se usa en la presente memoria.

5.3. Apolipoproteína A-I Milano

En un aspecto, la presente invención describe procedimientos y formulaciones para el tratamiento, reducción o prevención de lesiones originadas por síndromes agudos coronarios administrando una formulación que comprende Apo A-I Milano.

Apo A-I Milano humana es una variante natural de Apo A-I (Weisgraber et al. 1980, J. Clin. Invest. 66: 901-907). En Apo A-I Milano, el aminoácido arginina (Arg173) está reemplazado por el aminoácido cisteína (Cys173). Debido a que Apo A-I Milano contiene un residuo cisteína por cadena polipeptídica, puede existir en forma de monómero, homodímero o heterodímero. (Véase la patente de Estados Unidos número 5.876.968). Estas formas son químicamente intercambiables y el término Apo A-I Milano no discrimina entre estas formas. A nivel de ADN, la forma variante se origina de una sustitución de C a T en la secuencia génica, es decir, el codon CGC cambia a TGC, permitiendo el traslado de una cisteína (Cys) en lugar de arginina (Arg) en la posición de aminoácido 173.

En ciertas realizaciones, Apo A-I Milano puede ser una variante o Apo A-I Milano sustituida de forma conservadora. Mediante una sustitución conservadora se indica que ciertos residuos de aminoácidos de Apo A-I Milano pueden estar reemplazados con otros residuos de aminoácidos sin que afecten de una forma significativamente perjudicial la actividad de la proteína. Así, la presente invención también contempla las formas sustituidas o alteradas de Apo A-I Milano en las que al menos un residuo de aminoácido definido en la estructura está sustituido con otro residuo de aminoácido. A efectos de determinar las sustituciones de aminoácidos conservadoras, los aminoácidos se pueden clasificar de forma conveniente en dos categorías principales -hidrófilos e hidrófobos-dependiendo fundamentalmente de las características fisicoquímicas de la cadena lateral de aminoácidos. Estas dos categorías principales se pueden clasificar a su vez en subcategorías que definen de un modo más preciso las características de las cadenas laterales de aminoácidos. Por ejemplo, la clase de aminoácidos hidrófilos se puede subdividir en aminoácidos ácidos, básicos y polares. La clase de aminoácidos hidrófobos se puede subdividir a su vez en aminoácidos apolares y aromáticos. Las definiciones de las diversas categorías de aminoácidos que definen la estructura (I) son las siguientes:

“Aminoácido hidrófilo” se refiere a un aminoácido que presenta un carácter hidrófobo menor que cero de acuerdo con la escala de hidrofobicidad normalizada consensuada de Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179: 125-142. Aminoácidos hidrófilos codificados genéticamente incluyen Thr (T), Ser (S), His (H), Glu (E), Asn (N), Gln (O), Asp (D), Lys (K) y Arg (R).

“Aminoácido ácido” se refiere a un aminoácido hidrófilo que tiene un valor de pK en la cadena lateral menor que 7. Aminoácidos ácidos tienen de forma típica cadenas laterales cargadas negativamente a pH fisiológicos debido a la pérdida de un ion hidrógeno. Aminoácidos ácidos codificados genéticamente incluyen Glu (E) y Asp (D).

“Aminoácido básico” se refiere a un aminoácido hidrófilo que tiene un valor de pK en la cadena lateral mayor que 7. Aminoácidos básicos tienen de forma típica cadenas laterales cargadas positivamente a pH fisiológicos debido a la asociación con un ion hidronio. Aminoácidos básicos codificados genéticamente incluyen His (H), Arg (R) y Lys (K).

“Aminoácido polar” se refiere a un aminoácido hidrófilo que tiene una cadena lateral que no está cargada a pH fisiológico, pero que tiene al menos un enlace en el que la pareja de electrones compartida en común por dos átomos es mantenida más cerca por uno de los átomos. Aminoácidos polares codificados genéticamente incluyen Asn (N), Gln (Q), Ser (S) y Thr (T).

“Aminoácido hidrófobo” se refiere a un aminoácido que presenta un carácter hidrófobo mayor que cero de acuerdo con la escala de hidrofobicidad normalizada consensuada de Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179: 125-142. Aminoácidos hidrófobos codificados genéticamente incluyen Pro (P), Ile (I), Phe (F), Val (V), Leu (L), Trp (W), Met (M), Ala (A), Gly (G) y Tyr (Y).

“Aminoácido aromático” se refiere a un aminoácido hidrófobo con una cadena lateral que tiene al menos un anillo aromático o heteroaromático. El anillo aromático o heteroaromático puede contener uno o más sustituyentes tales como -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -NO, -NH2, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)NRR y similares donde cada R es de forma independiente alquilo (C1-C6), alquilo (C1-C6) sustituido, alquenilo (C1-C6), alquenilo (C1-C6) sustituido, alquinilo (C1-C6), alquinilo (C1-C6) sustituido, arilo (C5-C20), arilo (C5-C20) sustituido, alquilarilo (C6-C26), alquilarilo (C6-C26) sustituido, heteroarilo de 5 a 20 miembros, heteroarilo de 5 a 20 miembros sustituido, alquilheteroarilo de 6 a 26 miembros o alquilheteroarilo de 6 a 26 miembros sustituido. Aminoácidos aromáticos codificados genéticamente incluyen Phe (F), Tyr (Y) y Trp (W).

“Aminoácido no polar” se refiere a un aminoácido hidrófobo que tiene una cadena lateral que no está cargada a pH fisiológico y que tiene enlaces en los que la pareja de electrones compartida en común por dos átomos está por lo general mantenida por igual por cada uno de los dos átomos (es decir, la cadena lateral no es polar). Aminoácidos no polares codificados genéticamente incluyen Leu (L), Val (V), Ile (I), Met (M), Gly (G) y Ala (A).

“Aminoácido alifático” se refiere a un aminoácido hidrófobo que tiene una cadena lateral hidrocarbonada alifática. Aminoácidos alifáticos codificados genéticamente incluyen Ala (A), Val (V), Leu (L) e Ile (I).

El residuo de aminoácido Cys (C) no es habitual porque puede formar puentes disulfuro con otros residuos Cys (C) u otros aminoácidos que contienen sulfanilo. La capacidad de los residuos Cys (C) (y otros aminoácidos con cadenas laterales que contienen -SH) para presentarse en un péptido en cualquiera de las formas libre reducida -SH u oxidada con puentes disulfuro se ve afectada si los residuos Cys (C) contribuyen al carácter hidrófobo o hidrófilo neto para un péptido. Aunque Cys (C) presenta un carácter hidrófobo de 0,29 de acuerdo con la escala normalizada consensuada de Eisenberg (Eisenberg, 1984, supra), se sobreentiende que a efectos de la presente invención Cys

5 (C) se clasifica como aminoácido hidrófilo polar, independientemente de las clasificaciones generales definidas antes.

Como se apreciará por los expertos en la técnica, las categorías definidas antes no son mutuamente excluyentes. Así, aminoácidos que tienen cadenas laterales que presentan dos o más propiedades fisicoquímicas se pueden incluir en varias categorías. Por ejemplo, cadenas laterales de aminoácidos que tienen restos aromáticos que están

10 además sustituidos con sustituyentes polares tales como Tyr (Y), pueden presentar tanto propiedades hidrófobas aromáticas como propiedades polares o hidrófilas y por tanto, se pueden incluir en ambas categorías, aromáticos y polares. La clasificación apropiada de cualquier aminoácido será evidente para los expertos en la técnica, en especial a la vista de la descripción detallada aportada en la presente memoria. En ciertas realizaciones, la forma sustituida o alterada de Apo A-I Milano no es Apo A-I.

15 Apo A-I Milano utilizada en la invención se puede obtener a partir de cualquier fuente disponible. Por ejemplo, Apo A-I Milano puede ser Apo A-I Milano recombinante, sintética, semisintética o purificada. En una realización preferida, Apo A-I Milano puede ser una proteína recombinante (rApo A-I Milano) expresada en levadura o E. coli como se describe en la patente de Estados Unidos número 5.721.114 y en las patentes europeas EP 0 469 017 y EP 0 267

703. Procedimientos para obtener Apo A-I Milano, utilizada por la invención son bien conocidos en la técnica. Por

20 ejemplo, se puede separar Apo A-I Milano de plasma, por ejemplo, por centrifugación por gradiente de densidad seguido por la eliminación de lípidos de la lipoproteína, reducción, desnaturalización y cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico, hidrófoba, por ejemplo, fenilsefarosa, cromatografía de interacción o cromatografía de inmunoafinidad o producirse de forma sintética, semisintética o usando técnicas de ADN recombinante conocidas por los expertos en la técnica y la posterior purificación familiar para los expertos en la

25 técnica. (Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números. 6.107.467; 6.559.284; 6.423.830; 6.090.921; 5.834.596; 5.990.081; 6.506.879, Mulugeta et al., 1998, J. Chromatogr. 798(1-2): 83-90; Chung et al., 1980, J. Lipid Res. 21(3): 284-91; Chung et al., 1987, J. Lipid Res. 28(8): 913-29; Persson, et al., 1998, J. Chromatogr. 711: 97-109; patentes de Estados Unidos números 5.059.528, 5.834.596, 5.876.968 y 5.721.114; y las publicaciones PCT WO 86/04920 y WO 87/02062).

30 Si la Apo A-I Milano se obtiene de fuentes naturales, esta se puede obtener de cualquier animal de cualquier especie. En ciertas realizaciones, Apo A-I Milano se puede obtener de un mamífero. En ciertas realizaciones, Apo A-I Milano se puede obtener de un ser humano. En realizaciones preferidas de la invención, Apo A-I Milano se obtiene de la misma especie que el sujeto al que se administra Apo A-I Milano. En una realización preferida, Apo A-I Milano es una proteína Apo A-I Milano recombinante (rApo A-I Milano).

35 5.4. Procedimientos de administración

Los complejos Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas se pueden administrar por cualquier vía adecuada conocida por los expertos en la técnica que garantice la biodisponibilidad en circulación. Se puede usar cualquier vía de administración que proporcione una cantidad terapéuticamente eficaz de las formulaciones de la invención. La vía de administración puede estar indicada por el tipo de formulación farmacéutica. Por ejemplo, se

40 pueden administrar formulaciones inyectables por vía parenteral, incluyendo, inyecciones intravenosas (IV), intramusculares (IM), intradérmicas, subcutáneas (SC), intracoronarias, intrarteriales, pericardiales, intrarticulares e intraperitoneales (IP). (Véase, por ejemplo, Robinson et al., 1989, en: Pharmacotherapy: A Pathophysiologic Approach, Capítulo. 2, páginas 15-34).

En una realización preferida, los complejos Apo A-I Milano:fosfolípido o sus formulaciones farmacéuticas se pueden

45 administrar por vía parenteral. En una realización más preferida, la administración parenteral es intravenosa. Una administración intravenosa puede presentarse en forma de inyección de gran tamaño, por ejemplo, administrada durante aproximadamente 2-3 minutos o mediante infusión continua, por ejemplo, por medio de una bomba durante aproximadamente 1 hora o infundida de forma continua durante aproximadamente 24 horas. En una realización preferida, la infusión puede realizarse durante aproximadamente 1 a aproximadamente 3 horas.

50 Los procedimientos proporcionan la infusión intravenosa de la formulación farmacéutica descrita en la presente memoria. Se puede usar cualquier vaso adecuado como sitio de infusión, incluyendo vasos periféricos tales como los vasos de la fosa antecubital del brazo o una línea central en el tórax. En realizaciones preferidas, la formulación farmacéutica se infunde en el vaso cefálico o cubital medio en la fosa antecubital del brazo de un sujeto.

En ciertas realizaciones, la administración puede realizarse por medio de una bomba mecánica o dispositivo de

55 administración, por ejemplo un dispositivo de liberación pericárdico (PerDUCER®) o máquina de derivación cardiopulmonar.

5.5 Complejos lipídicos

En ciertas realizaciones, los procedimientos de la invención comprenden la administración de complejos lipídicos de

Apo A-I Milano. En ciertas realizaciones, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas de complejos Apo A-I Milano:fosfolípido. La eficacia se puede mejorar complejando lípidos con Apo A-I Milano. De forma típica, el lípido se mezcla con Apo A-I Milano antes de la administración. Apo A-I Milano y los lípidos se pueden mezclar en una solución acuosa en relaciones apropiadas y se pueden complejar por procedimientos bien conocidos en la técnica que incluyen liofilización, solubilización con detergente seguido por diálisis, microfluidización, ultrasonidos y homogeneización. La eficiencia del complejo se puede optimizar, por ejemplo, variando la presión, frecuencia de los ultrasonidos o concentración de detergente. Un ejemplo de un detergente usado corrientemente para preparar complejos Apo A-I Milano:fosfolípido es colato sódico.

En algunos casos se prefiere administrar Apo A-I Milano sola, básicamente exenta de lípidos, para tratar o prevenir síndromes agudos coronarios. En realizaciones preferidas, el complejo Apo A-I Milano:lípido se administra a un sujeto que lo necesite.

En una realización, el complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o una de sus formulaciones farmacéuticas puede estar en solución con un diluyente farmacéutico apropiado. En otra realización, se pueden hidratar o reconstituir con un diluyente farmacéutico apropiado antes de la administración preparaciones liofilizadas o secadas por congelación de complejos Apo A-I Milano:fosfolípido. En otra realización, el complejo Apo A-I Milano:lípido puede ser una preparación congelada que se descongela hasta que se consigue una solución homogénea antes de la administración a un sujeto que lo necesite.

El lípido es 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidilcolina (“POPC”) o (“1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina”). En otra realización más preferida, el complejo Apo A-I Milano: POPC comprende una relación aproximadamente uno a uno en peso de Apo A-I Milano: POPC. En una realización más preferida, el complejo Apo A-I Milano: POPC es una formulación farmacéutica. Al complejo Apo A-I Milano:POPC se hace referencia como ETC-216.

El complejo que comprende Apo A-I Milano y un lípido puede comprender cualquier cantidad de lípido y cualquier cantidad de Apo A-I Milano eficaz para tratar o prevenir síndromes agudos coronarios. En ciertas realizaciones, Apo A-I Milano puede comprender un complejo de Apo A-I Milano y fosfolípido en una relación de aproximadamente uno a aproximadamente uno en peso. Sin embargo, Apo A-I Milano puede comprender complejos con otras relaciones de fosfolípido a Apo A-I Milano tal como aproximadamente 100:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:10 y aproximadamente 1:100 (peso de proteína/peso de lípido). Se prefiere una relación en peso de aproximadamente 1:0,5 a aproximadamente 1:3 (peso de proteína/peso de lípido), más preferiblemente una relación de aproximadamente 1:0,8 a aproximadamente 1:1,2 (peso de proteína/peso de lípido), para producir la población más homogénea posible y a efectos de producir lotes estables y reproducibles. En una realización incluso más preferida, la relación de Apo A-I Milano a fosfolípido es 1:0,95 (peso de proteína/peso de lípido).

5.6. Preparación de complejos lipídicos

Los complejos Apo A-I Milano:lípido se pueden preparar por cualquier procedimiento conocido por un experto en la técnica. En algunos casos es deseable mezclar el lípido y Apo A-I Milano antes de la administración. Los lípidos pueden estar en solución o en la forma de liposomas o emulsiones formadas usando técnicas convencionales tales como homogeneización, homogeneización por ultrasonidos o extrusión. La homogeneización por ultrasonidos se lleva a cabo por lo general con un homogeneizador ultrasónico, tal como un homogeneizador ultrasónico Branson, en un baño de hielo. De forma típica, la suspensión se somete a varios ciclos de ultrasonidos. La extrusión se puede llevar a cabo mediante extrusoras de biomembranas, tales como Lipex Biomembrane ExtruderTM (Lipex Biomembrane Extruder, Inc. Vancouver, Canadá). Tamaños de poro definidos en los filtros de extrusión pueden generar vesículas liposomales unilamelares de tamaños específicos. Los liposomas también se pueden formar por extrusión a través de un filtro cerámico asimétrico, tal como un Ceraflow MicrofilterTM, disponible de forma comercial de Norton Company, Worcester Mass. o a través de un filtro de policarbonato u otros tipos de materiales polimerizados (es decir, plásticos) conocidos por los expertos en la técnica.

Se puede preparar un complejo Apo A-I Milano:lípido en una diversidad de formas, incluyendo, aunque sin quedar limitados a vesículas, liposomas o proteoliposomas. Se pueden usar una diversidad de procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica para preparar los complejos Apo A-I Milano:lípido. Se pueden usar una serie de técnicas disponibles para preparar liposomas o proteoliposomas. Por ejemplo se puede tratar con ultrasonidos Apo A-I Milano conjuntamente (usando un baño ultrasónico o una sonda ultrasónica) con el lípido apropiado para formar complejos lipídicos. En ciertas realizaciones, se puede combinar Apo A-I Milano con vesículas lipídicas preformadas dando lugar a la formación espontánea de un complejo apolipoproteína:lípido. En otra realización, Apo A-I Milano también puede prepararse por un procedimiento de diálisis con detergente; por ejemplo, se puede dializar una mezcla de Apo A-I Milano, lípido y un detergente tal como colato para eliminar el detergente y reconstituir para preparar los complejos lipídicos. (Véase, por ejemplo, Jonas et al., 1986, Methods Enzymol. 128, 553-82).

En otra realización, los complejos lipídicos se pueden preparar por liofilización combinada, como se describe en las patentes de Estados Unidos números 6.287.590 y 6.455.088. Se describen otros procedimientos, por ejemplo, en las

patentes de Estados Unidos números 6.004.925, 6.037.323 y 6.046.166. Para los expertos en la técnica serán evidentes otros procedimientos para preparar complejo Apo A-I Milano:lípido.

En una realización preferida, los complejos lipídicos se pueden preparar por homogeneización. En realizaciones preferidas, la preparación de los complejos Apo A-I Milano:lípido comienza cuando se diluye Apo A-I Milano recombinante hasta una concentración de 15 mg/ml en solución con agua para inyección. Se añade fosfato sódico hasta una concentración final de fosfato de 9-15 mM y para ajustar el pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,8. Se añade manitol para conseguir una concentración de aproximadamente 0,8 % a aproximadamente 1 % de manitol (p/v). A continuación se añade POPC para conseguir una mezcla de aproximadamente 1:0,95 (peso de proteína/peso de lípido) de dímero Apo A-I Milano a POPC. La mezcla se agita a 5000 rpm durante aproximadamente 20 minutos usando un agitador superior y una Ultra Turrax, manteniendo la temperatura de 37 ºC a 43 ºC. El recipiente de alimentación se agita continuamente a 300 rpm mientras se mantiene la temperatura de 32 ºC a 43 ºC con intercambiadores de calor en línea (Avestin, Inc.). Se lleva a cabo una homogeneización durante los 30 primeros minutos a 50 MPa y seguidamente, se mantiene la presión a 80-120 MPa hasta que el ensayo en proceso por cromatografía de exclusión molecular demuestra que el AUC % es > 70 % entre los patrones de proteína. Los complejos también se pueden preparar como formulaciones de 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml y 14 mg/ml en las que el peso es el de la proteína.

5.7. Terapia de combinación

La Apo A-I Milano o los complejos con lípidos o sus formulaciones farmacéuticas se pueden usar solos o en terapia de combinación con otras intervenciones en los procedimientos de la presente invención. Tales terapias incluyen, aunque sin quedar limitadas a las mismas, la administración simultánea o secuencial de otros fármacos.

En ciertas realizaciones, los procedimientos y formulaciones de la invención se pueden usar en combinación con otros fármacos para conseguir los procedimientos proporcionados en la presente memoria. La administración conjunta de otro fármaco puede realizarse para tratar, prevenir o aliviar enfermedades, patologías, trastornos o síntomas asociados, por ejemplo, fármacos antiarrítmicos administrados para tratar la arritmia coexistente. En ciertas realizaciones, los procedimientos proporcionan la administración conjunta de fármacos para tratar o prevenir el dolor asociado con síndromes agudos coronarios.

Como se ha descrito antes, la terapia convencional para sucesos isquémicos, incluyendo infarto de miocardio, angina y síndromes agudos coronarios no ha estado enfocada a la patología subyacente de placas ateroscleróticas rotas o inestables. Por ejemplo, un sujeto que presenta malestar torácico cardíaco u otros síntomas isquémicos se puede preparar para una intervención coronaria percutánea (PCI) urgente con fármacos anticoagulantes o antitrombóticos tales como aspirina, clopidogrel, heparina, eptifibatida o abciximab. Se pueden administrar bloqueantes beta-adrenérgicos (!-bloqueantes) para reducir la frecuencia cardíaca. La administración de inhibidores de la enzima conversora de la angiotensiona (inhibidores de la ECA) está recomendada para sujetos que padecen insuficiencia cardíaca congestiva concomitante (CHF) o disfunción ventricular izquierda (LV). Para sujetos que han sido reanimados de una muerte cardíaca súbita, se recomienda la administración de amiodarona. Con frecuencia se administra oxígeno al sujeto, por lo general mediante una máscara o cánula nasal y las constantes vitales se monitorizan estrechamente, incluyendo la saturación de oxígeno a través de oximetría de pulso. Para tratamientos de larga duración, con frecuencia se administran estatinas de inhibidor de HMGCoA reductasa al sujeto para reducir los niveles de LDC.

Por ejemplo, se puede administrar Apo A-I Milano o complejo lipídico o sus formulaciones farmacéuticas con otros fármacos farmacéuticamente activos que incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos antagonistas alfa/beta adrenérgicos, agentes antiadrenérgicos, antagonistas alfa-1 adrenérgicos, antagonistas beta adrenérgicos, activadores de AMP cinasa, inhibidores de la enzima conversora de la angiotensina (ECA), antagonistas del receptor de angiotensina II, bloqueantes del canal de calcio, agentes antiarrítmicos, vasodilatadores, nitratos, vasopresores, agentes inotrópicos, diuréticos, agentes anticoagulantes, agentes antiagregantes plaquetarios, agentes trombolíticos, agentes antidiabéticos, antioxidantes, antiinflamatorios, secuestrantes de ácidos biliares, estatinas, inhibidores de la proteína de transferencia de ésteres de colesterol (CETP), agentes hipocolesterolémicos/reguladores lipídicos, fármacos que bloquean la conversión del ácido araquidónico, terapia de reposición de estrógenos, análogos de ácidos grasos, inhibidores de la síntesis de ácidos grasos, fibratos, histidina, derivados del ácido nicotínico, agonistas o antagonistas del receptor activador proliferador de peroxisomas, inhibidores de la oxidación de ácidos grasos, talidomida o tiazolidindionas (Drug Facts and Comparisons, actualizado mensualmente, enero de 2003, Wolters Kluwer Company, St. Louis, Mo.; Physicians Desk Reference (56ª edición, 2002) Medical Economics).

Otros fármacos solos o en combinación, que se pueden añadir a, o pueden tener efectos sinérgicos con las propiedades beneficiosas de los complejos lipídicos de Apo A-I Milano o sus formulaciones farmacéuticas incluyen: Antagonistas Alfa/Beta Adrenérgicos (“!-bloqueantes”) tales como carvediol, (Coreg®); labetalol HCl, (Normodyne®); agentes antiadrenérgicos tales como guanadrel, (Hylorel®); guanetidina, (Ismelin®); reserpina, clonidina, (Catapres® y Catapres-TTS®); guanfacina, (Tenex®); guanabenz, (Wytensin®); metildopa y metildopato, (Aldomet®); Antagonistas Alfa-1 Adrenérgicos tales como doxazosina, (Cardura®); prazosina, (Minipress®); terazosina, (Hytrin®); y fentolamina, (Regitine®); Antagonistas Beta Adrenérgicos tales como sotalol, (Betapace AF® y Betapace®); timolol, (Blocadren®);

propranolol, (InderalLA® e Inderal®); betaxolol, (Kerlone®); acebutolol, (Sectral®); atenolol, (Tenormin®); metoprolol, (Lopressor® y Toprol-XL®); bisoprolol, (Zebata®); carteolol, (Cartrol®); esmolol, (Brevibloc®); naldolol, (Corgard®); penbutolol, (Levatol®); y pindolol, (Visken®); activadores de la AMP cinasa tales como ESP 31015, (ETC-1001); ESP 31084, ESP 31085, ESP 15228, ESP 55016 y ESP 24232; gemcabeno (PD 72953 y CI-1027); y MEDICA 16; 5 Inhibidores de la Ezima Conversora de la Angiotensina (ECA) tales como quinapril, (Accupril®); benazepril, (Lotensin®); captopril, (Capoten®)); enalapril, (Vasotec®); ramipril, (Altace®); fosinopril (Monopril®); moexipril, (Univasc®); lisinopril, (Prinivil® y Zestril®); trandolapril, (Mavik®), perindopril, (Aceon®); y Antagonistas del Receptor de Angiotensina II tales como candesaartán, (Atacand®); irbesartán, (Avapro®); losartán, (Cozaar®); valsartán, (Diovan®); telmisartán (Micardis®); eprosartán, (Tevetan®); y olmesartán, (Benicar®); Bloqueantes del Canal de Calcio tales como nifedipino, (Adalat®, Adalat CC®, Procardia® y Procardia XL®); verapamilo, (Calan®, CalanSR®, Covera-HS®, IsoptinSR®, Verelan® y VerelanPM®); diltiazem, (Cardizem®, CardizemCD® y Tiazac®); nimodipino, (Nimotop®); amlodipino, (Norvasc®); felodipino, (Plendil®); nisoldipino, (Sular®); bepridil, (Vascor®); isradipino, (DynaCirc®); y nicardipino, (Cardene®); Antiarrítmicos tales como diversas quinidinas; procainamida, (Pronestyl® y Procan®); lidocaína, (Xylocalne®); mexilitina, (Mexitil®); tocainida, (Tonocard®); flecainida, (Tambocor®); propafenona 15 (Rythmol®), moricizina, (Ethmozine®); ibutilida, (Covert®); disopiramida, (Norpace®); bretilio, (Bretylol®); amiodarona, (Cordarone®); adenosina, (Adenocard®); dofetilida (Tikosyn®); y digoxina, (Lanoxin®); Vasodilatadores tales como diazoxida, (Hyperstat IV®); hidralazina, (Apresoline®); fenoldopam, (Corolpam®); minoxidil, (Loniten®); y nitroprusiato, (Nipride®); Nitratos tales como dinitrato de isosorbida; (Isordil® y Sorbitrate®); mononitrato de isosorbida, (Imdur®, Ismo® y Monoket®); pasta de nitroglicerina, (Nitrol®); diversos parches de nitroglicerina; nitroglicerina SL, (Nitrostat®), pulverizadores nitrolinguales; y nitroglicerina IV, (Tridil®); Vasopresores tales como norepinefrina, (Levophed®); y fenilefrina, (Neo-Synephrine®); Agentes Inotróficos tales como amrinona; (Inocor®); dopamina, (Intropine®); dobutamina, (Dobutrex®); epinefrina, (Adrenalin®); isoprotemol, (Isuprel®), milrinona, (Primacor®); Diuréticos tales como espironolactona, (Aldactone®); torsemida, (Demadex®); hidroflumetiazida, (Diucardin®); clorotiazida, (Diuril®); ácido etacrínico, (Edecrin®); hidroclorotiazida, (hydroDIURIL® y Microzide®); amilorida, (Midamor®); clortalidona, 25 (Thalitone® y Hygroton®); bumetanida, (Bumex®); furosemida, (Lasix®); indapamida, (Lozol®); metolazona, (Zaroxolyn®); triamtereno, (Dyrenium®); y combinaciones de triamtereno e hidroclorotiazida (Dyazide® y Maxzide®); Antitrombóticos/Anticoagulantes/Antiagregantes plaquetarios tales como bivalirudina, (Angiomax®); lepirudina, (Refludan®); diversas heparinas; danaparoide, (Orgaran®); diversas heparinas de bajo peso molecular; dalteparina (Fragmin®); enoxaparina (Lovenox®); tinzaparina, (Innohep®); warfarina, (Coumadin®); dicumarol, (Dicoumarol®); anisindiona, (Miradone®); aspirina; argatroban, (Argatroban®); abciximab, (Reopro®); eptifibatida, (Integrilin®); tirofiban, (Aggrastat®); clopidogrel, (Plavix®); ticlopidina, (Ticlid®); y dipiridamol, (Persantine®); Trombolíticos tales como alteplasa, (Activase®); Activador del Plasminógeno Tisular (TPA), (Activase®); anistreplasa, APSAC, (Eminase®); reteplasa, rPA, (Retavasae®); esteptocinasa, SK, (Streptase®); urocinasa, (Abbokinase®); Agentes Antidiabéticos tales como metformina, (Glucophage®); glipizida, (Glucotrol®); clorpropamida, (Diabinese®); 35 acetohexamida, (Dymelor®); tolazamida, (Tolinase®); glimeprida, (Amaryl®); gliburida, (DiaBeta® y Micronase®); acarbosa, (Precose®); miglitol, (Glyset®); repaflinida, (Prandin®); nateglinida, (Starlix®); rosiglitazona, (Avandia®); y pioglitazona (Actos®); Antioxidantes y antiinflamatorios; Secuestrantes de los Ácidos Biliares tales como colestiramina, (LoCholest®, Prevalite® y Questran®); colestipol, (Colestid®); y colesevelam, (Welchol®); Estatinas (fármacos que inhiben la HMGCoA reductasa) tales como rovastatina, (Crestor®); fluvastatina, (Lescol®); atorvastatina, (Lipitor®); lovastatina, (Mevacor®); pravastatina, (Pravachol®); y simvastatina, (Zocor®); inhibidores de CETP; fármacos que bloquean la conversión del ácido araquidónico: terapia de reposición de estrógenos; análogos de ácidos grasos tales como PD 72953, MEDICA 16, ESP 24232 y ESP 31015; inhibidores de la síntesis de ácidos grasos; inhibidores de la oxidación de ácidos grasos, ranolazina, (Ranexa®); Fibratos tales como clofibrato, (Atromid-S®); gemfibrozilo, (Lopid®); cápsulas de fenofibrato micronizado (Tricor®); bezafibrato y ciprofibrato; histidina;

45 derivados del ácido nicotínico tales como comprimidos de liberación prolongada de niacina, (Niaspan®); agonistas y antagonistas del receptor activador proliferador de peroxisomas; talidomida, (Thalomid®) y compuestos descritos en las patentes de Estados Unidos números 6.459.003, 6.506.799 y en las publicaciones de solicitud de Estados Unidos números 20030022865, 20030018013, 20020077316 y 20030078239.

Otros fármacos solos o en combinación, que se pueden añadir a o pueden tener un efecto sinérgico con las propiedades beneficiosas de Apo A-I Milano o complejos lipídicos o sus formulaciones farmacéuticas incluyen, por ejemplo, fármacos antiproliferativos como paclitaxel y topotecan, (Brehm et al. 2001, Biochemical Pharmacology, 61(1): 119-127) y fármacos antiinflamatorios tales como agentes antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos (incluyendo inhibidores de ciclooxigenasa-2 (COX-2)).

5.8. Formulaciones farmacéuticas

55 En un aspecto, la presente invención proporciona formulaciones para el tratamiento, reducción o prevención de lesiones originadas por síndromes agudos coronarios administrando una formulación que comprende Apo A-I Milano. En realizaciones preferidas la Apo A-I Milano (Apo A-I Milano) puede estar complejada con un lípido. En una realización más preferida, Apo A-I Milano está complejada con POPC.

La Apo A-I Milano o sus complejos lipídicos se pueden administrar en la forma de una formulación farmacéutica. Una formulación farmacéutica, tal y como se describe en la presente memoria, incluye la adición de, por ejemplo, un diluyente, excipiente, vehículo o portador aceptable. Como es conocido en la técnica, la adición de uno o más diluyentes, excipientes, vehículos o portadores convierte a la formulación en adecuada para la administración a un sujeto y puede aportar otras propiedades favorables tales como una vida útil de almacenamiento prolongada.

Las formulaciones farmacéuticas comprenden de forma típica un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Se pueden emplear muchos portadores o vehículos farmacéuticamente aceptables. El ejemplo descrito en la presente memoria usa sacarosa-manitol. Con frecuencia se emplea solución salina normal como portador o vehículo farmacéutico. Otros portadores o vehículos incluyen glucosa, trehalosa, sacarosa, agua estéril, agua tamponada,

5 solución salina al 0,45 % (solución salina medio normal) y glicina al 0,3 % y puede incluir además glucoproteínas para mejorar la estabilidad, tales como albúmina. Estas formulaciones se pueden esterilizar por técnicas convencionales de esterilización bien conocidas. Las soluciones acuosas resultantes se pueden envasar para usar o filtrarse en condiciones asépticas y liofilizarse (secado por congelación). La preparación liofilizada se puede combinar entonces con una solución acuosa estéril antes de la administración.

10 Las formulaciones farmacéuticas también pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables que se requieren para aproximarse a condiciones fisiológicas, tales como agentes para ajustar el pH y tamponantes y agentes para ajustar la tonicidad, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico y cloruro de calcio. Se pueden añadir agentes antibacterianos, por ejemplo, fenol, cloruro de benzalconio o cloruro de benzetonio, para mantener la esterilidad de un producto, en especial formulaciones farmacéuticas destinadas a uso

15 parenteral multidosis. También se pueden usar en las formulaciones de la invención agentes estabilizadores y/o de dispersión.

Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender la apolipoproteína (Apo A-I Milano) en forma de sal. Por ejemplo, debido a que las proteínas pueden comprender extremos terminales y/o cadenas laterales ácidas y/o básicas, la Apo A-I Milano puede estar en las formulaciones farmacéuticas bien como ácidos o bases libres, o bien 20 como sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden incluir, ácidos adecuados capaces de formar sales con Apo A-I Milano incluyendo, por ejemplo, ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares; y ácidos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glucólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido antranílico, ácido

25 cinámico, ácido naftalenosulfónico, ácido sulfanílico. Bases adecuadas capaces de formas sales con Apo A-I Milano pueden incluir, por ejemplo, bases inorgánicas tales como hidróxido sódico, hidróxido amónico, hidróxido potásico; y bases orgánicas tales como mono-, di- y trialquilaminas (por ejemplo, trietilamina, diisopropilamina, metilamina, dimetilamina y similares) y etanolaminas opcionalmente sustituidas (por ejemplo, etanolamina, dietanolamina).

La formulación farmacéutica puede estar en una diversidad de formas adecuadas para cualquier vía de

30 administración, incluyendo parenteral, enteral, tópica o por inhalación. Administración parenteral se refiere a cualquier vía de administración que no se realice a través del canal alimentario, incluyendo, administración inyectable (es decir, intravenosa, intramuscular como se describe en la presente memoria). Administración enteral se refiere a cualquier vía de administración que use el canal alimentario, oral o rectal, incluyendo, comprimidos, cápsulas, soluciones orales, suspensiones, pulverizaciones, como se describe en la presente memoria. A efectos de

35 esta solicitud, administración enteral también se refiere a las vías de administración vaginal. Administración tópica se refiere a cualquier vía de administración a través de la piel, incluyendo, cremas, pomadas, geles y parches transdérmicos, como se describe en la presente memoria, (véase también, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª Edición Gennaro et al., eds. Mack Printing Company, Easton, Pa., 1990).

Las formulaciones farmacéuticas parenterales de la presente invención se pueden administrar por inyección, por

40 ejemplo, en una vena (intravenosamente), una arteria (intrarterialmente), un músculo (intramuscularmente), bajo la piel (subcutáneamente o en una formulación de liberación lenta) en el pericardio, en las arterias coronarias. Las formulaciones farmacéuticas inyectables pueden ser una formulación farmacéuticamente apropiada para administración directamente al corazón, pericardio o arterias coronarias. En realizaciones preferidas, las formulaciones farmacéuticas se infunden en un vaso periférico de un sujeto, por ejemplo, en el brazo o en la fosa

45 antecubital.

Las formulaciones farmacéuticas inyectables pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones estériles en vehículos acuosos u oleosos. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis y pueden comprender conservantes añadidos. Tampones preferidos para formulaciones farmacéuticas parenterales son fosfato, citrato y acetato.

50 En otra realización, la formulación farmacéutica puede disponerse en forma de polvo para la reconstitución con un vehículo adecuado, incluyendo agua estéril apirógena; solución salina o dextrosa antes de usar. En este punto, se puede liofilizar o coliofilizar Apo A-I Milano con un lípido como se ha descrito antes, según sea lo más adecuado. En otra realización, las formulaciones farmacéuticas se pueden suministrar en formas de dosis unitaria y reconstituirse antes de usar.

55 Para una liberación prolongada, la formulación farmacéutica se puede proporcionar en forma de una preparación de liberación lenta, para administrar por implante; por ejemplo, inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular. Así, por ejemplo, la formulación farmacéutica se puede formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados muy poco solubles; por ejemplo, como una forma de sal muy poco soluble de Apo A-I Milano o complejo Apo A-I Milano:lípido.

En otra realización, la formulación farmacéutica es un sistema de liberación transdérmico fabricado como un disco o parche adhesivo que libera lentamente el ingrediente activo para absorción percutánea. En esta realización, se pueden usar potenciadores de permeación para facilitar la penetración transdérmica de Apo A-I Milano. En otra realización, la formulación farmacéutica transdérmica puede contener además nitroglicerina para usar en pacientes con angina.

Para administración por inhalación, la formulación farmacéutica se puede liberar mediante la pulverización de un aerosol desde envases a presión, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol a presión, la unidad de dosis se puede determinar disponiendo una válvula que libera una cantidad medida, por ejemplo, un inhalador de dosis medidas. Se pueden formular cápsulas o cartuchos, por ejemplo, de gelatina para usar en un inhalador o insuflador que comprenden una mezcla de polvo de Apo A-I Milano y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Las formulaciones pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador que puede comprender una o más formas de dosis unitaria que comprenden las formulaciones farmacéuticas de Apo A-I Milano. El envase puede comprender por ejemplo una lámina de metal o plástico tal como un envase blíster. El envase o dispositivo dispensador puede venir acompañado de instrucciones o etiquetado para su administración.

En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica de ApoAI-M o complejo Apo A-I Milano:lípido puede comprender una concentración de Apo A-I Milano suficiente para tratar un sujeto que lo necesite. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica de Apo A-I Milano o complejo Apo A-I Milano:lípido puede comprender una concentración de Apo A-I Milano de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml. En realizaciones preferidas, las formulaciones pueden comprender Apo A-I Milano en una concentración de 10 mg/ml a 20 mg/ml. En una realización más preferida, las formulaciones pueden comprender Apo A-I Milano en una concentración de 13 mg/ml a 16 mg/ml. La concentración de Apo A-I Milano se puede determinar por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, la concentración de Apo A-I Milano se determina por cromatografía líquida de alta resolución de exclusión molecular (SE-HPLC).

En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica de Apo AI-M o complejo Apo A-I Milano:lípido puede comprender una concentración de lípido suficiente para formar complejos con Apo A-I Milano. En ciertas realizaciones, el lípido es un fosfolípido. En realizaciones preferidas, el lípido es POPC. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica de Apo A-I Milano o complejo Apo A-I Milano:lípido puede comprender una concentración de POPC de 1 mg/ml a 50 mg/ml. En realizaciones preferidas, las formulaciones pueden comprender POPC en una concentración de 5 mg/ml a 25 mg/ml. En una realización más preferida, las formulaciones pueden comprender POPC en una concentración de 10 mg/ml a 20 mg/ml. En una realización incluso más preferida, las formulaciones pueden comprender POPC en una concentración de 11 mg/ml a 17 mg/ml. La concentración de POPC se puede determinar por cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, la concentración de POPC se determina por cromatografía líquida de alta resolución.

En realizaciones preferidas, la formulación farmacéutica del complejo Apo A-I Milano:lípido puede comprender sacarosa en una cantidad suficiente para preparar una formulación farmacéuticamente adecuada de Apo A-I Milano

o complejo Apo A-I Milano:lípido. En ciertas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas pueden comprender del 0,5 % al 20 % de sacarosa. En ciertas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas pueden comprender del 3 % al 12 % de sacarosa. En ciertas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas pueden comprender del 5 % al 7 % de sacarosa. En realizaciones preferidas, las formulaciones farmacéuticas pueden comprender del 6,0 % al 6,4 % de sacarosa. En una realización más preferida, la formulación farmacéutica puede comprender 6,2 % de sacarosa.

En realizaciones preferidas, la formulación farmacéutica del complejo Apo A-I Milano:lípido puede comprender manitol en una cantidad suficiente para preparar una formulación farmacéuticamente adecuada de Apo A-I Milano o complejo Apo A-I Milano:lípido. En ciertas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas pueden comprender del 0,01 % al 5 % de manitol. En ciertas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas pueden comprender del 0,1 % al 3 % de manitol. En ciertas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas pueden comprender del 0,5 % al 2 % de sacarosa. En realizaciones preferidas, las formulaciones farmacéuticas pueden comprender del 0,8 % al 1 % de manitol. En una realización más preferida, la formulación farmacéutica puede comprender 0,9 % de manitol.

En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica del complejo Apo A-I Milano:lípido puede comprender un tampón en una cantidad suficiente para preparar una formulación farmacéuticamente adecuada de Apo A-I Milano o complejo Apo A-I Milano:lípido. En ciertas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas pueden comprender un tampón fosfato. En ciertas realizaciones, la concentración de tampón puede ser de 3 mM a 25 mM. En ciertas realizaciones, la concentración de tampón puede ser de 5 mM a 20 mM. En realizaciones preferidas, la concentración de tampón puede ser de 8 mM a 15 mM. En ciertas realizaciones, se añade un tampón apropiado para ajustar el pH de la formulación farmacéutica hasta un intervalo adecuado para la administración a un sujeto. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica puede tener un pH de 6,8 a 7,8. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica puede tener un pH de 7,0 a 7,8. En ciertas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas pueden tener un pH de 7,2 a 7,5. En realizaciones preferidas, la formulación farmacéutica puede tener un pH de 7,5.

En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica del complejo Apo A-I Milano:lípido tiene una osmolalidad que es adecuada para administración a un sujeto. En ciertas realizaciones, la osmolalidad de la formulación puede variar de 200 a 400 mOsm. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica puede tener una osmolalidad de 220 a 380 mOsm. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica puede tener una osmolalidad de 260 mOsm a 340 mOsm. En realizaciones preferidas, la formulación farmacéutica puede tener una osmolalidad de 280 mOsm a 320 mOsm. En una realización más preferida, la formulación farmacéutica puede tener una osmolalidad de 290 mOsm.

Las formulaciones de la invención proporcionan un complejo Apo A-I Milano:lípido de pureza suficiente para permitir la administración a un sujeto. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica puede comprender Apo A-I Milano en una pureza del 98 % o más, del 96% o más, del 95 % o más, del 93% o más, del 91% o más o del 90%

o más. En una realización preferida, la pureza de la Apo A-I Milano es del 90 % o más. La pureza de Apo A-I Milano se puede determinar por cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, la pureza de la Apo A-I Milano se puede determinar por HPLC de exclusión molecular.

Las formulaciones de la invención proporcionan un complejo Apo A-I Milano:lípido de pureza suficiente de POPC para permitir la administración a un sujeto. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica puede comprender POPC en una pureza del 98 % o más, del 96 % o más, aproximadamente 95 % o más, del 93 % o más, del 91 % o más o del 90 % o más. En una realización preferida, la pureza de POPC es mayor que el 90 %. La pureza de POPC se puede determinar por cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, la pureza de POPC se puede determinar por HPLC.

En realizaciones preferidas, el complejo Apo A-I Milano:lípido tiene cantidades de hidroperóxido lipídico del 10 % o menor, del 8 % o menor, del 6 % o menor, del 4 % o menor, del 2 % o menor, del 1 % o menor por debajo de los límites detectables que se determinan por el ensayo de oxidación ferrosa/naranja de xilenol (Jiang, et al. 1992, Anal. Biochem 202: 384-389). En ciertas realizaciones, el complejo A-IM:POPC tiene una pureza mayor que 85 % (medida como % del área total del pico) determinada por cromatografía de exclusión molecular. En ciertas realizaciones, la formulación tiene pocas o ninguna endotoxina. En realizaciones preferidas, la formulación tiene endotoxinas por debajo de 0,04 EU/mg de Apo A-I Milano.

En ciertas realizaciones, la formulación puede alcanzar un nivel de partículas mayores de 10 ∀m de tamaño menor que 6.000 por vial de 50 ml determinado por oscurecimiento luminoso. En ciertas realizaciones, el nivel de partículas mayores de 25 ∀m de tamaño es menor que 600 por vial de 50 ml determinado por oscurecimiento luminoso.

En una realización preferida, la formulación farmacéutica de complejo Apo A-I Milano:lípido se prepara diluyendo una rApo A-I Milano hasta una concentración de 15 mg/ml en solución con agua para inyección. Se añade fosfato sódico hasta una concentración final de fosfato 9-15 mM y se ajusta el pH de 7,0 a 7,8. Se añade manitol para conseguir una concentración del 0,8 % al 1 % de manitol (p/v). A continuación se añade POPC para conseguir una relación de 1:0,95 (peso de proteína/peso de lípido) de dímero de Apo A-I Milano a POPC. La mezcla se agita a 5000 rpm durante 20 minutos usando un impulsor superior y una Ultra Turrax, manteniendo la temperatura de 37ºC a 43ºC. El recipiente de alimentación se agita continuamente a 300 rpm mientras se mantiene la temperatura de 32ºC a 43ºC con intercambiadores de calor en línea (Avestin, Inc.). La homogeneización durante los 30 primeros minutos se lleva a cabo a 50 MPa y a continuación se mantiene la presión a 80-120 MPa hasta que un ensayo en proceso por cromatografía de exclusión molecular demuestra que el AUC % es mayor que 70 % entre los patrones de proteína. La osmolalidad del complejo se ajusta entonces mediante la adición del 6,0 % al 6,4 % de sacarosa. La formulación farmacéutica del complejo Apo A-I Milano:POPC se esteriliza entonces por filtración a través de filtros de 0,22 ∀m.

En otra realización preferida, la formulación farmacéutica comprende de 12 a 18 mg/ml de Apo A-I Milano recombinante, de 11 a 17 mg/ml de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina a pH 7,4, con 6,2 % de sacarosa y 0,9 % de manitol con una osmolalidad de 280 mOsm a 320 mOsm. La formulación farmacéutica puede tener rAPO A-I-M en una pureza de aproximadamente el 90 %, POPC en una pureza del 97 %. En una cierta realización, ninguna impureza aislada puede ser aproximadamente mayor del 2 %.

La formulación farmacéutica se puede almacenar congelada (-15ºC a -25ºC). En ciertas realizaciones, las formulaciones pueden ser soluciones frías, soluciones congeladas o soluciones liofilizadas. Se prefiere que las citadas formulaciones se descongelen y calienten hasta temperatura ambiente antes de la administración a un sujeto. Para evitar la desnaturalización de la proteína se recomienda descongelar y calentar suavemente.

En otra realización preferida, las formulaciones pueden estar en viales de vidrio estériles de 2 ml a 250 ml, preferiblemente de 10 ml a 100 ml, lo más preferible de 50 ml que contienen una formulación farmacéutica que comprende un complejo Apo A-I Milano:fosfolípido. En ciertas realizaciones las formulaciones farmacéuticas pueden comprender de 10 mg/ml a 15 mg/ml del complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o una de sus formulaciones farmacéuticas en un volumen de llenado final de 39 a 41 ml por vial. La cantidad de complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o una de sus formulaciones farmacéuticas puede variar de 500 mg a 750 mg por vial de 50 ml.

Las formulaciones farmacéuticas pueden ser para un uso único una vez o pueden contener excipientes antimicrobianos, como se han descrito antes, que hacen las formulaciones farmacéuticas adecuadas para varios

usos, por ejemplo, un vial multidosis. En ciertas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas pueden estar en envases de unidades de uso. Como es conocido por los expertos en la técnica, un envase de unidades de uso es una unidad lista para el paciente con el tamaño de prescripción conveniente para la distribución directa por el personal sanitario. Un envase de unidades de uso contiene una formulación farmacéutica en una cantidad necesaria 5 para un intervalo de tratamiento y duración típicos para una indicación dada. Los procedimientos y formulaciones de la invención proporcionan un envase de unidades de uso de una formulación farmacéutica que comprende, por ejemplo un complejo Apo A-I Milano:fosfolípido en una cantidad suficiente para tratar un adulto varón o hembra promedio con 15 mg/kg una vez a la semana durante 5 semanas. En una realización, el envase de unidades de uso puede comprender una formulación farmacéutica que comprende un complejo Apo A-I Milano:fosfolípido o una de

10 sus formulaciones farmacéuticas en una cantidad suficiente para tratar un sujeto adulto promedio con 45 mg/kg una vez a la semana durante 6 semanas. Será evidente para los expertos en la técnica que las dosis descritas en la presente memoria se basan en el peso del sujeto.

Las formulaciones farmacéuticas se pueden etiquetar e irán provistas de etiquetado adjunto para identificar la formulación contenida en las mismas y cualquier otra información útil para el personal sanitario y sujetos en el

15 tratamiento y prevención de trastornos cardiovasculares y vasculares, síndromes agudos coronarios, trastornos isquémicos y para la estabilización de placas, incluyendo, aunque sin quedar limitados a los mismos, instrucciones de uso, dosis, intervalo de dosificación, duración, indicación, contraindicaciones, advertencias, precauciones, instrucciones de manejo y almacenamiento y similares.

En otras realizaciones, la presente invención proporciona kits para tratar o prevenir trastornos cardiovasculares y

20 vasculares, síndromes agudos coronarios, trastornos isquémicos y para la estabilización de placas. Los kits comprenden una o más dosis eficaces de Apo A-I Milano o complejo Apo A-I Milano:lípido o sus formulaciones farmacéuticas junto con una etiqueta o etiquetado con instrucciones de uso de Apo A-I Milano o complejo Apo A-I Milano:lípido o sus formulaciones farmacéuticas para tratar o prevenir síndromes agudos coronarios de acuerdo con los procedimientos de la invención. En ciertas realizaciones, los kits pueden comprender componentes útiles para

25 llevar a cabo los procedimientos tales como dispositivos para liberar la Apo A-I Milano o complejo Apo A-I Milano:lípido o sus formulaciones farmacéuticas y componentes para el desechado seguro de estos dispositivos, por ejemplo, un envase de agujas. En ciertas realizaciones, los kits pueden comprender Apo A-I Milano o complejo Apo A-I Milano:lípido o sus formulaciones farmacéuticas en unas jeringas precargadas, dosis unitaria o envases de unidades de uso.

30 6. Ejemplos

La presente invención se comprenderá mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

6.1. Ejemplo 1: Tolerabilidad de ETC-216

Este ejemplo demuestra la seguridad y tolerabilidad de ETC-216 en voluntarios sanos.

Se llevó a cabo un estudio doble ciego, controlado con placebo para determinar la seguridad y tolerabilidad de Apo

35 A-I Milano y fosfolípido. Se complejó Apo A-I Milano con un fosfolípido (POPC) en una relación en peso de uno a uno, denominado ETC-216. El estudio evaluó la seguridad y tolerabilidad de cinco dosis en aumento de ETC-216 en voluntarios sanos varones y en dos dosis diferentes en voluntarias sanas hembras. Se obtuvo de todos los voluntarios antes del estudio el consentimiento informado.

Se administraron dosis intravenosas de ETC-216 a treinta y dos voluntarios sanos (“sujetos”) de edades que

40 oscilaban entre 18 y 50 años. En sujetos varones, se administraron dosis de hasta, e incluyendo, 100 mg/kg. En sujetos hembras, se administraron dosis de hasta, e incluyendo 50 mg/mg. En la Tabla 1 siguiente se presentan el sexo del sujeto, dosis y velocidad de administración.

Tabla 1 5

Dosis (mg proteína/kg de peso corporal): Número de sujetos Sexo Velocidad de infusión (mg/kg/min)

0 (placebo): 3 Varón 1,67

0 (placebo): 2 Varón 1,25

5: 3 Varón 1,67

15: 3 Varón 1,67

50: 3 Varón 1,67

75: 3 Varón 1,25

100: 3 Varón 1,25

0 (placebo): 1 Hembra 1,67

0 (placebo): 2 Hembra 0,83

15: 3 Hembra 1,67

15: 3 Hembra 0,83

50: 3 Hembra 0,83

El control de los acontecimientos adversos incluyó la evaluación de hematología, exploración física y constantes vitales. Los sujetos se controlaron durante 27 días después de la dosificación.

Veinte de los 32 sujetos en este estudio describieron acontecimientos adversos, los cuales fueron todos de leves a moderados. Los acontecimientos adversos que se presentaron en dos o más sujetos se consideraron relacionados posiblemente con el tratamiento del fármaco en estudio. Estos acontecimientos adversos y el número de sujetos que experimentaron estos acontecimientos adversos fueron, linfopenia (11 sujetos), leucocitosis (10 sujetos), nauseas (6 sujetos), cefaleas y diarrea (4 sujetos), vómitos (3 sujetos) y dolor abdominal e hipertrigliceridemia (2 sujetos). La mayoría de los acontecimientos adversos posiblemente relacionados (trastornos gastrointestinales y leucocitarios) se comunicaron después de la infusión de 50 mg/kg o 100 mg/kg de ETC-216 en sujetos varones. Dos acontecimientos adversos (hipoproteinemia y función hepática anómala) que se presentaron en sujetos tratados con placebo se consideraron posiblemente relacionados con el tratamiento en estudio. No se produjeron muertes, acontecimientos adversos graves o abandonos debidos a los acontecimientos adversos.

Como se proporciona en la FIG. 1, los niveles séricos de colesterol no esterificado HDL en sujetos varones 30 minutos después de una única dosis de ETC-216 aumentaron en dosis de 15 mg/kg y superiores.

Los títulos de anticuerpos frente a Apo A-I Milano se analizaron en suero antes de la infusión y hasta 27 días después de la infusión. No se produjeron respuestas de anticuerpos significativas en ninguno de los sujetos después de la administración de una única dosis.

La semivida terminal de aproximadamente 100 horas apoya la justificación de llevar a cabo el estudio inicial de múltiples dosis en seres humanos con una pauta de dosificación cada 7 días.

Estos resultados indican que ETC-216 era seguro y bien tolerado en todas las dosis y no se produjeron acontecimientos adversos graves.

6.2. Ejemplo 2: Eficacia de diferentes dosis de ETC-16 en la remisión de aterosclerosis

Este ejemplo demuestra la eficacia de dosis de 15 mg/kg y 45 mg/kg de ETC-216 en la remisión de aterosclerosis coronaria en sujetos con síndromes agudos coronarios.

Este estudio fue un estudio aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo de varias dosis para evalular la eficacia y seguridad de ETC-216 en sujetos con síndromes agudos coronarios que se valoraron por ecografía intravascular. Antes de iniciarse cualquier procedimiento específico del estudio, todos los sujetos proporcionaron el consentimiento informado aprobado por el Comité de Revisión Institucional (IRB) de cada institución participante.

Los sujetos elegibles fueron los que se diagnosticaron con síndromes agudos coronarios (angina inestable, infarto de miocardio sin onda Q o infarto de miocardio con elevación ST) en los 14 días antes de la selección y que se programaron para someterse a angiografía coronaria y/o intervención coronaria percutánea (PCI) y una estancia anticipada de 24 horas después del procedimiento. Los sujetos que cumplen estos criterios se excluyeron si su procedimiento se consideraba urgente y/o se consideraba que tenía un riesgo elevado de complicaciones agudas, que se determinaron por el médico encargado.

El criterio principal de valoración de la eficacia fue el cambio (fin del tratamiento menos antes del tratamiento) en el volumen de ateroma porcentual en un segmento de 30-80 mm de una arteria coronaria objetivo (visualizada) valorada por ecografía intravascular (IVUS). Se definió un resultado positivo como un cambio negativo en el volumen de ateroma porcentual con Intervalos de Confianza (IC) que no incluyen cero.

Los criterios secundarios de valoración de la eficacia fueron el cambio medio en el volumen total de ateroma y el grosor máximo de ateroma promedio. Los criterios secundarios de valoración de la eficacia se establecieron para IVUS y angiografía. Para IVUS, los criterios secundarios de valoración de la eficacia fueron:

1) Cambio nominal (final del tratamiento menos antes del tratamiento) en el “volumen” total de placa que se determinó por la media de las áreas de placa para todas las secciones de segmentos anatómicamente comparables de la arteria coronaria objetivo;

2) Cambio nominal (final del tratamiento menos antes del tratamiento) en el grosor máximo de placa promedio para todas las secciones de segmentos anatómicamente comparables de la arteria coronaria objetivo;

3) “Volumen” de segmento afectado mínimo y máximo:

a) Cambio nominal (final del tratamiento menos antes del tratamiento) en el “volumen” de placa del segmento para las secciones contiguas de 10 mm en estado basal que contienen el área porcentual de placa mínima (definida como el segmento menos afectado);

b) Cambio nominal (final del tratamiento menos antes del tratamiento) en el “volumen” de placa del segmento para las secciones contiguas de 10 mm en estado basal que contienen el área porcentual de placa máxima (definida como el segmento más afectado);

Los criterios secundarios de valoración de la eficacia para angiografía fueron:

1) Diámetro luminal coronario medio en todos los segmentos coronarios medidos;

2) Número de lesiones angiográficas nuevas en cada subgrupo de tratamiento;

3) Proporción de sujetos con una o más lesiones nuevas coronarias angiográficas al final del tratamiento;

4) Número de sitios con una lesión preexistente que presentan regresión;

5) Número de sitios con una lesión preexistente que presentan progresión;

6) Proporción de sujetos que presentan “regresión” en cualquiera de las lesiones preexistentes;

7) Proporción de sujetos que presentan “progresión o sin cambios” en todas las lesiones preexistentes;

8) Proporción de sujetos que presentan “regresión o sin cambio” en todas las lesiones preexistentes.

Los procedimientos para IVUS se analizaron como se describe por Nissen 2001, Am. J. Cardiol. 87: 15A-20A. De forma resumida, el operador digitaliza la cinta de vídeo IVUS, revisa el retroceso y selecciona el origen de la rama lateral más distal como el punto inicial para el análisis como se muestra en la FIG. 2(A). A continuación, se selecciona para el análisis cada 30ª parte de la imagen, que representa una serie de secciones transversales exactamente espaciadas en 0,5 mm. La sección transversal analizada final correspondía a la imagen más proximal en la secuencia antes de la aparición de la arteria coronaria principal izquierda u ostio coronario derecho (punto fiduciario proximal) como se muestra en las FIGS. 2(B)-2(D). El procedimiento se repitió para la exploración de seguimiento usando marcas idénticas para garantizar que se analizó el mismo segmento en ambos tiempos.

Se realizaron ambas medidas de IVUS directas y derivadas. Las medidas de IVUS directas se llevaron a cabo de acuerdo con los patrones de la American College of Cardiology and European Society of Cardiology (Mintz et al. J. Am. Coll. Cardiol. 37: 1478-92). Usando National Institute of Health Image 1.62 (software de domino público NIH), el operador llevó a cabo el procedimiento de calibración midiendo marcas de rejilla de 1 mm codificadas en la imagen IVUS por el escáner. Para cada sección transversal, el operador llevó a cabo una planimetría manual para trazar los bordes principales de los bordes de membrana elástica luminal y externa (FIGS. 3(A)-3(D)). Los grosores máximos de ateroma también se midieron directamente. La exactitud y reproductibilidad de estos procedimientos se han descrito con anterioridad, demostrando que, después de la calibración, las medidas de área de la sección transversal media por IVUS estuvieron en un intervalo del 0,5 % de las dimensiones reales para una máscara de Lucite perforada con precisión que variaba en un área de 3,24 mm2 a 27,99 mm2 (Schoenhagen et al. 2003, J. Am. Soc. Echocardiogr. 16: 277-84). La variabilidad de medidas por múltiples observadores demostró una desviación típica del 2,9 %.

Las medidas de IVUS derivadas incluyeron el cálculo del área de ateroma como área de la membrana elástica externa (EEM) menos el área luminal. Debido a que las secciones transversales de imagen se obtuvieron a intervalos de 0,5 mm, el volumen total de ateroma se pudo calcular usando la regla de Simpson como el área media de ateroma multiplicada por las longitudes extraídas en milímetros. El volumen porcentual de ateroma se calculó como: (# áreas de ateroma/# áreas EEM) x 100 (Véase, por ejemplo, Nissen et al., 2003, JAMA 290: 2292-2300). El análisis de la angiografía coronaria se llevó a cabo en un laboratorio central en la Cleveland Clinic Foundation usando procedimientos normalizados diseñados para reducir la variabilidad en las medidas. La comparación del diámetro de la punta del catéter de angiografía con su dimensión conocida se usó para calibrar el sistema. El criterio de valoración angiográfico fue el cambio en el diámetro luminal coronario medio desde el estado basal hasta el seguimiento.

Se distribuyeron aleatoriamente cincuenta y siete sujetos para recibir 15 mg/kg de ETC-216, 45 mg/kg de ETC-216 o un placebo de igual volumen cada 7 días (+ 1 día) con un máximo de hasta 5 dosis intravenosas. Los sujetos se distribuyeron aleatoriamente a 15 mg/kg de ETC-216, 45 mg/kg de ETC-216 o placebo en una relación 2:2:1. Completaron el estudio cuarenta y siete sujetos.

La dosis de 15 mg/kg se administró por infusión intravenosa durante aproximadamente 50 minutos y la dosis de 45 mg/kg se administró por infusión intravenosa durante aproximadamente 150 minutos. La velocidad de infusión se incrementó para algunos sujetos debido a la aparición de nauseas. Todas las infusiones intravenosas se administraron periféricamente.

5 Se realizó un control de los sujetos por parámetros analíticos clínicos incluyendo niveles de anticuerpos para ETC216, exploraciones físicas, constantes vitales, electrocardiogramas (ECG) y la frecuencia e intensidad de los acontecimientos adversos clínicos. La angiografía e IVUS se llevaron a cabo en cada paciente dos veces. La primera vez después de completar la visita inicial de selección y la segunda se produjo aproximadamente 2 semanas (+ 7 días) después de la última dosis del fármaco en estudio.

10 Se obtuvieron resultados positivos con respecto al primer criterio de valoración como se resumen en la Tabla 2 siguiente. En el grupo de tratamiento combinado (pacientes que recibieron bien la dosis de 15 mg/kg o bien la dosis de 45 mg/kg de ETC-216), el cambio en el volumen de ateroma porcentual medio (Desviación Típica o DT) fue 1,06 % (3,17 %). La mediana fue -0,81 % (IC del 95 %, -1,53 % al -0,34 %; p=0,02 comparado con el valor basal. Para el grupo de placebo, el cambio medio (DT) fue 0,14 % (3,09 %). La mediana fue 0,03 % (CI del 95 %I, -1,11 %

15 al 1,43 %; p -0,97 comparado con el valor basal).

TABLA 2. Volumen porcentual de ateroma en el segmento coronario objetivo

Basal: Seguimiento Cambio respecto al basal

Grupos de tratamiento: Nº de sujetos Media (DT)1 Mediana (IQR)2 Media (DT) Mediana (IQR) Media (DT) Mediana (IC3 del 95 %) Valor P4

Placebo: 11 34,80 (8,44) 35,29 (26,9939,81) 34,94 (9,74) 33,59 (27,0741,09) 0,14 (3,09) 0,03 (-1,11 al 1,43) 0,97

ETC-216 15 mg/kg: 21 39,71 (7,04) 40,55 (34,1644,97) 38,42 (6,5) 38,84 (32,7842,87) -1,29 (3,48) -1,14 (-2,24 al -0,56) 0,03

ETC-216 45 mg/kg: 15 37,92 (7,83) 41,22 (31,9244,10) 37,19 (7,71) 36,62 (32,8144,02) -0,73 (2,75) -0,34 (-01,21 al 0,43) 0,45

ETC-216 combinado: 36 38,96 (7,32) 40,88 (34,0144,53) 37,91 (6,95) 38,17 (32,7943,53) -1,06 (3,17) -0,81 (-1,53 al -0,34) 0,025

1Desviación típica 2Intervalo intercuartiles 3Intervalo de confianza 4Valores P para comparación en los grupos de la prueba de orden por signos de Wilcoxon. Para la comparación entre grupos de ETC-216, Apo A-I Milano:POPC combinado frente a placebo del análisis de covariancia de órdenes de cambio desde el estado basal, con el valor basal como una covariable, p = 0,029. 5Criterio principal de valoración de eficacia previamente especificado.

Con respecto a los criterios secundarios de valoración, también se obtuvieron resultados positivos, como se muestra en la Tabla 3 siguiente. Comparados con los valores basales, el cambio medio (DT) en el volumen de ateroma total en el grupo de tratamiento combinado fue -14,1 mm3 (39,5 mm3; mediana -13,3 mm3; IC del 95 %, -20,7 a -7,2; p <

20 0,001). Para el grupo placebo, el cambio correspondiente fue -2,9 mm3 (23,3 mm3). La mediana fue -0,2 mm3 (23,3 mm3). La mediana fue -0,2 mm3; IC del 95 %, -8,6 a 8,2; p = 0,97). El cambio medio (DT) desde el valor basal en el grosor máximo de ateroma para el grupo de tratamiento combinado fue -0,042 mm (0,080 mm). La mediana fue 0,035 mm (IC del 95 %, -0,058 a -0,020; p < 0,002). Para el grupo placebo, el cambio correspondiente fue -0,008 mm (0,061 mm; mediana -0,009 (IC del 95 %, -0,035 a 0,026; p = 0,83). Véase la Tabla 4, siguiente.

TABLA 3. Volumen total de ateroma en el segmento coronario objetivo

Basal, mm3: Seguimiento, mm3 Cambio respecto al basal, mm3

Grupos de tratamiento: Nº de sujetos Media (DT) Mediana (IQR) Media (DT) Mediana (IQR) Media (DT) Mediana (IC del 95 %) Valor P1

Placebo: 11 172,6 (113,2) 149,0 (58,6216,5) 169,8 (118,0) 145,1 (58,4217,8) -2,9 (23,3) -0,2 (-8,6 al 8,2) 0,97

ETC-216 15 mg/kg: 21 295,5 (166,5) 279,7 (173,6370,7) 280,4 (155,6) 265,5 (161,1351,6) -15,1 (50,6) -15,0 (-29,6 al -4,9) 0,21

ETC-216 45 mg/kg: 15 230,6 (156,7) 195,8 (90,9332,9) 218,0 (145,6) 183,8 (89,4311,1) -12,6 (15,3) -12,0 (-20,6 al -2,9) 0,007

ETC-216 combinado: 36 268,4 (163,5) 263,7 (129,4359,3) 254,4 (152,6) 244,8 (131,0337,6) -14,1 (39,5) -13,3 (-20,7 al -7,2) <0,0012

1Valores P para la comparación en el grupo de la prueba de órdenes por signos de Wilcoxon. Para la comparación entre grupos de ETC-216, Apo A-I Milano:POPC combinado frente a placebo a partir del análisis de covariancia de órdenes de cambio desde el estado basal, con el valor basal como una covariable, p = 0,018. 2 Criterio principal de valoración de eficacia previamente especificado.

TABLA 4. Grosor máximo de ateroma medio en el segmento coronario objetivo

Basal mm: Seguimiento mm Cambio respecto al basal, mm

Placebo: 11 0,649 (0,317) 0,683 (0,4020,846) 0,641 (0,332) 0,584 (0,3920,827) -0,008 (0,061) -0,009 (-0,035 al 0,026) 0,83

ETC-216 15 mg/kg: 21 0,815 (0,194) 0,830 (0,6830,953) 0,771 (0,168) 0,824 (0,6460,865) -0,044 (0,094) -0,049 (-0,079 al -0,015) 0,03

ETC-216 45 mg/kg: 15 0,738 (0,028) 0,792 (0,5310,992) 0,699 (0,269) 0,758 (0,4570,963) -0,039 (0,059) -0,029 (-0,056 al -0,007) 0,02

ETC-216 combinado: 36 0,783 (0,233) 0,816 (0,5780,963) 0,741 (0,216) 0,814 (0,5520,895) -0,042 (0,080) -0,035 (-0,058 al -0,020) <0,0012

1Valores P para la comparación en el grupo de la prueba de órdenes por signos de Wilcoxon. Para la comparación entre grupos de ETC-216, Apo A-I Milano:POPC combinado frente a placebo a partir del análisis de covariancia de órdenes de cambio desde el estado basal, con el valor basal como una covariable, p = 0,023. 2 Criterio principal de valoración de eficacia previamente especificado.

Los resultados mostraron que ETC-216 es eficaz para reducir el tamaño de la placa. Se demostró en ambos grupos de tratamiento una regresión estadísticamente significativa de la aterosclerosis.

5 6.3. Ejemplo 3: Sistema de Langendorff ex vivo

Este ejemplo demuestra el efecto cardioprotector de ETC-216 profiláctico en corazón de conejo isquémico aislado reperfundido. Se usaron en el estudio conejos macho blancos de Nueva Zelanda, obtenidos de Charles River con un peso aproximado de 2 a 3 kg. El conejo macho blanco de Nueva Zelanda se seleccionó como el sistema de ensayo apropiado para los propósitos de este estudio. El corazón de conejo isquémico aislado reperfundido es un modelo de

10 infarto de miocardio humano. Tras la recepción, se asignaron a los animales números de identificación únicos.

Los animales se alojaron en jaulas de acero inoxidable de acuerdo con pautas del Comité de la Universidad de Michigan sobre el uso y atención de animales. Los cuidados veterinarios se proporcionaron por la Unidad para la Medicina de Animales de Laboratorio de la Universidad de Michigan. La universidad de Michigan está acreditada por la Asociación Americana de Cuidados Sanitarios de Animales de Laboratorio y el programa de uso de la atención a animales se adapta a las normas de la Guide for the Care and use of Laboratory Animals, DHEW (NIH) Publ. N.º 86

23.

ETC-216 es complejo apolipoproteína A-I Milano recombinante/1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina en una relación en peso de uno a uno. Las soluciones madre de ETC-216 contenían 14 mg de proteína/ml en un tampón de sacarosa y manitol. Puesto que el tampón de sacarosa-manitol era incompatible con el tampón de Krebs-Henseleit y para controlar cualquier efecto independiente del manitol solo, se dializó ETC-216 para obtener un tampón de base que comprendía glucosa al 2 % en fosfato sódico 4 mM, pH 7,4. El ETC-216 se diluyó con tampón de Krebs-Henseleit proporcionando una concentración de fármaco de 0,45 mg/ml. El vehículo se diluyó de forma similar.

La selección de dosis se basó en datos históricos para dosis usados en ensayos clínicos de seguridad de dosis únicas en Fase I en seres humanos de Esperion, en los que se administraron a seres humanos dosis de hasta 100 mg/kg de ETC-216. Para los estudios descritos en este protocolo, una concentración de 0,5 mg/ml es aproximadamente equivalente a una dosis intravenosa de 25 mg/kg administrada a un ser humano.

Los experimentos se llevaron a cabo usando un aparato de Langendorff para perfundir corazones de conejo. Los conejos se someten a dislocación cervical para dejarlos inconscientes y se extraen los corazones rápidamente y se fija una cánula para perfusión a través de la aorta. El medio de perfusión consistía en un tampón de Krebs-Henseleit circulante (pH 7,4, 37ºC; “KH”) que se expuso continuamente a una mezcla de O2 al 95 %/CO2 al 5 % y se administró a un caudal constante de 20-25 ml/min. Se realizó la estimulación cardíaca de los corazones durante todo el protocolo a través de electrodos fijados a la aurícula derecha. Los estímulos cardíacos se administraron desde un generador de ondas cuadradas de laboratorio (10 % por encima de la estimulación fisiológica, duración de, 1 ms, Grass 588, Quincy, Mass.). La arteria pulmonar se canuló con tubo flexible SilasticTM para facilitar la recogida del efluente de la arteria pulmonar que representa el retorno venoso coronario al seno coronario. La vena cava superior e inferior y las venas pulmonares se ligaron para prevenir la pérdida de perfundido desde vasos seccionados. Se insertaron un drenaje ventricular izquierdo, sonda Thermistor y un globo de látex a través de la aurícula izquierda y se colocaron en el ventrículo izquierdo. El globo de látex lleno de fluido se conectó con un tubo rígido a un transductor de presión con catéter Miller para permitir la medida de la presión desarrollada en el ventrículo izquierdo. El globo intraventricular se expandió con agua destilada para conseguir una presión telediastólica en el ventrículo izquierdo basal inicial de aproximadamente 1333,22 pascales (10 mm de Hg). La presión de perfusión coronaria se midió con un transductor de presión conectado a una rama lateral de la cánula aórtica. Puesto que el caudal de perfusión de la arteria coronaria se mantuvo constante, las alteraciones en la presión de perfusión de la arteria coronaria sirvieron como indicador de cambio en la resistencia de la arteria coronaria. Todas las variables hemodinámicas se controlaron de forma continua usando un registrador multicanal tal como un Grass Polygraph 79D (Quincy, Mass.) unido a un sistema de Adquisición de Datos por Software “Polyview Software Data Acquisition System”. Los corazones se mantuvieron a 37 ºC durante todo el período experimental encerrando el corazón en una cámara de vidrio de doble luz con temperatura regulada y haciendo pasar el medio de perfusión a través de un sistema de depósito y liberación calentado.

Para los Procedimientos Experimentales se usaron dos grupos de tratamiento que se muestran a continuación.

Grupo Tratamiento Sustancia de ensayo Concentración (mg/ml)

1 Isquemia y reperfusión Vehículo 0

2 Isquemia y reperfusión ETC-216 0,45

Los corazones se trataron experimentalmente como se muestra en la FIG. 5. Los corazones aislados se estabilizaron en condiciones normóxicas (nivel normal de oxígeno) durante 20 minutos antes de la inducción de la isquemia global. Durante los 10 primeros minutos de este período, se expusieron los corazones a tampón KH solo y luego durante otros 10 minutos más al tampón KH que contenía vehículo (Grupo 1) o ETC-216 (Grupo 2). Los corazones se sometieron entonces a un período de 30 minutos de isquemia seguido por un período de 60 minutos de reperfusión con tampón KH que contenía vehículo (Grupo 1) o ETC-216 (Grupo 2). La inducción de isquemia global estuvo acompañada por la interrupción del flujo de perfundido al corazón y la reperfusión del corazón estuvo acompañada por la activación de la bomba para restaurar el caudal original.

Se recogieron alícuotas de efluente de la arteria pulmonar recogido de corazones en todos los grupos en estado basal (preisquemia) e inicialmente cada minuto hasta los 5 minutos, y cada 5 minutos después durante el período de reperfusión. Los efluentes se analizaron para determinar la concentración de creatina cinasa (FIG. 6) un índice de la lesión tisular. La creatina cinasa es una enzima citosólica liberada de las células lesionadas irreversiblemente. Las funciones cardíacas se controlaron de forma continua (FIG. 7).

Las determinaciones de los criterios de valoración cardíaca se realizaron para:

1 -Electrocardiograma-frecuencia cardíaca (estimulada) para detectar la presencia o ausencia de arritmias;

2 - Presión desarrollada en ventrículo izquierdo (FIG. 8) (datos se muestran como media + error típico de la media para el número indicado de corazones en cada grupo);

5 3 - dP/dt en ventrículo izquierdo

4 - Presión telediastólica en ventrículo izquierdo (FIG. 9) (datos se muestran como media + error típico de la media para el número indicado de corazones en cada grupo);

5 - Presión de perfusión coronaria (FIG. 10) (datos se muestran como media + error típico de la media para el número indicado de corazones en cada grupo);

10 6 -Obtención de drenaje linfático para determinar la liberación de creatina cinasa tisular antes y después de la reperfusión (FIG. 6)

A la finalización del protocolo experimental, las biopsias cardíacas de hasta cinco corazones de cada grupo de tratamiento se sumergieron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC para el posterior análisis de hidroperóxidos lipídicos. Las muestras de homogeneizado se normalizaron al contenido de proteína antes de

15 llevar a cabo un ensayo de peróxidos lipídicos (FIG. 11). ETC-216 redujo los hidroperóxidos lipídicos cardíacos en un 46 % en este ejemplo.

Tras completarse el protocolo diseñado, se perfundieron dos corazones de cada grupo durante 3 minutos con glutaraldehído al 2,5 % y LaCl3 al 1 % en tampón calcodilato sódico 0,1 M (pH 7,4). El LaCl3 osmófilo en condiciones normales es retenido en el compartimento vascular ligado a la pared del vaso y sirve como indicador de la integridad 20 sanguínea. La extravasación de LaCl3 en el espacio extravascular se usó para indicar la presencia de lesión vascular. Se extrajeron muestras de tejido del miocardio ventricular izquierdo y se cortaron en segmentos que medían aproximadamente 1 mm de lado. Las muestras se fijaron durante dos horas más a 4ºC en el tampón anteriormente citado. A continuación, se deshidrataron las muestras en una serie de etanol y se embebieron en EM bed-812 (Electron Microscopy Sciences, Ft, Washington, Pa.). Los bloques de tejido se seccionaron con un

25 ultramicrotomo Reichert y se colocaron sobre gradillas de cobre revestidas de Formvar seguido por la tinción con acetato de uranilo al 4 %. Las secciones se observaron con un microscopio electrónico Phillips CM-10.

Para examinar las muestras de miocardio de cada uno de los grupos de estudio se usó microscopía electrónica de transmisión. Las imágenes muestran que las características estructurales de sarcómero de los corazones tratados con vehículo son borradas y están presentes bandas contráctiles. Las mitocondrias están marcadamente hinchadas 30 con cuerpos de inclusión cristalinos rotos y osmófilos. En los corazones tratados con ETC-216 la estructura de sarcómero es relativamente normal y las mitocondrias aparecen intactas con un mínimo de hinchazón. La ausencia virtual de bandas de contracción permanece en marcado contraste con las observadas en los corazones testigo. La capacidad de ETC-216 para evitar la necrosis con bandas de contracción es coherente con la observación de que los corazones tratados previamente con ETC-216 no presentan un aumento en LVEDP tras la reperfusión. Tanto la

35 necrosis con bandas de contracción como un aumento sostenido en LVEDP se asocian con un aumento en la carga de calcio intracelular y lesión celular irreversible. La presencia de miofibrillas que emborronan las bandas Z y la ruptura de la arquitectura miofibrilar son indicadores de lesión extensiva. Otras lesiones morfológicas esperadas incluyeron crestas rotas y matrices de las mitocondrias así como cuerpos densos electrónicos grandes en las mitocondrias. El factor de aumento fue 7900 x en ambas micrografías (FIG. 12).

40 El análisis de las concentraciones de creatina cinasa (FIG. 6) indicó que la fase rápida de liberación enzimática en el efluente venoso se produjo en el momento de la reperfusión. Los corazones testigo (tratados con vehículo) mostraron una marcada liberación de creatina cinasa en comparación con los corazones tratados con ETC-216. Además, los corazones tratados con ETC-216 mostraron una menor presión telediastólica ventricular izquierda (FIGS. 7 y 9), mayor presión desarrollada ventricular izquierda (FIG. 8), menor presión de perfusión de la arteria

45 coronaria (FIG. 10) y menos hidroperóxidos lipídicos (LHP) comparados con los corazones testigo (FIG. 11). Además, ETC-216 protegía contra los cambios morfológicos en el miocardio (FIG. 12). Estos resultados demuestran los efectos cardioprotectores de ETC-216 cuando se administra antes del suceso isquémico.

6.4. Ejemplo de referencia 4: Administración aguda y crónica en el corazón de conejo reperfundido con oclusión de LAD a 100 mg/kg

50 Este ejemplo demuestra los efectos cardioprotectores de ETC-216 en un modelo in vivo de isquemia de miocardio regional y reperfusión. Se seleccionó como sistema de ensayo apropiado el conejo Blanco de Nueva Zelanda para los propósitos de este estudio debido a su falta de aporte sanguíneo colateral al corazón haciendo así innecesario emplear determinaciones de flujo sanguíneo miocárdico. En este estudio, se usaron diferentes pautas de dosificación en grupos separados de conejos que se sometieron a 30 minutos de isquemia de miocardio regional

55 mediante ligadura de la arteria coronaria y reperfusión. Se usaron dos pautas de dosificación. En el primer protocolo, se ensayó ETC-216 como un pretratamiento único en el que se expuso el corazón a 100 mg/kg del agente justo antes del inicio de la isquemia regional, mientras que en el segundo protocolo se administraron dos tratamientos previos de 100 mg/kg (un día antes e inmediatamente antes) al inicio de la isquemia regional. Estos protocolos se muestran en la (FIG. 13). Este estudio se centró en los efectos de ETC-216 como un agente cardioprotector en un estudio in vivo en el que se sometió el corazón de conejo a isquemia de miocardio regional durante un período de 30

5 minutos seguido por reperfusión durante un mínimo de cuatro horas. Este ejemplo demuestra que ETC-216 es un agente cardioprotector cuando se administra después del suceso isquémico.

Los procedimientos usados en este estudio están de acuerdo con las pautas del Comité de la Universidad de Michigan sobre el uso y atención de animales. Los cuidados veterinarios se proporcionaron por la Unidad para la Medicina de Animales de Laboratorio de la Universidad de Michigan. La universidad de Michigan está acreditada por 10 la Asociación Americana de Cuidados Sanitarios de Animales de Laboratorio y el programa de uso de la atención a animales se adapta a las normas de la Guide for the Care and use of Laboratory Animals, DHEW (NIH) Publ. N.º 86

23.

En este estudio se usaron conejos blancos de Nueva Zelanda de Charles River con un peso aproximado de 2-3 kg. Tras la recepción, se asignó a los animales un número de identificación único. Los conejos se anestesiaron con una 15 mezcla de xilazina (3,0 mg/kg) y ketamina (35 mg/kg) intramuscularmente, seguido por una inyección intravenosa de pentobarbital sódico (30 mg/kg). La anestesia se mantuvo con inyecciones intravenosas de una solución de pentobarbital (30 mg/ml). Se insertó un tubo endotraqueal con manguito y se colocaron los animales en una ventilación de presión positiva con aire de la sala. Se aisló la vena yugular derecha y se canuló para administración de ETC-216 o un volumen de vehículo igual. Se aisló la arteria carótida derecha y se colocó un transductor de 20 presión con micropunta y catéter MillarTM situado inmediatamente anterior a las válvulas aórticas para controlar la presión arterial aórtica y obtener la primera derivada del pulso de presión (dP/dt). Durante todo el experimento se monitorizó un electrocardiograma de dos derivaciones. Se realizó una toracotomía y pericardiotomía izquierda, seguidas por identificación de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD). Se pasó una sutura de seda (3,0; Deknatel, Fall River, Mass.) por detrás de la arteria y se insertaron ambos extremos de la sutura en un tramo 25 corto de tubo de polietileno. La disminución de presión en el tubo de polietileno mientras se ejerce tensión hacia arriba sobre los extremos libres de la sutura comprime la arteria coronaria subyacente dando lugar a la oclusión del vaso y a isquemia miocárdica regional. La oclusión se mantuvo durante 30 minutos después de los cuales se liberó la tensión en la sutura y se retiró el tubo de polietileno permitiendo que se produjera la reperfusión. La isquemia miocárdica regional se verificó por la presencia de una región en el área de distribución del vaso ocluido y por

30 cambios en el electrocardiograma consistentes con la presencia de isquemia miocárdica regional transluminal (elevación del segmento ST).

La determinación del criterio de valoración principal consistía en medidas del tamaño del infarto como porcentaje del ventrículo izquierdo y como porcentaje del área en riesgo (FIGS. 14 y 15). A la finalización del estudio, se administró a los conejos, aunque anestesiados, heparina (1.000 U intravenosamente) después de lo cual se sacrificaron. Los 35 corazones se separaron y luego se prepararon para su perfusión a través de la aorta en un aparato de Langendorff con tampón de Krebs-Henseleit a un caudal constante de 22-24 ml/min. Los corazones se lavaron con tampón durante 10 minutos para garantizar que el tejido estaba limpio. Se perfundieron a través del corazón cuarenta y cinco mililitros de una solución al 1 % de cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) en tampón fosfato (pH 7,4). El TTC demarca el miocardio no infartado en el área en riesgo con un color rojo ladrillo, indicando la presencia de precipitado de 40 formazan derivado de la reducción de TTC por coenzimas presentes en el tejido miocárdico viable. El tejido lesionado irreversiblemente, que carece de deshidrogenasas citosólicas, es incapaz de formar el precipitado de formazan y aparece como amarillo pálido. La arteria descendente anterior izquierda (LAD) se ligó en una posición idéntica al área ligada durante la inducción de isquemia miocárdica regional. La bomba de perfusión se detuvo y se inyectaron 2 l de una solución al 0,25 % de Azul de Evans lentamente a través de un orificio en la rama lateral 45 conectada a la cánula aórtica. El colorante se hizo pasar a través del corazón durante 10 segundos para garantizar una distribución igual del colorante. La presencia de Azul de Evans se usó para demarcar el tejido ventricular izquierdo que no estuvo sometido a isquemia regional, en oposición a la región en riesgo. Se extrajo el corazón del aparato de perfusión y se diseccionó en secciones transversales en ángulos rectos al eje vertical. El ventrículo derecho, ápex y tejido auricular se descartaron. Ambas superficies de cada sección transversal se colocaron sobre 50 láminas de acetato transparentes. Las imágenes se fotocopiaron y ampliaron. Las fotocopias se escanearon y cargaron en Adobe PhotoShop (Adobe Systems Inc., Seattle, Wash.). Las áreas de las regiones sin riesgo del ventrículo izquierdo normal (NLV), área en riesgo y de infarto se determinaron calculando el número de píxeles que ocupaban cada área usando el programa Adobe Photo Shop Software. El área total en riesgo se expresa como porcentaje del ventrículo izquierdo. El tamaño del infarto se expresa como porcentaje del área en riesgo (ARR)

55 (FIGS. 14 y 15).

El porcentaje infartado del área en riesgo, porcentaje infartado del ventrículo izquierdo y área en riesgo porcentual del ventrículo izquierdo en conejos tratados una vez (es decir, tratamiento agudo) o tratados dos veces (es decir, tratamiento crónico) con ETC-216 (100 mg/kg) o un volumen equivalente de vehículo. Los datos son la media + el error típico de la media para n= 6 animales por grupo. Los asteriscos en la FIG. 14 indican diferencia significativa

60 con respecto al testigo respectivo.

Se realizaron otras determinaciones de criterios de valoración. El tamaño final del infarto puede verse influenciado por aumentos o disminuciones en la utilización de oxígeno por el miocardio. Dos determinaciones importantes de la compensación de oxígeno miocárdico son la frecuencia cardíaca y la carga de presión. El producto de la frecuencia por la presión (frecuencia cardíaca x presión arterial media) proporciona una aproximación del cambio en los requerimientos de oxígeno por el miocardio por el corazón. Por tanto, el producto frecuencia cardíaca -presión se calculó para determinar si una reducción observada en el tamaño del infarto estaba relacionada con el cambio en el

5 producto frecuencia-presión. La frecuencia cardíaca y la presión aórtica se monitorizaron continuamente durante el protocolo experimental y se usaron los datos para calcular el producto frecuencia -presión en momentos específicos en el estudio para cada uno de los grupos de experimentación.

El área en riesgo porcentual del ventrículo izquierdo se redujo en los corazones tratados con ETC-216 al comparar con los grupos testigo para la administración aguda y crónica, no obstante los resultados no fueron estadísticamente

10 significativos. El porcentaje infartado del área en riesgo y el porcentaje infartado del ventrículo izquierdo se redujeron significativamente en los corazones tratados con ETC-216 al comparar con los grupos testigo para la administración aguda y crónica. Estos resultados indican que ETC-216 es cardioprotector cuando se administra de forma aguda y crónica.

La actividad creatina cinasa del tejido miocárdico en las regiones en riesgo y sin riesgo se pueden comparar. El

15 principio del ensayo se basa en un aumento en la absorbancia de la mezcla de reacción a 340 nm como resultado de la reducción equimolar de NAD a NADH. La velocidad del cambio en la absorbancia es directamente proporcional a la actividad creatina cinasa. Se define una unidad como la cantidad de enzima que produce un micromol de NADPH por minuto en las condiciones del procedimiento de ensayo.

Tejido miocárdico sometido a un período prolongado de eliminación del flujo sanguíneo (isquemia) sin reperfusión

20 sufrirá cambios morfológicos característicos de necrosis junto con la presencia de células inflamatorias. La apariencia morfológica de la muerte celular inducida por isquemia difiere de la producida como resultado de reperfusión. La última está caracterizada por bandas de contracción y se denomina necrosis con bandas de contracción. El tejido cardíaco de cada uno de los grupos se conservó y preparó para el examen por microscopio electrónico.

25 La lesión por reperfusión isquémica se asocia con la acumulación de células inflamatorias, fundamentalmente neutrófilos, en el área en riesgo. Mieloperoxidasa (MPO) es una enzima presente casi exclusivamente en neutrófilos (Liu et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 287: 527-537, 1998). Por tanto, se puede anticipar que el tejido de las regiones respectivas del corazón se puede ensayar para determinar la actividad MPO como un indicador de lesión. También se puede anticipar que una intervención capaz de reducir la respuesta inflamatoria estaría asociada con una

30 reducción en la actividad MPO en la región en riesgo perfundida cuando se compara con tejido cardíaco de la región en riesgo de animales no tratados. Así, el cambio porcentual en la actividad MPO (región en riesgo/región sin riesgo) se reduciría en los corazones tratados con fármaco al compararlos con los corazones tratados con vehículo testigos.

Al finalizar el experimento, se determinó la actividad mieloperoxidasa (MPO) en tejido en un ensayo no validado sin controlar preliminar. Se obtuvieron muestras de tejido cardíaco de la región en riesgo y de la región sin riesgo y se 35 homogeneizaron en bromuro de hexadeciltrimetil amonio al 0,5 % y disolvieron en tampón fosfato potásico 50 mM, pH 6,0 (véase también Liu et al., 1998, J. Pharmacol. Exp. Ther. 287: 527-537). Los homogeneizados se centrifugaron a 12.500 g a 4 ºC durante 30 minutos. Se recogieron los líquidos sobrenadantes y se hicieron reaccionar con 0,167 mg/ml de dihidrocloruro de o-dianisidina (Sigma) y H2O2 al 0,0005 % en tampón fosfato potásico 50 mM, pH 6,0. Se midió el cambio en la absorbancia de forma espectrofotométrica a 460 nm. Se definió

40 una unidad de MPO como la cantidad de enzima que hidroliza 1 mmol de H2O2/minuto a 25 ºC. Los resultados de este experimento preliminar, no presentados en la presente memoria, parecen indicar que no hubo diferencias entre los corazones tratados con ETC-216 y vehículo en términos de lesión por reperfusión isquémica, no obstante, los resultados tienen que ser todavía validados, por ejemplo, por comparación de los niveles de MPO antes de la lesión por reperfusión isquémica.

45 Como se demuestra por el menor porcentaje infartado del área en riesgo y el porcentaje infartado del ventrículo izquierdo, los corazones tratados con ETC-216 estuvieron protegidos de la lesión por reperfusión isquémica. La cardioprotección fue conferida por ambos protocolos de dosificación, es decir, ETC-216 administrado como una única dosis de 100 mg/kg antes del inicio de la isquemia o ETC-216 administrado en dos dosis de 100 mg/kg, una dosis administrada un día antes de la isquemia y una segunda dosis administrada inmediatamente antes de la

50 isquemia.

6.5. Ejemplo de referencia 5: Determinación de la Dosis Eficaz Mínima para la Administración Aguda en el Corazón de Conejo Reperfundido con Oclusión de LAD

Este ejemplo demuestra la eficacia profiláctica de diversas dosis de ETC-216 cuando se administra en forma de un único tratamiento previo antes del inicio de isquemia regional. El estudio en el Ejemplo 2 se centró en los efectos de 55 ETC-216 como agente cardioprotector en un estudio in vivo en el que se sometió el corazón de conejo a isquemia de miocardio regional durante un período de 30 minutos seguida por reperfusión durante un mínimo de cuatro horas. Se usaron dos pautas de dosificación. En el primer protocolo, se ensayó ETC-216 como tratamiento previo único en el que la circulación sistémica se expuso a 100 mg/kg del agente justo antes del inicio de la isquemia regional, mientras que en el segundo protocolo, se administraron dos tratamientos previos de 100 mg/kg un día antes e

inmediatamente antes) del inicio de la isquemia regional. Ambas pautas de dosificación mostraron que cualquiera de uno o dos tratamientos con 100 mg/kg de ETC-216 es cardioprotector.

Por tanto, se ensayó ETC-216 como un tratamiento previo único en el que se expuso el corazón a dosis únicas del agente o un volumen equivalente de vehículo justo antes del inicio de la isquemia regional para determinar los 5 efectos sobre la cardioprotección. Los corazones se analizaron por los mismos procedimientos usados en el Ejemplo

2. Además, este protocolo se diseñó para encontrar una dosis eficaz mínima de ETC-216 para tratar el corazón de conejo para la protección de la isquemia.

Para encontrar la dosis mínima eficaz de ETC-216, se usó el mismo protocolo que para el tratamiento agudo (véase la FIG. 13) en el que los animales recibieron tratamientos únicos de 10, 3 o 1 mg/kg de ETC-216 o un volumen 10 equivalente de vehículo como se muestra en la FIG. 16. El área en riesgo (AAR) o región isquémica expresada como porcentaje del ventrículo izquierdo total para el grupo de tratamiento de 10 mg/kg fue similar en el grupo control y en el grupo de tratamiento (FIG. 17). Los conejos tratados con 10 mg/kg de ETC-216 desarrollaron infartos menores (p < 0,0005) expresados como porcentaje del AAR comparado con los conejos tratados con vehículo (FIG. 18). También se observó una reducción en el tamaño del infarto de miocardio (p < 0,0001) cuando los datos se

15 expresaron como porcentaje del ventrículo izquierdo total (FIG. 17).

Se observaron resultados similares con una dosis de 3 mg/kg. El AAR expresado como porcentaje del ventrículo izquierdo total fue similar en los grupos tratados con ETC-216 y tratados con vehículo (FIG. 17). Los conejos tratados con 3 mg/kg de ETC-216 desarrollaron menores infartos (p < 0,05) expresados como porcentaje del área con comparado con conejos tratados con vehículo (FIG. 17). Se observó una reducción en el tamaño del infarto (p <

20 0,05) cuando los datos se expresaron como porcentaje del ventrículo izquierdo total (FIG. 17).

No se apreciaron diferencias significativas con una dosis de 1 mg/kg entre ETC-216 y vehículo en el tamaño del AAR cuando se expresó como porcentaje del ventrículo izquierdo (FIG. 17). A 1 mg/kg, no se apreciaron diferencias significativas entre grupos como porcentaje del AAR (FIG. 17) y en el tamaño del infarto de miocardio expresado como porcentaje del ventrículo izquierdo total (FIG. 17).

25 En la FIG. 17 se muestra un resumen de los datos de cada uno de los cuatro grupos de tratamiento (es decir, 100, 10, 3 y 1 mg/kg) y sus respectivos controles. El AAR del infarto fue similar en cada uno de los cuatro grupos. Entre las cuatro pautas de dosificación, el tamaño del infarto, bien sea expresado como porcentaje de la región en riesgo o porcentaje del ventrículo izquierdo, comparado con los respectivos controles se redujo con dosis de ETC-216 de 100, 10 y 3 mg/kg. Por el contrario, el tamaño del infarto en el grupo de animales que recibieron 1 mg/kg no difirió

30 del observado en el grupo tratado con vehículo respectivo.

La FIG. 18 muestra ejemplos de cambios temporales en el colesterol no esterificado con lipoproteínas. Se extrajeron muestras de sangre de conejos justo antes de y periódicamente después de la administración de 1, 3, 10 o 100 mg/kg de ETC-216 o vehículo. Se muestran perfiles de colesterol no esterificado en muestras de sueros sanguíneos temporales representativos en los que las lipoproteínas séricas se separaron en base al tamaño por cromatografía 35 de exclusión molecular con análisis de colesterol no esterificado en línea. Se aprecia el aumento en el colesterol no esterificado con colesterol de alta densidad a los 45 minutos después de la administración de ETC-216, en especial a 100 mg/kg y en un menor grado a 10 mg/kg a pesar de la virtual ausencia de colesterol no esterificado en el agente de ensayo ETC-216 administrado intramuscularmente. Se aprecia también el aumento notable retardado en colesterol no esterificado con lipoproteínas de baja densidad a 210 y 270 minutos después de la administración de

40 10 mg/kg o 100 mg/kg de ETC-216. Se aprecia también que los cambios en el colesterol no esterificado con lipoproteínas no fueron evidentes en la dosis de tratamiento de 3 mg/kg de ETC-216 en los puntos temporales valorados, no obstante, esta dosis fue cardioprotectora como se muestra en la FIG. 17.

Los resultados demuestran que dosis de 100 mg/kg, 10 mg/kg y 3 mg/kg son dosis profilácticas eficaces de ETC

216.

45 6.6. Ejemplo de referencia 6: ETC-216 Previene la lesión por Isquemia-Reperfusión cuando se administra después del inicio de la oclusión de la LAD en el corazón de conejo ocluido-reperfundido

Este ejemplo demuestra la eficacia de ETC-216 en la prevención o reducción de la lesión por reperfusión isquémica cuando se administra después del suceso isquémico u oclusivo. Los estudios de los Ejemplos 2 y 3 ilustran el beneficio profiláctico del tratamiento del músculo cardíaco antes del inicio de la isquemia. Por tanto, para determinar 50 si ETC-216 podría proteger el músculo cardíaco después de iniciarse la isquemia, se ocluyó la LAD antes de la administración del agente de ensayo o vehículo. En este protocolo, se ensayó ETC-216 como tratamiento único en el que se expuso el corazón a 10 mg/kg del agente o un volumen equivalente de vehículo administrado durante los últimos 5 minutos de isquemia regional y continuando durante los primeros 55 minutos de reperfusión (FIG. 19). El AAR o región isquémica expresada como porcentaje del ventrículo izquierdo total para el grupo de tratamiento de 10

55 mg/kg fue similar en el grupo testigo (FIG. 20). Los conejos tratados con ETC-216 desarrollaron infartos menores (p < 0,001) expresado como porcentaje del AAR comparado con conejos tratados con vehículo (FIG. 20). Se observó también una reducción en el tamaño del infarto de miocardio (p < 0,0005) cuando los datos se expresaron como porcentaje del ventrículo izquierdo total (FIG. 20).

Este ejemplo demuestra que un único tratamiento administrado después de un suceso isquémico, mitiga o reduje la lesión por reperfusión isquémica.

Se han descrito diversas realizaciones de la invención. Se pretende que las descripciones y ejemplos sean ilustrativas de la invención y no la limiten, de hecho, para los expertos en la técnica será evidente que se pueden

5 realizar modificaciones a las diversas realizaciones de la invención descritas sin apartarse del espíritu de la invención o el alcance de las reivindicaciones adjuntas descritas a continuación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Complejo Apolipoproteína A-I Milano:1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (complejo Apo A-IM:POPC) para su uso en un procedimiento para el tratamiento de síndromes coronarios agudos en sujeto en necesidad de los mismos, en el que dicho complejo Apo A-IM:POPC se administra en una dosis de 1 mg de proteína/kg a 100 mg de

5 proteína/kg.
2.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el complejo Apo A-IM:POPC se administra a un sujeto en una dosis de 15 mg/kg.
3.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el complejo Apo A-IM:POPC se administra a un sujeto en una dosis de 45 mg/kg.

10 4. El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el complejo Apo A-IM:POPC se administra a un sujeto en una dosis de 15 mg/kg a 45 mg/kg.
5.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la APO A-I Milano es Apo A-I Milano recombinante.
6.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el complejo Apo A

15 IM:POPC está compuesto por Apolipoproteína A-I Milano y 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina en una relación de 1:1 peso de proteína/peso de lípido.
7. El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el complejo Apo A-IM:POPC es una formulación farmacéutica líquida estéril.
8. El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación farmacéutica 20 se administra a un sujeto en una dosis de 15 mg/kg.
9.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación farmacéutica se administra a un sujeto en una dosis de 45 mg/kg.
10.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación

farmacéutica se administra a un sujeto una vez a la semana durante 6 meses, 5 meses, 4 meses, 3 meses, 2 meses 25 o 1 mes.
11.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación farmacéutica se administra a un sujeto cada día durante 1 mes.
12.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación farmacéutica se administra a un sujeto cada 3 días durante 1 mes a 6 meses.

30 13. El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación farmacéutica se administra cada 10 días durante 1 mes a 6 meses.
14. El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación farmacéutica se administra cada 14 días durante 1 mes a 6 meses.
15. El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el procedimiento 35 comprende además intervención quirúrgica.
16.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 15 en el que la intervención quirúrgica comprende angioplastia coronaria percutánea transluminal o injerto de revascularización aortocoronaria.
17.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende además la

administración de otro fármaco para tratar, prevenir o aliviar las enfermedades, trastornos, síntomas o dolor 40 asociados con síndromes agudos coronarios.
18.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que volumen de ateroma porcentual en un vaso afectado del sujeto se reduce en -0,73 % a -1,29 %.
19.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el volumen de ateroma total en el vaso objetivo del sujeto se reduce en -15,1 mm3 a -12,6 mm3.

45 20. El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el grosor máximo medio de ateroma en el segmento coronario objetivo del sujeto se reduce en -0,039 mm a -0,044 mm.
21.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación farmacéutica se administra por vía intravenosa.
22.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 21 en el que la formulación farmacéutica se administra durante una hora.
23.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 21 en el que la formulación farmacéutica se administra durante tres horas.

5 24. El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación farmacéutica comprende Apo A-I Milano, POPC, un vehículo de sacarosa-manitol y un tampón fosfato.
25. El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 24 en el que el vehículo de sacarosamanitol consiste en 6,0 % al 6,4 % de sacarosa y 0,8 % al 1 % de manitol.
26.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 25 en el que el vehículo de sacarosa10 manitol consiste en 6,2 % de sacarosa y 0,9 % de manitol.
27.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación farmacéutica tiene un pH de 7,0 a 7,8.
28.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 27 en el que el pH es 7,5.
29.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación 15 farmacéutica comprende 12 mg/ml a 18 mg/ml de Apo A-I Milano.
30.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación farmacéutica comprende 11 mg/ml a 17 mg/ml de POPC.
31.

El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación farmacéutica comprende menos de 6.000 partículas de un tamaño mayor que 10 ∀m por 50 ml.

20 32. El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación farmacéutica comprende menos de 600 partículas de un tamaño mayor que 25 ∀m por 50 ml.
33. El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la formulación farmacéutica tiene una osmolalidad de 280 a 320 mOsm.
34. El complejo Apo A-IM:POPC para su uso de acuerdo con la reivindicación 33 en el que la formulación 25 farmacéutica tiene una osmolalidad de 290 mOsm.

EFECTO AGUDO DE UNA ÚNICA DOSIS DE ETC-216 SOBRE EL COLESTEROL SÉRICO NO ESTERIFICADO HDL EN

SUJETOS VARONES HUMANOS NORMALES (ETC-216-001)

FIGURA 1