RS20060273A - Farmaceutske formulacije, metode i protokoli doziranja u lečenju i prevenciji akutnih koronarnih sindroma - Google Patents

Abstract

Sadašnji pronalazak obezbeđuje metode i formulacije za lečenje i sprečavanje akutnih koronarnih sindroma. Metode trenutnog pronalaska omogućavaju sigurne i delotvorne doze Apolipoprotein A-I Milano: fosfolipidnih kompleksa za redukciju i stabilizaciju arterosklerotičnih naslaga (pločica). Takođe su obezbeđene i farmaceutske formulacije ApoA-I Milano: fosfolipidnih kompleksa.

Description

FARMACEUTSKE FORMULACIJE, METODE I

PROTOKOLI DOZIRANJA U LEČENJU I PREVENCIJI

AKUTNIH KORONARNIH SINDROMA

[0001]Sadašnja patentna prijava odnosi se na U.S. Privremene prijave broja 60/513.1 16 (podnesena 20. oktobra 2003.) i 60/517.016 (podnesena 03. novembra, 2003.) SAD, i obe prijave u svom punom obimu su ovde navedene kao reference.

1. OBLAST TEHNIKE U KOJU PRONALAZAK SPADA

[0002]Sadašnji pronalazak obezbeđuje nove formulacije i metode za lečenje ili prevenciju akutnih koronarnih sindroma. U prioritetnom aspektu, formulacije predstavljaju jedinične doze specificirane pH, osmolalnosti i čistoće. U prioritetnom postupku, formulacija se primenjuje nedeljno, mesečno ili godišnje u opsegu doza od oko 1 mg/kg do oko 100 mg/kg prilikom jedne primene. Dodatno, otkrivene su i doze i načini doziranja kao i specifična oboljenja za koja se doze ili načini doziranja nameravaju koristiti. Formulacije i metode koriste apolipoprotein A-I Milano: fosfolipidni kompleks.

2. STANJE TEHNIKE

[0003] Postupanje i lečenje u slučaju infarkta srčanog mišića znatno se izmenilo od prve polovine dvadesetog veka, napredujući od ere odmora u krevetu i posmatranja. do naglaska na tehnologiju, uključujući hemodinamičko nadgledanje i balonske katetere, do povećane pažnje na trombolitičku terapiju. (Antman i Braunvvald, " Acute Mvocardial Infarction " u Heart Disease, udžbenik kardiovaskularne medicine, 6. izdanje, vol. 2, Braumvald et al, urednici, 2001, W.B. Saunders Companv, Philadelphia). Terapeutski prilazi lečenju kardiovaskularnih oboljenja, koji su mnogo napredivali poslednjih 100 godina, praćeni su povećanim razumevanjem patološke osnove.

[0004]Skoro svi infarkti srčanog mišića nastaju kao posledica koronarne arteroskleroze, obično praćene koronarnom trombozom. Sporo akumuliranje naslaga (pločica) može biti nekarakteristično zbog nastanka sporednih sudova. Međutim, arterosklerotične pločice, posebno one bogate lipidima, sklone su iznenadnom prskanju. Prskanje pločica i odgovarajuća endotelijalna povreda prouzrokuju oslobađanje medijatora kao što su tromboksan A2, serotonin, adenozin difosfat, trombin, aktivirajući faktor krvnih pločica, tkivni faktor i kiseonični slobodni radikali. Ovi medijatori izazivaju agregaciju krvnih pločica i mehaničku opstrukciju često dovodeći do nastajanja tromba koji ometa protok krvi i snabdevanje kiseonikom. Uporno i jako ometanje snabdevanja srčanog mišića kiseonikom može dovesti do njegovog akutnog infarkta. (Videti, Rioufol et ah, 2002, Circulation 106: 804, Timmis, 2003, Hcart 89: 1268-72).

[0005] Glavni način farmakoterapije arteroskleroze je kao terapeutski domet činila hronična terapija u cilju sprečavanja, ili radi usporenja, razvoja arterosklerotskih pločica (naslaga) prvenstveno fokusiranjem na sniženje LDL ili "lošeg holesterola". Na primer, terapija statinom je značajno doprinela poboljšanom kardiovaskularnom zdravlju; međutim, kao negativni efekat mogu se javiti smetnje u vidu rabdomiolize. Osim toga, statini nedovoljno pomažu u akutnoj situaciji, na primer, u smislu redukuje ranjivu, nestabilnu arteroslkerotičnu pločicu za vreme ishemične epizode. Lečenje u akutnim slučajevima uveliko se oslanjalo na trombolitike (kao što je tPA) i hiruršku intervenciju kao što je perkutana transluminalna koronarna angioplastija (PTCA) i implantacija bajpasa koronarne arterije (CABG). Dok trombolitici omogućavaju olakšanje smanjivanjem ili eliminacijom okludovanog tromba, oni ne utiču na osnove patologije. Intervencije kao što je PTCA sa sobom nose rizike i često nisu pogodne u slučaju akutnih stanja pacijenata. Iz tog razloga sadašnje farmakološke terapije malo mogu učiniti da pomognu pacijentima u slučaju kada nestabilne naslage (pločice) predstavljaju rizik po pacijenta.( Videti,Nevvton i Krause 2002,Atherosclerosis S3:31-38).

[0006] HDL terapija se pojavljuje kao nova paradigma lečenja abnormalne lipidemije (dislipidemije) i arteroskleroze.Idem.Apolipoprotein A-I Milano (Apo A-I Milano) postao je interesantan zahvaljujući paradoksalnom nalazu da nosioci ovog varijantnog oblika apolipoproteina imaju nizak nivo HDL (''dobar holesterol") i smanjeni rizik od kardiovaskularnog oboljenja.[ Videti,Franceschiniel ai, 1980, J. Clin. Invest. 66:892-900,VVeisgraber et al., 1983,./. Biol. Chem.258: 2508-2513, Franceschiniet al.,1985,Atherosclerosis58: 159-174, Franceschiniet al., 1987, Arteriosclerosis7: 426-435). Nađeno je da Apo A-I Milano homodimeri redukuju intimalno zadebljavanje (zadebljavanje unutrašnjeg tkiva krvnih sudova) kod kunića hranjenih holesterolom (Ameliet al,1994,Circulation,90: 1935-41 i Somaetal.,1995,Cir. Res.76: 405-1 1). Kod ApoE deficitarnih miševa arteroslkerotične lezije su smanjene primenom multiplo niske doze, kao i pojedinačnom primenom visoke doze Apo A-I Milano: lipidnih kompleksa (Shahet al.,1998,Circulation97: 780-85 i Shahetal.,2001,Circulation103: 3047-50). Regresija pločica kod kunića takođe je demonstrirana pojedinačnim lokalnim infuzijama Apo A-I Milano: fosfolipidnih kompleksa u dozama od 500 mg i 1000 mg proteina na kunić. (Chiesaet al.,2002,Cir. Res.90: 974-80). Indukovane lezije na modelu kunića najvećim delom se sastoje od makrofaga i nisu adekvatne kompleksnijim lezijama kod ljudi. Iz tog razloga, nije sigurno da bi analogno lečenje bilo delotvorno u slučaju kompleksnijih pločica (naslaga) koje nalazimo u slučaju arteroskleroze kod ljudi. (Liet al.,1999,Arterioscler Thrumb Vasc Biol 19:378-383 i Shahetal.,2001,Circulation103: 3047-50).

[0007] Ipak, iprkos poboljšanom razumevanju patopshologije infarkta srčanog mišića i razvoju HDL terapija, sigurnih i delotvornih doza, neophodni su dodatni protokoli doziranja i farmaceutske formulacije za profilaktičku i terapeutsku upotrebu Apo A-I Milano ili Apo A-I Milano: lipidnih kompleksa kod ljudi.

3. IZLAGANJE SUŠTINE POSTUPKA

[0008] Sadašnji pronalazak obezbeđuje metode i farmaceutske formulacije za lečenje i prevenciju kardiovaskularnog oboljenja ili sličnih oboljenja uključujući arteroskleroze, akutne koronarne sindrome, ishemiju, ishemične reperfuzije prilikom povreda, angine i infarkta srčanog mišića i redukciju ili stabilizaciju arterosklerotičnih naslaga (pločica), redukciju naslaga (pločica) u okludovanim sudovima i promociju efluksa holesterola. Prema tome, sadašnji pronalazak obuhvata doze i protokole doziranja za upotrebu Apo A-I Milano: fosfolipidnog kompleksa i farmaceutske formulacije Apo A-I Milano: fosfolipidnih kompleksa i cilju lečenja ili prevencije kardiovaskularnog oboljenja ili sličnih oboljenja uključujući arteroskleroze, akutne koronarne sindrome, ishemične reperfuzije prilikom povreda, angine i infarkta srčanog mišića, i redukciju ili stabilizaciju arterosklerotičnih naslaga (pločica), redukciju naslaga (pločica) u okludovanim sudovima i promociju efluksa holesterola. Postupak i ovde opisane formulacije prouzrokuju brzu redukciju ili stabilizaciju nestabilnih arterosklerotičnih pločica (naslaga) koje, ukoliko se ne leče ili se leče konvencionalnim postupcima, mogu prsnuti i dovesti do ishemičnih događaja uključujući akutne koronarne sindrome.

[0009] Podnosioci patentne prijave su utvrdili da egzogeno dobijeni mimetik HDL-a, kao što je Apo A-I Milano, prioritetno kao Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks, omogućava jedinstveni prilaz lečenju i prevenciji kardiovaskularnih oboljenja ili sličnih oboljenja; takva oboljenja uključuju, ali nisu ograničena na, arteroskleroze, akutne koronarne sindrome, ishemiju, ishemične reperfuzije prilikom povreda, anginu i infarkt srčanog mišića, ili na redukciju ili stabilizaciju arterosklerotičnih naslaga (pločica) u suženim ili okludovanim sudovima. Metode, uključujući doze i protokole doziranja i farmaceutske formulacije, sadašnjeg pronalaska omogućavaju sigurno, delotvorno i ne-Hirurško lečenje koje brzo promoviše efluks holesterola i njegovu cirkulaciju iz arterosklerotičnih naslaga (pločica). Promocija brzog efluksa holesterola smanjuje zapreminu ateroma u jednom ili više obolelih sudova. Smanjene aterome (masa naslage (pločice) koja se sastoji od degenerisane odebljale arterijske intime do kojih dolazi u arterosklerotičnim sudovima) omogućava povećani protok krvi i smanjuje rizik od ishemije, uključujući nestabilne angine, infarkt srčanog mišića i akutni koronarni sindrom.

[0010] Pre sadašnjeg pronalaska koji obezbeđuje farmaceutske formulacije Apo A-I M i specifične doze za lečenje i prevenciju od kardiovaskularnih oboljenja, uključujući akutne koronarne sindrome, arteroskleroze, angine, infarkta srčanog mišića, i ishemičnih reperfuzija prilikom povreda, konvencionalna arterosklerotična terapija se usredsređivala na sniženje LDL ili ''lošeg holesterola'' kao svoj terapeutski domet. Ove konvencionalne LDL terapije, na primer, lečenje pomoću statina, mogu zahtevati mesece tretmana pre nego što se nivo LDL seruma smanji u subjektu. Kod akutnog ili kardiovaskularnog oboljenja koje se pojavljuje, konvencionalna terapija se uveliko oslanjala na hiruršku intervenciju kao što je perkutano transluminalna koronarna angioplastija (PTCA) kao i implantacija bajpasa koronarne arterije (CABG). Međutim, Hirurška intervencija je često kontraindikovana kod nekih pacijenata u hitnoj situaciji, posebno kod pacijenata lošeg ukupnog zdravlja. Štaviše, ove konvencionalne metode ne omogućavaju ne-hirurško. farmakološko lečenje delotvorno u akutnoj situaciji. Osim toga, konvencionalne terapije fokusirane su na lečenje simptoma kardiovaskularnog oboljenja i akutnog koronarnog sindroma posebno u cirkulatornom sistemu. Konvencionalne terapije kako je gore opisano i detalnjije dole ispod, fokusirane su na redukciju nivoa LDL holesterola, redukciju formiranja krvnih začepljenja i sniženje krvnog pritiska što ne leči niti sprečava osnovne uzroke kardiovaskularnog oboljenja niti akutnih koronarnih sindroma, stabilizaciju, redukciju niti modifikaciju naslage (pločice) unutar zida krvnog suda.

[0011] Farmaceutske formulacije i metode, uključujući doze i sadašnjim pronalaskom obezbeđeni programi doziranja su sigurni, delotvorni i deluju brzo redukujući ili stabilizujući arterosklerotične naslage (pločice). Ovde opisane doze su brzo delujuće, i omogućavaju redukciju arterosklerotičnih naslaga (pločica) u malom vremenskom periodu u samo nekoliko nedelja promovišući cirkulaciju holesterola. U nekim oličenjima, ovde opisane doze se mogu upotrebiti za lečenje subjekta koji pati od akutnih koronarnih sindroma ili oboljenja vezanih za ishemiju ili začepljenost krvnih sudova. U nekim oličenjima, ovde opisane doze mogu se upotrebiti u cilju sprečavanja progresije oboljenja kada arterosklerotične pločice (naslage) predstavljaju rizik za subjekta. Nadalje, oboljenje čija se progresija sprečava može biti i okluzija krvnog suda ili sprečavanje prskanja nestabilne arterosklerotične naslage (pločice) što može voditi ishemičnim uslovima uključujući akutne koronarne sindrome i ishemične reperfuzije prilikom povreda.

[0012]Ovde obezbeđene metode i farmaceutske formulacije su tako delotvorne da pojedinačna doza od 45 mg/kg može stimulisati cirkulaciju holesterola iz arterosklerotičnih naslaga (pločica). U nekim oličenjima, pojedinačna visoka doza, na primer oko 45 mg/kg, Apo A-I Milano: fosfolipidnog kompleksa ili njegova farmaceutska formulacija, može se primeniti subjektu. U nekim oličenjima, jedna ili više visokih doza Apo A-I Milano: fosfolipidnog kompleksa ili njegove farmaceutske formulacije, može se primeniti na subjekt za čime sledi jedna ili više istih doza (45 mg/kg) ili nižih doza, na primer, oko 1 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 10 mg/kg ili oko 15 mg/kg. Na primer, subjektu se mogu primeniti dve doze od po 45 mg/kg a potom dodatna doza od 10 mg/kg. Dodatno, može se primeniti suprotni protokol polazeći od niske doze za čime sledi visoka doza. Naravno, pod uslovima akutnog oboljenja prioritetno se prvo primenjuju više doze. U nekim oličenjima, subjekt se može tretirati jednom nedeljno tokom nekoliko nedelja pomoću Apo A-I Milano: fosfolipidnog kompleksa ili njegove farmaceutske formulacije a potom naizmenično tretirati, na primer, dva puta godišnje, jednom godišnje ili svake dve godine, prema potrebi, da bi se zadržali otvoreni i ne-okludovani krvni sudovi, i da bi se smanjio rizik od prskanja naslage (pločice) i negativnih vaskularnih događaja.

[0013]U nekim oličenjima, metode za lečenje ili prevenciju akutnih koronarnih sindroma uključuje primenu Apo A-I Milano: fosfolipidnih kompleksa ili njihove farmaceutske formulacije približno svakog dana, približno svakog drugog dana, približno svakog 3. dana, približno svakog 4. dana, približno svakog 5. dana, približno svakog 6. dana, približno svakog 7. dana, približno svakog 8. do 10. dana ili približno svakog 11. do 14. dana subjektu kome je to potrebno. U prioritetnom oličenju, Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleksi ili njihove farmaceutske formulacije mogu se primeniti približno svakog 7. dana. U nekim oličenjima, primena Apo A-I Milano: fosfolipidnih kompleksa ili njihove farmaceutske formulacije mogu se jednokratno promeniti. U nekim oličenjima, primena se može nastaviti približno 1 nedelju, približno 2 nedelje, približno 3 nedelje, približno 4 nedelje, približno 5 nedelja, približno 6 nedelja, približno 7-12 nedelja, približno 13-24 nedelje ili približno 25-52 nedelja. U nekim prioritetnim oličenjima, primena Apo A-I Milano: fosfolipidnih kompleksa ili njihove farmaceutske formulacije primenjuje se približno svakog 7. dana tokom oko 5 nedelja. U nekim oličenjima, primena može biti prekidana posle, na primer, oko 5 nedelja. Na primer, subjekt se može tretirati jednom nedeljno tokom oko 5 nedelja a zatim lečiti oko 3 do oko 4 puta tokom sledeće godine. U nekim oličenjima, ovde opisane farmaceutske formulacije mogu se primeniti subjektu naizmenično da bi se održala prolaznost krvnog suda. Na primer, doza od oko 15 mg/kg može se primeniti na farmaceutsku formulaciju primene približno svakog 10 dana tokom približno 7 nedelja a zatim tretirati, na primer, približno 26 nedelja kasnije ili približno 52 nedelje kasnije. Druga oličenja, uključujući raspored doziranja i upotrebu postupka u kombinaciji sa konvencionalnom terapijom lekovima i hirurškim intervencijama su dole opisane.

[0014] Sadašnji pronalazak obezbeđuje farmaceutske formulacije za primenu Apolipoproteina A-I Milano (Apo A-I Milano) za lečenje ili prevenciju akutnih koronarnih sindroma i ishemične reperfuzije prilikom povreda. U prioritetnom oličenju, Apo A-I Milano je, za ovde opisane metode, kompleksiran sa lipidom. Na primer, lipid može biti neki fosfolipid, prioritetno l-palmitoil-2-oleoil-.w-glicero-3-fosfoholin (takođe nazvan, 1-palmitoiI-2-oleoil-fosfatidilholin ili POPC). U najprioritetnijem oličenju, Apo A-I Milano: POPC kompleks može biti farmaceutska formulacija. U drugom prioritetnom oličenju, Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleksa ili njegove farmaceutske formulacije mogu se primeniti u dozama od oko 1 mg protein/kg do oko 100 mg protein/kg subjektu kome je to potrebno.

[0015] U nekim oličenjima, metode mogu uključivati primenu doza Apo A-I Milano: fosfolipidnih kompleksa ili njihovih injektabilnih ili tečnih farmaceutskih formulacija za lečenje od akutnog koronarnog sindroma. U prioritetnom oličenju, ApoA I M: fosfolipidni

kompleksi ili njihove farmaceutske formulacije mogu se primeniti u dozama od oko 1 mg (protein)/kg do oko 100 mg (protein)/kg subjektu kome je to potrebno. U nekim oličenjima, metod može uključiti lečenje ili prevenciju akutnog koronarnog sindroma primenom Apo A-I Milano: fosfolipidnih kompleksa ili njihovih farmaceutskih formulacija kao intravenoznih infuzija. U nekim oličenjima, metode mogu uključiti primenu kao intravenoznih "push" infuzija. Pod intravenoznim push infuzijom, podrazumeva se da se Apo A-I Milano: fosfolipidi ili njihove farmaceutske formulacije primenjtiju intravenozno u kratkom vremenskom periodu, na primer do 5 minuta, na primer, 2-5 minuta. U nekim oličenjima, primena Apo A-I Milano: fosfolipidnih kompleksa ili njihove farmaceutske formulacije

može da uključuje i kontinualne intravenozne infuzije. Pod kontinualnom intravenoznom infuzijom podrazumeva se da se Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleksi ili njihove farmaceutske formulacije primenjuju kontinualno tokom dužeg perioda od 2-5 minuta, na primer, oko 30 minuta do oko 3 sata. Kontinualne intravenozne infuzije mogu se primeniti uz pomoć neke infuzione pumpe ili uređaja. U nekim oličenjima, primena Apo A-I Milano: fosfolipida ili njihovih farmaceutskih formulacija može biti kombinovana sa kontinualnim intravenoznim infuzijama i intravenoznim push infuzijama ("bolus doze") ApoA-I Milano: fosfolipidnih kompleksa ili njihovim farmaceutskim formulacijama. Bolus doza može se primeniti pre, posle ili za vreme kontinualne infuzije. U nekim oličenjima primena ApoA-I Milano ili lipidnih kompleksa ili njihovih farmaceutskih formulacija mogu biti u kombinaciji sa drugim lekovima koji leče ili sprečavaju kardiovaskularna oboljenja, prateća ili indukovana oboljenja ili omogućavaju simptomatično olakšanje. Primena drugih lekova može biti konkurentno ili sekvencijalno.

[0016] Metode obezbeđuju intravenozne infuzije ovde opisanih farmaceutskih formulacija. Za infuziju se može upotrebiti bilo koji pogodni sud, uključujući periferne sudove kao što su sudovi u antekubitalnom udubljenju ruke ili centralnom pravcu u grudi. U prioritetnim oličenjima, vrši se infuzija farmaceutske formulacije u cefalični ili srednji kubitalni sud na antekubitalnoj fosi ruke subjekta.

[0017] U nekim oličenjima, metode mogu uključivati primenu farmaceutske formulacije ApoA-I Milano: fosfolipidnog kompleksa visokih ili niskih doza ili njihovu kombinaciju. Kako je dole opisano, visoka doza farmaceutske formulacije tokom kratkog intervala doziranja može sigurno i efikasno da redukuje zaprem inu ateroma kod subjekata sa delimično ili potpuno okludovanim krvnim sudovima. U nekim oličenjima, farmaceutska formulacija može se primeniti pre, za vreme ili posle hiruške intervencije kao što je PTCA radi deblokiranja okludovanog suda. U nekim oličenjima, jedna ili više naizmeničnih doza mogu se primeniti subjektu radi održavanja prohodnosti prethodno okludovanog krvnog suda ("doza održavanja").

[0018] Sadašnji pronalazak obezbeđuje novi prilaz lečenju ili prevenciji ishemične reperfuzije prilikom povreda, to jest, upotrebu ovde opisanih farmaceutskih formulacija ili doza Apo A-I Milano kompleksa za lečenje ishemične reperfuzije. Korisne doze za ovo lečenje uključuju doze do 100 mg/kg ApoA-I Milano: fosfolipidnih kompleksa koje se primenjuju subjektu kome je to potrebno. U nekim oličenjima, metode mogu uključivati primenu farmaceutske kompozicije ApoA-1 Milano: fosfolipidnih kompleksa u dozama od oko 1 mg/kg do oko 100 mg/kg telesne težine subjekta. U specifičnim oličenjima, metode mogu uključivati primenu farmaceutske kompozicije ApoA-I Milano: fosfolipidnih kompleksa pri dozama od oko 10 mg/kg do oko 50 mg/kg. U prioritetnom oličenju, metoda može uključivati primenu farmaceutske kompozicije ApoA-I Milano: fosfolipidnog kompleksa pri specifičnoj dozi od oko 15 mg/kg. U drugom prioritetnim oličenju, metode mogu uključivati primenu farmaceutske kompozicije ApoA-I Milano: fosfolipidnog kompleksa pri specifičnoj dozi od oko 45 mg/kg. Sadašnji pronalazak takođe prioritetno uključuje upotrebu od 15 mg/kg samostalno ili u kombinaciji sa dozom od 45 mg/kg. Slično, doza od 45 mg/kg može se upotrebiti samostalno ili u kombinaciji sa dozom od 15 mg/kg za lečenje ili prevenciju ishemične reperfuzije prilikom povreda.

[0019] Ovde obezbeđena farmaceutska formulacija uključuje Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks pogodnog pH, osmolalnosti, toničnosti, čistoće i sterilnosti što omogućava sigurnu primenu subjektu. Farmaceutske formulacije mogu biti formulisane za pojedinačnu, jednokratnu upotrebu ili mogu biti formulisane da sadrže antimikrobske ekscipijente, kako je to dole opisano, što čini farmaceutske formulacije pogodnim za multiple doze. U nekim oličenjima, farmaceutska formulacija može se nalaziti u sterilnim prethodno napunjenim špricevima ili sterilnim prethodno napunjenim vrećicama koje se mogu zamrznuti ili držati na hladnom. U prioritetnim oličenjima, Apo A-I Milano: lipidni kompleks je Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks. U više prioritetnim oličenjima, Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks je Apo A-I Milano: POPC.

[0020] U nekim oličenjima, farmaceutska formulacija može se nalaziti kao jedinična doza ili pakovanja za jediničnu upotrebu. Kako je poznato onima obučenim u oblasti, pakovanje jedinične doze obezbeđuje isporuku jedne doze leka subjektu. Metode sadašnjeg pronalaska omogućavaju pakovanje jedinične doze farmaceutske formulacije koja uključuje, na primer, 1050 mg Apo A-I Milano proteina u pakovanju. Na primer, 1050 mg Apo A-I Milano proteina, je količina kojom se primenjuje 15 mg/kg Apo A-I Milano osobi od 70 kg. Jedinična doza može se nalaziti, na primer, u sterilnim bočicama za pojedinačnu upotrebu, u sterilnom prethodno napunjenim špricom, u sterilnim prethodno napunjenim vrećicama (tj., pigibek) i slično.

[0021] U nekim oličenjima, farmaceutska formulacija može biti u pakovanju jedinične doze spremne za upotrebu. Kako je poznato onima obučenim u oblasti, pakovanje jedinične doze je pogodno, veličine koja se može prepisati receptom, spremno za pacijenta jedinično obeležena za direktnu distribuciju od strane distributora lekova. Pakovanje jedinične doze sadrži farmaceutsku formulaciju u količini neophodnoj za tipični interval lečenja i trajanja za datu indikaciju. Metode sadašnjeg pronalaska omogućavaju pakovanje jedinične doze farmaceutske formulacije koja uključuje, na primer, Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks u količini dovoljnoj za lečenje odraslog muškarca ili žene prosečne veličine pomoću 15 mg/kg Apo A-I Milano proteina intravenozno jednom nedeljno tokom 5 nedelja. Tako, pakovanje jedinične doze spremne za upotrebu u cilju gore opisane upotrebe imalo bi pet doza Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks (raspoloživ u staklenoj flašici ili u prethodno napunjenom špricu). U jednom oličenju, jedinično pakovanje spremno za upotrebu može da uključuje farmaceutsku formulaciju koja uključuje Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks u količini dovoljnoj za lečenje odraslog muškarca ili žene prosečne veličine dozom od 15 mg/kg ili 45 mg/kg jednom nedeljno tokom 6 nedelja. Onima obučenim u oblasti biće očigledno da su ovde opisane doze zasnovane na količini telesne težine subjekta kome se primenjuje lek.

[0022] Farmaceutske formulacije mogu biti obeležene. i biti dodatno obeležene, radi identifikacije formulacije koju sadrže, a mogu sadržavati i druge informacije korisne za one koji brinu o zdravlju subjekta, samog pacijenta koji se leči od akutnog koronarnog sindroma, uključujući, ali ne ograničavajući se na, uputstva za upotrebu, dozu, interval doziranja, trajanje tretmana, indikaciju, kontraindikacije, upozorenja, mere predostrožnosti, način rukovanja i uputstvo za čuvanje i slično.

4. KRATAK OPIS SLIKA

[0023] Na slici 1 prikazan je akutni efekat jedinične doze ETC-216 na serum HDL kod normalnih muških subjekata;

[0024] Na slici 2 (A) prikazano je motorizovano povlačenje IVUS katetera za oslikavanje s početkom na distalnoj potpornoj grani (položaj C) i završavajući se na proksimalnoj grani (položaj A). Putanja katetera ilustrovana je na angiogramu;

[0025] Na slici 2 (B) dat je primer dobijenog reprezentativnog preseka krvnog suda na svakih 0,5 mm sve do proksimalne grane;

[0026] Na slici 2 (C) prikazanje intermedijerni presek krvnog suda;

[0027] Na slici 2 (D) prikazana je dislalna grana na IVUS slici;

[0028] Na slici 3 (A) prikazanje presek za analizu;

[0029] Na slici 3 (B) prikazana je spoljašnja elastična membrana (EEM);

[0030] Na slici 3 (C) prikazana je površina lumena;

[0031]Na slici 3 (D) prikazanje proračun debljine maksimalne aterome merene oduzimanjem preseka površine lumena od površine EEM;

[0032]Na slici 4 (A) prikazana je početna slika krvnog suda pacijenta pre primene ETC-216; a

[0033]Na slici 4 (B) prikazana je potonja slika krvnog suda pacijenta posle primene ETC-216. Površina aterome je smanjena od 8,1 to 5,35 mm<J>praktično uz nepromenjenu površinu lumena.

[0034]Na slici 5 dat je primer protokola gde su izolovana srca kunića lečena pomoću medij uma ili protein/lipidnog kompleksa sadašnjeg pronalaska (ETC-216) pre nastanka ishemije;

[0035]Na slici 6 prikazana je aktivnost kreatin kinaze u koronarnom venoznom efluentu;

[0036]Na slici 7 prikazan je "real-time monitoring" funkcije srca sakupljen iz medijuma i izolovanog srca kunića lečenog pomoću ETC-216 u Langendorff-ovom aparatu;

[0037]Na slici 8 prikazane su promene u nastalom pritisku leve komore (LVDP) izolovanog srca kunića u zavisnosti od vremena, pre, za vreme i posle 30 minuta od ukupnog ishemičnog zaustavljanja i 60 minuta posle reperfuzije;

[0038]Na slici 9 prikazane su promene u nastalom završnom dijastoličkom pritisku leve komore (LVEDP) izolovanog srca kunića u zavisnosti od vremena pre, za vreme i posle 30 minuta od ukupnog ishemičnog zaustavljanja i 60 minuta posle reperfuzije;

[0039]Na slici 10 prikazane su promene pritiska kod koronarne perfuzije (CPP) i izolovanog srca kunića u zavisnosti od vremena pre. za vreme i posle 30 minuta od ukupnog ishemičnog zaustavljanja i 60 minuta posle reperfuzije;

[0040]Na slici 11 prikazanje sadržaj lipidnog hidroperoksida u tkivu homogenata iz medijuma i ETC-216 srca lečenog kunića podvrgnutog ukupnom ishemičnom zaustavljanju tokom 30 minuta za čime sledi 60 minuta reperfuzije;

[0041]Na slici 12 prikazane su slike uzoraka srčanog mišića dobijene elektronskim mikroskopom srca kunića lečenih nosačem i ETC-216;

[0042]Na slici 13 prikazanje dodatni protokol sadašnjeg pronalaska gde jc jedan prethodni tretman (lečenje) primenjen pre nastanka ishemije kod grupe gde dolazi do akutne primene i dva prethodna tretmana (lečenja) primenjena pre nastanka ishemije kod grupe gde dolazi do hronične primene;

[0043]Na slici 14 prikazanje protokol za određivanje veličine infarkta;

[0044] Na slici 15 prikazanje procenat infarkta na rizičnoj površini, procenat infarkta leve komore, i procenat rizične površine leve komore kod kunića lečenih jednom (tj., akutni tretman) ili lečen dva puta (tj., hronični tretman) pomoću ETC-216 (100 mg/kg) ili ekvivalentnom zapreminom medijuma;

[0045] Na slici 16 prikazanje dodatni protokol sadašnjeg pronalaska gde su kunići lečeni medijumom pre nastanka ishemije (Grupa 1) ili pomoću 10, 3 ili 1 mg/kg ETC-216 (Grupa 2);

[0046] Na slici 17 prikazanje procenat infarkta na rizičnoj površini, procenat infarkta leve komore, i procenat rizične površine leve komore određene kod kunića lečenih jednom (tj., akutni tretman) pomoću 10, 3 ili 1 mg/kg ETC-216 ili pomoću ekvivalentne zapremine medijuma saharoza-manitol za svaku grupu;

[0047] Na slici 18 prikazane su promene kod lipoprotein neesterifikovanog holesterola u zavisnosti od proteklog vremena;

[0048] Na slici 19 prikazanje dodatni protokol sadašnjeg pronalaska gde je pojedinačni tretman medijumom ETC-216 primenjen tokom poslednjih 5 minuta od 30 minuta ishemičnog perioda; i

[0049] Na slici 20 prikazanje procenat infarkta na rizičnoj površini, procenat infarkta rizične površine leve komore, i procenat rizične površine leve komora određene kod kunića.

5. DETALJAN OPIS SADAŠNJEG PRONALASKA

5.1. Definicije

[0050] Kako se ovde koristi, sledeći izrazi imaće sledeće značenje:

[0051] Izrazi "lečiti", "lečenje'' ili "tretman" odnosi se na metod (postupak) za ublažavanje ili otklanjanje bolesti, oboljenja i/ili njihovih simptoma.

[0052] Izraz "terapeutski delotvorna količina" odnosi se na onu količinu Apo A-I Milano ili lipidnog kompleksa ili njegove farmaceutske formulacije dovoljne da do nekog obima ublaže jedan ili više simptoma stanja ili oboljenja koje se leći.

[0053] Izrazi "sprećiti", "sprečavanje" ili "prevencija" odnosi se na metodu kojom se subjekt štiti od dobijanja bolesti, oboljenja i/ili njihovih simptoma. U nekim oličenjima, izrazi "sprečiti", "sprečavanje" ili "prevencija" odnosi se na postupak za smanjenje rizika od dobijanja bolesti, oboljenja i/ili njihovih simptoma.

[0054] Izraz "profilaktički delotvorna količina" odnosi se na onu količinu ApoA-I Milano ili lipidnog kompleksa ili njegove farmaceutske formulacije dovoljne da rezultuje prevencijom, odloženim početkom ili povratkom jednog ili više simptoma stanja ili oboljenja koja se leči.

[0055] Izraz "akutni koronarni sindromi" odnosi se na ishemična oboljenja kao što je nestabilna angina, Q talas i ne-Q talas infarkta srčanog mišića ili kako je dato od strane International Classification of Desease 9. verzija (ICD-9) koju će zameniti 10. verzija (ICD-10). Infarkt srčanog mišića može postojati sa ili bez podizanja ST-segmenta na elektrokardiografu.

[0056] Izraz "ishemija" odnosi se na lokalnu anemiju do koje dolazi mehaničkom ili biološkom indukcijom, npr., spazam, tromboza, stenozna opstrukcija (uglavnom arterijsko suženje ili prekid) snabdevanja krvlju. Izraz "miokardijalna ishemija" odnosi se na neadekvatnu cirkulaciju krvi ka miokardiumu (srčanom mišiću), obično kao rezultat oboljenja koronarne arterije.

[0057] Izraz "ishemična reperfuzija" odnosi se na ponovno uspostavljanje povećane količine kiseonikom bogate krvi ka tkivu.

[0058] Izraz "kardiovaskularna oboljenja" odnosi se na srce, krvne sudove i bolesti cirkulacije krvi kao što su infarkt srčanog mišića, akutni koronarni sindrom, arteroskleroza, angina, ishemična reperfuzija prilikom povreda i slična oboljenja.

[0059] Izraz "hirurška intervencija" kako se ovde koristi, odnosi se na manuelne, ne-farmakološke ili operativne metode. Hirurška intervencija se može koristiti u dijagnostičke, radiološke, profilaktičke svrhe ili radi lečenja.

[0060] Izraz "nestabilna angina" odnosi se na promenu frekvence, ozbiljnosti ili trajanje tretmana od simptoma hronične stabilne angine, kao sto je bol u grudima koji može da se širi prema vilici i rukama ili epigastrični bol. Hronična stabilna anginaje bol u grudima, koji može da se širi prema vilici i rukama subjekta sto je indukovano fizičkim naporima, jelom i/ili stresom, a oslobađa se odmaranjem bez skorašnje promene frekvence ili ozbiljne aktivnosti neophodne da nastanu simptomi.

[0061] Izraz "farmaceutska formulacija" odnosi se na kompozicije koje uključuju Apo A-I Milano ili Apo A-I Milano: lipidni kompleks kao i pogodne razblaživačc, nosače, medijume ili ekscipijente pogodne za primenu subjektu. Ovaj izraz uključuje, ali nije ograničen na, oralne, parenteralne i topikalne kompozicije kako je opisano dole niže.

[0062] Izraz "oko" odnosi se na relativni izraz koji izražava aproksimaciju od plus ili minus 20 % neke nominalne vrednosti. Za polje ovog otkrivanja, ovakav nivo aproksimacije je pogodan osim ukoliko se vrednosl specifično ne navodi i ne zahteva manje odstupanje.

[0063] Izraz "oznaka" odnosi se na prikaz pisanim, štampanim ili grafičkim delom neposredno na kontejneru u kome se nalazi artikal, na primer, pisani materijal prikazan na staklenoj flašici koja sadrži farmaceutski aktivno sredstvo.

[0064] Izraz "obeležavanje" odnosi se na sve oznake i druge pisane, štampane ili grafičke materijale u vezi bilo kog artikla ili bilo kog njegovog kontejnera ili ambalaže ili propratnog teksta koji prate takve artikle, na primer, uložak pakovanja, video trake sa instrukcijama ili sa instrukcijama datim na DVD nosaču koje prate ili su vezane za kontejner koji sadrži farmaceutski aktivno sredstvo.

5.2. Metode Iečenja

[0065] Sadašnji pronalazak obezbeđuje metode i formulacije za lečenje ili prevenciju akutnih koronarnih sindroma, uključujući nestabilnu anginu, infarkt srčanog mišića ST-segmenta elevacije i ne-Q infarkta srčanog mišića. Sigurne i delotvorne doze ovde opisanih farmaceutskih formulacija odredili su podnosioci ove patentne prijave za lečenje i prevenciju od akutnih koronarnih sindroma.

[0066] Zasnovan na sadašnjem razumevanju, proistekao je okvir kojim se reorganizuju kiinička predstavljanja, sada nazvanih akutnih koronarnih sindroma ("ACS").Id.Akutni koronarni sindromi uključuju nestabilne angine, Q infarkta srčanog mišića i infarkta srčanog mišića ne-ST-segmenta elevacije i glavni su uzroci morbidnosti (bolesnih stanja) i smrtnosti, posebno u toku prvih 24 sata posle pojave bolesti. (Schoenhagenet al.,2000,Circulation101: 598-603). ACS jeste ishemična nelagodnost koja se javlja bez ST segmenta elevacije na elektrokardiografu. Ishemija se često razvija u nestabilnu anginu, Q i ne-Q infarkta srčanog mišića. (Antman i Braunvvald, " Acute Mvocardial Infarction " u Heart Disease, A Textbook of Cardiovascular Medicine,, 6. izdanje, vol. 2, Braunvvaldet al.,urednici, 2001, W.B. Saunders Companv, Philadelphia).

[0067] Metode i formulacije sadašnjeg pronalaska omogućavaju jedinstveni i delotvorni prilaz lečenju arteroskleroze i akutnih koronarnih sindroma. U metodama sadašnjeg pronalaska, Apo A-l Milano: fosfolipidni kompleks ili njegove farmaceutske formulacije omogućavaju ne-hiruršku terapiju koja preokreće patofiziološku osnovu oboljenja umesto da omogući olakšanje simptoma oboljenja. Metode sadašnjeg pronalaska omogućavaju primenu Apo A-I Milano. Apo A-I Milano: fosfolipidnog kompleksa ili njihove farmaceutske formulacije što omogućava HDL terapiju koja promoviše efluks holesterola, preokreće transport holesterola i smanjuje arterosklerotične naslage (pločice). Bez vezivanja za bilo koju teoriju, veruje se da Apo A-I Milano, Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks ili njihove farmaceutske formulacije podražavaju funkcionalni HDL koji promoviše efluks holesterola i preokreće transport holesterola, smanjuje zapreminu aterome i može da stabilizuje arterosklerotične naslage (pločice).

[0068] Sadašnji pronalazak obezbeđuje metode za lečenje akutnih koronarnih sindroma. U prioritetnim oličenjima, Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleksi ili njihove farmaceutske formulacije, kako je to dole opisano, mogu se primeniti u dozama od oko 1 mg (protein)/kg do oko 100 mg (protein)/kg, prioritetno doze od 1 mg (protein)/kg do 50 mg (protein)/kg; najprioriteti!ije, 15 mg/kg ili 45 mg/kg. Podnosioci ove patentne prijave su pokazali da su navedene doze sigurne, delotvorne i da se dobro tolerišu od strane subjekta koji pati od ili je podložan riziku od dobijanja akutnih koronarnih sindroma kako je ovde to detaljno opisano.

[0069] Sadašnji pronalazak obezbeđuje metode za lečenje ili prevenciju akutnih koronarnih sindroma uključujući ublaženje ili poboljšanje znakova ili simptoma akutnih koronarnih sindroma. U nekim oličenjima, metode omogućavaju lečenje ili redukciju koronarne arteroskleroze. U nekim oličenjima, metode omogućavaju promociju efluksa holesterola iz obolelih krvnih sudova. U nekim oličenjima, metode omogućavaju iniciranje preokreta transporta holesterola. U jednom oličenju, metode omogućavaju smanjenje zapremine aterome u obolelim krvnim sudovima. U nekim oličenjima, oboleli krvni sud je koronarna arterija. Zapremina aterome može se odrediti, kako je ovde opisano, pomoću intravaskularnog ultrazvučnog (IVUS) postupka. U nekim oličenjima, metode omogućavaju opadanje zapremine ukupnih naslaga (pločica) u obolelim krvnim sudovima. U nekim oličenjima, metode omogućavaju opadanje prosečne debljine maksimalne naslage (pločice) u obolelim krvnim sudovima. U nekim oličenjima, metode omogućavaju opadanje prosečne maksimalne debljine aterome. U nekim oličenjima, metode omogućavaju opadanje zapremine naslage (pločice) u najmanjem procentu površine naslage (pločice). U nekim oličenjima, metode omogućavaju opadanje u najvećem procentu površine naslage (pločice). U nekim oličenjima, metode omogućavaju povećani srednji koronarni luminalni promer obolelih krvnih sudova. U nekim oličenjima, subjekt na kog se primenjuju metode i formulacije sadašnjeg pronalaska, može zadobiti smanjene angiografske lezije u poređenju sa subjektom na kog nisu primenjene metode i formulacije sadašnjeg pronalaska. U nekim oličenjima, metode omogućavaju regresiju prethodnog postojećih lezija. U nekim oličenjima, metode i farmaceutske formulacije omogućavaju postizanje protočnosti okludovanog krvnog suda ili zadržavanje protočnosti okludovanog krvnog suda.

[0070]U nekim oličenjima, doze Apo A-T Milano: fosfolipidnog kompleksa od

oko 15 mg/kg do oko 45 mg/kg omogućavaju srednju redukciju zapremine aterome od oko 2%, oko 1% ili oko 0,05%. U nekim oličenjima doze Apo A-I Milano: fosfolipidnog kompleksa od oko 15 mg/kg do oko 45 mg/kg omogućavaju u cilju redukcije zapremine aterome od oko 20 mm', oko 15 mnr, oko 10 mm<1,>ili oko 5 mm<J.>U nekim oličenjima doze Apo A-I Milano: fosfolipidnih kompleksa od oko 15 mg/kg do oko 45 mg/kg omogućavaju redukciju maksimalne prosečne debljine aterome za oko -0,039 mm do -0,044 mm.

[0071]U jednom oličenju, metode omogućavaju lečenje od akutnih koronarnih sindroma kod subjekata sa znakom ili simptomom akutnog koronarnog sindroma. U jednom oličenju, subjekti mogu imati znake i/ili simptome ishemije srčanog mišića, na primer, bol u grudima, vilici, rukama, ili epigastričnoj oblasti, drhtavice, kratak dah, dijaforezu, mučninu i/ili povraćanje. U drugom oličenju, metode omogućavaju lečenje akutnih koronarnih sindroma kod subjekata koji pokazuju znake i simptome akutnih koronarnih sindroma zajedno sa promenama elektrokadiograma ("ECG" ili "EKG"), kao što je ST segment elevacije, T promena kao što su inverzije, povećanje udela kreatin kinazc, troponina I ili C-reaktivnog proteina.

[0072]U jednom oličenju, metode omogućavaju prevenciju od akutnih koronarnih sindroma subjekata koji spadaju u rizičnu grupu na razvoj akutnih koronarnih sindroma. Rizični subjekti mogu uključivati subjekte različitih godina (na primer. 18-24, oko 25, oko 30, oko 40, oko 50, oko 60, oko 70, oko 80 ili oko 90 godina starosti), subjekte sa porodičnom istorijom kardiovaskularnih oboljenja ili genetsku predispoziciju na kardiovaskularna oboljenja, subjekte koji imaju dijabetes, hipertenziju, oboljenje više sudova ili oboljenje levog glavnog suda ili su ranije imali infarkt srčanog mišića.

[0073]Podrazumeva se od strane onih obučenih u oblasti da stvarna doza formulacije sadašnjeg pronalaska može varirati sa visinom, težinom, godinama, ozbiljnosti oboljenja subjekta, prisustva pratećih medicinskih uslova i slično. Na primer, stariji subjekat kompromizovanih funkcija bubrega ili jetre može se tretirati manjom dozom Apo A-I Milano: lipidnog kompleksa opsega od oko 1 mg/kg( npr.,0,8 mg/kg ili 0,9 mg/kg). Gojazni subjekt sa jakim akutnim koronarnim sindromom sa dobrim radom bubrega i jetre može se tretirati dozom Apo A-I Milano: lipid kompleksa koja je, na primer, u višem delu opsega od oko 100 mg/kg doze( npr.,120 mg/kg, 119 mg/kg, 118 mg/kg, 115 mg/kg i slično). Pokazano je daje delotvorno doziranje ovde opisane formulacije u svrhu postizanja željenog cilja. Ovim dozama postiže se opseg cirkulišućih koncentracija koje uključuju delotvorne doze uz prihvatljiv rizik po njihov korisni profil.

[0074] Sadašnji pronalazak obezbeđuje metode lečenja ili sprečavanje akutnih koronarnih sindroma uz raspored primene doza pogodne za lečenje akutnih koronarnih sindroma kod subjekata kojima je potreban takav tretman. U nekim oličenjima, Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks ili njegove farmaceutske formulacije, kako je dole opisano, može se primeniti približno (oko) svakog dana, približno (oko) svakog drugog dana, oko svakog 3. dana, oko svakog 4. dana, oko svakog 5. dana, oko svakog 6. dana, oko svakog 7. dana, oko svakog 8-10. dana ili oko svakog 11-14. dana. Ovaj vremenski period naziva se i interval doziranja ili interval. U nekim oličenjima interval doziranja može biti svakog meseca, svakih šest meseci, svakih 12 meseci, svakih 18 meseci ili svakih 24 meseca. U prioritetnim oličenjima, Apo A-I Milano, lipidni kompleks ili njegove farmaceutske formulacije može se primeniti oko svakih 7 dana. U nekim oličenjima, primena Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleksi ili njihove farmaceutske formulacije mogu se jednokratno primeniti. U nekim oličenjima, primena se može nastaviti oko nedelju dana, oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 4 nedelje, oko 5 nedelja. oko 6 nedelja, oko 7-12 nedelja, oko 13-24 nedelja, oko 52 nedelja ili nastaviti tokom života subjekta. Ovaj vremenski period naziva se trajanje doziranja, trajanje lečenja ili trajanje. Tako, raspored primene doziranja može biti, na primer. farmaceutska formulacija Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks koji se primenje oko svakih 7 dana tokom oko 6 nedelja. U nekim oličenjima, interval doziranja može se nastaviti naizmenično posle oko 52 nedelje. Na primer, subjekt se može lečiti jednom nedeljno tokom oko 52 nedelje i zatim oko 3 do oko 4 puta tokom sledeće godine. U nekim prioritetnim oličenjima, primena farmaceutske formulacije koja uključuje Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks vrši se oko svakih 7 dana tokom priližno 5 nedelja. Drugi raspored primene doza koristeći različite dozne intervale i trajanje tretmana, kako je ovde opisano, spadaju u opseg sadašnjeg pronalaska.

[0075] Doze Apo A-l Milano: fosfolipidnog kompleksa ili njegove farmaceutske formulacije mogu varirati tokom trajanja lečenja. Na primer, subjekt se može tretirati pomoću 45 mg/kg farmaceutske formulacije Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks jednom nedeljno tokom 3 nedelje, a zatim biti lečen pomoću 15 mg/kg farmaceutske formulacije Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks jedanput svakog četvrtog meseca ili jednom godišnje tokom života subjekta. Takva naizmenična doza može se primeniti radi održavanja protočnosti krvnog suda. Naizmenične doze primenjene tokom celog života subjekta radi održavanja redukovane zapremine aterome i povećane zapremine krvnog suda spadaju u opseg sadašnjeg pronalaska.

[0076] Metode i formulacije sadašnjeg pronalaska mogu se upotrebiti zajedno sa hirurškom intervencijom,tj.,pre, za vreme ili posle operacije. Hirurška intervencija može uključiti angioplastiju, intravaskularni ultrazvuk, implantaciju bajpasa koronarne arterije (CABG), koronarnu angiografiju, implantaciju vaskularnog stenta, perkutanu koronarnu intervenciju (PCI) i/ili stabilizaciju naslaga (pločica). U nekim oličenjima, metode omogućavaju doziranja Apo A-I Milano: fosfolipidnih kompleksa ili njihove farmaceutskih formulacija pre ili posle hirurške intervencije radi otvaranja okludovanog suda, ili redukuju arterosklerotičnih naslaga (pločica) u krvnom sudu. Hirurška intervencija odnosi se na manuelne, ne-farmakološke ili operativne metode koje se koriste u dijagnozi, za oslikavanje (radiologiju), sprečavanje ili lečenje oboljenja ili stanja. Na primer, ultrazvučna intravaskularna (IVUS) i koronarna angiografija predstavljaju postupke koji mogu omogućiti kvantitativno određivanje količine naslage (pločice) (dijagnostička svrha), angiografija može omogućiti slike sudova (radiološka svrha) i angioplastija može otvoriti okludovani krvni sud (svrha - lečenje). Kako se ovde koristi, svi postupci uključeni su kao hirurške intervencije.

5.3. Apolipoprotein A-I Milano

[0077] Kao jedan aspekt, sadašnji pronalazak obezbeđuje metode i formulacije za tretman, redukciju ili prevenciju ozleda od akutnih koronarnih sindroma primenom formulacije koja uključuje Apo A-I Milano. U nekim oličenjima Apo A-l Milano (Apo A-I Milano) može biti kompleksiran sa lipidom.

[0078] Apo A-I Milano ljudskog porekla predstavlja prirodnu varijantu Apo A-I (VVeisgraberet al.1980,J. Clin. Invest.66: 901-907). Kod Apo A-I Milano amino kiselina arginin (Argl73) zamenjena je amino kiselinom cisteinom (Cysl73). Zbog toga što Apo A-I Milano sadrži jedan cisteinski ostatak u jednom polipeptidnom nizu, on može postojati u monomernom, homodimernom, ili heterodimernom obliku,( vicleti,U.S. patent br. 5,876,968, ovde naveden kao referenca u svoj svojoj potpunosti). Ovi oblici su hemijski izmenjivi, a izrazom Apo A-I Milano ne ukazuje sc na razliku između ovih oblika. Na DNA nivou varijantni oblik nastaje supstitucijom C pomoću T u sekvenci gena ,//'.kodon CGC izmenjen je u TGC, što omogućava translaciju cisteina (Cys) umesto arginina (Arg) na amino kiselinskoj poziciji 173.

[0079]U nekim oličenjima, Apo A-I Milano može predstavljati varijantu ili konzervativno supstituisani Apo A-I Milano. Pod konzervativnom supstitucijom misli se na neke određene aminokiselinske ostatke Apo A-I Milano koji mogu biti zamcnjeni drugim aminokiselinskim ostacima bez iole značajno štetnog dejstva na aktivnost proteina. Tako, takođe se smatra da se pod sadašnjim pronalaskom podrazumevaju promenjeni ili supstituisani oblici Apo A-I Milano pri čemu je najmanje jedan definisani aminokiselinski ostatak u strukturi supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom. U svrhe određivanja konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, amino kiseline mogu biti prigodno klasifikovane u dve glavne kategorije—hidrofilnu i hidrofobnu~što zavisi prvenstveno od fizičko hemijskih karakteristika amino kiselinskog bočnog niza. Ove dve glavne kategorije mogu biti dalje klasifikovane u podkategorije koje jasnije definišu karakteristiku aminokiselinskih bočnih nizova. Na primer, klasa hidrofilnih amino kiselina može se dalje podeliti u kisele, bazne i polarne amino kiseline. Klasa hidrofobnih amino kiselina može biti dalje podeljena u apolarne i aromatične amino kiseline. Definicije različitih kategorija amino kiselina kojima se definiše struktura (I) su kako sledi:

[0080]Termin "Hidrofilna amino kiselina" odnosi se na neku aminokiselinu koja iskazuje hidrofobnost manju od nula, normalizovanom prema hidrofobnosti skale odEisenberg et al.,1984,J. Mol. Biol.179: 125-142. Genetski zapisane hidrofilne amino kiseline uključuju Thr (T), Ser (S), His (H), Glu (E), Asn (N), Gln (Q), Asp (D), Lvs (K) i Arg (R).

[0081]Termin "Kisela amino kiselina" odnosi se na neku hidrofilnu amino kiselinu koja ima bočni niz čija je pK vrednost manja od 7. Kisela amino kiselina tipično ima negativno naelektrisane bočne nizove na fiziološkom pH zbog toga što dolazi do gubitka vodoničnog jona. Genetski zapisane kisele amino kiseline uključuju Glu (E) i Asp (D).

[0082]Termin "Bazna amino kiselina" odnosi se na neku hidrofilnu amino kiselinu koja ima bočni niz čija je pK vrednost veća od 7. Bazne amino kiseline tipično poseduju pozitivno naelektrisane bočne nizove na fiziološkom pH zbog toga što dolazi do asocijacije sa hidronijum jonom. Genetski zapisane bazne amino kiseline uključuju His (H), Arg (R) i Lys (K).

[0083]Termin "Polarna amino kiselina" odnosi se na hidrofilnu amino kiselinu sa bočnim nizom koji nije naelektrisan na fiziološkom pH, ali koji ima najmanje jednu vezu sa parom elektrona, deljenih od strane dva atoma, a koji su više privučeni jednom od atoma. Genetski zapisane polarne amino kiseline uključuju Asn (N), Gln (Q) Ser (S) i Thr (T).

[0084]Termin "Hidrofobna amino kiselina" odnosi se na neku amino kiselinu koja iskazuje hidrofobnost veću od nula, normalizovanoj prema skali hidrofobnosti od Eisenberg-a, 1984,J. Mol. Biol.179: 125-142. Genetski zapisane hidrofobnc amino kiseline uključuju Pro (P), lle (I), Phe (F), Val (V), Leu (L), Trp (W), Met (M), Ala (A), Gly (G) i Tyr (Y).

[0085]Termin "Aromatična amino kiselina" odnosi se na neku hidrofobnu amino kiselinu sa bočnim nizom koji poseduje najmanje jedan aromatični ili heteroaromatični prsten. Aromatični ili heteroaromatični prsten može sardžavati jedan ili više supstituenata kao što su -OH, --SH, -CN, -F, -Cl, ~Br, -1. -N02, -NO, -NH2, -NHR, -NRR, - C(0)R, -C(0)OH, -C(0)OR, -C(0)NH2, -C(0)NHR, -C(0)NRR, i slično, gde je svaki R nezavisno (Ci- C6) alki 1, supstituisani (Ci- C6) alkil, (Ci- C0 alkenil, supstituisani (Ci- C6) alkenil, (Ci- Ce) alkinil, supstituisani (Ci-Ce)alkinil, (C5- C20) aril, supstituisani (C5- C20) aril, (C6- C26) alkaril, supstituisani (C&- C2ć) alkaril, 5-20 člani heteroaril. supstituisani 5-20 člani heteroaril, 6-26 člani alkheteroaril ili supstituisani 6-26 člani alkheteroaril. Genetski zapisane aromatične amino kiseline uključuju Phe (F), Tvr (Y) i Trp (W).

[0086]"Nepolarna amino kiselina" odnosi se na neku hidrofobnu amino kiselinu sa bočnim nizom koji nije naelektrisan na fiziološkom pH i koji ima veze kod kojih je par elektrona deljen od strane dve atoma podjednako privučen od svakog od njih ( tj.. bočni niz nije polaran). Genetski zapisane apolarne amino kiselina uključuju Leti (L). Val (V), lle (1), Met (M). Gly (G) i Ala (A).

[0087] "Alfatična amino kiselina" odnosi se na neku hidrofobnu amino kiselinu koja ima alfatični ugljovodonični bočni niz. Genetski zapisane alfatične amino kiseline uključuju Ala (A), Val (V), Leu (L) i lle (1).

[0088] Aminokiselinski ostatak Cvs (C) je neobičan u tome što može graditi disulfidne mostove sa drugim Cvs (C) ostacima ili drugim amino kiselinama koje sadrže sulfanil grupu. Sposobnost Cys (C) ostataka (i drugih amino kiselina koja sadrži bočne nizove sa —SH grupom) da postoje u peptidu ili kao redukovane slobodne — SH grupe ili, posle oksidacije, u obliku disulfidnih mostova; to utiče na vrstu doprinosa Cvs (C) ostataka: ukupnom hidrofobnom ili hidrofilnom karakteru peptida. Dok Cys (C) iskazuje hidrofobnost od 0,29 prema normalizovanom konsenzusu skale Eisenberg-a (Eisenberg, 1984,suprot),u svrhu sadašnjeg pronalaska podrazumeva se daje Cys (C) kategorizovan kao polarna hidrofilna amino kiselina, uprkos gore definisanim opštim klasifikacijama.

[0089]Oni obučeni u oblasti shvatiće da se gore definisane kategorije međusobno ne isključuju. Tako, amino kiseline koje poseduju bočne nizove i koje iskazuju dve ili više fizičko hemijskih osobina mogu pripadati multiplim kategorijama. Na primer, amino kiselinski bočni nizovi koji sadrže aromatične grupe a koje su dalje supstituisane polarnim supstituentima, kao što je Tyr (Y), mogu iskazivati i aromatične hidrofobne osobine i polarne ili hidrofilne osobine, i iz tog razloga mogu pripadati obema kategorijama - aromatičnim i polarnim amino kiselinama. Odgovarajuća kategorizacija bilo koje amino kiseline biće očigledna onima obučenim u oblasti, posebno u svetlu detaljnog opisa pronalaska koji je ovde dat. U nekim oličenjima supstituisani ili izmenjeni oblik ApoA-I Milano nije Apo A-I.

[0090]Apo A-l Milano koji se koristi u sadašnjem pronalasku može se dobiti iz bilo kog raspoloživog izvora. Na primer, Apo A-I Milano može biti rekombinantnog, sintetičkog, polusintetičkog porekla ili može biti prečišćeni Apo A-I Milano. U prioritetnom oličenju, Apo A-I Milano može biti rekombinantni protein (rApo A-I Milano) ekspresovan u kvascu iliE. colikako je opisano u U.S. patentu br. 5,721,114 i evropskim patentima EP 0 469 017 i EP 0 267 703, koji su u svom punom obimu ovde navedeni kao reference. Metode za dobijanje Apo A-I Milano, koji se koristi u sadašnjem pronalasku su dobro poznate u oblasti. Na primer, Apo A-I Milano može se izdvojiti iz plazme, na primer, cenlrifugiranjem prema gradijentu gustine za čime sledi delipidacija od lipoproteina, redukcija, denaturacija i gel filtraciona hromatografija, jono izmenjivačka hromatografija, hidrofobna, npr., na fenil sefarozi, interakciona hromatografija ili imunoafinitetna hromatografija, ili se može dobiti sintetičkim putem, polu-sintetički ili koristeći rekombinantne DNA tehnike poznate onima obučenim u oblasti, za čime sledi prečišćavanje poznato onima obučenim u oblasti.( Vickti, npr.,U.S. Patent br. 6,107.467; 6,559,284; 6,423,830; 6,090.921; 5,834,596; 5,990,081; 6,506,879,Mulugetae/a/.,1998,. 1. Chromatogr. 798 (1-2): 83-90; Chung et al.,1980,./. LipidRes. 2 \ (3): 284-91; Cheung et al,1987,J. LipidRes. 28 (8): 913-29; Persson, et al.,1998,./. Chromatogr.711: 97-109; U.S. Patent br. 5,059,528, 5,834.596, 5,876,968 i 5,721,114; i PCT Publikacije WO 86/04920 i VVO 87/02062).

[0091]Ukoliko se Apo A-I Milano dobija iz prirodnih izvora, može se dobiti iz bilo kojeg životinjskog izvora iz bilo koje vrste. U nekim oličenjima, Apo A-I Milano može se dobiti iz sisara. U nekim oličenjima, Apo A-I Milano može se dobiti iz materijala ljudskog porekla. U prioritetnim oličenjima sadašnjeg pronalaska, Apo A-l Milano dobija se iz iste vrste kojoj pripada i subjekt kojem se Apo A-I Milano primenjuje. U prioritetnom oličenju, Apo A-I Milano je rekombinantni Apo A-l Milano protein (rApo A-I Milano).

5.4. Metode primene

[0092]Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleksi ili njihove farmaceutske formulacije mogu se primeniti bilo kojim pogodnim putem poznatim onima obučenim u oblasti i koji osigurava prirodnu raspoloživost prilikom cirkulacije. Prema sadašnjem pronalasku može se koristiti primena bilo kojim putem a koja obezbeđuje terapeutski delotvornu količinu date formulacije prema sadašnjem pronalasku. Put primene može biti indikovan tipom farmaceutske formulacije. Na primer, injektabilne formulacije mogu se primeniti parenteralno, uključujući, ali ne ograničavajući se na, intravenozne (IV), intramuskularne (IM), intradermalne, subkutane (SC), intrakoronarne, intraarterijalne, perikardijalne, intraartikularne i intraperitonealne (IP) injekcije.{ Videli, npr.,Robinsonet al.,1989, u: Pharmacoterapia: A Pathophvsiologic Approach, poglavlje 2, str. 15-34, ovde navedena kao referenca u svoj svojoj potpunosti.)

[0093]U prioritetnom oličenju, Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleksi ili njihove farmaceutske formulacije mogu se primeniti parenteralno. U prioritetnijem oličenju, parenteralna primena je intravenozna. Intravenozna primena može biti u vidu bolusa, na primer, primenjena tokom oko 2-3 minuta ili kao kontinualna infuzija, na primer, pomoću pumpe tokom oko 1 sata ili kontinualnom infuzijom, tokom oko 24 sata. U prioritetnom oličenju, infuzija se može davati tokom oko 1 do oko 3 sata.

[0094]Metode omogućavaju intravenoznu infuziju ovde opisanih farmaceutskih formulacija. Bilo koji pogodni krvni sud može se upotrebiti kao infuziono mesto, uključujući periferne sudove kao stoje antekubitalno udubljenje ruke ili centralni u pravcu grudi. U prioritetnim oličenjima, infuzija farmaceutske formulacije vrši se u cefalični ili srednji kubitalni sud na antekubitalnoj fosi ruke subjekta.

[0095]U nekim oličenjima, primena može biti pomoću mehaničke pumpe ili uređaja za primenu,npr.,perikardijalnog uređaja za primenu (PerDUCER®) ili kardiopulmonarnog bajpas uređaja.

5.5Lipidni kompleksi

[0096]U nekim oličenjima, metode sadašnjeg pronalaska uključuju primenu lipidnih kompleksa Apo A-I Milano. U nekim oličenjima, sadašnji pronalazak obezbeđuje farmaceutske formulacije Apo A-I Milano: fosfolipidnih kompleksa. Efikasnost se može povećati kompleksiranjem lipida za Apo A-l Milano. Tipično, lipid se pomeša sa Apo A-l Milano pre primene. Apo A-I Milano i lipid mogu se pomešati u vodenom rastvoru u odgovarajućim odnosima i mogu biti kompleksirani postupcima poznatim u oblasti uključujući sušenje zamrzavanjem, solubilizacijom detergenta za čime sledi dijaliza, mikrofluidizacija, sonikacija, i homogenizacija. Efikasnost kompleksa može biti optimizovana, na primer, pramenom pritiska, frekvence ultrazvuka, ili koncentracijom detergenta. Primer detergenta koji se obično koristi prilikom dobijanja Apo A-l Milano: fosfolipidnih kompleksa je natrijum holat.

[0097]U nekim slučajevima bolje je primeniti Apo A-l Milano samostalno, u osnovi bez prisustva lipida, za lečenje ili sprečavanje akutnih koronarnih sindroma. U prioritetnim oličenjima, Apo A-I Milano: lipidni kompleks primenjuje se subjektu kome je to potrebno.

[0098]U jednom oličenju, Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks može se nalaziti u rastvoru sa odgovarajućim farmaceutskim razblaživačem. U drugom oličenju, zamrzavanjem osušeni ili liofilizovani preparati Apo A-l Milano: fosfolipidni kompleksi mogu biti hidratisani ili rekonstituisani pomoću odgovarajućeg farmaceutskog razblaživačaa pre primene. U drugom oličenju, Apo A-I Milano: lipidni kompleksi mogu postojati kao zamrznuti preparati koji se rastapaju sve do postizanja homogenizovanog rastvora pre primene subjektu kome je to potrebno.

[0099]Lipid može biti bilo koji pogodni lipid poznat onima obučenim u oblasti. Mogu se koristiti lipidi koji ne sadrže fosfor, uključujući stearilamin, dodecilamin, acetil palmitat, (l,3)-D-manozil-(l,3) diglicerid, aminofenilglikozid, 3-holesteril-6'-(glikoziltio)heksil etarski glikolipidi, N-(2,3-di(9-(Z)-oktadeceniloksi))-prop-l-il-N,N,N-trimetilamonijum hlorid i amidi masnih kiselina. U prioritetnim oličenjima, lipid jeste fosfolipid.

[00100]Fosfolipid se može dobiti iz bilo kog izvora poznatog onima obučenim u oblasti. Na primer, fosfolipid se može dobiti iz komercijalnih izvora, prirodnih izvora ili sintetičkim ili polu-sintetičkim načinima poznatim onima obučenim u oblasti (Mel'nichuket al,1987,Ukr. Biokhim. Zh.59 (6) :75-7; Mel'nichuket al,1987,Ukr. Biokhim. Zh.59 (5): 66-70; Rameshet al,1979,./. Am. OilChem. Soc.56 (5): 585-7; Patel i Sparrovv, 1978,J. Chromatogr.150 (2): 542-7; Kaduceet al,1983,J. Lipid Res.24 (10): 1398-403; Schlueteret al,2003,Org. Leti.5 (3): 255-7; Tsujiet al,2002,Nippon Yakurigaku Zasshi120 (1): 67P-69P).

[00101]U prioritetnim oličenjima, lipid može biti fosfolipid. Fosfolipid može biti bilo koji od fosfolipida poznatih onima obučenim u oblasti. Na primer, fosfolipid može biti fosfolipid kratkog alkil niza, fosfatidilholin, fosfatidilholin iz jajeta, fosfatidilholin iz soje, dipalmitoilfosfatidilholin, fosfatidilglicerol iz soje, fosfatidilglicerol iz jajeta, distearoilfosfatidilglicerol, dimiristoilfosfatidilholin, distearoiIfosfatidiIhoiin. dilaurilfosfatidilholin, l-miristoil-2-palmitoilfosfatidiIhoIin, l-palmitoil-2-miristoilfosfatidilholin, l-palmitoil-2-stearoilfosfatidilholin, l-stearoil-2-palmitoilfosfatidiIholin, dioleoilfosfatidilholin, l-palmitoil-2-oleoilfosfatidilholin, l-oleoil-2-palmitilfosfatidilholin, dioleoilfosfatidiletanolamin, dilauroilfosfatidilglicerol, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilinozitol, fosfatidilglicerol, difosfatidilglicerol, dimiristoilfosfatidilglicerol, dipalmitoilfosfatidilglicerol, distearoilfosfatidilglicerol, dioleoilfosfatidilglicerol, fosfatidinska kiselina, dimiristoilfosfatidinska kiselina, dipalmitoilfosfatidinska kiselina, dimiristoilfosfatidiletanolamin, dipalmitoilfosfatidiletanolamin, dimiristoilfosfatidilserin, dipalmitoilfosfatidilserin, fosfatidilserin iz mozga, sfingolin, sfingolipide, sfingomielin iz mozga, dipalmitoilsfingomielin, distearoilsfingomielin, galaktocerebrozid, gangliozidi, cerebrozidi, fosfatidilglicerol, fosfatidinska kiselina, lizolecitin, lizofosfatidiletanolamin, cefalin, kardiolipin, dicetilfosfat, distearoil-fosfatidiletanolamin, kao i holesterol i njegovi derivati.

[00102]Fosfolipid može takođe biti neki derivat ili analog bilo kog od gore navedenih fosfolipida. U nekim oličenjima, Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks može da uključi i kombinacije dva ili više fosfolipida.

[00103]U prioritetnim oličenjima, metode sadašnjeg pronalaska omogućavaju primenu Apo A-I Milano: fosfolipidnog kompleksa. U prioritetnijem oličenju, lipid jeste fosfolipid, prioritetno, l-palmitoiI-2-oleoil fosfatidilholin ("POPC") ili ("l-palmitoil-2-oleoil-.w-glicero-3-fosfoholin"). U još više prioritetnom oličenju, Apo A-I Milano: POPC kompleks uključuje Apo A-I Milano: POPC u odnosu od oko jedan prema jedan težinski. U najprioritetnijem oličenju, Apo A-I Milano: POPC kompleksa sačinjava farmaceutsku formulaciju. Apo A-I Milano: POPC kompleks naziva se ETC-216.

[00104]Kompleks koji uključuje Apo A-I Milano i neki lipid može uključiti bilo koju količinu lipida, prioritetno fosfolipidnih, i bilo koju količinu Apo A-I Milano delotvorne za lečenje ili sprečavanje akutnih koronarnih sindroma. U nekim oličenjima, Apo A-I Milano može uključivati neki kompleks Apo A-I Milano i nekog fosfolipida u težinskom odnosu od oko jedan prema jedan. Međutim, Apo A-I Milano može da uključuje komplekse u drugim odnosima fosfolipida i Apo A-I Milano kao što je oko 100:1, oko 10:1, oko 5:1, oko 3:1, oko 2:1, oko 1:1, oko 1:2, oko 1:3, oko 1:5, oko 1:10 i oko 1:100 (težina proteina/težina lipida). Težinski odnos između od oko 1:0.5 do oko 1:3 (težina proteina/težina lipida), prioritetnije odnos od oko 1:0,8 do oko 1:1,2 (težina proteina/težina lipida) je prioritetan u cilju dobijanja najhomogenije populacije, kao i u svrhe proizvodnje stabilnih i reproduktabilnih šarži. U još više prioritetnim oličenju, odnos Apo A-I Milano prema fosfolipidu jeste 1:0,95 (težina proteina/težina lipida).

[00105]Dodatni lipidi pogodni za upotrebu u metodama sadašnjeg pronalaska su dobro poznati osobama obučenim u oblasti i navode se u različitim dobro poznatim izvorima,npr.,McCutcheon's Detergents i Emulsifiers i McCutcheon's Functional Materials, Allured Publishing Co., Ridgewood, N.J., i oba su obuhvaćena ovde kao reference. Uopšte, poželjno je da se lipidi nalaze kao tečni kristali na 37 °C, 35 °C, ili 32 °C. Lipidi u stanju tečnih kristala tipično prihvataju holesterol efikasnije nego lipidi u gel stanju. Kako subjeki tipično imaju osnovnu temperaturu od oko 37 °C, lipidi koji su u obliku tečnih kristala na 37 °C su obično u stanju tečnih kristala za vreme tretmana.

5.6.Dobijanje lipidnih kompleksa

[00106]Apo A-I Milano: lipidni kompleksi mogu biti napravljeni pomoću bilo kog postupka poznatim onima obučenim u oblasti. U nekim slučajevima poželjno je pomešati lipid i Apo A-I Milano pre primene. Lipidi mogu biti u rastvoru ili u obliku lipozoma ili emulzija nastalih koristeći standardne tehnike kao što je homogenizacija, sonikacija ili istiskivanje. Sonikacija se obično vrši pomoću sonifikatora sa vrhom, kao što je Branson-ov tip sonifikatora, u ledenom kupatilu. Tipično, suspenzija se podvrgava do nekoliko ciklusa sonikacije. Istiskivanje se može vršiti pomoću biomembranskih ekstrudera, kao što je Lipex Biomembrane Extruder™ (Lipex Biomembrane Extruder, Inc. Vancouver, Canada). Definisanjem veličine pora u filterima za istiskivanje mogu se generisati unilamelarni lipozomski mehurići specifičnih veličina. Lipozomi mogu takođe nastati istiskivanjem kroz asimetrični keramički filter, kao što je Ceraflovv Microfilter™, komercijalno dostupan od Norton Companv, VVorcester Mass. ili kroz polikarbonatni filter ili druge vrste polimerizovanih materijala( tj.plastičnog materijala) poznatim onima obučenim u oblasti.

[00107]Neki Apo A-I Milano: lipid kompleks se može dobiti u različitim oblicima, uključujući, ali ne ograničavajući se na mehuriće, lipozome ili proteolipozome. Različite metode dobro poznate onima obučenim u oblasti mogu se upotrebiti u cilju dobijanja Apo A-l Milano: lipid kompleksa. Mogu se koristiti nekoliko raspoloživih tehnika u cilju dobijanja lipozoma ili proteolipozoma. Na primer, Apo A-I Milano može biti ko-sonifikovan (koristeći kupatilo ili neki drugi sonikator) sa odgovarajućim lipidom u cilju dobijanja lipidnog kompleksa. U nekim oličenjima, Apo A-I Milano se može kombinovati sa prethodno dobijenim mehurićima lipida što rezultuje u spontanom nastajanju željenog apoiipoprotein: lipid kompleksa. U drugom oličenju, Apo A-I Milano se može takođe dobiti pomoću postupka dijalize iz detergentskog rastvora;npr.,smesa Apo A-I Milano, lipida i nekog detergenta kao stoje holat mogu biti dializovani radi uklanjanja detergenta i rekonstituisani da bi se dobio lipidni kompleks. (Videti,npr.,Jonaset al.,1986,Methods Enzymol.128, 553-82).

[00108]U drugom oličenju, lipidni kompleksi mogu se dobiti ko-liofilizacijom, kako je opisano u U.S. patentima br. 6,287,590 i 6,455,088, čiji su sadržaji ovde obuhvaćeni kao referenca u svoj svojoj potpunosti. Drugi postupci su otkriveni, na primer, u U.S. patentima br. 6,004,925, 6,037,323 i 6,046,166, i njihovi sadržaji su ovde obuhvaćeni kao referenca u svoj svojoj potpunosti. Drugi postupci dobijanja Apo A-I Milano: lipidnih kompleksa biće očigledni onima obučenim u oblasti.

[00109]U prioritetnom oličenju, lipidni kompleksi mogu se dobiti homogenizacijom. U prioritetnim oličenjima, pripravljanje Apo A-I Milano:lipidnih kompleksa započinje razblaživanjem rekombinantnog Apo A-l Milano do koncentracije od 15 mg/ml u rastvoru vode za injektiranje. Dodaje se natrijum fosfat do finalne koncentracije od 9-15 mM fosfata i do podešavanja pH do između oko 7,0 i oko 7,8. Manitol se dodaje do postizanja koncentracije od oko 0,8 % do oko 1 % manitola (vv/v). Zatim se dodaje POPC dok se ne dobije smesa od oko 1:0,95 (težine proteina/težine lipida) Apo A-I Milano dimera prema POPC. Smesa se meša na 5000 rpm tokom oko 20 minuta koristeći viseći propeler i Ultra Turrax uz zadržavanje temperature između 37 °C i 43 °C. Posuda kojom se vrši dodavanje se meša kontinualno na 300 rpm dok se temperatura održava između 32 °C do 43 °C pomoću izmenjivača toplote (Avestin, Inc.). Homogenizacija tokom prvih 30 minuta se vrši na 50 MPa(7250 psi) a posle toga, pritisak se održava na 80-120 MPa (11600-17400 psi) sve dok se usputnim testiranjem gel permeacionom hromatografijom ne iskaže % AUC od

>70 % između proteinskih standarda. Kompleksi se mogu takođe pripraviti kao 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml i 14 mg/ml formulacije pri čemu je navedena težina proteina.

5.7.Kombinaciona terapija

[00110]Prema metogama sadašnjeg pronalaska, Apo A-I Milano ili lipidni kompleksi ili njihove farmaceutske formulacije mogu se upotrebiti samostalno ili u kombinacionoj terapiji sa drugim intervencijama. Takva terapije uključuju, ali nisu ograničena na, simultanu ili sekvencijalnu primenu drugih lekova.

[00111]U nekim oličenjima, metode i formulacije sadašnjeg pronalaska mogu se upotrebiti u kombinaciji sa drugim tekovima radi postizanja ovde datog postupka. Primena i drugog leka može se vršiti i cilju lečenja, sprečavanja ili poboljšavanja date bolesti, stanja, oboljenja ili simptoma, na primer, antiaritmički lekovi primenjuju se u cilju lečenja usputno postojeće aritmije. U nekim oličenjima, metode omogućavaju zajedničku primenu lekova za lečenje ili sprečavanje bola koji prati akutne koronarne sindrome.

[00112] Kako je gore opisano, konvencionalna terapija ishemičnih događaja, uključujući infarkt srčanog mišića, anginu i akutne koronarne sindrome nemaju za cilj uklanjanje osnovu patologije prsnutih ili nestabilnih arterosklerotičnih naslaga (pločica). Na primer, subjekt koji ima srčanu nelagodnost u grudima ili druge ishemične simptome može se pripremiti za hitnu perkutanu koronarnu intervenciju (PCI) pomoću lekova protiv zapušenja ili antitrombičnim lekovima kao što je aspirin, clopidogrel, heparin, eptifibatid ili abciksimab. Beta-adrenerski blokatori ((3-blokatori) mogu se primeniti radi smanjenja brzine otkucaja srca. Primena angiotenzin inhibitora konvertujućeg enzima (ACE inhibitora) se preporučuje subjektima koji pate od pratećeg kongestivnog zaustavljanja rada srca (CHF) ili disfunkcije leve komore (LV). Subjektima koji su oživljeni posle iznenadnog prestanka rada srca (srčane smrti), preporučuje se primena amiodarona. Kiseonik se često primenjuje subjektu, obično putem maske ili nazalnom kamilom a vitalni znaci se pažljivo prate, uključujući, zasićenje kiseonikom koristeći pulsnu oksimetriju. Za dugotrajni tretman, statinski inhibitori HMGCoA reduktaze često se primenjuju subjektu radi redukcije LDC nivoa. [00113| Na primer, Apo A-l Milano ili lipidni kompleks ili njegove farmaceutske formulacije mogu se primeniti sa drugim farmaceutski aktivnim lekovima uključujući, ali ne ograničavajući se na, alfa/beta andregeneričke antagoniste, antiandregeneričke medijume, alfa-1 andregeneričke antagoniste, beta andregeneričke antagoniste, aktivatore AMP kinaze, inhibitore angiotenzin konvertujućeg enzima (ACE), antagoniste angiotenzin II receptora, blokatore kalcijumovog kanala, antiaritmička sredstva, vazodilatore, nitrate, vazopresore, inotropna sredstva, diuretike, medijume protiv koagulacije, medijume protiv agregacije krvnih pločica, trombolitičke medijume, antidijabetske medijume, antioksidante, anti-inflamatorne medijume, sekvestrante žučnih kiselina, statine, inhibitore holesterol estarskog transfer proteina (CETP), medijume za redukciju holesterola / regulatora lipida, lekove koji blokiraju konverziju arahidonske kiseline, terapiju zamene estrogena, analoge masnih kiselina, inhibitore sinteze masnih kiselina, fibrate, h i stid i n, derivati nikotinske kiseline, receptorske agoniste aktivatora peroksizomskog proliferatora ili antagoniste, inhibitore oksidacije masnih kiselina, talidomid ili tiazolidindione( Drug Facts and Comparisons,ažurira se mesečno, januar 2003., \Volters Kluwer Companv, St. Louis, MO;Physicians Desk Reference(56. izdanje, 2002.) Medical Economics).

[00114]Drugi lekovi, samostalno ili u kombinaciji, koji se mogu dodati ili mogu dovesti do sinergizma blagotvornih osobina ApoA-I Milano, lipidnih kompleksa ili njihove farmaceutske formulacije uključuju ali nisu ograničene na: alfa/beta andregeneričke antagoniste ("P-blokatore") kao što je, karvediol, (Goreg®); labetalol HC1, (Normodvne®); antiandregeneričke medijume kao stoje guanadrel, (Hvlorel®); guanetidin, (Ismelin®); rezerpin, klonidin, (Catapres® i Catapres-TTS®); guanfacin, (Tenex®); guanabenz, (Wytensin®); metildopa i metildopat, (Aldomet®); alfa-1 andregenerički antagonist kao što je doksazosin, (Cardura®); prazosin, (Minipress®); terazosin, (Hvtrin©); i fentolamin, (Regitine®); beta andregeneričke antagoniste kao što je sotalol, (Betapace AF® i Betapace®); timolol, (Blocadren®); propranolol, (InderalLA® i Inderal®); betaksolol, (Kerlone®); acebutolol, (Sectral®); atenolok (Tenormin®); metoprolol, (Lopressor® i Toprol-XL®); bisoprolol, (Zebata®); karteolol, (Cartrol®); esmolol, (Brevibloc®); naldolol.

(Corgard®); penbutolol, (Levatol®); i pindolol, (Visken®); aktivatore AMP kinaze kao što su ESP 31015, (ETC-1001); ESP 31084, ESP 31085, ESP 15228, ESP 55016 i ESP 24232; gemcabene (PD 72953 i Cl-1027); i MEDICA 16; inhibitore angiotensin konvertujućeg enzima (ACE) kao što je kv inapril, (Accupril®); benazepril, (Lotensin®); kaptopril, (Capoten®); enalapril, (Vasotec®); ramipril, (Altace®); fosinopril (Monopril®): moeksipril, (Univasc®); lizinopril, (Prinivil® i Zestril®); trandolapril, (Mavik®), perindopril, (Aceon®); i antagoniste angiotension II receptora kao što je kandesaartan, (Atacand®); irbesartan, (Avapro®); losartan, (Cozaar®); valsartan, (Diovan®); telmisartan, (Micardis®); eprosartan, (Tevetan®); i olmesartan, (Benicar®); blokatore kalcijumovog kanala kao što je nifedipin, (Adalat®, Adalat CC®, Procardia® i Procardia XL®); verapamil, (Calan®, CalanSR®, Ctokoma-HS®, IsoptinSR®, Verelan® i VerelanPM®); diltiazem, (Cardizem®, CardizemCD® i Tiazac®); nimodipin, (Nimotop®); amlodipin, (Norvasc®); felodipin, (Plendil®); nisoldipin, (Sular®); bepridil, (Vascor®); isradipin, (DynaCirc®); i nicardipin, (Cardene®); antiaritmike kao što su različiti kvinidini; prokainamid, (Pronestil® i Procan®); lidocain, (Xylocaine®); meksilitin, (Mexitil®); tocainid, (Tonocard®); flecainid, (Tambocor®); propafenon (Rythmol®), moricizin, (Ethmozine®); ibutilid, (Ctokomt®); disopiramid, (Norpace®); bretilium, (Bretilol®); amiodaron, (Cordarone®); adenozin,

(Adenocard®); dofetilid (Tikosvn®); i digoksin, (Lancođn®); vasodilatore kao stoje diazoksid, (Hvperstat IV®); hidralazin, (Apresoline®); fenoldopam, (Corolpam®); minoksidil, (Loniten®); i nitroprusid, (Nipride®); nitrate kao što je izosorbid dinitrat; (Isordil® i Sorbitrate®); izosorbid mononitrat, (Imdur®, Ismo® i Monoket®); Nitroglicerin pasta, (Nitrol®); različiti nitroglicerinski flasteri; nitroglicerin SL, (Nitrostat®), Nitrolingval sprej; i nitroglicerin IV, (Tridil®); vazopresore kao što su norepinefrin, (Levophed®); i fenilefrin, (Neo-Synephrine®); inotropne medijume kao što su amrinon; (Inocor®); dopamin, (Intropine®); dobutamin, (Dobutrex®); epinefrin, (Adbubregain®); izoproternol, (Isuprel®), milrinon, (Primacor©); diuretike kao što su spironolakton, (Aldactone®); torpolud, (Demadex®); hidroflumetiazid, (Diucardin®); hlortiazid, (Diuril®); etakriniska kiselina, (Edecrin®); hidrohlortiazid, (hidroDIURIL® i Microzide®); amilorid, (Midamor®); hlortalidon, (Thalitone® i Hygroton®); bumetanid, (Bumex®); furopolud, (Lasix®); indapamid, (Lozol®); metolazon, (Zaroxolyn®); triamteren, (Dyrenium®); i kombinacije triamterena i hidrohlortiazida (Dvazid® i Maxzide®); antitrombične / anticoagulantske / medijume protiv agregacije krvnih pločica kao što su bivalirudin, (Angiomax®); lepirudin, (Refludan®); različiti heparini; danaparoid, (Orgaran®); različite heparine niske molekulske težine; dalteparin, (Fragmin®); enoksaparin, (Lovenox®); tinzaparin, (Innohep®); varfarin, (Coumadin®); dikumarol, (Dicoumarol®); anizindion, (Miradone®); aspirin; argatroban, (Argatroban®); abciksimab, (Reopro®); eptifibatid, (Integrilin®); tirofiban, (Aggrastat®); klopidogrel, (Plavix®); tiklopidin, (Ticlid®); i dipiridamol, (Persantine®); trombolitici kao što su alteplaz, (Activase®); aktivatore tkivnog plazminogena (TPA), (Activase®); anistreplaza. APS AC, (Eminase®); reteplaza, rPA, (Retavasae®); steptokinaza, SK, (Streptase®); urokinaza, (Abbokinase®); antidijabetska medijume kao što su metformin, (Glucophage®); glipizid, (Glucotrol®); hlorpropamid, (Diabinese®); acetoheksamid, (Dymelor®); tolazamid, (Tolinase®); glimeprid, (Amaril®); gliburid, (DiaBeta® i Micronase®); akarboza, (Precose®); miglitol, (Glyset®); repaflinid, (Prandin®); nateglinid, (Starlix®); rosiglitazon, (Avandia®); i pioglitazon (Actos®); antioksidante i anti-inflamatorne medijume; sekvestrante žučnih kiselina kao što su holestiramin, (LoHolest®, Prevalite® i Questran®); kolestipol, (Colestid®); i kolesevelam, (Welchol®); statine (lekovi koji inhibiraju HMGCoA reduktazu) kao što su rovastatin, (Crestor®); fluvastatin, (Lescol®); atorvastatin, (Lipitor®); lovastatin, (Mevacor®); pravastatin, (Pravachol®); i simvastatin, (Zocor®); CETP inhibitore; lekove koji blokiraju konverziju arahidonske kiseline: terapija zamene estrogena; analoge masnih kiselina kao što su PD 72953, MEDICA 16, ESP 24232, i ESP 31015; inhibitore sinteze masnih kiselina; inhibitore sinteze masnih kiselina; inhibitore oksidacije masnih kiselina, ranolazin, (Ranexa®); fibrate kao što su klofibrat, (Atromid-S®); gemfibrozil, (Lopid®); kapsule mikronizovanih fenofibrata, (Tricor®); bezafibrat i ciprofibrat; histidin; derivate nikotinske kiseline kao što su tablete produženog otpuštanja niacina, (Niaspan®); agoniste peroksizomskog proliferatora aktivatora receptora i antagonisti; talidomid, (Thalomid®) i jedinjenja opisana u U.S. patentima br. 6,459,003, 6,506,799 i U.S. publikovanim patentnim prijavama br. 20030022865, 20030018013, 20020077316, i 20030078239 čiji su sadržaji ovde obuvaćeni u svom punom obimu kao reference.

[00115] Drugi lekovi blagotvornih osobina samostalno ili u kombinaciji, mogu se dodati ili mogu delovati sinergistički, ApoA-I Milano ili lipidni kompleksi ili njihove farmaceutske formulacije mogu biti uključeni, na primer, anti-proliferativni lekovi kao što su paklitaksel i topotekan, (Brehmet al.2001,Biochemical Pharmacology,61 (1): 119-127) i anti-inflamatorni lekovi kao što su steroidna i ne-steroidna anti-inflamatorna sredstva (uključujući inhibitore ciklooksigenaze-2 (COX-2)).

5.8. Farmaceutske formulacije

[00116] Kao jedan aspekt, sadašnji pronalazak obezbeđuje formulacije za tretman, redukciju ili prevenciju ozleda od akutnih koronarnih sindroma primenom neke farmaceutske formulacije koja uključuje Apo A-I Milano. U prioritetnim oličenjima Apo A-I Milano (Apo A-I Milano) može biti kompleksiran sa lipidom. U prioriteti!ijem oličenju, Apo A-l Milano je kompleksiran za POPC.

[00117] Apo A-I Milano ili njegovi lipidni kompleksi mogu se primeniti u obliku neke farmaceutske formulacije. Farmaceutska formulacija, kako je ovde opisano, uključuje dodatak, na primer, prihvatljivog razblaživača, ekscipijenta, medijume ili nosača. Kako je poznato u oblasti, dodatak jednog ili više razblaživača, ekscipijenta, medijume ili nosača čini formulaciju pogodnom za primenu subjektu i može doprineti drugim povoljnim osobinama kao što je produženi vek trajanja.

[00118] Farmaceutske formulacije tipično uključuju neki farmaceutski prihvatljivi nosač ili medijum. Mogu se upotrebiti mnogi farmaceutski prihvatljivi nosači ili medijumi. U ovde opisanom primeru koristi se saharoza-manitol. Kao farmaceutski nosač ili sredstvo često se koristi normalni vodeni rastvor soli. Drugi pogodni nosači ili medijumi uključuju glukozu, trehalozu, saharozu, sterilnu vodu, puferovanu vodu. 0,45% vodeni rastvor soli (0,5 M vodeni rastvor soli), i 0,3 % glicina, i može dalje uključivati glikoproteine u cilju povećane stabilnosti, kao stoje albumin. Ove formulacije mogu biti sterilizovane konvencionalnim, dobro poznatim tehnikama za sterilizaciju. Nastali vodeni rastvori mogu biti upakovani za upotrebu ili filtrovani pod aseptičkim uslovima i liofilizovani (sušeni smrzavanjem). Liofdizovana preparacija može se zatim pre primene kombinovati sa sterilnim vodenim rastvorom.

[00119] Farmaceutske formulacije mogu prema potrebi takođe sadržavati farmaceutski prihvatljive ekscipijente da bi se uprosečila fiziološka stanja, kao što su agensi za podešavanje pH i puferovanje, i medijume za podešavanje toničnosti, na primer, natrijum acetat, natrijum laktat, natrijum hlorid, kalijum hlorid, i kalcij um hlorid. Antibakterijski agensi, na primer, fenol, benzalkonijum hlorid ili benzetonijum hlorid, mogu se dodati radi održavanja sterilnosti proizvoda, posebno farmaceutske formulacije namenjene multidoznoj parenteralnoj upotrebi. Agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju mogu se takođe upotrebiti u formulacijama sadašnjeg pronalaska.

[00120] Farmaceutske formulacije mogu uključivati apolipoprotein (Apo A-I Milano) u obliku soli. Na primer, zbog toga što protein može sadržavati kisele i/ili bazne terminuse i/ili bočne nizove, Apo A-I Milano može biti sadržan u farmaceutskim formulacijama u obliku slobodnih kiselina ili baza, ili u obliku farmaceutski prihvatljivih soli. Farmaceutske prihvatljive soli mogu uključivati, pogodnu kiselinu sposobnu da nagradi soli sa Apo A-I Milano uključujući, na primer, neorganske kiseline kao što je hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, perhlorna kiselina, azotna kiselina, tiocijanska kiselina, sumporna kiselina, foforna kiselina i slično; i organske kiseline kao što su mravlja kiselina, sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, mlečna kiselina, pirogrožđana kiselina, oksalna kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, antranilna kiselina, cimetna kiselina, naftalen sulfonska kiselina, sulfanilna kiselina i slično. Pogodne baze sposobne da nagrade soli sa Apo A-I Milano mogu uključivati, na primer, neorganske baze kao što su natrijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalijum hidroksid i slično; i organske baze kao što su mono-, di- i tri-alkil amini( npr.,trietil amin, diizopropil amin, metil amin, dimetil amin i slično) i opciono supstituisani etanolamini( npr.,etanolamin, dietanolamin i slično).

[00121]Farmaceutska formulacija se može biti pripremljena u različitim oblicima pogodnim za primenu bilo koji putem, uključujući, ali ne ograničavajući se na, parenteralnu, enteralnu, topikalnu ili putem inhalacije. Parenteralna primena odnosi se na primenu bilo kojim putem koji se ne odnosi na probavni kanal, uključujući, ali ne ograničavajući se na, injektabilnu primenu( tj.,intravenoznu, intramuskularnu i slično, kako je ovde opisano). Enteralna primena odnosi se na primenu bilo kojim putem koji uključuje korišćenje probavnog kanala, oralna ili rektalna uključujući, ali ne ograničavajući se na, tablete, kapsule, oralne rastvore, suspenzije, sprejove i slično, kako je ovde opisano. U svrhe ovakve primene, enteralna primena takođe se odnosi na vaginalne puteve primene. Topikalna primena odnosi se na primenu ns bilo koji način kroz kožu, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kremove, masti, gelove i transdermalne flastere, kako je ovde opisano

( videti takođe,Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje Gennaroet al.,urednici)

Mack Printing Companv, Easton, Pennsvlvania, 1990).

[00122] Parenteralne farmaceutske formulacije sadašnjeg pronalaska mogu se primeniti injektiranjem, na primer, u venu (intravenozno), u arteriju (intraarterozno), u mišić

(intramuskularno), pod kožu (subkutano ili u depo formulacije), u srčanu kesu, u koronarne arterije. Injektabilne farmaceutske formulacije mogu postojati i kao farmaceutske odgovarajuće formulacije za primena direktno u srce, srčanu kesu ili koronarne arterije. U prioritetnim oličenjima, farmaceutske formulacije primenjuju se infuzijom u periferne krvne sudove subjekta,npr.u ruku ili antekubitalnu fosu.

[00123] Injektabilne farmaceutske formulacije mogu postojati kao sterilne suspenzije, rastvori ili emulzije u vodenim ili uljastim sredstvima. Formulacije za injektiranje mogu biti pripremljene u obliku jedinične doze,npr..u ampulama ili u multidoznim kontejnerima, i mogu uključivati dodate prezervative. Prioritetni puferi za parenteralne farmaceutske formulacije su fosfatni, citratni i acetatni.

[00124] U drugom oličenju, farmaceutske formulacije mogu se obezbediti u sprašenom obliku u cilju rekonstitucije sa nekim pogodnim sredstvom pre upotrebe, uključujući, ali ne ograničavajući se na, sterilnu nepirogenu vodu, vodeni rastvor soli, ili dekstrozu. U ovu svrhu, Apo A-l Milano može biti liofilizovan, ili ko-liofilizovan sa lipidom, kako je gore opisano, već prema potrebi. U još jednom oličenju, farmaceutske formulacije mogu biti pripremljene u jediničnom doznom obliku i rekonstituisane pre upotrebe.

[00125] U cilju produžene primene (dejstva), farmaceutske formulacije mogu se biti obezbediti kao depo preparacija, za primenu implantacijom;npr.,subkutanim. intradermalnim, ili intramuskularnim injektiranjem. Tako, na primer, farmaceutske formulacije mogu biti formulisane sa pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima( npr.,kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili jono izmenljivim smolama, ili kao slabo rastvorljivi derivati;npr.,kao oblik slabo rastvorile soli ApoA-1 Milano ili Apo A-I Milano: lipidnog kompleksa.

[00126] U drugom oličenju, farmaceutska formulacija obezbeđena je kao transdermalni sistem za primenu proizveden kao prianjajući disk ili traka koji sporo oslobađa aktivni sastojak u cilju perkutane apsorpcije. In ovom oličenju, mogu se upotrebiti permeacioni poboljšivači radi olakšanja transdermalne penetracije ApoA-I Milano. U drugom oličenju, transdermalne farmaceutske formulacije namenjene pacijentima sa anginom mogu dalje sadržavati nitroglicerin.

[00127] U cilju primene inhalacijom, farmaceutske formulacije mogu se primeniti pomoću aerosol spreja iz pakovanja pod pritiskom ili pomoću raspršivača, uz upotrebu pogodnog propelanta,npr.,dihlordifluormetana, trihlorfluormetana, dihlortetrafluoretana, ugljen dioksida ili drugog pogodnog gasa. U slučaju upotrebe aerosola pod pritiskom doziranje jedinične doze može biti određeno snabdevanjem slavine kojom se dozira određeno izmerena količina, na primer, izmerena doza inhalacionog medijuma. Kapsule i kasete odnpr.,želatina za upotrebu u inhaleru ili raspršivaču mogu biti formulisane da uključuju praškastu smesu ApoA-I Milano i pogodnu praškastu osnovu kao što je laktoza ili škrob.

[00128] Formulacija može, ukoliko se to želi, predstaviti kao pakovanje ili dispenzer za držanje koji može uključiti jedan ili više jediničnih doznih oblika koji uključuju Apo A-I Milano farmaceutske formulacije. Pakovanje može na primer, uključiti metalnu ili plastičnu foliju, kao što je blister pakovanje. Pakovanje ili dispenzer za držanje može biti snabdeven instrukcijama ili obeležen za primenu.

[00129] U nekim oličenjima, farmaceutske formulacije ApoAI-M ili Apo A-l Milano: lipidnih kompleksa mogu uključiti Apo A-I Milano u koncentraciji dovoljnoj za lečenje subjekta kome je to potrebno. U nekim oličenjima, farmaceutske formulacije ApoA-I Milano ili Apo A-I Milano: lipidnih kompleksa mogu uključiti koncentracije Apo A-I Milano od oko 5 mg/ml do oko 50 mg/ml. U prioritetnim oličenjima, formulacije mogu uključivati Apo A-I Milano u koncentraciji od oko 10 mg/ml do oko 20 mg/ml. U prioritetnijem oličenju, formulacije mogu uključivati Apo A-l Milano u koncentraciji od oko 13 mg/ml do oko 16 mg/ml. Koncentracija Apo A-I Milano može biti određena bilo kojom pogodnom tehnikom poznatom onima obučenim u oblasti. U nekim oličenjima, koncentracija Apo A-I Milano je određena ekskluzionom tečnom hromagografijom visoke performance (SE-HPLC).

[00130] U nekim oličenjima, farmaceutske formulacije ApoAI-M ili Apo A-I Milano: lipidnog kompleksa mogu uključiti koncentracije lipida dovoljne da nastanu kompleksi sa Apo A-I Milano. U nekim oličenjima, lipid je fosfolipid. U prioritetnim oličenjima, lipid je POPC. U nekim oličenjima, farmaceutske formulacije ApoA-I Milano ili Apo A-I Milano: lipid kompleksa može uključiti koncentracije POPC od oko 1 mg/ml do oko 50 mg/ml. U prioritetnim oličenjima, formulacije mogu uključivati POPC u koncentraciji od oko 5 mg/ml do oko 25 mg/ml. U prioritetnijem oličenju, formulacije mogu uključivati POPC u koncentraciji od oko 10 mg/ml do oko 20 mg/ml. U još više prioritetnom oličenju, formulacije mogu uključivati POPC u koncentraciji od oko 11 mg/ml do oko 17 mg/ml. Koncentracija POPC može biti određena bilo kojom pogodnom tehnikom poznatom onima obučenim u oblasti. U nekim oličenjima, koncentracija POPC određena je tečnom hromatografijom visoke performanse.

[00131] U prioritetnim oličenjima, farmaceutska formulacija ApoA-l Milano: lipidnog kompleksa može uključiti saharozu u količini dovoljnoj da nagradi farmaceutski pogodnu formulaciju Apo A-l Milano ili Apo A-I Milano: lipid kompleksa. U nekim oličenjima, farmaceutske formulacije mogu uključivati oko 0,5 % do oko 20 % saharoze. U nekim oličenjima, farmaceutske formulacije mogu uključivati oko 3 % do oko 12 % saharoze. U nekim oličenjima, farmaceutske formulacije mogu uključivati oko 5 % do oko 7 % saharoza. U prioritetnim oličenjima, farmaceutske formulacije mogu uključivati oko 6,0 % do oko 6,4 % saharoze. U najprioritetnijem oličenju, farmaceutske formulacije mogu uključivati 6,2 % saharoze.

[00132] U prioritetnim oličenjima, farmaceutska formulacija ApoA-I Milano: lipidnog kompleksa može uključiti manitol u količini dovoljnoj da se dobije farmaceutski pogodna formulacija Apo A-I Milano ili Apo A-I Milano: lipid kompleks. U nekim oličenjima, farmaceutske formulacije mogu uključivati oko 0,01 % do oko 5 % manitola. U nekim oličenjima, farmaceutske formulacije mogu uključivati oko 0,1 % do oko 3 % manitola. U nekim oličenjima, farmaceutske formulacije mogu uključivati oko 0,5 % do oko 2 % saharoze. U prioritetnim oličenjima, farmaceutske formulacije mogu uključivati oko 0,8 % do oko 1 % manitola. U najprioritetnijem oličenju, farmaceutske formulacije mogu uključivati 0,9 % manitola.

[00133] U nekim oličenjima, farmaceutska formulacija ApoA-I Milano: lipidnog kompleksa može uključiti pufer u količini dovoljnoj se dobije farmaceutski pogodna formulacija Apo A-I Milano ili Apo A-I Milano: lipidnog kompleksa. U nekim oličenjima, farmaceutske formulacije mogu uključivati fosfatni pufer. U nekim oličenjima, koncentracija pufera može biti oko 3 mM do oko 25 mM. U nekim oličenjima, koncentracija pufera može biti oko 5 mM do oko 20 mM. U prioritetnim oličenjima, koncentracija pufera može biti oko 8 mM do oko 15 mM. U nekim oličenjima, odgovarajući pufer se dodaje radi podešavanja pH vrednosti farmaceutske formulacije do opsega pogodnog za primenu subjektu. U nekim oličenjima, farmaceutska formulacija može imati pH vrednost od oko 6,8 do oko 7,8. U nekim oličenjima, farmaceutska formulacija može imati pl I vrednost od oko 7,0 do oko 7,8. U nekim oličenjima, farmaceutska formulacija može imati pH vrednost od oko 7,2 do oko 7,5. U prioritetnim oličenjima, farmaceutska formulacija može imati pH vrednost od oko 7,5.

[00134] U nekim oličenjima, farmaceutska formulacija ApoA-I Milano: lipidnog kompleksa je osmolalnosti pogodne za primenu subjektu. U nekim oličenjima, osmolalnost formulacije može biti oko 200 do oko 400 mOsm. U nekim oličenjima, farmaceutska formulacija može imati osmolalnost od oko 220 do oko 380 mOsm. U nekim oličenjima, farmaceutska formulacija može imati osmolalnost od oko 260 mOsm do oko 340 mOsm. U prioritetnim oličenjima, farmaceutska formulacija može imati osmolalnost od oko 280 mOsm do oko 320 mOsm. U najprioritetnijem oličenju, farmaceutska formulacija može imati osmolalnost od oko 290 mOsm.

[00135] Formulacije sadašnjeg pronalaska obezbeđuju Apo A-I Milano: lipidni kompleks dovoljne čistoće da bi sc omogućila primena subjektu. U nekim oličenjima, farmaceutska formulacija može uključivati Apo A-l Milano čistoće od oko 98 % ili više, oko 96 % ili više, oko 95 % ili više, oko 93 % ili više, oko 91 % ili više ili oko 90 % ili više. U prioritetnom oličenju, čistoća ApoA-I Milano je oko 90 % ili više. Čistoća ApoA-I Milano može biti određena bilo kojom pogodnom tehnikom poznatom onima obučenim u oblasti. U nekim oličenjima, čistoća ApoA-I Milano može biti određena ekskluzionom

HPLC.

[00136] Formulacije sadašnjeg pronalaska obezbeđuju Apo A-I Milano: lipidni kompleks dovoljne čistoće POPC-a da omogući primenu subjektu. U nekim oličenjima, farmaceutska formulacija može uključiti POPC čistoće od oko 98 % ili više, oko 96 % ili više, oko 95 % ili više, oko 93 % ili više, oko 91 % ili više ili oko 90 % ili više. U prioritetnom oličenju, čistoća POPC je veća od oko 90 %. Čistoća POPC može biti određena bilo kojom pogodnom tehnikom poznatom onima obučenim u oblasti. U nekim oličenjima, čistoća POPC može biti određena pomoću HPLC.

[00137]U nekim prioritetnim oličenjima, Apo A-I Milano: lipidni kompleks sadrži količine lipidnih hidroperoksida od oko 10 %, ili manje, oko 8 % ili manje, oko 6 % ili manje, oko 4 % ili manje, oko 2 % ili manje, oko 1 % ili niže od granica detekcije kako je određeno pomoću testa fero oksidacije/ksilenol oranža (Jiang,et al.1992,Anal. Biochem202: 384-389). U nekim oličenjima Apo A-IM: POPC kompleks je čistoće veće od 85 %

(merene kao % ukupne površine pika (signala)) na osnovu određivanja gel permeacionom hromatografijom. U nekim oličenjima, formulacija ima malo ili nema uopšte endotoksine. U prioritetnim oličenjima, formulacija sadrži endotoksine u količinama od < 0,04 EU/mg Apo A-I Milano.

[00138]U nekim oličenjima, količina čestica većih od 10 um veličine u formulaciji može biti < oko 6000 u flašici od 50 mL kako je određeno svetlosnim zamračenjem. U nekim oličenjima, količina čestica većih od 25 um veličine je < oko 600 na sud od 50 mL kako je određeno svetlosnim zamračenjem.

[00139]U prioritetnom oličenju, Apo A-I Milano: lipid kompleks farmaceutske formulacije pripravljen je razblaživanjem rApo A-I Milano do koncentracije od 15 mg/ml u rastvoru vode za injektiranje. Natrijum fosfat se dodaje do krajnje koncentracije od 9-15 mM fosfata i do podešavanja pH vrednosti do između oko 7,0 i oko 7,8. Manitol se dodaje do postizanja koncentracije od oko 0,8 % do oko 1 % manitola (w/v). Zatim se POPC dodaje do postizanja odnosa od 1:0,95 (težina proteina/težina lipida) Apo A-I Milano dimera prema POPC. Smesa se meša na 5000 rpm tokom oko 20 minuta koristeći viseći propeler i Ultra Turrax uz održavanje temperature između 37 °C i 43 °C. Sud za primenu se meša kontinualno na 300 rpm uz održavanje temperature između 32° C i 43° C pomoću linijskog izmenjivača toplote (Avestin, Inc.). Homogenizacija tokom prvih 30 minuta se vrši na 50 MPa (7250 psi) i posle toga, pritisak se održava na 80-120 MPa (1 1600-17400 psi) sve dok se testiranjem za vreme procesa koristeći gel permeacionu hromatografiju ne pokaže da se %AUC nije povećalo za oko 70 % u odnosu na proteinske standarde. Osmolalnost kompleksa se zatim oko podesi dodatkom od 6,0 % do 6,4 % saharoze. Farmaceutska formulacija ApoA-I Milano: POPC kompleksa se zatim sterilizuje filtracijom kroz filtere od 0.22 uM.

[00140]U drugom prioritetnim oličenju, farmaceutska formulacija uključuje oko 12 do oko 1 8 mg/ml rekombinantnog Apo A-I Milano, oko 1 1 do oko 17 mg/ml 1 -palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholina na pFI 7,4, sa 6,2 % saharoze i 0,9 % manitola uz osmolalnost od oko 280 mOsm do oko 320 mOsm. Farmaceutska formulacija može sadržavati rAPO A-I-M od oko 90 % čistoće, POPC od oko 97 % čistoće. U nekom oličenju, nijedne nečistoće može biti više od oko 2 %.

[00141]Farmaceutska formulacija se može biti čuvana u zamrznutom stanju (oko -15 °C do oko -25 °C). U nekim oličenjima, formulacije mogu biti hladni rastvori, zamrznuti rastvori ili liofilizovani rastvori. Prioritetno je da se takve formulacije rastapaju i zagrevaju do sobne temperature pre primene subjektu. Tsežno rastapanje i zagrevanje se preporučuje radi izbegavanja denaturacije proteina.

[00142]U drugom prioritetnim oličenju, formulacije se mogu čuvati u sterilnim staklenim flašicama od oko 2 mL do oko 250 mL, prioritetno oko 10 mL do oko 100 mL, najprioritetnije oko 50 mL koja sadrži farmaceutsku formulaciju koja uključuje Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks. U nekim oličenjima farmaceutske formulacije mogu uključivati količine oko 10 mg/mL do oko 15 mg/mL ApoA-I Milano: fosfolipidni kompleks u krajnjoj zapremini punjenja bočice od oko 39 do 41 ml. Količina Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks se može nalaziti u količini od oko 500 mg do 750 mg na bočicu od 50 mL.

[00143]Farmaceutske formulacije mogu biti namenjene pojedinačnoj, jednokratnoj upotrebi ili može sadržavati antimikrobske ekscipijente, kako je gore opisano, što čini farmaceutske formulacije pogodnim za višekratne upotrebe, na primer za upotrebu u bočici za višekratnu upotrebu. U nekim oličenjima, farmaceutske formulacije mogu biti u jedinstvenim jediničnim pakovanjima. Kako je poznato onima obučenim u oblasti, jedinstveno jedinično pakovanje je pogodno, obima je prepisanog recepta, pacijentu je prilagođena obeležena jedinica za direktnu distribuciju od strane zdravstvenih organa. Jedinstveno jedinično pakovanje sadrži farmaceutske formulacije u količini neophodnoj za tipični interval lečenja i trajanja tretmana za datu indikaciju. Metode i formulacije sadašnjeg pronalaska omogućavaju jedinstveno jedinično pakovanje farmaceutske formulacije uključujući, na primer, Apo A-I Milano: fosfolipidni kompleks u količini dovoljnoj za lečenje odraslog muškarca ili žene prosečne veličine pomoću doze od 15 mg/kg jednom nedeljno tokom 5 nedelja. U jednom oličenju, jedinstveno jedinično pakovanje može da uključuje farmaceutske formulacije koje uključuju Apo A-l Milano: fosfolipidni kompleks u količini dovoljnoj za lečenje prosečne veličine odraslog subjekta pomoću doze od 45 mg/kg jednom nedeljno tokom 6 nedelja. Biće očigledno onima obučenim u oblasti da su ovde opisane doze zasnovane na težini subjekta.

[00144]Farmaceutske formulacije mogu biti obeležene i posedovati prateće obeležavanje radi identifikacije ovde sadržane formulacije kao i druge informacije korisne zdravstvenim organima i subjektima koji su podvrgnuti lečenju i prevenciji od kardiovaskularnih i vaskularnih oboljenja, akutnih koronarnih sindroma, ishemičnih oboljenja kao i za stabilizaciju naslaga (pločica), uključujući, ali ne ograničavajući se na, uputstva za upotrebu, doze, interval doziranja, trajanje tretmana, indikaciju, kontraindikacije, upozorenja, mere predostrožnosti, način rukovanja i uputstvo za čuvanje i slično.

[00145] U daljim oličenjima, sadašnji pronalazak obezbeđuje pribore za lečenje ili sprečavanje kardiovaskularnih i vaskularnih oboljenja, akutnih koronarnih sindroma, ishemičnih oboljenja kao i za stabilizaciju naslaga (pločica). Pribori uključuju jednu ili više delotvornih doza Apo A-I Milano ili Apo A-I Milano: lipidnih kompleksa ili njihove farmaceutske formulacije zajedno sa oznakama ili oznake sa uputstvom za korišćenje Apo A-I Milano ili Apo A-I Milano: lipidnog kompleksa ili njihove farmaceutske formulacije za lečenje ili sprečavanje akutnih koronarnih sindroma u skladu sa metodama sadašnjeg pronalaska. U nekim oličenjima, pribori mogu uključiti komponente korisne za izvršenje metode kao što su to uređaji za isporuku (primenu) Apo A-I Milano ili Apo A-I Milano: lipidog kompleksa ili njihove farmaceutske formulacije kao i komponente za sigurno odlaganje ovih uređaja,npr.posebnu posudu. U nekim oličenjima, pribor može uključivati Apo A-I Milano ili Apo A-I Milano: lipidni kompleks ili njihove farmaceutske formulacije u prethodno napunjenim špricevima, jediničnim dozama ili jedinstvenim jediničnim pakovanjima.

6. PRIMERI

[00146] Nadalje će se podrazumevati da se sadašnji pronalazak odnosi na sledeće primere koji ga ne ograničavaju.

6.1. Primer 1: Podnošljivost ETC-216

[00147] Ovaj primer demonstrira sigurnost i podnošljivost ETC-216 u zdravstvenim volonterima.

[00148] U cilju utvrđivanja stepena sigurnosti i podnošljivosti, izvršenaje dvostruka šlepa placebo kontrolna studija Apo A-I Milano i fosfolipida. Apo A-I Milano je kompleksiran sa fosfolipidom (POPC) u težinskom odnosu od jedan prema jedan, koji se naziva ETC-216. U studiji je određena sigurnost i podnošljivost pet povećavajućih doza pojedinačnih intravenoznih infuzija ETC-216 zdravim muškim dobrovoljcima kao i dve različite doze zdravim ženskim dobrovoljcima. Posle upoznavanja sa testom pre početka studije, dobijen je pristanak od svih volontera.

[00149]Intravenozne doze ETC-216 primenjene su na tridesetdva zdrava dobrovoljca ("subjekta") između 18 do 50 godina starosti. Kod muških subjekata, primenjene su doze sve do, uključujući i, 100 mg/kg. Kod ženskih subjekata, primenjene su doze sve do, uključujući i, 50 mg/kg. Rod subjekta, doze i odnosi navedeni dole niže u Tabeli 1.

[00150]Vršenje monitoring nepovoljnih efekata uključujući kliničku laboratorijsku evaluaciju, fizički pregled i pregled vitalnih znakova. Subjekti su nadgledani tokom 27 dana posle doziranja (primene).

[00151] Kod dvadeset od 32 subjekta iz ove studije nađeni su nepovoljni efekti, od kojih su svi bili blagi do umereni. Za nepovoljne efekte koji su se javili kod dva ili više subjekata smatralo se da su povezani sa studijom o tretmanu lekom. Ovi nepovoljni događaji kao i broj subjekata koji doživljavaju ove nepovoljne događaja bili su, limfopenija (11 subjekata), leukocitoza (10 subjekata), muka (6 subjekata), glavobolja i dijarea (4 subjekta), povraćanje (3 subjekta) i abdominalni bol i hipertrigliceridmija (2 subjekata). Većina od mogućih sličnih nepovoljnih događaja (gastrointestinalna oboljenja i oboljenja belih krvnih zrnaca) primećeni su posle infuzije 50 mg/kg ili 100 mg/kg ETC-216 muškim subjektima. Za dva nepovoljna događaja (hipoproteinemija i abnormalna funkcija jetre) do kojih je došlo kod placebo lečenih subjekata smatralo se da se možda mogu povezati sa studijom o tretmanu. Nije došlo do smrti, ozbiljnih nepovoljnih događaja, ili odustajanja zbog nepovoljnih događaja.

[00152]Kako je dato na slici 1, nivo seruma HDL neesterifikovanog holesterola kod muških subjekata 30 minuta posle primene jednokratne doze ETC-216 povećao na dozama od 15 mg/kg i više.

[00153]Titar antitela na Apo A-I Milano određivanje u seri pre infuzije i sve do 27 dana posle infuzije. Nije nađen nikakav značajan odgovor antitela kod bilo kojeg od subjekata posle primene jednokratne doze.

[00154]Terminalni polu život od oko 100 sati podržava predlog (obrazloženje) za izvođenje studije o inicijalnom multi doznom doziranju ljudima sa protokolom doziranja od svakih 7 dana.

[00155]Ovi rezultati ukazuju daje ETC-216 bio siguran i dobro tolerisan at svim dozama i da nije došlo do ozbiljnih nepovoljnih događaja.

6.2. Primer2 :efikasnost različitih doza ETC-216 na

regresivnu arterosklerozu

[00156]Ovaj primer ukazuje na efikasnost doze od 15 mg/kg i od 45 mg/kg ETC-216 kod regresivne koronarne arteroskleroze kod subjekata sa akutnim koronarnim sindromima.

[00157]Ova studija predstavlja nasumičnu, dvostruko šlepu, placebo kontrolisanu

višedoznu studiju radi evaluacije efikasnosti i sigurnosti ETC-216 primenjenog subjekima sa akutnim koronarnim sindromom kako je određeno pomoću intravaskularnog ultrazvuka. Pre započinjanja bilo koje za studiju specifične procedure, svi subjekti su bili informisani i dali su saglasnost koja je odobrena od strane Institutional Revievv Board (IRB) svake od učestvujuće institucije.

[00158]Pogodni subjekti bili su oni sa dijagnostifikovanim akutnim koronarnim sindromima (nestabilna angina, ne Q infarkta srčanog mišića ili ST elevacije infarkta srčanog mišića) u toku 14 dana pre skrininga i koji su bili predviđeni da se podvrgnu koronarnoj angiografiji i/ili perkutanoj koronarnoj intervenciji (PCI) i predviđeno je da ostanu 24 sata posle predviđenog postupka. Subjekti koji zadovoljavaju ovaj kriterijum bili su isključeni ukoliko je njihov postupak smatran urgentnim i/ili se smatralo da nosi visok rizik od akutnih komplikacija, prema propisanom lečenju od strane lekara.

[00159]Završna tačka primarne efikasnosti predstavljena je pramenom (kraj lečenja minus prethodni tretman) u procentu zapremine aterome u segmentu od 30-80 mm neke ciljane (oslikane) koronarne arterije što je određeno intravaskularnim ultrazvukom (IVUS). Pozitivni rezultat definisan je kao negativna promena u procentu zapremine aterome uz intervale pouzdanosti (CIs) ne uključujući nulu.

[00160] Završne tačke sekundarne efikasnosti predstavljene su srednjom promenom u ukupnoj zapremini aterome i prosečnoj maksimalnoj debljini aterome. Završne tačke sekundarne efikasnosti određene su pomoću IVUS i angiografije. U slučaju IVUS-a, završne tačke sekundarne efikasnosti bile su: 1) Nominalna promena (kraj lečenja minus prethodni tretman) ukupnih naslaga (pločica) "zapremina" prema merenju u odnosu na površine prosečnih naslaga (pločica) iz svih isečaka anatomski uporedivih segmenata ciljane koronarne arterije; 2) Nominalna promena (kraj lečenja minus prethodni tretman) prosečne debljine maksimalne naslage (pločice) iz svih isečaka anatomski uporedivih segmenata ciljane koronarne arterije;

3) Najmanje i najviše oboleli segment "zapremine":

a) nominalna promena (kraj lečenja minus prethodni tretman) u segmentu naslage (pločice) "zapremine" od 10 mm susednih isečaka na osnovi koja sadrži najmanji

procenat površine naslage (pločice) (definisano kao najmanje oboleli segment);

b) nominalna promena (kraj lečenja minus prethodni tretman) u segmentu naslage (pločice) "zapremine" od 10 mm susednih isečaka na osnovi koja sadrži najveći

procenat naslage (pločice) površina (definisano kao najviše oboleli segment).

[00161] Završne tačke sekundarne efikasnosti za angiografiju bile su: 1) Srednji koronarni luminalni promer u okviru svih merenih koronarnih segmenata; 2) Broj novih angiografiskih lezija u svakoj lečenoj podgrupi; 3) Udeo subjekata sa jednom ili više novih angiografskih koronarnih lezija na kraju lečenja; 4) Broj mesta sa prethodno postojećimm lezijama što pokazuju regresiju; 5) Broj mesta sa prethodno postojećimm lezijama što pokazuju progresiju; 6) Udeo subjekata koji pokazuju "regresiju" u bilo kom slučaju prethodno postojećih lezija; 7) Udeo subjekata koji pokazuju "progresiju ili gde ne dolazi ni do kakve promene" u bilo kom slučaju prethodno postojećih lezija; 8) Udeo subjekata koji pokazuju "regresiju ili gde ne dolazi ni do kakve promene" u bilo kom slučaju prethodno postojećih lezija.

[00162]Postupci za IVUS su analizirani kako je opisano od strane Nissen 2001,Am. J. Cardiol.87: 15A-20A, koja je ove obuhvaćena kao referenca u punoj svojoj celini. Ukratko, operator digitizuje IVUS videotraku, pregleda povlačenje i odabira poreklo najudaljenijeg sporednog ogranka kao početnom tačkom za analizu kako kako je prikazano na slici 2(A). Zatim se svaka 30. slika odabira za analizu, i to predstavlja seriju preseka udaljenih tačno 0,5 mm. Poslednji analizirani presek je onaj na najproksimalnijoj slici u sekvenci pre pojave leve glavne koronarne arterije ili desnog koronarnog ostiuma (proksimalno povereno mesto) kako je prikazano na slikama 2(B)- 2(D). Postupak je ponovljen radi ponovljenog pregleda koristeći identične repere radi sigurnosti daje identični segment analiziran u obe vremenske tačke.

[00163]Izvršena su usmerena i izvedena IVUS merenja. Direktna IVUS merenja su izvršena u skladu sa standardima American College of Cardiologv i European Societv of Cardiologv (Mintzet al.2001,J. Am. Coll. Cardiol.37: 1478-92, koji su u svom punom obimu su ovde navedene kao reference). Koristeći se slikom 1.62 iz National Institute of Health (NIH javno dostupni softver), operator je izvršio kalibracioni postupak merenjem 1-mm oznaka na kordinativnoj mreži obeleženih na IVUS slici dobijenoj skenerom. Na svakom od preseka, operator je izvršio manuelnu planimetriju radi nalaženja vodećih ivica luminalih i spoljašnjih granica elastične membrane (slike 3(A)-3(D)). Maksimalne debljine aterome su takođe direktno izmerene. Tačnost i reproduktivnost ove metode bile su prethodno objavljene, potvrđujući daje, posle kalibracijc, srednji presek izmerenih površina koje se određuju IVUS-om bio u okviru 0,5 % od stvarnih dimenzija prema precizno izbušenim Lucitnim fantomskim površinama od 3.24 mm<2>do 27.99 mm2 (Schoenhagenet al.2003,J. Am. Soc. Echocardiogr.16: 277-84, referenca ovde navedena u svoj svojoj potpunosti). Na osnovu višestrukih posmatranja potvrđena su odstupanja od merenja kao standardna devijacija od 2,9 %.

[00164]Izvedena IVUS merenja uključujući proračun površine aterome kao površine spoljašnje elastične membrane (EEM) umanjene za luminalnu površinu. Zbog toga što su slike preseka dobijene u intervalima od 0,5 mm, ukupna zapremina aterome mogla se izračunati na osnovu Simpson-ovog pravila kao srednja površina aterome pomnožena dužinom povlačenja u milimetrima. Procenat zapremine aterome izračunat je kao: (£ površine aterome /I EEM površine ) x 100( Videli, npr.,Nissenet al.,2003,JAM. 4290: 2292-2300). Analiza koronarne angiografije izvršena je u glavnoj laboratoriji na Cleveland Clinic Foundation koristeći standardizovane metode osmišljene da redukuju varijabilnost merenja. Poređenje prečnika vrha angiografskog katetera sa svojom poznatom dimenzijom je upotrebljeno za kalibrisanje sistema. Za angiografsku završnu tačku uzeta je promena srednjeg koronarnog luminalnog prečnika poredeći početnu vrednost sa nastavkom merenja.

[00165]Nasumičnih pedestsedam subjekata je primilo 15 mg/kg ETC-216, 45 mg/kg ETC-216, ili zapreminu koja je odgovarala placebu, svakog 7. dana (± 1 dan) sa maksimalnih do 5 intravenoznih doza. Subjekti su nasumično tretirani sa do 15 mg/kg ETC-216, 45 mg/kg ETC-216 ili placebom u odnosu od 2:2:1. Cetrdesetsedam subjekta je završilo studiju.

[00166]Doza od 15 mg/kg primenjena je intravenozno infuzijom tokom oko 50 minuta a doza od 45 mg/kg primenjena je intravenozno infuzijom tokom oko 150 minuta. Brzina infuzije je povećana kod nekih subjekata zbog pojave mučnine. Sve intravenozne infuzije date su periferalno.

[00167]Subjekti su prećeni kliničkim laboratorijskim parametrima uključujući nivoe antitela na ETC-216, fizičke preglede, vitalne znake, elektrokardiograme (EKG) i frekvencu i intenzitet kliničkih nepovoljnih događaja. Angiografija i IVUS izvođeni su po dva puta na svakom pacijentu. Prvi put posle završetka početnog testiranja a drugi put oko 2 nedelje (± 7 dana) posle poslednje doze ispitivanog leka.

[00168]Dobijeni su pozitivni rezultati u odnosu na primarnu završnu tačku, što je sumirano u tabeli 2, dole niže. U grupi sa kombinovanim tretmanom (pacijenti koji su primili ili dozu od 15 mg/kg ili od 45 mg/kg ETC-216), promena srednje vrednosti (standardna devijacija ili SD) procenta zapremine aterome bila je -1,06 % (3.17 %). Srednja vrednost bilaje -0,81 % (95 % CI, -1,53 % do -0,34 %; p=0,02 u poređenju sa početnom. Kod placebo grupe promena srednje vrednosti (SD) bilaje 0,14 % (3,09 %). Srednja vrednost bilaje 0,03 % (95% CI, -1,11 % do 1,43 %; p-0,97 u poređenju sa početnom).

[00170]U odnosu na sekundarne završne tačke, dobijeni su takođe pozitivni rezultati, kako je dato u tabeli 3, dole niže. U poređenju sa početnom, srednja (SD) promena u ukupnoj zapremini aterome kod kombinovano lečenih grupa bila je -14,1 mmJ (39,5 mm<3>; središna -13,3 mm<1>; 95 % CI, -20,7 do -7,2; p<0,001). Za placebo grupu, odgovarajuća promena bilaje -2,9 mm<J>(23,3 mm<1>). Središna vrednost bilaje -0,2 mm<J>(23,3 mm<J>). Središna vrednost bilaje -0,2 mm<3>; 95 % CI, -8,6 do 8,2; p=0,97). Srednja (SD) promena u odnosu na početak u maksimalnoj debljini aterome za kombinovano lečenu grupu bilaje -0,042 mm (0,080 mm). Središna vrednost bilaje -0,035 mm (95 % CI, -0,058 do -0,020; p<0,002). Za placebo grupu, odgovarajuća promenu bila je -0,008 mm (0,061 mm; središna vrednost -0,009 (95 % CI, -0,035 do 0,026; p= 0,83). Videti tabelu 4, dole niže. [00172]Tabela 4. Srednja maksimalna debljina aterome u ciljanom koronarnom segmentu

[00173]Rezultati su pokazali da je ETC-216 efikasan u redukciji veličine naslage (pločice). U obe lečene grupe demonstrirana je statistički značajna regresija arteroskleroze.

6.3.Primer 3: Ex vivo Langendorff

[00174]Ovaj primer ukazuje na kardioprotektivni efekat profilaktičke primene ETC-216 u reperfuziranim izolovanim ishemičnim srcima kunića. Muški kunići New Zealand White, dobijeni od kompanije Charles River, približne težine 2-3 kg, upotrebljeni su u ovoj studiji. Muški kunić Nevv Zealand White odabran je kao odgovarajući test sistem u svrhe ove studije. Izolovano ishemično reperfuzirano srce kunića je model infarkta srčanog mišića kod ljudi. Pošto su stigle, životinjama su pripisani jedinstveni identification brojevi.

[00175]Životinje su čuvane u nerđajućim čeličnim kavezima u skladu sa uputstvima Komiteta za upotrebu i zaštitu životinja, Universitv of Michigan. Veterinarska nega obezbeđena je od strane Jedinice za laboratorijsku medicinu životinja (Laboratorv Animal Medicine), Universitv of Michigan. Universitv od Michigan je akreditovan od strane Američke asocijacije za akreditaciju programa za laboratorijsku zaštitu zdravlja životinja, i program za zaštitu životinja u skladu je sa standardima propisanim u Vodiču za zaštitu i upotrebu laboratorijskih životinja, DHEW (NIH) publikacija broj 86-23.

[00176]ETC-216 predstavlja rekombinantni apolipoprotein A-I Milano/l-palmitoil-2-oleoil fosfatidilholin kompleks u težinskom odnosu od jedan prema jedan. Prethodno napravljeni rastvori sadržavali su ETC-216, 14 mg protein/ml, u puferu saharoza manitol. Kako je pufer saharoza manitol nekompatibilan sa Krebs-Henseleit-ovim puferom, i da bi se kontrolisao bilo koji od nezavisnih efekata samog manitola, ETC-216 je dijalizovan da bi se dobio pufer pozadine koji se sastojao od 2 % glukoze u 4 mM natrijum fosfata, pH 7,4. ETC-216 je razblažen pomoću Krebs-Henseleit-ovog pufera da bi se dobio lek koncentracije od 0,45 mg/ml. Medijum je slično razblažen.

[00177]Selekcija doze je zasnovana na istorijskim podacima u vezi doza upotrebljenih u Esperion-ovoj primenjenoj pojedinačnoj dozi u sigurnosnim kliničkim ispitivanjima prilikom Faze I testiranja na ljudima, pri čemu su doze sve do 100 mg/kg ETC-216 bile primenjene na ljudima. U studijama prikazanim u ovom protokolu navedena koncentracija od 0,5 mg/ml je približno ekvivalentna intravenoznoj dozi od 25 mg/kg primenjene na ljude.

[00178] U izvođenim eksperimentima je korišćen Langendorff-ov aparat u cilju perfuzije srca kunića. Kunići su dovedeni u nesvesno stanje cervikalnom dislokacijom i srca su brzo uklonjena i spojena sa kanuiom radi perfuzije kroz aortu. Medijum za perfuziju sastojao se od cirkulišućeg Krebs-Henseleit-ovog pufera (pH 7,4, 37 °C; "KH") koji je kontinualno izložen smesi od 95 % 02 /5 % C02i dodavan je pri konstantnoj brzini od 20-25 ml/min. Ravnomerni rad srca kunića tokom celog protokola održavanje elektrodama povezanih za desni atrijum. Ravnomerni rad srca stimulisan je laboratorijskim "square vvave" generatorom (10 % iznad fiziološkog ritma, trajanje 1 msec, Grass 588, Kvincv, MA). Pulmonarna arterija je kanulovana pomoću SilasticTM cevčica da bi se olakšalo sakupljanje efluenta iz pulmonarne arterije što predstavlja koronarni venozni povratak koronarnom sinusu. Viša i niža vena kava i pulmonarne vene ligirane su da bi se sprečio gubitak perfuzata iz inače odsečenih sudova. Levi ventrikularni dren, termistorske probe, i lateks balon su dodati preko levog atrijuma i postavljeni su u levi ventrikulum. Balon od lateksa napunjen fluidom povezan je sa krutom cevčicom za kateter Miller-ovog transduktora pritiska da bi se omogućilo merenje nastalog levog ventrikularnog pritiska. Intraventrikularni balon je proširen destilovanom vodom sve do postizanja početne osnovne linije levog ventrikularnog krajnjeg dijastolskog pritiska od oko 10 mm Hg. Koronarna perfuzija pritiska merena je pomoću transduktora pritiska povezanog sa ispustom na kanuli aorte. Kako je brzina perfuzije koronarne arterije održavana konstantnom, promene u perfuziji pritiska koronarne arterije služila je kao indikator promena otpora koronarne arterije. Sve hemodinamičke promenljive praćene su kontinualno koristeći multikanalni pisač kao što je Grass Poligraph 79D (Kvincv, MA) povezan za Polivievv Softvvare, sistem za akviziciju podataka. Srca kunića su održavana at 37 °C tokom celokupnog eksperimentalnog perioda ograđivanjem srca u staklenu komoru s dve šupljine čija je temperatura regulisana, a medijum za perfuziju propuštanje kroz zagrejani rezervoar i sistem za snabdevanje.

[00179]Za eksperimentalne postupke upotrebljene su dve lečene grupe kako je i prikazano dole.

[00180JSrca kunića su eksperimentalno lečena kako je prikazano na slici 5. Izolovana srca su stabilizovana pod normoksičnom (normalni nivo kiseonika) uslovima tokom 20 minuta pre indukcije totalne ishemije. Za vreme prvih 10 minuta ovog perioda srca kunića su izložena prolazu samo Kl I pufera, a zatim tokom dodatnih 10 minuta prolazu KH pufera koji sadrži ili medijum (Grupa 1) ili ETC-216 (Grupa 2). Srca kunića su zatim podrvgnuta ishemiji tokom perioda od 30 minuta za čime sledi period od 60 minuta reperfuzije sa KH puferom koji sadrži medijum (Grupa 1) ili ETC-216 (Grupa 2). Indukcija totalne ishemije postignuta je zaustavljanjem protoka perfuzata u srce, a reperfuzija srca postignuta je uključivanjem pumpe radi uspostavljanja prethodne brzine protoka.

[00181]Alikvoti efluenta iz pulmonarne arterije su sakupljani iz srca kunića iz svih grupa na početku (pre ishemije), i inicijalno svakog minuta sve do 5. minuta, i svakog 5. minuta posle toga za vreme perioda reperfuzije. Efluenti su analizirani na koncentraciju kreatin kinaze (slika 6), što predstavlja indeks oštećenosti tkiva. Kreatin kinaza je citosolni enzim koji se oslobađa iz ireverzibilno oštećenih ćelija. Funkcije srca su kontinualno praćene (slika 7).

[00182]Završne tačke srca određivanje su zbog: 1-Elektrokardiograma- brzine rada srca (tempo) u cilju detekcije prisustva ili odsustva aritmija; 2- Nastalog pritiska leve komore (slika 8) (podaci su prikazani kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti za indikovani broj srca kunića u svakoj grupi);

3- Levog ventrikularnog dP/dt

4- Levog ventrikularnog završnog dijastolskog pritiska (slika 9)

(podaci su prikazani kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti za indikovani broj srca kunića u svakoj grupi);

5- Koronarne perfuzije pritiska (slika 10) (podaci su prikazani kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti za indikovani broj srca kunića u svakoj grupi);

6- Sakupljanja limfatične drenaže u cilju određivanja otpuštanja kreatin kinaze iz tkiva pre i posle reperfuzije (slika 6)

[00183]Na kraju eksperimentalnog protokola, biopsije srca od do pet srca kunića iz svake lečene grupe su odmah uronjene u tečni azot i čuvane na -80 °C radi potonje analize na lipidne hidroperikside. Uzorci homogenata su normalizovani na sadržaj proteina pre izvođenja testa na lipidne perokside (slika 11). Na ovom uzorku ETC-216 je smanjio lipidne hidroperikside iz srca za 46 %.

[00184]Posle završetka odabranog protokola, dva srca kunića iz svake grupe su podvrgnuta perfuziji tokom 3 minuta pomoću 2,5 % glutaraldehida i 1 % EaC13 u 0,1 M natrijum kalkodilatnom puferu (pH 7,4). Osmofilni LaC13 pod normalnim uslovima zadržava se u vaskularnom odcljku vezan za zid krvnog suda i služi kao indikator integriteta krvnog suda. Ekstravazacija LaC13 u ekstravaskularni prostor se upotrebljava kao indikacija prisustva vaskularnih povreda. Uzorci tkiva iz levog ventrikularnog srčanog mišića su uklonjeni i isečeni u segmenate veličine oko 1 mm sa svake strane. Uzorci su fiksirani tokom dodatnih 2 sata na 4 °C u gore pomenutom puferu. Posle toga, uzorci su dehidratisani u etanolu i fiksirani na EM bed-812 (Electron Microscopv Sciences, Ft, NVashington, PA). Blokovi tkiva su presecani pomoću Reichert ultramicrotome i postavljeni na formvar-om obložene bakarne rešetke za čime sledi bojenje pomoću 4 % uranil acetatom. Isečci su posmatrani pomoću Phillips CM-10 elektron mikroskopa. [00185|Transmisiona elektronska mikroskopija je upotrebljena za analizu miokardijalnih uzoraka iz svake od proučavanih grupa. Na slikama je prikazano da su kod srca kunića lečenih medijumom sarkomerne strukturne karakteristike uništene i da su prisutne trake nastale grčenjem. Mitohondrije su vidljivo nabubrele sa isprekidanim kristalnim i osmofilnim inkluzionim telima. Kod srca kunića lečenih pomoću ETC-216, sarkomerna struktura je relativno normalna i mitohondrije izgledaju netaknute uz samo minimalno bubrenje. Suštinsko odsustvo traka nastalih kontrakcijom vidno se razlikuje od onih primećenih u kontrolnoj grupi srca kunića. Sposobnost ETC-216 da sprečava nekrozu kontrakcionih traka je u skladu sa opažanjem da srca kunića prethodno lečena pomoću ETC-216 nisu iskazivala povećanje u količini LVEDP posle reperfuzije. Oba, nekroza kontrakcionih traka i podržano povećanje nivoa LVEDP vezani su za preterano povećanje intracelularnog kalcijuma i ireverzibilnog oštećenja ćelija. Prisustvo miofibrilnog zamućenja Z-traka, i prekid miofibrilarne arhitekture su indikativni za ekstenzivna oštećenja. Drugo očekivano morfološko oštećenje uključuje prekinute kriste i matrice mitohondrije kao i velika, elektronima gusta tela i mitohondrijama. Obe mikrografije urađene su pod uvećanjem od 7900x (slika 12).

[00186]Analiza koncentracija kreatin kinaze (slika 6) ukazuje da do brze faze oslobađanja enzima u venozni efluent dolazi u vreme reperfuzije. Kontrolna srca kunića (lečena medijumom) ukazuju na značano oslobađanje kreatin kinaze u poređenju sa srcima zamorčića lečenim pomoću ETC-216. Dodatno, srca kunića lečenih pomoću ETC-216 ukazuju na smanjeni levi ventrikularni krajnji dijastolski pritisak (slike 7 i 9), povišeni levi ventrikularni nastali pritisak (slika 8), smanjeni perfuzioni pritisak koronarne arterije (slika 10) i smanjenu količini lipidnih hidroperoksida (LHP) u poređenju sa kontrolnom grupom srca kunića (slika 11). Dodatno, ETC-216 štiti od morfoloških promena srčanog mišića (slika 12). Ove rezultati su potvrdili kardioprotektivni efekat ETC-216 kada se primeni pre ishemičnog događaja.

6.4. Primer 4: Akutna i hronična primena kod LAD okludovanog-

reperfuziranog srca kunića pri dozi od 100mg/kg

[00187]Ovaj primer demonstrira kardioprotektivni efekat ETC-216 uin vivomodelu regionalne ishemije srčanog mišića i reperfuzije. Mužjaci Nevv Zealand VVhite kunića odabrani su kao odgovarajući test sistem za svrhu ove studije zbog toga što kod njih ne postoji kolateralno snabdevanje srca krvlju, i iz tog razloga nije neophodno određivanje miokardijalnog protoka krvi. U ovoj studiji, upotrebljeni su različiti protokoli doziranja u odvojenim grupama kunića koji su podvrgnuti regionalnoj miokard(jalnoj ishemiji u trajanju do 30 minuta pomoću ligacije koronarne arterije i reperfuzije. Upotrebljena su dva protokola doziranja. U prvom protokolu, ETC-216 je testiran primenom u pojedinačnom prethodnom lečenju pri čemu je srce kunića izloženo količini do 100 mg/kg agensa neposredno pre nastanka regionalne ishemije, dok su prema drugom protokolu primenjena dva prethodna tretmana od 100 mg/kg (jedan dan pre i neposredno pre) nastanka regionalne ishemije. Ovi protokoli su prikazani (slika 13). Ova studija usredsredila se na efekte ETC-216 kao kardioprotektivnog agensa uin vivostudiji gde je srce kunića podvrgnuto regionalnoj miokardijalnoj ishemiji tokom perioda od 30 minuta za čime sledi reperfuzija od minimalno četiri sata. Ovim primerom demonstrirano je daje ETC-216 kardioprotektivno sredstvo kada se primeni posle ishemičnog događaja.

[00188] Procedure upotrebljene tokom ove studije su u skladu sa uputstvima Komiteta za upotrebu i zaštitu životinja, Universitv of Michigan. Veterinarska nega obezbeđena je od strane Jedinice za laboratorijsku medicinu životinja (Laboratorv Animal Medicine), Universitv of Michigan. Universitv od Michigan je akreditovan od strane Američke asocijacije za akreditaciju programa za laboratorijsku zaštitu zdravlja životinja, i program za zaštitu životinja u skladu je sa standardima propisanim u Vodiču za zaštitu i upotrebu laboratorijskih životinja, DHEW (N1H) publikacija broj 86-23.

[00189] Muški kunići Nevv Zealand White, dobijeni od kompanije Charles River, približne težine 2-3 kg, upotrebljeni su u ovoj studiji. Posle dolaska, životinjama je pripisan jedinstveni identifikacioni broje. Kunići su podvrgnuti anesteziji smesom ksilazin (3,0 mg/kg) i ketamina (35 mg/kg) intrmuskularno za čime sledi intravenozno injektiranje natrijum pentobarbitala (30 mg/kg). Anestezija je održavana intravenoznim injekcijama rastvora pentobarbitala (30 mg/ml). Umetnuta je endotrahealna cevčica sa manžetnom, i životinje su stavljene na ventilaciju pozitivnog pritiska sobnog vazduha. Desna vratna vena je izolovana i uvedena je kanula radi primene ETC-216 ili odgovarajuće zapremine medijuma. Izolovana je desna karotidna arterija, i opskrbljena je MillarTM transduktorom pritiska preko katetera sa mikro vrhom postavljenim neposredno iznad aortnih zalistaka u cilju praćenja aortnog krvnog pritiska i radi dobijanja izvedenog derivata pulsa pritiska (dP/dt). Vodstvo II elektrokadiograma je praćeno tokom celokupnog eksperimenta. Izvršene su leva torakotomija i perikardiotomija, za čime sledi identifikacija leve prednje silazne (LAD) koronarne arterije. Svileni šav (3,0; Deknatel, Fali River, MA) je umetnut iza arterije i oba kraja šava su umetnuta u polietilensku cevčicu male dužine. Silazni pritisak na polietilensku cevčicu uz istvoremeno ispoljavanje tenzije nagore ka slobodnom kraju šava sabija osnovnu koronarnu arteriju i rezultuje u okluziji krvnog suda i u regionalnoj miokardijalnoj ishemiji. Začepljenost je održavana tokom 30 minuta posle čega je pritisak na šav smanjen i polietilenska cevčica je povučena čime je omogućeno da dođe do reperfuzije. Regionalna ishemija srčanog mišića je verifikovana prisustvom oblasti na površini distribucije okludovanog krvnog suda i promenama u elektrokardiogramu konzistentnim sa prisustvom transmuralne regionalne ishemije srčanog mišića (ST-segment elevacije).

[00190] Glavno određivanje završne tačke sastojalo se od merenja veličine infarkta kao procenta leve komore i kao procenat površina pod rizikom (slike 14 i 15). Na kraju ove studije, kunićimaje, za vreme anestezije, davan heparin (1000 U intravenozno) posle čega su je izvršena eutanazija. Srce kunića je uklonjeno, a zatim pripremljeno za perfuziju kroz aortu pomoću Langendorff-ovog aparata sa Krebs-Henseleit-ovim puferom pri konstantnom protoku od 22-24 ml/min. Srca kunića su isprana puferom tokom 10 minuta radi osiguranja daje tkivo čisto. Perfuzija kroz srce je izvršena pomoću četrdestpet mililitara 1 % rastvora trifeniltetrazolijum hlorida (TTC) u fosfatnom puferu (pH 7,4). TTC obeležava deo srčanog mišića koji nije pod infarktom u okviru rizične površine cigla-crvenom bojom, ukazujući na prisustvo formazanskog precipitata koji nastaje kao posledica redukcije TTC pomoću koenzima prisutnih u radno sposobnom miokard(jalnom tkivu. Ireverzibilno oštećeno tkivo, kome nedostaju citosolne dehidrogenaze, nije sposobno da formira formazanski precipitat i obojeno je bledo žutom bojom. Leva prednja silazna (LAD) arterija ligirana je za identično mesto ligirane površine za vreme indukcije regionalne ishemije srčanog mišića. Perfuziona pumpa je zaustavljena i 2 ml 0,25 % rastvora Evans-ovog Plavog je sporo injektirano kroz otvor ispusta povezanog sa aortnom kanulom. Boja se provodi kroz srce tokom 10 sekundi radi osiguranja podjednake distribucije boje. Boja Evans-sovo Plavo upotrebljena je za obeležavanje levog ventrikularnog tkiva koje nije bilo izloženo regionalnoj ishemiji, što je suprotno od rizičnog regiona. Srce kunića je uklonjeno sa aparata za perfuziju i isečeno u poprečne delove pod desnim uglom u odnosu na vertikalnu osu. Tkiva desne komore, apeksa, i pretkomore su odbačena. Obc površine svakog poprečnog odeljka su prebačene na providne celulozne listove. Slike su fotokopirane i uveličane. Fotokopije su skenirane i prebačene u Adobe PhotoShop (Adobe Svstems Inc., Seattle, VVA). Koristeći Adobe Photo Shop Softvvare određene su površine normalne leve komore (NLV) ne-rizičnih regiona, rizičnih površina, i površine infarkta, izračuvanjem broja piksela koju obuhvata svaka površina. Ukupna rizična površina izražena je kao procenat leve komore. Veličina infarkta izražena je kao procenat rizične površine (ARR) (slike 14 i 15).

[00191] Procenat infarkta na rizičnoj površini, procenat infarkta leve komore, i procenat rizične površine leve komore kod kunića lečenih jednokratno (tj., akutni tretman) ili lečenih dva puta (tj., hronični tretman) pomoću ETC-216 (100 mg/kg) ili ekvivalentne zapremine medijuma. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± standardna greška srednje vrednosti dobijene na osnovu n= 6 životinja po grupi. Zvezdica na slici 14 ukazuje na značajnu razliku u odnosu na odgovarajući kontrolnu grupu.

[00192]Učinjena su i druga određivanja završne tačke. Na konačnu veličinu infarkta može se uticati povećanje ili smanjenje korišćenja miokardijalnog kiseonika. Dve važne determinante kompenzacije miokardijalnog kiseonika su brzina rada srca i opterećenja pritiskom. Brzina pritiska proizvoda (brzina srca x srednji pritisak arterijske krvi) obezbeđuje aproksimaciju za promenu kod miokardijalnih zahteva za kiseonikom od strane srca. Prema tome, za proizvod brzine i pritiska je izračunato da su određeni ukoliko se primećena redukcija veličine infarkta koreliše sa promenom brzine pritiska proizvoda. Brzina rada srca i srednji pritisak aorte su kontinualno praćeni tokom celokupnog eksperimentalnog protokola i podaci su upotrebljeni za izračunavanje brzine pritiska proizvoda u specifičnim vremenskim tačkama u ovoj studiji, i to za svaku eksperimentalnu grupu.

[00193]Procenat rizične površine leve komore smanjenje kod srca kunića lečenih pomoću ETC-216 u poređenju sa kontrolnim grupama i to u akutnoj i hroničnoj primeni, međutim, dobijeni rezultati nisu statistički značajni. Procenat infarkta na rizičnoj površini i procenat infarkta leve komore su značajno smanjeni kod srca kunića lečenih pomoću ETC-216 u poređenju sa kontrolnim grupama i to u akutnoj i hroničnoj primeni. Ovi rezultati ukazuju da ETC-216 jeste kardioprotektivno sredstvo kada je primenjen i to u akutnoj i hroničnoj primeni.

[00194]Može se porediti aktivnost kreatin kinaze miokardijalnog tkiva u rizičnim i ne-rizičnim oblastima. Osnova testa zasnovana je na povećanju apsorbance reakcione smese na 340 nm kao rezultat ekvimolarne redukcije NAD do NADH. Brzina promene apsorbance direktno je proporcionalna aktivnosti kreatin kinaze. Jedna jedinica definisanaje kao količina enzima koji proizvodi jedan mikromol NADPH na minut pod uslovima postupka iz testa.

[00195]Miokardijalna tkiva podvrgnuta produženom periodu opstrukcije protoka krvi (ishemiji) bez reperfuzije doživeće morfološke promene karakteristične za nekrozu zajedno sa prisustvom inflamatornih ćelija. Morfološke pojave od ishemijom indukovanih smrti ćelija razlikuju se od onih do kojih dolazi kao rezultat reperfuzije. Ove poslednje karakterisane su kontrakcijom traka i nazivaju se nekroza usled kontrakcije traka. Tkivo srca iz svake od grupa je sačuvano i pripremljeno za pregled elektronskom mikroskopijom.

[00196]Ishemične reperfuzije prilikom povreda su vezane za akumulaciju inflamatornih ćelija, dominantno neutrofila, na rizičnoj površini. Mieloperoksidaza (MPO) je enzim prisutan skoro isključivo kod neutrofda (Liu et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 287: 527-537, 1998). Iz tog razloga, pretpostavlja se da tkiva iz odgovarajućih oblasti srca mogu biti testirana na MPO aktivnost kao indikatora oštećenja. Takođe se pretpostavlja da bi intervencija sposobna da izvrši redukciju inflamatornog odgovora bila vezana za redukciju MPO aktivnosti u reperfuziranoj rizičnoj oblasti u poređenju sa tkivom srca iz rizične oblasti kod životinja koja nisu lečena. Tako, procenat promene u MPO aktivnosti (rizična oblast / ne-rizična oblast) bio bi smanjen kod srca kunića tretiranih lekom u poređenju sa srcima zamorčića tretiranih kontrolnim medijumom.

[00197] Na kraju eksperimenta, aktivnost mieloperoksidase (MPO) iz tkiva određena je preliminarnim, nekontrolisanim, testom koji nije validizovan. Uzorci tkiva srca dobijeni iz rizične oblasti i ne-rizične oblasti, i homogenizovani su u 0,5 % heksadeciltrimetil amonijum bromidu i rastvoreni u 50 mM kalijum fosfatnom puferu, pH 6,0 (videti takođe Liu et al.. 1998, J. Pharmacol. Exp. Ther. 287: 527-537). Homogenati su centrifugirani pri 12,500 g na 4 °C tokom 30 minuta. Supernatanti su sakupljeni i podrgnuti reakciji sa 0,167 mg/ml o-dianizidin dihidrohloridom (Sigma) i 0,0005 procentnim H2O2u 50 mM kalijum fosfatnom puferu, pH 6,0. Promena apsorbance merena je spektrofotometrijski na 460 nm. Jedna jedinica MPO definisana je kao ona količina enzima koja hidrolizuje 1 mmol H202/minut na 25 °C. Proističe da rezultati ovog preliminarnog eksperimenta, koji ovde nisu navedeni, ukazuju da nije bilo razlike između ETC-216 i medijumom lečenih srca kunića u smislu ishemične reperfuzije prilikom povreda, međutim, rezultati moraju tek da budu validizovani, na primer, poređenje MPO nivoa pre ishemične reperfuzije prilikom povreda.

[00198] Kako je demonstrirano smanjenim procentom infarkta rizične površine i smanjenim procentom infarkta leve komore, srca kunića lečena pomoću ETC-216 su zaštićena od ishemične reperfuzije prilikom povreda. Kardiološka zaštita je postignuta pomoću oba protokola doziranja, to jest, ETC-216 primenjen u pojedinačnoj dozi od 100 mg/kg pre nastanka ishemije ili ETC-216 primenjen u dve doze od po 100 mg/kg, jedne doze date jedan dan pre ishemije, a druge doza primenjene neposredno pre ishemije. 6.5. Primer 5: Određivanje minimalne delotvorne doze za akutnu primenu u LAD okludovanom - reperfuziranom srcu kunića

[00199]Ovaj primer demonstrira profilaktičku efikasnost različitih doza ETC-216 primenjenog u pojedinačnom prethodnom tretmanu neposredno pre nastanka regionalne ishemije. Studija iz primera 2 fokusiranaje na efekat ETC-216 kao kardioprotektivnog agensa uin vivostudiji gde je srce kunića bilo podvrgnuto regionalnoj miokardijalnoj ishemiji u toku perioda od 30 minuta za čime sledi reperfuzija tokom minimalno četiri sata. Upotrebljena su dva protokola doziranja. U prvom protokolu, ETC-216 je testiran u pojedinačnom prethodnom lečenju gde je sistemska cirkulacija bila izložena do 100 mg/kg agensa neposredno pre nastanka regionalne ishemije, dok su u drugom protokolu dve doze od 100 mg/kg bile primenjene pre (jedan dan pre i neposredno pre) nastanka regionalne ishemije. Oba protokola ukazala su da su jednostruki tretman ili dvostruki tretman pomoću 100 mg/kg ETC-216 kardioprotektivni.

[00200]lz tog razloga. E'l'C-216 je testiran u vidu jednostrukog prethodnog lečenja (tretmana) pri čemu je srce izloženo pojedinačnoj dozi agensa ili ekvivalentoj zapremini medijuma neposredno pre nastanka regionalne ishemije radi utvrđivanja efekata na kardiološku zaštitu. Srca kunića su analizirana pomoću istih metoda upotrebljenim u primeru 2. Dodatno, ovaj protokol je osmišljen radi iznalaženja minimalne efikasne doze ETC-216 za lečenje srca kunića u cilju zaštite od ishemije.

[00201]Da bi se našla minimalna delotvorna doza ETC-216, isti protokol za akutno lečenje (videti sliku 13) je upotrebljen i u ovom u kome su životinje primile pojedinačnu primenu od 10, 3 ili 1 mg/kg ETC-216 ili ekvivalentne zapremine medijuma kako je prikazano na slici 16. Rizična površina (AAR) ili ishemična oblast izražena kao procenat od ukupne leve komore za grupu lečenom pomoću 10 mg/kg i bila je slična u kontrolnoj grupi i u lečenoj grupi (slika 17). Kod kunića lečenih pomoću 10 mg/kg ETC-216 dolazilo je do manjeg infarkta (p<0,0005) izraženo kao procenat AAR u poređenju sa kunićima lečenih medijumom (slika 18). Redukcija veličine miokardijalnog infarkta (p<0,0001) takođe je primećena kada su podaci izraženi kao procenat ukupne leve komore (slika 17).

[00202]Slični rezultati su primećeni pri dozi od 3 mg/kg. Vrednost AAR izražena kao procenat ukupne leve komore bilaje slična kod grupe Iečene pomoću ETC-216 i u medijumom lečenoj grupi (slika 17). Kunići lečeni pomoću 3 mg/kg ETC-216 dobijali su manje infarkte (p<0,05) izražene kao procenat rizične površine u poređenju sa kunićima lečenih pomoću medijuma (slika 17). Redukcija miokardijalnog infarkta veličine (p<0,05) primećena je kada su podaci izraženi kao procenat ukupne leve komore (slika 17).

[00203]Nisu primećene značajne razlike pri dozi od 1 mg/kg između ETC-216 i medijuma u veličini AAR kada je izražena kao procenat leve komore (slika 17). Pri 1 mg/kg, nisu primećene značajne razlike između grupa kao procenat AAR (slika 17) i veličine miokardijalnog infarkta izražene kao procenat od ukupne leve komore (slika 17).

[00204] Pregled podataka iz svake od četiri akutno lečene grupe (tj., 100, 10, 3 i 1 mg/kg) i njihovih odgovarajućih kontrolnih grupa prikazanje na slici 17. AAR infarkta sličan je u svakoj od četiri grupe. U okviru četiri protokola doziranja, veličina infarkta, bez obzira da lije izražena kao procenat rizične oblasti ili procenat leve komore, u poređenju sa odgovarajućim kontrolnim grupama je smanjena pomoću ETC-216 doza od 100, 10 i 3 mg/kg. Za razliku od toga, veličina infarkta kod grupa životinja kojima je primenjena doza od 1 mg/kg nije se razlikovala od one primećene kod odgovarajućih grupa lečenih medijumom.

[00205] Na slici 18 prikazani su primeri privremenih promena lipoprotein neesterifikovanog holesterola. Uzorci krvi dobijeni iz kunića neposredno pre, i periodično posle primene 1,3, 10 ili 100 mg/kg ETC-216 ili medijuma. Prikazani su profili neesterifikovanog holesterola dobijeni iz reprezentativnih privremenih uzoraka krvnih seruma pri čemu su lipoproteini iz seruma odvojeni na osnovu svoje veličine pomoću gel-filtracione hromatografije sa analizom neesterifikovanog holesterola u sklopu sistema. Zapazite povećanje nivoa holesterola visoke gustine neesterifikovanog holesterola na 45 minuta posle primene ETC-216, posebno pri 100 mg/kg i do manjeg obima pri dozi od 10 mg/kg uprkos suštinskom odsustvu neesterifikovanog holesterola u intravenozno primenjenom ETC-216 test agensu. Takođe zapazite odloženo izraženo podizanje nivoa lipoproteina neesterifikovanog holesterola vrlo niske gustine na 210 i 270 minuta posle primene bilo 10 mg/kg ili 100 mg/kg ETC-216. Takođe zapazite da promene u lipoprotein neesteriifkovanom holesterolu nisu očigledne pri primenjenoj dozi od 3 mg/kg ETC-216 u vremenskim tačkama vršenog merenja, međutim, ova doza bilaje kardioprotektivna kako je prikazano na slici 17.

[00206] Navedeni rezultati demonstriraju da doze od 100 mg/kg, 10 mg/kg i 3mg/kg predstavljaju delotvorne profilaktičke doza ETC-216.

6.6. Primer 6: ETC-216 sprečava oštećenje nastalo ishemijom -

reperfuzijom kada je primenjen posle nastanka LAD okluzije u okludovanim-reperfuziranim srcima kunića

[00207] Ovaj primer demonstrira efikasnost ETC-216 u sprečavanju ili redukciji ishemične reperfuzije prilikom povreda kadaje primenjen posle ishemičnog ili okluzionog događaja. Studije iz primera 2 i 3 ilustruju profilaktičku korist od lečenja mišića srca pre nastanka ishemije. Iz tog razloga, da bi se odredilo da li bi ETC-216 mogao zaštiti srčani mišić posle nastanka ishemije, LAD je okludovan pre primene test agensa ili medijuma. Prema ovom protokolu, ETC-216 je testiran u pojedinačnom tretmanu kojim je srce izloženo delovanju do 10 mg/kg agensa ili ekvivalentne zapreminue medijuma, primenjenih u toku poslednjih 5 minuta od regionalne ishemije i nastavljeno tokom prvih 55 minuta od reperfuzije (slika 19). AAR ili ishemična oblast izražena kao procenat od ukupne leve komore za grupu lečenu pomoću 10 mg/kg bila je slična kontrolnoj grupi (slika 20). Kod kunića lečenih pomoću ETC-216 nastajali su manji infarkti (p<0,001) izraženi kao procenat od AAR u poređenju sa kunićima lečenih medijumom (slika 20). Redukcija veličine miokardijalnog infarkta (p<0,0005) takođe je primećena kada su podaci izraženi kao procenat od ukupne leve komore (slika 20).

[00208]Ovaj primer demonstrira da pojedinačno lečenje primenjeno posle ishemičnog događaja, oblažava ili smanjuje ishemične reperfuzije prilikom povreda.

[00209]Opisana su različita oličenja sadašnjeg pronalaska. Opisi i primeri su namenjeni da ilustruju sadašnji pronalazak i nisu ograničavajući. Naravno, onima obučenim u oblasti biće očigledno koje se modifikacije mogu izvršiti različitim oličenjima sadašnjeg opisanog pronalaska bez napuštanja duha sadašnjeg pronalaska ili opsega dodatih patentnih zahteva izloženih dole.

[00210]Sve ovde navedene reference su ovim obuhvaćene kao navodi u punom svom obimu.

Claims (74)

1. Postupak za lečenje akutnog koronarnog sindroma kod subjekta kome je to potrebno naznačen time što dati postupak uključuje primenu Apolipoproteina A-I Milano: l-palmitoil-2-oleoil-s«-glicero-3-fosfoholin kompleksa (Apo A-IM: POPC kompleks) u dozi od oko 1 mg protein/kg do oko 100 mg protein/kg.

2. Postupak iz zahteva 1 naznačen time što se Apo A-IM: POPC kompleks primenjuje subjektu u dozi od oko 15 mg/kg.

3. Postupak iz zahteva 1 naznačen time što se Apo A-IM: POPC kompleks primenjuje subjektu u dozi od oko 45 mg/kg.

4. Postupak iz zahteva 1 naznačen time što se Apo A-IM: POPC kompleks primenjuje subjektu u dozi od oko 15 mg/kg do oko 45 mg/kg.

5. Postupak iz zahteva 1 naznačen time što Apo A-I Milano jeste rekombinantni Apo A-l Milano.

6. Postupak iz zahteva 1 naznačen time što Apo A-IM: POPC kompleks uključuje Apolipoprotein A-I Milano i l-palmitoil-2-oleoil-.w-glicero-3-fosfoholin u odnosu od oko 1:1 težinski protein / težinski lipid.

7. Postupak iz zahteva 1 naznačen time što Apo A-IM: POPC kompleks čini sterilnu tečnu farmaceutsku formulaciju.

8. Postupak iz zahteva 7 naznačen time što se farmaceutska formulacija primenjuje subjektu u dozi od oko 15 mg/kg.

9. Postupak iz zahteva 7 naznačen time što se farmaceutska formulacija primenjuje subjektu u dozi od oko 45 mg/kg.

10. Postupak iz zahteva 7 naznačen time što se farmaceutska formulacija primenjuje subjektu jednom nedeljno tokom oko 6 meseci, oko 5 meseci, oko 4 meseca, oko 3 meseca, oko 2 meseca ili oko 1 meseca.

11. Postupak iz zahteva 7 naznačen time što se farmaceutska formulacija primenjuje subjektu oko svakog dana tokom oko 1 meseca.

12. Postupak iz zahteva 7 naznačen time što se farmaceutska formulacija primenjuje subjektu oko svakog 3. dana tokom oko 1 meseca do oko 6 meseci.

13. Postupak iz zahteva 7 naznačen time što se farmaceutska formulacija primenjuje oko svakog 10. dana tokom oko 1 meseca do oko 6 meseci.

14. Postupak iz zahteva 7 naznačen time što se farmaceutska formulacija primenjuje oko svakog 14. dana tokom oko 1 meseca do oko 6 meseci.

15. Postupak iz zahteva 1 naznačen time što dalje uključuje hiruršku intervenciju.

16. Postupak iz zahteva 15 naznačen time što hirurška intervencija uključuje perkutano transluminalni koronarnu angioplastiju ili implantaciju bajpasa koronarne arterije.

17. Postupak iz zahteva 1 naznačen time što nadalje uključuje primenu drugog leka za lečenje, sprečavanje ili poboljšanje stanja bolesti, oboljenja, simptoma ili bola vezanog za akutne koronarne sindrome.

18. Postupak iz zahteva 1 naznačen time što je procenat zapremine aterome krvnog suda obolelih subjekta smanjen za oko -0,73 % do oko -1,29 %.

19. Postupak iz zahteva 1 naznačen time što je ukupna zapremina aterome u ciljanom krvnom sudu subjekta smanjen za oko -15,1 mm<J>do oko -12,6 mm<J>.

20. Postupak iz zahteva I naznačen time što je srednja maksimalna debljina aterome u ciljanom koronarnom segmentu subjekta smanjena za oko -0,039 mm do -0,044 mm.

21. Postupak iz zahteva 7 naznačen time što se farmaceutska formulacija primenjuje intravenozno.

22. Postupak iz zahteva 21 naznačen time što se farmaceutska formulacija primenjuje tokom oko jednog sata.

23. Postupak iz zahteva 21 naznačen time što se farmaceutska formulacija primenjuje tokom oko tri sata.

24. Postupak iz zahteva 7 naznačen time što farmaceutska formulacija uključuje Apo A-I Milano, POPC, nosač saharoza-manitol i fosfatni pufer.

25. Postupak iz zahteva 24 naznačen time što se nosač saharoza-manitol sastoji od oko 6,0 % do oko 6,4 % saharoze i oko 0,8 % do oko 1 % manitola.

26. Postupak iz zahteva 25 naznačen time što se nosač saharoza-manitol sastoji od oko 6,2 % saharoze i oko 0,9 % manitola.

27. Postupak iz zahteva 7 naznačen time što je pH vrednost farmaceutske formulacije od oko 7,0 do oko 7,8.

28. Postupak iz zahteva 27 naznačen time što je pH vrednost oko 7,5.

29. Postupak iz zahteva 7 naznačen time što farmaceutska formulacija uključuje oko 12 mg/ml do oko 18 mg/ml Apo A-I Milano.

30. Postupak iz zahteva 7 naznačen time što farmaceutska formulacija uključuje oko 11 mg/ml do oko 17 mg/ml POPC.

31. Postupak iz zahteva 7 naznačen time što farmaceutska formulacija uključuje manje od 6000 čestica veličine veće od 10 um na 50 mL.

32 Postupak iz zahteva 7 naznačen time što farmaceutska formulacija uključuje manje od 600 čestica veličine veće od 25 mn na 50 mL.

33. Postupak iz zahteva 7 naznačen time što je osmolalnost farmaceutske formulacije od oko 280 do oko 320 mOsm.

34. Postupak iz zahteva 33 naznačen time što je osmolalnost farmaceutske formulacije od oko 290 mOsm.

35. Postupak za redukciju arterosklerotične naslage (pločice) kod subjekta kome je to potrebno naznačen time što dati postupak uključuje primenu 45 mg/kg rekombinantnog Apo A-I Milano: POPC kompleksa subjektu najmanje jedanput.

36. Postupak iz zahteva 35 naznačen time što se rekombinantni Apo A-I Milano: POPC kompleks primenjuje nedeljno, mesečno ili godišnje.

37. Postupak iz zahteva 35 naznačen time što se rekombinantni Apo A-I Milano: POPC kompleks primenjuje nedeljno tokom oko 3-5 nedelja.

38. Postupak iz zahteva 35 naznačen time što nadalje uključuje primenu doze subjektu od 15 mg/kg rekombinantnog Apo A-I Milano: POPC kompleksa najmanje jedanput.

39. Postupak iz zahteva 38 naznačen time što se kompleks primenjuje nedeljno, mesečno ili godišnje.

40. Postupak iz zahteva 35 naznačen time što se subjekt takođe leči drugim lekom za lečenje, sprečavanje ili poboljšanje stanja bolesti, oboljenja, simptoma ili bola vezanog za akutne koronarne sindrome.

41. Postupak iz zahteva 40 naznačen time što je lek statin, p-bloker, ACE inhibitor ili, antitrombično sredstvo, vazodilator ili njihove kombinacije.

42. Tečna farmaceutska formulacija naznačena time što uključuje rekombinantni Apo A-I Milano ili njegovu varijantu /l-palmitoil-2-oleoil-s«-glicero-3-fosfoholin kompleks u puferu, navedeni pufer uključuje oko 6,0 % do oko 6,4 % saharoze, dalje uključuje oko 0,8 do oko 1 % manitola, pH vrednost navedenog pufera je oko 7,0 do oko 7,8.

43. Farmaceutska formulacija iz zahteva 42 naznačena time što uključuje oko 6,2 % saharoze.

44. Farmaceutska formulacija iz zahteva 42 naznačena time što uključuje oko 0.9 % manitola.

45. Farmaceutska formulacija iz zahteva 42 naznačena time što je njena pFI vrednost oko 7.5.

46. Farmaceutska formulacija iz zahteva 42 naznačena time što je koncentracija rApo A-I Milano u navedenom puferu oko 12 mg na ml do oko 18 mg na ml.

47. Farmaceutska formulacija naznačena time što uključuje rekombinantni Apo A-I Milano, ili njegovu varijantu, kompleksiran sa 1-palmitoil-2-oleoil-sn-gliccro-3-fosfoholinom, i fosfatni pufer pll vrednosti od oko 7,0 do oko 7,8, navedeni pufer uključuje 2 % glukoze i 4 mM natrijum fosfata.

48. Farmaceutska formulacija iz zahteva 47 naznačena time što uključuje fosfatni pufer u cilju postizanja pH vrednosti od oko 7,5.

49. Farmaceutska formulacija iz zahteva 42 ili 47 naznačena time što je rekombinantni Apo A-I Milano konzervativno supstituisani Apo A-l Milano.

50. Farmaceutska formulacija iz zahteva 42 ili 47 naznačena time što su rekombinantni Apo A-I Milano i POPC kompleksirani u odnosu od 1:0,95 rekombinantnog Apo A-I Milano: POPC (težina proteina/težina lipida).

51. Farmaceutska formulacija iz zahteva 42 ili 47 naznačena time što uključuje manje od 6000 čestica veličine veće od 10 um na 50 mL.

52. Farmaceutska formulacija iz zahteva 42 ili 47 naznačena time što uključuje manje od 600 čestica veličine veće od 25 um na 50 mL.

53. Farmaceutska formulacija iz zahteva 42 ili 47 naznačena time što je vrednost osmolalnosti oko 280 do oko 320 mOsm.

54. Farmaceutska formulacija iz zahteva 53 naznačena time što je vrednost osmolalnosti oko 290 mOsm.

55. Farmaceutska formulacija iz zahteva 42 ili 47 naznačena time što je sterilna.

56. Farmaceutska formulacija iz zahteva 42 ili 47 naznačena time što je zamrznuta.

57. Farmaceutska formulacija iz zahteva 42 ili 47 naznačena time što se nalazi u sterilnoj staklenoj flašici, sterilnoj prethodno napunjenoj vrećici ili prethodno napunjenom špricu.

58. Liofilizovana farmaceutska formulacija naznačena time što uključuje: a) rekombinantni Apo A-l Milano, ili njegovu varijantu, kompleksiran sa l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholinom; b) oko 6,0 % do oko 6.4 % saharoze; i c) oko 0.8 do oko 1 % manitola.

59. Farmaceutska formulacija iz zahteva 58 naznačena time što uključuje oko 6,2 % saharoze.

60. Farmaceutska formulacija iz zahteva 58 naznačena time što uključuje oko 0,9 % manitola.

61. Farmaceutska formulacija iz zahteva 58 naznačena time što uključuje pufer, pH vrednost navedenog pufera je oko 7,5.

62. Farmaceutska formulacija iz zahteva 58 naznačena time što je rekombinantni Apo A-I Milano konzervativno supstituisani Apo A-l Milano.

63. Farmaceutska formulacija iz zahteva 58 naznačena time što je koncentracija POPC oko 11 mg/ml do oko 17 mg/ml.

64. Farmaceutska formulacija iz zahteva 58 naznačena time što su rekombinantni Apo A-I Milano i POPC kompleksirani u odnosu od 1:0,95 rekombinantnog Apo A-I Milano: POPC (težina proteina/težina lipida).

65. Farmaceutska formulacija iz zahteva 58 naznačena time što uključuje manje od 6000 čestica veličine veće od 10 um na 50 mL.

66. Farmaceutska formulacija iz zahteva 58 naznačena time što uključuje manje od 600 čestica veličine veće od 25 |um na 50 mL.

67. Farmaceutska formulacija iz zahteva 58 naznačena time što je vrednost osmolalnosti oko 280 do oko 320 mOsm.

68. Farmaceutska formulacija iz zahteva 67 naznačena time što je vrednost osmolalnosti oko 290 mOsm.

69. Farmaceutska formulacija iz zahteva 58 naznačena time što je sterilna.

70. Farmaceutska formulacija iz zahteva 58 naznačena time što se nalazi u sterilnoj staklenoj flašici, sterilnoj prethodno napunjenoj vrećici ili prethodno napunjenom špricu.

71. Postupak za lečenje ishemične reperfuzije kod subjekta kome je to potrebno naznačen time što navedeni metod uključuje primenu Apolipoprotein A-I Milano: l-palmitoil-2-oleoil-sn-gIiccro-3-fosfoholin kompleksa (Apo A-IM: POPC kompleks) u dozi od oko 15 mg protein/kg.

72. Postupak za lečenje ishemične reperfuzije kod subjekta kome je to potrebno naznačen time što navedeni metod uključuje primenu Apolipoprotein A-I Milano: l-palmitoil-2-oleoiI-sn-glicero-3-fosfoholin kompleksa (Apo A-IM: POPC kompleks) u dozi od oko 45 mg protein/kg.

73. Postupak iz zahteva 2, 8 ili 71 naznačen time što navedeni metod uključuje primenu 45 mg protein/kg.

74. Postupak iz zahteva 3. 9 ili 72 naznačen time što navedeni metod uključuje primenu 15 mg protein/kg.