ES2450136T3

ES2450136T3 - Proceso para la preparaci�n de clorinas y sus usos farmace�ticos

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Publication number: ES2450136T3
Application number: ES09768255.3T
Authority: ES
Inventors: Lu�S Guilherme Da Silva Arnaut Moreira; Maria Migu�Ns Pereira; Sebasti�O Jos� Formosinho Sanches Sim�Es; S�Rgio Paulo Magalh�Es Sim�Es; Krystyna Urbanska; Grazynia Stochel
Original assignee: Bluepharma - Industria Farmac Utica Sa; Bluepharma Ind Farmaceutica S A; Universidade de Coimbra
Current assignee: Bluepharma - Industria Farmac Utica Sa; Bluepharma Ind Farmaceutica S A; Universidade de Coimbra
Priority date: 2008-10-24
Filing date: 2009-10-22
Publication date: 2014-03-24
Anticipated expiration: 2029-10-22
Also published as: GB0819594D0; RU2011114878A; AU2009307106A1; HK1160848A1; WO2010047611A1; JP2012506425A; DK2346874T3; CN102227432B; AU2009307106B2; ZA201102760B; EP2346874A1; CA2741429A1; CN102227432A; PT2346874E; PL2346874T3; JP5567024B2; BRPI0919868B1; US9670217B2; CA2741429C; BRPI0919868B8

Abstract

Un procedimiento para sintetizar un derivado de clorina o bacterioclorina que tiene la siguiente fórmula:**Fórmula** en la que : **Fórmula** representa un enlace carbono-carbono simple o doble ; X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 son cada uno, halógenos (F, Cl, Br) y átomos de hidrógeno seleccionados independientemente, siempre que simultáneamente X2, X4, X6, y X8 o que simultáneamente X1, X3, X5 y X7 sean halógenos, o que todos los X sean halógenos ; R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 se seleccionan independientemente entre H, -OH y -SO2R, en el que cada R se selecciona independientemente entre - Cl, -OH, -aminoácido, -ORn, -NHRn y -NR2n -, donde Rn es un alquilo con 1 a 12 átomos de carbono; Y es un átomo de flúor o hidrógeno; incluyendo el paso siguiente: (i) La reducción en estado sólido de la porfirina substituida correspondiente en derivado y clorina o de bacterioclorina usando hidrazidas en ausencia de disolventes y opcionalmente en ausencia de bases; en el que la porfirina sustituida correspondiente tiene la fórmula : **Fórmula**

Description

Proceso para la preparaci�n de clorinas y sus usos farmace�ticos

OBJETO DE LA INVENCI�N

La presente invenci�n describe m�todos de preparaci�n, las propiedades y la composici�n farmac�utica para uso en terapia de clorinas y bacterioclorinas sulfonadas concebidas para la terapia fotodin�mica (PDT, siglas en ingl�s de Photodynamic therapy) de los tejidos hiperproliferativos, tales como tumores, vasos sangu�neos hiperproliferativos y otros trastornos o anomal�as que responden a la PDT. En particular, la presente invenci�n se refiere a un nuevo procedimiento para la s�ntesis qu�mica a gran escala de clorinas y bacterioclorinas estables, que se caracteriza por la ausencia de disolventes y la ausencia de bases.

I.FUNDAMENTOS DE LA INVENCI�N

I.A. Estado actual de la t�cnica

Varios compuestos macroc�clicos tetrapirr�licos, tales como las purpurinas, clorinas, bacterioclorinas, ftalocianinas y benzoclorinas pueden acumularse preferentemente en los tejidos hiperproliferativos cuando se inyectan en un organismo y absorben la luz, originando un estado activado en respuesta a la luz. Estos compuestos macroc�clicos presentan entonces un efecto citot�xico en las c�lulas donde se encuentran otros tejidos que han sido irradiados con la longitud de onda apropiada. Adem�s, estos compuestos emiten tambi�n energ�a a partir del tejido, fen�meno que puede utilizarse para detectar su ubicaci�n.

En PDT, se le inyecta al paciente un fotosensibilizador (por lo general a una concentraci�n de 0, 1 a 10 mg/kg de peso corporal), que presenta una cierta selectividad para causar da�os fotoqu�micos al tejido tumoral, y despu�s de un tiempo determinado, se irradia la zona del tumor con luz visible o de la gama de infrarrojos cercana (aproximadamente 50 a 200 J/cm2). El fotosensibilizador absorbe la luz y emite fluorescencia, o reacciona con las mol�culas presentes en los tejidos por medio de reacciones de transferencia de electrones o hidr�geno (procesos de Tipo I), o transfiere su energ�a al ox�geno molecular al estado fundamental generando ox�geno singlete O2 (1Δg) que ataca los tejidos (proceso de Tipo II). El principal contribuyente para el proceso de Tipo I es el i�n super�xido (O2 -), formado por la transferencia de electrones que proceden del sensibilizador excitado electr�nicamente. Existen pruebas a favor del proceso de foto-oxigenaci�n Tipo II en relaci�n al proceso Tipo I en c�lulas [1, 2], pero existen informes de aumento de la respuesta en PDT cuando tambi�n se genera el i�n super�xido [3]. En caso de detecci�n, la fluorescencia se determina por la exposici�n a la luz de la longitud de onda deseada, necesitando energ�as m�s bajas que aquellas utilizadas en el tratamiento. Generalmente, un tratamiento eficaz requiere la formaci�n de grandes cantidades de ox�geno singlete en el tejido, que puede tener un efecto sin�rgico con la formaci�n simult�nea de iones super�xidos u otras especies reactivas de ox�geno.

Las propiedades ideales de los sensibilizadores para su aplicaci�n en PDT incluyen: (i) s�ntesis simple, eficiente y econ�mica, (ii) estabilidad, la pureza y larga duraci�n de almacenamiento, (iii) solubilidad en soportes o disolventes biocompatibles, (iv) coeficiente elevado de absorci�n en la "ventana fototerap�utica" (600-900 nm), (v) sensibilizaci�n de ox�geno molecular singlete y/o generaci�n de iones super�xidos de alto rendimiento cu�ntico; (vi) toxicidad reducida o inexistente en ausencia de luz, (vii) acumulaci�n selectiva y retenci�n prolongada en los tejidos tumorales, (viii) baja fotosensibilidad de la piel bajo administraci�n sist�mica, (ix) fotoblanqueo controlado, (x) f�cil metabolismo o excreci�n despu�s del tratamiento. El sensibilizador s�lo es el precursor de las especies citot�xicas, que incluye especialmente el ox�geno singlete y otras especies reactivas de ox�geno, tales como el i�n super�xido. El precursor inmediato del ox�geno singlete y, a menudo, de iones super�xidos es el estado triplete del sensibilizador. Por lo tanto, para obtener un alto rendimiento cu�ntico de ox�geno singlete, o estado triplete del sensibilizador debe tener por lo menos tres propiedades: (i) rendimiento cu�ntico cercano a la unidad, (ii) energ�a electr�nica de al menos 20 kJ/mol superior al ox�geno singlete (94 kJ/mol) y (iii) vida de larga duraci�n (centenares de microsegundos). Se puede aumentar la acumulaci�n y retenci�n en los tejidos tumorales utilizando vectores espec�ficos, pero una propiedad intr�nseca pertinente del sensibilizador para tales fines es la hidrofilia/lipofilia del sensibilizador, y la capacidad de adaptar dichas propiedades para lograr los objetivos deseados es una propiedad muy apreciada.

El l�mite inferior de la ventana fototerap�utica se determina por la presencia de prote�nas que contienen el grupo hemo, responsable en su mayor�a de la absorci�n de la luz en la gama del espectro visible en los tejidos. La penetraci�n de la luz en los tejidos disminuye r�pidamente por debajo de 550 nm. Sin embargo, existe un aumento significativo en la penetraci�n de 550 a 630 nm, que se duplica de nuevo a 700 nm. A esto, sigue un aumento del 10 % en la penetraci�n del tejido a medida que la longitud de onda se desplaza hacia 800 nm. El l�mite superior de

la ventana fototerap�utica se determina por la absorci�n de la radiaci�n de infrarrojos seg�n las necesidades de agua y de energ�a para la transferencia eficiente de energ�a al ox�geno. De hecho, la transferencia de energ�a triplete controlada por difusi�n desde el sensibilizador para el ox�geno molecular requiere que la energ�a triplete del sensibilizador sea al menos de 115 kJ/mol. Adem�s, el despliegue de energ�a singlete-triplete en compuestos macroc�clicos tetrapirr�licos es aprox. de 40 kJ/mol [4], que requiere que el sensibilizador tenga una energ�a singlete superior a 150 kJ/mol. Teniendo en cuenta que el desplazamiento de Stokes de estos sensibilizadores es generalmente peque�o, deber�an absorber la luz por debajo de 800 nm. La conclusi�n es que un sensibilizador ideal debe absorber intensamente la luz de longitud de onda cercana a 750 nm. La fuerte absorci�n de bacterioclorinas en esta longitud de onda las hace candidatas ideales para los sensibilizadores en PDT. Para las aplicaciones en las que la penetraci�n de la luz no es tan cr�tica, las clorinas tambi�n son candidatas adecuadas para su utilizaci�n en PDT.

Photofrin�, un derivado de hematoporfirina [5], es el fotosensibilizador m�s ampliamente utilizado y ha sido aprobado para el tratamiento de una variedad de tumores s�lidos [6]. El derivado de hematoporfirina (HpD) se prepara mezclando la hematoporfirina con �cido ac�tico glacial y �cido sulf�rico despu�s de la hidr�lisis y la precipitaci�n en condiciones �cidas. Este m�todo fue descrito parcialmente por Lipson et al. [7]. El HpD producido de esta manera es una mezcla compleja de porfirinas. Cuando el HpD se separa en sus dos fracciones principales por filtraci�n en gel utilizando Sephadex LH-20, la porci�n con mayor peso molecular, denominada Photofrin �, es un agente m�s eficaz en PDT [8]. La dosis de Photofrin� recomendada en humanos es de 1-2 mg/kg de peso corporal. Los principales componentes de Photofrin� son d�meros y olig�meros de elevado peso molecular, unidos entre s� por el tipo de �ter, �ster y posiblemente carbono-carbono [9].

Photofrin� tiene ciertas caracter�sticas deseables, incluyendo una buena eficiencia, solubilidad en agua, rendimiento razonable de ox�geno singlete y facilidad de fabricaci�n. No obstante, Photofrin� tambi�n tiene desventajas: (i) est� compuesto de una mezcla compleja de d�meros de porfirina y olig�meros de elevado peso molecular, unidos entre s� por el tipo de �ter, �ster y / o carbono-carbono; (ii) muestra la fototoxicidad en la piel del paciente en las cuatro a seis semanas despu�s de la administraci�n; (iii) debido a su absorci�n relativamente d�bil en la gama del rojo (630 nm) y una falta de penetraci�n de la luz a trav�s de los tejidos, el uso actual de Photofrin� en cl�nica en el �mbito de aplicaci�n de PDT est� limitado a la destrucci�n del tejido canceroso situado a menos de 4 mm de la fuente de luz utilizada en la terapia. As� pues, se necesitan sensibilizadores m�s eficaces, qu�micamente puros, menos fotot�xicos, que muestren una mejor ubicaci�n y que absorban la luz con mayor intensidad en los infrarrojos.

Es conocido en la materia que la reducci�n qu�mica de los anillos tetrapirr�licos, que corresponde a la transformaci�n de una porfirina en una clorina, provoca el desplazamiento de la banda de absorci�n de mayor longitud de onda hacia el rojo, al mismo tiempo que provoca el aumento de su coeficiente de absorci�n. Estas propiedades fueron exploradas en los fotosensibilizadores de segunda generaci�n para PDT y 5, 10, 15, 20tetraquis (3-hidroxifenil) clorina (m-THPC), comercializados como Foscan� presentado como uno de los m�s potentes de esta segunda generaci�n de fotosensibilizadores [10]. La reducci�n posterior del anillo pirr�lico opuesto, que corresponde a la transformaci�n de clorina en bacterioclorina provoca el desplazamiento de la banda de absorci�n en los infrarrojos y el aumento adicional de su coeficiente de absorci�n. Sin embargo, hasta hace poco, se cre�a que las bacterioclorinas eran compuestos muy inestables [10] y los esfuerzos de investigaci�n en los sensibilizadores para PDT se concentraban en las clorinas [11]. Posteriormente, se demostr� que las bacterioclorinas estables pueden realmente sintetizarse. [12] Este hecho no se ha valorizado completamente en la literatura cient�fica, donde se afirma que la s�ntesis de bacterioclorinas estables con este m�todo se limita a la preparaci�n de bacterioclorinas con funcionalidades inertes [13]. No obstante, se han preparado bacterioclorinas con otras caracter�sticas (v�ase PCT/EP2005/012212, WO/2006/053707).

El inter�s obvio en el uso de bacterioclorinas como sensibilizadores en PDT y los informes de que algunas bacterioclorinas de origen natural son fotosensibilizadores eficaces tanto in vitro como in vivo [14, 15] motivaron varios intentos para sintetizar las bacterioclorinas. Las bacterioclorinas sint�ticas fueron preparadas por derivatizaci�n de las porfirinas correspondientes por dihidroxilaci�n vecinal con tetr�xido de osmio [16], la ciclizaci�n intramolecular [17], las reacciones de Diels-Alder usando porfirinas como dien�filos [18] o las reacciones de Diels-Alder con vinilporfirinas, donde el dieno es una porfirina [19] mediante cicloadiciones 1, 3-dipolar [20] e igualmente por autocondensaci�n de derivados de desidrodipirrino acetal [21] derivados. Adem�s, existe un m�todo cl�sico que Whitlock ha desarrollado durante muchas d�cadas para la preparaci�n de bacterioclorinas mediante la reducci�n de posiciones pirr�licas 7, 8 a 17, 18 de la porfirina usando diimida [22]. Este fue el m�todo utilizado por Bonnet para sintetizar el Foscan� y 5, 10, 15, 20-tetraquis (3-hidrofenil) bacterioclorina [23]. Durante este tiempo, la investigaci�n intensiva realizada sobre la s�ntesis de derivados de bacterioclorina dio lugar a un cierto n�mero de patentes basadas en los m�todos citados anteriormente (v�ase, por ejemplo, US2007/7166719, US2003/6624187, US2003/6569846, US2002/6376483, US1999/5864035, US1998/583108; WO90/12573, WO94/00118, WO95/32206, WO96/13504, WO97/32885, US2006/194 960).

Algunas de las nuevas bacterioclorinas sintetizadas tienen poca toxicidad en ausencia de luz y elevada selectividad por los tumores, son parcialmente solubles en agua y poseen fuertes bandas de absorci�n en la gama de 700 nm a 800 nm. Sin embargo, siguen persistiendo algunos inconvenientes, concretamente: (i) la s�ntesis complicada y costosa que implica etapas de purificaci�n laboriosas, (ii) hidrosolubilidad limitada que, en el caso de la aplicaci�n sist�mica requiere la disoluci�n en disolventes org�nicos, lo que representa una carga qu�mica adicional para el organismo, o requiere la conexi�n a un veh�culo, aumentando el coste del tratamiento, (iii) inestabilidad qu�mica, especialmente en presencia de la luz, (iv) rendimientos cu�nticos de ox�geno singlete bajos o desconocidos. Un interesante representante de la tercera generaci�n de fotosensibilizantes es un complejo paladiobacteriofeoforb�deo conocido en la actualidad como Tookad� y aprobado para los estudios cl�nicos de fase III. Tookad � se deriva de la bacterioclorofila y, como la mayor�a de las bacterioclorinas de origen natural, es muy sensible al ox�geno, provocando su r�pida oxidaci�n en estado de clorina, que tiene un pico m�ximo de absorci�n en 660 nm o por debajo de este valor. Adem�s, si se utiliza un l�ser para excitar la bacterioclorina in vivo, la oxidaci�n podr� formar un nuevo crom�foro que absorbe el l�ser fuera de la ventana, reduciendo la eficiencia fotosensibilizante. La degradaci�n fotoqu�mica de esta familia de compuestos se midi� con iluminaci�n a 778 nm (13 mW) en TX-100/PBS, revelando que el 90 % del compuesto se pierde irreversiblemente en 5 min (4J), con la aparici�n simult�nea de la banda de clorina a 660 nm [3].

La PDT tambi�n fue probada ampliamente en el tratamiento de enfermedades de la piel, en particular, la queratosis act�nica, carcinoma de c�lulas escamosas, la enfermedad de Bowen (carcinoma de c�lulas escamosas intraepiteliales) y carcinoma de c�lulas basales, pero existe muy poca informaci�n disponible del efecto en los melanomas malignos [24]. La alta pigmentaci�n de los tejidos con melanoma limita la eficacia de la PDT cuando se utiliza luz visible, porque la melanina aten�a la penetraci�n de la luz en longitudes de onda inferiores a 700 nm en los tejidos. Tambi�n hay informes sobre el uso t�pico de la PDT en enfermedades no tumorales, tales como la psoriasis. Los primeros estudios emplearon el derivado de hematoporfirina [25] y la sal tetras�dica del mesosulfonato tetrafenilporfino [26] en formulaciones l�quidas con potenciadores de penetraci�n a trav�s de la piel. Sin embargo, generalmente, cuando se aplica t�picamente HpD u otras porfirinas en una formulaci�n (l�quida, gel, crema, emulsi�n, etc.) con un veh�culo destinado a mejorar su difusi�n a trav�s del tejido, las porfirinas tienden a ser retenidas a medida que el potenciador de permeabilidad se diluye en los fluidos normales del tejido. En tales casos, las porfirinas ya no se pueden difundir a trav�s del tejido (ni siquiera permanecer en soluci�n). En consecuencia, la aplicaci�n t�pica de porfirinas se asocia a menudo con la p�rdida de la especificidad para tejidos malignos, y los tejidos normales cercanos al lugar de aplicaci�n pueden desarrollar una fotosensibilizaci�n permanente como resultado de la concentraci�n localizada de porfirina.

Para superar estos problemas, se ha sugerido que, en vez de aplicar t�picamente una porfirina, ser�a ventajoso usar un agente que no fuera �l mismo un fotosensibilizador, pero que indujiese la s�ntesis de porfirinas end�genas in vivo, en particular, la protoporfirina IX (PpIX) [27]. Se sabe que el �cido 5-amino-4-oxopentanoico, tambi�n conocido como �cido 5 -aminolevul�nico (o ALA), es un precursor biol�gico de la protoporfirina - IX. Un exceso de ALA provoca una acumulaci�n biol�gica de PpIX, que es el verdadero agente fotosensibilizante. Por lo tanto, aplicando t�picamente el ALA en los tumores cut�neos, y despu�s de varias horas de exposici�n de estos tumores a la luz, se puede obtener un efecto fototerap�utico beneficioso (v�ase, por ejemplo WO91/01727). Teniendo en cuenta que el ALA penetra m�s f�cilmente en los basilomas y carcinomas de c�lulas escamosas que en la piel sana, y puesto que la bios�ntesis de PpIX es m�s eficiente en tumores cut�neos, se ha descubierto que la aplicaci�n t�pica de ALA aumenta la producci�n selectiva de PpIX en los tumores. Esta es la base de varias formulaciones dermatol�gicas de ALA o de algunos de sus derivados que fueron aprobados y son de uso cl�nico, sobre todo el Levulan � y el Metvix �.

No obstante, aunque el uso de ALA representa un avance significativo en la materia, la terapia fotodin�mica con ALA no es totalmente satisfactoria. Los pacientes suelen informar en repetidas ocasiones de haber experimentado dolores durante la PDT con el ALA [28]. ALA es un prof�rmaco y la eficiencia de la producci�n del principio activo var�a de acuerdo con la bios�ntesis del paciente. S�lo una cantidad muy peque�a de la PpIX puede ser biosintetizada por las c�lulas. Tiende a ser inestable en formulaciones farmac�uticas. No es capaz de penetrar en todos los tumores ni en otros tejidos con la suficiente eficacia, lo que impide el tratamiento de una serie de tumores u otras enfermedades. Su mejor longitud de onda fotoactivable es de 635 nm aprox., cuando se ha demostrado que s�lo entre el 1 a 10% de la luz incidente roja (600-700 nm) puede atravesar una capa de tejido humano de 1 cm de espesor. Por lo tanto, todav�a existe la necesidad de mejores agentes terap�uticos fotodin�micos para aplicaciones t�picas.

I.B. Resumen de la invenci�n

En un primer aspecto, la presente invenci�n indica un proceso de preparaci�n de un derivado de clorina o bacterioclorina que tiene la siguiente f�rmula:

F�rmula (I) en la que: representa un enlace carbono-carbono simple o doble;

5 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 son cada uno, hal�genos (F, Cl, Br) y �tomos de hidr�geno seleccionados independientemente, con la condici�n que simult�neamente X2, X4, X6, y X8 o que simult�neamente, X1, X3, X5 y X7 sean hal�genos, o que todos los X sean hal�genos;

R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 se seleccionan independientemente entre H, -OH y -SO2R, en el que cada R se selecciona independientemente entre- Cl, -OH, - amino�cido, - ORn , - NHRn y -NR2n -, donde Rn es un alquilo con 10 1 a 12 �tomos de carbono;

Y es un �tomo de fl�or o hidr�geno;

incluyendo la siguiente etapa:

(i) La reducci�n en estado s�lido de la correspondiente porfirina sustituida en derivado clorina o bacterioclorina

utilizando hidracidas en ausencia de disolventes y opcionalmente en ausencia de bases; en el que la 15 correspondiente porfirina sustituida tiene la f�rmula:

F�rmula (II).

Por lo tanto, el compuesto de f�rmula (I) puede ser un derivado de clorina con la siguiente f�rmula:

F�rmula (V). Alternativamente, el compuesto de f�rmula (I) puede ser un derivado de bacterioclorina con la siguiente f�rmula:

F�rmula (VI). De manera apropiada, X2, X4, X6, X8 se seleccionan cada uno independientemente de los hal�genos (F, Cl, Br). De manera apropiada, R5, R6, R7, R8 son H. De manera apropiada, Y es H.

10 De manera apropiada, R1, R2, R3, R4, son -SO2R, en el que cada R se selecciona independientemente entre- Cl,

-: OH, - amino�cido, - ORn, - NHRn y - NR2n, en el que Rn es un radical alquilo con 1 a 12 �tomos de carbono. En otro aspecto, X2, X4, X6, X8 se seleccionan cada uno independientemente de los hal�genos (F, Cl, Br); R5, R6, R7, R8 son H; Y es H, y R1, R2, R3, R4, son -SO2R, en el que cada R se selecciona independientemente entre -Cl, -OH, - amino�cido, -

ORn, - NHRn y - NR2n, en el que Rn es un radical alquilo con 1 a 12 �tomos de carbono. En otro aspecto, la presente invenci�n indica un proceso de preparaci�n de un derivado de clorina o de bacterioclorina que tiene la siguiente f�rmula:

F�rmula (III) en la que:

10 representa un enlace carbono-carbono simple o doble; X2 se seleccionan a partir de hal�genos (F, Cl, Br), X1 se seleccionan entre hidr�geno o hal�genos (F, Cl, Br) y

R' es - SO2R, en el que cada R se selecciona independientemente entre -Cl, -OH, -amino�cido, -ORn, -NHRn y -

NR2n, en el que Rn es un radical alquilo que tiene de 1 a 12 �tomos de carbono,

incluyendo el paso siguiente:

15 (i) La reducci�n en estado s�lido de la correspondiente porfirina substituida en derivado de clorina o de bacteriocolorina usando hidracidas en ausencia de disolventes y, opcionalmente, en ausencia de bases, en el que la correspondiente porfirina sustituida tiene la f�rmula:

F�rmula (IV).

Por lo tanto, el compuesto de f�rmula (III) puede ser un derivado de clorina que posee la f�rmula:

F�rmula (VII). Alternativamente, el compuesto de f�rmula (III) puede ser un derivado de bacterioclorina con la f�rmula:

F�rmula (VIII).

En otro aspecto, R' es -SO2R, en el que R es -Cl para la correspondiente porfirina sustituida de f�rmula (IV), y el proceso incluye adem�s la siguiente:

(ii) la uni�n del derivado de clorina o de bacterioclorina con una amina H-NHRn o H-NR2n, un amino�cido o un 10 alcohol H–ORn, en el que Rn es un radical alquilo que tiene de 1 a 12 �tomos de carbono;

para proporcionar un derivado de clorina o de bacterioclorina en el que R' es -SO2R, en el que R es un amino�cido,

-: ORn, - NHRn - o NR2n, en los que Rn es un radical alquilo que tienen de 1 a 12 �tomos de carbono.

En otro aspecto, la presente invenci�n describe una composici�n farmac�utica que comprende:

(a): un derivado de clorina o de bacterioclorina con la f�rmula:

F�rmula (III)

: o una composici�n del derivado aceptable desde el punto de vista farmac�utico, en la que :

representa un enlace carbono-carbono simple o doble ;

X2 se selecciona a partir de hal�genos (F, Cl, Br), X1 se selecciona entre hidr�geno o hal�geno (F, Cl, Br) y R' son -SO2R;

R se selecciona cada uno independientemente a partir de -Cl, -OH, -amino�cido, -ORn, -NHRn y -NR2n, en el que Rn es un radical alquilo con 1 a 12 �tomos de carbono,

10 en el que el derivado de clorina o de bacterioclorina es eficaz en un tratamiento de terapia fotodin�mica para mejorar los s�ntomas de un trastorno hiperproliferativo, y

(b) un potenciador de la penetraci�n de superficie.

Adem�s, la presente invenci�n describe el uso de un derivado de clorina o de bacterioclorina, o de una composici�n del derivado aceptable desde el punto de vista farmac�utico, en la detecci�n de tejido 15 hiperproliferativo;

en el que el derivado de clorina o de bacterioclorina tiene la f�rmula:

F�rmula (III) En la que:

representa un enlace carbono-carbono simple o doble;

X2 se selecciona a partir de hal�genos (F, Cl, Br), X1 se seleccionan entre hidr�geno o hal�geno (F, Cl, Br) y R' son - SO2R;

5 R se selecciona cada uno independientemente a partir de -Cl, -OH, -amino�cido, -ORn, -NHRn y -NR2n, donde Rn es alquilo de 1 a 12 �tomos de carbono,

Adem�s, la presente invenci�n describe un m�todo para detectar la presencia de un tejido hiperproliferativo en un paciente e incluye:

(i) administrar al paciente una cantidad suficiente para diagnosticar un derivado de clorina o de bacterioclorina y la 10 cantidad de la siguiente f�rmula:

F�rmula (III)

En el que:

representa un enlace carbono-carbono simple o doble; 15 X2 se seleccionan a partir de hal�genos (F, Cl, Br ), X1 se seleccionan entre hidr�geno o hal�genos (F, Cl, Br ) y R' son -SO2R ;

R se seleccionan cada uno independientemente como -Cl, -OH, -amino�cido, -ORn, -NHRn y - NR2n, donde Rn son radicales alquilo de 1 a 12 �tomos de carbono,

o una composici�n de la derivada aceptable desde el punto vista farmac�utico que se asocia preferentemente con el 20 objetivo,

(ii) esperar un tiempo suficiente para que el derivado de clorina o de bacterioclorina se una al objetivo y para cualquier derivado de clorina o de bacterioclorina que no se une preferentemente al tejido objetivo y deba ser eliminado del tejido no objetivo, y

(iii) la visualizaci�n del compuesto en el paciente.

25 La etapa de visualizaci�n puede llevarse a cabo mediante la generaci�n de una imagen de resonancia magn�tica (MRI) de al menos una parte del cuerpo del paciente.

Alternativamente, la visualizaci�n se puede realizar, exponiendo el compuesto a la luz suficiente para causar su poder de fluorescencia.

Adem�s, la presente invenci�n describe una composici�n aceptable desde el punto de vista farmac�utico para su uso en el tratamiento de un c�ncer de piel o trastornos de la piel, incluyendo, queratosis act�nica, carcinoma de c�lulas escamosas, la enfermedad de Bowen, carcinoma de c�lulas basales, la psoriasis y el acn� vulgar y ros�cea;

en el que la composici�n comprende:

(i) un derivado de clorina o de bacterioclorina con la f�rmula:

F�rmula (III) En el que:

10 representa un enlace carbono-carbono simple o doble;

X2 se seleccionan a partir de hal�genos (F, Cl, Br), X1 se seleccionan entre hidr�geno o hal�genos (F, Cl, Br) y R' son - SO2R;

R se seleccionan cada uno independientemente a partir de -Cl, -OH, -amino�cido, -ORn, -NHRn y -NR2n, donde Rn son radicales alquilo de 1 a 12 �tomos de carbono;

15 y

(ii) un veh�culo aceptable desde el punto de vista farmac�utico para suministro transd�rmico o intrad�rmico de este compuesto, en el que el veh�culo incluye un potenciador de penetraci�n de la superficie que permeabiliza temporalmente la piel y facilita la penetraci�n del compuesto a trav�s de las diversas capas de la piel;

en el que

20 (a) la composici�n se administra a un paciente;

(b): se espera el tiempo suficiente para que el derivado de clorina o de bacterioclorina se acumule preferentemente en las proximidades del objetivo de tratamiento dermatol�gico, y

(c): el objetivo es irradiado para obtener la respuesta deseada en el c�ncer de piel o en los trastornos cut�neos.

Proceso para la preparaci�n de derivados

25 De manera apropiada, la hidrazina y el p-tolueno sulfonil hidrazida, de 4-clorobenzeno sulf�nico hidrazida, de 4, 4’oxi bis (benceno sulfonil) hidrazida, de benceno sulfonil hidrazida, de 4 – metoxibenceno sulfonil hidrazida o de hidrazida benzoico.

Las reacciones en estado s�lido requieren el uso de temperaturas superiores al punto de fusi�n de uno de los reactivos, de modo que el (los) otro(s) reactivo(s) se encuentre(n) parcialmente disuelto(s) o dispersado(s) en el reactivo fundido. En el caso de reacciones en estado s�lido entre derivados de porfirina e hidrazidas, la reacci�n en estado s�lido se efect�a convenientemente por encima del punto de fusi�n de la hidrazida.

Pertinentemente, la etapa de reducci�n se realiza a una temperatura de al menos 70 �C. Pertinentemente, la etapa de reducci�n se realiza a una temperatura de al menos 100 �C. En otro aspecto, la etapa de reducci�n se lleva a cabo a temperaturas entre 70 y 200 �C. Pertinentemente, la etapa de reducci�n se lleva a cabo durante al menos 5 minutos.

Pertinentemente, la etapa de reducci�n se realiza al vac�o o en atm�sfera inerte.

Composiciones farmac�uticas

Pertinentemente, la composici�n farmac�utica contiene al menos 0, 01% en peso del derivado de clorina o de bacterioclorina, o de una sal aceptable desde el punto de vista farmac�utico, en base al peso total de la composici�n. Pertinentemente, la composici�n farmac�utica contiene de 0, 01% a 30% en peso de del derivado de clorina o de bacterioclorina, o de una sal del derivado aceptable desde el punto de vista farmac�utico, en base al peso total de la composici�n. La composici�n farmac�utica apropiada contiene de 0, 01 % a 10 % en peso de derivado de clorina o de bacterioclorina, o de una sal aceptable desde el punto de vista farmac�utico, en base al peso total de la composici�n. La composici�n farmac�utica apropiada contiene entre 0, 1 % y 1 % en peso del derivado de clorina o de bacterioclorina, o de una sal aceptable desde el punto de vista farmac�utico, en base al peso total de la composici�n.

Cuando un potenciador de penetraci�n en superficie est� presente en una composici�n farmac�utica, pertinentemente la composici�n contiene de 0, 05 a 10 % en peso del potenciador de la penetraci�n de superficie, en base al peso total de la composici�n. Pertinentemente, la composici�n contiene de 0, 1 a 10 % en peso del potenciador de la penetraci�n de la superficie. Pertinentemente, este potenciador de la penetraci�n de la superficie puede seleccionarse entre dimetilsulf�xido y otros dialquilsulf�xidos, N-metilformamida, dimetilformamida, dimetilacetamida, glicoles, varios derivados de la pirrolidona, y diversas azacicloalcan-2-onas sustituidas en la posici�n 1.

Pertinentemente, los glicoles se pueden seleccionar entre polietilenoglicol, polietilenoglicol 425, trimetilenoglicol y propolenoglicol monolaureato.

Pertinentemente, los derivados de la pirrolidona se pueden seleccionar a partir de entre N-dodecil- pirrolidina-3, 5diona, N-dodecil- pirrolidina-2-tiona, N-dodecil-2-pirrolidona, N-(2-hidroxietil)-2-pirrolidona, N-ciclohexil-2pirrolidona, 1-butil-3-dodecil-2-pirrolidona, 1, 5-dimetil-2-pirrolidona, 1-etil-2-pirrolidona, 1-hexil-4-metiloxicarbonil2-pirrolidona, 1-hexil-2-pirrolidona, 1-(2-hidroxietil) pirrolidona, 3-hidroxi-N-metil-2-pirrolidinona, 1-lauril-4metiloxicarbonil-2-pirrolidona y N-metil-2-pirrolidona.

Pertinentemente, las azacicloalcan-2-onas sustituidas en posici�n 1, incluyendo 1-dodecilazacicloheptan -2-ona, en lo sucesivo, Azone �, se dan a conocer en las patentes US US. Pat. N� 4.562.075, 4.405.616, 4.326.893 y

3.989.816.

Detecci�n de tejido hiperproliferativo

Cuando los derivados de clorina y de bacterioclorina, o sus sales aceptables desde el punto de vista farmac�utico, se utilizan para detectar tejidos hiperproliferativos, el tejido hiperproliferativo puede ser un tejido endotelial vascular, tejido neovascularizado, tejido neovascularizado localizado en el ojo, pared vascular anormal de un tumor, tumor s�lido, tumor de cabeza, tumor de cuello, tumor en un ojo, tumores del tracto gastrointestinal, tumor del h�gado, tumor de mama, tumor de pr�stata, tumor de pulm�n, tumor no s�lido, c�lulas malignas de un tejido hematopoy�tico y tejido linf�tico, lesiones del sistema vascular, una enfermedad de la m�dula �sea, y las c�lulas enfermas donde la enfermedad es autoinmune o de origen inflamatoria.

Tratamiento de enfermedades hiperproliferativas

En otro aspecto, la presente invenci�n describe la utilizaci�n de un derivado de clorina o de bacterioclorina, o de una sal del derivado aceptable desde el punto de vista farmac�utico, en la fabricaci�n de un medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas.

Cuando los derivados de clorina o de bacterioclorina, o derivados de sales aceptables desde el punto de vista farmac�utico, se utilizan en el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas, pertinentemente los trastornos hiperproliferativos pueden ser c�nceres o carcinomas, mielomas, psoriasis y degeneraci�n macular. Los ejemplos pertinentes incluyen c�ncer g�strico, c�ncer ent�rico, c�ncer de pulm�n, c�ncer de mama, c�ncer de �tero, c�ncer de es�fago, c�ncer de ovario, c�ncer de p�ncreas, c�ncer far�ngeo, sarcomas, c�ncer hep�tico, c�ncer de vejiga, c�ncer de la mand�bula superior, c�ncer de conducto biliar, c�ncer de cabeza y cuello, c�ncer de lengua, tumor cerebral, c�ncer de piel, tumor maligno de la gl�ndula tiroides, c�ncer de pr�stata, c�ncer colorrectal, c�ncer de la gl�ndula par�tida, enfermedad de Hodgkin, mieloma m�ltiple, c�ncer renal, leucemia y linfocitoma maligno.

Tales tratamientos incluyen pertinentemente la irradiaci�n del derivado de clorina o de bacterioclorina, o de su derivado de composici�n aceptable desde el punto de vista farmac�utico, con luz de longitud de onda correspondiente a las bandas de absorci�n de clorina o de bacterioclorina. La longitud de onda apropiada de la luz es de 600 a 800 nm. Pertinentemente, cuando se utilizan clorinas, la luz debe tener una longitud de onda entre 630 y 690 nm. Pertinentemente cuando se utilizan bacterioclorinas, la luz debe tener una longitud de onda entre 720 nm y 780 nm.

Pertinente, la dosis adecuada de la luz es de 1 a 250 J/cm2. En algunos casos, la dosis apropiada de la luz es inferior a 50 J/cm2, inferior a 20 J/cm2, o inferior a 10 J/cm2.

Pertinentemente, la dosis apropiada del derivado de clorina o de bacterioclorina, o de sus sales aceptables desde el punto de vista farmac�utico, es de 0, 01 mg a 200 mg por kilogramo de peso corporal al d�a. Pertinentemente, la dosis adecuada es de 0, 01 mg a 100 mg por kilogramo de peso corporal al d�a.

La presente invenci�n se llev� a cabo con el conocimiento del estado de la t�cnica descrito anteriormente. La s�ntesis descrita en la patente WO 2006/053 707 ( PCT/EP2005/012212 ) incluye s�lo tres pasos semicuantitativos:

(i): funcionalizaci�n de tetraquis-fenilporfirinas halogenadas a trav�s de la clorosulfonaci�n del anillo fen�lico,

(ii): s�ntesis de compuestos anfif�licos a trav�s de la reacci�n con el grupo clorosulf�nico con agentes nucle�filos, agua, concretamente, aminas, y alcoholes; (iii) reducci�n del compuesto macroc�clico tetrapirr�lico con derivados de hidrazida en presencia de bases no nucle�filas inorg�nicas u org�nicas. Sin embargo, como se muestra en la Figura 2 de la patente WO 2006/053707, la s�ntesis de las bacterioclorinas sulfonadas y halogenadas por este m�todo est� asociada a la contaminaci�n por la clorina an�loga, y la purificaci�n requiere una separaci�n laboriosa. El objeto de la presente invenci�n consiste en proporcionar una s�ntesis econ�mica, respetando el medio ambiente y a gran escala de tetraquis fenilclorinas y tetraquis fenilbacterioclorinas puras, estables y funcionalizados con grupos extractores de electrones en las posiciones orto de los anillos fen�licos

Los bacterioclorinas tienen caracter�sticas espec�ficas que los convierten en los fotosensibilizadores preferidos en PDT:

1) Los �tomos de hal�geno presentes en las posiciones orto de los grupos fenilo ejercen tres funciones. En primer lugar, producen un "efecto de �tomo pesado" controlado, lo que aumenta el rendimiento del estado triplete del sensibilizador sin afectar la vida �til del triplete y su capacidad para transferir de manera eficiente la energ�a electr�nica al ox�geno molecular [29]. En segundo lugar, estabilizan el estado reducido de los compuestos macroc�clicos tetrapirr�licos, ya sea por los efectos electr�nicos y est�reo. En tercer lugar, incrementan la constante de velocidad de transferencia de energ�a para el ox�geno molecular mediante interacciones de transferencia de carga, lo que conduce a elevados rendimientos de ox�geno singlete, iones super�xido y otras especies reactivas del ox�geno.

2) El �cido sulf�nico presente en las posiciones meta de los grupos fenilo sirve para dos funciones. Primero, permite modificar de manera deseada la hidrofilia/lipofilia de los sensibilizadores, ya que los sensibilizadores muy hidr�fobos parecen ser menos fotot�xicos, probablemente debido a la baja solubilidad y su peque�a capacidad de reubicar la membrana plasm�tica en otros compartimentos intracelulares, mientras que los tintes muy hidr�filos pueden estar ubicados principalmente en el estroma tumoral y mostrar una eficacia reducida en PDT [30]. En segundo lugar, el grupo sulf�nico, especialmente vinculado a los sustituyentes voluminosos o largos, promueve la protecci�n est�rica adicional contra la oxidaci�n del anillo bacterioclorina de los colorantes.

3) La presencia simult�nea de �tomos de hal�geno en las posiciones orto y del grupo sulf�nico en las posiciones meta de los grupos fenilo ejerce una funci�n adicional. La modelizaci�n molecular y los datos experimentales indican que cuando no se limita la rotaci�n alrededor del enlace sencillo en la posici�n meso en las 5, 10, 15, 20

tetrafenilporfirinas con anillos de fenilo asim�tricos, se observan is�meros geom�tricos (conocidos como atropis�meros) debido a la posici�n diferente de los sustituyentes en orto y/o meta con respecto al plano de la porfirina [31]. Los atropis�meros tienen polaridades significativamente diferentes y coeficientes de absorci�n de la banda de absorci�n a la longitud de onda m�s larga que pueden diferir en casi un orden de magnitud. Particularmente, el is�mero D4 con los cuatro sustituyentes sulfamoil del mismo lado del plano de la porfirina, tiene el coeficiente de absorci�n m�s alto y es el atropis�mero m�s anfif�lico.

El uso generalizado de clorinas y bacterioclorinas sulfonadas en PDT requiere una s�ntesis econ�mica y compatible con el medio ambiente que se puede realizar a nivel industrial. Uno de los principales objetivos de la presente invenci�n consiste en proporcionar un nuevo m�todo de preparaci�n de tales compuestos, basado �nicamente en una porfirina precursora y una hidrazida, y cuando esta �ltima se a�ade en forma s�lida y se calienta por encima de la temperatura de fusi�n en un reactor cerrado herm�ticamente con ausencia de ox�geno y la base, se obtiene el producto deseado despu�s de un cierto tiempo.

La presente invenci�n describe m�todos de PDT por medio de la administraci�n t�pica de una determinada clorina

o bacterioclorina sulfonada, en un veh�culo adecuado. Los veh�culos para administraci�n t�pica de los fotosensibilizadores pueden ser de varias formas, incluyendo soluciones l�quidas, geles, cremas, emulsiones, pomadas, etc. Normalmente, la formulaci�n de tales veh�culos incluye por lo menos un potenciador de la penetraci�n de superficie. Contrariamente a la sabidur�a convencional en este campo, que afirma que los f�rmacos con pesos moleculares superiores a 500 Dalton no atraviesan bien la piel [32], proporcionamos formulaciones para el suministro intrad�rmico eficiente de las citadas clorinas o bacterioclorinas sulfonadas para enfermedades cut�neas, en las que las mol�culas tienen pesos moleculares ligeramente superiores a 1 kD.

Esta invenci�n describe compuestos para el tratamiento y la detecci�n de tejidos hiperproliferativos tales como tumores, por medio de m�todos fotodin�micos. Los compuestos tambi�n son �tiles en el tratamiento de trastornos dermatol�gicos como la psoriasis y el acn� vulgar y ros�cea; trastornos ginecol�gicos tales como la hemorragia uterina disfuncional; trastornos urol�gicos tales como el virus de condiloma, trastornos cardiovasculares tales como la reestenosis y las placas ateroscler�ticas; destrucci�n fotodin�mica de bacterias o virus, depilaci�n y cosm�tica, inhibici�n de la respuesta inmunol�gica despu�s de un trasplante de �rganos o tejidos.

Por �ltimo, la presente invenci�n tambi�n tiene como objetivo describir m�todos para el diagn�stico de tejidos hiperproliferativos usando clorinas o bacterioclorinas sulfonadas y halogenadas. A condici�n de que estos compuestos se acumulen en estos tejidos, la propiedad adicional que se requiere para fines de diagn�stico es la detecci�n inequ�voca de cantidades muy peque�as de estos compuestos. Estos compuestos tienen bandas de absorci�n muy distintas en las gamas de rojo y de infrarrojos, para que los tejidos sean m�s transparentes. La excitaci�n selectiva de estos compuestos causa una fluorescencia caracter�stica en longitudes de onda donde las mol�culas biol�gicas no emiten. La detecci�n de la fluorescencia se puede llevar a cabo con equipos de alta sensibilidad, y cantidades subnanomolares de clorinas sulfonadas o bacterioclorinas halogenadas que pueden medirse en los medios biol�gicos. La fuente de irradiaci�n para fotodiagn�stico y la fototerapia no est� restringida, pero se prefiere un rayo l�ser, ya que puede aplicar selectivamente intensos rayos de luz en la gama de longitudes de onda deseada. Es necesario que los rayos de luz tengan suficiente intensidad para que los compuestos emitan una fluorescencia apropiada para el diagn�stico y la terapia, ocasionando la muerte celular. Adem�s, cuando se utilizan clorinas o bacterioclorinas sulfonadas y fluoradas, se puede detectar la acumulaci�n de estos compuestos en peque�as zonas del cuerpo y vigilar sus metabolitos formados durante la eliminaci�n por el organismo mediante im�genes de resonancia magn�tica (MRI) de fl�or.

II.: DESCRIPCI�N DETALLADA

II.: A. Definiciones

En el contexto de esta invenci�n, "trastornos hiperproliferativos" se refiere a trastornos cuya patolog�a implica la proliferaci�n celular excesiva com�n causada por un crecimiento celular alterado o anormal e incluye la angiog�nesis descontrolada. Los ejemplos de trastornos hiperproliferativos incluyen, pero no est�n limitados a, c�nceres y carcinomas, mielomas, psoriasis y degeneraci�n macular.

En el contexto de esta invenci�n, "tejido hiperproliferativo" se refiere a un tejido que crece de manera incontrolada, e incluye tumores, y crecimiento incontrolado de los vasos, tales como el crecimiento de los vasos sangu�neos observados en la degeneraci�n macular relacionada con la edad.

En el �mbito de esta patente, “tumor" denota un neoplasma e incluye tanto los tumores benignos como malignos. Este t�rmino incluye especialmente los tumores malignos que pueden ser s�lidos o no s�lidos (por ejemplo, la

leucemia). Ejemplos de tumores son el c�ncer g�strico, c�ncer ent�rico, c�ncer de pulm�n, c�ncer de mama, c�ncer de �tero, c�ncer de es�fago, c�ncer de ovario, c�ncer de p�ncreas, c�ncer far�ngeo, sarcomas, c�ncer hep�tico, c�ncer de la vejiga, c�ncer de la mand�bula superior, c�ncer del conducto biliar, c�ncer de la cabeza y cuello, c�ncer de lengua, tumor cerebral, c�ncer de piel, tumor maligno de la tiroides, c�ncer de pr�stata, c�ncer colorrectal, c�ncer de la gl�ndula par�tida, la enfermedad de Hodgkin, mieloma m�ltiple, c�ncer renal, leucemia y linfocitoma maligno.

En el contexto de esta invenci�n, "agente infeccioso" denota la invasi�n de microbios o par�sitos. En el contexto utilizado en la presente memoria, "microbio" se refiere a virus, bacterias, rickettsias, micoplasmas, protozoos, hongos y otros microorganismos, y "parasitaria" se refiere a invertebrados multicelulares generalmente microsc�picos o muy peque�os, o sus huevos o sus formas j�venes, que son susceptibles a la eliminaci�n mediante la inducci�n de anticuerpos o destrucci�n por lisis o fagocitosis.

Bajo esta patente, un "agente farmac�utico" o "medicamento" se refiere a un compuesto qu�mico o composici�n capaz de inducir un efecto terap�utico o profil�ctico deseado cuando se administra a un paciente de la manera apropiada. El t�rmino incluye, pero no se limita a, fotosensibilizadores que absorben la luz y lo utilizan para actuar como un medicamento o para activar otros compuestos qu�micos que, posteriormente act�an como f�rmacos.

En el contexto de esta invenci�n, "derivado de composici�n aceptable desde el punto de vista farmac�utico" se refiere a composiciones en las que los fotosensibilizadores est�n vinculados a los grupos biol�gicamente activos, o en otras palabras, a cualquier grupo que promueva selectivamente la uni�n, la acumulaci�n o la eliminaci�n en un determinado medio biol�gico. Los ejemplos cl�sicos incluyen los sustituyentes derivados de az�cares, derivados de amino�cidos, y oligonucle�tidos o enlaces espec�ficos para receptores (hormonas esteroides, factores de crecimiento, neurotransmisores y anticuerpos). Tambi�n incluyen las sales de los fotosensibilizadores.

En el �mbito de esta invenci�n, "veh�culo aceptable desde el punto de vista farmac�utico" incluye todos y cualesquiera de los disolventes, medios de dispersi�n, excipientes para la formulaci�n de pastillas, p�ldoras, c�psulas, cremas, soluciones, suspensiones o emulsiones. Las t�cnicas implicadas en la formulaci�n de estas composiciones farmac�uticas son bien conocidas.

En el contexto de esta invenci�n, "potenciador de penetraci�n de superficie" se refiere a un compuesto o a una composici�n qu�mica capaz de aumentar o acelerar el suministro del f�rmaco a trav�s de una barrera, tal como la piel y otros tejidos, incluyendo el dimetilsulf�xido y otros dialquilsulf�xidos, la dimetilformamida, la dimetilacetamida, los glicoles, varios derivados de la pirrolidona, el Azone �, o cualquiera de los otros agentes que facilitan la penetraci�n en la piel descritos en la literatura, o mezclas de los mismos.

En el contexto de esta invenci�n, "irradiaci�n" designa la exposici�n de un paciente a todas las frecuencias del espectro electromagn�tico. Preferiblemente, la longitud de onda seleccionada para la irradiaci�n es igual a la (a las) longitud (es) de onda en la que el f�rmaco absorbe la luz.

En el contexto de esta patente "Luzitina" se refiere a cualquier tetraquis-fenilclorina o tetraquis- fenilbacterioclorina sulfonada que tiene grupos extractores de electrodos en las posiciones orto de los grupos fenilo, y las siguientes siglas se refieren a compuestos qu�micos espec�ficos que son ejemplos no limitativos de esta amplia gama de mol�culas:

-: Luzitina-Cl-c es 5, 10, 15, 20 -tetraquis (2-cloro-5-sulfonilfenil) de clorina,

-: Luzitina-FMet-c es 5, 10, 15, 20 -tetraquis (2-fluoro-5-N-metilsulfamoilfenil) clorina,

-: Luzitina -F es 5, 10, 15, 20 –tetraquis (2-fluoro-5-sulfonilfenil) bacterioclorina,

-: Luzitina –Cl es 5, 10, 15, 20 -tetraquis (2-cloro-5-sulfonilfenil) bacterioclorina,

-: Luzitina -Cl2 es 5, 10, 15, 20 -tetraquis (2, 6-dicloro-3-sulfonilfenil) bacterioclorina,

-: Luzitina-FMet es 5, 10, 15, 20 –tetraquis (2-fluoro-5-N-metilsulfamoilfenil) bacterioclorina,

-: Luzitina-F2Met es 5, 10, 15, 20-tetraquis (2, 6-fluoro-3-N-metilsulfamoilfenil) bacterioclorina,

-: Luzitina Cl2Et es 5, 10, 15, 20 -tetraquis-(2, 6-dicloro-3-N-etilsulfamoilfenil) bacterioclorina,

-: Luzitina- Cl2Hep es 5, 10, 15, 20 -tetraquis-(2, 6-dicloro-3-N-heptilsulfamoilfenil) bacterioclorina,

-: Luzitina FMet 2 es 5, 10, 15, 20-tetraquis-(2-fluoro-5-N, N-dimetisulfamoilfenil) bacterioclorina,

Tambi�n se usan aqu� los siguientes acr�nimos:

-: Cl2PhB, que se refiere a 5, 10, 15, 20-tetraquis (2, 6-diclorofenil) bacterioclorina

-: BMPO, que se refiere al 5-terc-butoxicarbonil-5-metil-1-pirrolino-N-�xido

-: DMPO, que se refiere al 5-dimetil-1-pirrolino-N-�xido

-: DMSO, que se refiere al dimetilsulf�xido

II. B. Compuestos precursores

Si los sintetizados 5, 10, 15, 20 –tetraquis (hal�geno-fenil) porfirinas y las 5, 10, 15, 20-tetraquis (2cianofenil)porfirinas, las 5, 10, 15, 20-tetraquis (2-trifluorometilfenil)porfirinas, las 5, 10, 15, 20-tetraquis (2-nitrofenil ) porfirinas y las 5, 10, 15, 20 tetraquis (2-carboximetilfenil) porfirinas por el m�todo de nitrobenceno [33], mezclando el pirrol con los fenilalde�dos halogenados deseados en una mezcla de �cido ac�tico/nitrobenceno a 120 �C. Una vez enfriada, la porfirina en su forma pura cristaliza directamente desde el medio de reacci�n. Todos los datos de caracterizaci�n (obtenidos por RMN, FAB y microan�lisis) concuerdan totalmente con las porfirinas descritas anteriormente.

La clorosulfonaci�n de las dichas porfirinas se ha realizado seg�n un procedimiento desarrollado anteriormente [34, 35]. La porfirina requerida (200 mg) y el �cido clorosulf�nico (10 ml, 150 mmoles) se agitaron a temperaturas comprendidas entre 50 y 250 �C durante 1 a 3 horas. Despu�s de este tiempo, se a�adi� el diclorometano (200 ml) a la soluci�n. Se realiz� la extracci�n continua de agua con agitaci�n hasta la neutralizaci�n. A continuaci�n, se lav� la soluci�n de diclorometano con bicarbonato de sodio y se sec� con Na2SO4 anhidro. Despu�s de la purificaci�n por cromatograf�a en columna en gel de s�lice usando diclorometano como eluyente y posterior evaporaci�n del disolvente, se obtuvieron las porfirinas clorosulfonadas deseadas en forma de cristales de color p�rpura.

La hidr�lisis de las porfirinas clorosulfonadas anteriormente mencionadas se hizo mediante la suspensi�n de 100 mg del compuesto deseado en agua destilada (120 ml) y llevar a cabo el reflujo de la mezcla durante 12 h. Las soluciones resultantes se concentraron en un evaporador rotatorio y el s�lido obtenido se sec� a 120 �C. Los derivados de �cido sulf�nico de porfirina se obtuvieron con un rendimiento cuantitativo. La caracterizaci�n de los mismos por RMN, FAB y micro-an�lisis se corresponden bien con datos de las publicaciones [34, 35].

II. C. Equipamientos

Los espectros de absorci�n se registraron en un espectrofot�metro Shimadzu UV-2100 o conun bioespectrofot�metro Carry 50 (Varian, Mulgrave, EEUU). Los espectros de fluorescencia fueron medidos con un espectrofot�metro Spex Fluorolog 3, con correcci�n de sistema de dependencia relativa a la longitud de onda (fotomultiplicador RCA C31034) o con un espectrofluor�metro PerkinElmer LS 50. Los espectros de absorci�n transitoria fueron medidos con un espectr�metro cin�tico de fotolisis por destello de l�ser modelo Applied Photophysics LKS 60 con una resoluci�n de 60 nanosegundos, utilizando para la excitaci�n el tercer arm�nico de un l�ser Nd/YAG de Spectra Physics Quanta-Ray GCR 130-01, un fotomultiplicador Hamamatsu 1P28 y un osciloscopio Hewlett -Packard Infinium (1 GS/s). Las mediciones que utilizan fot�lisis mediante destello fueron ejecutadas en presencia de aire y en soluciones saturadas de arg�n. Para los ensayos de calorimetr�a fotoac�stica se utiliz� el mismo l�ser Nd/YAG, una c�lula fotoac�stica frontal de fabricaci�n propia con un transductor de Panametrics de 2, 25 MHz (modelo 5676) y un osciloscopio Tektronix DSA 601 [36]. La fosforescencia de ox�geno singlete a temperatura ambiente se midi� a 1270 nm con un fotomultiplicador Hamamatsu R5509-42, enfriado a 193 K en una c�mara para nitr�geno l�quido (Products for Research modelo PC176TSCE005) tras la excitaci�n por l�ser a 355 nm de soluciones aireadas utilizando una adaptaci�n del espectr�metro de Applied Photophysics [37]. La emisi�n de ox�geno singlete a 1270 nm tambi�n fue monitorizada con un detector de germanio enfriado con nitr�geno l�quido (North Coast) acoplado a un osciloscopio Tektronix TDS (520B), despu�s de la excitaci�n de la muestra con pulsos l�ser de 5 ns utilizando el tercer arm�nico (355 nm) generado por un l�ser Nd: YAG con el sistema Q-switched (Continuum Surelite II).

Los an�lisis elementales fueron realizados con un analizador elemental Fisons Instruments EA 1108 CHNS-O. Los puntos de fusi�n se midieron en un aparato de punto de medici�n de puntos de fusi�n en electrot�rmica capilar. Los

espectros de 1H-RMN, 19F-RMN y los espectros de 13C-RMN se registraron en un espectr�metro de RMN Bruker AMX-300 MHz. Las atribuciones de las se�ales de 1H se efectuaron de modo experimental con COSY 2D y NOESY, y las atribuciones de las se�ales se hicieron experimentalmente con HSQC 2D y HMBC. Los datos MALDI-TOFMS se obtuvieron utilizando un Applied Biosystems Voyager DE-STR (Framingham, MA, EEUU) equipado con un l�ser de nitr�geno (y = 337 nm).

Los espectros de resonancia paramagn�tica electr�nica (RPE) de las especies con, al menos un electr�n no apareado se obtuvieron usando un espectr�metro Bruker ESP 300 (IBM Instruments Inc.). Los ajustes t�picos de este equipamiento fueron los siguientes: potencia de microondas 10 mW, amplitud modulada 0, 8G, la modulaci�n de amplitud 0, 8 g, alcance de exploraci�n 60, 0 G. Los espectros de RPE fueron registrados bajo irradiaci�n in situ con un l�ser de diodo de Hamamatsu. Los siguientes ajustes fueron utilizados para registrar los espectros: alta potencia (4 mW), baja amplitud modulada (0, 2 G) y alcance de exploraci�n estrecha (60 G), registr�ndose 20 exploraciones para cada espectro.

Las irradiaciones en experimentos in vitro se realizaron con una l�mpara hal�gena o fuente de l�ser. En el primer caso, una l�mpara de hal�geno de 500 W se coloc� a 50 cm de la placa irradiada con el fin de garantizar una irradiaci�n uniforme. Un filtro de agua enfriado (d = 35 mm) y un filtro de corte a 600 nm se colocaron entre la l�mpara y las muestras. La fluidez de luz que llegaba a las muestras fue de 3 mW/cm2. El espectro de emisi�n de la l�mpara hal�gena se registr� usando un espectrorradi�metro IL2000 (Spectrocube), Figura 1. En el segundo caso, se utilizaron tres diodos l�seres de Lynx, de cavidad externa TEC 500, accionados por controladores de l�ser PilotPC 500 (Sacher Lasertechnik, Marburgo, Alemania). Las energ�as de los l�seres eran estables a 40 mW para el l�ser de 748 nm, a 10 mW para el l�ser de 649 nm y a 10 mW para el l�ser de 633 nm. Las energ�as de los rayos l�ser se midieron regularmente con un LaserCheck de Coherent. En algunos experimentos in vitro la luz l�ser se centr� en una fibra �ptica mediante un colimador instalado en una microbanda �ptica, y as� distribuida por las c�lulas. Este sistema reduce la potencia de la luz l�ser de 748 nm a 30 mW.

Para la irradiaci�n de bacterioclorinas en experimentos de fotoblanqueo utiliza el l�ser de diodo Lynx de 74/8 nm. Para los estudios con animales, se utiliz� un l�ser de diodo Hamamatsu fabricado a medida, tipo LA0873, S/N M070301, con 140 mW a 748 nm. Este l�ser de diodo tiene como controlador un Thorlabs 500 mA ACC / APC Laser Diode Controller y los sistemas electr�nicos instalados en nuestro laboratorio. Las energ�as de este l�ser y de otros l�seres de alta energ�a empleados en este trabajo fueron verificados regularmente con un medidor de energ�a l�ser Ophir modelo AN/2E.

La absorci�n celular del fotosensibilizador en funci�n del tiempo y la viabilidad de las c�lulas fue confirmada por microscop�a de fluorescencia utilizando un microscopio Nikon Eclipse TS-100F.

Las muestras de piel sometidas a fluorescencia se analizaron con un microscopio de fluorescencia Olympus modelo BX51M usando un espejo de fluorescencia U-MSWG2 (filtro de excitaci�n 480-550, filtro de emisi�n de 590, filtro dicrom�tico 570 nm). La microscop�a confocal se realiz� con un microscopio invertido (DMI6000) Leica TCS SP5 (Leica Mycrosystems CMS GmbH, Mannheim, Alemania) con objetivo apocrom�tico de 63' de inmersi�n en agua (apertura �ptica digital 1, 2). Antes de pasar al modo confocal, se observ� la suspensi�n GUV (ves�culas unilamelares gigantes) directamente a trav�s de una l�mpara de sodio como fuente de luz y un filtro para seleccionar la fluorescencia de Rhod-DOPE para evaluar la eficacia de la formaci�n de GUVs. La fuente de excitaci�n utilizada en microscop�a de fluorescencia confocal fue la l�nea de 514 nm procedente del l�ser de Ar+ o la l�nea de 745 nm de un l�ser de Ti: Sa. La emisi�n se recogi� en el intervalo de 550-800 nm, aprovechando la ventaja de la fibra ac�stico-�ptica sintonizable y del divisor de haz del sistema de Leica TCS SPC5. La cantidad de luz perdida es m�nima de acuerdo con la "desviaci�n inteligente" que siempre se mantiene por debajo de 0, 5% (generalmente entre -0, 1% y 0, 1%) y existe un n�mero de fotones insignificante fuera de las estructuras lip�dicas. Las secciones confocales de menos de 0, 5 mm de espesor se obtuvieron utilizando el motor de paso galvanom�trico. Las proyecciones tridimensionales se obtuvieron mediante el software Leica Application Suite-Advanced Fluorescence.

II. D. M�todos

II.D.1. Los coeficientes de partici�n

Los coeficientes de partici�n (CP) n-octanol: agua fueron medidos usando una ligera modificaci�n del m�todo de agitaci�n en frasco descrito en la bibliograf�a [35] por algunos de los autores de esta patente. La modificaci�n incluye la excitaci�n de la banda de absorci�n a 500 nm aprox. y la detecci�n de fluorescencia en el espectro de la regi�n rojo/IR.

II.D.2. Fotoqu�mica y fotof�sica

Las experiencias de fotoblanqueo se llevaron a cabo en soluciones PBS, PBS: metanol (50: 50) y metanol. Las soluciones se irradiaron con el l�ser de diodo Lynx en una c�lula con paso �ptico de 1 cm. La absorci�n inicial de las soluciones fue cercana a 0, 8. El mecanismo de fotoblanqueo fue evaluado mediante la irradiaci�n del sensibilizador utilizando el l�ser de diodo Hamamatsu de 80 mW. El sensibilizador se irradi� en PBS y en presencia de �cido asc�rbico o azida.

Los rendimientos cu�nticos de fluorescencia (ΦF) fueron determinados en etanol tomando como referencia el rendimiento cu�ntico de fluorescencia de Cl2PhB en tolueno [4]. Las absorbancias de las soluciones de referencia y de la muestra se ajustaron aproximadamente a 0, 2 en una longitud de onda de excitaci�n de 515, 5 nm, diluyendo 10 veces las soluciones antes de la detecci�n de fluorescencia. El rendimiento cu�ntico de fluorescencia se obtuvo a partir de la relaci�n entre las bandas de fluorescencia de la muestra de referencia y se multiplica por el rendimiento cu�ntico de fluorescencia de la referencia de 0, 012, tal y como se describe en la bibliograf�a [12], despu�s de corregir la diferencia de los �ndices de refracci�n de etanol y de tolueno.

Los espectros de absorci�n del triplete-triplete y los tiempos de vida de los tripletes de los fotosensibilizadores (τT) se midieron con los espectros de absorci�n de transitorios descrito anteriormente, con excitaci�n a 355 nm, en el que las soluciones tienen absorbancias entre 0, 25 y 0, 30.

La calorimetr�a fotoac�stica de resoluci�n temporal (PAC) se realiz� con el equipo descrito anteriormente usando un procedimiento descrito por algunos de los autores de la patente [4]. Todas las mediciones se hicieron en etanol usando compuesto de manganeso 5, 10, 15, 20-tetrafenilporfirina como referencia fotoac�stica.

Los rendimientos cu�nticos de ox�geno singlete en etanol se obtuvieron por medio del procedimiento descrito por algunos de los autores de la patente [37] usando la fenalenona como referencia. La bibliograf�a indica que el rendimiento cu�ntico de ox�geno singlete obtenido con la fenalenona en etanol es ΦΔ= 0, 95 [38].

II.D.3.Resonancia Paramagn�tica Electr�nica (RPE)

Las especies reactivas del ox�geno producidas por la irradiaci�n de los fotosensibilizadores en PBS, concretamente el i�n super�xido y el radical hidroxilo, forman aducciones con varios capturadores de spin. Estas aducciones se pueden identificar por EPR. El tamp�n PBS empleado en estas mediciones se trat� previamente con una resina quelante, Chelex 100, para eliminar cualquier i�n met�lico contaminante que pudiera catalizar la descomposici�n de los per�xidos. Se utilizaron dos captores de spin: BMPO y DMPO. El DMPO se purific� inicialmente con carb�n activado/benceno y, a continuaci�n, se determin� una concentraci�n de partida por espectrofotometr�a utilizando el coeficiente de extinci�n ε226= 7.200 M-1 cm-1. Las mediciones de RPE se realizaron a temperatura ambiente usando un espectr�metro Bruker descrito anteriormente con irradiaci�n in situ y l�ser de diodo de Hamamatsu.

II.D.4. Pruebas de permeabilidad cut�neas

El mejor modelo animal para probar la permeabilidad cut�nea es el cerdo miniatura (minipig), debido a las similitudes entre las caracter�sticas de la piel del cerdo miniatura y la piel humana [39]. Se emplearon diferentes formulaciones de cremas, ung�entos, geles y soluciones l�quidas para aumentar la penetraci�n del fotosensibilizador en las muestras de piel de los cerdos miniatura. Las formulaciones que contienen fotosensibilizadores en cantidades variables de 0, 1 a 10 %, potenciadores de la permeabilidad, tales como Azone � y el DMSO, y diversos excipientes. Las pruebas ex vivo emplearon la piel cortada del dorso de los cerdos miniatura. Las pruebas in vivo se llevaron a cabo en la parte posterior de los cerdos miniatura. En cada prueba, la formulaci�n se aplic� sobre un �rea de aprox. 1 cm2 de la piel durante el tiempo deseado, bajo un vendaje oclusivo. Despu�s del tiempo, la formulaci�n se retir� con una esp�tula y se limpi� con un bastoncito de algod�n de uso m�dico empapado de etanol hasta que no se observasen residuos del sensibilizador. En pruebas in vivo, se retiraron con cirug�a muestras de piel, y despu�s se sacrificaron los animales.

El primer paso para fijar el tejido de las muestras de la piel consisti� en sumergirlas en paraformaldeh�do (4 % en soluci�n acuosa) durante al menos 24h. A continuaci�n, las muestras se transfirieron a una soluci�n de sacarosa al 25% durante al menos 48 h. Despu�s de este tratamiento, las muestras de piel se vuelven m�s densas que la soluci�n de sacarosa. Se extrajo una al�cuota por punci�n biopsa y se congel� en hielo seco y luego se mont� en soportes con Tissue-Tek O.C.T. Compound (Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, Pa�ses Bajos) y cortada en rodajas de espesor controlado, seleccionadas de 25 a 100 mm en un criostato. Las rodajas de piel se transfirieron a l�minas de microscopio y se mantuvieron fr�as hasta que se analizaron por microscop�a de fluorescencia y microscop�a confocal. Alternativamente, en lugar de utilizar paraformaldeh�do como fijador, las muestras de piel se congelaron directamente en hielo seco.

II.D.5. Ensayos in vitro

Los medicamentos descritos en esta invenci�n fueron evaluados en los estudios in vitro. En una serie de ensayos in vitro se irradiaron con una l�mpara de hal�geno mezclado con varios filtros. En otro conjunto se emple� la irradiaci�n l�ser de diodo para iluminar cada uno de los cultivos de c�lulas.

II.D.5.i) Ensayos in vitro con irradiaci�n procedente de una l�mpara hal�gena

Las l�neas celulares utilizadas en los ensayos de irradiaci�n con la l�mpara de hal�geno eran c�lulas MCF7 (carcinoma humano de mama), SKMEL 188 (melanoma humano) y S91/I3 (melanoma de rat�n). Fueron utilizadas tanto en ensayos referentes a toxicidad como a fototoxicidad. Las c�lulas MCF7 fueron cultivadas en medios suplementados con 10% de suero bovino fetal (FBS), 25 unidades/ml de penicilina y 25 μg/ml de estreptomicina. Las c�lulas de melanoma humano SKMEL-188 se cultivaron en medio F10 suplementado con 10 % de suero de bovino fetal (FCS), 100 unidades/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. La subl�nea I3 de c�lulas de melanoma Cloudman S91 fue cultivada en medio RPMI 1640 suplementado con 100 unidades/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y 5 % de suero de bovino fetal (FCS) (Gibco BRL). Todas las l�neas celulares fueron cultivadas en monocapas en placas de Petri de 60 mm de di�metro, y se incubaron a 37�C en una atm�sfera h�meda con 5 % de CO2.

Citotoxicidad. La viabilidad y la eficacia metab�lica de las c�lulas se determin� por la absorci�n y la reducci�n del bromuro de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeni tetrazolio (MTT) en tinte de formazano insoluble por las enzimas microsomales de c�lulas. Las l�neas celulares se cultivaron en medio RPMI con 10% de suero bovino fetal, penicilina y estreptomicina. Las c�lulas se mantuvieron en 5 % de CO2, 95 % de aire y 100 % de humedad. Para determinar la citotoxicidad, estas c�lulas se transfirieron a placas de 96 pozos con una densidad de 1 x 104 c�lulas por pozo en medio completo. Despu�s de 24 h, las c�lulas se incubaron con fotosensibilizadores a diferentes concentraciones (0, 25 a 50 �M) durante 18 horas a 37�C. Seguidamente, las c�lulas se lavaron dos veces con PBS y se incubaron en medio de crecimiento a 37�C durante 24 h. Despu�s de este per�odo, el medio se reemplaz� con 100 �l de medio fresco y 20 �l de MTT, y las c�lulas se incubaron con MTT a una concentraci�n final de 0, 5 mg / ml durante 3 h. A continuaci�n, el medio de cultivo fue reemplazado por la soluci�n de DMSO: metanol (1: 1) para disolver los cristales de formazano azul. La placa de cultivo de 96 pozos se agit� durante 0, 5 min a temperatura ambiente y se ley� la densidad �ptica a 560 nm inmediatamente usando un lector de ELISA (GENios Plus; Tecan Trading AG, Suiza). La supervivencia celular se expres� por la alteraci�n de la absorci�n de la sal de formazano y la tasa de supervivencia fue indicada como la relaci�n de porcentaje del n�mero de c�lulas viables tratadas y el n�mero de c�lulas viables no tratadas. El n�mero de c�lulas se determin� por regresi�n lineal a partir de una curva de calibraci�n.

Absorci�n celular dependiente del tiempo. Las c�lulas SKMEL 188, S91 y MCF7 se sembraron en placas de 96 pozos con 1x104 c�lulas por pozo y se expusieron a concentraciones de 20 μM de fotosensibilizadores de bacterioclorinas y clorinas en PBS durante diversos intervalos de tiempo de 10 min a 180 min, con el fin de probar la acumulaci�n del f�rmaco en funci�n del tiempo. Al final del intervalo de incubaci�n, las c�lulas se lavaron tres veces con PBS y se volvieron a suspender en 100 μL de PBS que conten�a 0, 25 % de Triton X-100. La retenci�n de fotosensibilizador en las c�lulas se detect� midiendo la fluorescencia de la fotosensibilizador acumulada usando un lector de ELISA. Adem�s, la absorci�n de fotosensibilizador y la viabilidad de las c�lulas se confirmaron por microscop�a de fluorescencia. En estos experimentos las c�lulas SKMEL 188, S91 y MCF7 fueron incubadas durante 2 horas con 20 μM de fotosensibilizador, se lavaron tres veces con PBS, se volvieron a suspender en PBS y se examinaron con microscop�a de fluorescencia.

Fotosensibilizaci�n celular. Las c�lulas SKMEL 188, S91 y MCF7 fueron preparadas conforme se ha descrito anteriormente. Como base de los ensayos de citotoxicidad, se seleccion� la concentraci�n de 5 �M de fotosensibilizador para las pruebas de fotosensibilizaci�n. Las c�lulas se incubaron durante 12 h a 37�C y luego se irradiaron a la tasa de 0, 53 mW/cm2 y en dosis entre 0, 64 y 0, 1 J/cm2. Debe tenerse en cuenta que el fotosensibilizador apenas utiliza 1/5 de velocidad del flujo disponible en la l�mpara de hal�geno filtrada. La prueba con MTT se realiz� 24 h despu�s de la irradiaci�n. Los valores se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes y se expresaron como porcentaje de supervivencia de las c�lulas con referencia a las c�lulas de control que fueron tratadas de forma similar pero no se incubaron con el fotosensibilizador, ni fueron iluminadas.

II.D.5.ii) Ensayos in vitro con irradiaci�n l�ser

Las l�neas celulares utilizadas en los ensayos con irradiaci�n l�ser fueron HT-29 (carcinoma de colon humano), PC3 (carcinoma de pr�stata humano), SW2 (c�ncer humano de pulm�n de peque�as c�lulas), A-549 (c�ncer humano de pulm�n de no peque�as c�lulas), S91/I3 (melanoma de rat�n) y CT26 (carcinoma de colon de rat�n). Estas

cepas fueron utilizadas para los experimentos relacionados tanto con la fototoxicidad como la citotoxicidad. Las c�lulas PC-3, SW2 y S91/I3 fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) y las c�lulas HT-29, A-549 y CT26 fueron cultivadas en medio Dulbecco Eagle modificado (DMEM) (Cambrex Bioscience, Verviers, B�lgica). Ambos medios de cultivo se complementaron con 10 % de suero fetal bovino inactivado por el calor (FBS) (Cambrex Bioscience, Verviers, B�lgica), 100 UI de penicilina/ml y 100 μg/ml de estreptomicina (Cambrex Bioscience, Verviers, B�lgica). El medio DMEM utilizado para las c�lulas CT26 tambi�n se suplement� con HEPES de 10 mM. Las l�neas celulares se mantuvieron en frascos de cultivo de 75 cm2 (Orange Scientific, Braine-l'Alleud, B�lgica) a 37�C en una atm�sfera h�meda y con 5% de CO2. Para los estudios in vitro, las c�lulas con 85-90% de confluencia fueron desprendidas de la superficie del frasco de cultivo con una soluci�n de tripsina-EDTA-Versene (Cambrex Bioscience, Verviers, B�lgica), se contaron y se sembraron en 96 placas de fondo plano a las densidades deseadas.

Ensayo de viabilidad celular. Al final de las experiencias de la viabilidad celular se evalu� por el ensayo de reducci�n de resazurina [40]. Brevemente, una soluci�n madre (0, 1 mg/ml en soluci�n salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7, 4) de resazurina (Sigma-Aldrich, Steinhelm, Alemania) fue diluida al 10% en medio de cultivo sin FBS o antibi�ticos, y se a�adieron 200 μl a las c�lulas en cada pozo. Las placas se incubaron durante 3-4 horas a 37�C. Los valores de absorbancia para cada pozo se midieron a 540 nm y 630 nm utilizando un lector de microplacas Multiskan Ex (Thermo-Electron Corporation, Vartaa, Finlandia).

Citotoxicidad. Las c�lulas se sembraron en 96 pozos de fondo plano (Orange Scientific Braine-l'Alleud, B�lgica) con 100 μl de medio de cultivo y se dejaron adherir durante una noche. El fotosensibilizador se a�adi� a las c�lulas (diluido en 100 μl de medio de cultivo) en concentraciones finales entre 0, 01 y 1 mm. Cada concentraci�n se analiz� cuatro veces. Los per�odos de incubaci�n en la oscuridad a 37�C fueron dos veces superiores que el tiempo de duplicaci�n de las c�lulas de la cepa del ensayo. Despu�s de la incubaci�n, se evalu� la viabilidad celular. En experimentos de control en paralelo, las c�lulas se incubaron sin el f�rmaco. La citotoxicidad se cuantific� mediante la expresi�n de la muerte celular relativa a las c�lulas no tratadas (% de c�lulas de control). Los resultados fueron indicados en gr�fico en forma de curvas de respuesta de la dosis (% de muerte celular en funci�n de la concentraci�n del f�rmaco) que permiten la determinaci�n de la concentraci�n que inhibe el 50% del crecimiento celular (CI50).

Fotosensibilizaci�n celular. Las c�lulas fueron sembradas en placas de 96 pozos DB Falcon negros de fondo plano (DB Biosciences – Labware, NJ, EEUU) en 100 μl placas de medio de cultivo y se dejaron adherir durante una noche. El f�rmaco se a�adi� a las c�lulas (diluidas en 100 μl de medio de cultivo) a las concentraciones deseadas. Las c�lulas fueron incubadas con el f�rmaco en la oscuridad a 37�C durante un tiempo determinado. Este tiempo de incubaci�n es generalmente denominado de intervalo de f�rmaco-luz. Despu�s de la incubaci�n, las c�lulas fueron lavadas una vez con 200 μl de PBS para eliminar el f�rmaco no internalizado y se a�adieron 100 μl de medio de cultivo fresco. Las c�lulas fueron irradiadas (cada pozo por separado) con luz a 748 nm de l�ser de diodo Lynx, anteriormente descrito, a una potencia de 100, 7 mW/cm2. El tiempo de irradiaci�n fue elegido para obtener la dosis de luz deseada. Se probaron dos condiciones de control paralelas: las c�lulas fueron incubadas en la oscuridad con la dosis m�s alta de f�rmaco y no fueron irradiadas, y las c�lulas fueron irradiadas con una dosis m�s alta de luz sin el f�rmaco. Despu�s de la irradiaci�n, se a�adieron 100 μl de medio de cultivo fresco. La viabilidad celular se evalu� aproximadamente 24h despu�s de la irradiaci�n.

II.D.6. Experimentos in vivo

Los ratones utilizados en el presente estudio proced�an de dos fuentes. Para los estudios de toxicidad en la oscuridad, biodistribuci�n y farmacocin�tica se emplearon ratones DBA/2 con un peso de 20-30 g procedentes del vivero de la Facultad de Bioqu�mica, Biof�sica y Biotecnolog�a de la Universidad Jagell�nica de Cracovia. Los ratones fueron mantenidos bajo dieta est�ndar de laboratorio y ten�an acceso al agua para beber en cualquier momento. La utilizaci�n de estos animales para fines experimentales fue aprobada por el Comit� de �tica en Experimentaci�n Animal de la Universidad Jagell�nica (Resoluci�n N� 384/99). Estos ratones tambi�n fueron utilizados en las pruebas en PDT.

Los otros ratones eran Balb/C y pesaban entre 20-25 g y proced�an del vivero de los Laboratorios de Charles River (Barcelona). Los ratones fueron mantenidos bajo dieta est�ndar de laboratorio y ten�an acceso al agua para beber en cualquier momento. La utilizaci�n de estos animales para fines experimentales fue aprobada por el Consejo del Centro de Neurociencia y Biolog�a Celular (Coimbra).

Los cuatro cerdos miniatura utilizados en este estudio proced�an de IMIDRA (Instituto Madrile�o de Investigaci�n y Desarrollo Rural, Agrario y Alimentario) en Aranjuez (Madrid). Todas eran hembras de 6-8 meses de edad, blancas con manchas marrones y pesaban por t�rmino medio 56, 8 kg (66, 2, 57, 1, 43, 5 y 60, 6 kg). Fueron recibidos en la

Estaci�n Nacional de Zootecnia, Vale de Santar�m, donde fueron alojados en cajas separadas de 1, 5 m2, alimentados con una dieta est�ndar para cerdos y agua ad libitum durante un per�odo de aclimataci�n de tres semanas. El estudio se realiz� de acuerdo con las regulaciones �ticas portuguesas bajo licencia otorgada por la Direcci�n General de Sanidad y Protecci�n de los Animales, ref. 0420/000/000/2007. El acceso a la alimentaci�n fue suspendido 24h antes del tratamiento. Se afeit� el dorso de los animales 24 h antes de la aplicaci�n de las formulaciones. La administraci�n t�pica de fotosensibilizadores se realiz� bajo anestesia. La medicaci�n preliminar utilizada 30 min. antes de las aplicaciones fue la siguiente: Azaperona (Stresnil �-Veterinaria ESTEVE-Espa�a), inyecci�n intramuscular de 2 mg/kg + sulfato de atropina, 50 mg de SC. La inducci�n se hizo con cetamina (Clorketam �-V�toquinol, Francia), 20 mg/kg, inyecci�n intramuscular. La anestesia se mantuvo con intubaci�n endotraqueal utilizando ventilaci�n espont�nea con 2-3 l /min de ox�geno + 3% isoflurano (Isoflo �-Veterinaria FUE, Espa�a). Se recogieron muestras de tres cerdos miniatura bajo anestesia general conforme fue descrito m�s arriba. Las muestras de piel de 20x20x10 de dimensi�n (largo, ancho, profundidad) se obtuvieron mediante escisi�n quir�rgica. Despu�s de la recogida de las muestras de piel, se sacrificaron los animales mediante la aplicaci�n de una sobredosis de tiopental s�dico (25 mg/kg) + 20 ml de cloruro de potasio 7, 5%. El cuarto cerdo miniatura se mantuvo vivo y se observ� durante 3 semanas, fue alimentado con una dieta est�ndar para cerdos y agua ad libitum. Despu�s de 3 semanas, la administraci�n t�pica de fotosensibilizadores se realiz� de nuevo bajo anestesia. Se aplica un choque el�ctrico para que el animal cayera inconsciente y fue sacrificado cort�ndole la vena yugular.

II. E. Propiedades de los compuestos

II.E.1. Propiedades f�sicas

Como se ha mencionado en los Fundamentos de la invenci�n, las propiedades f�sicas y qu�micas m�s importantes de los f�rmacos relevantes para la PDT son de fuerte absorci�n en el rango de 600-800 nm, de elevada eficiencia de generaci�n de ox�geno singlete, de estabilidad qu�mica, o fotoblanqueo controlado y coeficientes de reparto octanol: agua entre -2 y 5. Estas propiedades corresponden a la absorbancia de luz deseada en la ventana fototerap�utica y la generaci�n eficaz de especies citot�xicas inducidas por la luz, y reducen los efectos secundarios, tales como la fotosensibilidad prolongada de la piel, y la facilidad de administraci�n sist�mica o transd�rmica.

Las absorbencias de los compuestos se midieron en varias concentraciones, 1-20 �M, y en todos los casos se observ� el cumplimiento con la ley de Beer-Lambert. Adem�s, la longitud de onda de absorci�n m�xima (λm�x) no vari� de infrarrojos en el intervalo de concentraci�n estudiado. Esto indica que hay poca agregaci�n entre las mol�culas, que se encuentran principalmente en forma de mon�meros en los disolventes estudiados en estas concentraciones. La Tabla 1 muestra los coeficientes de absorci�n molar (εm�x) t�picos rojo e infrarrojos y los valores m�ximos de longitud de onda. Esta tabla tambi�n indica los rendimientos cu�nticos de fluorescencia (ΦF) representativos para las Luzitinas. Los rendimientos cu�nticos de fluorescencia de estas mol�culas disminuyen en presencia de sustituyentes tales como el cloro, una caracter�stica espec�fica determinante del efecto de �tomo pesado esperada de dichas mol�culas.

Los espectros de absorci�n del triplete-triplete de las Luzitinas medidas en este estudio son conformes con aquellos indicados en la literatura para clorinas y bacterioclorinas. Todas las desintegraciones del triplete fueron claramente monoexponenciales. En soluciones desaireadas obtenidas por flujo de N2 durante al menos 30 min, los tiempos de vida del triplete (τT) son del orden de milisegundos, lo que demuestra la fotoqu�mica ineficaz en ausencia de ox�geno. Los valores representativos se muestran en la Tabla 1. En el etanol saturado de aire la duraci�n de vida el triplete disminuy� en 200-300 nanosegundos, valor significativamente m�s corto que los tiempos de vida de las porfirinas correspondientes. Estos valores son consistentes con la transferencia de energ�a limitada por difusi�n a partir del estado triplete del sensibilizador para el ox�geno molecular a trav�s de una interacci�n de transferencia de carga.

Todas las emisiones de ox�geno singlete medidas en soluciones de etanol aireados est�n bien descritas por decaimientos monoexponenciales con tiempos de vida t�picos para el ox�geno singlete (τΔ). Los valores ΦΔ de la Tabla 1 fueron obtenidos por los m�todos descritos anteriormente y son representativos para estos fotosensibilizadores.

Tabla 1. Rendimientos cu�nticos de fluorescencia, tiempos de vida del triplete, rendimientos cu�nticos de ox�geno singlete y tiempos de vida del ox�geno singlete para fotosensibilizadores representativos en soluciones de etanol saturadas de aire.

λmax (nm): εmax (M-1 cm-1) ΦF τT (aire) (nseg) ΦΔ τΔ (�seg)

Photofrin �: 630 3200 400a) b) 10.6 a)

Luzitina -Cl -cc): 650 7000 0, 039 - 0, 69 –

Luzitina -Cl: 746, 5 23000 d) 0, 0403 240 0, 43 13, 6

Luzitina-Cl2: 745, 0 27000 d) 0, 0062 226 0, 85 15, 4

Luzitina-Fmet: 742.5 62000 d) 0, 0589 - 0, 71 14, 1

Luzitina-F2Met: 742, 5 78000 d) - - - -

Luzitina-Cl2Et: 745, 5 96000 0, 0081 265 0, 66 13, 7

Luzitina-Cl2Hep: 746 75 000 0, 0082 295 0, 63 14, 3

Luzitina-FMet2: 742, 5 78000 d) 0, 0585 - - -

Foscan �: 650 29600 e) 0, 089 f) 0, 43 f)

a) [41]. b) Las unidades monom�ricas HpD presentan ΦΔ = 0, 64 en metanol, pero en agua est�n presentes principalmente en forma de d�meros con ΦΔ= 0, 11 [42]. c) En soluci�n acuosa. d) Corregido por el contenido de clorina. d) [43]. e) En metanol, pero se reduce de mitad de este valor en un 65 % de agua en metanol [44]. f) En

5 metanol [45].

Normalmente, la suma de los rendimientos cu�nticos de fluorescencia y de ox�geno singlete y Luzitinas es 0, 6-0, 8, y 20 a 40 % de la luz absorbida se utiliza para otros procesos. Estos casos fueron investigados por resoluci�n fotoac�stica calorimetr�a temporal (PAC) y resonancia paramagn�tica electr�nica (RPE). El PAC mide la cantidad de energ�a liberada en los procesos no radioactivos (conversi�n interna, cruce entre sistemas, reacciones qu�micas) 10 en la desintegraci�n de los estados electr�nicamente excitados. El RPE mide la cantidad de especies con electrones desapareados (radicales libres) presentes en la muestra y se utiliza aqu� con irradiaci�n de l�ser directa para medir la generaci�n de iones super�xidos, el radical hidroxilo y otras especies reactivas de ox�geno (ROS) inducidas por la luz. La liberaci�n de energ�a medida por PAC es consistente con la formaci�n de estados triplete de bacterioclorina con rendimientos cu�nticos cercanos a la unidad y la energ�a triplete de 105-125 kJ/mol, lo que 15 concuerda con los datos de la bibliograf�a sobre bacterioclorinas halogenadas [12]. Los espectros RPE obtenidos durante la irradiaci�n de Luzitinas en PBS y en presencia de DMPO y BMPO revelaron la existencia de iones super�xidos y el radical hidroxilo. Estos datos juntos de RPE y de PAC muestran sin equ�voco que la irradiaci�n de estos fotosensibilizadores a 748 nm conduce a la formaci�n de iones super�xidos y, a continuaci�n, del radical hidroxilo, que contribuye a la fototoxicidad de las Luzitinas. Por lo tanto, la fototoxicidad de sensibilizadores es m�s

20 alta que aquella prevista a partir de sus rendimientos cu�nticos de ox�geno singlete, que ahora son 5 veces mayores que los de Photofrin �.

La estabilidad qu�mica de los compuestos se estudi� exponi�ndolos a la luz, al aire y a las alteraciones de pH. La degradaci�n m�s significativa se produce en el caso de soluciones aireadas irradiadas con luz de longitud de onda apropiada. En tales circunstancias, el fotoblanqueo de los compuestos sigue una ley cin�tica de primer orden y es 25 proporcional a la energ�a de la luz l�ser incidente. En general, tambi�n se observ� que el fotoblanqueo aumenta de acuerdo con el contenido de agua presente en la soluci�n. Bonnett inform� de la fotoconversi�n de Foscan� (m-THPC) y de la bacterioclorina an�loga (m-THPB) en PBS: metanol (50: 50) [46]. Scherz inform� de la fotoconversi�n de Tookad� en acetona y Triton-X PBS [3]. Para comparar la fotoestabilidad de Luzitinas con la fotoestabilidad de Foscan� y Tookad�, presentamos en la Tabla 2 los tiempos de media vida (t1/2) de f�rmacos representativos de los

30 descritos aqu�, juntamente con los de Foscan� y Tookad� est�ndar para una potencia de l�ser de 100 mW.

Tabla 2. Tiempo de media vida de bacterioclorinas irradiadas con l�ser de 100 mW a 748 nm y sus respectivos coeficientes de reparto n- octanol: agua (KOW).

F�rmaco: Disolvente t1/2 (seg) log KOW

Tookad� a): Tensioactivo: PBS 1, 56

Luzitina-F: PBS 58 -

Luzitina -Cl: PBS 174 -1, 70

Luzitina -Cl2: PBS 358 -1, 75

Luzitina -FMet: PBS: metanol metanol 647 3553 2, 3

Luzitina -F2Met: PBS: metanol 6.480 2, 7

Luzitina-Cl2Et: PBS: metanol 4.013 1, 8

Luzitina FMet2: metanol 4.352 >4

Foscan � b): PBS: metanol 8.582

Luzitina-Cl2Hep: metanol 164.105 >4

a) [3]. b) [46].

Distinguimos el fotoblanqueo de nuestras bacterioclorinas de la fotoconversi�n de m-THPB o Tookad�. Esta diferencia se basa en el hecho de que, despu�s de una prolongada irradiaci�n con l�ser, la mayor�a de nuestras bacterioclorinas se transforman en productos sin absorci�n detectable visible y el proceso puede describirse apropiadamente como fotoblanqueo. Por otro lado, la irradiaci�n de m-THPB o de Tookad� con l�ser produce grandes cantidades de las correspondientes clorinas que no absorben la luz l�ser, que se describe de forma m�s apropiada como una fotoconversi�n en otro colorante. El fotoblanqueo de nuestras bacterioclorinas es ventajoso, ya que causa menor fotosensibilidad de la piel, que no se observa en fotoconversi�n en otro colorante.

II.E.1. Propiedades Biol�gicas

El Photofrin� proporciona patrones de referencia importantes para la toxicidad en la oscuridad y para la eficacia de la PDT in vitro. La toxicidad de Photofrin� en la oscura l�nea celular H1299 de c�ncer de pulm�n de c�lulas no peque�as se evalu� en varias concentraciones de Photofrin� y la viabilidad celular se redujo hasta el 50% para ICoscuro50 = 8, 0 �g/ml [47]. Un estudio similar sobre la toxicidad de Photofrin� en las c�lulas oscuras Colo-26, una l�nea celular de carcinoma de colon de rat�n, proporcion� ICoscuro50"20 �g/ml (30 �M, suponiendo un mon�mero) [48]. Una l�nea celular de adenocarcinoma humano (HT29) ha sido una de las l�neas celulares m�s estudiadas en PDT. Los estudios sobre el efecto de la concentraci�n de la l�nea celular Photofrin� en la l�nea celular HT29 indicaron que la dosis letal que mata al 50 % de las c�lulas, con una dosis de 5 J/cm2 de luz hal�gena filtrada, es de CI50 = 7, 5 g / ml. Para un 90% de muerte celular, esta concentraci�n aumenta a IC90 = 40 �g/ml [49]. Por la misma l�nea celular, Foscan� es mucho m�s fotot�xico, con CI50 = 0, 8 �g/ml, cuando se utiliza un l�ser de colorante a 650 nm para proporcionar 10 J/cm2; sin embargo, a esta dosis de luz CI90 > 10 �g/ml alcanza los l�mites de su toxicidad en la oscuridad, ICoscuro50 = 13 �g/ml [50]. A diferencia de Photofrin�, la composici�n molecular de Foscan� es conocida y es m�s conveniente para expresar sus ICs en unidades molares. En estas unidades, la citotoxicidad de Foscan� es de ICoscuro50 = 19 �M y la toxicidad de una dosis de luz de 10 J/cm2 es de CI50 = 1, 2 �M. Por �ltimo, es interesante mencionar que la Tookad� causa una tasa de mortalidad del 50 % en las c�lulas HT29 a una dosis de 48 �M bajo irradiaci�n de 25 J/cm2 (patente US2003/ 6569846). Aunque los valores IC50 e IC90 dependen de los modos de administraci�n, los tiempos de incubaci�n, las fluencias de la luz y otros pormenores de los experimentos, los valores anteriores indican los mejores resultados en este campo.

La Tabla 3 compara la toxicidad de Photofrin� y Foscan� en la oscuridad acerca de la toxicidad en la oscuridad de las Luzitinas. La aplicaci�n de los m�todos descritos anteriormente y de acuerdo con los pormenores en los siguientes ejemplos, la dosis de luz requerida para matar el 50 % y el 90 % de las diferentes l�neas celulares bajo luz hal�gena filtrada en presencia de una clorina halogenada y sulfonada se indican en la Tabla 4, y los valores correspondientes para un bacterioclorina halogenada y sulfonada se muestran en la Tabla 5. La Tabla 6 muestra la fototoxicidad en funci�n de la concentraci�n de varias Luzitinas necesarias para matar el 90 % de las c�lulas con l�ser de 6 J/cm2.

Tabla 3. Toxicidad de los fotosensibilizadores en la oscuridad para las l�neas celulares de c�ncer humano y del rat�n.

L�nea celular: Tiempo de incubaci�n (h) Photofrin� IC50 (�g/ml) Foscan� IC50 (�M) Luzitina-Cl a) IC50 (�M)

H1299: 8, 0 -

HT-29: 48 - 19 500

SW2: 48 - - 400

PC-3: 72 - - 600

S91I3: 40 - - 500

a) Las c�lulas se incubaron durante dos veces el tiempo requerido para duplicaci�n de la poblaci�n de c�lulas en medio de cultivo completo en la oscuridad y en presencia de diferentes concentraciones del fotosensibilizador.

10 Tabla 4. Dosis de luz en J/cm2 requeridas para matar el 50 % y el 90 % de las c�lulas en las l�neas celulares indicadas, para [Luzitina-Cl-c]=20 �M ("20 �g/ml) bajo irradiaci�n de l�mpara de hal�geno filtrada.

L�nea celular: S91 SKMEL 188 MCF7

LD50: 0,13 0,26 0,3

LD90: 0,26 0,46 0,7

Tabla 5. Dosis de luz J/cm2 requerida para matar el 50 % y el 90 % de las c�lulas en las l�neas celulares indicadas, para [Luzitina Cl -] = 20 �M ("20 �g/ml) bajo irradiaci�n de la l�mpara de hal�geno filtrada.

L�nea celular: S91 SKMEL 188 MCF7

LD50: 0,15 0,1 0,08

LD90: 0, 3 0,32 0,25

Tabla 6. La concentraci�n del sensibilizador en �M necesaria para matar el 90 % de las c�lulas de las l�neas celulares de carcinoma de pr�stata humano (PC-3), adenocarcinoma humano (HT-29), carcinoma de pulm�n humano de c�lulas no peque�as (A- 549), melanoma de rat�n (S91I3) y carcinoma de colon de rat�n (CT26) bajo irradiaci�n con un l�ser de diodo de 6 J/cm2 a 28, 5 mW.

Fotosensibilizador: PC-3 HT-29 A-549 S91I3 CT26

Luzitina-Cl2: 20 50 -- 40 -

Luzitina-Cl2Et: 5 10 10 -- 5

Luzitina-FMet: 0, 5 0, 5 0, 5 -- 1, 0

Luzitina-F2Met: 0, 5 - 0, 5 -- 1, 0

Las tablas 4-6 muestran la baja toxicidad de las Luzitinas en la oscuridad y su extremadamente alta fototoxicidad. La Tabla 6 muestra que las concentraciones de Luzitina necesarias para matar el 90% de las c�lulas de diversas l�neas son hasta 100 veces menores que las requeridas por Photofrin� y hasta 20 menores que aquellas requeridas para Foscan�. Con dosis de l�ser 6 J/cm2 (60 segundos de irradiaci�n en las condiciones experimentales) es posible matar al 100% de las c�lulas en todas las l�neas celulares estudiadas con concentraciones de Luzitina que presentan una citotoxicidad insignificante en la oscuridad.

II. F. M�todos de utilizaci�n de los compuestos y composiciones

Las Luzitinas pueden administrarse a trav�s de formulaciones para aplicaci�n t�pica, oral, intravenosa, subcut�nea, intraperitoneal, rectal, sublingual, nasal, ocular, auditiva o por inhalaci�n, de acuerdo con la situaci�n cl�nica. La formulaci�n farmac�utica est� adaptada para la v�a de administraci�n seleccionada. Las formulaciones contienen, adem�s de la Luzitinas (aisladas o combinadas entre s�), un veh�culo aceptable desde el punto de vista farmac�utico. Antes de preparar la formulaci�n, se pueden obtener derivados de Luzitinas en sus correspondientes formas de sales, �steres, �teres o �steres en�licos, acetales, cetales, orto�steres, hemiacetales, hemicetales, �cidos, bases, solvatos, hidratos o prof�rmacos.

Despu�s de la administraci�n t�pica o sist�mica, o ambas, la zona tratada se expone a luz de la longitud de onda apropiada, preferiblemente entre 630 y 690 nm para clorinas o entre 720 y 780 nm para bacterioclorina, preferiblemente usando un l�ser. Los m�todos de irradiaci�n de varias zonas del cuerpo son bien conocidos en la materia. El intervalo f�rmaco-luz puede variar desde varios minutos a varios d�as, dependiendo del modo de administraci�n. La dosis de luz depende de la v�a de administraci�n, de la fuente de luz y del objetivo de la terapia. En el caso de irradiaci�n por l�ser continuo, la dosis de la luz debe ser de 10 a 250 Julios/cm2 con una potencia del l�ser entre 20 y 200 mW/cm2. Tambi�n puede utilizarse irradiado con l�ser pulsado con energ�as entre 0, 001 y 10 mJ/cm2 por pulso. La dosis de luz se puede aplicar en varias sesiones individuales. Para el diagn�stico, se puede reducir la dosis de luz. Cuando se emplean fuentes de luz de banda ancha de irradiaci�n, las dosis de luz se aumentan para mantener la energ�a de la fuente de luz en las regiones espectrales donde las Luzitina absorben, al nivel determinado para la irradiaci�n con l�ser.

Las Luzitinas pueden administrarse de una sola vez o se puede dividir en varias dosis peque�as para ser administradas en intervalos de tiempo. Las Luzitinas pueden administrarse con otros f�rmacos para obtener efectos sin�rgicos. Las dosis de luz administradas despu�s del intervalo de f�rmaco-luz son aquellas de la gama de variaci�n indicada anteriormente para una sola dosis. El tratamiento puede repetirse varias veces en distintos intervalos de tiempo. Se subentiende que la dosificaci�n precisa y la duraci�n del tratamiento dependen de la enfermedad que se est� tratando y pueden determinarse emp�ricamente usando protocolos conocidos en la materia.

II.F.1. Administraci�n sist�mica (v�a oral, inyectable, aerosol y rectal)

Un factor limitativo com�n asociado con la administraci�n oral es la degradaci�n putativa de la droga en las condiciones �cidas del est�mago. Como muestra el siguiente ejemplo, las Luzitinas son relativamente estables en pH 1 durante 3 horas. Las alteraciones observadas del espectro en valores bajos de pH se deben a la protonaci�n del anillo pirr�lico, pero son reversibles cuando se neutraliza el �cido. Otra dificultad que se encuentra con frecuencia en la administraci�n oral se refiere a la biodisponibilidad. Se pueden obtener Luzitinas que se aproximan a la regla de cinco de Lipinsky [51] para la absorci�n intestinal. Las Luzitinas pueden tener registro KOW < 5, cuatro donantes para la formaci�n de enlaces de hidr�geno, doce aceptores de enlaces de hidr�geno y el peso molecular de 1 kD. S�lo este �ltimo par�metro excede considerablemente los l�mites de la regla anteriormente indicada.

Teniendo en cuenta las propiedades fisicoqu�micas de las Luzitinas, pueden considerarse las formas de dosificaci�n, s�lidas, semi-s�lidas y l�quidas. En este contexto, hay que tener en cuenta la vanguardia en t�rminos de adyuvantes farmac�uticos para las diversas formas de dosificaci�n farmac�utica y modos de administraci�n.

El intervalo de f�rmaco-luz preferido en la administraci�n sist�mica puede variar desde unos minutos hasta 3 d�as, dependiendo del modo de administraci�n. Las composiciones farmac�uticas deber�an proporcionar una dosificaci�n de 0, 01 mg a 100 mg de Luzitina (o combinaci�n de Luzitinas) por kilogramo de peso corporal al d�a. La mejor dosis diaria de Luzitinas es de 0, 1 a 10 mg por kilogramo de peso corporal.

II.F.2. Administraci�n t�pica

La administraci�n t�pica se puede hacer con formulaciones adecuadas que contienen uno o varios potenciadores de penetraci�n y otros excipientes en forma l�quida, gel, hidrogel, crema, pomada, spray o cualquier otra formulaci�n dermatol�gica aceptable. Como se ha mencionado en los Fundamentos de la Invenci�n, la permeaci�n de la piel conseguida para el Photofrin� o para otros fotosensibilizadores de alto peso molecular es insuficiente para la PDT eficaz en los trastornos de la piel. Las Luzitinas tampoco reunieron la mayor�a de los criterios para un buen suministro a trav�s de la piel [32]. No obstante, nuestra capacidad para modular la anfilicidad, la capacidad de enlace de hidr�genos de estos compuestos, y hasta cierto punto, su peso molecular, simplifica la tarea de encontrar formulaciones que promueva su difusi�n pasiva en la dermis. Para una formulaci�n en gel presentada en el Ejemplo 21, se demostr� un suministro t�pico r�pido y eficaz en la dermis.

El intervalo de f�rmaco-luz preferido en la administraci�n t�pica se sit�a entre 15 minutos y 3 horas. La formulaci�n debe contener de 0, 01 a 10 %de Luzitina. Preferiblemente, el porcentaje del sensibilizador en la formulaci�n es de 0, 1 a 1 %.

La administraci�n t�pica tambi�n contempla la aplicaci�n en los ojos. Las aplicaciones destinadas para su uso oft�lmico pueden formularse como soluciones isot�nicas 0, 01 %-10 %, pH 5-7, con las sales adecuadas.

Los ejemplos incluidos en el �mbito de las reivindicaciones representan formas de realizaci�n preferidas de la invenci�n, todos los dem�s son ejemplos de referencia.

Esta invenci�n se describir� ahora con m�s detalle en los siguientes ejemplos no limitativos, con referencia a las siguientes figuras:

Figura 1. Densidad espectral de la l�mpara hal�gena de 500 W con un filtro de corte de 600 nm y el espectro de absorci�n de infrarrojos de una clorina (l�nea de puntos) y de una bacterioclorina (l�nea discontinua).

Figura 2. Espectro de absorci�n de Luzitina- FMet-c obtenido a partir de la reducci�n de la porfirina correspondiente mediante s�ntesis caracterizada por la ausencia total de disolventes org�nicos y de bases.

Figura 3. Espectro de absorci�n de Luzitina-Cl2Et obtenido a partir de la reducci�n de la porfirina correspondiente por medio de la s�ntesis caracterizada por la ausencia total de disolventes org�nicos y de bases.

Figura 4. Espectro de absorci�n de la fracci�n m�s polar (βα3+α4) de atropis�meros de Luzitina-Cl2Et que indica el aumento de la absorbancia en el infrarrojo, estimado a εm�x= 150.000 M-1 cm-1 a 748 nm.

Figura 5. Espectros de absorci�n de Luzitina-Cl2 en una soluci�n acuosa neutra (l�nea continua), despu�s de 2 horas en un pH de 1 (l�nea de puntos) y despu�s de la neutralizaci�n (l�nea discontinua). Los espectros se corrigieron para el efecto de diluci�n provocado por la adici�n de gotas de HCl y NaOH en una soluci�n acuosa.

Figura 6. Espectros de absorci�n da Luzitina-FMet en PBS: metanol (3: 2) antes (a la izquierda) y despu�s (a la derecha) de 65 min de irradiaci�n con el l�ser diodo Lynxs a 748 nm y la potencia de 28, 8 mW (110 J) que muestra el fotoblanqueo controlado.

Figura 7. Intensidad de fosforescencia de ox�geno singlete obtenida a 1.270 nm despu�s de la excitaci�n a 355 nm de Luzitina-Cl2Hep o de fenalenona en etanol de aire saturado. Se utiliz� la inclinaci�n de la recta obtenida a partir de la relaci�n de dependencia de la fosforescencia y la intensidad del l�ser para determinar el rendimiento cu�ntico de ox�geno singlete del sensibilizador.

Figura 8. Espectros de RPE obtenidos en la presencia de 80 �M de Luzitina-Cl bajo irradiaci�n. A la izquierda: con

BMPO 40 mM en PBS, el espectro corresponde al del aducto de spin de BMPO con el radical hidroxilo. A la derecha: con DMPO 40 mM en DMSO, el espectro corresponde al del aducto de spin DMPO con el i�n super�xido

Figura 9. Fracci�n de c�lulas S91 (porcentaje) supervivientes en diversas dosis de luz en la presencia de [Luzitina-Cl -c] = 20 �M. El fotosensibilizador no internalizado no se ha eliminado antes de la irradiaci�n. Insertar: Citotoxicidad de Luzitina-Cl-c en la oscuridad para l�neas celulares de las c�lulas S91 en diferentes concentraciones de sensibilizador.

Figura 10. Fracci�n de c�lulas MCF7 sobrevivientes (porcentaje) en diversas dosis de luz en presencia de [Luzitina -Cl] = 5 �M despu�s de 12h de incubaci�n. El fotosensibilizador no internalizado se retir� antes de la irradiaci�n. Insertar: Citotoxicidad de Luzitina Cl-en la oscuridad para las c�lulas de la l�nea MCF en diferentes concentraciones del sensibilizador. La potencia efectiva de la luz es de 0, 53 mW/cm2.

Figura 11. Efecto fotot�xico de Luzitina-Cl2 en la l�nea celular PC-3 de c�ncer de pr�stata despu�s de un intervalo de f�rmaco-luz de 24 horas. Las c�lulas en medio de cultivo fueron irradiadas con l�ser a 748 nm durante 30 � 60 segundos, que corresponde a la dosis de luz de 3 y 6 J/cm2, respectivamente.

Figura 12. Porcentaje de supervivencia celular relativa al control para varias concentraciones de Luzitina-Cl2Et en l�neas celulares de carcinoma de colon de rat�n despu�s de un intervalo f�rmaco-luz de 18 horas. El fotosensibilizador no internalizado fue removido antes de la irradiaci�n. Las c�lulas en medio de cultivo fueron irradiadas con l�ser a 748 nm durante 60 segundos, lo que corresponde a la dosis de luz de 6 J/cm2.

Figura 13. Porcentaje de supervivencia celular relativa al control para varias concentraciones de Luzitina-FMet en l�neas de c�lulas de adenocarcinoma humano despu�s de un tiempo de incubaci�n de 18 horas. El fotosensibilizador no internalizado fue removido antes de la irradiaci�n. Las c�lulas en medio de cultivo fueron irradiadas con l�ser a 748 nm durante 60 segundos, lo que corresponde a la dosis de luz de 6 J/cm2.

Figura 14. Porcentaje de supervivencia celular relativa al control para varias concentraciones de Luzitina-F2Met en l�neas celulares de c�ncer humano pulmonar de c�lulas no peque�as despu�s de un tiempo de incubaci�n de 18 horas. El fotosensibilizador no internalizado se retir� antes de la irradiaci�n. Las c�lulas en medio de cultivo fueron irradiadas con l�ser a 748 nm durante 60 segundos, lo que corresponde a la dosis de luz de 6 J/cm2.

Figura 15. Fluorescencia de Luzitina-Cl2Et en concentraciones de 3, 26 nM (l�nea continua) y 0, 26 nM l�nea de puntos) en el suero humano utilizadas para determinar el l�mite de detecci�n. Tambi�n se indica la l�nea de base (l�nea discontinua y de puntos) y la curva de Gauss (l�nea de puntos) que se utilizan para simular la concentraci�n m�s baja para la determinaci�n precisa de la fluorescencia de baja intensidad.

Figura 16. Fluorescencia de Luzitina Cl-c dividida por el peso del h�gado, la sangre y el cerebro, respectivamente, en orden de intensidad, despu�s de la administraci�n intraperitoneal de 10 mg/kg en ratones DBA/2.

Figura 17. Farmacocin�tica y biodistribuci�n de Luzitina-Cl despu�s de la administraci�n intraperitoneal de 10 mg/kg en ratones DBA/2. La intensidad de la fluorescencia en varios tejidos (sangre, tumores, coraz�n, pulmones, h�gado, bazo, ri��n, intestino, m�sculo, y la piel) se normaliz� para sus respectivos pesos.

Figura 18. Fluorescencia de Lucizitina-Cl2Et dividida por el peso del tumor y la sangre, respectivamente, en orden de intensidad, despu�s de la administraci�n intraperitoneal de 10 mg/kg en ratones DBA/2.

Figura 19. Volumen de los tumores en ratones Balb/C con tumores CT26 implantados y tratados con Luzitina-FMet. La l�nea gruesa representa el tama�o medio del tumor en cuatro animales de control, en el que se administr� la Luzitina-FMet, pero no irradiada. Las l�neas delgadas representan distintos animales tratados con Luzitina-FMet y l�ser de 132 J/cm2 a 748 nm.

Figura 20. Tama�o de los tumores S91 implantados en ratones DBA 2 tratados con Luzitina-Cl2Et. Fueron empleadas dos dosis de l�ser a 748 nm.

Figura 21. Fluorescencia confocal de Luzitina-FMet 3 h despu�s de la aplicaci�n t�pica en el dorso de un cerdo miniatura. Excitaci�n multifot�nica a 744 nm; eliminaci�n completa del ruido, im�genes de fluorescencia en el plano generado por 6 im�genes, detector de 800 V @, abertura = 379 �m. El fotosensibilizador se difunde a trav�s de 50 micrones de la capa c�rnea (estrato c�rneo) y la epidermis.

Figura 22. Los espectros de absorci�n de Luzitina-FMet 3 h despu�s de la aplicaci�n t�pica en el dorso de un cerdo

miniatura obtenido mediante espectroscopia confocal. Las diversas l�neas corresponden a mediciones en diferentes partes de la muestra.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1. PROCESO DE S�NTESIS EN ESTADO S�LIDO PARA OBTENER BACTERIOCLORINAS CON SUSTITUYENTES SACADORES DE ELECTRODOS

Este ejemplo ilustra la amplia gama de bacterioclorinas que pueden sintetizarse por un m�todo caracterizado por la ausencia de un disolvente y de base, o en la que s�lo una porfirina y una hidrazida (ambas en estado s�lido) se utilizan como materiales de partida.

En una preparaci�n, mezclamos 60 mg (6, 8 x 10-5 moles) de 5, 10, 15, 20-tetraquis (2-trifluorometilfenil) porfirina con 500 mg (2, 7 x 10-3 moles) de p-tolueno sulfonilhidrazida, ambas en forma de polvo muy fino. Se a�adieron en un reactor al que se evacu� el aire, cerrado herm�ticamente en atmosfera de N2 y calentado a una temperatura superior a 100 �C durante varios minutos. Despu�s de enfriarse (temperatura ambiente), el s�lido se removi� y se a�adieron varias porciones de 250 mg (1, 4 x 10-3 moles) de p-tolueno sulfonilhidrazida hasta la desaparici�n completa de la banda de Soret de la porfirina. La bacterioclorina se extrajo con una peque�a cantidad de disolvente org�nico. El exceso de hidrazida se elimin� por filtraci�n r�pida en gel de s�lice (altura de la columna de 8 cm y un di�metro interno de 2, 5 cm) usando diclorometano/n-hexano como eluyente. Despu�s de la evaporaci�n del disolvente y recristalizaci�n en �ter diet�lico-pentano, se obtuvo un 90 % de CF3PhB con menos de 5% de clorina contaminante.

La RMN del producto aislado son los siguientes:

1H-RMN: (400, 13 MHz, CDCl3 δ ppm : 7, 47-7, 45 (m, 4H), 7.26-7.20 (m, 8H), 7, 15-7, 12 (m, 4H), 2, 42 (s, 4H), 2, 37 (s, 4H), -1, 27 (s, 2H).

EJEMPLO 2. PROCESO DE S�NTESIS EN ESTADO S�LIDO PARA OBTENER CLORINAS HALOGENADAS

Para la preparaci�n de 5, 10, 15, 20-tetraquis (2-fluorofenil-5-N-metilsulfamoilfenil) clorina, Luzitina- FMet-c, mezclamos 50 mg (4, 72 � 10 -5 mol) de 5, 10, 15, 20 -tetraquis (2-fluorofenil-5-N-metilssulfamoilfenil) porfirina 18 mg (9, 44 � 10-5 mol) de p-tolueno sulfonilhidrazida. El reactor fue evacuado de aire, cerrado herm�ticamente en atm�sfera de N2 y se calent� a una temperatura superior a 100 � C durante varios minutos. Despu�s de enfriar (temperatura ambiente), se removi� el s�lido con una peque�a cantidad de disolvente org�nico y el exceso de hidrazida se elimin� por filtraci�n r�pida en gel de s�lice usando acetato de etilo/hexano como eluyente. Se obtuvo una mezcla de clorina contaminado con aproximadamente 10 % de bacterioclorina. La mezcla de clorina y bacterioclorina se disolvi� en diclorometano y se oxid� a la correspondiente clorina por calentamiento a 50�C en presencia de aire.

Despu�s de la recristalizaci�n en �ter diet�lico/pentano se observ� un 90 % de Luzitina-FMet-c con menos de 1 % de contaminaci�n por bacterioclorina. La Figura 2 muestra el espectro de absorci�n del producto final.

EJEMPLO 3. PROCESO DE S�NTESIS EN ESTADO S�LIDO PARA OBTENCI�N DE BACTERIOCLORINAS HALOGENADAS

Este ejemplo describe un m�todo claro, sencillo, econ�mico y respetuoso con el medio ambiente para sintetizar bacterioclorinas amfif�licas halogenadas sin utilizar disolventes en un solo reactor.

La porfirina apropiada (en estado s�lido) y el a p-tolueno sulfonilhidrazida (en estado s�lido) se pulverizaron bien y se mezclaron completamente. A continuaci�n, fueron introducidas en un reactor y evacuadas en alto vac�o. El reactor se cerr� herm�ticamente y se mantuvo al vac�o o lavado repetidamente con un gas inerte. Por �ltimo, el reactor se calent� (70-200�C) durante 1-340 minutos, mientras permanec�a cerrado herm�ticamente. Una vez terminada la reacci�n y enfriado el reactor a temperatura ambiente, se obtiene la bacterioclorina correspondiente con un rendimiento del 90 %. Despu�s de una filtraci�n r�pida en una columna de gel de s�lice, se obtiene una bacterioclorina con menos del 5 % de clorina contaminante correspondiente.

Para la preparaci�n de 5, 10, 15, 20-tetraquis (2, 6-dicloro-3-N-etilsulfamoilfenil) bacterioclorina, Luzitina-Cl2Et, con este m�todo, mezclamos 50 mg (3, 8 x 10-5 mol) de 5, 10, 15, 20-tetraquis (2, 6-dicloro-3-sulfoetilfenil) porfirina con 188 mg (10-3 mol) de p-tolueno sulfonilhidrazida, el reactor se evacu� con una bomba Edwards, se cerr� herm�ticamente y se calent� el reactor a temperatura superior a 70 � C durante varios minutos. Una vez enfriado (a

temperatura ambiente) se retir� el s�lido con una peque�a cantidad de �ter diet�lico y se retir� el exceso de hidrazida mediante filtraci�n r�pida en gel de s�lice (altura de la columna de 4 cm y un di�metro interno de 2, 5 cm) usando acetato de etilo/�ter diet�lico como eluyente. El s�lido resultante despu�s de la evaporaci�n del disolvente se recristaliz� en �ter diet�lico/pentano, obteniendo un rendimiento del 90 % en Luzitina-Cl2Et. Los espectros de absorci�n en la Figura 3 revela la existencia de menos del 5 % de la clorina correspondiente. El coeficiente de absorci�n molar de �sta y de otras bacterioclorinas se muestra en la Tabla 1, corregidos para la cantidad de clorina a veces presentes en las muestras. La comparaci�n entre los espectros de la Figura 3 a continuaci�n con los de la Figura 2 de la patente PCT/EP2005/012212, tambi�n de la Universidad de Coimbra revela una reducci�n de por lo menos 10 veces de impureza de clorinas por medio de este nuevo m�todo de s�ntesis, que tambi�n es m�s econ�mico, menos trabajoso y nada perjudicial para el medio ambiente. La RMN y MS del producto aislado indican los siguientes valores:

1H-RMN ( 300 MHz, CDCl3 ) δ, ppm : 8, 42 (d, J = 8, 55 Hz, 4H, p-H), 7, 88 (d, J = 8, 55 Hz, 4H, m-H); 7, 84-7, 82 (m, 4H, β-H ), 5, 01 (m, 4H, N-H), 3, 91 ( s, 8H, β -H ), 3, 22 (m, 8H, CH2), 1, 24 (t, 12H, J = 6, 73 Hz, CH3), -1, 29 (s, 2H, NH).

MS: (MALDI-TOF ) m/z: 1322, 0 [M]+.

EJEMPLO 4. ATROPIS�MEROS DE BACTERIOCOLORINAS HALOGENADAS

Este ejemplo indica la existencia de atropis�meros estables de bacterioclorinas halogenadas y sulfonadas y la posibilidad de separarlas f�cilmente. Tambi�n indica que los atropis�meros polares tienen coeficientes de extinci�n elevados en el infrarrojo.

Usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, pero con una columna mayor (8 cm de altura, 2, 5 cm de di�metro interno) y con acetato de etilo/n-hexano (1: 1) como primer eluyente y acetato de etil/n-hexano (3: 1) como �ltimo eluyente, observamos la separaci�n de 5, 10, 15, 20-tetraquis (2, 6-dicloro-3-N-etilsulfamoilfenil) bacterioclorina, la Luzitina-Cl2Et en dos fracciones. Cada fracci�n mostr� dos manchas en TLC, que se identificaron

como una mezcla de atropis�meros menos polares αβαβ+α2β2 o de m�s polares βα3+α4. La Figura 4 muestra el espectro de absorci�n de la mezcla de atropis�meros de mayor polaridad. Esta fracci�n presenta un aumento del 50 % en ε a 750 nm de banda, que alcanza 150.000 M-1 cm-1.

EJEMPLO 5. ESTABILIDAD Y BACTERIOCLORINAS HALOGENADAS Y SULFONADAS EN FUNCI�N DEL pH

Este ejemplo demuestra la estabilidad de bacterioclorinas halogenadas y sulfonadas en pH 1 a 37�C, es decir, el grado de acidez del est�mago.

La Luzitina-Cl2 fue disuelta en una soluci�n acuosa neutra y equilibrada a 37�C para obtener un espectro de absorci�n indicado en la Figura 5. Se a�adieron gotas de soluci�n acuosa de HCl para disminuir el pH 1 y 2 horas m�s tarde, se registr� el espectro de absorci�n de Luzitina-Cl2 en pH 1. Seguidamente, se a�adi� NaOH en la soluci�n acuosa para neutralizar la soluci�n y despu�s de 3 horas se registr� de nuevo el espectro de absorci�n. La Figura 5 muestra los espectros de absorci�n corregidos para la diluci�n que se produjo por la adici�n de HCl y NaOH en soluci�n acuosa. Los cambios espectrales observados en pH bajo se deben a la protonaci�n del anillo pirr�lico, pero son reversibles con la neutralizaci�n de la acidez. En estas condiciones, se recupera casi la mitad de Luzitina-Cl2, y la otra mitad se convierte en la clorina correspondiente.

EJEMPLO 6. ESTABILIDAD DE BACTERIOCLORINAS HALOGENADAS Y SULFONADAS EN PRESENCIA DE LUZ

Este ejemplo demuestra la gran estabilidad de las bacterioclorinas halogenadas y sulfonadas cuando se irradian con luz infrarroja, que resuelve los problemas de inestabilidad propios de otras bacterioclorinas de origen sint�tico, como en el caso de 5, 10, 15, 20-tetraquis (3-hidroxifenil) bacterioclorina o derivados de productos naturales, tales como en el caso de Tookad�.

La Luzitina- FMet se disolvi� en PBS: metanol (02: 03), transferida a una celda de cuarzo de 1 cm y se registr� su espectro de absorci�n (Figura 6). Seguidamente, la celda de cuarzo se coloc� en el haz de l�ser de diodo Lynx de 748 nm inicialmente desenfocado con el fin de obtener un haz coincidente con el di�metro de la ventana de la celda de cuarzo. La potencia del l�ser medido bajo estas condiciones fue de 28, 8 mW. Cada 5 minutos, se interrump�a la irradiaci�n y se registraba un nuevo espectro de absorci�n. Este procedimiento se realiz� durante 65 minutos. El fotoblanqueo sigue la cin�tica de una reacci�n de primer orden en el intervalo de tiempo del experimento. La Figura 6 tambi�n muestra el espectro de absorci�n despu�s de la irradiaci�n. A medida que el pico de absorbancia de

bacterioclorina a 743 nm disminuy� de 1, 128 a 0, 337, la absorci�n de la clorina s�lo aument� de 0, 114 a 0, 151. Teniendo en cuenta los coeficientes de absorci�n molar de estos compuestos en estas longitudes de onda, se hace evidente que, mientras que el 70 % de bacterioclorina se destruye durante la irradiaci�n, s�lo se forma un peque�o porcentaje de clorina. Los productos restantes no presentan espectros bien resueltos en el rango visible/IR y el proceso de fotodegradaci�n dominante puede ser descrito como fotoblanqueo.

La vida media de fotoblanqueo se midi� a diferentes intensidades de l�ser y mostr� ser proporcional a la potencia del l�ser. Las vidas medias de otras bacterioclorinas normalizadas para la irradiaci�n l�ser de 100 mW a 748 nm se muestran en la Tabla 1, junto con los datos de la bibliograf�a referente a la fotodegradaci�n de Foscan� y de Tookad� normalizada para la misma intensidad de luz. Tambi�n se observ� que la vida media de Luzitina-Cl aumenta 30 veces m�s cuando la soluci�n del fotosensibilizador en PBS est� saturada con arg�n, lo que reduce la concentraci�n de ox�geno en la soluci�n. Esto indica la participaci�n de ROS en el fotoblanqueo.

EJEMPLO 7. GENERACI�N EFICIENTE DE OX�GENO SINGLETE POR LA LUZ

Este ejemplo describe la generaci�n eficiente de ox�geno singlete en presencia de Luzitinas, luz de longitud de onda apropiada y ox�geno molecular disuelto en la soluci�n.

Una soluci�n de Luzitina-Cl2Hep etanol saturada de aire con una absorbancia aproximada de 0, 2 a 355 nm fue excitada en una c�lula de cuarzo de 1 cm con un l�ser de Nd: YAG pulsado y la emisi�n de ox�geno singlete fue acompa�ada de 1270 nm utilizando equipos y m�todos descritos anteriormente. La intensidad de fluorescencia de ox�geno singlete se estudi� como una funci�n de la intensidad del l�ser. Un estudio similar se llev� a cabo con fenalenona en etanol, con una concentraci�n correspondiente a la absorbancia de Luzitina-Cl2Hep a 355 nm. La Figura 7 muestra la dependencia de la intensidad de fosforescencia de ox�geno singlete a 1270 nm en funci�n de la energ�a l�ser, despu�s de la excitaci�n Luzitina-Cl2Hep o de fenalenona a 355 nm en etanol saturado de aire. Se utilizaron diferentes energ�as l�ser, y a partir de la inclinaci�n de la curva de dependencia de la emisi�n de ox�geno singlete en funci�n de la energ�a del l�ser y del valor de ΦΔ= 0, 95 para la fenalenona en etanol obtuvimos ΦΔ= 0, 78 para la Luzitina-Cl2Hep. La Tabla 1 muestra los valores para otros bacterioclorinas.

La fotoestabilidad de estas bacterioclorinas, asociadas con su eficiencia cu�ntica de casi 70 % en la producci�n de ox�geno singlete, implica que una determinada mol�cula de bacterioclorina bajo irradiaci�n continua producir� localmente una cantidad muy grande de mol�culas de ox�geno electr�nicamente excitadas antes de someterse a fotoblanqueo. Casi el 30 % de la energ�a absorbida por el sensibilizador se pierde en otros procesos, algunos de los cuales se identifican en el siguiente ejemplo.

EJEMPLO 8. FOTOGENERACI�N DE ESPECIES REACTIVAS DE OX�GENO (ROS)

Este ejemplo describe la generaci�n de especies reactivas de ox�geno, reactivas, concretamente, el i�n super�xido y el radical hidroxilo utilizando Luzitina-CI como sensibilizador.

Con el fin de determinar la fotogeneraci�n del i�n super�xido y de radical hidroxilo por Luzitina-Cl, se midieron espectros de RPE en presencia de 30-80 �M de Luzitina-Cl y 40 mM de BMPO en las siguientes condiciones:

a) Soluci�n acuosa saturada con aire en la oscuridad.

b) Soluci�n acuosa saturada de nitr�geno e irradiada con l�ser de diodo de Hamamatsu durante 8 minutos.

c) Soluci�n acuosa saturada con aire e irradiada con el l�ser de diodo de Hamamatsu durante 4 minutos.

d) Soluci�n acuosa saturada de aire e irradiada con el l�ser de diodo de Hamamatsu durante 8 minutos.

e) Soluci�n acuosa saturada de aire e irradiada con el l�ser de diodo de Hamamatsu durante 16 minutos.

f) Soluci�n acuosa saturada de aire e irradiada con el l�ser de diodo Hamamatsu durante 16 minutos en presencia de super�xido dismutasa (50 mg / ml).

g) Soluci�n acuosa saturada de aire e irradiada con el l�ser de diodo Hamamatsu durante 16 minutos en presencia de catalasa (30 �g/ml).

En las condiciones experimentales (a) y (b) no se detect� el aducto ROS-BMPO. Sin embargo, las condiciones

experimentales (c), (d) y (e) llevaron a la detecci�n de un aducto BMPO formado entre BMPO y el radical hidr�xilo (Figura 8). La presencia de luz es necesaria para la formaci�n de este aducto. La condici�n experimental (f) no presenta signos, lo que significa que el super�xido dismutasa, enzima que cataliza la dismutaci�n del i�n super�xido, inhibe la formaci�n del aducto BMPO-hidroxilo. Adem�s, la condici�n experimental (g) tampoco mostr� signos y demuestra que la catalasa, enzima que degrada el per�xido de hidr�geno en agua y ox�geno molecular tambi�n inhibe la formaci�n del aducto BMPO-radical hidroxilo. Estos resultados indican que los radicales hidr�xilo no se forman directamente desde el fotosensibilizador y el ox�geno molecular, sino como subproductos. La inhibici�n observada en presencia del super�xido dismutasa ha demostrado la formaci�n de iones super�xido. La inhibici�n observada en presencia de catalasa sugiere que el per�xido de hidr�geno tambi�n es un precursor del radical hidroxilo.

Se realizaron experimentos similares con DMPO en DMSO. Detectamos el aducto DMPO-super�xido en presencia de aire y luz (Figura 8). Sin embargo, en ausencia de aire o de luz o en presencia de super�xido dismutasa, este aducto no fue observado.

Estos datos juntos indican la formaci�n de i�n super�xido, seguido por la formaci�n de per�xido de hidr�geno, y, posteriormente, del radical hidroxilo, que son especies reactivas de ox�geno muy bien caracterizadas en cuanto a la capacidad de causar da�os celulares. Estas ROS completan la eficacia de la formaci�n de ox�geno singlete del 70 % aproximadamente de estas bacterioclorinas y muestran que el 30 % restante de la energ�a absorbida por el sensibilizador no se pierde, sino que se utiliza en la formaci�n de otras especie citot�xicas adem�s de la de ox�geno singlete.

EJEMPLO 9. LA FOTOTOXICIDAD DE LUZITINA CI-c IN VITRO EN L�NEAS CELULARES DE MELANOMA DE RAT�N BAJO IRRADIACI�N CON L�MPARA NORMAL

Este ejemplo muestra que las Luzitinas son muy t�xicas para las c�lulas de melanoma de rat�n irradiadas con una l�mpara de hal�geno filtrada a concentraciones en las que su toxicidad en la oscuridad es insignificante.

La citotoxicidad en la oscuridad y la actividad fotosensibilizante de la Luzintina CI-c en la l�nea de c�lulas S91 (melanoma de rat�n) se midieron de acuerdo con los materiales y m�todos descritos anteriormente, excepto por el hecho, que despu�s de la incubaci�n, las c�lulas no se lavaron para eliminar el fotosensibilizador no internalizado antes de la irradiaci�n. El inserto en la Figura 9 muestra la citotoxicidad en la oscuridad de diferentes concentraciones de Luzitina-Cl-c durante el tiempo de incubaci�n de 120 minutos. La Figura 9 muestra la fracci�n de c�lulas S91 que sobreviven en diferentes dosis de luz cuando las c�lulas son irradiadas en presencia de [Luzitina-Clc]=20 �M. Las dosis de luz necesarias para matar el 90 % (LD90) o 50 % (DL50) de las c�lulas en cultivo se dan en la Tabla 3.

EJEMPLO 10. LA FOTOTOXICIDAD DE LA Luzitina-CI IN VITRO EN CARCINOMA HUMANO DE MAMA BAJO IRRADIACI�N CON L�MPARA NORMAL

Este ejemplo muestra que las Luzitinas son muy t�xicas para las c�lulas de carcinoma de mama humano cuando se irradian con una l�mpara de hal�geno filtrada, en concentraciones en las que su toxicidad en la oscuridad es insignificante.

La citotoxicidad en la oscuridad y la actividad fotosensibilizante de la Luzitina-CI en la l�nea celular MCF7 (carcinoma de mama humano) se midieron de acuerdo con los materiales y m�todos descritos anteriormente. El inserto de la Figura 10 muestra la citotoxicidad en la oscuridad de diferentes concentraciones de Luzitina-Cl en un tiempo de incubaci�n de 12 horas. La Figura 10 indica la fracci�n de c�lulas MCF7 que sobrevive a la presencia de [LuzitinaCl]=5 �M y varias dosis de luz. Claramente, la concentraci�n de 5 �M de Luzitina-CI caus� 100% de muerte en las c�lulas expuestas a la l�mpara de hal�geno filtrada de dosis 0, 6 J/cm2. Las dosis de luz necesarias para matar el 90 % (LD90) o 50 % (DL50) de las c�lulas en cultivo se dan en la Tabla 4.

EJEMPLO 11. LA FOTOTOXICIDAD DE LA Luzitina-Cl2 IN VITRO EN CARCINOMA HUMANOS DE PROSTATA IRRADIADO CON LASER

Este ejemplo muestra que las Luzitinas son muy t�xicas para las c�lulas de carcinoma de pr�stata humano cuando se irradian con l�ser a concentraciones en las que su toxicidad en la oscuridad es insignificante.

La citotoxicidad de la Luzitina-Cl2 en la oscuridad para la l�nea de c�lulas PC-3 (carcinoma de pr�stata humano) se midi� de acuerdo con los materiales y m�todos descritos anteriormente. De acuerdo con estos experimentos, 0, 05 mM es la mayor concentraci�n de Luzitina-Cl2 que causa relativamente pocos efectos en la viabilidad de las l�neas

celulares en el ensayo en la oscuridad. Esta ser� la concentraci�n de referencia en los siguientes estudios de fototoxicidad.

La actividad fotosensibilizante de la Luzitina-Cl2 en l�neas de c�lulas PC-3 se midi� de acuerdo con los materiales y m�todos descritos anteriormente. La fracci�n superviviente de c�lulas con dosis de luz 3 y 6 J/cm2 y un tiempo de incubaci�n 24 horas se muestran en la Figura 11 para diferentes concentraciones de este fotosensibilizador. De acuerdo con la Figura 11, la [Luzitina-Cl2]=20 �M causa un 100% de la muerte en las c�lulas expuestas a la dosis de luz l�ser de 6J/cm2.

EJEMPLO 12. LA FOTOTOXICIDAD DE LUZITINA-Cl2Et IN VITRO EN L�NEAS CELULARES DE CARCINOMA DE COLON DE RAT�N IRRADIADAS CON L�SER

Este ejemplo muestra que las Luzitinas son muy t�xicas para las c�lulas de carcinoma de colon en ratones cuando se irradian con l�ser a concentraciones en las que su toxicidad en la oscuridad es insignificante.

La citotoxicidad de la Luzitina-Cl2Et en la oscuridad para las l�neas de c�lulas CT26 (carcinoma de colon de rat�n) no se puede medir en t�rminos de IC50 porque el compuesto se precipita en medio del cultivo antes de alcanzar este nivel de citotoxicidad. La concentraci�n de 50 �M es la concentraci�n m�s alta de Luzitina-Cl2Et que causa un efecto relativamente peque�o sobre la viabilidad de esta l�nea celular en la oscuridad.

La actividad fotosensibilizante de la Luzitina-Cl2Et en l�neas de c�lulas CT26 se midi� de acuerdo con los materiales y m�todos descritos anteriormente. La fracci�n de c�lulas supervivientes a la dosis de luz de 6 J/cm2 y el tiempo de incubaci�n de 18 horas se muestra en la Figura 12 para diferentes concentraciones de este fotosensibilizador. Esta Figura indica que la Luzitina-Cl2Et a una concentraci�n de 5 �M causa un 90% de la muerte en las c�lulas expuestas a dosis de luz l�ser de 6 J/cm2, LD90 = 5 �M. De acuerdo con la Figura 12, la [Luzitina-Cl2] = 10 �M causa el 100 % de la muerte de las c�lulas expuestas a dosis de luz l�ser de 6 J/cm2. La Tabla 6 indica las concentraciones de Luzitina-Cl2Et necesarias para alcanzar la LD90 en varias otras l�neas celulares de irradiaci�n l�ser de diodo 6 J/cm2 a 28, 5 mW.

EJEMPLO 13. LAFOTOTOXICIDAD DE LUZITINA FMet IN-VITRO EN C�LULAS DE CARCINOMA HUMANO DE COL�N IRRADIADAS CON L�SER

Este ejemplo muestra que las Luzitinas son muy t�xicas para las c�lulas de carcinoma humano de colon irradiadas con l�ser, en concentraciones en las que su toxicidad en la oscuridad es insignificante.

La citotoxicidad de la Luzitina-FMet en la oscuridad para las l�neas de c�lulas HT-29 (adenocarcinoma humano de colon) no se pudo medir en t�rminos de CI50 porque el compuesto precipita en medio del cultivo antes de alcanzar este nivel de citotoxicidad. La concentraci�n de 50 �M es la concentraci�n m�s alta de Luzitina-FMet que causa relativamente poco efecto en la viabilidad de las l�neas celulares ensayadas en la oscuridad.

La actividad fotosensibilizante de la Luzitina-FMet en l�neas de c�lulas HT-29 se midi� de acuerdo con los materiales y m�todos descritos anteriormente. La fracci�n de c�lulas supervivientes a la dosis de luz de 6 J/cm2 y un tiempo de incubaci�n de 18 horas se muestran en la Figura 13 para diferentes concentraciones de este fotosensibilizador. Esta figura indica que la Luzitina-FMet en una concentraci�n de 0, 5 �M causa un 90 % de muerte en las c�lulas expuestas a dosis de luz l�ser de 6 J/cm2, LD90 = 1 �M. De acuerdo con la Figura 13, [Luzitina-FMet-] = 1 �M causa la muerte celular en el 100 % expuesto a una dosis de luz l�ser de 6 J/cm2. La Tabla 6 muestra las concentraciones de Luzitina-FMet necesarias para alcanzar LD90 en varias otras l�neas celulares de irradiaci�n l�ser de diodo 6 J/cm2 a 28, 5 mW.

EJEMPLO 14. LA FOTOTOXICIDAD DE LUZITINA -F2Met IN VITRO EN CARCINOMA PULMONAR HUMANO DE C�LULAS NO PEQUE�AS IRRADIADO CON L�SER

Este ejemplo muestra que las Luzitinas son muy t�xicas para c�lulas no peque�as de carcinoma humano de pulm�n cuando se irradia con l�ser en las concentraciones en que su toxicidad en la oscuridad es insignificante.

La citotoxicidad en la oscuridad Luzitina-F2Met para l�neas de c�lulas A-549 (c�ncer de pulm�n de c�lulas no peque�as) no se puede medir en t�rminos de IC50 porque el compuesto se precipita en el medio de cultivo antes de alcanzar este nivel de citotoxicidad. La concentraci�n de 50 mM es la concentraci�n m�s alta de Luzitina-F2Met que causa un efecto relativamente peque�o sobre la viabilidad de las l�neas celulares ensayadas en la oscuridad.

La fracci�n de c�lulas supervivientes a la dosis de luz de 6 J/cm2 y un tiempo de incubaci�n de 18 horas se muestran en la Figura 14 para diferentes concentraciones de este fotosensibilizador. Esta figura indica que la Luzitina-F2Met a una concentraci�n de 0, 5 mM causa un 90 % de muerte en las c�lulas expuestas a dosis de luz l�ser de 6 J/cm2, LD90 = 0, 5 �M. De acuerdo con la figura 14, [Luzitina-F2Met] = 0, 5 �M causa el 100 % de muerte en las c�lulas expuestas a dosis de luz l�ser de 6 J/cm2. La Tabla 6 muestra las concentraciones de Luzitina-F2Met necesario para alcanzar la LD90 en varias otras l�neas celulares con irradiaci�n l�ser de diodo 6 J/cm2 a 28, 5 mW.

EJEMPLO 15. L�MITE DE DETECCI�N DE FLUORESCENCIA

Este ejemplo muestra la sensibilidad extrema y selectividad de la detecci�n de Luzitinas en muestras biol�gicas.

Se prepararon soluciones de diferentes concentraciones diluyendo en suero humano una soluci�n stock de 1% de Luzitina-Cl2Et en etanol. Las concentraciones variaron de 0, 2 nM a 10 nM. Las muestras se excitaron a 514 nm en el espectrofluor�metro descrito anteriormente utilizando grietas 04: 05: 03: para la excitaci�n y la emisi�n. La emisi�n fue capturada en el rango infrarrojo, como se muestra en la Figura 15.

El l�mite de detecci�n se determin� mediante la ecuaci�n

donde Sy/x es la desviaci�n est�ndar de la curva de calibraci�n y b es su inclinaci�n. Se obtuvo el l�mite de detecci�n de 0, 17 nM (o 0, 2 ng/g).

EJEMPLO 16. TOXICIDAD IN VIVO EN LA OSCURIDAD

Este ejemplo indica que las Luzitinas no son t�xicas para los ratones a concentraciones mucho m�s altas que aquellas aprobadas para PDT con fotosensibilizadores disponibles en el comercio.

Los ratones se dividieron en los siguientes grupos:

a) 10 animales recibieron 2 mg/kg Luzitina –Cl

b ) 10 animales recibieron 5 mg/kg Luzitina-Cl

c ) 10 animales recibieron 10 mg/kg Luzitina-Cl

d ) 10 animales recibieron 15 mg/kg de Cl-Luzitina

e) 10 animales recibieron 20 mg/kg Luzitina-Cl

f ) 10 animales se dejaron sin tratar y formaron el grupo de control.

Las soluciones de Luzitina-Cl (0, 5 ml) fueron inyectadas por v�a subcut�nea y se observaron a los animales atentamente durante 30 d�as. En los primeros 6 d�as despu�s de la inyecci�n los animales del grupo (e) mostraban sensibilidad a la luz y algunos animales del grupo (d) tambi�n presentaban una peque�a sensibilidad. La sensibilidad de estos animales se manifest� en forma de aversi�n a la fuente de luz orientada directamente hacia ellos. Los animales se pesaron regularmente, pero no se observ� ning�n cambio significativo en el peso de alguno de ellos. Despu�s de 30 d�as, los animales fueron anestesiados con Morbital (Biowet, Polonia), se retiraron sus �rganos y muestras de tejido y se analiz� la morfolog�a de la sangre, as� como la histolog�a de los �rganos seleccionados. No se observ� cambio en la sangre ni en los �rganos.

Las dosis utilizadas en estos ensayos de toxicidad en la oscuridad fueron 10 veces mayores que las recomendadas para su uso en el caso de Photofrin � y 100 veces mayores que las dosis empleadas con Foscan�. No obstante, no se alcanz� el l�mite de toxicidad en la oscuridad medible en las ratas. Esto demuestra que se pueden utilizar dosis m�s altas de Luzitinas en PDT que las dosis de Photofrin� o Foscan�.

EJEMPLO 17. BIODISTRIBUCI�N DE LA CLORINA DESPU�S DE LA ADMINISTRACI�N IP

Este ejemplo indica que las Luzitinas pueden atravesar la barrera hematoencef�lica dos horas despu�s de la administraci�n intraperitoneal.

La Luzitina-Cl-c se administr� en una dosis de 10 mg/kg en ratones DBA/2 mediante inyecci�n intraperitoneal. La distribuci�n de clorina en los tejidos se examin� 2 h despu�s de la administraci�n. Los animales fueron anestesiados con Morbital (Biowet, Polonia) y algunos de sus �rganos, incluyendo el cerebro, se extirparon, se pesaron, y luego se almacenaron a -30�C hasta la ejecuci�n de an�lisis posteriores. El contenido de pigmentos en las muestras de tejido se analiz� por espectrometr�a de fluorescencia. Para extraer los pigmentos, las muestras de tejido se homogeneizaron durante 1 min en 7 ml de acetona acuosa a 90%, helada, usando un homogeneizador de tejidos MPW-120 (Medical Instruments, Polonia) a la velocidad de 10.000 rpm. El material homogeneizado se centrifug� a 2000 g durante 10 min a 4 �C, se recogi� el sobrenadante y el sedimento se extrajo de nuevo con acetona acuosa al 90 % para garantiza la recuperaci�n total del pigmento. Los extractos se reunieron y se analiz� su contenido en pigmentos. Las muestras se excitaron a 413 nm y los espectros de fluorescencia se registraron en un rango entre 600 y 800 nm. La Figura 16 muestra la intensidad de fluorescencia procedente del cerebro, la sangre y el h�gado, normalizada para sus respectivos pesos.

La distribuci�n del sensibilizador entre la sangre y el cerebro fue de 4: 1 dos horas despu�s de la administraci�n intraperitoneal en ratones DBA/2. Esta es una prueba del principio de que las Luzitinas apropiadas pueden cruzar la barrera hematoencef�lica en cantidades significativas para convertirse en un fotosensibilizador en el cerebro. El siguiente ejemplo demuestra que esta clase de sensibilizadores tiende a acumularse en los tumores, lo que aumenta el n�mero de fotosensibilizadores disponibles para el tratamiento de tumores cerebrales.

EJEMPLO 18. FARMACOCIN�TICA DE BACTERIOCLORINA DESPU�S DE LA ADMINISTRACI�N INTRAPERITONEAL

Este ejemplo muestra que las Luzitinas despu�s de la administraci�n intraperitoneal se acumulan principalmente en los tumores, y luego se eliminan a tasas m�s bajas.

El modelo de tumor utilizado fue el de c�lulas de melanoma Cloudman S91 cultivadas en monocapa en medio RPMI con un 5 % de suero fetal bovino completado con antibi�ticos. Las c�lulas se cultivaron a 37�C en atm�sfera humedecida con 5 % de CO2. Las c�lulas de melanoma (~ 1x106 ) se suspendieron en 0, 1 ml de soluci�n salina tamponada por fosfato (PBS) e implantadas por v�a subcut�nea en el lado derecho del dorso del animal. El tumor se pudo visualizar diez d�as despu�s de la implantaci�n. Los animales se trataron tres semanas despu�s de la inyecci�n.

La Luzitina-Cl se administr� a una dosis de 10 mg/kg en ratones DBA/ 2 mediante inyecci�n intraperitoneal. Se analiz� la distribuci�n tisular de la bacterioclorina en los siguientes intervalos: 2 h, 6 h, 12 h, 24 h y 48 h despu�s de la administraci�n intraperitoneal. Los animales fueron anestesiados con ketamina y xilazina, sus �rganos y muestras de tejidos se extirparon, se pesaron y se almacenaron a -30� C hasta realizar an�lisis posteriores. El contenido de pigmentos en las muestras de tejido se analiz� por espectrometr�a de fluorescencia. Para extraer los pigmentos, las muestras de tejido se homogeneizaron durante 1 min en 7 ml de soluci�n etanol/DMSO (75: 25), helada, usando un homogeneizador de tejidos MPW-120 (Medical Instruments, Polonia) a la velocidad de 10.000 rpm. El material homogeneizado se centrifug� a 2000 g durante 10 min a 4�C, se recogi� el sobrenadante y el sedimento se extrajo de nuevo con soluci�n de etanol: DMSO para garantizar la recuperaci�n completa del pigmento. Los extractos se reunieron y se analiz� su contenido en pigmentos. Las muestras se excitaron a 517 nm y los espectros de fluorescencia se registraron en el rango entre 600 y 850 nm. La Figura 17 muestra la intensidad de fluorescencia del tumor y de varios �rganos normalizada a sus respectivos pesos.

Existe una acumulaci�n significativa de este fotosensibilizador en el tumor un d�a despu�s de la administraci�n intraperitoneal, cuando alcanza una concentraci�n 3 veces superior de aquella en el m�sculo. Adem�s, la acumulaci�n en la piel es insignificante, lo que explica la ausencia de fotosensibilidad de los ratones en estudios de toxicidad en la oscuridad. Por �ltimo, el fotosensibilizador fue eliminado de la mayor�a de los �rganos en 24 h. Estas farmacocin�ticas son muy favorables para la selecci�n de la ventana temporal del tratamiento con PDT en la que los efectos secundarios se reducen y la eficacia del tratamiento alcanza el m�ximo.

Se realizaron estudios similares con otras Luzitinas y la Luzitina-Cl2Et mostr� una fuerte selectividad para el tumor en comparaci�n con aquellas para el m�sculo (Figura 18).

EJEMPLO 19. PDT DE CARCINOMA DE COLON EN RATONES Balb/C USANDO Luzitina-FMet

Este ejemplo indica que las Luzitinas promueven la regresi�n/necrosis del tumor cuando se exponen a la luz de

longitud de onda apropiada.

El modelo de tumor fue el carcinoma de colon de rat�n CT26 cultivado en monocapa en medio RPMI con un 5% de suero fetal bovino completado con antibi�ticos. Las c�lulas se cultivaron a 37 �C en atm�sfera humedecida y con 5 % de CO2. Las c�lulas de carcinoma (~ 1x106) se suspendieron en 0, 1 ml de soluci�n salida tamponada por fosfato (PBS) e implantadas por v�a subcut�nea en el lado derecho del dorso de los ratones Balb/C. El tumor creci� hasta alcanzar 5 mm de di�metro aproximadamente una semana despu�s de la implantaci�n. No se observ� ninguna necrosis espont�nea. El tratamiento se inici� cuando el tumor alcanz� 5 mm de di�metro en cada uno de los animales. El d�a que los tumores alcanzaron el tama�o para el tratamiento se inyect� en los ratones una dosis de 10 mg/kg de Luzitina-FMet en PEG400 por v�a intraperitoneal. 24 h despu�s de la inyecci�n, cuatro ratas se anestesiaron con cetamina y xilazina, y se trataron con el l�ser de diodo Hamamatsu de 748 nm descrito anteriormente a la tasa de fluencia de 100 mW/cm2 durante 22 minutos (fluencia total de 132 J/cm2). Otras cuatro ratas se dejaron sin tratar y sirvieron de control. Los ratones fueron controlados diariamente, dos mediciones ortogonales L y W (perpendicular a L) se hicieron en los tumores y sus respectivos vol�menes se calcularon por medio de la f�rmula V= LxW2/2 y se registraron.

La Figura 19 muestra el volumen relativo del tumor medido en diferentes d�as despu�s de ser irradiados con l�ser. Los tama�os de los tumores en los animales tratados son m�s peque�os que los tama�os medios de los tumores de los animales de control y en uno de los casos, el tumor ha desaparecido por completo.

EJEMPLO 20. PDT DE LAS C�LULAS DE MELANOMA EN RATONES DBA/2 USANDO Luzitina-Cl2Et

Este ejemplo indica que las Luzitinas promueven la regresi�n/necrosis del tumor cuando se exponen a la luz de la longitud de onda apropiada.

El modelo de tumor fue el de las c�lulas de melanoma Cloudman S91 cultivadas en monocapa en medio RPMI con un 5% de suero fetal bovino al que se a�adieron antibi�ticos. Las c�lulas se cultivaron a 37 �C en atm�sfera humedecida y con 5 % de CO2. Las c�lulas de melanoma (~ 1x106) se suspendieron en 0, 1 ml de soluci�n salina tamponada con fosfato (PBS) y se implantaron por v�a subcut�nea en el lado derecho del dorso de los ratones DBA/2. El tumor creci� hasta alcanzar 5 mm de di�metro aproximadamente una semana despu�s de la implantaci�n. No se observ� ninguna necrosis espont�nea. El tratamiento se inici� cuando el tumor alcanz� 5 mm de di�metro en cada uno de los animales. El d�a en que los tumores alcanzaron el tama�o para el tratamiento, se inyect� a los ratones una dosis de 10 mg/kg de Luzitina-Cl2Et en PEG400 por v�a intraperitoneal. 24 h despu�s de la inyecci�n, los ratones fueron anestesiados con cetamina y xilazina, inmovilizados en un soporte de pl�stico y luego tratados con diferentes dosis de luz con el l�ser de diodo Hamamatsu 748 nm descrito anteriormente. Pocos minutos despu�s de la irradiaci�n, la zona del tumor mostr� signos evidentes de necrosis, que se extendieron por toda la zona irradiada horas despu�s. Los ratones fueron controlados diariamente y el tama�o de los tumores se midi� y registr�. La Figura 20 muestra el tama�o del tumor medido en diferentes d�as despu�s de ser irradiados con l�ser. Se puede observar claramente que una sola sesi�n de tratamiento promovi� una regresi�n duradera del tumor.

EJEMPLO 21. FORMULACIONES PARA ADMINISTRACI�N T�PICA

Este ejemplo indica que la Luzitinas puede propagarse r�pidamente a trav�s de la piel cuando se aplican con una formulaci�n transd�rmica adecuada. Cuatro cerdos miniatura se utilizaron para probar la difusi�n a trav�s de la piel del fotosensibilizador Luzitina-FMet y evaluar los posibles efectos secundarios de formulaciones para la administraci�n t�pica.

En primer lugar, el fotosensibilizador se disolvi� en etanol absoluto (5 mg en 0, 556 ml). A continuaci�n, se a�adieron 1, 737 ml de propilenglicol y finalmente 0, 22 ml de Azone� y 0, 3 ml de agua. La mezcla se agit� vigorosamente en un mezclador de v�rtice y se mantuvo en un ba�o de ultrasonidos para facilitar la solubilizaci�n y despu�s se a�adi� a la base de gel compuesta de agua (76, 65 %), 96% de etanol (15 %), glicerina (6 %), trietanolamina (1, 35 %) y Carbopol 940 (1 %). La formulaci�n se mezcl� a fondo para lograr una buena homogeneizaci�n. En esta formulaci�n, la concentraci�n final del fotosensibilizador es de 0, 1% y de Azone� es de 4 %.

El tratamiento de los animales se ha descrito anteriormente. Las formulaciones se aplicaron a mano, protegidas con guantes quir�rgicos, en zonas determinadas de antemano y los animales estaban tranquilos bajo el efecto de la anestesia. Cada aplicaci�n abarc� una zona circular de aprox. 3 cm de di�metro con algunos mil�metros de espesor del gel. La aplicaci�n fue cubierta con un ap�sito oclusivo. En algunos animales, se repiti� el mismo procedimiento 3 horas m�s tarde en otra zona del dorso. En los animales, las formulaciones re retiraron 6 h despu�s de la aplicaci�n, el dorso del animal se limpi� y se le mantuvo con vida durante 10 d�as para una evaluaci�n adicional. Se

recogieron muestras de piel como fue descrito anteriormente. Cada muestra era aproximadamente rectangular con laterales de 2 cm y un espesor de 1 cm. Ninguno de los animales, particularmente el animal mantenido en vida, mostr� evidencia de efectos secundarios causados por la formulaci�n con o sin alguno de los sensibilizadores.

Despu�s de procedimiento de fijaci�n, cada muestra se cort� en rodajas para evaluarla en microscop�a de fluorescencia y microscop�a confocal. Se presenta un ejemplo representativo de las im�genes obtenidas de las muestras en la Figura 21. Las im�genes revelan que en el intervalo de 3 h de la aplicaci�n del gel, la Luzitina FMet se propag� a lo largo de la epidermis. La fluorescencia de Luzitina-FMet tambi�n fue confirmada por su espectro de absorci�n indicado en la Figura 22. Por lo tanto, se puede obtener una composici�n para aplicaci�n t�pica de Luzitinas que se difunde a trav�s de la capa c�rnea de la epidermis en unas horas, lo cual es muy conveniente para PDT de trastornos cut�neos.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para sintetizar un derivado de clorina o bacterioclorina que tiene la siguiente f�rmula:

F�rmula (I) 5 en la que : representa un enlace carbono-carbono simple o doble ;

X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 son cada uno, hal�genos (F, Cl, Br) y �tomos de hidr�geno seleccionados independientemente, siempre que simult�neamente X2, X4, X6, y X8 o que simult�neamente X1, X3, X5 y X7 sean hal�genos, o que todos los X sean hal�genos ;

10 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 se seleccionan independientemente entre H, -OH y -SO2R, en el que cada R se selecciona independientemente entre - Cl, -OH, -amino�cido, -ORn, -NHRn y -NR2n -, donde Rn es un alquilo con 1 a 12 �tomos de carbono;

Y es un �tomo de fl�or o hidr�geno;

incluyendo el paso siguiente:

15 (i) La reducci�n en estado s�lido de la porfirina substituida correspondiente en derivado y clorina o de bacterioclorina usando hidrazidas en ausencia de disolventes y opcionalmente en ausencia de bases; en el que la porfirina sustituida correspondiente tiene la f�rmula :

F�rmula (II).
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicaci�n 1 para la s�ntesis de un derivado de clorina o de bacterioclorina con la siguiente f�rmula:

F�rmula (III) 5 en la que : representa un enlace carbono-carbono simple o doble; X2 se seleccionan a partir de hal�genos (F, Cl, Br), X1 se selecciona entre hidr�geno o hal�geno (F, Cl, Br) y R' son -SO2R;

R se seleccionan cada uno independientemente entre - Cl, -OH, -amino�cido, -ORn, -NHRn y -NR2n, donde Rn es un 10 radical alquilo que tiene de 1 a 12 �tomos de carbono;

incluyendo el siguiente paso:

(i) La reducci�n en estado s�lido de la porfirina substituida correspondiente en derivado de clorina o de bacterioclorina usando hidrazidas en ausencia de disolventes y opcionalmente en ausencia de bases, en el que la porfirina substituida correspondiente tiene la f�rmula:

15

F�rmula (IV).

40

600 650 700 750 800 850 900 λ (nm)

Figura 1

300 400 500 600 700 800 λ (nm)

Figura 2

Figura 3 Figura 4

Figura 5

Figura 6

01234567 Intensidad del l�ser (mJ/pulso)

Figura 7 Figura 8

Tiempo de irradiaci�n (min)

Fracci�n de c�lulas supervivientes con luz

Dosis de luz (J/cm2)

Figura 9

Tiempo de irradiaci�n (min) 0 5 10 1520

Fracci�n de c�lulas supervivientes con luz

Dosis de luz (J/cm2)

Figura 10

Figura 11

Figura 12 Figura 13

0 0.5 1 1.5 2 [Luzitina-F Met], �M

Figura 14 6 105

5 105

4 105

3 105

2 105

1 105

λ (nm)

Intensidad de fluorescencia (unidades arbitrarias)

Figura 15 1000

Intensidad de fluorescencia

800 600 400 200 0

λ (nm)

Figura 16 500

Tiempo (horas)

Intensidad de Fluorescencia

Figura 17

35 30

Intensidad de Fluorescencia

25 20 15 10 5 0

λ (nm)

Figura 18

Volumen del tumor, mm2

[Luzitina-FMet]=10 mg/kg en ratones Balb/C con tumor CT26 implantado 1400 1200 1000 800

600 400 200 0

D�as

Figura 19

[Luzitina-C l Et]=10 mg/kg en rat�n DBA/2 con tumor S91 implantado
2.5

Tama�o del tumor, cm

1.5 1
0.5 0

D�as

Figura 20

Figura 21 Figura 22