ES2458301T3 - Celulasas mejoradas - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión de celulasa que comprende una primera secuencia de aminoácidos de un núcleo de celulasa, que es la celulasa 20 K de Melanocarpus albomyces de SEC ID Nº: 2 o una modificación de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la deleción de Ala en la posición 207, la deleción de Val en la posición 208, la sustitución de Phe209Trp y la inserción de Pro después de la posición 206, y una segunda secuencia de aminoácidos de un engarce y dominio de unión a celulosa, CBD, que es el engarce y el CBD de la celobiohidralasa I de Trichoderma reesei de SEC ID Nº: 4, o una modificación de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la sustitución de tirosina en la posición 492, posición 31 del CBD, 493, 10 posición 32 del CBD, de la CBHI madura de T. reesei con un aminoácido alifático o aromático, y las deleciones de los aminoácidos 434 a 444 o 434 a 460 de la secuencia de la CBHI madura de T. reesei, en la que dicha primera secuencia de aminoácidos y dicha segunda secuencia de aminoácidos están conectados por una región de unión que tiene la fórmula: 1Val - 2Gln - 3Ile - 4Pro - 5Ser - 6Ser, o 1Gly - 2Glu - 3Ille - 4Gly - 5Ser

Description

Celulasas mejoradas.

Campo de la invención

La presente invencion se refiere a nuevas proteinas de fusion de celulasa, a preparaciones y a composiciones que contienen estas proteinas de fusion de celulasa, a vectores de expresion, a celulas hospedadoras y a metodos para su preparacion y a usos de las celulasas, a preparaciones y composiciones en la industria textil, de detergentes y de pasta y papel.

Antecedentes de la invención

La celulosa es un polisacarido lineal de restos de glucosa unidos por enlaces 1-1,4. En la naturaleza, la celulosa esta normalmente asociada con lignina junto con hemicelulosas, tales como xilanos y glucomananos. Las enzimas celuloliticas hidrolizan celulosa y son producidas por una amplia diversidad de bacterias y hongos. Las celulasas son enzimas importantes desde el punto de vista industrial con un valor comercial anual actual de aproximadamente 190 millones de dolares americanos. En la industria textil, las celulasas se usan en el acabado de tela vaquera para crear un aspecto moderno de lavado a la piedra en ropa de tela vaquera en un proceso de biolavado a la piedra (biostoning) y tambien se usan, por ejemplo, para eliminar pelusa y prevenir la acumulacion de fibra en la superficie de prendas de algodon. En la industria de detergentes las celulasas se usan para realzar los colores y para prevenir el agrisado y la acumulacion de fibra en la superficie del tejido de las prendas (pilling). Adicionalmente las celulasas se usan en la industria alimentaria y en la fabricacion de piensos animales, y tienen un gran potencial en la industria de la pasta y del papel, por ejemplo, en destintado para eliminar la tinta de las superficies de la fibra y en la mejora del drenaje de la pasta. El amplio espectro de usos industriales de las celulasas ha establecido una necesidad de productos comerciales de celulasa que contienen diferentes componentes de celulasa y que actuan optimamente a diferentes intervalos de pH y temperatura.

El uso practico de las celulasas es complicado por la naturaleza de las celulasas conocidas, que a menudo son mezclas de celulasas que tienen una diversidad de actividades y especificidades por sustratos. Por esta razon, se han realizado esfuerzos para obtener celulasas que solo tengan las actividades deseadas. Las propiedades exclusivas de cada celulasa hacen que algunas sean mas adecuadas para determinados fines que otras. Aunque las enzimas difieren de diversas formas, una de las diferencias mas importantes es el pH optimo. Las celulasas neutras son mas activas en el intervalo de pH de 6-8 y las celulasas alcalinas en el intervalo de pH de 7,5-10, mientras que las celulasas acidas, con un pH optimo de 4,5-5,5, muestran niveles de actividad muy bajos a valores de pH mas elevados. Las celulasas neutras y acidas son especialmente utiles en la industria textil. En el tratamiento de tejidos las celulasas atacan a las cadenas de las moleculas de celulosa que forman las fibras de algodon, afectando de esta manera a las caracteristicas del tejido.

En la industrial textil, el aspecto "lavado a la piedra" o aspecto desgastado ha suscitado interes en los productores de tela vaquera en los ultimos aros. El lavado a la piedra tradicional con piedra pomez reduce la resistencia del tejido y sobrecarga las lavadoras. La tendencia se ha dirigido a procesos de acabado enzimaticos de tela vaquera y las celulasas han reemplazado o se estan utilizando junto con la piedra pomez para dar a los tejidos este aspecto "usado" deseado. El tratamiento enzimatico controlado perjudica menos a las prendas y a las lavadoras y elimina la necesidad de utilizar piedra.

Las celulasas aplicadas en el tratamiento de tela vaquera se dividen normalmente en dos grupos principales: celulasas acidas y neutras. Las celulasas acidas actuan tipicamente en un intervalo de pH de 4,5 a 5,5 y las celulasas neutras en un intervalo de pH de 6 a 8. Las celulasas acidas utilizadas en el biolavado a la piedra proceden principalmente de Trichoderma reesei (forma sexual de Hypocrea jecorina) y las celulasas neutras proceden de una variedad de hongos, que incluyen los generos Melanocarpus, Humicola, Thielavia, Myceliophthora, Fusarium, Acremonium y Chrysosporium (Haakana et al. 2004). Las enzimas de T. reesei incluyen, por ejemplo, celulasas de glucosido de la familia 5 (endoglucanasa II, EGII), familia 7 (celobiohidrolasa I, CBHI) y familia 12 (endoglucanasa III, EGIII; Ward et al. 1993) y las celulasas neutras, mas frecuentemente endoglucanasas, de la familia 45 y la familia 7 (Henrissat, 1991; Henrissat y Bairoch, 1993).

Las celulasas comprenden un dominio/nucleo (CO) catalitico que expresan actividad celulasa. Ademas del dominio catalitico la molecula de celulasa puede comprender uno o mas dominios de union a celulosa (CBO, Cellulose Binding Domain), denominados tambien dominios/modulos de union a carbohidratos (CBO/CBM), que pueden estar localizados en el extremo N o en el extremo C del dominio catalitico. Los CBO tienen actividad de union a carbohidratos e intervienen en la union de la celulasa con la celulosa cristalina pero tienen escaso o ningun efecto sobre la actividad hidrolitica celulasa de la enzima en sustratos solubles. Estos dos dominios estan tipicamente conectados mediante una region engarzadora flexible y altamente glucosilada.

Las celulasas que ejercen su accion atacando principalmente a la superficie de la fibra, son especialmente utiles en el lavado a la piedra de la tela vaquera terida con colorante indigo, ya que el colorante se localiza en la superficie de la fibra. Cuando se utilizan para tratar el tejido de algodon, las celulasas neutras generalmente requieren un tiempo de lavado mas prolongado que las celulasas acidas. Sin embargo, las celulasas neutras tienen una accion menos agresiva sobre el algodon que las celulasas acidas, y no afectan a la resistencia del tejido tanto como las celulasas acidas. Las celulasas neutras tienen un perfil de pH mas amplio y por tanto el aumento de pH que se produce durante el biolavado a la piedra tiene escaso efecto sobre la actividad de enzimas celulasas neutras. Sin embargo, dado que los tratamientos con celulasa tambien tienen efectos no deseables, tales como, la produccion de daros a la fibra y la perdida de resistencia, debe buscarse un equilibrio adecuado entre los efectos deseados y no deseados.

El documento W097/14804 describe tres nuevas celulasas neutras procedentes de Melanocarpus, que son especialmente utiles en la industria textil y de detergentes. Especialmente se describe una endoglucanasa de 20 kOa (Cel45A), una endoglucanasa de 50 kOa (Cel7A) y una celobiohidrolasa de 50 kOa (Cel7B). En el presente documentos, estas celulasas se denominan "celulasa 20K", "celulasa 50K" y "celulasa B 50K", respectivamente, derivan de Melanocarpus albomyces y presentan buenos efectos de lavado a la piedra.

Oadas las exigencias existentes, especialmente en la industria textil y de detergentes, de celulasas adicionales mejoradas, se ha sugerido que, formando proteinas de fusion, podrian obtenerse mejoras en las celulasas. Ademas, en el documento W097/14804 se sugieren, en lineas generales, construcciones de proteinas de fusion de celulasa 20K, celulasa 50K y celulasa B 50K con, por ejemplo, celulasa, hemicelulasa o manasa de Trichoderma reesei o dominios funcionales de las mismas. Ademas, para crear nuevas propiedades para las celulasas descritas, se sugieren fusiones de las celulasas descritas con dominios, tales como dominios de union a celulosa (CBO), preferentemente con su engarce. Sin embargo, no se proporcionan ejemplos especificos, ni se describen las nuevas propiedades en cuestion.

Las proteinas de fusion de celulasa tambien se conocen, por ejemplo, del documento W096/29397, que desvela endoglucanasas formadas por una fusion entre endoglucanasas de Myceliophthora thermophila, de Macrophomina phaseolina y de Crinipellis scabella y el CBO/engarce de Humicola insolens. Oichas endoglucanasas, en su forma natural, no tienen un CBO/engarce.

El documento EP 663 950 desvela variantes de celulasa, especialmente variantes de celulasa de 43 kOa de Humicola insolens, en las que la celulasa puede incluir una region engarzadora de otra especie de microorganismo, por ejemplo, para proporcionar propiedades mejoradas, tales como resistencia mejorada a tensioactivos anionicos, a oxidacion o a agentes blanqueantes.

Sin embargo, existe una necesidad continua de celulasas mejoradas que tambien sean menos darinas para la fibra en la industria textil y en otros campos donde se utilizan tradicionalmente celulasas. En particular, existe una necesidad continua de celulasas que sean mas eficaces para mejorar la economia de los procesos.

La presente invencion tiene la intencion de satisfacer esta necesidad.

Breve descripción de la invención

Un objeto de la presente invencion es proporcionar nuevas proteinas de fusion de celulasa que tengan propiedades hidroliticas mejoradas para su uso en la industria textil, especialmente en el lavado a la piedra de tela vaquera, y para su uso en composiciones de detergentes, asi como en otros campos. Las nuevas proteinas de fusion de celulasa de invencion son activas a valores de pH neutros y alcalinos, tienen un resultado de lavado altamente mejorado en aplicaciones textiles de bioacabado y biolavado a la piedra y en aplicaciones de detergentes, e incluso no comprometen la resistencia de los tejidos. Con la eficacia mejorada de las proteinas de fusion de celulasa de la invencion, el proceso de fabricacion de las enzimas es significativamente mas economico. Se consiguen ventajas adicionales, tambien en cuanto a logistica y conservacion de los productos enzimaticos, ya que se requieren menores cantidades del producto enzimatico.

Un objeto adicional de la presente invencion es proporcionar polinucleotidos que codifiquen a las nuevas proteinas de fusion de celulasa de la presente invencion.

Un objeto adicional de la presente invencion es proporcionar nuevos plasmidos de expresion o vectores que contengan dichos polinucleotidos, utiles para la produccion de las nuevas proteinas de fusion de celulasa de la presente invencion y nuevos hospedadores transformados con dichos plasmidos de expresion.

Un objeto adicional de la presente invencion es proporcionar preparaciones enzimaticas, que contengan una o mas nuevas proteinas de fusion de celulasa que tengan propiedades hidroliticas mejoradas.

Un objeto aun adicional de la presente invencion es proporcionar metodos de uso de las preparaciones enzimaticas y de las proteinas de fusion de celulasa para el acabado de textiles, especialmente para el biolavado a la piedra de tela vaquera.

Un objeto todavia adicional de la presente invencion es proporcionar medios para el uso de las preparaciones enzimaticas de la invencion en composiciones de detergentes.

La presente invencion se refiere a una nueva proteina de fusion de celulasa que comprende:

A. una primera secuencia de aminoacidos opcionalmente modificada de un nucleo de celulasa derivado de una especie, y

B. una segunda secuencia de aminoacidos opcionalmente modificada de un engarce y/o dominio de union a celulosa (CBO) derivado de otra especie,

en la que entre dicha primera secuencia de aminoacidos y dicha segunda secuencia de aminoacidos se ha introducido una region de union, mediante la cual se obtiene una proteina de fusion estable. La proteina de fusion de la invencion comprende una primera secuencia de aminoacidos de un nucleo de celulasa, que es la celulasa de 20 K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2 o una modificacion de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la delecion de Ala en la posicion 207, la delecion de Val en la posicion 208, la sustitucion de Phe209Trp y la insercion de Pro despues de la posicion 206, y

una segunda secuencia de aminoacidos de un engarce y un dominio de union a celulosa (CBO), que es el engarce y el CBO de la celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei de SEC IO N°: 4, o una modificacion de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la sustitucion de tirosina en la posicion 492 (posicion 31 del CBO), posicion 493 (posicion 32 del CBO) de la CBHI madura de T. reesei con un aminoacido alifatico o aromatico y las deleciones de los aminoacidos 434 a 444 o 434 a 460 de la secuencia de la CBHI madura de T. reesei,

en la que dicha primera secuencia de aminoacidos y dicha segunda secuencia de aminoacidos estan conectadas mediante una region de union que tiene la formula:

1Val -2Gln - 3Ile - 4Pro - 5Ser -6Ser, o 1Gly -2Glu - 3Ile - 4Gly -5Ser.

La presente invencion tambien se refiere a un vector de expresion que comprende una primera secuencia de polinucleotidos que codifica una primera secuencia de aminoacidos opcionalmente modificada de un nucleo de celulasa derivado de una especie, una segunda secuencia de polinucleotidos que codifica una segunda secuencia de aminoacidos opcionalmente modificada de un engarce y/o dominio de union a celulosa (CBO) derivado de otra especie, y un polinucleotido que codifica una region de union y que conecta dicha primera y segunda secuencia de polinucleotidos, codificando dichas secuencias de polinucleotidos las secuencias de aminoacidos respectivas de las proteinas de fusion de celulasa de la invencion. El vector de expresion de la invencion comprende una secuencia de polinucleotidos que codifica una primera secuencia de aminoacidos de un nucleo de celulasa, que es la celulasa de 20 K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2 o una modificacion de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la delecion de Ala en la posicion 207, la delecion de Val en la posicion 208, la sustitucion de Phe209Trp y la insercion de Pro despues de la posicion 206, y una secuencia de polinucleotidos que codifica una segunda secuencia de aminoacidos de un engarce y un dominio de union a celulosa (CBO), que es el engarce y el CBO de la celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei de SEC IO N°: 4, o una modificacion de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la sustitucion de tirosina en la posicion 492 (posicion 31 del CBO), posicion 493 (posicion 32 del CBO) de la CBHI madura de T. reesei con un aminoacido alifatico o aromatico y las deleciones de los aminoacidos 434 a 444 o 434 a 460 de la secuencia de la CBHI madura de T. reesei, y una secuencia de polinucleotidos que codifica una region de union que conecta dicha primera y segunda secuencia de aminoacidos, teniendo dicha region de union la formula:

1Val -2Gln - 3Ile - 4Pro - 5Ser -6Ser, o 1Gly -2Glu - 3Ile - 4Gly -5Ser.

La presente invencion tambien se refiere a nuevos hospedadores transformados con los vectores de la invencion, especialmente hospedadores que pueden realizar una expresion a alto nivel de la proteina de fusion de celulasa de la invencion.

Adicionalmente, la presente invencion se refiere a una preparacion enzimatica que contiene una o mas proteinas de fusion de celulasa de la invencion.

Adicionalmente, la presente invencion se refiere a un metodo para el uso de las preparaciones enzimaticas de la invencion para el acabado de textiles, especialmente para el biolavado a la piedra de tela vaquera.

La presente invencion tambien se refiere al uso de las preparaciones enzimaticas de la invencion en composiciones de detergentes.

Dibujos

La Fig. 1 es el mapa esquematico del plasmido pALK1480.

La Fig. 2 es el mapa esquematico del plasmido pALK492.

La Fig. 3 es el mapa esquematico del plasmido pALK424.

La Fig. 4 es el mapa esquematico del plasmido pALK1237.

La Fig. 5 es el mapa esquematico del plasmido pALK1241.

La Fig. 6 es el mapa esquematico del plasmido p3SR2.

La Fig. 7 es el mapa esquematico del plasmido pALK1649.

La Fig. 8 es el mapa esquematico del plasmido pALK1694.

Fig. 9A. Casete de expresion usado en la transformacion de protoplastos de Trichoderma reesei para producir las proteinas de fusion 20K+CBO. El gen 20K+CBO esta bajo el control del promotor cbh1 (cel7A) (prom cbh1) y la terminacion de la transcripcion se garantiza usando la secuencia terminadora (term) cbh1. Se incluyeron, el gen amdS (amdS) y la region 3' flanqueante de cbhI (3' flanqueante cbhl). Fig. 9B. Secuencia de aminoacidos de un punto de union en el cual la proteina de 20K de Melanocarpus albomyces (Cel45A) se fusiona con el peptido engarzador de la CBHI de Trichoderma reesei (Cel7A) seguido por el dominio de union a celulosa (CBO) en los plasmidos pALK1434 y pALK1435. Los aminoacidos incluidos en la region de engarce se indican subrayados y la secuencia de aminoacidos de la region CBO se indica en cursiva. El primer aminoacido de la region CBO se indica con un numero superindice.

Fig. 10A. Casete de expresion usado en la transformacion de protoplastos de Trichoderma reesei para producir las proteinas de fusion 20K+CBO. El gen 20K+COB esta bajo el control del promotor cbh1 (cel7A) (prom cbh1) y la terminacion de la transcripcion se garantiza usando la secuencia terminadora (term) cbh1. Se incluye el gen amdS (amdS) y la region 3' flanqueante de cbhI (3' flanqueante cbhl). Fig. 10B. Secuencia de aminoacidos de un punto de union en el cual la proteina de 20K de Melanocarpus albomyces (Cel45A) se fusiona con el peptido engarzador de la CBHI de Trichoderma reesei (Cel7A) seguido por el dominio de union a celulosa (CBO) en los plasmidos pALK1768, pALK1769, pALK1770 y pALK1775. Los aminoacidos incluidos en la region de engarce se indican subrayados y la secuencia de aminoacidos de la region CBO se indica en cursiva. El primer aminoacido de la region CBO se indica con un numero superindice.

Fig. 11A. Casete de expresion usado en la transformacion de protoplastos de Trichoderma reesei para producir la proteina de fusion 20K+CBOmut. El gen 20K+CBOmut esta bajo el control del promotor cbh1 (cel7A) (prom cbh1) y la terminacion de la transcripcion se garantiza usando la secuencia terminadora (term) cbh1. El gen amdS se incluyo como un marcador de transformacion. Fig. 11B. Secuencia de aminoacidos de un punto de union en el cual la proteina de 20K de Melanocarpus albomyces (Cel45A) se fusiona con el peptido engarzador de la CBHI de Trichoderma reesei (Cel7A) seguido por el dominio de union a celulosa (CBO). Tambien se presentan las sustituciones de aminoacidos en la region CBO de los casetes de expresion pALK1877 - pALK1880. Los aminoacidos incluidos en la region de engarce se indican subrayados, y la secuencia de aminoacidos de la region CBO se indica en cursiva. El primer aminoacido y los restos de tirosina o sus sustituciones en la region CBO se indican con numeros superindice.

Fig. 12A. Secuencia de aminoacidos del peptido engarzador interdominio de la CBHI de T. reesei (Cel7A). Los aminoacidos incluidos en la region de engarce se indican subrayados. "G-444 y "G-460 representan la delecion de engarce de los restos 434-444 y 434-460, respectivamente. Fig. 12B. Secuencia de aminoacidos de un punto de union en el cual la proteina 20K de Melanocarpus albomyces (Cel45A) se fusiona con el peptido engarzador truncado de la CBHI de Trichoderma reesei (Cel7A) seguido por el dominio de union a celulosa (CBO) intacto o mutado en los casetes de expresion pALK1893, pALK1896, pALK1899 y pALK1952. Los aminoacidos incluidos en la region de engarce se indican subrayados, y la secuencia de aminoacidos de la region CBO se indica en cursiva. El primer aminoacido y los restos de tirosina o sus sustituciones en la region CBO se indican con numeros superindice.

Fig. 13A. Casete de expresion usado en la transformacion de protoplastos de Trichoderma reesei para la produccion de la proteina de fusion 50K+CBO. El gen 50K+CBO esta bajo el control del promotor cbhI (prom cbh1) y la terminacion de la transcripcion se garantiza con la adicion del terminador (term) cbhI. Se incluyen el gen amdS (amdS) y la region 3' flanqueante cbhI (3' cbhl). Fig. 13B. Secuencia de aminoacidos del punto de union de la proteina de 50K de M. albomyces unida al engarce+CBO de la CBHI de T. reesei. Los aminoacidos incluidos en la region de engarce se indican subrayados, y la secuencia de aminoacidos de la region CBO se marca en cursiva. El primer aminoacido de la region CBO se indica con un numero superindice.

Fig. 14A. Casete de expresion usado en la transformacion de protoplastos de Trichoderma reesei para la produccion de la proteina de fusion 50KB+CBO. El gen 50KB+CBO esta bajo el control del promotor cbhI (prom cbhl) de T. reesei y la terminacion de la transcripcion se garantiza con la adicion del terminador (term) cbhI. Se incluyen el gen amdS (amdS) y la region 3' flanqueante cbhI (3' cbhl). Fig. 14B. Secuencia de aminoacidos del punto de union de la proteina de 50KB de M. albomyces unida al engarce+CBO de la CBHI de T. reesei. Los aminoacidos incluidos en la region de engarce se indican subrayados, y la secuencia de aminoacidos de la region CBO se marca en cursiva. El primer aminoacido de la region CBO se indica con un numero superindice.

Fig. 15A. Casete de expresion usado en la transformacion de protoplastos de Trichoderma reesei para la produccion de la proteina de fusion CBHI+CBO de Thermoascus aurantiacus. El gen CBHI+CBO esta bajo el control del promotor cbh1 (cel7A) (prom cbh1) y la terminacion de la transcripcion se garantiza usando la secuencia terminadora (term) cbh1. Se incluyo el gen amdS como marcador de transformacion. Fig. 15B. Secuencia de aminoacidos de un punto de union en el cual la proteina CBHI de Thermoascus aurantiacus se fusiona con el peptido engarzador de la CBHI de Trichoderma reesei seguido por el dominio de union a celulosa (CBO). Los aminoacidos incluidos en la region de engarce se indican subrayados y la secuencia de aminoacidos de la region CBO se marca en cursiva. El primer aminoacido de la region CBO se indica con un numero superindice.

Fig. 16. Rendimiento de las cepas RF5977 y RF6090 que expresan las proteinas de fusion de la invencion comparado con el de una preparacion 20K comercial en el tratamiento de tela vaquera. Aumento de luminosidad en funcion de la dosificacion enzimatica en las condiciones de lavado descritas en los Ejemplos 8 y 9.

Fig. 17. Efecto de las proteinas de fusion 20K+CBO y de preparaciones enzimaticas comerciales correspondientes sobre la resistencia del tejido de tela vaquera. Fig. 17A. Resistencia al desgarro (N), urdimbre. Fig. 17B. Resistencia al desgarro (N), trama.

Fig. 18. Muestra el efecto eliminador de acumulacion de fibra en la superficie del tejido (pilling) de la proteina de fusion 20K+CBO.

Fig. 19. Ilustra el rendimiento de la proteina de fusion 20K+CBO en la aplicacion de detergentes. La figura muestra la diferencia comparativa de color entre el articulo 224 contra el agrisado lavado con o sin la enzima, y el articulo original (no lavado); A. a 40 °C y B. a 60 °C.

Fig. 20. Ilustra el rendimiento de la proteina de fusion 20K+CBO en la aplicacion de detergentes. La figura muestra la diferencia comparativa de color entre el articulo 224 contra el agrisado lavado con la enzima y sin la enzima; A. a 40 °C y B. a 60 °C.

Descripción detallada de la invención

La presente invencion se basa en intentos para mejorar adicionalmente celulasas neutras, en particular los descritos en el documento W097/14804, cuyo objetivo es reducir la perdida de la resistencia del tejido en el tratamiento enzimatico. En algunas aplicaciones, la celulasa 20K ha demostrado propiedades no deseables en relacion con la resistencia de la fibra, posiblemente debido al pequero tamaro. La hipotesis sencilla fue que un aumento de tamaro de la enzima disminuiria la capacidad de la misma para penetrar en las fibras, debilitando de este modo las fibras a un menor grado, es decir, la enzima seria menos agresiva. Para ello se utilizo la estrategia de proteinas de fusion sugerida en el documento W097/14804 y se diseraron construcciones de fusion que contenian un nucleo de celulasa neutra de una especie de Melanocarpus y una cola que consistia en un engarce/CBO de una celobiohidrolasa I acida de T. reesei. Sin embargo, de manera sorprendente, contrariamente a las sugerencias de la tecnica anterior, las construcciones de proteinas de fusion completamente estables no podrian obtenerse, salvo si los compareros de fusion se separan entre si en las condiciones de cultivo. Esto era supuestamente debido a la presencia de proteasa (o proteasas).

Para producir proteinas de fusion estables, una estrategia fue diserar nuevas construcciones de union que no tenian aminoacidos hidrofobos adyacentes (por ejemplo, V, I, L, F y W) para impedir la escision por aspartilproteasas. Sin embargo, aunque las construcciones produjeron proteinas de fusion, ocasionalmente se observaba alguna degradacion.

Basandose en el alineamiento de celulasas neutras que, de manera natural, contienen una cola de engarce/CBO, se produjeron construcciones adicionales y finalmente estas construcciones demostraron que eran mas estables y mas utiles en ensayos posteriores. Ademas, se diseraron construcciones de fusion que llevaban mutaciones en el CBO dando como resultado una afinidad o adsorcion reducida o minima para la celulosa (Linder et al. 1995).

Las nuevas construcciones producidas mejoraron las propiedades de resistencia, como era el objetivo. Sorprendentemente, las proteinas de fusion de celulasa estables tambien mostraron una mejora inesperada en los resultados del lavado, y su eficacia fue incluso seis veces tan alta como la de sus celulasas "parentales". Sin embargo, los rendimientos de produccion se mantuvieron aproximadamente al mismo nivel. Esto significa que, para conseguir el mismo resultado de lavado de la celulasa de la tecnica anterior solo se necesita una sexta parte de la cantidad real de la actividad celulasa. Esto produce reducciones considerables en la etapa de produccion y tambien en la logistica y almacenamiento, disminuyendo de este modo la carga ambiental. Tambien se reducen los efectos no deseados de las preparaciones de celulasa, aportando de este modo ahorros adicionales a los usuarios finales del producto enzimatico. Considerando que anualmente se producen alrededor de 2 pares de billones de pantalones vaqueros, y que la mayoria de ellos tiene un acabado con celulasa, la ventaja es muy significativa.

Por consiguiente, la presente invencion proporciona una nueva proteina de fusion de celulasa que comprende

A. una primera secuencia de aminoacidos opcionalmente modificada de un nucleo de celulasa derivada de una especie, y

B. una segunda secuencia de aminoacidos opcionalmente modificada de un engarce y/o dominio de union a celulosa (CBO) derivada de otra especie,

en la que, como se ha definido especificamente en lineas anteriores, entre dicha primera secuencia de aminoacidos y dicha segunda secuencia de aminoacidos se ha introducido una region de union, mediante la cual se obtiene una proteina de fusion estable.

En una realizacion de la invencion la region de union tiene la siguiente formula general:

1Val -2Gln - 3Ile -4Pro - 5Ser -6Ser

En otra realizacion de la invencion la region de union tiene la siguiente formula general:

1Gly -2Glu - 3Ile -4Gly -5Ser.

Oe acuerdo con la invencion la primera secuencia de aminoacidos es de una celulasa neutra y la segunda secuencia de aminoacidos es de una celulasa acida.

La primera secuencia de aminoacidos es de una celulasa de la familia 45 (Cel45) y la segunda secuencia de aminoacidos es de una celulasa de la familia 7 (Cel7).

Como se usa en el presente contexto, la expresion "nucleo de celulasa" o "nucleo" significa el dominio catalitico / nucleo (CO) de una enzima que expresa actividad celulasa. Oicho dominio catalitico puede estar en su forma natural (es decir, intacto) o, preferentemente, estar modificado como se define mas adelante. Las expresiones variante "derivada" y funcional indican polipeptidos indican polipeptidos que expresan la misma actividad celulasa pero que incluyen modificaciones como se define mas adelante.

En el presente contexto se utilizan codigos de aminoacidos convencionales de una letra y codigos de aminoacidos de tres letras. Por tanto, A y Ala indican alanina, R y Arg indican arginina, N y Asn indican asparagina, O y Asp indican acido aspartico, Cys y C indican cisteina, E y Glu indican acido glutamico, Q y Gln indican glutamina, G y Gly indican glicina, H e His indican histidina, I e Ile indican isoleucina, L y Leu indican leucina, K y Lys indican lisina, M y Met indican metionina, F y Phe indican fenilalanina, P y Pro indican prolina, S y Ser indican serina, T y Thr indican treonina, W y Trp indican triptofano, Y Tyr indican tirosina, y V y Val indican valina. Ademas de aminoacidos L de origen natural, pueden usarse aminoacidos O.

En las proteinas de fusion de celulasa de la invencion, la celulasa natural es, preferentemente, de origen fungico. La celulasa neutra puede derivar de Melanocarpus albomyces. La celulasa acida utilizada en las proteinas de fusion de celulasa de la invencion proviene de Trichoderma reesei.

La primera secuencia de aminoacidos es la celulasa 20 K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2 o un derivado de la misma, y la segunda secuencia de aminoacidos es del engarce y el CBO de la celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei de SEC IO N°: 4 o un derivado de la misma.

En una realizacion preferida de la invencion las proteinas de fusion de celulasa contienen modificaciones en el nucleo de celulasa y/o en el engarce y/o el en CBO. Como se usa en el presente contexto, la expresion "modificado" significa mutaciones, tales como una delecion, insercion, o sustitucion de uno o mas aminoacidos, u otras modificaciones, tales como glucosilaciones. Como ejemplos de dichas mutaciones se incluye la sustitucion de restos de tirosina conservados en la posicion 31 (correspondiente a la tirosina Y492 del polipeptido maduro) y/o posicion 32 (correspondiente a la tirosina Y493 del polipeptido maduro) con un aminoacido alifatico, preferentemente con alanina, y/o con un aminoacido aromatico, tal como triptofano, del CBO de la CBHI de Trichoderma reesei, como describen Linder et al., 1995. 0tros ejemplos de dichas mutaciones incluyen mutaciones inter-engarce de la CBHI de Trichoderma reesei, como describen Srisodsuj et al., 1993, tales como las deleciones de aminoacidos de la posicion 434 a 444 y de la posicion 434 a 460 de la secuencia de CBHI madura de Trichoderma. 0tros ejemplos de dichas mutaciones incluyen la delecion de Ala en la posicion 207, la delecion de Val en la posicion 208, la sustitucion de Phe209Trp, y la insercion de Pro despues de la posicion 206 en la secuencia de la celulasa 20 K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2.

Las proteinas de fusion de celulasa de la invencion son estables. En el contexto de la presente invencion la expresion "proteina de fusion de celulasa estable" significa que al menos 20 %, preferentemente al menos 40 %, mas preferentemente al menos 70 %, mas preferentemente 90 %-100 %, de la proteina de fusion de celulasa producida contiene una region de union no escindida entre las secuencias de aminoacidos durante la fermentacion. Esto significa que un 20 %-100 %, preferentemente 40 %-100 %, mas preferentemente 70 %-100 % de la celulasa producida tiene la primera y la segunda secuencia de aminoacidos fusionadas entre si. La expresion "proteina de fusion de celulasa estable" significa adicionalmente que la preparacion de proteina de fusion de celulasa puede ser estable como tal o que se ha estabilizado, por ejemplo, con tratamiento termico o ajustando el pH o aradiendo estabilizantes o agentes reductores de actividad proteasa o separando la proteina de fusion del cultivo. En el presente contexto, tratamiento termico significa un tratamiento a temperatura, que permite que la proteina de fusion se mantenga adecuadamente estable en la preparacion. El tratamiento termico puede ser, por ejemplo, un tratamiento a un pH de 6,0 a 65 °C durante 60 a 70 minutos.

En el presente contexto, la expresion "proteina de fusion intacta" significa que la union entre la primera y segunda secuencias de aminoacidos en la proteina de fusion de la invencion permanece integra, aunque puede aparecer o no degradacion terminal en dichas secuencias.

En la proteina de fusion de celulasa de la invencion, la primera secuencia de aminoacidos es una secuencia 20 K de Melanocarpus albomyces que tiene la SEC IO N°: 2 o una modificacion definida de la misma. Tambien se describe una realizacion en la que la primera secuencia de aminoacidos es la secuencia 50 K de Melanocarpus albomyces que tiene la SEC IO N°: 6 o una variante funcional de la misma. En otra realizacion desvelada la primera secuencia de aminoacidos es la secuencia 50 KB de Melanocarpus albomyces que tiene la SEC IO N°: 8 o una variante funcional de la misma. En otra realizacion desvelada la primera secuencia de aminoacidos es la secuencia de la CBHI de Thermoascus aurantiacus que tiene la SEC IO N°: 10 o una variante funcional de la misma. En la proteina de fusion de celulasa de la invencion la segunda secuencia de aminoacidos es el engarce y la secuencia del dominio de union a celulasa de SEC IO N°: 4 de la celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei o una modificacion definida de la misma.

Por tanto, en una realizacion muy preferida de la proteina de fusion de celulasa de la invencion, la primera secuencia de aminoacidos del nucleo de celulasa se selecciona de SEC IO N°: 37, 38, 39 y 40, especialmente SEC IO N°: 39 y la segunda secuencia de aminoacidos de un engarce y secuencia CBO se selecciona de SEC IO N°: 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50. En una realizacion especial de la invencion, la primera secuencia de aminoacidos del nucleo de celulasa es la SEC IO N°: 39 y la segunda secuencia de aminoacidos de un engarce y secuencia CBO es la SEC IO N°: 47, 49 o 50.

La presente invencion tambien se refiere a un vector de expresion que comprende una primera secuencia de polinucleotidos que codifica una primera secuencia de aminoacidos opcionalmente modificada de un nucleo de celulasa derivada de una especie, y una segunda secuencia de polinucleotidos que codifica una segunda secuencia de aminoacidos opcionalmente modificada de un engarce y/o dominio de union a celulosa (CBO) derivada de otra especie, y un polinucleotido que codifica una region de union especifica y que conecta dicha primera y segunda secuencia de polinucleotidos, codificando dichas secuencias de polinucleotidos las secuencias de aminoacidos respectivas, como se ha definido anteriormente de modo especifico.

La presente invencion tambien se refiere a preparaciones de celulasa que contienen una o mas proteinas de fusion de celulasa de la invencion en solitario o junto con enzimas adicionales y aditivos de acuerdo con la aplicacion especial en cuestion.

La presente invencion tambien se refiere a usos de y a metodos para el uso de las preparaciones de proteina de fusion de celulasa de la invencion con fines especificamente descritos mas adelante.

Las preparaciones de proteinas de fusion de celulasa de la invencion son especialmente utiles en la industria textil y de detergentes. Estas celulasas muestran un efecto de desgaste muy mejorado y un aumento de luminosidad visible y medible. Muestran retrotincion (backstaining) aceptable, asi como contrastes buenos y nitidos de biolavado a la piedra. Son utiles en la industria textil para el bioacabado de tejidos o prendas, por ejemplo, eliminacion de acumulacion de fibra en la superficie del tejido (depilling), eliminacion de pelusa (defuzzing), aclarado del color, reduccion de aspereza, creacion de diferentes acabados (por ejemplo, un efecto de "piel de melocoton", "desgastado", "lavado con arena" o "aspecto antiguo") y para el bioacabado de hilo, por ejemplo, reduccion de pilosidad y mejora de la suavidad. Tener dichas buenas propiedades de eliminacion de acumulacion de fibra es muy inusual de las celulasas neutras, ya que las enzimas utilizadas en aplicaciones de bioacabado industrial son tipicamente celulasas acidas. La celulasa neutra que tiene excelentes propiedades de eliminacion de acumulacion de fibra, como la proteina de fusion 20K+CBO, permite realizar el tratamiento de bioacabado simultaneamente durante la tincion, lo que conduce a ahorros considerables. Ademas, la inalterabilidad del color es frecuentemente mejor en condiciones neutras que en condiciones acidas.

0tros usos incluyen el uso en composiciones de detergentes para mejorar las propiedades del cuidado del tejido por su efecto contra la acumulacion de fibra en la superficie del (pilling), antiagrisado, aclarado del color y suavidad y para mejorar el efecto limpiador textil, por ejemplo, eliminacion de suciedad.

Como se usa en el presente contexto, la expresion "biolavado a la piedra" de tejidos o prendas significa el uso de enzimas en lugar de, o ademas de, piedra pomez, para el tratamiento de tejidos o prendas, especialmente de tela vaquera.

Como se usa en el presente contexto, la expresion "bioacabado" se refiere al uso de enzimas en una hidrolisis controlada de fibras celulosicas para modificar la superficie del tejido o del hilo, de tal manera que impida permanentemente la acumulacion de fibra en la superficie del tejido, mejore la manipulacion del tejido, tal como su tersura y suavidad, limpie la estructura de la superficie reduciendo la formacion de pelusas, lo que da como resultado el aclaramiento de los colores, mejore la drapabilidad del tejido, mejore la capacidad de absorcion de la humedad, lo que tambien puede mejorar la adsorcion de colorantes.

Como se usa en el presente contexto, la expresion "retrotincion" se refiere a la tendencia que tiene el tinte liberado para depositarse de nuevo sobre la superficie de las fibras de tejido.

Como se usa en el presente contexto, la expresion "detergente" se refiere a un agente limpiador que puede contener agentes tensioactivos (tensioactivos anionicos, no ionicos, cationicos y anfoliticos), sintetizantes y otros ingredientes opcionales tales como agentes anti-redeposicion y de suspension de suciedad, abrillantadores opticos, agentes blanqueadores, colorantes y pigmentos e hidrolasas. En la Patente de Estados Unidos N° 5.433.750 se proporciona una lista adecuada del contenido de detergentes y en la Patente de Estados Unidos N° 3.664.961 se proporciona una lista adecuada de tensioactivos.

Una secuencia de aminoacidos que es un "equivalente" o un "derivado" de una secuencia de aminoacidos especifica significa una secuencia de aminoacidos que no es identica a la secuencia de aminoacidos especifica, pero en su lugar contiene al menos algunos cambios de aminoacidos (deleciones, sustituciones, inversiones, inserciones, etc.) que no afectan esencialmente a la actividad biologica de la proteina en comparacion con una actividad similar de la secuencia de aminoacidos especifica, cuando se usa para una aplicacion determinada.

La actividad biologica de una celulasa es su actividad catalitica, y/o su capacidad de unirse a material celulosico.

Un vector de expresion es un plasmido o vector de clonacion que puede expresar AON que codifica las proteinas de fusion de celulasa de la invencion despues de la transformacion en un hospedador deseado. Cuando se utiliza un hospedador fungico, el gen de interes se proporciona preferentemente a un hospedador fungico como parte de un vehiculo de clonacion o expresion que integra en su interior el cromosoma fungico, o permite que el gen de interes se integre en el cromosoma hospedador, o como un plasmido que se replica de manera autonoma. Las secuencias son parte del vehiculo de clonacion o vehiculo de expresion tambien puede integrarse con dicho AON durante el proceso de integracion. Ademas en hongos, el vector de expresion, o partes del mismo, pueden dirigirse al interior de locus predeterminados.

El AON que codifica las proteinas de fusion de la invencion tambien se coloca preferentemente bajo el control de (es decir, esta unido operativamente con) determinadas secuencias de control, tales como secuencias promotoras proporcionadas por el vector (que se integran con el gen de interes). Como alternativa, las secuencias de control pueden ser las que se encuentran en un sitio de insercion.

Las secuencias de control de expresion de un vector de expresion variaran dependiendo de si el vector se disera para expresar un determinado gen en un hospedador procariota o eucariota (por ejemplo, un vector lanzadera puede proporcionar un gen para la seleccion en hospedadores bacterianos). Las secuencias de control de expresion pueden contener elementos reguladores de la transcripcion, tales como promotores, elementos potenciadores y secuencias de terminacion de la transcripcion y/o elementos reguladores de la traduccion, tales como sitios de inicio y terminacion de la traduccion.

Se dice que una molecula polinucleotidica, tal como AON, es "capaz de expresar" un polipeptido si esta contiene secuencias de control de expresion que contienen informacion reguladora transcripcional y dichas secuencias estan "unidas operativamente" a la secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido.

Una union operativa es una union en la que una secuencia esta conectada con una secuencia (o secuencias) reguladora de tal manera que coloca la expresion de la secuencia bajo la influencia o el control de la secuencia reguladora. Se dice que dos secuencias de AON (tal como una secuencia de la region promotora unida al extremo 5' de la secuencia codificante de la proteina) estan unidas operativamente si la funcion del promotor da como resultado la transcripcion.

Los vectores de la invencion tambien pueden comprender otros elementos reguladores unidos operativamente, tal como secuencias potenciadoras.

En una realizacion preferida, se construyen transformantes geneticamente estables mediante los cuales el AON que codifica las proteinas de fusion de celulasa de la invencion se integra en el cromosoma del hospedador por transformacion con un vector, que incluye secuencias que promueven la integracion de dicho vector en el cromosoma.

Las celulas que en sus cromosomas tienen AON integrado, estable, que codifica las proteinas de fusion de celulasa de la invencion, se seleccionan introduciendo tambien uno o mas marcadores, homologos o heterologos, que permiten la seleccion de celulas hospedadoras que contienen el vector de expresion en el cromosoma, por ejemplo, el marcador puede proporcionar resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibioticos, o a metales pesados, tales como cobre, o marcadores que complementan una mutacion auxotrofica en el cromosoma hospedador y similar. El gen marcador de seleccion puede estar unido directamente a las secuencias genicas de AON a expresar

o puede introducirse en la misma celula por co-transformacion.

Una vez que el vector o la secuencia de AON que contiene la construccion (o construcciones) se prepara para la expresion, la construccion (o construcciones) de AON se introducen en una celula hospedadora apropiada mediante cualquiera de una diversidad de medios adecuados, incluyendo transformacion, como se conoce en la tecnica. Oespues de la introduccion del vector, las celulas receptoras se cultivan en un medio selectivo, que se selecciona para el cultivo de celulas transformadas.

Los sistemas hospedadores de produccion y expresion adecuados son, por ejemplo, el sistema de produccion desarrollado por el hongo hospedador Trichoderma (documento EP 244 234) o el sistema de produccion de Aspergillus, tal como A. oryzae o A. niger (documentos W0 9708325 y W0 9533386, US 5.843.745, US 5.770.418)

o el sistema de produccion desarrollado para Fusarium, tal como F. oxysporum (Malardier et al., 1989). Los sistemas de produccion adecuados desarrollados para bacterias son sistemas de produccion desarrollados para Bacillus, por ejemplo, B. subtilis o para E. coli, o para el actinomiceto Streptomyces. Los sistemas de produccion adecuados desarrollados para levaduras son sistemas desarrollados para Saccharomyces, Shizosaccharomyces o Pichia pastoris. Tambien son posibles sistemas de produccion en algunos otros microbios o en celulas de mamifero o en plantas.

La expresion de la secuencia (o secuencias) genica clonada da como resultado la produccion de la proteina deseada, o la produccion de un fragmento de esta proteina. Esta expresion puede tener lugar de una manera continua en las celulas transformadas, o de una manera controlada.

Se entiende que los fragmentos son partes de moleculas de acido nucleico lo suficientemente largas para codificar la proteina descrita o un fragmento biologicamente activo de la misma. El termino "derivado" significa, en este contexto, que las secuencias de nucleotidos de estas moleculas difieren de las secuencias de las moleculas de acido nucleico descritas anteriormente, en una o mas posiciones y tienen alta homologia con respecto a dicha secuencia. Se entiende que la homologia se refiere a una identidad de secuencia de al menos 40 %, particularmente una identidad de al menos 60 %, preferentemente mas de 80 % y aun mas preferentemente mas del 90 %. Las variaciones de las moleculas de acido nucleico descritas anteriormente pueden ser el resultado de una delecion, sustitucion, insercion, adicion o combinacion. Ademas, homologia significa que las secuencias de nucleotidos o proteinas codificadas respectivas son funcional y/o estructuralmente equivalentes.

Como se usa en el presente contexto las expresiones "preparacion enzimatica" y "preparacion de celulasa" se refieren a un cualquier producto enzimatico, que contiene al menos una proteina de fusion de celulasa. Por tanto, dicha preparacion enzimatica puede ser un medio de cultivo agotado o un filtrado que contenga una o mas proteinas de fusion de celulasa o una o mas proteinas de fusion de celulasa y otras enzimas, una proteina de fusion de celulasa aislada o una mezcla de una o mas proteinas de fusion de celulasa o una mezcla de una o mas proteinas de fusion de celulasa y una o mas enzimas distintas. Ademas de la actividad de proteina de fusion de celulasa, dicha preparacion puede contener aditivos, tales como estabilizantes, tampones, conservantes, tensioactivos y/o componentes del medio de cultivo. Los aditivos preferidos son tales como los que se usan normalmente en las preparaciones enzimaticas destinadas para la aplicacion en la que usa la preparacion enzimatica. La preparacion enzimatica puede estar en forma de liquido, polvo o granulado.

En el presente documento, por "medio de cultivo agotado" se entiende el medio de cultivo del hospedador que comprende las enzimas producidas. Preferentemente las celulas hospedadoras se separan de dicho medio despues de la produccion.

La preparacion enzimatica puede comprender una o mas proteinas de fusion de celulasa de la presente invencion u otras enzimas de celulasa junto con una o mas proteinas de fusion de celulasa de la presente invencion. Por ejemplo, las proteinas de fusion de celulasa que tienen diferentes propiedades pueden combinarse para elaborar la preparacion enzimatica mas util para diferentes condiciones.

Para obtener las preparaciones enzimaticas de la invencion, los hospedadores que tienen las propiedades deseadas (es decir, hospedadores capaces de expresar cantidades economicamente asequibles de las proteinas de fusion de celulasa de la invencion) se cultivan en condiciones adecuadas, las enzimas deseadas se segregan del hospedador en el medio de cultivo, y la preparacion enzimatica se recupera de dicho medio de cultivo por metodos conocidos en la tecnica.

La preparacion enzimatica puede comprender ademas de proteinas de fusion celulasa, una o mas enzimas distintas, que pueden ser, por ejemplo, amilasas, lacasas y/o peroxidasas. Como alternativa, antes, durante o despues del tratamiento con la proteina de fusion de celulasa de la presente invencion, puede realizarse otro tratamiento enzimatico. El tratamiento enzimatico puede comprender, por ejemplo, uno o mas tratamientos con amilasa, uno o mas tratamientos con celulasa y/o uno o mas tratamientos con peroxidasa y/o lacasa. El que otras enzimas se incluyan en la preparacion enzimatica o se usen en el tratamiento enzimatico, depende de la aplicacion.

La preparacion enzimatica puede ser el medio de cultivo con o sin las celulas hospedadoras naturales o transformadas, o se recupera del mismo por la aplicacion de metodos bien conocidos en la tecnica. Sin embargo, debido a que las proteinas de fusion de celulasa de la invencion se segregan en los medios de cultivo y presentan actividad en las condiciones ambientales de licor celulolitico, es una ventaja de la invencion que las preparaciones enzimaticas de la invencion puedan utilizarse directamente a partir del medio de cultivo sin purificacion adicional. Si se desea, dichas preparaciones pueden liofilizarse o de otra manera la actividad enzimatica puede concentrarse y/o estabilizarse para su conservacion. Las preparaciones enzimaticas de la invencion son muy economicas de proporcionar y usar porque (1) las enzimas pueden usarse en bruto, sin procesar; el aislamiento de una enzima especifica del medio de cultivo es innecesario y porque (2) las enzimas se segregan en el medio de cultivo, por lo cual solo es preciso recuperar el medio de cultivo para obtener la preparacion enzimatica deseada; no se requiere

extraer ninguna enzima de los hospedadores. Preferentemente, para efectuar dicha produccion el hospedador es Trichoderma, y especialmente T. reesei.

Las preparaciones enzimaticas de la invencion pueden proporcionarse como un licor o como un solido, por ejemplo, en un polvo seco o en forma granular o liquida, especialmente granulos no espolvoreables, o un liquido estabilizado,

o la preparacion enzimatica puede concentrarse de otra manera o estabilizarse para su conservacion o uso. Se contempla que las preparaciones enzimaticas que contienen una o mas de las celulasas neutras de la invencion puedan enriquecerse adicionalmente o puedan carecer parcial o completamente de actividades enzimaticas especificas, para satisfacer las exigencias de una utilidad especifica en diversas aplicaciones, por ejemplo, en la industria textil. Puede seleccionarse una mezcla de actividades enzimaticas segregada por un hospedador, y especialmente por un hongo, para que sea ventajosa en una aplicacion industrial particular, por ejemplo, en el biolavado a la piedra.

Las preparaciones enzimaticas de la invencion pueden ajustarse para satisfacer las exigencias de las necesidades especificas en diversas aplicaciones en la industria textil, de detergentes o de pasta y papel.

Las combinaciones pueden prepararse con otras macromoleculas, no necesariamente todas ellas producidas por el mismo hospedador (por ejemplo, otras enzimas tales como endoglucanasas, proteasas, lipasas, peroxidasas, oxidasas o amilasas), o con productos quimicos que pueden potenciar el rendimiento, la estabilidad o capacidad tamponante de la preparacion enzimatica deseada. Los granulos no espolvoreables pueden revestirse. Las preparaciones enzimaticas liquidas pueden estabilizarse aradiendo un poliol, tal como propilenglicol, un azucar o un alcohol de azucar, acido lactico o acido borico, o cloruro sodico, de acuerdo con procedimientos establecidos.

Pueden prepararse formas protegidas de las enzimas de la invencion como se describe en el documento EP

238.216.

Las preparaciones enzimaticas de la invencion pueden contener un tensioactivo que puede ser anionico, no ionico, cationico, anfoterico o una mezcla de estos tipos, especialmente cuando se usan como una composicion de detergente. Se describen composiciones de detergentes utiles, por ejemplo, en el documento W0 94/07998 y en las patentes de Estados Unidos Nos 5.443.750 y 3.664.961.

Si se requiere, tambien puede purificarse una enzima deseada de acuerdo con condiciones convencionales, tales como extraccion, precipitacion, cromatografia, cromatografia por afinidad, electroforesis o similares.

Las preparaciones enzimaticas de la presente invencion son especialmente utiles en la industria textil, preferentemente en el biolavado a la piedra y en el bioacabado o en la industria de detergentes. 0tros sectores utiles son la industria de la pasta y del papel.

El lavado a la piedra consta de tres etapas: eliminacion del apresto, abrasion y post-tratamiento. La primera etapa, el proceso de eliminacion del apresto, es normalmente el primer tratamiento en humedo de los vaqueros y significa la eliminacion de almidon u otros agentes encolantes aplicados normalmente a los hilos de la urdimbre para impedir que se produzcan daros durante el proceso de hilado. Para eliminar el apresto basado en almidon se utilizan alfa amilasas para mejorar y dar uniformidad al procesado de humectacion. Oespues de eliminar el apresto, los vaqueros se aclaran normalmente con agua o directamente se continua con la etapa de abrasion.

La segunda etapa, la abrasion, puede realizarse con enzimas o con piedra pomez o con ambas. En todos los casos se requiere accion mecanica para eliminar el tinte y el tratamiento se realiza normalmente en lavadoras, tal como de tipo tambor. En el presente documento, el termino "desgastado" significa el aspecto del tejido de tela vaquera cuando se ha tratado con enzimas de celulasa o con piedras o con ambas. Como resultado de una eliminacion desigual de tinte, existen contrastes entre areas teridas y areas en las que se ha eliminado el tinte. Expresiones sinonimas son "aspecto de lavado a la piedra" o "aspecto usado". En el lavado a la piedra enzimatico, o biolavado a la piedra, la abrasion con piedra pomez se elimina completa o parcialmente y la celulasa se arade para facilitar la abrasion del tinte indigo de la superficie de la fibra. El tratamiento con celulasa puede realizarse usando celulasas neutras o acidas o ambas. Si un tejido no esta tratado con celulasa o lavado a la piedra, se dice que el aspecto del tejido es "apagado", ya que se perderian los contrastes de moda. Cuando se desea un efecto mas descolorido, puede realizarse blanqueamiento usando agentes quimicos y/o metodos enzimaticos, tales como, un tratamiento con lacasa.

Oespues de la abrasion se realiza la tercera etapa, el post-tratamiento, que incluye las etapas de lavado y aclarado durante las cuales pueden utilizarse, detergentes, abrillantadores opticos o suavizantes. Oespues del tratamiento enzimatico, la reaccion debe detenerse para impedir que se produzcan daros en los materiales tratados, por ejemplo por temperatura y/o inactivacion del pH, comprendiendo lo ultimo un aclarado cuidadoso y/o un lavado con detergente. Esto garantiza que la resistencia mecanica de la fibra no este adicionalmente comprometida por la presencia continuada de la enzima.

La expresion "tela vaquera" significa, en relacion con la presente invencion, tejido de tela vaquera, normalmente prendas de tela vaquera, particularmente vaqueros. Ventajosamente la tela vaquera es tela vaquera terida con indigo. La tela vaquera tambien puede tratarse con indigo, con derivados de indigo o tela vaquera terida con indigo

junto con algun otro colorante, por ejemplo tela vaquera terida con indigo con fondos de azufre.

El tratamiento con una o varias celulasas puede sustituir por completo el tratamiento con piedra pomez (por ejemplo, 1 kg de enzima comercial frente a 100 kg de piedra). Sin embargo, cuando se desee, para producir un acabado muy desgastado, el tratamiento con celulasa puede combinarse con tratamiento con piedra pomez. A traves de un lavado que combine una celulasa neutra con piedra pomez tambien se consigue un efecto de piel de melocoton en el que se crea un recubrimiento piloso delicado que sobresale. Las celulasas de la presente invencion son especialmente utiles para proporcionar un aspecto desgastado y minimizar la retrotincion en el biolavado a la piedra.

El biolavado a la piedra se realiza preferentemente en un intervalo de pH de aproximadamente 4,5 -9,5, y mas preferentemente entre en un intervalo de pH de 6,0 -8,0. La temperatura de la reaccion puede variar de aproximadamente 40 -80 °C, preferentemente entre 50 -70 °C, y mas preferentemente entre 55 -65 °C y aun mas preferentemente a una temperatura de 60 °C. La proporcion de licor (proporcion del volumen de liquido por peso de tejido) puede variar de aproximadamente 2:1 -30:1, preferentemente 4:1 -15:1, y mas preferentemente 5:1 -10:1. La dosificacion enzimatica puede variar de aproximadamente 5-8000 NCU/g de tejido, preferentemente 20-3000 NCU/g de tejido y mas preferentemente 30-1500 NCU/g de tejido. El tiempo de tratamiento puede variar entre 15 min -4 h, mas preferentemente 20 min - 90 min y mas preferentemente 30 min - 60 min. Cabe destacar que la dosificacion enzimatica depende en gran medida del tipo de tejido, de la maquinaria, de las condiciones de procesado (pH, temperatura, proporcion de licor, tiempo de tratamiento, carga de tela vaquera, escala de proceso) y del tipo de preparacion enzimatica y similar. Si se desea, puede utilizarse piedra pomez en combinacion con las proteinas de fusion de celulasa. La dosificacion enzimatica necesaria sera entonces significativamente inferior. Un experto en la tecnica puede definir dosificaciones y condiciones adecuadas.

Las proteinas de fusion de celulasa de la presente invencion son utiles en la industria textil para el bioacabado de tejidos o prendas, por ejemplo, eliminacion de acumulacion de fibra en la superficie del tejido, eliminacion de pelusa, aclarado del color, reduccion de aspereza, creacion de diferentes acabados (por ejemplo, un efecto de "piel de melocoton", "desgastado", "lavado con arena" o "aspecto antiguo") y para el bioacabado de hilo, por ejemplo, reduccion de pilosidad y mejora de la suavidad). Las proteinas de fusion de celulasa de la presente invencion pueden usarse en bioacabado en condiciones acidas y neutras usando basicamente las mismas condiciones que las del biolavado a la piedra.

Las proteinas de fusion de celulasa de la presente invencion son utiles en composiciones de detergentes para para mejorar las propiedades del cuidado del tejido por su efecto contra la acumulacion de fibra en la superficie del tejido, antiagrisado, aclarado del color y suavidad y para mejorar el efecto limpiador textil, por ejemplo, eliminacion de suciedad.

El material textil que se trata con las preparaciones enzimaticas de la invencion puede fabricarse con fibras que contienen celulosa natural o con fibras que contienen celulosa fabricada por el hombre o mezclas de las mismas. Son ejemplos de fibras celulosicas naturales el algodon, lino, caramo, yute y ramio. Son ejemplos de fibras celulosicas fabricadas por el hombre la viscosa, el acetato de celulosa, triacetato de celulosa, rayon, cupro y liocel. Las fibras celulosicas mencionadas anteriormente tambien pueden emplearse como mezclas de fibras sinteticas tales como poliester, poliamida o fibras acrilicas. El material textil puede ser hilo o punto o tejido o puede formarse por cualquier otro medio.

Las celulasas de la invencion, ademas de ser especialmente utiles para el tratamiento de tejidos, son utiles en general en cualquier sector que requiera actividad celulasa.

En la industria de la pasta y del papel, pueden usarse celulasas neutras, por ejemplo, en la eliminacion de tinta de diferentes papeles y cartones reciclados que tienen pH neutro o alcalino, mejorando la calidad de la fibra o aumentando el drenaje en la fabricacion del papel. 0tros ejemplos incluyen la eliminacion de espesante de la pasta de impresion y el exceso de tinta despues de la impresion textil y como un tratamiento para piensos animales. Por ejemplo, si la aplicacion que se desea es mejorar la resistencia mecanica de la pasta, entonces las preparaciones enzimaticas de la invencion pueden proporcionar una o mas de estas proteinas para potenciar o facilitar la capacidad de las fibras de celulosa de unirse entre si. Oe una manera similar, en la aplicacion del refinado de pasta, las preparaciones de proteinas de fusion de celulasa de la invencion pueden proporcionar una o mas de esas proteinas a un nivel que potencie o facilite dicha dilatacion. Oe las proteinas de fusion de la invencion especialmente adecuadas para aplicaciones de pasta, son aquellas con un nucleo CBHI de 50KB de Melanocarpus albomyces o Thermoascus aurantiacus.

Las proteinas de fusion de celulasa de la presente invencion proporcionan ventajas inesperadas cuando se usan en la industria textil y especialmente en el biolavado a la piedra. Las proteinas de fusion de celulasa de la invencion son considerablemente mas eficaces que las celulasas de la tecnica anterior. En el biolavado a la piedra podian usarse al menos dos veces, normalmente al menos tres veces e incluso seis veces dosificaciones mas bajas en cuanto a dosificacion de unidades de actividad de celulasa neutra sobre el peso del tejido, sin alterar la resistencia del tejido. En otras palabras, usando las proteinas de fusion de celulasa de la presente invencion se consigue un resultado hasta seis veces mayor. Oado que el rendimiento de produccion de las proteinas de fusion de celulasa de la invencion corresponde al de la celulasa de 20K conocida, la eficacia de produccion global se mejora significativamente. Esto puede proporcionarse directamente con grandes ahorros en cuanto a las cantidades necesarias de la enzima: la posibilidad de usar cantidades reducidas de la enzima ofrece un valor economico considerable en cuanto tanto a la fabricacion como al uso, incluyendo la logistica.

La invencion se ilustra en los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1. Construcciones de los vectores de expresión para proteínas de fusión 20K+CBD

En el aislamiento, purificacion y tratamientos enzimaticos de AON (plasmidos, fragmentos de AON), en reacciones de cadena de la polimerasa (PCR), y en transformaciones con E. coli, etc. se utilizaron metodos convencionales de biologia molecular. Los metodos basicos utilizados se describen en los manuales convencionales de biologia molecular, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) y Sambrook y Russell (2001).

Se diseraron construcciones de plasmidos para unir la secuencia codificante 20K de Melanocarpus albomyces (Cel45A, AC N° AJ515703; SEC IO N°: 1) con la secuencia codificante del engarce y el CBO de la CBHI de Trichoderma reesei (AC N° AR088330; Sridsodsuk et al. 1993; SEC IO N°: 3). Se diseraron en total seis uniones diferentes, como se describe en la Tabla 1.

Para las construcciones n° 1 y n° 2 expuestas en la Tabla 1, se introdujo un solo sitio NruI en el extremo de la secuencia codificante 20K. Este sitio permite la fusion directa despues del codon para la serina n° 213 de la 20K madura con cualquier fragmento de AON con un extremo romo. Se desarrollo una reaccion PCR con los cebadores 20K Nco (SEC IO N°: 11) y 20K NruXho (SEC IO N°: 14) con el plasmido pALK1480 (Fig. 1) como molde usando el programa A (Tabla 3). El plasmido pALK1480 tiene la copia genomica de la cel45A de M. albomyces (que codifica la Cel45A o 20K) insertado bajo el promotor cbh1 de T. reesei y una fusion exacta y tiene el terminador cbh1 cadena abajo del gen en el vector pUC19 (New England Biolabs, Inc., Estados Unidos). La mezcla de reaccion de la PCR contenia tampon de reaccion 1x OyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlandia), Mg2+ 8 mM (la concentracion final ajustada con adicion de MgCl2), dNTP 0,2 mM, 0,5 !M de cada cebador, 1,0 unidades de AON polimerasa OyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlandia), y aproximadamente 50 ng/100 !l de molde. El producto PCR se sometio a digestion con las enzimas de restriccion NcoI y XhoI y los fragmentos se aislaron del gel de agarosa despues electroforesis. El fragmento de 6,1 kb cortado de manera similar y aislado de pALK1480 se ligo con el fragmento de la PCR, y se transformo en E. coli XL1-Blue (Stratagene, Estados Unidos). El AON plasmidico se aislo de los transformantes y se verifico, por secuenciacion, un candidato adecuado. El plasmido resultante se denomino pALK1429.

Las reacciones de la PCR se realizaron por separado, como se ha indicado anteriormente, con los pares de cebadores 1 BamMly (SEC IO N°: 16) + XhoAge (SEC IO N°: 15) y 2 BamMly (SEC IO N°: 17) + XhoAge (SEC IO N°: 15) con pALK492 como molde (Fig. 2), y los productos resultantes de la PCR, que contenian el engarce y el CBO, se sometieron a digestion con MIyl (que produce un extremo romo justo antes del primer codon deseado de la secuencia codificante del engarce y CBO) y AgeI. El plasmido pALK492 lleva un fragmento PstI de aproximadamente 6,9 kb del AON cromosomico QM6a de T. reesei que incluye el gen cbh1/cel7A subclonado en el sitio Pstl de pUC19. El plasmido pALK1429 obtenido anteriormente se sometio a digestion con NruI y AgeI, y parte del vector se aislo y se ligo por separado con los dos productos de la PCR digeridos obtenidos anteriormente y se transformo en E. coli XL1-Blue. Los AON plasmidicos se aislaron, se verificaron por secuenciacion y los plasmidos resultantes se denominaron pALK1430 (que lleva, como inserto, el producto de la PCR 1 BamMly + XhoAge) y pALK1431 (que lleva, como inserto, el producto PCR 2 BamMly + XhoAge).

Tabla 1. Diferentes uniones construidas entre la 20K de Melanocarpus albomyces y el engarce+CBD de CBHI de Trichoderma reesei.

ConstrucciónNº

Uniones engarce-núcleo núcleo 20Kmolde pALK1480 engarce+CBDmolde pALK492 Construcciones de plásmidos

cebador 5'

cebador 3' cebador 5' cebador 3'

1

...hddggfavfkaps.-gstgn... 20K Ncol 20K NruXho GPI 1 BamMly-oligo XhoAge oligo pAKL1434 <-pALK1430 <-pALK1429

2

...hddggfavfkaps.-ggnpppg... 20K Ncol 20K NruXho GPI 2 BamMly-oligo XhoAge oligo pAKL1435 <-pALK1431 <-pALK1429

3

...hddggfa.fGPIgs-tgn... 20K Ncol 2 20K NruXho GPI 3 BamMly-oligo XhoAge oligo pAKL1768 <-pALK1764 <-pALK1758

4

...hddggfWGEIgs-tgn... 20K Ncol 3 20K NruXho WGEI 3 BamMly-oligo XhoAge oligo pAKL1769 <-pALK1765 <-pALK1759

5

...hddggfPavQIPSs-tgn... 20K Ncol 2 20K NruXho PavQIPS 3 BamMly-oligo XhoAge oligo pAKL1770 <-pALK1766 <-pALK1760

6

...hddggfaWGEIgs-tgn... 20K Ncol 3 20K NruXho WGEI-2 3 BamMly-oligo XhoAge oligo pAKL1775 <-pALK1774 <-pALK1773

En la segunda columna, la parte que esta mas a la izquierda es la secuencia derivada de Melanocarpus y la parte que esta mas de la derecha es la secuencia derivada deTrichoderma. Las letras minusculas indican secuencias originales, las letras mayusculas indican la secuencia modificada, el punto (.) indica un aminoacido delecionado y un guion indica el punto de union unido ligando los plasmidos en cuestion. El primer aminoacido de la secuencia de Melanocarpus es histidina n° 201 de la secuenciamadura y en las construcciones n° 1, n° 3, n° 4 y n° 6 el primer aminoacido de la secuencia de Trichoderma es glicina n° 427, la construccion n° 2 glicina n° 434 y en laconstruccion n° 5 serina n° 428 de la secuencia madura.

Tabla 2. Cebadores usados

Cebador

Longitudnucleotidos Secuencia Secuencia IO N°:

20K Nco

27 5'-TACGCCATGGTCGTCCAGTCGACCAGC 11

20K Nco 2

35 5'-TACGCCATGGTCGTCCAGTCGACCAGCACGGGCGG 12

20K Nco 3

46 5'-TACGCCATGGTCGTCCAGTCGACCAGCACGGGCGGCGACCTCGGCA 13

20K NruXho

40 5'-CGTACTCGAGTCATCGCGAGGGGGCCTTGAAGACGGCGAA 14

XhoAge

30 5-TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGC 15

1 BamMly

34 5'-TAGGATCCGAGTCCCATTGGCAGCACCGGCAACC 16

2 BamMly

36 5'-TAGGATCCGAGTCCTAGCGGCGGCAACCCTCCCGGC 17

3 BamMly

34 5'-TAGGATCCGAGTCCCATTACCGGCAACCCTAGCG 18

20K NruXho GPI

55 5'-CGTACTCGAGTCATCGCGAGCCGATGGGGCCGAAGGCGAAGCCGCCGTCGTCGTG 19

20K NruXho WGEI

52 5'-CGTACTCGAGTCATCGCGAGCCGATCTCGCCCCAGAAGCCGCCGTCGTCGTG 20

20K NruXho PavQIPS

58 5'-CGTACTCGAGTCATCGCGACGAGGGGATCTGGACGGCGGGGAAGCCGCCGTCGTCGTG 21

20K NruXho WGEI-2

52 5'-CGTACTCGAGTCATCGCGAGCCGATCTCGCCCCAGGCGAAGCCGCCGTCGTC 22

50K NruXhol

37 5'-TCGTCTCGAGTCGCGATGGGGCCGAAGCGGATGTTGG 23

50K Sphl

31 5'-GGAGGGCATGCCCAACAGCAGCGAGATCACC 24

2-50K NrulSpel

38 5'-CGGCACTAGTTCGCGACCCGATCTCGCCCCAGCGCAGG 25

50K Xhol

26 5'-CGCCGAGGGCCGGCTCGAGAGCATCC 26

Tabla 3. Programas de la reacción PCR usados

Etapa

A B C O

1

95 °C 5 min 95 °C 5 min 98 °C 1 min 98 °C 1 min

2

95 °C 1 min 95 °C 1 min 98 °C 30 s 98 °C 30 s

3

55 °C 1 min 60 °C 5 min 72 °C 1 min 65 °C 30 s

4

72 °C 1 min 72 °C 5 min IR A 2 29x 72 °C 1 min

5

IR A 2 24x IR A 2 24x 95 °C 5 min IR A 2 29x

6

MANTENER A 4 °C 72 °C 1 min MANTENER A 4 °C 72 °C 10 min

7

MANTENER A 4 °C MANTENER A 4 °C

El marcador amdS y la region 3' flanqueante cbh1 de T. reesei se insertaron en los vectores pALK1430 y pALK1431 de la siguiente manera: el vector pALK424 (patente de Estados Unidos 5.837.51; Fig. 3) se escindio con EcoRIy

5 SpeI, el fragmento resultante de 4,8 kb se hizo romo mediante la reaccion de relleno de Klenow y se ligo por separado con los plasmidos pALK1430 y pALK1431 escindidos con StuI, respectivamente, y se transformo en E. coli XL1-Blue. Los AON plasmidicos se aislaron y la orientacion deseada de los insertos se comprobo por digestion con enzimas de restriccion apropiadas. Los plasmidos verificados se denominaron pALK1434 (inserto de pALK1430) y pALK1435 (inserto de pALK1431), respectivamente (Tabla 1).

10 Para las construcciones n° 3, n° 4, n° 5 y n° 6 expuestas en la Tabla 1, se adopto una estrategia diferente. La secuencia codificante de la 20K y los diferentes puntos de union modificados (Tabla 1) se diseraron para finalizar en el codon codificante de serina, que forma una parte del sitio NruI aradido. Para todas estas construcciones se utilizo el mismo inserto para proporcionar la secuencia codificante de la parte principal del engarce y CBO. Este ultimo se construyo de la siguiente manera. Se realizo una reaccion PCR con la mezcla de reaccion descrita anteriormente

15 (excepto sin adicion de Mg2+) y usando el par de cebadores 3 BamMly (SEC IO N°: 18) y XhoAge (SEC IO N°: 15) y como molde AON de pALK492. Se uso el programa B indicado en la Tabla 3. El producto de la PCR resultante se sometio a digestion con BamHI y XhoI, se aislo y se ligo con parte del vector escindido de manera similar de pBluescript II KS+ (Stratagene, Estados Unidos) y se transformo en E. coli XL1 Blue. El AON plasmidico se aislo, se comprobo por digestion con enzimas de restriccion apropiadas y se verifico por secuenciacion. Se selecciono un

20 plasmido candidato con la secuencia deseada y se denomino pALK1767.

Para la construccion n° 3 indicada en la Tabla 1 se realizo una reaccion PCR usando el par de cebadores 20K Nco 2 (SEC IO N°: 12) y 20K-NruXho GPI (SEC IO N°: 19) y como molde AON de pALK1480. Se usaron dos mezclas de reaccion: una con la composicion descrita anteriormente para la construccion de pALK1767, y la otra con OMS0 aradido al 3 % (v/v). Estas dos mezclas de reaccion se dividieron y se desarrollaron con los programas C y O

25 de la Tabla 3. Todas las reacciones produjeron fragmentos de AON de tamaro esperado y las preparaciones se combinaron y sometieron a digestion con NcoI y XhoI. El fragmento de AON se aislo y se ligo con un fragmento de 6,1 kb escindido y aislado de manera similar de pALK1480 y se transformo en E. coli XL1 Blue. El AON plasmidico se aislo, se comprobo por digestion con enzimas de restriccion apropiadas y se verifico por secuenciacion. Se selecciono un plasmido candidato con la secuencia deseada y se denomino pALK1758.

30 Para la construccion n° 4 indicada en la Tabla 1 se realizo una reaccion PCR usando el par de cebadores 20K Nco 3 (SEC IO N°: 13) y 20K-NruXho WGEI (SEC IO N°: 20) y como molde AON de pALK1480. La mezcla de reaccion PCR contenia tampon de reaccion 1x Phusion™ GC (Finnzymes, Finlandia), dNTP 0,2 mM, 0,5 !M de cada cebador, OMS0 al 3 % (v/v) y 1,5 unidades de AON polimerasa Phusion™ (Finnzymes, Finlandia) y aproximadamente 70 ng/100 !l del molde. La mezcla de reaccion se dividio y se proceso con los programas C y O

35 de la Tabla 3. Ambas reacciones produjeron tamaros de AON de tamaro esperado y las preparaciones se combinaron y se sometieron a digestion con NcoI y XhoI. El fragmento de AON se aislo y se ligo con un fragmento de 6,1 kb aislado y escindido de manera similar de pALK1480 y se transformo en E. coli XL1 Blue. El AON plasmidico se aislo, se comprobo por digestion con enzimas de restriccion apropiadas y se verifico por secuenciacion. Se selecciono un plasmido candidato con la secuencia deseada y se denomino pALK1759.

40 Para la construccion n° 5 indicada en la Tabla 1 se realizo una reaccion PCR usando el par de cebadores 20K Nco 2 (SEC IO N°: 12) y 20K-NruXho PavQIPS (SEC IO N°: 21) y como molde AON de pALK1480. Se usaron dos mezclas de reaccion: una con la composicion descrita anteriormente para la construccion de pALK1759 y la otra sin OMS0. Estas dos mezclas de reaccion se dividieron y se procesaron con los programas C y O de la Tabla 3. Todas las reacciones produjeron fragmentos de AON de tamaro esperado y las preparaciones se combinaron y se

45 sometieron a digestion con NcoI y XhoI. El fragmento de AON se aislo y se ligo con el fragmento de 6,1 kb aislado y escindido de manera similar de pALK1480 y se transformo en E. coli XL1 Blue. Los AON plasmidicos se aislaron, se comprobaron por digestion con enzimas de restriccion apropiadas y se verificaron por secuenciacion. Se selecciono un plasmido candidato y se denomino pALK1760; este habia adquirido una mutacion en el unico sitio XhoI, pero esto no supuso ningun problema para la subclonacion posterior.

Para la construccion n° 6 indicada en la Tabla 1 se realizo una reaccion PCR usando el par de cebadores

5 20K Nco 3 (SEC IO N°: 13) y 20K-NruXho WGEI-2 (SEC IO N°: 22) y como molde AON de pALK1480 (70 ng/100 !l). Se uso la misma composicion de mezcla de reaccion que para la construccion del plasmido pALK1767, y se proceso con el programa C de la Tabla 3. La preparacion se sometio a digestion con NcoI y XhoI. El fragmento de AON se aislo y se ligo con un fragmento de 6,1 kb escindido y aislado de manera similar de pALK1480 y se transformo en E. coli XL1 Blue. Los AON plasmidicos se aislaron, se comprobaron por digestion con enzimas de

10 restriccion apropiadas y se verificaron por secuenciacion. Se selecciono un plasmido candidato y se denomino pALK1773.

Los plasmidos pALK1758, pALK1759, pALK1760 y pALK1773 se escindieron por separado con NruI y AgeI, y las partes del vector se aislaron. Cada preparacion se ligo con un fragmento de 235 pb aislado de pALK1767 despues de digestion con Mlyl y Agel y cada mezcla de ligamiento se transformo por separado en E. coli XL10-Gold. Los AON

15 plasmidicos se aislaron, se comprobaron por digestion con enzimas de restriccion apropiadas y se verificaron por secuenciacion. Los plasmidos verificados se denominaron pALK1764, pALK1765, pALK1766 y pALK1774, respectivamente (Tabla 1).

El marcador amdS y la region 3' flanqueante cbh1 de T. reesei se insertaron en los vectores pALK1764, pALK1765, pALK1766 y pALK1774 de la siguiente manera: pALK424 se escindio con EcoR1 y Spe1, el fragmento resultante de

20 4,8 kb se hizo romo mediante la reaccion de relleno de Klenow, y se ligaron por separado con los plasmidos pALK1764, pALK1765, pALK1766 y pALK1774 escindidos con Stul, respectivamente y se transformaron en E. coli XL10-Gold. Los AON plasmidicos se aislaron y la orientacion deseada de los insertos se comprobo por digestion de enzimas de restriccion apropiadas. Los plasmidos verificados se denominaron pALK1768, pALK1769, pALK1770 y pALK1775, respectivamente (Tabla 1) (Fig. 10).

25 EJEMPLO 2. Producción de las proteínas de fusión 20K+CBD en T. reesei

Los casetes de expresion lineales de 8,7 kb de los plasmidos pALK1434 y pALK1435 se aislaron de la estructura vectorial despues de digestion con EcoRI y se transformaron en protoplastos A47 de T. reesei. Las transformaciones se realizaron como se describe en Penttila et al. (1987) con las modificaciones descritas en Karhunen et al. (1993) seleccionando con acetamida como la unica fuente de nitrogeno. Los transformantes se purificaron en placas de

30 seleccion a traves de conidios sencillos antes de esporularlos en PO (Agar con Oextrosa de Patata).

La produccion 20K+CBO de los transformantes se analizo a partir del sobrenadante de cultivo de los cultivos en matraz agitador (50 ml). Los transformantes se cultivaron durante 7 dias en un medio inductor de celulasa complejo (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con KH2P04 al 5 % a un pH de 5,5. La actividad enzimatica de la proteina de fusion se midio como la liberacion de azucares reductores de carboximetilcelulosa (CMC al 3 %) a 50 °C en tampon 35 Hepes 50 mM, pH 7,0 durante 10 min (actividad NCU; nkat; Bailey y Nevalainen, 1981; Haakana et al., 2004). Las actividades NCU de los mejores transformantes de produccion se presentan en la Tabla 4. Los genotipos de los transformantes seleccionados se confirmaron usando transferencias de Southern, en las que se incluyeron diversas digestiones genomicas y el casete de expresion respectivo se uso como una sonda. La proteina 20K+CBO se detecto a partir del sobrenadante de cultivo usando los anticuerpos policlonales suscitados contra la celulasa neutra

40 20K purificada de Melanocarpus albomyces (Haakana et al. 2004) y el sistema AP de transferencia de Western ProtoBlot (Promega). Los analisis de transferencia de Western mostraron que las enzimas de fusion 20K+CBO se produjeron principalmente como proteinas de fusion estables en T. reesei.

Tabla 4. Actividades NCU de los transformantes 20K+CBD seleccionados a partir de cultivos en matraz agitador

Transformante

N° de construccion Numero RF Actividad de la celulasa neutra, NCU/ml Fenotipo de la celulasa endogena

A47/pALK1434/n° 20

n° 1 RF5580 3278 CBHI-

A47/pALK1434/n° 23

n° 1 RF5581 2091 (CBHI+)

A47/pALK1434/n° 37

n° 1 RF5582 2330 CBHI-

A47/pALK1435/n° 3

n° 2 RF5583 3624 CBHI-

A47/pALK1435/n° 7

n° 2 RF5584 3211 CBHI-

A47/pALK1435/n° 11

n° 2 RF5585 1172 (CBHI+)

A47/pALK1435/n° 14

n° 2 RF5586 3152 CBHI

En la Tabla 4, el numero de construccion se refiere al de la Tabla 1; el numero RF se refiere a que los transformantes se denominaron como cepas RF.

El posible direccionamiento del casete de expresion hacia el locus cbh1 (cel7A) se identifico como un fenotipo CBHI negativo por transferencia de Western. La deteccion de la proteina CBHI se realizo usando los anticuerpos

5 monoclonales CI-258 o CI-261 (Aho et al., 1991) y el sistema AP de transferencia de Western ProtoBlot (Promega, USA). Los genotipos de los transformantes seleccionados se confirmaron usando transferencias de Southern, en las que se incluyerom diversas digestiones genomicas y como sonda se uso el casete de expresion respectivo.

Los casetes de expresion lineales de 8,7 kb de los plasmidos pALK1768, pALK1769, pALK1770 y pALK1775 preparados en el Ejemplo 1 se aislaron de la estructura vectorial despues de digestion con EcoRI y se transformaron

10 en protoplastos RF5796 y RF5798 de T. reesei (originandose ambas cepas de la cepa QM6a (Bailey y Nevalainen, 1981) y teniendo el fenotipo CBHI- CBHII- EGI- EGII- para las celulasas endogenas de T. reesei) seleccionando con acetamida como la unica fuente de nitrogeno. Los transformantes se purificaron en placas de seleccion a traves de conidios sencillos antes de su esporulacion sobre PO.

La produccion de 20K+CBO de los transformantes se analizo a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos

15 en matraz agitador (50 ml). Los transformantes se cultivaron durante 7 dias en un medio inductor de celulasa complejo (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con KH2P04 al 5 % a pH 5,5. La actividad NCU de las proteinas de fusion 20K+CBO producidas se ensayo despues como se ha descrito anteriormente. Las actividades NCU de los transformantes seleccionados se presentan en la Tabla 5. Los genotipos de los transformantes seleccionados se confirmaron usando transferencias de Southern, en las que se incluyeron diversas digestiones genomicas y como

20 sonda se uso el casete de expresion respectivo. La proteina 20K+CBO se detecto de los sobrenadantes de cultivo usando anticuerpos policlonales suscitados contra la celulasa neutra 20K purificada de M. albomyces (Haakana et al. 2004) y el sistema AP de transferencia de Western ProtoBlot (Promega, USA). El analisis de transferencia de Western mostro que los transformantes produjeron la enzima de fusion 20K+CBO. Algunos cultivos tambien mostraron una banda que reaccionaba con el antisuero anti-20K y que tenia la movilidad de la proteina 20K de tipo

25 silvestre, indicando que posiblemente se habia producido alguna escision del engarce+CBO durante el cultivo. La proteina de fusion 20K+CBO producida por los transformantes pALK1770 se selecciono para estudios posteriores debido a su estabilidad.

Tabla 5. Actividades NCU de los transformantes 20K+CBD seleccionados a partir de cultivos en matraz agitador

Transformante

N° de construccion Numero RF Actividad celulasa neutra, NCU/ml

RF5796/pALK1768/n° 6

n° 3 RF5966 3622

RF5796/pALK1768/n° 7

n° 3 RF5967 1316

RF5796/pALK1768/n° 9

n° 3 RF6035 6605

RF5798/pALK1768/n° 11

n° 3 RF5970 1525

RF5798/pALK1768/n° 17

n° 3 RF5971 2885

RF5798/pALK1768/n° 20

n° 3 RF5972 2598

RF5796/pALK 1769/n° 7

n° 4 RF5968 4344

RF5796/pALK1769/n° 10

n° 4 RF5969 4858

RF5796/pALK1769/n° 11

n° 4 RF6036 6145

RF5798/pALK1769/n° 4

n° 4 RF5973 4505

RF5798/pALK1769/n° 8

n° 4 RF5974 4895

RF5796/pALK 1770/n° 13

n° 5 RF5975 3073

RF5796/pALK1770/n° 17

n° 5 RF5976 2256

RF5796/pALK1770/n° 22

n° 5 RF5977 2107

RF5798/pALK1770/n° 10

n° 5 RF5978 1907

RF5798/pALK 1770/n° 14

n° 5 RF5979 3661

Transformante

N° de construccion Numero RF Actividad celulasa neutra, NCU/ml

RF5796/pALK1775/n° 8

n° 6 RF6078 2431

RF5796/pALK1775/n° 13

n° 6 RF6078 3505

RF5796/pALK1775/n° 21

n° 6 RF6080 2541

RF5798/pALK1775/n° 22

n° 6 RF6081 1697

RF5798/pALK1775/n° 29

n° 6 RF6082 3096

En la Tabla 5, el numero de construccion se refiere al de la Tabla 1; el numero RF se refiere a que los transformantes se denominaron como cepas RF.

Las cepas de T. reesei RF5582, RF5583, RF6036, RF5977 y RF5978 se cultivaron en un biorreactor para ensayos

5 de aplicacion. Algunas preparaciones se trataron con calor (pH 6,0, 65 °C, 60 - 70 min) para inactivar cualquier actividad enzimatica endogena remanente de T. reesei. La 20K+CBO es relativamente termoestable (Miettinen0inonen et al. 2004), y no se desnaturaliza durante el tratamiento.

EJEMPLO 3. Producción de las proteínas de fusión 20K + CBD mutantes por afinidad en T. reesei

La enzima 20K de Melanocarpus albomyces (cel45A, AC N° AJ515703) se fusiono con el dominio de union a

10 celulosa (CBO) de CBHI de Trichoderma reesei, en el que los restos de tirosina conservados en las posiciones 31 (correspondiente a Y492 del polipeptido maduro) y/o 32 (correspondiente a Y493 del polipeptido maduro) se mutaron a alanina como describen Linder et al., 1995. Ademas, el resto de tirosina en la posicion 31 se reemplazo por triptofano, un aminoacido encontrado de forma natural en la region CBO de, por ejemplo, CBHI de Humicola grisea (Azevedo et al., 1990) y EGV de T. reesei (CeI45A, Saloheimo et al., 1994). Los CBO mutados se construyeron por

15 PCR, y las sustituciones de aminoacidos de Y31A, Y32A, Y31W e Y31A Y32A se incluyeron en el dominio de union a celulosa de CBHI de T. reesei (numeracion de acuerdo con la secuencia de aminoacidos del CBO). En todas las construcciones se uso el cebador director: 3 BamMly: 5'-TAGGATCCGAGTCCCATTACCGGCAACCCTAGCG-3' (SEC IO. N°: 18). Los cebadores inversos usados para la amplificacion de los diferentes productos del CBOmut se describen en la Tabla 6. Las mezclas de reaccion de la PCR contenian tampon de reaccion 1x PfuUltra™ HF

20 (Stratagene, USA) proporcionando una concentracion de Mg2+ 2 mM, dNTP 0,2 mM, 2 !M de cada cebador y 1,5 unidades de AON polimerasa PfuUltra™ HF (Stratagene, Estados Unidos) y aproximadamente 45 ng del plasmido pALK492 como molde. El plasmido pALK492 (Fig. 2) contiene el gen cbh1 de T. reesei. Las condiciones para las reacciones de la PCR fueron las siguientes: desnaturalizacion inicial durante 2 min a 95 °C, seguido de 30 ciclos de 1 min a 95 °C, hibridacion durante 1 min. a 65 °C (gradiente ±5 ° C), extension durante 2 min. a 72 °C y una

25 extension final a 72 °C durante 10 min.

Tabla 6. Cebadores inversos de la PCR diseñados para amplificar productos CBD mutados

Cebador

Longitud (nucleótidos) Secuencia, inversa Sustitución deaminoácidos SecuenciaID Nº

XhoAge Y31A

69 5'-TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGCTTTACAGGCACTGAGAGTAGGCAGGGTTCAGG Y31A SEC IO N°: 27

XhoAge Y32A

69 5'-TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGCTTTACAGGCACTGAGAGGCGTAAGGGTTCAGG Y32A SEC IO N°: 28

XhoAge Y31W

69 5'-TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGCTTTACAGGCACTGAGAGTACCAAGGGTTCAGG Y31W SEC IO N°: 29

XhoAge Y31A-Y32A

69 5'-TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGCTTTACAGGCACTGAGAGGCGGCAGGGTTCAGG Y31A Y32A SEC IO N°: 30

Todas las combinaciones de cebadores produjeron el fragmento de AON especifico en las reacciones de la PCR a una temperatura de hibridacion de 60 °C. Los productos de la PCR se aislaron de estas reacciones, se sometieron a digestion con enzimas de restriccion XhoI y BamHI y despues se clonaron con pBluescript II KS+ (Stratagene, USA). Los plasmidos obtenidos se denominaron pALK1884 (mutacion Y31A), pALK1885 (mutacion Y32A), pALK1886 5 (mutacion Y31W) y pALK1887 (mutaciones Y31A Y32A). Los fragmentos de la PCR en los plasmidos se confirmaron por secuenciacion. Los insertos digeridos con Mlyl y AgeI de los plasmidos pALK1884 a pALK1887 se ligaron posteriormente a un fragmento vectorial pALK1760 digerido con NruI y AgeI que contenia el gen de 20K de longitud completa de Melanocarpus albomyces fusionado con el promotor cbh1 (cel7A) y el terminador de T. reesei La parte C terminal del gen 20K en pALK1760 se modifico de tal manera que el ligamiento del fragmento CBO 10 produjo un punto de union de PAVQIPSS (construccion n° 5), que se observo que daba como resultado un producto de fusion estable en T. reesei como se describe en los Ejemplos 1 y 2. En la etapa final, el marcador amdS se aradio como un fragmento SpeI-EcoRI de extremo romo (4,5 kb) del plasmido p3SR2 (Fig. 6) para obtener plasmidos de expresion de pALK1877 (mutacion Y31A), pALK1878 (mutacion Y32A), pALK1879 (mutacion Y31W) y pALK1880 (mutacion Y31A Y32A) para la produccion de enzimas de fusion 20K+CBOmut en T. reesei. En la Fig. 11B 15 se muestran las secuencias de aminoacidos de la proteina de fusion 20K con el peptido engarzador seguido por la region CBO mutada. Los plasmidos de expresion se confirmaron por secuenciacion, y los casetes de expresion lineales de 8,4 kb (Fig. 11A) se aislaron de la estructura vectorial despues de digestion con Notl y se transformaron en protoplastos RF5796 de T. reesei. Las transformaciones se realizaron en Penttila et al. (1987) con las modificaciones descritas en Karhunen et al. (1993), seleccionando con acetamida como una unica fuente de

20 nitrogeno. Los transformantes se purificaron en placas de seleccion a traves de conidios sencillos antes de esporularlos en PO.

La produccion de 20K+CBOmut de los transformantes se analizo del sobrenadante de cultivo de los cultivos en matraz agitador (50 ml). Los transformantes se cultivaron durante 7 dias en un medio inductor de celulasa complejo (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con KH2P04 al 5 %, a pH 5,5. La actividad enzimatica de la proteina de fusion se 25 midio como la liberacion de azucares reductores de carboximetilcelulosa (CMC al 3 %) a 50 °C en tampon Hepes 50 mM, pH 7,0 durante 10 min (actividad NCU, nkat; Bailey y Nevalainen, 1981; Haakana et al., 2004). Las actividades NCU de los transformantes de mejor produccion se muestran en la Tabla 7. Los genotipos de los transformantes seleccionados se confirmaron usando transferencia de Southern, en las que se incluyeron diversas digestiones genomicas y como sonda se uso el casete de expresion respectivo. La proteina 20K+CBOmut se detecto del

30 sobrenadante de cultivo usando anticuerpos policlonales suscitados contra la celulasa neutra 20K purificada de Melanocarpus albomyces (Haakana et al. 2004) y el sistema AP de transferencia de Western ProtoBlot (Promega). El analisis de transferencia de Western mostro que las enzimas de fusion 20K+CBOmut se produjeron como proteinas de fusion estables en T. reesei.

Tabla 7. Actividades NCU de los transformantes 20K+CBDmut seleccionados a partir de cultivo en matraz 35 agitador

Transformante

Sustitución de aminoácido Número RF Actividad celulasa neutra, NCU/ml

pALK1877/n° 26

Y31A RF6084 3658

pALK1877/n° 34

Y31A RF6085 2447

pALK1878/n° 02

Y32A RF6086 3434

pALK1878/n° 13

Y32A RF6088 2915

pALK1879/n° 13

Y31W RF6090 2545

pALK1879/n° 24

Y31W RF6091 3452

pALK1880/n° 06

Y31A Y32A RF6092 3415

pALK1880/n° 25

Y31A Y32A RF6094 2727

El numero RF se refiere a que los transformantes se denominaron como cepas RF.

Las cepas RF6084 a RF6086, RF6088, RF6090 a F6092 y RF6094 se fermentaron para obtener material para los ensayos de aplicacion (vease los EJEMPL0S 9-11).

40 EJEMPLO 4. Producción de las proteínas de fusión 20K+CBD con deleción de engarce en T. reesei.

La enzima de 20K de Melanocarpus albomyces se fusiono con el dominio de union a celulosa (=CBO) de CBHI de Trichoderma reesei, que posteriormente se modifico introduciendo deleciones en el peptido de engarce interdominio. Las deleciones de engarce se diseraron de acuerdo con Srisodsuk et al., 1993. La delecion de aminoacidos de la posicion 434 a 444 (mutante "G-444) del polipeptido maduro elimina aproximadamente un tercio del engarce 45 incluyendo la secuencia repetida rica en glicina y prolina pero dejando todos los supuestos sitios de O-glucosilacion intactos. La delecion de restos de la posicion 434 a 460 (Mutante "G-460) elimina practicamente todo el engarce

(Fig. 12A). Tambien se construyeron deleciones de engarce 20K+CBO adicionales que tenian una mutacion de afinidad doble de Y31A Y32A en la region CBO.

Se realizaron reacciones PCR para introducir las deleciones al peptido engarzador, asi como la sustitucion de aminoacidos a la region CBO. Las amplificaciones PCR se realizaron como se describe en el Ejemplo 3, excepto que 5 se utilizo una temperatura de hibridacion de 60 °C (gradiente ±5 °C). Se utilizaron los cebadores directos

5'- TAGGATCCGAGTCCCATTACCGGCAACCCTAGCACCACCACCACCCGCCGCCCAGCC-3' (SEC IO N°: 31) y

5' -TAGGATCCGAGTCCCATTACCGGCAACCCTAGCCCTACCCAGTCTCACTACGGCCAGTGC-3' (SEC IO N°: 32) para sintetizar las deleciones de engarce de "G-444 y "G-460, respectivamente. Correspondientemente, se uso el cebador inverso 5'-TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGCTTTACAGG-3'(SEC IO N°: 33) para

10 amplificar la region CBO intacta de la CBHI de T. reesei. La mutacion Y31A Y32A en la region CBO se genero con el cebador inverso

5'-TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGCTTTACAGGCACTGAGAGGCGGCAGGGTTCAGG-3' (SEC IO. N°: 30).

Todas las combinaciones de cebadores produjeron el fragmento de AON especifico en las reacciones de la PCR

15 desde el intervalo de temperaturas de hibridacion de 55,2 °C a 65,0 °C. Los plasmidos de expresion pALK1893 (delecion "G-444), pALK1896 (delecion "G-460), pALK1899 (delecion "G-444, mutacion Y31A Y32A) y pALK1952 (delecion "G-460, mutacion Y31A Y32A) se construyeron como se describe en el Ejemplo 3. En la Fig. 12 se muestran las secuencias de aminoacidos de la fusion de la proteina 20K con el peptido de engarce truncado seguido por el CBO intacto o mutado. Se aislaron los casetes de expresion lineales de 8,3 kb de la estructura vectorial

20 despues de digestion con EcoRI y se transformaron en protoplastos RF5796 de T. reesei. La transformacion, la purificacion de transformantes, los cultivos en matraz agitador, las mediciones de actividad, las hibridaciones de transferencia de Southern y los analisis de transferencia de Western se realizaron como se describe en el Ejemplo 3.

Tabla 8. Actividades NCU de los transformantes seleccionados 20K+CBD con deleción de engarce a partir de cultivo en matraz agitador

Transformante

Deleción de engarce/ Sustitución de aminoácidos Número RF Actividad celulasa neutra, NCU/ml

pALK1893/n° 08

"G-444 RF6107 1182

pALK1893/n° 10

"G-444 RF6108 2058

pALK1896/n° 05

"G-460 RF6110 2576

pALK1896/n° 07

"G-460 RF6111 2628

pALK1899/n° 07

"G-444, Y31a Y32A RF6112 1947

pALK1899/n° 20

"G-444, Y31a Y32A RF6114 2462

pALK 1952/n° 01

"G-460, Y31a Y32A RF6115 2428

pALK1952/n° 17

"G-460, Y31a Y32A RF6116 1738

El numero RF se refiere a que los transformantes se denominaron como cepas RF.

Las cepas seleccionadas RF6107, RF6108, RF6110 a RF6112 y RF6114 a RF6116 se fermentaron para obtener material para los ensayos de aplicacion (Ejemplos 9 a 11). Los analisis de transferencia de Western mostraron que las enzimas fusion 20K+CBO con delecion de engarce se produjeron como proteinas de fusion estables en T.

30 reesei.

EJEMPLO 5. Producción de la proteína de fusión 50K+CBD recombinante de Melanocarpus albomyces en T. reesei (Referencia)

Se diseraron construcciones de plasmidos para unir la secuencia codificante de 50K (cel7A, AC n° AJ515704) de Melanocarpus albomyces con la region de engarce y el dominio de union a celulosa (CBO) de la CBHI de T. reesei 35 (cel7A, AC n° AR088330; Srisodsuk et al. 1993). El plasmido pALK1237 (Fig. 4), que es una base para las nuevas

construcciones, contenia el gen cel7A bajo el control del promotor cbh1 de T. reesei como una fusion exacta.

En primer lugar, se introdujo un solo sitio de restriccion Nrul cerca del extremo C de la secuencia codificante 50K. Esto permite la fusion directa de cualquier AON con extremo romo despues del aminoacido S393 del polipeptido 50K maduro (Fig. 13B). Se realizo una reaccion de PCR con los cebadores 2 50K NruISpel (5' CGGCACTAGTTCGCGACCCGATCTCGCCCCAGCGCAGG 3'; SEC IO N°: 25) y 50K Xhol (5' CGCCGAGGGCCGGCTCGAGAGCATCC 3'; SEC IO N°: 26) usando como molde pALK1237. La reaccion de la PCR contenia el tampon de reaccion 1x OyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlandia), dNTP 0,25 mM, 0,5 !M de cada cebador, 2,0 unidades de AON polimerasa OyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlandia) y aproximadamente 50 ng/100 !l de AON molde pALK1237. Las condiciones para la amplificacion de la PCR fueron las siguientes: desnaturalizacion inicial durante 5 min. a 96 °C, seguido de 25 ciclos de hibridacion durante 15 s a 96 °C, durante 60 s a 56 °C o 61 °C, extension durante 60 s a 72 °C, y una extension final a 72 °C durante 10 min. El producto de la PCR se sometio a digestion con las enzimas de restriccion XhoI y Spel y se purifico del gel de agarosa. El fragmento de la PCR purificado se ligo en el fragmento de restriccion de 6,9 kb de Xhol-Spel del plasmido pALK1237 y se transformo en E. coli XL1-Blue (Stratagene, USA). El AON plasmidico se aislo de los transformantes y se verificaron tres candidatos por secuenciacion. El clon seleccionado se denomino pALK1703.

El engarce+CBO de CBHI de T. reesei se amplifico por PCR con los cebadores 3 BamMly 50 (5' TTGGATCCGAGTCGCAGCACCGGCAACCCTAGCG 3'; SEC IO N°: 36) y XhoAge (5' TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGC 3'; SEC IO N°: 15) usando, como molde, pALK492. Las condiciones de reaccion de la PCR fueron como se ha descrito anteriormente, excepto que el tiempo de extension en la reaccion de amplificacion fue de 90 s. El producto de la PCR se sometio a digestion con las enzimas Mlyl y Agel y se purifico del gel de agarosa. El fragmento de la PCR que contenia el engarce+CBO se ligo en el fragmento de restriccion de 6,8 kb de Agel-Nrul de pALK1703 y se transformo en E.coli XL1-Blue (Stratagene, Estados Unidos). Los transformantes se analizaron como se ha descrito anteriormente y un clon adecuado se denomino pALK1704.

Para permitir la seleccion de los transformantes de T. reesei, se inserto el gen marcador amdS y la region 3' flanqueante cbhl de T. reesei en el plasmido vectorial pALK1704. Se aislo un fragmento de restriccion de 4,8 kb de EcoRI-Spel de pALK424 (documento US 5.837.515) y los extremos del fragmento se rellenaron con la enzima Klenow. El fragmento del marcador amdS con extremo romo se ligo en el pALK1704 digerido con Stul y se transformo en E. coli XL1-Blue (Stratagene, Estados Unidos). El AON plasmidico se aislo de los transformantes y la orientacion deseada del inserto se verifico por enzimas de restriccion. El transformante seleccionado se denomino pALK1708.

Se aislo un casete de expresion lineal de 9,2 kb (Fig. 13A) de la estructura pALK1708 por digestion con EcoRI, se transformo en protoplastos RF5636 de T. reesei (derivado de la cepa QM6a; Bailey y Nevalainen, 1981) y los transformantes se seleccionaron con acetamida como unica fuente de nitrogeno. La cepa hospedadora carecia de tres celulasas principales endogenas: CBHII (CeI6A), EGI (CeI7B) y EGII (CeI5A). La transformacion se realizo de acuerdo con Penttila et al. (1987) con las modificaciones descritas por Karhunen et al. (1993). Los transformantes se purificaron en placas de seleccion a traves de conidios sencillos antes de esporularlos en PO.

Se analizo la produccion de la proteina de fusion 50K+CBO de los transformantes del sobrenadante de cultivo de cultivos en matraz agitador (50 ml). Los transformantes se cultivaron durante 7 dias en un medio inductor de celulosa complejo (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con KH2P04 al 5 % a pH 5,5. La actividad enzimatica de la proteina de fusion se midio como la liberacion de azucares reductores de carboximetilcelulosa (CMC al 3 %) a 50 °C en tampon Hepes 50 mM, pH 7,0 (actividad NCU; Bailey y Nevalainen 1981; Haakana et al. 2004). La actividad de los transformantes vario de 2035 a 3633 NCU/ml. La proteina 50K+CBO se detecto del sobrenadante de cultivo por el sistema AP de transferencia de Western ProtoBlot (Promega) usando anticuerpos policlonales suscitados contra la celulasa neutra 50K purificada de Melanocarpus albomyces (Haakana et al. 2004). El analisis de transferencia de Western mostro que la proteina de fusion 50K+CBO producida de T. reesei es estable. Se analizaron los genotipos de los transformantes seleccionados por transferencia de Southern usando, como sonda, el casete de expresion. El posible direccionamiento del casete de expresion del locus cbhl tambien se verifico por transferencia de Western usando anticuerpos monoclonales CBHI (CI-261, Aho et al. 1991) para detectar la proteina CBHI.

EJEMPLO 6. Producción de la proteína de fusión 50KB+CBD recombinante de Melanocarpus albomyces en

T. reesei (Referencia).

Se diseraron las construcciones de plasmidos para unir la secuencia codificante 50KB de Melanocarpus albomyces (cel7B, AC n° AJ515705) con la region de engarce y el dominio de union a celulosa (CBO) de CBHI de T. reesei (cel7A, AC n° AR088330; Srisodsuk et al. 1993). El plasmido pALK1241 (Fig. 5), que es una base para las nuevas construcciones, contenia el gen cel7B bajo el control del promotor cbh1 de T. reesei como una fusion exacta.

En primer lugar, se introdujo un unico sitio de restriccion Nrul cerca del extremo C de la secuencia codificante 50KB. Esto permite la fusion directa de cualquier AON con extremo romo despues del aminoacido S426 del polipeptido 50KB maduro (Fig. 14B). Se realizo una reaccion de PCR con los cebadores 50KB NruIXhol (5' TCGTCTCGAGTCGCGATGGGGCCGAAGCGGATGTTGG 3'; SEC IO N°: 23) y 50KB Sphl (5' GGAGGGCATGCCCAACAGCAGCGAGATCACC 3'; SEC IO N°: 24) usando, como molde, pALK1241. La reaccion de la PCR contenia tampon de reaccion 1x OyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlandia), dNTP 0,25 mM, 0,5 !M de cada cebador, 2,0 unidades de AON polimerasa OyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlandia) y aproximadamente 50 ng/100 !l de AON molde pALK1241. Las condiciones para la amplificacion de la PCR fueron las siguientes: desnaturalizacion inicial durante 5 min. a 96 °C, seguido de 25 ciclos de hibridacion durante 15 s a 96 °C, durante 60 s de hibridacion a 56 °C o 60 °C, extension durante 60 s a 72 °C, y una extension final a 72 °C durante 5 min. El producto de la PCR se sometio a digestion con las enzimas de restriccion XhoI y Sphl y se purifico del gel de agarosa. El fragmento de la PCR purificado se ligo en el fragmento de restriccion de 6,9 kb de Xhol-Sphl del plasmido pALK1241 y se transformo en E. coli XL1-Blue (Stratagene, USA). El AON plasmidico se aislo de los transformantes y se verifico un candidato por secuenciacion. El clon seleccionado se denomino pALK1705.

El engarce+CBO de CBHI de T. reesei se amplifico por PCR con los cebadores 3 BamMly 50 (5' TTGGATCCGAGTCGCAGCACCGGCAACCCTAGCG 3'; SEC IO. N°: 18) y XhoAge (5' TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGC 3'; 15) usando, como molde, pALK492. Las condiciones de reaccion de la PCR fueron como se ha descrito anteriormente, excepto que el tiempo de extension en la reaccion de amplificacion fue de 90 s. El producto de la PCR se sometio a digestion con las enzimas Mlyl y Agel y se purifico del gel de agarosa. El fragmento de la PCR que contenia el engarce+CBO se ligo en el fragmento de restriccion de 7,2 kb de Agel-Nrul de pALK1705 y se transformo en E.coli XL1-Blue (Stratagene, Estados Unidos). Los transformantes se analizaron como se ha descrito anteriormente y un clon adecuado se denomino pALK1706.

Para permitir la seleccion de transformantes de T. reesei, el gen marcador amdS y la region 3' flanqueante cbhl de T. reesei se insertaron en el plasmido vectorial pALK1706. Se aislo un fragmento de restriccion de 4,8 kb de EcoRI-Spel de pALK424 (documento US 5.837.515) y los extremos del fragmento se rellenaron con la enzima Klenow. El fragmento marcador amdS con extremo romo se ligo en el pALK1706 digerido con Stul y se transformo en E. coli XL1-Blue (Stratagene, USA). El AON plasmidico se aislo de los transformantes y la orientacion deseada del inserto se verifico por digestion con enzimas de restriccion. El transformante seleccionado se denomino pALK1709.

Se aislo un casete de expresion lineal de 9,6 kb (Fig. 14A) de la estructura pALK1709 por digestion con EcoRI, se transformo en protoplastos RF5636 de T. reesei y se seleccionaron transformantes con acetamida como unica fuente de nitrogeno. La cepa hospedadora carecia de tres celulasas endogenas principales: CBHII (CeI6A), EGI (CeI7B) y EGII (CeI5A). La transformacion se realizo de acuerdo con Penttila et al. (1987) con modificaciones descritas por Karhunen et al. (1993). Los transformantes se purificaron en placas de seleccion a traves de conidios sencillos antes de esporularlos en PO.

Se analizo la produccion de la proteina de fusion 50K+CBO de los transformantes del sobrenadante de cultivo de cultivos en matraz agitador (50 ml). Los transformantes se cultivaron durante 7 dias en un medio inductor de celulosa complejo (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con KH2P04 al 5 % a pH 5,5. La actividad celobiohidrolasa de la proteina de fusion se midio usando el sustrato 4-metilumbeliferil-1-O-lactosido (actividad MUL; van Tilbeurgh et al. 1988). Se detecto la proteina 50KB+CBO del sobrenadante de cultivo por el sistema AP de transferencia de Western ProtoBlot (Promega) usando anticuerpos policlonales suscitados contra la celulasa 50KB purificada de Melanocarpus albomyces (Haakana et al. 2004). En el analisis de transferencia de Western no se detecto la proteina de 50KB de tipo silvestre lo que mostraba que la proteina de fusion 50KB+CBO producida de T. reesei es estable. Se analizaron los genotipos de los transformantes seleccionados por transferencia de Southern usando, como sonda, el casete de expresion. El posible direccionamiento del casete de expresion al locus cbhl tambien se verifico por transferencia de Western usando anticuerpos monoclonales CBHI (CI-261, Aho et al. 1991) para detectar la proteina CBHI.

EJEMPLO 7. Producción de las proteínas de fusión CBHI+CBD recombinantes de Thermoascus aurantiacus en T. reesei (Referencia)

La CBHI de Thermoascus aurantiacus (AC N° AF478686, Hong et al., 2003; SEC IO N°: 9) se fusiono con el engarce y el CBO de la CBHI de Trichoderma reesei (AC N° AR088330, Srisodsuk et al. 1993; SEC IO N°: 3). Primero, la secuencia codificante del engarce y el CBO de la CBHI de T. reesei se sintetizo por PCR usando los siguientes cebadores:

5'-TTAAACATATGTTATCTACTCCAACATCAAGGTCGGACCCATTGGCAGCACCGGCAACCCTAGCGGC-3' (secuencia directa, SEC IO N°: 34) y

5'-TATATGCGGCCGCACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGCTTTACAGGC-3 (secuencia inversa, SEC IO N°: 35).

La mezcla de la reaccion de la PCR contenia tampon de reaccion 1x OyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlandia), Mg2+ 15 mM, dNTP 0,2 mM, 2 !M de cada cebador, 0,6 unidades de AON polimerasa OyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlandia), y aproximadamente 75 ng/30 !l del molde pALK492. El plasmido pALK492 contiene el gen cbh1 (cel7A) de T. reesei. Las condiciones para la reaccion de la PCR fueron las siguientes: desnaturalizacion inicial durante 2 min, a 98 °C, seguido de 30 ciclos de hibridacion durante 30 s a 98 °C, durante 30 s a 68 °C (gradiente ±4 °C), extension durante 30 s a 72 °C y una extension final a 72 °C durante 10 min. El fragmento de AON especifico en

la reaccion de la PCR se obtuvo a un intervalo de temperatura de hibridacion de 64 °C a 68,5 °C. El fragmento CBO sintetizado, que contiene tambien la secuencia de nucleotidos 3'-terminal del gen cbh1 de Thermoascus aurantiacus, se sometio a digestion con las enzimas de restriccion Ndel y Notl y el fragmento se aislo del gel de agarosa despues de electroforesis. Oespues de esto, el fragmento de la PCR aislado se ligo con el fragmento del vector pALK1649 (Fig. 7) digerido con Ndel y Notl que contenia el gen cbh1 de longitud completa de Thermoascus aurantiacus. El plasmido obtenido se denomino pALK1888, y el fragmento amplificado por PCR en el plasmido se confirmo por secuenciacion. Como resultado de la fusion, la parte C-terminal de la CBHI de Thermoascus aurantiacus en el plasmido pALK1888 contenia un punto de union de GPIGST (Fig. 15B). El inserto sometido a digestion con SacII y Agel del pALK1888 plasmidico se ligo con el fragmento del vector pALK1694 (Fig. 8) sometido a digestion con SacII y Agel, lo que produjo la fusion de CBHI+CBO de Thermoascus aurantiacus con el promotor cbh1 (cel7A) de T. reesei (una fusion exacta) y con el terminador. En la etapa final, se aradio el fragmento marcador amdS, como se describe en el Ejemplo 3, para obtener el plasmido de expresion de pALK1890 para la produccion de la enzima de fusion CBHI+CBO recombinante de Thermoascus aurantiacus en T. reesei. La secuencia de aminoacidos de la fusion de la proteina CBHI de Thermoascus aurantiacus con el peptido engarzador seguido de la region CBO de la CBHI de T. reesei se muestra en la Fig. 15B.

El plasmido de expresion se confirmo por digestiones con enzimas de restriccion, y el casete de expresion lineal de 8,9 kb (Fig. 15A) se aislo de la estructura vectorial despues de digestion con Notl y se transformo en protoplastos RF5796 de T. reesei. Las transformaciones se realizaron como en Penttila et al. (1987) con las modificaciones descritas en Karhunen et al. (1993). Los transformantes se purificaron en placas de seleccion a traves de conidios sencillos antes de esporularlos en PO.

La produccion de CBHI+CBO de Thermoascus aurantiacus de los transformantes se analizo del sobrenadante de cultivo de los cultivos en matraz agitador (50 ml). Los transformantes se cultivaron durante 7 dias en un medio inductor celulasa complejo (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con KH2P04 al 5 % a pH 5,5. La actividad celobiohidrolasa se ensayo usando el sustrato 4-metilumbeliferil-1-O-lactosido (MUL) de acuerdo con van Tilbeurgh et al. 1988. Los genotipos de los transformantes seleccionados se confirmaron usando transferencias de Southern en las que se incluyeron diversas digestiones genomicas y como sonda se uso el casete de expresion. Los analisis SOS-PAGE mostraron que la enzima CBHI+CBO recombinante de Thermoascus aurantiacus se produjo como una proteina de fusion estable en T. reesei.

EJEMPLO 8. Rendimiento de las preparaciones de la proteína de fusión 20K+CBD en bioacabado/biolavado a la piedra de tela vaquera

Las proteinas de fusion 20K + CBO producidas, como se describe en el Ejemplo 2, usando Trichoderma como hospedador, se sometieron a ensayo para determinar su capacidad en el biolavado a la piedra de tela vaquera para crear un aspecto desgastado similar al proporcionado por la piedra pomez. Para realizar la comparativa se utilizo una preparacion comercial de 20K eficaz en el acabado de tela vaquera.

Como material de ensayo se utilizaron vaqueros ingleses confeccionados con tela vaquera terida con indigo con fondos de azufre despues de eliminar el apresto con alfa-amilasa EC0ST0NE® A200. Los hilos de urdimbre y trama del tejido se hilaron en anillo. Los tratamientos con celulasa se realizaron con la lavadora extractora Wascator F0M 71 CLS de Electrolux en las condiciones descritas en la Tabla 9.

Tabla 9. Condiciones de ensayo utilizadas para los tratamientos con celulasa

Parámetro del proceso

Carga de tela vaquera

1,3 kg

Agua

19 l

Tampon/control de pH (pH 6,5)

Na2HP04.H20 31,6 g Acido citrico 10,5 mg

Tiempo

55 min

Temperatura

60 °C

Oosificacion de celulasa

250 - 3000 NCU/g tejido

Las enzimas se dosificaron como unidades de actividad de celulasa neutra (NCU) por peso de tejido. La enzima celulasa se inactivo despues de escurrir elevando el pH por encima de 11 aradiendo 5 g de Na0H (10 min, 40 °C) y aclarando tres veces. Los vaqueros se secaron en una secadora. En cada ensayo se utilizaron dos pares de vaqueros.

El nivel de efecto/abrasion con el biolavado a la piedra se evaluo midiendo el color como valores de reflectancia con un espectrofotometro Minolta CM 2500 o CM 1000 usando las coordenadas de espacio de color L*a*b* (iluminante O65/2°). El color de la tela vaquera del anverso y del reverso (datos no mostrados) se midio despues del eliminar el apresto (es decir, antes del tratamiento con la celulasa) y despues del tratamiento con la celulasa. Cada medicion fue el promedio de aproximadamente 40 mediciones. Se utilizaron dos pares de vaqueros en cada ensayo y el resultado final es el promedio de ellos. La luminosidad o aumento de luminosidad despues del tratamiento enzimatico se uso para evaluar el efecto de abrasion (rendimiento o efecto de biolavado a la piedra). Los resultados se muestran en las Tablas 10 y 11, en las que los datos en negrita se usan para para destacar niveles de abrasion similares y dosificaciones equivalentes. Se utilizaron tratamientos con 20K o sin enzima para realizar comparativas. Algunas de las preparaciones (Tabla 11) se habian tratado con calor (pH 6,0, a 65 °C, durante 60 a 70 min) para inactivar cualquier reactividad enzimatica endogena remanente de T. reesei y/o para ensayar el efecto del tratamiento con calor sobre la estabilidad de la enzima.

Tabla 10. Mediciones de color del anverso de tela vaquera tratada con las proteínas de fusión 20K+CBD

Cepa Nº

Enzima NCU/g tejido Antes del tratamientocon celulasa Después del tratamientocon celulasa Aumento deL*

L*

b* L* b*

-

Sin enzima 0 16,77 -9,95 18,18 -12,39 1,42

-

20K 1 3000 16,80 -9,70 24,00 -14,71 7,20

-

20K 1 1500 16,73 -10,05 22,98 -14,62 6,25

RF6036

20K + CBO 500 16,41 -10,14 22,80 -14,19 6,40

RF5977

20K + CBO 250 16,68 -9,91 22,81 -14,47 6,13

RF5977

20K + CBO 500 16,73 -10,01 24,07 -14,70 7,34

RF5977

20K + CBO 1500 16,71 -9,68 25,63 -14,79 8,93

L* indica la luminosidad, -b* es la direccion azul, +b* es la direccion amarilla.1Preparacion comercial

Tabla 11. Mediciones de color del anverso de la tela vaquera tratada con las proteínas de fusión 20K+CBD tratadas con calor

Cepa Nº

Enzima NCU/g tejido Antes del tratamientocon celulasa Después del tratamientocon celulasa Aumento deL*

L*

b* L* b*

-

Sin enzima 0 16,77 -9,95 18,18 -12,39 1,42

-

20K 1 (no tratada con calor) 3000 16,80 -9,70 24,00 -14,71 7,20

-

20K 1 (no tratada con calor) 1500 16,73 -10,05 22,98 -14,62 6,25

RF5206

20K CBHI 3000 16,80 -10,00 22,61 -14,59 5,81

RF5582

20K+CBO construccion n° 1, CBHI 3000 16,83 -10,01 26,39 -15,13 9,56

RF5582

20K+CBO- construccion n° 1, CBHI 1000 16,61 -9,76 23,98 -14,98 7,37

RF5582

20K+CBO- construccion n° 1, CBHI- 500 16,70 -9,93 22,75 -14,75 6,05

RF5583

20K+CBO-construccion n° 2, CBHI 3000 16,73 -9,98 24,78 -14,95 8,05

RF5583

20K+CBO- construccion n° 2, CBHI 1000 16,92 -9,92 22,73 -14,75 5,81

RF5583

20K+CBO- construccion n° 2, CBHI 500 16,62 -10,03 21,76 -14,37 5,14

RF5977

20K+CBO- construccion n° 5,2 500 16,56 -9,77 23,00 -14,55 6,45

L* indica la luminosidad, -b* es la direccion azul, +b* es la direccion amarilla.1Preparacion comercial, 2 CBHI-, CBHII-, EGI-, EGII

Los resultados indicados en la Tabla 10 y en la Fig. 16 muestran que el rendimiento de lavado de las proteinas de fusion 20K+CBO de la invencion en el tratamiento de tela vaquera mejoro enormemente en comparacion con las cepas 20K. Con la cepa RF5977 podia usarse una dosificacion enzimatica tan baja como 250 NCU/g tejido para obtener un nivel de abrasion similar (luminosidad L*) en comparacion con el obtenido con la dosificacion de 1500 NCU/g de 20K. Por tanto se obtuvo un rendimiento de lavado 6 veces mejor y el contraste fue bueno. Ademas el rendimiento del lavado obtenido con la cepa RF5978 fue similar al obtenido con RF5977.

El tratamiento con calor de las preparaciones de la proteina de fusion parecieron disminuir algo el efecto de lavado a la piedra, por ejemplo, con la cepa RF5977 se necesito una dosificacion de 500 NCU/g de tejido para obtener el mismo nivel de abrasion al obtenido con la dosificacion de 250 NCU/g de la preparacion enzimatica no tratada con calor (Tabla 10). Sin embargo, se consiguio una mejora triplicada en el resultado del lavado en comparacion con una preparacion de la tecnica anterior.

EJEMPLO 9. Rendimiento de las preparaciones de proteína de fusión 20K+ CBD mutante por afinidad y proteína de fusión 20K+CBD con deleción de engarce en bioacabado/biolavado a la piedra de tela vaquera.

Las enzimas de fusion 20K + CBO mutante por afinidad producidas usando Trichoderma como hospedador descritas en el Ejemplo 3 y las proteinas de fusion 20K + CBO con delecion de engarce producidas usando Trichoderma como hospedador, como se describe en el Ejemplo 4, se sometieron a ensayo para determinar su capacidad en el biolavado a la piedra de tela vaquera. Para realizar la comparativa se utilizo una preparacion comercial de 20K eficaz en el acabado de tela vaquera.

La tela vaquera y los sistemas de ensayo para el biolavado a la piedra fueron como se indica en el Ejemplo 8. Ademas el efecto del tratamiento con celulasa se evaluo como en el Ejemplo 8. Los resultados del ensayo del biolavado a la piedra de las preparaciones de la proteina de fusion 20K+CBO mutante por afinidad y de la proteina de fusion 20K+CBO con delecion de engarce se muestran en la Tabla 12.

La cepa RF6090 con la sustitucion de aminoacido Y31W mostro excelente rendimiento de lavado (aproximadamente 6 veces mejor que con 20K) y buen contraste. La eficacia de la cepa RF6090 en comparacion con 20K puede observarse claramente tambien en la Fig. 16. La cepa RF6084 con la sustitucion de aminoacido Y31A fue aproximadamente 1,5 veces mejor que 20K. Las proteinas de fusion 20K+CBOmut con una sustitucion de aminoacido Y32A o Y31A Y32A tuvieron un efecto de biolavado a la piedra inferior que 20K. El resultado del lavado de las proteinas con delecion de engarce 20K+CBO en el tratamiento de tela vaquera mejoro enormemente en comparacion con la cepa 20K y se obtuvo un buen contraste. Con la cepa RF6108 ("G-444) el resultado del lavado fue al menos 6 veces mejor que con 20K y con la cepa RF6110 ("G-460) fue aproximadamente 3 veces mejor.

Tabla 12. Mediciones de color del anverso de la tela vaquera tratada con las proteínas de fusión 20K+ CBD mutante por afinidad y 20K+CBD con deleción deengarce

Cepa Nº

Enzima(sustitución de aminoácidos) Actividad/gtejido Antes del tratamientocon celulasa Después del tratamientocon celulasa Aumento deL*

L*

B* L* B*

-

Sin enzima 0 16,77 -9,95 18,18 -12,39 1,42

-

20K 1 3000 16,80 -9,70 24,00 -14,71 7,20

-

20K 1 1500 16,73 -10,05 22,98 -14,62 6,25

RF6086

20K +CBOmut(Y32A) 1500 16,83 -9,68 22,05 -14,14 5,22

RF6086

20K +CBOmut(Y32A) 3000 16,68 -9,76 23,30 -14,40 6,62

RF6084

20K +CBOmut(Y31A) 1000 16,83 -9,42 23,15 -14,26 6,32

RF6090

20K +CBOmut(Y31W) 250 16,79 -9,32 22,99 -14,24 6,21

RF6090

20K +CBOmut(Y31W) 1000 16,77 -9,22 25,10 -14,74 8,33

RF6094

20K +CBOmut(Y31A Y32A) 1500 16,78 -9,30 21,66 -14,02 4,89

RF6094

20K +CBOmut(Y31A Y32A) 3000 16,71 -9,36 22,27 -14,14 5,56

-

20K 1 3000 16,80 -9,70 24,00 -14,71 7,20

RF6108

20K + CBO ("G-444) 250 16,65 -9,59 23,62 -13,97 6,97

RF6110

20K + CBO ("G-460) 1000 16,81 -9,72 24,17 -14,39 7,37

L* indica la luminosidad, -b* es la direccion azul, +b* es la direccion amarilla. 1Preparacion comercial

EJEMPLO 10. Efecto de las proteínas de fusión 20K+CBD sobre la resistencia de la tela vaquera

Para las mediciones de resistencia, se seleccionaron algunos de los vaqueros obtenidos de los ensayos de lavado con las proteinas de fusion 20K+CBO (Ejemplos 8 y 9) que tuvieron un nivel de abrasion similar (L* - valor de aproximadamente 23 o 24 despues del tratamiento con celulasa). La resistencia al desgarro despues del tratamiento

5 con las proteinas de fusion 20K+CBO y con las muestras de control se midio por el metodo de Elmendof de acuerdo con la norma SFS-EN IS0 13937-1. Las muestras se cortaron en la direccion tanto de la trama como en la de la urdimbre. Los resultados se muestran en la Tabla 13.

Las proteinas de fusion de celulasa produjeron esencialmente la misma perdida de resistencia o inferior que con 20K, es decir, con algunas preparaciones la resistencia del tejido continuo siendo incluso superior. La perdida de

10 resistencia mas baja, en la direccion tanto de la urdimbre como de la trama, se obtuvo con la cepa RF6108 con la delecion de engarce "G-44. Ademas, la mutante por afinidad RF6090 con la sustitucion de aminoacido Y31W produjo una perdida de resistencia inferior que la 20K. La cepa RF5977 tuvo un efecto bastante similar sobre la resistencia del tejido en comparacion con 20K.

Algunos de los vaqueros lavados con las preparaciones de proteinas de fusion tratadas con calor (Ejemplo 8, Tabla

15 11) tambien se seleccionaron para las mediciones de resistencia al desgarro. Se observo que la resistencia del tejido mejoraba con algunas preparaciones tratadas con calor, pero debido al rendimiento de lavado reducido tuvieron que usarse dosificaciones mas altas para obtener el mismo nivel de abrasion.

Tabla 13. Mediciones de resistencia al desgarro de vaqueros tratados con las proteínas de fusión 20K+CBD de la invención

Cepa Nº

Proteína enzimática NCU/gtejido L* Urdimbre Trama

Resistenciaal desgarro (N)

(%) Resistenciaal desgarro (N) (%)

-

Sin enzima 0 1,5 62,2 100,0 46,2 100,0

-

20K 1 1500 22,9 46,3 74,4 31,9 69,0

RF5977

20K CBO 250 22,9 48,1 77,3 32,1 69,5

RF6086

20K +CBOmut (Y32A) 3000 23,1 46,6 74,9 30 64,9

RF6084

20K +CBOmut (Y31A) 1000 23,1 47,2 75,9 30,6 66,2

RF6090

20K +CBOmut (Y31W) 250 23,2 48,6 78,1 34,4 74,5

RF6094

20K +CBOmut (Y31A Y32A) 3000 22,3 48,4 77,8 32,9 71,2

-

20K 1 3000 23,9 47,6 76,5 28,9 62,6

RF6108

20K + CBO ("G-444) 250 23,8 54,3 87,3 35,2 76.2

RF6110

20K + CBO ("G-460) 1000 24,0 48,4 77,8 29,8 64,5

1 Preparacion comercial

EJEMPLO 11. Comparación de preparaciones de proteínas de fusión 20K+CBD seleccionadas con preparaciones enzimáticas de la técnica anterior

Las mejores proteinas de fusion 20K+CBO de los Ejemplos 8 y 9 se sometieron a ensayo con otro tipo de tela vaquera. Para realizar la comparativa, se utilizo la preparacion 20K (Ecostone® NP8500) eficaz en el acabado de 5 tela vaquera y dos preparaciones de la tecnica anterior disponibles en el comercio, OeniMax® 399S de Novozymes y Mex 500 de Meiji, que es la preparacion enzimatica solida mas concentrada disponible en el comercio.

El sistema de ensayo para el biolavado a la piedra fue como el descrito en el Ejemplo 8, excepto que la carga de la tela vaquera fue de 1 kg y la proporcion de licor por tanto ligeramente mas alta. En cada ensayo se utilizaron cinco trozos de tela vaquera ("perneras") confeccionados con sarga de tela vaquera australiana (Bradmill Textiles Pty,

10 Australia) despues de eliminar el apresto. Los hilos de la urdimbre y de la trama del tejido estaban hilados en anillo. Las enzimas se dosificaron como unidades de actividad NCU, de manera que se obtuvieron niveles de abrasion similares (medidos como luminosidad del anverso de la tela vaquera despues de tratamiento con celulasa). El efecto del tratamiento con celulasa se evaluo como en el Ejemplo 8, excepto que en cada pernera se realizaron 20 mediciones de color.

15 Se seleccionaron dos perneras con niveles de abrasion similares (L* - valor de aprox. 26 despues del tratamiento con celulasa) para cada ensayo de lavado para las mediciones de resistencia. La resistencia al desgarro despues del tratamiento con las proteinas de fusion 20K+CBO y con las muestras de control se midieron como en el Ejemplo

10. Los resultados se muestran en la Tabla 14 y en las Figuras 17A y 17B.

La resistencia al desgarro de la trama, que es un hilo tipicamente mas debil que el de la urdimbre, fue mayor con las

20 proteinas de fusion de las cepas RF5977, RF6090, RF6108 y RF6110 que con 20K. Con todas las cepas de las proteinas de fusion se obtuvo una mayor resistencia considerable en la direccion tanto de la urdimbre como de la trama en comparacion con OeniMax 399S y Mex 500. Ademas la cepa 20K fue menos contraproducente a la resistencia del tejido que las otras preparaciones de la tecnica anterior.

Tabla 14. Mediciones de la resistencia al desgarro de tela vaquera tratada con las proteínas de fusión 25 20K+CBD de la invención, 20K y preparaciones de la técnica anterior

Enzima

Forma L* Urdimbre Trama

Resistencia al desgarro (N)

Resistencia al desgarro (N)

Ecostone NP8500

polvo 25,9 58,0 40,3

RF5977, 20K+CBO

granulo 26,0 56,1 44,4

Mex 500, Meiji

polvo 26,1 48,4 31,1

OeniMax 3995, Novozymes

granulo 25,5 50,6 38,1

RF6090, 20K+CBOmut (Y31W)

liquido 26,0 57,9 43,4

RF6108, 20K+CBO ("G-444)

liquido 25,9 55,6 43,9

RF6110, 20K+CBO ("G-460)

liquido 26,9 59,8 45,4

Ejemplo 12. Rendimiento de la preparación 20K+CBD en el bioacabado (eliminación de acumulación de fibra en la superficie del tejido (depilling))

L* indica la luminosidad del anverso de la tela vaquera despues del tratamiento con celulasa.

El rendimiento de la proteina de fusion concentrada 20K+CBO en el bioacabado se sometio a ensayo. Para realizar

30 la comparativa se utilizo una preparacion de celulasa acida comercial, rica en EGII (US 5.874.293) usada en formulaciones de bioacabado, y un tratamiento sin enzima. Se realizaron tratamientos para eliminar la acumulacion de fibra en la superficie del tejido (depilling), con la lavadora extractora Wascator F0M 71 CLS de Electrolux en las condiciones descritas en la Tabla 15.

Como material de ensayo se utilizaron trozos de dos tipos de sueteres no usados confeccionados con algodon al

35 100 %: tejido basado en jersey y elastico con superficie cubierta de pelusa con material de relleno. En primer lugar las muestras se prelavaron durante 10 min a 60 °C con agentes tensioactivos/humectantes 1 ml/l (Sandoclean PCJ de Sandos e Imacol CN de Clariant) y se aclararon 3 veces. Oespues de esto, las prendas de algodon se trataron con celulasa a 60 °C durante 60 minutos en presencia de los mismos adyuvantes textiles a los utilizados en el prelavado. Oespues de escurrir, la enzima se inactivo (durante 10 min a 60 °C) elevando el pH por encima de 11 con

40 hidroxido sodico. Oespues, los trozos de prendas de punto se aclararon tres veces y se secaron en una secadora.

Tabla 15. Condiciones de ensayo/parámetros de procesado usados en los tratamientos de bioacabado

Parámetros de procesado

Carga del tejido

1,0 kg

Agua

15 litros

Sandoclean PC e Imacol CN

1 ml/l

Control de pH pH 5-5,3/pH 6-6,3

Ajuste con acido acetico (80 %)

Tiempo

60 min

Temperatura

60 °C

Oosificacion de celulasa

Oe 0,25 % a 0,63 % del peso del tejido

El efecto del tratamiento con celulasa se evaluo visualmente a simple vista y con una lupa. En la Tabla 16 se muestran los resultados y en la Fig. 18 se muestran fotografias tomadas con un macroobjetivo de una camara 5 digital.

La preparacion de la proteina de fusion 20K+CBO tuvo excelentes propiedades de bioacabado dando lugar a una amplia reduccion de formacion de pelusa (fuzzing) y prevencion de formacion de acumulacion de fibra en la superficie del tejido (pilling), lo cual puede observarse claramente en las fotografias (tomadas de las muestras elasticas) en la Fig. 18. Las muestras de control, especialmente las de jersey elastico, tratadas sin enzima, 10 contenian superficies densas cubiertas con pelusa y acusada acumulacion de fibra en la superficie del tejido (pilling). Con la preparacion 20K+CBO se obtuvo una superficie de prenda de punto muy clara incluso con la dosificacion mas reducida (0,25 % del peso del tejido, o.w.f. (of weight fabric)), correspondiente a una actividad celulasa neutra de 125 NCU/g de tejido. Esta dosificacion produjo un efecto casi tan bueno como el de una dosificacion doble. Usando una dosificacion de una preparacion de 20K+CBO al 0,5 % del peso del tejido se obtuvo un efecto similar de

15 eliminacion de acumulacion de fibra en la superficie del tejido (depilling), en comparacion con el uso de una dosificacion del 0,63 % o.w.f. de la preparacion rica en EG II, que se utilizo a la dosificacion tipica para este concentrado enzimatico en la aplicacion de biolavado. Ademas, el medio de cultivo de la proteina 20K+CBO producido por el hospedador recombinante es volumetricamente al menos dos veces tan eficaz en el bioacabado como el de EG II producido por un hospedador recombinante.

20 Tabla 16. Resultados de tratamientos de bioacabado con la proteína de fusión 20K+CBD en comparación con una preparación rica en EGII y control sin enzima

Muestra

Dosificación g Dosificación, % o.w.f.a) Efecto depilling b)

Conc. de 20K +CBO

5 0,50 +++++

Conc. de 20K +CBO

2,5 0,25 ++++

Conc. rica en EGII

6,3 0,63 +++++

Control, sin enzima

- - -

a) del peso de la fibra b) +++++ Excelente efecto (depilling) de eliminacion de acumulacion de fibra en la superficie del tejido, superficie visualmente muy limpia

25 ++++ Muy buen efecto (depilling) de eliminacion de acumulacion de fibra en la superficie del tejido, superficie visualmente limpia -Superficie densa cubierta con pelusa y/o acusada acumulacion de fibra en la superficie del tejido.

Ejemplo 13. Rendimiento de la preparación 20K+CBD en aplicaciones de detergentes

Se sometio a ensayo la eficacia de una preparacion de proteina de fusion 20K+CBO granulada con ciclos de lavado

30 repetidos en una lavadora domestica usando enzima del 0 al 0,5 % del peso de formulacion de detergente (detergente convencional ECE 98), que no contenia ninguna enzima. Las condiciones de ensayo se describen en la Tabla 17. La carga, la dosificacion de detergente y las condiciones principales de ensayo eran de acuerdo con la norma EN 60456:2003 aunque sin contaminantes adicionales. Las muestras de tejido se recogieron despues de 5, 10 y 15 lavados.

Tabla 17. Diseño del ensayo para ensayar el rendimiento de la preparación 20K+CBD

Artículo

Especificación

Concentracion de enzima en uso

0, 0,1, 0,25, 0,5 %

Lavadora

Siemens 1632 IQ

Programa de lavado

Programa de algodon estandar sin logica difusa

Oetergente

ECE 98, 50 g por lavado

pH del detergente en licor de lavado

11

Temperatura de lavado

40/60 °C

Oureza del agua

15 °fH

Carga

IEC60456:2003 carga 4 kg

Suciedad artificial aradida Total 38 piezas (37 x 37 cm) de cada tipo

Art. N° 101*, algodon manchado con negro de humo/ aceite de oliva Art. N° 163*, algodon manchado con papilla Art. N° 112*, algodon manchado con cacao

Tela de ensayo

Antiagrisado sobre el Art. N° 224* Resistencia a traccion sobre el Art. N° 224*

* del EMPA Test materialen AG, Suiza

Los resultados del ensayo sobre el antiagrisado, realizado sobre el articulo 224 (IS0 2267) y medido como diferencias de contraste color, se muestran en las Tablas 18 y 19 y en las Figuras 19 y 20. La diferencia de color se 5 midio mediante el metodo de tristimulus usando el colorimetro Spectraflash 500 (iluminante O65/10°)

La preparacion de la proteina de fusion 20K+CBO mostro un efecto positivo sobre el valor del color tristimulus Y y por lo tanto sobre el antiagrisado. El efecto de diferentes concentraciones enzimaticas fue casi el mismo. Oe por si, una concentracion enzimatica muy pequera (0,10 %) fue suficiente para el antiagrisado. Se obtuvieron efectos mas bien similares (datos no mostrados) con la proteina de fusion 20K+CBO en comparacion con la celulasa del

10 detergente comercial BI0T0UCH®OCC que contenia una actividad celulasa neutra (NCU) 1,8 veces superior.

Tambien se uso el articulo 224 para realizar mediciones sobre la resistencia a traccion (datos no mostrados) realizadas de acuerdo con la IS0 13934-1:1999 despues de 15 lavados. Ninguna de las concentraciones enzimaticas tuvo un efecto perjudicial sobre la resistencia a traccion. Todos los resultados estaban dentro de la desviacion entre si (variacion ±2,5 %). Lo mismo se aplico al estiramiento contra la carga a la rotura.

15 Tabla 18. Rendimiento de la proteína de fusión 20K+CBD en aplicaciones de detergentes. Oiferencia de contraste de color entre el antiagrisado del articulo 224 y el articulo original (no lavado) lavado con enzima

Temperatura de lavado, Conc. enzimática (%)

Diferencia (deltaY)

Después de 5 lavados

Después de 10 lavados Después de 15 lavados

40 °C, 0 %

-7,46 -10,39 -12,30

40 °C, 0,10 %

-5,78 -6,60 -8,01

40 °C, 0,25 %

-5,52 -6,08 -8,18

40 °C, 0,50 %

-4,85 -5,24 -7,56

60 °C, 0 %

-8,65 -11,43 -13,95

60 °C, 0,10 %

-5,77 -6,77 -8,41

60 °C, 0,250 %

-4,72 -5,70 -7,46

60 °C, 0,50 %

-4,33 -6,29 -7,44

Tabla 19. Rendimiento de la proteína de fusión 20K+CBD en aplicaciones de detergentes. Oiferencia de contraste de color entre el antiagrisado del articulo 224 lavado con enzima y lavado sin enzima.

Temperatura de lavado,

Diferencia (deltaY)

Conc. enzimática (%)

Después de 5 lavados Después de 10 lavados Después de 15 lavados

40 °C, 0 %

0 0 0

40 °C, 0,10 %

1,68 3,79 4,29

40 °C, 0,25 %

1,94 4,31 4,12

40 °C, 0,50 %

2,61 5,15 4,74

60 °C, 0 %

0 0 0

60 °C, 0,10 %

2,88 4,66 5,54

60 °C, 0,250 %

3,93 5,73 6,49

60 °C, 0,50 %

4,32 5,14 6,51

REFERENCIAS

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15 Proceedings of the second TRICEL symposium on TRICHODERMA REESEI CELLULASES ANO 0THER HYOR0LASES, Espoo, Finlandia, 1993, ed. por P. Suominen y T. Reinikainen. Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8 (1993): 153-158.

LISTA DE SECUENCIAS

5

�110� AB Enzymes 0y �120� Celulasas mejoradas

�130� 2050016

10

�160� 50

�170� PatentIn version 3.1

15

�210� 1 �211� 936 �212� AON �213� Melanocarpus albomyces

20

�400� 1

�210� 2 �211� 214 25 �212� PRT �213� Melanocarpus albomyces

�400� 2

�210� 3 �211� 1820 �212� AON �213� Trichoderma reesei

�400� 3

5 �210� 4 �211� 497 �212� PRT �213� Trichoderma reesei

10 �400� 4

�210� 5 �211� 1895 5 �212� AON �213� Melanocarpus albomyces

�400� 5

10 �210� 6 �211� 408 �212� PRT �213� Melanocarpus albomyces

�400� 6 �210� 7 �211� 2100 �212� AON

�213� Melanocarpus albomyces �400� 7

�210� 8 �211� 430 �212� PRT �213� Melanocarpus albomyces

�400� 8 �210� 9 �211� 3459 �212� AON

�213� Thermoascus aurantiacus �400� 9

�400� 10

�210� 11

�211� 27

5

�212� AON

�213� Cebador

�400� 11

tacgccatgg tcgtccagtc gaccagc

27

10

�210� 12

�211� 35

�212� AON

�213� Cebador

15

�400� 12

tacgccatgg tcgtccagtc gaccagcacgggcgg

35

�210� 13

20

�211� 46

�212� AON

�213� Cebador

�400� 13 tacgccatgg tcgtccagtc gaccagcacgggcggcgacc tcggca

46

�210� 14 �211� 40 �212� AON �213� Cebador

�400� 14 cgtactcgag tcatcgcgag ggggccttga agacggcgaa

40

�210� 15 �211� 30 �212� AON �213� Cebador

�400� 15 tgactcgaga ccggtgcgtc aggctttcgc

30

�210� 16 �211� 34 �212� AON �213� Cebador

�400� 16 taggatccga gtcccattgg cagcaccggc aacc

34

�210� 17 �211� 36 �212� AON �213� Cebador

�400� 17 taggatccga gtcctagcgg cggcaaccct cccggc

36

�210� 18 �211� 34 �212� AON �213� Cebador

�400� 18 taggatccga gtcccattac cggcaaccct agcg

34

�210� 19 �211� 55 �212� AON �213� Cebador

�400� 19 cgtactcgag tcatcgcgag ccgatggggc cgaaggcgaa gccgccgtcg tcgtg

55

�210� 20 �211� 52 �212� AON �213� Cebador

�400� 20 cgtactcgag tcatcgcgag ccgatctcgc cccagaagcc gccgtcgtcg tg

52

�210� 21 �211� 58 �212� AON �213� Cebador

�400� 21 cgtactcgag tcatcgcgac gaggggatct ggacggcggg gaagccgccg tcgtcgtg

58

�210� 22 �211� 52 �212� AON �213� Cebador

�400� 22 cgtactcgag tcatcgcgag ccgatctcgc cccaggcgaa gccgccgtcg tc

52

�210� 23 �211� 37 �212� AON �213� Cebador

�400� 23 tcgtctcgag tcgcgatggg gccgaagcgg atgttgg

37

�210� 24 �211� 31 �212� AON �213� Cebador

�400� 24 ggagggcatg cccaacagca gcgagatcac c

31

�210� 25 �211� 38 �212� AON �213� Cebador

�400� 25 cggcactagt tcgcgacccg atctcgcccc agcgcagg

38

�210� 26 �211� 26 �212� AON �213� Cebador

�400� 26 cgccgagggc cggctcgaga gcatcc

26

�210� 27 �211� 69 �212� AON �213� Cebador

�400� 27

�210� 28 �211� 69 �212� AON �213� Cebador

�400� 28

�210� 29 �211� 69 �212� AON �213� Cebador

�400� 29

�400� 30 �400� 37

�210� 30 �211� 69 �212� AON �213� Cebador

�210� 31 �211� 57 �212� AON �213� Cebador

�400� 31 taggatccga gtcccattac cggcaaccct agcaccacca ccacccgccg cccagcc

57

�210� 32 �211� 60 �212� AON �213� Cebador

�400� 32 taggatccga gtcccattac cggcaaccct agccctaccc agtctcacta cggccagtgc

60

�210� 33 �211� 45 �212� AON �213� Cebador

�400� 33 tgactcgaga ccggtgcgtc aggctttcgc acggagcttt acagg

45

�210� 34 �211� 67 �212� AON �213� Cebador

�400� 34

�210� 35 �211� 50 �212� AON �213� Cebador

�400� 35 tatatgcggc cgcaccggtg cgtcaggctt tcgcacggag ctttacaggc

50

�210� 36 �211� 34 �212� AON �213� Cebador

�400� 36 ttggatccga gtcgcagcac cggcaaccct agcg

34

�210� 38

�211� 207

�212� PRT

�213� Melanocarpus albomyces 15

�400� 38 �400� 39 �400� 40 �400� 41

�400� 42

�400� 43

�400� 44

10

�210� 45

�211� 69

�212� PRT

�213� Trichoderma reesei

15

�400� 45

�212� PRT

�213� Trichoderma reesei

�400� 46 �400� 47 �400� 49

10

�210� 48

�211� 69

�212� PRT

�213� Trichoderma reesei

15

�400� 48

10

�210� 50

�211� 42

�212� PRT

�213� Trichoderma reesei

15

�400� 50

Claims (34)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una proteina de fusion de celulasa que comprende

   una primera secuencia de aminoacidos de un nucleo de celulasa, que es la celulasa 20 K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2 o una modificacion de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la delecion de Ala en la posicion 207, la delecion de Val en la posicion 208, la sustitucion de Phe209Trp y la insercion de Pro despues de la posicion 206, y

   una segunda secuencia de aminoacidos de un engarce y dominio de union a celulosa, CBO, que es el engarce y el CBO de la celobiohidralasa I de Trichoderma reesei de SEC IO N°: 4, o una modificacion de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la sustitucion de tirosina en la posicion 492, posicion 31 del CBO, 493, posicion 32 del CBO, de la CBHI madura de T. reesei con un aminoacido alifatico o aromatico, y las deleciones de los aminoacidos 434 a 444 o 434 a 460 de la secuencia de la CBHI madura de T. reesei,

   en la que dicha primera secuencia de aminoacidos y dicha segunda secuencia de aminoacidos estan conectados por una region de union que tiene la formula:

   1Val -2Gln - 3Ile -4Pro - 5Ser -6Ser, o

   1Gly -2Glu - 3Ille -4Gly -5Ser.

2. 2.

   La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 1, en la que dicha primera secuencia de aminoacidos es una modificacion de la SEC IO N°: 2 seleccionada del grupo que consiste en: la delecion de Ala en la posicion 207, la delecion de Val en la posicion 208, la sustitucion de Phe209Trp y la insercion de Pro despues de la posicion 206, y/o dicha segunda secuencia de aminoacidos es una modificacion del engarce y del CBO de la SEC IO N°: 4 seleccionada del grupo que consiste en: la sustitucion de tirosina en la posicion 492, posicion 31 del CBO, 493, posicion 32 del CBO, de la CBHI madura de T. reesei, con un aminoacido alifatico o aromatico, y las deleciones de los aminoacidos 434 a 444 o 434 a 460 de la secuencia de la CBHI madura de T. reesei.

3. 3.

   La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 2, en la que en dicha segunda secuencia de aminoacidos, el aminoacido tirosina en la posicion 492, posicion 31 del CBO, y/o 493, posicion 32 del CBO, de la CBHI madura de Trichoderma reesei esta sustituido con alanina y/o con triptofano.

4. 4.

   La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 3, en la que dicha segunda secuencia de aminoacidos se selecciona de un grupo de SEC IO N°: 45, 46, 47 y 48.

5. 5.

   La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 2, en la que en dicha segunda secuencia de aminoacidos los aminoacidos 434 a 444 o 434 a 460 de la secuencia de la CBHI madura de Trichoderma reesei esta delecionada.

6. 6.

   La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 1, en la que dicha segunda secuencia de aminoacidos se selecciona de un grupo de SEC IO N°: 44, 49 y 50.

7. 7.

   La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 2, en la que en dicha primera secuencia de aminoacidos el aminoacido valina en la posicion 208 de la secuencia de celulasa 20K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2 se ha delecionado.

8. 8.

   La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 2, en la que en dicha primera secuencia de aminoacidos el aminoacido alanina en la posicion 207 de la secuencia de celulasa 20K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2 se ha delecionado.

9. 9.

   La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 2, en la que en dicha primera secuencia de aminoacidos el aminoacido fenilalanina en la posicion 209 de la secuencia de celulasa 20K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2 se ha sustituido con Trp.

10. 10.

    La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 2, en la que dicha primera secuencia de aminoacidos contiene una prolina insertada despues de la posicion 206 en la secuencia de celulasa 20K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2.

11. 11.

    La proteina de fusion de celulasa de la reivindicacion 2, en la que dicha primera secuencia de aminoacidos se selecciona de un grupo de SEC IO N°: 37, 38, 39 y 40.

12. 12.

    La proteina de fusion de celulasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que una preparacion que contiene dicha proteina de fusion se ha estabilizado adicionalmente por tratamiento con calor.

13. 13.

    Un vector de expresion que comprende una secuencia de polinucleotidos que codifica una primera secuencia de aminoacidos de un nucleo de celulasa, que es la celulasa 20K de Melanocarpus albomyces de SEC IO N°: 2 o una

    modificacion de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la delecion de Ala en la posicion 207, la delecion de Val en la posicion 208, la sustitucion de Phe209Trp y la insercion de Pro despues de la posicion 206, y una secuencia de polinucleotidos que codifica una segunda secuencia de aminoacidos de un engarce y un dominio de union a celulosa, CBO, que es el engarce y el CBO de la celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei de SEC IO N°: 4,

    o una modificacion de la misma seleccionada del grupo que consiste en: la sustitucion de tirosina en la posicion 492, posicion 31 del CBO, 493, posicion 32 del CBO, de la CBHI madura de T. reesei, con un aminoacido alifatico o aromatico, y las deleciones de los aminoacidos 434 a 444 o 434 a 460 de la secuencia de la CBHI madura de T. reesei, y una secuencia de polinucleotidos que codifica una region de union que conecta dicha primera y segunda secuencia de aminoacidos, teniendo dicha region de union la formula:

    1Val -2Gln - 3Ile -4Pro - 5Ser -6Ser, o

    1Gly -2Glu - 3Ille -4Gly -5Ser.

14. 14.

    El vector de expresion de la reivindicacion 13, en el que la primera secuencia de aminoacidos esta codificada por la SEC IO N°: 1, y la segunda secuencia de aminoacidos esta codificada por la SEC IO N°: 3.

15. 15.

    El vector de expresion de la reivindicacion 13 o 14, en el que dicha primera secuencia de aminoacidos es una modificacion de la SEC IO N°: 2 seleccionada del grupo que consiste en: la delecion de Ala en la posicion 207, la delecion de Val en la posicion 208, la sustitucion de Phe209Trp y la insercion de Pro despues de la posicion 206, y/o dicha secuencia de aminoacidos es una modificacion del engarce y CBO de SEC IO N°: 4 seleccionada del grupo que consiste en: la sustitucion de tirosina en la posicion 492, posicion 31 del CBO, 493, posicion 32 del CBO de la CBHI madura de T. reesei con un aminoacido alifatico o aromatico y las deleciones 434 a 444 o 434 a 460 de la secuencia de la CBHI madura de T. reesei.

16. 16.

    El vector de expresion de la reivindicacion 15, que comprende una secuencia de polinucleotidos que codifica dicha segunda secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de SEC IO N°: 45, 46, 47 y 48.

17. 17.

    El vector de expresion de la reivindicacion 15, que comprende una secuencia de polinucleotidos que codifica dicha segunda secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de SEC IO N°: 49 y 50.

18. 18.

    El vector de expresion de la reivindicacion 15, que comprende un polinucleotido que codifica dicha primera secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo de SEC IO N°: 37, 38, 39 y 40.

19. 19.

    Una celula hospedadora que comprende un vector de expresion como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18.

20. 20.

    La celula hospedadora de la reivindicacion 19, que es de origen fungico.

21. 21.

    La celula hospedadora de la reivindicacion 20, que pertenece a hongos filamentosos.

22. 22.

    La celula hospedadora de la reivindicacion 20 o 21, que pertenece al genero Trichoderma o Aspergillus.

23. 23.

    La celula hospedadora de la reivindicacion 22, que es Trichoderma reesei.

24. 24.

    Un proceso para la produccion de una proteina de fusion de celulasa como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que comprende las etapas de cultivar la celula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23 y recuperar la proteina del medio de cultivo.

25. 25.

    Una preparacion enzimatica que comprende una proteina de fusion de celulasa como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

26. 26.

    Un proceso de biolavado a la piedra que comprende la etapa de aradir una proteina de fusion de celulasa, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la preparacion de la reivindicacion 25, a tejidos o prendas que contienen algodon.

27. 27.

    El proceso de la reivindicacion 26, en el que los tejidos o las prendas son de tela vaquera.

28. 28.

    Un proceso de bioacabado, que comprende la etapa de aradir una proteina de fusion de celulasa, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la preparacion de la reivindicacion 25, a materiales textiles como tejidos o prendas o hilo.

29. 29.

    El proceso de la reivindicacion 28, en el que los materiales textiles se confeccionan con fibras que contienen celulosa natural o con fibras que contienen celulosa fabricada por el hombre o mezclas de las mismas.

30. 30.

    El proceso de la reivindicacion 28, en el que los materiales textiles son mezclas de fibras sinteticas y fibras que contienen celulosa.

31. 31.

    Una composicion de detergente que comprende una proteina de fusion de celulasa, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la preparacion enzimatica de la reivindicacion 25 y auxiliares, tales como

    agentes activos en superficie, tensioactivos, agentes blanqueantes o sintetizantes.

32. 32.

    Un metodo de tratamiento de fibra celulosica que contiene material textil, en el que dicho metodo comprende poner en contacto dicho material textil con la composicion de detergente de la reivindicacion 31.

33. 33.

    Un metodo para el tratamiento de pasta o fibra derivada de madera, que comprende la etapa de aradir una proteina de fusion de celulasa, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la preparacion de la reivindicacion 25, a pasta quimica o mecanica derivada de madera o a fibra secundaria.

34. 34.

    Un metodo para mejorar la calidad de piensos para animales, que comprende tratar un material vegetal con una proteina de fusion de celulasa, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o la preparacion de la reivindicacion 25.