BRPI0609906A2 - proteìna de fusão de celulase, seu processo de produção e composição detergente contendo a mesma, vetor de expressão, célula hospedeira, preparação de enzima, processos para desbotamento e para bioacabamento e métodos de tratamento de fibra celulósica contendo material têxtil, para tratar fibra ou polpa derivada de madeira e para melhorar a qualidade de ração animal - Google Patents

Abstract

PROTEINA DE FUSãO DE CELULASE, SEU PROCESSO DE PRODUçãO E COMPOSIçãO DETERGENTE CONTENDO A MESMA, VETOR DE EXPRESSãO, CéLULA HOSPEDEIRA, PREPARAçãO DE ENZIMA, PROCESSOS PARA DESBOTAMENTO E PARA BIOACABAMENTO E MéTODOS DE TRATAMENTO DE FIBRA CELULóSICA CONTENDO MATERIAL TêXTIL, PARA TRATAR FIBRA OU POLPA DERIVADA DE MADEIRA E PARA MELHORAR A QUALIDADE DE RAçãO ANIMAL. A presente invenção fornece novas proteínas de fusão de celulase, preparações de proteínas de fusão de celulase e composições de proteínas de fusão de celulase. A presente invenção se refere ainda a vetores de expressão de celulase, células hospedeiras expressando celulase e métodos para preparar tais vetores e células. Os usos de celulases, preparações de celulase e composições de celulase nas indústrias têxtil, de detergente, polpa e papel também são fornecidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CELULASESMELHORADAS".

Campo da invenção

A presente invenção se refere a novas proteínas de fusão celu-lase, preparações e composições contendo essas proteínas de fusão celula-se, vetores de expressão, células hospedeiras e métodos para sua prepara-ção e usos das celulases, preparações e composições nas indústrias têxtil,de detergente e polpa e papel.

Antecedentes da invenção

Celulose é um polissacarídeo linear de resíduos de glicose co-nectados por ligações (3-1,4. Na natureza, celulose é geralmente associadacom lignina juntamente com hemiceluloses, tais como xilanas e glicomana-nas. Enzimas celulolíticas hidrolisam a celulose e são produzidas por umaampla variedade de bactérias e fungos. CElulases são enzimas industrial-mente importantes com um valor de mercado anual atual de cerca de 190milhões de dólares. Na indústria têxtil, celulases são usadas em acabamentode sarja de Nimes para criar uma aparência lavada de pedra segundo a mo-da em roupas de sarja de Nimes num processo de desbotamento, e elastambém são usadas, por exemplo, para limpar flocos e prevenir a formaçãode pílulas na superfície de roupas de algodão. Na indústria de detergentes,celulases são usadas para clarificar corres e para prevenir o acinzentamentoe a formação de pílulas das peças de roupa. Celulases são ainda usadaspela indústria de alimentos e de produção de ração animal, e elas têm umótimo potencial na indústria de polpa e papel, por exemplo, na retirada detinta para liberar tinta das superfícies da fibra e na melhoria da drenagem dapolpa. O amplo espectro de usos industriais para celulases estabeleceu umanecessidade para produtos de celulase comerciais contendo diferentes com-ponentes de celulase e funcionando otimamente em diferentes faixas de pHe temperatura.

O uso prático de celulases é dificultado pela natureza das celu-lases conhecidas, as quais são geralmente misturas de celulases com umavariedade de atividades e especificidades de substrato. Por essa razão, temsido feitos esforços para obter celulases com somente as atividades deseja-das. As propriedades únicas de cada celulase tornam algumas mais ade-quadas para certos propósitos do que outras. Enquanto as enzimas diferemnuma variedade de formas, uma das mais importantes diferenças é o pHótimo. Celulases neutras são mais ativas na faixa de pH 6 - 8 e celulasesalcalinas na faixa de pH 7,5 - 10, enquanto que celulases ácidas, com o pHótimo em pH 4,5 - 5,5, apresentam níveis de atividade muito baixos em valo-res de pH mais altos. CElulases neutras e ácidas são especialmente úteis naindústria têxtil. No tratamento têxtil, as celulases atacam as cadeias de mo-léculas de celulose que formam as fibras de algodão, afetando dessa formaas características do tecido.

Na indústria têxtil, aparência de "pedra lavada" ou uma aparên-cia abradada tem sido interessante para os produtores de sarja nos anosrecentes. A lavagem de pedra tradicional com pedras de pedra-pomes reduza força do tecido e carrega os aparelhos de lavagem. A tendência tem sidopara processos de acabamento de sarja de Nimes enzimáticos e celulasesforam substituídas ou tem sido usadas juntamente com pedra-pomes paraconferir ao tecido sua aparência "gasta" desejada. O tratamento enzimáticocontrolado resulta em menos danos para as peças de vestuário e máquinase elimina a necessidade pelo descarte de pedras.

Celulases aplicadas no tratamento de sarja de Nimes são geral-mente divididas em dois grupos principais: celulases ácidas e neutras. Celu-lases ácidas tipicamente operam em pH 4,5 - 5,5 e as celulases neutras nafaixa de pH 6 - 8. Celulases ácidas usadas em desbotamento principalmentese originam da Trichoderma reesei (forma sexual da Hypocrea jecorina) e ascelulases neutras vêm de uma variedade de fungos, incluindo os gêneros deMelanocarpus, Humicola, Thielavia, Myceliophthora, Fusarium, Acremoniume Chrysosporium (Haakana et ai 2004). Enzimas T. reesei incluem, por e-xemplo, celulases da família de glicosídeos 5 (endoglucanase II, EGII), famí-lia 7 (celobioidrolase I, CBHI) e família 12 (endoglucanase III, EGIII; Ward etai 1993) e as celulases neutras, mais comumente endoglucanases, da famí-lia 45 e da família 7 (Henrissat, 1991; Henrissat e Bairoch, 1993).Celulases compreendem um domínio/núcleo cataiítico (CD) ex-pressando atividade da celulase. Além do domínio catalítico, a molécula decelulase pode compreender um ou mais domínios de ligação de celulose(CBDs), também chamados de domínios/módulos de ligação de carboidratos(CBD/CBM), os quais podem estar localizados ou no N- ou no C- terminal dodomínio catalítico. CBDs têm atividade de ligação a carboidrato e eles me-deiam a ligação da celulase para a celulose cristalina, mas têm pouco ounenhum efeito na atividade hidrolítica da celulase da enzima em substratossolúveis. Esses dois domínios estão tipicamente conectados através de umaregião ligante flexível e altamente glicosilada.

Celulases que atacam primariamente na superfície da fibra sãoespecialmente úteis na lavagem com pedra de sarja de Nimes pintada comcorante índigo, uma vez que o corante é localizado na superfície da fibra.

Quando usado para tratar tecido de algodão, celulases neutras geralmenterequerem um tempo de lavagem mais longo do que as celulases ácidas. En-tretanto, celulases neutras têm uma ação menos agressiva no algodão doque celulases ácidas, e não afetam a força do tecido tanto quanto as celula-ses ácidas. Celulases neutras têm um perfil de pH mais amplo e, dessa for-ma, o aumento no pH que ocorre durante o desbotamento tem pouco efeitona atividade das enzimas de celulase neutras. Entretanto, uma vez que ostratamentos da celulase também tem efeitos indesejáveis, tais como dano defibras ou perda de força, um equilíbrio adequado entre os efeitos desejadose indesejáveis tem que ser procurado.

WO97/14804, o qual é aqui incorporado por referência, revelatrês novas celulases neutras de origem Melanocarpus, as quais são especi-almente úteis na indústria têxtil e de detergente. Especificamente, uma en-doglucanase de 20 KDa (Cel45A), uma endoglucanase de 50 KDa (Cel7A) euma celobioidrolase de 50 KDa (Cel7B) são descritas. Essas celulases aquidesignadas como "celulase 20K", "celulase 50K" e "celulase 50K B", respec-tivamente, são derivadas de Melanocarpus albomyces e mostram bons efei-tos de lavagem de pedra.

Uma vez que há uma demanda existente, especialmente na in-dústria têxtil e detergente, para outras celulases melhoradas, foi sugeridoque melhorias nas celulases poderiam ser obtidas pela formação de proteí-nas de fusão. Também na WO97/14804, constructos de proteína de fusãoda celulase 20K, celulase 50K e celulase 50K B com, por exemplo, celulase,hemicelulase ou manase de Trichoderma reeseiou seus domínios funcionaissão geralmente sugeridos. Além disso, para criar novas propriedades paraas celulases reveladas, fusões das celulases reveladas com domínios, taiscomo o domínio de ligação da celulose (CBD), preferivelmente com seu li-gante, são sugeridas. Entretanto, nenhum exemplo específico é dado, nemsão descritas as novas propriedades tencionadas para.

Proteínas de fusão de celulase são adicionalmente conhecidas,por exemplo, a partir de W096/29397, que revela endoglucanases formadaspor uma fusão entre endoglucanases de Myceliophthora thermophila, deMacrophomina phaseolina e de Crinipellis scabella e o CBD/ligante de Hu-micola insolens. As referidas endoglucanases na sua forma natural não têmum CBD/ligante.

EP 663 950 revela variantes de celulase, especialmente varian-tes de celulase de Humicola insolens de 43 KDa, em que a celulase podeincluir uma região ligante de outra espécie de microrganismo, por exemplo,para proporcionar propriedades melhoradas, tais como resistência melhora-da a tensoativos aniônicos, à oxidação ou aos agentes alvejantes.Entretanto, há uma necessidade contínua por celulases melhoradas quetambém são menos danosas à fibra na indústria têxtil e em outros campos,onde celulases tradicionalmente são usadas. Particularmente há uma ne-cessidade contínua por celulases mais eficientes para melhorar a economiado processo.

A presente invenção almeja atender a essa necessidade.Breve descrição da invenção

Um objeto da presente invenção é fornecer novas proteínas defusão de celulase com propriedades hidrolíticas melhoradas para uso na in-dústria têxtil, especialmente na lavagem de pedra de sarja de Nimes, e parauso nas composições detergentes assim como em outros campos. As novasproteínas de fusão de celulase da invenção são ativas em valores de pHneutro e alcalino, elas têm um desempenho de lavagem muito melhorado emaplicações de desbotamento e bioacabamento têxtil e em aplicações de de-tergentes, e elas ainda não comprometem a força dos tecidos. Com a efici-ência melhorada das proteínas de fusão da celulase, o processo de produ-ção das enzimas é significativamente mais econômico. Vantagens adicionaistambém são alcançadas em termos de logística e na estocagem dos produ-tos de enzima, quando quantidades menores de produto de enzima são ne-cessárias.

Um outro objeto da presente invenção é fornecer polinucleotí-deos que codificam as novas proteínas de fusão de celulase das presentesinvenções.

Um outro objeto da presente invenção é fornecer novos plasmí-deos ou vetores de expressão contendo tais polinucleotídeos, úteis para aprodução de novas proteínas de fusão de celulase da presente invenção, enovos hospedeiros transformados com os respectivos plasmídeos de ex-pressão.

Um outro objeto da presente invenção é fornecer preparaçõesenzimáticas, as quais contêm uma ou mais novas proteínas de fusão de ce-lulase com propriedades hidrolíticas melhoradas.

Ainda um outro objeto da presente invenção é fornecer métodosde uso de preparações enzimáticas e as proteínas de fusão de celulase paraacabamento de tecidos, especialmente para o desbotamento de sarja deNimes.

Ainda um outro objeto da presente invenção é fornecer meiospara o uso de preparações enzimáticas da invenção em composições dedetergente.

A presente invenção se refere a uma nova proteína de fusão decelulase compreendendo

A. uma primeira seqüência de aminoácidos opcionalmente modi-ficada de um núcleo de celulase derivado de uma espécie, e

B. uma segunda seqüência de aminoácidos opcionalmente mo-dificada de um ligante e/ou de um domínio de ligação de celulose (CBD) de-rivado de outra espécie,

em que uma região de junção foi introduzida entre a referidaprimeira seqüência de aminoácidos e a referida segunda seqüência de ami-noácidos, por meio da qual uma proteína de fusão estável é obtida.

Preferivelmente, a região de junção tem a seguinte fórmula ge-ral:

1A-2B-3C-4D-5E-6F

em que

1A é selecionado de um grupo consistindo em Gly, Ala, Leu, Pro,He, e Vai; preferivelmente 1A é Gly ou Vai, mais preferivelmente Gly;

2B é selecionado de um grupo consistindo em Gly, Ala, Leu, Pro,lie, Phe, Vai, Glu, Asp, Gln, e Asn; preferivelmente 2B é Pro, Gln, ou Glu;

3C é selecionado de um grupo consistindo em Gly, Ala, Lys, Leu,Pro, Me, Vai, Ser e Thr; preferivelmente 3C é lie;

4D é selecionado de um grupo consistindo em Gly, Ala, Leu, Pro,

He, e Vai; preferivelmente 4D é Gly ou Pro;

5E é selecionado de um grupo consistindo em Ser, Pro e Thr;preferivelmente 5E é Ser; e

6F é selecionado de um grupo consistindo em Ser, Thr ou estáausente, preferivelmente 6F é Ser ou está ausente; em que 1A está ligado naseqüência de aminoácidos C-terminal do núcleo de celulase e 6F está ligadona seqüência de aminoácidos N-terminal do ligante e/ou domínio (CBD).

A presente invenção ainda se refere a um vetor de expressãocompreendendo uma primeira seqüência de polinucleotídeo que codificauma primeira seqüência de aminoácidos opcionalmente modificada de umnúcleo de celulase derivado de uma espécie, e uma segunda seqüência depolinucleotídeos que codifica uma segunda seqüência de aminoácidos op-cionalmente modificada de um ligante e/ou de um domínio de ligação de ce-lulose (CBD) derivado de outras espécies, e um polinucleotídeo que codificauma região de junção que conecta as referidas primeira e segunda seqüên-cia de polinucleotídeo, as referidas seqüências de polinucleotídeo codifican-do as respectivas seqüências de aminoacidos das proteínas de fusão decelulase da invenção.

A presente invenção ainda se refere a novos hospedeiros trans-formados com os vetores da invenção, especialmente hospedeiros que sãocapazes de um alto nível de expressão da proteína de fusão de celulase dainvenção.

A presente invenção se refere ainda a uma preparação enzimá-tica, a qual contém uma ou mais proteínas de fusão de celulase da invenção.

A presente invenção se refere ainda a um método para o usodas preparações enzimáticas da invenção para o acabamento de tecidos,especialmente para o desbotamento de sarja de Nimes.

A presente invenção se refere ainda ao uso das preparaçõesenzimáticas da invenção em composições de detergente.

Desenhos

Fig. 1 é o mapa esquemático do plasmídeo pALK1480.Fig. 2 é o mapa esquemático do plasmídeo pALK492.Fig. 3 é o mapa esquemático do plasmídeo pALK424.Fig. 4 é o mapa esquemático do plasmídeo pALK1237.Fig. 5 é o mapa esquemático do plasmídeo pALK1241.Fig. 6 é o mapa esquemático do plasmídeo p3SR2.Fig. 7 é o mapa esquemático do plasmídeo pALK1649.Fig. 8 é o mapa esquemático do plasmídeo pALK1694.Fig. 9A. O cassete de expressão usado na transformação deprotoplastos de Trichoderma reesei para produzir as proteínas de fusão20K+CBD. O gene 20K+CBD estava sob o controle do promotor cbhl(cel7A) (cbhl prom) e a terminação da transcrição foi assegurada pelo usoda seqüência terminadora cbhl (termo). O gene amdS (amdS) e a regiãoflanqueadora cbhl 3' (flanqueadora cbhl 3') foram incluídos, figura 9B. Se-qüência de aminoacidos de um ponto de junção no qual a proteína 20K deMelanocarpus albomyces (Cel45A) é fundida com o peptídeo ligante CBHIde Trichoderma reesei (cel7A) seguido pelo domínio de ligação de celulose(CBD) em plasmídeos pALK1434 e pALK1435. Os aminoacidos contidos naregião ligante estão sublinhados, e a seqüência de aminoácidos da regiãoCBD está marcada em itálico. O primeiro aminoácido na região CBD é indi-cado por números sobrescritos.

Fig. 10A. O cassete de expressão usado na transformação deprotoplastos de Trichoderma reesei para produzir as proteínas de fusão20K+CBD. O gene 20K+CBD estava sob o controle do promotor cbhl(cel7A) {cbhl prom) e a terminação da transcrição foi assegurada pelo usoda seqüência terminadora cbhl (termo). O gene amdS (amdS) e a regiãoflanqueadora cbhl 3' (flanqueadora cbhl 3') foram incluídos, figura 10B.Se-qüência de aminoácidos de um ponto de junção no qual a proteína 20K deMelanocarpus albomyces (Cel45A) é fundida com o peptídeo ligante CBHIde Trichoderma reesei (Cel7A) seguido pelo domínio de ligação de celulose(CBD) em plasmídeos pALK1768, pALK1769, pALK1770 e pALK1775. Osaminoácidos contidos na região ligante estão sublinhados, e a seqüência deaminoácidos da região CBD está marcada em itálico. O primeiro aminoácidona região CBD é indicado por números sobrescritos.

Fig. 11 A. O cassete de expressão usado na transformação deprotoplastos de Trichoderma reesei para produzir as proteínas de fusão20K+CBDmut. O gene 20K+CBDmLrt estava sob o controle do promotor cbhl(cel7A) {cbhl prom) e a terminação da transcrição foi assegurada pelo usoda seqüência terminadora cbhl (termo). O gene amdS foi incluído como omarcador de transformação, figura 11B. Seqüência de aminoácidos de umponto de junção no qual a proteína 20K de Melanocarpus albomyces(Cel45A) é fundida com o peptídeo ligante CBHI de Trichoderma reesei(Cel7A) seguido pelo domínio de ligação de celulose (CBD). As plasmídeospALK1768, pALK1769, pALK1770 e pALK1775. Os aminoácidos substitui-ções de aminoácidos na região CBD dos cassetes de expressão pALK1877 -pALK1880 também estão apresentadas. Os aminoácidos contidos na regiãoligante estão sublinhados, e a seqüência de aminoácidos da região CBD es-tá marcada em itálico. O primeiro aminoácido e os resíduos de tirosina desuas substituições na região CBD estão indicados por números sobrescritos.

Fig. 12A. Seqüência de aminoácidos do peptídeo de ligação in-terdomínio da CBHI de T. reesei (Cel7A). Os aminoácidos contidos na regiãoligante estão sublinhados. AG-444 e AG-460 representam a anulação do li-gante dos resíduos 434 - 444 e 434 - 460, respectivamente, figura 12B. Se-qüência de aminoácidos de um ponto de junção no qual a proteína 20L deMelanocarpus albomyces está fundida com o peptídeo ligante cortado daCBHI de Trichoderma reesei (Cel7A) seguido pelo domínio de ligação à celu-lose intacto ou modificado (CBD) nos cassetes de expressão pALK1893,pALK1896, pALK1899 e pALK1952. Os aminoácidos contidos na região li-gante estão sublinhados e a seqüência de aminoácidos da região CBD estámarcada por itálico. O primeiro aminoácido e os resíduos de tirosina ou suassubstituições na região CBD estão indicados por números sobrescritos.

Fig. 13A. O cassete de expressão usado na transformação deprotoplastos de Trichoderma reesei para produzir as proteínas de fusão50K+CBD. O gene 50K+CBD está sob o controle do promotor cbhl (cbhlprom) de T. reesei e a terminação da transcrição é assegurada com a adiçãodo terminador cbhl (termo). O gene amdS (amdS) e a região flanqueadoracbhl 3' (cbhl 3') são incluídas, figura 13B. Seqüência de aminoácidos de umponto de junção da 50K de M. albomyces ligado ao ligante CBHI + CBD deT. reesei. Os aminoácidos contidos na região ligante estão sublinhados, e aseqüência de aminoácidos da região CBD está marcada em itálico. O primei-ro aminoácido na região CBD é indicado por números sobrescritos.

Fig. 14A. O cassete de expressão usado na transformação deprotoplastos de Trichoderma reesei para produzir as proteínas de fusão50KB+CBD. O gene 50KB+CBD está sob o controle do promotor cbhl (cbhlprom) de T. reesei e a terminação da transcrição é assegurada com a adiçãodo terminador cbhl (termo). O gene amdS (amdS) e a região flanqueadoracbhl 3' (cbhl 3') são incluídas, figura 14B. Seqüência de aminoácidos de umponto de junção da 50KB de M. albomyces ligado ao ligante CBHI + CBD deT. reesei. Os aminoácidos contidos na região ligante estão sublinhados, e aseqüência de aminoácidos da região CBD está marcada em itálico. O primei-ro aminoácido na região CBD é indicado por números sobrescritos.

Fig 15A. O cassete de expressão usado na transformação deprotoplastos de Trichoderma reesei para produzir as proteínas de fusão C-BHI + CBD recombinantes de Thermoascus aurantiacus. O gene CBHI+CBDestava sob o controle do promotor cbhl (cbhl prom) (cel7A) e a terminaçãoda transcrição foi assegurada pelo uso da seqüência terminadora (termo). Ogene amdS foi incluído como um marcador de transformação, figura 15B.Seqüência de aminoácidos de um ponto de junção no qual a proteína CBHIde Thermoascus aurantiacus é fundida com o peptídeo ligante da CBHI deTrichoderma reesei seguido pelo domínio de ligação à celulose (CBD). Osaminoácidos contidos na região ligante estão sublinhados, e a seqüência deaminoácidos da região CBD está marcada em itálico. O primeiro aminoácidona região CBD é indicado por números sobrescritos.

Fig. 16. O desempenho das cepas RF5977 e RF6090 expres-sando proteínas de fusão da invenção em comparação com uma preparaçãocomercial 20K no tratamento de sarja de Nimes. O aumento da claridadecomo uma função da dosagem enzimática em condições de lavagem estádescrito nos Exemplos 8 e 9.

Fig. 17. Efeito das proteínas de fusão cbd + 20k e as correspon-dentes preparações enzimáticas comerciais na força do tecido de sarja deNimes. figura 17A. Força de rasgo (N), deformação, figura 17B. Força derasgo (N), tecido.

Fig. 178 mostra o efeito remoção de pilling da proteína de fusãocbd + 20k.

Fig. 19 ilustra o desempenho da proteína de fusão 20K+CBD naaplicação de detergente. A figura mostra a diferença de parelhamento de corentre o artigo anti-acinzentamento 224 lavado com ou sem a enzima, e oartigo original (não-lavado); A. a 40°C e B. a 60°C.

Fig. 20 ilustra o desempenho da proteína de fusão 20K+CBD naaplicação de detergente. A figura mostra a diferença de parelhamento de corentre o artigo anti-acinzentamento 224 lavado com enzima e sem enzima; A.a 40°C e B. a 60°C.

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção é baseada em esforços para melhorar maiscelulases neutras, particularmente aquelas descritas em WO97/14804, obje-tivando a redução da perda de força no tecido no tratamento enzimático. Emalgumas aplicações, a celulase 20K mostrou propriedades indesejáveis emrelação à força da fibra, possivelmente devido ao pequeno tamanho. A hipó-tese simples foi a de que um aumento no tamanho da enzima poderia redu-zir a capacidade da enzima de penetrar nas fibras, enfraquecendo dessaforma as fibras para uma extensão menor, isto é, a enzima poderia ser me-nos agressiva. Para fazer isso, a tentativa de proteína de fusão sugerida emWO97/14804 foi usada, e constructos de fusão contendo um núcleo de celu-lase neutra de uma espécie Melanocarpus e uma cauda consistindo em umligante/CBD de uma celobioidrolase ácida I de T. reesei foram projetados.Surpreendentemente, entretanto, ao contrário das sugestões da técnica an-terior, constructos de proteína de fusão completamente estáveis não pude-ram ser obtidos, nas os parceiros de fusão separados um do outro nas con-dições de cultivo. Isso foi presumivelmente devido à presença de protea-se(s).

Para produzir as proteínas de fusão estáveis, uma tentativa foiprojetar novos constructos de junção sem ter aminoácidos hidrofóbicos adja-centes (por exemplo, V, I, L, F e W) para prevenir a clivagem por aspartilo-proteases. Entretanto, embora os constructos produzissem proteínas de fu-são, ocasionalmente foi observada alguma degradação.

Baseando-se no alinhamento das celulases neutras contendonaturalmente uma cauda de ligante/CBD, outros constructos foram produzi-dos e finalmente esses constructos provaram ser mais estáveis e mais úteispara testagem adicional. Além disso, constructos de fusão foram projetadosos quais carregaram mutações no CBD resultando em afinidade ou adsorçãoreduzida ou mínima para a celulose (Linder et ai, 1995).

Os novos constructos produziram propriedades de força melho-radas, como foi o objetivo. Surpreendentemente, as proteínas de fusão decelulase estáveis apresentaram adicionalmente melhoria não-esperada nodesempenho de lavagem, e foram tão altas quanto mesmo seis vezes tãoeficientes quanto suas celulases "de origem". Entretanto, os rendimentos deprodução foram mantidos acerca do mesmo nível. Isso significa que somen-te um sexto da quantidade de atividade de celulase presentemente necessá-ria é suficiente para alcançar o mesmo desempenho de lavagem da celulaseda técnica anterior. Isso produz economias consideráveis no passo de pro-dução, e também na logística e estocagem, diminuindo dessa forma a cargaambiental. Também os efeitos indesejáveis das preparações de celulase sãoreduzidos, causando dessa forma economias adicionais para os usuáriosfinais do produto enzimático. Considerando que cerca de 2 bilhões de paresde calças jeans são produzidos anualmente, e a maior parte deles é finaliza-da com celulase, a vantagem é altamente significativa.

Concordantemente, a presente invenção fornece uma nova pro-teína de fusão de celulase, compreendendo

A. uma primeira seqüência de aminoácidos opcionalmente modi-ficada de um núcleo de celulase derivado de uma espécie, e

B. uma segunda seqüência de aminoácidos opcionalmente mo-dificada de um ligante e/ou de um domínio de ligação de celulose (CBD) de-rivado de outra espécie,

em que uma região de junção foi introduzida entre a referidaprimeira seqüência de aminoácidos e a referida segunda seqüência de ami-noácidos, por meio da qual uma proteína de fusão estável é obtida.

Em uma modalidade preferida da invenção, a região de junçãotem a seguinte fórmula geral:

<formula>formula see original document page 13</formula>

em que

1A é selecionado de um grupo consistindo em Gly, Ala, Leu, Pro,lie, e Vai; preferivelmente 1A é Gly ou Vai, mais preferivelmente Gly;

2B é selecionado de um grupo consistindo em Gly, Ala, Leu, Pro,lie, Phe, Vai, Glu, Asp, Gln, e Asn; preferivelmente 2B é Pro, Gln, ou Glu;

3C é selecionado de um grupo consistindo em Gly, Ala, Lys, Leu,Pro, lie, Vai, Ser e Thr; preferivelmente 3C é He;

4D é selecionado de um grupo consistindo em Gly, Ala, Leu, Pro,lie, e Vai; preferivelmente 4D é Gly ou Pro;5E é selecionado de um grupo consistindo em Ser, Pro e Thr;preferivelmente 5E é Ser; e

6F é selecionado de um grupo consistindo em Ser, Thr ou estáausente, preferivelmente 6F é Ser ou está ausente; em que 1A está ligado naseqüência de aminoacidos C-terminal do núcleo de celulase e 6F está ligadona seqüência de aminoacidos N-terminal do ligante e/ou domínio (CBD).

Em uma modalidade especialmente preferida da invenção, a re-gião de junção tem a seguinte fórmula geral:

<formula>formula see original document page 14</formula>

em que

2B é Pro, Gln, ou Glu;

4D é Gly ou Pro;

5E é Ser; e

6F é 6F é Ser ou está ausente.

Em outra modalidade especialmente preferida da invenção, aregião de junção tem a seguinte fórmula geral:

<formula>formula see original document page 14</formula>

Em outra modalidade especialmente preferida da invenção, aregião de junção tema seguinte fórmula geral:

<formula>formula see original document page 14</formula>

Em outra modalidade especialmente preferida da invenção, aregião de junção tem a seguinte fórmula geral:

<formula>formula see original document page 14</formula>

Em uma modalidade preferida da invenção, a primeira seqüênciade aminoacidos é de uma celulase neutra e a segunda seqüência de amino-acidos é de uma celulase ácida.

Em outra modalidade preferida da invenção, a primeira seqüên-cia de aminoacidos é de uma celulase da família 45 (Cel 45) e a segundaseqüência de aminoacidos é da celulase da família 7 (Cel 7).

Conforme usado no presente contexto, a expressão "núcleo decelulase" ou "núcleo" significa o domínio/núcleo catalítico (CD) de uma en-zima expressando atividade da celulase. Tal domínio catalítico pode estar nasua forma de ocorrência natural (isto é, intacto) ou, preferivelmente, estarmodificado conforme definido abaixo. As expressões "derivado" e variantefuncional denotam polipeptídeos expressando a mesma atividade da celula-se, mas incluindo modificações conforme definido abaixo.

No presente contexto, códigos de aminoácidos de uma letra ecódigos de aminoácido de três letras convencionais são usados. Conse-qüentemente, A e Ala denotam alanina, R e Arg denotam arginina, N e Asndenotam asparagina, D e Asp denotam ácido aspártico, Cys e C denotamcisteína, E e Glu denotam ácido glutâmico, Q e Gln denotam glutamina, G eGly denotam glicina, H e His denotam histidina, I e lie denotam isoleucina, Le Leu denotam leucina, K e Lys denotam lisina, Me Met denotam metionina,F e Phe denotam fenilalanina, P e Pro denotam prolina, S e Ser denotamserina, T e Thr denotam treonina, W e Trp denotam triptofano, Y e Tyr deno-tam tirosina e V e Vai denotam valina. Além de L-aminoácidos de ocorrêncianatural, D-aminoácidos também poderiam ser usados.

Nas proteínas de fusão de celulase da invenção, a celulase neu-tra é preferivelmente de origem fungica. A celulase neutra pode ser derivadado gênero de Melanocarpus, Humicola, Thielavia, Myceliophthora, Fusarium,Acremonium, Chrysosporium, Thermoascus, Scopulariopsis, Myriococcum,Talaromyces, ou Chaetomium. São especialmente preferidas as Melanocar-pus sp, com Melanocarpus albomyces sendo especialmente preferida. A ce-lulase ácida usada nas proteínas de fusão da celulase da invenção foramoriginadas de Trichoderma sp. ou Hypocrea, especialmente de Trichodermareesei.

Numa modalidade especificamente preferida da invenção, a pri-meira seqüência de aminoácidos é a celulase 20K de Melanocarpus albomy-ces da SEQ ID NO: 2 ou um derivado seu, e a segunda seqüência de ami-noácidos é o ligante e/ou CBD da celobioidrolase I de Trichoderma reesei daSEQ ID NO: 4 ou um derivado seu.

Numa modalidade preferida da invenção, as proteínas de fusãode celulase contêm modificações no núcleo da celulase e/ou no ligante e/ouCBD. Conforme usado no presente contexto, a expressão "modificado" serefere a mutações, tais como inserção ou substituição de um ou mais ami-noácidos, ou outras modificações, tais como glicosilações. Exemplos de taismutações incluem a substituição de resíduos de tirosina conservados nasposições 31 (correspondendo à tirosina Y492 do polipeptídeo maduro) e/ou32 (correspondendo à tirosina Y493 do polipeptídeo maduro) com um ami-noácido alifático, preferivelmente com alanina, e/ou com um aminoácido a-romático, tal como triptofano, de CBD ou CBHI de Trichoderma reesei con-forme descrito por Linder et aí. 1995. Outros exemplos de tais mutações in-cluem mutações interligantes de CBHO de Trichoderma reesei conformedescrito por Srisodsuk et ai, 1993, tais como anulações de aminoácidos daposição 434 até a 444 e da posição 434 até a 460 da seqüência de CBHI deTrichoderma maduro. Outros exemplos de tais mutações incluem a anulaçãoda Ala na posição 207, a anulação da Va na posição 208, a substituição daPhe209Trp e a inserção de Pro depois da posição 206 na seqüência de 20Kcelulase de Melanocarpus albomyces da SEQ ID NO: 2.

As proteínas de fusão da celulase da invenção são estáveis. Nocontexto da presente invenção, a expressão "proteína de fusão de celulaseestável" significa que pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 40%,mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente 90 - 100% daproteína de fusão de celulase produzida contém uma região de junção não-clivada entre as seqüências de aminoácidos durante a fermentação. Issosignifica que 20% - 100%, preferivelmente 40% - 100%, mais preferivelmen-te 70% - 100% da celulase produzida tem a primeira e a segunda seqüênciade aminoácidos unidas por fusão. A expressão "proteína de fusão de celula-se estável" significa adicionalmente que o preparo da proteína de fusão decelulase pode ser estável como tal ou foi estabilizado, por exemplo, por tra-tamento com calor ou pelo ajuste do pH ou pela adição de estabilizantes ouagentes que reduzem a atividade da protease ou pela separação da proteínade fusão da cultura. O tratamento com calor no presente contexto significaum tratamento numa temperatura a qual permita que a proteína de fusão napreparação seja mantida adequadamente estável. O tratamento com calorpode ser, por exemplo, um tratamento no pH 6,0 a 65 QC por 60 a 70 minu-tos.

No presente contexto, a expressão "proteína de fusão intacta"significa que a junção entre a primeira e a segunda seqüência de aminoáci-dos na proteína de fusão da invenção permanece não quebrada, emborapossa ou não aparecer degradação terminal nas referidas seqüências.

Numa modalidade preferida da proteína de fusão da celulase dainvenção, a primeira seqüência de aminoácido é uma seqüência 20K de Me-lanocarpus albomyces com SEQ ID NO: 2 ou uma variante funcional sua.

Em outra modalidade preferida da primeira seqüência de aminoácido é aseqüência 50K de Melanocarpus albomyces com a SEQ ID NO: 6 ou umavariante funcional sua. Em outra modalidade preferida da primeira seqüênciade aminoácidos é a seqüência 50KB de Melanocarpus albomyces com aSEQ ID NO: 8 ou uma variante funcional sua. Em outra modalidade preferidada primeira seqüência de aminoácidos é a seqüência da CBHI de Thermo-ascus aurantiacus com SEQ ID NO: 10 ou uma variante funcional sua. Emainda uma modalidade preferida da proteína de fusão de celulase da inven-ção, a segunda seqüência de aminoácidos é o ligante e a seqüência de do-mínio de ligação da celulase com SEQ ID NO: 4 da celobioidrolase I de 7/7-choderma reesei ou uma variante funcional sua.

Dessa forma, uma modalidade altamente preferida da proteínade fusão da celulase da invenção, a primeira seqüência de aminoácidos donúcleo de celulase é selecionada da SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41, 42 e 43,especialmente SEQ ID. NO: 39, e a segunda seqüência de aminoácidos deuma seqüência ligante e/ou CBD é selecionada de SEQ ID. NO: 44, 45, 46,47, 48, 49 e 50. Numa modalidade especial da invenção, a primeira seqüên-cia de aminoácidos do núcleo de celulase é a SEQ ID NO: 39 e a segundaseqüência de aminoácidos de uma seqüência ligante e/ou CBD é a SEQ IDNO: 47, 49 ou 50.

A presente invenção ainda se refere a um veto de expressãocompreendendo uma primeira seqüência de polinucleotídeo codificando umaprimeira seqüência de aminoácidos opcionalmente modificada de um núcleode celulase derivado de uma espécie, e uma segunda seqüência de polinu-cleotídeo codificando uma segunda seqüência de aminoácidos opcionalmen-te modificada de um ligante e/ou de um domínio de ligação à celulose (CBD)derivado de outra espécie, e um polinucleotídeo codificando uma região dejunção específica conectando as referidas primeira e segunda seqüências depolinucleotídeo, as referidas seqüências de polinucleotídeo codificando asrespectivas seqüências de aminoácidos conforme especificamente definidoacima.

A presente invenção se refere ainda a preparações de celulasecontendo uma ou mais proteínas de fusão de celulase da invenção, sozinhasou juntas com enzimas adicionais e aditivos de acordo com a aplicação es-pecial em questão.

A presente invenção se refere ainda aos usos de e métodos pa-ra o uso das preparações de proteína d efusão de celulase da invenção paraos propósitos especificamente revelados abaixo.

As preparações de proteína de fusão de celulase da invençãosão especialmente úteis na indústria têxtil e detergente. Essas celulases a-presentam um efeito de abrasão altamente melhorado e visível e um aumen-to da claridade mensurável. Eles apresentam um manchamento de fundoaceitável e bom, assim como um contraste focado em desbotamento. Elessão úteis na indústria têxtil para o bioacabamento de tecidos ou peças devestuário, por exemplo, remoção de pilling, desfloculação, clarificação decor, redução de aspereza, criação de diferentes acabamentos (por exemplo,um efeito de "pele de pêssego", "usado", "lavado em areia" ou "aparênciaantiga") e para o bioacabamento de fio, por exemplo, redução do excesso depêlos e melhoria da maciez. Ter tais boas propriedades remoção de pilling émuito incomum para celulases neutras, uma vez que as enzimas usadas nasaplicações de bioacabamento industrial são tipicamente celulases ácidas.Celulase neutra com excelentes propriedades remoção de pilling como aproteína de fusão cbd + 20k capacita o tratamento de bioacabamento simul-taneamente durante a tintura, levando a economias consideráveis. Tambéma firmeza de cor é geralmente melhor em condições neutras do que em áci-das.Usos adicionais incluem o uso em composições detergentes pa-ra melhorar as propriedades de cuidado de tecido por antipilling, anti-acinzentamento, clarificação de cor e amaciamento, e para melhorar o efeitode limpeza têxtil, por exemplo, remoção de manchas.

Conforme utilizado no presente contexto, a expressão "desbo-tamento" de tecido ou peça de vestuário significa o uso de enzimas no lugarde, ou além de, pedra-pomes para p tratamento de tecido ou vestuário, es-pecialmente sarja de Nimes.

Conforme utilizado no presente contexto, a expressão "bioaca-bamento" se refere ao uso de enzimas numa hidrólise controlada de fibrascelulósicas para modificar a superfície do fio ou tecido de uma forma queprevina permanentemente o pilling, melhore o manuseio de tecido como ma-ciez e lisura, limpe a estrutura da superfície pela redução da flocosidade, oque resulta na clarificação de cores, melhora a capacidade de prender dotecido, melhora a capacidade de absorção de umidade, o que pode melhorartambém a capacidade de coloração.

Conforme utilizado no presente contexto, a expressão "backstai-ning" se refere à tendência de o corante liberado redepositar na superfíciedas fibras do tecido.

Conforme usado no presente contexto, a expressão "detergente"se refere a um agente de limpeza que pode conter agentes ativos de super-fície (tensoativos aniônico, não-iônico, catiônico e anfolítico), abrasivos eoutros ingredientes opcionais, tais como agentes anti-redeposição e de sus-pensão de manchas, clarificadores óticos, agentes alvejantes, corantes epigmentos e hidrolases. Uma listagem adequada dos conteúdos de deter-gentes é dada na Patente Americana No. 5.433.750, uma lista adequada detensoativos é dada na Patente Americana No. 3.664.961.

Por uma seqüência de aminoácido que é um "equivalente" ouum "derivado" de uma seqüência de aminoácido específica se entende umaseqüência de aminoácido que não é idêntica à seqüência de aminoácidoespecífica, mas antes contém pelo menos algumas alterações de aminoáci-dos (anulações, substituições, inversões, inserções, etc.) que não necessa-riamente afetam a atividade biológica da proteína em comparação com umaatividade similar da seqüência de aminoacido específica, quando usada parauma dada aplicação.

A atividade biológica de uma celulase é a sua atividade catalíti-ca, e/ou sua capacidade de se ligar ao material celulósico.

Um vetor de expressão é um plasmídeo de clonagem ou um ve-tor capaz de expressar DNA que codifica as proteínas de fusão de celulaseda invenção após a transformação num hospedeiro desejado. Quando umhospedeiro fúngico é usado, o gene de interesse é preferivelmente fornecidoa um hospedeiro fúngico como parte de um veículo de expressão ou clona-gem que se integra no cromossomo fúngico, ou permite que o gene de inte-resse se integre no cromossomo hospedeiro, ou como um plasmídeo que sereplica autonomicamente. Seqüências que são parte do veículo de clonagemou do veículo de expressão também podem estar integradas com o referidoDNA durante o processo de integração. Além disso, no fungo o vetor de ex-pressão ou suas partes podem ser alvejadas em locais predeterminados.

O DNA que codifica as proteínas de fusão da invenção é tam-bém preferivelmente colocado sob o controle de (isto é, operativamente liga-do a) certas seqüências de controle, tais como seqüências promotoras for-necidas pelo vetor (a qual se integra com o gene de interesse). Alternativa-mente, as seqüências de controle podem ser aquelas no sítio de inserção.

As seqüências de controle de expressão de um vetor de expres-são irá variar dependendo se o vetor é projetado para expressar certo genenum hospedeiro procariótico ou num eucariótico (por exemplo, um vetor paralançamento pode fornecer um gene para seleção em hospedeiros bacteria-nos). Seqüências de controle de expressão podem conter elementos regula-tórios transcricionais tais como promotores, elementos intensificadores eseqüências de terminação transcricionais, e/ou elementos regulatórios tra-ducionais, tais como de iniciação traducional e sítios de terminação.

Uma molécula de polinucleotídeo, tal como DNA, é dita comosendo "capaz de expressar" um polipeptídeo se ele contiver seqüências decontrole de expressão as quais contêm informação regulatória transcricionale tais seqüências são "operavelmente ligadas" à seqüência de nucleotídeo aqual codifica o polipeptídeo.

Uma ligação operável é uma ligação na qual a seqüência é co-nectada a uma seqüência (ou seqüências) regulatória de tal forma a colocara expressão da seqüência sob a influência ou controle da seqüência regula-tória. Duas seqüências de DNA (tal como uma seqüência da região promoto-ra ligada à extremidade 5' da seqüência codificador de proteína) são ditascomo sendo operavelmente ligadas em função dos resultados do promotorna transcrição.

Os vetores da invenção podem ainda compreender outros ele-mentos regulatórios operativamente ligados, tais como seqüências intensifi-cadoras.

Numa modalidade preferida, transformantes geneticamente es-táveis são construídos por meio dos quais o DNA que codifica as proteínasde fusão da celulase da invenção está integrado no cromossomo do hospe-deiro pela transformação com um vetor, o qual abriga seqüências que pro-movem a integração do referido vetor no cromossomo.

Células que têm DNA estavelmente integrado que codifica asproteínas de fusão de celulase da invenção nos seus cromossomos são se-lecionadas também pela introdução de um ou mais marcadores, homólogosou heterólogos, os quais permitem a seleção de células hospedeiras asquais contêm o vetor de expressão no cromossomo, por exemplo, o marca-dor por proporcionar resistência a biocida, por exemplo, resistência a antibió-ticos, ou metais pesados, tais como cobre, ou marcadores complementandouma mutação auxotrófica no cromossomo hospedeiro, e semelhantes. Ogene do marcador selecionável pode ou estar diretamente ligado às seqüên-cias de gene de DNA a serem expressas ou introduzido na mesma célulapor co-transformação.

Uma vez que o vetor ou seqüência de DNA da invenção conten-do o(s) constructo(s) é preparada para expressão, o(s) constructo(s) de DNAé introduzido numa célula hospedeira apropriada por qualquer uma de umavariedade de formas adequadas, incluindo a transformação conforme é co-nhecido na técnica. Depois da introdução do vetor, as células receptorascrescem num meio seletivo, o qual seleciona para o crescimento de célulastransformadas.

Sistemas hospedeiros de expressão e produção adequados são,por exemplo, o sistema de produção desenvolvido para o hospedeiro de fun-go Trichoderma (EP 244 234), ou um sistema de produção de Aspergillus, talcomo A. oryzae ou A. niger (WO 9708325 e WO 9533386, US 5.843.745, US5.770.418), ou a produção de um sistema desenvolvido para Fusarium, talcomo F. oxysporum (Malardier et al., 1989). Sistemas de produção adequa-dos desenvolvidos para bactéria são um sistema de produção desenvolvidopara Bacillus, por exemplo B. subtilis ou para E. coli, ou para o actinomiceteStreptomyces. Sistemas de produção adequados desenvolvidos para leve-duras são sistemas desenvolvidos para Saccharomyces, Shizosaccharomy-ces ou Pichia pastor/s.Sistemas de produção em alguns outros micróbios ouem células de mamíferos ou em plantas também são possíveis.

A expressão da(s) seqüência(s) de gene clonado resulta na pro-dução da proteína desejada, ou na produção de um fragmento dessa proteí-na. Essa expressão pode ocorrer de uma forma contínua nas células trans-formadas, ou de uma forma controlada.

Fragmentos são entendidos como sendo partes das moléculasde ácido nucléico longas o suficiente para codificar para a proteína descritaou um fragmento biologicamente ativo seu. O termo "derivado" significa nes-se contexto que as seqüências de nucleotídeos dessas moléculas diferemdas seqüências das moléculas de ácido nucléico descritas acima em uma oumais posições e são altamente homólogas à referida seqüência. Homologiaé entendido por se referir a uma identidade de seqüência de pelo menos40%, particularmente a uma identidade de pelo menos 60%, preferivelmentemais de 80% e ainda mais preferivelmente de mais de 90%. Os desvios dasmoléculas de ácido nucléico descritos acima podem ser o resultado da anu-lação, substituição, inserção, adição ou combinação. Homologia, além disso,significa que as respectivas seqüências de nucleotídeo ou proteínas codifi-cadas são funcionalmente e/ou estruturalmente equivalentes.Conforme usado no presente contexto, as expressões "prepara-ção de enzima" e "preparação de celulase" se referem a qualquer produtoenzimático, o qual contém pelo menos uma proteína de fusão de celulase.Conseqüentemente, tal preparação de enzima pode ser um meio de culturagasto ou filtrado contendo uma ou mais proteínas de fusão de celulase ouuma ou mais proteínas de fusão de celulase e outras enzimas, uma proteínade fusão de celulase isolada ou uma mistura de uma ou mais proteínas defusão de celulase ou uma mistura de uma ou mais proteínas de fusão decelulase e uma ou mais outras enzimas. Além da atividade da proteína defusão de celulase, tal preparação pode conter aditivos, tais como estabilizan-tes, tampões, conservantes, tensoativos e/ou componentes de meio de cul-tura. Aditivos preferidos são tais, os quais são comumente usados nas pre-parações enzimáticas tencionadas para o pedido, onde a preparação enzi-mática é usada. A preparação enzimática pode estar na forma de líquido, póou granulado.

Por "meio de cultura gasto" é aqui significado o meio de culturado hospedeiro compreendendo as enzimas produzidas. Preferivelmente, ascélulas hospedeiras são separadas do referido meio depois da produção.

A preparação enzimática pode compreender uma ou mais pro-teínas de fusão de celulase da presente invenção ou outras enzimas de ce-lulase juntamente com uma ou mais proteínas de fusão de celulase da pre-sente invenção. Por exemplo, proteínas de fusão de celulase com diferentespropriedades podem ser combinadas para tornar a preparação enzimáticamais útil para diferentes condições.

Para obter as preparações enzimáticas da invenção, os hospe-deiros com as propriedades desejadas (isto é, hospedeiros capazes de ex-pressar quantidades economicamente praticáveis das proteínas de fusão decelulase da invenção) são cultivados sob condições adequadas, as enzimasdesejadas são secretadas dos hospedeiros no meio de cultura e a prepara-ção enzimática é recuperada do referido meio de cultura por métodos co-nhecidos na técnica.

A preparação enzimática pode compreender, além da proteínade fusão de celulase, uma ou mais outras enzimas, as quais podem ser, porexemplo, amilases, lacases e/ou peroxidases. Alternativamente, antes, du-rante ou depois do tratamento com a proteína de fusão de celulase da pre-sente invenção, outro tratamento enzimático pode ser executado. O trata-mento enzimático pode compreender, por exemplo, um ou mais tratamentoscom amilase, um ou mais tratamentos com celulase e/ou um ou mais trata-mentos com peroxidase e/ou lacase. Quais outras enzimas são incluídas napreparação enzimatica ou são usadas no tratamento enzimático, depende daaplicação.

A preparação enzimatica pode ser o meio de cultura com ou semas células hospedeiras naturais ou transformadas, ou é recuperada domesmo pela aplicação de métodos bem conhecidos na técnica. Entretanto,devido às proteínas de fusão de celulase da invenção serem secretadas nomeio de cultura e apresentarem atividade nas condições ambiente do líquidocelulótico, é uma vantagem da invenção que as preparações enzimáticas dainvenção possam ser utilizadas diretamente do meio de cultura sem purifica-ção adicional. Caso desejado, tais preparações podem ser liofilizadas ou aatividade enzimatica, de outra forma, concentrada e/ou estabilizada paraestocagem. As preparações enzimáticas da invenção são muito econômicaspara suprir e usar porque (1) as enzimas podem ser usadas de uma formabruta; o isolamento de uma enzima específica do meio de cultura é desne-cessário e (2) devido às enzimas serem secretadas no meio de cultura, so-mente o meio de cultura precisa ser recuperado para obter a preparaçãoenzimatica desejada; não há necessidade de extrair uma enzima dos hospe-deiros. Preferivelmente, o hospedeiro para tal produção é Trichoderma, eespecialmente T. reesei.

As preparações enzimáticas da invenção podem ser fornecidascomo um líquido ou como um sólido, por exemplo, uma forma de pó seco ougranular ou líquida, especialmente de grânulos que não espanam, ou umlíquido estabilizado, ou a preparação enzimatica pode ser, de outra forma,concentrada ou estabilizada para estocagem ou uso. É previsto que prepa-rações enzimáticas contendo uma ou mais das celulases neutras da inven-ção podem ser adicionalmente enriquecidas ou tornadas parcialmente oucompletamente deficientes em atividades enzimáticas específicas, de formaa satisfazer os requerimentos de uma utilidade específica em várias aplica-ções, por exemplo, na indústria têxtil. Uma mistura de atividades enzimáticassecretadas por um hospedeiro e, especialmente, um fungo, pode ser esco-lhida como sendo vantajosa numa aplicação industrial particular, por exem-plo, desbotamento.

As preparações enzimáticas da invenção podem ser ajustadaspara satisfazer os requerimentos de necessidades específicas em váriasaplicações na indústria têxtil, de detergente ou de polpa e papel.

Misturas podem ser preparadas com outras macromoléculas quenão são necessariamente todas produzidas a partir do mesmo hospedeiro(por exemplo, outras enzimas tais como endoglucanases, proteases, lipases,peroxidases, oxidases ou amilases) ou substâncias químicas que podemaumentar o desempenho, estabilidade ou tamponamento da preparação en-zimática desejada. Grânulos que não espanam podem ser revestidos. Pre-parações enzimáticas líquidas podem ser estabilizadas pela adição de umpoliol, tal como propilenoglicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láticoou ácido bórico, ou cloreto de sódio, de acordo com métodos estabelecidos.

Formas protegidas das enzimas da invenção podem ser prepa-radas conforme descrito na EP 238.216.

As preparações enzimáticas da invenção podem conter um ten-soativo o qual pode ser aniônico, não-iônico, catiônico, anfotérico ou umamistura desses tipos, especialmente quando usada como uma composiçãodetergente. Composições detergentes úteis estão descritas, por exemplo, naWO 94/07998, Patente Americana No. 5.443.750 e na Patente AmericanaNo. 3.664.961.

Caso requerida, uma enzima desejada pode ser ainda purificadade acordo com condições convencionais, tais como extração, precipitação,cromatografia, cromatografia por afinidade, eletroforese ou semelhantes.

As preparações enzimáticas dessa invenção são especialmenteúteis na indústria têxtil, preferivelmente em desbotamento e no bioacaba-mento ou na indústria detergente. Outras áreas úteis são na indústria depolpa e papel.

Lavagens de pedra têm três passos: desgrude, abrasão e pós-tratamento. O primeiro passo, o processo de desgrude é normalmente o pri-meiro tratamento úmido do jeans e significa a remoção de amido ou de ou-tros agentes de grude aplicados usualmente aos fios urdidos para prevenir odano durante o processo de tecelagem. Alfa-amilases são usadas para re-mover goma baseada em amido para um processamento úmido melhorado euniforme. Depois da desgomagem os jeans são normalmente rinsados comágua ou continuados diretamente com o passo de abrasão.

O segundo passo, abrasão, pode ser efetuado com enzimas oupedra-pomes ou ambas. Em todos os casos, a ação mecânica é necessáriapara remover o corante, e o tratamento é geralmente executado em máqui-nas de lavar roupa, como lavadoras de tambor. O termo "abradado" significaaqui a aparência do tecido de sarja de Nimes quando ele foi tratado por en-zimas de celulase ou pedras, ou ambos. Como resultado da remoção de co-rante desigual, existem contrastes entre áreas com corante e áreas a partirdas quais corante foi removido. Expressões sinônimas são "aparência delavado em pedra" ou "aparência gasta". Na lavagem com pedra enzimática,ou desbotamento, a abrasão com pedra-pomes é completamente ou parci-almente eliminada e a celulase é adicionada para facilitar a abrasão do co-rante índigo da superfície da fibra. O tratamento com celulase pode ser feitousando celulases neutras ou ácidas, ou ambas. Se um tecido não for tratadocom celulase ou lavado em pedra, a aparência do tecido é dita como sendo"pesada", uma vez que os contrastes da moda poderiam estar faltando.Quando um efeito mais desbotado é desejado, o alvejamento usando agen-tes químicos e/ou métodos enzimáticos, tais como tratamento com lacase,pode ser executado.

Abrasão é geralmente seguida pelo terceiro passo, depois dotratamento, que inclui os passos de lavagem e de rinsagem durante os quaisdetergentes, clarificadores óticos ou amaciantes podem ser usados. Depoisdo tratamento enzimático, a reação deve ser interrompida para prevenir da-nos dos materiais tratados, por exemplo, por inativação por temperatura e/oupH, o último compreendendo uma rinsagem completa e/ou uma remoção porlavagem do detergente. Isso assegura que a força mecânica da fibra não éadicionalmente comprometida pela presença continuada da enzima.

Por "sarja de Nimes" se entende, juntamente com essa inven-ção, tecido de sarja de Nimes, usualmente peças de roupa de sarja de Ni-mes, particularmente jeans. Vantajosamente, a sarja de Nimes é sarja deNimes corada com índigo. Sarja de Nimes também pode ser tratada comíndigo, co derivados do índigo ou sarja de Nimes corada com índigo junta-mente com algum outro corante, por exemplo, sarja de Nimes corada co ín-digo fundo de enxofre.

Tratamento com celulase(s) pode substituir completamente otratamento com pedras-pomes (por exemplo, 1 Kg de enzima comercial vs.100 Kg de pedras). Entretanto, o tratamento com celulase pode ser combi-nado com o tratamento com pedra-pomes quando for desejado produzir umacabamento pesadamente abradado. Um efeito de pele de pêssego no qualuma fina cobertura semelhante a pêlos espichada é criada também é conse-guido por uma lavagem combinando uma celulase neutra com pedra-pomes.As celulases dessa invenção são especialmente úteis para proporcionar umvisual abradado e para minimizar o manchamento de fundo no desbotamen-to.

Desbotamento é preferivelmente efetuado num pH de cerca de4,5 - 9,5, e mais preferivelmente entre um pH de 6,0 - 8,0. A temperatura dareação pode variar de cerca de 40 - 80°C, preferivelmente entre 50 - 70°C, emais preferivelmente entre 55 - 65°C, e mais preferivelmente a 60°C. A pro-porção de líquido (a proporção do volume de líquido por peso de tecido) po-de variar de cerca de 2:1 - 30:1, preferivelmente 4:1 - 15:1, e mais preferi-velmente de 5:1 - 10:1. A dosagem enzimática pode variar de cerca de 5 -8000 NCU/g de tecido, preferivelmente de 20 - 3000 NCU/g de tecido e maispreferivelmente de 30 - 1500 NCU/g de tecido. O tempo de tratamento podevariar entre 15 min - 4 h, mais preferivelmente de 20 min - 90 min e maispreferivelmente de 30 min - 60 min. Deve ser enfatizado que a dosagem en-zimática depende em grande parte do tipo de tecido, maquinaria, condiçõesdo processo (pH, temperatura, proporção do líquido, tempo de tratamento,carga de sarja de Nimes, escala do processo) e do tipo de preparação enzi-mática e semelhantes. Caso desejado, pedra-pomes podem ser usadas jun-tamente com as proteínas celulase de fusão. A dosagem enzimática requeri-da será, então, significativamente mais baixa. Uma pessoa versada na técni-ca é capaz de definir dosagens e condições adequadas.

As proteínas de fusão de celulase da invenção são úteis na in-dústria têxtil para o bioacabamento de tecidos ou peças de roupa, por exem-pio, remoção de pilling, desfloculação, clarificação de cor, redução da aspe-reza, criação de diferentes acabamentos (por exemplo, um efeito de "pele depêssego", "gasto", "lavado em areia" ou "aparência antiga") e o bioacaba-mento dos fios (por exemplo, redução dos pêlos, melhoria da maciez). Asproteínas de fusão de celulase dessa invenção podem ser usadas no bioa-cabamento em ácido e em condições neutras usando basicamente as mes-mas condições que no desbotamento.

As proteínas de fusão de celulase dessa invenção são úteis nascomposições detergentes para melhorar as propriedades de cuidado de te-cido por antipilling, anti-acinzentamento, clarificação de cor e amaciamento,e para melhorar o efeito de limpeza têxtil, por exemplo, remoção de man-chas.

O material têxtil que é tratado com as preparações enzimáticasda invenção pode ser produzido de celulose natural contendo fibras ou celu-lose sintética contendo fibras ou misturas suas. Exemplos de celulósicosnaturais são algodão, linho, cânhamo, juta e rami. Exemplos de celulósicossintéticos são viscose, acetato de celulose, triacetato de celulose, "rayon",cupro e liocel. Os celulósicos acima mencionados podem também ser em-pregados como misturas de fibras sintéticas tais como poliéster, poliamidaou fibras acrílicas. O material têxtil pode ser fio ou tricotado ou trançado ouformado por qualquer outra forma.

As celulases da invenção, além de serem especialmente úteispara o tratamento de tecidos, são úteis em geral em qualquer área que re-queira a atividade de celulase.

Na indústria de polpa e de papel, celulases neutras podem serusadas, por exemplo, na retirada de tinta de diferentes papéis reciclados eem papelões com pH neutro ou alcalino, na melhoria da qualidade da fibraou no aumento da drenagem na produção de papel. Outros exemplos inclu-em a remoção do espessante da pasta de estampagem e do excesso decorante depois da estampagem têxtil, e como um tratamento para ração a-nimal. Por exemplo, se a aplicação tencionada for a melhoria da força dapolpa mecânica, então as preparações enzimáticas da invenção podem for-necer uma ou mais dessas proteínas de forma a aumentar ou facilitar a ca-pacidade das fibras de celulose de se ligarem juntas. De uma forma similar,na aplicação do refinamento da polpa, as preparações de proteína de fusãode celulase da invenção podem proporcionar uma ou mais dessas proteínasnum nível que intensifique ou facilite tal expansão. Das proteínas de fusãoda invenção especialmente adequadas para aplicações de polpa são aque-las com 50 KB de Melanocarpus albomyces ou núcleo de CBHI de Thermo-ascus aurantiacus.

As proteínas de fusão de celulase da presente invenção propor-cionam vantagens não-esperadas quando usadas na indústria têxtil e espe-cialmente em desbotamento. As proteínas de fusão de celulase da invençãosão consideravelmente mais eficientes do que as celulases da técnica ante-rior. No desbotamento pelo menos dosagens duas vezes, usualmente pelomenos três vezes e mesmo seis vezes menores em termos de unidades deatividade de celulase neutra dosadas no peso do tecido puderam ser usa-das, sem impedir a força do tecido. Em outras palavras, um desempenho atéseis vezes maior é alcançado pelo uso das proteínas de fusão da celulaseda presente invenção. Uma vez que o rendimento da produção das proteí-nas de fusão da celulase da invenção corresponde àquele da celulase 20Kconhecida, a eficiência de produção global é significativamente melhorada.

Isso pode ser proporcionado grandemente para grandes economias nasquantidades de enzimas necessárias: a possibilidade de usar quantidadesreduzidas da enzima oferece um valor econômico considerável em termostanto de produção quanto de uso, incluindo a logística.

A invenção é descrita em maiores detalhes nos seguintes exem-plos, os quais não são para serem interpretados para estreitar o escopo dainvenção, mas somente para esclarecer o uso da invenção.

Exemplo 1. Construção dos vetores de expressão para asproteínas de fusão cbd + 20k

Métodos de biologia molecular padronizados foram usados noisolamento, purificação e tratamentos enzimáticos de DNA (plasmídeos,fragmentos de DNA) em reações em cadeia da polimerase (PCR), em trans-formações com E. coli, etc. Os métodos básicos usados estão descritos nosmanuais de biologia molecular padrões, por exemplo, Sambrook et ai (1989)e Sambrook and Russell (2001).

Constructos de plasmídeos foram projetados para juntar a se-qüência codificadora de 20K de Melanocarpus albomyces (Cel45A, AC#AJ515703; SEQ ID. NO: 1) com a seqüência codificadora do ligante e CBDdo CBHI de Trichoderma reesei{AC# AR088330; Srisodsuk etal. 1993; SEQID. NO: 3). De modo geral, seis junções diferentes foram projetadas confor-me descrito na Tabela 1.

Para os constructos #1 e #2 estabelecidos na Tabela 1, um úni-co sítio Nrul foi introduzido na extremidade da seqüência codificadora 20K.Esse sítio capacita a fusão direta depois do códon para a serina #213 do20K maduro co qualquer fragmento de DNA com uma extremidade sem cor-te. Uma reação de PCR correu com os iniciadores 20K_Nco (SEQ ID NO:11) e 20K_NruXho (SEQ ID NO: 14) com o plasmídeo pALK1480 (Fig. 1)como o molde usando o programa A (Tabela 3). pALK1480 tem a cópia ge-nômica de cel45A de M. albomyces (codificando a Cel45A ou 20K) inseridasob o promotor T. reesei cbhl como uma fusão exata e como terminadorcbhl à jusante do gene no vetor pUC19 (New England, Biolabs, Inc., EUA).A mistura de reação de PCR continha tampão de reação 1 x DyNAzyme™EXT (Finnzymes, Finlândia), Mg2+ 8 mM ( a concentração final ajustada comMgCI2 adicionado), dNTPs 0,2 mM, 0,5 \M de cada iniciador, 1,0 unidade deDNA polimerase DyNAzyme™ (Finnzymes, Finlândia) e aproximadamente500 ng/100 \iL do molde. O produto de PCR foi digerido com enzimas derestrição Ncol e Xhol e o fragmento foi isolado do gel de agarose depois daeletroforese. O fragmento de 6,1 Kb semelhantemente cortado e isolado depALK1480 foi ligado com o fragmento de PCR, e transformado em E. coliXL1-Blue (Stratagene, EUA). O DNA de plasmídeo foi isolado dos transfor-mantes, e um candidato adequado foi verificado por seqüenciamento. Oplasmídeo resultante foi designado como pALK1429.

As reações de PCR foram efetuadas separadamente como aci-ma compares de iniciadores 1_BamMly (SEQ ID NO: 16) + XhoAge (SEQ IDNO: 15) e 2_BamMly (SEQ ID NO: 17) +XhoAge (SEQ ID NO: 15) compALK492 como o molde (Fig. 2) e os produtos de PCR resultantes, contendoo ligante e CBD, foram digeridos com Mlyl (produzindo uma extremidadesem corte exatamente antes do primeiro códon desejado da seqüência codi-ficadora do ligante e CBD) e AgeL. pALK492 carrega cerca de 6,9 Kb dofragmento Pstl de DNA cromossomal QM6a de T. reesei abrigando o genecbh1/cel7A subclonado no sítio Pstl de pUC19. pALK1429 obtido acima foidigerido com Nrul e Agel, e a parte do vetor foi isolada e ligada separada-mente com os dois produtos de PCR digeridos obtidos acima, e transforma-da em XL1-Blue de E. coli. DNAs de plasmídeos foram isolados, verificadorpor seqüenciamento e os plasmídeos resultantes foram designados comopALK1430 (carregando o produto de PCR 1_BamMly + XhoAge como umainserção) e como pALK1431 (carregando o produto de PCR 2_BamMly +XhoAge como uma inserção).Tabela 1. Diferentes junções construídas entre 20K de Melanocarpus afbomyces e o ligante CBHI + CBD de Trichoderma reesei.

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Na segunda coluna, a parte mais à esquerda é a seqüência derivada de Melanocarpus e a parte mais à direita é aseqüência derivada de Trichoderma. Letras minúsculas indicam seqüências originais, letras maiúsculas indicam a seqüênciamodificada, período (.) indica um aminoacido anulado e um hífen indica o ponto de junção unido pela ligação dos plasmideosrelevantes. O primeiro aminoacido da seqüência de Melanocarpus é a histidina #201 da seqüência madura e nos constructos#1, #3, #4 e #6 o primeiro aminoacido da seqüência Trichoderma é glicina #427, no constructo #2 é glicina #434 e no constructo #5 serina #428 da seqüência madura.Tabela 2. Iniciadores usados

<table>table see original document page 33</column></row><table>Tabela 3. Programas de reação de PCR usados

<table>table see original document page 34</column></row><table>

O marcador amdS e a região flanqueadora cbhl 3' de T. reeseiforam inseridas nos vetores pALK1430 e pALK1431 como se segue:pALK424 (Patente Americana No. 5.837.51; figura 3) foi cortado com EcoRIe Spel, o fragmento resultante de 4,8 Kb foi deixado sem corte pela reaçãode preenchimento de Klenow, e ligado separadamente com plasmídeospALK1430 e pALK1431 cortados com Stul, respectivamente, e transformadoem XL1-Blue de E. coli. Os DNAs de plasmídeos foram isolados e a orienta-ção desejada das inserções foi averiguada por digestão com enzimas derestrição apropriadas. Os plasmídeos verificados foram designados comopALK1434 (inserção do pALK1430) e pALK1435 (inserção do pALK1431),respectivamente (Tabela 1).

Para os constructos #3, #4, #5 e #6 estabelecidos na Tabela 1foi feita uma tentativa diferente. A seqüência codificadora do 20K e de pon-tos de junção modificados diferentes (Tabela 1) foram designadas para ter-minar no códon que codifica serina, o qual forma uma parte do sítio Nrul adi-cionado. Para todos aqueles constructos a mesma inserção foi usada parafornecer a seqüência codificante da maior parte do ligante e de CBD. O últi-mo foi construído como se segue: Uma reação de PCR foi efetuada com amistura reacional descrita acima (exceto sem Mg2+ adicionado) e usando opar de iniciadores 3_BamMly (SEQ ID NO: 18) e XhoAge (SEQ ID NO: 15) eDNA de pALK492 como o molde. O programa B na Tabela 3 foi usado. Oproduto de PCR resultante foi digerido com BamHI e Xhol, isolado e ligadocom a parte do vetor similarmente cortado de pBluescript II KS+ (Stratagene,EUA), e transformado em XL1 Blue de E. coli. o DNA de plasmídeo foi isola-do, verificado por digestão com enzimas de restrição apropriadas e verifica-do por seqüenciamento. Um plasmideo candidato com a seqüência desejadafoi escolhido e designado como pALK1767.

Para o constructo #3 na Tabela 1, uma reação de PCR foi efetu-ada usando o par de iniciadores 20K_Nco_2 (SEQ ID NO: 12) e 20K-NruXho_GPI (SEQ ID NO: 19) e DNA de pALK1480 como o molde. Duasmisturas reacionais foram usadas: uma com a composição descrita acimapara a construção de pALK1767 e a outra com DMSO adicionado para 3%(v/v). Essas duas misturas reacionais foram divididas e corridas com os pro-gramas C e D na Tabela 3. Todas as reações produziram fragmentos deDNA de tamanho esperado, e as preparações foram combinadas e digeridascom Ncol e Xhol. Os fragmentos de DNA foram isolados e ligados com umfragmento de 6,1 Kb isolado e semelhantemente cortado do pALK1480, etransformados em XL1 Blue de E. coli. O DNA de plasmideo foi isolado, veri-ficado por digestão com enzimas de restrição apropriadas e verificado porseqüenciamento. Um plasmideo candidato com a seqüência desejada foiescolhido e designado como pALK1758.

Para o constructo #4 na Tabela 1, uma reação de PCR foi efetu-ada usando o par de iniciadores 20K_Nco_3 (SEQ ID NO: 13) e 20K-NruXho_WGEI (SEQ ID NO: 20) e DNA de pALK1480 como o molde. A mis-tura reacional de PCR continha tampão de reação 1x Phusion™ GC(Finnzymes, Finlândia), dNTPs 0,2 mM, 0,5 de cada iniciador, DMSO 3%(v/v) e 1,0 unidade de DNA polimerase Phusion™ (Finnzymes, Finlândia) eaproximadamente 70 ng/100 fiL do molde. A mistura reacional foi dividida ecorrida com os programas C e D na Tabela 3. Ambas as reações produziramfragmentos de DNA de tamanho esperado, e as preparações foram combi-nadas e digeridas com Ncol e Xhol. O fragmento de DNA foi isolado e ligadocom um fragmento de 6,1 Kb isolado e semelhantemente cortado dopALK1480, e transformado em XL1 Blue de E. coli. O DNA de plasmideoforam isolados, verificados por digestão com enzimas de restrição apropria-das e verificados por seqüenciamento. Um plasmideo candidato com a se-qüência desejada foi escolhido e designado como pALK1759.Para o constructo #5 na Tabela 1, uma reação de PCR foi efetu-ada usando o par de iniciadores 20K_Nco_2 (SEQ ID NO: 12) e 20K-NruXho_PavQIPS (SEQ ID NO: 21) e DNA de pALK1480 como o molde.Duas misturas reacionais foram usadas: uma com a composição descritaacima para a construção de pALK1759 e a outra sem DMSO. Essas duasmisturas reacionais foram divididas e corridas com os programas C e D naTabela 3. Todas as reações produziram fragmentos de DNA de tamanhoesperado, e as preparações foram combinadas e digeridas com Ncol e Xhol.O fragmento de DNA foi isolado e ligado com um fragmento de 6,1 Kb isola-do e semelhantemente cortado do pALK1480, e transformados em XL1 Bluede E. coli. Os DNAs de plasmídeo foram isolados, verificados por digestãocom enzimas de restrição apropriadas e verificados por seqüenciamento.Um plasmídeo candidato foi escolhido e designado como pALK1760; ele ad-quiriu uma mutação no sítio Xhol único, mas isso não apresentou problemapara a subclonagem adicional.

Para o constructo #6 na Tabela 1, uma reação de PCR foi efetu-ada usando o par de iniciadores 20K (SEQ ID NO: 13) e 20K-NruXho_WGEI2 (SEQ ID NO: 22) e DNA de pALK1480 como o molde (70ng/100 u.L). A mesma composição da mistura reacional foi usada par a cons-trução do plasmídeo pALK1767, e ela correu com o programa C na Tabela 3.A preparação foi digerida com Ncol e Xhol. O fragmento de DNA foi isoladoe ligado com um fragmento de 6,1 Kb isolado e semelhantemente cortado dopALK1480, e transformados em XL1 Blue de E. coli. Os DNAs de plasmídeoforam isolados, verificados por digestão com enzimas de restrição apropria-das e verificados por seqüenciamento. Um plasmídeo candidato foi escolhi-do e designado como pALK1773.

Os plasmídeos pALK1758, pALK1759, pALK1760 e pALK1773foram separadamente cortados com Nrul e Agel, e as partes do vetor foramisoladas. Cada preparação foi ligada com um fragmento de 235 pb isoladodo pALK1767 depois da digestão com Mlyl e Agel, e cada mistura de ligaçãofoi transformada separadamente em XL10-Gold de E. coli. Os DNAs deplasmídeo foram isolados, verificados por digestão com enzimas de restriçãoapropriadas e verificados por seqüenciamento. Os plasmídeos verificadosforam designados como pALK1764, pALK1765, pALK1766, e pALK1774,respectivamente (Tabela 1).

O marcador amdS e a região flanqueadora 3' cbhl de T. reeseiforam inseridas em vetores pALK1764, pALK1765, pALK1766, e pALK1774como se segue: pALK424 foi cortado com EcoR1 e Spe1, o fragmento de 4,8Kb resultante foi tomado sem corte pela reação de preenchimento de Kle-now e ligado separadamente com os plasmídeos pALK1764, pALK1765,pALK1766 e pALK1774 cortados com Stul, respectivamente, e transforma-dos em XL10-Gold de E. coli. DNAs de plasmídeo foram isolados e a orien-tação desejada das inserções foi checada por digestão das enzimas de res-trição apropriadas. Os plasmídeos verificados foram designados comopALK1768, pALK1769, pALK1770, e pALK1775, respectivamente (Tabela 1)(Fig. 10).

Exemplo 2. Produção das proteínas de fusão cbd + 20k em T. reesei

Cassetes de expressão linear de 8,7 Kb dos plasmídeospALK1434 e pALK1435 foram isolados da estrutura do vetor depois da di-gestão com EcoRI e transformados para protoplastos A47 de T. reesei. Astransformações foram efetuadas conforme descrito em Penttilã et ai. (1987)com as modificações descritas em Karhunen et ai (1993) selecionando comacetamida como a única fonte de nitrogênio. Os transformantes foram purifi-cados nas placas de seleção através de conídias individuais antes de seremesporuladas em PD (Ágar batata dextrose).

A produção de cbd + 20k dos transformantes foi analisada a par-tir dos sobrenadantes de cultura das culturas do frasco de agitação (50 ml_).Os transformantes cresceram por 7 dias num meio indutor de celulase com-plexo (Joutsjoki et ai 1993) tamponado com KH2P04 5% em pH 5,5. A ativi-dade enzimática da proteína de fusão foi medida como a liberação dos açú-cares redutores da carboximetilcelulose (CMC 3%) a 50 -C em tampão He-pes 50 mM pH 7,0 em 10 min (atividade NCU, nkat; Bailey e Nevalainen,1981; Haakana et aí., 2004). Atividades de NCU dos melhores transforman-tes produtores estão apresentadas na Tabela 4. Os genótipos dos transfor-mantes escolhidos foram confirmados pelo uso de Southern blots, nos quaisvárias digestões genômicas foram incluídas e o respectivo cassete de ex-pressão foi usado como uma sonda. A proteína cbd + 20k foi detectada dossobrenadantes de cultura usando os anticorpos policlonais promovidos con-tra a celulase neutra de 20K de Melanocarpus albomyces purificada (Haaka-na et ai 2004) e o sistema AP de Western blot ProtoBlot (Promega). A análi-se de Western blot mostrou que as enzimas cbd + 20k de fusão foram pro-duzidas principalmente como proteínas de fusão estáveis em T. reesei.

Tabela 4. Atividades NCU dos transformantes cbd + 20k se-lecionados de culturas de frasco de agitação

<table>table see original document page 38</column></row><table>

Na Tabela 4, o número de construção se refere à Tabela 1; onúmero RF se refere àqueles onde os transformantes foram nomeados co-mo cepas RF.

O alvejamento possível do cassete de expressão para o localcbhl (cel7A) foi varrido como um fenótipo CBHI negativo por Western blot. Adetecção da proteína CBHI foi efetuada usando os anticorpos monoclonaisCI-258 ou CI-261 (Aho et al., 1991) e o sistema de Western blot ProtoBlotAP (Promega, EUA). Os genótipos dos transformantes escolhidos foramconfirmados pelo uso de Southern blots, nos quais várias digestões genômi-cas foram incluídas e o respectivo cassete de expressão foi usado comosonda.

Cassetes de expressão lineares de 8,7 Kb dos plasmídeospALK1768, pALK1769, pALK1770 e pALK1775 preparados no Exemplo 1foram isolados da estrutura do vetor depois da digestão de EcoRI e trans-formados em protoplastos RF5796 e RF5798 de T. reese/(ambas as cepasoriginadas da cepa QM6a (Bailey e Nevalainen, 1981) e com o fenótipo C-BHI- CBHII- EGI- EGII- para as celulases T. reeseiendógenas) selecionandocom acetamida como a única fonte de nitrogênio. Os transformantes forampurificados em placas de seleção através de conídias individuais antes deserem esporuladas em PD.

A produção de cbd + 20k dos transformantes foi analisada a par-tir dos sobrenadantes de cultura das culturas do frasco de agitação (50 ml_).Os transformantes cresceram por 7 dias num meio indutor de celulase com-plexo (Joutsjoki et ai 1993) tamponado com KH2P04 5% em pH 5,5. A ativi-dade NCU das proteínas de fusão cbd + 20k produzidas foi, a seguir, ensai-ada conforme descrito acima. As atividades NCU dos transformantes sele-cionados estão apresentadas na Tabela 5. Os genótipos dos transformantesescolhidos foram confirmados pelo uso de Southern blots nos quais váriasdigestões genômicas foram incluídas e o respectivo cassete de expressãofoi usado como uma sonda. A proteína cbd + 20k foi detectada a partir dossobrenadantes de cultura usando os anticorpos policlonais levantados contraa celulase neutra 20K de M. albomyces (Haakana et ai. 2004) e o sistemaAP de Western blot ProtoBlot (Promega, EUA). A análise de Western blotmostrou que a enzima cbd + 20k de fusão foi produzida pelos transforman-tes. Algumas culturas mostraram também uma banda reagindo com o antis-soro anti-20K e com a mobilidade da proteína 20K do tipo selvagem, indi-cando que possivelmente alguma clivagem do ligante + CBD ocorreu duran-te o cultivo. A proteína de fusão cbd + 20k produzida pelos transformantespALK1770 foi escolhida em estudos adicionais devido à sua estabilidade.Tabela 5. Atividades NCU dos transformantes cbd + 20k doscultivos do frasco de agitação

<table>table see original document page 40</column></row><table>

Na Tabela 5, o número de construção se refere à Tabela 1; onúmero RF se refere àqueles onde os transformantes foram nomeados como cepas RF.

Cepas RF5582, RF5583, RF6036, RF5977 e RF5978 de T. ree-sei cresceram num bioreator para testes de aplicações. Algumas prepara-ções foram tratadas por aquecimento (pH 6,0, 659C, 60 - 70 min) para inati-var qualquer atividade de enzima endógena de T. reesei remanescente, cbd+ 20k é relativamente estável ao aquecimento (Miettinen-Oinonen et al. 2004), e não desnatura durante o tratamento.

Exemplo 3. Produção das proteínas mutantes de afinidadecbd + 20k de fusão em T. reesei

Enzima 20K de Melanocarpus albomyces (cel45A, AC# AJ515703)foi fundida com o domínio de ligação à celulose (CBD) de CBHI de Tricho-derma reesei no qual os resíduos de tirosina conservados nas posições 31(correspondendo ao Y492 do polipeptídeo maduro) e/ou 32 (correspondendoao Y493 do polipeptídeo maduro) foram modificados para alanina conformedescrito por Linder et ai, 1995. Além disso, o resíduo de tirosina na posição31 foi substituído por triptofano, um aminoácido naturalmente encontrado naregião CBD de, por exemplo, Humicola grisea CBHI (Azevedo et ai, 1990) eT. reesei EGM (Cel45A, Saloheimo etal., 1994). Os CBDs modificados foramconstruídos por PCR e as substituições dos aminoácidos de Y31A, Y32A,Y31W e Y31A_Y32A foram incluídas no domínio de ligação de celulose doCBHI de T. reesei (numeração de acordo com a seqüência de aminoácidosdo CBD). Em todos os constructos, o iniciador "forward" 3_BamMly: 5'-TAGGATCCGAGTCCCATTACCGGCAACCCTAGCG-3' (SEQ ID. NO: 18)foi usado. Os iniciadores reversos usados para a amplificação de diferentesprodutos CBDmut estão descritos na Tabela 6. As misturas de reação de PCRcontinham tampão reacional 1 x PfuUltra™ HF (Stratagene, EUA) fornecen-do concentração de Mg2+ 2 mM, dNTPs 0,2 mM, 2 p,M de cada iniciador e1,5 unidades de DNA polimerase PfuUltra™ HF (Stratagene, EUA) e apro-ximadamente 45 ng de plasmídeo pALK492 como molde. O plasmídeopALK492 (Fig. 2) contém o gene cbhl de T. reesei. As condições para asreações de PCR foram as seguintes: 2 min de desnaturação inicial a 95 QC,seguido por 30 ciclos de 1 min a 95 9C, 1 min de anelamento a 65 eC (gradi-ente de ± 5 eC), 2 min de extensão a 72 9C e uma extensão final a 72 eC por10 min.Tabela 6. Iniciadores de PCR reverso projetados para amplificar produtos de CBD modificados

<table>table see original document page 42</column></row><table>Todas as combinações de PCR produziram o fragmento de DNAespecífico nas reações de PCR na temperatura de anelamento de 60 eC. Osprodutos de PCR foram isolados dessas reações, digeridos com enzimas derestrição Xhol e BamHI e, a seguir, clonados para o pBluescript II KS+ (Stra-tagene, EUA). Os plasmídeos obtidos foram nomeados como pALK1884(mutação Y31A), pALK1885 (mutação Y32A), pALK1886 (mutação Y31W) epALK1887 (mutações Y31A_Y32A). Os fragmentos de PCR nos plasmídeosforam confirmados por seqüenciamento. As inserções digeridas Mlyl e Ageldos plasmídeos pALK1884 a pALK1887 foram ainda ligadas a um fragmentode vetor pALK1760 digerido com Nrul e Agel contendo o gene 20K de Mela-nocarpus albomyces de comprimento total fundido com o terminador e pro-motor cbhl (cel7A) de T. reesei. A parte C terminal do gene 20K nopALK1760 foi modificada de forma que a ligação do fragmento CBD produziuum ponto de junção de PAVQIPSS (constructo #5) o qual mostrou resultarnum produto de fusão estável em T. reesei conforme descrito nos Exemplos1 e 2. No passo final, o marcador amdS foi adicionado como um fragmentoSpel-EcoRI de extremidade sem corte (4,5 Kb) do plasmídeo p3SR2 (Fig. 6)para obter plasmídeos de expressão de pALK1877 (mutação Y31a),pALK1878 (mutação Y32A), pALK1879 (mutação Y31W) e pALK1880 (mu-tação Y31A_Y32A) para a produção de enzimas cbd + 20kmut de fusão em T.reesei. As seqüências de aminoácidos da proteína 20K de fusão ao peptídeoligante, seguidas pela região CBD modificada estão apresentadas na figura11B. Os plasmídeos de expressão foram conformados por seqüenciamento,e os cassetes de expressão lineares de 8,4 Kb (Fig. 11 A) foram isolados daestrutura do vetor depois da digestão com Notl e foram transformados emprotoplastos RF5796 de T. reesei. As transformações foram efetuadas emPentillã et ai (1987) co as modificações descritas em Karhunen ei ai (1993),selecionando com acetamida como a única fonte de nitrogênio. Os transfor-mantes foram purificados em placas de seleção através de conídias indivi-duais antes de serem esporuladas em PD.

A produção de cbd + 20kmut dos transformantes foi analisada apartir dos sobrenadantes de cultura das culturas do frasco de agitação (50mL). Os transformantes cresceram por 7 dias num meio indutor de celulasecomplexo (Joutsjoki et ai 1993) tamponado com KH2P04 5% em pH 5,5. Aatividade enzimática da proteína de fusão foi medida como a liberação dosaçúcares redutores da carboximetilcelulose (CMC 3%) a 50 9C em tampãoHepes 50 mM pH 7,0 em 10 min (atividade NCU, nkat; Bailey e Nevalainen,1981; Haakana era/., 2004). Atividades de NCU dos melhores transforman-tes produtores estão apresentadas na Tabela 7. Os genótipos dos transfor-mantes escolhidos foram confirmados pelo uso de Southern blots, nos quaisvárias digestões genômicas foram incluídas e o respectivo cassete de ex-pressão foi usado como uma sonda. A proteína cbd + 20kmUt foi detectadados sobrenadantes de cultura usando os anticorpos policlonais promovidoscontra a celulase neutra de 20K de Melanocarpus albomyces purificada (Ha-akana et ai 2004) e o sistema AP de Western blot ProtoBlot (Promega). Aanálise de Western blot mostrou que as enzimas cbd + 20kmut de fusão fo-ram produzidas principalmente como proteínas de fusão estáveis em 7". ree-sei.

Tabela 7. Atividades NUC dos transformantes cbd + 20kmut seleciona-dos a partir de cultivo de frasco de agitação.

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Número RF se refere àqueles que os transformantes foram no-meados como cepas RF.

As cepas de RF6084 a RF6086, RF6088, RF6090 a RF6092 eRF6094 foram, fermentadas para obter material para os testes de aplicação(ver Exemplos 9 -11).

Exemplo 4. Produção das proteínas de anulação de ligantecbd + 20k de fusão em T. reesei

Enzima 20K de Melanocarpus albomyces foi fundida com o do-mínio de ligação à celulose (=CBD) do CBHI de Trichoderma reesei, o qualfoi ainda modificado pela introdução de anulações no peptídeo ligante inter-domínio. As anulações do ligante foram projetadas de acordo com Srisodsuket ai, 1993. A anulação de aminoácidos da posição 434 até a 444 (mutanteAG-444) do polipeptídeo maduro remove aproximadamente um terço do li-gante incluindo a seqüência repetida rica em glicina e em prolina, mas dei-xando todos os sítios de O-glicosilação putativos intactos. A anulação dosresíduos da posição 434 até a posição 460 (Mutante AG-460) remove prati-camente todo o ligante (Fig. 12A). Anulações de ligante cbd + 20k adicionaiscom uma mutação de dupla afinidade de Y31A_Y32A na região CBD foramtambém construídas.

Reações de PCR foram efetuadas para introduzir as anulações ao peptídeoligante assim como a substituição do aminoácido à região CBD. As amplifi-cações de PCR foram feitas conforme descrito no Exemplo 3, exceto que atemperatura de anelamento de 60 eC (gradiente de ± 5eC) foi usada. Os ini-ciadores "forward" 5'-TAGGATCCGAGTCCCATTACCGGCAACCCTAGCACCACCACCACCCGCCGCCCAGCC-3' (SEQ ID. NO: 31) e 5'-TAGGATCCGAGTCCCATTACCGGCAACCCTAGCCCTACCCAGTCTCACTACGGCCAGTGC-3' (SEQ ID. NO: 32) foram usados para sintetizar as anulações doligante de AG-444 e do AG-460, respectivamente. Correspondentemente, oiniciador reverso 5'-TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGCTTTACAGG-3 (SEQ ID. NO: 33) foi usado para amplificar a região CBDintacta do CBHI de T. reesei. A mutação Y31A_Y32A da região CBD foi ge-rada com o iniciador reverso 5'-TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGCTTTACAGGCACTGAGAGGCGGCAGGGTTCAGG-3' (SEQID. NO: 30).

Todas as combinações de iniciadores produziram o fragmentode DNA específico nas reações de PCR na faixa de 55,29C até 65,09C detemperaturas de anelamento. Os plasmídeos de expressão pALK1893 (anu-lação AG-444 ), pALK1896 (anulação AG-460), pALK1899 (anulação AG-444, mutação Y31A_Y32A) e pALK1952 (anulação AG-460, mutaçãoY31A_Y32A) foram construídos conforme descrito no Exemplo 3. As se-qüências de aminoacidos da proteína de fusão 20K para o peptídeo ligantecortado seguido pelo CBD intacto ou modificado estão apresentadas na figu-ra 12B. Os cassetes de expressão linear de 8,3 Kb foram isolados da estru-tura do vetor depois da digestão por EcoRI e foram transformados em proto-plastos RF5796 de T. reesei. Transformação, purificação transformante, cul-turas de frasco de agitação, medições de atividade, hibridizações por Sou-thern blot, e análises de Western blot foram efetuadas conforme descrito no Exemplo 3.

Tabela 8. Atividades NCU dos transformantes de anulaçãode ligante CBD + 20K selecionados a partir do cultivo de frascos de agitação

<table>table see original document page 46</column></row><table>

O número RF se refere àqueles onde os transformantes foramnomeados como cepas RF.

As cepas selecionadas RF6107, RF6108, RF6110 até RF6112 eRF6114 até RF6116 foram fermentadas para obter material para os testesde aplicação (Exemplos 9 a 11). A análise de Western blot mostrou que asenzimas de anulação de ligante CBD + 20K de fusão foram produzidas comoproteínas de fusão estáveis em T. reesei.

Exemplo 5. Produção da proteína de fusão 50K + CBD deMelanocarpus albomyces recombinante em T. reesei.

Constructos de plasmídeos foram projetados para juntar a se-qüência codificadora de 50K de Melanocarpus albomyces (cel7A, AC#AJ515704) com a região ligante e o domínio de ligação de celulose (CBD) doCBHI de T. reesei (cel7A, AC# AR088330; Srisodsuk etal. 1993). PlasmídeopALK1237 (Fig. 4), o qual é uma base para os novos constructos, contém ogene cel7A sob controle do promotor cbhl de T. reesei como uma fusãoexata.

Primeiro, um único sitio de restrição Nrul foi introduzido próximodo C-terminal da seqüência codificadora 50K. Isso capacita a fusão direta dequalquer DNA sem corte depois do aminoácido S393 do polipeptídeo 50Kmaduro (Fig. 13B). Uma reação de PCR foi efetuada com os iniciadores2_50K_NrulSpel (5' cggcactagttcgcgacccgatctcgccccagcgcagg 3';SEQ ID. NO: 25) e 50K_Xhol (5' cgccgagggccggctcgagagcatcc 3'; SEQID. NO: 26) usando pALK1237 como um molde. A reação de PCR continha 1x de tampão de reação DyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlândia), dNTPs0,25 mM, 0,5 jliM de cada iniciador, 2,0 unidades de DNA polimerase de Dy-NAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlândia) e aproximadamente 50 ng/100 |iL deDNA molde pALK1237. As condições para a amplificação por PCR foramcomo se segue: 5 min de desnaturação inicial a 96 9C, seguido por 25 ciclosde 15 s a 96 9C, anelamento de 60 s a 56 eC ou 61 eC, 60 s de extensão a72 9C e uma extensão final a 72 9C por 10 min. O produto de PCR foi digeri-do com as enzimas de restrição Xhol e Spel e purificado a partir de gel deagarose. O fragmento de PCR purificado foi ligado no fragmento de restriçãoXhol-Spel de 6,9 Kb do plasmídeo pALK1237 e transformado em XL1-Bluede E. coli (Stratagene, EUA). DNA de plasmídeo foi isolado dos transforman-tes e três candidatos foram verificados por seqüenciamento. O clone sele-cionado foi designado como pALK1703.

O ligante CBHI + CBD de T. reesei foi amplificado por PCR cominiciadores 3_BamMly_50 (5TTGGATCCGAGTCGCAGCACCGGCAACCCTAGCG 3"; SEQ ID. NO: 36) e XhoAge (5' TGACTCGAGACCGGTGCGT-CAGGCTTTCGC 3'; SEQ ID. NO: 15) usando pALK492 como molde. Ascondições de reação de PCR foram conforme descritas acima, exceto que otempo de extensão na reação de amplificação foi de 90 s. O produto de PCRfoi digerido com enzimas Mlyl e Agel e purificado a partir de gel de agarose.O fragmento de PCR contendo o ligante + CBD foi ligado no fragmento derestrição Agel-Nrul de 6,8 Kb de pALK1703 e transformado em XL1-Blue E.coli (Stratagene, EUA). Os transformantes foram analisados conforme des-crito acima e um clone adequado foi designado como pALK1704.

Para capacitar a seleção de transformantes de T. reesei o genemarcador amdS e a região flanqueadora 3' cbhl de T. reesei foi inserida noplasmídeo do vetor pALK1704. Um fragmento de restrição EcoRI-Spel de4,8 Kb de pALK424 (US 5.837.515) foi isolado e as extremidades do frag-mento foram preenchidas com enzima Klenow. O fragmento marcador amdSde extremidade sem corte foi ligado no pALK1704 digerido Stul e transfor-mado em XL1-Blue E. coli (Stratagene, EUA). DNA de plasmídeo foi isoladoa partir de transformantes e a orientação desejada da inserção foi verificadapela digestão da enzima de restrição. O transformante selecionado foi de-signado como pALK1708.

Um cassete de expressão linear de 9,2 Kb (Fig. 13A) da estrutu-ra pALK1708 foi isolado por digestão por EcoRI, transformado em protoplas-tos RF5636 de T. reesei (derivados da cepa QM6a; Bailey e Nevalainen,1981), e transformantes selecionados com acetamida como a única fonte denitrogênio. A cepa do hospedeiro não tem três celulases endógenas princi-pais: CBHII (Cel6A), EGI (Cel7B) e EGII (Cel5A). A transformação foi efetu-ada de acordo com Pentillà et al. (1987) com modificações descritas por Ka-rhunen et ai (1993). Os transformantes foram purificados em placas de sele-ção através de conídias individuais antes de esporular as mesmas em PD.

A produção da proteína de fusão 50K + CBD dos transformantesfoi analisada a partir dos sobrenadantes de cultura de criações de frasco deagitação (50 mL). Os transformantes cresceram por 7 dias num meio indutorde celulose complexo (Joutsjoki et al. 1993) tamponado com KH2P04 5% empH 5,5. A atividade enzimática da proteína de fusão foi medida como a libe-ração dos açúcares redutores da carboximetilcelulose (CMC 3%) a 50SC emtampão Hepes 50 mM pH 7,0 em 10 min (atividade NCU; Bailey e Nevalai-nen, 1981; Haakana et al., 2004). A atividade dos transformantes variou de2035 a 3633 NCU/mL A proteína 50K + CBD foi detectada a partir do so-brenadante da cultura por sistema AP de Western blot ProtoBlot (Promega)usando anticorpos policlonais promovidos contra a celulase neutra 50K deMelanocarpus albomyces purificada (Haakana et al. 2004). A análise deWestern blot mostrou que a proteína de fusão 50K + CBD produzida de T.reesei é estável. Os genótipos dos transformantes escolhidos foram analisa-dos por Southern blotting usando o cassete de expressão como uma sonda.O alvejamento possível do cassete de expressão para o local cbhl tambémfoi verificado por Western blotting usando anticorpos CBHI monoclonais (Cl-261, Aho et al., 1991) para detectar a proteína CBHI.

Exemplo 6. Produção da proteína de fusão 50KB+CBD deMelanocarpus albomyces recombinante em T. reesei.

Constructos de plasmídeo foram projetados para se juntar à seqüência codi-ficadora 50K de Melanocarpus albomyces (cel7B, AC# AJ515705) que codi-fica a seqüência com a região ligante e o domínio de ligação de celulose(CBD) do CBHI de T. reesei {cel7A, AC# AR088330; Srisodsuk et al. 1993).Plasmídeo pALK1241 (Fig. 5), o qual é uma base para os novos constructos,contém o gene cel7B sob controle do promotor cbhl de T. reesei como umafusão exata.

Primeiro, um único sítio de restrição Nrul foi introduzido próximodo C-terminal da seqüência codificadora 50KB. Isso capacita a fusão diretade qualquer DNA sem corte depois do aminoácido S426 do polipeptídeo50KB maduro (Fig. 14B). Uma reação de PCR foi efetuada com os iniciado-res 50KB_NrulXhol (5' TCGTCTCGAGTCGCGATGGGGCCGAAGCG-GATGTTGG 3'; SEQ ID. NO: 23) e 50KB_Sphl (5' GGAGGGCATGCCCAA-CAGCAGCGAGATCACC 3'; SEQ ID. NO: 24) usando pALK1241 como mol-de. A reação de PCR continha tampão de reação 1 x DyNAzyme™ (Finnzy-mes, Finlândia), dNTPs 0,25 mM, 0,5 |iM de cada iniciador, 2,0 unidades deDNA polimerase de DyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlândia) e aproxima-damente 50 ng/100 \iL de DNA molde pALK1241. As condições para a am-plificação por PCR foram como sé segue: 5 min de desnaturação inicial a 969C, seguido por 25 ciclos de 15 s a 96 gC, anelamento de 60 s a 56 9C ou 619C, 60 s de extensão a 72 eC e uma extensão final a 72 BC por 5 min. O pro-duto de PCR foi digerido com as enzimas de restrição Xhol e Sphl e purifi-cado a partir de gel de agarose. O fragmento de PCR purificado foi ligado nofragmento de restrição Xhol-Spel de 6,9 Kb do plasmídeo pALK1241 e trans-formado em XL1-Blue de E. coli (Stratagene, EUA). DNA de plasmídeo foiisolado dos transformantes e um candidato foi verificado por seqüenciamen-to. O clone selecionado foi designado como pALK1705.

O ligante CBHI + CBD de T. reesei foi amplificado por PCR comos iniciadores 3_BamMly_50 (5' TTGGATCCGAGTCGCAGCACCGGCAACCCTAGCG 3'; SEQ ID. NO: 18) e XhoAge (5'TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGC 3'; 15) usando pALK492 como molde. As condições dareação de PCR foram conforme é descrito acima, exceto que o tempo deextensão na reação de amplificação foi de 90 s. O produto de PCR foi dige-rido com enzimas Mlyl e AgeL e purificado a partir de gel de agarose. O li-gante + CBD contendo fragmento de PCR foi ligado no fragmento de restri-ção Agel-Nrul de 7,2 Kb de pALK1705 e transformado em XL 1-Blue E. coli(Stratagene, EUA). Os transformantes foram analisados conforme descritoacima e um clone adequado foi designado como pALK1706.

Para capacitar a seleção de transformantes de T. reesei o genemarcador andS e a região flanqueadora 3' cbhl de T. reesei foram inseridosno plasmídeo do vetor pALK1706. Um fragmento de restrição de EcoRI-Spelde 4,8 Kb de pALK424 (US 5.837.515) foi isolado e as extremidades dofragmento foram preenchidas com enzima Klenow. O fragmento do marca-dor andS de extremidade sem corte foi ligado no pALK1706 digerido comStul e transformando em XLI-Blue E. coli (Stratagene, EUA). DNA de plas-mídeo foi isolado dos transformantes e a orientação desejada da inserção foiverificada pela digestão da enzima de restrição. O tansformante selecionadofoi designado como pALK1709.

Um cassete de expressão linear de 9,6 Kb (Fig. 14A) da estrutu-ra pALK1709 foi isolado por digestão de EcoRI, transformado em protoplas-tos RF5636 de T. reesei, e os transformantes selecionados com acetamidacomo a única fonte de nitrogênio. A cepa do hospedeiro não tem três celula-ses endógenas principais: CBHII (Cel6A), EGI (Cel7B) e EGII (Cel5A). Atransformação foi efetuada de acordo com Pentillã et al. (1987) com modifi-cações descritas por Karhunen et al. (1993). Os transformantes foram purifi-cados em placas de seleção através de conídias simples ante de esporularas mesmas em PD.

A produção da proteína de fusão 50KB + CBD dos transforman-tes foi analisada a partir dos sobrenadantes de cultura das culturas de frascode agitação (50 mL). Os transformantes cresceram por 7 dias num meio in-dutor de celulose complexo (Joutsjoki et al. 1993) tamponado com KH2P045% em pH 5,5. A atividade enzimática da celobioidrolase da proteína de fu-são foi medida usando substrato de 4-metilumbelferil-[3-D-lactosídeo (ativi-dade MUL; van Tilbeurgh et al. 1988). A proteína 50KB + CBD foi detectadaa partir dos sobrenadantes da cultura por sistema AP de Western blot Pro-toBlot (Promega) usando anticorpos policlonais levantados contra a celulase50KB de Melanocarpus albomyces purificada (Haakana et al. 2004). Na aná-lise de Western blot nenhuma proteína de 50KB do tipo selvagem foi detec-tada mostrando que a proteína de fusão 50KB + CBD produzida a partir deT. reesei é estável. Os genótipos dos transformantes escolhidos oram anali-sados por Southern blotting usando o cassete de expressão como uma son-da. O alvejamento possível do cassete de expressão para o local cbhl tam-bém foi verificado por Western blotting usando anticorpos CBHI monoclonais(CI-261, Aho et al., 1991) para detectar a proteína CBHI.

Exemplo 7. Produção das proteínas de fusão CBHI + CBD deThermoascus aurantiacus recombinante em T. reeseiCBHI de Thermoascus aurantiacus (AC# AF478686, Hong et ai, 2003; SEQID. NO: 9) foi fundido com o ligante e CBD de CBHI de Trichoderma reesei(AC# AR088330, Srisodsuk et al. 1993; SEQ ID. NO: 3). Primeiro, a seqüên-cia codificadora do ligante e o CBD de CBHI de 7. reesei foi sintetizada porPCR usando os seguintes iniciadores: 5'-TTAAACATATGTTATCTACTCCAACATCAAGGTCGGACCCATTGGCAGCACCGGCAACCCTAGCGGC-3'(seqüência "forward", SEQ ID. NO: 34) e 5'-TATATGCGGCCGCACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGCTTTACAGGC-3' (seqüência reversa,SEQ ID. NO: 35).

A mistura de reação de PCR continha 1 x de tampão de reaçãoDyNAzyme™ EXT (Finnzymes, Finlândia), Mg2+ 15 mM., dNTPs 0,2 mM, 2|nM de cada iniciador, 0,6 unidades de DNA polimerase de DyNAzyme™EXT (Finnzymes, Finlândia) e aproximadamente 75 ng/30 u,L de moldepALK492. O plasmídeo pALK492 contém o gene cbhl (cel7A) de T. reesei.

As condições para a reação de PCR foram as seguintes: 2 min de desnatu-ração inicial a 98 9C, seguido por 30 ciclos de 30 seg a 98 9C, 30 seg deanelamento a 68 9C (gradiente de ± 4 QC), 30 seg de extensão a 72 9C euma extensão final a 72 9C por 10 min. O fragmento de DNA específico nareação de PCR foi obtido na faixa de temperatura de anelamento de 64 9Caté 68,5 9C. O fragmento CBD sintetizado, contendo também a seqüência denucleotídeos 3'-terminal do gene cbhl de Thermoascus aurantiacus foi dige-rido pelas enzimas de restrição Ndel e Notl e o fragmento foi isolado a partirde gel de agarose depois da eletroforese. Depois disso, o fragmento de PCRisolado foi ligado ao fragmento de vetor pALK digerido por Ndel e Notl (Fig.7) contendo o gene cbhl de Thermoascus aurantiacus de comprimentocompleto. O plasmídeo obtido foi nomeado como pALK1888, e o fragmentode PCR amplificado no plasmídeo foi confirmado por seqüenciamento. Comoresultado da fusão, a parte C-terminal do CBHI de Thermoascus aurantiacusno plasmídeo pALK1888 contém um ponto de junção de GPIGST (Fig. 15B).

A inserção digerida Sacll e Agel do plasmídeo pALK1888 foi ligada ao frag-mento do vetor pALK1694 digerido Sacll e Agel (Fig. 8), o que resulta nafusão CBHI + CBD de Thermoascus aurantiacus ao terminador e promotor(uma fusão exata) cbhl de T. reesei (cel7A). No passo final, o fragmentomarcador amdS foi adicionado, conforme descrito no Exemplo 3, para obtero plasmídeo de expressão de pALK1890 para a produção da enzima de fu-são CBHI + CBD de Thermoascus aurantiacus recombinante em T. reesei. Aseqüência de aminoácidos da fusão da proteína CBHI de Thermoascus au-rantiacus com o peptídeo ligante seguido pela região CBD de CBHI de T.reesei é apresentada na figura 15B.

O plasmídeo de expressão foi confirmado pelas digestões daenzima de restrição, e o cassete de expressão linear de 8,9 Kb (Fig. 15A) foiisolado da estrutura do vetor depois da digestão Notl e foi transformado nosprotoplastos RF5796 de T. reesei. As transformações foram efetuadas comoem Pentillà et al. (1987) com as modificações descritas em Karhunen et al.(1993). Os transformantes foram purificados em placas de seleção atravésde conídias individuais antes de esporular as mesmas em PD.

A produção de CBHI + CBD de Thermoascus aurantiacus dostransformantes foi analisada através dos sobrenadantes de cultura das cultu-ras do frasco de agitação (50 ml_). Os transformantes cresceram por 7 diasnum meio de indução de celulase complexo (Joutsjoki et al. 1993) tampona-do com KH2P04 5% em pH 5,5. A atividade da celobioidrolase foi avaliadausando substrato de 4-metilumbelferil-p-D-lactosídeo (MUL) de acordo comvan Tilbeurgh et al. 1988. Os genótipos dos transformantes escolhidos foramconfirmados pelo uso de Southern blots nos quais várias digestões genômi-cas foram incluídas e o cassete de expressão foi usado como uma sonda. Aanálise de SDS-PAGE mostrou que a enzima CBHI + CBD Thermoascusaurantiacus recombinante foi produzida como uma proteína de fusão estávelem T. reesei.

Exemplo 8. Desempenho das preparações de proteína CBD+ 20K de fusão em acabamento/desbotamento de sarja de Nimes

Proteínas de fusão CBD + 20K produzidas usando Trichodermacomo hospedeiro conforme descrito no Exemplo 2 foram testadas quanto Àsua capacidade em desbotamento da sarja de Nimes para criar uma aparên-cia abradada semelhante àquela fornecida por pedra-pomes. Uma prepara-ção de 20K comercial eficiente no acabamento de sarja de Nimes foi usadapara comparação.

Jeans inglês feito de sarja de Nimes corada com índigo comfundo de enxofre foi usado como material de teste depois de desgomar comalfa-amilase ECOSTONE® A200. Fios urdidos e tramados no tecido foram"ring spun". Os tratamentos de celulase foram efetuados com extrator delavagem Wascator FOM 71 CLS da Electrolux sob condições descritas na Tabela 9.Tabela 9. Condições e teste usadas nos tratamentos de celulase

<table>table see original document page 54</column></row><table>

As enzimas foram dosadas como unidades de atividade de celu-lase neutra (NCU) por peso de tecido. A enzima celulase foi inativada depoisda drenagem pela elevação do pH acima de 11 pela adição de 5 g de NaOH(10 min, 40 eC) e pela rinsagem três vezes. Os jeans foram secos num tam-bor secador de roupa. Dois pares de jeans foram usados em cada teste.

O nível de efeito de desbotamento/abrasão foi avaliado pela me-dição da cor como valores de reflectância com espectrofotômetro MinoltaCM 2500 ou CM 1000 usando coordenadas de espaço de cor L*a*b* (ilumi-nador D65/29). A cor do lado da face e o lado reverso da sarja de Nimes(dados não mostrados) foi medida depois da desgomagem (isto é, antes dotratamento com celulase) e depois do tratamento com celulase. Cada medi-ção foi a média de aproximadamente 40 medidas. Dois pares de jeans foramusados em cada teste e o resultado final é a média deles. A claridade ou oaumento da claridade depois do tratamento com a enzima foi usado para aavaliação do efeito de abrasão (desempenho ou efeito desbotamento). Osresultados estão mostrados nas Tabelas 10 e 11, onde o negrito é usadopara ressaltar os níveis de abrasão semelhantes e as dosagens equivalen-tes. Os tratamentos com 20K ou sem qualquer enzima foram usados paracomparação. Algumas das preparações (Tabela 11) foram tratadas com a-quecimento (pH 6,0, 65 9C, 60 a 70 min) para inativar qualquer atividade en-zimática endógena de T. reesei remanescente e/ou para testar o efeito dotratamento com aquecimento na estabilidade da enzima.Tabela 10. Medições de cor do lado da face da sarja de Nimes tratada com proteínas de fusão CBD + 20K

<table>table see original document page 55</column></row><table>Resultados na Tabela 10 e figura 16 mostram que o desempe-nho da lavagem das proteínas de fusão CBD + 20K da invenção no trata-mento de sarja de Nimes foi muito melhorado em comparação com as cepas20K. Com a cepa RF5977 a dosagem enzimatica tão baixa quanto 250NCU/g de tecido pôde ser usada para obter um nível de abrasão similar (cla-ridade L*) àquele obtido com a dosagem de 20K de 1500 NCU/g. Assim, umdesempenho de lavagem 6 vezes melhor foi obtido, e contraste foi bom.

Também o desempenho de lavagem obtido com a cepa RF5978 foi seme-lhante àquele obtido com a cepa RF5977.

Tratamento com aquecimento das preparações da proteína defusão aparentou até certo grau diminuir oi efeito de lavagem em pedra, porexemplo, com a cepa RF5977 uma dosagem de 500 NCU/g de tecido foinecessária para obter o mesmo nível de abrasão que com a dosagem de250 NCU/g da preparação enzimatica não tratada por aquecimento (Tabela10). Todavia, uma melhora de 3 vezes no desempenho de lavagem foi al-cançada em comparação com uma preparação da técnica anterior.

Exemplo 9. Desempenho das preparações de proteína mu-tante de afinidade CBD + 20K de fusão e de proteína de anulação doligante CBD + 20K de fusão no acabamento/desbotamento de sarja deNimes

Enzimas mutantes de afinidade CBD + 20K de fusão produzidasusando Trichoderma como hospedeiro conforme descrito no Exemplo 4 fo-ram testadas quanto à sua capacidade no desbotamento da sarja de Nimes.

Uma preparação 20K eficiente no acabamento de sarja de Nimes foi usadapor comparação.

A sarja de Nimes e os sistemas de teste para desbotamento fo-ram como no Exemplo 8. Também o efeito do tratamento com celulase foiavaliado como no Exemplo 8. Os resultados do teste de desbotamento paraa proteína mutante de afinidade CBD + 20K de fusão e as preparações deproteína de anulação de 20K + ligante CBD de fusão estão mostradas naTabela 12.

A cepa RF6090 com a substituição no aminoácido Y31W mos-trou um excelente desempenho de lavagem (ca. 6 vezes melhor do que 20K)e um bom contraste. A eficiência da cepa RF6090 em comparação com 20Kpode ser claramente vista também na figura 16. A cepa RF6084 com a subs-tituição do aminoacido Y31A foi ca. 1,5 vezes melhor do que a de 20K. Asproteínas de fusão CBD + 20Kmut com uma substituição de aminoacido Y32Aou Y31A_Y32A teve um efeito de desbotamento mais baixo do que 20K. Odesempenho de lavagem das proteínas de anulação 20K + ligante CBD notratamento da sarja de Nimes foi muito melhorado em comparação com acepa 20K e foi obtido um bom contraste, Com a cepa RF6108 (AG-444) odesempenho de lavagem foi pelo menos 6 vezes melhor do que com 20K ecom a cepa RF6110 (AG-460) ca. 3 vezes melhor.Tabela 12. Medições de cor do lado da face de sarja de Nimes tratada com mutante de afinidade CBD + 20K eproteínas de anulação de ligante CBD + 20K de fusão

<table>table see original document page 58</column></row><table>Exemplo 10. Efeito nas proteínas de fusão CBD + 20K naforça da sarja de Nimes

Alguns dos jeans obtidos a partir dos testes de lavagem comproteínas de fusão CBD + 20K (Exemplos 8 e 9) que tiveram um nível deabrasão similar (L* - valor ca. 23 ou 24 depois do tratamento com celulase)foram selecionados pelas medições de força. A força de rasgo depois dotratamento com proteínas de fusão CBD + 20K e as amostras de controleforam medidas pelo método de Elmendof de acordo com SFS-EN ISO13937-1 padrão. Os exemplares foram cortados tanto na direção da urdiduraquanto na da trama. Os resultados estão mostrados na Tabela 13.

As proteínas de fusão da celulase causaram essencialmente amesma perda de força ou menos que a 20K, isto é, com algumas prepara-ções a força do tecido permaneceu ainda maior. A mais baixa perda de forçatanto na direção da urdidura quanto da trama foi obtida com a cepa RF6108com a anulação do ligante AG-444. Também o mutante por afinidadeRF6090 com a substituição do aminoácido Y31W causou uma menor perdade força do que a 20K. A cepa RF5977 teve um efeito antes similar na forçado tecido do que 20K.

Alguns dos jeans lavados com preparações de proteína de fusãotratadas com aquecimento (Exemplo 8, Tabela 11) também foram seleciona-dos para medições de força de rasgo. Foi notado que a força do tecido foimelhorada com algumas preparações tratadas com aquecimento, mas devi-do ao desempenho de lavagem reduzido, dosagens mais altas tiveram queser usadas para obter o mesmo nível de abrasão.Tabela 13. Medições de força de rasgo de jeans tratado com proteínas de fusão CBD + 20K da invenção

<table>table see original document page 60</column></row><table>Exemplo 11. Comparação das preparações de proteína defusão CBD + 20K selecionadas com as preparações enzimáticas datécnica anterior

As melhores proteínas de fusão CBD + 20K dos Exemplos 8 e 9foram testadas com outro tipo de sarja de Nimes. Preparação 20K (Ecosto-ne® NP8500) eficiente no acabamento da sarja de Nimes e duas prepara-ções da técnica anterior comercialmente disponíveis, Denimax® 399S daNovozymes e Mex500 da Meiji, a qual é a preparação enzimática sólida maisconcentrada comercialmente disponível, foram usadas para comparação.

O sistema de teste para desbotamento foi como no Exemplo 8,exceto que a carga de sarja de Nimes foi de 1 Kg e a proporção de líquido,conseqüentemente, foi levemente maior. Cinco peças de sarja de Nimes("pernas") feitas de sarja de Nimes Down Under (Bradmill Textiles Pty, Aus-trália) foram usadas para cada teste depois da desgomagem. Fios de urdidu-ra e da trama do tecido foram "ring spun". As enzimas foram dosadas comounidades de dosagem - NCU, de forma que níveis de abrasão similares(medidos como claridade do lado da face de sarja de Nimes depois do tra-tamento com celulase) foram obtidos. O efeito do tratamento de celulase foiavaliado como no Exemplo 8, exceto 20 medições de cor foram medidas porperna.

Duas pernas com nível de abrasão semelhantes (valor L* ca. 26depois do tratamento com celulase) de cada teste de lavagem foram sele-cionadas ara as medições de força. A força de rasgo depois do tratamentocom proteínas de fusão CBD + 20K e amostras de controle foram medidascomo no Exemplo 10. Os resultados estão mostrados na Tabela 14 e nasFiguras 17A e 17B.

A força de rasgo do tecido, a qual é tipicamente mais fraca do fiodo que a urdidura, foi mais alta com as proteínas de fusão das cepasRF5977, RF6090, RF6108 e RF6110 do que com 20K. Com todas as cepasde proteína de fusão foi obtida uma força consideravelmente maior tanto nadireção da urdidura quanto da trama em comparação com DeniMax 399S eMex 500. Também a cepa 20K foi menos prejudicial à força no tecido do queoutras preparações da técnica anterior.

Tabela 14. Medições de força de rasgo de sarja de Nimestratada com proteínas de fusão CBD + 20 K da invenção, 20K e prepa-rações da técnica anterior

<table>table see original document page 62</column></row><table>

L* indica a claridade do lado da face da sarja de Nimes depois do tratamentocom celulase

Exemplo 12. Desempenho da preparação de CBD + 20K nobioacabamento (remoção de pilling)

O desempenho da preparação de proteína de fusão CBD + 20Kconcentrada no bioacabamento foi testado. Uma preparação de celulaseácida enriquecida com EGII comercial (US 5.874.293) usada em formula-ções de bioacabamento e tratamento sem enzima foram usados por compa-ração. Os tratamentos de remoção de pilling foram efetuados com o extratorde lavagem Wascator FOM 71 CLS da Electrolux sob as condições descritasna Tabela 15.

Peças de dois tipos de pulôveres não-usados feitos de 1200%de algodão: tecido baseado em jérsei e rib com superfície flocosa foramusadas como material de teste co material de enchimento. Amostras forampré-lavadas por 10 min a 609C com 1 mL/L de tensoativos/agentes umidifi-cantes (Sandoclean PCJ da Sandos e Imacol CN da Clariant) e rinsadas 3vezes. Depois disso, os tecidos de malha foram tratados com celulase a609C por 60 minutos na presença dos mesmos adjuvantes têxteis que osusados na pré-lavagem. Depois da drenagem a enzima foi inativada (por 10min a 609C) pela elevação do pH acima de 11 com hidróxido de sódio. Aspeças de roupa de malha foram, então, rinsadas três vezes e secas numtambor secador de roupas.

Tabela 15. As condições/parâmetros de processo de testeusados nos tratamentos de bioacabamento

<table>table see original document page 63</column></row><table>

O efeito do tratamento de celulase foi avaliado visualmente aolho nu e com uma lupa. Os resultados estão mostrados na Tabela 16 e fo-tos de câmera digital tomadas com uma macro-objetiva estão mostradas nafigura 18.

A preparação de proteína de fusão CBD + 20K teve excelentepropriedades de bioacabamento levando a uma redução extensiva na floco-sidade e na prevenção da formação de pílulas que possam ser claramentevistas a partir das fotos (tomadas das amostras de rib) na figura 18. As a-mostras de controle, especialmente de pulôver rib, tratadas sem enzima,continham uma flocosidade de superfície densa e pilling severo. Com a pre-paração CBD + 20K uma superfície muito limpa da roupa de malha foi obti-da já com a menor dosagem (0,25% do peso do tecido, o.w.f.), correspon-dendo a uma atividade de celulase neutra de 125 NCU/g de tecido. Essadosagem resultou num efeito quase tão bom quanto uma dosagem de duasvezes. Usando uma dosagem de 0,5% de preparação CBD + 20K do pesodo tecido, um efeito remoção de pilling semelhante foi obtido em compara-ção com o uso de uma dosagem de 0,63% o.w.f. de preparação enriquecidacom EG II, que foi usada numa dosagem típica para esse concentrado deenzima na aplicação do bioacabamento. Também o meio de cultura do CBD+ 20K produzido pelo hospedeiro recombinante é volumetricamente pelomenos duas vezes tão efetivo no bioacabamento do que aquele de EG IIproduzido por um hospedeiro recombinante.Tabela 16. Os resultados dos tratamentos de bioacabamentocom proteína de fusão CBD + 20K em comparação com enriquecido

<table>table see original document page 64</column></row><table>

b) +++++ Excelente efeito remoção de pilling, superfície visualmente muitolimpa.

++++ Efeito remoção de pilling muito bom, superfície visualmente limpa.- Flocosidade de superfície densa e/ou pilling severo.

Exemplo 13. Desempenho da preparação CBD + 20K na apli-cação de detergente

A eficiência de uma preparação de proteína de fusão CBD + 20Kgranulada foi testada com ciclos de lavagem repetidos numa máquina do-méstica usando enzima de 0 até 0,5% de peso de formulação detergente(detergente padrão ECE 98), a qual não continha quaisquer enzimas. Ascondições de teste estão descritas na Tabela 17. Carga, dosagem de deter-gente e as principais condições de teste foram de acordo com o padrão EN60456:2003, mas com sujeiras adicionais. As amostras de tecido foram to-madas depois de 5,10 e 15 lavagens.

Tabela 17. Projeto do teste para testar o desempenho dapreparação CBD + 20K

<table>table see original document page 64</column></row><table>

* da EMPA Test materialen AG, SuíçaOs resultados de teste no anti-acinzentamento, executado noartigo 224 (ISO 2267) e medido como diferenças de igualdade de cor, estãomostrados nas Tabelas 18 e 19 e nas Figuras 19 e 20. A diferença de cor foimedida pelo método de três estímulos usando um colorímetro Spectraflash500(illuminantD65/109).

A preparação de proteína de fusão CBD + 20K mostrou um efei-to positivo no valor de cor de três estímulos Y e, conseqüentemente, no anti-acinzentamento. O efeito de diferentes concentrações enzimáticas foi apro-ximadamente o mesmo. Já uma concentração de enzima muito baixa(0,10%) foi suficiente para o anti-acinzentamento. Antes efeitos similares(dados não mostrados) foram obtidos com a proteína de fusão CBD + 20Kem comparação com a celulase detergente comercial BIOTOUCH®DCCcontendo 1,8 vezes mais atividade celulase neutra (NCU).

Artigo 224 também foi usado para medições de força elástica(dados não mostrados) efetuadas de acordo com ISO 13934-1:1999 depoisde 15 lavagens. Nenhuma das concentrações enzimáticas teve um efeitodanoso na força elástica. Todos os resultados estavam dentro do desvio umdo outro (variação de ± 2,5%). O mesmo foi aplicado ao alongamento paraquebrar a carga.

Tabela 18. Desempenho da proteína de fusão CBD + 20K naaplicação detergente. Diferença de igualdade de cor entre o artigo 224 anti-

<table>table see original document page 65</column></row><table>Tabela 19. Desempenho da proteína de fusão CBD + 20K naaplicação detergente. Diferença de igualdade de cor entre o artigo 224 anti-acinzentamento lavado com enzima e a lavagem sem enzima.

<table>table see original document page 66</column></row><table>REFERÊNCIAS

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<110> AB Enzymes Oy

<120> Celulases melhoradas

<130> 2050016

<160> 50

<170> Patentln version 3.1

<210> 1

<211> 936

<212> DNA

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 1

tcgcccctaa ccgagaacca aagactccaa gaatgcgctc tactcccgtt ctccgcgccc 60

tcctggccgc agcattgccc ctcggggccc tcgccgccaa cggtcagtcc acgaggtaac 120

tgatcacccg cctcattacg cgtgccgacc ggaccgcgtt^cagggctcac tgctcaccgc 180

atccagatac tgggactgct gcaagccgtc gtgcggctgg gccggaaagg gccccgtgaa 240

ccagcccgtc tactcgtgcg acgccaactt ccagcgcatc cacgacttcg atgccgtctc 300

gggctgcgag ggcggccccg ccttctcgtg cgccgaccac agcccctggg ccattaatga 360

caacctctcg tacggcttcg cggcgactgc actcagcggc cagaccgagg agtcgtggtg 420

ctgtgcctgc tacgcgtgag tgtgcttggg cccaacgtcg gtgattccgg agttcagacc 480

actgacccag cgacccgctc gccagtctga cctttacatc gggtcccgtg gccggcaaga 540

ccatggtcgt ccagtcgacc agcacgggcg gcgacctcgg cagcaaccac ttcgacctca 600

acatccccgg cggcggcgtc ggcctcttcg acggctgcac tccccagttc ggcggcctcc 660

cgggcgcacg gtacggcggc atctcgtcgc gccaggagtg cgactcgttc cccgagccgc 720

tcaagcccgg ctgccagtgg cgcttcgact ggttccagaa cgccgacaac ccgtccttta 780

ccttcgagcg ggtccagtgc cccgaggagc tggtcgctcg gaccggctgc aggcgccacg 840

acgacggcgg cttcgccgtc ttcaaggccc ccagcgcctg atccgttttt gggcagtgtc 900

cgtgtgacgg cagctacgtg gaacgacctg gagctc 936<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 2

Ala Asn Gly Gln Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys

1 5 10 15

Gly Trp Ala Gly Lys Gly Pro Vai Asn Gln Pro Vai Tyr Ser Cys Asp 20 25 30

Ala Asn Phe Gln Arg lie His Asp Phe Asp Ala Vai Ser Gly Cys Glu 35 40 45

Gly Gly Pro Ala Phe Ser Cys Ala Asp His Ser Pro Trp Ala lie Asn 50 55 60

Asp Asn Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Leu Ser Gly Gln Thr 65 70 75 80

Glu Glu Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Thr Ser Gly 85 90 95

Pro Vai Ala Gly Lys Thr Met Vai Vai Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly 100 105 110

Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn lie Pro Gly Gly Gly Vai 115 120 125

Gly Leu Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala 130 135 140

Arg Tyr Gly Gly lie Ser Ser Arg Gln Glu Cys Asp Ser Phe Pro Glu 145 150 155 160

Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala 165 170 . 175

Asp Asn Pro Ser Phe Thr Phe Glu Arg Vai Gln Cys Pro Glu Glu Leu 180 185 190

Vai Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg His Asp Asp Gly Gly Phe Ala Vai 195 200 205

Phe Lys Ala Pro Ser Ala210

<210>

3

<211>

1820

<212>

DNA

<213>

Trichoderma

reesei

<400>

3

ccgcggactg cgcatcatgt atcggaagtt ggccgtcatc tcggccttct tggccacagc tcgtgctcag tcggcctgca ctctccaatc ggagactcac ccgcctctga catggcagaa atgctcgtct ggtggcactt gcactcaaca gacaggctcc gtggtcatcg acgccaactg gcgctggact cacgctacga acagcagcac gaactgctac gatggcaaca cttggagctc gaccctatgt cctgacaacg agacctgcgc gaagaactgc tgtctggacg gtgccgccta cgcgtccacg tacggagtta ccacgagcgg taacagcctc tccattggct ttgtcaccca gtctgcgcag aagaacgttg gcgctcgcct ttaccttatg ggcagcgaca cgacctacca ggaattcacc ctgcttggca acgagttctc tttcgatgtt gatgtttcgc agctgccgta agtgacttac catgaacccc tgacgtatct tcttgtgggc tcccagctga ctggccaatt taaggtgcgg cttgaacgga gctctctact tcgtgtccat ggacgcggat ggtggcgtga gcaagtatcc caccaacacc gctggcgcca agtacggcac ggggtactgt gacagccagt gtccccgcga tctgaagttc atcaatggcc aggccaacgt tgagggctgg gagccgtcat ccaacaacgc aaacacgggc attggaggac acggaagctg ctgctctgag atggatatct gggaggccaa ctccatctcc gaggctctta ccccccaccc ttgcacgact gtcggccagg agatctgcga gggtgatggg tgcggcggaa cttactccga taacagatat ggcggcactt gcgatcccga tggctgcgac tggaacccat accgcctggg caacaccagc ttctacggcc ctggctcaag ctttaccctc gataccacca agaaattgac cgttgtcacc cagtccgaga cgtcgggtgc catcaaccga tactatgtcc agaatggcgt cactttccag cagcccaacg ccgagcttgg tagttactct ggcaacgagc tcaacgatga ttactgcaca gctgaggagg cagaattcgg cggatcctct ttctcagaca agggcggcct gactcagttc aagaaggcta cctctggcgg catggttctg gtcatgagtc tgtgggatga tgtgagtttg atggacaaac atgcgcgttg acaaagagtc aagcagctga ctgagatgtt acagtactac gccaacatgc tgtggctgga ctccacctac ccgacaaacg agacctcctc cacacccggt gccgtgcgcg gaagctgctc caccagctcc ggtgtccctg ctcaggtcga atctcagtct cccaacgcca aggtcacctt ctccaacatc aagttcggac ccattggcag caccggcaac cctagcggcg gcaaccctcc cggcggaaac ccgcctggca ccaccaccac ccgccgccca gccactacca

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560ctggaagctc tcccggacct acccagtctc actacggcca gtgcggcggt attggctaca 1620

gcggccccac ggtctgcgcc agcggcacaa cttgccaggt cctgaaccct tactactctc 1680

agtgcctgta aagctccgtg cgaaagcctg açgcaccggt agattcttgg tgagcccgta 1740

tcatgacggc ggcgggagct acatggcccc gggtgattta ttttttttgt atctacttct 1800

gacccttttc aaatatacgg 1820

<210> 4 <211> 497 <212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 4

Gln Ser Ala Cys Thr Leu Gln Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr Trp 15 10 15

Gln Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gln Gln Thr Gly Ser Vai 20 25 30

Vai lie Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser Thr 35 40 45

Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp Asn 50 55 60

Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala Ser 65 70 75 80

Thr Tyr Gly Vai Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser lie Gly Phe Vai 85 90 95

Thr Gln Ser Ala Gln Lys Asn Vai Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met Gly 100 105 110

Ser Asp Thr Thr Tyr Gln Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe Ser 115 120 125

Phe Asp Vai Asp Vai Ser Gln Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu 130 135 140

Tyr Phe Vai Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Vai Ser Lys Tyr Pro Thr 145 150 155 160

Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys 165 170 175Pro Arg Asp Leu Lys Phe lie Asn Gly Gln Ala Asn Vai Glu Gly Trp 180 185 190

Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly lie Gly Gly His Gly Ser 195 200 205

Cys Cys Ser Glu Met Asp lie Trp Glu Ala Asn Ser lie Ser Glu Ala 210 215 220

Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Vai Gly Gln Glu lie Cys Glu Gly 225 230 235 240

Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr Cys 245 250 255

Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr Ser 260 265 270

Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys Leu 275 280 285

Thr Vai Vai Thr Gln Ser Glu Thr Ser Gly Ala lie Asn Arg Tyr Tyr

290 295 300

Vai Gln Asn Gly Vai Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly Ser

305 310 315 320

Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu Ala 325 330 335

Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln Phe 340 345 350

Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Vai Leu Vai Met Ser Leu Trp Asp 355 360 365

Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asn 370 375 380

Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Vai Arg Gly Ser Cys Ser Thr Ser 385 390 395 400

Ser Gly Vai Pro Ala Gln Vai Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys Vai 405 410 415

Thr Phe Ser Asn lie Lys Phe Gly Pro lie Gly Ser Thr Gly Asn Pro 420 425 430

Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr Thr 435 440 445Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser 450 455 460

His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Vai Cys 465 470 475 480

Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Vai Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys 485 490 495

Leu

<210> 5 <211> 1895 <212> DNA

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 5

gaattcgggg gttgccaggg agtcgtacag gggtgggtgg agggggatgg gggatggaag 60

ggggatggag aagaaagcat atatgggacg tttgtgctcg ccggctcccc tctgccacgt 12 0

tcccttgcct ccttgcctgg gttgttgttg gtcttccctt caccatccga caaaccaacc 180

tgctgcgggt gaactcgcag agcgccttcg gacgacgaca gacagacgca ccatgactcg 240

caacatcgcc ctgctcggcg ccgcgtcggc gctcctgggc ctcgcccacg gccagaagcc 300

gggcgagacg cccgaggtgc acccgcagct gacgacgttc cggtgcacca aggcggacgg 360

gtgccagccg cggaccaact acattgtgct ggactcgctg tcgcacccgg tgcaccaggt 420

ggacaacgac tacaactgcg gcgactgggg gcagaagccc aacgcgacgg cgtgcccgga 480

cgtcgagtcg tgcgcgcgca actgcatcat ggagggcgtg cccgactaca gccagcacgg 540

cgtcacgacg agcgacacgt cgctgcgcct gcagcagctc gtcgacggcc gcctcgtcac 600

gccgcgcgtc tacctgctcg acgagaccga gcaccgctac gagatgatgc acctgaccgg 660

ccaggagttc acctttgagg tcgacgccac caagctgccc tgcggcatga acagcgccct 720

ctacctgtcc gagatggacc cgaccggcgc ccggagcgag ctcaaccccg gcggtgccta 780

ctacggcacc ggctactgcg acgcccagtg cttcgtgacg ccattcatca acggcattgt 840

gagtgttccc ctttggcccc ccccctgaaa atagatgtac ctgggtgcta accccggggt 900

gtcgcaccaa aacagggcaa catcgagggc aagggctcgt gctgcaacga gatggacatc 960

tgggaggcca actcgcgggc gacgcacgtg gcgccgcaca cgtgcaacca gacgggtctg 1020

tacatgtgcg agggcgccga gtgcgagtac gacggcgtgt gcgacaagga cgggtgcggg 1080

tggaacccgt accgggtcaa catcaccgac tactacggca actcggacgc gttccgcgtc 1140gacacgcggc ggcccttcac cgtggtgacg cagttcccgg ccgacgccga gggccggctc 1200

gagagcatcc accggctgta cgtgcaggac ggcaaggtga tcgagtcgta cgtcgtcgac 1260

gcgccgggcc tgccccggac cgactcgctc aacgacgagt tctgcgccgc cacgggcgcc 1320

gcgcgctacc tcgacctcgg cggcaccgcg ggcatgggcg acgccatgac gcgcggcatg 1380

gtgctggcca tgagcatctg gtgggacgag tccggcttca tgaactggct cgacagcggc 1440

gaggccggcc cctgcctgcc cgacgagggc gaccccaaga acattgtcaa ggtcgagccc 1500

agccccgagg tcacctacag caacctgcgc tggggcgaga tcgggtcgac ctttgaggcc 1560

gagtccgacg acgacggcga cggcgacgac tgctagataa ctaactagtg ggcggaaagg 1620

gcgggggatg cgtaacttac atacagcccg gagttgtttt gagtgtagag tattgagctt 1680

tcgatgtgtt agttgagtgg aatggaaaat tcgcgtcttt gccccggtgg ttgcgataaa 1740

caatagtcgg ctggtgcatt tgtgacactt caattgcgct gttggcttgg tgacagacac 1800

ggcagcgtcg atgacccgac acccagaata attcgcatgg ttgattattg ttattgtgct 1860

ttaaatcgga ggctgatgct catctcttcg aattc 1895

<210> 6 <211> 408 <212> PRT

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 6

Gln Lys Pro Gly Glu Thr Pro Glu Vai His Pro Gln Leu Thr Thr Phe

15 10 15

Arg Cys Thr Lys Ala Asp Gly Cys Gln Pro Arg Thr Asn Tyr Ile Vai 20 25 30

Leu Asp Ser Leu Ser His Pro Vai His Gln Vai Asp Asn Asp Tyr Asn 35 40 45

Cys Gly Asp Trp Gly Gln Lys Pro Asn Ala Thr Ala Cys Pro Asp Vai 50 55 60

Glu Ser Cys Ala Arg Asn Cys Ile Met Glu Gly Vai Pro Asp Tyr Ser 65 70 75 80

Gln His Gly Vai Thr Thr Ser Asp Thr Ser Leu Arg Leu Gln Gln Leu

Vai Asp Gly Arg Leu Vai Thr Pro Arg Vai Tyr Leu Leu Asp Glu Thr 100 105 110Glu His Arg Tyr Glu Met Met His Leu Thr Gly Gln Glu Phe Thr Phe 115 120 125

Glu Vai Asp Ala Thr Lys Leu Pro Cys Gly Met Asn Ser Ala Leu Tyr 130 135 140

Leu Ser Glu Met Asp Pro Thr Gly Ala Arg Ser Glu Leu Asn Pro Gly 145 150 155 160

Gly Ala Tyr Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Phe Vai Thr 165 170 175

Pro Phe lie Asn Gly lie Gly Asn lie Glu Gly Lys Gly Ser Cys Cys 180 185 190

Asn Glu Met Asp lie Trp Glu Ala Asn Ser Arg Ala Thr His Vai Ala 195 200 205

Pro His Thr Cys Asn Gln Thr Gly Leu Tyr Met Cys Glu Gly Ala Glu 210 215 220

Cys Glu Tyr Asp Gly Vai Cys Asp Lys Asp Gly Cys Gly Trp Asn_Pro 225 230 235 240

Tyr Arg Vai Asn lie Thr Asp Tyr Tyr Gly Asn Ser Asp Ala Phe Arg 245 250 255

Vai Asp Thr Arg Arg Pro Phe Thr Vai Vai Thr Gln Phe Pro Ala Asp 260 265 270

Ala Glu Gly Arg Leu Glu Ser lie His Arg Leu Tyr Vai Gln Asp Gly

275 280 285

Lys Vai lie Glu Ser Tyr Vai Vai Asp Ala Pro Gly Leu Pro Arg Thr 290 295 300

Asp Ser Leu Asn Asp Glu Phe Cys Ala Ala Thr Gly Ala Ala Arg Tyr 305 310 315 320

Leu Asp Leu Gly Gly Thr Ala Gly Met Gly Asp Ala Met Thr Arg Gly 325 330 335

Met Vai Leu Ala Met Ser lie Trp Trp Asp Glu Ser Gly Phe Met Asn 340 345 350

Trp Leu Asp Ser Gly Glu Ala Gly Pro Cys Leu Pro Asp Glu Gly Asp 355 360 365

Pro Lys Asn lie Vai Lys Vai Glu Pro Ser Pro Glu Vai Thr Tyr Ser 370 375 380Asn Leu Arg Trp Gly Glu lie Gly Ser Thr Phe Glu Ala Glu Ser Asp 385 390 395 400

Asp Asp Gly Asp Gly Asp Asp Cys 405

<210> 7 <211> 2100 <212> DNA

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 7

cccggtctgg agacggggag cgcgccagcg acgcaggata agaaggcgac gaccgcgcct 60

ccgagccagg cccaggacag caggagaact cgccacgcgc aagcagcacg cccgatcgac 120

agtgtcccgc tctgcccaca gcactctgca accatgatga tgaagcagta cctccagtac 180

ctcgcggccg cgctgccgct cgtcggcctc gccgccggcc agcgcgctgg taacgagacg 240

cccgagaacc accccccgct cacctggcag aggtgcacgg ccccgggcaa ctgccagacc 300

gtgaacgccg aggtcgtcat tgacgccaac tggcgctggc tgcacgacga caacatgcag 360

aactgctacg acggcaacca gtggaccaac gcctgcagca ccgccaccga ctgcgctgag 420

aagtgcatga tcgagggtgc cggcgactac ctgggcacct acggcgcctc gaccagcggc 480

gacgccctga cgctcaagtt cgtcaccaag cacgagtacg gcaccaacgt cggctcgcgc 540

ttctacctca tgaacggccc ggacaagtac cagatgttca acctcatggg caacgagctt 600

gcctttgacg tcgacctctc gaccgtcgag tgcggcatca acagcgccct gtacttcgtc 660

gccatggagg aggacggcgg catggccagc tacccgagca accaggccgg cgcccggtac 720

ggcactgggg tgagttgagc tccgctttgt ttcgagtcgc aacgaggcac tttctgggcg 780

ccggctaact ctctcgattc ctccgacagt actgcgatgc ccaatgcgct cgtgatctca 840

agttcgttgg cggcaaggcc aacattgagg gctggaagtc gtccaccagc gaccccaacg 900

ctggcgtcgg cccgtacggc agctgctgcg ctgagatcga cgtctggtga gtgcgagacc 960

gtccacccag gttcggatgc ggggtggaaa tttcgcggct aacggagcac cccccaggga 1020

gtcgaatgcc tatgccttcg ctttcacgcc gcacgcgtgc acgaccaacg agtaccacgt 1080

ctgcgagacc accaactgcg gtggcaccta ctcggaggac cgcttcgccg gcaagtgcga 1140

cgccaacggc tgcgactaca acccctaccg catgggcaac cccgacttct acggcaaggg 1200

caagacgctc gacaccagcc gcaagttcac gtgcgtgacc ccttgtggcg caacctttct 1260

ctgcctgcct ggacacactg aaactgacac gtcgttttcg gctgcagcgt cgtctcccgc 1320

ttcgaggaga acaagctctc ccagtacttc atccaggacg gccgcaagat cgagatcccg 1380

ccgccgacgt gggagggcat gcccaacagc agcgagatca cccccgagct ctgctccacc 1440atgttcgatg tgttcaacga ccgcaaccgc ttcgaggagg tcggcggctt cgagcagctg 1500

aacaacgccc tccgggttcc catggtcctc gtcatgtcca tctgggacga cgtaagtacc 1560

cgccgacctc cctagccaca caagccgcat ccggcgaggc acgccatcgc tgctgctaac 1620

acgagaccgt tcgtagcact acgccaacat gctctggctc gactccatct acccgcccga 1680

gaaggagggc cagcccggcg ccgcccgtgg cgactgcccc acggactcgg gtgtccccgc 1740

cgaggtcgag gctcagttcc ccgacgcgta agacttgccc ccgaccccaa gcttccactt 1800

ctggatgccg aatgctaaca cgcgaaacag ccaggtcgtc tggtccaaca tccgcttcgg 1860

ccccatcggc tcgacctacg acttctaagc cggtccatgc actcgcagcc ctgggcccgt 1920

cacgcccgcc acctcccctc gcggaaactc tccgtgcgtc gcgggctcca aagcattttg 1980

gcctcaagtt tttttcgttc atgtttcagt tctttccgca tgtatcctaa gctccgatag 2040

caagagaaat tgccagtctg agttttggga acctgtgatc cacatcatgg acgcataatg 2100

<210> 8 <211> 430 <212> PRT

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 8

Gln Arg Ala Gly Asn Glu Thr Pro Glu Asn His Pro Pro Leu Thr Trp 15 10 15

Gln Arg Cys Thr Ala Pro Gly Asn Cys Gln Thr Vai Asn Ala Glu Vai 20 25 30

Vai lie Asp Ala Asn Trp Arg Trp Leu His Asp Asp Asn Met Gln Asn 35 40 45

Cys Tyr Asp Gly Asn Gln Trp Thr Asn Ala Cys Ser Thr Ala Thr Asp 50 55 60

Cys Ala Glu Lys Cys Met lie Glu Gly Ala Gly Asp Tyr Leu Gly Thr 65 70 75 80

Tyr Gly Ala Ser Thr Ser Gly Asp Ala Leu Thr Leu Lys Phe Vai Thr 85 90 95

Lys His Glu Tyr Gly Thr Asn Vai Gly Ser Arg Phe Tyr Leu Met Asn 100 105 110

Gly Pro Asp Lys Tyr Gln Met Phe Asn Leu Met Gly Asn Glu Leu AlaPhe Asp Vai Asp Leu Ser Thr Vai Glu Cys Gly lie Asn Ser Ala Leu 130 135 140

Tyr Phe Vai Ala Met Glu Glu Asp Gly Gly Met Ala Ser Tyr Pro Ser 145 150 155 160

Asn Gln Ala Gly Ala Arg Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys 165 170 175

Ala Arg Asp Leu Lys Phe Vai Gly Gly Lys Ala Asn lie Glu Gly Trp 180 185 190

Lys Ser Ser Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Vai Gly Pro Tyr Gly Ser 195 200 205

Cys Cys Ala Glu lie Asp Vai Trp Glu Ser Asn Ala Tyr Ala Phe Ala 210 215 220

Phe Thr Pro His Ala Cys Thr Thr Asn Glu Tyr His Vai Cys Glu Thr 225 230 235 240

Thr Asn Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Glu Asp Arg Phe Ala Gly Lys Cys 245 250 255

Asp Ala Asn Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Pro Asp 260 265 270

Phe Tyr Gly Lys Gly Lys Thr Leu Asp Thr Ser Arg Lys Phe Thr Vai 275 280 285

Vai Ser Arg Phe Glu Glu Asn Lys Leu Ser Gln Tyr Phe lie Gln Asp 290 295 300

Gly Arg Lys lie Glu lie Pro Pro Pro Thr Trp Glu Gly Met Pro Asn 305 310 315 320

Ser Ser Glu lie Thr Pro Glu Leu Cys Ser Thr Met Phe Asp Vai Phe

325 330 335

Asn Asp Arg Asn Arg Phe Glu Glu Vai Gly Gly Phe Glu Gln Leu Asn 340 345 350

Asn Ala Leu Arg Vai Pro Met Vai Leu Vai Met Ser lie Trp Asp Asp 355 360 365

His Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser lie Tyr Pro Pro Glu Lys 370 375 380

Glu Gly Gln Pro Gly Ala Ala Arg Gly Asp Cys Pro Thr Asp Ser Gly 385 390 395 400Vai Pro Ala Glu Vai Glu Ala Gln Phe Pro Asp Ala Gln Vai Vai Trp 405 410 415

Ser Asn lie Arg Phe Gly Pro lie Gly Ser Thr Tyr Asp Phe 420 425 430

<210> 9 <211> 3459 <212> DNA

<213> Thermoascus aurantiacus

<400> 9

gaattctaga cctttatcct ttcatccgac cagacttccc tttttgacct tggcgccctg 60

ttgactacct acctacctag gtagtaacgt cgtcgaccct cttgaatgat ccttgtcaca 120

ctgcaaacat ccgaaaacat acggcaaaag atgattgggc atggatgcag gagacatcga 180

atgagggctt agaaggaaat gaaaacctgg gaccaggacg ctaggtacga tgaaatccgc 240

caatggtgaa actttaagtc gtgcctacag cacaggctct gtgaagattg cgctgttcag 300

acttaatctt ctcatcacag tccaagtctt tatgaaaagg aaaaagagag ggaagagcgc 360

tatttcgagc tgttggcctc atagggagac agtcgagcat accagcggta tcgacgttag 420

actcaaccaa gaataatgac gagaataaac acagaagtca accttgaact ggatagcagg 480

gttccagcag cagatagtta cttgcataaa gacaactccc cgagggctct ctgcatacac 540

caggatgttc cggaattatt cactgctcgt ttccgacgtg gcgtcagtga tccgtctcca 600

cagaactcta cctgggaata acccagggga ggaatctgca agtaagaact taataccaat 660

ccccggggct gccgaggtga atcgaatctc ccgcgggaaa ttaaacccat acgatgtttt 720

tgcaccacat gcatgcttag cacgatttct ccgcaaggga gtcacagaga aagacatatt 780

tcgcatacta ctgtgactct gcagagttac atatcactca ggatacattg cagatcattg 840

tccgggcatc aaaaatggac ctgcaggatc aacggcccga caaaacacaa gtggctaaag 900

ctgggggatg cccgaaaccc tctggtgcaa tatcatttga tggatgttcc ccccgcattt 960

ctaagacatc gacggatcgg cccgcatact aatcctttta tcaaccaaaa gttccactcg 1020

actagagaaa aaaaaggcca aggccactag ttgcagtcgg atactggtct tttcgccgtc 1080

caacaccttc atccatgatc cccttagcca ccaatgcccc acataataca tgttgacata 1140

ggtacgtagc tctgttatcc aatcggatcc gaacctcttt aacggacccc tcctacacac 1200

cttatcctaa cttcagaaga ctgttgccca ttggggattg aggaggtccg ggtcgcagga 1260

tgcgttctag gctaaattct cggccggtag ccatctcgaa tctctcgtga agccttcatc 1320

tgaacggttg gcggcccgtc aagccgatga ccatgggttc ctgatagagc ttgtgcctga 1380ccggccttgg cggcatagac gagctgaaca catcaggtat gaacagatca gatataaagt 1440

cggattgagt cctagtacga agcaatccgc caccaccaaa tcaagcaacg agcgacacga 1500

ataacaatat caatcgaatc gcaatgtatc agcgcgctct tctcttctct ttcttcctcg 1560

ccgccgcccg cgcgcacgag gccggtaccg taaccgcaga gaatcaccct tccctgacct 1620

ggcagcaatg ctccagcggc ggtagttgta ccacgcagaa tggaaaagtc gttatcgatg 1680

cgaactggcg ttgggtccat accacctctg gatacaccaa ctgctacacg ggcaatacgt 1740

gggacaccag tatctgtccc gacgacgtga cctgcgctca gaattgtgcc ttggatggag 1800

cggattacag tggcacctat ggtgttacga ccagtggcaa cgccctgaga ctgaactttg 1860

tcacccaaag ctcagggaag aacattggct ogcgcctgta cctgctgcag gacgacacca 1920

cttatcagat cttcaagctg ctgggtcagg agtttacctt cgatgtcgac gtctccaatc 1980

tcccttgcgg gctgaacggc gccctctact ttgtggccat ggacgccgac ggcaatttgt 2040

ccaaataccc tggcaacaag gcaggcgcta agtatggcac tggttactgc gactctcagt 2100

gccctcggga tctcaagttc atcaacggtc aggtacgtca gaagtgataa ctagccagca 2160

gagcccatga atcattaact aacgctgtca aatacaggcc aacgttgaag gctggcagcc 2220

gtctgccaac gacccaaatg ccggcgttgg taaccacggt tcctcgtgcg ctgagatgga 2280

tgtctgggaa gccaacagca tctctactgc ggtgacgcct cacccatgcg acacccccgg 2340

ccagaccatg tgccagggag acgactgtgg tggàacctac tcctccactc gatatgctgg 2400

tacctgcgac cctgatggct gcgacttcaa tccttaccag ccaggcaacc actcgttcta 2460

cggccccggg aagatcgtcg acactagctc caaattcacc gtcgtcaccc agttcatcac 2520

cgacgacggg acaccctccg gcaccctgac ggagatcaaa cgcttctacg tccagaacgg 2580

caaggtgatc ccccagtcgg agtcgacgat cagcggcgtc accggcaact caatcaccac 2640

cgagtattgc acggcccaga aggcagcctt cggcgacaac accggcttct tcacgcacgg 2700

cgggcttcag aagatcagtc aggctctggc tcagggcatg gtcctcgtca tgagcctgtg 2760

ggacgatcac gccgccaaca tgctctggct ggacagcacc tacccgactg atgcggaccc 2820

ggacacccct ggcgtcgcgc gcggtacctg ccccacgacc tccggcgtcc cggccgacgt 2880

tgagtcgcag aaccccaatt catatgttat ctactccaac atcaaggtcg gacccatcaa 2940

ctcgaccttc accgccaact aagtaagtaa cgggcactct accaccgaga gcttcgtgaa 3000

gatacagggg tagttgggag attgtcgtgt acaggggaca tgcgatgctc aaaaatctac 3060

atcagtttgc caattgaacc atgaagaaaa gggggagatc aaagaagtct gtcagaagag 3120

aggggctgtg gcagcttaag ccttgttgta gatcgttcag agaaaaaaaa agtttgcgta 3180

cttattatat taggtcgatc attatccgat tgactccgtg acaagaatta aaaagagtac 3240

tgcttgcttg cctatttaaa ttgttatata cgccgtagcg cttgcggacc acccctcaca 3300

gtatatcggt tcgcctcttc ttgtctcttc atctcacatc acaggtccag gtccagcccg 3360gcccggtccg ggtgccatgc atgcacaggg ggactaatat attaatcgtg accctgtvcc 3420. taagctaggg tccctgcatt ttgaacctgt ggacgtctg 3459

<210> 10

<211> 440

<212> PRT

<213> Thermoascus aurantiacus

<400> 10

Gln Gln Ala Gly Thr Vai Thr Ala Glu Asn His Pro Ser Leu Thr Trp

1 5 10 15

Gln Gln Cys Ser Ser Gly Gly Ser Cys Thr Thr Gln Asn Gly Lys Vai 20 25 30

Vai lie Asp Ala Asn Trp Arg Trp Vai His Thr Thr Ser Gly Tyr Thr 35 40 45

Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Thr Ser lie Cys Pro Asp Asp 50 55 60

Vai Thr Cys Ala Gln Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ser Gly 65 70 75 80

Thr Tyr Gly Vai Thr Thr Ser Gly Asn Ala Leu Arg Leu Asn Phe Vai 85 90 95

Thr Gln Ser Ser Gly Lys Asn lie Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Leu Gln 100 105 110

Asp Asp Thr Thr Tyr Gln lie Phe Lys Leu Leu Gly Gln Glu Phe Thr 115 120 125

Phe Asp Vai Asp Vai Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu 130 135 140

Tyr Phe Vai Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Leu Ser Lys Tyr Pro Gly 145 150 155 160

Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys 165 170 175

Pro Arg Asp Leu Lys Phe lie Asn Gly Gln Ala Asn Vai Glu Gly Trp 180 185 190Gln Pro Ser Ala Asn Asp Pro Asn Ala Gly Vai Gly Asn His Gly Ser 195 200 205

Cys Cys Ala Glu Met Asp Vai Trp Glu Ala Asn Ser lie Ser Thr Ala 210 215 220

Vai Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Thr Met Cys Gln Gly 225 230 235 240

Asp Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Thr Arg Tyr Ala Gly Thr Cys 245 250 255

Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Gln Gly "Asn His Ser 260 265 270

Phe Tyr Gly Pro Gly Gln lie Vai Asp Thr Ser Ser Lys Phe Thr Vai 275 280 285

Vai Thr Gln Phe lie Thr Asp Asp Gly Thr Pro Ser Gly Thr Leu Thr 290 295 300

Glu lie Lys Arg Phe Tyr Vai Gln Asn Gly Lys Vai lie Pro Gln Ser 305 310 315 320

Glu Ser Thr lie Ser Gly Vai Thr Gly Asn Ser lie Thr Thr Glu Tyr 325 330 335

Cys Thr Ala Gln Lys Ala Ala Phe Gly Asp Asn Thr Gly Phe Phe Thr 340 345 350

His Gly Gly Leu Gln Lys lie Ser Gln Ala Leu Ala Gln Gly Met Vai 355 360 365

Leu Vai Met Ser Leu Trp Asp Asp His Ala Ala Asn Met Leu Trp Leu 370 375 380

Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asp Ala Asp Pro Asp Thr Pro Gly Vai Ala 385 390 395 400

Arg Gly Thr Cys Pro Thr Thr Ser Gly Vai Pro Ala Asp Vai Glu Ser 405 410 415

Gln Tyr Pro Asn Ser Tyr Vai lie Tyr Ser Asn lie Lys Vai Gly Pro 420 425 430lie Asn Ser Thr Phe Thr Ala Asn 435 440 <210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> Primer

<400> 11

tacgccatgg tcgtccagtc gaccagc 27

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> Primer

<400> 12

tacgccatgg tcgtccagtc gaccagcacg ggcgg 3 5

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> Primer

<400> 13

tacgccatgg tcgtccagtc gaccagcacg ggcggcgacc tcggca 46

<210> 14 <211> 40 <212> DNA

<213> Primer

<400> 14

cgtactcgag tcatcgcgag ggggccttga agacggcgaa 40

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> Primer<400> 15

tgactcgaga ccggtgcgtc aggctttcgc

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> Primer

<400> 16

taggatccga gtcccattgg cagcaccggc aacc

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> Primer

<400> 17

taggatccga gtcctagcgg cggcaaccct cccggc

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> Primer

<400> 18

taggatccga gtcccattac cggcaaccct agcg

<210> 19

<211> 55

<212> DNA

<213> Primer

<400> 19

cgtactcgag tcatcgcgag ccgatggggc cgaaggcgaa gccgccgtcg tcgtg

<210> 20

<211> 52<212> DNA <213> Primer

<400> 20

cgtactcgag tcatcgcgag ccgatctcgc cccagaagcc gccgtcgtcg tg 52

<210> 21

<211> 58

<212> DNA

<213> Primer

<400> 21

cgtactcgag tcatcgcgac gaggggatct ggacggcggg gaagccgccg tcgtcgtg 58

<210> 22

<211> 52

<212> DNA

<213> Primer

<400> 22

cgtactcgag tcatcgcgag ccgatctcgc cccaggcgaa gccgccgtcg tc 52

<210> 23

<211> 37 <212> DNA <213> Primer

<400> 23

tcgtctcgag tcgcgatggg gccgaagcgg atgttgg 37

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> Primer

<400> 24

ggagggcatg cccaacagca gcgagatcac c

31<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> Primer

<400> 25

cggcactagt tcgcgacccg atctcgcccc agcgcagg

<210> 26

<211> 26

<212> DNA

<213> Primer

<400> 26

cgccgagggc cggctcgaga gcatcc

<210> 27

<211> 69

<212> DNA

<213> Primer

<400> 27

tgactcgaga ccggtgcgtc aggctttcgc acggagcttt acaggcactg agagtaggca gggttcagg

<210> 28

<211> 69

<212> DNA

<213> Primer

<400> 28

tgactcgaga ccggtgcgtc aggctttcgc acggagcttt acaggcactg agaggcgtaa gggttcagg

<210> <211> <212>

29 69 DNA<213> Primer

<400> 29

tgactcgaga ccggtgcgtc aggctttcgc acggagcttt acaggcactg agagtaccaa 60 gggttcagg 69

<210> 30

<211> 69

<212> DNA

<213> Primer

<400> 30

tgactcgaga ccggtgcgtc aggctttcgc acggagcttt acaggcactg agaggcggca 60 gggttcagg 69

<210> 31

<211> 57

<212> DNA

<213> Primer

<400> 31

taggatccga gtcccattac cggcaaccct agcaccacca ccacccgccg cccagcc 57

<210> 32

<211> 60

<212> DNA

<213> Primer

<400> 32

taggatccga gtcccattac cggcaaccct agccctaccc agtctcacta cggccagtgc 60

<210> 33

<211> 45

<212> DNA

<213> Primer

<400> 33

tgactcgaga ccggtgcgtc aggctttcgc acggagcttt acagg 45<210> 34

<211> 67

<212> DNA

<213> Primer

<400> 34

ttaaacatat gttatctact ccaacatcaa ggtcggaccc attggcagca ccggcaaccc 60 tagcggc 67

<210> 35

<211> 50

<212> DNA

<213> Primer

<400> 35

tatatgcggc cgcaccggtg cgtcaggctt tcgcacggag ctttacaggc 50

<210> 36

<211> 34

<212> DNA

<213> Primer

<400> 36

ttggatccga gtcgcagcac cggcaaccct agcg 34

<210> 37

<211> 208

<212> PRT

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 37

Ala Asn Gly Gln Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys

1 5 10 15

Gly Trp Ala Gly Lys Gly Pro Vai Asn Gln Pro Vai Tyr Ser Cys Asp 20 25 30

Ala Asn Phe Gln Arg lie His Asp Phe Asp Ala Vai Ser Gly Cys Glu 35 40 45

Gly Gly Pro Ala Phe Ser Cys Ala Asp.His Ser Pro Trp Ala lie Asn 50 55 60Asp Asn Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Leu Ser Gly Gln Thr 65 70 75 80

Glu Glu Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Thr Ser Gly 85 90 95

Pro Vai Ala Gly Lys Thr Met Vai Vai Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly 100 105 110

Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn lie Pro Gly Gly Gly Vai 115 120 125

Gly Leu Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala 130 135 140

Arg Tyr Gly Gly lie Ser Ser Arg Gln Glu Cys Asp Ser Phe Pro Glu 145 150 155 160

Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala 165 . 170 175

Asp Asn Pro Ser Phe Thr Phe Glu Arg Vai Gln Cys Pro Glu Glu Leu 180 185 190

Vai Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg His Asp Asp Gly Gly Phe Ala Phe 195 200 205

<210> 38 <211> 207 <212> PRT

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 38

Ala Asn Gly Gln Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys 15 10 15

Gly Trp Ala Gly Lys Gly Pro Vai Asn Gln Pro Vai Tyr Ser Cys Asp 20 25 30

Ala Asn Phe Gln Arg lie His Asp Phe Asp Ala Vai Ser Gly Cys Glu 35 40 45

Gly Gly Pro Ala Phe Ser Cys Ala Asp His Ser Pro Trp Ala lie Asn

50 55 60

Asp Asn Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Leu Ser Gly Gln Thr 65 70 75 80Glu Glu Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Thr Ser Gly 85 90 95

Pro Vai Ala Gly Lys Thr Met Vai Vai Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly 100 105 110

Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn lie Pro Gly Gly Gly Vai 115 120 125

Gly Leu Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala 130 135 140

Arg Tyr Gly Gly lie Ser Ser Arg Gln Glu Cys Asp Ser Phe Pro Glu 145 150 155 160

Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala 165 170 175

Asp Asn Pro Ser Phe Thr Phe Glu Arg Vai Gln Cys Pro Glu Glu Leu 180 185 190

Vai Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg His Asp Asp Gly Gly Phe Trp 195 200 205

<210> 39 <211> 208 <212> PRT

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 39

Ala Asn Gly Gln Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys 15 10 15

Gly Trp Ala Gly Lys Gly Pro Vai Asn Gln Pro Vai Tyr Ser Cys Asp 20 25 30

Ala Asn Phe Gln Arg lie His Asp Phe Asp Ala Vai Ser Gly Cys Glu 35 40 45

Gly Gly Pro Ala Phe Ser Cys Ala Asp His Ser Pro Trp Ala lie Asn 50 55 60

Asp Asn Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Leu Ser Gly Gln Thr 65 70 75 80

Glu Glu Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Thr Ser Gly 85 90 95Pro Vai Ala Gly Lys Thr Met Vai Vai Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly 100 105 110

Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn lie Pro Gly Gly Gly Vai 115 120 125

Gly Leu Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala 130 135 140

Arg Tyr Gly Gly lie Ser Ser Arg Gln Glu Cys Asp Ser Phe Pro Glu 145 150 155 160

Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala 165 170 175

Asp Asn Pro Ser Phe Thr Phe Glu Arg Vai Gln Cys Pro Glu Glu Leu 180 185 190

Vai Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg His Asp Asp Gly Gly Phe Pro Ala 195 200 205

<210> . 40 <211> 208 <212> . PRT

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 40

Ala Asn Gly Gln Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys 15 10 15

Gly Trp Ala Gly Lys Gly Pro Vai Asn Gln Pro Vai Tyr Ser Cys Asp 20 25 30

Ala Asn Phe Gln Arg lie His Asp Phe Asp Ala Vai Ser Gly Cys Glu 35 40 45

Gly Gly Pro Ala Phe Ser Cys Ala Asp His Ser Pro Trp Ala lie Asn 50 55 60

Asp Asn Leu Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Leu Ser Gly Gln Thr 65 70 75 80

Glu Glu Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Thr Ser Gly 85 90 95

Pro Vai Ala Gly Lys Thr Met Vai Vai Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly 100 105 110Asp Leu Gly 115 Ser Asn His Phe Asp 120 Leu Asn lie Pro Gly Gly Gly Vai 125 Gly Leu 130 Phe Asp Gly Cys Thr 135 Pro Gln Phe Gly Gly Leu 140 Pro Gly Ala Arg Tyr 145 Gly Gly lie Ser 150 Ser Arg Gln Glu Cys 155 Asp Ser Phe Pro Glu 160

Pro Leu Lys Pro Gly 165 Cys Gln Trp Arg Phe 170 Asp Trp Phe Gln Asn 175 Ala

Asp Asn Pro Ser 180 Phe Thr Phe Glu Arg 185 Vai Gln Cys Pro Glu 190 Glu Leu

Vai Ala Arg 195 Thr Gly Cys Arg Arg 200 His Asp Asp Gly Gly 205 Phe Ala Trp

<210> 41

<211> 388

<212> PRT

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 41

Gln Lys 1 Pro Gly Glu 5 Thr Pro Glu Vai His 10 Pro Gln Leu Thr Thr 15 Phe

Arg Cys Thr Lys 20 Ala Asp Gly Cys Gln 25 Pro Arg Thr Asn Tyr 30 lie Vai

Leu Asp Ser 35 Leu Ser His Pro Vai 40 His Gln Vai Asp Asn 45 Asp Tyr Asn

Cys Gly Asp 50 Trp Gly Gln Lys 55 Pro Asn Ala Thr Ala 60 Cys Pro Asp Vai

Glu Ser 65 Cys Ala Arg Asn 70 Cys lie Met Glu Gly Vai 75 Pro Asp Tyr Ser 80

Gln His Gly Vai Thr 85 Thr Ser Asp Thr Ser 90 Leu Arg Leu Gln Gln 95 Leu

Vai Asp Gly Arg 100 Leu Vai Thr Pro Arg 105 Vai Tyr Leu Leu Asp 110 Glu Thr

Glu His Arg Tyr Glu Met Met His Leu Thr Gly Gln Glu Phe Thr Phe115 120 125Glu Vai Asp Ala Thr Lys Leu Pro Cys Gly Met Asn Ser Ala Leu Tyr130 135 140

Leu Ser Glu Met Asp Pro Thr Gly Ala Arg Ser Glu Leu Asn Pro Gly145 150 155 160

Gly Ala Tyr Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Phe Vai Thr165 170 175

Pro Phe lie Asn Gly lie Gly Asn lie Glu Gly Lys Gly Ser Cys Cys180 . 185 190

Asn Glu Met Asp lie Trp Glu Ala Asn Ser Arg Ala Thr His Vai Ala195 200 205

Pro His Thr Cys Asn Gln Thr Gly Leu Tyr Met Cys Glu Gly Ala Glu210 215 220

Cys Glu Tyr Asp Gly Vai Cys Asp Lys Asp Gly Cys Gly Trp Asn Pro225 230 235 240

Tyr Arg Vai Asn lie Thr Asp Tyr Tyr Gly Asn Ser Asp Ala Phe Arg245 250 255

Vai Asp Thr Arg Arg Pro Phe Thr Vai Vai Thr Gln Phe Pro Ala Asp260 265 270

Ala Glu Gly Arg Leu Glu Ser lie His Arg Leu Tyr Vai Gln Asp Gly275 280 285

Lys Vai lie Glu Ser Tyr Vai Vai Asp Ala Pro Gly Leu Pro Arg Thr290 295 300

Asp Ser Leu Asn Asp Glu Phe Cys Ala Ala Thr Gly Ala Ala Arg Tyr305 310 315 320

Leu Asp Leu Gly Gly Thr Ala Gly Met Gly Asp Ala Met Thr Arg Gly325 330 335

Met Vai Leu Ala Met Ser lie Trp Trp Asp Glu Ser Gly Phe Met Asn340 345 350

Trp Leu Asp Ser Gly Glu Ala Gly Pro Cys Leu Pro Asp Glu Gly Asp355 360 365

Pro Lys Asn lie Vai Lys Vai Glu Pro Ser Pro Glu Vai Thr Tyr Ser370 375 380

Asn Leu Arg Trp385<210> 42

<211> 421

<212> PRT

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 42

Gln Arg Ala Gly Asn Glu Thr Pro Glu Asn His Pro Pro Leu Thr Trp15 10 15

Gln Arg Cys Thr Ala Pro Gly Asn Cys Gln Thr Vai Asn Ala Glu Vai20 25 30

Vai lie Asp Ala Asn Trp Arg Trp Leu His Asp Asp Asn Met Gln Asn35 40 45

Cys Tyr Asp Gly Asn Gln Trp Thr Asn Ala Cys Ser Thr Ala Thr Asp50 55 60

Cys Ala Glu Lys Cys Met lie Glu Gly Ala Gly Asp Tyr Leu Gly Thr65 70 75 80

Tyr Gly Ala Ser Thr Ser Gly Asp Ala Leu Thr Leu Lys Phe Vai Thr85 90 95

Lys His Glu Tyr Gly Thr Asn Vai Gly Ser Arg Phe Tyr Leu Met Asn100 105 110

Gly Pro Asp Lys Tyr Gln Met Phe Asn Leu Met Gly Asn Glu Leu Ala115 120 125

Phe Asp Vai Asp Leu Ser Thr Vai Glu Cys Gly lie Asn Ser Ala Leu130 135 140

Tyr Phe Vai Ala Met Glu Glu Asp Gly Gly Met Ala Ser Tyr Pro Ser145 150 155 160

Asn Gln Ala Gly Ala Arg Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys165 170 175

Ala Arg Asp Leu Lys Phe Vai Gly Gly Lys Ala Asn lie Glu Gly Trp180 185 190

Lys Ser Ser Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Vai Gly Pro Tyr Gly Ser195 200 205

Cys Cys Ala Glu lie Asp Vai Trp Glu Ser Asn Ala Tyr Ala Phe Ala210 215 220Phe Thr Pro His Ala Cys Thr Thr Asn Glu Tyr His Vai Cys Glu Thr225 230 235 240

Thr Asn Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Glu Asp Arg Phe Ala Gly Lys Cys245 250 255

Asp Ala Asn Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn Pro Asp

260 265 270

Phe Tyr Gly Lys Gly Lys Thr Leu Asp Thr Ser Arg Lys Phe Thr Vai275 280 - 285

Vai Ser Arg Phe Glu Glu Asn Lys Leu Ser Gln Tyr Phe lie Gln Asp290 295 300

Gly Arg Lys lie Glu lie Pro Pro Pro Thr Trp Glu Gly Met Pro Asn305 310 315 320

Ser Ser Glu lie Thr Pro Glu Leu Cys Ser Thr Met Phe Asp Vai Phe325 330 335

Asn Asp Arg Asn Arg Phe Glu Glu Vai Gly Gly Phe Glu Gln Leu Asn340 345 350

Asn Ala Leu Arg Vai Pro Met Vai Leu Vai Met Ser lie Trp Asp Asp355 360 365

His Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser lie Tyr Pro Pro Glu Lys370 375 380

Glu Gly Gln Pro Gly Ala Ala Arg Gly Asp Cys Pro Thr Asp Ser Gly385 390 395 400

Vai Pro Ala Glu Vai Glu Ala Gln Phe Pro Asp Ala Gln Vai Vai Trp405 410 415

Ser Asn lie Arg Phe420

<210> 43

<211> 430

<212> PRT

<213> Thermoascus aurantiacus

<400> 43

Gln Gln Ala Gly Thr Vai Thr Ala Glu Asn His Pro Ser Leu Thr Trp

1 5 10 15Gln Gln Cys Ser Ser Gly Gly Ser Cys Thr Thr Gln Asn Gly Lys Vai20 25 30

Vai lie Asp Ala Asn Trp Arg Trp Vai His Thr Thr Ser Gly Tyr Thr35 40 45

Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Thr Ser lie Cys Pro Asp Asp50 55 60

Vai Thr Cys Ala Gln Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ser Gly65 70 75 80

Thr Tyr Gly Vai Thr Thr Ser Gly Asn Ala Leu Arg Leu Asn Phe Vai

85 90 95

Thr Gln Ser Ser Gly Lys Asn lie Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Leu Gln100 105 110

Asp Asp Thr Thr Tyr Gln lie Phe Lys Leu Leu Gly Gln Glu Phe Thr115 120 125

Phe Asp Vai Asp Vai Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu130 135 140

Tyr Phe Vai Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Leu Ser Lys Tyr Pro Gly145 150 155 160

Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys165 170 175

Pro Arg Asp Leu Lys Phe lie Asn Gly Gln Ala Asn Vai Glu Gly Trp180 185 190

Gln Pro Ser Ala Asn Asp Pro Asn Ala Gly Vai Gly Asn His Gly Ser195 200 205

Cys Cys Ala Glu Met Asp Vai Trp Glu Ala Asn Ser lie Ser Thr Ala210 215 220

Vai Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Thr Met Cys Gln Gly225 230 235 240

Asp Asp Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Thr Arg Tyr Ala Gly Thr Cys245 250 255

Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Gln Gly Asn His Ser260 265 270

Phe Tyr Gly Pro Gly Gln lie Vai Asp Thr Ser Ser Lys Phe Thr Vai275 280 285Vai Thr Gln Phe lie Thr Asp Asp Gly Thr Pro Ser Gly Thr Leu Thr290 295 300

Glu.Ile Lys Arg Phe Tyr Vai Gln Asn Gly Lys Vai lie Pro Gln Ser305 310 315 320

Glu Ser Thr lie Ser Gly Vai Thr Gly Asn Ser lie Thr Thr Glu Tyr325 330 335

Cys Thr Ala Gln Lys Ala Ala Phe Gly Asp Asn Thr Gly Phe Phe Thr

340 345 350

His Gly Gly Leu Gln Lys lie Ser Gln Ala Leu Ala Gln Gly Met Vai355 360 365

Leu Vai Met Ser Leu Trp Asp Asp His Ala Ala Asn Met Leu Trp Leu370 375 380

Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asp Ala Asp Pro Asp Thr Pro Gly Vai Ala385 390 395 400

Arg Gly Thr Cys Pro Thr Thr Ser Gly Vai Pro Ala Asp Vai Glu Ser405 410 415

Gln Tyr Pro Asn Ser Tyr Vai lie Tyr Ser Asn lie Lys Vai420 425 430

<210> 44<211> 69<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 44

Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly15 10 15

Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly20 25 30

Pro Thr Gln Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly35 40 45

Pro Thr Vai Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Vai Leu Asn Pro Tyr50 55 60

Tyr Ser Gln Cys Leu65<210> 45<211> 69<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 45

Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly15 10 15

Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly20 25 30

Pro Thr Gln Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly35 40 45

Pro Thr Vai Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Vai Leu Asn Pro Ala50 55 60

Tyr Ser Gln Cys Leu65

<210> 46<211> 69<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 46

Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn.Pro Pro Gly15 10 15

Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly20 25 30

Pro Thr Gln Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly35 40 45

Pro Thr Vai Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Vai Leu Asn Pro Tyr50 55 60

Ala Ser Gln Cys Leu65

<210> 47<211> 69<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 47

Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly1 5 10 15

Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly20 25 30

Pro Thr

Gln35

Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly lie Gly40 45

Tyr Ser GlyPro Thr Vai Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Vai Leu Asn Pro Trp50 55 60

Tyr Ser Gln Cys Leu65

<210> 48

<211> 69

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 48

Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly15 10 15

Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly20 25 30

Pro Thr Gln Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly lie Gly Tyr Ser Gly35 40 45

Pro Thr Vai Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Vai Leu Asn Pro Ala50 55 60

Ala Ser Gln Cys Leu65

<210> 49<211> 58<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 49

Thr Gly Asn Pro Ser Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr15 10 15

Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly20 25 30

lie Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Vai Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln35 40 45

Vai Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu50 55<210> 50

<211> 42

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 50

Thr Gly Asn Pro Ser Pro Thr Gln Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly1 5 10 15

lie Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Vai Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln20 25 30

Vai Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu35 40

Claims (55)

1. Proteína de fusão de celulase compreendendoA. uma primeira seqüência de aminoácidos opcionalmentemodificada de um núcleo de celulase derivado de uma es-pécie, eB. uma segunda seqüência de aminoácidos opcionalmentemodificada de um ligante e/ou de um domínio de ligação decelulose (CBD) derivado de outra espécie,em que uma região de junção foi introduzida entre a referidaprimeira seqüência de aminoácidos e a referida segunda seqüência de ami-noácidos, por meio da qual uma proteína de fusão estável é obtida.

2. Proteína de fusão de celulase da reivindicação 1, em que aregião de junção tem a seguinte fórmula geral:-1A-2B-3C-4D-5E-6Fem que-1A é selecionado de um grupo consistindo em Gly, Ala, Leu, Pro,Me, e Vai; preferivelmente 1A é Gly ou Vai, mais preferivelmente Gly;-2B é selecionado de um grupo consistindo em Gly, Ala, Leu, Pro,lie, Phe, Vai, Glu, Asp, Gln, e Asn; preferivelmente 2B é Pro, Gln, ou Glu;-3C é selecionado de um grupo consistindo em Gly, Ala, Lys, Leu,Pro, lie, Vai, Ser e Thr; preferivelmente 3C é He;-4D é selecionado de um grupo consistindo em Gly, Ala, Leu, Pro,Me, e Vai; preferivelmente 4D é Gly ou Pro;5E é selecionado de um grupo consistindo em Ser, Pro e Thr;preferivelmente 5E é Ser; e-6F é selecionado de um grupo consistindo em Ser, Thr ou estáausente, preferivelmente 6F é Ser ou está ausente; em que 1A está ligado naseqüência de aminoácidos C-terminal do núcleo de celulase e 6F está ligadona seqüência de aminoácidos N-terminal do ligante e/ou domínio (CBD).

3. Proteína de fusão de celulase, de acordo coma reivindicação-2, em que a região de junção tema seguinte fórmula geral:-1Gly-2B-3lle-4D-5Ser-6Fem que-2B é Pro, Gln, ou Glu;-4D é Gly ou Pro;-5E é Ser; e-6F é Ser ou está ausente.

4. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindicação-2, em que a região de junção tem a seguinte fórmula:-1 Vai - 2Gln - 3lle - 4Pro - 5Ser - 6Ser.

5. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindicação-2, em que a região de junção tem a fórmula:-1Gly - 2Glu - 3lle - 4Gly- 5Ser ou 1Gly - 2Pro - 3lle - 4Gly- 5Ser.

6. Proteína de fusão de celulase, de qualquer uma das reivindi-cações de 1 a 5, em que a referida primeira seqüência de aminoacidos é deuma celulase neutra e a referida segunda seqüência de aminoacidos é de-uma celulase ácida.

7. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindicação-6, em que a referida primeira seqüência de aminoacidos é da celulase dafamília 45 e a referida segunda seqüência de aminoacidos é da celulase dafamília 7.

8. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindicação-6, em que a referida celulase neutra é de origem fúngica.

9. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindicação-8, em que a referida celulase neutra é derivada do gênero de Melanocarpus,Humicola, Thielavia, Myceliophthora, Fusarium, Acremonium, Chrysosporí-um, Thermoascus, Scopulariopsis, Myriococcum, Talaromyces ou Chaeto-mium, preferivelmente de um Melanocarpus sp, mais preferivelmente de Me-lanocarpus albomyces.

10. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 9, em que a referida celulase é celulase 20K de Melanocarpus albomy-ces, celulase 50K, celulase 50KB ou um derivado seu.

11. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 9, em que a referida celulase é CBHI de Thermoascus aurantiacus ouum derivado seu.

12. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 6, em que a referida celulase ácida é derivada de Trichoderma sp. ouHypocrea, preferivelmente de Trichoderma reesei.

13. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 6, em que a referida celulase neutra é a celulase 20K de Melanocarpusalbomyces da SEQ ID NO: 2 ou um derivado seu, e a segunda seqüência deaminoácidos é o ligante e/ou CBD da celobioidrolase I de Trichoderma ree-sei da SEQ ID NO: 4 ou um derivado seu.

14. Proteína de fusão de celulase, de acordo com qualquer umadas reivindicações de 1 a 13, em que a referida primeira seqüência de ami-noácidos e/ou a referida segunda seqüência de aminoácidos é modificada.

15. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 14, em que na referida segunda seqüência de aminoácidos, o aminoáci-do tirosina na posição 492 (posição 31 do CBD) e/ou 493 (posição 32 doCBD) de CBHI de Trichoderma reesei maduro é substituído com um amino-ácido alifático, preferivelmente com alanina, e/ou com um aminoácido aro-mático, preferivelmente com triptofano.

16. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 15, em que a referida segunda seqüência de aminoácidos, é seleciona-da de um grupo da SEQ ID NO: 45, 46, 47 e 48.

17. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 14, em que na referida segunda seqüência de aminoácidos, os aminoá-cidos 434 a 444 ou 434 a 460 da seqüência de CBHI de Trichoderma reeseimaduro são anulados.

18. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 17, em que a referida segunda seqüência de aminoácidos é selecionadade um grupo da SEQ ID NO: 49 e 50.

19. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 14, em que na referida primeira seqüência de aminoácidos, o aminoáci-do valina na posição 208 da seqüência de celulase 20K de Melanocarpusalbomyces da SEQ ID NO: 2 foi anulado.

20. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 14, em que na referida primeira seqüência de aminoacidos, o aminoáci-do alanina na posição 207 da seqüência de celulase 20K de Melanocarpusalbomyces da SEQ ID NO: 2 foi anulado.

21. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 14, em que na referida primeira seqüência de aminoacidos, o aminoáci-do fenilalanina na posição 209 da seqüência de celulase 20K de Melanocar-pus albomyces da SEQ ID NO: 2 foi substituído com Trp.

22. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 14, em que na referida primeira seqüência de aminoacidos, o aminoáci-do contém uma prolina inserida depois da posição 206 na seqüência de ce-lulase 20K de Melanocarpus albomyces da SEQ ID NO: 2.

23. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 14, em que na referida primeira seqüência de aminoacidos, o aminoáci-do é selecionado do grupo de SEQ ID NO: 37, 38, 39 e 40.

24. Proteína de fusão de celulase, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 23, em que a referida proteína de fusão é estável.

25. Proteína de fusão de celulase, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1 a 23, em que uma preparação contendo a referida pro-teína de fusão foi adicionalmente estabilizada por tratamento com aqueci-mento.

26. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 1, em que a referida primeira celulase naturalmente não tem um CBD.

27. Proteína de fusão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 1, em que o CBD foi anulado da referida primeira celulase.

28. Vetor de expressão compreendendo uma primeira seqüênciade polinucleotídeo codificando uma primeira seqüência de aminoacidos op-cionalmente modificada de um núcleo de celulase derivado de uma espécie,e uma segunda seqüência de polinucleotídeo codificando uma segunda se-qüência de aminoacidos opcionalmente modificada de um ligante e/ou umdomínio de ligação de celulose (CBD) derivado de outra espécie, e um poli-nucleotídeo que codifica uma região de junção conectando as referidas pri-meira e segunda seqüências de polinucleotídeo, as referidas seqüências depolinucleotídeo codificando as respectivas seqüências de aminoácidos con-forme especificamente definido acima.

29. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 28, emque a primeira seqüência de polinucleotídeo codifica um núcleo de celulaseneutro e a referida segunda seqüência de polinucleotídeo codifica um ligantee/ou um domínio de ligação de celulose (CBD) de uma celulase ácida.

30. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 29, emque a referida celulase neutra é derivada do gênero de Melanocarpus, Hu-micola, Thielavia, Myceliophthora, Fusarium, Acremonium, Chrysosporium,Thermoascus, Scopulariopsis, Myriococcum, Talaromyces ou Chaetomium,preferivelmente de um Melanocarpus sp, mais preferivelmente de Melano-carpus albomyces.

31. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 30, e quea referida celulase é celulase 20K de Melanocarpus albomyces, celulase 50K, celulase 50KB ou um derivado seu.

32. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 30, emque a referida celulase é CBHI de Thermoascus aurantiacus.

33. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 28, emque a referida celulase ácida é derivada de Trichoderma sp. ou Hypocrea,preferivelmente de Trichoderma reesei.

34. Vetor de expressão de celulase, de acordo com a reivindica-ção 28, em que a referida celulase neutra é a celulase 20K de Melanocarpusalbomyces da SEQ ID NO: 1 ou um derivado seu, e a segunda seqüência deaminoácidos é o ligante e/ou CBD da celobioidrolase I de Trichoderma ree-sei da SEQ ID NO: 3 ou um derivado seu.

35. Vetor de expressão, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 28 a 34, em que a referida primeira seqüência de aminoáci-dos e/ou a referida segunda seqüência de aminoácidos é modificada.

36. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 35, emque a referida segunda seqüência de polinucleotídeo codifica uma seqüênciade aminoácidos selecionada de um grupo de SEQ ID NO: 45, 46, 47 e 48.

37. Vetor de expressão de 35, em que a referida segunda se-qüência de polinucleotídeo codifica uma seqüência de aminoácidos selecio-nada de um grupo de SEQ ID NO: 49 e 50.

38. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 35, emque a referida primeira seqüência de polinucleotídeo codifica uma seqüênciade aminoácidos selecionada de um grupo de SEQ ID NO: 37, 38, 39 e 40.

39. Vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 28, emque a referida primeira seqüência de polinucleotídeo codifica uma celulase, aqual naturalmente não tem um CBD.

40. Célula hospedeira compreendendo um vetor de expressãoconforme definido em qualquer uma das reivindicações 28 a 39.

41. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 40, a qualé de origem fúngica.

42. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 41, a qualpertence ao fungo filamentoso.

43. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 41 ou 42,a qual pertence ao gênero Trichoderma ou Aspergillus.

44. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 43, a qualé Trichoderma reesei.

45. Processo para a produção de uma proteína de fusão de celu-lase, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 27, com-preendendo os passos de cultivar a célula hospedeira de qualquer uma dasreivindicações 41 a 44 e a recuperação da proteína do meio de cultura.

46. Preparação de enzima, compreendendo uma proteína defusão de celulase conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 27.

47. Processo para desbotamento, o qual compreende o passode adicionar uma proteína de fusão de celulase conforme definido em qual-quer uma das reivindicações 1 a 27 ou a preparação da reivindicação 46 apeças de vestuário ou tecido contendo algodão.

48. Processo, de acordo com a reivindicação 47, em que o teci-do ou peças de vestuário é sarja de Nimes.

49. Processo para bioacabamento, o qual compreende o passode adicionar uma proteína de fusão de celulase conforme definido em qual-quer uma das reivindicações 1 a 27, ou o preparo da reivindicação 46 paramateriais têxteis como tecidos ou peças de vestuário ou fios.

50. Processo, de acordo com a reivindicação 49, em que os ma-teriais têxteis são produzidos a partir de celulose natural contendo fibras oufibras contendo celulose domésticas ou são misturas destes.

51. Processos, de acordo com a reivindicação 49, em que osmateriais têxteis são misturas de fibras sintéticas e de fibras contendo celu-lose.

52. Composição detergente compreendendo uma proteína defusão de celulase conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a-27 ou a preparação de enzima da reivindicação 46 e adjuvantes, tais comoagentes ativos de superfície, tensoativos, agentes alvejantes ou abrasivos.

53. Método de tratamento de fibra celulósica, contendo materialtêxtil, em que o referido método compreende o contato do referido materialtêxtil com a composição detergente da reivindicação 52.

54. Método para tratar fibra ou polpa derivada de madeiram iqual compreende o passo de adicionar uma proteína de fusão de celulaseconforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou o preparoda reivindicação 46 para polpa química ou mecânica derivada de madeira oufibra secundária.

55. Método para melhorar a qualidade de ração animal, o qualcompreende o tratamento do material vegetal com uma proteína de fusão de celulase conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou opreparo da reivindicação 46.