ES2466649T3 - Revascularización de tejido retiniano isquémico - Google Patents

Abstract

Utilización de un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) para la preparación de una composición farmacéutica para promover la revascularización fisiológica beneficiosa de tejido retiniano isquémico, en la que la composición farmacéutica está destinada a administrar a un mamífero que sufre isquemia retiniana una cantidad terapéuticamente eficaz de un fragmento angiostático de TrpRS suficiente para inhibir la neovascularización patológica y promover la revascularización fisiológica de las zonas isquémicas de la retina.

Description

Revascularización de tejido retiniano isquémico.

Declaración de interés gubernamental

Una parte del trabajo descrito en la presente memoria fue financiado por las subvenciones número EY11254 y EY12598 de los National Institutes of Health. El gobierno de los Estados Unidos presenta ciertos derechos sobre la presente invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento de enfermedades neovasculares retinianas. Más particularmente, la presente invención se refiere a métodos para promover la revascularización retiniana administrando un fragmento proteico angiostático a un paciente, y a un método de identificación para identificar agentes terapéuticos para tratar enfermedades neovasculares retinianas.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades vasculares de la retina, incluyendo retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad exudativa (ARMD), retinopatía del prematuro (ROP) y oclusiones vasculares, son causas importantes de deterioro visual y ceguera. Este grupo de enfermedades se encuentra en el centro de una investigación exhaustiva dirigida a identificar nuevas modalidades de tratamiento que ayudarán a prevenir o modificar la neovascularización ocular patológica. Por ejemplo, la ARMD afecta a 12-15 millones de estadounidenses sobre la edad de 65 años, y provoca pérdida visual en el 10-15% de ellos como efecto directo de la neovascularización coroidea (subretiniana). La causa principal de pérdida visual para estadounidenses menores de 65 años es la diabetes; 16 millones de individuos en los Estados Unidos son diabéticos y 40.000 al año padecen complicaciones oculares de la enfermedad, a menudo un resultado de la neovascularización retiniana. Aunque la fotocoagulación con láser ha sido eficaz en la prevención de la pérdida visual grave en subgrupos de pacientes diabéticos de alto riesgo, la incidencia global a los 10 años de la retinopatía permanece sustancialmente sin cambios. Para pacientes con neovascularización coroidea debida a ARMD o enfermedad inflamatoria del ojo, tal como histoplasmosis ocular, la fotocoagulación, con pocas excepciones, no es eficaz en la prevención de la pérdida visual. Aunque las terapias fotodinámicas no destructivas recientemente desarrolladas mantienen la promesa de reducir temporalmente la pérdida individual en pacientes con neovascularización coroidea no tratable anteriormente, sólo el 61,4% de los pacientes tratados cada 3-4 meses presentaban una visión mejorada o estabilizada en comparación con el 45,9% del grupo tratado con placebo.

La degeneración macular relacionada con la edad y la retinopatía diabética son las causas principales de pérdida visual en naciones industrializadas y esto así como resultado de la neovascularización retiniana anómala. Puesto que la retina consiste en capas bien definidas de elementos neuronales, gliales y vasculares, alteraciones relativamente pequeñas, tales como las observadas en la proliferación vascular o el edema, pueden conducir a una pérdida significativa de función visual. Las degeneraciones retinianas heredadas, tales como la retinitis pigmentaria (RP), también están asociadas con anomalías vasculares, tales como estrechamiento arteriolar y atrofia vascular. Aunque se ha experimentado un progreso significativo en la identificación de factores que promueven e inhiben la angiogénesis, actualmente no está disponible ningún tratamiento para tratar específicamente la enfermedad vascular ocular.

Las degeneraciones heredadas de la retina afectan a tantos como 1 de cada 3500 individuos, y se caracterizan por ceguera nocturna progresiva, pérdida del campo visual, atrofia del nervio óptico, atenuación arteriolar, permeabilidad vascular alterada y pérdida de visión central que progresa a menudo hasta ceguera completa (Heckenlively, J. R., editor, 1988; Retinitis Pigmentosa, Filadelfia: JB Lippincott Co.). El análisis genético molecular de estas enfermedades ha identificado mutaciones en aproximadamente 110 genes diferentes que representan sólo un pequeño porcentaje de los individuos afectados conocidos (Humphries et al., 1992, Science 256:804-808; Farrar et al. 2002, EMBO J. 21:857-864.). Muchas de estas mutaciones están asociadas con componentes enzimáticos y estructurales de la maquinaria de fototransducción, incluyendo rodopsina, GMPc fosfodiestereasa, rds periferina y RPE65. A pesar de estas observaciones, no existe todavía ningún tratamiento eficaz para ralentizar o revertir la progresión de estas enfermedades degenerativas retinianas. Recientes avances en terapia génica han conducido a una reversión satisfactoria de los fenotipos rds (Ali et al. 2000, Nat. Genet. 25:306-310) y rd (Takahashi et al. 1999,

J. Virol. 73:7812-7816) en ratones y del fenotipo RPE65 en perros (Acland et al. 2001, Nat. Genet. 28:92-95) cuando se suministra el transgén de tipo salvaje a fotorreceptores o al epitelio pigmentado retiniano (RPE) en animales con una mutación específica.

La angiogénesis es el proceso mediante el cual se forman nuevos vasos sanguíneos. En respuesta a señales químicas específicas, brotan capilares a partir de vasos existentes, creciendo finalmente en tamaño según lo necesite el organismo. Inicialmente, las células endoteliales, que revisten los vasos sanguíneos, se dividen en una dirección ortogonal al vaso existente, formando un brote sólido. Entonces, las células endoteliales adyacentes

forman grandes vacuolas y las células se reordenan de modo que las propias vacuolas se orientan extremo con extremo y finalmente se fusionan formando la luz de un nuevo capilar (formación del tubo).

La angiogénesis se estimula mediante varias condiciones, tal como en respuesta a una herida, y acompaña prácticamente a todo crecimiento tisular en organismos vertebrados tales como mamíferos. La angiogénesis también desempeña un papel en ciertos estados patológicos tales como retinopatía diabética y ciertos cánceres. El crecimiento de tumores, por ejemplo, requiere el crecimiento de vasos sanguíneos para proporcionar oxígeno y nutrientes al tejido tumoral en crecimiento.

La angiogénesis puede detenerse o inhibirse interfiriendo con las señales químicas que estimulan el proceso angiogénico. Por ejemplo, las células endoteliales angiogénicas producen proteasas para digerir la lámina basal que rodea a los vasos sanguíneos, abriendo así un camino para el nuevo capilar. La inhibición de estas proteasas, o su formación, puede impedir la formación de nuevos vasos. Asimismo, las células endoteliales proliferan en respuesta a señales químicas. Las señales de proliferación particularmente importantes incluyen las familias de proteínas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). Se ha demostrado que VEGF está implicado en la vascularización de ciertos tumores. La interferencia con estos procesos de señalización de la proliferación también puede inhibir la angiogénesis.

Varios factores están implicados en la angiogénesis. Las moléculas del factor de crecimiento de fibroblastos tanto ácido como básico son mitógenos para células endoteliales y otros tipos de células. Un mitógeno altamente selectivo para células endoteliales vasculares es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

En el adulto normal, la angiogénesis está rigurosamente regulada, y está limitada a la cicatrización de heridas, el embarazo y el ciclo uterino. La angiogénesis se activa mediante moléculas angiogénicas específicas tales como factor de crecimiento de fibroblastos ácido y básico (FGF), VEGF, angiogenina, factor de crecimiento transformante (TGF), factor α de necrosis tumoral (TNF-α) y factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF). La angiogénesis puede suprimirse mediante moléculas inhibidoras tales como interferón-α, trombospondina-1, angiostatina y endostatina. Es el equilibrio de estos estimuladores e inhibidores que se producen de manera natural el que controla la vasculatura capilar quiescente de manera normal. Cuando este equilibrio se altera, como en ciertos estados patológicos, se induce la proliferación, la migración y en última instancia la diferenciación de las células endoteliales capilares. Los documentos WO 02/067970 y WO 03/009813 describen fragmentos de TRpRS para uso en el tratamiento de enfermedad neovascular ocular inhibiendo la neovascularización ocular a través de su actividad angiostática.

La angiogénesis ejerce un papel central en una variedad de enfermedades, incluyendo cáncer y neovascularización ocular. Se ha demostrado también que el crecimiento sostenido y la metástasis de una variedad de tumores dependen del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos del huésped al interior del tumor en respuesta a factores angiogénicos derivados del tumor. La proliferación de nuevos vasos sanguíneos en respuesta a una variedad de estímulos aparece como el hallazgo dominante en la mayoría de las enfermedades oculares y que producen ceguera, incluyendo retinopatía diabética proliferativa, ARMD, glaucoma rubeótico, queratitis intersticial y retinopatía del prematuro. En estas enfermedades, el daño tisular puede estimular la liberación de factores angiogénicos que dan como resultado proliferación capilar. El VEGF desempeña un papel dominante en la neovascularización del iris y retinopatías neovasculares. Aunque los informes muestran claramente una correlación entre los niveles de VEGF intraoculares y la neovascularización ocular retinopática isquémica, FGF probablemente desempeña un papel. Es conocido que FGF ácido y básico está presente en la retina adulta normal, aun cuando niveles detectables no se correlacionan sistemáticamente con neovascularización. Esto puede deberse en gran medida al hecho de que FGF se une muy fuertemente a componentes cargados de la matriz extracelular y puede no estar fácilmente disponible en una forma libremente difusible que se detectaría mediante ensayos convencionales de fluidos intraoculares.

Una ruta común final en la respuesta angiogénica implica intercambio de información mediado por integrinas entre una célula endotelial vascular en proliferación y la matriz extracelular. Esta clase de receptores de adhesión, denominados integrinas, se expresan como heterodímeros que presentan una subunidad α y β en todas las células. Una integrina de este tipo, αvβ3, es el miembro más promiscuo de esta familia y permite que las células endoteliales interaccionen con una amplia variedad de componentes de la matriz extracelular. Los antagonistas peptídicos y de anticuerpo de esta integrina inhiben la angiogénesis induciendo selectivamente apoptosis de las células endoteliales vasculares en proliferación. Existen dos rutas de angiogénesis dependientes de citocinas, y pueden definirse por su dependencia de distintas integrinas de células vasculares, αvβ3 y αvβ5. Específicamente, la angiogénesis inducida por FGF básico y VEGF depende de la integrina αvβ3 y αvβ3, respectivamente, puesto que antagonistas de anticuerpo de cada integrina bloquean selectivamente una de estas rutas angiogénicas en los modelos de membrana corioalantoica de pollo (CAM) y corneal de conejo. Los antagonistas peptídicos que bloquean todas las integrinas αv inhiben la angiogénesis estimulada por FGF y VEGF. Aunque los vasos sanguíneos oculares humanos normales no presentan ninguna integrina, las integrinas αvβ3 y αvβ5 se presentan selectivamente en vasos sanguíneos en tejidos de pacientes con enfermedad neovascular del ojo activa. Aunque sólo se observó sistemáticamente αvβ3 en tejido procedente de pacientes con ARMD, tanto αvβ3 como αvβ5 estaban presentes en tejidos de pacientes con retinopatía diabética proliferativa. Los antagonistas peptídicos de integrinas administrados

de manera sistémica bloquearon la formación de nuevos vasos sanguíneos en un modelo de ratón de vasculogénesis retiniana.

Las pruebas de posibles tratamientos para enfermedades neovasculares retinianas se han visto facilitadas en gran medida por el desarrollo de modelos de retinopatía inducida por oxígeno (OIR) en varias especies animales, incluyendo cachorros de gato, cachorros de perro beagle, rata y ratón. En cada uno de estos modelos, la exposición de animales recién nacidos a hiperoxia (o a hiperoxia e hipoxia alternas) provoca la regresión o el retraso del desarrollo vascular retiniano, seguido de angiogénesis anómala tras su regreso a niveles de oxígeno normales. Estos modelos imitan los episodios que se producen durante la retinopatía del prematuro (ROP), una afección que implica neovascularización patológica que puede afectar a lactantes prematuros.

A lo largo de la última década, el modelo de ratón de OIR se ha convertido en el modelo más común para estudiar la angiogénesis anómala asociada con retinopatías inducidas por oxígeno. El patrón de anomalías vasculares en este modelo difiere ligeramente del observado en ROP; en el ratón, la retina posterior central deviene avascular tras la exposición a hiperoxia, mientras que en lactantes humanos la periferia es avascular. No obstante, este es un modelo bien aceptado para estudiar los mecanismos de la enfermedad y el posible tratamiento de la retinopatía inducida por hipoxia, y los cambios vasculares son muy constantes, reproducibles y cuantificables. En los últimos años, la utilización de este modelo se ha extendido al estudio general de vasculopatías isquémicas e intervenciones antiangiogénicas relacionadas, y se utiliza actualmente de manera extendida en entornos de investigación tanto básica como aplicada.

El método históricamente común para cuantificar la respuesta neovascular proliferativa en el modelo de IOR de ratón se basa en el recuento del número de células asociadas con nuevos vasos que se extienden desde la retina hacia el humor vítreo (“núcleos de membrana limitante pre-interna (ILM)”). Esto se realiza en secciones transversales sagitales, habitualmente en regiones próximas al (pero que no incluyen) disco óptico. El método es muy laborioso, requiere mucho tiempo y está plagado de dificultades, incluyendo la necesidad de diferenciar células de los vasos anómalos de las de los vasos hialoideos en el humor vítreo. En general, debido a que sólo se evalúa cada 30ª sección en serie, una gran parte del tejido no se cuantifica, introduciendo posiblemente grandes errores de muestreo. Además, ya que se seccionan inmediatamente ojos completos, se impide la evaluación en el mismo ojo de otro importante parámetro de este modelo, concretamente el grado de obliteración vascular y la tasa de revascularización retiniana que se produce concomitantemente con la formación de glomérulos neovasculares anómalos. Este parámetro se evalúa de la mejor manera en preparaciones microscópicas de retina completa retinianas.

En consecuencia, existe la necesidad continua de métodos mejorados para tratar enfermedades neovasculares retinianas y para evaluar la eficacia terapéutica de tales tratamientos en toda la retina. Los métodos de la presente invención satisfacen estas necesidades.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una utilización para promover la revascularización fisiológica de tejido retiniano isquémico. La utilización comprende administrar a un mamífero que sufre isquemia retiniana una cantidad terapéuticamente eficaz de un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS), inhibiendo simultáneamente de ese modo la neovascularización patológica de la retina a la vez que promoviendo la revascularización fisiológica beneficiosa de áreas dañadas de la retina. En una forma de realización preferida, el fragmento angiostático de TrpRS es el fragmento T2. Preferiblemente, el mamífero es un paciente humano que sufre isquemia retiniana.

La utilización de la presente invención es útil para el tratamiento de enfermedades oculares isquémicas y neovasculares, incluyendo retinopatías isquémicas tales como retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, y similares.

También se describe un método de identificación para identificar y evaluar la eficacia terapéutica de agentes terapéuticos potenciales para tratar enfermedades neovasculares retinianas. El método comprende exponer a un ratón neonato, preferiblemente aproximadamente 7 días, a hiperoxia durante un período de tiempo suficiente para inducir la regresión medible de la vasculatura retiniana, preferiblemente de aproximadamente 5 días, y posteriormente devolver al ratón a normoxia. Después de volver a normoxia, se administra entonces a un ojo del ratón un agente terapéutico potencial. La retina completa del ojo tratado se aísla, preferiblemente aproximadamente 5 días después de volver a la normoxia. También se aísla una retina sustancialmente completa a partir de un ojo de control procedente del mismo ratón o un ratón de la misma edad expuesto al mismo nivel de hiperoxia durante la misma cantidad de tiempo. Al ojo de control se le ha administrado preferiblemente un tampón o disolución salina en lugar del agente terapéutico potencial. Los vasos sanguíneos de las retinas tratada y de control se tiñen para la identificación y visualización fáciles.

Se adquieren imágenes micrográficas de sustancialmente toda la retina teñida para visualizar el área de obliteración vascular provocada por la hiperoxia y el área de glomérulos neovasculares prerretinianos que se forman al volver a

la normoxia. Las imágenes micrográficas se analizan entonces para evaluar el área de obliteración vascular provocada por las condiciones hiperóxicas, y para evaluar el grado de neovascularización patológica que se produce al volver a la normoxia. La eficacia de un agente terapéutico potencial se evalúa comparando el área de obliteración vascular en ojos tratados frente a ojos de control, y comparando el área de glomérulos neovasculares prerretinianos en los ojos tratados frente a los ojos de control. El grado de neovascularización patológica se evidencia por el área de la retina que muestra glomérulos neovasculares prerretinianos en ojos tratados con respecto a los ojos de control. Una disminución en el área de glomérulos neovasculares prerretinianos indica actividad angiostática, es decir, que el agente inhibe la neovascularización patológica. La evaluación de la revascularización se lleva a cabo comparando el área de obliteración vascular en ojos tratados con respecto a los ojos de control. Una reducción en el área de obliteración vascular en ojos tratados frente a los controles indica que el agente terapéutico induce revascularización fisiológica beneficiosa de las retinas dañadas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa montajes fotomicrográficos de retinas completas teñidas procedentes de ratones neonatos, que ilustran el desarrollo normal de vasculatura en el ojo de ratón a partir de una edad postnatal de 9 días (P9) a 22 días (P22). Los Paneles A, B y C ilustran la vasculatura a P9, P18 y P22, respectivamente, visualizada tiñendo con perfusión de FITC-dextrano. Los Paneles D, E y F ilustran la vasculatura a P9, P18 y P22, respectivamente, visualizada tiñendo con lectina GS.

La figura 2 representa montajes fotomicrográficos y gráficas que ilustran el desarrollo de la vasculatura retiniana en ratones neonatos expuestos a hiperoxia durante el período de P7 a P12. Los Paneles A, B y C son fotomicrografías que muestran áreas de obliteración vascular. El Panel D (gráfica superior) es una gráfica de área retiniana frente a la edad. El Panel D (gráfica inferior) es una gráfica del área de obliteración vascular frente a la edad. El Panel E es una gráfica de dispersión que muestra la correlación del área retiniana del ojo izquierdo con el área retiniana del ojo derecho. El Panel F es una gráfica de dispersión que muestra la correlación del área obliterada vascular del ojo izquierdo con el área obliterada vascular del ojo derecho. El Panel G es una gráfica de barras que muestra la baja variabilidad de observador a observador del área medida de obliteración vascular para 6 retinas diferentes aisladas a diferentes edades medida por 4 observadores diferentes según el método de identificación de la invención.

La figura 3 representa fotomicrografías y gráficas que ilustran el desarrollo de glomérulos neovasculares prerretinianos en ratones neonatos expuestos a hiperoxia durante el período de P7 a P12. Los Paneles A-F son fotomicrografías en las que el Panel A se representa para mostrar glomérulos neovasculares prerretinianos (porciones brillantes). El Panel B muestra la imagen del Panel A con los glomérulos vasculares en rojo. El Panel C muestra aquellas áreas de glomérulos neovasculares que están sólo parcialmente perfusionadas – los glomérulos conectados a la vasculatura subyacente se muestran en verde. El Panel D muestra que las células teñidas con isolectina GS son predominantemente CD31 positivas (verde), indicando estirpe vascular. El Panel E muestra que algunas células de la estirpe macrofágica (verde) están presentes entre los glomérulos neovasculares CD31 positivos. El panel G es una gráfica que muestra el área de glomérulos neovasculares como una función de la edad. El Panel H muestra una correlación del área de glomérulos neovasculares del ojo derecho frente al ojo izquierdo. El Panel I es una gráfica de barras que ilustra la baja variabilidad entre observadores a la hora de determinar el área de glomérulos neovasculares según el método de identificación de la invención. El Panel J muestra la correlación entre el área de glomérulos según se mide mediante el método de identificación de la invención frente al método de sección transversal de la técnica anterior más laborioso para medir núcleos pre-ILM.

La figura 4 representa fotomicrografías y gráficas que ilustran la cuantificación de la obliteración vascular y áreas de glomérulos neovasculares prerretinianos en ratones neonatos expuestos a hiperoxia durante el período de P7 a P12, según el método de identificación de la invención. Panel A: (imagen derecha superior) muestra el área de obliteración vascular de un ojo de ratón de control expuesto a hiperoxia según el método de identificación de la invención; (imagen central superior) muestra área de glomérulos neovasculares (rojo) para el ojo de ratón de control; (imagen izquierda superior) es una sección transversal de la retina de control que muestra núcleos pre-ILM (flechas). Panel B: (imagen derecha inferior) muestra el área de obliteración vascular de un ojo de ratón expuesto a hiperoxia y tratado con un inhibidor de iNOS según el método de identificación de la invención; (imagen central inferior) muestra área de glomérulos neovasculares (rojo) para el ojo de ratón tratado; (imagen izquierda inferior) es una sección transversal de la retina tratada que muestra núcleos pre-ILM (flechas). Panel B: (gráfica izquierda) compara área de obliteración vascular para el ojo de control frente al ojo tratado con iNOS; (gráfica central) compara área de glomérulos neovasculares para el ojo de control frente al ojo tratado con iNOS; (gráfica derecha) compara el número de núcleos pre-ILM para el ojo de control frente al ojo tratado con iNOS.

La figura 5 representa fotomicrografías y gráficas que ilustran la cuantificación de los efectos de mejora de un fragmento angiostático de TrpRS sobre la obliteración vascular y la formación de glomérulos neonatales en ratones neonatos expuestos a hiperoxia durante el período de P7 a P12, según el método de identificación de la invención. El panel A es una gráfica que compara área de glomérulos neovasculares para ojos tratados a diversas dosis con T2-TrpRS en comparación con ojos tratados con dosis similares de TrpRS de longitud

completa en el método de identificación de la invención. El Panel B es una gráfica que compara el área de obliteración vascular para ojos tratados con diversas dosis de T2-TrpRS en comparación con ojos tratados con dosis similares de TrpRS de longitud completa en el método de identificación de la invención. Los Paneles C y D ilustran el área reducida de obliteración vascular para ojos tratados con T2-TrpRS (C) frente a ojos de control inyectados con tampón de PBS (D). El Panel E ilustra la revascularización acelerada inducida por T2-TrpRS (imagen superior) frente al ojo de control (imagen inferior). El Panel F ilustra que el aptámero de VEGF provoca un retraso en la revascularización de áreas obliteradas vasculares. Los Paneles G y H son gráficas que comparan la actividad de T2-TrpRS y del aptámero de VEGF en el método de identificación de la presente invención.

La figura 6 ilustra la secuencia de restos de aminoácidos de T2-TrpRS (SEC ID nº: 1) y T2-TrpRS-GD mutante (SEC ID nº: 2).

La figura 7 ilustra la secuencia de restos de aminoácidos de mini-TrpRS (SEC ID nº: 3).

La figura 8 ilustra la secuencia de restos de aminoácidos de T1-TrpRS (SEC ID nº: 4).

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

Un método para promover la revascularización fisiológica beneficiosa de tejido retiniano isquémico comprende administrar a un mamífero que sufre isquemia retiniana una cantidad terapéuticamente eficaz de un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS), inhibiendo de ese modo simultáneamente la neovascularización patológica a la vez que promueve la revascularización fisiológica de áreas dañadas de la retina. Preferiblemente, el fragmento de TrpRS se administra mediante inyección intravítrea en el ojo.

Los fragmentos angiostáticos preferidos de TrpRS incluyen el fragmento T2 (T2-TrpRS; SEC ID nº: 1, FIG. 6), un mutante de T2-TrpRS (T2-TrpRS-GD; SEC ID nº: 2, FIG. 6), una TrpRS truncada conocida como mini-TrpRS (SEC ID nº: 3, FIG. 7) y T1-TrpRS (SEC ID nº: 4, FIG. 8). La secuencia de restos de aminoácidos de T2-TrpRS-GD (SEC ID nº: 2), difiere de SEC ID nº: 1 por las sustituciones de dos restos de aminoácidos (es decir, S121G y Y122D). Más preferiblemente, el fragmento angiostático de TrpRS es el fragmento de T2.

También se describe un método de identificación para evaluar la eficacia terapéutica de agentes terapéuticos putativos para tratar enfermedades neovasculares retinianas. Este método utiliza un modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno para estimular un estado de enfermedad retinopática en el ojo de un ratón. El método comprende exponer ratones neonatales (preferiblemente aproximadamente 7 días) a hiperoxia (por ejemplo, una atmósfera de 75% de oxígeno) durante un período de tiempo suficiente para inducir la regresión medible de la vasculatura retiniana, preferiblemente aproximadamente 5 días, y posteriormente volver el ratón a normoxia (es decir, aire normal). Después de volver a la normoxia, a un ojo de cada ratón se le administra entonces un agente terapéutico potencial. Preferiblemente, a un ojo de un ratón individual se le administra el agente terapéutico, mientras que al otro ojo se le administra un placebo, tal como una disolución salina o una disolución tampón, como control. Alternativamente, algunos ratones se pueden utilizar como controles mientras que otros se tratan con el agente terapéutico potencial. Las retinas completas de los ratones tratados y de control se aíslan, preferiblemente alrededor de 5 días después de volver a normoxia, y sus vasos sanguíneos se tiñen para la identificación fácil.

Las imágenes micrográficas de sustancialmente todas las retinas teñidas se adquieren y analizan para evaluar el área de obliteración vascular provocada por las condiciones hiperóxicas, y para evaluar el grado de neovascularización patológica que se produce al volver a la normoxia. La eficacia de un agente terapéutico potencial se evalúa comparando el área de obliteración vascular en ojos tratados frente a ojos de control, y/o comparando el área de glomérulos neovasculares prerretinianos en los ojos tratados frente a los ojos de control.

Un método de identificación preferido para identificar y evaluar la eficacia terapéutica de agentes terapéuticos potenciales para tratar enfermedades neovasculares retinianas comprende exponer un ratón neonato a hiperoxia durante un período de tiempo suficiente para inducir regresión medible de la vasculatura retiniana y devolver el ratón a normoxia. A continuación, se administra una disolución de agente terapéutico putativo a un ojo del ratón. Después de un período de hasta aproximadamente 5 días, el ratón se somete a eutanasia y sustancialmente toda la retina se retira del ojo al que se administró el agente terapéutico putativo. La vasculatura de la retina se tiñe, y sustancialmente toda la retina teñida se traslada a una imagen micrográfica para visualizar la vasculatura de la retina. A partir de la imagen, se determina al menos una de (a) el área de obliteración vascular observable en la retina teñida, y (b) el área de glomérulos neovasculares prerretinianos en la retina teñida. Subsiguientemente, se realiza una comparación de al menos uno de (i) el área de obliteración vascular observable en la retina teñida en comparación con el área de obliteración vascular observable en una retina teñida procedente de un ojo de control de un ratón expuesto a las mismas condiciones de hiperoxia pero al que no se le ha administrado el agente terapéutico putativo, y (b) el área de glomérulos neovasculares prerretinianos en la retina teñida en comparación con el área de glomérulos vasculares prerretinianos en una retina teñida procedente de un ojo de control de un ratón expuesto a las mismas condiciones de hiperoxia pero al que no se le administró el agente terapéutico putativo.

Un método de identificación preferido para identificar y evaluar la eficacia terapéutica de agentes terapéuticos potenciales para tratar enfermedades neovasculares retinianas comprende:

exponer un ratón neonato de 7 días a una atmósfera que contiene aproximadamente 75% de oxígeno durante aproximadamente 5 días (condiciones hiperóxicas);

devolver el ratón a una atmósfera de aire normal (normoxia);

administrar un agente terapéutico potencial a un ojo del ratón después de devolverlo a aire normal;

someter a eutanasia al ratón y retirar sustancialmente toda la retina del ojo al que se administró el agente terapéutico putativo;

teñir la vasculatura de la retina del ojo al que se administró el agente terapéutico putativo;

preparar al menos una imagen micrográfica de sustancialmente toda la retina teñida para visualizar su vasculatura;

determinar el área de obliteración vascular observable en la retina teñida y el área de glomérulos neovasculares prerretinianos en la retina teñida a partir de al menos una imagen micrográfica;

comparar el área de obliteración vascular observable en la retina teñida con el área de obliteración vascular observable en una retina teñida procedente de un ojo de control de un ratón expuesto a las mismas condiciones hiperóxicas, no habiéndose administrado al ojo de control el agente terapéutico putativo; y

comparar el área de glomérulos neovasculares prerretinianos en la retina teñida con el área de glomérulos vasculares prerretinianos observables en la retina teñida procedente de un ojo de control de un ratón expuesto a las mismas condiciones hiperóxicas, no habiéndose administrado al ojo de control el agente terapéutico putativo.

El grado de neovascularización patológica se evidencia en el área de la retina que muestra glomérulos neovasculares prerretinianos en ojos tratados con respecto a ojos de control visibles en la imagen micrográfica. Una disminución en el área de glomérulos neovasculares prerretinianos indica actividad angiostática, es decir, que el agente inhibe la neovascularización patológica. La evaluación de la revascularización se lleva a cabo comparando el área de obliteración vascular en retinas procedentes de ojos tratados frente a ojos de control. Una reducción en el área de obliteración vascular en retinas procedentes de ojos tratados frente a controles indica que el agente terapéutico induce revascularización fisiológica beneficiosa de retinas dañadas.

Las composiciones terapéuticas que comprenden un fragmento de TrpRS angiostático pueden incluir portadores, excipientes y vehículos farmacológicamente apropiados y farmacéuticamente aceptables. En general, estos vehículos incluyen disoluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, incluyendo medios salinos y tamponados tales como disolución salina tamponada con fosfato (PBS). Los vehículos parenterales pueden incluir disolución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactado, o aceites fijos. Además, los vehículos intravenosos pueden incluir reponedores de fluidos y nutrientes, y reponedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer. También pueden estar presentes excipientes tales como conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes. Los auxiliares, vehículos, otros excipientes de la formulación adecuados, y los métodos para formular composiciones farmacéuticas se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 14ª Ed., Mack Publishing Co., 1970, particularmente Parte VIII, “Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture”, páginas 1461 - 1762, cuyas descripciones relevantes se incorporan a la presente memoria como referencia.

Las composiciones terapéuticas se pueden envasar en botellas o viales adecuadamente esterilizados, ya sea en forma de múltiples dosis o en formas de una sola dosificación. Los recipientes se cierran preferiblemente de forma hermética después de ser llenados con una composición de la invención. Preferiblemente, las composiciones se envasan en un recipiente que presenta una etiqueta fijada al mismo, etiqueta la cual identifica los fármacos presentes en la composición, y tiene una nota en forma prescrita por una agencia gubernamental, tal como la Food and Drug Administration de los Estados Unidos de América, que refleja la aprobación de la composición bajo las leyes apropiadas, la información de la dosificación, y similar. La etiqueta contiene preferiblemente información sobre la composición que es útil para un profesional sanitario que administra la composición a un paciente. El envase también contiene preferiblemente materiales informativos impresos que se refieren a la administración de la composición, instrucciones, indicaciones, y cualesquiera advertencias requeridas necesarias.

Modelo de retinopatía inducida por oxígeno (OIR).

Todo el trabajo con animales se adhirió a directrices de protocolo estrictas para el cuidado humano y uso de animales en investigación. La OIR se indujo según el protocolo descrito por Smith et al. Invest. Opthalmol. Vis. Sci., 1994; 35:101-111. Crías de ratón de siete días y sus madres se transfirieron desde aire ambiental hasta un entorno

hiperóxico de aproximadamente 75% de oxígeno durante 5 días, y después se devolvieron a aire ambiental (normoxia). La exposición a condiciones hiperóxicas se llevó a cabo poniendo las jaulas de los animales en una incubadora de infantes humanos modificada. El oxígeno se hizo circular a través de la incubadora (usando una máquina de anestesia para animales, para controlar el caudal), y los niveles se monitorizaron y mantuvieron a 7475% usando un analizador de oxígeno aprobado por la FDA (AX-300, Teledyne Analytical Instruments, CA, USA). Durante los 5 días de hiperoxia, los animales se examinaron al menos tres veces diariamente. Se disponía de alimento y agua ilimitados para las madres durante el experimento. Después de 5 días, es decir, Día 12 (P12) posnatal, las jaulas se devolvieron al aire ambiental.

Preparación de montaje completo retiniano e inmunohistoquímica

Después de que los ratones se eutanasiaron, los ojos enucleados se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante aproximadamente 10 minutos, y las retinas se disecaron realizando un corte circular detrás del limbo, aproximadamente en la raíz del iris, y retirando entonces la parte anterior del ojo. La lente y el humor vítreo se disecaron, y la retina se separó de las capas esclerótica y coroidea, dejando a la retina en una configuración de copa de ojo. Se realizaron incisiones relajantes radiales en la retina para permitir que se achatara, y cualesquiera restos del humor vítreo o hialoide se retiraron cuidadosamente de la retina achatada.

Para angiografía de FITC-dextrano, los animales se anestesiaron mediante inyecciones intraperitoneales de ketamina HCl (Ketalar, Parke Davis, UK, 100 mg/kg) en combinación con el agente relajante Xilazina (2 mg/kg). Se inyectaron aproximadamente 300 μl de FITC-dextrano de peso molecular elevado (2 x 106 Da) (concentración 50 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO) en el ventrículo izquierdo, y se dejó circular durante aproximadamente dos minutos antes de someter a eutanasia al animal y enuclear los ojos. Para la tinción con isolectina G4, las retinas se posfijaron en paraformaldehído al 4% durante alrededor de 45 minutos, y se incubaron a temperatura ambiente toda la noche con isolectina GS-IB4 de Griffonia simplicifolia (isolectina GS), que se conjugó con Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, dilución 1:150 en disolución salina tamponada con fosfato (PBS)), para proporcionar “isolectina GS-594”. Después de 4-5 lavados con PBS durante un período de 2 horas, las retinas se montaron como preparaciones de montaje completo sobre portaobjetos con SLOW FADE (Molecular Probes), para la formación subsiguiente de imágenes.

Puesto que la isolectina GS teñirá no sólo células endoteliales vasculares sino también macrófagos murinos activados, se usaron anticuerpos policlonales específicos para el marcador endotelial CD31 (BD Biosciences-Pharmingen, dilución 1:100 en suero fetal bovino al 10% (FBS)/tampón NGS al 10%) y anticuerpos contra el marcador macrofágico F4/80 (1:150) en un subconjunto de retinas para caracterizar posteriormente las células positivas a isolectina GS. Las retinas se bloquearon con 20% de FBS, 20% de NGS en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente, y se incubaron con el anticuerpo primario e isolectina GS-594 durante toda la noche. Después de los lavados con PBS, se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 488 (Invitrogen Corporation) durante 2 horas, se lavaron, y las retinas se montaron como se describió anteriormente.

Formación de imágenes y cuantificación

Se tomaron imágenes micrográficas usando una lente de objetivo 4x con una resolución de detector de 512 x 512 píxeles. Se tuvo mucho cuidado en enfocar justo por encima de la membrana limitante interna de la retina usando microscopía confocal (BioRad), de manera que los glomérulos neovasculares prelaminares se hicieron más prominentes que el plexo vascular superficial subyacente, haciendo más fácil la cuantificación posterior de las áreas de glomérulos neovasculares. En la mayoría de los casos, se adquirieron cuatro imágenes solapantes (representando cada una un cuadrante retiniano) a partir de cada retina. Usando Adobe PHOTOSHOP® 6.0, entonces se crearon montajes usando puntos de referencia retinianos tales, como el disco óptico y vasos principales, para alinear las imágenes. Estos montajes permitieron la visualización y cuantificación de toda la retina. En unos pocos casos en los que tanto las áreas obliteradas como todas las áreas de neovascularización se localizaron cerca del centro de la retina, se adquirieron imágenes 4x individuales centradas en el disco óptico. Aunque la retina periférica no está incluida en su totalidad en tales imágenes, los cambios relevantes inducidos por OIR se pueden observar completamente en estos casos. Cada imagen individual se convirtió en un tamaño de 2 x 2 pulgadas con una resolución de 300 píxeles por pulgada antes de crear el montaje y cuantificar las áreas de obliteración y de glomérulos neovasculares.

Después de que se generaron las imágenes y se crearon los montajes retinianos, se cuantificaron la obliteración vascular y formaciones neovasculares anormales por individuos en un protocolo a ciegas para evitar el sesgo, y las retinas reales se visualizaron con el microscopio, siempre que fue necesario, para ayudar a determinar las áreas reales de obliteración y glomérulos neovasculares en las imágenes. Para medir las áreas de obliteración vascular, se usó la herramienta de selección Adobe PHOTOSHOP® freehand. Se trazaron los bordes de las áreas avasculares, y se computó el área total de obliteración en píxeles. También se llevó a cabo la medida de las áreas de glomérulos neovasculares en la configuración de montaje retiniano completo, y se basó en la mayor intensidad de tinción con isolectina en estas regiones, su aspecto característico, y las imágenes creadas enfocando por encima de la membrana limitante interna de la retina. Los glomérulos neovasculares se seleccionaron específicamente a mano usando la herramienta Magic Wand en el software de Adobe PHOTOSHOP®. Entonces se determinó el área total en

píxeles. Una vez que se midieron las áreas en píxeles, se aplicó un factor de conversión, que para nuestros parámetros se calculó que era 27,8 μm2 por píxel, y se derivaron las áreas absolutas (en μm2). Este factor de conversión se computó basándose en la adquisición de imágenes (lente de 4x de aumento) y en parámetros de ensamblaje del montaje, tales como tamaño (2 x 2 pulgadas) y resolución (300 píxeles por pulgada) al importar y crear los montajes en el software de Adobe PHOTOSHOP®.

Secciones transversales retinianas y recuento de núcleos pre-ILM

En un subconjunto de seis ojos, tras la cuantificación en la configuración de montaje completo, las retinas se retiraron de los portaobjetos y se procesaron para el seccionamiento transversal y el recuento de núcleos pre-ILM. Después de la fijación adicional en PFA al 4%, las retinas se embebieron en parafina y se seccionaron en serie en su totalidad. Se llevó a cabo una tinción estándar con H&E, y se contaron todos los núcleos presentes en el lado vítreo de la ILM. Se computó el número promedio de núcleos por sección. En un conjunto adicional de ojos tratados con un inhibidor de iNOS (descrito a continuación), se embebieron ojos completos en parafina, se seccionaron de forma transversal, se tiñeron con H&E, y se contó una muestra de secciones transversales como se describe previamente por Smith et al. Se identificó el nervio óptico, y 2-4 secciones en cada lado del mismo, separadas 30 a 90 μm, se contaron para determinar la neovascularización.

Inyección de compuestos angiostáticos

Se realizaron inyecciones intravítreas a P12 (al volver a la normoxia) para los tratamientos de una sola inyección, o a P13 y P16 para los tratamientos con doble inyección. En cada caso, se inyectaron volúmenes de 0,5 μl de la disolución apropiada (control de PBS, disoluciones de PBS que contienen agente terapéutico individual, o disoluciones de PBS que contienen terapias de combinación) usando una jeringuilla de Hamilton provista de una aguja de calibre 33. Las inyecciones se realizaron entre el ecuador y el limbo córneo. Durante la inyección, la localización de la aguja se visualizó a través de un microscopio de disección para asegurar que estaba en la cavidad vítrea, y de este modo minimizar la posibilidad de daño retiniano o de la lente. Tras la inyección, se recolocaron los párpados para cerrar la fisura.

Resultados

El proceso normal de desarrollo vascular retiniano posnatal en el ratón está bien caracterizado, e incluye crecimiento centrípeto de vasos superficiales que emergen del disco óptico en el nacimiento y que alcanzan la periferia lejana de la retina aproximadamente 9-11 días después. Cerca del final de la primera semana después del nacimiento, los vasos cortos comienzan a sumergirse desde esta red superficial para formar la red vascular profunda, que habitualmente está terminada en alrededor de P11-12. Después, se forma una capa final intermedia de vasos (IL). El proceso va acompañado de ondas de remodelación y poda, y está totalmente terminado en alrededor de P21-23. En ratones C57B16/J neonatos, la exposición a niveles elevados de oxígeno altera significativamente esta secuencia ordenada de sucesos. Tras la exposición a oxígeno al 75% entre P7 y P12, grandes áreas de la red vascular vuelven hacia el centro de la retina (obliteración vascular), dejando sólo los vasos principales y prácticamente ninguna red capilar. Esto se puede observar en preparaciones de montaje completo tanto perfusionadas con dextrano (Figura 1, Panel A) como teñidas con isolectina (Figura 1, Panel D) de un ojo P9. Los macrófagos positivos a isolectina también estaban presentes en el área de obliteración vascular (Figura 1, Panel D, y también Figura 2, Panel C). La retina periférica todavía muestra signos de una red vascular compuesta principalmente de vasos superficiales (Figura 2, Panel C). Al volver a normoxia a P12, un estado relativo de isquemia en la retina pobremente vascularizada provoca un recrecimiento de vasos superficiales desde la periferia hacia dentro, acompañado de un brote vascular en la retina para formar la capa vascular profunda, y también un brote anormal en la interfaz entre la retina y el humor vítreo (glomérulos vasculares prerretinianos). Hacia alrededor de P18, las áreas de obliteración vascular son más pequeñas, extendiéndose alrededor del disco óptico y a lo largo de las arterias retinianas principales (Figura 1, Panel B y E), y los glomérulos prerretinianos son evidentes como regiones positivas a lectina, teñidas brillantemente (Figura 1, Panel E, Figura 3, Panel A). Es importante señalar que tras la perfusión de los vasos retinianos con un colorante fluorescente (en este caso, dextrano FITC), las áreas de obliteración vascular están claramente delineadas, pero los glomérulos no se pueden identificar fácilmente (compárese la figura 1, Panel B con el Panel E). Hacia alrededor de P22-23, la retina está habitualmente muy revascularizada (Figura 1, Panel C y Panel F), y los glomérulos están casi completamente resueltos aunque pueden pasar más días antes de que asuma un aspecto completamente normal.

Ejemplo 1. Cuantificando áreas de obliteración vascular y velocidad de revascularización retiniana.

A fin de cuantificar la obliteración vascular y la velocidad de revascularización retiniana, se transformaron en imágenes preparaciones de montaje completo retinianas teñidas con isolectina o inyectadas con dextrano, usando microscopía fluorescente a un aumento bajo. Se usaron cuatro imágenes solapantes para construir un montaje de la retina (Figura 2, Panel A), y se midió el área de obliteración (amarillo) así como el área retiniana total (línea azul) usando programas de procesamiento de imágenes computerizados fácilmente disponibles (Figura 2, Panel B). Puesto que el borde entre la retina vascular y avascular está habitualmente bien definido en estas preparaciones, la variabilidad entre observadores fue muy baja (Figura 2, Panel G). Se tuvo cuidado de no incluir en el análisis áreas

en las que estaba presente una disección o artefacto de montaje. Los cambios en el área retiniana total a lo largo del tiempo se muestran en el panel superior de la figura 2, Panel D. El crecimiento retiniano continúa aparentemente durante la hiperoxia, y el área retiniana total crece aproximadamente 20% entre P8 y P13. Más tarde, la velocidad de cambio disminuye. El transcurso de tiempo de la obliteración de los vasos y la revascularización (Figura 2, Panel D, gráfica inferior) muestra que la obliteración se produce bastante rápidamente tras la exposición a hiperoxia a P7, y ocupa aproximadamente 30-35% del área retiniana total entre P8-P12. La revascularización tras la vuelta a la normoxia se produce a una velocidad más lenta, comenzando la neovascularización extensiva alrededor de P16, cuatro días después de volver a normoxia. El proceso es bastante simétrico, como se muestra por el grado elevado de correlación entre ojos similares (es decir, ojos del mismo animal) en términos de área retiniana total (Figura 2, Panel E), y especialmente en el grado de obliteración vascular (Figura 2, Panel F). Preferiblemente, se usaron controles de ojos similares en la práctica de los métodos de la presente invención.

Ejemplo 2. Cuantificando el grado de neovascularización anormal.

Entre P15 y P22, y particularmente de P17-P19, el crecimiento vascular anormal se produce en la interfaz entre la retina y el humor vítreo en el modelo de OIR de ratón. Estos glomérulos vasculares prerretinianos son especialmente obvios en el borde entre las regiones periférica vascularizada y central obliterada de la retina. Estos elementos vasculares mal dirigidos se han cuantificado clásicamente en secciones transversales embebidas en parafina, teñidas con H&E, contando núcleos de células que sobresalen hacia el lado vítreo de la membrana limitante interna (ILM). Sin embargo, estas áreas también se pueden observar de forma bastante clara en imágenes de montajes completos teñidas con isolectina, como colecciones de células que se superponen a la red vascular superficial (Figura 1, Panel E, Figura 3, Panel A). Usando una herramienta de umbral de intensidad (disponible en un gran número de programas comerciales de análisis de imágenes), o el software de Adobe PHOTOSHOP® para seleccionar a mano las regiones de formación de glomérulos prerretinianos, se puede medir fácilmente el área de estas regiones positivas a isolectina que se tiñen fuertemente (Figura 3, Panel B, áreas neovasculares marcadas en rojo). La microscopía confocal ayuda a aclarar la localización de estas células, así como su relación con los vasos sanguíneos retinianos subyacentes (Figura 3, Panel C). Obsérvese que estas áreas de proliferación están sólo parcialmente perfundidas, como se puede observar por las manchas verdes de dextrano-FITC inyectado intravenosamente en ellas (Figura 3, Panel C). Este nivel limitado de perfusión excluye el uso de angiografía de dextrano-FITC para visualizar adecuadamente y cuantificar los glomérulos. Los marcadores específicos de células muestran que la mayoría de las células positivas a isolectina en los glomérulos expresan el marcador endotelilal CD31, confirmando su identidad vascular (Figura 3, Panel D). De forma interesante, también están presentes células de la estirpe macrofágica en las aglomeraciones, como se muestra mediante la inmunotinción con F4/80 (Figura 3, Panel E).

En la figura 3, Panel G, se muestra el grado y transcurso de tiempo de la vascularización anormal. Entre P16-P20, aproximadamente 12-16% del área retiniana total está cubierta por glomérulos neovasculares, llegando a un máximo en P17. Es importante señalar que la remodelación continua y rápida de estos glomérulos se produce entre P15-P22. Después de la revascularización retiniana, que transcurre concomitantemente con la remodelación, también se resuelven las áreas remodeladas. Los grupos de células relativamente grandes, sobresalientes (por ciento 3, Panel A-E) se recortan hasta filas de células positivas a isolectina, que generalmente siguen a los vasos retinianos (Figura 3, Panel F) y finalmente desaparecen entre P22-P25 (Figura 1, Panel F).

Aunque la correlación entre ojos similares, en términos de formación de glomérulos, no es tan buena como la observada para obliteración vascular, es no obstante un proceso muy simétrico (Figura 3, Panel H). La variabilidad entre observadores fue nuevamente baja, independientemente del punto de tiempo estudiado y el grado de formación de glomérulos aparente (Figura 3, Panel I), atestiguando la consistencia relativa y claridad del método de cuantificación de la presente invención. Finalmente, a fin de examinar si las áreas neovasculares medidas en montajes completos se correlacionan con recuentos de núcleos pre-ILM (es decir, prerretinianos) en secciones transversales, se embebió en parafina un número de retinas montadas completas previamente cuantificadas, se seccionaron de forma cruzada, y se contaron los núcleos pre-ILM en todas las secciones. La figura 2, Panel J, muestra las relaciones de área de glomerulización y de recuentos de núcleos en cada uno de 6 ojos diferentes, normalizadas al promedio de cada parámetro. Es evidente que estos dos métodos de cuantificación están generalmente de acuerdo (es decir, un ojo con un área de glomérulos más grande tiende también a tener un recuento mayor de núcleos, y viceversa). El protocolo de cuantificación del presente método tiene ventajas con respecto al método de recuento de sección transversal, sin embargo, por cuanto la retina completa se evalúa de una vez.

Ejemplo 3. Efecto antiangiogénico de un inhibidor de iNOS.

La utilidad de la técnica de cuantificación de la presente invención se evaluó y comparó adicionalmente con el método de la técnica anterior de recuento de núcleos pre-ILM examinando el efecto de un nuevo agente antiangiogénico, un inhibidor de iNOS, sobre la revascularización retiniana y angiostasia. El inhibidor (o disolución salina de control) se suministró entre P12-P17 mediante inyecciones intraperitoneales una vez al día en los ojos de los ratones, y a P17 los ojos se enuclearon y se procesaron para la cuantificación mediante una de las dos técnicas. La figura 4, Panel A, muestra preparaciones de montaje completo y sección transversal de retinas de ratones de

control P17 (fila superior) y animales tratados con el inhibidor de iNOS (fila inferior). Las áreas de obliteración vascular se delinearon en los paneles izquierdos (líneas azules), las áreas de glomérulos neovasculares se marcaron en los mismos montajes completos en los paneles del centro (rojo), y los ejemplos de núcleos pre-ILM se muestran en las secciones transversales a la derecha (flechas). La inyección del inhibidor de iNOS redujo el área de obliteración vascular en alrededor de 28% en comparación con los controles (Figura 4, Panel B, barras a la izquierda). El área de glomérulos neovasculares, según se cuantifican a partir de montajes completos, se redujo en aproximadamente 30% (barras del centro), lo que es similar a la magnitud del efecto observado cuando se contaron núcleos pre-ILM en secciones transversales de (es decir, aproximadamente 36%, gráfica en la parte derecha inferior).

Ejemplo 4. T2-TrpRS inhibe potentemente la formación de glomérulos neovasculares en el modelo de OIR.

El T2-TrpRS es un fragmento proteolítico de la triptófano ARNt sintetasa (TrpRS) que ha demostrado un potencial angiostático importante en varios modelos de angiogénesis, incluyendo el modelo de Matrigel de ratón y el modelo de angiogénesis retiniana de ratón neonato. El método de la presente invención se usó para ensayar la actividad de T2-TrpRS sobre neovascularización patológica en el modelo de OIR de ratón. Usando el presente método de cuantificación, también se evaluaron los efectos de la inyección T2-TrpRS sobre la revascularización del plexo retiniano superficial tras la obliteración vascular inducida por oxígeno. Cuando se inyectó de forma intravítrea a P12, justo en el momento en los ratones se devolvieron desde hiperoxia (75% de O2) a normoxia, T2-TrpRS redujo notablemente el área de formación de glomérulos neovasculares a P17 de una manera dependiente de la dosis (Figura 5). La triptófano ARNt sintetasa de longitud completa (FL-TrpRS) también demostró cierta actividad a la dosis más elevada, pero se observaron niveles significativamente menores de inhibición en comparación con inyecciones equivalentes de T2-TrpRS. Puesto que se encontró previamente que FL-TrpRS no tiene actividad angiostática en otros modelos de angiogénesis, es posible que la actividad observada resulte de la escisión natural de la FL-TrpRS hasta un producto similar a T2-TrpRS tras la inyección in vivo.

Las áreas obliteradas también se cuantificaron en retinas de control y tratadas con T2-TrpRS, para analizar los efectos sobre la revascularización fisiológica de la retina tras la obliteración inducida por oxígeno (Figura 5, Panel B). Aunque T2-TrpRS inhibió potentemente la formación de glomérulos neovasculares, no se inhibió la revascularización de los plexos vasculares retinianos superficiales y profundos normales. De hecho, las retinas inyectadas con T2-TrpRS mostraron consistentemente una revascularización significativamente potenciada, incluso a dosis más bajas. En retinas inyectadas con T2-TrpRS, las áreas obliteradas a P17 se redujeron consistentemente en alrededor de 40% en comparación con las áreas obliteradas en retinas inyectadas con control de PBS a P17 (Figura 5, Panel B). Las áreas obliteradas en el momento de la inyección (P12) fueron aproximadamente iguales (datos no representados). De este modo, la reducción significativa e inesperada en el área de obliteración a P17 sugiere una nueva actividad para T2-TrpRS promoviendo la revascularización fisiológica mientras que inhibe simultáneamente la neovascularización patológica. Tras la inyección de 1,25 mg/ojo de T2-TrpRS de T2-TrpRS, la morfología vascular de la retina pareció casi normal, especialmente en comparación con retinas OIR normales o inyectadas de control (Figura 5, Panel C-E). Incluso a P22, cuando los glomérulos neovasculares se han invertido de forma natural y la retina se está curando, los neovasos en retinas OIR de control parecieron gravemente anormales en comparación con retinas inyectadas con T2-TrpRS a P17 (Figura 5, Panel E). Las retinas inyectadas con FL-TrpRS también demostraron una potenciación significativa del proceso de revascularización, pero solamente a las dosis más elevadas.

La actividad de T2-TrpRS en el modelo de OIR se comparó directamente con la de un aptámero de VEGF que ha demostrado propiedades como antagonista de la actividad de VEGF165, y ha demostrado una inhibición potente de la formación de glomérulos neovasculares inducida por OIR. Ambas moléculas angiostáticas fueron potentes inhibidores de la formación de glomérulos neovasculares. Los ojos inyectados con 1,25 mg/ojo de T2-TrpRS mostraron una reducción ligera pero significativa en las áreas de glomérulos neovasculares en comparación con las retinas tratadas con el aptámero de VEGF. De este modo, incluso tras la inyección de concentraciones molares de 10 veces por debajo del aptámero, T2-TrpRS mostró una actividad inhibidora muy competitiva sobre la formación de glomérulos neovasculares en el modelo de OIR. A diferencia de T2-TrpRS, el aptámero de VEGF no potenció la revascularización del plexo superficial. De hecho, aunque el aptámero de VEGF no evitó que se produjese la revascularización fisiológica, la revascularización se retrasó consistentemente en comparación con retinas inyectadas con vehículo de control (PBS) (Figura 5, Panel F-G). Este retraso en el proceso de revascularización para ojos tratados con el aptámero de VEGF fue incluso más obvio a P19 después de dos inyecciones distintas de dosis más bajas (Figura 5, Panel H).

Discusión.

El método actualmente aceptado para cuantificar la neovascularización anormal en el modelo de OIR se basa en el recuento de núcleos prelaminares en secciones transversales histológicas del ojo embebidas en parafina y teñidas con H&E. Este método es muy laborioso, consume tiempo, es bastante variable y depende del observador, y también evita la cuantificación exacta del grado de obliteración vascular en el mismo ojo, puesto que no se generan montajes completos retinianos. Aunque se ha dado a conocer previamente el análisis de áreas avasculares usando análisis de montajes completos, el método de la presente invención es el primer método de identificación que se

puede usar para cuantificar las áreas absolutas de formación de glomérulos neovasculares y obliteración en el análisis del mismo ojo. El presente método usa métodos de corte de tejidos y tinción habituales y programas de ordenador fácilmente disponibles, haciéndolo fácilmente un patrón con una baja variabilidad entre observadores. Además, este nuevo método también tiene la ventaja de reducir el error de muestreo, puesto que se cuantifican retinas completas en lugar de un número limitado de secciones. La diferenciación de núcleos vítreos asociados con el sistema hialoide de aquellos asociados con glomérulos neovasculares también puede ser difícil en los métodos de sección transversal de la técnica anterior, particularmente en el modelo de OIR, en el que se produce persistencia del sistema hialoide. En el presente método, los vasos hialoidales se eliminan generalmente durante la disección, y cualesquiera restos que permanezcan se identifican fácilmente y se omiten del análisis.

El presente método de identificación se usó para evaluar la actividad angiostática de T2-TrpRS en el modelo de OIR de angiogénesis patológica. Se observó un fuerte efecto angiostático de T2-TrpRS, dependiente de la dosis, sobre la neovascularización patológica en el modelo de OIR. La inyección de aproximadamente 1,25 μg/ojo de T2-TrpRS condujo a una inhibición casi completa de la formación de glomérulos neovasculares. Estos efectos observados fueron comparables, si no superiores a, aquél de un aptámero de VEGF, otro inhibidor potente de la neovascularización patológica en el modelo de OIR. Los efectos a largo plazo sobre la neovascularización asociada a OIR se evaluaron analizando la neovascularización retiniana en P19, después de dos inyecciones de inhibidores de dosis más baja. T2-TrpRS inhibió la neovascularización patológica y redujo la formación de glomérulos en aproximadamente 75% en comparación con una reducción del 55% después del tratamiento con el aptámero de VEGF (0,5 mg/ojo/inyección, 53,9 picomoles).

Sorprendentemente, T2-TrpRS también potenció el proceso de revascularización fisiológica beneficioso tras la retinopatía inducida por oxígeno. Aunque las áreas de obliteración fueron equivalentes en el momento de la inyección, las áreas obliteradas en retinas tratadas con T2-TrpRS se redujeron consistentemente a la mitad en comparación con las retinas de control. En consecuencia, el tratamiento con T2-TrpRS conduce a una curación retiniana sorprendentemente rápida y más completa, y una vasculatura resultante que se asemeja anatómicamente mucho más a una vasculatura retiniana normal.

Listado de secuencias

<110> THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE

<120> REVASCULARIZACIÓN DE TEJIDO RETINIANO ISQUÉMICO

<130> 18-215 T1

<140> EP

<141> 2006-02-24

<150> 60/655,732

<151> 2005-02-24

<160> 4

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

<210> 1

<211> 378

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2 5 <211> 378

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2 10

<210> 3

<211> 423

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 401

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Utilización de un fragmento angiostático de triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS) para la preparación de una composición farmacéutica para promover la revascularización fisiológica beneficiosa de tejido retiniano isquémico,

   5 en la que la composición farmacéutica está destinada a administrar a un mamífero que sufre isquemia retiniana una cantidad terapéuticamente eficaz de un fragmento angiostático de TrpRS suficiente para inhibir la neovascularización patológica y promover la revascularización fisiológica de las zonas isquémicas de la retina.

2. 2.

   Utilización según la reivindicación 1, en la que el fragmento angiostático de TrpRS es T2-TrpRS (SEC ID nº: 1). 10

3. 3. Utilización según la reivindicación 1, en la que el fragmento angiostático de TrpRS es T2-TrpRS-GD (SEC ID nº: 2).

4. 4.

   Utilización según la reivindicación 1, en la que el fragmento angiostático de TrpRS es mini-TrpRS (SEC ID nº: 3). 15

5. 5. Utilización según la reivindicación 1, en la que el fragmento angiostático de TrpRS es T1-TrpRS (SEC ID nº: 4).