ES2468265T3

ES2468265T3 - Anticuerpos biespec�ficos bivalentes

Info

Publication number: ES2468265T3
Application number: ES08864000.8T
Authority: ES
Inventors: Christian Klein; Wolfgang Schaefer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-16
Publication date: 2014-06-16
Anticipated expiration: 2028-12-16
Also published as: AR069776A1; MX2010005888A; RU2010129539A; CN101896504A; EP2231709A1; IL205285A0; CA2709345A1; BRPI0821375B8; WO2009080251A1; US20090232811A1; RU2547615C2; CL2008003779A1; BRPI0821375A2; CN101896504B; CA2709345C; EP2231709B1; BRPI0821375B1; JP2011506509A; KR101265912B1; PE20091340A1

Abstract

Anticuerpo biespecífico bivalente, que comprende: a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y en el que los dominios constantes CL y CH se sustituyen uno por otro.

Description

Anticuerpos biespec�ficos bivalentes

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos biespec�ficos bivalentes, a su preparación y a su utilización.

Antecedentes de la invención

Las proteínas manipuladas, tales como los anticuerpos biespec�ficos o multiespec�ficos capaces de unirse a dos o más ant�genos, son conocidas de la técnica. Estas proteínas de unión multiespec�ficas pueden generarse mediante fusión celular, conjugación química o técnicas de ADN recombinante.

Recientemente se ha desarrollado una amplia diversidad de formatos de anticuerpo biespec�fico recombinante, por ejemplo anticuerpos biespec�ficos tetravalentes mediante fusión de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios de cadena sencilla (ver, por ejemplo, Coloma M.J. et al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997; documento WO n� 2001/077342, y Morrison S.L., Nature Biotech. 25:1233-1234, 2007).

Tambi�n se han desarrollado otros formatos nuevos en los que la estructura del núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) ya no se encuentra retenida, tales como diacuerpos, triacuerpos o tetracuerpos, minicuerpos, varios formatos de una sola cadena (scFv, bis-scFv), que son capaces de unirse a dos o más ant�genos (Holliger P. et al., Nature Biotech. 23:1126-1136, 2005; Fischer N. y L�ger O., Pathobiology 74:3-14, 2007; Shen J. et al., J. Immunol. Methods 318:65-74, 2007; Wu C. et al., Nature Biotech. 25:1290-1297, 2007).

La totalidad de dichos formatos utiliza conectores, para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a una proteína adicional de unión (por ejemplo scFv) o para fusionar, por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv (Fischer N. y L�ger O., Pathobiology 74:3-14, 2007). Aunque resulta evidente que los conectores presentan ventajas para la manipulación de los anticuerpos biespec�ficos, también pueden provocar problemas en contextos terapéuticos. En efecto, estos p�ptidos foráneos podrían inducir una respuesta inmunol�gica contra el conector mismo o contra la unión entre la proteína y el conector. Además, la naturaleza flexible de estos p�ptidos provoca que presenten una mayor tendencia al corte proteol�tico, potencialmente conduciendo a una pobre estabilidad del anticuerpo, a agregación y a una inmunogenicidad incrementada. Además, puede resultar deseable conservar funciones efectoras, tales como, por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), que se encuentran mediadas por la parte Fc, mediante el mantenimiento de un elevado grado de similitud a anticuerpos naturales. De esta manera, idealmente, el objetivo debe ser el desarrollo de anticuerpos biespec�ficos que presentan una estructura general muy similar a los anticuerpos naturales (por ejemplo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM), con diferencias mínimas respecto a las secuencias humanas.

En un enfoque, se han producido anticuerpos biespec�ficos que son muy similares a los anticuerpos naturales, utilizando la tecnología del cuadroma (ver Milstein C. y Cuello A.C., Nature 305:537-40, 1983), basada en la fusión somática de dos líneas celulares de hibridoma diferentes que expresan anticuerpos monoclonales murinos con las especificidades deseadas del anticuerpo biespec�fico. Debido al apareamiento aleatorio de las cadenas pesada y ligera de dos anticuerpos diferentes dentro de la línea celular de hibridoma (o cuadroma) híbrido resultante, se generan hasta diez especies diferentes de anticuerpo de entre las que únicamente una es el anticuerpo biespec�fico funcional deseado. Debido a la presencia de productos secundarios incorrectamente apareados, y rendimientos de producción significativamente reducidos, resultan necesarios procedimientos sofisticados de purificación (ver, por ejemplo, Morrison S.L., Nature Biotech. 25:1233-1234, 2007). En general, se mantiene el mismo problema de productos secundarios mal apareados en el caso de que se utilicen técnicas de expresión recombinante.

Un enfoque para evitar el problema de los productos secundarios mal apareados, que se conoce como “bot�n en ojal”, pretende forzar el apareamiento de dos cadenas pesadas de anticuerpos diferentes mediante la introducción de mutaciones en los dominios CH3 para modificar la interfaz de contacto. En una cadena se sustituyen amino�cidos voluminosos por amino�cidos con cadenas laterales cortas, para crear un “ojal”. A la inversa, se introducen amino�cidos con cadenas laterales grandes en el otro dominio CH3, para crear un “bot�n”. Mediante la coexpresi�n de estas dos cadenas pesadas (y dos cadenas ligeras idénticas, que deben ser las apropiadas para ambas cadenas pesadas), se han observado altos rendimientos de formación de heterod�meros (“bot�n-ojal”) frente a la formación de homod�meros (“ojal-ojal” o “bot�n-bot�n”) (Ridgway J.B., Protein Eng. 9:617-621, 1996, y documento WO n� 96/027011). El porcentaje de heterod�meros podría incrementarse adicionalmente mediante el remodelaje de las superficies de interacción de los dominios CH3 utilizando un enfoque de expresión f�gica y la introducción de un puente disulfuro para estabilizar los heterod�meros (Merchant A.M. et al., Nature Biotech. 16:677681, 1998; Atwell S. et al., J. Mol. Biol. 270:26-35, 1997). Se describen nuevos enfoques para la tecnología de bot�n-en-ojal en, por ejemplo, el documento EP n� 1870459A1. Aunque este formato aparentemente resulta muy atractivo, en la actualidad no se dispone de datos que describan la progresión hacia el uso cl�nico. Una importante

limitaci�n de esta estrategia es que las cadenas ligeras de los dos anticuerpos parentales deben ser idénticas para evitar el apareamiento incorrecto y la formación de moléculas inactivas. De esta manera, esta técnica no resulta apropiada para el desarrollo sencillo de anticuerpos biespec�ficos bivalentes recombinantes contra dos ant�genos partiendo de dos anticuerpos contra el primer y segundo ant�genos, debido a que las cadenas pesadas de estos

5 anticuerpos y/o las cadenas ligeras idénticas deben optimizarse.

El documento WO n� 2006/093794 se refiere a composiciones de unión a proteína heterodim�rica. El documento WO n� 99/37791 describe derivados de anticuerpos con múltiples fines. Morrison et al., J. Immunolog. 160:28022808, 1998, se refieren a la influencia del intercambio de dominios de la región variable sobre las propiedades

10 funcionales de IgG.

Descripci�n resumida de la invención

La invención se refiere a un anticuerpo biespec�fico bivalente, que comprende:

a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno, y

b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo ant�geno,

20 en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, yen el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro.

Una realización adicional de la invención es un método para la preparación de un anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención, que comprende las etapas de:

a) transformar una célula huésped con

-: vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno, y

-: vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo ant�geno,

en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, yen el que los dominios constantes CL y 35 CH1 se sustituyen uno por otro.

b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpo, y

c) recuperar dicha molécula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.

Una realización adicional de la invención es una célula huésped que comprende:

en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, yen el que los dominios constantes CL y 50 CH1 se sustituyen uno por otro.

Una realización adicional de la invención es una composición, preferentemente una composición farmacéutica o diagnóstica del anticuerpo según la invención.

55 Una realización adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención y por lo menos un excipiente farmac�uticamente aceptable.

Una realización adicional de la invención es un método destinado al tratamiento de un paciente que necesita de terapia, caracterizado por la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo 60 según la invención.

Descripci�n detallada de la invención

en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, yen el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro.

Por lo tanto, dicho anticuerpo biespec�fico bivalente comprende:

a) una primera cadena ligera y una primera cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno, y b) una segunda cadena ligera y una segunda cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo ant�geno,

en el que los dominios variables VL y VH de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se sustituyen uno por otro, y en el que los dominios constantes CL y CH1 de la segunda cadena ligera y la segunda cadena pesada se sustituyen uno por otro.

De esta manera, para dicho anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, se aplica lo siguiente: dentro de la cadena ligera:

el dominio VL de cadena ligera variable se sustituye por el dominio variable de cadena pesada VH de dicho anticuerpo, y el dominio constante de cadena ligera CL se sustituye por el dominio constante de cadena pesada CH1 de dicho anticuerpo;

y dentro de la cadena pesada:

el dominio variable de cadena pesada VH se sustituye por el dominio variable de cadena ligera VL de dicho anticuerpo, y el dominio constante de cadena pesada CH1 se sustituye por el dominio constante de cadena ligera CL de dicho anticuerpo.

El término "anticuerpo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a anticuerpos monoclonales completos. Dichos anticuerpos completos consisten de dos parejas de una "cadena ligera" (CL) y una "cadena pesada" (CP) (dichas parejas de cadena ligera (CL)/cadena pesada se abrevian en la presente memoria como CL/CP). Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas de dichos anticuerpos son polip�ptidos que consisten de varios dominios. En un anticuerpo completo, cada cadena pesada coprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente memoria como CPRV o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende los dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2 y CH3 (clases de anticuerpo IgA, IgD e IgG) y opcionalmente el dominio constante de cadena pesada CH4( clases de anticuerpo IgE e IgM). Cada cadena ligera comprende un dominio variable de cadena ligera VL y un dominio constante de cadena ligera CL. La estructura de un anticuerpo completo natural, el anticuerpo IgG, se muestra en, por ejemplo, Fig. 1. Los dominios variables VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas por regiones que se encuentran más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL est� compuesto de tres CDR y cuatro FR, dispuestos de extremo amino-terminal a extremo carboxi-terminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (Janeway C.A. Jr. et al., Immunobiology, 5a ed., Garland Publishing, 2001; y Woof J, Burton D Nat Rev Immunol 4:89-99, 2004). Las dos parejas de cadena pesada y cadena ligera (CP/CL) son capaces de unirse específicamente al mismo ant�geno. De esta manera, dicho anticuerpo completo es un anticuerpo monoespec�fico bivalente. Entre dichos "anticuerpos" se incluyen, por ejemplo, anticuerpos de ratón, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos genéticamente manipulados (anticuerpos variantes o mutantes), con la condición de que se conserven sus propiedades características. Resultan especialmente preferentes los anticuerpos humanos o humanizados, especialmente en forma de anticuerpos humanos o humanizados recombinantes.

Existen cinco tipos de cadenas pesadas de anticuerpo de mamífero indicados por las letras griegas: a, 5, E, Y y m (Janeway C.A. Jr., et al., Immunobiology, 5a ed., Garland Publishing, 2001). El tipo de cadena pesada presente define la clase del anticuerpo; estas cadenas se encuentran en los anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente (Rhoades R.A., Pflanzer R.G., Human Physiology, 4a ed., Thomson Learning, 2002). Las diferentes

cadenas pesadas difieren en su tamaño y composición; a y Y contienen aproximadamente 450 amino�cidos, mientras que m y E presentan aproximadamente 550 amino�cidos.

Cada cadena pesada presenta dos regiones: la región constante y la región variable. La región constante es idéntica en todos los anticuerpos del mismo isotipo, aunque difiere en anticuerpos de isotipo diferente. Las cadenas pesadas Y, a y 5 presentan una región constante compuesta de tres dominios constantes, CH1, CH2 y CH3 (en una línea) y una región bisagra para una flexibilidad adicional (Woof J., Burton D., Nat. Rev. Immunol. 4:89-99, 2004); las cadenas pesadas m y E presentan una región constante compuesta de cuatro dominios constantes: CH1, CH2, CH3 y CH4 (Janeway C.A. Jr. et al., Immunobiology, 5a ed., Garland Publishing, 2001). La región variable de la cadena pesada difiere en los anticuerpos producidos por diferentes células B, aunque es la misma para todos los anticuerpos producidos por una célula B individual o clon de células B. La región variable de cada cadena pesada presenta una longitud aproximada de 110 amino�cidos y est� compuesta de un único dominio de anticuerpo.

En mamíferos existen únicamente dos tipos de cadena ligera, denominados lambda (A) y kappa (K). Una cadena ligera presenta dos dominios sucesivos: un dominio constante, CL, y un dominio variable, VL. La longitud aproximada de una cadena ligera es de 211 a 217 amino�cidos. Preferentemente, la cadena ligera es una cadena ligera kappa (K) y el dominio constante, CL, preferentemente es C kappa (K).

Las expresiones “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición de amino�cidos.

Los "anticuerpos" según la invención pueden ser de cualquier clase (por ejemplo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, preferentemente IgG o IgE) o subclase (por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2, preferentemente IgG1), en la que ambos anticuerpos, a partir de los que se deriva el anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención, presentan una parte Fc de la misma subclase (por ejemplo IgG1, IgG4 y similar, preferentemente IgG1), preferentemente del mismo alotipo (por ejemplo cauc�sico).

Una “parte Fc de un anticuerpo” es una expresión bien conocida por el experto en la materia y definida basándose en el corte con papa�na de los anticuerpos. Los anticuerpos según la invención contienen una parte Fc, preferentemente una parte Fc derivada de origen humano y preferentemente todas las demás partes de las regiones constantes humanas. La parte Fc de un anticuerpo participa directamente en la activación del complemento, la unión de C1q, la activación de C3 y la unión de receptores de Fc. Aunque la influencia de un anticuerpo sobre el sistema del complemento depende de determinadas condiciones, la unión a C1q est� cauada por sitios de unión definidos en la parte Fc. Dichos sitios de unión son conocidos de la técnica y han sido descritos, por ejemplo, por Lukas T.J. et al., J. Immunol. 127:2555-2560, 1981; Brunhouse R. y Cebra J.J., Mol. Immunol. 16:907-917, 1979; Burton D.R. et al., Nature 288:338-344, 1980; Thommesen J.E. et al., Mol. Immunol. 37:995-1004, 2000; Idusogie E.E. et al., J. Immunol. 164:4178-4184, 2000; Hezareh M. et al., J. Virol. 75:12161-12168, 2001; Morgan A. et al., Immunology 86:319-324, 1995, y la patente EP n� 0 307 434. Dichos sitios de unión de región constante se caracterizan, por ejemplo, por los amino�cidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración según el índice EU de Kabat, ver posteriormente). Los anticuerpos de las subclases IgG1, IgG2 e IgG3 habitualmente muestran activación del complemento y la unión a C1q y la activación de C3, mientras que IgG4 no activa el sistema de complemento y no se une a C1q y no activa C3. Preferentemente la parte Fc es una parte Fc humana.

La expresión “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable, es decir la región de unión, procedente de una fuente o especie, y por lo menos una parte de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, habitualmente preparado mediante técnicas de ADN recombinante. Los anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable murina y una región constante humana resultan preferentes. Otras formas preferentes de “anticuerpos quiméricos” comprendidas dentro de la presente invención son aquéllas en las que la región constante ha sido modificada o cambiada respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de C1q y/o a la unión del receptor de Fc (FcR). Dichos anticuerpos quiméricos también se denominan “anticuerpos de cambio de clase”. Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN codificantes de regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN codificantes de regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfecci�n g�nica son bien conocidas de la técnica Ver, por ejemplo, Morrison S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984; patentes US n� 5.202.238 y n� 5.204.244.

La expresión “anticuerpo humanizado” se refiere a anticuerpos en los que el marco o las “regiones determinantes de complementariedad” (CDR) han sido modificadas para que comprendan la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente de la de la inmunoglobulina parental. En una realización preferente, se injerta una CDR murina en la región marco de un anticuerpo humano para preparar un “anticuerpo humanizado”. Ver, por ejemplo, Riechmann L. et al., Nature 332:323-327, 1988, y Neuberger M.S. et al., Nature 314:268-270, 1985. Son CDR

particularmente preferentes las que representan secuencias que reconocen los ant�genos indicados anteriormente para los anticuerpos quiméricos. Otras formas de “anticuerpos humanizados” comprendidas dentro de la presente invención son aquéllas en las que la región constante ha sido adicionalmente modificada o cambiada respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de C1q y/o a la del receptor de Fc (FcR).

La expresión “anticuerpo humano”, tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir anticuerpos que presentan regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos del estado de la técnica (van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-374, 2001). También pueden producirse anticuerpos humanos en animales transg�nicos (por ejemplo ratones) que sean capaces, tras la inmunizaci�n, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción end�gena de inmunoglobulinas. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal resultar� en la producción de anticuerpos humanos tras el reto de ant�geno (ver, por ejemplo, Jakobovits A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555, 1993; Jakobovits A. et al., Nature 362:255-258, 1993; Brueggemann M. et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). También pueden producirse anticuerpos humanos en bibliotecas de expresión f�gica (Hoogenboom H.R. y Winter G.J., Mol. Biol. 227:381-388, 1992; Marks J.D. et al., J. Mol. 222:581-597, 1991). Las técnicas de Cole S.P.C. et al. y de Boerner et al. también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole S.P.C. et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, New York, 1986, páginas 77 a 96; y Boerner P. et al., J. Immunol. 147:86-95, 1991). Tal como ya se ha indicado para los anticuerpos quiméricos y humanizados según la invención, la expresión “anticuerpo humano” tal como se utiliza en la presente memoria también comprende los anticuerpos que se han modificado en la región constante para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de C1q y/o la unión de FcR, por ejemplo mediante “intercambio de clase”, es decir, el cambio o mutación de partes Fc (por ejemplo de IgG1 a IgG4 y/o la mutación IgG1/IgG4).

La expresión “anticuerpo recombinante humano”, tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de una célula huésped, tal como una célula NS0 � CHO, o de un animal (por ejemplo un ratón) que es transg�nico para genes de inmunoglobulina humana o para anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Dichos anticuerpos recombinantes humanos presentan regiones variables y constantes en una forma reorganizada. Los anticuerpos recombinantes humanos según la invención han sido sometidos a hipermutaci�n somática in vivo. De esta manera, las secuencias de amino�cidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas y relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente en el repertorio in vivo de anticuerpos de la línea germinal humana.

La expresión “dominio variable” (dominio variable de una cadena ligera (VL), región variable de una cadena pesada (VH)) tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cada uno de la pareja de cadena ligera y cadena pesada que participa directamente en la unión del anticuerpo al ant�geno. Los dominios de cadenas ligera y pesada variables presentan la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias se encuentran ampliamente conservadas, conectadas mediante tres “regiones hipervariables” (o regiones determinantes de complementariedad, CDR). Las regiones marco adoptan una conformación de láminas � y las CDR pueden formar bucles que conectan la estructura de láminas �. Las CDRs en cada cadena son mantenidas en su estructura tridimensional por las regiones de marco y forman conjuntamente con las CDRs de la otra cadena el sitio de unión de ant�geno. Las regiones CDR3 de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo desempeñan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de los anticuerpos según la invención y por lo tanto proporcionan un objetivo adicional de la invención.

Las expresiones "región hipervariable" o “parte de unión a ant�geno del anticuerpo” tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a los residuos amino�cidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al ant�geno. La región hipervariable comprende residuos amino�cidos de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". Las regiones “de marco” o “FR” son aquellas regiones de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable tal como se definen en la presente memoria. Por lo tanto, las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo comprenden, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las CDR en cada cadena se encuentran separadas por amino�cidos de marco. Especialmente, la CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye más a la unión de ant�geno. Las regiones CDR y FR se determinan según la definición estándar de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

Los "dominios constantes" de la cadena pesada y de la cadena ligera no participan directamente en la unio�n de un anticuerpo a un ant�geno, aunque muestran diversas funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de

amino�cidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o las inmunoglobulinas se dividen en las clases siguientes:

La expresión "anticuerpo biespec�fico bivalente", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo tal como se ha indicado anteriormente en el que cada una de las dos parejas de cadena pesada y cadena ligera (CP/CL) se une específicamente a un ant�geno diferente, es decir, la primera cadena pesada y la primera cadena ligera (originada de un anticuerpo contra un primer ant�geno) se unen específicamente de manera conjunta a un primer ant�geno y la segunda cadena pesada y la segunda cadena ligera (originadas de un anticuerpo contra un segundo ant�geno) se unen específicamente de manera conjunta a un segundo ant�geno (tal como se ilustra en la fig. 2); dichos anticuerpos biespec�ficos bivalentes son capaces de unirse específicamente a dos ant�genos diferentes simultáneamente, y a no más de dos ant�genos; por el contrario, por una parte, un anticuerpo monoespec�fico, capaz de unirse únicamente a un ant�geno y, por otra parte, por ejemplo, un anticuerpo tetraespec�fico tetravalente, que puede unirse a cuatro moléculas de ant�geno simultáneamente.

Seg�n la invención, la proporción de un anticuerpo biespec�fico bivalente deseado en comparación con productos secundarios no deseados puede mejorarse mediante la sustitución de determinados dominios en únicamente una pareja de cadena pesada y cadena ligera (CP/CL). Aunque la primera de las dos parejas de CP/CL se origina de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno y no resulta esencialmente modificado, el segundo de las dos parejas de CP/CL se origina de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno y resulta alterado por la sustitución siguiente:

-: cadena ligera: sustitución del dominio variable de cadena ligera, VL, por el dominio variable de cadena pesada, VH, de dicho anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, y el dominio constante de cadena ligera, CL, por el dominio constante de cadena pesada, CH1, de dicho anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, y -cadena pesada: sustitución del dominio variable de cadena pesada, VH, por el dominio variable de cadena ligera, VL, de dicho anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, y el dominio constante de cadena pesada, CH1, por el dominio constante de cadena ligera, CL, de dicho anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno.

De esta manera, los anticuerpos biespec�ficos bivalentes resultantes son anticuerpos artificiales que comprenden:

a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno; y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno,

en el que dicha cadena ligera (de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno) contiene un dominio variable, VH, en lugar de VL, y un dominio constante CH1 en lugar de CL, en el que dicha cadena pesada (de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno) contiene un dominio variable, VL, en lugar de VH, y un dominio constante CL en lugar de CH1.

En un aspecto adicional de la invención, dicha proporción mejorada de un anticuerpo biespec�fico bivalente deseado en comparación con productos secundarios no deseados puede mejorarse adicionalmente mediante una de las dos alternativas siguientes:

A) Primera alternativa (ver la fig. 3): Los dominios CH3 de dicho anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención pueden alterarse mediante tecnología de "bot�n en ojal", que se describe en detalle con varios ejemplos en, por ejemplo, el documento n� WO 96/027011, Ridgway J.B. et al., Protein Eng. 9:617-621, 1996, y en Merchant A.M. et al., Nat. Biotechnol. 16:677-681, 1998. En este método, las superficies de interacción de los dos dominios CH3 se alteran para incrementar la heterodimerizaci�n de ambas cadenas pesadas que contienen dichos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "bot�n", mientras que el otro es el "ojal". La introducción de un puente disulfuro estabiliza los heterod�meros (Merchant A.M. et al., Nature Biotech. 16:677-681, 1998; Atwell S. et al., J. Mol. Biol. 270:26-35, 1997) e incrementa el rendimiento. Por lo tanto, en una realización preferente, los dominios CH3 de un anticuerpo biespec�fico bivalente en el que cada uno de primer dominio CH3 y segundo dominio CH3 se reúnen en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 de anticuerpo resulta alterado mediante la tecnología de "bot�n en ojal", incluyendo la estabilizaci�n adicional mediante la introducción de un puente disulfuro en los dominios CH3 (descrito en el documento n� WO 96/027011, Ridgway J.B. et al., Protein Eng. 9:617-621, 1996; Merchant A.M. et al., Nature Biotech. 16:677-681, 1998; y Atwell S. et al., J. Mol. Biol. 270:26-35, 1997) para estimular la formación del anticuerpo biespec�fico bivalente. De esta manera, en un aspecto de la invención, dicho anticuerpo

biespec�fico bivalente se caracteriza porque cada uno de dominio CH3 de una cadena pesada y dominio CH3 de la otra cadena pesada se reúne en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 de anticuerpo, en el que dicha interfaz resulta alterada para estimular la formación del anticuerpo biespec�fico bivalente, en el que la alteración se caracteriza porque:

a) el dominio CH3 de una cadena pesada resulta alterado, de manera que dentro del interfaz original el dominio CH3 de una cadena pesada que se reúne con la interfaz original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro del anticuerpo biespec�fico bivalente, un residuo amino�cido resulta sustituido por un residuo amino�cido que presenta un volumen de cadena lateral más grande, generando de esta manera una protuberancia dentro de la interfaz del dominio CH3 de una cadena pesada que es posicionable en una cavidad dentro del interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada, y b) el dominio CH3 de otra cadena pesada resulta alterado,

de manera que dentro del interfaz original del segundo dominio CH3 que se reúne con la interfaz del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespec�fico bivalente, un residuo amino�cido resulta sustituido por un residuo amino�cido que presenta un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una cavidad dentro de la interfaz del segundo dominio CH3 dentro del cual es posicionable una protuberancia dentro de la interfaz del primer dominio CH3. Preferentemente dicho residuo amino�cido que presenta un volumen de cadena lateral más grande se selecciona de entre el grupo que consiste de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y tript�fano (W). Preferentemente dicho residuo amino�cido que presenta un volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona de entre el grupo que consiste de alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V). En un aspecto de la invención, se alteran adicionalmente ambos dominios CH3 mediante la introducción de ciste�na (C) como amino�cido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3 de manera que puede formarse un puente disulfuro entre ambos dominios CH3. En otra realización preferente de la invención, se alteran ambos dominios CH3 mediante la utilización de los residuos R409D, K370E (K409D) como residuos de bot�n y D399K y E357K para los residuos de ojal descritos en, por ejemplo, el documento n� EP 1870459A1, o B) Segunda alternativa (ver la figura 4): mediante la sustitución de un dominio constante CH3 de cadena pesada por un dominio constante de cadena pesada CH1, mientras que el otro dominio constante de cadena pesada CH3 se sustituye por un dominio constante de cadena ligera, CL .

El dominio constante de cadena pesada CH1 por el que se sustituye el dominio de cadena pesada CH3 puede ser de cualquier clase de Ig (por ejemplo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) o subclase de IgG (por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2). El dominio constante de cadena ligera CL por el que se sustituye el dominio de cadena pesada CH3 puede ser de tipo lambda (A) o de tipo kappa (K), preferentemente del tipo kappa (K).

De esta manera, una realización preferente de la invención es un anticuerpo biespec�fico bivalente, que comprende:

en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y en el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro, y en el que opcionalmente

c) el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio de la otra cadena pesada se reúne cada uno en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 de anticuerpo, en el que dicha interfaz resulta alterada para estimular la formación del anticuerpo biespec�fico bivalente, en el que la alteración se caracteriza porque:

ca) el dominio CH3 de una cadena pesada resulta alterado, de manera que dentro de la interfaz original el dominio CH3 de una cadena pesada que se reúne con la interfaz original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro del anticuerpo biespec�fico bivalente, un residuo amino�cido resulta sustituido por un residuo amino�cido que presenta un volumen de cadena lateral más grande, generando de esta manera una protuberancia dentro de la interfaz del dominio CH3 de una cadena pesada que es posicionable en una cavidad dentro de la interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada, y

cb) el dominio CH3 de otra cadena pesada resulta alterado, de manera que dentro de la interfaz original del segundo dominio CH3 que se reúne con la interfaz del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespec�fico bivalente, un residuo amino�cido resulta sustituido por un residuo amino�cido que presenta un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una cavidad dentro de la interfaz del segundo dominio CH3 dentro del cual es posicionable una protuberancia dentro de la interfaz del primer dominio CH3,

o d) un dominio constante CH3 de cadena pesada resulta sustituido por un dominio constante de cadena pesada CH1, mientras que el otro dominio constante de cadena pesada CH3 se sustituye por un dominio constante de cadena ligera, CL.

Las expresiones "ant�geno" o "molécula de ant�geno" tal como se utilizan en la presente memoria se utilizan intercambiablemente y se refieren a todas las moléculas que pueden ser específicamente ligadas por un anticuerpo. El anticuerpo biespec�fico bivalente es de unión específica a un primer ant�geno y a un segundo ant�geno diferente. El término "ant�genos" tal como se utiliza en la presente memoria incluye, por ejemplo, proteínas, diferentes ep�topos sobre proteínas (como ant�genos diferentes en el sentido de la invención), y polisac�ridos. Lo anterior incluye principalmente partes (capas, cápsulas, paredes celulares, flagelos, fimbrias y toxinas) de bacterias, virus y otros microorganismos. Los lípidos y ácidos nucleicos son antig�nicos únicamente en combinación con proteínas y polisac�ridos. Entre los ant�genos exígenos no microbianos (no autoant�genos) pueden incluirse polen, clara de huevo y proteínas de tejidos y órganos trasplantados o sobre la superficie de células sanguíneas trasfundidas. Preferentemente, el ant�geno se selecciona de entre el grupo que consiste de citoquinas, proteínas de superficie celular, enzimas y receptores de citoquinas, proteínas, enzimas y receptores de superficie celular.

Los ant�genos tumorales son aquellos ant�genos que son presentados por las moléculas del CMH-I � CMH-II sobre la superficie de las células tumorales. Estos ant�genos en ocasiones pueden ser presentados por células tumorales y nunca por células normales. En este caso se denominan ant�genos específicos tumorales (AET) y típicamente resultan de una mutación específica tumoral. Son más comunes los ant�genos que son presentados por las células tumorales y las células normales y se denominan ant�genos asociados a tumor (AAT). Los linfocitos T citot�xicos que reconocen estos ant�genos pueden ser capaces de destruir las células tumorales antes de que proliferen o metastaticen. Los ant�genos tumorales también pueden encontrarse sobre la superficie del tumor en forma de, por ejemplo, un receptor mutado, en cuyo caso ser�n reconocidos por las células B.

En una realización preferente, por lo menos uno de los dos ant�genos diferentes (primer y segundo ant�genos), al que se une específicamente el anticuerpo biespec�fico bivalente, es un ant�geno tumoral.

En otra realización preferente, los dos ant�genos diferentes (primer y segundo ant�genos), a los que se une el anticuerpo biespec�fico bivalente, son ant�genos tumorales; en este caso el primer y segundo ant�genos también pueden ser dos ep�topos diferentes en la misma proteína específica tumoral.

En otra realización preferente, uno de los dos ant�genos diferentes (primer y segundo ant�genos), al que se une específicamente el anticuerpo biespec�fico bivalente, es un ant�geno tumoral y el otro es un ant�geno de célula efectora, tal como, por ejemplo, un receptor de célula T, CD3, CD16 y similar.

En otra realización preferente, uno de los dos ant�genos diferentes (primer y segundo ant�genos), al que se une específicamente el anticuerpo biespec�fico bivalente, es un ant�geno tumoral y el otro es una sustancia antic�ncer, tal como una toxina o un inhibidor de quinasa.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "de unión específica" o "se une específicamente a" se refieren a un anticuerpo que se une específicamente a un ant�geno. Preferentemente la afinidad de unión del anticuerpo de unión específica a este ant�geno presenta un valor de KD de 10-9 moles/l o inferior (por ejemplo de 10-10 moles/l), preferentemente presenta un valor de KD de 10-10 moles/l o inferior (por ejemplo de 10-12 moles/l). Se determina la afinidad de unión con un ensayo de unión estándar, tal como la técnica de resonancia de plasm�n superficial (Biacore�).

El término "ep�topo" incluye cualquier determinante polipept�dico capaz de unión específica a un anticuerpo. En determinadas realizaciones, el determinante epit�pico incluye grupos superficiales químicamente activos de moléculas tales como amino�cidos, cadenas sac�ridas laterales, fosforilo o sulfonilo, y, en determinadas realizaciones, puede presentar características estructurales tridimensionales específicas y o características de carga específicas. Un ep�topo es una región de un ant�geno que resulta ligado por un anticuerpo. En determinadas realizaciones, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un ant�geno en el caso de que reconozca preferentemente su ant�geno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

Una realización adicional de la invención es un método para la preparación de un anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención, que comprende:

a) transformar una célula huésped con: -vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y una cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno, y -vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno,

en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y, en el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro,

b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permiten la síntesis de dicha molécula de anticuerpo, y c) recuperar dicha molécula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.

En general existen dos vectores codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de dicho anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno, y además dos vectores codificantes de la cadena ligera y de la cadena pesada de dicho anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno. Uno de los dos vectores es codificante de la cadena ligera respectiva y el otro de los dos vectores es codificante de la cadena pesada respectiva. Sin embargo, en un método alternativo para la preparación de un anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención, únicamente puede utilizarse para transformarse la célula huésped un primer vector codificante de la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno y únicamente un segundo vector codificante de la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno.

La invención comprende un método para la preparación de los anticuerpos, que comprende cultivar las células huésped correspondientes bajo condiciones que permiten la síntesis de dichas moléculas de anticuerpo y recuperar dichos anticuerpos a partir de dicho cultivo, por ejemplo mediante la expresión de:

-: una primera secuencia de ácidos nucleicos codificante de la cadena ligera de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno, -una segunda secuencia de ácidos nucleicos codificante de la cadena pesada de dicho anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno, -una tercera secuencia de ácidos nucleicos codificante de la cadena ligera de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que el dominio variable de cadena ligera, VL, se sustituye por el dominio variable de cadena pesada, VH, y en el que el dominio constante de cadena ligera, CL, se sustituye por el dominio constante de cadena pesada, CH1, y -una cuarta secuencia de ácidos nucleicos codificante de la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que el dominio variable de cadena pesada, VH, se sustituye por el dominio variable de cadena ligera, VL, y en el que el dominio constante de cadena pesada, CH1, se sustituye por el dominio constante de cadena ligera, CL.

Una realización adicional de la invención es una célula huésped, que comprende:

-: vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y una cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno, y -vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno,

a) un vector que comprende una molécula de ácidos nucleicos codificante de la cadena ligera y un vector que comprende una molécula de ácidos nucleicos codificante de la cadena pesada, de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno, y b) un vector que comprende una molécula de ácidos nucleicos codificante de la cadena ligera y un vector que comprende una molécula de ácidos nucleicos codificante de la cadena pesada, de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno,

en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y

en el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro.

Una realización adicional de la invención es una composición, preferentemente una composición farmacéutica o diagnóstica del anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención.

Una realización adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención y por lo menos un excipiente farmac�uticamente aceptable.

Una realización adicional de la invención es un método para el tratamiento de un paciente que necesita terapia, caracterizada por la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención.

La expresión “ácido nucleico o molécula de ácidos nucleicos”, tal como se utilizan en la presente memoria, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácidos nucleicos puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es de ADN bicatenario.

Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones “célula”, “línea celular” y “cultivo celular” se utilizan intercambiablemente y la totalidad de dichas expresiones incluye la progenie. De esta manera, las expresiones “transformantes” y “células transformadas” incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de la misma, con independencia del número de transferencias. También debe interpretarse que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o naturales. Se encuentra incluida la progenie variante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado realizado en la célula originalmente transformada. Resultar� claro a partir del contexto se se pretenden utilizar denominaciones diferenciadas.

El término "transformación" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un procedimiento de transferencia de un vector/ácido nucleico en una célula huésped. En el caso de que se utilicen células sin barreras de pared celular formidables a modo de células huésped, la transfecci�n se lleva a cabo, por ejemplo, mediante el método de precipitación con fosfato de calcio tal como se describe en Graham F.L. y van der Eb A.J., Virology 52:456-467, 1973. Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para introducir ADN en las células, tales como la electroporaci�n, la nucleofecci�n, la inyección nuclear o la fusión de protoplastos. En el caso de que se utilicen células procari�ticas o células que contienen construcciones de pared celular sustanciales, un método de transfecci�n es, por ejemplo, el tratamiento con calcio utilizando cloruro de calcio tal como describen Cohen S.N. et al., PNAS 69:2110-2114, 1972.

La producción recombinante de anticuerpos utilizando la transformación es bien conocida del estado de la técnica y se describe, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17:183-202, 1999; Geisse

S. et al., Protein Expr. Purif. 8:271-282, 1996; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16:151-160, 2000; Werner R.G. et al., Arzneimittelforschung 48:870-880, 1998, as� como en la patente US n� 6.331.415 y n� 4.816.567.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la "expresión" se refiere al procedimiento por el que se transcribe un ácido nucleico en ARNm y/o al procedimiento por el que el ARNm transcrito (también denominado transcrito) se traduce posteriormente en p�ptidos, polip�ptidos o proteínas. Los transcritos y los polip�ptidos codificados se denominan colectivamente producto g�nico. En el caso de que el polinucle�tido se derive del ADN gen�mico, la expresión en una célula eucari�tica puede incluir el procesamiento del ARNm.

Un "vector" es una molécula de ácidos nucleicos, en particular autorreplicante, que transfiere una molécula de ácidos nucleicos insertada al interior de una célula huésped y/o entre células huésped. El término incluye vectores que funcionan principalmente para la inserción de ADN o ARN en una célula (por ejemplo la integración cromos�mica), la replicaci�n de vectores que funcionan principalmente para la replicaci�n de ADN o ARN, y los vectores de expresión que funcionan para la transcripción y/o traducción del ADN o ARN. También se encuentran incluidos vectores que proporcionan más de una de las funciones descritas.

Un "vector de expresión" es un polinucle�tido que, al ser introducido en una célula huésped apropiada, puede ser transcrito y traducido en un polip�ptido. Un "sistema de expresión" habitualmente se refiere a una célula huésped adecuada que comprende un vector de expresión que puede funcionar para rendir un producto de expresión deseado.

Los anticuerpos biespec�ficos bivalentes según la invención preferentemente se producen por medios recombinantes. Dichos métodos son ampliamente conocidos del estado de la técnica y comprenden la expresión de proteínas en células procari�ticas y eucari�ticas con el posterior aislamiento del polip�ptido anticuerpo y habitualmente la purificación hasta una pureza farmac�uticamente aceptable. Para la expresión de proteínas, los ácidos nucleicos codificantes de cadenas ligeras y pesadas o fragmentos de los mismos se insertan en vectores de

expresi�n mediante métodos estándares. La expresión se lleva a cabo en células huésped procari�ticas o eucari�ticas apropiadas, tales como células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levaduras o células de E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (sobrenadante o células tras la lisis). Los anticuerpos biespec�ficos bivalentes pueden encontrarse presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. La purificación se lleva a cabo con el fin de eliminar otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándares, incluyendo el tratamiento alcalino/SDS, la cromatograf�a de columna y otras bien conocidas de la técnica. Ver Ausubel F. et al., editor, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, New York, 1987.

La expresión en células NS0 se describe en, por ejemplo, Barnes L.M. et al., Cytotechnology 32:109-123, 2000, y Barnes L.M. et al., Biotech. Bioeng. 73:261-270, 2001. La expresión transitoria se describe en, por ejemplo, Durocher Y. et al., Nucl. Acids. Res. 30:E9, 2002. La clonaci�n de dominios variables se describe en Orlandi, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837, 1989; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289, 1992, y en Norderhaug, L. et al., J. Immunol. Methods 204:77-87, 1997. Un sistema de expresión transitoria preferente (HEK293) se describe en Schlaeger, E.-J. y Christensen, K., Cytotechnology 30:71-83, 1999, y en Schlaeger, E.-J.,

J. Immunol. Methods 194:191-199, 1996.

Entre las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas se incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión ribos�mica. Es conocido que las células eucari�ticas utilizan promotores, intensificadores y señales de poliadenilaci�n.

Un ácido nucleico se encuentra “operablemente ligado” en el caso de que se sitúe en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretorio se encuentra operablemente ligado a ADN para un polip�ptido en el caso de que se exprese como preprote�na que participa en la secreción del polip�ptido; un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que afecte a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribos�mica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que se sitúe de manera que facilite la traducción. Generalmente, “operablemente ligado” se refiere a que las secuencias de ADN que e ligan son contiguas, y, en el caso de un líder secretorio, son contiguos y se encuentran en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no son necesariamente contiguos. La unión se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción apropiados. En el caso de que dichos sitios no existan, se utilizan adaptadores oligonucle�tidos sintéticos o conector según la práctica convencional.

Los anticuerpos biespec�ficos bivalentes se separan convenientemente del medio de cultivo mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatograf�a de hidroxilapatito, electroforesis en gel, di�lisis o cromatograf�a de afinidad. El ADN y ARN codificantes de los anticuerpos monoclonales se aíslan y secuencian fácilmente utilizando procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuente de dicho ADN y ARN. Tras el aislamiento, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que seguidamente se transfectan en células huésped, tales como células HEK 293, células CHO o células de mieloma que de otra manera no producirían proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células huésped.

Las variantes (o mutantes) de secuencia de amino�cidos del anticuerpo biespec�fico bivalente se preparan mediante la introducción de cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo o mediante síntesis de nucleótidos. Sin embargo, dichas modificaciones pueden llevarse a cabo sólo en un abanico muy limitado, por ejemplo tal como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, las modificaciones no alteran las características de anticuerpo anteriormente indicadas, tales como el isotipo de IgG y la unión de ant�geno, aunque pueden mejorar el rendimiento de la producción recombinante, la estabilidad de la proteína o facilitar la purificación.

Los ejemplos, listado de secuencias y figuras siguientes se proporcionan con el fin de ayudar a la comprensión de la presente invención, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas.

Listado de secuencias

SEC ID n� 1 secuencia de amino�cidos de la cadena pesada de anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje SEC ID n� 2 secuencia de amino�cidos de la cadena ligera de anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje SEC ID n� 3 secuencia de amino�cidos de la cadena pesada* (CP*) del anticuerpo de intercambio

<IGF-1R> VL-VH/CL-CH1, en el que el dominio variable de cadena pesada, VH, se

sustituye por el dominio de cadena ligera, VL, y el dominio de cadena pesada, CH1, se

sustituye por el dominio de cadena ligera, CL. SEC ID n� 4 secuencia de amino�cidos de la cadena ligera* (CL*) del anticuerpo <IGF-1R> de

intercambio VL-VH/CL-CH1, en el que el dominio de cadena ligera, VL, se sustituye por

el dominio de cadena pesada, VH, y el dominio de cadena ligera, CL, se sustituye por el dominio de cadena pesada, CH1.

SEC ID n� 5 secuencia de amino�cidos de la etiqueta pept�dica de unión de His-estreptavidina de ectodominio de IGF-1R (IGF-1R-His-SBP ECD)

SEC ID n� 6 secuencia de amino�cidos de la cadena pesada del anticuerpo <ANGPT2> de angiopoyetina-2 de tipo salvaje

SEC ID n� 7 secuencia de amino�cidos de la cadena ligera del anticuerpo <ANGPT2> de angiopoyetina-2 de tipo salvaje

SEC ID n� 8 secuencia de amino�cidos de la cadena pesada* (CP*) del anticuerpo <ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1, en el que el dominio de cadena pesada VH es sustituido por el dominio de cadena ligera VL, y el dominio de cadena pesada CH1 es sustituido por el dominio de cadena ligera CL.

SEC ID n� 9 secuencia de amino�cidos de la cadena ligera* (CL*) del anticuerpo <ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1, en el que el dominio de cadena ligera VL es sustituido por el dominio de cadena pesada VH, y el dominio de cadena ligera CL es sustituido por el dominio de cadena pesada CH1.

SEC ID n� 10 secuencia de amino�cidos del dominio CH3 (bot�n) con un intercambio T366W para la utilización en la tecnología de bot�n-en-ojal.

SEC ID n� 11 secuencia de amino�cidos del dominio CH3 (ojal) con un intercambio T366S, L368A, Y407V para la utilización en tecnología de bot�n-en-ojal

SEC ID n� 12 secuencia de amino�cidos de la cadena pesada de anticuerpo <VEGF> de tipo salvaje

SEC ID n� 13 y n� 14 secuencia de amino�cidos de la cadena ligera de anticuerpo <VEGF> de tipo salvaje con y sin líder

SEC ID n� 15 secuencia de amino�cidos de la cadena pesada* (CP*) del anticuerpo <ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1, en el que el dominio de cadena pesada VH es sustituido por el dominio de cadena ligera VL, y el dominio de cadena pesada CH1 es sustituido por el dominio de cadena ligera CL y el dominio CH3 porta una secuencia de amino�cidos con un intercambio T366S, L368A, Y407V (ojal) para la utilización en tecnología de bot�n-en-ojal

SEC ID n� 16 secuencia de amino�cidos de la cadena pesada de anticuerpo <VEGF> de tipo salvaje, en la que el dominio CH3 porta una secuencia de amino�cidos con un intercambio T366W (bot�n) para la utilización en la tecnología de bot�n-en-ojal

SEC ID n� 17 secuencia de amino�cidos de la cadena pesada (G)* (CP*) del anticuerpo <ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1, en el que el dominio de cadena pesada VH es sustituido por el dominio de cadena ligera VL y el dominio de cadena pesada CH1 es sustituido por el dominio de cadena ligera CL con una inserción de glicina adicional.

SEC ID n� 18 secuencia de amino�cidos de la cadena ligera (G)* (CL*) del anticuerpo <ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1, en el que el dominio de cadena ligera VL es sustituido por el dominio de cadena pesada VH y el dominio de cadena ligera CL es sustituido por el dominio de cadena pesada CH1 con una inserción de glicina adicional.

Descripci�n de las figuras

Figura 1 Figura esquemática de IgG, un anticuerpo completo natural específico para un ant�geno con dos parejas de cadena pesada y cadena ligera que comprende dominios variables y constantes en un orden t�pico. Figura 2 Figura esquemática de IgG, un anticuerpo completo natural específico para un ant�geno con dos parejas de cadena ligera que comprende dominios variables y constantes en un orden t�pico. Figura esquemática de un anticuerpo biespec�fico bivalente, que comprende: a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH son sustituidos uno por otro, y en el que los dominios constantes CL y CH1 son sustituidos uno por otro. Figura 3 Figura esquemática de un anticuerpo biespec�fico bivalente, que comprende: a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH son sustituidos uno por otro, y en el que los dominios constantes CL y CH1 son sustituidos uno por otro, y en el que los dominios CH3 de ambas cadenas pesadas son alterados mediante la tecnología de bot�n-en-ojal. Figura 4 Figura esquemática de un anticuerpo biespec�fico bivalente, que comprende: a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH son sustituidos uno por otro, y en el que los dominios constantes CL y CH1 son sustituidos uno por otro, y en el que uno de los dominios constantes de cadena pesada CH3 de ambas cadenas pesadas es sustituido por un dominio constante de cadena pesada CH1 y el otro dominio constante de cadena pesada CH3 es sustituido por un dominio constante de cadena ligera CL.

Figura 5 Esquema de secuencia de proteína de la cadena pesada* (CP*) del anticuerpo <IGF-1R> de intercambio VL-VH/CL-CH1. Figura 6 Esquema de secuencia de proteína de la cadena ligera* (CL*) del anticuerpo <IGF-1R> de intercambio VL-VH/CL-CH1. Figura 7 Mapa plasm�dico del vector de expresión de la cadena pesada* de <IGF-1R> CP*, pUC-CP*-IGF-1R Figura 8 Mapa plasm�dico del vector de expresión de la cadena ligera* de <IGF-1R> CL*, pUC-CL*-IGF-1R Figura 9 Mapa plasm�dico del vector de expresión 4700-Hyg-OriP Figura 10 SDS-PAGE del anticuerpo monoespec�fico bivalente <IGF-1R> de intercambio VL-VH/CL-CH1 (IgG1*) con CP* y CL* aislado mediante inmunoprecipitaci�n con proteína A-agarosa a partir de sobrenadantes de cultivo celular tras la transfecci�n transitoria de células HEK293E. Figura 11 Unión del anticuerpo monoespec�fico <IGF-1R> de intercambio VL-VH/CL-CH1 y anticuerpo <IGF1R> de tipo salvaje del ECD de IGF-1R en un ensayo de unión basado en ELISA. Figura 12 Mapa plasm�dico del vector de expresión de la cadena pesada* de <ANGPT2> CP*, pUC-CP*-ANGPT2 Figura 13 Mapa plasm�dico del vector de expresión de la cadena ligera* de <ANGPT2> CL*, pUC-CL*-ANGPT2 Figura 14 SDS-PAGE reductora y no reductora de la purificación de la mezcla de A) anticuerpo monoespec�fico <IGF-1R> de intercambio VL-VH/CL-CH1, B) anticuerpo biespec�fico <ANGPT2-IGF-1R> de intercambio VL-VH/CL-CH1, y C) anticuerpos <ANGPT2> de tipo salvaje ("mezcla de intercambio VL-VH/CL-CH1 biespec�fica") a partir de sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatograf�a de afinidad de proteína A seguido de cromatograf�a de exclusión por tamaño y concentración. Figura 15 Principio de ensayo de FACS celular de ensayo de puente de IGF-1R-ANGPT2 en células expresantes de IGF-1R I24 con el fin de detectar la presencia de anticuerpo biespec�fico funcional <ANGPT2-IGF1R> de intercambio VL-VH/CL-CH1. Figura 16 Resultados para las muestras A a G de FACS celular de ensayo de puente de IGF-1R-ANGPT2 en células expresantes de IGF-1R I24 con el fin de detectar la presencia de anticuerpo biespec�fico funcional <ANGPT2-IGF-1R> de intercambio VL-VH/CL-CH1 en sobrenadantes de cultivo celular.

Muestra: IGF-1R celular Anticuerpo ANGPT2h Anticuerpo de detección Detección

A: I24 no tratado - <Ang-2>mIgG1-Biotina SA-PE

B: I24 no tratado 2 mg/ml hANGPT2 <Ang-2>mIgG1-Biotina SA-PE

C: I24 Mezcla de anticuerpos biespec�ficos <ANGPT2-IGF-1R> de intercambio VL-VH/CL-CH1 2 mg/ml hANGPT2 <Ang-2>mIgG1-Biotina SA-PE

D: I24 Mezcla de tipo salvaje 2 mg/ml hANGPT2 <Ang-2>mIgG1-Biotina SA-PE

E: I24 Anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje 2 mg/ml hANGPT2 <Ang-2>mIgG1-Biotina SA-PE

F: I24 Anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje 2 mg/ml hANGPT2 <Ang-2>mIgG1-Biotina SA-PE

G: I24 Anticuerpo monoespec�fico <IGF-1 R> de intercambio VL-VH/CL-CH1 2 mg/ml hANGPT2 <Ang-2>mIgG1-Biotina SA-PE

Figura 17 Resultados para las muestras A a G de FACS celular de ensayo de puente de IGF-1R-ANGPT2 en células expresantes de IGF-1R I24 con el fin de detectar la presencia de anticuerpo biespec�fico funcional <ANGPT2-IGF-1R> de intercambio VL-VH/CL-CH1.

Muestra: IGF-1R celular Anticuerpo ANGPT2_h Anticuerpo de detección Detección

A: I24 no tratado - <Ang-2>mIgG1-Biotina SA-PE

B: I24 no tratado 2 mg/ml ANGPT2_h <Ang-2>mIgG1-Biotina SA-PE

C: I24 Mezcla biespec�fica de intercambio VL-VH/CL-CH1 2 mg/ml ANGPT2_h mIgG1-Biotina-Isotype control SA-PE

D: I24 Mezcla biespec�fica de intercambio VL-VH/CL-CH1 2 mg/ml ANGPT2_h <Ang-2>mIgG1-Biotina SA-PE

E: I24 Mezcla de tipo salvaje 2 mg/ml ANGPT2_h <Ang-2>mIgG1-Biotina SA-PE

F: I24 Anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje 2 mg/ml ANGPT2_h <Ang-2>mIgG1-Biotina SA-PE

G: I24 Anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje 2 mg/ml ANGPT2_h <Ang-2>mIgG1-Biotina SA-PE

Figura 18 Esquema del ELISA de unión de ECD de IGF-1R Figura 19 Esquema del ELISA de unión de ANGPT2 Figura 20 Esquema del ELISA de unión de VEGF-ANGPT2 Figura 21 Esquema del ensayo Biacore de puente de ANGPT2-VEGF Figura 22 SDS-PAGE de la purificación del anticuerpo <IGF-1R> de intercambio VL-VH/CL-CH1, el anticuerpo <IGF-1R> purificado de intercambio VL-CH/CL-CH1 corresponde a una agrupación concentrada mediante CET, B) cromatograf�a de exclusión por tamaño (CET) del intercambio <IGF-1R> purificado de intercambio VL-VH/CL-CH1. Figura 23 SDS-PAGE de la purificación del anticuerpo <ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1, el anticuerpo <ANPT2> purificado de intercambio VL-CH/CL-CH1 corresponde a una agrupación concentrada mediante CET, B) cromatograf�a de exclusión por tamaño (CET) del intercambio <ANGPT2> purificado de intercambio VL-VH/CL-CH1. Figura 24 Unión del anticuerpo monoespec�fico <ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1 y anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje a ANGPT2 en un ensayo de unión basado en ELISA. Figura 25 Análisis de Biacore de la unión del anticuerpo monoespec�fico <ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1 y anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje a ANGPT2. Figura 26 SDS-PAGE reductora y no reductora de las fracciones de eluci�n de la cromatograf�a de exclusión por tamaño del anticuerpo biespec�fico <VEGF-ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1 Figura 27 Asignación de bandas en SDS-PAGE mediante espectrometr�a de masas de fracciones nativas. Se indica la posición de las proteínas identificada mediante espectrometr�a de masas en la SDS-PAGE no reductora respectiva. Figura 28 Análisis de las fracciones de eluci�n 5 y 9 de la cromatograf�a de exclusión por tamaño del intercambio biespec�fico <VEGF-ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1 en el ELISA de puente de VEGF-ANGPT2. Se incluye a modo de control positivo un anticuerpo biespec�fico y tetravalente TvG6-Ang23 que reconoce ANGPT2 y VEGF simultáneamente. Figura 29 Análisis de la resonancia del plasm�n superficial de las fracciones de eluci�n 5 y 9 de la cromatograf�a de exclusión por tamaño del anticuerpo biespec�fico <VEGF-ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1 en el ensayo Biacore de puente de VEGF-ANGPT2. Se incluye a modo de control positivo un anticuerpo biespec�fico y tetravalente TvG6-Ang23 que reconoce ANGPT2 y VEGF simultáneamente. Figura 30 Esquema del anticuerpo biespec�fico <VEGF-ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1 con bot�nen-ojal para la heterodimerizaci�n. Figura 31 Análisis de Biacore de la unión del anticuerpo monoespec�fico <ANGPT2> de intercambio VLVH(G)/CL-CH1(G) y anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje a ANGPT2.

Ejemplos

Materiales y métodos generales

Se proporciona información general sobre las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulinas humanas en: Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Los amino�cidos de las cadenas de anticuerpos est�n numeradas y se hace referencia a ellas según la numeración de EU (Edelman G.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63:78-85, 1969; Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

T�cnicas de ADN recombinante

Se utilizaron métodos estándares para manipular el ADN, tal como se describe en Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Se utilizaron los reactivos biológicos moleculares siguiendo las instrucciones del fabricante.

S�ntesis g�nica

Se prepararon segmentos g�nicos deseados a partir de oligonucle�tidos construidos mediante síntesis química. Los segmentos g�nicos de 600 a 1.800 pb de longitud, los cuales se encuentran flanqueados por sitios de corte de endonucleasa de restricción únicos, se ensamblaron mediante hibridación y ligación de oligonucle�tidos que incluía la amplificación por PCR y posteriormente fueron clonados mediante los sitios de restricción indicados, por ejemplo KpnI/SacI o AscI/PacI en un vector de clonaci�n pGA4 basado en pPCRScript (Stratagene). Las secuencias de ADN

de los fragmentos g�nicos subclonados se confirmaron mediante secuenciaci�n del ADN. Los fragmentos de síntesis g�nica se ordenaron según las especificaciones proporcionadas en Geneart (Regensburg, Alemania).

Determinaci�n de la secuencia del ADN

Las secuencias de ADN se determinaron mediante secuenciaci�n de doble cadena realizada por MediGenomix GmbH (Martinsried, Alemania) o por Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Alemania).

An�lisis de secuencias de ADN y de proteínas y gestión de los datos de secuencias

Se utilizó el paquete inform�tico versión 10.2 del GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) y Vector NT1 Advance suite versión 8.0 de Infomax para la creación de secuencias, mapeado, análisis, anotado e ilustración. Vectores de expresión

Para la expresión de los anticuerpos indicados, se aplicaron variantes de pl�smidos de expresión para la expresión transitoria (por ejemplo en células HEK293 EBNA o HEK293-F) basados en una organización de ADNc con un promotor de intr�n A del CMV o en una organización gen�mica con un promotor del CMV. Aparte del casete de expresión de anticuerpo los vectores contenían:

-un origen de replicaci�n que permite la replicaci�n de este pl�smido en E. coli, y

-: un gen -lactamasa que proporciona resistencia a la ampicilina en E. coli.

La unidad de transcripción del gen de anticuerpo est� compuesta de los elementos siguientes:

-: uno o más sitios de restricción únicos en el extremo 5’, -el intensificador y promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano,

-: seguido de la secuencia de intr�n A en el caso de la organización de ADNc, -una región 5’ no traducida de un gen de anticuerpo humano,

-: una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina,

-: la cadena de anticuerpo humano (de tipo salvaje o con intercambio de dominios) en forma de ADNc o como organización gen�mica con una organización ex�n-intr�n de inmunoglobulina, -una región 3’ no traducida con una secuencia de señal de poliadenilaci�n, y -uno o más sitios de restricción únicos en el extremo 3’.

Los genes de fusión que comprenden las cadenas de anticuerpo indicadas, tal como se indica posteriormente, se generan mediante PCR y/o síntesis g�nica, y se ensamblan utilizando métodos y técnicas recombinantes conocidos mediante conexión de los segmentos de ácidos nucleicos correspondientes, por ejemplo utilizando sitios de restricción únicos en los vectores respectivos. Las secuencias subclonadas de ácidos nucleicos se verificaron mediante secuenciaci�n del ADN. Para las transfecciones transitorias, se prepararon cantidades mayores de los pl�smidos a partir de cultivos de E. coli transformados (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

T�cnicas de cultivo celular

Se utilizaron técnicas estándares de cultivo celular tales como las descritas en Current Protocols in Cell Biology, Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J. y Yamada K.M. (editores), John Wiley & Sons, Inc., 2000.

Se expresaron anticuerpos biespec�ficos mediante cotransfecci�n transitoria de los pl�smidos de expresión respectivos en células HEK293-EBNA en crecimiento adherente o en células HEK29-F que crecían en suspensión, tal como se indica posteriormente.

Transfecciones transitorias en el sistema HEK293-EBNA

Se expresaron anticuerpos biespec�ficos mediante cotransfecci�n transitoria de los pl�smidos de expresión respectivos (por ejemplo codificantes de la cadena pesada y de la cadena pesada modificada, as� como las cadenas ligera y ligera modificada correspondientes) en células HEK293-EBNA en crecimiento adherente (línea celular renal embrionaria humana 293 que expresa el ant�geno nuclear del virus de Epstein-Barr; American Type Culture Collection número de depósito ATCC n� CRL-10852, Lote n� 959 218) cultivadas en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco, Gibco) suplementado con FCS (suero de feto bovino, Gibco) al 10% con niveles ultrabajos de IgG, L-glutamina 2 mM (Gibco) y geneticina 250 mg/ml (Gibco). Para la transfecci�n, se utilizó reactivo de transfecci�n FuGENETM 6 (Roche Molecular Biochemicals) en una proporción de reactivo FuGENETM (él) a ADN (�g) de 4:1 (comprendida entre 3:1 y 6:1). Se expresaron proteínas a partir de los pl�smidos respectivos utilizando una proporción molar de pl�smidos codificantes de cadena (modificada y de tipo salvaje) ligera y pesada de 1:1

(equimolar) comprendida entre 1:2 y 2:1, respectivamente. Las células se alimentaron el día 3 con L-glutamina 4 mM, glucosa [Sigma] y NAA [Gibco]. Los sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpo biespec�fico se recolectaron entre los días 5 y 11 tras la transfecci�n mediante centrifugaci�n y se almacenaron a –20�C. Se proporciona información general sobre la expresión recombinante de inmunoglobulinas humanas en, por ejemplo, células HEK293, en: Meissner P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75:197-203, 2001.

Transfecciones transitorias en el sistema HEK293-F

Se generaron anticuerpos biespec�ficos mediante transfecci�n transitoria de los pl�smidos respectivos (por ejemplo codificantes de cadena pesada y de cadena pesada modificada, as� como las cadenas ligera y ligera modificada correspondientes) utilizando el sistema HEK293-F (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se transfectaron células HEK293-F (Invitrogen) cultivadas en suspensión en un matraz oscilante o en un fermentador bajo agitaci�n en medio de expresión FreeStyle 293 sin suero (Invitrogen) con una mezcla de los cuatro pl�smidos de expresión y 293fectina o con fectina (Invitrogen). Para un matraz oscilante de 2 litros (Corning) se sembraron células HEK293-F a una densidad de 106 células/ml en 600 ml y se incubaron a 120 rpm, en 8% de CO2. El día después de transfectar las células a una densidad celular de aproximadamente 1,5x106 células/ml con aproximadamente 42 ml de mezcla de A) 20 ml de Opti-MEM (Invitrogen) con 600 mg de ADN total de pl�smido (1 �g/ml) codificante de la cadena pesada o de la cadena pesada modificada, respectivamente, y la cadena ligera correspondiente en una proporción equimolar, y B) 20 ml de Opti-MEM + 1,2 ml de 293 fectina o fectina (2 él/ml). Según el consumo de glucosa, se a�adi� solución de glucosa durante el curso de la fermentación. Tras 5 a 10 días se recolect� el sobrenadante que contenía el anticuerpo secretado, y los anticuerpos se purificaron directamente del sobrenadante o el sobrenadante se congel� y se almacen�.

Determinaci�n de proteínas

Se determin� la concentración de proteínas de anticuerpos biespec�ficos purificados y derivados, mediante la determinación de la densidad óptica (DO) a 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado basándose en la secuencia de amino�cidos según Pace C.N. et al., Protein Science 4:2411-2423, 1995.

Determinaci�n de la concentración de anticuerpos en sobrenadantes

Se estim� la concentración de anticuerpos y derivados en sobrenadantes de cultivo celular mediante inmunoprecipitaci�n con perlas de agarosa-proteína A (Roche). Se lavaron 60 él de perlas de agarosa-proteína A tres veces en TBS-NP40 (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Nonidet-P40 al 1%). Posteriormente, se aplicaron 1 a 15 ml de sobrenadante de cultivo celular a las perlas de agarosa-proteína A preequilibradas en TBS-NP40. Tras la incubaci�n durante 1 hora a temperatura ambiente, las perlas se lavaron en una columna de filtro Ultrafree-MC (Amicon) una vez con 0,5 ml de TBS-NP40, dos veces con 0,5 ml de 2x de solución salina tamponada con fosfato (2xPBS, Roche) y brevemente cuatro veces con 0,5 ml de citrato sádico 100 mM, pH 5,0. El anticuerpo ligado se eluy� mediante la adicion de 35 él de tampón para muestras NuPAGE� LDS (Invitrogen). Se combin� la mitad de la muestra con agente reductor de muestras NuPAGE� o se dej� sin reducir, respectivamente, y se calentó durante 10 minutos a 70�C. Después, se aplicaron 5 a 30 él a un SDS-PAGE Bis-Tris NuPAGE� al 4-12% (Invitrogen) (con tampón MOPS para SDS-PAGE no reducido y tampón MES con aditivo antioxidante de tampón de migración NuPAGE� (Invitrogen) para un SDS-PAGE reducido) y se ti�� con azul de Coomassie.

La concentración de anticuerpos y derivados en sobrenadantes de cultivo celular se midió cuantitativamente mediante cromatograf�a HPLC de afinidad. Brevemente, se aplicaron sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpos y derivados que se unen a la proteína A, a una columna Poros A/20 de Applied Biosystems en KH2PO4 200 mM, citrato sádico 100 mM, pH 7,4, y se eluyeron de la matriz con NaCl 200 mM, ácido cítrico 100 mM, pH 2,5 en un sistema HPLC 1100 de Agilent. Las proteínas elu�das se cuantificaron a partir de la absorbancia de UV y la integración de las áreas de los picos. Un anticuerpo IgG1 estándar purificado sirvió como estándar.

Alternativamente, se midió la concentración de anticuerpos y derivados en los sobranadantes de cultivo celular mediante ELISA tipo s�ndwich de IgG. Brevemente, se recubrieron placas de microtitulaci�n de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina StreptaWell High Bind (Roche) con 100 él/pocillo de molécula de captura biotinilada anti-IgG humana F(ab’)2<h-FcY> BI (Dianova) a una concentración de 0,1 �g/ml durante 1 hora a temperatura ambiente, o alternativamente durante la noche a 4�C y posteriormente se lavaron tres veces con 200 él/pocillo de PBS, Tween al 0,05% (PBST, Sigma). Se añadieron 100 él/pocillo de una serie de dilución en PBS (Sigma) de sobrenadantes de cultivo celular que contenían el anticuerpo respectivo, a los pocillos y se incubaron durante 1 a 2 horas en un agitador de placas de microtitulaci�n a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con 200 él/pocillo de PBST y el anticuerpo unido se detect� con 100 él de F(ab’)2<hFcY>POD (Dianova) a una concentración de 0,1 �g/ml como anticuerpo de detección durante 1 a 2 horas en un agitador para placas de microtitulaci�n a temperatura ambiente. Se lav� el anticuerpo de detección no unido, tres veces con 200 él/pocillo de PBST y el anticuerpo de detección unido se detect� mediante la adición de 100 él de ABTS/pocillo. La determinación

de la absorbancia se llev� a cabo en un espectrómetro Tecan Fluor a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia: 492 nm).

Purificaci�n de proteínas

Se purificaron proteínas a partir de sobrenadantes de cultivo celular filtrados siguiendo protocolos estándares. Brevemente, se aplicaron anticuerpos a una columna de proteína A-sefarosa (GE Healthcare) y se lavaron con PBS. La eluci�n de los anticuerpos se consiguió a pH 2,8, seguido de la neutralización inmediata de la muestra. Se separaron las proteínas agregadas de los anticuerpos monom�ricos mediante cromatograf�a de exclusión por tamaño (Superdex 200, GE Healthcare) en PBS o en histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0. Se agruparon las fracciones de anticuerpo monom�rico, se concentraron en caso necesario utilizando, por ejemplo, un concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (valor de corte de 30 MWCO), se congelaron y se almacenaron a –20�C o a – 80�C. Parte de las muestras se proporcionaron a la analítica de proteínas posterior y caracterización analítica mediante, por ejemplo, SDS-PAGE, cromatograf�a de exclusión por tamaño o espectrometr�a de masas.

SDS-PAGE

Se utilizó el sistema de gel premoldeado NuPAGE� (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. En particular, se utilizaron geles premoldeados NuPAGE� Novex� Bis-TRIS al 10% � 4-12% (pH 6,4) y un tampón de migración NuPage� MES (geles reducidos con aditivo antioxidante NuPAGE� para tampón antioxidante de migración) o tampón de migración MOPS (geles no reducidos).

Cromatograf�a analítica de exclusión por tamaño

La cromatograf�a de exclusión por tamaño para la determinación de la agregación y estado oligom�rico de los anticuerpos se llev� a cabo mediante cromatograf�a HPLC. Brevemente, se aplicaron anticuerpos purificados con proteína A en una columna Tosoh TSKgel G3000SW en NaCl 300 mM, KH2PO4/K2HPO4 50 mM, pH 7,5 en un sistema HPLC 1100 de Agilent o en una columna Superdex 200 (GE Healthcare) en 2xPBS en un sistema de HPLC de Dionex. Las proteínas elu�das se cuantificaron a partir de la absorbancia de UV y la integración de las áreas de los picos. El estándar de filtración en gel 151-1901 de BioRad sirvió de estándar.

Espectrometr�a de masas

Se determin� la masa desglucosilada total de los anticuerpos entrecruzados y se confirm� mediante espectrometr�a de masas de ionizaci�n por electropulverizaci�n (EM-IEP). Brevemente, se desglucosilaron 100 mg de anticuerpos purificados con 50 mU de N-glucosidasa F (PNGasaF, ProZyme) en KH2PO4/K2HPO4 100 mM, pH 7, a 37�C durante 12 a 24 horas a una concentración de proteínas de hasta 2 mg/ml y posteriormente se desalaron mediante HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). La masa de las cadenas pesada y ligera respectivas se determin� mediante EM-IEP tras la desglucosilaci�n y reducción. Brevemente, se incubaron 50 Ig de anticuerpo en 115 él, con 60 él de TCEP 1 M y 50 él de hidrocloruro de guanidina 8 M posteriormente desalado. Se determin� la masa total y la masa de las cadenas pesada y ligera reducidas mediante EM-IEP en un sistema Q-Star Elite MS dotado de una fuente NanoMate.

ELISA de unión de ECD de IGF-1R

Las propiedades de unión de los anticuerpos generados se evaluaron en un ensayo ELISA con el dominio extracelular (ECD) de IGF-1R. Para ello, el dominio extracelular de IGF-1R (residuos 1 a 462) que comprendía la secuencia líder natural y los 12 dominios LI ricos en ciste�na del ectodominio de la IGF-1R humana de la cadena alfa (según McKern et al. 1997, Ward et al. 2001) fusionados con una etiqueta p�ptido N-terminal ligante de Hisestreptavidina (His-SBP) se clon� en un derivado de vector pcDNA3 y se expres� transitoriamente en células HEK293F. La secuencia de proteínas de ECD de IGF-1R-His-SBP se proporciona en SEC ID n� 5. Se recubrieron placas de microtitulaci�n de 96 pocillos StreptaWell High Bind Streptavidin A (Roche) con 100 Il/pocillo de sobrenadante de cultivo celular que contenía proteína de fusión soluble IGF-1R-ECD-SBP durante la noche a 4�C y se lavaron tres veces con 200 Il/pocillo de PBS, Tween al 0,05% (PBST, Sigma). A continuación, se añadieron 100 él/pocillo de una serie de dilución del anticuerpo respectivo y como referencia, se a�adi� a los pocillos anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje en PBS (Sigma) que incluía BSA al 1% (fracción V, Roche) y se incubaron durante 1 a 2 horas en un agitador de placas de microtitulaci�n a temperatura ambiente. Para la serie de dilución, se aplicó a los pocillos la misma cantidad de anticuerpo purificado a modo de referencia o sobrenadantes de la transfecci�n transitoria en HEK293E (HEK293F) normalizados mediante Sandwich-IgG-ELISA para la misma concentración de anticuerpo. Los pocillos se lavaron tres veces con 200 él/pocillo de PBST y el anticuerpo unido se detect� con 100 él/pocillo de F(ab’)2<hFcY>POD (Dianova) a una concentración de 0,1 �g/ml como anticuerpo de detección durante 1 a 2 horas en un agitador para placas de microtitulaci�n a temperatura ambiente. Se lav� el anticuerpo de detección no unido, tres veces con 200 él/pocillo de PBST y el anticuerpo de detección unido se detect� mediante la adición de

100 él de ABTS/pocillo. La determinación de la absorbancia se llev� a cabo en un espectrómetro Tecan Fluor a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia: 492 nm).

Biacore de ECD de IGF-1R

Tambi�n se investigó la unión de los anticuerpos generados a ECD de IGF-1R humano mediante resonancia de plasm�n superficial utilizando un instrumento BIACORE T100 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suecia). Brevemente, para las mediciones de afinidad, se inmovilizaron anticuerpos JIR 109-005-098 de cabra anti-IgG humana en un chip CM5 mediante acoplamiento de aminas para la presentación de los anticuerpos contra ECD de IGF-1R etiquetado con Fc. Se midió la unión en tampón HBS (HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,005%, pH 7,4), a 25�C. Se a�adi� ECD de IGF-1R (R&D Systems o purificado en el propio laboratorio) en solución a diversas concentraciones. Se midió la asociación mediante una inyección de ECD de IGF-1R de 80 segundos a 3 minutos; la disociaci�n se midió mediante lavado de la superficie del chip con tampón HBS durante 3 a 10 minutos y se estim� un valor de KD utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1. Debido a la baja densidad de carga y nivel de captura de anticuerpos <IGF-1R>, se obtuvo una unión monovalente de ECD de IGF-1R. Se restaron los datos de control negativo (por ejemplo las curvas de tampón) de las curvas de muestras para la corrección de la deriva intrínseca de la línea base del sistema y para la reducción de la señal de ruido. Se utilizó el programa Biacore T100 Evaluation versión 1.1.1 para el análisis de los sensogramas y para el cálculo de los datos de afinidad (figura 18).

ELISA de unión a ANGPT2

Las propiedades de unión de los anticuerpos generados se evaluaron en un ensayo ELISA con proteína ANGPT2 His de longitud completa (R&D Systems).

Para ello, se recubrieron placas de microtitulaci�n de poliestireno transparente mejoradas Falcon con 100 él de ANGPT2 humana recombinante 1 �g/ml (R&D Systems, sin portador) en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4�C. Se lavaron los pocillos tres veces con 300 él de PBST (Tween-20 al 0,2%) y se bloquearon con 200 él de BSA al 2%-Tween-20 al 0,1% durante 30 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se lavaron tres veces con 300 él de PBST. Se añadieron 100 él/pocillo de una serie de dilución de anticuerpos purificados <ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1 y a modo de referencia anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje en PBS (Sigma) a los pocillos y se incubaron durante 1 h en un agitador de placas de microtitulaci�n a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos tres veces con 300 él de PBST (Tween-20 al 0,2%) y se detect� el anticuerpo unido con 100 él/pocillo de F(ab’) <hk>POD 0,1 mg/ml (Biozol, n� de cat. 206005) � 100 Il/pocillo de F(ab') <hFcY>POD 0,1 mg/ml (ImmunoResearch) en BSA al 2% y Tween-20 al 0,1% como anticuerpo de detección durante 1 h en un agitador de placas de microtitulaci�n a temperatura ambiente. Se lav� el anticuerpo de detección no unido, tres veces con 300 él/pocillo de PBST y el anticuerpo de detección unido se detect� mediante la adición de 100 él de ABTS/pocillo. La determinación de la absorbancia se llev� a cabo en un espectrómetro Tecan Fluor a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia: 492 nm).

BIACORE de unión a ANGPT2

Tambi�n se investigó la unión de los anticuerpos generados a ANGPT2 humano mediante resonancia de plasm�n superficial utilizando un instrumento BIACORE T100 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suecia). Brevemente, para las mediciones de afinidad se inmovilizaron anticuerpos policlonales <hIgG-Fcg> de cabra en un chip CM5 � CM4 mediante acoplamiento de aminas para la presentación de los anticuerpos contra ANGPT2 humano. Se midió la unión en tampón HBS (HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,005%, pH 7,4) con o sin Ca2+ 5 mM, a 25�C. Se a�adi� ANGPT2-His purificado (R&D Systems o purificado en el propio laboratorio) a diversas concentraciones en solución. Se midió el grado de asociación mediante una inyección de ANGPT2 de 3 minutos; la disociaci�n se midió mediante lavado de la superficie del chip con tampón HBS durante 3 a 5 minutos y se estim� un valor de KD utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1. Debido a la heterogeneidad de la preparación de ANGPT2, no pudo observarse unión 1:1; de esta manera, los valores de KD sólo son estimaciones relativas. Se restaron los datos de control negativo (por ejemplo las curvas de tampón) de las curvas de muestras para la corrección de la deriva intrínseca de la línea base del sistema y para la reducción de la señal de ruido. Se utilizó el programa Biacore T100 Evaluation versión 1.1.1 para el análisis de los sensogramas y para el cálculo de los datos de afinidad (figura 19).

Inhibici�n de la unión de ANGPT2-h a Tie-2-ECD (ELISA)

Para someter a ensayo la capacidad de los anticuerpos de ANGPT2 de interferir con la unión de Tie2, se dise�� el ELISA siguiente. Se llev� a cabo el ensayo en placas de microtitulaci�n de 384 pocillos (MicroCoat, DE, n� de cat. 464718) a TA. Tras cada etapa de incubaci�n, se lavaron las placas 3 veces con PBST. Al inicio, las placas se recubrieron con 0,5 Ig/ml de proteína Tie-2 (R&D Systems, Reino Unido, n� de cat. 313-TI) durante como mínimo 2 horas (h). A continuación, se bloquearon los pocillos con PBS suplementado con Tween-20 al 0,2% y BSA al 2%

(Roche Diagnostics GmbH, DE) durante 1 h. Las diluciones de anticuerpos purificados en PBS se incubaron conjuntamente con 0,2 Ig/ml de ANGPT2_hu (R&D Systems, Reino Unido, n� de cat. 623-AN) durante 1 h a TA. Tras el lavado se a�adi� una mezcla de 0,5 Ig/ml de anti-ANGPT2 biotinilado, clon BAM0981 (R&D Systems, Reino Unido) y estreptavidina-HRP diluida 1:3.000 (Roche Diagnostics GmbH, DE, n� de cat. 11089153001) durante 1 h. Después, se lavaron las placas 6 veces con PBST. Las placas se revelaron con reactivo ABTS recién preparado (Roche Diagnostics GmbH, DE, tampón n� 204 530 001, tabletas n� 11 1112 422 001) durante 30 minutos a TA. Se midió la absorbancia a 405 nm.

ELISA de puente de ANGPT2-VEGF

Se evaluaron las propiedades de unión de los anticuerpos biespec�ficos generados en un ensayo ELISA con proteína VEGF165-His de longitud completa inmovilizada (R&D Systems) y proteína ANGPT2-His humana (R&D Systems) para la detección de anticuerpo biespec�fico unido simultáneamente. únicamente un anticuerpo biespec�fico era capaz de unirse simultáneamente a VEGF y a ANGPT2 y, de esta manera, formar un puente entre los dos ant�genos, mientras que los anticuerpos IgG1 monoespec�ficos “estándares” no fueron capaces de unirse simultáneamente a VEGF y ANGPT2. Para ello, se recubrieron placas de microtitulaci�n de poliestireno transparente mejoradas Falcon, con 100 él de VEGF165 humana recombinante 2 �g/ml (R&D Systems) en PBS durante 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4�C. Se lavaron los pocillos tres veces con 300 él de PBST (Tween-20 al 0,2%) y se bloquearon con 200 él de BSA al 2%-Tween-20 al 0,1% durante 30 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se lavaron tres veces con 300 él de PBST. Se añadieron 100 él/pocillo de una serie de dilución de anticuerpo biespec�fico purificado y anticuerpos de control en PBS (Sigma) a los pocillos y se incubaron durante 1 h en un agitador de placas de microtitulaci�n a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos tres veces con 300 él de PBST (Tween-20 al 0,2%) y los anticuerpos unidos se detectaron mediante la adición de 100 él de ANGPT2-His humana 0,5 Ig/ml (R&D Systems) en PBS. Se lavaron los pocillos tres veces con 300 él de PBST (Tween-20 al 0,2%) y el ANGPT2 unido se detect� con 100 él de anticuerpo de <ANGPT2>mIgG1-biotina 0,5 �g/ml (BAM0981, R&D Systems) durante 1 h a temperatura ambiente. El anticuerpo de detección no unido se lav� tres veces con 300 él de PBST (Tween-20 al 0,2%) y los anticuerpos unidos se detectaron mediante la adición de 100 él de conjugado de estreptavidina-POD 1:2.000 (Roche Diagnostics GmbH, n� de cat. 11089153) diluido 1:4 en tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. El conjugado de estreptavidina-POD no unido se lav� tres-seis veces con 300 él de PBST (Tween-20 al 0,2%) y el conjugado de estreptavidina-POD unido se detect� mediante la adición de 100 él de ABTS/pocillo. La determinación de la absorbancia se llev� a cabo en un espectrómetro Tecan Fluor a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia: 492 nm) (figura 20).

Ensayo Biacore para detectar la unión simultánea de anticuerpos biespec�ficos a VEGF y a ANGPT2

Con el fin de corroborar adicionalmente los datos del ELISA de puente, se prepar� un ensayo adicional utilizando la tecnología de resonancia de plasm�n superficial en un instrumento Biacore T100 para confirmar la unión simultánea a VEGF y a ANGPT2. Los datos se analizaron utilizando el paquete inform�tico de T100: se captur� ANGPT2 a un nivel de captura de entre 2.000 y 1.700 UR mediante un anticuerpo pentaHis (PentaHis-Ab sin BSA, Qiagen n� 34660) inmovilizado sobre un chip CM5 mediante acoplamiento de aminas (sin BSA). El tampón HBS-N sirvió como tampón de migración; la activación se llev� a cabo con una mezcla de EDC/NHS. El anticuerpo de captura PentaHis-Ab sin BSA se diluyó en tampón de acoplamiento NaAc, pH 4,5, c=30 �g/ml, finalmente los grupos carboxilo todavía activados se bloquearon mediante la inyección de etanolamina 1 M; se sometieron a ensayo densidades de ligando de entre 5.000 y 17.000 UR. Se captur� ANGPT2 a una concentración de 500 nM con el anticuerpo PentaHis-Ab a un caudal de 5 él/minuto diluido con tampón de migración + BSA 1 mg/ml. A continuación, se demostr� la unión de anticuerpo biespec�fico a ANGPT2 y a VEGF mediante la incubaci�n con VEGF_rh. Para ello, se unió el anticuerpo biespec�fico a ANGPT2 a un caudal de 50 él/minuto y a una concentración de 100-500 nM, se diluyó con tampón de migración + BSA 1 mg/ml y se detect� la unión simultánea mediante incubaci�n con VEGF (VEGF_rh, R&D-Systems, n� de cat. 293-VE) en PBS + tampón de migración Tween-20 al 0,005% (v/v) + BSA 1 mg/ml a un caudal de 50 él/minuto y una concentración de VEGF de 100-150 nM. Tiempo de asociación: 120 s; tiempo de disociaci�n:

1.200 s. La regeneración se llev� a cabo tras cada ciclo a un caudal de 50 él/minuto con 2x10 mM de glicina, pH 2,0, y un tiempo de contacto de 60 s. Se corrigieron los sensogramas utilizando el método habitual de doble referenciado (referencia de control: unión de anticuerpo biespec�fico y VEGFrh a la molécula de captura PentaHisAb). Se midieron los blancos para cada Ab con VEGF_rh concentración “0”. En la figura 21 se muestra un esquema del ensayo Biacore. Se corrigieron los sensogramas utilizando el doble referenciado habitual (referencia de control: unión de anticuerpo biespec�fico Ab y VEGF_rh a la molécula de captura PentaHisAb). Se midieron los blancos para cada Ab con VEGF_rh concentración “0”.

Ejemplo 1:

Producci�n, expresión, purificación y caracterización de anticuerpo monoespec�fico bivalente <IGF-1R>, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y en el que los dominios constantes CL y CH1 se

sustituyen uno por otro (abreviadamente en la presente memoria, anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL- CH1).

Ejemplo 1A

Construcci�n de los pl�smidos de expresión para el anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1.

Las secuencias de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 del receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina, incluyendo las secuencias líder respectivas indicadas en el presente ejemplo, se derivaron de la cadena pesada del anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje (SEC ID n� 1, pl�smido 4843-pUC-CP-IGF-1R) y una cadena ligera (SEC ID n� 2, pl�smido 4842-pUC-CL-IGF-1R) descritas en el documento n� WO 2005/005635 y los dominios constantes de cadenas pesada y ligera se derivaron de un anticuerpo humano (C-kappa e IgG1).

Los segmentos g�nicos codificantes de la secuencia líder del anticuerpo <IGF-1R>, dominio variable de cadena ligera (VL) y el dominio constante de cadena ligera kappa humana (CL) se unieron y se fusionaron con el extremo 5' de los dominios Fc de los dominios constantes de la cadena pesada Y1 humana. El ADN codificante de la proteína de fusión respectiva resultante del intercambio de los dominios VH y CH1 por los dominios VL y CL se gener� mediante síntesis g�nica y se indica como <IGF1R> CP* (Cadena Pesada*) (SEC ID n� 3) a continuación. Los segmentos g�nicos de la secuencia líder del anticuerpo <IGF-1R>, dominio variable de cadena pesada (VH) y los dominios constantes de la cadena pesada Y1 humana (CH1) se unieron como cadena independiente. El ADN codificante de la proteína de fusión respectiva resultante del intercambio de los dominios VL y CL por los dominios VH y CH1 se gener� mediante síntesis g�nica y se indica como <IGF1R> CL* (Cadena Ligera*) (SEC ID n� 4) a continuación.

Las figuras 5 y 6 muestran una vista esquemática de la secuencia proteica de <IGF-1R> CP* cadena pesada* modificada y de <IGF-1R> CL* cadena ligera* modificada.

A continuación se describen brevemente los vectores de expresión respectivos: Vector DW047-pUC-CP*-IGF-1R El vector DW047-pUC-CP*-IGF-1R es un pl�smido de expresión, por ejemplo para la expresión transitoria de <IGF1R> cadena pesada* CP* (casete de expresión organizado de ADNc; con CMV-Intr�n A en células HEK293 (EBNA)

o para la expresión estable en células CHO.

Aparte del casete de expresión de <IGF-1R> CP*, dicho vector contiene: -un origen de replicaci�n procedente del vector pUC18 que permite la replicaci�n de este pl�smido en E. coli, y

La unidad de transcripción del gen de <IGF-1R> CP* est� compuesta de los elementos siguientes:

-: un sitio de restricción AscI único en el extremo 5’, -el intensificador y promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano, -seguido de la secuencia del intr�n A, -una región 5’ no traducida de un gen de anticuerpo humano,

-: una secuencia de señal de cadena ligera de inmunoglobulina, -la cadena CP* madura de <IGF-1R> humana codificante de uan fusión del dominio variable de cadena ligera (VL) humana y el dominio constante de la cadena ligera kappa (CL) humana fusionado con el extremo 5' de los dominios Fc de los dominios constantes de la cadena pesada Y1 humana (bisagra-CH2-CH3). -una región 3’ no traducida con una secuencia de señal de poliadenilaci�n, y -el sitio de restricción único SgrAI en el extremo 3’.

El mapa plasm�dico del vector de expresión de <IGF-1R> CP*, DW047-pUC-CP*-IGF-1R se muestra en la figura 7. La secuencia de amino�cidos de <IGF-1R> CP* (incluyendo la secuencia de señal) se proporciona en SEC ID n� 3. Vector DW048-pUC-CL*-IGF-1R

El vector DW048-pUC-CL*-IGF-1R es un pl�smido de expresión, por ejemplo para la expresión transitoria de <IGF1R> cadena ligera* CL* de intercambio VL-VH/CL-CH1 (casete de expresión organizado de ADNc; con CMV-Intr�n A en células HEK293 (EBNA) o para la expresión estable en células CHO.

Aparte del casete de expresión de <IGF-1R> CL*, dicho vector contiene: -un origen de replicaci�n procedente del vector pUC18 que permite la replicaci�n de este pl�smido en E. coli, y

La unidad de transcripción del gen de <IGF-1R> CL* est� compuesta de los elementos siguientes: -el sitio de restricción único Sse8387I en el extremo 5’, -el intensificador y promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano, -seguido de la secuencia del intr�n A, -una región 5’ no traducida de un gen de anticuerpo humano,

- una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina, -la cadena CL* madura del anticuerpo <IGF-1R> humano codificante de uan fusión del dominio variable de cadena pesada (VH) humana y los dominios constantes de la cadena pesada Y1 (CH1) humana. -una región 3’ no traducida con una secuencia de señal de poliadenilaci�n, y -los sitios de restricción únicos SalI y FseI en el extremo 3’.

El mapa plasm�dico del vector de expresión de <IGF-1R> CL*, DW048-pUC-CL*-IGF-1R se muestra en la figura 8. La secuencia de amino�cidos de <IGF-1R> CL* (incluyendo la secuencia de señal) se proporciona en SEC ID n� 4.

Los pl�smidos DW047-pUC-CP*-IGF-1R y DW048-pUC-CL*-IGF-1R pueden utilizarse para cotransfecciones transitorias o estables en, por ejemplo, células HEK293, HEK293 EBNA o CHO (sistema de 2 vectores). Por motivos de comparación, el anticuerpo <IGF1R> de tipo salvaje se expres� transitoriamente a partir de los pl�smidos 4842pUC-CL-IGF-1R (SEC ID n� 2 y 4843-pUC-CP-IGF-1R (SEC ID n� 1) análogos a los indicados en el presente ejemplo.

Con el fin de conseguir niveles de expresión más altos en expresiones transitorias en células HEK293 EBNA, el casete de expresión de <IGF-1R> CP* puede subclonarse mediante los sitios AscI y SgrAI y el casete de expresión de <IGF-1R> CL* puede subclonarse mediante los sitios Sse8387I y FseI en el vector de expresión 4700 pUCHyg_OriP, que contiene: -un elemento OriP, y -un gen de resistencia a la higromicina como marcador seleccionable.

Las unidades de transcripción de cadenas pesada y ligera pueden subclonarse en dos vectores independientes 4700-pUC-Hyg-OriP para la cotransfecci�n (sistemas de 2 vectores) o pueden clonarse en un vector 4700-pUC-Hyg-OriP común (sistema de 1 vector) para las posteriores transfecciones transitorias o estables con los vectores resultantes. La figura 9 muestra un mapa plasm�dico del vector básico 4700-pUC-OriP.

Ejemplo 1B

Construcci�n de los pl�smidos de expresión para el anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1

Los genes de fusión de <IGF-1R> (genes de fusión de CP* y CL*) que comprendían las secuencias de Fab intercambiadas del anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje se ensamblaron mediante métodos y técnicas recombinantes conocidas mediante conexión de los segmentos de ácidos nucleicos correspondientes.

Cada una de las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de CP* y CL* de IGF-1R se sintetizaron mediante síntesis química y posteriormente se clonaron en un vector de clonaci�n pGA4 basado en pPCRScript (Stratagene) en Geneart (Regensburg, Alemania). El casete de expresión codificante de CP* de IGF-1R se ligó en el pl�smido de

E. coli respectivo mediante los sitios de restricción PvuII y BmgBI, resultando en el vector final DW047-pUC-CP*IGF-1R; el casete de expresión codificante de la CL* de IGF-1R respectiva se ligó en el pl�smido de E. coli respectivo mediante los sitios de restricción PvuII y SalI, resultando en el vector final DW048-pUC-CL*-IGF-1R. Las secuencias subclonadas de ácidos nucleicos se verificaron mediante secuenciaci�n del ADN. Para las transfecciones estables y transitorias, se prepararon cantidades mayores de los pl�smidos mediante preparación de pl�smidos a partir de cultivos de E. coli transformados (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Ejemplo 1C

Expresi�n transitoria de anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 en células HEK293 EBNA

Se expres� anticuerpo recombinante <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 mediante cotransfecci�n transitoria de los pl�smidos DW047-pUC-CP*-IGF-1R y DW048-pUC-CL*-IGF-1R en células HEK293-EBNA en crecimiento adherente (línea celular 293 renal embrionaria humana que expresa ant�geno nuclear de virus de Epstein-Barr, número de depósito de la American Type Culture Collection (ATCC) n� CRL-10852, lote 959 218) cultivadas en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco, Gibco) suplementado con FCS (suero de feto bovino, Gibco) al 10% con niveles ultrabajos de IgG, L-glutamina 2 mM (Gibco) y geneticina 250 mg/ml (Gibco). Para la transfecci�n, se utilizó reactivo de transfecci�n FuGENETM 6 (Roche Molecular Biochemicals) en una proporción de reactivo FuGENETM (él) a ADN (�g)

de 4:1 (comprendida entre 3:1 y 6:1). Se expresaron pl�smidos de cadenas ligera y pesada codificantes de CP* y CL* de <IGF1R> (pl�smidos DW047-pUC-CP*-IGF-1R and DW048-pUC-CL*-IGF-1R) a partir de dos pl�smidos diferentes utilizando una proporción molar de pl�smidos codificantes de cadena ligera a codificantes de cadena pesada de 1:1 (equimolar) comprendida entre 1:2 y 2:1, respectivamente. Las células se alimentaron el día 3 con Lglutamina 4 mM, glucosa [Sigma] y NAA [Gibco]. Los sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 se recolectaron entre los días 5 y 11 tras la transfecci�n mediante centrifugaci�n y se almacenaron a –20�C. Se proporciona información general sobre la expresión recombinante de inmunoglobulinas humanas en, por ejemplo, células HEK293, en: Meissner P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75:197-203, 2001.

Ejemplo 1D

Inmunoprecipitaci�n de anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1

Se aisl� el anticuerpo monoespec�fico bivalente <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 a partir de sobrenadantes de cultivo celular (Ejemplo 1C) mediante inmunoprecipitaci�n con perlas de proteína A-agarosa (Roche). Se lavaron 60 él de perlas de agarosa-proteína A tres veces en TBS-NP40 (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Nonidet-P40 al 1%). Posteriormente, se aplicaron 1 a 15 ml de sobrenadante de cultivo celular a las perlas de agarosa-proteína A preequilibradas en TBS-NP40. Tras la incubaci�n durante 1 h a temperatura ambiente, las perlas se lavaron en una columna de filtro Ultrafree-MC (Amicon) una vez con 0,5 ml de TBS-NP40, dos veces con 0,5 ml de 2x de solución salina tamponada con fosfato (2xPBS, Roche) y brevemente cuatro veces con 0,5 ml de citrato sádico 100 mM, pH 5,0. El anticuerpo ligado se eluy� mediante la adicion de 35 él de tampón para muestras NuPAGE� LDS (Invitrogen). Se combin� la mitad de la muestra con agente reductor de muestras NuPAGE� o se dej� sin reducir, respectivamente, y se calentó durante 10 minutos a 70�C. Después, se aplicaron 20 él a un SDS-PAGE Bis-Tris NuPAGE� al 4-12% (Invitrogen) (con tampón MOPS para SDS-PAGE no reducodp y tampón MES con aditivo antioxidante de tampón de migración NuPAGE� (Invitrogen) para un SDS-PAGE reducido) y se ti�� con azul de Coomassie. La figura 10 muestra el SDS-PAGE de un experimento de inmunoprecipitaci�n t�pico. El anticuerpo monoespec�fico bivalente <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 se comporta como un anticuerpo IgG1 t�pico, con una banda de aproximadamente 25 kDa correspondiente a la cadena ligera CL* y una banda de 50 kDa correspondiente a la cadena pesada CP* respectiva. En el estado no reducido puede observarse una banda en aproximadamente 150 kDa del anticuerpo completo.

Ejemplo 1E

Purificaci�n de anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 y confirmación de la identidad mediante espectrometr�a de masas

El anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 expresado y secretado se purificó a partir de sobrenadantes de cultivo celular filtrados, mediante cromatograf�a de afinidad de proteína A siguiendo métodos estándares conocidos. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular que contenían el anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 de transfecciones transitorias se clarificaron mediante centrifugaci�n (10.000 g durante 10 minutos) y filtración a través de un filtro de 0,45 Im y se aplicaron a una columna de proteína A HiTrap MabSelect Xtra (GE Healthcare) equilibrada con tampón PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM y KCl 2,7 mM, pH 7,4). Las proteínas no ligadas se lavaron con tampón de equilibraci�n PBS, seguido de tampón de citrato sádico 0,1 M, pH 5,5, y se lavaron con PBS. La eluci�n del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 se consiguió con citrato sádico 100 mM, pH 2,8, seguido de la neutralización inmediata de la muestra con 300 ml de Tris 2 M, pH 9,0, por cada fracción de 2 ml. Se separ� la proteína agregada de los anticuerpos monom�ricos mediante cromatograf�a de exclusión por tamaño en una columna de grado prep. HiLoad 26/60 Superdex 200 (GE Healthcare) en histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0, y las fracciones de anticuerpo monom�ricas se concentraron posteriormente utilizando un concentrador centrífugo Amicon Ultra-15 de Millipore. El anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 se congel� y se almacen� a -20�C � -80�C. Se analizó la integridad del intercambio <IGF1R> VL-VH/CL-CH1 mediante SDS-PAGE en presencia y en ausencia de un agente reductor y posterior tinción con azul de Coomassie brillante tal como se describe en el Ejemplo 1D. El anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 purificado se comporta como un anticuerpo IgG1 t�pico, con una banda de aproximadamente 25 kDa correspondiente a la cadena ligera CL* y una banda de 50 kDa correspondiente a la cadena pesada CP* respectiva. En el estado no reducido puede observarse una banda en aproximadamente 150 kDa del anticuerpo completo. La agregación y el estado oligom�rico del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 se analizaron mediante cromatograf�a analítica de exclusión por tamaño y demostraron que el anticuerpo Fab entrecruzado purificado se encontraba en un estado monom�rico. Se proporcionaron muestras caracterizadas para el análisis proteico y caracterización funcional posteriores. La espectrometr�a de masas IEP confirm� la masa molecular teórica (calculada sin el residuo de lisina C-terminal de la cadena pesada y con un residuo piroglutamato C-terminal de la cadena ligera) del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 completamente desglusilado como especie principal (figura 22).

Ejemplo 1F

An�lisis de las propiedades de unión a IGF-1R del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> 5 VL-VH/CL-CH1 en un ELISA de unión de ECD de IGF-1R y mediante Biacore

Se evaluaron las propiedades de unión del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 en un ensayo ELISA con el dominio extracelular (ECD) de IGF-1R tal como se ha indicado anteriormente. La figura 11 muestra los resultados normalizados de una titulación del anticuerpo de intercambio 10 <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 y del anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje de sobrenadantes de transfecci�n transitoria en HEK293E mediante ELISA de IgG de tipo s�ndwich. Puede observarse claramente que el anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 es funcional y muestra características de unión comparables a las del anticuerpo <IGF1R> de tipo salvaje y, de esta manera, aparentemente es completamente funcional. Las diferencias menores observadas se encuentran dentro del error del método y podrían resultar, por ejemplo, de variaciones menores de la

15 concentración de proteína.

Estos resultados fueron corroborados por los datos del Biacore con los anticuerpos purificados respectivos, que demostraron que el anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 presentaba una afinidad y cinética de unión comparables para ECD de IGF-1R a las del anticuerpo de tipo salvaje original dentro del

20 error del método. Se proporcionan los datos cinéticos en la tabla a continuación:

ka [1/Ms]: kd [1/s] K(D) [M]

anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje: 3,18x106 5,52110x10-3 1,74x10-9

Anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1: 2,65x106 6,258x10-3 2,36x10-9

Ejemplo 1G

25 Análisis de las propiedades de unión a IGF-1R del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 mediante FACS con células 124 sobreexpresantes de IGF-1R.

Con el fin de confirmar la actividad de unión de <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1, se estudi� mediante FACS anticuerpo de intercambio de unión a IGF-1R sobreexpresado sobre la superficie de las células I24 (células NIH3T3 que expresan 30 IGF-1R humana recombinante, Roche). Brevemente, se incubaron 5x105 células I24 por cada tubo de FACS con una dilución de anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 y anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje como referencia, y se incubaron sobre hielo durante 1 h. Se lav� el anticuerpo no unido con 4 ml de PBS helado (Gibco) + FCS al 2% (Gibco). A continuación, las células se centrifugaron (5 min a 400 g) y el anticuerpo ligado se detect� con conjugado F(ab')2 <FcY_h>PE (Dianova) sobre hielo durante 1 h protegido de la luz. El anticuerpo de detección no 35 ligado se lav� con 4 ml de PBS helado + FCS al 2%. A continuación, las células se centrifugaron (5 min a 400 g), se resuspendieron en 300 a 500 ml de PBS y el anticuerpo de detección ligado se cuantific� en un FACSCalibur o FACS Canto (BD, canal FL2, 10.000 células por adquisición). Durante el experimento se incluyeron los controles de isotipo respectivos para excluir cualesquiera sucesos de unión no específica. La unión del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 y el anticuerpo de referencia <IGF-1R> de tipo salvaje a IGF-1R sobre células I24 se

40 compara mediante un desplazamiento de la intensidad de fluorescencia media dependiente de la concentración. Algunos experimentos adicionales demostraron que el anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 también conservaban su actividad de inducción de la internalizaci�n de IGF-1R sobre células MCF7 y sólo presentaban una actividad ADCC reducida sobre las células DU145 en caso de incubarse con PBMC humanas comparable a la del anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje.

45 Conjuntamente los experimentos en el Ejemplo 1 demostraron que mediante la utilización del intercambio de dominios pueden generarse anticuerpos totalmente funcionales con propiedades comparables a las de los anticuerpos de tipo salvaje. Todas las propiedades funcionales se conservaron en los ensayos bioquímicos y celulares. Estos anticuerpos con intercambio de dominios forman la base para la generación de anticuerpos

50 biespec�ficos, tal como se indica posteriormente.

Ejemplo 2:

Producci�n, expresión, purificación y caracterización de anticuerpo monoespec�fico bivalente <ANGPT2>, en el que

55 los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y en el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro (abreviadamente en la presente memoria, anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1).

Ejemplo 2A

Construcci�n de los pl�smidos de expresión para el anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio variante <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1

Las secuencias de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio de angiopoyetina <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1, incluyendo las secuencias líder respectivas indicadas en el presente ejemplo, se derivaron de la cadena pesada del anticuerpo <ANGPT2> (SEC ID n� 6), y una cadena ligera (SEC ID n� 7) descrita en el documento n� WO 2006/045049 y los dominios constantes de cadenas pesada y ligera se derivaron de un anticuerpo humano (C-kappa e IgG1).

Los segmentos g�nicos codificantes de la secuencia líder del anticuerpo <ANGPT2>, dominio variable de cadena ligera (VL) y el dominio constante de cadena ligera kappa humana (CL) se unieron y se fusionaron con el extremo 5' de los dominios Fc de los dominios constantes de la cadena pesada Y1 humana (bisagra-CH2-CH3). El ADN codificante de la proteína de fusión respectiva resultante del intercambio de los dominios VH y CH1 por los dominios VL y CL se gener� mediante síntesis g�nica y se indica como <ANGPT2> CP* (Cadena Pesada*) (SEC ID n� 8) a continuación.

Los segmentos g�nicos de la secuencia líder del anticuerpo <ANGPT2>, dominio variable de cadena pesada (VH) y los dominios constantes de la cadena pesada Y1 humana (CH1) se unieron como cadena independiente. El ADN codificante de la proteína de fusión respectiva resultante del intercambio de los dominios VL y CL por los dominios VH y CH1 se gener� mediante síntesis g�nica y se indica como <ANGPT2> CL* (Cadena Ligera*) (SEC ID n� 9) a continuación.

Los vectores de expresión respectivos son análogos a los indicados en el Ejemplo 1A. El mapa plasm�dico del vector de expresión de <ANGPT2> CP*, pUC-CP*-ANGPT2, se muestra en la figura 12. La secuencia de amino�cidos de <ANGPT2> CP* (incluyendo la secuencia de señal) se proporciona en SEC ID n� 8.

El mapa plasm�dico del vector de expresión de <ANGPT2> CL*, pUC-CL*-ANGPT2, se muestra en la figura 13. La secuencia de amino�cidos de <ANGPT2> CL* (incluyendo la secuencia de señal) se proporciona en SEC ID n� 9. Los pl�smidos pUC-CP*-ANGPT2 y pUC-CL*-ANGPT2 pueden utilizarse para cotransfecciones transitorias o estables en, por ejemplo, células HEK293-F, HEK293 EBNA o CHO (sistema de 2 vectores).

Con el fin de conseguir niveles de expresión más altos en expresiones transitorias en células HEK293 EBNA, el casete de expresión de <ANGPT2> CP* puede subclonarse mediante los sitios AscI y SgrAI y el casete de expresión de <ANGPT2> CL* puede subclonarse mediante los sitios Sse8387I y FseI en el vector de expresión 4700 pUCHyg_OriP, tal como se indica en el Ejemplo 1A: Las unidades de transcripción de cadenas pesada y ligera pueden subclonarse en dos vectores independientes 4700-pUC-Hyg-OriP para la cotransfecci�n (sistemas de 2 vectores) o pueden clonarse en un vector 4700-pUC-Hyg-OriP común (sistema de 1 vector) para las posteriores transfecciones transitorias o estables con los vectores resultantes mediante los sitios FseI, SgrAI, Sse8387I y AscI.

El anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje se clon� en los pl�smidos SB04-pUC-CP-ANGPT2 (SEC ID n� 6) y SB06-pUC-CL-ANGPT2 (SEC ID n� 7) que son análogos a los vectores descritos en el presente ejemplo y en el ejemplo anterior, 1A. Las unidades de transcripción para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje se subclonaron a partir de los pl�smidos vectores básicos SB04-pUC-CP-ANGPT2 y SB06-pUC-CL-ANGPT2 mediante los sitios FseI, SgrAI, Sse8387I en los pl�smidos SB07-pUC-Hyg-OriP-CP-ANGPT2 y SB09-pUC-Hyg-OriP-CL-ANGPT2 con el fin de conseguir niveles de expresión transitoria más altos en las células HEK293E. Por motivos comparativos y para los experimentos de coexpresi�n (ver el Ejemplo 3), el anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje se (co-) expres� transitoriamente a partir de los pl�smidos SB07-pUC-Hyg-OriP-CP-ANGPT2 y SB09-pUC-Hyg-OriP-CL-ANGPT2 � a partir de los pl�smidos SB04-pUC-CP-ANGPT2 y SB06-pUC-CL-ANGPT2.

Ejemplo 2B

Construcci�n de los pl�smidos de expresión para el anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1

Los genes de fusión del anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 (genes de fusión de CP* y CL*) que comprendían las secuencias de Fab intercambiadas del anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje se ensamblaron mediante métodos y técnicas recombinantes conocidos mediante conexión de los segmentos de ácidos nucleicos correspondientes.

Cada una de las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de CP* y CL* del anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 se sintetizaron mediante síntesis química y posteriormente se clonaron en un vector de clonaci�n pGA4 basado en pPCRScript (Stratagene) en Geneart (Regensburg, Alemania). El casete de expresión codificante de CP* del anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 se ligó en el pl�smido de E. coli

respectivo mediante los sitios de restricción PstI y EcoNI, resultando en el vector final pUC-CP*-<ANGPT2>; el casete de expresión codificante de la CL* de <ANGPT2> respectiva se ligó en el pl�smido de E. coli respectivo mediante los sitios de restricción PvuII y FseI, resultando en el vector final pUC-CL*-<ANGPT2>. Las secuencias de ácidos nucleicos subclonadas se verificaron mediante secuenciaci�n del ADN. Para las transfecciones transitorias y estables, se prepararon cantidades mayores de los pl�smidos mediante preparación de pl�smidos a partir de cultivos de E. coli transformados (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Ejemplo 2C

Expresi�n transitoria de anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 en células HEK293 EBNA

Se expres� anticuerpo recombinante de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 mediante cotransfecci�n transitoria de los pl�smidos pUC-CP*-ANGPT2> y pUC-CL*-ANGPT2> en células HEK293-EBNA de crecimiento adherente (línea celular 293 renal embrionaria humana que expresa ant�geno nuclear de virus de Epstein-Barr, número de depósito de la American Type Culture Collection (ATCC) n� CRL-10852, lote 959 218) cultivadas en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco, Gibco) suplementado con FCS (suero de feto bovino, Gibco) al 10% con niveles ultrabajos de IgG, L-glutamina 2 mM (Gibco) y geneticina 250 mg/ml (Gibco). Para la transfecci�n, se utilizó reactivo de transfecci�n FuGENETM 6 (Roche Molecular Biochemicals) en una proporción de reactivo FuGENETM (él) a ADN (�g) de 4:1 (comprendida entre 3:1 y 6:1). Se expresaron pl�smidos de cadenas ligera y pesada codificantes de CP* y CL* de <ANGPT2> (pl�smidos pUC-CP*-ANGPT2> and pUC-CL*-ANGPT2>) a partir de dos pl�smidos diferentes utilizando una proporción molar de pl�smidos codificantes de cadena ligera a codificantes de cadena pesada de 1:1 (equimolar) comprendida entre 1:2 y 2:1, respectivamente. Las células se alimentaron el día 3 con L-glutamina 4 mM, glucosa [Sigma] y NAA [Gibco]. Los sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 se recolectaron entre los días 5 y 11 tras la transfecci�n mediante centrifugaci�n y se almacenaron a –20�C. Se proporciona información general sobre la expresión recombinante de inmunoglobulinas humanas en, por ejemplo, células HEK293, en: Meissner P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75:197-203, 2001.

Ejemplo 2D

Purificaci�n de anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 y confirmación de la identidad mediante espectrometr�a de masas

El anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 expresado y secretado se purificó a partir de sobrenadantes de cultivo celular filtrados, mediante cromatograf�a de afinidad de proteína A siguiendo métodos estándares conocidos. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular que contenían el anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 de transfecciones transitorias se clarificaron mediante centrifugaci�n (10.000 g durante 10 minutos) y filtración a través de un filtro de 0,45 Im y se aplicaron a una columna de proteína A HiTrap MabSelect Xtra (GE Healthcare) equilibrada con tampón PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM y KCl 2,7 mM, pH 7,4). Las proteínas no ligadas se lavaron con tampón de equilibraci�n PBS, seguido de tampón de citrato sádico 0,1 M, pH 5,5, y se lavaron con PBS. La eluci�n del anticuerpo de intercambio VL-VH/CL-CH1 se consiguió con citrato sádico 100 mM, pH 2,8, seguido de la neutralización inmediata de la muestra con 300 ml de Tris 2 M, pH 9,0, por cada fracción de 2 ml. Se separ� la proteína agregada de los anticuerpos monom�ricos mediante cromatograf�a de exclusión por tamaño en una columna de grado prep. HiLoad 26/60 Superdex 200 (GE Healthcare) en histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0, y las fracciones de anticuerpo monom�ricas se concentraron posteriormente utilizando un concentrador centrífugo Amicon Ultra-15 de Millipore. El anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 se congel� y se almacen� a 20�C � -80�C. Se analizó la integridad del anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 mediante SDS-PAGE en presencia y en ausencia de un agente reductor y posterior tinción con azul de Coomassie brillante (figura 23-A). La agregación y el estado oligom�rico del anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 se analizaron mediante cromatograf�a analítica de exclusión por tamaño (figura 23-B). Se proporcionaron muestras caracterizadas para el análisis proteico y caracterización funcional posteriores. La espectrometr�a de masas IEP confirm� la masa molecular teórica del anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 desglucosilado como especie principal. No pudo observarse contaminación por proteínas similares a anticuerpos.

Ejemplo 2F

An�lisis de las propiedades de unión a <ANGPT2> del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 en un ELISA de unión de <ANGPT2> y mediante Biacore

Se evaluaron las propiedades de unión del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 en un ensayo ELISA con proteína ANGPT2>-His de longitud completa (R&D Systems) tal como se ha indicado anteriormente. La figura 24 muestra los resultados de una titulación del anticuerpo de intercambio <IGF

1R> VL-VH/CL-CH1 purificado y del anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje en el ELISA de unión de tipo s�ndwich. Puede observarse claramente que el anticuerpo de intercambio <ANGPT> VL-VH/CL-CH1 es funcional y muestra características de unión comparables a las del anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje y, de esta manera, aparentemente es completamente funcional. Las diferencias menores observadas se encuentran dentro del error del método y podrían resultar, por ejemplo, de variaciones menores de la concentración de proteína.

Estos resultados fueron corroborados por los datos del Biacore con los anticuerpos purificados respectivos, que demostraron que el anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 presentaba un valor de KD de 13 pM, presentaba una afinidad y cinética de unión comparables para ANGPT2 dentro del error del método a las del anticuerpo original de tipo salvaje <ANGPT2> con un valor KD de 12 pM (figura 25).

Ejemplo 2G

An�lisis de las propiedades funcionales del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1

Con el fin de demostrar que el anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 presenta propiedades funcionales comparables a las del anticuerpo original de tipo salvaje <ANGPT2>, se compararon los dos anticuerpos para su capacidad de interferir con la unión de ANGPT2 a su dominio extracelular del receptor Tie2 en un ensayo de unión de ELISA tal como se ha indicado anteriormente. En el ELISA de unión respectivo, el anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 presentaba un valor de EC50 de 135 ng/ml para la interferencia con la unión de ANGPT2 humano, que es comparable al valor de EC50 de 145 nM para el anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje original. Estos datos fueron confirmados en un ensayo de unión competitiva de ligandos celulares con células HEK293 sobreexpresantes de Tie2 sobre su superficie, en las que el anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 presentaba un valor de EC50 de 225 ng/ml para la interferencia con la unión de la ANGPT2 humana que era comparable al valor de EC50 de 205 nM para el anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje original (datos no mostrados). Conjuntamente los experimentos en el Ejemplo 2 demostraron que mediante la utilización del intercambio de dominios pueden generarse anticuerpos totalmente funcionales con propiedades comparables a las de los anticuerpos de tipo salvaje. Todas las propiedades funcionales se conservaron en los ensayos bioquímicos y celulares. Estos anticuerpos con intercambio de dominios forman la base para la generación de anticuerpos biespec�ficos, tal como se indica posteriormente, en los Ejemplos 3 y 4.

Ejemplo 2H

Un análisis de modelaje molecular de los anticuerpos con intercambio de dominios revel� que el espacio est�rico entre los dominios intercambiados podría estar limitando el plegamiento. Por lo tanto, se diseñaron constructos en los que se introdujo un residuo adicional de glicina en el extremo C-terminal de los dominios intercambios del Fab, por ejemplo entre la región conectora de VL-CL y la bisagra, o en el extremo del dominio VH-CH1 libre, respectivamente. El anticuerpo bivalente monoespec�fico respectivo se indica como anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH(G)/CL-CH1(G) a continuación.

Las secuencias de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio de angiopoyetina <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1, incluyendo las secuencias líder respectivas indicadas en el presente ejemplo, se derivaron de la cadena pesada del anticuerpo <ANGPT2> humano (SEC ID n� 6), y una cadena ligera (SEC ID n� 7) descrita en el documento n� WO 2006/045049 y los dominios constantes de cadenas pesada y ligera se derivaron de un anticuerpo humano (C-kappa e IgG1).

Los segmentos g�nicos codificantes de la secuencia líder del anticuerpo <ANGPT2>, dominio variable de cadena ligera (VL) y el dominio constante de la cadena ligera kappa humana (CL) se unieron y se fusionaron con el extremo 5' de los dominios Fc de los dominios constantes de la cadena pesada Y1 humana (bisagra-CH2-CH3), incluyendo un residuo adicional de glicina. El ADN codificante de la proteína de fusión respectiva resultante del intercambio de los dominios VH y CH1 por los dominios VL y CL se gener� mediante síntesis g�nica y se indica como <ANGPT2> CP(G)* (Cadena Pesada*) (SEC ID n� 17) a continuación.

Los segmentos g�nicos de la secuencia líder del anticuerpo <ANGPT2>, dominio variable de cadena pesada (VH) y los dominios constantes de la cadena pesada Y1 humana (CH1) se unieron como cadena independiente, incluyendo un residuo adicional de glicina. El ADN codificante de la proteína de fusión respectiva resultante del intercambio de los dominios VL y CL por los dominios VH y CH1 se gener� mediante síntesis g�nica y se indica como <ANGPT2> CL(G)* (Cadena Ligera*) (SEC ID n� 18) a continuación.

Los vectores de expresión respectivos son análogos a los indicados en los Ejemplos 2, anteriormente. A continuación, se utilizaron estos vectores de expresión para la coexpresi�n transitoria del anticuerpo <ANGPT2> VL

VH(G)/CL-CH1(G) respectivo con intercambio de dominio en células HEK293-F. El anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH(G)/CL-CH1(G) respectivo se purificó a partir de la expresión transitoria tal como se ha indicado anteriormente, y se analizó mediante SDS-PAGE, cromatograf�a de exclusión por tamaño y espectrometr�a de masas del anticuerpo respectivo. Los rendimientos de expresión de proteínas eran buenos y similares a los rendimientos de expresión obtenidos para el anticuerpo de intercambio VL-VH/CL-CH1 indicado anteriormente. Todas las propiedades investigadas no mostraron resultados inesperados y eran esencialmente comparables al anticuerpo de tipo salvaje <ANGPT2> respectivo. La figura 31 de muestra las propiedades virtualmente comparables del anticuerpo de tipo salvaje <ANGPT2> y el anticuerpo <ANGPT2> VL-VH(G)/CL-CH1(G) en un ensayo Biacore de unión de ANGPT2. Dentro del error del método, ambos anticuerpos mostraron una afinidad de unión comparable para ANGPT2 humano, con valores de KD estimados (medias de dos determinaciones) de aproximadamente 38 pM para el anticuerpo de tipo salvaje <ANGPT2> y de aproximadamente 45 pM para el anticuerpo <ANGPT2> VLVH(G)/CL-CH1(G).

ka [1/Ms]: kd [1/s] K(D) [M]

anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje: 5,26x105 2,0x10-4 3,79x10-10

Anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH(G)/CL-CH1(G): 5,29x106 2,358x10-3 4,45x10-9

Ejemplo 3

Expresi�n de anticuerpo biespec�fico bivalente <ANGPT2-IGF-1R>, en el que en las cadenas pesada y ligera de unión específica a IGF-1R, los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y en el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro (abreviadamente en la presente memoria, anticuerpo de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1).

Ejemplo 3A

Coexpresi�n transitoria del anticuerpo de tipo salvaje <ANGPT2> y del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 en células HEK293 EBNA, rindiendo el anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1

Con el fin de generar un anticuerpo biespec�fico funcional que reconociese <ANGPT2> mediante la región Fab de tipo salvaje <ANGPT2> en un lado e IGF-1R mediante la región Fab del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 en el otro lado, se coexpresaron los dos pl�smidos de expresión codificantes del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 (Ejemplo 1A) con dos pl�smidos de expresión codificantes del anticuerpo de tipo salvaje <ANGPT2> (Ejemplo 2A). Bajo la premisa de una asociación estadística entre las cadenas pesadas de tipo salvaje CP y las cadenas pesadas entrecruzadas de Fab CP*, lo anterior result� en la generación de anticuerpo biespec�fico y bivalente de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1. Bajo la premisa de que ambos anticuerpos se expresan igualmente bien y sin considerar productos secundarios, lo anterior debería haber resultado en una proporción 1:2:1 de los tres productos principales: anticuerpo monoespec�fico de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1, anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 y anticuerpo de tipo salvaje <ANGPT2>. Además, pueden esperarse varios productos secundarios, tales como CL-CL* (fragmento Fab2), CP-CP* (anticuerpo monovalente) y d�meros CP*-CP.

En contraste, al coexpresar los dos pl�smidos de expresión codificantes del anticuerpo de tipo salvaje <IGF-1R> (Ejemplo 1A) y los dos pl�smidos de expresión codificantes del anticuerpo de tipo salvaje <ANGPT2> como referencia, únicamente se genera una proporción reducida de anticuerpo biespec�fico <IGF-1R-ANGPT2> funcional debido a la asociación estadística de las cadenas pesadas aunque asociación no guiada de cadenas ligeras con ambas cadenas pesadas de los anticuerpos de tipo salvaje <IGF-1R> y <ANGPT2>.

Para generar la mezcla de los productos principales: A) anticuerpo monoespec�fico de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1, B) anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 y C) anticuerpos de tipo salvaje <ANGPT2>, los cuatro pl�smidos, DW047-pUC-CP*-IGF-1R Y DW048-pUC-CL*-IGF-1R y los pl�smidos SB07-pUC-Hyg-OriP-CP-ANGPT2 y SB09-pUC-Hyg-OriP-CL-ANGPT2 � los pl�smidos SB04-pUC-CP-ANGPT2 y SB06-pUC-CL-ANGPT2, se cotransfectaron transitoriamente en células HEK293-EBNA de crecimiento adherente (líneas celular renal embrionaria humana 293 expresante de ant�geno nuclear de virus de Epstein-Barr; número de depósito de la American Type Culture Collection (ATCC) n� CRL-10852, n� de lote 959 218) cultivadas en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco, Gibco) suplementado con FCS (suero de feto bovino, Gibco) al 10% con niveles ultrabajos de IgG, L-glutamina 2 mM (Gibco) y geneticina 250 mg/ml (Gibco). Para la transfecci�n, se utilizó reactivo de transfecci�n FuGENETM 6 (Roche Molecular Biochemicals) en una proporción de reactivo FuGENETM (él) a ADN (�g) de 4:1 (comprendida entre 3:1 y 6:1). Los pl�smidos de cadenas ligera y pesada codificantes de <IGF1R> CP* y CL* (pl�smidos DW047-pUC-CP*-IGF-1R y DW048-pUC-CL*-IGF-1R) y de <ANGPT2> CP y CL (pl�smidos SB07-pUC-Hyg-OriP-CP-ANGPT2 y SB09-pUC-Hyg-OriP-CL-ANGPT2 � los pl�smidos SB04-pUC-CP-ANGPT2 y SB06-pUC-CL-ANGPT2, respectivamente) se expresaron a partir de cuatro pl�smidos diferentes

utilizando una proporción molar de pl�smidos codificantes de cadenas ligeras a pl�smidos codificantes de cadenas pesadas de 1:1 (equimolaridad). Las células se alimentaron el día 3 con L-glutamina 4 mM, glucosa [Sigma] y NAA [Gibco]. El sobrenadante recolectado contenía una mezcla de los productos principales: A) anticuerpo monoespec�fico de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1, B) anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF1R> VL-VH/CL-CH1 y C) anticuerpos de tipo salvaje <ANGPT2> y se indica como "mezcla biespec�fica de intercambio VL-VH/CL-CH1". Los sobrenadantes de cultivo celular que contenían la mezcla biespec�fica de intercambio VL-VH/CL-CH1 se recolectaron entre los días 5 y 11 después de la transfecci�n, mediante centrifugaci�n, y se almacenaron a -20�C.

Por motivos de comparación, el anticuerpo de tipo salvaje <IGF-1R> se coexpres� transitoriamente a partir de pl�smidos CP y CL (4842-pUC-CL-IGF-1R y 4843-pUC-CP-IGF-1R, Ejemplo 1A) conjuntamente con los pl�smidos de tipo salvaje <ANGPT2> CP y CL (SB07-pUC-Hyg-OriP-CP-ANGPT2 y SB09-pUC-Hyg-OriP-CL-ANGPT2 � SB04-pUC-CP-ANGPT2 y SB06-pUC-CL-ANGPT2, respectivamente). Las células se alimentaron el día 3 con L-glutamina 4 mM, glucosa [Sigma] y NAA [Gibco]. El sobrenadante recolectado contenía una mezcla de diferentes variantes de anticuerpo de tipo salvaje <IGF-1R> y <ANGPT2>, monoespec�ficas, biespec�ficas o incompetentes para la unión debido a la asociación no guiada de cadenas ligeras con las cadenas pesadas de los anticuerpos de tipo salvaje <IGF-1R> y <ANGPT2>, resultando en una asociación incorrecta de cadenas ligeras, y se indica como "mezcla de tipo salvaje". Los sobrenadantes de cultivo celular que contenían la mezcla de tipo salvaje se recolectaron entre los días 5 y 11 después de la transfecci�n, mediante centrifugaci�n, y se almacenaron a -20�C.

Debido a que el anticuerpo de tipo salvaje <ANGPT2> mostraba rendimientos de expresión transitoria significativamente más altos que los anticuerpos entrecruzados Fab <IGF-1R> y <IGF-1R>, la proporción de pl�smidos de anticuerpo de tipo salvaje <ANGPT2> y pl�smidos de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 se encontraba desplazada en favor de la expresión del anticuerpo de tipo salvaje <ANGPT2>. La proporción de pl�smidos debe adaptarse durante los experimentos futuros para permitir una expresión igual de ambas especificidades, resultando en una distribución más uniforme de los diferentes anticuerpos.

Ejemplo 3B

Inmunoprecipitaci�n de anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1

Se aisl� a partir de sobrenadantes de cultivo celular (Ejemplo 3A) mediante inmunoprecipitaci�n con perlas de proteína A-agarosa (Roche) una mezcla de los productos principales: A) anticuerpo monoespec�fico de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1, B) anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 y C) anticuerpos de tipo salvaje <ANGPT2> ("mezcla biespec�fica de intercambio VL-VH/CL-CH1") y se indica como "mezcla biespec�fica de intercambio VL-VH/CL-CH1". Se lavaron 60 él de perlas de agarosa-proteína A tres veces en TBS-NP40 (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Nonidet-P40 al 1%). Posteriormente, se aplicaron 1 a 15 ml de sobrenadante de cultivo celular a las perlas de agarosa-proteína A preequilibradas en TBS-NP40. Tras la incubaci�n durante 1 h a temperatura ambiente, las perlas se lavaron en una columna de filtración Ultrafree-MC (Amicon) una vez con 0,5 ml de TBS-NP40, dos veces con 0,5 ml de 2x de solución salina tamponada con fosfato (2xPBS, Roche) y brevemente cuatro veces con 0,5 ml de citrato sádico 100 mM, pH 5,0. El anticuerpo ligado se eluy� mediante la adicion de 35 él de tampón para muestras NuPAGE� LDS (Invitrogen). Se combin� la mitad de la muestra con agente reductor de muestras NuPAGE� o se dej� sin reducir, respectivamente, y se calentó durante 10 minutos a 70�C. Después, se aplicaron 20 él a un SDS-PAGE Bis-Tris NuPAGE� al 4-12% (Invitrogen) (con tampón MOPS para SDS-PAGE no reducido y tampón MES con aditivo antioxidante de tampón de migración NuPAGE� (Invitrogen) para un SDS-PAGE reducido) y se ti�� con azul de Coomassie. En el SDS-PAGE no pudo observarse ninguna diferencia entre las tres especies de anticuerpo. Todos los anticuerpos se comportaron como anticuerpos IgG1 t�picos, con una banda de aproximadamente 25 kDa correspondiente a la cadenas ligeras y una banda de 50 kDa correspondiente a la cadenas pesadas respectivas. En el estado no reducido podía observarse una banda en aproximadamente 150 kDa del anticuerpo completo. De esta manera, con el fin de demostrar la presencia de anticuerpo biespec�fico <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 funcional, se purificó la mezcla entrecruzada de las tres especies de anticuerpo (Ejemplo 3C) y se dise�� un ensayo de FACS celular de puente (Ejemplo 3D).

Ejemplo 3C

Purificaci�n de anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1

La mezcla de los productos principales: A) anticuerpo monoespec�fico de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1, B) anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 y C) anticuerpos de tipo salvaje <ANGPT2> ("mezcla biespec�fica de intercambio VL-VH/CL-CH1") del Ejemplo 3A se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo celular filtrados mediante cromatograf�a de afinidad de proteína A seguido de cromatograf�a de exclusión por tamaño siguiendo métodos estándares conocidos. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular que contenían la mezcla de anticuerpos procedente de transfecciones de los pl�smidos DW047

pUC-CP*-IGF-1R y DW048-pUC-CL*-IGF-1R y SB07-pUC-Hyg-OriP-CP-ANGPT2 y SB09-pUC-Hyg-OriP-CL-ANGPT2<IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 se clarificaron mediante centrifugaci�n (10.000 g durante 10 minutos) y filtración a través de un filtro de 0,45 Im y se aplicaron a una columna de proteína A HiTrap MabSelect Xtra (GE Healthcare) equilibrada con tampón PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM y KCl 2,7 mM, pH 7,4). Las proteínas no ligadas se lavaron con tampón de equilibraci�n PBS, seguido de tampón de citrato sádico 0,1 M, pH 5,5, y se lavaron con PBS. La eluci�n del anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 se consiguió con citrato sádico 100 mM, pH 2,8, seguido de la neutralización inmediata de la muestra con 300 ml de Tris 2 M, pH 9,0, por cada fracción de 2 ml. Se separ� la proteína agregada de los anticuerpos monom�ricos mediante cromatograf�a de exclusión por tamaño en una columna de grado prep. HiLoad 26/60 Superdex 200 (GE Healthcare) en histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0, y las fracciones de anticuerpo monom�ricas se concentraron posteriormente utilizando un concentrador centrífugo Amicon Ultra-15 de Millipore. La mezcla de anticuerpos de intercambio VL-VH/CL-CH1 se congel� y se almacen� a -20�C o a -80�C. Se analizó la integridad de las especies de anticuerpo mediante SDS-PAGE (ver la fig. 14) en presencia y en ausencia de un agente reductor y posterior tinción con azul de Coomassie brillante tal como se describe en el Ejemplo 1D. La mezcla de anticuerpos se comport� como anticuerpos IgG1 t�picos, con una banda aproximadamente en 25 kDa correspondiente a la cadenas ligeras y una banda en 50 kDa correspondiente a la cadenas pesadas respectivas. En el estado no reducido podía observarse una banda en aproximadamente 150 kDa del anticuerpo completo. No eran visibles productos secundarios evidentes, tales como anticuerpos monovalentes, etc., en el SDS-PAGE tras la purificación con proteína A. La agregación y el estado oligom�rico del anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 se analizaron mediante cromatograf�a analítica de exclusión por tamaño y demostraron que las especies de anticuerpo purificadas se encontraban en un estado monom�rico. Se proporcionaron muestras caracterizadas para el análisis proteico y caracterización funcional posteriores. De esta manera, con el fin de demostrar la presencia de anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 funcional, se purificó la mezcla de las tres especies de anticuerpo en un ensayo de FACS celular de puente (Ejemplo 3D).

Por motivos de comparación, la mezcla de tipo salvaje resultante de la coexpresi�n de los pl�smidos de anticuerpo de tipo salvaje <IGF-1R> CP y CL (4842-pUC-CL-IGF-1R y 4843-pUC-CP-IGF-1R, Ejemplo 1A) conjuntamente con los pl�smidos de tipo salvaje <ANGPT2> CP y CL (SB07-pUC-Hyg-OriP-CP-ANGPT2 y SB09-pUC-Hyg-OriP-CL-ANGPT2) se purificó como referencia a partir de sobrenadantes de cultivo celular filtrados, mediante cromatograf�a de afinidad de proteína A seguido de cromatograf�a de exclusión por tamaño siguiendo el procedimiento descrito.

Ejemplo 3D

Detecci�n de anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 funcional en un ensayo FACS celular de puente sobre células I24 expresantes de IGF-1R

Con el fin de confirmar la presencia de anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 funcional en la "mezcla biespec�fica de intercambio VL-VH/CL-CH1" de los productos principales A) anticuerpo mooespec�fico de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1, B) anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF1R> VL-VH/CL-CH1 y C) anticuerpos de tipo salvaje <ANGPT2> de la coexpresi�n transitoria descritos en el Ejemplo 3A, se llev� a cabo un ensayo FACS celular de puente de IGF-1R-ANGPT2 sobre células I24 (células NIH3T3 expresantes de IGF-1R humano recombinante, Roche). El principio del ensayo se ilustra en la fig. 15. Un anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 que se encuentra presente en el sobrenadante (Ejemplo 3A) o en la mezcla de anticuerpos purificada (Ejemplo 3C), respectivamente, es capaz de unirse a IGF-1R en las células I24 y a ANGPT2 simultáneamente, y de esta manera formar� un puente entre sus dos ant�genos diana y las dos regiones Fab opuestas.

Brevemente, se incubaron 5x105 células I24 por cada tubo de FACS con 50 ml de sobrenadante de cultivo celular no diluido o con una dilución de 160 mg/ml de mezcla de anticuerpos totales purificada y se incubaron sobre hielo durante 1 h. En el primer caso las células se incubaron con A) sobrenadantes de cultivo celular de la coexpresi�n de los pl�smidos de <IGF-1R> entrecruzado (DW047-pUC-CP*-IGF-1R y DW048-pUC-CL*-IGF-1R) con los pl�smidos de tipo salvaje <ANGPT2> (SB04-pUC-CP-ANGPT2> y SB06-pUC-CL-ANGPT2) indicados como "mezcla biespec�fica de intercambio VL-VH/CL-CH1" o B) con sobrenadante de cultivo celular procedente de la coexpresi�n de los pl�smidos de tipo salvaje <IGF-1R> (4842-pUC-CL-IGF-1R y 4843-pUC-CP-IGF-1R) con los pl�smidos de tipo salvaje <ANGPT2> (SB04-pUC-CP-ANGPT2> y SB06-pUC-CL-ANGPT2) indicados como "mezcla de tipo salvaje" (figura 16). En el segundo caso, la mezcla de anticuerpos purificada respectiva de la mezcla biespec�fica de intercambio VL-VH/CL-CH1 � de la mezcla de tipo salvaje se aplicó a las células I24 (Ejemplo 3C, figura 17). Se elimin� mediante lavado el anticuerpo no ligado con 4 ml de PBS helado (Gibco) y FCS al 2% (Gibco) y las células se centrifugaron (5 min a 400g) y el anticuerpo biespec�fico ligado se detect� con 50 ml de angiopoyetina-2 (ANGPT2) humana 2 mg/ml (R&D Systems) durante 1 h sobre hielo. A continuación, la angiopoyetina-2 (ANGPT2) no ligada se elimin� mediante lavado una vez (fig. 16) o dos veces (fig. 17) con 4 ml de PBS helado (Gibco) + FCS al 2% (Gibco); las células se centrifugaron (5 min a 400g) y la angiopoyetina-2 ligada se detect� con 50 ml de anticuerpo <Ang2>IgG1_m-Biotina 5 mg/ml (BAM0981, R&D Systems) durante 45 min sobre hielo; alternativamente

las células se incubaron con 50 ml de IgG1_m-Biotina-control de isotipo 5 mg/ml (R&D Systems). Se elimin� mediante lavado el anticuerpo no ligado con 4 ml de PBS helado (Gibco) y FCS al 2% (Gibco) y las células se centrifugaron (5 min a 400g) y el anticuerpo de detección ligado se detect� con 50 ml de conjugado de estreptavidina-PE 1:400 (Invitrogen/Zymed) durante 45 min sobre hielo protegido de la luz. El conjugado de estreptavidina-PE no ligado se elimin� mediante lavado con 4 ml de PBS helado + FCS al 2%. A continuación, las células se centrifugaron (5 min a 400 g), se resuspendieron en 300 a 500 ml de PBS y el conjugado de estreptavidina-PE ligado se cuantific� en un FACSCalibur o FACS Canto (canal FL2, 10.000 células por adquisición). Durante el experimento se incluyeron los controles de isotipo respectivos para excluir cualesquiera sucesos de unión no específica. Además, a modo de controles se incluyeron los anticuerpos monoespec�ficos bivalentes IgG1 purificados <IGF1R> y <ANGPT2>.

La fig. 16 muestra los resultados del ensayo de FACS celular de puente sobre células I24 con los sobrenadantes de cultivo celular; la fig. 17 muestra los resultados con la mezcla de anticuerpos purificada. En ambos casos en los que se aplicó la tecnología de intercambio VL-VH/CL-CH1, la incubaci�n con sobrenadante o con "mezcla de anticuerpos biespec�ficos de intercambio VL-VH/CL-CH1" purificada procedente de la coexpresi�n de un anticuerpo de intercambio VL-VH/CL-CH1 con un anticuerpo de tipo salvaje result� en un desplazamiento significativo de la fluorescencia indicativo de la presencia de un anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 funcional que era capaz de unirse a IGF-1R en las células I24 y a ANGPT2 simultáneamente, y que de esta manera forma un puente entre sus dos ant�genos diana y las dos regiones Fab opuestas. En contraste con lo anterior y tal como se predice para la coexpresi�n de dos anticuerpos de tipo salvaje, sólo se forma una proporción muy reducida de anticuerpos biespec�ficos funcionales, resultando en únicamente un ligero desplazamiento de la fluorescencia en el ensayo FACS de puente al aplicar el sobrenadante de cultivo celular o la "mezcla de tipo salvaje" de anticuerpos purificada procedente de la coexpresi�n de los pl�smidos de tipo salvaje <IGF-1R> con los pl�smidos de tipo salvaje <ANGPT2>, indicando la presencia de sólo una fracción reducida de anticuerpo biespec�fico de tipo salvaje <IGF-1R-ANGPT2> funcional.

Estos resultados demuestran que mediante la coexpresi�n de pl�smidos de intercambio VL-VH/CL-CH1 codificantes de un anticuerpo <IGF-1R> con pl�smidos de tipo salvaje codificantes de un anticuerpo <ANGPT2>, pueden generarse fácilmente anticuerpos biespec�ficos de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 funcionales que reconocen las dos dianas diferentes simultáneamente. En contraste, la coexpresi�n de dos pl�smidos de tipo salvaje codificantes de los anticuerpos <IGF-1R> y <ANGPT2> resulta en una complejidad elevada de los anticuerpos formados y en sólo una proporción menor de anticuerpo biespec�fico de tipo salvaje <IGF-1R-ANGPT2> funcional.

Ejemplo 4

Generaci�n de anticuerpo biespec�fico bivalente de intercambio <VEGF-ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 con dominios CH3 modificados (botones-en-ojales) (figura 30)

Tal como se muestra en el ejemplo, anteriormente, la coexpresi�n de pl�smidos codificantes de anticuerpos de tipo salvaje con pl�smidos codificantes de anticuerpos de intercambio VL-VH/CL-CH1 resulta en la generación de una mezcla biespec�fica de intercambio VL-VH/CLC-H1 de los productos principales A) anticuerpo monoespec�fico de intercambio VL-VH/CL-CH1, B) anticuerpo biespec�fico de intercambio VL-VH/CL-CH1 y C) anticuerpo de tipo salvaje. Con el fin de mejorar adicionalmente el rendimiento de anticuerpo biespec�fico de intercambio <VEGF-ANGPT2> VL-VH/CL-CH1, se aplicó la tecnología de botones-en-ojales a la coexpresi�n de un anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 y un anticuerpo de tipo salvaje <VEGF> para inducir la heterodimerizaci�n de las cadenas pesadas no modificadas y modificadas respectivas (mediante CP y CP*) y obtener una preparación de anticuerpos biespec�ficos más homogénea y funcional. En el presente ejemplo, se gener� un anticuerpo biespec�fico que reconocía VEGF y ANGPT2 simultáneamente basándose en el anticuerpo de tipo salvaje <VEGF> llamado G6-31 y el anticuerpo <ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1 llamado Mab536, tal como se ha indicado anteriormente.

Tal como se ha indicado anteriormente, los segmentos g�nicos codificantes de la secuencia líder del anticuerpo <ANGPT2>, dominio variable de cadena ligera (VL) y el dominio constante de cadena ligera kappa humana (CL) se unieron y se fusionaron con el extremo 5' de los dominios Fc de los dominios constantes de la cadena pesada Y1 humana (bisagra-CH2-CH3). El ADN codificante de la proteína de fusión respectiva resultante del intercambio de los dominios VH y CH1 por los dominios VL y CL se gener� mediante síntesis g�nica y se indica como <ANGPT2> CP* (Cadena Pesada*) (SEC ID n� 8).

Las secuencias de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera de tipo salvaje del anticuerpo monoespec�fico bivalente <VEGF> G6-31, incluyendo las secuencias líder respectivas indicadas en el presente ejemplo, se derivaron de los dominios variables de cadena pesada del anticuerpo <VEGF> humano G6-31 de SEC ID n� 12, y los dominios variables de cadena ligera de SEC ID n� 13, derivados ambos del anticuerpo G6-31 anti-VEGF humano derivado mediante expresión f�gica, el cual se describe en detalle en Liang et al., J. Biol. Chem. 281(2):951-61, 13 de enero de 2006 y en la patente US n� 2007/0141065, y los dominios constantes de cadenas pesada y ligera se derivaron de un anticuerpo humano (C-kappa e IgG1).

Con este fin, el pl�smido codificante de la cadena pesada del anticuerpo G6-31 de tipo salvaje <VEGF> se modificó mediante la introducción de un segmento g�nico de CH3 generado mediante síntesis g�nica y codificante del residuo de bot�n T366W de SEC ID n� 10 en el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de tipo salvaje G631 <VEGF> respectivo, resultando en SEC ID n� 16; en contraste, el pl�smido codificante de la cadena pesada*, CP*, del anticuerpo Mab536 <ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1 se modificó mediante la introducción de un segmento g�nico de CH3 generado mediante síntesis g�nica y codificante de los residuos de ojal T366S, L368A e Y407V de SEC ID n� 11 en el dominio CH3 de la cadena pesada*, CP*, del anticuerpo Mab536 <ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1, resultando en SEC ID n� 15. En este caso, los pl�smidos codificantes del anticuerpo G6-31 <VEGF> de tipo salvaje de bot�n se organizaron como vectores gen�micos, mientras que los pl�smidos para el anticuerpo Mab536 <ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1 se organizaron como vectores intr�nA-ADNc.

A continuación, los cuatro pl�smidos respectivos codificantes de la cadena pesada CP de G6-31 <VEGF> con el bot�n SEC ID n� 16 y la cadena ligera LC de tipo salvaje SEC ID n� 14 y la cadena pesada*, CP*, de <ANGPT> de intercambio VL-VH/CL-CH1 modificada con el ojal SEC ID n� 15 y la cadena ligera*, modificada, LC* (SEC ID n� 8) se coexpresaron en una proporción equimolar mediante transfecciones transitorias en el sistema HEK293-F tal como se ha indicadoa nteriormente a una escala de 2,6 L en un fermentador Quad. Se purificaron los anticuerpos con una columna HiTrap MabSelect (GE), seguido de cromatograf�a de exclusión por tamaño en una columa HiLoad Superdex 200 26/60 (GE), tal como se ha indicado anteriormente. Los rendimientos tras la CET fueron del orden de aproximadamente 38 mg de fracciones de anticuerpo purificadas a partir de 2 l de expresión transitoria. La figura 26 muestra SDS-PAGE reducido y no reducido de las fracciones de exclusión por tamaño obtenidas durante la purificación. En el SDS-PAGE reducido puede observarse que las cadenas pesada y ligera de tipo salvaje y modificadas respectivas han sido sintetizadas y purificadas homog�neamente. Sin embargo, en el SDS-PAGE no reducido resulta evidente que todavía se encontraban presentes varias especies de anticuerpo.

A continuación se analizaron mediante espectrometr�a de masas las fracciones de exclusión por tamaño obtenidas (desglucosiladas pero no reducidas o desglucosiladas y reducidas). Pudieron identificarse varias especies de anticuerpo en las fracciones de espectrometr�a de masas y también pudieron asignarse a las bandas observadas en el SDS-PAGE respectivo (figura 27). La tabla, a continuación, muestra las especies de anticuerpo que pudieron identificarse:

Especies: 1. Frac 5 desgluc. 1. Frac 9 desgluc.

CL G6-31/ 23255 Da / (SS): 23251 Da: - -

CP G6-31/ 49149 Da /(SS):49136 Da: - -

CL* de anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 / 23919 Da/ (SS): 23914 Da: - -

CP* de anticuerpo de intercambio <ANGPT> VL-VH/CL-CH1 Mab536/ 49245 Da/ (SS): 49231 Da: -

CL G6-31 + CL de anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 Mab536 => (SS): 47165 Da: X X

Antic. completo G6-31(SS) 144774 Da: X

Antic. completo biespec�fico <VEGF-ANGPT2> de intercambio VL-VH/CL-CH1 (SS) 145532 Da (CL+ CP G6-31) + (CL* + CP*): X

Medio antic. G6-31 (SS) 72387 Da: X X

(CP G6-31) + (CP de anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 Mab536 )=> (SS) 98367 Da: X X

(SH) 2 x (CP de anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 Mab536) + CL G6-31 => 121745 Da: X

2 x (CP G6-31) + CL G6-31 + CP de anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 Mab536 =>(SS):170754 Da: X + 20 Da

El anticuerpo biespec�fico de intercambio <VEGF-ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 deseado que reconoce VEGF con un brazo y ANGPT2 con el otro brazo pudo, de esta manera, identificarse inequívocamente mediante espectrometr�a de

masas y también pudo observarse en el SDS-PAGE correspondiente. En la figura 30 se muestra un diagrama esquemático del anticuerpo biespec�fico de intercambio <VEGF-ANGPT2> VL-VH/CL-CH1. La concentración más alta de este anticuerpo deseado pudo encontrarse en las fracciones 5 y 6, mientras que su concentración era más reducida en las fracciones posteriores.

Adem�s, la presencia de anticuerpo biespec�fico de intercambio <VEGF-ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 capaz de unirse simultáneamente a ANGPT2 y VEGF se confirm� mediante un ensayo ELISA de puente (figura 28) y en ensayos Biacore de puente (figura 29) indicados anteriormente, en los que se demuestra que el anticuerpo biespec�fico deseado era capaz de unirse a ANGPT2 y a VEGF simultáneamente. En estos ensayos el anticuerpo biespec�fico

10 tetravalente TvG6-Ang23 sirvió de control.

Debe indicarse que, debido a una relativa sobreexpresi�n del anticuerpo <VEGF> de tipo salvaje G6-31, por ejemplo debido a mejores rendimientos de expresión para los vectores gen�micos codificantes de derivados de G6-31, se indujo la formación de productos secundarios inactivos, resultando en un exceso de d�meros de G6-31 inactivos y 15 mitades de anticuerpo. Con el fin de alcanzar un rendimiento máximo del anticuerpo biespec�fico de intercambio <VEGF-ANGPT2> VL-VH/CL-CH1 deseado, se est�n realizando estudios adicionales que consiguen una expresión uniforme de la totalidad de las cuatro cadenas de anticuerpo y reducen la formación de productos secundarios. Entre estos estudios se incluyen: i) la optimización de la estequiometr�a equimolar de los 4 pl�smidos utilizados para la coexpresi�n, por ejemplo mediante combinación de las unidades transcripcionales sobre uno o dos pl�smidos, la

20 introducción de los elementos de control respectivos, as� como ii) la optimización de la heterodimerizaci�n, por ejemplo mediante la utilización de tecnologías de bot�n en ojal, tales como la introducción de un puente disulfuro adicional en el dominio CH3, por ejemplo Y349C, en la "cadena de bot�n", y D356C en la "cadena de ojal" y/o combinados con la utilización de los residuos R409D, K370E (K409D) para los residuos de bot�n y D399K y E357K para los residuos de ojal indicados en el documento n� EP 1870459A1.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

30 <120> Anticuerpos biespec�ficos bivalentes

<130> 24677

<150> EP 07024867

<151> 2007-12-21

<160> 18

40 <170> PatentIn versión 3.2

<210> 1

<211> 467

<212> PRT 45 <213> Artificial

<220>

<223> secuencias de amino�cidos de la cadena pesada del anticuerpo de tipo salvaje <IGF-1R>

50 <400> 1

<210> 2 5 <211> 235

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 10 <223> secuencias de amino�cidos de la cadena ligera del anticuerpo de tipo salvaje <IGF-1R>

<400> 2 <210> 3

<211> 462 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de amino�cidos de la cadena pesada* (CP*) del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL

10 CH1, en el que el dominio de cadena pesada VH se sustituye por el dominio de cadena ligera VL, y el dominio de cadena pesada CH1 se sustituye por el dominio de cadena ligera CL

<400> 3

<210> 4

<211> 240 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de amino�cidos de la cadena ligera* (CL*) del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL

10 CH1, en el que el dominio de cadena ligera VL se sustituye por el dominio de cadena pesada VH, y el dominio de cadena ligera CL se sustituye por el dominio de cadena pesada CH1

<400> 4 <210> 5

<211> 557 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de amino�cidos etiqueta p�ptido de unión His-estreptavidina de ectodominio de IGF-1R (IGF-1R10 His-SBP ECD)

<400> 5

<210> 6

<211> 471 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencias de amino�cidos de la cadena pesada del anticuerpo de tipo salvaje de la angiopoyetina-2 10 <ANGPT2>

<400> 6

<210> 7

<211> 219 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencias de amino�cidos de la cadena ligera del anticuerpo de tipo salvaje de la angiopoyetina-2 10 <ANGPT2>

<400> 7 <210> 8 <211> 468

<212> PRT

<213> Artificial

5 <220>

<223> secuencia de amino�cidos de la cadena pesada* (CP*) del anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1, en el que el dominio de cadena pesada VH se sustituye por el dominio de cadena ligera VL, y el dominio de cadena pesada CH1 se sustituye por el dominio de cadena ligera CL

10 <400> 8

<210> 9

<211> 244 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de amino�cidos de la cadena ligera* (CL*) del anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL

<400> 9 <210> 10

<211> 107 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de amino�cidos del dominio CH3 (bot�n) con un intercambio T366W para la utilización en la 10 tecnología de bot�n en ojal

<400> 10 <210> 11

<211> 107 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de amino�cidos del dominio CH3 (ojal) con intercambios T366W, L368A e Y407V para la 10 utilización en la tecnología de bot�n en ojal

<400> 11 <210> 12

<211> 469 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencias de amino�cidos de la cadena pesada del anticuerpo de tipo salvaje <VEGF>

<400> 12

<210> 13 5 <211> 233

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 10 <223> secuencia de amino�cidos de la cadena ligera del anticuerpo de tipo salvaje <VEGF> con líder

<400> 13 <210> 14

<211> 214 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de amino�cidos de la cadena ligera del anticuerpo de tipo salvaje <VEGF> sin líder

<400> 14

<210> 15

<211> 446

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> secuencia de amino�cidos de la cadena pesada* (CP*) del anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-

CH1, en el que el dominio de cadena pesada VH se sustituye por el dominio de cadena ligera VL, y el dominio de 10 cadena pesada CH1 se sustituye por el dominio de cadena ligera CL y CH3

<400> 15

<210> 16

<211> 450 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencias de amino�cidos de la cadena pesada del anticuerpo de tipo salvaje <VEGF>, en el que el dominio

10 CH3 porta una secuencia de amino�cidos con un intercambio T366W (bot�n) para la utilización en la tecnología de bot�n en ojal

<400> 16

<210> 17

<211> 447 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de amino�cidos de la cadena pesada* (CP*) del anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL

10 CH1, en el que el dominio de cadena pesada VH se sustituye por el dominio de cadena ligera VL, y el dominio de cadena pesada CH1 se sustituye por el dominio de cadena ligera CL con una Gly

<400> 17

<210> 18

<211> 226

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> secuencia de amino�cidos de la cadena ligera* (CL*) del anticuerpo de intercambio <ANGPT2> VL-VH/CL-CH1, en el que el dominio de cadena ligera VL se sustituye por el dominio de cadena pesada VH, y el dominio de cadena pesada CL se sustituye por el dominio de cadena pesada CH1 con una Gly

<400> 18

Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo biespec�fico bivalente, que comprende:

a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno, y

b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y en el que los dominios constantes CL y CH se sustituyen uno por otro.
2.

Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque cada uno del dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se reúne en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 de anticuerpo, en el que dicha interfaz se altera para inducir la formación del anticuerpo biespec�fico bivalente, en el que la alteración se caracteriza porque:

a) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de manera que dentro de la interfaz original del dominio CH3 de una cadena pesada que se reúne con la interfaz original del dominio CH3 de la otra cadena pesada del anticuerpo biespec�fico bivalente, se sustituye un residuo amino�cido por un residuo amino�cido de volumen de cadena lateral más grande, generando de esta manera una protuberancia en el interior de la interfaz del dominio CH3 de una cadena pesada, pudiendo situarse dicha protuberancia en una cavidad en el interior de la interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada y b) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada, de manera que dentro de la interfaz original del segundo dominio CH3 que se reúne con la interfaz original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespec�fico bivalente, se sustituye un residuo amino�cido por un residuo amino�cido de volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una cavidad en el interior de la interfaz del segundo dominio CH3, en el interior de la cual puede situarse una protuberancia dentro de la interfaz del primer dominio CH3.
3.

Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho residuo amino�cido de volumen de cadena lateral más grande se selecciona de entre el grupo que consiste de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y tript�fano (W).
4.

Anticuerpo según la reivindicación 2 � 3, caracterizado porque dicho residuo amino�cido de volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona de entre el grupo que consiste de alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V).
5.

Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque ambos dominios CH3 se alteran adicionalmente mediante la introducción de ciste�na (C) como amino�cido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3.
6.

Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque:

uno de los dominios constantes de cadena pesada CH3 de ambas cadenas pesadas se sustituye por un dominio constante de cadena pesada CH1, y el otro dominio constante de cadena pesada CH3 se sustituye por un dominio constante de cadena ligera CL.
7.

Método para la preparación de un anticuerpo biespec�fico bivalente según la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

a) transformar una célula huésped con:

-

vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno, y -vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, yen el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro.

b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpo, y c) recuperar dicha molécula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.
8. Célula huésped que comprende: -vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno, y -vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo ant�geno,

en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y en el que los dominios constantes CL y CH1 se sustituyen uno por otro.

10 9. Composición del anticuerpo biespec�fico bivalente según las reivindicaciones 1 a 6.
10. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespec�fico bivalente según las reivindicaciones 1 a 6 y por lo menos un excipiente farmac�uticamente aceptable.