ES2469791T3

ES2469791T3 - Anticuerpos biespec�ficos bivalentes

Info

Publication number: ES2469791T3
Application number: ES08864374.7T
Authority: ES
Inventors: Christian Klein; Wolfgang Sch�Fer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-16
Publication date: 2014-06-20
Anticipated expiration: 2028-12-16
Also published as: CO6280542A2; EP2225279B1; EP2225279A1; WO2009080252A1; BRPI0821791A2; CA2709023C; KR101249607B1; TW200932269A; PE20091172A1; BRPI0821791B1; RU2010129549A; MA31904B1; US20090162359A1; US20140120613A1; NZ585627A; US10927163B2; CN101903404B; MX2010006396A; US10138293B2; US20120164726A1

Abstract

Anticuerpo biespecífico bivalente, que comprende: a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específico a un segundo antígeno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro.

Description

Anticuerpos biespec�ficos bivalentes

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos biespec�ficos bivalentes, a su preparación y a su utilización.

Antecedentes de la invención

Las proteínas manipuladas, tales como los anticuerpos biespec�ficos o multiespec�ficos capaces de unirse a dos o más ant�genos, son conocidas de la técnica. Estas proteínas de unión multiespec�ficas pueden generarse mediante fusión celular, conjugación química o técnicas de ADN recombinante.

Recientemente se ha desarrollado una amplia diversidad de formatos de anticuerpo recombinante biespec�fico, por ejemplo anticuerpos biespec�ficos tetravalentes mediante la fusión de, por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG y dominios de cadena sencilla (ver, por ejemplo, Morrison S.L. et al., Nature Biotech. 15:159-163, 1997, documento n� WO 2001/077342, y Coloma M.J., Nature Biotech. 25:1233-1234, 2007).

Adem�s, se han desarrollado algunos otros formatos nuevos en los que ya no se retiene la estructura nuclear del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM), tales como diacuerpos, triacuerpos o tetracuerpos, minicuerpos, varios formatos de una sola cadena (scFv, Bis-scFv), que son capaces de unirse a dos o más ant�genos (Holliger P. et al., Nature Biotech. 23:1126-1136, 2005; Fischer N. y L�ger O., Pathobiology 74:3-14, 2007; Shen J. et al., Journal of Immunological Methods 318:65-74, 2007; Wu C. et al., Nature Biotech. 25:1290-1297, 2007).

La totalidad de dichos formatos utiliza conectores para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a una proteína adicional de unión (por ejemplo scFv) o para fusionar, por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv (Fischer N. y L�ger O., Pathobiology 74:3-14, 2007). Aunque resulta evidente que los conectores presentan ventajas para la manipulación de los anticuerpos biespec�ficos, también pueden provocar problemas en contextos terapéuticos. En efecto, estos p�ptidos foráneos podrían inducir una respuesta inmunol�gica contra el conector mismo o contra la unión entre la proteína y el conector. Además, la naturaleza flexible de estos p�ptidos provoca que presenten una mayor tendencia al corte proteol�tico, potencialmente conduciendo a una pobre estabilidad del anticuerpo, a agregación y a una inmunogenicidad incrementada. Además, puede resultar deseable conservar funciones efectoras, tales como, por ejemplo, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), que se encuentran mediadas por la parte Fc, mediante el mantenimiento de un elevado grado de similitud a anticuerpos naturales. De esta manera, idealmente, el objetivo debe ser el desarrollo de anticuerpos biespec�ficos que presentan una estructura general muy similar a los anticuerpos naturales (por ejemplo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM), con diferencias mínimas respecto a las secuencias humanas.

En un enfoque, se han producido anticuerpos biespec�ficos que son muy similares a los anticuerpos naturales, utilizando la tecnología del cuadroma (ver Milstein C. y Cuello A.C., Nature 305:537-40, 1983), basada en la fusión somática de dos líneas celulares de hibridoma diferentes que expresan anticuerpos monoclonales murinos con las especificidades deseadas del anticuerpo biespec�fico. Debido al apareamiento aleatorio de las cadenas pesada y ligera de dos anticuerpos diferentes dentro de la línea celular de hibridoma (o cuadroma) híbrido resultante, se generan hasta diez especies diferentes de anticuerpo de entre las que únicamente una es el anticuerpo biespec�fico funcional deseado. Debido a la presencia de productos secundarios incorrectamente apareados, y rendimientos de producción significativamente reducidos, resultan necesarios procedimientos sofisticados de purificación (ver, por ejemplo, Morrison S.L., Nature Biotech. 25:1233-1234, 2007). En general, se mantiene el mismo problema de productos secundarios mal apareados en el caso de que se utilicen técnicas de expresión recombinante.

Un enfoque para evitar el problema de los productos secundarios mal apareados, que se conoce como “bot�n en ojal”, pretende forzar el apareamiento de dos cadenas pesadas de anticuerpos diferentes mediante la introducción de mutaciones en los dominios CH3 para modificar la interfaz de contacto. En una cadena se sustituyen amino�cidos voluminosos por amino�cidos con cadenas laterales cortas, para crear un “ojal”. A la inversa, se introducen amino�cidos con cadenas laterales grandes en el otro dominio CH3, para crear un “bot�n”. Mediante la coexpresi�n de dichas dos cadenas pesadas (y dos cadenas ligeras idénticas, las cuales deben ser apropiadas para ambas cadenas pesadas), se observaron rendimientos elevados de formación de heterod�meros ('bot�n-ojal') frente a la formación de homod�meros ('ojal-ojal' o 'bot�n-bot�n') (Ridgway J.B., Presta LG., Carter P. y documento n� WO1996/027011). El porcentaje de heterod�meros pudo incrementarse adicionalmente mediante remodelaje de las superficies de interacción de los dos dominios CH3 utilizando un enfoque de expresión f�gica y la introducción de un puente disulfuro para estabilizar los heterod�meros (Merchant A.M. et al., Nature Biotech. 16:677-681, 1998; Atwell S., Ridgway J.B., Wells J.A., Carter P., J. Mol. Biol. 270:26-35, 1997). Se describen nuevos enfoques para la tecnología de bot�n-en-ojal en, por ejemplo, el documento EP n� 1870459A1. Aunque este formato aparentemente resulta muy atractivo, en la actualidad no se dispone de datos que describan la progresión hacia el uso cl�nico. Una

importante limitación de esta estrategia es que las cadenas ligeras de los dos anticuerpos parentales deben ser idénticas para evitar el apareamiento incorrecto y la formación de moléculas inactivas. De esta manera, esta técnica no resulta apropiada para el desarrollo sencillo de anticuerpos biespec�ficos bivalentes recombinantes contra dos ant�genos partiendo de dos anticuerpos contra el primer y segundo ant�genos, debido a que las cadenas pesadas de

5 estos anticuerpos y/o las cadenas ligeras idénticas deben optimizarse.

Xie Z. et al., J. Immunol. Methods 286:95-101, 2005, se refieren a un nuevo formato de anticuerpo biespec�fico utilizando scFv en combinación con tecnología de bot�n-en-ojal para la parte Fc.

10 Chan L. et al., Mol. Immunol. 41:527-538, 2004, dan a conocer un anticuerpo monoespec�fico bivalente en el que los dominios CH y VL en ambos brazos han sido intercambiados, creando de esta manera dos veces un constructo VH-CL:VL-CH1. Sin embargo, en dicha publicación el �nfases recae sobre la influencia de estos cambios estructurales sobre las funciones efectoras.

15 El documento n� WO 93/06217 da a conocer el acoplamiento de dos fragmentos de anticuerpo monoespec�fico o biespec�fico utilizando un residuo de ciste�na con un tiol libre.

El documento n� WO 99/37791 da a conocer la utilización de la interacción CL-CH1 como andamiaje de heterodimerizaci�n para constructos de anticuerpo biespec�fico o multiespec�fico.

Descripci�n resumida de la invención

La invención se refiere a un anticuerpo biespec�fico bivalente, que comprende:

25 a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específico a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro.

Una realización adicional de la invención es un método para la preparación de un anticuerpo biespec�fico bivalente 30 según la invención, que comprende las etapas de:

a) transformar una célula huésped con:

-: vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada 35 de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno,

-: vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro,

40 b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpo, y c) recuperar dicha molécula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.

Una realización adicional de la invención es una célula huésped que comprende:

45 - vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno,

-: vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro.

Una realización adicional de la invención es una composición, preferentemente una composición farmacéutica o diagnóstica del anticuerpo según la invención.

Una realización adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la 55 invención y por lo menos un excipiente farmac�uticamente aceptable.

Una realización adicional de la invención es un método destinado al tratamiento de un paciente que necesita de terapia, caracterizado por la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo según la invención.

Descripci�n detallada de la invención

a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específico a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro.

Por lo tanto, dicho anticuerpo biespec�fico bivalente comprende:

a) una primera cadena ligera y una primera cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno, y b) una segunda cadena ligera y una cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH de la segunda cadena ligera y de la segunda cadena pesada se sustituyen uno por otro.

De esta manera, para dicho anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, se aplica lo siguiente: dentro de la cadena ligera: el dominio variable de cadena ligera VL se sustituye por el dominio variable de cadena pesada VH de dicho anticuerpo; y dentro de la cadena pesada: el dominio variable de cadena pesada VH se sustituye por el dominio variable de cadena ligera VL de dicho anticuerpo.

El término "anticuerpo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a anticuerpos monoclonales completos. Dichos anticuerpos completos consisten de dos parejas de una "cadena ligera" (CL) y una "cadena pesada" (CP) (dichas parejas de cadena ligera (CL)/cadena pesada se abrevian en la presente memoria como CL/CP). Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas de dichos anticuerpos son polip�ptidos que consisten de varios dominios. En un anticuerpo completo, cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente memoria como CPRV o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende los dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2 y CH3 (clases de anticuerpo IgA, IgD e IgG) y opcionalmente el dominio constante de cadena pesada CH4( clases de anticuerpo IgE e IgM). Cada cadena ligera comprende un dominio variable de cadena ligera VL y un dominio constante de cadena ligera CL. La estructura de un anticuerpo completo natural, el anticuerpo IgG, se muestra en, por ejemplo, Fig. 1. Los dominios variables VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas por regiones que se encuentran más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL est� compuesto de tres CDR y cuatro FR, dispuestos de extremo amino-terminal a extremo carboxi-terminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (Janeway C.A., Jr et al., Immunobiology, 5a ed., Garland Publishing, 2001; y Woof J., Burton D., Nat. Rev. Immunol. 4:89-99, 2004). Las dos parejas de cadena pesada y cadena ligera (CP/CL) son capaces de unirse específicamente al mismo ant�geno. De esta manera, dicho anticuerpo completo es un anticuerpo monoespec�fico bivalente. Entre dichos "anticuerpos" se incluyen, por ejemplo, anticuerpos de ratón, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos genéticamente manipulados (anticuerpos variantes o mutantes), con la condición de que se conserven sus propiedades características. Resultan especialmente preferentes los anticuerpos humanos o humanizados, especialmente en forma de anticuerpos humanos o humanizados recombinantes.

Existen cinco tipos de cadenas pesadas de anticuerpo de mamífero indicados por las letras griegas: a, 5, �, y y m (Janeway C.A. Jr., et al., Immunobiology, 5a ed., Garland Publishing, 2001). El tipo de cadena pesada presente define la clase del anticuerpo; estas cadenas se encuentran en los anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente (Rhoades R.A., Pflanzer R.G., Human Physiology, 4a ed., Thomson Learning, 2002). Las diferentes cadenas pesadas difieren en su tamaño y composición; a y y contienen aproximadamente 450 amino�cidos, mientras que m y � presentan aproximadamente 550 amino�cidos.

Cada cadena pesada presenta dos regiones: la región constante y la región variable. La región constante es idéntica en todos los anticuerpos del mismo isotipo, aunque difiere en anticuerpos de isotipo diferente. Las cadenas pesadas y, a y 5 presentan una región constante compuesta de tres dominios constantes, CH1, CH2 y CH3 (en una línea) y una región bisagra para una flexibilidad adicional (Woof J., Burton D., Nat. Rev. Immunol. 4:89-99, 2004); las cadenas pesadas m y � presentan una región constante compuesta de cuatro dominios constantes: CH1, CH2, CH3 y CH4 (Janeway C.A. Jr. et al., Immunobiology, 5a ed., Garland Publishing, 2001). La región variable de la cadena pesada difiere en los anticuerpos producidos por diferentes células B, aunque es la misma para todos los anticuerpos producidos por una célula B individual o clon de células B. La región variable de cada cadena pesada presenta una longitud aproximada de 110 amino�cidos y est� compuesta de un único dominio de anticuerpo.

En mamíferos existen únicamente dos tipos de cadena ligera, denominados lambda (A) y kappa (K). Una cadena ligera presenta dos dominios sucesivos: un dominio constante, CL, y un dominio variable, VL. La longitud aproximada de una cadena ligera es de 211 a 217 amino�cidos. Preferentemente, la cadena ligera es una cadena ligera kappa

(K) y el dominio constante, CL, preferentemente se deriva de una cadena ligera kappa (K) (el dominio constante CK).

Las expresiones “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición de amino�cidos.

Los "anticuerpos" según la invención pueden ser de cualquier clase (por ejemplo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, preferentemente IgG o IgE) o subclase (por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2, preferentemente IgG1), en la que ambos anticuerpos, a partir de los que se deriva el anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención, presentan una parte Fc de la misma subclase (por ejemplo IgG1, IgG4 y similar, preferentemente IgG1), preferentemente del mismo alotipo (por ejemplo cauc�sico).

Una “parte Fc de un anticuerpo” es una expresión bien conocida por el experto en la materia y definida basándose en el corte con papa�na de los anticuerpos. Los anticuerpos según la invención contienen una parte Fc, preferentemente una parte Fc derivada de origen humano y preferentemente todas las demás partes de las regiones constantes humanas. La parte Fc de un anticuerpo participa directamente en la activación del complemento, la unión de C1q, la activación de C3 y la unión de receptores de Fc. Aunque la influencia de un anticuerpo sobre el sistema del complemento depende de determinadas condiciones, la unión a C1q est� cauada por sitios de unión definidos en la parte Fc. Dichos sitios de unión son conocidos de la técnica y han sido descritos, por ejemplo, por Lukas T.J. et al., J. Immunol. 127:2555-2560, 1981; Brunhouse R. y Cebra J.J., Mol. Immunol. 16:907-917, 1979; Burton D.R. et al., Nature 288:338-344, 1980; Thommesen J.E. et al., Mol. Immunol. 37:995-1004, 2000; Idusogie E.E. et al., J. Immunol. 164:4178-4184, 2000; Hezareh M. et al., J. Virol. 75:12161-12168, 2001; Morgan A. et al., Immunology 86:319-324, 1995, y la patente EP n� 0 307 434. Dichos sitios de unión de región constante se caracterizan, por ejemplo, por los amino�cidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración según el índice EU de Kabat, ver posteriormente). Los anticuerpos de las subclases IgG1, IgG2 e IgG3 habitualmente muestran activación del complemento y la unión a C1q y la activación de C3, mientras que IgG4 no activa el sistema de complemento y no se une a C1q y no activa C3. Preferentemente la parte Fc es una parte Fc humana.

La expresión “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable, es decir la región de unión, procedente de una fuente o especie, y por lo menos una parte de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, habitualmente preparado mediante técnicas de ADN recombinante. Los anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable murina y una región constante humana resultan preferentes. Otras formas preferentes de “anticuerpos quiméricos” comprendidas en la presente invención son aquéllas en las que la región constante ha sido modificada o cambiada respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de C1q y/o a la unión de receptor Fc (FcR). Este tipo de anticuerpos quiméricos también se denomina “anticuerpos de clase intercambiada”. Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN codificantes de regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN codificantes de regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfecci�n g�nica bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Morrison S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1985, y las patentes US n� 5.202.238 y n� 5.204.244.

La expresión “anticuerpo humanizado” se refiere a anticuerpos en los que el marco o las “regiones determinantes de complementariedad” (CDR) han sido modificadas para que comprendan la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente de la de la inmunoglobulina parental. En una realización preferente, se injerta una CDR murina en la región marco de un anticuerpo humano para preparar un “anticuerpo humanizado”. Ver, por ejemplo, Riechmann, L. et al., Nature 332:323-327, 1988, y Neuberger, M.S. et al., Nature 314:268-270, 1985. Las CDR particularmente preferentes corresponden a aquéllas que representan secuencias que reconocen los anteriormente indicados ant�genos de los anticuerpos quiméricos. Otras formas de “anticuerpos humanizados” comprendidas dentro de la presente invención son aquéllas en las que la región constante ha sido adicionalmente modificada o cambiada respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de C1q y/o a la del receptor de Fc (FcR).

La expresión “anticuerpo humano”, tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir anticuerpos que presentan regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos del estado de la técnica (van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-374, 2001). También pueden producirse anticuerpos humanos en animales transg�nicos (por ejemplo ratones) que sean capaces, tras la inmunizaci�n, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción end�gena de inmunoglobulinas. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal resultar� en la producción de anticuerpos humanos tras el reto de ant�geno (ver, por ejemplo, Jakobovits A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555, 1993; Jakobovits A. et al., Nature 362:255-258, 1993; Bruggemann M. et al., Year Immunol. 7:33-40, 1993). También pueden producirse anticuerpos humanos en bibliotecas de expresión f�gica (Hoogenboom H.R. y Winter G.J., Mol. Biol. 227:381-388, 1992; Marks J.D. et al., J. Mol. 222:581-597, 1991).

Las técnicas de Cole et al. y de Boerner et al. también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77, 1985; y Boerner P. et al., J. Immunol. 147:86-95, 1991). Tal como se ha indicado para los anticuerpos quiméricos y humanizados según la invención, la expresión “anticuerpo humano” tal como se utiliza en la presente memoria también comprende anticuerpos modificados en la región constante para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de C1q y/o a la unión de FcR, por ejemplo mediante “intercambio de clase”, es decir, el cambio o la mutación de partes de Fc (por ejemplo de IgG1 a IgG4 y/o la mutación IgG1/IgG4).

La expresión “anticuerpo recombinante humano”, tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de una célula huésped, tal como una célula NS0 o CHO, o de un animal (por ejemplo un ratón) que es transg�nico para genes de inmunoglobulina humana o para anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Dichos anticuerpos recombinantes humanos presentan regiones variables y constantes en una forma reorganizada. Los anticuerpos recombinantes humanos según la invención han sido sometidos a hipermutaci�n somática in vivo. De esta manera, las secuencias de amino�cidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas y relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente en el repertorio in vivo de anticuerpos de la línea germinal humana.

La expresión “dominio variable” (dominio variable de una cadena ligera (VL), región variable de una cadena pesada (VH)) tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cada uno de la pareja de cadena ligera y cadena pesada que participa directamente en la unión del anticuerpo al ant�geno. Los dominios de cadenas ligera y pesada variables presentan la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias se encuentran ampliamente conservadas, conectadas mediante tres “regiones hipervariables” (o regiones determinantes de complementariedad, CDR). Las regiones marco adoptan una conformación de láminas � y las CDR pueden formar bucles que conectan la estructura de láminas �. Las CDR en cada cadena son mantenidas en su estructura tridimensional por las regiones de marco y forman conjuntamente con las CDR de la otra cadena el sitio de unión de ant�geno. Las regiones CDR3 de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo desempeñan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de los anticuerpos según la invención y por lo tanto proporcionan un objetivo adicional de la invención.

Las expresiones "región hipervariable" o “parte de unión a ant�geno del anticuerpo” tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a los residuos amino�cidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al ant�geno. La región hipervariable comprende residuos amino�cidos de las “regiones determinantes de complementariedad” o “CDR”. Las regiones “de marco” o “FR” son aquellas regiones de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable tal como se definen en la presente memoria. Por lo tanto, las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo comprenden, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las CDR en cada cadena se encuentran separadas por dichos amino�cidos de marco. En particular, la CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye más a la unión de ant�geno. Las regiones CDR y FR se determinan según la definición estándar de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

Los "dominios constantes" de la cadena pesada y de la cadena ligera no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un ant�geno, pero muestran diversas funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de amino�cidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas se dividen en clases:

La expresión "anticuerpo biespec�fico bivalente" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo tal como se ha indicado anteriormente en el que cada una de las dos parejas de cadena pesada y cadena ligera (CP/CL) es de unión específica a un ant�geno diferente, es decir, la primera cadena pesada y la primera cadena ligera (originadas de un anticuerpo contra un primer ant�geno) se unen específicamente de manera conjunta a un primer ant�geno, y la segunda cadena pesada y la segunda cadena ligera (originadas de un anticuerpo contra un segundo ant�geno) se unen específicamente de manera conjunta a un segundo ant�geno (tal como se ilustra en la fig. 2); dichos anticuerpos biespec�ficos bivalentes son capaces de unirse específicamente a dos ant�genos diferentes simultáneamente, y a no más de dos ant�genos; por el contrario, por una parte un anticuerpo monoespec�fico es capaz de unirse únicamente a un ant�geno y, por otra parte, por ejemplo un anticuerpo tetraespec�fico tetravalente puede unirse a cuatro moléculas de ant�geno simultáneamente.

Seg�n la invención, la proporción de un anticuerpo biespec�fico bivalente en comparación con los productos secundarios no deseados puede mejorarse mediante la sustitución de determinados dominios en únicamente una pareja de cadena pesada y cadena ligera (CP/CL). Aunque la primera de las dos parejas CP/CL se origina de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno y se deja esencialmente sin modificación, la segunda de las

parejas CP/CL se origina en un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, y se modifica mediante la sustitución siguiente:

-: cadena ligera: sustitución del dominio variable de cadena ligera, VL, por el dominio variable de cadena pesada, VH, de dicho anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, y

-: cadena pesada: sustitución del dominio variable de cadena pesada, VH, por el dominio variable de cadena ligera, VL, de dicho anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno.

De esta manera, los anticuerpos biespec�ficos bivalentes resultantes son anticuerpos artificiales que comprenden:

a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en los que dicha cadena ligera (de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno) contiene un dominio variable VH en lugar de VL, y en el que dicha cadena pesada (de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno) contiene un dominio variable VL en lugar de VH.

En un aspecto adicional de la invención, dicha proporción mejorada de un anticuerpo biespec�fico bivalente deseado en comparación con productos secundarios no deseados puede mejorarse adicionalmente mediante una de las dos alternativas siguientes:

A) Primera alternativa (ver la fig. 3): los dominios CH3 de dicho anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención pueden alterarse mediante la tecnología de “bot�n en ojal” que se describe en detalle mediante varios ejemplos en, por ejemplo, el documento n� WO 96/027011, Ridgway, J.B. et al., Protein Eng. 9:617-621, 1996, y en Merchant, A.M. et al., Nat. Biotechnol. 16:677-681, 1998. En dicho método, se alteran las superficies de interacción de los dos dominios CH3 para incrementar la heterodimerizaci�n de ambas cadenas pesadas que contienen dichos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el “bot�n”, mientras que el otro es el “ojal”. La introducción de un puente disulfuro estabiliza los heterod�meros (Merchant A.M. et al., Nature Biotech. 16:677-681, 1998; Atwell S., Ridgway J.B., Wells J.A., J. Mol. Biol. 270:26-35, 1997) e incrementa el rendimiento. Por lo tanto, en una realización preferente, los dominios CH3 de un anticuerpo biespec�fico bivalente, en el que cada uno de primer dominio CH3 y segundo dominio CH3 se reúne en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 de anticuerpo, se alteran mediante la tecnología de "bot�n en ojal", que incluye la estabilizaci�n adicional mediante la introducción de un puente disulfuro en los dominios CH3 (descrita en el documento n� WO96/027011; Ridgway J.B. et al., Protein Eng. 9:617-621, 1996; Merchant A.M. et al., Nature Biotech. 16:677-681, 1998, y Atwell S., Ridgway J.B., Wells J.A., Carter P., J. Mol. Biol. 270:26-35, 1997) para estimular la formación del anticuerpo biespec�fico bivalente. De esta manera, en un aspecto de la invención, dicho anticuerpo biespec�fico bivalente se caracteriza porque: el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se reúnen en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 del anticuerpo, en donde se altera dicha interfaz con el fin de estimular la formación del anticuerpo biespec�fico bivalente, en el que la alteración se caracteriza porque:

a) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de manera que dentro de la interfaz original del dominio CH3 de una cadena pesada que se reúne con la interfaz original del dominio CH3 de la otra cadena pesada del anticuerpo biespec�fico bivalente, se sustituye un residuo amino�cido por un residuo amino�cido de volumen de cadena lateral más grande, generando de esta manera una protuberancia en el interior de la interfaz del dominio CH3 de una cadena pesada, pudiendo situarse dicha protuberancia en una cavidad en el interior de la interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada y b) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada,

de manera que, dentro de la interfaz original del segundo dominio CH3 que se reúne con la interfaz original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespec�fico bivalente, se sustituyen un residuo amino�cido por un residuo amino�cido que presenta un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una cavidad dentro de la interfaz del segundo dominio CH3 dentro de la cual puede posicionarse una protuberancia dentro de la interfaz del primer dominio CH3. Preferentemente, dicho residuo amino�cido de volumen de cadena lateral más grande se selecciona de entre el grupo que consiste de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y tript�fano (W). Preferentemente, dicho residuo amino�cido de volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona de entre el grupo que consiste de alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V).

En un aspecto de la invención, ambos dominios CH3 se alteran adicionalmente mediante la introducción de ciste�na (C) como el amino�cido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de manera que pueda formarse un puente disulfuro entre ambos dominios CH3. En otra realización preferente de la invención se alteran ambos dominios CH3 mediante la utilización de los residuos R409D; K370E (K409D) para los residuos de bot�n y los dominios D399K y E357K para los residuos de ojal indicados en, por ejemplo, el documento n� EP 1870459A1. o B) Segunda alternativa (ver la figura 4): mediante la sustitución de un dominio constante de cadena pesada CH3 por un dominio constante de cadena pesada CH1, y el otro dominio constante de cadena pesada CH3 por un dominio constante de cadena ligera CL.

El dominio constante de cadena pesada CH1 por el que se sustituye el dominio de cadena pesada CH3 puede ser de cualquier clase de Ig (por ejemplo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) o subclase de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2).

El dominio constante de cadena ligera CL por el que se sustituye el dominio de cadena pesada CH3 puede ser de tipo lambda (A) o kappa (K), preferentemente del tipo kappa (K).

De esta manera, una realización preferente de la invención es un anticuerpo biespec�fico bivalente, que comprende:

a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y en el que opcionalmente: c) cada uno de dominio CH3 de una cadena pesada y dominio CH3 de la otra cadena pesada se reúnen en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 del anticuerpo, en donde se altera dicha interfaz con el fin de estimular la formación del anticuerpo biespec�fico bivalente, en el que la alteración se caracteriza porque:

ca) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de manera que dentro de la interfaz original del dominio CH3 de una cadena pesada que se reúne con la interfaz original del dominio CH3 de la otra cadena pesada del anticuerpo biespec�fico bivalente, se sustituye un residuo amino�cido por un residuo amino�cido de volumen de cadena lateral más grande, generando de esta manera una protuberancia en el interior de la interfaz del dominio CH3 de una cadena pesada, pudiendo situarse dicha protuberancia en una cavidad en el interior de la interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada y cb) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada, de manera que dentro de la interfaz original del segundo dominio CH3 que se reúne con la interfaz original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespec�fico bivalente, se sustituye un residuo amino�cido por un residuo amino�cido de volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una cavidad en el interior de la interfaz del segundo dominio CH3, en el interior de la cual puede posicionarse una protuberancia dentro de la interfaz del primer dominio CH3,

o d)un dominio constante de cadena pesada CH3 se sustituye por un dominio constante de cadena pesada CH1, y el otro dominio constante de cadena pesada CH3 se sustituye por un dominio constante de cadena ligera CL.

Las expresiones "ant�geno" o "molécula de ant�geno" tal como se utilizan en la presente memoria se utilizan intercambiablemente y se refieren a la totalidad de las moléculas que pueden unirse específicamente a un anticuerpo. El anticuerpo biespec�fico bivalente se une específicamente a un primer ant�geno y a un segundo ant�geno diferente. El término "ant�genos" tal como se utiliza en la presente memoria incluye, por ejemplo, proteínas, ep�topos diferentes sobre proteínas (como ant�genos diferentes en el sentido de la invención) y polisac�ridos. Lo anterior incluye principalmente partes (capas, cápsulas, paredes celulares, flagelos, fimbrias y toxinas) de bacterias, virus y otros microorganismos. Los lípidos y los ácidos nucleicos son antig�nicos únicamente en combinación con proteínas y polisac�ridos. Entre los ant�genos exígenos (no autoant�genos) no microbianos pueden incluirse polen, clara de huevo y proteínas procedentes de tejidos y órganos trasplantados o situados sobre la superficie de células sanguíneas trasplantadas. Preferentemente el ant�geno se selecciona de entre el grupo que consiste de citoquinas, proteínas de superficie celular, enzimas y receptores de citoquinas, proteínas de superficie celular, enzimas y receptores.

Los ant�genos tumorales son aquellos ant�genos presentados por moléculas del CMH-I � CMH-II sobre la superficie de las células tumorales. Estos ant�genos en ocasiones pueden ser presentados por las células tumorales y nunca por las células normales. En este caso se denominan ant�genos específicos tumorales (AET) y típicamente resultan de una mutación específica de tumor. Son más comunes los ant�genos presentados por las células tumorales y las

c�lulas normales, y se denominan ant�genos asociados a tumor (AAT). Los linfocitos T citot�xicos que reconocen dichos ant�genos pueden ser capaces de destruir las células tumorales antes de que proliferen o se metastaticen. Los ant�genos tumorales también pueden encontrarse sobre la superficie del tumor en forma de, por ejemplo, un receptor mutado, en cuyo caso ser�n reconocidos por las células B.

En una realización preferente, por lo menos uno de los dos ant�genos diferentes (primer y segundo ant�genos), a los que se une específicamente el anticuerpo biespec�fico bivalente, es un ant�geno tumoral.

En otra realización preferente, los dos ant�genos diferentes (el primer y el segundo ant�genos), a los que se une específicamente el anticuerpo biespec�fico bivalente, son ant�genos tumorales; en este caso, el primer y segundo ant�genos también pueden ser dos ep�topos diferentes en la misma proteína específica tumoral.

En otra realización preferente, uno de los dos ant�genos diferentes (el primer y el segundo ant�genos), a los que se une específicamente el anticuerpo biespec�fico bivalente, es un ant�geno tumoral y el otro es un ant�geno de célula efectora, tal como, por ejemplo, un receptor de célula T, CD3, CD16 y similar.

En otra realización preferente, uno de los dos ant�genos diferentes (el primer y el segundo ant�genos), a los que se une específicamente el anticuerpo biespec�fico bivalente, es un ant�geno tumoral y el otro es una sustancia antic�ncer, tal como una toxina o un inhibidor de quinasa.

Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "de unión específica" o "se une específicamente a" se refieren a un anticuerpo de unión específica a un ant�geno. Preferentemente, la afinidad de unión del anticuerpo de unión específica a dicho ant�geno presenta un valor KD de 10-9 moles/l o inferior (por ejemplo de 10-10 moles/l), preferentemente con un valor KD de 10-10 moles/l o inferior (por ejemplo de 10-12 moles/l). La afinidad de unión se determina con un ensayo de unión estándar, tal como una técnica de resonancia de plasm�n superficial (Biacore�).

El término "ep�topo" incluye cualquier determinante polip�ptido capaz de unión específica a un anticuerpo. En determinadas realizaciones, el determinante ep�topo incluye grupos superficiales químicamente activos de moléculas, tales como amino�cidos, cadenas laterales sac�ridas, fosforilo o sulfonilo y, en determinadas realizaciones, puede presentar características estructurales tridimensionales específicas, o presentar características de carga específica. Un ep�topo es una región de un ant�geno que se une a un anticuerpo. En determinadas realizaciones, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un ant�geno en el caso de que reconozca preferentemente su ant�geno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

Una realización adicional de la invención es un método para la preparación de un anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención, que comprende:

a) transformar una célula huésped con:

-: vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno,

-: vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpo, y c) recuperar dicha molécula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.

En general, existen dos vectores codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de dicho anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno, y además dos vectores codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de dicho anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno. Uno de los dos vectores codifica la cadena ligera respectiva y el otro de los dos vectores es codificante de la cadena pesada respectiva. Sin embargo, en un método alternativo para la preparación de un anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención, únicamente un primer vector codificante de la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno y únicamente un segundo vector codificante de la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno pueden utilizarse para transformar la célula huésped.

La invención comprende un método para la preparación de los anticuerpos, que comprende cultivar las células huésped correspondientes bajo condiciones que permitan la síntesis de dichas moléculas de anticuerpo y recuperar dichos anticuerpos a partir de dicho cultivo, por ejemplo mediante la expresión de:

-: una primera secuencia de ácidos nucleicos codificante de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno,

-: una segunda secuencia de ácidos nucleicos codificante de la cadena pesada de dicho anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno,

-: una tercera secuencia de ácidos nucleicos codificante de la cadena ligera de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que el dominio variable de cadena ligera, VL, se sustituye por el dominio variable de cadena pesada, VH, y

-: una cuarta secuencia de ácidos nucleicos codificante de la cadena pesada de dicho anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que el dominio variable de cadena pesada, VH, se sustituye por el dominio variable de cadena ligera, VL.

-: vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno,

a) un vector que comprende una molécula de ácidos nucleicos codificante de la cadena ligera y un vector que comprende una molécula de ácidos nucleicos codificante de la cadena pesada, de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno, b) un vector que comprende una molécula de ácidos nucleicos codificante de la cadena ligera y un vector que comprende una molécula de ácidos nucleicos codificante de la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro.

Una realización adicional de la invención es una composición, preferentemente una composición farmacéutica o diagnóstica del anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención.

Una realización adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención y por lo menos un excipiente farmac�uticamente aceptable.

Una realización adicional de la invención es un método destinado al tratamiento de un paciente que necesita de terapia, caracterizado por la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo biespec�fico bivalente según la invención.

La expresión “ácido nucleico o molécula de ácidos nucleicos”, tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácidos nucleicos puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es de ADN bicatenario.

Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones “célula”, “línea celular” y “cultivo celular” se utilizan intercambiablemente y todas dichas expresiones incluyen la progenie. De esta manera, las expresiones “transformantes” y “células transformadas” incluyen la célula sujeto primario y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transferencias. También debe interpretarse que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o naturales. Se encuentra incluida la progenie variante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado realizado en la célula originalmente transformada. En donde se pretendan utilizar denominaciones diferentes, éstas resultarán evidentes a partir del contexto.

El término “transformación” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un procedimiento de transferencia de un vector/ácido nucleico al interior de una célula huésped. En el caso de que se utilicen células sin grandes barreras de pared celular como células huésped, la transfecci�n se lleva a cabo mediante, por ejemplo, el método de precipitación con fosfato de calcio, tal como describen Graham y Van der Eb, Virology 52:456ff, 1978. Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para introducir ADN en células, tales como la inyección nuclear o la fusión de protoplasto. En el caso de que se utilice una o más células que contienen construcciones sustanciales de pared celular, un método de transfecci�n es, por ejemplo, el tratamiento con calcio utilizando cloruro de calcio tal como se describe en Cohen F.N. et al., PNAS 69:7110ff, 1972.

La producción recombinante de anticuerpos utilizando la transformación es bien conocida del estado de la técnica y se describe, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17:183-202, 1999; Geisse

S. et al., Protein Expr. Purif. 8:271-282, 1996; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16:151-161, 2000; Werner R.G. et al., Arzneimittelforschung 48:870-880, 1998, as� como en las patentes US n� 6.331.415 y n� 4.816.567.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “expresión” se refiere al procedimiento por el que se transcribe un ácido nucleico en ARNm y/o al procedimiento por el que el ARNm transcrito (también denominado

transcrito) se traduce posteriormente en p�ptidos, polip�ptidos o proteínas. Los transcritos y los polip�ptidos codificados se denominan colectivamente “producto g�nico”. En el caso de que se derive el polinucle�tido de ADN gen�mico, la expresión en una célula eucari�tica puede incluir el procesamiento del ARNm.

Un “vector” es una molécula de ácidos nucleicos, en particular autorreplicativa, que transfiere una molécula de ácidos nucleicos insertada al interior de células huésped o entre las mismas. El término incluye vectores que funcionan principalmente insertando ADN o ARN en una célula (por ejemplo la integración cromos�mica), la replicaci�n de vectores que funcionan principalmente replicando ADN o ARN, y los vectores de expresión que funcionan transcribiendo y/o traduciendo ADN o ARN. También se encuentran incluidos los vectores que proporcionan más de una de las funciones anteriormente descritas.

Un “vector de expresión” es un polinucle�tido que, al introducirlo en una célula huésped apropiada, puede transcribirse y traducirse en un polip�ptido. Un “sistema de expresión” habitualmente se refiere a una célula huésped adecuada que comprende un vector de expresión que puede funcionar rindiendo un producto de expresión deseado.

Los anticuerpos bivalentes biespec�ficos según la invención preferentemente se producen por medios recombinantes. Dichos métodos son ampliamente conocidos del estado de la técnica y comprenden la expresión de proteínas en células procari�ticas y eucari�ticas con el posterior aislamiento del polip�ptido anticuerpo y habitualmente la purificación hasta una pureza farmac�uticamente aceptable. Para la expresión de proteínas, se insertan ácidos nucleicos codificantes de cadenas ligeras y pesadas o fragmentos de las mismas en vectores de expresión mediante métodos estándares. La expresión se lleva a cabo en células huésped procari�ticas o eucari�ticas apropiadas, tales como células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levaduras o células de E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (del sobrenadante o de las células tras la lisis). Los anticuerpos biespec�ficos bivalentes pueden encontrarse presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Se lleva a cabo la purificación con el fin de eliminar otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándares, incluyendo la cromatograf�a de columna y otras bien conocidas de la técnica. Ver Ausubel F. et al., editor, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987.

La expresión en células NS0 se describe en, por ejemplo, Barnes L.M. et al., Cytotechnology 32:109-123, 2000; y Barnes L.M. et al., Biotech. Bioeng. 73:261-270, 2001. La expresión transitoria se describe en, por ejemplo, Durocher Y. et al., Nucl. Acids Res. 30:E9, 2002. La clonaci�n de dominios variables se describe en Orlandi, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837, 1989; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289, 1992, y en Norderhaug, L. et al., J. Immunol. Methods 204:77-87, 1997. Un sistema de expresión transitoria preferente (HEK293) se describe en Schlaeger, E.-J. y Christensen, K., Cytotechnology 30:71-83, 1999, y en Schlaeger, E.-J.,

J. Immunol. Methods 194:191-199, 1996.

Entre las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas se incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de unión ribos�mica. Es conocido que las células eucari�ticas utilizan promotores, intensificadores y señales de poliadenilaci�n.

Un ácido nucleico se encuentra “operablemente ligado” en el caso de que se sitúe en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretorio se encuentra operablemente ligado a ADN para un polip�ptido en el caso de que se exprese como preprote�na que participa en la secreción del polip�ptido; un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que afecte a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribos�mica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que se sitúe de manera que facilite la traducción. Generalmente, la expresión “operablemente ligado” se refiere a que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretorio, contiguas y en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no son necesariamente contiguos. La unión se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción apropiados. En el caso de que dichos sitios no existan, se utilizan adaptadores oligonucle�tidos sintéticos o conector según la práctica convencional.

Se separan convenientemente anticuerpos biespec�ficos bivalentes a partir del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatograf�a en hidroxilapatito, electroforesis en gel, di�lisis o cromatograf�a de afinidad. El ADN o ARN codificante de los anticuerpos monoclonales se aísla y se secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuente de dicho ADN y ARN. Tras el aislamiento, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que seguidamente se transfectan en células huésped, tales como células HEK 293, células CHO o células de mieloma que de otra manera no producirían proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células huésped.

Las variantes (o mutantes) de secuencia de amino�cidos del anticuerpo biespec�fico bivalente se preparan mediante la introducción de cambios nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo, o mediante síntesis de nucleótidos. Sin embargo, estas modificaciones únicamente pueden llevarse a cabo bajo condiciones muy limitadas, por ejemplo tal como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, las modificaciones que no alteran las características anteriormente indicadas del anticuerpo, tal como el isotipo y la unión de ant�geno del IgG pero que podrían mejorar el rendimiento de la producción recombinante, la estabilidad de la proteína o facilitar la purificación.

Los ejemplos, listado de secuencias y figuras siguientes se proporcionan para ayudar a comprender la presente invención, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas.

Listado de secuencias

SEC ID n� 1 secuencia de amino�cidos de la cadena pesada del anticuerpo de tipo salvaje <IGF-1R>

SEC ID n� 2 secuencia de amino�cidos de la cadena ligera del anticuerpo de tipo salvaje <IGF-1R>

SEC ID n� 3 Secuencia de amino�cidos de la cadena pesada*** (CP***) del anticuerpo de intercambio VL-VH <IGF-1R>, en el que el dominio de cadena pesada VH se sustituye por el dominio de cadena ligera VL -variante A.

SEC ID n� 4 Secuencia de amino�cidos de la cadena ligera*** (CL***) del anticuerpo de intercambio VL-VH <IGF-1R>, en el que el dominio de cadena ligera VL se sustituye por el dominio de cadena pesada VH -variante A.

SEC ID n� 5 secuencia de amino�cidos de la etiqueta p�ptido de unión His-estreptavidina de ectodominio de IGF-1R (IGF-1R-His-SBP ECD)

SEC ID n� 6 secuencia de amino�cidos de la cadena pesada del anticuerpo de tipo salvaje de la angiopoyetina-2 <ANGPT2>

SEC ID n� 7 secuencia de amino�cidos de la cadena ligera del anticuerpo de tipo salvaje de la angiopoyetina-2 <ANGPT2>

SEC ID n� 8 secuencia de amino�cidos del dominio CH3 (bot�n) con un intercambio T366W para la utilización en la tecnología de bot�n en ojal

SEC ID n� 9 secuencia de amino�cidos del dominio CH3 (ojal) con intercambios T366W, L368A e Y407V para la utilización en la tecnología de bot�n en ojal

SEC ID n� 10 Secuencia de amino�cidos de la cadena pesada*** (CP***) del anticuerpo de intercambio VL-VH <IGF-1R>, en el que el dominio de cadena pesada VH se sustituye por el dominio de cadena ligera VL -variante B.

SEC ID n� 11 Secuencia de amino�cidos de la cadena ligera*** (CL***) del anticuerpo de intercambio VL-VH <IGF-1R>, en el que el dominio de cadena ligera VL se sustituye por el dominio de cadena pesada VH -variante B.

SEC ID n� 12 secuencia de amino�cidos de la etiqueta p�ptido de unión His-estreptavidina de ectodominio de IGF-1R (IGF-1R-His-SBP ECD)

Descripci�n de las figuras

Figura 1 Estructura esquemática de IgG, un anticuerpo completo natural específico de un ant�geno con dos parejas de cadena pesada y cadena ligera que comprenden dominios variables y constantes en un orden t�pico.

Figura 2 Figura esquemática de un anticuerpo biespec�fico bivalente, que comprende: a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro.

Figura 3 Figura esquemática de un anticuerpo biespec�fico bivalente, que comprende: a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y en los que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y en el que los dominios CH3 de ambas cadenas pesadas se alteran mediante la tecnología de bot�n en ojal.

Figura 4 Figura esquemática de un anticuerpo biespec�fico bivalente, que comprende: a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro, y en los que los dominios constantes de cadena pesada CH3 de ambas cadenas pesadas se sustituyen por un dominio constante de

cadena pesada CH1 y el otro dominio constante de cadena pesada CH3 se sustituye por un dominio constante de cadena ligera, CL.

Figura 5 Esquema de la secuencia de proteína de la cadena pesada*** CP***<IGF-1R> del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH

Figura 6 Esquema de la secuencia de proteína de la cadena ligera*** CL***<IGF-1R> del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH (con un dominio constante kappa de cadena ligera CL)

Figura 7 Mapa plasm�dico del vector de expresión de cadena pesada*** <IGF-1R> CP***, pUC-CP***-IGF1R Mapa plasm�dico del vector de expresión de cadena ligera*** <IGF-1R> CL***, pUC-CL***-IGF-

Figura 8 1R

Figura 9 Mapa plasm�dico del vector de expresión 4700-Hyg-OriP

Principio de ensayo del ensayo FACS celular de puente de IGF-1R-ANGPT2 sobre células I24 Figura 10 expresantes de IGF-1R para detectar la presencia de anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH funcional

Figura 11 Esquema de Biacore de ECD de IGF-1R

Figura 12 SDS-PAGE y cromatograf�a de exclusión por tamaño del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH (IgG1*) con CP* y CL* aislados a partir de sobrenadantes de cultivo celular tras la transfecci�n transitoria de células HEK293-F

Figura 13 Unión de anticuerpo monoespec�fico de intercambio <IGF-1R> VL-VH y del anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje al ECD de IGF-1R en un ensayo de unión basado en ELISA.

Figura 14 SDS-PAGE de la mezcla de anticuerpos de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH purificada a partir de sobrenadantes de cultivo celular de células HEK293-F transfectadas transitoriamente.

Figura 15 Resultados para las muestras A a F del FACS celular de puente de IGF-1R-ANGPT2 sobre células I24 expresantes de IGF-1R para detectar la presencia de anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH funcional en mezcla purificada de anticuerpos. Proteínas purificadas Muestras A a F: A = I24 no tratadas B = I24 + 2 mg/ml de ANGPT2_h + IgG_h isotipo D = I24 + 2 mg/ml de ANGPT2_h + mezcla para la coexpresi�n de anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH y anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje que comprendía el anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH E = 124 + 2 mg/ml de ANGPT2_h + anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje F = I24 + 2 mg/ml de ANGPT2_h + anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje

Ejemplos

Materiales y métodos generales

Se proporciona información general sobre las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas en: Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Los amino�cidos de las cadenas de anticuerpo se numeran y se hace referencia a las mismas según la numeración EU (Edelman G.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63:78-85, 1969; Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).

T�cnicas de ADN recombinante

Se utilizaron métodos estándares para manipular el ADN, tales como los descritos en Sambrook J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos biológicos moleculares se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

S�ntesis g�nica

Se prepararon los segmentos g�nicos deseados a partir de oligonucle�tidos construidos mediante síntesis química. Los segmentos g�nicos de 600 a 1800 pb de longitud, que se encontraban flanqueados por sitios de corte de

5 endonucleasa únicos, se ensamblaron mediante hibridación y ligación de oligonucle�tidos, incluyendo la amplificación por PCR, y posteriormente se clonaron mediante los sitios de restricción indicados, por ejemplo KpnI/SacI o AscI/PacI en un vector de clonaci�n pGA4 basado en pPCRScript (Stratagene). Las secuencias de ADN de los fragmentos g�nicos subclonados se confirmaron mediante secuenciaci�n del ADN. Los fragmentos de síntesis g�nica se ordenaron según las especificaciones proporcionadas por Geneart (Regensburg, Alemania).

Determinaci�n de la secuencia de ADN

Se determinaron las secuencias de ADN mediante secuenciaci�n de doble cadena realizada en MediGenomix GmbH (Martinsried, Alemania) o en Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Alemania).

An�lisis de secuencias de ADN y de proteínas y gestión de los datos de secuencia

Se utilizó el paquete inform�tico versión 10.2 del GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) y Vector NTI Advance suite versión 8.0 de Infomax para la creación, mapeado, análisis, anotación e ilustración de las secuencias.

Vectores de expresión

Para la expresión de los anticuerpos variantes indicados, se utilizaron pl�smidos de expresión para la expresión transitoria (por ejemplo en células HEK293 EBNA o HEK293-F) basada en una organización de ADNc con o sin un

25 promotor del CMV con intr�n A o en una organización gen�mica con un promotor de CMV.

Aparte del casete de expresión de anticuerpo, los vectores contenían:

-: un origen de replicaci�n que permitía la replicaci�n de este pl�smido en E. coli, y30 - un gen �-lactamasa que proporciona resistencia a la ampicilina en E. coli.

La unidad de transcripción del gen de anticuerpo estaba compuesta de los elementos siguientes:

-: uno o más sitios de restricción únicos en el extremo 5’ 35 - el intensificador y promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano,

-: seguido de la secuencia de intr�n A en el caso de la organización de ADNc,

-: una región 5’ no traducida de un gen de anticuerpo humano,

-: una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina,

-: la cadena de anticuerpo humano (de tipo salvaje o con intercambio de dominios) en forma de ADNc o como 40 organización gen�mica con una organización ex�n-intr�n de inmunoglobulina,

-: una región 3’ no traducida con una secuencia de señal de poliadenilaci�n, y

-: uno o más sitios de restricción únicos en el extremo 3’.

Los genes de fusión que comprendían las cadenas de anticuerpo indicadas, tal como se indica posteriormente, se

45 generan mediante PCR y/o síntesis g�nica, y se ensamblaron utilizando métodos y técnicas recombinantes conocidos mediante conexión de los segmentos de ácidos nucleicos correspondientes, por ejemplo utilizando sitios de restricción únicos en los vectores respectivos. Las secuencias subclonadas de ácidos nucleicos se verificaron mediante secuenciaci�n del ADN. Para las transfecciones transitorias, se prepararon cantidades mayores de los pl�smidos a partir de cultivos de E. coli transformados (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

T�cnicas de cultivo celular

Se utilizaron técnicas estándares de cultivo celular tales como las descritas en Current Protocols in Cell Biology, Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J. y Yamada K.M. (editores), John Wiley & Sons, Inc.,

55 2000.

Se expresaron anticuerpos biespec�ficos mediante cotransfecci�n transitoria de los pl�smidos de expresión respectivos en células HEK293-EBNA en crecimiento adherente o en células HEK29-F que crecían en suspensión, tal como se indica posteriormente.

Transfecciones transitorias en el sistema HEK293-EBNA

Se expresaron anticuerpos biespec�ficos mediante cotransfecci�n transitoria de los pl�smidos de expresión respectivos (por ejemplo codificantes de la cadena pesada y de la cadena pesada modificada, as� como las cadenas ligera y ligera modificada correspondientes) en células HEK293-EBNA en crecimiento adherente (línea celular renal embrionaria humana 293 que expresa el ant�geno nuclear del virus de Epstein-Barr; American Type Culture Collection número de depósito ATCC n� CRL-10852, Lote n� 959 218) cultivadas en DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco, Gibco) suplementado con FCS (suero de feto bovino, Gibco) al 10% con niveles ultrabajos de IgG, L-glutamina 2 mM (Gibco) y geneticina 250 mg/ml (Gibco). Para la transfecci�n, se utilizó reactivo de transfecci�n FuGENETM 6 (Roche Molecular Biochemicals) en una proporción de reactivo FuGENETM (μl) a ADN (μg) de 4:1 (comprendida entre 3:1 y 6:1). Se expresaron proteínas a partir de los pl�smidos respectivos utilizando una proporción molar de pl�smidos codificantes de cadena (modificada y de tipo salvaje) ligera y pesada de 1:1 (equimolar) comprendida entre 1:2 y 2:1, respectivamente. Las células se alimentaron el día 3 con L-glutamina 4 mM, glucosa [Sigma] y NAA [Gibco]. Los sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpo biespec�fico se recolectaron entre los días 5 y 11 tras la transfecci�n mediante centrifugaci�n y se almacenaron a -20�C. Se proporciona información general sobre la expresión recombinante de inmunoglobulinas humanas en, por ejemplo, células HEK293, en: Meissner P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75:197-203, 2001.

Transfecciones transitorias en el sistema HEK293-F

Se generaron anticuerpos biespec�ficos mediante transfecci�n transitoria de los pl�smidos respectivos (por ejemplo codificantes de cadena pesada y de cadena pesada modificada, as� como las cadenas ligera y ligera modificada correspondientes) utilizando el sistema HEK293-F (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se transfectaron células HEK293-F (Invitrogen) cultivadas en suspensión en un matraz oscilante o en un fermentador bajo agitaci�n en medio de expresión FreeStyle 293 sin suero (Invitrogen) con una mezcla de los cuatro pl�smidos de expresión y 293fectina o con fectina (Invitrogen). Para un matraz oscilante de 2 litros (Corning) se sembraron células HEK293-F a una densidad de 106 células/ml en 600 ml y se incubaron a 120 rpm, en 8% de CO2. El día después de transfectar las células a una densidad celular de aproximadamente 1,5x106 células/ml con aproximadamente 42 ml de mezcla de A) 20 ml de Opti-MEM (Invitrogen) con 600 mg de ADN total de pl�smido (1 μg/ml) codificante de la cadena pesada o de la cadena pesada modificada, respectivamente, y la cadena ligera correspondiente en una proporción equimolar, y B) 20 ml de Opti-MEM + 1,2 ml de 293 fectina o fectina (2 μl/ml). Según el consumo de glucosa, se a�adi� solución de glucosa durante el curso de la fermentación. Tras 5 a 10 días se recolect� el sobrenadante que contenía el anticuerpo secretado, y los anticuerpos se purificaron directamente del sobrenadante o el sobrenadante se congel� y se almacen�.

Determinaci�n de proteínas

Se determin� la concentración de proteínas de los anticuerpos purificados y derivados de los mismos mediante la determinación de la densidad óptica (DO) a 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción molar calculado a partir de la secuencia de amino�cidos según Pace et al., Protein Science 4:2411-2423, 1995.

Determinaci�n de la concentración de anticuerpos en sobrenadantes

Se estim� la concentración de anticuerpos y derivados en sobrenadantes de cultivo celular mediante inmunoprecipitaci�n con perlas de agarosa-proteína A (Roche). Se lavaron 60 μl de perlas de agarosa-proteína A tres veces en TBS-NP40 (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Nonidet-P40 al 1%). Posteriormente, se aplicaron 1 a 15 ml de sobrenadante de cultivo celular a las perlas de agarosa-proteína A preequilibradas en TBS-NP40. Tras la incubaci�n durante 1 hora a temperatura ambiente, las perlas se lavaron en una columna de filtro Ultrafree-MC (Amicon) una vez con 0,5 ml de TBS-NP40, dos veces con 0,5 ml de 2x de solución salina tamponada con fosfato (2xPBS, Roche) y brevemente cuatro veces con 0,5 ml de citrato sádico 100 mM, pH 5,0. El anticuerpo ligado se eluy� mediante la adicion de 35 μl de tampón para muestras NuPAGE� LDS (Invitrogen). Se combin� la mitad de la muestra con agente reductor de muestras NuPAGE� o se dej� sin reducir, respectivamente, y se calentó durante 10 minutos a 70�C. Después, se aplicaron 5 a 30 μl a un SDS-PAGE Bis-Tris NuPAGE� al 4-12% (Invitrogen) (con tampón MOPS para SDS-PAGE no reducido y tampón MES con aditivo antioxidante de tampón de migración NuPAGE� (Invitrogen) para un SDS-PAGE reducido) y se ti�� con azul de Coomassie.

La concentración de anticuerpos y derivados en sobrenadantes de cultivo celular se midió cuantitativamente mediante cromatograf�a HPLC de afinidad. Brevemente, se aplicaron sobrenadantes de cultivo celular que contenían anticuerpos y derivados que se unen a la proteína A, a una columna Poros A/20 de Applied Biosystems en KH2PO4 200 mM, citrato sádico 100 mM, pH 7,4, y se eluyeron de la matriz con NaCl 200 mM, ácido cítrico 100 mM, pH 2,5 en un sistema HPLC 1100 de Agilent. Las proteínas elu�das se cuantificaron a partir de la absorbancia de UV y la integración de las áreas de los picos. Un anticuerpo IgG1 estándar purificado sirvió como estándar.

Alternativamente, se midió la concentración de anticuerpos y derivados en los sobranadantes de cultivo celular mediante ELISA tipo s�ndwich de IgG. Brevemente, se recubrieron placas de microtitulaci�n de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina StreptaWell High Bind (Roche) con 100 μl/pocillo de molécula de captura biotinilada anti-IgG humana F(ab’)2<h-Fcy> BI (Dianova) a una concentración de 0,1 μg/ml durante 1 hora a temperatura ambiente, o alternativamente durante la noche a 4�C y posteriormente se lavaron tres veces con 200 μl/pocillo de PBS, Tween al 0,05% (PBST, Sigma). Se añadieron 100 μl/pocillo de una serie de dilución en PBS (Sigma) de sobrenadantes de cultivo celular que contenían el anticuerpo respectivo, a los pocillos y se incubaron durante 1 a 2 horas en un agitador de placas de microtitulaci�n a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con 200 μl/pocillo de PBST y el anticuerpo unido se detect� con 100 μl de F(ab’)2<hFcy>POD (Dianova) a una concentración de 0,1 μg/ml como anticuerpo de detección durante 1 a 2 horas en un agitador para placas de microtitulaci�n a temperatura ambiente. Se lav� el anticuerpo de detección no unido, tres veces con 200 μl/pocillo de PBST y el anticuerpo de detección unido se detect� mediante la adición de 100 μl de ABTS/pocillo. La determinación de la absorbancia se llev� a cabo en un espectrómetro Tecan Fluor a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia: 492 nm).

Purificaci�n de proteínas

Se purificaron proteínas a partir de sobrenadantes de cultivo celular filtrados siguiendo protocolos estándares. Brevemente, se aplicaron anticuerpos a una columna de proteína A-sefarosa (GE Healthcare) y se lavaron con PBS. La eluci�n de los anticuerpos se consiguió a pH 2,8, seguido de la neutralización inmediata de la muestra. Se separaron las proteínas agregadas de los anticuerpos monom�ricos mediante cromatograf�a de exclusión por tamaño (Superdex 200, GE Healthcare) en PBS o en histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0. Se agruparon las fracciones de anticuerpo monom�rico, se concentraron en caso necesario utilizando, por ejemplo, un concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (valor de corte de 30 MWCO), se congelaron y se almacenaron a -20�C o a 80�C. Parte de las muestras se proporcionaron a la analítica de proteínas posterior y caracterización analítica mediante, por ejemplo, SDS-PAGE, cromatograf�a de exclusión por tamaño o espectrometr�a de masas.

SDS-PAGE

Se utilizó el sistema de gel premoldeado NuPAGE� (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. En particular, se utilizaron geles premoldeados NuPAGE� Novex� Bis-TRIS al 10% � 4-12% (pH 6,4) y un tampón de migración NuPage� MES (geles reducidos con aditivo antioxidante NuPAGE� para tampón antioxidante de migración) o tampón de migración MOPS (geles no reducidos).

Cromatograf�a analítica de exclusión por tamaño

La cromatograf�a de exclusión por tamaño para la determinación de la agregación y estado oligom�rico de los anticuerpos se llev� a cabo mediante cromatograf�a HPLC. Brevemente, se aplicaron anticuerpos purificados con proteína A en una columna Tosoh TSKgel G3000SW en NaCl 300 mM, KH2PO4/K2HPO4 50 mM, pH 7,5 en un sistema HPLC 1100 de Agilent o en una columna Superdex 200 (GE Healthcare) en 2xPBS en un sistema de HPLC de Dionex. Las proteínas elu�das se cuantificaron a partir de la absorbancia de UV y la integración de las áreas de los picos. El estándar de filtración en gel 151-1901 de BioRad sirvió de estándar.

Espectrometr�a de masas

Se determin� la masa desglucosilada total de los anticuerpos entrecruzados y se confirm� mediante espectrometr�a de masas de ionizaci�n por electropulverizaci�n (EM-IEP). Brevemente, se desglucosilaron 100 mg de anticuerpos purificados con 50 mU de N-glucosidasa F (PNGasaF, ProZyme) en KH2PO4/K2HPO4 100 mM, pH 7, a 37�C durante 12 a 24 horas a una concentración de proteínas de hasta 2 mg/ml y posteriormente se desalaron mediante HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). La masa de las cadenas pesada y ligera respectivas se determin� mediante EM-IEP tras la desglucosilaci�n y reducción. Brevemente, se incubaron 50 Ig de anticuerpo en 115 μl, con 60 μl de TCEP 1 M y 50 μl de hidrocloruro de guanidina 8 M posteriormente desalado. Se determin� la masa total y la masa de las cadenas pesada y ligera reducidas mediante EM-IEP en un sistema Q-Star Elite MS dotado de una fuente NanoMate.

ELISA de unión de ECD de IGF-1R

Las propiedades de unión de los anticuerpos generados se evaluaron en un ensayo ELISA con el dominio extracelular (ECD) de IGF-1R. Para ello, el dominio extracelular de IGF-1R (residuos 1 a 462) que comprendía la secuencia líder natural y los 12 dominios LI ricos en ciste�na del ectodominio de la IGF-1R humana de la cadena alfa (según McKern et al. 1997, Ward et al. 2001) fusionados con una etiqueta p�ptido N-terminal ligante de Hisestreptavidina (His-SBP) se clon� en un derivado de vector pcDNA3 y se expres� transitoriamente en células HEK293F. La secuencia de proteínas de ECD de IGF-1R-His-SBP se proporciona en SEC ID n� 12. Se recubrieron

placas de microtitulaci�n de 96 pocillos StreptaWell High Bind Streptavidin A (Roche) con 100 Il/pocillo de sobrenadante de cultivo celular que contenía proteína de fusión soluble IGF-1R-ECD-SBP durante la noche a 4�C y se lavaron tres veces con 200 Il/pocillo de PBS, Tween al 0,05% (PBST, Sigma). A continuación, se añadieron 100 μl/pocillo de una serie de dilución del anticuerpo respectivo y como referencia, se a�adi� a los pocillos anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje en PBS (Sigma) que incluía BSA al 1% (fracción V, Roche) y se incubaron durante 1 a 2 horas en un agitador de placas de microtitulaci�n a temperatura ambiente. Para la serie de dilución se aplicó a los pocillos la misma cantidad de anticuerpo purificado. Los pocillos se lavaron tres veces con 200 μl/pocillo de PBST y el anticuerpo unido se detect� con 100 μl/pocillo de F(ab’)2<hFcy>POD (Dianova) a una concentración de 0,1 μg/ml

(1:8.000) como anticuerpo de detección durante 1 a 2 horas en un agitador para placas de microtitulaci�n a temperatura ambiente. Se lav� el anticuerpo de detección no unido, tres veces con 200 μl/pocillo de PBST y el anticuerpo de detección unido se detect� mediante la adición de 100 μl de ABTS/pocillo. La determinación de la absorbancia se llev� a cabo en un espectrómetro Tecan Fluor a una longitud de onda de medición de 405 nm (longitud de onda de referencia: 492 nm).

Biacore de ECD de IGF-1R

Tambi�n se investigó la unión de los anticuerpos generados a ECD de IGF-1R humano mediante resonancia de plasm�n superficial utilizando un instrumento BIACORE T100 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suecia). Brevemente, para las mediciones de afinidad, se inmovilizaron anticuerpos JIR 109-005-098 de cabra anti-IgG humana en un chip CM5 mediante acoplamiento de aminas para la presentación de los anticuerpos contra ECD de IGF-1R etiquetado con Fc. Se midió la unión en tampón HBS (HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,005%, pH 7,4), a 25�C. Se a�adi� ECD de IGF-1R (R&D Systems o purificado en el propio laboratorio) en solución a diversas concentraciones. Se midió la asociación mediante una inyección de ECD de IGF-1R de 80 segundos a 3 minutos; la disociaci�n se midió mediante lavado de la superficie del chip con tampón HBS durante 3 a 10 minutos y se estim� un valor de KD utilizando un modelo de unión Langmuir 1:1. Debido a la baja densidad de carga y nivel de captura de anticuerpos <IGF-1R>, se obtuvo una unión monovalente de ECD de IGF-1R. Se restaron los datos de control negativo (por ejemplo las curvas de tampón) de las curvas de muestras para la corrección de la deriva intrínseca de la línea base del sistema y para la reducción de la señal de ruido. Se utilizó el programa Biacore T100 Evaluation versión 1.1.1, para el análisis de los sensogramas y para el cálculo de los datos de afinidad. La figura 11 muestra un esquema del ensayo Biacore.

Ejemplo 1

Producci�n, expresión, purificación y caracterización de anticuerpo monoespec�fico bivalente <IGF-1R>, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro (abreviado en la presente memoria como anticiuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH).

Ejemplo 1A

Construcci�n de los pl�smidos de expresión para el anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH

Las secuencias de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH, incluyendo las secuencias líder respectivas indicadas en el presente ejemplo, se derivan de la cadena pesada del anticuerpo <IGF1R> humano (SEC ID n� 1, pl�smido 4843-pUC-CP-IGF-1R) y una cadena ligera (SEC ID n� 2, pl�smido 4842-pUC-CL-IGF-1R) descritas en el documento n� WO 2005/005635 y los dominios constantes de cadenas pesada y ligera se derivan de un anticuerpo humano (C-kappa e IgG1).

Los segmentos g�nicos codificantes de la secuencia líder del anticuerpo <IGF-1R>, dominio variable de cadena ligera (VL) y el dominio constante 1 de cadena pesada (CH1) se unieron y se fusionaron con el extremo 5' de los dominios Fc de los dominios constantes de la cadena pesada y1 humana (Bisagra-CH2-CH3). El ADN codificante de la proteína de fusión respectiva resultante del intercambio del dominio VH por el dominio VL (intercambio VH-VL) se gener� mediante síntesis g�nica y se indica como <IGF1R> CP*** (SEC ID n� 10) a continuación. Inicialmente, los dominios VL-CH1 se fusionaron con una secuencia ligeramente diferentes (SEC ID n� 3) debido a los rendimientos de expresión reducidos de esta conexión, se seleccion� SEC10, que muestra rendimientos de expresión comparables a los de los anticuerpos de tipo salvaje.

Los segmentos g�nicos de la secuencia líder del anticuerpo <IGF-1R>, dominio variable de cadena pesada (VH) y el dominio constante de cadena ligera (CL) se unieron como cadena independiente. El ADN codificante de la proteína de fusión respectiva resultante del intercambio del dominio VL por el dominio VH (intercambio VH-VL) se gener� mediante síntesis g�nica y se indica como <IGF1R> CL*** (Cadena pesada***) (SEC ID n� 11) a continuación. Inicialmente, los dominios VH-CL se fusionaron con una secuencia ligeramente diferente (SEC ID n� 4) debido a los rendimientos de expresión reducidos de esta conexión, se seleccion� SEC ID n� 11, que muestra rendimientos de expresión comparables a los de los anticuerpos de tipo salvaje.

Las figuras 5 y 6 muestran una vista esquemática de la secuencia proteica de <IGF-1R> cadena pesada modificada 5 CP*** y de <IGF-1R> CL*** cadena ligera modificada***.

A continuación se describen brevemente los vectores de expresión respectivos:

Vector pUC-CP***-IGF-1R

10 El vector pUC-CP***-IGF-1R es un pl�smido de expresión, por ejemplo para la expresión transitoria del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH cadena pesada*** CP*** (casete de expresión organizado de ADNc; con CMV-Intr�n A) en células HEK293 (EBNA) o para la expresión estable en células CHO.

15 Aparte del casete de expresión de <IGF-1R> CP***, dicho vector contiene:

-: un origen de replicaci�n procedente del vector pUC18 que permite la replicaci�n de este pl�smido en E. coli, y

-: un gen �-lactamasa que proporciona resistencia a la ampicilina en E. coli.

20 La unidad de transcripción del gen de <IGF-1R> CP*** est� compuesta de los elementos siguientes:

-: un sitio de restricción AscI único en el extremo 5’,

-: el intensificador y promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano,

-: seguido de la secuencia del intr�n A, 25 -una región 5’ no traducida de un gen de anticuerpo humano,

-: una secuencia de señal de cadena ligera de inmunoglobulina,

-: la cadena CP*** madura de <IGF-1R> humana codificante de una fusión del dominio variable de cadena ligera (VH) humana y el dominio constante de la cadena ligera kappa (CL) humana fusionado con el extremo 5' de los dominios Fc de los dominios constantes de la cadena pesada y1 humana (Bisagra-CH2-CH3).

30 - una región 3’ no traducida con una secuencia de señal de poliadenilaci�n, y

-: el sitio de restricción único SgrAI en el extremo 3’.

El mapa plasm�dico del vector de expresión de <IGF-1R> de intercambio VL-VH cadena pesada*** CP***, pUCCP***-IGF-1R, se muestra en la figura 7. La secuencia de amino�cidos de <IGF-1R> CP*** (incluyendo la secuencia

35 de señal) se proporciona en SEC ID n� 10.

Vector pUC-CL***-IGF-1R

El vector pUC-CL***-IGF-1R es un pl�smido de expresión, por ejemplo para la expresión transitoria del anticuerpo de

40 intercambio <IGF-1R> VL-VH cadena ligera*** CL*** (casete de expresión organizado de ADNc; con CMV-Intr�n A) en células HEK293 (EBNA) o para la expresión estable en células CHO.

Aparte del casete de expresión de <IGF-1R> CL***, dicho vector contiene:

45 -un origen de replicaci�n procedente del vector pUC18 que permite la replicaci�n de este pl�smido en E. coli, y

La unidad de transcripción del gen de <IGF-1R> CL*** est� compuesta de los elementos siguientes:

50 - el sitio de restricción único Sse8387I en el extremo 5’,

-: el intensificador y promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano, - seguido por la secuencia del intr�n A

-: una región 5’ no traducida de un gen de anticuerpo humano,

-: una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina,

55 - la cadena CL*** madura del anticuerpo <IGF-1R> humano codificante de una fusión del dominio variable de cadena ligera (VL) humana y los dominios constantes de la cadena pesada y1 (CH1) humana.

-: los sitios de restricción únicos SalI y FseI en el extremo 3’.

60 El mapa plasm�dico del vector de expresión de <IGF-1R> de intercambio VL-VH cadena ligera** CL***, pUC-CL***IGF-1R, se muestra en la figura 8. La secuencia de amino�cidos de <IGF-1R> CL*** (incluyendo la secuencia de señal) se proporciona en SEC ID n� 11.

Los pl�smidos pUC-CP***-IGF-1R y pUC-CL***-IGF-1R pueden utilizarse para cotransfecciones transitorias o estables en, por ejemplo, células HEK293, HEK293 EBNA o CHO (sistema de 2 vectores). Por motivos de comparación, el anticuerpo <IGF1R> de tipo salvaje se expres� transitoriamente a partir del pl�smido 4842-pUC-CLIGF-1R (SEC ID n� 2 y 4843-pUC-CP-IGF-1R (SEC ID n� 1) análogos a los indicados en el presente ejemplo.

Con el fin de conseguir niveles de expresión más altos en expresiones transitorias en células HEK293 EBNA, el casete de expresión de <IGF-1R> CP*** puede subclonarse mediante los sitios AscI y SgrAI y el casete de expresión de <IGF-1R> CL*** puede subclonarse mediante los sitios Sse8387I y FseI en el vector de expresión 4700 pUCHyg_OriP, que contiene:

-: un elemento OriP, y

-: un gen de resistencia a la higromicina como marcador seleccionable.

Las unidades de transcripción de cadenas pesada y ligera pueden subclonarse en dos vectores independientes 4700-pUC-Hyg-OriP para la cotransfecci�n (sistemas de 2 vectores) o pueden clonarse en un vector 4700-pUC-Hyg-OriP común (sistema de 1 vector) para las posteriores transfecciones transitorias o estables con los vectores resultantes. La figura 9 muestra un mapa plasm�dico del vector básico 4700-pUC-OriP.

Ejemplo 1 B

Los genes de fusión de <IGF-1R> (genes de fusión de CP*** y CL***) que comprendían las secuencias de Fab intercambiadas del anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje se ensamblaron mediante métodos y técnicas recombinantes conocidas mediante conexión de los segmentos de ácidos nucleicos correspondientes.

Cada una de las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de CP*** y CL*** de IGF-1R se sintetizó mediante síntesis química y posteriormente se clon� en un vector de clonaci�n pGA4 basado en pPCRScript (Stratagene) en Geneart (Regensburg, Alemania). El casete de expresión codificante de CP*** de IGF-1R se ligó en el pl�smido de

E. coli respectivo mediante los sitios de restricción PvuII y BmgBI, resultando en el vector final pUC-CP***-IGF-1R; el casete de expresión codificante de la CL*** de IGF-1R respectiva se ligó en el pl�smido de E. coli respectivo mediante los sitios de restricción PvuII y SalI, resultando en el vector final pUC-CL***-IGF-1R. Las secuencias subclonadas de ácidos nucleicos se verificaron mediante secuenciaci�n del ADN. Para transfecciones estables y transitorias, se prepararon cantidades mayores de los pl�smidos mediante preparación de pl�smidos a partir de cultivos de E. coli transformados (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Ejemplo 1C

Expresi�n transitoria de anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH, purificación y confirmación de la identidad mediante espectrometr�a de masas

Se expres� el anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH recombinante mediante cotransfecci�n transitoria de los pl�smidos pUC-CP***-IGF-1R y pUC-CL***-IGF-1R en células HEK293-F en suspensión tal como se ha indicado anteriormente.

El anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH expresado y secretado se purificó a partir de sobrenadantes de cultivo celular filtrados, mediante cromatograf�a de afinidad de proteína A tal como se ha indicado anteriormente. Brevemente, los sobrenadantes de cultivo celular que contenían el anticuerpo de intercambio <IGF1R> VL-VH de transfecciones transitorias se clarificaron mediante centrifugaci�n y se aplicaron a una columna de proteína A HiTrap MabSelect Xtra (GE Healthcare) equilibrada con tampón PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM y KCl 2,7 mM, pH 7,4). Las proteínas no ligadas se lavaron con tampón de equilibraci�n PBS, seguido de tampón de citrato sádico 0,1 M, pH 5,5, y se lavaron con PBS. La eluci�n del anticuerpo se llev� a cabo con citrato sádico 100 mM, pH 2,8, seguido de la neutralización inmediata de la muestra con 300 ml de Tris 2 M, pH 9,0, por cada fracción de 2 ml. Se separ� la proteína agregada de los anticuerpos monom�ricos mediante cromatograf�a de exclusión por tamaño en una columna de grado prep. HiLoad 26/60 Superdex 200 (GE Healthcare) en histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0, y las fracciones de anticuerpo monom�ricas se concentraron posteriormente utilizando un concentrador centrífugo Amicon Ultra-15 de Millipore. El anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH se congel� y se almacen� a -20�C � a -80�C. Se analizó la integridad del intercambio <IGF-1R> VL-VH mediante SDS-PAGE en presencia y en ausencia de un agente reductor y posterior tinción con azul de Coomassie brillante tal como se ha indicado anteriormente. El estado monom�rico del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH se confirm� mediante cromatograf�a analítica de exclusión por tamaño (figura 12). Se proporcionaron muestras caracterizadas para el análisis proteico y caracterización funcional posteriores. La espectrometr�a de masas IEP confirm� la masa molecular teórica del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH/CL-CH1 desglucosilado.

Ejemplo 1D

An�lisis de las propiedades de unión a IGF-1R del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH en un ELISA de unión de ECD de IGF-1R y mediante Biacore

Se evaluaron las propiedades de unión del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> VL-VH en

10 un ensayo ELISA con el dominio extracelular (ECD) de IGF-1R tal como se ha indicado anteriormente. Para ello, el dominio extracelular de IGF-1R (residuos 1 a 462) que comprendía la secuencia líder natural y los 12 dominios LI ricos en ciste�na del ectodominio de la IGF-1R humana de la cadena alfa (según McKern et al. 1997, Ward et al. 2001) fusionados con una etiqueta p�ptido N-terminal ligante de His-estreptavidina (His-SBP) se clon� en un derivado de vector pcDNA3 y se expres� transitoriamente en células HEK293F. La secuencia de proteínas de ECD

15 de IGF-1R-His-SBP se proporciona en: ver anteriormente. La curva de titulación obtenida demostr� que el anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH era funcional y mostraba características de unión y cinéticas comparables a las del anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje y, de esta manera, dentro del error del método, aparentemente era completamente funcional (figura 13).

20 Estos resultados se est�n confirmado mediante Biacore con los anticuerpos purificados respectivos.

Ejemplo 1G

An�lisis de las propiedades de unión a IGF-1R del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <IGF-1R> 25 VL-VH mediante FACS con células 124 sobreexpresantes de IGF-1R

Con el fin de confirmar la actividad de unión de <IGF-1R> VL-VH a IGF-1R sobreexpresado sobre la superficie de células I24 (células NIH3T3 que expresan IGF-1R humana recombinante, Roche) se estudi� mediante FACS. Brevemente, se incubaron 5x105 células I24 por cada tubo de FACS con una dilución de anticuerpo de intercambio 30 <IGF-1R> VL-VH y anticuerpo <IGF-1R> de tipo salvaje como referencia, y se incubaron sobre hielo durante 1 h. Se lav� el anticuerpo no unido con 4 ml de PBS helado (Gibco) + FCS al 2% (Gibco). A continuación, las células se centrifugaron (5 min a 400 g) y el anticuerpo ligado se detect� con conjugado F(ab')2 <Fcy_h>PE (Dianova) sobre hielo durante 1 h protegido de la luz. El anticuerpo de detección no ligado se lav� con 4 ml de PBS helado + FCS al 2%. A continuación, las células se centrifugaron (5 min a 400 g), se resuspendieron en 300 a 500 ml de PBS y el

35 anticuerpo de detección ligado se cuantific� en un FACSCalibur o FACS Canto (BD, canal FL2, 10.000 células por adquisición). Durante el experimento se incluyeron los controles de isotipo respectivos para excluir cualesquiera sucesos de unión no específica. La unión del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH y el anticuerpo de referencia <IGF-1R> de tipo salvaje a IGF-1R sobre células I24 resulta en un desplazamiento comparable de la intensidad de fluorescencia media dependiente de la concentración.

Ejemplos 2

Descripci�n de un anticuerpo monoespec�fico bivalente <ANGPT2> de tipo salvaje

45 Ejemplo 2A

Construcci�n de los pl�smidos de expresión para el anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <ANGPT2> de tipo salvaje

50 Las secuencias de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoespec�fico bivalente de intercambio <ANGPT2> de tipo salvaje, incluyendo las secuencias líder respectivas indicadas en el presente ejemplo, se derivan de la cadena pesada del anticuerpo <ANGPT2> humano (SEC ID n� 6), y una cadena ligera (SEC ID n� 7) descrita en el documento n� WO 2006/045049 y los dominios constantes de cadenas pesada y ligera se derivan de un anticuerpo humano (C-kappa e IgG1).

55 El anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje se clon� en los pl�smidos SB04-pUC-CP-ANGPT2 (SEC ID n� 6) y SB06-pUC-CL-ANGPT2 (SEC ID n� 7) que son análogos a los vectores descritos en el ejemplo anterior, 1A.

Por motivos comparativos y para los experimentos de coexpresi�n (ver el Ejemplo 3), el anticuerpo <ANGPT2> de

60 tipo salvaje se (co-) expres� transitoriamente a partir de los pl�smidos SB04-pUC-CP-ANGPT2 y SB06-pUC-CL-ANGPT2.

Ejemplo 2B

Construcci�n de los pl�smidos de expresión para el anticuerpo monoespec�fico bivalente <ANGPT2> de tipo salvaje

Cada una de las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de CP y CL de ANGPT2> se sintetizaron mediante síntesis química y posteriormente se clonaron en un vector de clonaci�n pGA4 basado en pPCRScript (Stratagene) en Geneart (Regensburg, Alemania). El casete de expresión codificante de CP de <ANGPT2> se clon� en el pl�smido de E. coli respectivo, resultando en el vector final SB04-pUC-CP-ANGPT2; el casete de expresión codificante de CL de <ANGPT2> respectivo se clon� en el pl�smido de E. coli respectivo, resultando en el vector final SB06-pUC-CL-ANGPT2. Las secuencias subclonadas de ácidos nucleicos se verificaron mediante secuenciaci�n del ADN. Para las transfecciones y estables transitorias, se prepararon cantidades mayores de los pl�smidos mediante preparación de pl�smidos a partir de cultivos de E. coli transformados (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Ejemplos 3

Expresi�n de anticuerpo biespec�fico bivalente <ANGPT2-IGF-1R>, en el que en las cadenas pesada y ligera de unión específica a IGF-1R, los dominios constantes VL y VH se sustituyen uno por otro (abreviadamente en la presente memoria, anticuerpo de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH)

Ejemplo 3A

Coexpresi�n transitoria y purificación del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH y del anticuerpo <ANGPT> de tipo salvaje en células HEK293 EBNA, rindiendo el anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH

Con el fin de generar un anticuerpo biespec�fico funcional que reconociese IGF-1R mediante la región Fab del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> en un lado y <ANGPT2> mediante la región Fab del anticuerpo de intercambio <ANGPT2> de tipo salvaje, por el otro lado, se coexpresaron los dos pl�smidos de expresión codificantes del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH (Ejemplo 1A) con dos pl�smidos de expresión codificantes del anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje (Ejemplo 2A). Bajo la premisa de una asociación estadística entre las cadenas pesadas de tipo salvaje y las cadenas pesadas CP*** de intercambio VL-VH, lo anterior resulta en la generación del anticuerpo biespec�fico y bivalente de intercambio <IGF-1R-ANGPT2> VL-VH. Bajo la premisa de que ambos anticuerpos se expresan igualmente bien y sin considerar productos secundarios, lo anterior debería resultar en una proporción

1:2:1 de los tres productos principales: A) anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH, B) anticuerpo biespec�fico de intercambio <IGF-1R-ANGPT2> VL-VH, y C) anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje. Pueden esperarse varios productos secundarios. Sin embargo, debido al intercambio de sólo los dominios VL-VH, la frecuencia de productos secundarios debería reducirse en comparación con el entrecruzamiento de Fab completo. Observar que, debido a que el anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje mostraba rendimientos de expresión transitoria significativamente más altos que los anticuerpos <IGF-1R> de tipo salvaje y de intercambio <IGF-1R> VL-VH, la proporción de pl�smidos de anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje y los pl�smidos de intercambio <IGF-1R> VL-VH se encontraba desplazada en favor de la expresión del anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje.

Para generar la mezcla de los productos principales A) anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH, B) anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH, y C) anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje, los cuatro pl�smidos, pUC-CP***-IGF-1R y pUC-CL***-IGF-1R, y SB04-pUC-CP-ANGPT2 y SB06-pUC-CL-ANGPT2, se cotransfectaron transitoriamente en células HEK293-F en suspensión tal como se ha indicado anteriormente. El sobrenadante recolectado contenía una mezcla de los productos principales: A) anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH, B) anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH, y C) anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje y se indica como "mezcla biespec�fica de intercambio VL-VH". Los sobrenadantes de cultivo celular que contenían la mezcla de anticuerpo biespec�fico de mezcla VL-VH se recolectaron mediante centrifugaci�n y posteriormente se centrifugaron tal como se ha indicado anteriormente.

La integridad de la mezcla de anticuerpos se analizó mediante SDS-PAGE en presencia y en ausencia de un agente reductor y posterior tinción con azul de Coomassie brillante y mediante cromatograf�a de exclusión por tamaño, tal como se ha indicado. El SDS-PAGE mostraba que existen 2 cadenas pesada y ligera diferentes en la preparación tal como se esperaba (gel reducido) (figura 14). Se proporcionaron muestras caracterizadas para el análisis proteico y caracterización funcional posteriores.

Ejemplo 3B

Detecci�n de anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH funcional en un ensayo FACS celular de puente sobre células I24 expresantes de IGF-1R

Con el fin de confirmar la presencia de anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH funcional en la mezcla biespec�fica de intercambio VL-VH/CL-CH1 purificada de los productos principales A) anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH, B) anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH y C) anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje procedentes de la coexpresi�n transitoria indicada en el Ejemplo 3A, se llev� a cabo un ensayo FACS celular de puente de IGF-1R-ANGPT2 sobre células I24 (células NIH3T3 expresantes de IGF-1R humano recombinante, Roche). El principio del ensayo se ilustra en la figura 10. Un anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH que se encuentra presente en la mezcla de anticuerpos purificada es capaz de unirse a IGF-1R en las células I24 y a ANGPT2 simultáneamente, y de esta manera formar� un puente entre sus dos ant�genos diana y con las dos regiones Fab opuestas.

Brevemente, se incubaron 5x105 células I24 por cada tubo de FACS con mezcla de anticuerpos purificada total y se incubaron sobre hielo durante 1 h (titulación: mezcla de 160 mg/ml). Los anticuerpos purificados respectivos <IGF1R> y <ANGPT2> de tipo salvaje se aplicaron a las células I24 a modo de controles. Se lav� el anticuerpo no ligado con 4 ml de PBS helado (Gibco) y FCS al 2% (Gibco) y las células se centrifugaron (5 min a 400g) y el anticuerpo biespec�fico ligado se detect� con 50 ml de angiopoyetina-2 (ANGPT2) humana 2 mg/ml (R&D Systems) durante 1 h sobre hielo. A continuación, la ANGPT2 no ligada se elimin� mediante lavado una o dos veces con 4 ml de PBS helado (Gibco) + FCS al 2% (Gibco); las células se centrifugaron (5 min a 400g) y la ANGPT2 ligada se detect� con 50 ml de anticuerpo <Ang2>IgG1_m-Biotina 5 mg/ml (BAM0981, R&D Systems) durante 45 min sobre hielo; alternativamente las células se incubaron con 50 ml de IgG1_m-Biotina-control de isotipo 5 mg/ml (R&D Systems). Se elimin� mediante lavado el anticuerpo no ligado con 4 ml de PBS helado (Gibco) y FCS al 2% (Gibco) y las células se centrifugaron (5 min a 400g) y el anticuerpo de detección ligado se detect� con 50 ml de conjugado de estreptavidina-PE 1:400 (Invitrogen/Zymed) durante 45 min sobre hielo protegido de la luz. El conjugado de estreptavidina-PE no ligado se elimin� mediante lavado con 4 ml de PBS helado + FCS al 2%. A continuación, las células se centrifugaron (5 min a 400 g), se resuspendieron en 300 a 500 ml de PBS y el conjugado de estreptavidina-PE ligado se cuantific� en un FACSCalibur o FACS Canto (canal FL2, 10.000 células por adquisición). Durante el experimento se incluyeron los controles de isotipo respectivos para excluir cualesquiera sucesos de unión no específica. Además, a modo de controles se incluyeron los anticuerpos monoespec�ficos bivalentes IgG1 purificados <IGF1R> y <ANGPT2>.

Los resultados en la fig. 15 demuestran que la incubaci�n con la mezcla purificada de anticuerpos entrecruzados (anticuerpo de intercambio <ANGPT2-IGF-1R>VL-VH) de la coexpresi�n de un antiucuerpo entrecruzado (anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH) con un anticuerpo de tipo salvaje (anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje) result� en un desplazamiento significativo de la fluorescencia, indicando la presencia de un anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH funcional que era capaz de unión a IGF-1R en células I24 y a ANGPT2 simultáneamente, y de esta manera establece un puente entre sus dos ant�genos diana y las dos regiones Fab opuestas. En contraste con lo anterior, los anticuerpos de control respectivos <IGF-1R> y <Ang-2> no result� en un desplazamiento de la fluorescencia en el ensayo FACS de puente.

Conjuntamente estos datos demuestran que, mediante la coexpresi�n de los pl�smidos de tipo salvaje y entrecruzados respectivos, pueden generarse anticuerpos biespec�ficos funcionales. Los rendimientos de anticuerpo biespec�fico correcto pueden incrementarse forzando la correcta heterodimerizaci�n de las cadenas pesadas de tipo salvaje y entrecruzada modificada, por ejemplo utilizando la tecnología de bot�n en ojal, as� como la estabilizaci�n con disulfuros (ver el Ejemplo 4).

Ejemplo 4

Expresi�n de anticuerpo biespec�fico bivalente de intercambio <VEGF-ANGPT2> VL-VH con dominios CH3 modificados (botones-en-ojales)

Para mejorar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo biespec�fico de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH, se aplicó la tecnología de bot�n en ojal a la coexpresi�n de los anticuerpos de intercambio <IGF-1R> VL-VH y <ANGPT2> de tipo salvaje con el fin de obtener una preparación homogénea y funcional de anticuerpos biespec�ficos. Con este fin se sustituyó el dominio CH3 en la cadena pesada* CP* del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH por el dominio CH3 (bot�n) de SEC ID n� 8 con un intercambio T366W y el dominio CH3 en la cadena pesada del anticuerpo <ANGPT2> de tipo salvaje se sustituyó por el dominio CH3 (ojal) de SEC ID n� 9 con un intercambio T366S, L368A, Y407V, o viceversa. Además, puede incluirse un disulfuro para incrementar la estabilidad y los rendimientos, as� como residuos adicionales que forman puentes iónicos e incrementar los rendimientos de heterodimerizaci�n (documento n� EP 1870459A1).

La coexpresi�n transitoria y la purificación del anticuerpo biespec�fico bivalente de intercambio <ANGPT2-IGF-1R> VL-VH resultante con dominios CH3 modificados (botones en ojales) se llev� a cabo tal como se indica en el Ejemplo

3.

Debe indicarse que puede conseguirse una optimización de la heterodimerizaci�n por ejemplo mediante la utilización de tecnologías de bot�n en ojal diferentes, tales como la introducción de un puente disulfuro adicional en el dominio CH3, por ejemplo Y349C, en la "cadena de bot�n", y D356C en la "cadena de ojal" y/o combinados con la utilización de los residuos R409D, K370E (K409D) para los residuos de bot�n y D399K y E357K para los residuos de ojal

5 indicados en el documento n� EP 1870459A1.

An�logamente al Ejemplo 4, pueden prepararse anticuerpos biespec�ficos bivalentes de intercambio VL-VH con dominios CH3 modificados (botones en ojales) dirigidos contra ANGPT2 y otro ant�geno diana (utilizando las cadenas pesada y ligera de ANGPT2 anteriormente inidcadas y las cadenas pesada y ligera*** de intercambio VL-VH

10 CP*** y CL*** de un anticuerpo dirigido contra otra diana, de manera que ambas cadenas pesadas son modificadas mediante "botones en ojales"), o dirigidos contra IGF-1R y otra diana (utilizando las cadenas pesada ya ligera de un anticuerpo dirigido contra dicha otra diana y las cadenas pesada y ligera*** de intercambio de IGF-1R VL-VH anteriormente indicadas CP*** y CL***, en las que ambas cadenas pesadsas se modifican mediante "botones en ojales").

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

20 <120> Anticuerpos biespec�ficos bivalentes

<130> 24678 EP

<150> EP 07024864

<151> 2007-12-21

<160> 12

30 <170> PatentIn versión 3.2

<210> 1

<211> 467

<212> PRT 35 <213> Artificial

<220>

<223> secuencias de amino�cidos de la cadena pesada del anticuerpo de tipo salvaje <IGF-1R>

<210> 2

<211> 235 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencias de amino�cidos de la cadena ligera del anticuerpo de tipo salvaje <IGF-1R>

<400> 2 <210> 3

<213> Artificial

<220>

<223>: secuencia de amino�cidos de la cadena pesada*** (CP***) del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH, en 10 el que el dominio de cadena pesada VH se sustituye por el dominio de cadena ligera VL -variante A.

<400> 3

<210> 4

<213> Artificial

<220>

<223>: secuencia de amino�cidos de la cadena ligera*** (CL***) del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH, en el 10 que el dominio de cadena ligera VL se sustituye por el dominio de cadena pesada VH -variante A.

<400> 4

<210> 5

<213> Artificial

<220>

<223>: secuencia de amino�cidos de etiqueta p�ptido de unión His-estreptavidina del ectodominio de IGF-1R (IGF10 1R-His-SBP ECD)

<400> 5

<210> 6 5 <211> 471

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

10 <223> secuencia de amino�cidos de la cadena pesada del anticuerpo de tipo salvaje de la angiopoyetina-2 <ANGPT2>

<400> 6

<210> 7

<211> 219 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223>: secuencia de amino�cidos de la cadena ligera del anticuerpo de tipo salvaje de la angiopoyetina-2 10 <ANGPT2>

<400> 7

<210> 8

<213> Artificial

<220>

<223>: secuencia de amino�cidos del dominio CH3 (bot�n) con un intercambio T366W para la utilización en la 10 tecnología de bot�n en ojal

<400> 8

5: <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial

10: <220> <223> secuencia de amino�cidos del dominio CH3 (ojal) con intercambios T366W, L368Autilizaci�n en la tecnología de bot�n en ojal e Y407V para la

<400> 9

<210> 10

<211> 440 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> secuencia de amino�cidos de la cadena pesada*** (CP***) del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH, en 10 el que el dominio de cadena pesada VH se sustituye por el dominio de cadena ligera VL -variante B.

<400> 10

<210> 11

<211> 225 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223>: secuencia de amino�cidos de la cadena ligera*** (CL***) del anticuerpo de intercambio <IGF-1R> VL-VH, en el 10 que el dominio de cadena ligera VL se sustituye por el dominio de cadena pesada VH -variante B.

<400> 11

<210> 12

<213> Artificial

<220>

<400> 12

Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo biespec�fico bivalente, que comprende:

5 a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer ant�geno, y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específico a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro.
2. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque:

el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se reúnen en una interfaz que comprende una interfaz original entre los dominios CH3 del anticuerpo, en el que se altera dicha interfaz con el fin de estimular la formación del anticuerpo biespec�fico bivalente, en el que la alteración se caracteriza porque:

a) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de manera que dentro de la interfaz original, el dominio CH3 de una cadena pesada que se reúne con la interfaz original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro del anticuerpo biespec�fico bivalente, se sustituye un residuo amino�cido por un residuo amino�cido con un volumen de cadena lateral mayor, generando de esta manera una protuberancia dentro de la interfaz del dominio CH3 de una

20 cadena pesada que es posicionable en una cavidad dentro de la interfaz del dominio CH3 de la otra cadena pesada, y b) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada, de manera que dentro de la interfaz original del segundo dominio CH3 que se reúne con la interfaz original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespec�fico bivalente,

25 se sustituye un residuo amino�cido por un residuo amino�cido de volumen de cadena lateral más pequeño, generando de esta manera una cavidad en el interior de la interfaz del segundo dominio CH3, en el interior de la cual puede posicionarse una protuberancia dentro de la interfaz del primer dominio CH3,
3. Anticuerpo según la reivindicación 2, caracterizado porque:

dicho residuo amino�cido de volumen de cadena lateral más grande se selecciona de entre el grupo que consiste de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y tript�fano (W).
4. Anticuerpo según cualquiera de la reivindicación 2 � 3, caracterizado porque:

dicho residuo amino�cido que presenta un volumen menor de cadena lateral se selecciona de entre el grupo que consiste de alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V).
5. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque ambos dominios CH3 se alteran

40 adicionalmente mediante la introducción de ciste�na (C) como amino�cido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3.
6. Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque uno de los dominios constantes de cadena pesada

CH3 de ambas cadenas pesadas se sustituye por un dominio constante de cadena pesada CH1, y el otro dominio 45 constante de cadena pesada CH3 se sustituye por un dominio constante de cadena ligera CL.
7. Método para la preparación de un anticuerpo biespec�fico bivalente según la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

50 a) transformar una célula huésped con:

-

vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno,

-

vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno

55 por otro, b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpo, y c) recuperar dicha molécula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.
8. Célula huésped que comprende:

-

vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un primer ant�geno,

-

vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de unión específica a un segundo ant�geno, en el que los dominios variables VL y VH se sustituyen uno por otro.

5 9. Composición del anticuerpo biespec�fico bivalente según las reivindicaciones 1 a 6.
10. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespec�fico bivalente según las reivindicaciones 1 a 6 y por lo menos un excipiente farmac�uticamente aceptable.