ES2476917T3 - Nuevos selectores quirales y fases estacionarias para la separación de mezclas de enanti�meros - Google Patents
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Abstract
Uso de derivados de ß-aminoácidos no sustituidos en posición α de la estructura en calidad de selectores quirales en procedimientos para la separación de mezclas de sustancias, preferiblemente 5 de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de enantiómeros, en particular de enantiómeros de sustancias seleccionadas del grupo que contiene ß-aminoácidos y sus derivados, β-aminoácidos y α-hidroxiácidos, caracterizado por que n significa 1-5, preferiblemente n significa 1 o n significa 2, R1 significa alquilo (C1-C4), arilo (C6-C10), aralquilo (C7-C13), heteroalquilo (C7-C10), piridilo, hidroximetilo, CH(OH)CH3, CH2CONH2, CH2COOH, (CH2)2CONH2, (CH2)2COOH, (CH2)4NH2, (CH2)2SCH3 o (CH2)3NHC(NH)NH2, en donde X es OH o representa un enlazador de aminopropilo, a través del cual el selector está unido, en forma de amida de ácido carboxílico, al material de soporte, y R2 significa 3,5-dinitrobenzoilo o naftilo, cuando X representa un enlazador para la unión covalente a un material de soporte, o R2 significa CH2CHR3R4, en donde R3 significa H u OH y R4 significa alquilo (C1-C20), arilo (C6 -C10) o aralquilo (C7- C13), cuando X representa OH.
Description
Nuevos selectores quirales y fases estacionarias para la separación de mezclas de enanti�meros.
La presente invención se refiere al uso de β-amino�cidos no sustituidos en posición α y, en particular, sus derivados en calidad de selectores quirales para la separación de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de mezclas de enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas del grupo que contiene β-amino�cidos y sus derivados, α-amino�cidos y α-hidroxi�cidos, as� como fases estacionarias quirales (CSP – siglas en alemán) que contienen β-amino�cidos no sustituidos en posición α y, en particular, sus derivados en calidad de selectores quirales centrales, a su síntesis y a procedimientos para la separación de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de mezclas de enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas del grupo que contiene β-amino�cidos y sus derivados, α-amino�cidos y α-hidroxi�cidos, con ayuda de estas fases estacionarias.
La creciente demanda de sustancias puras en cuanto a los enanti�meros y principios activos para aplicaciones químicas y farmacéuticas ha conducido al desarrollo de una pluralidad de tecnologías de separación estereoselectivas, ante todo en el campo de la cromatograf�a, que se pueden emplear a escala analítica para el control de la pureza enantiom�rica y para la comprobación de procesos de racemizaci�n, para el control de calidad farmacéutica y para estudios farmacocin�ticos, al igual que a escala preparativa para proporcionar los compuestos puros en cuanto a los enanti�meros.
En contraposición a diastere�meros, los enanti�meros presentan propiedades químicas y físicas idénticas en un entorno aquiral. Por lo tanto, las separaciones cromatogr�ficas de enanti�meros puede llevarse a cabo ya sea utilizando métodos indirectos, es decir, después de la reacción del analito con un reactivo de derivatizaci�n quiral para dar una mezcla de diastere�meros que, a diferencia de una mezcla de enanti�meros, se puede separar en material de fase aquiral, o con ayuda de los denominados métodos directos utilizando un selector quiral que es incorporado en la fase móvil o estacionaria. La capacidad de separación se basa aquí en la diferente estabilidad de los complejos diastere�meros que se forman por interacciones no covalentes entre el analito y el selector.
Procedimientos directos, al igual que indirectos, encontraron aplicación en el campo de la separación de enanti�meros en diversos métodos cromatogr�ficos y electrofor�ticos tales como la cromatograf�a de gases (GC), la cromatograf�a líquida de alta resolución (también cromatograf�a líquida de alta presión, HPLC), la cromatograf�a de capa fina (DC), cromatograf�a líquida s�per- y sub-crítica (SFC), la electrocromatograf�a capilar (CEC) y la electroforesis capilar (CE) (G�bitz y Schmid (comps.), Methods in Molecular Biology, Vol. 243:. Chiral Separations: Methods and Protocols, Humana Press Inc: Totowa, NJ: 2004; G�bitz y Schmid, Biopharm. Drug Dispos. 2001, 22, 291-336).
Un derivatizaci�n del analito significa al menos una etapa de reacción adicional, que puede conducir a la formación de productos secundarios y de descomposición no deseados, as� como a la racemizaci�n (parcial). Además de ello, deben estar presentes en el analito grupos funcionales adecuados para la derivatizaci�n, y el reactivo de derivatizaci�n quiral debe estar disponible en alta pureza enantiom�rica (G�bitz y Schmid, Biopharm. Drug Dispos. 2001, 22, 291-336), por lo cual hoy en día se prefieren métodos cromatogr�ficos o electrofor�ticos no derivativos.
La adición de un selector quiral a la fase móvil de un sistema cromatogr�fico o electrofor�tico representa ciertamente un método de manipulación simple para la separación de enanti�meros, pero es muy caro y no se puede poner en práctica en todos los casos.
Procedimientos cromatogr�ficos directos utilizando fases estacionarias quirales, en los que un selector quiral est� unido de forma covalente o por adsorción a un material de soporte son convenientes en términos de manipulación y
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- suponiendo un rendimiento de separación suficiente del material en fase quiral -también aplicables a escala preparativa. Precisamente en el campo de fases estacionarias quirales, es deseable un selector quiral, el cual, por una parte, permita una separación eficiente de los dos enanti�meros de un compuesto quiral, pero, por otra parte, sea lo suficientemente flexible como para permitir la aplicación de una amplia clase de compuestos.
Una variante de los métodos directos son procesos de intercambio de ligandos (LE), que se basan en la formación de complejos ternarios mixtos entre un ion met�lico, un selector quiral y el analito, ambos de los cuales actúan como ligandos sobre el ion met�lico.
Responsables en este caso para una separación exitosa son las diferentes constantes de estabilidad de los complejos mixtos con el enanti�mero (R) o bien (S) del analito. El principio de intercambio de ligandos pudo emplearse con éxito en una serie de los procedimientos arriba mencionados para la separación de enanti�meros: por una parte, bajo la adición de un selector quiral al electrolito en la electroforesis capilar y, además de ello, utilizando fases estacionarias quirales en cromatograf�a en columna clásica, la cromatograf�a líquida de alto rendimiento, la cromatograf�a de capa fina y la electrocromatograf�a capilar, en donde, en estos casos, el selector quiral puede estar unido de forma covalente o por adsorción al material de soporte.
Dado que, no obstante, hasta la fecha no pueden ser pronosticadas separaciones quirales, sigue siendo un gran desafío cromatogr�fico encontrar con eficacia y rapidez la combinación adecuada de fase quiral estacionaria y móvil (Subramanian, Practical Approach to Chiral Separations by Liquid Chromatography, Wiley-VCH: Weinheim 1994; G�bitz y Schmid (comps.), Methods in Molecular Biology, Vol. 243: Chiral Separations: Methods and Protocols, Humana Press Inc: Totowa, NJ: 2004; Francotte, GIT Labor-Fachzeitschrift 5/2006, 452-455), e investigaciones intensas han conducido a materiales de fase siempre nuevos y mejorados (L�mmerhofer y Lindner, En: Separation Methods in Drug Synthesis and Purification, Valk� (comp.), Elsevier: Amsterdam 2000, 337-437). De acuerdo con Armstrong et al. (Anal. Chem. 2001, 73, 557A-561A), ya en 2001 se podían adquirir en el comercio más de 100 fases estacionarias quirales basadas en diferentes selectores solamente para la cromatograf�a líquida de alto rendimiento. Cada uno de los fabricantes ofrece extensos manuales de aplicación, en los que se listan, casi de forma exclusiva de forma específica para el producto, las más variadas condiciones de separación, p. ej., para aminas quirales alif�ticas, aromáticas, alic�clicas o heteroc�clicas, alcoholes, amino-alcoholes o α-amino�cidos y sus derivados. Esta pluralidad de fases estacionarias quirales adquiribles comercialmente confirma, por una parte, la enorme importancia y el gran interés en estas técnicas de separación, pero también una gran desventaja que afecta hasta la fecha a los métodos cromatogr�ficos y electrofor�ticos directos con ayuda de fases estacionarias quirales: a menudo se necesita una serie de fases estacionarias quirales (costosas) para lograr una separación eficiente, incluso en el caso de unidades estructuralmente estrechamente relacionadas.
Por lo tanto, investigaciones propias, al igual que datos de la bibliografía confirman que, hasta la fecha, para la cromatograf�a quiral, por ejemplo de β-amino�cidos y sus derivados, es necesaria una pluralidad de fases estacionarias que luego se emplean en cromatograf�a de gases (GC) o cromatograf�a de líquidos (p. ej. HPLC). A partir del estado de la técnica se conocen, p. ej., fases de carbamato de celulosa, derivados de amilosa, �teres corona (Berkecz et al., J. Chromatogr. A, 2006, 1125, 138-143; Hyun et al., J. Sep. Sci. 2005, 28, 421-427), fases de intercambio de ligandos (Hyun et al., J. Sep. Sci. 2003, 26, 1615-1622; Hyun et al., Biomed. Chromatogr. 2003, 17, 292-296) o fases de glicop�ptidos macroc�clicas (Sztojkov-Ivanov et al., Chromatographia 2006, 64, 89-94; Illisz et al., J. Sep. Sci. 2006, 29, 1305-1321 y la bibliografía all� citada; D'Acquarica et al., Tetrahedron: Assymetry 2000, 11, 2375-2385).
En los últimos años, debido a sus particulares propiedades farmacol�gicas, los β-amino�cidos se han incorporado como componentes clave en una pluralidad de peptidomim�ticos y otras sustancias biol�gicamente activas (Kuhl et al., Amino Acids 2005, 29, 89-100). Asociado con esto se desarroll� también una demanda creciente de métodos analíticos para examinar la pureza en cuanto a los enanti�meros de las unidades de síntesis y los productos finales, precisamente también en el sector de la determinación de trazas secundarias para la detección de trazas de un enanti�mero en presencia de un claro exceso del ant�poda óptico (Juaristi y Soloshonok, Enantioselective Synthesis of β-Amino Acids, Wiley-VCH: Nueva York 2005).
La misión de la presente invención consiste en proporcionar nuevos selectores quirales, sobre la base de los cuales pueden proporcionarse nuevas fases quirales para la separación de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de mezclas de enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas entre el grupo que contiene β-amino�cidos y sus derivados, αamino�cidos y α-hidroxi�cidos, que permiten una separación eficiente y en lo posible universal de pares de enanti�meros de compuestos quirales, en particular de β-amino�cidos y sus derivados con métodos cromatogr�ficos, en particular con ayuda de la cromatograf�a líquida de alto rendimiento, a escala analítica y preparativa.
Ahora se ha encontrado, de manera completamente sorprendente, que derivados de β-amino�cidos no sustituidos en posición α, representan selectores quirales flexibles y, a pesar de ello, altamente selectivos en procesos para la
separaci�n de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de mezclas de enanti�meros, en particular de β-amino�cidos y sus derivados. Otras clases de sustancias para las que se pueden utilizar los selectores de acuerdo con la invención para la separación de enanti�meros son, por ejemplo, α-amino�cidos y α-hidroxi�cidos. Por lo tanto, es una ventaja particular de la presente invención que las fases quirales que contienen selectores quirales a base de derivados de β-amino�cidos no sustituidos en posición α, se puedan emplear sorprendentemente de manera universal para la separación
cromatogr�fica de un gran número de clases de sustancias.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención es el uso de selectores quirales de la estructura (I)
en la que n significa 1-5, preferiblemente n significa 1 o n significa 2, R1 significa alquilo (C1-C4), arilo (C6-C10),
aralquilo (C7-C13), heteroalquilo (C7-C10), piridilo, hidroximetilo, CH(OH)CH3, CH2CONH2, CH2COOH, (CH2)2CONH2,
(CH2)2COOH, (CH2)4NH2, (CH2)2SCH3 o (CH2)3NHC(NH)NH2;
en donde X es OH o representa un enlazador de aminopropilo, a través del cual el selector est� unido, en forma de
amida de ácido carbox�lico, al material de soporte,
y R2 significa 3,5-dinitrobenzoilo o naftilo, cuando el selector quiral se une covalentemente a un material de soporte
a través de un enlazador X,
o R2 significa CH2CHR3R4, en donde R3 significa H u OH y R4 significa alquilo (C1-C20), arilo (C6 -C10) o aralquilo (C7-C13), cuando X representa OH.
Conforme a la invención, el selector quiral est� presente predominantemente en una configuración absoluta con
respecto al átomo de carbono C3 (átomo de carbono β), mientras que un estereocentro potencialmente presente en
las cadenas laterales no tiene que estar presente predominantemente en una configuración absoluta.
En el sentido de la invención, un radical alquilo (C1-C4) designa un radical con 1 a 4 átomos de carbono saturados que puede presentar tener ramificaciones arbitrarias, preferiblemente los radicales metilo, isopropilo, isobutilo y sec.-butilo.
En el marco de la invención, un radical arilo (C6-C10) designa un radical aromático con 6 a 10 átomos de carbono, preferiblemente los radicales fenilo as� como 1- y 2-naftilo, que pueden estar mono-, oligo-, poli- o per-sustituidos con otros radicales o grupos funcionales, especialmente con flúor, cloro, bromo, metilo y/o radicales trifluorometilo, as� como grupos hidroxilo y/o ciano.
En el sentido de la invención, un radical aralquilo (C7-C13) designa preferiblemente un radical arilo (C6-C10) unido a la molécula a través de un grupo metileno, as� como, además, preferiblemente radicales feniletilo y difenilmetilo.
En el sentido de la invención, un radical heteroaralquilo (C7-C10) designa preferiblemente un radical piridilo o indolilo unido a la molécula a través de un grupo metileno.
En el sentido de la invención, un radical naftilo designa preferiblemente un radical 1-naftilo o 2-naftilo, al que pueden estar unidos otros sustituyentes.
Preferiblemente, R1 significa fenilo; se da preferencia particular a la forma de realización en la que R1 significa fenilo y n significa 1 o n significa 2. Preferiblemente, además, R4 significa fenilo.
Objeto de la invención es, además, el uso de los selectores quirales descritos por la estructura (I) para la preparación de fases estacionarias para procesos de separación cromatogr�ficos de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de mezclas de enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas entre el grupo que contiene βamino�cidos y sus derivados, α-amino�cidos y α-hidroxi�cidos, en donde el selector quiral es unido de forma covalente o por adsorción a un material de soporte basado en gel de sílice o un monolito.
Los selectores quirales descritos por la estructura (I) o bien las fases estacionarias quirales basadas en ellos son adecuados como selectores en procesos para la separación cromatogr�fica de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de mezclas de enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas entre el grupo que contiene βamino�cidos y sus derivados, α-amino�cidos y α-hidroxi�cidos. Además de la mezcla de enanti�meros, la muestra también puede contener otros compuestos tales como, por ejemplo, subproductos y/o impurezas, que deben ser separadas. Procedimientos cromatogr�ficos en el sentido de la invención son, entre otros, la cromatograf�a en capa fina (DC), electrocromatograf�a capilar (CEC) y, de manera particularmente preferida, la cromatograf�a líquida de alto rendimiento (HPLC). Otros procedimientos cromatogr�ficos en el sentido de la invención son la microcromatograf�a líquida de alto rendimiento (�-HPLC) y la electrocromatograf�a capilar (CEC) en microchips (la denominada tecnología de laboratorio en chip). Una ventaja particular de la presente invención estriba en que los selectores quirales permiten la preparación de fases estacionarias que son estables bajo diversas condiciones y que pueden ser operadas tanto en el modo de fase normal (NP), como en el modo orgánico-polar (PO) y en el modo de fase inversa (RP). Una ventaja adicional de la presente invención es que los selectores quirales, en virtud de su alta selectividad, permiten la determinación de trazas secundarias de enanti�meros.
Se da preferencia, además, a los procedimientos cromatogr�ficos mencionados en el modo de intercambio de
5 ligando, en los que la fase móvil comprende iones met�licos cargados positivamente, preferiblemente iones met�licos divalentes, en particular iones cobre(II) (Davankov, J. Chromatogr. 1971, 60, 280-283). En el modo de intercambio de ligando, se da preferencia a la unión por adsorción del selector quiral conforme a la estructura (I), en donde X significa OH y R2 significa CH2CHR3R4, en donde R3 representa H u OH y R4 representa alquilo (C1-C20), arilo (C6-C10) o aralquilo (C7-C13).
La invención proporciona, además, una fase estacionaria quiral para la separación cromatogr�fica de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de mezclas de enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas entre el grupo que contiene β-amino�cidos y sus derivados, α-amino�cidos y α-hidroxi�cidos, que
15 contienen un material de soporte y un selector quiral, en donde el selector quiral contiene un derivado de βamino�cido no sustituido en posición α, de la estructura
en donde n significa 1-5, preferiblemente n significa 1 o n significa 2, R1 significa alquilo (C1-C4), arilo (C6-C10), aralquilo (C7-C13), heteroaralquilo (C7-C10), piridilo, hidroximetilo, CH(OH)CH3, CH2CONH2, CH2COOH, (CH2)2CONH2, (CH2)2COOH, (CH2)4NH2, (CH2)2SCH3 o (CH2)3NHC(NH)NH2, R2 significa 3,5-dinitrobenzoilo o naftilo, y X representa un enlazador de aminopropilo, a través del cual el selector est� unido, en forma de amida de ácido carbox�lico, al material de soporte.
De acuerdo con la invención, el selector quiral est� presente predominantemente en una configuración absoluta con 25 respecto al átomo de carbono C3 (átomo de carbono β).
Preferiblemente, R1 significa fenilo, se prefiere particularmente la realización en la que R1 significa fenilo y n significa 1 o n significa 2.
El enlazador X representa un enlazador de aminopropilo, a través del cual el selector est� unido, en forma de amida
Materiales de soporte preferidos en el sentido de la invención son materiales basados en gel de sílice o monolitos.
35 La invención proporciona, además, un procedimiento para la preparación de una fase estacionaria quiral que contiene un selector quiral de la estructura (II) o (IIa), que comprende las siguientes etapas: (ia) acilaci�n (R2 = 3,5dinitrobenzoilo) de un β-amino�cido no sustituido en posición α o del correspondiente éster de β-amino�cido con un derivado de 3,5-dinitrobenzoilo adecuado para la acilaci�n, preferiblemente cloruro de 3,5-dinitrobenzoilo, o (ib) síntesis de un β-amino�cido N-naftilado no sustituido en posición α o del correspondiente éster de β-amino�cido (R2 = naftilo) (ii) eventualmente, saponificaci�n de la función éster, (iii) eventualmente, acoplamiento de otras unidades de β-amino�cido no sustituido en posición α, (iv) unión covalente del selector quiral a un material de soporte, eventualmente a través de un enlazador. La preparación de los compuestos de la estructura general (II) y (IIa) puede tener lugar, por ejemplo, mediante acilaci�n de (R2 = 3,5-dinitrobenzoilo) del β-amino�cido o bien del correspondiente éster de β-amino�cido con un derivado de 3,5-dinitrobenzoilo adecuado para la acilaci�n,
45 preferiblemente cloruro de 3,5-dinitrobenzoilo (análogamente al procedimiento publicado por Pirkle et al. para la preparación de fases quirales, entre otros sobre la base de α-amino�cidos (J. Chromatogr. 1980, 192, 143158)). La síntesis de un β-amino�cido N-naftilado no sustituido en posición α o del correspondiente éster de βamino�cido predominantemente en una forma enantiom�rica (R2 = naftilo) es posible, por ejemplo, a través de una variación de la clásica reacción de Bucherer partiendo del correspondiente β-amino�cido y naftol (análogamente al procedimiento publicado por Pirkle y Pochapsky para la preparación de N-(2-naftil)-2-amino�cidos y ésteres con altas purezas en cuanto a los enanti�meros (J. Org. Chem. 1986, 51, 102-105)). Los ésteres de β-amino�cidos se requieren para formar los selectores con una unidad de β-amino�cido repetitiva (n > 1), que puede tener lugar, por ejemplo, por la vía de la síntesis clásica de p�ptidos en disolución. Para más detalles y vías de síntesis alternativas se remite a la bibliografía especializada para la síntesis de p�ptidos (p. ej., Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Volúmenes 15/1 y 15/2; M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Editorial Springer 1984).
5 Además, la invención proporciona un procedimiento para la separación cromatogr�fica de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de mezclas de enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas entre el grupo que contiene βamino�cidos y sus derivados, α-amino�cidos y α-hidroxi�cidos, utilizando los selectores quirales descritos por las estructuras (II) o (IIa) o las fases estacionarias quirales basadas en ellos, que comprende (i) la puesta en contacto de una disolución de la mezcla de sustancias a separar con una fase estacionaria quiral que comprende un material de soporte y un selector quiral conforme a la estructura (II) o (IIa), (ii) la separación de los componentes de la mezcla de sustancias en virtud de su diferente interacción con la fase estacionaria utilizando una fase móvil, y (iii) eventualmente, la recogida fraccionada de la fase móvil y el aislamiento de la sustancia cromatogr�ficamente
15 purificada de la misma. Este procedimiento es apropiado también para la determinación de trazas secundarias de enanti�meros, preferiblemente de enanti�meros de α-y β-amino�cidos. Se da preferencia a procesos de cromatograf�a de líquidos, especialmente procesos HPLC. éstos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, en el modo de fase normal (NP), el modo polar-orgánico (PO) o el modo de fase inversa (RP) y sin adición de iones met�licos.
Adem�s, la presente invención proporciona una fase estacionaria quiral para la separación cromatogr�fica de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de mezclas de enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas entre el grupo que contiene β-amino�cidos y sus derivados, α-amino�cidos y α-hidroxi�cidos, que contienen un material de soporte y un selector quiral, en donde el selector quiral representa un derivado de β-amino�cido no sustituido en posición α de la
25 estructura (III)
en donde R1 significa alquilo (C1-C4), arilo (C
6-C10), aralquilo (C7-C13), heteroaralquilo (C7-C10), piridilo, hidroximetilo, CH(OH)CH3, CH2CONH2, CH2COOH, (CH2)2CONH2, (CH2)2COOH, (CH2)4-NH2, (CH2)2-SCH3 o (CH2)3NHC(NH)NH2 y R3 significa H u OH y R4 significa alquilo (C1-C20), arilo (C6 -C10) o aralquilo (C7-C13).
De acuerdo con la invención, el selector quiral est� presente predominantemente en una configuración absoluta con respecto al átomo de carbono C3 (átomo de carbono β), mientras que el estereocentro potencialmente presente en posición 2’ no debe estar presente predominantemente en una configuración absoluta.
35 Preferiblemente, R1 significa fenilo.
En el sentido de la invención, R4 representa preferiblemente un radical fenilo sustituido de cadena corta, más preferiblemente un radical fenilo no sustituido, o un radical alquilo con 1 a 20 átomos de carbono lineal o ramificado, preferiblemente con 4 a 18 átomos de carbono, de manera particularmente preferida con 6 a 16 átomos de carbono, en particular con 10 a 12 átomos de carbono, y de manera particularmente preferida representa n-decilo. En particular, se prefiere la forma de realización en la que R1 significa fenilo y R4 significa n-decilo.
La aplicación de los selectores quirales conformes a la fórmula (III) sobre materiales de soporte adecuados tiene lugar preferiblemente por adsorción mediante la denominada cobertura dinámica en materiales de fase inversa
45 (materiales “Reversed-Phase”, materiales RP), preferiblemente basado en gel de sílice o monolitos. Materiales RP preferidos son, p. ej., RP-2, RP-4, RP-5, RP-6, RP-8, RP-12 y, en particular, RP-18.
La invención proporciona, además, un procedimiento para la preparación de una fase estacionaria quiral que contiene un selector quiral conforme a la estructura (III), que comprende las siguientes etapas: (i) preparación del amino�cido N-alquilado, (ii) unión por adsorción del amino�cido N-alquilado a un material de soporte.
La preparación de los compuestos de la estructura general (III) puede tener lugar, por ejemplo, por reacción de un compuesto ep�xido correspondiente con el respectivo β-amino�cido con el empleo de cantidades equimolares de una base fuerte, p. ej. metilato de sodio (Busker et al., documento DE 3 143 726 A1). Esto conduce a la
55 configuración rac�mica en el átomo de carbono 2'. Un método alternativo para la preparación de selectores quirales de la estructura (III) es la N-alquilaci�n del β-amino�cido correspondiente con un bromuro de n-alquilo (p. ej. de acuerdo con Davankov et al., Chromatographia 1980, 13, 677-685).
Se da preferencia, además, a un procedimiento para la separación cromatogr�fica de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de mezclas de enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas entre el grupo que contiene βamino�cidos y sus derivados, α-amino�cidos y α-hidroxi�cidos, a escala analítica, semi-preparativa o preparativa, utilizando los selectores quirales descritos por la estructura (III) o las fases estacionarias quirales basadas en ellos, en particular en el modo de intercambio de ligandos (LE) con adición de iones met�licos, preferiblemente iones met�licos, divalentes y, de manera particularmente preferida iones cobre(II). Un procedimiento de este tipo comprende (i) la puesta en contacto de una disolución de la mezcla de sustancias a separar con una fase estacionaria quiral que comprende un selector quiral conforme a la estructura (III), (ii) la separación de los componentes individuales de la mezcla de sustancias en virtud de su diferente interacción con el selector quiral utilizando una fase móvil que contiene iones de metales de transición divalentes, preferiblemente iones cobre(II), y
(iii) en el caso de una aplicación de cromatograf�a líquida preparativa o semi-preparativa, eventualmente la recogida fraccionada de las fases móviles y el aislamiento de la sustancia cromatogr�ficamente purificada del mismo. Este procedimiento se adecua, además, para la determinación de trazas secundarias de enanti�meros, preferiblemente de enanti�meros de α-y β-amino�cidos.
En el sentido de la invención, la separación cromatogr�fica designa la separación de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de mezclas de enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas entre el grupo que contiene βamino�cidos y sus derivados, α-amino�cidos y α-hidroxi�cidos, en una fase estacionaria, tanto para fines analíticos sin posterior aislamiento de las sustancias separadas como para fines semi-preparativos o preparativos con posterior aislamiento de las sustancias separadas de componentes del sistema cromatogr�fico (material de soporte, fase móvil) y otras sustancias contenidas en la muestra.
En el sentido de la invención, predominantemente en una configuración absoluta significa más de 50 %, preferiblemente al menos 90%, en particular al menos 95% de una forma enanti�mera �pticamente activa, y de manera particularmente preferida la forma pura en cuanto a los enanti�meros.
La Figura 1 muestra la resolución cromatogr�fica de isómeros ópticos de diferentes derivados de β-amino�cidos utilizando fases estacionarias quirales de acuerdo con el Ejemplo 1.
La Figura 2 muestra la resolución cromatogr�fica de isómeros ópticos de diferentes derivados de β-amino�cidos utilizando fases estacionarias quirales de acuerdo con el Ejemplo 2.
La Figura 3 muestra la resolución cromatogr�fica de isómeros ópticos de diferentes α-y β-amino�cidos as� como αhidroxi�cidos, utilizando fases estacionarias quirales según el Ejemplo 3.
La Figura 4 muestra la aplicación de una fase estacionaria quiral conforme al Ejemplo 2 para la determinación de la pureza en cuanto a los enanti�meros, especialmente en el campo de la determinación de trazas secundarias. El cromatograma superior muestra la resolución cromatogr�fica de una mezcla rac�mica de ácido (R)- y (S)-3-terc.butoxicarbonilamino-3-fenilpropi�nico utilizando una fase estacionaria quiral conforme al Ejemplo 2. En el medio, se representa el cromatograma del ácido (S)-3-terc.-butoxicarbonilamino-3-fenilpropi�nico en esta fase. El cromatograma inferior muestra la resolución de ácido (S)-3-terc.-butoxicarbonilamino-3-fenilpropi�nico que ha sido suplementado con ácido (R)-3-terc.-butoxicarbonilamino-3-fenilpropi�nico al 1%.
Como ya se ha mencionado, el estado conocido de la técnica anterior da a conocer una pluralidad de selectores quirales y fases estacionarias basadas en éstos. As�, por ejemplo, para la separación de β-amino�cidos y sus derivados por medio de cromatograf�a líquida de alto rendimiento, encontraron aplicación hasta la fecha selectores quirales basados en �teres corona, derivados de α-amino�cidos o glicop�ptidos macroc�clicos. En la Tabla 1 se recopilan diversos procedimientos cromatogr�ficos para la separación de β-amino�cidos enanti�meros, que se conocen de la técnica anterior, y se comparan con los resultados que se pueden conseguir con la enseñanza de la presente invención La caracterización de las columnas de separación tiene lugar de una manera habitual – tal como se describe, p. ej., en Meyer, Praxis der Hochdruckfl�ssigkeitschromatographie, Wiley-VCH Weinheim 2004 – mediante los factores de capacidad k1 y k2, el factor de separación α y la resolución Rs. Las condiciones exactas cromatogr�ficas se pueden tomar de la bibliografía original respectiva.
Tabla 1: Separación cromatogr�fica de mezclas de enanti�meros de β-amino�cidos de la estructura general H2N-CHR1-CH2-CO2H en fases estacionarias quirales
- R1
- Selector quiral Fase móvil* k1 α Rs Ref.
- Ph
- Vancomicina MeOH/AcOH/TFA 100:0,1:0,1 0,70 1,13 0,80 [1]
- (S)-Leucinol
- MeOH/H2O 50:50 + CuSO4 (0,3 mM) 1,38 1,61 1,48 [2]
- Ristocetina A
- MeOH/AcOH/TFA 100:0,4:0,1 2,61 1,25 1,54 [3]
- A-40,926
- MeOH/H2O 90:10 + NH4OAc (25 mM) 0,71 1,33 2,03 [4]
- Teicoplanina
- MeOH/H2O 90:10 + NH4OAc (25 mM) 0,73 1,32 2,05 [4]
- �cido (18-corona-6)2,3,11,12.tetracarbox�lico
- MeOH/H2O 50:50 + AcOH (5 mM) 3,60 1,60 2,76 [5]
- (R)-Fenilglicinol
- MeOH/H2O 50:50 + CuSO4 (0,3 mM) 4,41 2,03 4,15 [2]
- �cido 3-amino-3fenilpropi�nico
- MeOH/H2O 90:10 + Cu(OAc)2 (0,1 mM) 3,16 1,72 5,08 a
- 3-MeOC6H4
- Teicoplanina MeOH/AcOH/TFA 100:0,01:0,01 2,66 1,00 0,0 [1]
- Vancomicina
- MeOH/AcOH/TFA 100:0,1:0,1 0,75 1,16 0,80 [1]
- Ristocetina A
- MeOH/AcOH/TFA 100:0,1:0,1 1,43 1,15 1,00 [1]
- �cido (18-corona-6)2,3,11,12.tetracarbox�lico
- MeOH/H2O 50:50 + AcOH (5 mM) 3,83 1,31 1,71 [6]
- 4-(3,5-dinitrobenzamido)1,2,3,4-tetrahidrofenantreno
- n-hexano/EtOH/TFA 90:10:0,2 n.a.b 2,6 2,1 [7]
- �cido 3-amino-3fenilpropi�nico
- MeOH/H2O 90:10 + Cu(OAc)2 (0,1 mM) 6,72 1,63 5,13 a
- 2-ClC6H4
- Teicoplanina MeOH/AcOH/TFA 100:0,01:0,01 1,46 1,08 < 0,40 [1]
- Ristocetina A
- MeOH/AcOH/TFA 100:0,1:0,1 1,23 1,11 0,70 [1]
- �cido (18-corona-6)2,3,11,12.tetracarbox�lico
- MeOH/H2O 20:80 + (AcOH 10 mM) 3,04 1,14 1,06 [6]
- �cido 3-amino-3fenilpropi�nico
- MeOH/H2O 90:10 + Cu(OAc)2 (0,1 mM) 10,88 3,34 10,6 a
a presente invención; b n.a. = no indicado
5 * otros parámetros: véase la bibliografía / Ejemplos de esta invención: Caudal 1 ml/min, 30�C
[1] Sztojkov-Ivanov et al., Chromatographia 2006, 64, 89-94.
[2] Hyun et al., J. Sep. Sci. 2003, 26, 1615-1622.
[3] P�ter et al., J. Chromatogr. A 2001, 926, 229-238. 10 [4] D'Acquarica et al., Tetrahedron: Assymetry 2000, 11, 2375-2385.
[5] Hyun et al., J. Sep. Sci. 2002, 25, 648-652.
[6] Berkecz et al., J. Chromatogr. A 2006, 1125, 138-143.
[7] Madhavan, Chromatographia 2007, 66, 243-246.
15 Como resulta evidente a partir de la Tabla 1, los selectores de acuerdo con la invención y las fases estacionarias basadas en ellos se manifiestan extremadamente ventajosos en comparación con los selectores conocidos de la técnica anterior con respecto a su capacidad de separación, caracterizada por el factor de separación α y la resolución de los enanti�meros RS, precisamente también con respecto a aplicaciones semi-preparativas y preparativas. Además de ello, presentan una amplia aplicabilidad; también se hace referencia aquí a los resultados
20 mostrados en las Tablas 2-4.
A partir de la técnica anterior se conocen también selectores quirales que se basan en α-amino�cidos y que tienen una cierta similitud con los selectores descritos por la estructura (II) (Welch, J. Chromatogr. A 1994, 3-26). Sin embargo, en ninguno de los selectores quirales all� descritos se trata de un derivado de β-amino�cido no sustituido en posición α. En el estado conocido de la técnica se describe incluso en varias fuentes que una distancia grande entre los grupos funcionales relevantes para el reconocimiento quiral y una alta flexibilidad conformacional del selector, que surgen debido al grupo metileno adicional en los selectores de acuerdo con la invención en comparación con α-amino�cidos o también en comparación con los β-amino�cidos sustituidos en posición α, tienen un efecto negativo sobre el rendimiento de separación (véase, entre otros, Pirkle y McCune, J. Chromatogr. 1988, 441, 311; Wang et al., Anal. Chem. 2000, 72, 5459-5465; Welch, J. Chromatogr. A 1994, 3-26).
Los ejemplos que siguen ilustran la invención en detalle, pero no la limitan de modo alguno.
Preparaci�n de una fase estacionaria quiral bajo la unión covalente de ácido (S)-3-(3,5-dinitro-benzamido)-3fenilpropi�nico a una matriz de gel de sílice aminopropil-funcionalizada (fase amino)
(1) Síntesis de ácido (S)-3-(3,5-dinitrobenzamido)-3-fenilpropi�nico
16 g de ácido (S)-3-amino-3-fenilpropi�nico ((S)-β-fenilalanina) se mezclan con 80 ml de lejía de sosa acuosa al 5%, y la disolución resultante se ajusta a un valor del pH de 11-12 mediante la adición de lejía de sosa acuosa al 50%. Después de la adición de 20 ml de tetrahidrofurano, la mezcla de reacción se enfría a 10 �C, se añade una disolución de 23,1 g de cloruro de dinitrobenzoilo en 60 ml de tetrahidrofurano a lo largo de un espacio de tiempo de 60 min, y la mezcla de reacción se agita durante otros 60 min. La fase orgánica se separa después por destilación, y la fase acuosa remanente se extrae dos veces con metil-terc.-butil-éter. La fase acuosa se mezcla con 200 ml de acetato de etilo y se ajusta a un valor del pH de 1-2 mediante la adición de ácido clorhídrico 4 N. Las fases se separan, y la fase orgánica se lava con 200 ml de disolución saturada de cloruro sádico. Después de separar por destilación el disolvente a 45 �C y p = 150 mbar, el residuo se recoge en 300 ml de ciclohexano. El producto se separa por filtración y se seca a 40 �C. La purificación adicional del producto tiene lugar por medio de cromatograf�a líquida de alto rendimiento preparativa en un material de fase inversa (p. ej., Kromasil RP-18, tamaño de gran 10 �m) en una mezcla de disolventes de acetonitrilo/agua/ácido trifluoroac�tico. Rendimiento: 8,0 g, pureza por HPLC 99,8% de área; análisis elemental: 53,4% de C, 3,6% de H, 12,7% de N; 1H-RMN (DMSO) δ (ppm): 2,85 (dd, 1H), 2,96 (dd, 1H), 5,48 (m, 1H), 7,26 (t, 1H), 7,35 (t, 2H), 7,44 (d, 2H), 8,96 (t, 1H), 9,07 (d, 2H), 9,58 (d, 1H), 13,30 (s, 1H, CO2H).
(2) Unión de ácido (S)-3-(3,5-dinitrobenzamido)-3-fenilpropi�nico a una fase de gel de sílice aminopropilfuncionalizada (fase amino)
En una disolución de 4 g de ácido (S)-3-(3,5-dinitrobenzamido)-3-fenilpropi�nico en 200 ml de tetrahidrofurano se suspenden 4,1 g de fase amino (YMC-Gel Amino NH12S05, tamaño de grano 5 �m) y la mezcla de reacción se combina, con agitaci�n, con 3,2 g de N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (EEDQ). Después de 8 h a temperatura ambiente, el material de la fase se separa por filtración, se lava en cada caso con 50 ml de metanol y dietil�ter y se seca. Rendimiento: 4,6 g del material de soporte deseado, análisis elemental: 10,6% de C, 1,2% de H y 2,4% de N; correspondiente a una cobertura de 0,4 mmol/g.
El llenado de una columna de 250 x 5 mm HPLC tiene lugar a 300 bar según el método de densidad equilibrada (véase Meyer, Praxis der Hochdruckfl�ssigkeitschromatographie, Wiley-VCH: Weinheim 2004).
Ejemplo de aplicación 1
Las columnas de separación preparadas conforme al Ejemplo 1 son adecuadas, bajo condiciones de HPLC, para la cromatograf�a de una pluralidad de β-amino�cidos o bien derivados de β-amino�cidos (véase la Tabla 2). La Figura 1 muestra la resolución cromatogr�fica de isómeros ópticos de diferentes derivados de β-amino�cidos utilizando columnas de separación conformes al Ejemplo 1.
Tabla 2
- Sustancia
- Fase móvil* k’1 k’2 α Rs.
- �cido 3-acetilamino-3-(4-fluorofenil)propi�nico
- A 2,30 2,65 1,15 2,21
- �cido 3-acetilamino-3-(4-clorofenil)-propi�nico
- A 2,39 3,01 1,26 3,79
- �cido 3-acetilamino-3-(p-tolil)-propi�nico
- A 2,73 3,51 1,29 4,24
- �cido 3-acetilamino-3-(4-metoxifenil)propi�nico
- A 4,71 6,41 1,36 5,52
- �cido 3-acetilamino-3-(4-nitrofenil)-propi�nico
- A 4,59 5,00 1,09 1,30
- �cido 3-acetilamino-3-fenil-propi�nico
- A 3,12 3,71 1,19 2,77
- �cido 3-terc.-butiloxicarbonilamino-3-(4fluorofenil)-propi�nico
- B 1,69 1,83 1,09 1,35
- �cido 3-terc.-butiloxicarbonilamino-3-(4metoxifenil)-propi�nico
- B 3,57 4,41 1,23 4,24
- �cido 3-terc.-butiloxicarbonilamino-3-(p-tolil)propi�nico
- B 2,07 2,46 1,19 3,19
- �cido 3-terc.-butiloxicarbonilamino-3-(4clorofenil)-propi�nico
- B 1,73 1,93 1,11 1,85
- �cido 3-terc.-butiloxicarbonilamino-3-(4nitrofenil)-propi�nico
- B 3,50 3,70 1,06 1,08
- �cido 3-terc.-butiloxicarbonilamino-3-fenilpropi�nico
- B 2,15 2,41 1,12 2,01
- �cido 3-benciloxicarbonilamino-3-(p-tolil)propi�nico
- B 6,33 6,67 1,05 1,13
- �cido 3-benciloxicarbonilamino-3-(4metoxifenil)-propi�nico
- B 11,32 12,26 1,08 1,75
Fase móvil A: Isohexano / etanol / ácido trifluoroac�tico (800 + 200 + 1, v/v/v)
Fase móvil B: Isohexano / metil-terc.-butil�ter / etanol / ácido trifluoroac�tico (800 + 150 + 50 + 1, v/v/v/v)
5
* otros parámetros: Caudal 1 ml/min, temperatura 30 �C
10 Preparación de una fase estacionaria quiral bajo unión covalente de ácido (S)-3-[(S)-3-(3,5-dinitrobenzamido)-3fenilpropanamido]-3-fenilpropi�nico (3-(3,5-dinitrobenzoil)-(S)-β-fenilalanil-(S)-β-fenilalanina) a una matriz de gel de sílice aminopropil-funcionalizada (fase amino)
(1) Síntesis de ácido (S)-3-[(S)-3-(3,5-dinitrobenzoil)-3-fenilpropanamido]-3-fenilpropi�nico (3-(3,515 dinitrobenzoil)-(S)-β-fenilalanil-(S)-β-fenilalanina)
a. Síntesis de éster etílico del ácido (S)-3-(3,5-dinitrobenzamido)-3-fenilpropi�nico
11,49 g de hidrocloruro de éster etílico del ácido (S)-3-amino-3-fenilpropi�nico se suspenden en 100 ml de
20 tetrahidrofurano y se enfrían a 0-10 �C en un baño de hielo. Después de la adición de 14 ml de trietilamina, se añade una disolución de 11,52 g de cloruro de 3,5-dinitrobenzoilo en 40 ml de tetrahidrofurano con agitaci�n y enfriamiento durante un espacio de tiempo de 30 min. El baño de enfriamiento se retira, y la mezcla de reacción se agita durante otros 120 min, pudiendo calentarse hasta temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtra, y el filtrado se concentra a sequedad (fracción de producto 1). La torta de filtración - que consiste en hidrocloruro de
25 trietilamina y más producto - se recoge en 100 ml de acetato de etilo y se digiere a 35 �C durante 20 min. La suspensión se filtra, y la torta de filtración se desecha. El filtrado se concentra a sequedad bajo presión reducida a 40 �C (fracción de producto 2). Las fracciones de producto se reúnen. Rendimiento: 16,4 g; pureza por HPLC > 97% de área. Para la purificación adicional, el producto bruto se digiere en 400 ml de agua a temperatura ambiente durante 2 h y después se filtra. El rendimiento en húmedo asciende a 15,4 g; pureza por HPLC 99,8% del área. El
30 producto se hace reaccionar ulteriormente sin purificación adicional.
b. Saponificaci�n para dar ácido (S)-3-(3,5-dinitrobenzamido)-3-fenilpropi�nico
15,4 g de éster etílico del ácido (S)-3-(3,5-dinitrobenzamido)-3-fenilpropi�nico de la reacción a se disuelven en 100
35 ml de tetrahidrofurano, y la disolución resultante se mezcla con 50 ml de agua. Con intensa agitaci�n, la mezcla de reacción ligeramente turbia se calienta a 45 �C, y el valor del pH se ajusta a 13 hasta 13,5 con lejía de sosa acuosa al 32% y se mantiene constante durante el curso de la reacción. Después de haberse finalizado la reacción (control por HPLC, conversión > 99% de área), el valor del pH de la disolución se ajusta a 7-8 mediante la adición de ácido clorhídrico 6 N y, a continuación, el disolvente orgánico se separa por destilación a presión reducida. La disolución acuosa se diluye a 350 ml con agua y, con intensa agitaci�n, el valor del pH se ajusta a 1-2 con ácido clorhídrico 6
N. El producto precipitado se separa por filtración con succión y se lava dos veces con agua. Después de secar a 40 �C bajo presión reducida, se determina un rendimiento de 13,67 g. La pureza por HPLC asciende a 99,8% del área.
c. Síntesis de éster (2,5-dioxopirrolidin-1-�lico) del ácido (S)-3-(3,5-dinitrobenzamido)-3-fenilpropi�nico (éster 3-(3,5-dinitrobenzoil)-(S)-β-fenilalanina(2,5-dioxopirrolidin-1-�lico)
12 g de ácido (S)-3-(3,5-dinitrobenzamido)-3-fenilpropi�nico de la reacción b) se disuelven en 120 ml de tetrahidrofurano y se mezclan con 3,92 g de N-hidroxisuccinimida. Bajo enfriamiento en un baño de hielo a 0-5 �C se añaden en porciones 7,1 g de diciclohexilcarbodiimida a la mezcla de reacción. Al completarse la adición, la tanda se deja reposar en el baño de hielo con agitaci�n adicional hasta que la disolución alcance la temperatura ambiente. Después de haberse terminado la reacción (control por HPLC conversión > 95% de área), la diciclohexilurea precipitada se separa por filtración y se lava con tetrahidrofurano. El filtrado se concentra a presión reducida, y el residuo se digiere a reflujo en 250 ml de 2-propanol durante 2 h. El producto se separa por filtración con succión, se lava con 2-propanol y se seca a 50 �C bajo presión reducida. El rendimiento asciende a 13,87 g; pureza por HPLC 98,8% del área.
d. Reacción para dar ácido (S)-3-[(S)-3-(3,5-dinitrobenzamido)-3-fenilpropanamido]-3-fenilpropi�nico (3(3,5-dinitrobenzoil)-(S)-β-fenilalanil-(S)-β-fenilalanina)
5,65 g de ácido (S)-3-amino-3-fenilpropi�nico se suspenden en 70 ml de agua, el valor del pH de la suspensión se ajusta a 10,5 hasta 11 mediante la adición de lejía de sosa, y se añaden 70 ml de tetrahidrofurano. La tanda se enfría a 0-5 �C en un baño de hielo y, con agitaci�n, se añaden en porciones 13 g de éster (2,5-dioxopirrolidin-1-�lico) del ácido (S)-3-(3,5-dinitrobenzamido)-3-fenilpropi�nico a lo largo de un espacio de tiempo de 15 min. Después de haberse completado la adición, el valor del pH de la mezcla de reacción se mantiene en 9-9,5 mediante la adición de lejía de sosa. Después de alcanzar un valor del pH constante hasta prácticamente la conversión completa (control por HPLC; <0,5% de área de precursor), la disolución se diluye con agua hasta un volumen de aproximadamente 800 ml, se ajusta un valor del pH de 1,5-2 mediante la adición de ácido clorhídrico 4 N y se agita durante otros 30 min. El sólido se separa por filtración con succión, se lava con agua y se seca a 50 �C bajo presión reducida. El sólido secado se digiere en 250 ml de tetrahidrofurano a 40 �C durante 20 min, la suspensión se enfría y el sólido (fracción de producto 1) se filtra con succión. Las aguas madres se concentran en baño de agua a una temperatura de 40 �C a un volumen de aproximadamente 70-80 ml, la suspensión resultante se enfría a temperatura ambiente, y el sólido (fracción de producto 2) se separa por filtración con succión. Las fracciones de producto se reúnen y se secaron a 50 �C bajo presión reducida. El rendimiento asciende a 11,1 g; Pureza por HPLC > 99,5% de área; 1H-RMN (DMSO) δ (ppm): 2,64 (d, 2H), 2,77 (m, 2H), 5,15 (m, 1H), 5,52 (m, 1H), 7,10-7,20 (m, 5H), 7,25 (t, 1H), 7,31 (t, 2H), 7,39 (d, 2H), 8,44 (d, 1H), 8,95 (m, 1H), 9,01 (m, 2H), 9,53 (d, 1H), 12,17 (s, 1H, CO2H).
(2) Unión del ácido (S)-3-[(S)-3-(3,5-dinitrobenzamido)-3-fenilpropanamido]-3-fenilpropi�nico a una fase de gel de sílice aminopropil-funcionalizada (fase amino)
En una disolución de 4,7 g de ácido (S)-3-[(S)-3-(3,5-dinitrobenzamido)-3-fenilpropanamido]-3-fenilpropi�nico en 1 I de tetrahidrofurano se suspenden 5 g de fase amino (YMC-Gel Amino NH12S05, tamaño de grano 5 �m), y la suspensión se mezcla, con agitaci�n, con 4 g de N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina (EEDQ). Después de 24 h a temperatura ambiente, el material de la fase se separa por filtración, se lava en cada caso con 100 ml de metanol y dietil�ter, y a continuación se seca. Análisis elemental: 12,44% de C, 1,36% de H y 2,76% de N; correspondiente a una cobertura de 0,312 mmol/g.
El llenado de una columna de 250 x 5 mm HPLC tiene lugar a 300 bar según el método de la densidad equilibrada (véase Meyer, Praxis der Hochdruckfl�ssigkeitschromatographie, Wiley-VCH Weinheim 2004).
Ejemplo de aplicación 2
Tambi�n las columnas de separación preparadas conforme al Ejemplo 2 son adecuadas bajo condiciones de HPLC para una pluralidad de β-amino�cidos o bien derivados de β-amino�cidos – en parte, con selectividad mejorada frente al mon�mero. Esto se atribuye a un reconocimiento quiral más intenso de los diferentes analitos por parte del selector dipept�dico.
En la Tabla 3 se recopilan los resultados. La Figura 2 muestra la resolución cromatogr�fica de isómeros ópticos de diferentes derivados de β-amino�cidos utilizando las columnas de separación conformes al Ejemplo 2.
Tabla 3
- Sustancia
- Fase móvil* k’1 k’2 α Rs.
- �cido 3-terc.-butiloxicarbonilamino-3-(4fluorofenil)-propi�nico
- A 2,26 2,51 1,11 1,21
- �cido 3-terc.-butiloxicarbonilamino-3-(4metoxifenil)-propi�nico
- A 4,52 5,85 1,29 2,64
- �cido 3-terc.-butiloxicarbonilamino-3-(p-tolil)propi�nico
- A 2,46 3,02 1,23 2,35
- �cido 3-terc.-butiloxicarbonilamino-3-(4clorofenil)-propi�nico
- A 2,33 2,72 1,17 1,74
- �cido 3-terc.-butiloxicarbonilamino-3-(4nitrofenil)-propi�nico
- A 5,39 5,97 1,11 1,03
- �cido 3-benciloxicarbonilamino-3-(p-tolil)propi�nico
- B 1,50 1,70 1,14 2,04
- �cido 3-benciloxicarbonilamino-3-(4metoxifenil)-propi�nico
- B 1,52 1,77 1,17 2,50
- �cido 3-benciloxicarbonilamino-3-(4fluorofenil)-propi�nico
- B 1,61 1,76 1,11 1,68
- �cido 3-benciloxicarbonilamino-3-(4clorofenil)-propi�nico
- B 2,17 2,51 1,16 2,74
- �cido 3-benciloxicarbonilamino-3-fenilpropi�nico
- B 1,21 1,33 1,10 1,33
- �cido 3-acetilamino-3-(4-fluorofenil)propi�nico
- C 2,02 2,22 1,10 1,24
- �cido 3-acetilamino-3-(4-clorofenil)-propi�nico
- C 2,08 2,40 1,15 1,82
- �cido 3-acetilamino-3-(p-tolil)-propi�nico
- C 2,22 2,63 1,19 2,40
- �cido 3-acetilamino-3-(4-metoxifenil)propi�nico
- C 3,76 4,58 1,22 2,85
- �cido 3-acetilamino-3-fenil-propi�nico
- C 2,31 2,62 1,13 1,66
Fase móvil A: Isohexano / 2-propanol / ácido trifluoroac�tico (900 + 100 + 1, v/v/v)
Fase móvil B: Acetonitrilo / agua / ácido acético (700 + 300 + 1, v/v/v)
Fase móvil C: Isohexano / etanol / ácido trifluoroac�tico (750 + 250 + 1, v/v/v)
10 * otros parámetros: Caudal 1 ml/min, temperatura 30 �C
Preparaci�n de una fase estacionaria quiral con una cobertura dinámica de un material de soporte de RP con ácido 15 (3S)-3-(2-(R,S)-hidroxidodecilamino)-3-fenilpropi�nico
(1) Síntesis de ácido (3S)-3-(2-(R,S)-hidroxidodecilamino)-3-fenilpropi�nico
27,01 g de metilato de sodio y 82,6 g de ácido (S)-3-amino-3-fenilpropi�nico se disuelven en 800 ml de
20 metanol. Después de la adición de 92 g de 1,2-epoxidodecano, la disolución se agita a temperatura ambiente durante 20 h. A continuación, el valor del pH de la disolución se ajusta a pH 6 con ácido clorhídrico metan�lico y se separa por filtración el cloruro de sodio que cristaliza. Después de la separación por destilación del metanol, queda un residuo oleoso, que cristaliza al mezclar con agitaci�n con 700 ml de acetona. Resultan 153,4 g de cristales incoloros. 1H-RMN (DMSO) δ (ppm): 0,85 (t, 3H), 1,13-1,31 (m, 18H), 2,28/2,60/2,70/2,86 (m, 2H), 3,02 (m, 1H),
25 3,34 (m , 1H), 3,66-3,78 (m, 1H), 4,57 (m, 1H), 5,20/5,29 (s, ancho, 1H, OH), 7,42 (m, 3H), 7,60 (m, 2H ), 9,40 (s, ancho, 2H, NH2+), 12,56 (s, 1H, CO2H)
(2) Cobertura dinámica de un material de soporte RP18
30 1 g de ácido (3S)-3-(2-(R,S)-hidroxidodecilamino)-3-fenilpropi�nico se disuelve en 50 ml de metanol (disolución del selector), y la fase estacionaria a cubrir (Kromasil C18, longitud de la columna 250 mm, diámetro interno de la columna 4,6 mm) se enjuaga con metanol. A continuación, la disolución de selector se bombea a través de la columna de forma reciclante con un caudal de 1 mL/min durante 3 h. Después de una etapa de aclarado metan�lica a un caudal de 4 mL/min, se bombea a través de la columna una disolución metan�lica saturada de acetato de cobre(II) a temperatura ambiente y un caudal de 1 mL/min durante aproximadamente 30 min. Después de esto, la columna de separación est� preparada para su empleo en cromatograf�a.
5 Ejemplo de aplicación 3
Las columnas de separación modificadas conforme al Ejemplo 3 son adecuadas, en el modo de intercambio de ligandos, para la separación de enanti�meros para una pluralidad de β-amino�cidos y sus derivados, pero también de α-amino�cidos y α-hidroxi�cidos.
10 En la Tabla 4 se recopilan los resultados. La Figura 3 muestra la resolución cromatogr�fica de isómeros ópticos de diferentes β-amino�cidos utilizando las columnas de separación conformes al Ejemplo 3.
Tabla 4 15
- Sustancia
- k’1 k’2 α Rs.
- �cido 3-amino-3-(4-clorofenil)-propi�nico
- 15,43 25,10 1,63 5,44
- �cido 3-amino-3-(3-metoxifenil)-propi�nico
- 6,72 10,95 1,63 5,13
- �cido 3-amino-(4-cianofenil)-propi�nico
- 3,04 6,13 2,02 6,03
- �cido 3-amino-3-tiofen-2-il-propi�nico
- 2,37 4,10 1,73 3,38
- �cido 3-amino-3-(2-clorofenil)-propi�nico
- 10,88 36,3 3,34 10,6
- �cido 3-amino-3-(3-clorofenil)-propi�nico
- 15,41 24,50 1,59 4,94
- �cido 2-hidroxi-2-fenilac�tico
- 10,81 13,81 1,28 1,26
- �cido 2-amino-3-fenilpropi�nico
- 14,61 26,92 1,84 2,75
- �cido 3-amino-3-fenil-propi�nico
- 3,16 5,44 1,72 5,08
- �cido 3-amino-3-(4-fluorofenil)-propi�nico
- 4,14 6,54 1,58 5,57
- �cido 3-amino-3-(3-fluorofenil)-propi�nico
- 4,87 7,41 1,52 4,10
Fase móvil: Disolución de acetato de cobre(II) 0,1 mM / metanol (900 + 100, v/v), caudal 1 ml(min, temperatura: 30 �C.
Claims (23)
- REIVINDICACIONES1. Uso de derivados de β-amino�cidos no sustituidos en posición α de la estructura5 en calidad de selectores quirales en procedimientos para la separación de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas del grupo que contiene β-amino�cidos y sus derivados, α-amino�cidos y α-hidroxi�cidos, caracterizado por que n significa 1-5, preferiblemente n significa 1 o n significa 2,10 R1 significa alquilo (C1-C4), arilo (C6-C10), aralquilo (C7-C13), heteroalquilo (C7-C10), piridilo, hidroximetilo, CH(OH)CH3, CH2CONH2, CH2COOH, (CH2)2CONH2, (CH2)2COOH, (CH2)4NH2, (CH2)2SCH3 o (CH2)3NHC(NH)NH2, en donde X es OH o representa un enlazador de aminopropilo, a través del cual el selector est� unido, en forma de amida de ácido carbox�lico, al material de soporte, y R2 significa 3,5-dinitrobenzoilo o naftilo, cuando X representa un enlazador para la unión covalente a un material15 de soporte,o R2 significa CH2CHR3R4, en donde R3 significa H u OH y R4 significa alquilo (C1-C20), arilo (C6 -C10) o aralquilo (C7-C13), cuando X representa OH.
- 2. Uso de derivados de β-amino�cidos según la reivindicación 1, caracterizado por que el selector quiral est�20 presente predominantemente en una configuración absoluta con respecto al átomo de carbono C-3 (átomo de carbono β).
- 3. Uso de derivados de β-amino�cidos según la reivindicación 1 � 2, caracterizado por que R1 significa fenilo.25 4. Uso de derivados de β-amino�cidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que R4 significa alquilo (C8-C18), preferiblemente alquilo (C6-C16), en particular alquilo (C10-C12), y de manera particularmente preferida R4 significa n-decilo.
- 5. Uso de derivados de β-amino�cidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que R4 30 significa fenilo y n significa 1.
- 6. Uso de derivados de β-amino�cidos de la estructuraen donde n = 1-5, preferiblemente n = 1 o n = 2,35 R1 = alquilo (C1-C4), arilo (C6-C10), aralquilo (C7-C13), heteroalquilo (C7-C10), piridilo, hidroximetilo, CH(OH)CH3, CH2CONH2, CH2COOH, (CH2)2CONH2, (CH2)2COOH, (CH2)4NH2, (CH2)2SCH3 o (CH2)3NHC(NH)NH2, en donde, además, X es OH o representa un enlazador de aminopropilo, a través del cual el selector est� unido, en forma de amida de ácido carbox�lico, al material de soporte, y R2 significa 3,5-dinitrobenzoilo o naftilo, cuando X representa un enlazador para la unión covalente a un material40 de soporte,o R2 significa CH2CHR3R4, en donde R3 significa H u OH y R4 significa alquilo (C1-C20), arilo (C6 -C10) o aralquilo (C7-C13), cuando X representa OH, para la preparación de fases estacionarias para procedimientos de separación cromatogr�ficos de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de45 enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas del grupo que contiene β-amino�cidos y sus derivados, α-amino�cidos y α-hidroxi�cidos, caracterizado por que el selector quiral se une de forma covalenteo por adsorción a un material de soporte basado en gel de sílice o en un monolito.
- 7. Una fase estacionaria quiral para la separación cromatogr�fica de mezclas de sustancias, preferiblemente de 50 mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas del grupo que contiene β-amino�cidos y sus derivados, α-amino�cidos y α-hidroxi�cidos, que contiene un material de soporte y un selector quiral, caracterizada por que el selector quiral5 en donde n significa 1-5, preferiblemente n significa 1 o n significa 2, R1 significa alquilo (C1-C4), arilo (C6-C10), aralquilo (C7-C13), heteroaralquilo (C7-C10), piridilo, hidroximetilo, CH(OH)CH3, CH2CONH2, CH2COOH, (CH2)2CONH2, (CH2)2COOH, (CH2)4NH2, (CH2)2SCH3 o (CH2)3NHC(NH)NH2, R2 significa 3,5-dinitrobenzoilo o naftilo, y X representa un enlazador de aminopropilo, a través del cual el selector est� unido, en forma de amida de ácido carbox�lico, al material de soporte.
- 8. Una fase estacionaria quiral según la reivindicación 7, caracterizada por que el selector quiral est� presente predominantemente en una configuración absoluta con respecto al átomo de carbono C-3 (átomo de carbono β).
- 9. Una fase estacionaria quiral según la reivindicación 7 u 8, caracterizada por que R1 representa fenilo. 15
-
- 10.
- Una fase estacionaria quiral según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizada por que el material de soporte es una fase de gel de sílice o de monolito.
-
- 11.
- Procedimiento para la preparación de una fase estacionaria quiral según una cualquiera de las reivindicaciones
20 7 a 10, que comprende las siguientes etapas: (ia) acilaci�n (R2 = 3,5-dinitrobenzoilo) de un β-amino�cido no sustituido en posición α o del correspondiente éster de β-amino�cido con un derivado de 3,5-dinitrobenzoilo adecuado para la acilaci�n, preferiblemente cloruro de 3,5dinitrobenzoilo, o (ib) síntesis de un β-amino�cido N-naftilado no sustituido en posición α o del correspondiente éster de β-amino�cido25 (R2 = naftilo),(ii) eventualmente, saponificaci�n de la función éster,(iii) eventualmente, acoplamiento de otras unidades de β-amino�cido no sustituido en posición α,(iv) unión covalente del selector quiral a un material de soporte, mediante un enlazador de aminopropilo, a travésdel cual el selector est� unido, en forma de amida de ácido carbox�lico, al material de soporte. 30 - 12. Procedimiento para la separación cromatogr�fica de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas entre el grupo que contiene β-amino�cidos y sus derivados, α-amino�cidos y αhidroxi�cidos, que comprende las siguientes etapas:35 (i) puesta en contacto de una disolución de la mezcla de sustancias a separar con una fase estacionaria quiral según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10,(ii) la separación de los componentes individuales de la mezcla de sustancias en virtud de su diferente interacción con la fase estacionaria utilizando una fase móvil,(iii) eventualmente, la recogida fraccionada de la fase móvil y el aislamiento de la sustancia cromatogr�ficamente 40 purificada de la misma.
- 13. Procedimiento según la reivindicación 12 para la determinación de trazas secundarias de enanti�meros, preferiblemente de enanti�meros de α-y β-amino�cidos.45 14. Procedimiento según la reivindicación 12 � 13, caracterizado por que se trata de procedimientos de cromatograf�a líquida, preferiblemente procedimientos HPLC.
- 15. Una fase estacionaria quiral para la separación cromatogr�fica de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de enanti�meros, en particular de50 enanti�meros de sustancias seleccionadas entre el grupo que contiene β-amino�cidos y sus derivados, αamino�cidos y α-hidroxi�cidos, que contienen un material de soporte y un selector quiral, caracterizada por que elen donde R1 significa alquilo (C1-C4), arilo (C6-C10), aralquilo (C7-C13), heteroaralquilo (C7-C10), piridilo, hidroximetilo, CH(OH)CH3, CH2CONH2, CH2COOH, (CH2)2CONH2, (CH2)2COOH, (CH2)4-NH2, (CH2)2-SCH3 o (CH2)3NHCNHNH2 y R3 significa H u OH y R4 significa alquilo (C1-C20), arilo (C6 -C10) o aralquilo (C7-C13).
-
- 16.
- Una fase estacionaria quiral según la reivindicación 15, caracterizada por que el selector quiral est� presente predominantemente en una configuración absoluta con respecto al átomo de carbono C3 (átomo de carbono β), mientras que el estereocentro potencialmente presente en posición 2’ no debe estar presente predominantemente en una configuración absoluta.
-
- 17.
- Una fase estacionaria quiral según la reivindicación 15 � 16, caracterizada por que R1 significa fenilo.
-
- 18.
- Una fase estacionaria quiral según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado por que R4 significa alquilo (C4-C18), preferiblemente alquilo (C6-C16), en particular alquilo (C10-C12), y de manera particularmente preferida R4 significa n-decilo.
-
- 19.
- Una fase estacionaria quiral según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado por que R4 significa fenilo.
-
- 20.
- Una fase estacionaria quiral según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizada por que el selector quiral est� unido por adsorción a un material de soporte basado en gel de sílice o en un monolito.
-
- 21.
- Una fase estacionaria quiral según la reivindicación 20, caracterizada por que el material de soporte es un material de fase inversa.
-
- 22.
- Una fase estacionaria quiral según la reivindicación 21, caracterizada por que el material de soporte se selecciona del grupo que comprende las fases RP-2, RP-4, RP-5, RP-6, RP-8, RP-12 y, en particular, RP-18.
-
- 23.
- Procedimiento para la preparación de una fase estacionaria quiral según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, que comprende las siguientes etapas:
- (i)
- preparación del amino�cido N-alquilado,
- (ii)
- unión por adsorción del amino�cido N-alquilado a un material de soporte.
- 24. Procedimiento para la separación cromatogr�fica de mezclas de sustancias, preferiblemente de mezclas de sustancias quirales, de manera particularmente preferida de enanti�meros, en particular de enanti�meros de sustancias seleccionadas entre el grupo que contiene β-amino�cidos y sus derivados, α-amino�cidos y αhidroxi�cidos, que comprende las siguientes etapas:
- (i)
- puesta en contacto de una disolución de la mezcla de sustancias a separar con una fase estacionaria quiral que contiene un selector quiral según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22,
- (ii)
- separaci�n de los componentes individuales de la mezcla de sustancias en virtud de su diferente interacción con el selector quiral utilizando una fase móvil que contiene iones de metales de transición divalentes, preferiblemente iones cobre(II),
(iii) eventualmente la recogida fraccionada de la fase móvil y el aislamiento de las sustancias cromatogr�ficamente purificadas de la misma. - 25. Procedimiento según la reivindicación 24, para la determinación de trazas secundarias de enanti�meros, preferiblemente de enanti�meros de α-y β-amino�cidos.
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