ES2527645T3

ES2527645T3 - Variantes de alfa-amilasa de Geobacillus stearothermophilus (AMYS) con propiedades mejoradas

Info

Publication number: ES2527645T3
Application number: ES11187405.3T
Authority: ES
Inventors: William A. Cuevas; David A. Estell; Sura Hussain Hadi; Sang-Kyu Lee; Sandra W. Ramer; Andrew Shaw; Amr R. Toppozada; Walter Weyler
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2008-06-06
Filing date: 2009-06-02
Publication date: 2015-01-27
Anticipated expiration: 2029-06-02
Also published as: US20120156733A1; CN105483099A; US8084240B2; BRPI0913402A2; EP2623591A3; EP2447361A2; US20090314286A1; EP2623591B1; JP2011522536A; EP2447361A3; WO2009149130A2; BRPI0913402B1; CN102057040A; EP2623591A2; PL2447361T3; CN105483099B; CA2726265A1; JP5492879B2; AU2009256280B2; EP2447361B1

Abstract

Una variante de polipéptido que tiene actividad de α-amilasa en la que la variante de polipéptido tiene al menos una característica alterada que mejora el rendimiento de la enzima, comprendiendo la variante de polipéptido: una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un polipéptido de α-amilasa parental seleccionado de entre AmyS que tienen la secuencia de SEQ ID Nº: 1 o una variante truncada de AmyS que tiene la secuencia de SEQ ID Nº 2, y que tiene al menos la siguiente mutación en un residuo de aminoácido correspondiente al del polipéptido de α-amilasa parental como se determina alineando las variantes de polipéptidos con el polipéptido parental, donde la mutación cambia el residuo de aminoácido a partir del de los polipéptidos parentales, y donde la mutación es una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 188P y 188D.

Description

Variantes de alfa-amilasa de Geobacillus stearothermophilus (AMYS) con propiedades mejoradas

CAMPO TÉCNICO

[0001] Se describen variantes de una α-amilasa original que muestra una alteración en al menos una de las siguientes propiedades en relación con dicha α-amilasa original: actividad específica, especificidad de sustrato, 5 unión de sustrato, escisión de sustrato, estabilidad térmica, actividad dependiente de pH, estabilidad dependiente de pH, estabilidad a la oxidación, dependencia de Ca2+, pI y rendimiento de lavado. Las variantes son adecuadas para la conversión de almidón, la producción de etanol, el lavado de ropa, el lavado de vajillas, la limpieza de superficies duras, el desaprestado de textiles y/o la producción de edulcorante.

ANTECEDENTES 10

[0002] Las alfa (α)-amilasas (α-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, E.C. 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligo y polisacáridos 1,4-glucosídicos lineales y ramificados. Las α-amilasas se pueden utilizar comercialmente en las etapas iniciales del procesamiento de almidón (licuefacción); en la molienda de maíz húmedo; en la producción de alcohol; como agentes de limpieza en matrices detergentes; en la industria textil para el desaprestado del almidón; en aplicaciones de horneo; en la industria de 15 las bebidas; en campos petrolíferos en los procesos de perforación; en el destintado de papel reciclado y en piensos para animales.

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[0003] WO02/092797 describe variantes (mutantes) de alfa-amilasas originales tipo Termamyl, cuya variante tiene actividad de alfa-amilasa y presenta propiedades alteradas en relación con el alfa-amilasa original.

[0004] Aunque se han utilizado α-amilasas actualmente disponibles con cierto éxito en estas aplicaciones, siguen 20 siendo necesarias α-amilasas con actividad específica aumentada, especificidad de sustrato adaptada, estabilidad térmica, de pH y a la oxidación mejorada, y dependencia de Ca2+ reducida.

[0005] En un aspecto, se describen las nuevas variantes (mutantes) α-amilolíticas de una α-amilasa SPEZYME® Xtra o de una α-amilasa tipo AmyS, en concreto, las variantes que presentan propiedades alteradas que son 25 ventajosas con respecto al procesamiento industrial del almidón (licuefacción, sacarificación y limpieza del almidón y similares).

[0006] Dichas alteraciones en las propiedades se pueden conseguir introduciendo mutaciones en una α-amilasa parental que afectan, por ejemplo, a la actividad específica, a la especificidad de sustrato, a la unión de sustrato, al modelo de escisión de sustrato, a la estabilidad térmica, al perfil de actividad/pH, al perfil de estabilidad/pH, a 30 la estabilidad hacia la oxidación, a la dependencia de Ca2+ y a otras propiedades de interés. Por ejemplo, la alteración puede dar como resultado una variante que, en comparación con la α-amilasa original tipo Spezyme Xtra, tiene una dependencia de Ca2+ reducida y/o un perfil de actividad/pH y/o termoestabilidad alterados.

[0007] En algunos aspectos, las variantes se basan en la α-amilasa de Geobacillus stearothermophilus original, o tienen un grado específico de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a esta α-amilasa, por 35 ejemplo: 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o incluso 99 %. En otros aspectos, las variantes se basan en la α-amilasa original relacionada, por ejemplo, las que tienen al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o incluso 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a la α-amilasa de Geobacillus stearothermophilus. 40

[0008] En algunos aspectos, se proporciona una variante de polipéptido que tiene actividad de α-amilasa y al menos una característica alterada que mejora el rendimiento de la enzima, comprendiendo la variante de polipéptido una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un polipéptido de α-amilasa parental seleccionado de entre AmyS (SEQ ID Nº 1) o una variante truncada de AmyS (SEQ ID Nº 2), y que tiene al menos una de las siguientes mutaciones en un residuo de 45 aminoácidos correspondiente al del polipéptido de α-amilasa parental como se determina alineando las variantes de polipéptidos con el polipéptido parental, donde la mutación cambia el residuo de aminoácidos a partir del de los polipéptidos parentales:

a) una sustitución que introduce un residuo de aminoácidos cargado positivamente en una o varias posiciones seleccionado del grupo consistente en D19, N28, E29, Q86, Q89, Q97, N224, N271, N281, 50 D306, D318, Q319, Q358, D393, Q443, y D458;

b) una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 74A, 115L, 124K, 124R, 132A, 132C, 135A, 145A, 146A, 148A, 148N, 159A, 159C, 159D, 159E, 159F, 159G, 159H, 159K, 159L, 159N, 159R, 159S, 159T, 159V, 169A, 169L, 169M, 169Y, 179A, 181A, 181C, 181D, 181E, 181L, 181P, 181Q, 181V, 181Y, 242A, 242D, 242E, 242Q, 261L, 271A, 55

271V, 278A, 278H, 278K, 278N, 278R, 281A, 281L, 281M, 302D, 302M, 304D, 304E, 304M, 321A, 321H, 321Q, 321R, 333Q, 378D, 378N, 378R, 382D, 398A, 418A, 418M, 418N, 420A, 421R, 432A, 432D, 432L, 432M, 432N, 432Q, 432R, 432Y, 437D, 437G, 437H, 437L, 437M, 437Y, 446A, 446Y, 454A, 464Q, 464Y, 474A, 474E, 474K, 474L, 474M, 474N, 474P, 474Q, 474R, 474S, y 474V;

c) una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo 5 consistente en 61, 6N, 6Q, 6T, 6V, 14T, 16F, 25A, 25C, 25G, 25Q, 27M, 36Q, 36S, 39G, 39V, 50I, 50L, 50M, 50N, 50Q, 52S, 53T, 67N, 67S, 80D, 80I, 90E, 133P, 133V, 137M, 137S, 141E, 141I, 141L, 141M, 141Q, 141R, 141S, 141V, 150E, 151I, 152G, 155S, 155Y, 168W, 173T, 188P, 193F, 193K, 193L, 193Y, 213L, 213M, 213V, 217Q, 220P, 220Q, 220R, 220S, 220V, 221I, 221S, 249E, 250F, 250I, 250M, 252L, 253Y, 254E, 254F, 254T, 254V, 255F, 255K, 255W, 257L, 257M, 257S, 257V, 258D, 258G, 258H, 258K, 10 258Q, 258T, 258V, 268F, 274W, 283M, 283N, 283V, 285E, 285Q, 293G, 293K, 294W, 301F, 301I, 301P, 301R, 301T, 301W, 309D, 309V, 312H, 312S, 312V, 312Y, 313G, 313H, 313I, 313L, 313S, 313V, 318T, 338A, 338C, 338G, 338M, 338T, 339K, 339T, 339V, 340A, 340M, 340Q, 340T, 343C, 343I, 343P, 343R, 343Y, 345I, 345Q, 369I, 369T, 370G, 375T, 385T, 386K, 394L, 394V, 400A, 400N, 400V, 402H, 402I, 402T, 402V, 402W, 403A, 403E, 403G, 403Q, 403R, 403T, 403V, 404C, 404E, 404G, 404I, 404V, 15 419A, 419C, 419M, 419T, 422E, 422G, 433A, 433H, 433I, 433K, 433L, 433M, 433V, 433Y, 442A, 442G, 442N, 442R, 442S, 442T, 442V, 442W, 442Y, 445G, 4451, 445N, 445T, 445V, 445W, 447I, 447N, 447Q, 447W, 447Y, 448C, 448F, 448G, 448H, 448I, 448N, 448Y, 450C, 450H, 450M, 450N, 450R, 450S, 450T, 450W, 455G, 455I, 455P, 455V, 463A, 463M, 463S, 463T, 463V, 463W, 465G, 465I, 465K, 465N, 465T, 465V, 469D, 469W, 469Y, 471I, 471V, 473G, 473Y, 476A, 476G, 476L, 476M, 476N, y 476T 20

d) una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 124N, 125A, 125K, 125N, 130A, 130S, 159A, 159D, 159E, 159G, 159H, 159K, 159L, 159N, 159R, 159S, 159T, 166F, 166G, 166H, 166S, 166Y, 169L, 179A, 179P, 180A, 180D, 180H, 180K, 180L, 180N, 180T, 180V, 180Y, 181A, 181D, 181E, 181G, 181P, 181R, 181S, 181V, 187A, 187C, 187K, 187N, 187P, 187Q, 187R, 187S, 242H, 242N, 278H, 278K, 278N, 278R, 281M, 302D, 304M, 304Y, 25 321H, 321Q, 321R, 333Q, 432Q, 437Y, 446A, 474Q, y 474S,

e) una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 6A, 6D, 6E, 6H, 61, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 6Y, 13K, 14F, 14T, 14Y, 15A, 15D, 15E, 015G, 15H, 15K, 15N, 15P, 15Q, 15R, 15S, 15T, 15W, 16A, 16E, 16G, 16H, 16K, 16N, 16P, 16Q, 16R, 16T, 25C, 39D, 39E, 39N, 39Q, 81Y, 121P, 139D, 139H, 139R, 139Y, 177A, 188D, 30 191H, 191K, 192A, 192D, 192G, 192N, 192P, 192Q, 192S, 192T, 192V, 192Y, 196A, 196C, 196D, 196E, 196F, 196H, 196I, 196K, 196P, 196R, 196S, 196T, 196V, 201A, 201E, 201G, 201H, 201M, 202H, 216E, 216G, 216H, 216M, 216Q, 216R, 216S, 216T, 216Y, 221A, 221D, 221F, 221I, 221L, 221M, 221N, 221R, 221S, 221V, 221Y, 237G, 240G, 240N, 240P, 240Q, 240R, 240T, 246R, 250A, 250D, 250E, 250F, 250G, 250I, 250K, 250L, 250M, 250N, 250Q, 250R, 250S, 250W, 252K, 268A, 268D, 268E, 268G, 268H, 35 268K, 268N, 268P, 268Q, 268R, 268S, 274A, 274D, 274G, 274I, 274K, 274L, 274N, 274Q, 274R, 274S, 274T, 275K, 285Q, 285Y, 293K, 293R, 318A, 318F, 318G, 318I, 318K, 318L, 318M, 318R, 318S, 318T, 318V, 318Y, 319C, 319D, 319H, 319I, 319K, 319R, 319Y, 320K, 320R, 320T, 338A, 338G, 338I, 338M, 338P, 338S, 338V, 339G, 339P, 340A, 340D, 340E, 340H, 340K, 340N, 340Q, 345E, 363D, 363E, 363M, 363N, 363Q, 363S, 366Q, 370A, 370D, 370E, 370H, 370K, 370N, 370Q, 370S, 375A, 375D, 40 375E, 375K, 375N, 375Q, 375R, 375S, 419A, 419I, 419M, 419P, 419S, 419V, 448Y, 452N, 452Q, 452R, 452S, 471R, y 471Y; y

f) una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en I181A, I181P, I181C, I181E, I181Y, S242A, S242E, G132A, N193Y, y E188P.

[0009] En algunos aspectos, la variante incluye una mutación que introduce un residuo de aminoácidos cargado 45 positivamente en una o varias posiciones seleccionado del grupo consistente en D19, N28, E29, Q86, Q89, Q97, N224, N271, N281, D306, D318, Q319, Q358, D393, Q443, y D458, y la variante de polipéptido presenta un rendimiento de limpieza mejorado. En aspectos concretos, la limpieza mejorada está bajo condiciones de lavado de América del Norte y se determina utilizando un ensayo de micromuestra. En aspectos concretos, el residuo de aminoácido cargado positivamente es arginina. 50

[0010] En algunos aspectos, la variante incluye una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 74A, 115L, 124K, 124R, 132A, 132C, 135A, 145A, 146A, 148A, 148N, 159A, 159C, 159D, 159E, 159F, 159G, 159H, 159K, 159L, 159N, 159R, 159S, 159T, 159V, 169A, 169L, 169M, 169Y, 179A, 181A, 181C, 181D, 181E, 181L, 181P, 181Q, 181V, 181Y, 242A, 242D, 242E, 242Q, 261L, 271A, 271V, 278A, 278H, 278K, 278N, 278R, 281A, 281L, 281M, 302D, 302M, 304D, 304E, 304M, 321A, 55 321H, 321Q, 321R, 333Q, 378D, 378N, 378R, 382D, 398A, 418A, 418M, 418N, 420A, 421R, 432A, 432D, 432L, 432M, 432N, 432Q, 432R, 432Y, 437D, 437G, 437H, 437L, 437M, 437Y, 446A, 446Y, 454A, 464Q, 464Y, 474A, 474E, 474K, 474L, 474M, 474N, 474P, 474Q, 474R, 474S, y 474V, y la variante ha mejorado la termoestabilidad en comparación con el polipéptido parental.

[0011] En algunos aspectos, la variante incluye una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 61, 6N, 6Q, 6T, 6V, 14T, 16F, 25A, 25C, 25G, 25Q, 27M, 36Q, 36S, 39G, 39V, 501, 50L, 50M, 50N, 50Q, 52S, 53T, 67N, 67S, 80D, 80I, 90E, 133P, 133V, 137M, 137S, 141E, 141I, 141L, 141M, 141Q, 141R, 141S, 141V, 150E, 151I, 152G, 155S, 155Y, 168W, 173T, 188P, 193F, 193K, 193L, 193Y, 213L, 213M, 213V, 217Q, 220P, 220Q, 220R, 220S, 220V, 221I, 221S, 249E, 250F, 250I, 5 250M, 252L, 253Y, 254E, 254F, 254T, 254V, 255F, 255K, 255W, 257L, 257M, 257S, 257V, 258D, 258G, 258H, 258K, 258Q, 258T, 258V, 268F, 274W, 283M, 283N, 283V, 285E, 285Q, 293G, 293K, 294W, 301F, 301I, 301P, 301R, 301T, 301W, 309D, 309V, 312H, 312S, 312V, 312Y, 313G, 313H, 313I, 313L, 313S, 313V, 318T, 338A, 338C, 338G, 338M, 338T, 339K, 339T, 339V, 340A, 340M, 340Q, 340T, 343C, 343I, 343P, 343R, 343Y, 345I, 345Q, 369I, 369T, 370G, 375T, 385T, 386K, 394L, 394V, 400A, 400N, 400V, 402H, 402I, 402T, 402V, 402W, 10 403A, 403E, 403G, 403Q, 403R, 403T, 403V, 404C, 404E, 404G, 404I, 404V, 419A, 419C, 419M, 419T, 422E, 422G, 433A, 433H, 433I, 433K, 433L, 433M, 433V, 433Y, 442A, 442G, 442N, 442R, 442S, 442T, 442V, 442W, 442Y, 445G, 445I, 445N, 445T, 445V, 445W, 447I, 447N, 447Q, 447W, 447Y, 448C, 448F, 448G, 448H, 448I, 448N, 448Y, 450C, 450H, 450M, 450N, 450R, 450S, 450T, 450W, 455G, 455I, 455P, 455V, 463A, 463M, 463S, 463T, 463V, 463W, 465G, 465I, 465K, 465N, 465T, 465V, 469D, 469W, 469Y, 471I, 471V, 473G, 473Y, 476A, 15 476G, 476L, 476M, 476N, y 476T, y la variante ha mejorado la termoestabilidad en comparación con el polipéptido parental.

[0012] En algunos aspectos, la variante incluye una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 124N, 125A, 125K, 125N, 130A, 130S, 159A, 159D, 159E, 159G, 159H, 159K, 159L, 159N, 159R, 159S, 159T, 166F, 166G, 166H, 166S, 166Y, 169L, 179A, 179P, 180A, 20 180D, 180H, 180K, 180L, 180N, 180T, 180V, 180Y, 181A, 181D, 181E, 181G, 181P, 181R, 181S, 181V, 187A, 187C, 187K, 187N, 187P, 187Q, 187R, 187S, 242H, 242N, 278H, 278K, 278N, 278R, 281M, 302D, 304M, 304Y, 321H, 321Q, 321R, 333Q, 432Q, 437Y, 446A, 474Q, y 474S, y la variante presenta actividad o expresión aumentada en comparación con el polipéptido parental.

[0013] En algunos aspectos, la variante incluye una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de 25 aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 6A, 6D, 6E, 6H, 6I, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 6Y, 13K, 14F, 14T, 14Y, 15A, 15D, 15E, 015G, 15H, 15K, 15N, 15P, 15Q, 15R, 15S, 15T, 15W, 16A, 16E, 16G, 16H, 16K, 16N, 16P, 16Q, 16R, 16T, 25C, 39D, 39E, 39N, 39Q, 81Y, 121P, 139D, 139H, 139R, 139Y, 177A, 188D, 191H, 191K, 192A, 192D, 192G, 192N, 192P, 192Q, 192S, 192T, 192V, 192Y, 196A, 196C, 196D, 196E, 196F, 196H, 196I, 196K, 196P, 196R, 196S, 196T, 196V, 201A, 201E, 201G, 201H, 201M, 202H, 216E, 30 216G, 216H, 216M, 216Q, 216R, 216S, 216T, 216Y, 221A, 221D, 221F, 221I, 221L, 221M, 221N, 221R, 221S, 221V, 221Y, 237G, 240G, 240N, 240P, 240Q, 240R, 240T, 246R, 250A, 250D, 250E, 250F, 250G, 250I, 250K, 250L, 250M, 250N, 250Q, 250R, 250S, 250W, 252K, 268A, 268D, 268E, 268G, 268H, 268K, 268N, 268P, 268Q, 268R, 268S, 274A, 274D, 274G, 274I, 274K, 274L, 274N, 274Q, 274R, 274S, 274T, 275K, 285Q, 285Y, 293K, 293R, 318A, 318F, 318G, 318I, 318K, 318L, 318M, 318R, 318S, 318T, 318V, 318Y, 319C, 319D, 319H, 319I, 35 319K, 319R, 319Y, 320K, 320R, 320T, 338A, 338G, 338I, 338M, 338P, 338S, 338V, 339G, 339P, 340A, 340D, 340E, 340H, 340K, 340N, 340Q, 345E, 363D, 363E, 363M, 363N, 363Q, 363S, 366Q, 370A, 370D, 370E, 370H, 370K, 370N, 370Q, 370S, 375A, 375D, 375E, 375K, 375N, 375Q, 375R, 375S, 419A, 419I, 419M, 419P, 419S, 419V, 448Y, 452N, 452Q, 452R, 452S, 471R, y 471Y, y la variante presenta actividad o expresión aumentada en comparación con el polipéptido parental. 40

[0014] En algunos aspectos, la variante incluye una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en I181A, I181P, I181C, I181E, I181Y, S242A, S242E, G132A, N193Y, y E188P, y la variante presenta reducción aumentada de la viscosidad en un ensayo de licuefacción de almidón en comparación con el polipéptido parental.

[0015] En algunos aspectos, se describe una variante de polipéptido α-amilasa que comprende una secuencia de 45 aminoácidos derivada de un polipéptido α-amilasa parental y que tiene una combinación de tres o más mutaciones en posiciones seleccionadas del grupo consistente en 5, 6, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 25, 27, 29, 36, 39, 50, 52, 53, 54, 67, 71, 73, 75, 77, 80, 81, 83, 85, 90, 92, 107, 111, 113, 114, 120, 121, 126, 128, 131, 133, 137, 138, 139, 141, 143, 147, 149, 150, 151, 152, 155, 160, 165, 168, 172, 173, 177, 188, 191, 192, 193, 196, 200, 201, 202, 213, 216, 217, 220, 221, 227, 232, 235, 237, 238, 240, 246, 249, 250, 252, 253, 254, 255, 257, 258, 50 268, 272, 274, 275, 279, 283, 285, 293, 294, 297, 300, 301, 306, 309, 312, 313, 317, 318, 319, 320, 338, 339, 340, 343, 345, 363, 366, 369, 370, 375, 379, 381, 385, 386, 391, 392, 393, 394, 400, 402, 403, 404, 406, 407, 410, 413, 414, 416, 419, 422, 427, 433, 436, 439, 442, 445, 447, 448, 450, 452, 455, 463, 465, 469, 471, 473, y 476, donde el polipéptido tiene actividad de α-amilasa y donde cada una de las al menos tres o más mutaciones introduce un residuo de aminoácidos que difiere del presente en el polipéptido parental. En aspectos concretos, 55 el número de mutaciones es 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más.

[0016] En algunos aspectos, cuando la mutación no está ya en la posición 242, la mutación está presente en combinación con las sustituciones S242A, S242E, S242Q, S242F, S242H, o S242N. En aspectos concretos, la sustitución es S242Q. En algunos aspectos, cuando la mutación no está ya en la posición 179 o 180, la mutación está presente en combinación con una deleción en las posiciones 179 y 180. En algunos aspectos, cuando la 60 mutación no está ya en la posición 349 o 428, la mutación está presente en combinación con una sustitución de una cisteína en uno a varios de estos aminoácidos.

[0017] En algunos aspectos, cuando la mutación no está ya en una de las siguientes posiciones, la mutación está presente en combinación con una sustitución en la posición P17, D19, T21, N28, S51, G72, V74, A82, Q86, Q89, A93, G95, Q97, W115, D117, P123, S124, D125, N127, I130,G132, Q135, P145, G146, G148,S153,Y159, W166, S169, K171, W187, P209, N224, S242, G256, D269, N271, T278, N281, G302, A304, R308, T321, Q358, P378, S382, K383, T398, H405, T417, E418, P420, G421, P432, W437, G446, G454, S457, T459, T461, S464, 5 G474, o R483.

[0018] En algunos aspectos, cuando la mutación no está ya en una de las siguientes posiciones, la mutación está presente en combinación con una sustitución en la posición M8, M9, M15, M96, V128, A111, H133, W138, T149, M197, N188, M200, M206, A209, A210, M284, M307, M311, M316, H405, T412, M438, N193F, y V416G.

[0019] En algunos aspectos, el polipéptido parental tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o 10 incluso al menos 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto al polipéptido de SEQ ID Nº 1.

[0020] En algunos aspectos, el polipéptido parental tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o incluso al menos 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto al polipéptido de SEQ ID Nº 2.

[0021] En algunos aspectos, el polipéptido parental tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o incluso al menos 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un polipéptido seleccionado del 15 grupo consistente en SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 2, SEQ ID Nº 3, SEQ ID Nº 4, SEQ ID Nº 5, SEQ ID Nº 6, SEQ ID Nº 7, SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 9, SEQ ID Nº 10, SEQ ID Nº 11, SEQ ID Nº 12, SEQ ID Nº 15, y SEQ ID Nº 16. En algunos aspectos, el polipéptido parental incluye un truncamiento de los residuos de aminoácidos del extremo C-terminal. En aspectos concretos, el truncamiento es de los 29 residuos de aminoácidos del extremo C-terminal.

[0022] En algunos aspectos, la variante de polipéptido no incluye una mutación en ninguna de las posiciones 20 106 o 199, o ni en ambas.

[0023] En algunos aspectos, se puede añadir o eliminar una o varias mutaciones de una lista de mutaciones sin alejarse de la descripción. En relación con esto, cualquier mutación o mutaciones que aparezcan en el contexto de una lista de mutaciones se pueden combinar como un subconjunto de mutaciones.

[0024] En otro aspecto, se describe una composición que comprende una o varias de las variantes de α-amilasas 25 anteriormente mencionadas. En aspectos concretos, la composición es una composición de limpieza, tal como un detergente para lavar la ropa, un detergente para lavar la vajilla, una composición de limpieza de superficies duras, o similares. La composición puede incluir un detergente.

[0025] En otro aspecto, se describe un método para hidrolizar un sustrato de almidón soluble utilizando una variante de α-amilasa. En algunos aspectos, la variante incluye una sustitución que introduce uno o varios de los 30 residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en I181A, I181P, I181C, I181E, I181Y, S242A, S242E, S242Q, G132A, N193Y, y B188P.

[0026] En algunos aspectos, la variante de α-amilasa se utiliza en combinación con una enzima hidrolizante de ácido fítico, en la que la relación de actividad de α-amilasa (en unidades de α-amilasa) con respecto a la actividad de ácido fítico (en unidades de fitasa), es decir, AAU:FTU, está comprendida entre aproximadamente 35 1:15 y aproximadamente 15:1, y preferiblemente entre 1:10 y aproximadamente 10:1. En aspectos particulares, la relación de AAU:FTU está comprendida entre 1:4 y 3:1, o incluso 1:1.

[0027] En un aspecto adicional, se describe un método para la licuefacción de almidón en una suspensión, que implica un sustrato que incluye materia vegetal tal como almidón granulado procedente de un proceso de molienda ya sea en seco o en húmedo, comprendiendo el método una etapa de licuefacción principal y/o 40 secundaria, que implica añadir a la suspensión en la etapa de licuefacción primaria y/o secundaria, en cualquier orden, una combinación de al menos una enzima hidrolizante de ácido fítico y al menos una variante de α-amilasa, ya sea simultáneamente o por separado. El método puede comprender además la sacarificación del almidón licuificado para obtener azúcares fermentables; y la recuperación de los azúcares fermentables. En algunos aspectos el método comprende además fermentar los azúcares fermentables bajo condiciones de 45 fermentación adecuadas para obtener productos finales, tales como alcohol. En algunos aspectos, la composición de la enzima contiene al menos una variante de α-amilasa y una fitasa. En algunos aspectos, la composición de la enzima está en forma mezclada.

[0028] En un aspecto adicional, se describe un método para fermentar un sustrato de almidón, comprendiendo el método la adición en cualquier orden de una combinación de una variante de α-amilasa y una fitasa en una dosis 50 única o fraccionada. En otro aspecto, el sustrato de almidón tratado se fermenta en etanol.

[0029] En un aspecto adicional, se describe un proceso de conversión de almidón y/o un proceso de fermentación de etanol que no requieren la adición de ácido o álcali para ajustar el pH. Un aspecto se refiere a una etapa de licuefacción sin ajuste de pH, en la que el pH de la licuefacción está en el intervalo de pH 4.5 a 5.4 y no se añaden sustancias químicas de neutralización de ácidos en la etapa del proceso de licuefacción. En otro 55 aspecto, el pH de la licuefacción está en el intervalo de pH 4.8 a 5.8 y no se añaden sustancias químicas de neutralización de ácidos en la etapa del proceso de licuefacción.

[0030] En otro aspecto, se describe un método para obtener un sustrato fermentable, que implica poner en contacto una suspensión de grano molido que contiene almidón granulado con una enzima hidrolizante de ácido fítico a una temperatura de 0 °C -30 °C menos que la temperatura de gelatinización del almidón, poner en contacto la suspensión con una variante de α-amilasa, aumentar la temperatura por encima de la temperatura de gelatinización para que el almidón granulado permita la gelatinización del almidón, e hidrolizar el almidón 5 gelatinizado poniéndolo en contacto con la α-amilasa durante un tiempo suficiente para hidrolizar el almidón, y obtener un sustrato fermentable. La enzima hidrolizante de ácido fítico puede ser una fitasa bacteriana o fúngica. La fitasa fúngica puede ser una fitasa Aspergillus o una fitasa Buttiauxella. En algunos aspectos, la fitasa bacteriana proviene de Escherichia coli.

[0031] En otro aspecto, se describe el un proceso para producir un azúcar fermentable, que comprende (a) 10 mezclar el material que contiene almidón molido con agua y vinaza (thin stillage), donde la vinaza está en el intervalo de 10 % a 70 % volumen/volumen y obtener una suspensión que comprende almidón y tener un contenido de residuos secos (ds, del inglés dry solids) de 20 % a 50 % peso/peso, (b) tratar la suspensión con una fitasa antes de licuificar el almidón o de forma simultánea, (c) licuificar el almidón, (d) añadir una variante de α-amilasa al almidón durante la etapa (b) y/o de forma simultánea con la etapa de licuefacción, y (e) sacarificar el 15 almidón licuificado para obtener azúcares fermentables, donde el pH no se ajusta durante ninguna de las etapas (a), (b), (c), (d) o (e). En algunos aspectos, se recupera el azúcar fermentable y se purifica o se isomeriza. En otros aspectos, la fitasa se añade antes de la etapa de licuefacción. En algunos aspectos, la α-amilasa se añade con la fitasa. En aún más aspectos adicionales, se añade una segunda dosis de α-amilasa durante la etapa de licuefacción. 20

[0032] En un aspecto adicional, se describe un proceso de producción de alcohol a partir del material que contiene almidón, que comprende licuificar y sacarificar el almidón licuificado como se ha descrito anteriormente para obtener azúcares fermentables y fermentar de forma adicional los azúcares fermentables bajo condiciones de fermentación adecuadas utilizando un microorganismo de fermentación para obtener alcohol. En algunos aspectos, las etapas de sacarificación y fermentación son simultáneas. En algunos aspectos, el alcohol es 25 etanol.

[0033] En otro aspecto, se describen constructos de ADN, que incluyen vectores de expresión, que codifican variantes de α-amilasas, junto con métodos para expresar y utilizar las variantes de α-amilasas, solas o en combinación con otras enzimas α-amilolíticas, por ejemplo, en varios procesos industriales, tales como licuefacción y limpieza de almidón. 30

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0034]

La Figura 1 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de varias α-amilasas relacionadas con AmyS.

La Figura 2 muestra el plásmido pHPLT-AmyS. 35

La Figura 3 muestra el porcentaje de actividad residual de variantes de genoteca S242 después de tensión por calor a 95 °C durante 30 minutos. Faltan las posiciones de las variantes P, S, W e Y y se sustituyen por AmyS natural (SPEZYME® Xtra, designada "Z"). Las líneas indican 2× y 3× por encima de la desviación estándar del porcentaje de actividad residual de la enzima natural. S242A y S242Q muestran claramente mayores actividades residuales que la enzima natural. 40

Las Figuras de la 4A a la 4I muestran alineamientos por parejas de las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Figura 1.

La Figura 5 muestra las curvas de fusión térmicas y los puntos fusión de la enzima natural y de las variantes de amilasas sin calcio añadido.

La Figura 6 muestra las curvas de fusión térmicas y los puntos fusión de la enzima natural y de las 45 variantes de amilasas con 2 mM de calcio.

La Figura 7 muestra el perfil de actividad de SPEZYME® Xtra y dos variantes en relación con Liquozyme SC para tres puntos de tiempo.

La Figura 8 muestra el perfil de actividad de cuatro variantes en relación con la variante S242Q para tres puntos de tiempo. 50

La Figura 9 muestra la reducción de la viscosidad de la harina de maíz debido a la acción de las α-amilasas LIQUOZYME® SC o SPEZYME® Xtra en una dosis de 30 µg.

La Figura 10 muestra la reducción de la viscosidad de la harina de maíz debido a la acción de las α-amilasas LIQUOZYME® SC o SPEZYME® Xtra, o una de las dos variantes (S242A y S242Q) en una dosis de 30 µg.

La Figura 11 muestra la reducción de la viscosidad de la harina de maíz debido a la acción de las α-amilasas LIQUOZYME® SC o SPEZYME® Xtra, o una o de las dos variantes (S242A y S242Q) en una 5 dosis de 20 µg.

La Figura 12 muestra la progresión del equivalente de dextrosa (DE, por sus siglas en inglés) del maíz molido entero tratado con LIQUOZYME® SC, SPEZYME® Xtra o una o de las dos variantes (S242A y S242Q) a lo largo del tiempo (0, 30, 60, y 90 minutos).

La Figura 13 muestra la viscosidad después del jet-cooking (aplicación de vapor a presión) del maíz 10 molido entero tratado con LIQUOZYME® SC, SPEZYME® Xtra o una o de las dos variantes (S242A y S242Q) a lo largo del tiempo (0, 30, 60, y 90 minutos).

La Figura 14 muestra la progresión de DE del maíz molido entero tratado con fitasa y una amilasa (SPEZYME® Xtra o variante S242Q) a lo largo del tiempo (0, 30, 60, y 90 minutos). MAXALIQ® es una mezcla fitasa/amilasa disponible en Genencor, a Danisco Division. Hace referencia al Ejemplo 8. 15

La Figura 15 muestra la viscosidad después del jet-cooking del maíz molido entero tratado con fitasa y amilasa (SPEZYME® Xtra o variante S242Q) a lo largo del tiempo (0, 30, 60, y 90 minutos).

La Figura 16 muestra la progresión de DE del maíz molido entero tratado con la variante de S242Q y fitasa. Hace referencia al Ejemplo 9.

La Figura 17 muestra la viscosidad después del jet-cooking del maíz molido entero tratado con la 20 variante de S242Q y fitasa. Hace referencia al Ejemplo 9.

La Figura 18 muestra el efecto del tratamiento con fitasa del maíz molido entero en el aumento en la termoestabilidad y en la baja estabilidad de pH de la variante S242Q y hace referencia al Ejemplo 9.

La Figura 19 muestra el efecto de la adición de fitasa durante la licuefacción principal del maíz molido entero en la reducción de la viscosidad después del jet-cooking y hace referencia al Ejemplo 9. 25

La Figura 20 muestra una comparación del contenido de sulfato y ácido fítico en granos secos de destilería con solubles (DDGS por sus siglas en inglés): 1) a partir de un proceso convencional, y 2) a partir del proceso sin ajuste de pH. Hace referencia al Ejemplo 10.

La Figura 21 es un gráfico que muestra el índice de progresión de DE y el porcentaje de reducción de ácido fítico como IP6. 30

La Figura 22 es un gráfico que muestra el efecto de la variante de α-amilasa S242Q en la progresión de DE bajo condiciones de procesamiento convencionales. Hace referencia al Ejemplo 8.

La Figura 23 es un gráfico que representa el rendimiento de S242Q y sus variantes en el ensayo de micromuestra de almidón de arroz como una función de carga bajo las condiciones de lavado de América del Norte. Las condiciones eran TIDE® 2x a 20 °C. Hace referencia al Ejemplo 16. 35

La Figura 24 es un gráfico que representa el rendimiento de otra α-amilasa (es decir, amilasa truncada TS-23 de Bacillus sp.) con las mutaciones de carga en el ensayo de micromuestra de almidón de arroz bajo las condiciones de lavado de Europa Occidental. Las condiciones eran PERSIL® a 40 °C. Hace referencia al Ejemplo 16.

La Figura 25 es un gráfico que representa el rendimiento de S242Q y sus variantes en el ensayo de 40 almidón con BODIPY como una función de carga. Hace referencia al Ejemplo 16.

La Figura 26A es un gráfico que representa la hidrólisis de almidón con BODIPY relativa como una función de expresión en tubo de agitación relativa (es decir, hidrólisis de almidón con BODIPY relativa frente a expresión de tubo de agitación relativa). La Figura 26B es un gráfico que representa la hidrólisis de micromuestra de almidón relativa como una función de expresión en tubo de agitación relativa (es 45 decir, hidrólisis de micromuestra de almidón relativa frente a expresión en tubo de agitación relativa). Hace referencia al Ejemplo 19.

La Figura 27A es un gráfico que representa la expresión en tubo de agitación relativa como una función de carga. La Figura 27B es un gráfico que representa la hidrólisis de almidón con BODIPY relativa como una función de carga. Hace referencia al Ejemplo 19. 50

La Figura 28A es un gráfico que representa la expresión en tubo de agitación relativa como una función de carga. La Figura 28B es un gráfico que representa la actividad de limpieza de micromuestra relativa como una función de carga. Hace referencia al Ejemplo 19.

La Figura 29 es un gráfico que representa la viscosidad final después de licuificar el almidón de maíz utilizando la primera estructura Amys con 30 % de residuos secos, pH 5.8 y dosis de enzima de 30 mg. 5 En la variante +6 la viscosidad final es muy elevada y no se puede medir (sobrecarga de instrumento). Hace referencia al Ejemplo 16.

La Figura 30 es un gráfico que representa la estabilidad térmica de la primera escala de carga de AmyS (first AmyS charge ladder) como una función de cambio de carga relativa a la enzima natural. Experimento llevado a cabo utilizando un ensayo de estabilidad térmica con amilasa estándar. Hace 10 referencia al Ejemplo 17.

La Figura 31A es un gráfico que representa la actividad de limpieza del almidón de arroz de la primera escala de carga de AmyS como una función de pH. El pH 3.0-4.25 es 200 mM de formiato de sodio + 0,01 % de Tween-80. El pH 4.25-5.5 es 200 mM de acetato de sodio + 0,01 % de Tween-80. Los datos se ajustan a las curvas de titulación, cada una con un único valor de pKa. Hace referencia al Ejemplo 15 21.

La Figura 31B es un gráfico que representa el efecto de las mutaciones de carga en pKa aparente para catálisis de AmyS (primera escala de carga). Hace referencia al Ejemplo 21.

La Figura 32A muestra la reducción de la viscosidad de la harina de maíz de las variantes de AmyS en comparación con SPEZYME® Xtra. 20

La Figura 32B muestra la reducción de la viscosidad de la harina de maíz de AmyS N193Y.

La Figura 32C muestra el efecto de la adición de fitasa en la reducción de la viscosidad de AmyS N193Y.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS

[0035] Las siguientes secuencias de aminoácidos y nucleótidos se mencionan en el presente documento. 25

SEQ ID Nº 1 (AmyS natural de longitud total)

SEQ ID Nº 2 (AmyS natural truncada; SPEZYME® Xtra) 35

SEQ ID Nº 3 (AmyS S242A de longitud total)

SEQ ID Nº 4 (AmyS S242Q de longitud total) 10

SEQ ID Nº 5 (AmyS S242E de longitud total)

SEQ ID Nº 6 (Yamane 707)

SEQ ID Nº 7 (AmyL natural, LAT)

SEQ ID Nº 8 (AmyL natural; Termamyl)

SEQ ID Nº 9 (amilasa de B. amyloliquefaciens)

SEQ ID Nº 10 (STAINZYME™)

SEQ ID Nº 11 (NATALASE™)

SEQ ID Nº 12 (KAO KSM 1378)

SEQ ID Nº 13 (KAO KSM K38)

SEQ ID Nº 14 (KAO KSM K36)

SEQ ID Nº 15 (LIQUIZYME® SC) 25

SEQ ID Nº 16 (SPEZYME® Etil)

SEQ ID Nº 17 (cebador (primer, en inglés) S242 F)

5'-[Phos]GTCAAGCATATTAAGTTCNNSTTTTTTCCTGATTGGTTG-3'

SEQ ID Nº 18 (cebador (primer) S242 R)

5'-[PhOS]CAACCAATCAGGAAAAAASNNGAACTTAATATGCTTGAC-3'

SEQ ID Nº 19 (fitasa BP17) 5

SEQ ID Nº 20 (secuencia de codificación para el péptido de señal LAT)

SEQ ID Nº 21 (péptido de señal LAT)

MKQQKRLYAR LLTLLFALIF LLPHSAASA

SEQ ID Nº 22 (AmyS S242Q truncada)

SEQ ID Nº 23 (secuencia de codificación para AmyS madura)

SEQ ID Nº 24 (Satori F)

5'-CTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTC-3'

SEQ ID Nº 25 (Satori R) 25

5'-TTATCCTTTACCTTGTCTCCAAGC-3'

DESCRIPCIÓN DETALLADA

I. Introducción

[0036] La composición y los métodos presentes se refieren a variantes de una α-amilasa original que muestra 30 una alteración en al menos una de las siguientes propiedades en relación con dicha α-amilasa original: actividad específica, especificidad de sustrato, unión de sustrato, escisión de sustrato, estabilidad térmica, actividad dependiente de pH, estabilidad dependiente de pH, estabilidad a la oxidación, dependencia de Ca2+, pI y rendimiento de lavado. Las variantes son adecuadas para la conversión de almidón, la producción de etanol, el lavado de ropa, el lavado de vajilla, la limpieza de superficies duras y otros usos industriales. 35

[0037] Aunque se describen numerosas mutaciones, éstas tienen en común la capacidad de mejorar el rendimiento de α-amilasas parentales que comparten características estructurales en cuanto a identidad de secuencia de aminoácidos y estructura de tres dimensiones. Se ha observado que varias de estas mutaciones se pueden combinar con otras mutaciones, lo cual las hace especialmente valiosas en el diseño de variantes de α-amilasas con propiedades preseleccionadas. También se describen las posiciones que no son susceptibles de 40 mutación, en general, o no son susceptibles de mutación y combinación con otras mutaciones. La identificación de estas posiciones también es importante en el diseño de variantes de α-amilasas con propiedades preseleccionadas.

[0038] Aunque los estudios realizados en apoyo de las presentes composiciones y métodos se llevaron a cabo principalmente utilizando una α-amilasa parental concreta de Geobacillus stearothermophilus, las α-amilasas estructuralmente relacionadas son propensas a beneficiarse de mutaciones equivalentes. Por consiguiente, la presente descripción proporciona un conjunto de directrices para modificar cualquiera de un gran número de α-amilasas para producir cambios beneficiosos en las características de rendimiento y para identificar nuevas α-5 amilasas propensas a tener características de rendimiento deseables basándose en la presencia de ciertos residuos de aminoácidos en posiciones específicas.

[0039] Estos y otros aspectos y modos de realización de las composiciones y métodos se describen con más detalle a continuación.

II. Definiciones y nomenclatura 10

[0040] Antes de describir las presentes composiciones y métodos con más detalle, a continuación se exponen terminología, nomenclatura y principios generales diversos.

A. Definiciones

[0041] Los siguientes términos y expresiones se definen para una mayor claridad. A los términos y a las expresiones que no se definen se les debe dar el significado habitual que tienen en la técnica. Se hace referencia 15 a referencias de biología molecular estándar, tales como Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ª Ed., 1989); Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION; A LABORATORY MANUAL (1990); Ausubel et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (1994); Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2ª ED., John Wiley e hijos, Nueva York (1994); y Hale y Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991). 20

[0042] Como se utiliza en el presente documento, el término “almidón” se refiere a cualquier material que comprende los carbohidratos polisacáridos complejos de plantas, que comprende amilosa y amilopectina con la fórmula (C6H10O5)x, en la que X puede ser cualquier número. Ejemplos de fuentes de almidón incluyen, pero sin carácter limitativo, granos, pastos, tubérculos y raíces, y más específicamente trigo, cebada, maíz, centeno, arroz, sorgo, salvado, yuca, mijo, patata, boniato y tapioca. 25

[0043] Como se utiliza en el presente documento, el término "alfa (α)-amilasa” se refiere a enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces α-1,4-glucosídicos, por ejemplo, clase E.C. 3.2.1.1. Estas enzimas también se han descrito como aquellas que efectúan la exo o endohidrólisis de enlaces 1,4-α-D-glucosídicos en polisacáridos que contienen unidades de D-glucosa enlazadas α-1,4. Otro término utilizado para describir estas enzimas es “glucogenasas”. Ejemplo de enzimas incluyen α-1,4-glucano-4-glucanohidrasa-glucanohidrolasa. 30

[0044] Como se utiliza en el presente documento, el término "recombinante", cuando se utiliza con referencia a una célula, ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector se ha modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o una proteína heteróloga o por la alteración de un ácido nucleico nativo o una proteína nativa, o que la célula se deriva de una célula modificada de esta manera. Por tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la 35 forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que se expresan anormalmente de otro modo, se expresan por disminución o no se expresan en absoluto.

[0045] Como se utilizan en el presente documento, los términos "proteína" y "polipéptido" se utilizan indistintamente para referirse a una cadena contigua de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Se utiliza el código de una letra o de tres letras convencional para residuos de aminoácidos. 40

[0046] Como se utiliza en el presente documento, el término "secuencia de señal" se refiere a una secuencia de residuos de aminoácidos en la parte N-terminal de un polipéptido, que facilita la secreción de un polipéptido extracelular fuera de la célula. La forma madura de la proteína extracelular carece de la secuencia de señal, la cual se escinde durante el proceso de secreción.

[0047] Como se utiliza en el presente documento, un "gen" se refiere a un segmento de ADN que participa en la 45 producción de un polipéptido e incluye regiones precedentes y posteriores a las regiones codificantes, así como secuencias intervinientes (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones). El nombre de un gen se escribe normalmente en cursiva, mientras que el nombre de una proteína correspondiente generalmente no se escribe en cursiva y la primera letra se escribe en mayúscula.

[0048] Como se utiliza en el presente documento, los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se utilizan 50 indistintamente para referirse a una cadena contigua de nucleósidos unidos por enlaces fosfodiéster o similares, y engloba ADN, ARN, ya sea monocatenario, bicatenario, o parcialmente bicatenario, así como ADN o ARN modificado químicamente o derivados sintéticos de los mismos. A menos que se especifique lo contrario, las secuencias de ácidos nucleicos están presentes en una dirección de 5' a 3'. El experto en la materia entenderá que debido a que el código genético es degenerado, más de un codón puede codificar un aminoácido concreto. 55

[0049] Como se utiliza en el presente documento, un "vector" se refiere a una secuencia de polinucleótidos diseñada para introducir ácidos nucleicos en uno o varios tipos de células. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores lanzadera, plásmidos, partículas de fago, cassettes y similares.

[0050] Como se utiliza en el presente documento, un "vector de expresión" se refiere a un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que está operativamente unida a una secuencia de control adecuada 5 capaz de efectuar la expresión del ADN en un huésped adecuado. Tales secuencias de control pueden incluir un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia de operador opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión al ribosoma adecuados en el ARNm, potenciadores y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traslado.

[0051] Como se utiliza en el presente documento, un "promotor" es una secuencia reguladora que participa en la 10 unión de ARN polimerasa para iniciar la transcripción de un gen. El promotor puede ser un promotor inducible o un promotor constitutivo. Un ejemplo de promotor es el del gen cbh1 de Trichoderma reesei, que es un promotor inducible.

[0052] Como se utiliza en el presente documento, el término "bajo control de transcripción" indica que la transcripción de un polinucleótido específico, normalmente una secuencia de ADN, depende de si está 15 operativamente unido a un promotor específico y/o a otro(s) elemento(s), que regulan su transcripción.

[0053] Como se utiliza en el presente documento, el término "bajo control de traslado" indica que la traslado de un polinucleótido específico, normalmente una secuencia de ARNm, depende de si está operativamente unido a un(os) elemento(s) específico(s), que regulan su traslado.

[0054] Como se utiliza en el presente documento, el término "derivado" engloba los términos "originado de", 20 “obtenido de”, "obtenible de" y "aislado de" y se utiliza para indicar que un polipéptido, un polinucleótido, un vector de expresión, una célula huésped, o similar, específico es una variante modificada de un polipéptido, un polinucleótido, un vector de expresión, una célula huésped, o similar, parental.

[0055] Como se utiliza en el presente documento, "operativamente unido" significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida. Por ejemplo, una secuencia 25 regulatoria puede estar “operativamente unida” a una secuencia codificante de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue bajo condiciones compatibles con la secuencia regulatoria.

[0056] El término "marcador selectivo/seleccionable" se refiere a un gen capaz de ser expresado en una célula huésped que permite la facilidad de selección de aquellas células huésped que utilizan un componente de medios o una condición de crecimiento. Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero sin carácter 30 limitativo, genes que confieren resistencia antibiótica/antimicrobiana (por ejemplo, higromicina, bleomicina o cloranfenicol) y/o genes que confieren una ventaja metabólica o nutricional.

[0057] Como se utiliza en el presente documento, un polinucleótido o un polipéptido tiene un cierto “por ciento/porcentaje de identidad de secuencia” (por ejemplo, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 %) con otra secuencia cuando el porcentaje especificado de bases o residuos de 35 aminoácidos es el mismo que sigue al alineamiento de las secuencias. El alineamiento y el porcentaje de homología o identidad se pueden determinar utilizando cualquier programa de software adecuado conocido en la técnica, por ejemplo los descritos en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel et al. (eds) (1987) suplemento 30, sección 7.7.18).Los programas preferidos incluyen los programas Vector NTI Advance™ 9.0 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA), GCG Pileup, FASTA (Pearson et al. (1988) Proc. Natl, Acad. Sci EE.UU. 40 85:2444-2448), y BLAST (BLAST Manual, Altschul et al., Natl Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md., y Altschul et al. (1997) NAR 25:3389-3402). Otro programa de alineamiento preferido es ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA) utilizando preferiblemente parámetros por defecto. Otro programa de software para el análisis de secuencias que es útil es el programa de búsqueda de datos TFASTA, disponible en el paquete de software para el análisis de secuencias versión 6.0 (Sequence Analysis Software 45 Package Version 6.0, Genetic Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI).

[0058] Como se utiliza en el presente documento, una "cepa huésped" o una "célula huésped" se refiere a un organismo adecuado para introducir un vector de expresión o constructo de ADN que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido en cuestión. Las cepas huésped son preferiblemente células bacterianas o fúngicas pero también pueden ser células vegetales (por ejemplo, protoplastos), células de 50 insectos o células de mamíferos.

[0059] Como se utiliza en el presente documento, el término "cultivar" se refiere a hacer crecer una población de células microbianas bajo condiciones adecuadas en un medio líquido o sólido. Cultivar incluye la bioconversión fermentativa de un sustrato de almidón que contiene almidón granulado en un producto final (normalmente en un recipiente o reactor). 55

[0060] Como se utiliza en el presente documento, el término “fermentación” se refiere a la rotura enzimática y sustancialmente anaeróbica de sustancias orgánicas por microorganismos para producir compuestos orgánicos

más simples. Aunque la fermentación se produce generalmente bajo condiciones anaeróbicas, no se pretende que el término se limite únicamente a condiciones estrictamente anaeróbicas, puesto que la fermentación también se produce en presencia de oxígeno.

[0061] Como se utiliza en el presente documento, el término "poner en contacto", con referencia a una enzima y a su sustrato, se refiere a la disposición de la enzima en proximidad suficientemente cercana al sustrato para 5 permitir que la enzima convierta el sustrato en un producto final (es decir, actuar en el sustrato). La puesta en contacto se puede producir mediante la mezcla de las soluciones o suspensiones de las enzimas y los sustratos.

[0062] Como se utiliza en el presente documento, el término "conversión enzimática" se refiere en general a la modificación de un sustrato por la acción de una enzima, por ejemplo, la modificación de un sustrato de almidón por la acción de una amilasa, una glucoamilasa u otra enzima. 10

[0063] Como se utiliza en el presente documento, el término “sacarificación” se refiere a la conversión enzimática de almidón a glucosa.

[0064] Como se utiliza en el presente documento, el término "gelatinización" se refiere a la solubilización de almidón (por ejemplo, almidón crudo o cristalino) mediante cocción para formar una suspensión viscosa.

[0065] Como se utiliza en el presente documento, el término “licuefacción” se refiere a la etapa en la conversión 15 del almidón en la que se hidroliza el almidón gelatinizado a dextrinas solubles de menor peso molecular.

[0066] Como se utiliza en el presente documento, el término "grado de polimerización (DP, por sus siglas en inglés)” se refiere al número (n) de unidades de anhidroglucopiranosa en un sacárido dado. Ejemplos de sacáridos de DP1 son los monosacáridos, tales como la glucosa y la fructosa. Ejemplos de sacáridos de DP2 son los disacáridos, tales como la maltosa y la sacarosa. Un sacárido de DP>3 tiene un grado de polimerización 20 superior a 3.

[0067] Como se utilizan en el presente documento, los términos "producto final" o "producto final deseado" se refieren a una molécula que se deriva enzimáticamente de un sustrato, como el almidón.

[0068] Como se utilizan en el presente documento, el término "contenido de residuos secos (ds, por sus siglas en inglés) " se refiere a los sólidos totales de una suspensión expresados en términos de % en una base de peso 25 seco (% wt/wt).

[0069] Como se utiliza en el presente documento, el término “suspensión” se refiere a una mezcla acuosa que contiene sólidos insolubles.

[0070] Como se utiliza en el presente documento, el término "almidón residual" se refiere al almidón restante (soluble o insoluble) en una composición de almidón después de la fermentación. 30

[0071] Como se utiliza en el presente documento, una “etapa de reciclado” se refiere al reciclado de componentes en forma de masa, que pueden incluir almidón residual, enzimas y/o microorganismos que afecten o participen en la fermentación de composiciones de almidón adicionales.

[0072] Como se utiliza en el presente documento, el término “masa” se refiere a una mezcla de moléculas de carbono fermentables (por ejemplo, carbohidratos) en agua, que puede utilizarse para producir un producto 35 fermentado, tal como un alcohol. Los términos “cerveza” y “masa” se pueden utilizar indistintamente.

[0073] Como se utiliza en el presente documento, el término “vinaza” se refiere a una mezcla de sólidos no fermentados y agua, que es el residuo después de eliminar el alcohol de una masa fermentada.

[0074] Como se utilizan en el presente documento, los términos “granos secos de destilería (DDG, por sus siglas en inglés)” y “granos secos de destilería con solubles (DDGS, por sus siglas en inglés)” se refieren a un 40 subproducto útil de fermentación de grano.

[0075] Como se utiliza en el presente documento, un "microorganismo etanologénico" se refiere a un microorganismo capaz de convertir un azúcar u oligosacárido en etanol. Los microorganismos etanologénicos son generalmente etanologénicos debido a su capacidad para expresar una o varias enzimas que convierten azúcar en etanol de forma individual o conjunta. 45

[0076] Como se utiliza en el presente documento, el término “productor de etanol” o “microorganismo productor de etanol” se refiere a cualquier organismo o célula capaz de producir etanol a partir de una hexosa o pentosa. Generalmente, las células productoras de etanol contienen un alcohol deshidrogenasa y una piruvato descarboxilasa. Los ejemplos de microorganismos productores de etanol incluyen microorganismos fúngicos tales como la levadura. Una levadura preferida incluye cepas de Sacchromyces, en concreto, S. cerevisiae. 50

[0077] Como se utiliza en el presente documento, el término "heterólogo", con referencia a un polinucleótido o polipéptido, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que no se produce de forma natural en una célula huésped. La proteína puede ser un polipéptido industrial comercialmente importante, tal como una enzima. Se

pretende que el término englobe polinucleótidos y polipéptidos que son (o se codifican por) genes que se producen de forma natural, genes mutados y/o genes sintéticos.

[0078] Como se utiliza en el presente documento, el término "endógeno", con referencia a un polinucleótido o polipéptido, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que se produce de forma natural en la célula huésped.

[0079] Como se utilizan en el presente documento, los términos "recuperado", "aislado" y "separado" se refieren 5 a un compuesto, una proteína, una célula, un ácido nucleico, o un aminoácido que se elimina de al menos un componente con el que está asociado de forma natural.

[0080] Como se utilizan en el presente documento, los términos "transformado", "establemente transformado" y "transgénico" utilizados con referencia a una célula, significan que la célula incluye una secuencia de ácidos nucleicos no nativa (por ejemplo, heteróloga) integrada en su genoma o transportada como un plásmido 10 episomal que se mantiene a lo largo de múltiples generaciones.

[0081] Como se utiliza en el presente documento, el término "expresión" se refiere al proceso por el que se produce un polipéptido basándose en la secuencia nucleotídica de un gen. El proceso incluye tanto la transcripción como la traslado.

[0082] Como se utiliza en el presente documento, el término "introducido", en el contexto de insertar una 15 secuencia de ácidos nucleicos en una célula, se refiere a la "transfección", "transformación" o "transducción" e incluye referencia a la incorporación de una secuencia de ácidos nucleicos en una célula eucariota o procariota en la que la secuencia de ácidos nucleicos puede incorporarse al genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido o ADN mitocondrial), convertirse en un replicón autónomo o expresarse transitoriamente (por ejemplo, ARNm transfectado). 20

[0083] Como se utiliza en el presente documento, el término "actividad específica" se refiere al número de moles de sustrato que pueden convertirse en producto por una enzima o por una preparación de enzima por unidad de tiempo bajo condiciones específicas. La actividad específica se expresa generalmente como unidades (U)/mg de proteína.

[0084] Como se utiliza en el presente documento, el término "rendimiento" se refiere a la cantidad de producto 25 final producido utilizando un método específico y reactivos específicos (que incluyen enzimas). La cantidad de producto final se puede expresar en términos de masa, volumen, concentración o similares, y puede incluir una referencia a la cantidad de material de partida (por ejemplo, sustrato), tiempo u otras condiciones.

[0085] Como se utiliza en el presente documento, el término “índice de rendimiento (PI, por sus siglas en inglés)” se refiere al índice de rendimiento de una variante de enzima con respecto a una enzima original o de referencia. 30 En este contexto, se utilizan varios términos y expresiones adicionales para caracterizar el rendimiento de las variantes: las “mutaciones aceleradoras” tienen un PI > 1; las mutaciones neutras tienen un PI > 0,5; las mutaciones no deletéreas tienen un PI > 0,05; las mutaciones deletéreas tienen un PI = 0,05; las mutaciones combinables tienen un PI = 0,5 para al menos una propiedad y > 0,05 para todas las propiedades.

[0086] Como se utiliza en el presente documento, “mutaciones combinables” son mutaciones que se pueden 35 combinar para suministrar proteínas con índices de rendimiento (PI) preseleccionados para una o más propiedades deseadas (véase más arriba).

[0087] Como se utiliza en el presente documento, "ATCC" se refiere a la Colección americana de cultivos tipo (American Type Culture Collection) ubicada en Manassas, VA, EE.UU.

[0088] Como se utiliza en el presente documento, "NRRL" se refiere a la Colección de cultivos del servicio de 40 investigación agrícola (Agricultural Research Service Culture Collection), Centro nacional para la investigación de la utilización agrícola (previamente conocido como “USDA Northern Regional Research Laboratory”), en Peoria, IL, EE.UU.

[0089] En general, los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Los artículos en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo 45 contrario. Los encabezamientos se proporcionan para facilitar la lectura y no deberían interpretarse como materia descrita limitante con respecto a una parte de la memoria.

B. Nomenclatura

[0090] Se utilizan los códigos convencionales de una letra y de tres letras para los residuos de aminoácidos a menos que se especifique lo contrario. Las variantes de polipéptidos se describen utilizando la siguiente 50 nomenclatura: aminoácido(s) original(es): posición(es): aminoácido(s) sustituido(s).

[0091] Según esta nomenclatura, por ejemplo, la sustitución de serina por una alanina en la posición 242 se muestra como:

Ser142A1a o S242A

[0092] Una deleción de alanina en la posición 30 se muestra como:

Ala30* o A30* o AA30

[0093] Y una inserción de un residuo de aminoácido adicional, tal como la lisina, se muestra como:

Ala30AlaLys o A30AK 5

[0094] Una deleción de un segmento consecutivo de residuos de aminoácidos, tal como los residuos de aminoácidos 30-33, se indica como (30-33)* o ∆(A30- N33).

[0095] Cuando un polipéptido contiene una “deleción” en comparación con otros polipéptidos (o un polipéptido original) y se realiza una inserción en esta posición esto se indica como:

*36Asp o *36D, donde el ejemplo representa la inserción de un ácido aspártico en la posición 36. 10

[0096] Las mutaciones múltiples están separadas por signos de suma. Por ejemplo: las mutaciones en las posiciones 30 y 34, sustituyendo la alanina y el ácido glutámico por asparagina y serina, respectivamente, se representan como:

Ala30Asp+Glu34Ser o A30N+E34S

[0097] Cuando uno o más residuos de aminoácidos alternativos se pueden insertar en una posición dada esto se 15 indica como

A30N,E o A30N o A30E

[0098] Además, cuando se identifica una posición adecuada para la modificación sin que se haya sugerido ninguna modificación específica, se entenderá que cualquier residuo de aminoácido se puede sustituir por el residuo de aminoácido presente en la posición. Por ejemplo, cuando se menciona una modificación de una 20 alanina en la posición 30, pero no se especifica, se entenderá que la alanina se puede delecionar o sustituir por cualquier otro aminoácido, es decir, cualquiera de:

R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V.

[0099] Además, “A30X” significa cualquiera de las siguientes sustituciones:

A30R, A30N, A30D, A30C, A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, 25 A30T, A30W, A30Y, o A30 V; que también se puede presentar como: A30R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.

[0100] Si la enzima original utilizada para la numeración ya tiene el residuo de aminoácido en cuestión sugerido para la sustitución en esa posición, se utiliza la siguiente nomenclatura:

"X30N" o "X30N,V" en el caso en el que, por ejemplo, uno o N o V está presente en la enzima natural. 30

[0101] Por lo tanto, esto significa que otras enzimas originales correspondientes se sustituyen por un “Asn” o “Val” en la posición 30.

C. Características de los residuos de aminoácidos

[0102] La siguiente información general sobre las características de los residuos de aminoácidos se proporciona a modo de referencia: 35

[0103] Aminoácidos cargados:

Asp, Glu, Arg, Lys, His

[0104] Aminoácidos cargados negativamente (con el residuo más negativo en primer lugar):

Asp, Glu

[0105] Aminoácidos cargados positivamente (con el residuo más positivo en primer lugar): 40

Arg, Lys, His

[0106] Aminoácidos neutros:

Gly, Ala, Val, Leu, lie, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys, Asn, Gln, Ser, Thr, Pro

[0107] Residuos de aminoácidos hidrófobos (con el residuo más hidrófobo listado en último lugar):

Gly, Ala, Val, Pro, Met, Leu, lie, Tyr, Phe, Trp,

[0108] Aminoácidos hidrófilos (con el residuo más hidrófilo listado en último lugar):

Thr, Ser, Cys, Gln, Asn

III. α-amilasas para utilizarse en las presentes composiciones y métodos 5

[0109] Los siguientes párrafos describen α-amilasas "del tipo Spezyme® Xtra " o "del tipo AmyS " que se pueden modificar y utilizar según se describe en el presente documento.

A. Homología entre α-amilasas

[0110] Los experimentos llevados a cabo en apoyo de las presentes composiciones y métodos se han llevado a cabo utilizando α-amilasas Geobacillus (antes Bacillus) stearothermophilus (es decir, AmyS,), ejemplificadas por 10 la SEQ ID Nº 2. Una variante de esta amilasa está comercialmente disponible como SPEZYME® Xtra (Danisco US Inc, Genencor Division, Palo Alto, CA, EE.UU.).

[0111] Un número de α-amilasas producido por Bacillus spp. son muy homólogas (idénticas) en el nivel de aminoácido con respecto a AmyS, y se espera que las muchas mutaciones descritas en el presente documento produzcan efectos similares cuando se realicen con estas amilasas, colectivamente denominadas α-amilasas 15 "del tipo Spezyme® Xtra " o α-amilasas "del tipo AmyS". En la Tabla A se resume la identidad de un número de α-amilasas Bacillus conocidas:

Tabla A. Porcentaje de identidad

: AP1378 BAN BSG SP690 SP722 AA560 LAT

: 100,0 86,4 66,9 66,5 87,6 86,2 95,5 68,1

AP1378: 86,4 100,0 67,1 68,1 95,1 86,6 86,0 69,4

BAN: 66,9 67,1 100,0 65,6 67,1 68,8 66,9 80,7

BSG: 66,5 68,1 65,6 100,0 67,9 67,1 66,3 65,4

SP690: 87,6 95,1 67,1 67,9 100,0 87,2 87,0 69,2

SP722: 86,2 86,6 68,8 67,1 87,2 100,0 86,8 70,8

AA560: 95,5 86,0 66,9 66,3 87,0 86,8 100,0 68,3

LAT: 68,1 69,4 80,7 65,4 69,2 70,8 68,3 100,0

[0112] Se ha observado que la α-amilasa B. Licheniformis (LAT) que tiene la secuencia de aminoácidos que se 20 muestra en la SEQ ID Nº 7 es aproximadamente 81 % homologa a la α-amilasa B. Amyloliquefaciens que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID Nº 9, y aproximadamente 65 % homologa a la α-amilasa Geobacillus (antes Bacillus) stearothermophilus (BSG; AmyS) que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID Nº 1. α-amilasas homólogas adicionales incluyen SP690 y SP722 descritas en WO 95/26397 y la α-amilasa #707 derivada de Bacillus sp., que se muestra en la SEQ ID Nº 6 y descrita por 25 Tsukamoto et al. (1988) Biochemical and Biophysical Research Communications 151:25-31. La α-amilasa KSM AP1378 (SEQ ID Nº 12) se describe en WO 97/00324 (de KAO Corporation).

[0113] Aún más α-amilasas homólogas adicionales incluyen la α-amilasa producida por la cepa B. Lichenformis descrita en EP 0 252 666. (ATCC 27811), y las α-amilasas identificadas en WO 91/00353 y WO 94/18314. Otras α-amilasas comerciales del tipo SPEZYME® Xtra están comprendidas en los productos vendidos bajo los 30 siguientes nombres comerciales: SPEZYME® AA y Ultraphlow (disponible de Danisco US Inc, Genencor Division), y KEISTASE™ (disponible de Daiwa) y LIQUEZYME® SC (SEQ ID Nº 15) disponible de Novozymes, DK). Otras α-amilasas relacionadas incluyen Termamyl® (SEQ ID Nº 8; Novozymes), STAINZYME™ (SEQ ID Nº 10; Novozymes), NATALASE™ (SEQ ID Nº 11; Novozymes), KAO KSM K38 (SEQ ID Nº 13), KAO KSM K36 (SEQ ID Nº 14), otras α-amilasas mencionadas en la Tabla, y otras α-amilasas descritas en el presente 35 documento.

[0114] Debido a la homología sustancial observada entre estas α-amilasas, se considera que pertenecen a la misma clase de α-amilasas y se engloban en las presentes composiciones y métodos. Aunque la α-amilasa G. Stearothermophilus (SEQ ID Nº 2) se utiliza como punto de partida, también se espera que las posiciones correspondientes en estas y otras α-amilasas, por ejemplo, las α-amilasas SP722, BLA, BAN, AA560, SP690, 40 KSM AP1378, #707 y otras α-amilasas Bacillus, se beneficien de las modificaciones a describir.

[0115] Por consiguiente, se pretende que los términos α-amilasa del tipo SPEZYME® Xtra o α-amilasa del tipo AmyS incluyan una α-amilasa que tenga la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11,

12, 15, y 16. En algunos aspectos, las α-amilasas del tipo Spezyme® Xtra o las α-amilasas del tipo AmyS también incluyen α-amilasas que muestran una identidad sustancial a nivel de aminoácidos con respecto a la SEQ ID Nº 2, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o incluso al menos 99 % de homología (identidad). En aspectos adicionales, las α-5 amilasas del tipo Spezyme® Xtra o las α-amilasas del tipo AmyS también incluyen α-amilasas que muestran una identidad sustancial a nivel de aminoácidos con respecto a una o más de las SEQ ID Nos: 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, y 16, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o incluso al menos 99 % de homología (identidad). 10

[0116] La homología de α-amilasas conocidas o sospechadas con respecto a una α-amilasa de referencia se puede determinar mediante programas informáticos conocidos en la técnica. Generalmente, un alineamiento estructural entre SPEZYME® Xtra (SEQ ID Nº 2) y, por ejemplo, otra α-amilasa se puede utilizar para identificar posiciones equivalentes/correspondientes en otras α-amilasas del tipo SPEZYME® Xtra, que se pueden mutar como se describe en el presente documento para producir efectos similares. Un programa a modo de ejemplo es 15 GAP, que se proporciona en el paquete de programas GCG (descrito previamente). En concreto, el Gap GCG v8 se puede utilizar con la matriz de puntuación por defecto para la identidad y los siguientes parámetros por defecto: penalización de creación GAP de 5,0 y penalización de extensión GAP de 0,3, respectivamente para la comparación de secuencias de ácidos nucleicos, y penalización de creación GAP de 3,0 y penalización de extensión GAP de 0,1, respectivamente para la comparación de secuencias de proteínas. GAP utiliza el método 20 de Needleman y Wunsch, (1970), J.Mol. Biol. 48:443-453, para realizar alineamientos y para calcular la identidad. En la técnica se conocen otros programas y métodos.

[0117] Otro método para obtener alineamientos estructurales es utilizar el programa Pile Up del paquete GCG utilizando valores por defecto de penalizaciones gap, es decir, una penalización de creación gap de 3,0 y una penalización de extensión gap de 0,1. Otros métodos de alineamiento estructural incluyen el análisis de grupo 25 hidrófobo (Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155) y el roscado inverso (Huber, T; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE vol. 7, nº. 1 pp. 142-149 (1998).

[0118] Las α-amilasas del tipo SPEZYME® Xtra o las α-amilasas del tipo AmyS incluyen además polipéptidos codificados por una secuencia de ADN que hibrida con una secuencia de ADN que codifica una o varias de las α-amilasas previamente mencionadas, como se ejemplifica en las SEQ ID Nos: 9 (BAN), 5 (BSG; AmyS), 3 30 (SP722), 1 (SP690), 7 (LAT), y 11 (AA560) de WO 06/002643 y polinucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 y 16. Un ácido nucleico es hibridable con otra secuencia de ácidos nucleicos cuando una forma monocatenaria del ácido nucleico puede aparearse con el otro ácido nucleico bajo condiciones de temperatura apropiadas y solución de fuerza iónica. Las condiciones de hibridación y de la lavado son muy conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook (1989), véase más 35 arriba, en concreto los capítulos 9 y 11). Una sonda de oligonucleótido utilizada en la caracterización de una α-amilasa conocida o sospechada del tipo SPEZYME® Xtra descrita previamente se puede preparar adecuadamente basándose en la secuencia completa o parcial de nucleótidos o aminoácidos de la α-amilasa en cuestión.

[0119] Las condiciones adecuadas para analizar la hibridación implican preremojar en 5X SSC y prehibridar 40 durante 1 hora a 40 °C en una solución de forfamida al 20 %, una solución de 5X Denhardt, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6.8 y 50 mg de ADN de timo de ternera sonicado desnaturalizado, seguido de la hibridación en la misma solución complementada con 100 mM de ATP durante 18 horas a 40 °C, seguido de lavar el filtro tres veces en 2X SSC, 0,2 % de SDS a 40 °C durante 30 minutos (bajo rigor), preferiblemente a 50 °C (rigor medio), más preferiblemente a 65 °C (rigor alto), aún más preferiblemente a 75 °C (rigor muy alto). Se pueden encontrar 45 más detalles sobre el método de hibridación en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor, 1989. En algunos modos de realización, las condiciones de rigor corresponden a una Tm de 65 °C y 0,1×SSC, 0,1 % de SDS.

B. α-amilasas parentales

[0120] Cualquiera de las α-amilasas del tipo SPEZYME® Xtra/AmyS previamente mencionadas puede servir 50 como una α-amilasa parental para ser modificada y utilizada como se describe en el presente documento. La α-amilasa parental/original también se puede denominar una “estructura principal” o “plantilla”, y se pueden derivar variantes de amilasas de la misma. En algunos aspectos, la α-amilasa original se deriva de G. stearothermophilus. En un aspecto concreto, la α-amilasa original tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 2. En otros aspectos, la α-amilasa parental tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nos: 1, 6, 7, 8, 9, 10, 55 11, 12, 15, y 16, o muestra una identidad sustancial a nivel de aminoácidos con respecto a las SEQ ID Nos: 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, y/o 16, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o incluso al menos 99 % de homología (identidad).

[0121] Una α-amilasa parental también puede ser una α-amilasa híbrida, es decir, una α-amilasa que comprende una combinación de secuencias de aminoácidos parciales derivadas de al menos dos α-amilasas, tales como las descritas previamente. Además, la α-amilasa híbrida puede incluir una porción de una α-amilasa del tipo SPEZYME® Xtra/AmyS y una porción de una o varias otras α-amilasas de origen microbiano (bacteriano o fúngico) y/o mamífero. 5

[0122] De esta manera, la α-amilasa híbrida original puede comprender una combinación de secuencias de aminoácidos parciales que derivan de al menos dos α-amilasas del tipo SPEZYME® Xtra, o de al menos una α-amilasa del tipo SPEZYME® Xtra y al menos una α-amilasa bacteriana que no es del tipo SPEZYME® Xtra, o de al menos una del tipo SPEZYME® Xtra y al menos una α-amilasa fúngica, etcétera. Por ejemplo, la α-amilasa original puede comprender una parte C-terminal de una α-amilasa derivada de una cepa de B. licheniformis, y 10 una parte N-terminal de una α-amilasa derivada de una cepa de G. stearothermophilus.

IV. Propiedades alteradas de variantes de α-amilasa

[0123] La siguiente sección describe la relación entre mutaciones, que están presentes en las variantes de polipéptidos descritas en el presente documento, y alteraciones deseables en las propiedades (relacionadas con las de una α-amilasa original del tipo SPEZYME® Xtra), que resultan de las mismas. 15

[0124] En un primer aspecto una variante de una α-amilasa original de G. stearothermophilus descrita, que comprende una alteración en una o varias posiciones (utilizando la SEQ ID Nº 1 o la SEQ ID Nº 2 para la numeración de aminoácidos) seleccionadas del grupo de:

P17, D19, T21, N28, S51, G72, V74, A82, Q86, Q89, A93, G95, Q97, W115, D117, P123, S124, D125, N127, I130,G132, Q135, P145, G146, G148,S153,Y159, W166, S169, K171, W187, P209, N224, S242, G256, 20 D269, N271, T278, N281, G302, A304, R308, T321, Q358, P378, S382, K383, T398, H405, T417, E418, P420, G421, P432, W437, G446, G454, S457, T459, T461, S464, G474, R483.

en el que

(a) la alteración o las alteraciones son independientemente

(i) una inserción de una corriente de aminoácido del aminoácido que ocupa la posición, 25

(ii) una deleción del aminoácido que ocupa la posición, o

(iii) una sustitución del aminoácido que ocupa la posición por un aminoácido diferente,

(b) la variante tiene actividad de α-amilasa y (c) cada posición corresponde a una posición de la secuencia de aminoácidos de la α-amilasa de G. stearothermophilus original que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº 1 o 2. 30

[0125] Específicamente contempladas en el presente documento están S242A, S242Q, S242N y S242E, que se pueden combinar con mutaciones en R179, G180, I181, G182, y/o K183, asociadas con la unión calcio-sodio, y/o una mutación en P245 en la mitad de una hélice-α.

[0126] Se pueden encontrar posiciones correspondientes en otras α-amilasas originales del tipo SPEZYME® Xtra mediante alineamiento como se describe previamente y se muestra en el alineamiento de la Figura 4. 35

Estabilidad

[0127] En el contexto de las variantes descritas en el presente documento, las mutaciones (que incluyen sustituciones de aminoácidos y deleción) de importancia con respecto a lograr una estabilidad alterada, en concreto una estabilidad mejorada (es decir, mayor o menor), a temperaturas especialmente altas (es decir, 70 °C -120 °C) y/o pH extremo (es decir, pH bajo o elevado, es decir, pH 4-6 o pH 8-11, respectivamente), en 40 concreto en concentraciones sin (es decir, no unidas, por lo tanto en solución) calcio por debajo de 60 ppm, incluyen cualquiera de las mutaciones listadas en la sección “Propiedades alteradas”. La estabilidad se puede determinar como se describe en la sección “Métodos” que aparece más adelante en el texto.

[0128] Ejemplos de mutaciones en α-amilasas SPEZYME® Xtra y α-amilasas relacionadas que aumentan la estabilidad incluyen: 45

(a) una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos: 74A, 115L, 124K, 124R, 132A, 132C, 135A, 145A, 146A, 148A, 148N, 159A, 159C, 159D, 159E, 159F, 159G, 159H, 159K, 159L, 159N, 159R, 159S, 159T, 159V, 169A, 169L, 169M, 169Y, 179A, 181A, 181C, 181D, 181E, 181L, 181P, 181Q, 181V, 181Y, 242A, 242D, 242E, 242Q, 261L, 271A, 271V, 278A, 278H, 278K, 278N, 278R, 281A, 281L, 281M, 302D, 302M, 304D, 304E, 304M, 321A, 321H, 321Q, 321R, 333Q, 378D, 378N, 378R, 382D, 398A, 50 418A, 418M, 418N, 420A, 421R, 432A, 432D, 432L, 432M, 432N, 432Q, 432R, 432Y, 437D, 437G, 437H, 437L, 437M, 437Y, 446A, 446Y, 454A, 464Q, 464Y, 474A, 474E, 474K, 474L, 474M, 474N, 474P, 474Q, 474R, 474S, y 474V, o

(b) una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos: 61, 6N, 6Q, 6T, 6V, 14T, 16F, 25A, 25C, 25G, 25Q, 27M, 36Q, 36S, 39G, 39V, 50I, 50L, 50M, 50N, 50Q, 52S, 53T, 67N, 67S, 80D, 80I, 90E, 133P, 133V, 137M, 137S, 141E, 141I, 141L, 141M, 141Q, 141R, 141S, 141V, 150E, 151I, 152G, 155S, 155Y, 168W, 173T, 188P, 193F, 193K, 193L, 193Y, 213L, 213M, 213V, 217Q, 220P, 220Q, 220R, 220S, 220V, 221I, 221S, 249E, 250F, 250I, 250M, 252L, 253Y, 254E, 254F, 254T, 254V, 255F, 255K, 255W, 257L, 5 257M, 257S, 257V, 258D, 258G, 258H, 258K, 258Q, 258T, 258V, 268F, 274W, 283M, 283N, 283V, 285E, 285Q, 293G, 293K, 294W, 301F, 3011, 301P, 301R, 301T, 301W, 309D, 309V, 312H, 312S, 312V, 312Y, 313G, 313H, 313I, 313L, 313S, 313V, 318T, 338A, 338C, 338G, 338M, 338T, 339K, 339T, 339V, 340A, 340M, 340Q, 340T, 343C, 3431, 343P, 343R, 343Y, 345I, 345Q, 369I, 369T, 370G, 375T, 385T, 386K, 394L, 394V, 400A, 400N, 400V, 402H, 402I, 402T, 402V, 402W, 403A, 403E, 403G, 403Q, 403R, 403T, 403V, 10 404C, 404E, 404G, 404I, 404V, 419A, 419C, 419M, 419T, 422E, 422G, 433A, 433H, 433I, 433K, 433L, 433M, 433V, 433Y, 442A, 442G, 442N, 442R, 442S, 442T, 442V, 442W, 442Y, 445G, 445I, 445N, 445T, 445V, 445W, 447I, 447N, 447Q, 447W, 447Y, 448C, 448F, 448G, 448H, 448I, 448N, 448Y, 450C, 450H, 450M, 450N, 450R, 450S, 450T, 450W, 455G, 455I, 455P, 455V, 463A, 463M, 463S, 463T, 463V, 463W, 465G, 465I, 465K, 465N, 465T, 465V, 469D, 469W, 469Y, 471I, 471V, 473G, 473Y, 476A, 476G, 476L, 476M, 476N, 15 y 476T

Estabilidad de Ca2+

[0129] Estabilidad de Ca2+ alterada significa que se ha mejorado la estabilidad de la enzima bajo disminución de Ca2+, es decir, estabilidad mayor o menor. En el contexto de las variantes descritas en el presente documento, las mutaciones (incluyendo las sustituciones y las deleciones de aminoácidos) de importancia con respecto a 20 lograr una estabilidad de Ca2+ alterada, en concreto una estabilidad de Ca2+ mejorada, es decir, una estabilidad mayor o menor, con un pH especialmente alto (es decir, pH 8-10.5) incluyen cualquiera de las mutaciones listadas en la sección “Propiedades alteradas”.

Actividad específica y o expresión aumentada

[0130] En un aspecto adicional, las mutaciones importantes (incluyendo las sustituciones y deleciones de 25 aminoácidos) con respecto a obtener variantes que presentan actividad específica alterada, en concreto actividad específica aumentada o disminuida, especialmente a temperaturas entre 10 °C y 60 °C, preferiblemente entre 20 °C y 50 °C, especialmente entre 30 °C y 40 °C, incluyen cualquiera de las mutaciones listadas en la sección “Propiedades alteradas”. La actividad específica se puede determinar como se describe en la sección “Métodos” que aparece más adelante en el texto. En algunos casos, las mutaciones aumentan la expresión en lugar de o 30 además de aumentar la actividad específica. Ejemplos de mutaciones son como siguen:

(a) una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 124N, 125A, 125K, 125N, 130A, 130S, 159A, 159D, 159E, 159G, 159H, 159K, 159L, 159N, 159R, 159S, 159T, 166F, 166G, 166H, 166S, 166Y, 169L, 179A, 179P, 180A, 180D, 180H, 180K, 180L, 180N, 180T, 180V, 180Y, 181A, 181D, 181E, 181G, 181P, 181R, 181S, 181V, 187A, 187C, 187K, 187N, 35 187P, 187Q, 187R, 187S, 242H, 242N, 278H, 278K, 278N, 278R, 281M, 302D, 304M, 304Y, 321H, 321Q, 321R, 333Q, 432Q, 437Y, 446A, 474Q, y 474S, o

(b) una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 6A, 6D, 6E, 6H, 61, 6K, 6L, 6M, 6N, 6P, 6Q, 6R, 6S, 6T, 6V, 6W, 6Y, 13K, 14F, 14T, 14Y, 15A, 15D, 15E, 015G, 15H, 15K, 15N, 15P, 15Q, 15R, 15S, 15T, 15W, 16A, 16E, 16G, 16H, 16K, 16N, 16P, 16Q, 40 16R, 16T, 25C, 39D, 39E, 39N, 39Q, 81Y, 121P, 139D, 139H, 139R, 139Y, 177A, 188D, 191H, 191K, 192A, 192D, 192G, 192N, 192P, 192Q, 192S, 192T, 192V, 192Y, 196A, 196C, 196D, 196E, 196F, 196H, 196I, 196K, 196P, 196R, 196S, 196T, 196V, 201 A, 201E, 201G, 201H, 201M, 202H, 216E, 216G, 216H, 216M, 216Q, 216R, 216S, 216T, 216Y, 221A, 221D, 221F, 221I, 221L, 221M, 221N, 221R, 221S, 221V, 221Y, 237G, 240G, 240N, 240P, 240Q, 240R, 240T, 246R, 250A, 250D, 250E, 250F, 250G, 250I, 250K, 250L, 45 250M, 250N, 250Q, 250R, 250S, 250W, 252K, 268A, 268D, 268E, 268G, 268H, 268K, 268N, 268P, 268Q, 268R, 268S, 274A, 274D, 274G, 2741, 274K, 274L, 274N, 274Q, 274R, 274S, 274T, 275K, 285Q, 285Y, 293K, 293R, 318A, 318F, 318G, 318I, 318K, 318L, 318M, 318R, 318S, 318T, 318V, 318Y, 319C, 319D, 319H, 319I, 319K, 319R, 319Y, 320K, 320R, 320T, 338A, 338G, 338I, 338M, 338P, 338S, 338V, 339G, 339P, 340A, 340D, 340E, 340H, 340K, 340N, 340Q, 345E, 363D, 363E, 363M, 363N, 363Q, 363S, 366Q, 370A, 370D, 50 370E, 370H, 370K, 370N, 370Q, 370S, 375A, 375D, 375E, 375K, 375N, 375Q, 375R, 375S, 419A, 419I, 419M, 419P, 419S, 419V, 448Y, 452N, 452Q, 452R, 452S, 471R, y 471Y.

Estabilidad a la oxidación

[0131] Las variantes descritas pueden tener estabilidad a la oxidación alterada, en concreto estabilidad a la oxidación mayor, en comparación con la α-amilasa original. Una estabilidad a la oxidación mayor es ventajosa 55 en, por ejemplo, composiciones detergentes y una estabilidad a la oxidación menor puede ser ventajosa en una composición para la licuefacción del almidón. La estabilidad a la oxidación se puede determinar como se describe en la sección “Métodos” que aparece más adelante en el texto.

Perfil de pH alterado

[0132] Las posiciones y las mutaciones importantes con respecto a obtener variantes con un perfil de pH alterado, en concreto una actividad mejorada con un pH especialmente alto (es decir, pH 8-10.5) o un pH bajo (es decir, pH 4-6) incluyen mutaciones de residuos de aminoácidos situados cerca de los residuos del sitio activo. En algunos casos, la actividad mejorada se observa, por ejemplo, con un pH < 6, con un pH < 5, o con un pH > 9.

[0133] Las mutaciones/sustituciones específicas preferidas son las listadas previamente en la sección 5 “Propiedades alteradas” para las posiciones en cuestión. Se describen ensayos adecuados en la sección “Métodos” que aparece más adelante en el texto.

Rendimiento de lavado

[0134] Las posiciones y las mutaciones importantes con respecto a obtener variantes con rendimiento de lavado mejorado con pH especialmente alto (es decir, pH 8.5-11) incluyen las mutaciones/sustituciones específicas 10 listadas previamente en la sección “Propiedades alteradas” para las posiciones en cuestión. El rendimiento de lavado se puede analizar como se describe en la sección “Métodos” que aparece más adelante en el texto.

Licuefacción del almidón

[0135] Algunas mutaciones tienen el efecto de reducir la viscosidad de una composición de almidón en comparación con la observada utilizando una α-amilasa “natural”, tal como SPEZYME® Xtra. Ejemplos de 15 mutaciones incluyen una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en I181A, I181P, I181C, I181E, I181Y, S242A, S242E, S242Q, G132A, N193Y, y E188P.

Otras mutaciones en las variantes

[0136] En algunos aspectos, las presentes variaciones incluyen una o varias modificaciones además de las descritas previamente. Por ejemplo, puede ser ventajoso que uno o varios residuos de prolina se sustituyan por 20 un residuo distinto de prolina. Ejemplos de residuos distintos de prolina incluyen alanina, glicina, serina, treonina, valina y leucina. De manera similar, puede ser ventajoso sustituir uno o varios residuos de cisteína por un residuo distinto de cisteína. Ejemplos de residuos distintos de cisteína incluyen serina, alanina, treonina, glicina, valina y leucina.

[0137] Además, puede ser ventajoso introducir mutaciones en una o varias de las siguientes posiciones 25 (utilizando la SEQ ID Nº 7 para la numeración): M15, V128, A111, H133, W138, T149, M197, N188, A209, A210, H405, T412, en concreto las siguientes mutaciones individuales, dobles, triples o múltiples:

M15X, en concreto M15T,L;

V128X, en concreto V128E;

H133X, en concreto H133Y; 30

N188X, en concreto N188S,T,P;

M197X, en concreto M197T,L;

A209X, en concreto A209V;

M197T/W138F; M197T/138Y; M15T/H133Y/N188S;

M15N128E/H133Y/N188S; E119C/S130C; D124C/R127C; H133Y/T1491; 35

G475R, H133Y/S187D; H133Y/A209V.

[0138] En el caso de la α-amilasa original que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº 7, los residuos de aminoácidos pertinentes que se pueden eliminar o sustituir con vistas a mejorar la estabilidad a la oxidación incluyen el único residuo de cisteína (C363) y los residuos de metionina situados en las posiciones M8, M9, M96, M200, M206, M284, M307, M311, M316 y M438 en la SEQ ID Nº 2. 40

[0139] Con respecto a incrementar la estabilidad térmica de un variante de α-amilasa relacionada con su α-amilasa original, parece ser particularmente deseable eliminar al menos uno, y preferiblemente dos o incluso tres, de los siguientes residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº 2 que son F178, R179, G180, I181, G182 y K183. Deleciones de este tipo en parejas particularmente valiosas son R179*+G180*; y I181*+G182* (SEQ ID Nº 16 o 15, respectivamente) (o equivalentes de estas deleciones en 45 parejas en otra α-amilasa que cumple los requisitos de una α-amilasa original en el contexto de la presente descripción).

[0140] Otras mutaciones de interés incluyen N193F y V416G, como se ejemplifica en la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEQ ID Nº 2.

V. Métodos para preparar variantes de α-amilasa 50

[0141] En la técnica se conocen varios métodos para introducir mutaciones en los genes. Tras una breve exposición de la clonación de secuencias de ADN que codifican α-amilasas, se expondrán métodos para generar mutaciones en sitios específicos dentro de la secuencia que codifica α-amilasas.

A. Clonación y expresión de ácidos nucléicos que codifican una α-amilasa

[0142] La secuencia de ADN que codifica una α-amilasa original se puede aislar a partir de cualquier célula o microorganismo que produzca la α-amilasa en cuestión, utilizando diferentes métodos muy conocidos en la técnica. En primer lugar, se debería construir un ADN genómico y/o una genoteca de ADNc utilizando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la α-amilasa objeto de estudio. Entonces, si se 5 conoce la secuencia de aminoácidos de la α-amilasa, se pueden sintetizar sondas oligonucleótidas homólogas y marcadas y utilizarlas para identificar clones que codifiquen α-amilasas a partir de una genoteca genómica preparada a partir del organismo en cuestión. De forma alternativa, una sonda de oligonucleótidos marcada que contiene secuencias homólogas a un gen de α-amilasa conocido se podría utilizar como sonda para identificar clones que codifiquen α-amilasas, utilizando unas condiciones de hibridación y de lavado de menor rigor. 10

[0143] Otro método para identificar clones que codifican la α-amilasa implicaría insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transfomar bacterias de α-amilasa negativa con la genoteca de ADN genómico resultante, y después colocar en placas las bacterias transformadas sobre agar que contenga un sustrato para la α-amilasa, permitiendo de ese modo a los clones expresar la α-amilasa que se va a identificar. 15

[0144] De forma alternativa, la secuencia de ADN que codifica la enzima se puede preparar sintéticamente mediante métodos estándar establecidos, por ejemplo, el método de fosfoamidita descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers (1981) o el método descrito por Matthes et al. (1984). En el método de fosfoamidita se sintetizan oligonucleótidos, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático, se purifican, se aparean, se ligan y se clonan en vectores apropiados. 20

[0145] Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen mezclado genómico y sintético, de origen mezclado sintético y de ADNc o de origen mezclado genómico y de ADNc, preparado mediante la ligadura de fragmentos de origen sintético genómico o de ADNc (según convenga, los fragmentos correspondientes a diferentes partes de la secuencia completa de ADN), conforme a técnicas estándar. La secuencia de ADN también se puede preparar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) utilizando cebadores 25 específicos, por ejemplo según se describe en la patente estadounidense nº 4.683.202.

B. Mutagénesis dirigida

[0146] Una vez que se ha aislado una secuencia de ADN que codifica α-amilasas y se han identificado sitios deseables para la mutación, se pueden introducir mutaciones utilizando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados; se insertan 30 nucleótidos mutantes durante la síntesis de oligonucleótidos. En un método específico, se crea un espacio de ADN monocatenario, el cual conecta la secuencia que codifica la α-amilasa, en un vector que lleva el gen de la α-amilasa. Entonces se aparea el nucleótido sintético, el cual soporta la mutación deseada, con una parte homóloga del ADN monocatenario. El espacio restante se llena después con ADN polimerasa I (fragmento Klenow) y la construcción se liga utilizando ligasa T4. 35

[0147] Otro método para introducir mutaciones en secuencias de ADN que codifican α-amilasas implica la generación en 3 fases de un fragmento de PCR que contenga la mutación deseada introducida utilizando una hebra de ADN sintetizada químicamente como uno de los cebadores en las reacciones de PCR. A partir del fragmento generado mediante PCR, se puede aislar un fragmento de ADN que lleve la mutación mediante escisión con endonucleasas de restricción y reinsertarlo en un plásmido de expresión. 40

[0148] Los métodos alternativos para proporcionar variantes incluyen transposiciones genéticas, por ejemplo, como se describe en WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) o en WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S), u otras técnicas correspondientes que dan como resultado una enzima híbrida que comprende la(s) mutación(es), por ejemplo, la(s) sustitución(es) y/o la(s) eliminación(es) en cuestión.

C. Expresión de variantes de α-amilasa 45

[0149] Una secuencia de ADN que codifica una variante producida mediante los métodos descritos previamente, o mediante métodos alternativos, se puede expresar utilizando un vector de expresión, que incluye normalmente secuencias de control que codifican un promotor, un operador, un sitio de unión de ribosomas, una señal de inicio de traslado, y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.

[0150] El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una variante de α-50 amilasa puede ser cualquier vector que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinanto, y la elección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la cual se ha de introducir. De este modo, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, minicromosoma o un cromosoma artificial. De forma 55 alternativa, el vector puede ser uno que, al introducirlo en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el/los cromosoma(s) en el/los que se ha integrado.

[0151] La secuencia de ADN debería estar conectada operativamente a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección y que pueda derivarse de genes que codifican proteínas ya sean homólogas o heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de α-amilasa, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac de E. coli, 5 los promotores dagA del gen de agarasa de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de α-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, los promotores del gen de amilasa maltogénica de G. stearothermophilus (amyM), los promotores de la α-amilasa de B. amyloliquefaciens (amyQ), los promotores de los genes xylA y xylB de B. subtilis etc. Para la transcripción en un huésped fúngico, son ejemplos de promotores útiles aquellos derivados del gen que codifica la amilasa TAKA de A. oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la 10 α-amilasa neutra de A. niger, la α-amilasa estable en ácido de A. niger, la glucoamilasa de A. niger, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o la acetamidasa de A. nidulans.

[0152] El vector de expresión también puede comprender un terminador de transcripción adecuado y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación operativamente conectadas a la secuencia de ADN que codifica una 15 variante de α-amilasa. Las secuencias de terminación y poliadenilación pueden derivarse de manera adecuada de las mismas fuentes que el promotor.

[0153] El vector también puede comprender una secuencia de ADN que permita al vector replicarse en la célula huésped en cuestión. Son ejemplos de secuencias de este tipo los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19; pACYC177; pUB110; pE194, pAMB1 y pIJ702. 20

[0154] El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped, tal como los genes dal de B. subtilis o de B. licheniformis, o uno que confiere resistencia antibiótica como resistencia a la ampicilina, a la kanamicina, al cloranfenicol o a la tetraciclina. Además, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que da origen a resistencia a la higromicina, o la selección se puede realizar 25 mediante cotransformación, por ejemplo, como se describe en WO 91/17243.

[0155] Aunque la expresión intracelular puede ser ventajosa en algunos aspectos, por ejemplo, al utilizar ciertas bacterias como células huéspedes, generalmente se prefiere que la expresión sea extracelular. En general, las α-amilasas de Bacillus mencionadas en el presente documento comprenden una preregión que permite la secreción de la proteasa expresada en el medio de cultivo. Si se desea, se puede sustituir esta preregión por una 30 preregión diferente o secuencia señal, llevada a cabo convenientemente mediante la sustitución de las secuencias de ADN que codifican las respectivas preregiones.

[0156] Los procedimientos utilizados para ligar el constructo de ADN que codifica una variante de α-amilasa, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación, son muy conocidos por los expertos en la materia (por 35 ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor, 1989).

[0157] La célula que comprende un constructo de ADN o un vector de expresión se utiliza ventajosamente como célula huésped en la producción recombinante de una variante de α-amilasa. La célula se puede transformar con el constructo de ADN que codifica la variante, integrando convenientemente el constructo de ADN (en una o varias copias) en el cromosoma huésped. Esta integración se considera generalmente como una ventaja puesto 40 que es más probable que la secuencia de ADN se mantenga establemente en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped se puede realizar según métodos convencionales, por ejemplo, mediante recombinación homóloga o heteróloga. De forma alternativa, la célula se puede transformar con un vector de expresión como se describe previamente en relación con los diferentes tipos de células huésped.

[0158] La célula puede ser una célula de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, pero 45 preferiblemente es una célula microbiana, por ejemplo, una célula bacteriana o fúngica (incluyendo la levadura).

[0159] Son ejemplos de bacterias adecuadas las bacterias Gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E. coli. La 50 transformación de las bacterias se puede efectuar, por ejemplo, mediante transformación de los protoplastos o utilizando células competentes de una manera conocida per se.

[0160] El organismo de levadura se puede seleccionar favorablemente de una especie de Saccharomyces o Schizosaccharomyces, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae. El hongo filamentoso puede pertenecer ventajosamente a una especie de Aspergillus, por ejemplo, A. oryzae o A. niger. Las células fúngicas se pueden 55 transformar mediante un proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida de la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. En EP 238 023 se describe un procedimiento adecuado para transformar células huésped de Aspergillus.

[0161] Un aspecto de las presentes composiciones y métodos se refiere a producir una variante de α-amilasa cultivando una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción de la variante de amilasa y la recuperación de la variante de amilasa a partir de las células y/o el medio de cultivo. El medio utilizado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar la célula huésped en cuestión y obtener la expresión de la variante de α-amilasa. Los medios adecuados se encuentran disponibles a partir de 5 proveedores comerciales o se pueden preparar según recetas publicadas (por ejemplo, como se describe en catálogos de la ATCC).

[0162] La variante de α-amilasa segregada a partir de las células huésped se puede recuperar convenientemente a partir del medio de cultivo mediante procedimientos muy conocidos, que incluyen la separación de las células del medio mediante centrifugación o filtración, y la precipitación de componentes proteínicos del medio mediante 10 una sal tal como sulfato de amonio, seguida de la utilización de procedimientos cromatográficos tales como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad, o similares.

VI. Aplicaciones industriales

[0163] Las presentes variantes de α-amilasa poseen propiedades valiosas que permiten diferentes aplicaciones industriales. Por ejemplo, las variantes se pueden utilizar para el procesamiento/conversión de almidón, por 15 ejemplo, para la licuefacción del almidón (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 3.912.590, la solicitud de patente EP nos 252 730 y 63 909, WO 99/19467, y WO 96/28567).

[0164] Las variantes pueden ser útiles además en la producción de edulcorantes y etanol (véase, por ejemplo, la patente estadounidense nº 5.231.017), tales como, etanol para combustible, para bebidas o industrial, a partir de almidón o de granos enteros. Las variantes pueden ser útiles además en la fabricación o elaboración de cerveza. 20 Las variantes pueden estar en forma de composiciones, que pueden incluir además, por ejemplo, una glucoamilasa, una pululanasa y otra α-amilasa, además de tampones adecuados, agentes estabilizadores, conservantes y similares.

[0165] Las variantes de amilasa también son útiles para el lavado de ropa, para el lavado de vajilla y para la limpieza de superficies duras, como componentes de composiciones detergentes. Las variantes también pueden 25 ser útiles para el desaprestado de textiles, tejidos y prendas (véase, por ejemplo, WO 95/21247, la patente estadounidense Nº 4.643.736, EP 119.920), y en la producción de pulpa y de papel.

[0166] Estos y otros usos de las presentes composiciones y métodos se describen con más detalle más adelante en el texto.

A. Aplicaciones de procesamiento de grano y de conversión de almidón 30

[0167] Las aplicaciones de procesamiento de grano y de conversión de almidón se dividen en dos categorías, a saber (1) conversión de almidón general, que abarca la conversión de almidón en, por ejemplo, maltodextrinas, jarabe de dextrosa y jarabe de alto contenido en fructosa, (2) producción de etanol, y (3) elaboración de cerveza. Aunque muchas etapas implicadas en estos procesos son similares, se describen por separado. En algunos casos, la variante de α-amilasa se utiliza en combinación con una fitasa (4). También se describen 35 composiciones para llevar a cabo estas aplicaciones (5).

1. Conversión de almidón general

[0168] Los procesos de conversión de almidón convencionales, tales como los procesos de licuefacción y de sacarificación, se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense nº 3.912.590 y en las publicaciones de patentes EP nos 252.730 y 63.909. Generalmente, el proceso de conversión de almidón degrada el almidón a 40 componentes de carbohidratos de peso molecular más bajo. En el caso de convertir el almidón en un azúcar, el almidón se despolimeriza en un proceso que implica una etapa de pretratamiento y dos o tres etapas de procesos consecutivos, es decir, un proceso de licuefacción, un proceso de sacarificación y, dependiendo del producto final deseado, un proceso de isomerización opcional.

a. Pretratamiento de almidón nativo/crudo 45

[0169] El almidón nativo/crudo consiste en gránulos microscópicos, que son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando se calienta una suspensión de almidón acuosa, los gránulos se hinchan y finalmente explotan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de “gelatinización”, se da un incremento espectacular en la viscosidad. Puesto que el nivel en los sólidos es de 30 % - 40 % en un proceso industrial típico, el almidón tiene que diluirse o “licuificarse” para poder manejarlo. Esta reducción en la 50 viscosidad se obtiene convencionalmente mediante degradación enzimática.

b. Licuefacción

[0170] Durante la etapa de licuefacción, se degradan moléculas de almidón de cadena larga en moléculas lineales y ramificadas más cortas (maltodextrinas) mediante una α-amilasa. El proceso de licuefacción generalmente se lleva a cabo a aroximadamente 105 °C-110 °C durante aproximadamente de 5 a 10 minutos 55

seguido de 1-2 horas a 95 °C. El pH está normalmente entre aproximadamente 5.5 y 6.2. Con el fin de asegurar una estabilidad enzimática óptima bajo estas condiciones, normalmente se añade 1 mM de calcio (40 ppm de iones sin calcio). Después de este tratamiento, el almidón licuificado tendrá un “equivalente de dextrosa” (DE) de 10-15.

c. Sacarificación 5

[0171] Después del proceso de licuefacción, las maltodextrinas se convierten en dextrosa mediante la adición de una glucoamilasa (por ejemplo, OPTIDEX® L-400) y una enzima desramificante, tal como una isoamilasa (patente estadounidense nº 4.335.208) o una pululanasa. Antes de esta etapa, el pH se reduce a un valor por debajo de aproximadamente 4.5, mientras se mantiene la temperatura alta (por encima de 95 °C), para inactivar la α-amilasa licuefactante para reducir la formación de oligosacáridos cortos llamados “precursores de panosa” 10 que la enzima desramificante no puede hidrolizar correctamente. La temperatura se baja a 60 °C y se añaden la glucoamilasa y la enzima desramificante. El proceso de sacarificación continúa durante 24-72 horas.

[0172] Normalmente, cuando se desnaturaliza la α-amilasa después de la etapa de licuefacción, aproximadamente 0,2 % - 0,5 % del producto de sacarificación es el trisacárido ramificado Glc pα1-6Glc pα1-4Glc (panosa), que no puede degradarse mediante una pululanasa. Si la amilasa activa de la etapa de 15 licuefacción está presente durante la sacarificación (es decir, sin desnaturalizar), este nivel puede ser tan alto como 1 % - 2 %, que es altamente indeseable puesto que disminuye el rendimiento de la sacarificación significativamente.

d. Isomerización

[0173] Cuando el producto de azúcar final deseado es, por ejemplo, jarabe de alto contenido en fructosa, el 20 jarabe de dextrosa se puede convertir en fructosa. Después del proceso de sacarificación, se aumenta el pH a un valor comprendido en el intervalo de aproximadamente 6-8, preferiblemente pH 7.5, y se elimina el calcio mediante intercambio iónico. El jarabe de dextrosa se convierte entonces en jarabe de alto contenido en fructosa utilizando, por ejemplo, una glucosa isomerasa inmovilizada (tal como GENSWEET® IGI-HF).

2. Producción de etanol 25

[0174] En la producción de alcohol (etanol) general a partir de granos enteros se puede separar en 4 etapas principales, es decir, (a) molienda, (b) licuefacción, (c) sacarificación, y (d) fermentación. Algunas de estas etapas son similares a las descritas previamente.

a. Molienda y producción de suspensión

[0175] Un sustrato que contiene almidón, tal como grano, maíz, milo, o similar, se muele para abrir la estructura y 30 permitir procesamiento adicional. Los dos procesos utilizados se denominan generalmente molienda en húmedo o en seco. En la molienda en seco, se muele grano entero y se utiliza en la parte restante del proceso. La molienda en húmedo separa eficazmente el germen y la harina (gránulos de almidón y proteína) y se aplica, con unas cuantas excepciones, en lugares en donde existe una producción similar de jarabes.

[0176] El material que contiene almidón molido se combina con agua y se recicla la vinaza dando como resultado 35 una suspensión acuosa. La suspensión comprenderá entre 15 % y 55 % de residuo seco en peso/peso (por ejemplo, entre 20 % y 50 %, entre 25 % y 50 %, entre 25 % y 45 %, entre 25 % y 40 %, entre 20 % y 35 % y entre 30 % y 36 % de residuo seco). La vinaza reciclada (conocida también como “backset”) está normalmente en el intervalo de 10 % a 70 % en volumen/volumen (por ejemplo, de 10 % a 60 %, de 10 % a 50 %, de 10 % a 40 %, de 10 % a 30 %, de 10 % a 20 %, de 20 % a 60 %, de 20 % a 50 %, de 20 % a 40 % y también de 20 % a 40 30 %). De 25 % a 40 % de residuo seco es bastante común.

[0177] Una vez que el material que contiene almidón molido se combina con agua y backset, normalmente el pH no se ajusta en la suspensión. Además, el pH no se ajusta después de la adición de la fitasa (véase más adelante) y la α amilasa a la suspensión. El pH de la suspensión estará normalmente en el intervalo comprendido entre pH 4.5 y menos de 6.0 (por ejemplo, pH entre 4.5 y 5.8, pH entre 4.5 y 5.6, pH entre 4.8 y 5.8, pH entre 5.0 45 y 5.8, pH entre 5.0 y 5.4, pH entre 5.2 y 5.5 y pH entre 5.2 y 5.9). El pH de la suspensión puede estar entre pH 4.5 y 5.2 dependiendo de la cantidad de vinaza añadida a la suspensión y del tipo de material que comprende la vinaza fina. Por ejemplo, el pH de la vinaza puede estar entre pH 3.8 y pH 4.5. La Tabla B ilustra el cambio de pH que tiene lugar con la adición de cantidades crecientes de vinaza a una suspensión de maíz molido entero (32 % de residuo seco) después de agitarla durante 2 horas a 155 °F. 50

Tabla B. Cambio de pH que tiene lugar con la adición de cantidades crecientes de vinaza

% peso/peso de vinaza: pH final

: 5.52

: 5.29

: 5.16

: 5.09

: 5.05

: 4.98

: 4.94

[0178] Cabe mencionar que durante la producción de etanol se pueden añadir ácidos para disminuir el pH de la cerveza con el fin de reducir el riesgo de contaminación microbiana antes de la destilación.

[0179] En algunos casos, se añade fitasa a la suspensión. Las fitasas se describen con más detalle más adelante en el texto. En algunos casos, se añade una α-amilasa a la suspensión. En algunos casos, se añade 5 una fitasa y una α-amilasa a la suspensión secuencialmente. En algunos casos, se añaden una fitasa y una α-amilasa simultáneamente. En algunos casos, la suspensión que comprende la fitasa y la α-amilasa se incuba (pretrata) durante un periodo comprendido entre 5 minutos y 8 horas (por ejemplo, entre 5 minutos y 6 horas, entre 5 minutos y 4 horas, entre 5 minutos y 2 horas y entre 15 minutos y 4 horas). En otros casos, la suspensión se incuba a una temperatura comprendida entre 40 °C y 115 °C (por ejemplo, entre 45 °C y 80 °C, entre 50 °C y 10 70 °C, entre 50 °C y 75 °C, entre 60 °C y 110 °C, entre 60 °C y 95 °C, entre 70 °C y 110 °C, entre 70 °C y 85 °C y entre 77 °C y 86 °C).

[0180] En algunos casos, la suspensión se incuba a una temperatura comprendida entre 0 °C y 30 °C (por ejemplo, entre 0 °C y 25 °C, entre 0 °C y 20 °C, entre 0 °C y 15 °C, entre 0 °C y 10 °C y entre 0 °C y 5 °C) por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón del material que contiene almidón. En algunos casos, la 15 temperatura está por debajo de 68 °C, por debajo de 65 °C, por debajo de 62 °C, por debajo de 60 °C, o incluso por debajo de 55 °C. En algunos modos de realización, la temperatura está por encima de 45 °C, por encima de 50 °C, por encima de 55 °C, e incluso por encima de 60 °C. La incubación de la suspensión que comprende una fitasa y una α-amilasa a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón se puede denominar una licuefacción primaria (1ª). 20

[0181] Actualmente, se cree que las α-amilasas microbianas disponibles comercialmente utilizadas en el proceso de licuefacción no son suficientemente estables para producir un sustrato de almidón licuificado a partir de un proceso de molienda seco utilizando grano entero molido a una temperatura por encima de aproximadamente 80 °C con un pH menor que pH 5.6. Generalmente, la estabilidad de muchas α-amilasas disponibles comercialmente se reduce a un pH inferior a aproximadamente 4.0. 25

b. Licuefacción

[0182] En el proceso de licuefacción, los gránulos de almidón se solubilizan mediante hidrólisis a maltodextrinas en su mayor parte de un DP mayor de 4. La materia prima puede ser grano entero molido o una corriente lateral del procesamiento del almidón. El grano molido y licuificado se conoce también como masa. La hidrólisis se puede llevar a cabo mediante el tratamiento con ácido o enzimáticamente mediante α-amilasa. La hidrólisis con 30 ácido se utiliza de forma limitada.

[0183] La licuefacción enzimática normalmente se lleva a cabo en un proceso de suspensión en caliente de tres etapas. La suspensión se calienta a entre 60 °C y 95 °C (preferiblemente entre 77 °C y 86 °C , entre 80 °C y 85 °C y entre 83 °C y 85 °C) y se añade(n) la(s) enzima(s). Entonces la suspensión se cuece con vapor a presión (jet cooking) a entre 95 °C y 140 °C, preferiblemente entre 105 °C y 125 °C, se enfría a entre 60 °C y 95 °C y se 35 añade(n) más enzima(s) para obtener la hidrólisis final. El proceso de licuefacción se lleva a cabo con un pH comprendido entre 4.0 y 6.5, normalmente con un pH comprendido entre 5 y 6.

[0184] La suspensión se puede incubar con una α-amilasa y, opcionalmente, una fitasa (descrita en el presente documento) e incubarse durante 5 minutos a 2 horas, a una temperatura comprendida entre 60 °C y 75 °C. En una etapa de licuefacción adicional, el material que contiene almidón incubado o pretratado puede estar 40 expuesto a un incremento de la temperatura tal como de 0 °C a 45 °C por encima de la temperatura de gelatinización del almidón del material que contiene almidón (por ejemplo, de 70 °C a 120 °C, de 70 °C a 110 °C, y de 70 °C a 90 °C) durante un periodo de tiempo de 2 minutos a 6 horas (por ejemplo, de 2 minutos a 4 horas, 90 minutos, 140 minutos y de 90 a 140 minutos) con un pH comprendido entre aproximadamente 4.0 y 5.5, más preferiblemente entre 1 hora y 2 horas. Se puede aumentar la temperatura mediante un sistema jet cooking 45 convencional de alta temperatura durante un periodo de tiempo corto, por ejemplo de 1 a 15 minutos. Entonces el almidón se puede hidrolizar de forma adicional a una temperatura comprendida entre 75 °C y 95 °C, (por ejemplo, entre 80 °C y 90 °C y entre 80 °C y 85 °C) durante un periodo de tiempo de 15 a 150 minutos (por ejemplo, de 30 a 120 minutos). El pH puede no ajustarse durante estas etapas de procesamiento y el pH de la masa licuificada está comprendido entre pH 4.0 y pH 5.8 (por ejemplo, pH entre 4.5 y 5.8, pH entre 4.8 y 5.4, y 50 pH entre 5.0 y 5.2). En algunos modos de realización, se añadirá una segunda dosis de α-amilasa termoestable a la etapa de licuefacción secundaria, pero en otros modos de realización, no habrá una dosis adicional de α-amilasa.

[0185] Las etapas de incubación y licuefacción pueden estar seguidas por las etapas de sacarificación y fermentación. 55

c. Fermentación

[0186] Los azúcares fermentables obtenidos durante las etapas de proceso de licuefacción se pueden utilizar para producir alcohol, en concreto etanol, mediante fermentación microbiana. El organismo utilizado en las fermentaciones dependerá del producto final deseado.

[0187] Normalmente, si el etanol es el producto final deseado se utilizará la levadura como organismo de 5 fermentación. En algunos modos de realización preferidos, el organismo que produce etanol es una levadura y específicamente Saccharomyces tal como cepas de S. cerevisiae (patente estadounidense 4.316.956). Diversas S. cerevisiae están comercialmente disponibles e incluyen, pero sin carácter limitativo, FALI (Fleischmann's Yeast), SUPERSTART (Alltech), FERMIOL (DSM Specialties), RED STAR (Lesaffre) y Angel alcohol yeast (Angel Yeast Company, China). La cantidad de levadura inicial empleada en los métodos es una cantidad 10 efectiva para producir un cantidad de etanol comercialmente significante en una cantidad de tiempo adecuada, (por ejemplo, para producir al menos 10 % de etanol a partir de un sustrato que tiene entre 25 % y 40 % de residuo seco en menos de 72 horas). Las células de levadura se proporcionan generalmente en cantidades de 104 a 1012, y preferiblemente de 107 a 1010 de levadura viable por ml de caldo de fermentación. La fermentación incluirá además de un microorganismo de fermentación (por ejemplo, levadura), nutrientes, opcionalmente 15 enzimas adicionales, que incluyen, pero sin carácter limitativo, fitasas. La utilización de levadura en la fermentación se conoce muy bien y se hace referencia a THE ALCOHOL TEXTBOOK, K. JACQUES ET AL., EDS. 1999, NOTTINGHAM UNIVERSITY PRESS, REINO UNIDO. La fermentación de la levadura se lleva a cabo normalmente durante de 24 a 96 horas, normalmente de 35 a 60 horas. La temperatura de la fermentación está comprendida normalmente entre 26 °C y 34 °C, por ejemplo, aproximadamente 32 °C, y el pH está entre 20 aproximadamente 3 y 6, preferiblemente alrededor de 4 y 5.

[0188] Utilizando microorganismos de fermentación apropiados, se pueden obtener otros productos finales, que incluyen, pero sin carácter limitativo, glicerol, 1,3-propanodiol, gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato, ácido 2-ceto-L-gulónico, ácido succínico, ácido láctico, amino ácidos y derivados de los mismos. Por ejemplo, cuando el ácido láctico es el producto final deseado, se puede utilizar una Lactobacillus sp. (L. casei). 25 Cuando el glicerol o el 1,3-propanodiol son los productos finales deseados, se puede utilizar E. coli. Cuando el 2-ceto-D-gluconato, el 2,5-diceto-D-gluconato, y el ácido 2-ceto-L-gulónico son los productos finales deseados, se puede utilizar Pantoea citrea.

d. Sacarificación y SSF

[0189] El material que contiene almidón licuificado se sacarifica en presencia de enzimas de sacarificación tales 30 como glucoamilasas. El proceso de sacarificación puede durar de 12 horas a 120 horas (por ejemplo, de 12 a 90 horas, de 12 a 60 horas y de 12 a 48 horas). No obstante, es común llevar a cabo una etapa de presacarificación de aproximadamente 30 minutos a 2 horas (por ejemplo, de 30 a 90 minutos) en un intervalo de temperaturas comprendido entre 30 °C y 65 °C, normalmente por encima de 50 °C y a menudo alrededor de 60 °C, que es seguida por una sacarificación completa durante la fermentación. A esta última etapa se le puede denominar 35 sacarificación y fermentación simultánea (SSF, por sus siglas en inglés). La SSF es común en la producción de etanol, donde las enzimas de sacarificación y los organismos de fermentación (por ejemplo, levadura) se añaden conjuntamente y entonces se lleva a cabo a una temperatura de 30 °C a 40 °C y con un pH entre 4.2 y 4.8, preferiblemente pH 4.5.

[0190] Los azúcares fermentables (por ejemplo, dextrinas, monosacáridos, particularmente glucosa) se producen 40 a partir de sacarificación enzimática. Estos azúcares fermentables se pueden purificar adicionalmente y/o convertir en productos de azúcar útiles. Además, los azúcares se pueden utilizar como materia prima de fermentación en un proceso de fermentación microbiana para producir productos finales, tales como alcohol (por ejemplo, etanol y butanol), ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido succínico y ácido láctico), alcoholes de azúcar (por ejemplo, glicerol), compuestos intermedios de ácido ascórbico (por ejemplo, 2-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-45 D-gluconato y ácido 2-ceto-L-gulónico), aminoácidos (por ejemplo, lisina), proteínas (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de los mismos).

e. Destilación

[0191] Opcionalmente, después de la fermentación se puede recuperar alcohol (por ejemplo, etanol) mediante destilación. La producción de etanol es normalmente al menos 8 %, al menos 10 %, al menos 12 %, al menos 50 14 %, al menos 15 %, al menos 16 %, al menos 17 %, al menos 18 % (volumen/volumen), y en algunos casos, al menos 19 %, al menos 20 %, al menos 21 %, al menos 22 %, e incluso al menos 23 % (volumen/volumen). El etanol obtenido se puede utilizar como, por ejemplo, etanol para combustibles, etanol para bebidas, es decir, alcohol neutro potable; o etanol industrial.

f. Subproductos 55

[0192] El residuo del proceso de fermentación es el grano ya procesado, que normalmente se utiliza para piensos ya sea en forma líquida o seca. El grano ya procesado puede tomar la forma de los denominados

“coproductos de fermentación”, tales como granos secos de destilería (DDG) y granos secos de destilería con solubles (DDGS), que también se pueden utilizar en piensos.

3. Elaboración de cerveza

[0193] Las presentes variantes de α-amilasas pueden ser útiles en un proceso de elaboración de cerveza. Normalmente, las α-amilasas se añaden durante el proceso de macerado, donde se obtienen sus ventajas, en 5 términos de estabilidad, actividad específica y similares, como en el caso de la conversión del almidón.

4. Utilización de variantes de α-amilasas en combinación con otras enzimas

[0194] En todos los aspectos de la licuefacción, la sacarificación, la SSF y el procesamiento de carbohidratos, generalmente, los presentes polipéptidos de variante de α-amilasa se pueden utilizar en combinación con una o más enzimas de adición, por ejemplo, una α-amilasa adicional, una glucoamilasa, una isoamilasa, una β-amilasa, 10 una amilasa maltogénica, una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, una esterasa, una oxidasa, una pectinasa, una pectina liasa, una cutinasa, una lacasa y/o una fitasa. Muchas de estas enzimas se describen con más detalle con relación a aplicaciones de limpieza.

[0195] Las fitasas son enzimas capaces de descomponer el ácido fítico (fitato) que se encuentra en los granos y en las semillas oleaginosas. Se cree que el fitato, así como compuestos intermedios en su degradación, 15 desestabilizan o afectan adversamente de otra manera a las α-amilasas, reduciendo así su eficiencia.

[0196] Las fitasas que se pueden utilizar en combinación con variantes de α-amilasas son capaces de hidrolizar ácido fítico bajo las condiciones definidas de las etapas de incubación y licuefacción. En algunos modos de realización, la fitasa es capaz de liberar al menos un fosfato inorgánico de un hexafosfato de inositol (ácido fítico). Las fitasas se pueden agrupar según su preferencia por una posición específica del grupo éster fosfato en 20 la molécula de fitato en la que se inicia la hidrólisis (por ejemplo, como 3-fitasas (EC 3.1.3.8) o como 6-fitasas (EC 3.1.3.26)). Un ejemplo típico de fitasa es mio-inositol-hexakisfosfato-3-fosfohidrolasa.

[0197] Las fitasas se pueden obtener de microorganismos tales como organismos fúngicos y bacterianos. Algunos de estos microorganismos incluyen, por ejemplo, Aspergillus (por ejemplo, A. niger, A. terreus, A. ficum y A. fumigatus), Myceliophthora (M. thermophila), Talaromyces (T. thermophilus) Trichoderma spp (T. reesei). y 25 Thermomyces (WO 99/49740). También las fitasas están disponibles de especies de Penicillium, por ejemplo, P. hordei (ATCC Nº 22053), P. piceum (ATCC Nº 10519), o P. brevi-compactum (ATCC Nº 48944). Véase, por ejemplo, la patente estadounidense 6.475.762. Además, las fitasas están disponibles de Bacillus (por ejemplo, B. subtilis, Pseudomonas, Peniophora, E. coli, Citrobacter, Enterbacter y Buttiauxella (véase WO2006/043178).

[0198] Las fitasas comerciales están disponibles tales como NATUPHOS® (BASF), RONOZYME® P 30 (Novozymes A/S), PHZYME® (Danisco A/S, Diversa) y FINASE® (AB Enzymes). El método para determinar la actividad de fitasa microbiana y la definición de una unidad de fitasa ha sido publicada por Engelen et al. (1994) J. AOAC Int. 77:760 - 764. La fitasa puede ser una fitasa natural, una variante o un fragmento de la misma.

[0199] Los ejemplos de fitasas se derivan de especies de la bacteria Buttiauxiella. La Buttiauxiella spp. incluye B. agrestis, B. brennerae, B. ferragutiase, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae, y B. warmboldiae. Cepas de la 35 especie Buttiauxella están disponibles en DSMZ, el Centro nacional de recursos de material biológico alemán (Inhoffenstrabe 7B, 38124 Braunschweig, Alemania). La cepa P1-29 de Buttiauxelia sp. depositada con el número de muestreo NCIMB 41248 es un ejemplo de una cepa especialmente útil de la que se puede obtener una fitasa. La fitasa puede ser BP-natural, una variante de la misma (tal como BP-11) descrita en WO 06/043178, o una variante como se describe en la publicación patente estadounidense nº US20080220498, presentada el 6 40 de marzo de 2007 (véase, por ejemplo, la Tabla 1 y la SEQ ID Nº 3).

[0200] La fitasa también puede ser la variante BP-17 de la fitasa de Buttiauxiella, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 19, que se muestra a continuación, o una fitasa que tenga al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 88 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % e incluso al menos 99 % de identidad de 45 secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID Nº 19.

[0201] La cantidad (dosis) de fitasa utilizada en los procesos de incubación y/o licuefacción puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,001 a 50 FTU/g de residuo seco, (por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,01 a 25 FTU/g de residuo seco, de aproximadamente 0,01 a 15 FTU/g de residuo seco, de aproximadamente 0,01 a 10 FTU/g de residuo seco, de aproximadamente 0,05 a 15 FTU/g de residuo seco, y de aproximadamente 0,05 a 5,0 FTU/g. 5

5. Composiciones para el procesamiento del grano y la conversión del almidón

[0202] Un aspecto de las presentes composiciones y métodos es una composición que comprende una o varias de las variantes de α-amilasas para utilizarse en la conversión de almidón, que incluye la conversión de almidón general, la fermentación de alcohol, la elaboración de cerveza y similares. Tales composiciones pueden incluir tampones, sales, minerales, estabilizantes, conservantes, agentes antimicrobianos, tintes, fragancias y similares, 10 seleccionados para proteger la(s) variante(s) de α-amilasa(s) de una degradación prematura (incluyendo la proteólisis), para prolongar el almacenamiento, mejorar la apariencia, asignar un código de color a la composición y similares.

[0203] Las composiciones pueden incluir además enzimas adicionales en relación con la conversión de almidón, que incluyen, por ejemplo, glucoamilasas y fitasas. Glucoamilasas concretas son G1 o G2 AMG de Aspegillis 15 niger, que se describen en Boel et al. (1984) EMBO J. 3:1097-1102 o una variante de las mismas, como se describe en WO 00/04136 o en WO 01/04273), la AMG de Talaromyces emersonii, como se describe en WO 99/28448, o la glucoamilasa de Trichoderma reesei, como se describe en WO 06/060062.

B. Producción de pulpa y papel

[0204] Las presentes variantes de α-amilasas también se pueden utilizar en la producción de materiales 20 lignocelulósicos, tales como pulpa, papel y cartón, a partir de papel y cartón usados reforzados con almidón, especialmente cuando el repulpeo ocurre con un pH por encima de 7, y cuando las amilasas facilitan la desintegración del material residual a través de la degradación del almidón de refuerzo. Las variantes de α-amilasas son especialmente útiles en un proceso para producir una pulpa para fabricar papel a partir de papel impreso recubierto con almidón. El proceso se puede llevar a cabo como se describe en WO 95/14807, y 25 comprende las etapas de: (a) desintegrar el papel para producir una pulpa, (b) tratarla con una enzima que degrade el almidón antes, durante o después de la etapa (a), y (c) separar las partículas de tinta de la pulpa después de las etapas (a) y (b).

[0205] Las α-amilasas también pueden ser útiles cuando se utiliza el almidón enzimáticamente modificado en la fabricación del papel junto con cargas alcalinas tales como carbonato de calcio, caolín y arcillas. Con las 30 presentes variantes de α-amilasas es posible modificar el almidón en presencia de la carga, permitiendo de esta manera un proceso integrado más simple.

C. Desaprestado de textiles, tejidos y prendas

[0206] Las presentes variantes de α-amilasas también pueden ser útiles en el desaprestado de textiles, tejidos o prendas. En la industria del procesamiento textil, las α-amilasas se utilizan tradicionalmente como auxiliares en el 35 proceso de desaprestado para facilitar la eliminación del apresto que contiene almidón, que ha servido como un recubrimiento protector de los hilos de tramas durante el tejido. La eliminación completa del apresto después del tejido es importante para asegurar resultados óptimos en los procesos posteriores, en los que el tejido se descruda, se blanquea y se tiñe. Se prefiere la descomposición enzimática del almidón debido a que no implica ningún efecto dañino en el material de las fibras. 40

[0207] Con el fin de reducir el coste del procesamiento y aumentar el rendimiento de la molienda, algunas veces se combina el procesamiento del desaprestado con las etapas de descrudado y blanqueo. En tales casos, se utilizan los auxiliares no enzimáticos tales como el álcali o los agentes de oxidación para descomponer el almidón, puesto que las α-amilasas tradicionales no son muy compatibles con niveles de pH altos ni con agentes de blanqueo. La descomposición no enzimática del apresto del almidón causa algunos daños en las fibras debido 45 a las sustancias químicas más bien agresivas utilizadas. Por consiguiente, sería deseable utilizar las variantes de α-amilasas que ofrecen un rendimiento mejorado en soluciones alcalinas. Tales variantes se pueden utilizar solas o en combinación con una celulasa en el desaprestado de tejidos o textiles que contienen celulosa.

[0208] Los procesos de desaprestado y blanqueo son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, tales procesos se describen en WO 95/21247, en la patente estadounidense nº 4.643.736, en EP 119.920. Los productos 50 actuales comercialmente disponibles para el desaprestado incluyen OPTISIZE® FLEX de Genencor.

D. Composiciones de limpieza y composiciones detergentes

[0209] Las presentes variantes de α-amilasas se pueden añadir y convertirse de esta manera en un componente de una composición detergente. La composición detergente se puede formular como un detergente para lavar la ropa a mano o a máquina, que incluye una composición aditiva de lavado de ropa adecuada para el 55 pretratamiento de tejidos manchados y una composición suavizante de tejidos añadida en el aclarado. La composición detergente también se puede formular para operaciones de lavado de vajilla a mano o a máquina, o

para utilizarse en operaciones de limpieza de superficies duras domésticas generales. En general, las propiedades de la variante de α-amilasa deberían ser compatibles con el detergente seleccionado en términos de su pH y otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos.

[0210] La composición de detergente o el aditivo pueden comprender una o varias enzimas adicionales tales como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica (por ejemplo, otra α-amilasa), una 5 glucoamilasa, una amilasa maltogénica, una CGTasa y/o una celulosa mananasa (tal como MANNASTAR™ de Danisco US Inc., Genencor Division), una pectinasa, una pectina liasa, una cutinasa y/o una lacasa, que se describen con más detalle a continuación:

[0211] Proteasas: Las proteasas adecuadas se pueden derivar de cualquier organismo e incluyen variantes químicamente modificadas o creadas. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, 10 preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son las subtilisinas, especialmente las derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (descritas en WO 89/06279). Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son la tripsina (por ejemplo, de origen bovino o porcino) y la proteasa de Fusarium descrita en WO 89/06270 y WO 94/25583. 15

[0212] Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en WO98/23732, WO99/20770, WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o varias de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 94, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.

[0213] Las enzimas de proteasa comercialmente disponibles preferidas incluyen ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURALASE®, ESPERASE®, y KANNASE® (de Novozymes A/S), MAXATASE®, MAXACAL, 20 MAXAPEM®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT OXP®, FN2®, FN3®, FN4® (Genencor International Inc.).

[0214] Lipasas: Las lipasas adecuadas incluyen las de origen fúngico o bacteriano e incluyen variantes químicamente modificadas o creadas. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo de Thermomyces), por ejemplo, de H. lanuginosa (T. Lanuginosus), como se describe en EP 258 068 y en EP 25 305 216 o de H. insolens, como se describe en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas, por ejemplo de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1.372.034), P. fluorescens, cepa SD 705 de Pseudomonas sp. (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus, por ejemplo, de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophyisica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422). Otros ejemplos son 30 variantes de lipasas tales como las descritas en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202. Las enzimas de lipasa comercialmente disponibles preferidas incluyen LIPOLASE™ y LIPOLASE ULTRA™ (Novozymes A/S).

[0215] Amilasas: También se pueden añadir una o varias amilasas adicionales. Las amilasas adecuadas (α y/o 35 β) incluyen las de origen fúngico o bacteriano e incluyen variantes químicamente modificadas o creadas. Las amilasas incluyen, por ejemplo, α-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de B. licheniformis, descrita con más detalle en GB 1.296.839. Ejemplos de α-amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94/18314, WO 96/39528, WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, y WO 97/43424, especialmente las variantes con sustituciones en una o varias de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 40 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444. Las α-amilasas comercialmente disponibles son DURAMYL™, LIQUEZYME™ TERMAMY™, NATALASE™, FUNGAMYL™ y BANT™ (Novozymes A/S), RAPIDASE™ y PURASTAR™ (de Genencor).

[0216] Celulasas: Las celulasas adecuadas incluyen las de origen fúngico o bacteriano. Se incluyen los mutantes químicamente modificados o creados. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, 45 Pseudomonas, Trichoderma, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en la patente estadounidense nº 4.435.307, la patente estadounidense nº 5.648.263, la patente estadounidense nº 5.691.178, la patente estadounidense nº 5.776.757 y WO 89/09259. Las celulasas de Trichoderma reesei se describen en la patente estadounidense nº 4.689.297, la patente estadounidense nº 5.814.501, la patente estadounidense nº 50 5.324.649, WO 92/06221 y WO 92/06165. Las celulasas de Bacillus se describen en la patente estadounidense nº 6.562.612. Las celulasas comercialmente disponibles incluyen CELLUZYME®, y CAREZYME® (Novozymes A/S), CLAZINASE®, y PURADAX HA@ (Genencor International Inc.), y KAC-500(B)® (Kao Corporation).

[0217] Peroxidasas/Oxidasas: Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen las de origen vegetal, bacteriano o fúngico e incluyen las variantes químicamente modificadas o creadas. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen 55 peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. cinereus, y variantes de las mismas tales como las descritas en WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257. Las peroxidasas comercialmente disponibles incluyen GUARDZYME® (Novozymes A/S).

[0218] La(s) enzima(s) detergente(s) se puede(n) incluir en una composición detergente añadiendo aditivos independientes que contienen una o varias enzimas, o añadiendo una composición aditiva combinada que comprenda todas estas enzimas. Un aditivo detergente se puede formular como un líquido, una suspensión, una barra, una pastilla, un polvo, un granulado, una pasta, etc. Ejemplos de formulaciones de aditivos detergentes son granulados no pulverulentos y suspensiones o líquidos estabilizados. Un detergente líquido puede ser 5 acuoso, conteniendo normalmente hasta 70 % de agua y de 0 % a 30 % de disolvente orgánico, o no acuoso.

[0219] Los granulados no pulverulentos se pueden producir, por ejemplo, como se describe en las patentes estadounidenses nos 4.106.991 y 4.661.452 y opcionalmente se pueden recubrir mediante métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de recubrimiento ceroso son los productos de óxido de (poli)etileno (polietilenglicol, PEG) con pesos molares medios de 1.000 a 20 000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 10 50 unidades de óxido de etileno; etoxilatos de alcoholes grasos en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y en los que hay de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y monoglicéridos y diglicéridos y triglicéridos de ácidos grasos. En GB 1483591 se proporcionan ejemplos de materiales de recubrimiento que forman una película adecuados para aplicarse mediante técnicas de lecho fluido. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, estabilizarse añadiendo un poliol, tal como 15 propilenoglicol, un azúcar o un polialcohol, ácido láctico o ácido bórico, según los métodos establecidos. Las enzimas protegidas se pueden preparar según el método descrito en EP 238.216.

[0220] La composición detergente normalmente comprende uno o varios surfactantes, que pueden ser no iónicos (incluyendo semipolares), aniónicos, catiónicos y/o zwitteriónicos. Los surfactantes están normalmente presentes en un nivel de 0,1 % a 60 % en peso. Ejemplos de composiciones detergentes incluyen de aproximadamente 20 1 % a aproximadamente 40 % de un surfactante aniónico, tal como alquilbencenosulfonato lineal, α-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, α-sulfo éster metílico de ácido graso, jabón o ácido alquilo o alquenilsuccínico, y/o de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 40 % de un surfactante no iónico, tal como etoxilato de alcohol, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglucósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de 25 ácido graso, polihidroxi alquil amida de ácido graso, o derivados N-acilo N-alquilo de glucosamina ("glucamidas").

[0221] La composición detergente puede incluir 0 % a 65 % de mejorador de detergentes o de agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilendiaminotetraacético, ácido dietilentriaminopentaacético, ácido alquilo o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (por ejemplo, SKS-6 de Hoechst). La composición detergente puede incluir uno o varios 30 polímeros, tales como carboximetilcelulosa, poli(vinilpirrolidona), poli(etilenglicol), poli(vinil alcohol), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos tales como poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros ácido lauril metacrilato/acrílico.

[0222] El detergente puede contener un sistema de blanqueo, que puede incluir una fuente de H2O2 tal como perborato o percarbonato, que se puede combinar con un activador de blanqueo formador de perácido tal como 35 tetraacetiletilendiamina o nonanoiloxibencenosulfonato. De forma alternativa, el sistema de blanqueo puede comprender peroxiácidos de, por ejemplo, tipo amida, imida o sulfona.

[0223] La(s) enzima(s) de la composición detergente se pueden estabilizar utilizando agentes estabilizadores convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenoglicol o glicerol, un azúcar o un polialcohol, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático, o un derivado de 40 ácido fenilborónico tal como ácido borónico 4-formilfenil, y la composición se puede formular como se describe en, por ejemplo, WO 92/19709 y WO 92/19708.

[0224] La composición detergente también puede contener otros ingredientes de composiciones detergentes convencionales, tales como suavizantes de tejidos, arcillas, potenciadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensión de suciedad, agentes de redeposición anti suciedad, tintes, 45 bactericidas, blanqueadores ópticos, hidrótropos, inhibidores de decoloración o perfumes.

[0225] La variante de α-amilasa se debería presentar en una cantidad efectiva, que se puede determinar fácilmente utilizando los ensayos descritos en el presente documento. Como punto de partida, se contempla que se añada una (o varias) variante(s) de α-amilasa en una cantidad correspondiente a 0,01-100 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado, y preferiblemente aproximadamente 0,1-1 mg de proteína enzimática 50 por litro de solución de lavado. Un ejemplo de cantidad es aproximadamente 0,055 mg de proteína enzimática por litro de solución de lavado.

[0226] Ejemplos de composiciones detergentes para lavavajillas incluyen lo siguiente:

1) COMPOSICIÓN DE LAVAVAJILLAS AUTOMÁTICO EN POLVO

Surfactante no iónico: 0,4-2,5 %

Metasilicato de sodio: 0-20 %

Disilicato de sodio: 3-20 %

Trifosfato de sodio: 20-40 %

Carbonato de sodio: 0-20 %

Perborato de sodio: 2-9 %

Tetraacetiletilenodiamina (TAED): 1-4 %

Sulfato de sodio: 5-33 %

Enzimas: 0,0001-0,1 %

2) COMPOSICIÓN DE LAVAVAJILLAS AUTOMÁTICO EN POLVO

Surfactante no iónico (p. ej., etoxilato de alcohol): 1-2 %

Disilicato de sodio: 2-30 %

Carbonato de sodio: 10-50 %

Fosfonato de sodio: 0-5 %

Dihidrato de citrato trisódico: 9-30 %

Acetato de nitrilotrisodio (NTA): 0-20 %

Monohidrato de perborato sódico: 5-10 %

Tetraacetiletilenodiamina (TAED): 1-2 %

Polímero de poliacrilato (p. ej., copolímero de ácido maléico/ácido acrílico): 6-25 %

Enzimas: 0,0001-0,1 %

Perfume: 0,1-0,5 %

Agua: 5-10 %

3) COMPOSICIÓN DE LAVAVAJILLAS AUTOMÁTICO EN POLVO

Surfactante no iónico: 0,5-2,0 %

Disilicato de sodio: 25-40 %

Citrato de sodio: 30-55 %

Carbonato de sodio: 0-29 %

Bicarbonato de sodio: 0-20 %

Monohidrato de perborato sódico: 0-15 %

Tetraacetiletilenodiamina (TAED): 0-6 %

Copolímero de ácido maléico/ácido acrílico: 0-5 %

Arcilla: 1-3 %

Ácidos poliamínicos: 0-20 %

Poliacrilato de sodio: 0-8 %

Enzimas: 0,0001-0,1 %

4) COMPOSICIÓN DE LAVAVAJILLAS AUTOMÁTICO EN POLVO

Surfactante no iónico: 1-2 %

Zeolita MAP: 15-42 %

Disilicato de sodio: 30-34 %

Citrato de sodio: 0-12 %

Carbonato de sodio: 0-20 %

Monohidrato de perborato sódico: 7-15 %

Tetraacetil etileno: 0-3 %

Polímero diamina (TAED): 0-4 %

Copolímero de ácido maléico/ácido acrílico: 0-5 %

Fosfonato orgánico: 0-4 %

Arcilla: 1-2 %

Enzimas: 0,0001-0,1 %

Sulfato de sodio: Balance

5) COMPOSICIÓN DE LAVAVAJILLAS AUTOMÁTICO EN POLVO

Surfactante no iónico: 1-7 %

Disilicato de sodio: 18-30 %

Citrato de trisodio: 10-24 %

Carbonato de sodio: 12-20 %

Monopersulfato (2 KHSO5.KHSO4.K2SO4): 15-21 %

Estabilizador de blanqueo: 0,1-2 %

Copolímero de ácido maléico/ácido acrílico: 0-6 %

Pentaacetato de dietilentriamina, sal de pentasodio: 0-2,5 %

Enzimas: 0,0001-0,1 %

Sulfato de sodio, agua: Balance

6) COMPOSICIÓN DE LAVAVAJILLAS EN POLVO Y LÍQUIDO CON SISTEMA SURFACTANTE DE LIMPIEZA

Surfactante no iónico: 0-1,5 %

Octadecil dimetilamina N-óxido dihidrato: 0-5 %

80:20 en wt. de mezcla C18/C16 de octadecil dimetilamina N-óxido dihidrato y hexadecildimetilamina N-óxido dihidrato: 0-4 %

70:30 en wt. de mezcla C18/C16 de octadecil bis (hidroxietil)amina N-óxido anhidro y hexadecil bis (hidroxietil)amina N-óxido anhidro: 0-5 %

Etoxisulfato de alquilo C13-C15 con un grado medio de etoxilación de 3: 0-10 %

Etoxisulfato de alquilo C12-C15 con un grado medio de etoxilación de 3: 0-5 %

Etoxilato de alcohol C13-C15 con un grado medio de etoxilación de 12: 0-5 %

Una mezcla de etoxilatos de alcoholes C12-C15 con un grado medio de etoxilación de 9: 0-6,5 %

Una mezcla de etoxilatos de alcoholes C13-C15 con un grado medio de etoxilación de 30: 0-4 %

Disilicato de sodio: 0-33 %

Tripolifosfato de sodio: 0-46 %

Citrato sódico: 0-28 %

Ácido cítrico: 0-29 %

Carbonato de sodio: 0-20 %

Monohidrato de perborato sódico: 0-11,5 %

Tetraacetiletilenodiamina (TAED): 0-4 %

Copolímero de ácido maléico/ácido acrílico: 0-7,5 %

Sulfato de sodio: 0-12,5 %

Enzimas: 0,0001-0,1 %

7) COMPOSICIÓN DE LAVAVAJILLAS AUTOMÁTICO LÍQUIDO NO ACUOSO

Surfactante no iónico líquido (p. ej., etoxilatos de alcohol): 2,0-10,0 %

Silicato de metal alcalino: 3,0-15,0 %

Fosfato de metal alcalino: 20,0-40,0 %

Portador líquido seleccionado de glicoles, poliglicoles, polióxidos y glicoléteres superiores: 25,0-45,0 %

Estabilizador (p. ej., un éster parcial de ácido fosfórico y un alcanol C16-C18): 0,5-7,0 %

Supresor de espuma (p. ej., silicona): 0-1,5 %

Enzimas: 0,0001-0,1 %

8) COMPOSICIÓN DE LAVAVAJILLAS LÍQUIDO NO ACUOSO

Surfactante no iónico líquido (p. ej. etoxilatos de alcohol): 2,0-10,0 %

Silicato sódico: 3,0-15,0 %

Carbonato de metal alcalino: 7,0-20,0 %

Citrato sódico: 0,0-1,5 %

Sistema estabilizante (p. ej., mezclas de silicona finamente dividida y éteres de dialquil poliglicol de bajo peso molecular): 0,5-7,0 %

Polímero de poliacrilato de bajo peso de molécula: 5,0-15,0 %

Espesante de gel de arcilla (p. ej., bentonita): 0,0-10,0 %

Polímero de hidroxipropilcelulosa: 0,0-0,6 %

Enzimas: 0,0001-0,1 %

Portador líquido seleccionado de licoles, poliglicoles, polióxidos y glicoléteres superiores: Balance

9) COMPOSICIÓN DE LAVAVAJILLAS AUTOMÁTICO LÍQUIDO TIXOTRÓPICO

Ácido graso C12-C14: 0-0,5 %

Surfactante de copolímero de bloque: 1,5-15,0 %

Citrato sódico: 0-12 %

Tripolifosfato de sodio: 0-15 %

Carbonato de sodio: 0-8 %

Tristearato de aluminio: 0-0,1 %

Sulfonato de cumeno sódico: 0-1,7 %

Espesante de poliacrilato: 1,32-2,5 %

Poliacrilato de sodio: 2,4-6,0 %

Ácido bórico: 0-4,0 %

Formiato sódico: 0-0,45 %

Formiato de calcio: 0-0,2 %

N-decidifenil óxido disulfonato de sodio: 0-4,0 %

Monoetanolamina (MEA): 0-1,86 %

Hidróxido sódico (50%): 1,9-9,3 %

1,2-Propanodiol: 0-9,4 %

Enzimas: 0,0001-0,1 %

Supresor de espuma, tinte, perfumes, agua: Balance

10) COMPOSICIÓN DE LAVAVAJILLAS AUTOMÁTICO LÍQUIDO

Etoxilato de alcohol: 0-20 %

Sulfonato de éster de ácido graso: 0-30 %

Dodecilsulfato sódico: 0-20 %

Poliglucosida de alquilo: 0-21 %

Ácido oleico: 0-10 %

Monohidrato de disilicato de sodio: 18-33 %

Dihidrato de citrato sódico: 18-33 %

Estearato de sodio: 0-2,5 %

Monohidrato de perborato sódico: 0-13 %

Tetraacetiletilenodiamina (TAED): 0-8 %

Copolímero de ácido maléico/ácido acrílico: 4-8 %

Enzimas: 0,0001-0,1 %

11) COMPOSICIÓN DE LAVAVAJILLAS AUTOMÁTICO LÍQUIDO QUE CONTIENE PARTÍCULAS BLANQUEADORAS PROTEGIDAS 5

Silicato sódico: 5-10 %

Pirofosfato de tetrapotasio: 15-25 %

Trifosfato de sodio: 0-2 %

Carbonato potásico: 4-8 %

Partículas blanqueadoras protegidas, p. ej., clorina: 5-10 %

Espesante polimérico: 0,7-1,5 %

Hidróxido potásico: 0-2 %

Enzimas: 0,0001-0,1 %

Agua: Balance

12) Composiciones de lavavajillas automático según se describe en 1), 2), 3), 4), 6) y 10), en las que el perborato se sustituye por percarbonato.

13) Composiciones de lavavajillas automático según se describe en 1)-6) que contienen además un catalizador de manganeso. El catalizador de manganeso puede, por ejemplo, ser uno de los compuestos descritos en 10 "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, pp. 637-639.

VII. Métodos para medir las propiedades de las α-amilasas

[0227] Esta sección describe ensayos básicos para medir las propiedades de las α-amilasas. Se describen ensayos adicionales en la sección de Ejemplos,

A. Ensayos de selección de filtro

[0228] Los siguientes ensayos se pueden utilizar para seleccionar variantes de α-amilasa de tipo SPEZYME® Xtra que tienen estabilidad alterada con un pH alto o bajo y/o bajo condiciones de agotamiento de Ca2+ en comparación con la enzima original y la α-amilasa de tipo SPEZYME® Xtra.

1. Ensayo de filtro con pH alto 5

[0229] Se colocan genotecas de Bacillus en placas en un sándwich de acetato de celulosa (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) y filtros de nitrocelulosa (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) en placas de TY agar con 10 micro g/ml de kanamicina a 37°C durante al menos 21 horas. La capa de acetato de celulosa se localiza en la placa de TY agar.

[0230] Cada sándwich de filtro se marca específicamente con una aguja después de colocarlo en placas, pero 10 antes de la incubación, con el objetivo de poder localizar las variantes positivas en el filtro, y el filtro de nitrocelulosa con las variantes ligadas se transfiere a un recipiente con tampón de glicina-NaOH, pH 8.6-10.6 y se incuba a temperatura ambiente (se puede alterar de 10 °C a 60 °C) durante 15 min. Los filtros de acetato de celulosa con colonias se almacenan en las placas TY a temperatura ambiente hasta su uso. Tras la incubación, se detecta actividad residual en las placas que contienen 1 % de agarosa, 0,2 % de almidón en tampón de 15 glicina-NaOH, pH 8.6-10.6. Las placas de ensayo con filtros de nitrocelulosa se marcan de la misma manera que el sándwich de filtro y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de eliminar los filtros, las placas de ensayo se tiñen con una solución de Lugol al 10 %. Las variantes que degradan el almidón se detectan como manchas blancas en fondo azul oscuro y luego se identifican en las placas de almacenamiento. Las variantes positivas se reseleccionan dos veces bajo las mismas condiciones que la primera selección. 20

2. Ensayo de filtro con calcio bajo

[0231] Se colocan genotecas de Bacillus en placas en un sándwich de acetato de celulosa (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) y filtros de nitrocelulosa (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) en placas de TY agar con un antibiótico pertinente, por ejemplo, kanamicina o cloranfenicol, a 37°C durante al menos 21 horas. La capa de acetato de celulosa se localiza en la placa de TY agar. 25

[0232] Cada sándwich de filtro se marca específicamente con una aguja después de colocarlo en placas, pero antes de la incubación, con el objetivo de poder localizar las variantes positivas en el filtro, y el filtro de nitrocelulosa con las variantes ligadas se transfiere a un recipiente con tampón de carbonato/bicarbonato, pH 8.5-10 y con diferentes concentraciones de EDTA (0,001 mM - 100 mM). Los filtros se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. Los filtros de acetato de celulosa con colonias se almacenan en las placas TY a 30 temperatura ambiente hasta su uso. Tras la incubación, se detecta actividad residual en las placas que contienen 1 % de agarosa, 0,2 % de almidón en tampón de carbonato/bicarbonato, pH 8.5-10. Las placas de ensayo con filtros de nitrocelulosa se marcan de la misma manera que el sándwich de filtro y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de eliminar los filtros, las placas de ensayo se tiñen con una solución de Lugol al 10 %. Las variantes que degradan el almidón se detectan como manchas blancas en fondo azul oscuro y luego 35 se identifican en las placas de almacenamiento. Las variantes positivas se reseleccionan dos veces bajo las mismas condiciones que la primera selección.

3. Ensayo de filtro con pH bajo

[0233] Se colocan genotecas de Bacillus en placas en un sándwich de acetato de celulosa (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) y filtros de nitrocelulosa (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) en 40 placas de TY agar con 10 micro g/ml de cloranfenicol a 37°C durante al menos 21 horas. La capa de acetato de celulosa se localiza en la placa de TY agar.

[0234] Cada sándwich de filtro se marca específicamente con una aguja después de colocarlo en placas, pero antes de la incubación, con el objetivo de poder localizar las variantes positivas en el filtro, y el filtro de nitrocelulosa con las variantes ligadas se transfiere a un recipiente con tampón de citrato, pH 4.5 y se incuba a 45 80 °C durante 20 min (cuando se seleccionan variantes en la estructura principal natural) o a 85 °C durante 60 minutos (cuando se seleccionan variantes de la α-amilasa original). Los filtros de acetato de celulosa con colonias se almacenan en las placas TY a temperatura ambiente hasta su uso. Tras la incubación, se detecta actividad residual en las placas de ensayo que contienen 1 % de agarosa, 0,2 % de almidón en tampón de citrato, pH 6.0. Las placas de ensayo con filtros de nitrocelulosa se marcan de la misma manera que el sándwich 50 de filtro y se incuban durante 2 horas a 50 °C. Después de eliminar los filtros, las placas de ensayo se tiñen con una solución de Lugol al 10 %. Las variantes que degradan el almidón se detectan como manchas blancas en fondo azul oscuro y luego se identifican en las placas de almacenamiento. Las variantes positivas se reseleccionan dos veces bajo las mismas condiciones que la primera selección.

3. Elección secundaria 55

[0235] Los transformantes positivos después de la reselección se eligen de la placa de almacenamiento y se analizan en un ensayo de placas secundario. Los transformantes positivos se cultivan durante 22 horas a 37ºC

en 5 ml de LB + cloranfenicol. El cultivo de Bacillus de cada transformante positivo y como control un clon que expresa la estructura principal correspondiente se incuban en un tampón de citrato, pH 4.5 a 90ºC y se toman muestras a los 0, 10, 20, 30, 40, 60 y 80 minutos. Se mancha una muestra de 3 µL en una placa de ensayo. La placa de ensayo se tinta con una solución de Lugol al 10%. Las variantes mejoradas se ven como variantes con mayor actividad residual (detectada como halos en la placa de ensayo) que la estructura principal. Las variantes 5 mejoradas se determinan mediante secuenciación de nucleótidos.

B. Ensayo de estabilidad de variantes no purificadas

[0236] La estabilidad de las variantes se puede ensayar como sigue: los cultivos de Bacillus que expresan las variantes para analizar se cultivan durante 21 horas a 37 °C en 10 ml de LB + cloranfenicol. Se mezclan 800 µL 10 del cultivo con 200 µL de tampón de citrato, pH 4.5. Un número de alícuotas de 70 µL correspondientes al número de puntos en el tiempo de la muestra se preparan en tubos de PCR y se incuban a 70 °C o 90 °C para varios puntos en el tiempo (normalmente 5, 10, 15, 20, 25 y 30 minutos) en una máquina de PCR. La muestra de 0 minutos no se incuba a alta temperatura. La actividad en la muestra se mide transfiriendo 20 µL a 200 µL del sustrato PNP-G7 de α-amilasa MPR3 (Boehringer Mannheim Cat. nº 1660730) como se describe más adelante 15 en el texto en “Ensayos para la actividad de α-amilasa”. Los resultados se representan como porcentaje de actividad (con relación al punto en el tiempo 0) en función del tiempo, o se expresan como porcentaje de actividad residual después de la incubación durante un cierto periodo de tiempo.

C. Fermentación y purificación de las variantes de α-amilasa

[0237] Una cepa de B. subtilis que contiene el plásmido de expresión pertinente se puede fermentar y purificar 20 como sigue: La cepa se mancha sobre una placa de LB agar con 10 µg/ml de kanamicina de un caldo a -80 °C, y se cultiva durante toda la noche a 37 °C. Las colonias se transfieren a medios de 100 ml PS-1 complementados con 10 micro g/ml de cloranfenicol en un matraz de agitación de 500 ml. El cultivo se agita a 37 °C a 270 rpm durante 5 días.

Composición del medio PS-1: 25

Azúcar en perlas: 100 g/l

Harina de soja: 40 g/l

Na2HPO4,12 H2O: 10 g/l

Pluronic ™ PE 6100: 0,1 g/l

CaCO3: 5 g/l

[0238] Las células y los restos celulares se extraen del caldo de fermentación mediante centrifugado a 4500 rpm en 20-25 minutos. Después, el sobrenadante se filtra para obtener una solución completamente transparente. El filtrado se concentra y se lava en un filtro UF (membrana de corte de 10.000 MW) y el tampón se cambia a 20 mM de acetato, pH 5.5. El filtrado UF se aplica en una S-sefarosa FF y se lleva a cabo la elución mediante 30 una elución por etapas con 0,2 M de NaCl en el mismo tampón. El eluato se dializa contra 10 mM de Tris, pH 9.0 y se aplica en una Q-sefarosa FF y se eluye con un gradiente lineal de 0-0,3 M de NaCl sobre volúmenes de 6 columnas. Las fracciones que contienen la actividad (medidas mediante el ensayo Phadebas) se agrupan, se ajusta el pH a pH 7.5 y el color restante se extrae mediante un tratamiento con 0,5 % en peso/volumen de carbón activo durante 5 minutos. 35

D. Determinación de la actividad específica

[0239] La actividad específica se determina utilizando el ensayo PHADEBAS® (Pharmacia) como actividad/mg de enzima. Se siguen las instrucciones del fabricante (véase también a continuación en “Ensayo para la actividad de α-amilasa”).

E. Determinación del punto isoeléctrico 40

[0240] El pI se determina mediante isoelectroenfoque (por ejemplo, Pharmacia, Anfolina, pH 3.5-9.3).

F. Determinación de la estabilidad

[0241] La estabilidad de la amilasa se puede medir utilizando el método como sigue:

[0242] La enzima se incuba bajo las condiciones pertinentes. Las muestras se toman en diversos momentos, por ejemplo, después de 0, 5, 10, 15 y 30 minutos y se diluyen 25 veces (misma dilución para todas las muestras 45 tomadas) en un tampón de ensayo (50 mM de tampón Britton pH 7.3) y la actividad se mide utilizando el ensayo Phadebas (Pharmacia) bajo condiciones estándar pH 7.3, 37ºC.

[0243] La actividad medida antes de la incubación (0 minutos) se utiliza como referencia (100%). El descenso del porcentaje se calcula como una función del tiempo de incubación. La tabla muestra la actividad residual después de, por ejemplo, 30 minutos de incubación. 50

G. Ensayos para la actividad de α-amilasa

1. Ensayo PHADEBAS®

[0244] La actividad α-amilasa se determina mediante un método que emplea tabletas de Phadebas® como sustrato. Los tabletas de Phadebas (Phadebas® Amylase Test, suministrado por Pharmacia Diagnostic) contienen un polímero de almidón de color azul insoluble reticulado, que ha sido mezclado con albúmina de 5 suero bovino y una sustancia del tampón y colocado en tabletas.

[0245] Para cada medición individual se suspende una tableta en un tubo que contiene 5 ml de tampón Britton-Robinson de 50 mM (50 mM de ácido acético, 50 mM de ácido fosfórico, 50 mM de ácido bórico, 0,1 mM de CaCl2, pH ajustado al valor de interés con NaOH). La prueba se lleva a cabo en un baño termostático a la temperatura de interés. La α-amilasa que se ha de evaluar se diluye en x ml de 50 mM de tampón Britton-10 Robinson. Se añade 1 ml de esta solución de α-amilasa a 5 ml de tampón Britton-Robinson de 50 mM. El almidón se hidroliza mediante la α-amilasa dando fragmentos azules solubles. La absorbancia de la solución azul resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función de la actividad de α-amilasa.

[0246] Es importante que la absorbancia de 620 nm medida después de 10 ó 15 minutos de incubación (tiempo de la prueba) esté en el intervalo de 0,2 a 2,0 unidades de absorbancia a 620 nm. En este intervalo de 15 absorbancia existe una linealidad entre la actividad y la absorbancia (ley de Lambert-Beer). La dilución de la enzima debe ajustarse por consiguiente para adaptarse este criterio. Bajo un conjunto específico de condiciones (temp., pH, tiempo de reacción, condiciones del tampón) 1 mg de una α-amilasa dada hidrolizará una cantidad determinada de sustrato y se producirá un color azul. La intensidad del color se mide a 620 nm. La absorbancia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína de α-amilasa pura) de la 20 α-amilasa en cuestión bajo el conjunto de condiciones dadas.

2. Método alternativo

[0247] La actividad de la α-amilasa se determina mediante un método que emplea el sustrato PNP-G7. PNP-G7, que es una abreviatura de p-nitrofenil-α,D-maltoheptaosido, es un oligosacárido bloqueado que puede escindirse mediante una endoamilasa. Después de la escisión, la α-Glucosidasa incluida en el kit asimila el sustrato para 25 liberar una molécula de PNP libre que tiene un color amarillo y, de este modo, se puede medir por espectofometría visible a λ=405 nm (400-420 nm). Los kits que contienen el sustrato PNP-G7 y la α-Glucosidasa son fabricados por Boehringer-Mannheim (nº cat. 1054635).

[0248] Para preparar la solución del reactivo se añaden 10 ml del sustrato/solución de tampón a 50 ml de enzima/solución de tampón según recomienda el fabricante. El ensayo se lleva a cabo transfiriendo una muestra 30 de 20 µL a una placa de microtitulación de 96 pocillos y se incuba a 25 °C. Se añaden 200 µL de la solución del reactivo pre-equilibrada a 25 °C. La solución se mezcla y se preincuba 1 minuto y se mide la absorción cada 30 segundos durante 4 minutos a una densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés) de 405 nm en un lector ELISA.

[0249] La pendiente de la curva de absorción en función del tiempo es directamente proporcional a la actividad de la α-amilasa en cuestión bajo el conjunto de condiciones dado. 35

H. Determinación de sensibilidad a LAS

[0250] La variante se incuba con diferentes concentraciones de LAS (alquilbencensulfonato lineal; Nansa 1169/P) durante 10 minutos a 40 °C. La actividad residual se determina mediante el método de ensayo PHADEBAS® o el método alternativo que emplea el sustrato PNP-G7. El LAS se diluye en un tampón de fosfato de 0,1 M, pH 7.5. Se utilizan las siguientes concentraciones: 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm y 40 10 ppm o no se utiliza LAS.

[0251] La variante se diluye en los diferentes tampones de LAS a una concentración de 0,01-5 mg/l en un volumen total de 10 ml y se incuba durante 10 minutos en un baño termostático con temperatura controlada. La incubación se detiene al transferir una alícuota pequeña en el tampón de ensayo frío. Es importante que durante la medición de la actividad la concentración de LAS esté por debajo de 1 ppm, para no afectar la medición de 45 actividad.

[0252] Entonces se determina la actividad residual por duplicado utilizando el ensayo PHADEBAS® o el método alternativo antes mencionados. La actividad se mide después de la sustracción del blanco. La actividad sin LAS es 100 %.

G. Determinación de la actividad de fitasa (FTU) 50

[0253] La actividad de fitasa (FTU) se mide liberando fosfato inorgánico. El fosfato inorgánico forma un compuesto amarillo con reactivo vanadato/molibdato ácido y el compuesto amarillo se mide a una longitud de onda de 415 nm en un espectrofotómetro y el fosfato inorgánico liberado se cuantifica con una curva estándar de fosfato. Una unidad de fitasa (FTU) es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de fosfato inorgánico de fitato

por minuto bajo las condiciones de reacción dadas en la norma europea (CEN/TC 327,2005-TC327WI 003270XX).

H. Determinación del contenido de ácido fítico

[0254] Para determinar el contenido de ácido fítico, se extrajo ácido fítico de una muestra ajustando el pH de la suspensión al 5 % (si se trata de una muestra seca) a pH 10 y se determinó después mediante un método de 5
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC, por sus siglas en inglés) utilizando una columna de intercambio de iones. El ácido fítico se eluyó de la columna utilizando un sistema de gradiente de NaOH. Se calculó entonces el contenido de ácido fítico en el líquido comparándolo con un estándar de ácido fítico.

[0255] Las presentes composiciones y métodos se describen con más detalle en los siguientes ejemplos que no pretenden limitar de ninguna manera el alcance de la invención. 10

EJEMPLOS

[0256] En la descripción y en la sección experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaciones: wt% (concentración porcentual en peso); °C (grados Centígrados); H2O (agua); dH2O (agua desionizada); dIH2O (agua desionizada, filtración Milli-Q); g o gm (gramos); µg (microgramos); mg (miligramos); kg (kilogramos); µL y µl (microlitros); mL y ml (mililitros); mm (milímetros); µm (micrometros); M (molar); mM (milimolar); µM 15 (micromolar); U (unidades); MW (peso molecular); seg (segundos); min(s) (minuto/minutos); hr(s) (hora/horas); DO (oxígeno disuelto); W/V (peso/volumen); W/W (peso/peso); V/V (volumen/volumen); IKA (IKA Works Inc. 2635 North Chase Parkway SE, Wilmington, NC); Genencor (Danisco US Inc, Genencor Division, Palo Alto, CA); Ncm (Newton centímetro) y ETOH (etanol). eq (equivalentes); N (normal); ds o DS (contenido de residuo seco), SAPU (unidad de proteasa de ácido espectrofotométrico, en la que 1 SAPU es la cantidad de actividad de 20 enzima de proteasa que libera un micromol de tirosina por minuto a partir de un sustrato de caseína bajo condiciones del ensayo) y GAU (unidad de glucoamilasa, que se define como la cantidad de enzima que producirá 1 g de azúcar reductor calculado como glucosa por hora a partir de un sustrato de almidón soluble con pH 4.2 y a 60 °C).

Ejemplo 1. Construcción de variantes 25

[0257] Las variantes en la secuencia madura de AmyS se construyeron utilizando un enfoque de sitio dirigido. Por ejemplo, las variantes en la posición S242 se construyeron como sigue:

[0258] La plantilla para la mutagénesis fue pHPLT-AmyS metilada (véase la Figura 2) utilizando dam-Metilasa de New England Biolabs (Massachusetts). Los cebadores degenerados (S242F (progresivo) y S242R (inverso), dados a continuación) se sintetizaron y se diluyeron a 10 µM en Operon (Huntsville, AL) con secuencias 30 progresivas e inversas complementarias que contenían ambas un fosfato 5' para la ligación en la reacción. La secuencia de la α-amilasa original se muestra como SEQ ID Nº 2. Las genotecas se crearon con el kit QUIK-CHANGE™ Multi-sitio de Stratagene (Stratagene, La Jolla CA) utilizando cebadores de oligonucleótido distribuidos de forma aleatoria con NN(G/C) en la posición de destino. El aminoácido seleccionado (por ejemplo, S242) se reemplazó aleatoriamente con las 19 alternativas posibles. 35

[0259] Cebadores S242 para mutagénesis:

S242 F: 5'-[Phos]GTCAAGCATATTAAGTTCNNSTTTTTTCCTGATTGGTTG-3' SEQ ID Nº 17

S242 R: 5'-[Phos]CAACCAATCAGGAAAAAASNNGAACTTAATATGCTTGAC-3' SEQ ID Nº 18

[0260] La reacción se llevó a cabo como sigue:

Reacción Quik-Change: 40

[0261] La reacción consistió en 18 µL de H2O destilada estéril, 2,5 µL de tampón 10x del kit, 1 µL de dNTPs del kit, 1,25 µL de los cebadores progresivos (de 10 uM de caldo), 1,25 µL de los cebadores inversos (de 10 uM de caldo), 1 µL de plásmido de ADN pHPLT-AmyS como plantilla (~70 ng), y 1 µL de la mezcla enzimática del kit para un total de 26,5 µL.

Condiciones del ciclo: 45

[0262] Las condiciones del ciclo fueron 95 °C durante 1 min una vez, después 95 °C durante 1 min, 55 °C durante 1 min, 65 °C durante 10 min para 25 ciclos. Se añadió un µL de Dpn I (10 U/µL) a la mezcla de reacción Quik-Change Multi-sitio y se incubó a 37 °C durante 18 horas y después se añadieron otros 0,5 µl durante 3 horas adicionales.

[0263] Se utilizó un µL de la reacción digerida con DpnI como plantilla para la amplificación en círculo rodante 50 con el kit de amplificación Templiphi (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y la reacción se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo de Amersham. Se transformó un µL de ADN de círculo rodante en 100 µL de células competentes de Bacillus subtilis (dos proteasas de cepa de B. subtilis eliminada (ΔaprE, ΔnprE,

amyE::xylRPxylAcomK-phleo)) y se agitó a 37 °C durante 1 hora. La transformación completa se colocó después en placas de LA + 10 ppm de Neo + almidón insoluble al 1 % (25 µL en una placa, 75 µL en otra placa) y se incubó durante la noche a 37 °C. Se recogieron 96 transformantes en 150 µL de LB + 10 ppm de Neo en una placa de microtitulación y se cultivaron durante la noche a 37 °C. La placa de la noche se estampó en una placa grande de LA + 10 ppm de Neo + almidón insoluble al 1 % con una herramienta de replicación de 96 pocillos y se 5 envió a Quintara Biosciences (Berkeley, CA, USA) para PCR y secuenciación de colonia.

[0264] Después de determinar las variantes de secuencias, éstas se recogieron en una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenía 125 µL de LB + 10 ppm de Neo, disponiendo las variantes en un formato cuádruple con controles. La placa de microtitulación dispuesta se cultivó durante 6 horas a 37 °C y a 250 rpm. Utilizando una herramienta de replicación (Enzyscreen, Leiden, Países Bajos) se utilizó la placa del cultivo de 10 microtitulación para inocular una nueva placa de microtitulación (placa de microtitulación y tapas de la placa de Enzyscreen, Leiden, Países Bajos) que contenía 150 µL de medio MBD para la expresión de la proteína (G. Vogtentanz et al., A Bacillus subtilis fusion protein system to produce soybean Bowman-Birk protease inhibitor, Prot. Expr. & Purif., 55 (2007) 40-52) y complementada con 5 mM de CaCl2 para la expresión de la proteína. Las placas de expresión se cultivaron durante 64 horas a 37 °C, 250 rpm y 70 % de humedad. Los cultivos de 15 expresión se filtraron después mediante una placa de microfiltro (0,22 um, Millipore, Billerica, MA) y se cribaron por termoestabilidad mejorada (véase el Ejemplo 3).

Genotecas de AmyS

[0265] Se realizaron genotecas de evaluación de sitio para las siguientes variantes de AmyS:

P17, D19, T21, N28, S51, G72, V74, A82, Q86, Q89, A93, W115, D117, P123, S124, D125, N127, I130, 20 G132, Q135, P145, G146, G148A, S153A, Y159, W166, S169, K171, R179, G180,1181, G182, K183, W187, G194, P209, N224, S242, P245, G256, D269, N271, T278, N281, G302, A304, R308, T321, Q358, P378, S382, K383, T398, H405, T417, E418, P420, G421, P432, W437, Q443, G446, G454, S457, T459, T461, S464, G474, R483.

Ejemplo 2. Expresión, purificación y caracterización de variantes 25

[0266] Las colonias se vetearon a partir de las placas de microtitulación del Ejemplo 1 y se pusieron en placas de almidón con 10 ppm de Neomicina. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C y se recogieron las colonias individuales y se utilizaron para inocular matraces de agitación (250 mL con 25 mL de medios de cultivo) que contenían medios de cultivo (véase a continuación) y 20 ppm de Neomicina. Estos se cultivaron a 37 °C, a 275 rpm, durante aproximadamente 8 horas (hasta que se alcanzó una densidad óptica (OD) (600 nm) de 2,0). 30 Después de lo cual, los caldos de cultivo se mezclaron con 50 % de glicerol a una relación de 2:1, se colocaron en frascos de cultivo marcados individualmente y se congelaron a -80 °C. La subsiguiente producción de las α-amilasas seleccionadas se hizo a partir de estas concentraciones de glicerol.

[0267] Las fermentaciones de amilasas se llevaron a cabo en matraces de agitación de 500 mL y se cultivaron a 37 °C durante 60 horas en un medio de cultivo de MOPS mínimo (Neidhardt et al., J. Bacteriol. (1974) 35 119(3):736-747) con 1 % (peso/volumen) de Soytone. Las enzimas se purificaron del caldo de fermentación utilizando cromatografía de interacción hidrófoba. En definitiva, el caldo se concentró 10 veces, después se diluyó de nuevo con 50 mM de MES, 2 mM de CaCl2, pH 6.8 con 1M de sulfato de amonio, y se filtró de forma estéril utilizando filtro de fibra de vidrio. Las muestras se cargaron entonces en una columna de alta densidad de fenil sefarosa FF (20 x 95 mm; Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences, Suecia) preequilibradas con el mismo 40 tampón. Las proteínas que no eran amilasa se eliminaron con 10 volúmenes de columna del mismo tampón sin sulfato de amonio seguido por 5 volúmenes de columna de agua. Finalmente, se eluyeron las enzimas de interés con 50 mM de MES, 2 mM de CaCl2, pH 6.8 que contenía 40 % de propilenglicol.

[0268] Las concentraciones de proteína se determinaron o mediante un método de densitometría en gel SDS page cuantitativo estándar o mediante un ensayo de actividad que utilizaba un kit de ensayo de amilasa estándar 45 de Megazyme (Wicklow, Irlanda). Los ensayos se convirtieron usando una curva estándar generada utilizando la amilasa purificada (amilasa de Bacillus 707; SEQ ID Nº 6).

Ejemplo 3. Determinación de propiedades alteradas: Tensión térmica

[0269] Este ejemplo muestra que las variantes descritas en el presente documento pueden tener una propiedad alterada en relación con la α-amilasa original. Se llevó a cabo un cribado de estabilidad térmica de alto 50 rendimiento de variantes de α-amilasa de G. stearothermophilus (AmyS).

[0270] Se investigaron las condiciones de tensión por calor y se seleccionaron de tal forma que después de la tensión por calor la enzima natural inicial mostró aproximadamente 40 % de su actividad sin tensión (es decir, la actividad después de la tensión por calor/actividad antes de la tensión por calor fue de aproximadamente 0,4). Las genotecas de mutantes se cribaron por cuadriplicado y los ganadores potenciales se identificaron como los 55 que mostraron una actividad residual después de la tensión por calor que fue de al menos dos desviaciones estándar más que la actividad residual media de la enzima natural inicial.

[0271] La expresión de la amilasa fue aproximadamente 100 ppm en los sobrenadantes del cultivo de las placas de expresión. Después de 60-65 horas de cultivo a 37 °C en un agitador humidificado (a 250 rpm y 70 % de humedad relativa), los sobrenadantes del cultivo se clarificaron para eliminar el material celular utilizando placas de filtro. Los sobrenadantes clarificados se diluyeron 10 veces en un tampón que contenía 50 mM de NaOAc/2,6 mM de CaCl2/0,002 % de Tween-20, pH 5.8, a una concentración final de aproximadamente 10 ppm. Se diluyó 5 además una alícuota del sobrenadante a 0,02 ppm, y se determinó la actividad de las variantes enzimáticas como se describe más adelante utilizando un sustrato de almidón de maíz marcado de manera fluorescente. Se sometió una segunda alícuota del sobrenadante a 30 minutos de tensión por calor a 95 °C en un ciclador térmico, antes de diluirse a 0,02 ppm en 50 mM de NaOAc/2,6 mM de CaCl2/0,002 % de Tween-20, pH 5.8 y se ensayó para actividad residual utilizando el mismo sustrato fluorescente y el ensayo se describe más adelante en el 10 texto.

[0272] La actividad de la amilasa se determinó utilizando el ensayo de amilasa EnzCheck esencialmente como describe el fabricante (Invitrogen, San Diego CA). La concentración final de la amilasa en el ensayo fue de aproximadamente 0,02 ppm. El tampón del ensayo fue de 50 mM de NaOAc/2,6 mM de CaCl2/0,002 % de Tween-20, pH 5.8. El sustrato fue el colorante fluorescente BODIPY conjugado de 100 µg/mL de almidón de 15 maíz de DQ™ (Invitrogen - Eugene, OR). La fluorescencia incrementada, que indica la actividad de la amilasa, se midió utilizando un Spectomax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). La reacción se monitorizó a temperatura ambiente durante 5 minutos con el instrumento grabando en modo cinético. La longitud de onda de excitación fue de 485 nm; la emisión se monitorizó a 520 nm con un filtro de corte a 515 nm.

[0273] La AmyS natural (SPEZYME ® Xtra) mostró 33 % - 43 % de actividad residual después de someterse a 20 tensión térmica durante 30 minutos a 95 °C. Las variantes de AmyS, S242A y S242Q, retuvieron 55 % - 65 % y 70 % - 80 % de actividades residuales, respectivamente, siguiendo las mismas condiciones de tensión térmica. Véase la Figura 3 y la Tabla 3-1. Estas mediciones de la actividad residual indican que las dos variantes son más termoestables que la α amilasa natural. Algunas variantes faltaban en las genotecas y se indican mediante posición de la letra con indicador de eliminación de texto. En su lugar, se colocó la amilasa natural (SPEZYME ® 25 Xtra); (WT) indica que se colocó la amilasa natural en su lugar. Cada placa incluye SPEZYME® Xtra (designada Z) como control.

Tabla 3-1. Porcentaje de actividades residuales de cada muestra de variantes.

Variantes: % de actividad residual Promedio Desviación estándar %CV

A: 60,6 59,8 56,5 64,6 60,4 3,3

C: 38,1 35,6 28,3 34,5 34,1 4,2

D: 50,6 42,9 45,0 48,7 46,8 3,5

(WT): 45,3 38,6 39,5 40,7 41,0 3,0

(WT): 40,5 40,2 41,2 38,9 40,2 1,0

G: 36,4 35,7 44,8 36,7 38,4 4,3

(WT): 34,9 36,9 37,0 42,1 37,7 3,0

I: 20,9 26,7 27,5 17,2 23,1 4,9

K: 22,6 21,5 19,3 24,5 22,0 2,2

L: 34,9 30,7 34,5 30,7 32,7 2,3

M: 35,3 37,3 38,3 41,3 38,1 2,5

(WT): 43,9 43,2 46,0 42,2 43,8 1,6

(WT): 33,8 35,61 40,2 37,4 36,8 2,7

Q: 80,6 71,0 75,9 71,5 74,8 4,5

R: 9,6 4,5 6,1 5,4 6,4 2,2

(WT): 38,6 39,9 37,2 37,3 38,3 1,3

T: 36,8 31,5 35,1 27,8 32,8 4,0

V: 25,0 24,7 25,0 22,9 24,4 1,0

(WT): 32,7 37,5 36,3 38,8 36,3 2,6

(WT): 37,1 42,6 46,0 38,6 41,1 4,0

Z (Xtra): 38,8 41,5 42,5 32,7 38,9 4,4

Ejemplo 4. Determinación de propiedades alteradas mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC, 30 por sus siglas en inglés)

[0274] Se purificaron SPEZYME® Xtra, S242A y S242Q del caldo de fermentación de la matraz de agitación (véase el Ejemplo 2) utilizando cromatografía de interacción hidrófoba. La proteína se eluyó de la columna en forma purificada utilizando 50 mM de MES, pH 6.8, que contenía 40 % de propilenglicol y 2 mM de CaCl2.

[0275] Las curvas de capacidad de calor excesivo se midieron utilizando un microcalorímetro de exploración ultrasensible de alto rendimiento, VP-Cap DSC (MicroCal, Inc., Northampton, MA). El procedimiento estándar para las mediciones DSC y la teoría de la técnica se han publicado previamente en (Freire, E. (1995) Differential Scanning Calorimetry Methods. Mol. Biol. 41, 191-218). Se examinaron aproximadamente 500 µL de 0,5 mg/ml de α-amilasa natural de Bacillus stearothermophilus o las variantes S242S y S242Q (en ausencia y presencia de 5 2 mM de cloruro de calcio) en un intervalo de temperatura por encima de 30 °C - 120 °C. La misma muestra se volvió a examinar después para comprobar la reversibilidad del proceso. Para la α-amilasa el proceso de desarrollo térmico fue irreversible. El tampón utilizado fue 10 mM de acetato de sodio, pH 5.5. Se utilizó un índice de exploración de 200 °C/hr para minimizar cualquier objeto que pudiera resultar de la agregación. El punto térmico medio (Tm, por su abreviación del inglés) de las curvas DSC se utilizó como un indicador de la 10 estabilidad térmica. La Tabla 4-1 muestra los puntos de fusión térmicos para las proteínas de amilasa analizadas. En la Figura 5 se muestran las curvas de fusión térmica y los puntos de fusión de la amilasa natural y de las variantes de amilasa.

[0276] El desarrollo térmico de las variantes de amilasa S242A y S242Q en ausencia y presencia de 2 mM de cloruro de calcio muestra un considerable aumento en los puntos de fusión de las variantes cuando se compara 15 con el de la amilasa natural. En ausencia de cloruro de calcio añadido, la amilasa natural tiene un punto de fusión térmico de 100,8 °C, mientras que los Tm de S242A y S242Q son 106,5 °C y 110,1 °C, respectivamente. De esta manera, la sustitución de S242 con A resulta en un aumento en el Tm de 5,7 °C; y la sustitución de S242 con Q resulta en un aumento en el Tm de 9,3 °C.

[0277] En presencia de 2 mM de cloruro de calcio, la amilasa natural caracterizada tiene un punto de fusión 20 térmico de 106,8 °C mientras los Tm para S242A y S242Q son 111,8 °C y 113,8 °C, respectivamente. De esta manera, en presencia de 2 mM de cloruro de calcio, las tres proteínas mostraron valores de Tm aumentados. El aumento de Tm en la amilasa natural y las variantes S242A fue 6 °C y 5,3 °C, respectivamente. El aumento de Tm en las variantes S242Q fue 3,7 °C. Esto sugiere que la variante S242Q se estabiliza en menor medida mediante calcio, o depende menos del calcio para la estabilidad. El aumento en el Tm de S242A y S242Q con 25 relación a la amilasa natural en presencia de cloruro de calcio fue 5 °C y 3°C, respectivamente. Esto sugiere que las propiedades termodinámicas de las variantes difieren de las de SPEZYME® Xtra, y es coherente con su rendimiento mejorado en estudios de aplicación (véase el Ejemplo 5).

Tabla 4-1

: Tm (sin Ca2+) Tm (con 2 mM Ca2+)

SPEZYME® Xtra: 100,8 106,8

S242A: 106,5 111,8

S242Q: 110,1 113,8

Ejemplo 5. Perfiles de actividad

[0278] Este ejemplo muestra que las variantes analizadas tienen perfiles de actividad alterados con relación no sólo a la α-amilasa original sino también a una enzima estándar de la industria. Las determinaciones de proteína se hicieron sobre muestras purificadas o en placas. Tanto a las variantes experimentales como a las α-amilasas estándar se le administraron concentraciones de proteína iguales. 35

[0279] Cualquier variante en placa o purificada se diluyó a aproximadamente 20 ppm utilizando tampón de ácido málico de pH 5.6. El sustrato consistió en 15 % de almidón de maíz en el mismo tampón de ácido málico de 50 mM, pH 5.6. Se equilibraron 400 µL de la suspensión de almidón a 70 °C durante 2,5 minutos. Después se añadieron rápidamente 7 µL de la enzima diluida al almidón equilibrado (concentración final de proteína de aproximadamente 0,36 ppm). La mezcla de reacción se colocó entonces en un bloque de calentamiento por 40 agitación precalentado a 85 °C y se mezcló a 300 rpm. Las reacciones se desactivaron con 50 µL de 125 mM de NaOH a intervalos de tiempo predeterminados. Los tubos de reacción se hicieron girar entonces y el sobrenadante se diluyó 10 veces en 10 mM de NaOH, para analizar el perfil DP mediante HPAEC-PAD.

[0280] Las reacciones se establecieron a 4, 10 y 20 minutos. El área total de DP2 al final del proceso HPLC se integró y el área se dividió por la proteína total y el tiempo de reacción. 45

[0281] La reacción de 4 minutos proporciona una indicación de la rapidez con la que la enzima empieza a descomponer el sustrato; la reacción a los 10 minutos proporciona una indicación de la actividad térmica de la enzima, y la reacción a los 20 minutos proporciona una indicación de la estabilidad térmica de la enzima. Los resultados se proporcionan en las Figuras 7 y 8.

Ejemplo 6. Licuefacción en el viscosímetro 50

[0282] Este ejemplo muestra que las variantes S242A y S242Q del Ejemplo 3 que presentaron actividad residual alterada con relación a la amilasa natural original también tienen un rendimiento alterado con relación a la α-

amilasa original. Las variantes de α-amilasa del Ejemplo 2 se purificaron y se caracterizaron con respecto a proteína total y actividad específica antes de que se analizaran en la aplicación.

[0283] La reducción de la viscosidad de la harina de maíz debida a la acción de la α-amilasa se monitorizó utilizando un instrumento HAAKE Viscotester 550. La suspensión del sustrato se prepara nueva a diario a modo de lotes con 30 % de residuos secos de harina de maíz. El pH se ajustó a 5.8 utilizando ácido sulfúrico. Se 5 pesaron 50 g de la suspensión (15 g de residuos secos) y se preincubaron, con agitación, durante 10 minutos para calentarlos hasta 70 °C. Después de la adición de la α amilasa la temperatura se elevó inmediatamente de 70 °C a 85 °C con una velocidad de rotación de 75. Una vez que la temperatura de la suspensión y la mezcla enzimática alcanzó 85 °C, la temperatura se mantuvo constante y la viscosidad se monitorizó durante 30 minutos más. La viscosidad se midió a lo largo del proceso y se reportó en µNm. A la AmyS natural, a la S242A y a la 10 S242Q se les administraron concentraciones de proteína iguales (20 o 30 µg/50 g de suspensión de harina de maíz).

[0284] La prueba de aplicación del viscosímetro mostró que ambas variantes Amys, S242A y S242Q, tuvieron mejor rendimiento que las α amilasas de referencia - LIQUOZYME® SC y SPEZYME® Xtra. Ambas variantes exhibieron el pico de viscosidad baja característico de SPEZYME® Xtra y la baja viscosidad final de 15 LIQUOZYME® SC. Cuando se cargó a la menor concentración de 20 µg de proteína total, las diferencias de los picos de viscosidad más bajos de las variantes comparados con los de LIQUOZYME® SC se hicieron aún más evidentes. Véanse las Figuras 9, 10 y 11.

Ejemplo 7. Licuefacción en un Jet Cooker (aparato de inyección de vapor a presión)

[0285] El maíz molido entero se suspendió en una suspensión al 32 % (residuos secos de maíz) utilizando una 20 proporción de 70:30 de agua con respecto a vinaza. El pH de la suspensión se ajustó a pH 5.8 con 10 N de NaOH. La suspensión se calentó a 70 °C (158 °F) utilizando agua y vapor en una caldera con camisa calefactora. Se añadieron las enzimas de la licuefacción (SPEZYME® Xtra, LIQUOZYME® SC o S242Q) y se calentó la suspensión a 85 °C (158 °F) durante aproximadamente 10 minutos. Después de 10 minutos adicionales de incubación a 85 °C, la suspensión se hizo pasar por un jet-cooker mantenido a 107 °C (225 °F) con un tiempo de 25 retención de 3 minutos utilizando un chorro grande de planta piloto (equipado con un hidrocalentador M103 de Hydro-thermal Corp., Waukesha, Wisconsin). El licuado se recogió del chorro a presión y se colocó en un baño termostático a 85 °C. Se añadió una segunda dosis de la enzima de licuefacción después del chorro a presión. El licuado se agitó de forma continuada y se mantuvo a 85 °C durante 90 minutos. Se recogieron muestras a los 0, 30, 60 y 90 minutos. Todas las muestras se analizaron después del chorro a presión para determinar el DE 30 (utilizando el método Schoorls; método disponible previa solicitud), y la viscosidad (viscosímetro de tipo Brookfield (Lab-line Instruments Inc. de Melrose Park, Illinois), eje de 3 a 20 rpm). La dosificación de las enzimas de licuefacción antes y después del chorro a presión se indican en las siguientes Figuras como “X + Y”, donde X representa el número de unidades de enzima añadidas antes del chorro a presión, e Y representa el número de unidades añadidas al licuado después de pasar por el jet cooker. Los resultados se muestran en las Figuras 12 y 35 13.

Ejemplo 8. Efecto de la eliminación de la inhibición del ácido fítico en la termoestabilidad de la α amilasa

[0286] En este ejemplo se examinó el efecto de la eliminación de la inhibición del ácido fítico en la termoestabilidad de las α-amilasas termoestables licuefactantes.

A. Sin jet cooking (aplicación de vapor a presión) (dosis de enzima individual) 40

[0287] Se preparó una suspensión de maíz molido entero (obtenido de Badger State Ethanol, Monroe, WI, EE.UU.) con agua que contenía 30 % volumen/volumen de vinaza a una concentración final de aproximadamente 32 % de residuo seco. Los sólidos de maíz se prepararon en una caldera con camisa calefactora. La suspensión se mezcló bien y se midió el pH de la suspensión (pH 5.2) y se utilizó sin ajustes adicionales de pH. Esta suspensión se mezcló en una caldera con camisa calefactora y se llevó a la temperatura 45 de pretratamiento de 70 °C. Justo antes de alcanzar 70 °C, se añadieron la enzima licuefactante, es decir, una αamilasa (4 AAU por gramo de residuo seco de maíz) y una fitasa (4 FTU por gramo de residuo seco de maíz), y se inició un temporizador para comenzar la incubación o la etapa de licuefacción primaria. La suspensión se incubó durante 30 minutos en presencia de la amilasa con o sin fitasa añadida. La fitasa utilizada en este experimento fue BP-17 (véase el texto anterior). Aunque la fitasa se añadió al mismo tiempo que la α-amilasa en 50 este ejemplo, se puede añadir antes de la amilasa.

[0288] La suspensión tratada se colocó después en un baño termostático mantenido a 90 °C para iniciar la etapa de licuefacción secundaria (2ª licuefacción). Se tomaron muestras para analizar la viscosidad (mediante Brookfield) y la DE (mediante Schoorls) a los 0, 30, 60 y 90 minutos. Los resultados se muestran en las Figuras 14 y 15. 55

B. Con jet cooking (dosis de enzima fraccionada)

[0289] Se preparó una suspensión de maíz molido entero (obtenido de Badger State Ethanol, Monroe, WI,) con agua que contenía 30 % volumen/volumen de vinaza a una concentración final de aproximadamente 32 % de residuo seco. Los sólidos de maíz se prepararon en una caldera con camisa calefactora. La suspensión se mezcló bien y se midió el pH de la suspensión (pH 5.2). Esta suspensión se mezcló en una caldera con camisa calefactora y se llevó a la temperatura de pretratamiento de 70 °C. Justo antes de alcanzar 70 °C, se añadió la 5 enzima licuefactante, es decir, una variante de α-amilasa S242Q (3 AAU por gramo de residuo seco de maíz) y se inició un temporizador para comenzar la incubación o la etapa de licuefacción primaria. La suspensión se incubó durante 30 minutos en presencia de la α-amilasa con o sin fitasa añadida (4 FTU por gramo de residuo seco de maíz). Aunque la fitasa se añadió al mismo tiempo que la α-amilasa en este ejemplo, se puede añadir antes de la amilasa. 10

[0290] La suspensión incubada se hizo pasar entonces por un jet cooker (225 °F; 107,2° C) que se precalentó a la temperatura deseada utilizando vapor y agua. La suspensión se envió a través del chorro de vapor a presión a la velocidad máxima (configuración 1,5) de aproximadamente 4 litros/minuto. La utilización de los tres primeros circuitos del serpentín de retención dio como resultado un tiempo de retención de poco más de 3 minutos. Después de desplazar toda el agua y de que la temperatura deseada se mantuviera estable, se recogió una 15 alícuota de masa de maíz solubilizada y se colocó en un baño secundario (agitación con varilla) a 85 °C para iniciar la etapa de licuefacción secundaria (2ª licuefacción). Se añadió una segunda dosis de S242Q (1 AAU/gm de residuo seco) y la licuefacción continuó durante 90 minutos más. Se tomaron muestras para analizar la viscosidad (mediante Brookfield) y la DE (mediante Schoorls) a los 0, 30, 60 y 90 minutos. Este licuado se utilizó en el Ejemplo 10B. 20

C. Jet cooking, convencional

[0291] Se preparó una suspensión de maíz molido entero (obtenido de Badger State Ethanol, Monroe, WI,) con agua que contenía 30 % volumen/volumen de vinaza a una concentración final de aproximadamente 32 % de residuo seco. Los sólidos de maíz se prepararon en una caldera con camisa calefactora. La suspensión se mezcló bien y se midió el pH de la suspensión (pH 5.2) y se ajustó a pH 5.8 con NaOH diluido. Esta suspensión 25 se mezcló en una caldera con camisa calefactora y se llevó a la temperatura de pretratamiento de 70 °C. Justo antes de alcanzar 70 °C, se añadió la enzima licuefactante, es decir, una variante de α-amilasa S242Q (3 AAU por gramo de residuo seco de maíz) y se inició un temporizador para comenzar la incubación o la etapa de licuefacción primaria. La suspensión se incubó durante 30 minutos en presencia de la α-amilasa sin fitasa añadida. 30

[0292] La suspensión incubada se hizo pasar entonces por un jet cooker (225 °F; 107,2° C) que se precalentó a la temperatura deseada utilizando vapor y agua. La suspensión se envió a través del chorro de vapor a presión a la velocidad máxima (configuración 1,5) de aproximadamente 4 litros/minuto. La utilización de los tres primeros circuitos del serpentín de retención dio como resultado un tiempo de retención de poco más de 3 minutos. Después de desplazar toda el agua y de que la temperatura deseada se mantuviera estable, se recogió una 35 alícuota de masa de maíz solubilizada y se colocó en un baño secundario (agitación con varilla) a 85 °C para iniciar la etapa de licuefacción secundaria (2ª licuefacción). Se añadió una segunda dosis de la variante de a-amilasa S242Q (1 AAU/gm de residuo seco) y la licuefacción continuó durante 90 minutos más. Se tomaron muestras para analizar la viscosidad (mediante Brookfield) y la DE (mediante Schoorls) a los 0, 30, 60 y 90 minutos. El experimento anterior con un pH de suspensión de 5.5. Véase la Figura 22. Este licuado se utilizó en 40 el Ejemplo 10A.

D. Resultados con y sin jet cooking

[0293] La adición de fitasa BP-17 durante la incubación (licuefacción primaria) redujo el contenido de ácido fítico del maíz molido entero de 0,60 % de residuo seco de maíz a 0,09 % de residuo seco de maíz (reducción >85 %) (Figura 21). También es muy evidente a partir de las Figuras 14 y 15 que las α-amilasas se inactivaron a una 45 temperatura de jet cooking de 225 °F (107 °C) basándose en el desarrollo del DE o en la reducción de la viscosidad. Sin embargo, la inclusión de fitasa antes del jet cooking (que se cree que elimina la inhibición del ácido fítico) dio como resultado un aumento significativo en la termoestabilidad de las α amilasas, como se muestra por la progresión del DE y la reducción de la viscosidad a 90 °C durante la etapa de licuefacción secundaria. Se observaron resultados similares con jet cooking (no se muestran los datos) como se muestra en 50 las Figuras 14 y 15.

Ejemplo 9. Efecto de la concentración de fitasa BP-17 en la estabilidad de la α-amilasa con pH bajo

[0294] Se estudió además el aumento en la termoestabilidad de la α amilasa debido a la eliminación de la inhibición del ácido fítico de la α amilasa. El ácido fítico se hidrolizó utilizando fitasa antes de la licuefacción secundaria de maíz molido entero y se determinó la mejora en la estabilidad de pH con un pH bajo. 55

[0295] En un experimento típico, se suspendió maíz molido entero al 32 % (residuo seco de maíz) utilizando una proporción de 70:30 de agua y vinaza. Se midió el pH de la suspensión y se observó que era pH 5.2. La suspensión se calentó a 70 °C utilizando agua y vapor en una caldera con camisa calefactora. Se añadieron la enzima de licuefacción, es decir, la variante de α-amilasa S242Q (4 AAU/gm de residuo seco de maíz) y

concentraciones distintas de BP-17 (0-12 FTU/gm de residuo seco de maíz), y la suspensión se pretrató manteniendo la temperatura a 70 °C durante 45 minutos. Tras 45 minutos de pretratamiento, la suspensión se colocó en un baño termostático a 90 °C. El licuado se agitó continuamente y se mantuvo a 90 °C durante 90 minutos. Se recogieron muestras a los 0, 30, 60 y 90 minutos. Se analizó el DE (utilizando el método Schoorls) y la viscosidad (viscosímetro Brookfield eje de 2 a 20 rpm) de todas las muestras. Los datos de progresión del DE 5 y de la viscosidad se resumen en las Figuras 16 y 17.

[0296] Los resultados de las Figuras 16 y 17 mostraron que la reducción de la inhibición del ácido fítico de la variante de α-amilasa S242Q dio como resultado un aumento significativo en la estabilidad de pH bajo para la actividad, como se demuestra por un aumento constante en la progresión del DE a 90 °C con una disminución concomitante en la viscosidad del licuado. Los datos mostraron claramente que la variante de α-amilasa S242Q 10 se puede utilizar satisfactoriamente en el proceso de licuefacción para maíz molido entero con un pH 5.2 si se elimina la inhibición del ácido fítico. En la Figura 21, se puede observar que el índice de progresión del DE aumenta con el aumento de la eliminación del ácido fítico y alcanza un máximo en 4 FTU/gm de residuo seco que indica que la fitasa aumenta la termoestabilidad de la variante de α-amilasa S242Q eliminando el ácido fítico de la suspensión. 15

Ejemplo 10. Efecto del pH

[0297] En este ejemplo se estudió el efecto del pH en la variante de α-amilasa S242Q.

[0298] En un experimento típico, se suspendió maíz molido entero al 32 % (residuo seco de maíz) utilizando una proporción de 70:30 de agua y vinaza. Se midió el pH de la suspensión y se observó que era pH 5.2. El pH se disminuyó a entre 4.2 y 4.8 utilizando H2SO4. La suspensión se calentó a 70 °C utilizando agua y vapor en una 20 caldera con camisa calefactora. Se añadieron la enzima de licuefacción, es decir, la variante S242Q (4 AAU/gm de residuo seco) y BP-17 (4 FTU/gm de residuo seco), y la suspensión se pretrató manteniendo la temperatura a 70 °C durante 45 minutos. Tras 45 minutos de pretratamiento, la suspensión se colocó en un baño termostático a 90 °C. El licuado se agitó continuamente y se mantuvo a 90 °C durante 90 minutos. Se recogieron muestras a los 0, 30, 60 y 90 minutos. Se analizó el DE (utilizando el método Schoorls) y la viscosidad (viscosímetro Brookfield 25 eje de 2 a 20 rpms) de todas las muestras. Los datos de progresión del DE y de la viscosidad se resumen en las Figuras 18 y 19.

[0299] Los resultados mostraron que la progresión del DE disminuyó con la disminución del pH de 5.2 a 4.5. La enzima se inactivó por completo a un pH 4.2.

Ejemplo 11. Efecto en la producción de etanol 30

[0300] Los licuados se utilizaron como materia prima de fermentación en la fermentación del etanol para la producción de alcohol. Se mezcló una suspensión de maíz molido entero (obtenido de Badger State Ethanol, Monroe, WI) con agua que contenía 30 % volumen/volumen de vinaza a una concentración final de aproximadamente 32 % de residuo seco.

A. Proceso convencional 35

[0301] Se utilizó el licuado del Ejemplo 8C (Licuado A).

[0302] Se ajustó el pH del licuado secundario a 4.2 utilizando H2SO4 antes de la etapa de sacarificación y fermentación simultánea (SSF).

B. pH bajo, jet cooking (dosis fraccionada)

[0303] Se utilizó el licuado del Ejemplo 8B (Licuado B). No se realizó ningún ajuste de pH antes de la SSF. 40

C. Sacarificación y fermentación simultánea

[0304] En cada experimento se obtuvieron las taras de los pesos de los recipientes antes de la preparación de los medios. Se colocó un licuado de 32 % de residuo seco de maíz (2 litros) en un matraz de 2 L. Se prepararon inóculos de levadura de Red Star Ethanol Red (RED STAR (Lesaffre)) añadiendo de 10 gramos de levadura y un gramo de glucosa a 40 gramos de agua bajo agitación moderada durante una hora. Se añadieron cinco mls de 45 cada inóculo a los fermentadores equilibrados, seguido por la adición de Etanol de G Zyme™ 480 (Danisco US Inc, Genencor Division) a 0,4 GAU/g de residuo seco (gds) de maíz para iniciar la sacarificación y fermentación simultánea. Se observó el peso bruto inicial y se colocó el matraz en un baño termostático mantenido a 32 °C. Las muestras se tomaron en diferentes intervalos de tiempo y se analizaron para determinar el contenido de carbohidrato y etanol utilizando HPLC. Las fermentaciones también se llevaron a cabo utilizando un kilogramo de 50 cada licuado y se midió la pérdida de peso durante la fermentación en diferentes intervalos de tiempo. Se midió el alcohol, basándose en la pérdida de peso debido a la pérdida de dióxido de carbono. En la conclusión de la fermentación, se obtuvo un peso bruto final. El caldo se transfirió cuantitativamente a un recipiente de fondo redondo de 5 L. La destilación se llevó a cabo al vacío hasta que se recogieron aproximadamente 800 mls de etanol en un receptáculo que contenía 200 mls de agua. El etanol se diluyó a 2 L y se analizó mediante HPLC. El 55

peso y el DS de los residuos de destilación se obtuvieron antes del secado. El análisis del almidón residual se llevó a cabo en los granos secos de destilería con solubles (DDGS). Los cálculos estequiométricos se llevaron a cabo basándose en la pérdida de peso, la destilación y el análisis de almidón residual.

[0305] Cálculo de etanol utilizando la pérdida de peso de CO2.

Producción de etanol (mmol) = pérdida de CO2 (g) / 88

Producción de etanol (g) = (pérdida de CO2 (g) / 88) * 92 => pérdida de CO2 (g) * 1,045

Producción de etanol (ml) = ((pérdida de CO2 (g) / 88) * 92) / 0,789 => pérdida de CO2 (g) x 1,325

[0306] Los datos de la Figura 20 muestran una diferencia principal en el contenido sin sulfato y ácido fítico entre 10 el proceso convencional y el proceso sin ajuste de pH. La eliminación de la inhibición del ácido fítico de la α amilasa termoestable en la incubación dio como resultado los granos secos de destilería con solubles (DDGS) con contenido de ácido fítico reducido, una cantidad de fosfato libre disponible mayor y sulfato reducido. De esta manera, el proceso sin ajuste de pH confiere estabilidad de pH con un pH bajo para las α amilasas termoestables licuefactantes en la licuefacción del almidón. 15

Ejemplo 12. Métodos adicionales

[0307] Se utilizaron los siguientes ensayos en los Ejemplos descritos a continuación. Cualquier desviación de los protocolos proporcionados a continuación se indica en los Ejemplos. En estos experimentos, se utilizó un espectrofotómetro para medir la absorbancia de los productos formados después de la finalización de las reacciones. 20

A. Determinación del contenido de proteína

Ensayo BCA (ácido bicinconínico)

[0308] En estos ensayos, se utilizó el ensayo BCA (Pierce) para determinar la concentración de proteína en muestras en la escala de placas de microtitulación (MTP, por sus siglas en inglés). En este sistema de ensayo, las soluciones químicas y de reactivo utilizadas fueron: reactivo de ensayo de proteína BCA y tampón de dilución 25 Pierce (50 mM de MES, pH 6.5, 2 mM de CaCl2, 0,005 % de TWEEN®-80). El equipo utilizado fue un lector de MTP SpectraMAX (tipo 340; Molecular Devices). Las placas de microtitulación se obtuvieron de Costar (tipo 9017).

[0309] En la prueba, se pipetearon 200 µl del Reactivo BCA dentro de cada pocillo, seguido de 20 µl de proteína diluida. Después de mezclar minuciosamente, las MTPs se incubaron durante 30 minutos a 37 °C. Se eliminaron 30 las burbujas de aire y se leyó la densidad óptica (OD) de la solución en los pocillos a 562 nm. Para determinar la concentración de proteína, la lectura de fondo se sustrajo de las lecturas de la muestra. La OD562 se representó gráficamente para las proteínas estándar (enzima purificada), para producir una curva estándar. La concentración de la proteína de las muestras se interpoló a partir de la curva estándar.

Ensayo Bradford 35

[0310] En estos ensayos, se utilizó el ensayo del reactivo de colorante Bradford (Quick Start) para determinar la concentración de proteína en muestras en la escala MTP. En este sistema de ensayo, las soluciones químicas y de reactivo utilizadas fueron: reactivo de colorante Bradford Quick Start (BIO-RAD nº de catalogo 500-0205), y tampón de dilución (10 mM de NaCl, 0,1 mM de CaCl2, 0,005 % de TWEEN®-80). El equipo utilizado fue un Robot Biomek FX (Beckman) y un lector de MTP SpectraMAX (tipo 340). Las placas de microtitulación se 40 obtuvieron de Costar (tipo 9017).

[0311] En el análisis, se pipetearon 200 µl de reactivo de colorante Bradford dentro de cada pocillo, seguido de 15 µl de dilución de tampón. Finalmente, se añadieron 10 µl de caldo de cultivo filtrado en los pocillos. Después de mezclar minuciosamente, las placas de microtitulación se incubaron durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. Se eliminaron las burbujas de aire y se leyeron las densidades ópticas de los pocillos a 45 595 nm. Para determinar la concentración de proteína, la lectura de fondo (es decir, a partir de pocillos no inoculados) se sustrajo de las lecturas de la muestra. Los valores de OD595 obtenidos proporcionan una medida relativa del contenido de proteína en las muestras.

B. Ensayo de micromuestra para analizar el rendimiento de la enzima

[0312] Los detergentes utilizados en este ensayo no contenían enzimas o las enzimas presentes en detergentes 50 comerciales se destruyeron mediante desactivación por calor como se describe en otra parte de este documento.

El equipo utilizado incluyó un termomezclador Eppendorf y un lector de MTP SpectraMAX (tipo 340). Las placas de microtitulación se obtuvieron de Costar (tipo 9017).

Preparación de detergente (AATCC HDL; condiciones de EE.UU.)

[0313] El agua Milli-Q se ajustó a 6 gpg de dureza de agua (Ca/Mg=3/1), y se añadió 1,5 g/l de detergente líquido de referencia estándar AATCC 2003 sin abrillantador. La solución detergente se agitó vigorosamente durante al 5 menos 15 minutos. Después, se añadieron 5 mM de HEPES (sin ácido) y se ajustó el pH a 8.0.

Ensayo de micromuestra de almidón de arroz para analizar el rendimiento de la amilasa

[0314] Los detergentes de prueba se prepararon como se describe en otra parte de este documento. El equipo utilizado incluyó una agitadora/incubadora New Brunswick Innova 4230 y un lector de MTP SpectraMAX (tipo 340). Las placas de microtitulación se obtuvieron de Corning (tipo 3641). Las muestras de almidón de arroz 10 refinado con pigmento color naranja (CS-28) se obtuvieron del Center for Test Materials (Centro de materiales de ensayo) (Vlaardingen, Países Bajos). Antes de cortar micro-muestras circulares de 0,25 pulgadas (6,35 mm), la tela se lavó con agua. Se colocaron dos micromuestras en cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos. El detergente de prueba se equilibró a 20 °C (Norte America) o 40 °C (Europa Occidental). Se añadieron 190 µl de solución detergente en cada pocillo de la placa de microtitulación, que contenían micro muestras. A 15 esta mezcla, se añadieron 10 µL de solución de enzima diluida. La placa de microtitulación se selló con una lámina adhesiva y se colocó en la incubadora durante 1 hora con agitación a 750 rpm a la temperatura de prueba deseada (normalmente 20 °C o 40 °C). Después de la incubación, se transfirieron 150 µl de la solución de cada pocillo a una placa de microtitulación nueva. Esta placa de microtitulación se leyó a 488 nm utilizando un lector de placas de microtitulación SpectraMAX para cuantificar la limpieza. Los controles en blanco, así como los 20 controles que contenían las micromuestras y el detergente, pero no enzima, también se incluyeron.

Cálculo del rendimiento de la enzima

[0315] El valor de absorbancia obtenido se corrigió para el valor del blanco (es decir, obtenido después de la incubación de las micromuestras en ausencia de enzima). La absorbancia resultante fue una medida de la actividad hidrolítica. 25

C. Determinación de la concentración de amilasa mediante titulación con anticuerpo

[0316] Como se describe en el presente documento, la concentración de α-amilasa y la actividad específica se determinó mediante titulación con un anticuerpo policlonal inhibidor. Se observó que los anticuerpos policlonales originados para α-amilasa de Bacillus stearothermophilus (AmyS) eran fuertes inhibidores de Amys y la α-amilasa de Bacillus sp. TS-23 (por ejemplo, la unión en lo suficientemente fuerte para producir una titulación 30 lineal de la pérdida de actividad). Por consiguiente, este anticuerpo se puede utilizar para medir la concentración de enzima, que a su vez se utiliza para calcular la actividad específica. En resumen, se mide la cantidad de inhibición enzimática producida por varias concentraciones de anticuerpo conocidas. A partir de esta información, la concentración de anticuerpo requerida para la inhibición completa se extrapola, que es equivalente a la concentración de enzima en la muestra. La actividad de la a-amilasa y la inhibición se midieron utilizando el 35 ensayo de almidón con BODIPY fluorogénico. El tampón fue de 50 mM de MOPS, pH 7.0, que contenía 0,005 % de Tween-80.

[0317] Un anticuerpo policlonal dirigido contra Amys purificadas se originó en un conejo y se purificó mediante métodos estándar. Se determinó un valor “de concentración aparente” empírico de una solución madre del anticuerpo midiendo la inhibición de una muestra de AmyS de actividad específica conocida. Entonces se utilizó 40 la muestra del anticuerpo para determinar la concentración y la actividad específica de las variantes AmyS y TS23t. Estos valores se utilizaron para crear placas madre enzimáticas de 96 pocillos normalizadas, donde todas las variantes se diluyeron a una concentración común.

D. Electroforesis en gel de la proteína nativa

[0318] Se midió la movilidad electroforética de muestras de variantes de proteína utilizando el sistema PhastGel 45 (GE Healthcare) en geles de poliacrilamida nativos prefabricados (PhastGel Homógeno) a una concentración ya sea de 7,5 % o de 12,5 %. Se utilizaron tiras de tampón (PhastGel Nativo) y consistieron en pH 8.8 en 0,88 M de L-Alanina, 0,25 M de tampón de Tris. Las condiciones normales del proceso consistieron en 400 V durante 12,75 minutos con una distancia de ánodo a cátodo de 3,7 cm.

[0319] De forma alternativa, la movilidad electroforética de las muestras de variantes de proteína se midió en 50 geles de agarosa de 1 mm de grosor al 0,5 % - 1,5 % con varios valores de pH (es decir, 5.8, 8.0 y 10.0) mediante una selección de un sistema de tampón adecuado. La electroforesis se lleva a cabo bajo condiciones no desnaturalizantes. La longitud del cátodo-ánodo fue de 13,9 cm. Se mezcló una muestra de 1-2 µg de proteína con 5 % de glicerol + 0,05 % de bromofenol azul y se cargó en cada calle. Los geles se procesaron normalmente durante 1 hora a 100 V. 55

[0320] En ambos casos, los geles se tiñeron con colorante azul Louisville disuelto en 10 % de ácido acético y se destiñeron con 10 % de metanol y 10 % de ácido acídico en agua. Es posible cargar entre 12 y 20 variantes de proteína simultáneamente, dependiendo del sistema de gel nativo utilizado. Como consecuencia, la movilidad electroforética de una variante de proteína se puede evaluar inmediatamente con relación a los estándares de escala de carga (charge ladder standards) en el mismo gel. 5

E. Inactivación del detergente por calor

[0321] La inactivación por calor de las fórmulas detergentes comerciales sirve para destruir la actividad enzimática de cualquier componente de proteína mientras se conservan las propiedades de los componentes no enzimáticos. De esta manera, este método fue adecuado para preparar detergentes adquiridos comercialmente para utilizarse en el análisis de variantes de la enzima. Para los detergentes para lavar la ropa líquidos de alta 10 resistencia (HDL, por sus siglas en inglés) de Norteamérica (NA) y de Europa Occidental (WE), la inactivación por calor se realizó colocando el detergente líquido previamente pesado (en una botella de vidrio) en un baño termostático a 95 °C durante 2 horas. El tiempo de incubación para la inactivación por calor del detergente para lavar la ropa granulado de alta resistencia (HDG, por sus siglas en inglés) de Norteamérica (NA) y Japón (JPN) fue de 8 horas y el tiempo de incubación para el detergente HDG de Europa Occidental (WE) fue de 5 horas. El 15 tiempo de incubación para la inactivación por calor de los detergentes para lavavajillas automáticos (ADW, por sus siglas en inglés) de NA y WE fue de 8 horas. Los detergentes se adquirieron en supermercados locales. Tanto los detergentes calentados como los no calentados se ensayaron durante los 5 minutos de disolución del detergente para determinar con precisión el porcentaje desactivado. La actividad de enzima se analizó mediante el ensayo suc-AAPF-pNA. 20

[0322] Para analizar la actividad enzimática en detergentes inactivados por calor, las disoluciones de detergentes operativas se prepararon a partir de los concentrados inactivados por calor. Las cantidades de dureza del agua adecuadas (6 gpg o 12 gpg) y el tampón se añadieron a las disoluciones detergentes para ajustarse a las condiciones deseadas (Tabla 12-1). Las disoluciones se mezclaron mediante agitación de vórtice o inversión de las botellas. 25

Tabla 12-1. Condiciones para lavado de ropa y lavavajillas

Región: Forma Dosis Detergente* Tampón Gpg pH T (°C)

Lavado de ropa (líquido y granulado de alta resistencia)

NA: HDL 0,78 g/l P&G TIDE® 2X 5 mM de HEPES 8.0

WE: HDL 5,0 g/L Henkel Persil 5 mM de HEPES 8.2

WE: HDG 8,0 g/L P&G Ariel 2 mM de Na2CO3 10.5

JPN: HDG 0,7 g/L P&G TIDE® 2 mM de Na2CO3 10.0

NA: HDG 1,0 g/L P&G TIDE® 2 mM de Na2CO3 10.0

Lavavajillas automático

WE: ADW 3,0 g/L RB Calgonit 2 mM de Na2CO3 10.0

NA: ADW 3,0 g/L P&G Cascade 2 mM de Na2CO3 10.0

* Abreviaciones: Procter & Gamble (P&G); y Reckitt Benckiser (RB).

F. Ensayo con Terg-o-tometer para determinar el rendimiento de la limpieza

[0323] Se utilizó un protocolo estándar para evaluar la limpieza de suciedad de proteína y carbohidrato por el que se midió el nivel de suciedad en una muestra de tela antes y después de la limpieza bajo condiciones estándar. Las muestras de tela consistieron en tela de algodón tejida manchada con almidón de maíz, almidón de arroz o 30 una mezcla de sangre, leche y negro de carbón, y se compraron de Testfabrics, Inc. (West Pittiston, PA). Las manchas técnicas de almidón de maíz (EMPA 161) y sangre, leche y negro de carbón (EMPA 116) se produjeron mediante materiales de prueba AG EMPA (St. Gallen, Suiza). Las manchas de almidón de arroz (CFT CS-28) las produjo el Center for Testmaterials BV (Vlaardingen, Países Bajos). Cada mancha se midió antes y después del tratamiento por reflectancia óptica utilizando un reflectómetro Minolta CR-410 ajustado a un iluminante estándar 35 D65 (6500 °K). La diferencia en los valores L, a, b se convirtió en una diferencia de color total (dE), como se define por el espacio de color CIE-LAB. La limpieza de las manchas se expresó como el índice de eliminación de manchas en porcentaje (% SRI, por sus siglas en inglés) tomando una relación entre la diferencia en color antes y después del lavado y comparándola con la diferencia de manchas no lavadas (antes del lavado) con respecto a la tela no manchada. 40

[0324] Los experimentos de limpieza se llevaron a cabo en un Terg-o-tometer (United States Testing Co., Hoboken, NJ) equipado con 6 recipientes de acero inoxidable de 2 L con agitadores en la parte superior. Cada tratamiento se llevó a cabo en un volumen total de 1 L que consistía en 6 granos por galón 3:1 (calcio:magnesio) de dureza de agua o en 12 granos por galón de dureza de agua. Los detergentes utilizados en los experimentos de lavado fueron 1,5 g/L de detergente líquido de AATCC HDL WOB 2003 con 5 mM de tampón de HEPES con 45 pH 8, 0,7 g/L de detergente granulado de AATCC HDD WOB 1993, 8 g/L de detergente granulado IEC A* 60456

con perborato y blanqueador TAED, o 5 g/L de detergente líquido Persil Power Gel. La enzima se agregó directamente a la solución de lavado y se iniciaron entonces las reacciones añadiendo 40 g/L o 200 g/L de tela manchada o de lastre. Las reacciones de lavado se agitaron a 100 rpm durante 10, 15 o 40 minutos a 20 °C, 25 °C, 30 °C, 40 °C, o 50 °C. Después de la limpieza, las muestras se enjuagaron durante 3 minutos con agua del grifo, se centrifugaron en una lavadora de carga frontal a 1000 rpm para eliminar el exceso de agua, y se 5 secaron en una secadora a baja temperatura en un ciclo de planchado permanente durante aproximadamente 45 minutos. La comparación del grado de eliminación de suciedad se evaluó mediante reflectometría y se expresó como el índice de eliminación de suciedad en porcentaje (% SRI). La condición de control no contuvo enzima y el control positivo consistió en varias dosis de enzimas comerciales de referencia.

G. Ensayo de almidón con BODIPY para la determinación de la actividad de la amilasa 10

[0325] El ensayo de almidón con Bodipy se llevó a cabo utilizando el kit de ensayo de ultra amilasa ENZCHEK® (E33651, Invitrogen). Se preparó 1 mg/mL de solución madre del sustrato de almidón DQ disolviendo el contenido del recipiente que contenía el sustrato liofilizado en 100 µL de 50 mM de tampón de acetato de sodio con pH 4.0. El recipiente se agitó en vórtice durante aproximadamente 20 segundos y se dejó a temperatura ambiente, en la oscuridad, mezclando ocasionalmente hasta que se disolvió. Se añadieron 900 µL de tampón de 15 ensayo (50 mM de acetato de sodio con 2,6 mM de CaCl2, pH 5.8) y el recipiente se agitó en vórtice durante aproximadamente 20 segundos. La solución de sustrato se almacenó a temperatura ambiente, en la oscuridad, hasta que estuvo lista para utilizarse o a 4 °C. Para el ensayo, se prepararon 100 µg/mL de solución operativa del sustrato DQ a partir de 1 mg/mL de solución del sustrato en el tampón de ensayo. Se añadieron 190 µL de 100 µg/mL de solución del sustrato en cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano. 20 Se añadieron 10 µL de las muestras de enzima en los pocillos, se mezcló durante 30 segundos utilizando un termomezclador a 800 rpm. Se incluyó en el ensayo una muestra en blanco que contenía tampón y sustrato solamente (blanco sin enzima). El índice de cambio de la intensidad de fluorescencia se midió (excitación: 485 nm, emisión: 520 nm) en un lector de placas de microtitulación de fluorescencia a 25 °C durante 5 minutos.

H. Hidrólisis de harina de maíz para determinar la actividad de la amilasa 25

[0326] Ensayo de hidrólisis del almidón del de sustrato de harina de maíz para la actividad enzimática. La harina de maíz orgánico (Azure Farms, lot nº 03227) se extendió uniformemente en una microplaca Greiner de 96 pocillos, con pocillos de tubo de fondo plano negros de polipropileno (nº de cat. 655209), utilizando un dispositivo de dispensación de sólidos (V&P Scientific). Se añadieron 85 µL de 20 mM de acetato de sodio con pH 5.6 en cada pocillo y se mezclaron. Se aplicó un sello de lámina en la parte superior de la placa y la placa se preincubó 30 a 70 °C en el termomezclador durante 20-30 minutos. Las muestras de enzima se diluyeron en la placa de polipropileno de Agilent (5042-1385) en 20 mM de tampón de acetato de sodio. Se añadieron 11 µL de muestras de enzimas diluidas a la placa del sustrato y la placa se selló firmemente con otra lámina. Las placas se transfirieron entonces a una incubadora/agitadora Vortemp 56 de Labnet con bloques de metal (nº de cat. S2056A), se precalentaron a 95 °C y se ajustó la velocidad de agitación a 500 rpm. La incubación continuó 35 durante 30 minutos. Al final de la incubación, las placas se enfriaron rápidamente en un cubo con hielo y la reacción de hidrólisis del almidón se detuvo mediante la adición de 100 µL de 0,1 N H2SO4 a cada pocillo. La placa se mezcló brevemente y los productos de la reacción de hidrólisis del almidón se analizaron o por el ensayo PAHBAH o por HPLC.

[0327] Detección colorimétrica de concentraciones de azúcar soluble a partir de la hidrólisis enzimática del 40 sustrato de harina de maíz. Se añadieron alícuotas de 80 µL de 0,5 N de NaOH a todos los pocillos de una placa de PCR vacía seguido de 20 µL de reactivo PAHBAH (5 % en peso/volumen de hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico (PAHBAH, Sigma # H9882, disuelto en 0,5 N de HCl) y se mezclaron (placa de reacción PAHBAH). Se añadieron 10 µL de los sobrenadantes de la reacción hidrolítica del almidón a la placa de reacción PAHBAH. Todas las placas se sellaron y se colocaron en el termociclador (MJ Research Tetrad), programado 45 durante 2 minutos a 95 °C, y después se enfriaron a 20 °C. Se transfirieron a una placa de lectura muestras de 80 µL de las mezclas de reacción PAHABH desarrolladas y se midió la absorbancia a 405 nm en un espectrofotómetro.

[0328] Determinación HPLC de concentraciones de azúcar soluble a partir de la hidrólisis enzimática del sustrato de harina de maíz. Los estándares de azúcar soluble (DP1-DP7) obtenidos de Sigma (St. Louis, MO) se 50 diluyeron todos en agua Mili-Q a 100 mg/mL y se utilizaron para convertir el área pico para los azúcares en concentraciones de azúcar reales. La placa inactivada del ensayo de hidrólisis del almidón se hizo girar en una centrifugadora Beclanan Coulter Allegra 6R durante 5 minutos a 3000 rpm a 25 °C. El sobrenadante se pipeteó a partir de la placa de giro y se transfirió a una placa de filtro Multiscreen-HV (nº de catálogo MAHVN4550). La placa de filtro se hizo girar sobre una placa HPLC de Agilent en la centrifugadora Hettich Rotanta durante 10 55 minutos a 6000 rpm a 25 °C. Se transfirieron 50 µL de 0,01 N de la fase móvil de ácido sulfúrico (0,1 N de ácido sulfúrico diluido 10X con agua Milli-Q) a cada pocillo de otra placa HPLC de Agilent limpia. La placa filtrada se mezcló brevemente y se transfirieron 50 µL del filtrado a los pocillos correspondientes en la placa con 50 µL de fase móvil por pocillo. Los estándares del azúcar diluido se añadieron a los pocillos vacíos de la placa para incluirse en la calibración. El contenido se mezcló brevemente en una agitadora de plataforma y la placa se 60 cubrió con una tapa con ranuras para pocillos de Nalgene. La columna HPLC (columna Bio-Rad Aminex HPX-

87H nº de cat. 125-0140) se preparó de antemano con 2 L de fase móvil funcionando a una velocidad de flujo constante de 0,6 mL/minuto. Todas las muestras de la placa se llevaron a cabo con un volumen de inyección de 20 µL y se analizaron utilizando AMINEXH.M y RID (índice de refracción) como detector. Después de completar el proceso, la velocidad de flujo en la HPLC disminuyó a 0,05 mL/min.

I. Determinación de la reducción de la viscosidad del almidón mediante amilasa 5

[0329] En este ensayo, se midió la reducción de la viscosidad de la solución del sustrato del almidón de maíz en un viscosímetro. La suspensión del sustrato de almidón de maíz se preparó nueva en el modo por lotes con 30 % de residuos secos de harina de maíz en agua destilada y se ajustó a un pH 5.8 utilizando ácido sulfúrico. Para cada proceso, se pesaron 50 gr de la suspensión (15 gramos de residuos secos) y se preincubaron durante 10 minutos para calentarlos a 70 °C. Después de la adición de la amilasa, la temperatura se elevó inmediatamente 10 de 70 °C a 85 °C con una velocidad de rotación de 75 rpm. Una vez que la temperatura de la mezcla de suspensión y amilasa alcanzó 85 °C, la temperatura se mantuvo constante y la viscosidad se monitorizó durante 30 minutos más.

J. Medición de la unión de la enzima a sustratos macromoleculares

[0330] Los ensayos de unión se realizaron para determinar la unión del sustrato de las variantes de la escala de 15 carga de Amilasa (AmyS) (cambio de carga = -12 a +12 con relación a la AmyS natural) a residuos y bagazo de maíz. Los sustratos utilizados incluyeron bagazo (bagazo de caña de azúcar de Brasil, pretratado con ácido diluido por el National Renewable Energy Laboratory, lavado y tamponado a pH 5), AFEX (residuo de maíz de expansión de fibra de amoníaco) y PCS (residuo de maíz pretratado con ácido sulfúrico diluido, lavado y ajustado a pH 5). Todos los sustratos se llevaron al porcentaje de sólidos deseado antes de utilizarse. 20

[0331] Unión de amilasa: Las variantes de la escala de carga de amilasa (Amylase charge ladder variants) se purificaron y se diluyeron a 200 ppm para analizarlas. Se preparó una solución de bagazo de celulosa al 1 % en tampón de borato (40 mM, pH 8.5, 0,016 % de Tween80). Se añadieron 150 µl de la solución de bagazo en cada pocillo en una placa de filtración de microtitulación. Se añadieron 150 µl de tampón de borato en un grupo de pocillos separados, que sirvieron como controles. Se añadieron 10 µl de variantes de la escala de carga de 25 amilasa en la placa de filtración, cada condición estaba por duplicado. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. El filtrado se recogió y la actividad de la amilasa en el sobrenadante se midió mediante el ensayo de almidón con BODIPY.

[0332] Medición de la unión de la enzima a micromuestras: Las variantes de amilasa se incubaron con o sin micromuestras de almidón de arroz CS-28 bajo condiciones de lavado estándar durante 30 minutos. La cantidad 30 de enzima libre se midió mediante el ensayo de almidón con BODIPY. La fracción de la unión de la enzima a las micromuestras se calculó como sigue: Fracción de unión = Actividad de la enzima en ausencia de muestra - Actividad de la enzima en presencia de muestra) / (Actividad de la enzima en ausencia de muestra).

K. Cuantificación de proteína de amilasa de Geobacillus stearothermophilus

[0333] La proteína de amilasa de G. stearothermophilus se cuantificó mediante inmunoensayo competitivo. En 35 resumen, la amilasa de G. stearothermophilus purificada se marcó con un colorante fluorescente (fluoresceína) y el anticuerpo con respecto a la amilasa de G. stearothermophilus se marcó con un colorante inhibidor de la fluorescencia (tetrametilrodamina). La señal de fluorescencia del conjugado de amilasa con fluoresceína se inactiva tras la unión del anticuerpo marcado con inhibidor. La presencia de amilasa libre en la muestra compite por el anticuerpo marcado con inhibidor, dando como resultado un aumento de la señal de fluorescencia. Por 40 consiguiente, la intensidad de la señal de fluorescencia es proporcional a la cantidad de amilasa libre en la muestra. El ensayo se calibró con amilasa de G. stearothermophilus purificada de concentraciones conocidas.

[0334] Marcado de la amilasa de G. stearothermophilus con colorante fluorescente: La amilasa de Geobacillus stearothermophilus purificada se marcó con isotiocianato de fluoresceína (Molecular Probes, Eugene OR) con pH 9.5 en 50 mM de tampón de carbonato de sodio según el protocolo del fabricante. Al final de la reacción, la 45 proteína se separó del colorante no unido mediante filtración de gel sobre Sephadex G-25 (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) en solución salina tamponada con fosfato.

[0335] Preparación del anticuerpo y marcado con colorante inhibidor: El anticuerpo con respecto a la amilasa de Geobacillus stearothermophilus se preparó mediante inmunizando conejos y recuperando el antisuero. El antisuero se almacenó a -20 °C hasta su uso. Se preparó la fracción de inmunoglobulina llevando a cabo la 50 precipitación de sulfato de amonio; se añadieron 15 ml de 3,75 M de sulfato de amonio a 20 ml de antisuero y se dejó reposar a 4 °C durante 60 minutos antes de la centrifugación a 2000 g para recuperar el precipitado. El precipitado recuperado se lavó dos veces mediante suspensión y sedimentación en 10 ml 1,6 M de sulfato de amonio helado. El precipitado final se disolvió en 4 ml de agua y se dializó frente a 50 mM de carbonato de sodio con pH 9.5 a 4 °C. Se estimó que la concentración de proteína fue 29,2 mg/ml mediante A280 utilizando el 55 coeficiente de extinción ε1 % = 15. La fracción de inmunoglobulina se marcó con isotiocianato de tetrametilrodamina (Sigma, St. Louis, MO) en 50 mM de carbonato de sodio pH 9.5. El colorante no unido se

eliminó entonces por filtración en gel en una columna de Sephadex G-25 equilibrada con solución salina tamponada con fosfato que contenía 0,1 % de desoxicolato.

[0336] Procedimiento del ensayo: El inmunoensayo se llevó a cabo en placas de microtitulación de 96 pocillos (Coming #3650). La concentración de la amilasa con fluoresceína se ajustó de manera que la concentración final en el ensayo fuera el centro de la curva estándar deseada. De forma similar, la concentración del anticuerpo 5 inhibidor se ajustó de tal manera que la concentración final permitiera la máxima modulación de la señal de fluorescencia. Utilizando un sistema de manipulación de líquidos automatizado, se añadieron 5 µL de muestra, 5 µL de amilasa con fluoresceína y 5 µL de anticuerpo inhibidor a 180 µL de solución salina tamponada con fosfato que contenía 2 % (peso/volumen) de polietilenglicol 8000 (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.). Después de agitar brevemente, las placas se dejaron incubar a temperatura ambiente durante una hora y la señal de fluorescencia 10 se determinó utilizando un lector de placas de fluorescencia (Molecular Devices) con filtros de excitación y emisión ajustados a 495 nm y 520 nm, respectivamente.

Ejemplo 13. Producción de amilasa en B. subtilis

[0337] En este ejemplo, se describen la producción de un mutante truncado de α amilasa de amilasa de G. stearothermophilus (que tiene una mutación S242Q y una deleción del aminoácido 29 del extremo C-terminal; 15 también referido en el presente documento como S242Q) y sus variantes en B. subtilis. La transformación se llevó a cabo como se conoce en la técnica (véase por ejemplo, WO 02/14490). En resumen, el gen que codifica las amilasas originales se clonó en el vector de expresión pHPLT, que contiene el promotor LAT (PLAT), una secuencia que codifica el péptido de señal LAT (preLAT), seguido por los sitios de restricción PstI y HpaI para la clonación. 20

[0338] La región de codificación para el péptido de señal LAT se muestra a continuación:

(SEQ ID Nº 20).

[0339] La secuencia de aminoácidos del péptido de señal LAT se muestra a continuación:

MKQQKRLYAR LLTLLFALIF LLPHSAASA (SEQ ID Nº 21) 25

[0340] La secuencia de aminoácidos de la amilasa S242Q madura truncada con el aminoácido sustituido que se muestra en cursiva se utilizó como base para hacer las genotecas de variantes descritas en el presente documento:

(SEQ ID Nº 22).

[0241] La región de codificación de la amilasa AmyS madura se muestra a continuación:

(SEQ ID Nº 23).

[0342] La secuencia de aminoácidos de la amilasa AmyS madura se utilizó como bases para hacer las genotecas de variantes AmyS y se proporciona como SEQ ID Nº 2.

[0343] Los productos de PCR se purificaron utilizando columnas Qiaquik de Quiagen, y se volvieron a suspender 25 en 50 µL de agua desionizada. Se asimilaron 50 µL del ADN purificado con HpaI (Roche) y PstI (Roche), y el ADN resultante se volvió a suspender en 30 µL de agua desionizada. Se clonaron 10-20 ng/µL del ADN en plásmido pHPLT utilizando los sitios de clonación PstI y HpaI. Las mezclas de ligación se transformaron directamente en células B. subtilis competentes (genotipo: Δvpr, ΔwprA, Δmpr-ybfJ, ΔnprB). Las células B. subtilis tienen un gen de competencia (comK) que se coloca bajo un promotor inducible de xilosa, por lo que se 30 utilizó xilosa para inducir competencia para la unión y absorción de ADN (véase, Hahn et al. (1996) Mol. Microbiol. 21:763-775).

[0344] Los elementos del plásmido pHPLT-AmyS incluyen: pUB 110 = fragmento de ADN del plásmido pUB110 (McKenzie et al. (1986) Plasmid 15: 93-103). Las características del plásmido incluyen: oripUB 110 = origen de la replicación de pUB110; neo = gen de resistencia a neomicina de pUB110, Plat = promotor de transcripción de la 35 amilasa de B. licheniformis; Pre LAT = péptido de señal de amilasa de B. licheniformis; SAMY 425ss = La región de codificación de la secuencia del gen de AmyS truncada (reemplazada por las regiones de codificación para cada variante de AmyS truncada expresada en este estudio); Terminador = terminador de transcripción de la amilasa de B. licheniformis.

Ejemplo 14. Expresión de variantes de enzima 40

[0345] Este ejemplo describe los métodos utilizados para expresar varias enzimas recombinantes de la B. subtilis transformada de los Ejemplos anteriores en una escala de 2 ml.

[0346] Los clones de B. subtilis que contienen los vectores de expresión de AmyS (o una de sus variantes) o de S242Q (o una de sus variantes) se replicaron con un replicador de 96 pocillos de acero a partir de concentrados de glicerol en placas de cultivo de 96 pocillos (BD, 353075) que contenían 150 µl de medio LB + 10 µg/ml de 45

neomicina, se cultivaron durante la noche a 37 °C, 220 rpm en un contenedor humidificado. Se utilizó una alícuota de 100 µl del cultivo de la noche para inocular 2000 µl de medio definido + 10 µg/ml de neomicina en tubos de cultivo de plástico de 5 ml. El medio de cultivo fue un medio semidefinido enriquecido basado en el tampón de MOPS, con urea como la fuente de nitrógeno principal, glucosa como la fuente de carbono principal, y se complementó con 1 % de soytone y 5 mM de calcio para un crecimiento celular fuerte. Los tubos del cultivo se 5 incubaron a 37 °C, 250 rpm, durante 72 horas. Después de esta incubación, los caldos de cultivo se centrifugaron durante 10 minutos a 3000 x g. La solución del sobrenadante se decantó en tubos cónicos de polipropileno de 15 ml y se alicuotaron 80 µL de cada muestra en placas de 96 pocillos para cuantificar la proteína.

Ejemplo 15. Producción de variantes de enzima 10

[0347] Este Ejemplo describe la producción de las escalas de carga de enzima y de las genotecas de carga de combinación.

Escalas de carga de enzima

[0348] Se seleccionan múltiples variantes de proteína que abarcan una gama de propiedades físicas de interés a partir de genotecas existentes o se generan mediantes técnicas de mutagénesis dirigida como se conoce en la 15 técnica (véase, por ejemplo, la publicación de la patente estadounidense nº 2008-0293610). Este grupo de proteínas sonda definido se ensaya entonces en un análisis de interés.

[0349] Se muestran ejemplos de variantes de escala de carga de amilasa en las tablas que aparecen a continuación y se ensayaron como se describe en el presente documento. En estas tablas, el cambio de carga es relativo a la enzima original. 20

[0350] Se proporcionó la secuencia del gen AmyS a Gene Oracle (Mountain View, CA) para sintetizar las 28 variantes de escalas de carga que se muestran en las Tablas 15-1 y 15-2. Gene Oracle sintetizó y clonó las variantes AmyS en el vector pGov4 y las transformó en E. coli. Se proporcionó a cada variante el ADN aislado de minipreps, así como una inserción de agar.

[0351] Las variantes eran PCR amplificado y clonado en el vector de expresión pHPLT de B. subtilis. Las 25 variantes se amplificaron como un fragmento PstI-HindIII del plásmido pGov4 utilizando cebadores:

Satori F 5'-CTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTC-3' (SEQ ID Nº 24); y

Satori R 5'-TTATCCTTTACCTTGTCTCCAAGC-3' (SEQ ID Nº 25).

[0352] Los productos de PCR se purificaron utilizando columnas Qiaquik de Quiagen, y se volvieron a suspender en 50 µL de agua milli-Q. Se asimilaron 50 µL del ADN purificado con HindIII (Roche) y PstI (Roche), y el ADN 30 resultante se volvió a suspender en 30 µL de agua desionizada. Se clonaron 10-20 ng/µL del ADN en plásmido pHPLT utilizando los sitios de clonación PstI y HpaI. Las mezclas de ligación se transformaron directamente en células B. subtilis competentes (genotipo: amyE::xylRPxylAcomK-phleo). Estas células de B. subtilis tienen un gen de competencia (comK) que se coloca bajo un promotor inducible de xilosa, por lo que se utilizó xilosa para inducir la competencia para la unión y la absorción de ADN. 35

Tabla 15-1. Primera escala de carga de AmyS

Número: Variante de AmyS Carga Δ

1-6

R308Q R483Q K171Q K383Q K447Q K471Q N28D N224D N271D N281D Q86E Q89E

-: 12

1-5

R308Q R483Q K171Q K383Q K447Q N28D N224D N271D N281D Q86E

-: 10

1-4

R308Q R483Q K171Q K383Q N28D N224D N271D N281D

-: 8

1-3

R308Q R483Q K171Q N28D N224D N271D

-: 6

1-2

R308Q R483Q N28D N224D

-: 4

1-1

R308Q N28D

-: 2

AmyS: Original

2-1: D318N N28R +2

2-2: D318N D306N N28R N224R +4

2-3: D318N D306N D19N N28R N224R N271R +6

2-4: D318N D306N D19N D393N N28R N224R N271R N281R +8

2-5: D318N D306N D19N D393N D458N N28R N224R N271R N281R Q86R +10

2-6: D318N D306N D19N D393N D458N E29Q N28R N224R N271R N281R Q86R Q89R +12

: Tabla 15-2. Segunda escala de carga de AmyS

3-7

Q97R Q319R Q358E Q443E N28D N224D N271D N281D Q86E Q89E R308Q R483Q K171Q K383Q K447Q K471Q

-: 12

3-6

Q97R Q319R Q358E Q443E N28D N224D N271D N281D Q86E R308Q R483Q K171Q K383Q K447Q

-: 10

3-5

Q97R Q319R Q358E Q443E N28D N224D N271D N281D R308Q R483Q K171Q K383Q

-: 8

3-4

Q97R Q319R Q358E Q443E N28D N224D N271D R308Q R483Q K171Q

-: 6

3-3

Q97R Q319R Q358E Q443E N28D N224D R308Q R483Q

-: 4

3-2

Q97R Q319R Q358E Q443E N28D

-: 2

3-1: Q97R Q319R Q358E Q443E

4-1: Q97R Q319R Q358E Q443E N28K D318N +2

4-2: Q97R Q319R Q358E Q443E N28K N224K D318N D306N +4

4-3: Q97R Q319R Q358E Q443E N28K N224K N271K D318N D306N D19N +6

4-4: Q97R Q319R Q358E Q443E N28K N224K N271K N281K D318N D306N D19N D393N +8

4-5: Q97R Q319R Q358E Q443E N28K N224K N271K N281K Q86R D318N D306N D19N D393N D458N +10

4-6: Q97R Q319R Q358E Q443E N28K N224K N271K N281K Q86R Q89R D318N D306N D19N D393N D458N E29Q +12

5-1

Q97R Q319R Q358E Q443E N28D R308Q S242E

-: 3

5-2

Q97R Q319R Q358E Q443E N28D N224D R308Q S242E

-: 4

5-3

Q97R Q319R Q358E Q443E N28D N224D R308Q S242Q

-: 3

Tabla 15-3. Escala de carga de AmyS-S242Q

Variante de AmyS-S242Q: Carga Δ

Q97E-Q319E-Q358E-Q443E

-: 4

Q97E-Q319E-Q358E

-: 3

Q97E-Q319E

-: 2

Q97E

-: 1

Q97R-Q319E

AmyS-S242Q original

Q97R: +1

Q97R-Q319R: +2

Q97R-Q319R-Q358R: +3

Q97R-Q319R-Q358R: +4

Genotecas de combinación de carga de enzima (CCL, por sus siglas en inglés): Generación de CCL de AmyS-S242Q de G. stearothermophilus

[0353] El ADN de plásmido de AmyS-S242Q se aisló de una cepa de B. subtilis transformada (genotipo: ΔaprE, 5 ΔnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) y se envió a DNA2.0 Inc. como la plantilla para la construcción de CCL. Se pidió a DNA2.0 Inc. (Mountain View, CA, EE.UU.) la generación de genotecas de posición en cada uno de los cuatro sitios en la amilasa AmyS-S242Q (S242Q) que se muestran en la Tabla 15-4. Las variantes se suministraron como concentrados de glicerol en placas de 96 pocillos.

[0354] La genoteca de carga de combinación de AmyS-S242Q se designó mediante la identificación de los 10 cuatro residuos siguientes: Gln-97, Gln 319, Gln 358 y Gln 443. Se creó un CCL de cuatro sitios, de 81 miembros realizando todas las combinaciones de tres posibilidades en cada sitio: amilasa natural, arginina o ácido aspártico.

Tabla 15-4. Variantes de CCL de S242Q

Variante #: Q97 Q319 Q358 Q443 Carga Δ

Q97E Q319E Q358E Q443E

-: 4

Q97E Q319E Q358E Q443R

-: 2

Q97E Q319E Q358E

-

-: 3

Q97E Q319E Q358R Q443E

-: 2

: Q97E Q319E Q358R Q443R

Tabla 15-4. Variantes de CCL de S242Q

Tabla 15-4. Variantes de CCL de S242Q

Variante #: Q97 Q319 Q358 Q443 Carga Δ

Q97E Q319E Q358R

-

-: 1

Q97E Q319E

-

Q443E

-: 3

Q97E Q319E

-

Q443R

-: 1

Q97E Q319E

-

-

-: 2

Q97E Q319R Q358E Q443E

-: 2

: Q97E Q319R Q358E Q443R

Q97E Q319R Q358E

-

-: 1

: Q97E Q319R Q358R Q443E

: Q97E Q319R Q358R Q443R +2

Q97E Q319R Q358R

-

+1

Q97E Q319R

-

Q443E

-: 1

Q97E Q319R

-

Q443R +1

Q97E Q319R

-

-

Q97E

-

Q358E Q443E

-: 3

Q97E

-

Q358E Q443R

-: 1

Q97E

-

Q358E

-

-: 2

Q97E

-

Q358R Q443E

-: 1

Q97E

-

Q358R Q443R +1

Q97E

-

Q358R

-

Q97E

-

-

Q443E

-: 2

Q97E

-

-

Q443R

Q97E

-

-

-

-: 1

Q97R Q319E Q358E Q443E

-: 2

: Q97R Q319E Q358E Q443R

Q97R Q319E Q358E

-

-: 1

: Q97R Q319E Q358R Q443E

: Q97R Q319E Q358R Q443R +2

Q97R Q319E Q358R

-

+1

Q97R Q319E

-

Q443E

-: 1

Q97R Q319E

-

Q443R +1

Q97R Q319E

-

-

: Q97R Q319R Q358E Q443E

: Q97R Q319R Q358E Q443R +2

Q97R Q319R Q358E

-

+1

: Q97R Q319R Q358R Q443E +2

: Q97R Q319R Q358R Q443R +4

Q97R Q319R Q358R

-

+3

Q97R Q319R

-

Q443E +1

Q97R Q319R

-

Q443R +3

Q97R Q319R

-

-

+2

Q97R

-

Q358E Q443E

-: 1

Q97R

-

Q358E Q443R +1

Q97R

-

Q358E

-

Q97R

-

Q358R Q443E +1

Q97R

-

Q358R Q443R +3

Q97R

-

Q358R

-

+2

Q97R

-

-

Q443E

Q97R

-

-

Q443R +2

Q97R

-

-

-

+1

-

Q319E Q358E Q443E

-: 3

-

Q319E Q358E Q443R

-: 1

Variante #: Q97 Q319 Q358 Q443 Carga Δ

-

Q319E Q358E

-

-: 2

-

Q319E Q358R Q443E

-: 1

-

Q319E Q358R Q443R +1

-

Q319E Q358R

-

-

Q319E

-

Q443E

-: 2

-

Q319E

-

Q443R

-

Q319E

-

-

-: 1

-

Q319R Q358E Q443E

-: 1

-

Q319R Q358E Q443R +1

-

Q319R Q358E

-

-

Q319R Q358R Q443E +1

-

Q319R Q358R Q443R +3

-

Q319R Q358R

-

+2

-

Q319R

-

Q443E

-

Q319R

-

Q443R +2

-

Q319R

-

-

+1

-

-

Q358E Q443E

-: 2

-

-

Q358E Q443R

-

-

Q358E

-

-: 1

-

-

Q358R Q443E

-

-

Q358R Q443R +2

-

-

Q358R

-

+1

-

-

-

Q443E

-: 1

-

-

-

Q443R +1

81 (original): Q97 Q319 Q358 Q443

Ejemplo 16. Rendimiento del lavado de enzima

[0355] Este Ejemplo describe el análisis de la variante S242Q en un ensayo de micromuestra de 1,0 µg/ml en detergente HDL de AATCC o 5 mM de tampón HEPES bajo resistencia iónica variable. Se utilizaron los métodos proporcionados en el Ejemplo 12 (véase, por ejemplo, “Ensayo de micromuestra de almidón de arroz para 5 analizar el rendimiento de la amilasa”).

[0356] Existe un cambio de carga neta óptima para el rendimiento de limpieza de la enzima en detergente HDL de AATCC. El rendimiento se mide en términos de rendimiento de limpieza relativo observado en un ensayo de la actividad de la micromuestra de almidón de arroz. Un valor de aproximadamente 1,0 indica el rendimiento de limpieza más alto en este ensayo. Esto es un ejemplo de la optimización de una propiedad física de la proteína 10 (por ejemplo, carga neta) para mejorar un resultado o beneficio dado (por ejemplo, el rendimiento de la limpieza en un detergente para ropa líquido). La carga óptima identificada con este grupo de proteínas sonda limitado coincide con la carga óptima observada cuando se mide la genoteca de combinación de carga completa. El uso de proteínas sonda es, por consiguiente, predictivo del comportamiento de toda la genoteca.

[0357] De acuerdo con la teoría de Debye-Hückel (Israelachivili, Intermolecular and Surface Forces, segunda 15 edición: With Applications to Colloidal and Biological Systems, Academic Press 2d Ed. [1992]), las interacciones electroestáticas están controladas principalmente por la resistencia de las fuerzas de doble capa entre las especies que interactúan a un potencial constante o carga constante (enzimas, sustratos, tela y detergente), su tamaño y la constante dieléctrica del medio circundante. Con el fin de caracterizar el comportamiento electroestático de las partículas en un medio complejo, tal como una formulación detergente, su interacción en un 20 ambiente reducido que posee la misma longitud de apantallamiento Debye es suficiente. Esto se logró seleccionando un tampón de pH y una conductividad coincidentes con los del detergente bajo condiciones de lavado. Un tampón apropiado para tal análisis es 5 mM de tampón HEPES con pH 8.0 con cantidades variables de electrolito indiferente, tal como NaCl. La adición de 2,5 mM de NaCl a este tampón coincide con el pH y la conductividad de las condiciones de lavado normales de América del Norte. La adición de 100 mM de NaCl es 25 representativo de las condiciones de lavado japonesas y europeas, normalmente más altas en resistencia iónica debido tanto al incremento de la dureza del agua como al de las concentraciones de detergente.

[0358] La Figura 23 muestra que las variantes S242Q de carga positiva eran mejores para limpiar las micromuestras de almidón de arroz bajo las condiciones de lavado de América del Norte. De forma similar, las

variantes de carga positiva de otra α-amilasa (es decir, TS23t) eran mejores para limpiar micromuestras de almidón de arroz bajo las condiciones de lavado de América del Norte (Figura 24), demostrando que las mutaciones de carga tienen un efecto similar en diferentes α-amilasas. Las variantes S242Q de carga positiva también muestran una actividad específica más alta para la hidrólisis de los sustratos de almidón de maíz granulado (Figura 25). 5

[0359] La licuefacción del almidón por parte de las variantes de escala de carga de AmyS se determinó monitorizando la viscosidad final tras la licuefacción del almidón de maíz. Un valor de viscosidad bajo es indicativo de descomposición de polisacáridos de almidón. Como se muestra en la Figura 14, se observó una carga óptima (por ejemplo, -4 a -2) en la licuefacción. Las variantes de Amys que fueron demasiado negativas (por ejemplo, -12 a -10) mostraron viscosidades finales muy elevadas, y las variantes que fueron demasiado 10 positivas (por ejemplo, +6 o mayor) mostraron viscosidades finales aún más elevadas (por ejemplo, fuera de los límites de la instrumentación de laboratorio debido a la sobrecarga de torsión).

Ejemplo 17. Termoestabilidad

[0360] Este Ejemplo describe la determinación de la relación entre la carga de la proteína y la estabilidad térmica. Los ensayos de amilasa se basaron en la hidrólisis del almidón con BODIPY antes y después de 15 calentar el sobrenadante del cultivo. Se utilizaron las mismas soluciones químicas y de reactivos que se describen en el Ejemplo 12.

Ensayo de estabilidad térmica para α-amilasas

[0361] Los sobrenadantes del cultivo filtrado se diluyeron en serie en 50 mM de acetato de sodio + 2 mM de CaCl2, pH 5.8, con 0,002 % de Tween. Se ensayaron 10 µl de cada sobrenadante del cultivo diluido para 20 determinar la actividad de amilasa inicial mediante el ensayo de almidón con BODIPY. Se colocaron 50 µl de cada sobrenadante del cultivo diluido en una placa de PCR de bajo perfil de 96 pocillos de VWR. Se agregaron 30 µL de aceite mineral en cada pocillo a modo de sellador. La placa se incubó en un ciclador térmico Peltier DNA engine de BioRad a 95 °C durante 30 o 60 minutos dependiendo de la estabilidad de la enzima original. Después de la incubación, la placa se enfrió a 4 °C durante 5 minutos y después se mantuvo a temperatura 25 ambiente. Se añadieron 10 µl de cada muestra a una placa nueva y se ensayó para determinar la actividad final de amilasa mediante el ensayo de almidón con BODIPY descrito en el Ejemplo 1.

Cálculo de la termoestabilidad

[0362] La actividad residual de una muestra se expresó como la relación de la absorbancia final y la absorbancia inicial, ambas corregidas para blancos. Un índice más alto indica una variante más estable térmicamente. Esto 30 es un ejemplo de la optimización de una propiedad física de una proteína, en este caso la carga neta, para mejorar la estabilidad térmica de la enzima para una aplicación de detergente para ropa líquido.

[0363] La termoestabilidad de las variantes se evaluó como se ha descrito anteriormente. Los ganadores en termoestabilidad de las CCL de S242Q se enumeran en la Tabla 17-1. Los ganadores se definen como los que tienen una relación de actividad residual del mutante con respecto a actividad residual de la enzima original (es 35 decir, S242Q) mayor que 1. La Figura 30 muestra la actividad residual de la primera escala de carga de AmyS como una función de cambio de carga en relación con la enzima natural. La estabilidad termal empleada en este ensayo se describe en el Ejemplo 12. Una vez más, como se muestra en la Figura, la acumulación de cargas negativas extremas (-12) o cargas positivas (+4) en relación con la enzima natural son perjudiciales para la estabilidad térmica. Esto es un ejemplo de la optimización de una propiedad física de una proteína, en este caso 40 la carga neta, para mejorar la estabilidad térmica de la enzima para una aplicación de detergente para ropa líquido.

Tabla 17-1: CCL de S242Q – ganadores en estabilidad térmica

Variante #: act. residual del mutante/act. residual de la enzima orig.

: Q97E Q319E Q358E Q443R 1,12

: Q97E Q319R Q358E Q443E 1,12

: Q97E Q319R Q358R Q443E 1,36

: Q97E Q319R Q358R Q443R 1,16

: Q97E Q319R Q358R 1,37

: Q97E Q319R Q443R 1,29

: Q97E Q319R 1,11

: Q97E 1,16

: Q97R Q319E Q358R Q443R 1,18

: Q97R Q319R Q358E Q443E 1,29

: Q97R Q319R Q358E Q443R 1,22

Variante #: act. residual del mutante/act. residual de la enzima orig.

: Q97R Q319R Q358E 1,21

: Q97R Q319R Q358R Q443E 1,20

: Q97R Q319R Q358R Q443R 1,26

: Q97R Q319R Q358R 1,48

: Q97R Q319R Q443E 1,21

: Q97R Q319R Q443R 1,21

: Q97R Q319R 1,14

: Q97R Q358R Q443R 1,14

: Q319E Q443R 1,26

: Q319E 1,18

: Q319R Q358E Q443E 1,19

: Q319R Q358E Q443R 1,28

: Q319R Q358R Q443R 1,14

: Q319R Q443E 1,22

: Q358E Q443E 1,15

: Q358E Q443R 1,15

: Q358E 1,18

Ejemplo 18. Rendimiento de la enzima

[0364] Este Ejemplo muestra que el rendimiento de la enzima puede verse afectado por la carga. El rendimiento de la enzima se evaluó utilizando detergentes inactivados por calor como se describe anteriormente en el Ejemplo 12. Los ganadores se definieron como los que tenían un Índice de Rendimiento (PI, por sus siglas en 5 inglés) mayor que 1. El PI es la relación de la actividad residual del mutante con respecto a la actividad residual de la enzima original (es decir, S242Q). Los resultados se muestran en las Tablas 18-1 y 18-2.

Tabla 18-1: CCL de S242Q – ganadores de micromuestra de almidón de arroz CS-28, Tide 2x (Condiciones de América del Norte como se describen en el Ejemplo 12)

Variante #: carga rel PI

: Q97E Q319R Q358R Q443E 1,44

: Q97E Q319R Q358R Q443R 1,32

: Q97E Q319R Q358R 1,40

Q97E Q319R Q443E

-: 1

1,33

: Q97E Q319R Q443R 1,40

: Q97E Q319R 1,41

Q97E Q358E Q443R

-: 1

1,15

: Q97E Q358R Q443R 1,21

Q97E Q443E

-: 2

1,18

: Q97E Q443R 1,25

Q97E

-: 1

1,16

Q97R Q319E Q358E Q443E

-: 2

2,32

: Q97R Q319E Q358E Q443R 2,54

Q97R Q319E Q358E

-: 1

2,93

: Q97R Q319E Q358R Q443E 2,27

: Q97R Q319E Q358R Q443R 2,28

: Q97R Q319E Q358R 2,34

Q97R Q319E Q443E

-: 1

2,31

: Q97R Q319E Q443R 2,31

: Q97R Q319E 2,14

: Q97R Q319R Q358E Q443E 1,93

: Q97R Q319R Q358E Q443R 1,85

: Q97R Q319R Q358E 2,14

: Q97R Q319R Q358R Q443E 1,92

: Q97R Q319R Q358R Q443R 1,37

Variante #: carga rel PI

: Q97R Q319R Q358R 1,61

: Q97R Q319R Q443E 1,90

: Q97R Q319R Q443R 1,64

: Q97R Q319R 1,99

Q97R Q358E Q443E

-: 1

1,40

: Q97R Q358E Q443R 1,29

: Q97R Q358E 1,60

: Q97R Q358R Q443E 1,57

: Q97R Q358R Q443R 1,38

: Q97R Q358R 1,37

: Q97R Q443E 1,51

: Q97R 1,51

: Q319E Q358E Q443E 1,14

: Q319E Q358E Q443R 1,38

: Q319E Q358E 1,10

Q319E Q358R Q443E

-: 1

1,25

: Q319E Q358R Q443R 1,41

: Q319E Q358R 1,49

: Q319E Q443E 1,16

: Q319E Q443R 1,45

Q319E

-: 1

1,28

: Q319R Q358E Q443E 1,12

: Q319R Q358E Q443R 1,19

: Q319R Q358E 1,36

: Q319R Q358R Q443E 1,24

: Q319R Q358R 1,19

: Q319R Q443E 1,29

: Q358R Q443E 1,22

: Q358R 1,25

Q443E

-: 1

1,24

: Q443R 1,17

Tabla 18-2: CCL de S242Q – ganadores de micromuestra de almidón de arroz CS-28, Persil (condiciones de Europa Occidental)

Variante #: carga rel PI

Q97E Q319E Q358E Q443R

-: 2

1,41

Q97E Q319E Q358E

-: 3

1,94

Q97E Q319E Q358R Q443E

-: 2

1,61

: Q97E Q319E Q358R Q443R 1,39

Q97E Q319E Q358R

-: 1

2,04

Q97E Q319E Q443E

-: 3

2,05

Q97E Q319E Q443R

-: 1

1,84

Q97E Q319E

-: 2

2,27

Q97E Q319R Q358E Q443E

-: 2

1,35

: Q97E Q319R Q358R Q443E 1,45

: Q97E Q319R Q358R Q443R 1,17

: Q97E Q319R Q358R 1,22

Q97E Q319R Q443E

-: 1

1,26

: Q97E Q319R Q443R 1,29

: Q97E Q319R 1,76

: Q97E Q443R 1,36

Variante #: carga rel PI

Q97E

-: 1

1,31

Q97R Q319E Q358E Q443E

-: 2

2,21

: Q97R Q319E Q358E Q443R 1,96

Q97R Q319E Q358E

-: 1

1,94

: Q97R Q319E Q358R Q443E 2,11

: Q97R Q319E G1358R Q443R 1,87

: Q97R Q319E Q358R 2,41

Q97R Q319E Q443E

-: 1

2,20

: Q97R Q319E Q443R 2,21

: Q97R Q319E 2,07

: Q97R Q319R Q358E Q443E 1,86

: Q97R Q319R Q358E Q443R 1,83

: Q97R Q319R Q358E 1,99

: Q97R Q319R Q358R Q443E 1,85

: Q97R Q319R Q358R Q443R 1,36

: Q97R Q319R Q358R 1,90

: Q97R Q319R Q443E 1,99

: Q97R Q319R Q443R 1,94

: Q97R Q319R 1,75

Q97R Q358E Q443E

-: 1

1,71

: Q97R Q358E Q443R 1,39

: Q97R Q358E 1,85

: Q97R G1358R Q443R 1,24

: Q97R Q358R 1,36

: Q97R Q443E 1,25

: Q97R 1,88

Q319E Q358E Q443E

-: 3

1,12

Q319E Q358E Q443R

-: 1

1,17

Q319E Q358R Q443E

-: 1

1,16

: Q319E Q358R Q443R 1,25

: Q319E Q358R 1,50

Q319E

-: 1

1,36

Q319R Q358E Q443E

-: 1

1,10

: Q319R Q358E Q443R 1,18

: Q319R Q358E 1,25

: Q319 R Q358R Q443E 1,29

: Q319R Q443E 1,15

[0365] La actividad también se midió utilizando el ensayo de hidrólisis de almidón con BODIPY como se proporciona en el presente documento. Los resultados se muestran en la Tabla 18-3. Una actividad específica relativa en este sustrato de almidón (un almidón de maíz) mayor que 1 indica que la variante tiene actividad específica mayor que la enzima S242Q original. El ppm relativo es el título de expresión de la variante en 5 relación con la enzima original, mayor que 1 indica títulos superiores (en tubos de agitación), que los de la enzima S242Q original.

Tabla 18-3: CCL de S242Q – ganadores de título y/o almidón con BODIPY

Variante #: Carga ppm rel act. específ. rel.

Q97E Q319E Q358E Q443E

-: 4

1,27 1,29

Q97E Q319E Q358E Q443R

-: 2

1,19 1,31

Q97E Q319E Q358E

-: 3

1,00 1,43

Q97E Q319E Q358R Q443E

-: 2

1,23 1,43

: Q97E Q319E Q358R Q443R 0,94 1,78

Q97E Q319E Q358R

-: 1

0,89 1,81

Variante #: Carga ppm rel act. específ. rel.

Q97E Q319E Q443E

-: 3

1,40 1,41

Q97E Q319E Q443R

-: 1

1,12 1,58

Q97E Q319E

-: 2

1,09 1,56

Q97E Q319R Q358E G1443E

-: 2

1,45 1,32

: Q97E Q319R Q358E Q443R 1,32 1,49

Q97E Q319R Q358E

-: 1

1,58 1,27

: Q97E Q319R Q358R Q443E 0,65 1,44

: G97E Q319R Q358R Q443R 0,66 1,65

: Q97E Q319R Q358R 0,80 1,64

Q97E Q319R Q443E

-: 1

1,09 1,51

: Q97E Q319R Q443R 1,00 1,42

: Q97E Q319R 0,87 1,78

Q97E Q358E Q443E

-: 3

1,22 0,88

Q97E Q358E

-: 2

1,12 0,88

Q97E Q358R Q443E

-: 1

0,91 1,16

: G97E Q358R Q443R 0,78 1,25

: Q97E Q358R 1,08 1,14

Q97E Q443E

-: 2

1,12 1,00

Q97R Q319E Q358E Q443E

-: 2

0,78 1,87

: Q97R Q319E Q358E Q443 R 0,80 1,81

Q97R Q319E Q358E

-: 1

0,68 2,21

: Q97R Q319E Q358R Q443E 0,68 1,96

: Q97R Q319E Q358R Q443R 0,70 2,05

: Q97R Q319E Q358R 0,60 2,27

Q97R Q319E Q443E

-: 1

0,65 2,25

: Q97R Q319E Q443R 0,70 2,15

: Q97R Q319E 0,73 2,23

: Q97R Q319R Q358E Q443E 0,93 2,11

: Q97R Q319R Q358E Q443R 0,65 2,21

: Q97R Q319R Q358E 0,82 2,22

: Q97R Q319R Q358R Q443E 0,74 2,28

: Q97R Q319R Q358R Q443R 0,55 2,09

: Q97R G319R Q358R 0,67 2,48

: Q97R Q319R Q443E 0,84 2,35

: Q97R Q319R Q443R 0,73 2,41

: Q97R Q319R 0,76 2,45

Q97R Q358E Q443E

-: 1

0,79 1,45

: Q97R Q97R Q358E Q443R 0,75 1,42

: Q97R Q358E 0,82 1,46

: Q97R Q358R Q443E 0,67 1,69

: Q97R Q358R Q443R 0,60 1,60

: Q97R Q358R 0,64 1,29

: Q97R Q443E 0,83 1,43

: Q97R 0,72 1,49

Q319E Q358E Q443E

-: 3

0,99 1,15

Q319E Q358E Q443R

-: 1

0,77 1,40

Q319E Q358E

-: 2

0,83 1,34

Q319E Q358R Q443E

-: 1

0,73 1,49

: Q319E Q358R Q443R 0,67 1,61

: Q319E Q358R 0,80 1,67

Q319E Q443E

-: 2

0,91 1,39

: Q319E Q443R 0,73 1,45

Variante #: Carga ppm rel act. específ. rel.

Q319E

-: 1

0,75 1,41

Q319R G358E Q443E

-: 1

1,05 1,28

: Q319R Q358E Q443R 0,94 1,42

: Q319R Q358E 0,96 1,39

: Q319R Q358R Q443E 1,02 1,50

: Q319R Q358R Q443R 0,71 1,57

: Q319R Q358R 0,71 1,58

: Q319R Q443E 0,91 1,49

: Q319R 0,95 1,56

: Q358R Q443R 0,67 1,22

: Q358R 0,66 1,15

Ejemplo 19. Equilibrio de los efectos de la mutación en la actividad y la expresión de la amilasa

[0366] Este Ejemplo muestra que dos propiedades enzimáticas en conflicto se pueden optimizar simultáneamente mediante la introducción de múltiples sustituciones de aminoácidos.

[0367] Como se determinó durante la experimentación, la expresión media de AmyS-242Q disminuyó con un 5 aumento de la carga positiva. No obstante, la hidrólisis del almidón con BODIPY específica aumentó con el aumento de la carga positiva. La expresión de la amilasa recombinante mejorada y la hidrólisis del almidón son deseables en una variante modificada de AmyS-242Q adecuada para la licuefacción del almidón en la industria del etanol como combustible o en la limpieza en aplicaciones detergentes, por ejemplo. Sin embargo, estas propiedades son aparentemente propiedades en conflicto. Como se determinó durante la experimentación, es 10 posible producir una variante de amilasa más altamente expresada sin comprometer gravemente la hidrólisis del almidón mediante la combinación selectiva de mutaciones individuales. La estrategia descrita en el presente documento se utilizó satisfactoriamente para producir y seleccionar variantes de AmyS-242Q con muchas sustituciones que presentan mejoras en una primera propiedad (por ejemplo, la expresión como la propiedad principal), mientras se mejora o no se sacrifica una segunda propiedad (por ejemplo, la hidrólisis del almidón 15 como la propiedad secundaria).

[0368] Además, opuesta a la expresión media de las variantes AmyS-242Q, la limpieza de micromuestras de almidón de maíz aumentó con el aumento de la carga positiva. La expresión de la amilasa recombinante mejorada y el rendimiento de la limpieza son deseables en una variante modificada de AmyS-242Q adecuada para la licuefacción del almidón en la industria del etanol como combustible o en la limpieza en aplicaciones 20 detergentes, por ejemplo. Sin embargo, estas propiedades también son aparentemente propiedades en conflicto. Como se determinó durante la experimentación, es posible producir una variante de amilasa más altamente expresada sin comprometer gravemente el rendimiento de la limpieza mediante la combinación selectiva de mutaciones individuales. La estrategia descrita en el presente documento se utilizó satisfactoriamente para producir y seleccionar variantes de AmyS-242Q con muchas sustituciones que presentan mejoras en una 25 primera propiedad (por ejemplo, la expresión como la propiedad principal), mientras se mejora o no se sacrifica una segunda propiedad (por ejemplo, la limpieza de micromuestras de almidón de arroz como la propiedad secundaria).

[0369] En concreto, una genoteca de combinación de carga de AmyS-S242Q de 80 miembros que comprendía variantes que tenían combinaciones de desde una a cuatro sustituciones de residuos cargados se analizó para 30 determinar la expresión en tubo de agitación, la hidrólisis del almidón con BODIPY y la actividad de limpieza del almidón de arroz. Los ganadores AmyS-S242Q se muestran en las Tablas 19-1 y 19-2. Es importante destacar que las variantes con muchas sustituciones de la Tabla 19-1 tienen una expresión igual o mejorada y una hidrólisis de almidón con BODIPY igual o mejorada en comparación con la enzima original. De manera similar, las variantes con muchas sustituciones de la Tabla 19-2 tienen una expresión igual o mejorada y una actividad 35 de limpieza del almidón de arroz igual o mejorada en comparación con la enzima original.

Tabla 19-1. Ganadores de expresión y de hidrólisis de almidón con BODIPY de AmyS-S242Q

Variante: Carga Expresión (PI) BODIPY (PI)

Q97E Q319E Q358E Q443E

-: 4

1,27 1,29

Q97E Q319E Q358E Q443R

-: 2

1,19 1,31

Q97E Q319E Q358E

-: 3

1,00 1,43

Q97E Q319E Q358R Q443E

-: 2

1,23 1,43

Q97E Q319E Q443E

-: 3

1,40 1,41

Q97E Q319E Q443R

-: 1

1,12 1,58

Variante: Carga Expresión (PI) BODIPY (PI)

Q97E Q319E

-: 2

1,09 1,56

Q97E Q319R Q358E Q443E

-: 2

1,45 1,32

: Q97E Q319R Q358E Q443R 1,32 1,49

Q97E Q319R Q358E

-: 1

1,58 1,27

Q97E Q319R Q443E

-: 1

1,09 1,51

: Q97E Q319R Q443R +1 1,00 1,42

: Q97E Q358R 1,08 1,14

Q97E Q443E

-: 2

1,12 1,00

Q319R Q358E Q443E

-: 1

1,05 1,28

: Q319R Q358R Q443E +1 1,02 1,50

Tabla 19-2. Ganadores de expresión y de hidrólisis de almidón de arroz de AmyS-S242Q

Variante: Carga Expresión CS-28

Q97E Q319E Q358E Q443E

-: 4

1,27 1,01

: Q97E Q319R Q358E Q443R 1,32 1,18

Q97E Q319R Q358E

-: 1

1,58 1,13

Q97E Q319R Q443E

-: 1

1,09 1,43

: Q97E Q319R Q443R +1 1,00 1,55

: Q97E Q358R Q358R 1,08 1,15

Q97E Q443E

-: 2

1,12 1,09

Q319R Q358E Q443E

-: 1

1,05 1,18

: Q319R Q358R Q443E +1 1,02 1,15

[0370] En resumen, debido a que la actividad enzimática y la producción enzimática tienen dependencias de carga diferentes (véanse las Figuras, 27A, 27B, 28A y 28B) están negativamente correlacionadas (véanse las 5 Figuras 26A y 26B). No obstante, existen un número de variantes que se mejoran en ambas, expresión y actividad, y analizar la genoteca de esta manera permite identificarlas.

[0371] Aunque se muestra con amilasas, este método es aplicable a otras clases de enzimas tales como proteasas, lipasas, celulasas, transferasas y pectinasas. Además, cualquier combinación de dos o más propiedades se puede analizar simultáneamente tales como expresión, actividad, unión, estabilidad térmica y 10 estabilidad quelante y detergente.

Ejemplo 20 – Limpieza de micromuestra e hidrólisis de almidón

[0372] El rendimiento de la enzima se evaluó utilizando detergentes inactivados por calor como se describe anteriormente. Los ensayos se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 12 (véase “Ensayo de micromuestra de almidón de arroz para analizar el rendimiento de la amilasa” y “Ensayo de almidón con BODIPY 15 para la determinación de la actividad de la amilasa”). Los ganadores se definen como los que tienen un Índice de Rendimiento (PI, por sus siglas en inglés) mayor que 1. El PI es la relación de la actividad residual del mutante con respecto a la actividad residual de la enzima natural. La Tabla 20-1 muestra los cálculos de las variantes AmyS que son mejores que la enzima natural (ΔΔG <0) en comparación con los resultados de cambio de carga (Δ CHRG). El cambio de carga, Kyte-Doolittle, Eisenberg y la unión de hidrógeno se definen en WO 20 2008/153925, presentada el 6 de junio de 2008. Además, la Tabla 20-1 muestra los resultados de hidropaticidad de Kyte-Doolittle (Δ K-D) y de las escalas de hidrofobicidad de Eisenberg (Δ E). La Tabla 20-1 también muestra los valores de la unión de hidrógeno (Δ HB), con un resultado de -2 significando la pérdida de capacidad de unión de hidrógeno. La Tabla 20-1 muestra los cálculos de las variantes AmyS que son mejores que la enzima natural con respecto a la hidrólisis de harina de maíz a 5, 10 y 60 minutos (CF5, CF10, CF60), actividad sobre 25 sustratos DP7 con pH 4.0 y 5.8 (pH 4, pH 5.8), limpieza del almidón de arroz con pH 8.6 y 10 (Limpieza 8 y Limpieza 10) y expresión de proteína en B. subtilis (EXP). El efecto de la carga en la actividad tiene el sentido opuesto al efecto de la carga en la expresión. La unión de hidrógeno y la hidrofobicidad también muestran efectos estadísticamente relevantes en estas propiedades. Evidentemente, las propiedades de las sustituciones de aminoácidos tales como carga e hidrofobicidad pueden afectar a los niveles de expresión en B. subtilis y E. 30 coli, así como a la actividad básica y a la estabilidad de las proteínas.

Tabla 20-1. Quintiles de AmyS para múltiples propiedades

AmyS: o/e AmyS o/e AmyS o/e AmyS o/e

CF5 ΔΔG Δ CHRG -2: 1,60 CF5 ΔΔG Δ HB -2 0,84 CF5 ΔΔG Δ K-D -2 1,12 CF5 ΔΔG Δ E -2 1,13

Δ CHRG -1: 1,29 Δ HB -1 0,98 Δ K-D -1 1,19 Δ E -1 1,09

Δ CHRG 0: 0,97 Δ HB 0 1,02 Δ K-D 0 0,83 Δ E 0 1,05

Δ CHRG +1: 0,84 Δ HB +1 0,92 Δ K-D +1 1,15 ΔE+1 0,89

Δ CHRG +2: 0,56 Δ HB +2 1,19 Δ K-D +2 0,77 ΔE +2 1,12

CF10 ΔΔG Δ CHRG -2: 1,66 CF10 ΔΔG Δ HB -2 0,86 CF10 ΔΔG Δ K-D-2 1,10 CF10 ΔΔG Δ E -2 1,26

Δ CHRG -1: 1,18 Δ HB -1 1,00 Δ K-D -1 1,15 Δ E -1 1,04

Δ HRG 0: 0,97 Δ HB 0 1,02 Δ K-D 0 0,86 ΔE 0 1,08

Δ CHRG +1: 0,91 Δ HB +1 0,97 Δ K-D +1 1,12 Δ E +1 0,90

Δ CHRG +2: 0,77 Δ HB +2 1,12 Δ K-D +2 0,82 Δ E +2 1,16

CF60 ΔΔG Δ CHRG -2: 1,46 CF60 ΔΔG Δ HB -2 1,00 CF60 ΔΔG A K-D -2 0,94 CF60 ΔΔG Δ E -2 0,98

Δ CHRG -1: 1,33 Δ HB -1 0,96 Δ K-D -1 1,15 Δ E -1 1,01

Δ CHRG 0: 0,96 Δ HB 0 1,01 Δ K-D 0 0,79 Δ E 0 1,05

Δ CHRG +1: 0,84 Δ HB +1 0,95 Δ K-D+1 1,16 Δ E+1 0,94

Δ CHRG +2: 0,82 Δ HB +2 1,05 Δ K-D +2 0,89 Δ E +2 1,54

pH4 ΔΔG Δ CHRG -2: 1,63 pH4 ΔΔG Δ HB -2 0,91 pH4 ΔΔG Δ K-D -2 1,29 pH4 ΔΔG Δ E -2 1,07

Δ CHRG -1: 1,28 Δ HB -1 0,89 Δ K-D -1 1,19 Δ E -1 1,13

Δ CHRG 0: 0,96 Δ HB 0 0,97 Δ K-D 0 0,72 Δ E 0 1,01

Δ CHRG +1: 0,88 Δ HB +1 0,93 Δ K-D +1 1,12 Δ E +1 0,89

Δ CHRG +2: 0,19 Δ HB +2 1,26 Δ K-D +2 0,86 Δ E +2 0,95

pH5.8 ΔΔG Δ CHRG -2: 1,66 pH5.8 ΔΔG A HB -2 0,99 pH5.8 ΔΔG Δ K-D -2 1,00 pH5.8 ΔΔG Δ E -2 1,23

Δ CHRG -1: 1,26 Δ HB -1 0,99 Δ K-D -1 1,17 Δ E -1 1,06

Δ CHRG 0: 0,95 Δ HB 0 0,95 Δ K-D 0 0,80 Δ E 0 0,99

Δ CHRG +1: 0,94 Δ HB +1 0,90 Δ K-D +1 1,08 ΔE+1 0,94

Δ CHRG +2: 0,83 Δ HB +2 1,15 Δ K-D +2 0,92 Δ E +2 1,16

Limpieza 8 ΔΔG Δ CHRG -2: 1,34 Limpieza 8 ΔΔG Δ HB -2 1,07 Limpieza 8 ΔΔG Δ K-D -2 0,89 Limpieza 8 ΔΔG Δ E -2 0,88

Δ CHRG -1: 1,22 Δ HB -1 1,02 Δ K-D -1 1,10 Δ E -1 0,98

Δ CHRG 0: 0,96 Δ HB 0 0,96 Δ K-D 0 0,83 ΔE 0 1,00

Δ CHRG +1: 0,94 Δ HB +1 0,90 Δ K-D +1 1,07 Δ E +1 1,01

Δ CHRG +2: 0,62 Δ HB +2 1,05 Δ K-D +2 1,02 Δ E +2 1,32

Limpieza 10 ΔΔG Δ CHRG -2: 1,32 Limpieza 10 ΔΔG Δ HB -2 0,86 Limpieza 10 ΔΔG Δ K-D -2 1,03 Limpieza 10 ΔΔG Δ E -2 0,81

Δ CHRG -1: 1,43 Δ HB -1 1,36 Δ K-D-1 1,11 ΔE -1 1,03

Tabla 20-1. Quintiles de AmyS para múltiples propiedades

AmyS: o/e AmyS o/e AmyS o/e AmyS o/e

Δ CHRG 0: 0,92 Δ HB 0 0,72 Δ K-D 0 0,80 ΔE 0 1,00

Δ CHRG +1: 0,88 Δ HB +1 1,07 Δ K-D +1 1,16 Δ E +1 0,97

Δ CHRG +2: 0,74 Δ HB +2 1,11 Δ K-D +2 0,91 Δ E +2 1,48

EXP ΔΔG Δ CHRG -2: 0,00 EXP ΔΔG Δ HB -2 0,63 EXP ΔΔG Δ K-D -2 0,65 EXP ΔΔG Δ E -2 0,71

Δ CHRG -1: 0,35 Δ HB -1 0,91 Δ K-D -1 1,11 Δ E -1 1,29

Δ CHRG 0: 1,08 Δ HB 0 0,95 Δ K-D 0 1,49 Δ E 0 1,06

Δ CHRG +1: 1,35 Δ HB +1 1,39 Δ K-D +1 0,77 Δ E +1 0,79

Δ CHRG +2: 1,64 Δ HB +2 1,16 Δ K-D +2 0,72 Δ E +2 0,20

Ejemplo 21. Modulación de un perfil pH-actividad de una enzima

[0373] Este Ejemplo describe la utilización de mutaciones de carga de superficie para optimizar un perfil pH-actividad de una enzima para una reacción dada. La Figura 31A muestra la actividad de limpieza de micromuestra de almidón de arroz como una función del pH para la primera escala de carga de AmyS del 5 Ejemplo 15. El intervalo de pH desde 3.0 hasta 4.25 estuvo en 200 mM de formiato de Na que contenía Tween-80 al 0,01 %, mientras que el intervalo de pH desde 4.25 hasta 5.5 estuvo 200 mM de en acetato de Na que contenía Tween-80 al 0,01 %. Los datos se ajustan a las curvas de titulación, cada una con un valor pKa individual. La Figura 31B muestra un pKa aparente para catálisis de AmyS como una función del cambio de carga para la primera escala de carga de AmyS del Ejemplo 15. Estos datos muestran que los perfiles pH-10 actividad de una α-amilasa pueden cambiarse significativamente mediante mutaciones de carga de superficie, incluso en tampón de 200 mM. Aunque esto se ha reportado a una resistencia iónica muy baja para subtilisina (Russell et al. (1987) J Mol Biol. 193: 803-13) y para D-xilosa isomerasa (Cha et al. (1998) Mol Cell. 8:374-82), se cree que es la primera vea que esto se ha realizado con α-amilasa, y sorprendentemente, incluso a una resistencia iónica alta. 15

Ejemplo 22. Supercribado de AmyS

[0374] Los siguientes ensayos se utilizaron en los ejemplos que se describen a continuación. Cualquier desviación de los protocolos proporcionados a continuación se indica en los ejemplos. En estos experimentos, se utilizó un espectrofotómetro de 96 pocillos para medir la absorbancia de los productos formados después de la finalización de las reacciones. 20

Ensayo de hidrólisis de almidón para la determinación de la actividad específica y estabilidad térmica

[0375] Se llevó a cabo un ensayo de la actividad de la α-amilasa en harina de maíz para medir la actividad específica y la estabilidad de AmyS de B. subtilis y variantes de AmyS. Se utilizaron las condiciones que más se asemejaban a las aplicaciones del mundo real en la limpieza y el procesamiento del grano. La actividad se define como extremos reductores generados debido a la descomposición enzimática de la harina de maíz, determinada 25 por el método PAHBAH (hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico). La estabilidad se define como actividad sostenida a 85 °C.

[0376] Hardware: Variomag Teleshake 95 de Inheco con adaptador de placa de PCR, Multidrop de Thermo Electron, placa de PCR PCR-96-FS-C con faldilla amplia de Axygen, Termocicladores - con un mínimo de 4 bloques de 96 pocillos (un MJ Research Tetrad), manipuladores de líquidos Biomek FX. 30

[0377] Hidrólisis del almidón: Se utilizó harina de maíz orgánico de Azure Farms, tamizada para fines de manejo de líquidos, para obtener la fracción < 600 micras, se horneó 4 horas a 80 °C, después se dejó equilibrar durante la noche a temperatura ambiente. Se preparó una suspensión al 2 % en peso/peso en lotes de 500 g y 1000 g. La suspensión se agitó vigorosa y continuamente durante el ajuste de pH, el equilibrado de pH y el traslado del vaso de precipitados a la placa de PCR. Para 1000 g, se agitaron durante 15 minutos 23 g de harina de maíz 35 prehorneada y 977 g de agua desionizada casera, se ajustaron con H2SO4 a pH 5.8 y se dejó equilibrar durante 30 minutos, punto en el cual se realizó un ajuste final de pH si fue necesario. Se utilizaron pipetas de 8 canales con las puntas recortadas para un tamaño de apertura de aproximadamente 1,5 mm para distribuir la suspensión en los pocillos de las placas de PRC de Axygen.

[0378] Los sobrenadantes del cultivo de AmyS y de las variantes de AmyS se diluyeron a aproximadamente 40 1 µg/mL en un tampón de dilución (agua + 0,005 % de Tween-80) y 10 µL de sobrenadante diluido se transfirieron a las placas de reacción de 5 minutos, 10 minutos y 60 minutos y se mezcló una vez pipeteando la muestra arriba y abajo. Se transfirió una alícuota de 50 µL de aceite mineral ligero a cada pocillo. Las placas se transfirieron a las unidades de Inheco precalentadas a 85 °C. En los puntos de tiempo indicados tras la

incubación (5, 10 y 60 minutos), se detuvo la reacción de hidrólisis de almidón por adición de 10 µL de 4 N de NaOH en cada pocillo. Los productos de la reacción de la hidrólisis de almidón se analizaron mediante el ensayo PAHBAH.

[0379] Ensayo PAHBAH: Se añadieron alícuotas de 80 µL de 0,5 N de NaOH a todos los pocillos de una placa de PCR vacía seguido de 20 µL del reactivo PAHBAH (5 % en peso/volumen de hidrazida de ácido p-5 hidroxibenzoico (PAHBAH, Sigma # H9882, disuelto en 0,5 N de HCl) y se mezclaron pipeteando arriba y abajo (placa de reacción PAHBAH). Se añadieron 10 µL de los sobrenadantes de la reacción hidrolítica del almidón a la placa de reacción PAHBAH. Todas las placas se sellaron y se colocaron en el termociclador, programado durante 2 minutos a 95 °C, y después se enfriaron a 20 °C. Las muestras de 80 µL de las mezclas de reacción PAHABH desarrolladas se transfirieron a una placa (de lectura) nueva y se midió la absorbancia a 405 nm en un 10 espectrofotómetro.

Ensayo de limpieza de muestras para determinar el rendimiento de eliminación de manchas

[0380] En este ensayo, el rendimiento de eliminación de manchas de las AmyS de B. subtilis y de las variantes de AmyS se determinó en una escala de placa de microtitulación utilizando micromuestras manchadas de almidón de arroz CS-28. Se obtuvieron micromuestras de diámetro circular de ¼" de CFT Vlaardingen (Países 15 Bajos). Se colocaron dos micromuestras en cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos.

[0381] Se analizaron las muestras del caldo de cultivo filtrado a una concentración adecuada mediante dilución con una mezcla de 10 mM de NaCl, 0,1 mM de CaCl2, 0,005 % de Tween-80 a 20× la concentración final deseada en el análisis de rendimiento (conc. final en el análisis 0,025 - 0,10 ppm).

[0382] Se midió el rendimiento de la amilasa tanto con pH 8 como con pH 10. 20

[0383] A cada pocillo de las placas que contenían micromuestras se añadieron o 190 µl de solución tampón que contenía 25 mM de HEPES (Sigma, H7523), 2 mM de CaCl2, 0,005 % de Tween-80, pH 8.0, o 190 µl de solución tampón que contenía 25 mM de CAPS (Sigma, C2632), 2 mM de CaCl2, 0,005 % de Tween-80, pH 10.0. Se añadieron 10 µL de muestras de amilasas diluidas a cada pocillo que contenía micromuestras (para proporcionar un volumen total de 200 µL/pocillo). La placa se cubrió con un sello de placa y se colocó en una incubadora 25 durante 60 minutos a 40 °C, con agitación a 1150 rpm (incubadora iEMS). Tras la incubación bajo las condiciones apropiadas, se extrajeron 100 µL de solución de cada pocillo, se colocaron en una placa de microtitulación nueva y se midió la absorbancia a 488 nm en un espectrofotómetro. “Los controles de blanco”, que contenían 2 micromuestras por pocillo y detergente pero ninguna muestra de amilasa se incluyeron también en el análisis. 30

[0384] Cálculo del rendimiento de la hidrólisis del almidón de arroz CS-28: El valor de absorbancia obtenido se corrigió para el valor de blanco (micromuestras incubadas en ausencia de enzima). La absorbancia resultante - ΔOD488 - fue una medida de la actividad amilolítica. Para cada muestra (de AmyS o de variante de AmyS) se calculó el índice de rendimiento dividiendo la actividad de la variante por la actividad de la enzima natural. El índice de rendimiento comparó el rendimiento de la variante (valor real) y de la enzima de referencia de AmyS 35 estándar (valor teórico) a la misma concentración de proteína.

[0385] Un índice de rendimiento (PI) que es mayor que 1 (PI > 1) identificó una variante mejor (en comparación con la estándar, por ejemplo, la natural), mientras que un PI de 1 (PI = 1) identificó una variante que presentaba el mismo rendimiento que la estándar, y un PI menor que 1 (PI < 1) identificó una variante con un rendimiento peor que la estándar. Por lo tanto, el PI identificó variantes con diferencias de rendimiento con respecto a la 40 enzima natural.

[0386] Se evaluaron las siguientes variantes de sitio utilizando los ensayos descritos en este Ejemplo:

P17A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

D19A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

T21A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y 45

N28A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

S51A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

G72A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

V74A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

A82A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y 50

Q86A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

Q89A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y

A93A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

W115D,E,F,G,K,L,N,P,Q,R,S,V,Y

D117A,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W

P123A,D,E,G,K,L,M,P,Q,R,S,T,V 5

S124A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,S,T,V,Y

D125A,D,E,G,K,M,Q,R,S,T,V

N127A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

I130A,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W

G132A,C,D,E,F,G,H,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y 10

Q135A,F,G,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,Y

P145A,D,E,F,H,I,K,L,N,P,R,S,T,V,Y

G146A,C,D,E,G,H,K,L,P,R,S,T,V,W

G148A,C,D,E,F,G,H,L,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

S153A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y 15

Y159A,C,D,E,F,G,H,K,L,N,R,S,T,V,W

W166C,E,F,G,H,I,K,L,M,P,R,S,T,V,Y

S169A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,Y

K171C,D,E,G,H,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y

R179A,G,H,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y 20

G180A,C,D,F,G,H,I,K,L,N,P,R,S,T,V,Y

I181A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,R,S,T,V,Y

G182A,C,D,E,F,G,H,K,L,P,R,S,T,V,Y

K183A,C,E,F,G,H,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y

W187A, C, E,G,I,K,L,N,P,Q,R,S,V,W 25

G194A,E,G,H,K,L,M,P,R,S,T,V,W

P209A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

N224A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

S242A,C,D,G,I,K,L,M,Q,R,S,T,V

P245A,C,D,E,F,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y 30

G256A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W

D269A,C,D,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,Y

N271A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,S,T,V,W,Y

T278A,E,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,W,Y

N281A,D,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y 35

G302C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y

A304A,D,E,F,H,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y

R308A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y

T321A,C,F,H,I,L,P,Q,R,S,T,V,Y

Q358A,C,D,E,F,G,H,L,M,N,P,Q,R,S,T,V

P378C,D,F,G,H,I,L,N,P,R,S,T,V,Y

S382A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W 5

K383A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y

T398A,C,D,E,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V

H405A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y

T417A,D,E,H,I,L,M,P,Q,R,S,T,V,W

E418A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y 10

P420A,C,D,E,H,I,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y

G421A,D,E,F,G,H,I,L,N,P,Q,R,S,T,W,Y

P432A,D,E,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,Y

W437C,D,E,F,G,H,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

Q443A,C,F,G,K,L,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y 15

G446A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

G454A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V

S457A,C,D,E,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

T459A,D,G,I,K,L,Q,R,S,T,V,Y

T461A,D,E,F,G,I,K,L,N,P,R,S,T,V,W,Y 20

S464D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,V,W,Y

G474A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V

R483A,C,F,G,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y

Ejemplo 23. Rendimiento de las variantes de AmyS

[0387] El rendimiento de las variantes de AmyS (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 22) se analizó 25 para determinar la expresión de la proteína (expresión), la hidrólisis de harina de maíz durante 10 minutos (Harina de maíz 10) o la hidrólisis de harina de maíz durante 60 minutos (Harina de maíz 60), la actividad en sustrato DP7 con pH 4 (DP7 pH 4) o la actividad en sustrato DP7 con pH 5.8 (DP7 pH 5.8), y la limpieza de micromuestra manchada con almidón de arroz CS 28 con pH 8 (limpieza pH 8) o la limpieza de micromuestra manchada con almidón de arroz CS 28 con pH 10 (limpieza pH 10). Los resultados se muestran en la Tabla 23-1. 30 La expresión de la proteína se midió mediante el ensayo Bradford descrito en el Ejemplo 12. Los ensayos de hidrólisis de la harina de maíz y de limpieza de muestras se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 22. La funcionalidad de las variantes de AmyS se cuantificó como un índice de rendimiento (Pi) (es decir, la relación de rendimiento de una variante en relación con la AmyS natural). Un PI > 1 de cualquier propiedad indica que la variante se ha mejorado (en comparación con el control) para esa propiedad. ND indica que el valor obtenido 35 estaba fuera de los límites del ensayo.

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Posición: variante Harina de maíz 10 Harina de maíz 60 DP7 pH 4 DP7 pH 5.8 Limpieza pH 8 Limpieza pH 10 Expresión

: P017A 1,O8 1,07 1,13 1,32 1,35 1,04 0,58

: P017C 1,38 1,46 1,20 1,41 1,47 1,29 0,50

: P017D 1,30 1,30 1,02 1,24 1,33 1,10 0,58

: P017E 1,07 1,20 1,03 1,18 1,29 1,04 0,70

: P017F 0,95 1,10 0,84 0,95 1,37 0,83 0,59

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

Tabla 23-1: Rendimiento de las variantes de AmyS

: P017G 0,90 0,83 0,83 0,90 1,04 0,84 0,88

: P017H 0,91 0,84 1,03 1,03 1,07 0,86 0,96

: P017I 0,78 0,83 0,79 0,91 0,83 0,77 0,87

: P017K 0,88 0,64 0,83 0,96 1,11 0,88 0,90

: P017L 0,69 0,64 0,44 0,32 0,91 0,92 0,67

: P017M 1,19 1,46 1,13 1,32 1,58 0,83 0,50

: P017N 1,05 1,16 1,13 1,30 1,14 0,81 0,70

: P017Q 1,24 1,31 1,19 1,21 1,09 0,90 0,73

: P017R 1,21 1,23 0,93 1,13 1,40 1,01 0,71

: P017S 0,97 0,85 0,78 0,84 1,00 0,87 0,76

: P017T 0,81 0,91 0,68 0,75 1,12 0,73 0,76

: P017V 0,79 0,79 0,70 0,75 0,94 0,82 0,81

: P017W 0,81 0,77 0,70 0,82 0,89 0,77 0,75

: P017Y 0,75 0,79 0,98 0,97 1,01 0,95 0,96

: D019A 1,50 1,69 1,29 1,55 2,01 1,42 0,48

: D019C 1,34 1,49 1,29 1,47 1,59 1,25 0,51

: D019E 1,39 1,38 1,41 1,48 1,69 1,40 0,67

: D019F 3,22 3,51 0,75 0,87 6,54 3,43 0,10

: D019G 1,20 1,29 1,19 1,20 0,98 1,22 0,75

: D019H 0,93 0,97 0,91 1,05 1,32 0,98 0,93

: D019I 1,13 0,90 0,93 1,05 1,82 0,96 0,38

: D019K 0,90 0,81 0,97 1,09 0,93 0,91 0,99

D019L 0,84 0,65

-: 0,65

-: 0,23

1,79 1,94 0,13

: D019M 1,60 1,98 1,07 1,40 1,63 1,41 0,35

: D019N 1,34 1,16 1,69 1,23 1,20 1,06 0,71

: D019P 0,93 1,14 1,00 1,27 1,56 1,32 0,53

: D019Q 1,35 1,24 1,94 1,65 1,31 1,20 0,74

: D019R 1,02 1,05 0,94 1,03 1,44 1,12 0,80

: D019S 1,03 1,12 1,08 1,12 1,09 0,89 0,95

: D019T 1,04 1,06 1,07 1,11 1,22 0,89 0,97

: D019V 1,05 1,28 1,07 1,27 2,16 1,52 0,36

: D019W 0,64 0,93 0,52 0,71 1,24 0,81 0,56

: D019Y 0,98 1,10 1,43 1,32 1,34 1,03 0,69

: T021A 1,25 1,34 1,36 1,50 1,41 1,19 0,75

: T021C 1,59 1,73 1,42 1,58 1,79 1,26 0,49

: T021D 1,23 1,39 1,63 1,54 1,48 1,27 0,78

: T021E 1,32 1,35 1,53 1,59 1,48 1,05 0,72

: T021F 1,26 1,36 1,66 1,48 1,42 1,11 0,71

: T021G 1,11 1,14 1,35 1,29 1,24 1,05 0,91

: T021H 0,87 0,85 0,95 0,98 1,08 0,86 1,10

: T021I 1,04 1,04 1,31 1,31 1,57 1,14 0,71

: T021K 0,89 0,88 1,02 1,07 1,02 1,01 1,07

: T021L 0,80 0,92 1,33 1,20 1,08 0,88 0,89

: T021M 1,37 1,40 1,34 1,55 1,48 1,34 0,75

: T021N 1,36 1,42 1,28 1,47 1,23 1,16 0,75

: T021P 1,13 1,25 1,14 1,27 1,30 1,20 0,82

: T021Q 1,32 1,42 1,50 1,55 1,33 1,20 0,79

: T021R 1,17 1,26 1,14 1,21 1,23 1,11 0,86

: T021S 1,08 1,28 1,09 1,17 1,12 0,97 0,91

: T021V 1,10 1,19 1,12 1,24 1,35 0,95 0,73

: T021W 0,98 1,01 0,91 0,95 1,17 1,11 0,75

: T021Y 0,81 0,89 1,02 1,07 1,03 0,62 0,87

: N028A 1,28 1,51 1,24 1,42 1,64 1,39 0,74

N028C

-: 0,92

-: 2,93

1,18 0,31 1,18 2,17

-: 0,05

: N028D 1,29 1,39 1,69 1,63 1,37 1,23 0,77

: N028E 1,26 1,36 1,21 1,38 1,21 1,06 0,79

: N028F 1,29 1,34 1,16 1,35 1,48 1,26 0,54

: N028G 0,98 1,05 0,99 1,08 0,98 0,81 1,06

: N028H 0,98 1,09 1,06 1,18 1,20 1,01 0,94

: N0281 0,88 1,02 0,86 0,97 1,17 0,87 0,71

: N028K 0,93 0,95 1,01 1,09 0,84 0,94 0,98

: N028L 0,79 1,00 0,91 1,02 1,11 0,87 0,74

: N028M 1,48 1,67 1,62 1,79 2,01 1,57 0,53

: N028P 1,47 1,60 2,00 2,47 1,89 1,47 0,48

: N028Q 1,19 1,23 1,01 1,18 1,20 1,24 0,75

: N028R 1,11 1,07 1,10 1,27 1,38 1,10 0,80

: N028S 1,11 1,23 0,98 1,08 1,03 0,94 0,91

: N028T 1,13 1,22 1,07 1,21 1,22 0,99 0,84

: N028V 0,98 0,97 1,12 1,13 1,35 0,90 0,75

: N028W 1,00 1,05 0,92 1,08 1,25 0,92 0,65

: N028Y 0,92 1,00 0,87 0,88 1,13 0,76 0,86

: S051A 1,01 0,99 1,39 1,21 1,11 1,14 0,97

: S051C 0,96 1,01 1,06 1,36 0,91 0,51 0,80

: S051D 0,94 1,00 1,34 1,42 0,95 1,07 0,97

: S051E 0,71 0,64 1,10 1,25 0,79 1,02 1,11

: S051F 0,96 0,93 1,04 1,29 1,06 1,06 0,89

: S051G 0,83 0,77 0,81 0,82 0,80 1,09 1,24

: S051H 0,74 0,70 0,56 0,86 0,93 0,99 1,20

: S051I 0,75 0,73 0,80 0,83 0,82 0,74 1,18

: S051K 0,62 0,58 0,54 0,67 0,68 0,82 1,39

: S051L 0,71 0,72 0,85 0,88 0,74 0,83 1,41

: S051M 0,97 1,00 1,24 1,26 1,11 1,01 0,94

: S051N 1,04 1,05 0,99 1,02 0,64 1,02 0,96

: S051P 0,81 0,79 0,31 1,23 1,22 0,78 0,75

: S051Q 1,01 0,96 1,07 1,08 1,07 1,06 1,03

: S051R 0,88 0,88 0,66 0,89 0,92 1,09 1,02

: S051T 0,89 0,80 0,76 0,79 0,96 0,91 1,17

: S051V 0,78 0,70 0,70 0,75 0,86 0,78 1,21

: S051W 0,81 0,76 0,81 0,94 0,87 0,81 1,17

: S051Y 0,70 0,76 0,98 0,96 0,83 0,93 1,16

: G072A 1,53 1,40 1,25 1,36 1,46 1,46 0,65

: G072C 1,53 1,39 1,52 1,68 1,40 1,20 0,61

: G072D 1,36 1,38 1,69 1,72 1,36 1,59 0,78

G072E 0,13 0,59 0,75 0,39

-: 0,18

-: 0,75

-: 0,19

G072F 0,07 0,74 1,79 0,84 0,39 0,30

-: 0,07

: G072H 0,97 0,96 0,95 1,09 1,05 1,11 0,98

G072I 12,27

-: 18,04

-: 7,88

-: 5,43

-: 47,34

-: 40,91

0,00

G072K 0,20

-: 2,21

-: 4,25

-: 2,09

3,20

-: 0,46

0,04

G072L 0,21

-: 1,59

-: 3,13

-: 1,59

-: 0,59

-: 0,13

0,04

G072M 0,09 0,37 0,78 0,27 0,06 0,01

-: 0,16

G072N

-: 0,09

0,41 0,34 0,12 0,01 0,12

-: 0,17

G072P

-: 0,20

0,29 1,24 0,48 0,06

-: 0,23

-: 0,11

: G072Q 1,68 1,60 1,60 1,66 1,62 1,60 0,68

: G072R 1,23 1,19 0,83 1,05 1,06 1,42 0,80

G072S 0,77

-: 1,60

-: 0,59

2,54 0,70 8,99

-: 0,01

: G072T 0,93 0,98 0,88 0,94 1,08 1,05 1,02

: G072V 1,31 1,27 1,19 1,30 1,48 1,22 0,68

G072W 0,10

-: 0,61

-: 1,03

-: 0,54

0,41

-: 0,49

0,12

: G072Y 1,11 1,01 1,28 1,31 1,21 1,01 0,84

: V074A 1,43 1,43 1,55 1,54 1,43 1,38 0,79

V074C 0,05 0,20 0,77 0,33

-: 0,16

0,40

-: 0,19

V074D

-: 0,22

0,91 2,69 1,24 0,32

-: 0,58

-: 0,05

: V074E 1,65 1,71 1,69 1,69 1,56 1,84 0,65

: V074F 2,44 2,48 0,48 0,33 3,48 3,18 0,13

: V074G 1,29 1,28 1,15 1,14 0,98 1,08 0,97

: V074H 0,79 0,78 0,82 0,89 0,84 0,78 1,19

: V074I 1,15 1,16 1,26 1,26 1,21 1,01 0,98

V074K 0,08

-: 0,61

-: 1,67

-: 0,73

1,78 0,54 0,07

V074L 0,77

-: 0,57

-: 2,18

-: 1,10

0,59

-: 1,43

0,07

V074M

-: 0,14

-: 0,19

1,02 0,48 0,45

-: 0,53

-: 0,13

V074N

-: 0,22

0,25 1,07 0,53 0,05 0,15

-: 0,13

: V074Q 1,57 1,60 1,61 1,59 1,30 1,16 0,78

V074R

-: 0,93

-: 0,49

1,45 0,77

-: 0,63

-: 1,66

-: 0,08

V074S

-: 3,20

-: 3,28

-: 0,69

-: 1,93

-: 2,28

-: 5,92

0,05

V074T 7,70

-: 8,69

-: 7,16

-: 3,32

-: 0,73

-: 6,93

0,02

V074W 0,47

-: 0,38

-: 3,18

-: 1,38

0,49 0,72 0,04

: V074Y 1,12 1,08 0,88 0,91 0,97 1,00 0,93

: A082C 1,45 1,58 1,16 1,26 1,31 1,25 0,64

: A082E 1,37 1,32 1,36 1,39 1,12 1,02 0,89

: A082F 1,36 1,33 1,07 1,14 1,25 1,19 0,84

: A082G 1,17 1,33 0,79 0,93 1,18 1,07 0,68

: A082H 1,08 1,04 0,95 0,96 0,90 1,13 1,15

: A082I 0,96 1,00 1,04 1,03 0,97 0,82 1,15

A082K 9,74 1,65

-: 13,38

-: 6,33

-: 9,02

35,95 0,01

: A082L 1,00 0,96 0,94 0,99 0,82 0,84 1,08

A082M

-: 0,42

0,35 0,64 0,22 0,16

-: 0,23

-: 0,20

: A082N 1,36 1,39 1,35 1,45 1,38 1,31 0,83

: A082P 1,54 1,45 1,25 1,38 1,44 1,14 0,76

A082Q

-: 0,19

0,28 1,16 0,54 0,15 1,37

-: 0,12

: A082R 1,17 1,17 1,29 1,34 1,42 1,45 0,99

: A082S 1,02 1,07 0,92 1,01 0,90 0,86 1,06

: A082T 1,08 1,08 0,99 1,06 1,00 1,32 1,02

: A082V 0,98 1,08 0,97 1,05 1,02 0,90 1,02

: A082W 1,16 1,16 0,83 0,99 1,08 0,97 0,96

: A082Y 0,81 0,87 0,95 0,95 0,95 1,06 1,14

: Q086A 1,00 1,11 1,43 1,46 1,25 1,02 0,83

: Q086C 1,00 1,11 1,01 1,19 1,09 0,64 0,73

: Q086D 0,96 1,03 1,22 1,29 1,11 0,99 0,87

: Q086E 0,92 0,93 1,12 1,15 0,80 0,97 0,97

Q086F 0,26

-: 0,46

-: 3,07

-: 1,44

-: 0,60

-: 1,61

0,05

Q086G 0,21 1,02

-: 1,18

-: 0,54

-: 0,42

-: 2,55

0,12

Q086H 1,34 1,23

-: 1,23

-: 0,61

-: 2,15

-: 1,84

0,10

: Q086I 0,84 0,85 0,88 0,95 0,85 0,81 0,99

: Q086K 0,64 0,66 0,88 0,84 0,71 0,81 1,42

: Q086L 0,71 0,71 0,78 0,80 0,71 0,70 1,24

Q086N

-: 4,91

-: 2,76

5,03 2,01 3,01 2,98

-: 0,02

: Q086P 1,13 1,17 1,36 1,48 1,31 1,11 0,86

Q086R

-: 7,06

24,56

-: 23,74

-: 11,36

-: 12,19

-: 55,94

0,00

Q086S 0,44 1,09

-: 1,75

-: 0,70

-: 0,40

-: 2,57

0,08

: Q086T 0,94 0,91 0,90 0,99 0,78 0,91 1,03

: Q086V 0,88 0,89 0,85 0,91 0,81 0,71 0,93

: Q086W 0,78 0,74 0,81 0,85 0,80 0,69 1,24

: Q086Y 0,72 0,74 0,94 0,91 0,77 0,82 1,13

Q089A 0,33

-: 0,78

0,99 0,42

-: 0,25

3,87

-: 0,12

Q089C

-: 0,69

0,00 0,05

-: 0,23

-: 0,17

0,59

-: 0,11

: Q089D 1,32 1,36 1,41 1,47 1,37 1,07 0,73

Q089E

-: 0,37

-: 0,82

0,68 0,35 0,65 1,13

-: 0,12

: Q089F 1,56 1,48 1,17 1,25 1,54 1,00 0,44

: Q089G 1,13 1,03 1,21 1,15 1,10 1,02 0,93

: Q089H 1,82 1,91 0,35 0,65 1,10 1,61 0,17

: Q089I 1,16 1,01 1,04 1,10 1,15 0,90 0,77

: Q089K 0,85 0,87 1,20 1,06 1,11 0,87 1,10

: Q089L 0,95 0,94 0,97 0,98 0,72 0,77 0,86

: Q089M 1,29 1,21 1,53 1,56 1,40 1,16 0,64

: Q089N 1,40 1,30 1,64 1,67 1,56 1,26 0,71

Q089P

-: 0,80

0,03 1,23 0,45 0,97 2,98

-: 0,11

: Q089R 1,15 1,00 1,27 1,34 1,15 1,13 0,95

Q089T 11,41

-: 3,81

-: 9,90

-: 2,46

-: 5,57

-: 36,35

0,02

: Q089V 1,15 0,96 1,24 1,23 1,20 0,84 0,90

: Q089W 0,84 0,66 0,84 0,84 0,79 0,69 1,11

: Q089Y 0,97 0,97 1,23 1,19 1,06 0,88 0,95

: A093C 1,36 1,43 1,51 1,80 1,74 1,33 0,57

: A093D 1,21 1,41 1,52 1,53 1,26 1,12 0,80

: A093E 1,53 1,50 1,78 1,75 1,55 1,55 0,71

: A093F 1,24 1,42 1,20 1,45 1,54 1,13 0,72

: A093G 1,20 1,15 1,23 1,29 1,35 1,10 0,89

: A093H 0,98 0,88 1,01 1,03 1,01 0,91 1,11

: A093I 0,97 1,11 1,11 1,39 1,28 1,16 0,76

: A093K 0,93 0,92 1,10 1,07 0,87 0,86 1,14

: A093L 0,90 0,91 1,08 1,09 0,97 1,03 0,96

: A093M 1,10 1,13 1,45 1,53 1,42 1,34 0,82

: A093N 1,52 1,46 1,77 1,72 1,46 1,59 0,73

A093P

-: 0,84

-: 0,82

0,20

-: 0,65

-: 0,46

-: 0,39

-: 0,09

: A093Q 1,36 1,45 1,41 1,56 1,41 1,40 0,76

: A093R 1,15 1,13 1,23 1,32 1,29 1,04 0,91

: A093S 1,09 1,11 1,30 1,22 1,02 0,93 0,94

: A093T 0,93 0,90 1,02 1,05 0,89 0,98 1,02

: A093V 1,02 1,08 1,11 1,16 1,10 0,93 0,87

: A093W 1,02 0,97 0,98 1,05 0,92 0,82 0,88

: A093Y 0,93 0,91 1,17 1,22 1,12 1,12 0,83

: W115D 0,97 1,05 0,95 1,04 1,15 1,05 0,91

: W115E 0,88 0,90 0,91 0,96 0,69 0,88 1,09

: W115F 0,87 0,92 0,79 0,85 0,95 0,73 1,11

: W115G 0,81 0,81 0,93 0,89 0,84 1,10 1,28

: Wl15K 0,67 0,64 0,75 0,74 0,73 0,62 1,44

: W115L 0,58 0,58 0,67 0,65 0,62 0,69 1,63

: W115N 0,87 0,94 1,13 1,07 1,08 0,98 1,02

: W115P 1,12 1,12 1,18 1,20 1,22 1,29 0,87

: W115Q 0,96 0,96 1,01 1,04 0,99 0,85 1,00

: W115R 0,79 0,83 0,92 0,94 0,95 0,65 1,07

: W115S 0,92 0,87 1,02 0,98 0,96 1,00 1,14

: W115V 0,77 0,81 0,83 0,79 0,89 0,82 1,27

: W115Y 0,56 0,63 0,74 0,73 0,77 0,69 1,41

: D117A 1,29 1,21 1,20 1,32 1,83 1,39 0,45

: D117E 1,40 1,34 1,30 1,21 1,65 1,33 0,65

: D117G 1,10 1,02 1,08 1,08 1,19 1,33 0,78

: D117H 0,92 0,82 0,84 0,89 1,21 1,08 0,87

: D117I 0,98 0,70 0,65 0,79 1,49 1,26 0,50

: D117K 0,68 0,57 0,93 0,89 0,82 0,86 1,30

: D117L 0,81 0,77 0,94 0,86 1,09 0,86 0,64

: D117M 1,21 1,13 1,23 1,32 1,44 0,97 0,53

: D117N 1,30 1,26 1,63 1,48 1,48 1,23 0,71

: D117P 1,07 1,04 1,27 1,17 1,29 1,10 0,88

: D117Q 1,63 1,62 1,46 1,51 2,08 1,57 0,56

: D117R 1,06 1,12 1,12 1,05 1,25 0,83 0,95

: D117S 0,89 0,90 0,92 0,98 1,09 0,94 0,81

: D117T 0,93 0,83 0,82 0,88 1,03 1,20 0,91

: D117V 1,08 0,86 0,91 1,08 2,00 1,98 0,40

: D117W 0,76 0,56 0,82 0,82 0,74 0,70 1,20

: P123A 1,06 1,01 1,43 1,25 1,10 0,95 0,84

: P123D 1,19 1,05 1,18 1,22 1,38 1,34 0,84

: P123E 1,49 1,39 1,45 1,41 1,65 1,24 0,66

: P123G 1,10 0,96 1,18 1,07 1,18 1,10 0,90

: P123K 0,84 0,62 1,09 0,96 1,00 0,89 1,18

: P123L 0,83 0,72 1,03 1,00 1,21 0,98 0,93

: P123M 1,14 1,00 1,13 1,29 1,52 1,25 0,61

: P123Q 1,25 1,15 1,19 1,35 1,55 1,30 0,68

: P123R 1,02 0,95 1,28 1,28 1,12 1,11 0,96

: P123S 1,07 0,84 0,88 0,92 1,17 0,97 0,96

: P123T 1,00 0,89 0,83 0,90 1,13 0,83 0,97

: P123V 0,83 0,79 0,97 1,08 1,23 0,99 0,83

: S124A 1,33 1,45 1,31 1,39 1,27 1,34 0,79

: S124C 1,28 1,32 0,93 1,15 1,54 1,21 0,77

: S124D 1,19 1,20 1,14 1,24 1,35 1,31 0,88

: S124E 1,15 1,22 1,16 1,19 1,24 1,11 0,93

: S124F 1,12 1,19 1,05 1,16 1,05 0,98 1,01

: S124G 0,92 0,81 0,79 0,84 1,14 0,80 1,08

: S124H 0,91 0,98 0,97 1,02 1,12 1,11 0,98

: S124I 0,93 0,92 0,92 0,91 0,99 1,05 1,10

: S124K 0,89 0,89 0,95 0,90 0,92 0,77 1,24

: S124L 0,70 0,73 0,74 0,62 0,74 0,61 1,36

: S124N 1,16 1,18 1,00 1,15 1,17 0,96 0,87

: S124P 1,08 0,97 1,06 1,25 1,43 1,02 0,71

: S124Q 1,16 1,22 1,09 1,18 1,27 1,20 0,82

: S124R 1,26 1,24 1,05 1,16 1,35 1,21 0,88

: S124T 1,03 1,09 0,90 0,92 1,06 1,03 1,02

: S124V 0,97 0,96 0,81 0,86 0,98 1,00 1,01

: S124Y 0,87 0,88 0,74 0,83 0,86 0,75 1,13

: D125A 0,75 0,72 1,11 1,21 1,17 1,04 0,82

: D125E 1,02 1,00 0,92 1,01 0,96 0,77 0,94

: D125G 0,51 0,48 0,91 0,90 0,46 0,77 1,15

: D125K 0,37 0,34 0,65 0,80 0,79 0,68 1,23

: D125M 1,08 1,06 1,02 1,11 1,11 0,98 0,93

: D125Q 0,87 0,74 0,92 1,03 0,85 0,81 0,94

: D125R 0,43 0,43 0,69 0,92 0,74 0,61 1,06

: D125S 0,67 0,57 0,96 1,03 0,80 0,82 1,12

: D125T 0,91 0,92 0,78 0,80 0,78 0,59 1,17

: D125V 0,38 0,36 0,67 0,81 0,78 1,01 1,17

: N127A 0,80 0,88 1,41 1,37 1,42 1,34 0,69

: N127C 1,25 1,40 1,26 1,39 1,48 1,45 0,69

: N127D 1,21 1,24 1,24 1,31 1,19 1,41 0,78

: N127F 0,98 0,84 1,27 1,23 1,09 0,90 0,82

: N127G 0,86 0,71 1,05 1,04 1,03 1,05 0,93

: N127H 0,70 0,63 0,83 0,89 0,86 0,81 1,02

: N127K 0,51 0,47 0,77 0,86 0,95 1,01 1,03

: N127L 0,71 0,67 0,99 1,04 1,12 1,01 0,93

: N127M 1,00 1,15 1,47 1,46 1,35 1,23 0,73

: N127P 1,10 1,04 1,30 1,39 i.is 1,21 0,65

: N127Q 1,04 1,01 1,42 1,47 1,33 1,00 0,71

: N127R 0,88 0,87 1,04 1,10 1,14 0,89 0,96

: N127S 0,87 0,71 1,08 1,06 1,04 0,91 0,90

: N127T 0,78 0,68 0,79 0,79 0,93 0,75 1,08

: N127V 0,75 0,78 1,34 1,27 1,11 0,97 0,75

: N127W 0,79 0,73 0,76 0,80 0,84 0,82 1,16

: N127Y 1,16 1,12 1,23 1,15 1,21 1,14 0,82

: I130A 1,15 1,06 1,61 1,47 1,25 1,13 0,82

: I130G 0,81 0,71 1,10 1,12 1,25 1,11 0,91

: I130H 0,58 0,51 0,83 0,87 0,92 0,79 1,18

: I130K 0,73 0,64 1,06 0,96 0,94 0,84 1,14

: I130L 0,80 0,77 1,08 1,04 0,99 0,92 0,96

: I130M 1,45 1,37 1,42 1,44 1,33 1,19 0,77

: I130N 1,08 0,95 1,48 1,46 1,11 1,01 0,78

: I130P 0,29 0,41 0,91 1,29 1,33 1,36 0,76

I130Q

-: 0,18

-: 1,25

1,18 0,52

-: 0,19

0,03

-: 0,12

: I130R 1,09 0,91 1,30 1,34 0,91 1,00 0,85

: I130S 1,02 0,81 1,02 1,06 1,07 0,84 0,97

: I130T 0,97 0,99 1,09 1,04 0,97 0,99 0,98

: I130V 1,12 1,21 1,12 1,12 0,94 0,96 0,83

: I130W 0,85 0,69 0,95 1,01 1,11 0,89 0,89

: G132A 1,52 1,66 1,32 1,47 1,60 1,39 0,68

: G132C 1,38 1,47 1,26 1,28 1,10 0,87 0,79

: G132D 1,84 1,78 1,18 1,50 1,56 1,56 0,51

: G132E 1,17 1,33 1,11 1,21 0,90 0,86 0,86

: G132F 1,20 1,21 1,03 1,18 1,03 1,03 0,91

: G132H 0,98 1,03 0,93 0,97 1,04 0,99 1,02

: G132L 0,98 1,03 0,76 0,84 0,88 0,85 0,95

: G132M 1,81 1,76 1,51 1,61 1,81 1,73 0,61

: G132N 1,18 1,23 1,11 1,27 1,15 1,08 0,82

: G132P 1,51 1,59 1,28 1,40 1,26 1,34 0,75

: G132R 1,35 1,32 0,97 1,12 1,02 1,06 0,87

: G132S 1,32 1,34 1,08 1,22 1,15 0,96 0,77

: G132T 1,09 1,05 0,87 0,96 0,94 0,98 1,03

: G132V 0,99 1,09 0,96 1,02 0,95 1,03 0,98

: G132W 1,17 1,13 0,95 1,07 1,02 0,84 0,91

: G132Y 0,93 0,87 0,81 0,86 0,80 0,81 1,15

: Q135A 0,95 0,99 1,00 1,20 1,13 0,99 0,84

: Q135F 0,93 1,05 0,91 1,03 1,04 1,39 0,94

: Q135G 0,77 0,80 0,75 0,84 0,97 1,05 1,08

: Q135K 0,59 0,69 0,63 0,71 0,70 0,74 1,27

Q135L 0,40 0,22

-: 0,66

-: 0,33

0,38

-: 0,14

0,19

: Q135M 0,91 1,03 1,01 1,14 0,90 1,01 0,86

: Q135P 1,12 1,16 0,96 1,07 0,85 1,16 0,87

: Q135R 0,92 1,01 0,95 1,00 0,95 1,14 1,08

: Q135S 0,93 0,93 0,80 0,95 0,91 0,87 0,94

: Q135T 0,84 0,83 0,73 0,80 0,79 0,83 1,19

: Q135V 0,92 0,84 0,66 0,75 0,98 1,23 0,76

: Q135Y 0,75 0,75 0,69 0,79 0,75 0,91 1,16

: P145A 1,15 1,17 1,44 1,50 1,30 1,29 0,71

: P145D 1,35 1,61 1,15 1,33 1,45 1,48 0,57

: P145E 1,55 1,48 1,26 1,45 1,34 1,65 0,63

: P145F 1,34 1,32 1,02 1,20 1,12 1,32 0,74

: P145H 0,98 0,88 0,81 0,99 1,13 1,03 0,90

: P145I 1,20 1,06 0,84 0,98 1,10 1,20 0,85

: P145K 0,90 0,89 0,88 1,05 1,15 1,02 0,88

: P145L 1,03 0,90 0,81 1,01 0,97 1,23 0,85

: P145N 1,19 1,43 1,41 1,58 1,49 1,48 0,61

: P145R 1,22 1,11 1,10 1,29 1,14 1,11 0,86

: P145S 1,12 1,04 1,03 1,10 1,08 1,12 0,85

: P145T 1,15 0,99 0,91 1,00 0,92 0,81 0,89

: P145V 1,09 1,18 1,08 1,19 1,24 1,25 0,73

: P145Y 1,14 1,12 0,89 1,15 1,08 1,16 0,75

: G146A 1,18 1,00 1,34 1,41 1,19 1,05 0,77

: G146C 2,03 1,89 1,71 1,89 2,19 1,52 0,40

: G146D 1,32 1,35 1,45 1,52 1,50 1,17 0,70

: G146E 1,43 1,43 1,63 1,62 1,38 1,33 0,82

: G146H 1,00 0,99 0,77 0,88 1,01 0,93 1,06

: G146K 0,94 0,84 1,06 1,07 1,05 1,10 1,08

: G146L 0,99 0,80 0,85 ND 0,97 0,74 0,97 ,

: G146P 1,33 1,24 1,30 1,36 1,43 1,31 0,76

: G146R 1,21 1,07 1,12 1,30 1,21 1,41 0,85

: G146S 1,18 1,13 1,02 1,04 0,97 0,94 0,91

: G146T 0,91 0,83 0,98 1,00 0,97 0,78 1,13

: G146V 1,19 1,04 1,15 1,21 1,22 1,16 0,79

: G146W 0,94 0,88 0,83 0,91 0,80 1,01 0,93

: G148A 1,20 1,28 1,37 1,49 1,22 1,10 0,71

: G148C 1,09 0,94 1,25 1,28 1,17 1,19 0,84

G148D

-: 1,07

-: 0,40

0,77 0,36 0,81 1,35

-: 0,11

: G148E 1,17 1,19 1,27 1,27 1,37 1,02 0,89

: G148F 1,08 1,07 1,13 1,16 1,03 1,27 0,97

: G148H 0,89 0,90 1,00 0,97 0,91 0,66 1,13

: G148L 0,88 0,83 0,89 0,90 0,94 0,91 1,16

: G148N 1,00 0,98 1,20 1,17 1,13 1,18 1,01

: G148P 1,30 1,33 1,34 1,45 1,35 1,09 0,76

G148Q

-: 1,69

-: 1,32

1,69 0,84

-: 0,01

0,58

-: 0,07

: G148R 1,27 1,20 1,12 1,24 1,14 0,71 0,85

: G148S 0,96 0,97 0,92 0,96 0,84 1,05 1,03

: G148T 1,35 1,20 0,70 0,86 1,35 0,90 0,49

: G148V 0,96 0,95 0,95 1,02 1,04 0,69 1,03

: G148W 1,00 0,88 0,90 0,96 0,89 0,83 1,00

: G148Y 0,82 0,74 0,86 0,93 0,91 0,87 1,14

: S153A 1,14 1,15 1,09 1,23 1,21 1,09 0,86

: S153C 1,70 1,78 1,37 1,54 1,51 1,61 0,53

: S153D 1,34 1,25 0,99 1,11 1,18 1 ,02 0,88

: S153E 1,76 1,18 1,20 1,34 1,54 1,36 0,61

: S153F 1,42 1,35 1,07 1,18 1,22 1,36 0,80

: S153G 1,35 1,16 0,97 1,03 1,08 1,25 0,88

: S153H 0,98 0,91 0,72 0,77 0,92 1,00 1,05

: S153I 1,31 1,09 0,95 1,05 1,28 1,35 0,74

: S153K 0,79 0,82 0,80 0,87 1,02 1,00 1,08

: S153L 1,11 0,96 0,92 0,98 1,03 1,26 0,92

: S153N 1,29 1,38 1,38 1,43 1,20 1,75 0,76

: S153P 1,09 1,19 1,21 1,28 1,15 1,15 1,00

: S153Q 1,14 1,22 0,95 1,21 1,39 1,47 0,73

: S153R 1,29 1,16 1,00 1,12 1,18 1,16 0,95

: S153T 0,93 1,02 0,82 0,89 0,88 0,97 1,01

: S153V 1,30 1,16 0,97 1,07 1,08 1,26 0,77

: S153W 0,94 0,95 0,75 0,86 0,85 1,21 0,90

: S153Y 1,15 1,03 0,96 1,00 1,03 1,13 0,86

: Y159A 1,17 1,17 1,42 1,52 1,50 1,70 0,74

: Y159C 1,46 1,19 1,80 1,73 1,10 1,66 0,66

: Y159D 1,08 1,21 1,89 1,88 1,63 2,01 0,78

: Y159E 1,23 1,25 1,34 1,50 1,31 1,66 0,73

: Y159F 1,11 1,10 1,03 1,10 0,96 1,17 0,97

: Y159G 0,92 0,79 0,95 1,02 1,22 1,44 0,94

: Y159H 0,97 0,86 0,97 1,05 1,07 1,17 1,01

: Y159K 1,03 0,78 1,20 1,21 0,96 1,71 0,90

: Y159L 0,77 0,61 0,95 1,00 1,24 1,41 0,98

: Y159N 0,97 0,94 1,46 1,56 1,40 1,85 0,78

: Y159R 1,10 0,86 1,19 1,40 1,39 1,75 0,80

: Y159S 0,97 0,82 1,01 1,09 1,25 1,44 0,94

: Y159T 0,93 0,93 1,18 1,20 1,26 1,74 0,87

: Y159V 1,09 0,95 0,96 1,07 1,12 1,48 0,87

: Y159W 1,08 1,12 0,98 1,08 0,73 0,96 0,88

: W166C 0,57 0,71 0,61 0,60 0,90 1,03 0,80

: W166E 0,58 0,78 0,94 0,74 1,09 1,12 0,97

: W166F 0,75 0,82 0,73 0,81 0,82 1,06 1,07

: W166G 0,65 0,57 0,42 0,50 0,84 0,93 1,18

: W166H 0,59 0,64 0,57 0,67 0,90 0,92 1,26

: W166I 0,56 0,65 0,85 0,79 0,65 1,16 1,13

: W166K 0,47 0,49 0,96 0,81 0,60 1,09 1,49

: W156L 0,45 0,54 0,79 0,64 0,58 0,91 1,46

: W166M 0,70 0,83 0,96 0,82 0,89 1,24 1,00

W166P 0,16 0,30

-: 0,15

-: 0,02

1,19 1,09 0,69

: W166R 0,67 0,86 1,40 1,17 0,83 0,76 0,94

: W166S 0,61 0,64 0,63 0,57 0,90 0,95 1,14

: W166T 0,60 0,73 0,92 0,76 0,70 0,33 1,15

: W166V 0,51 0,61 0,88 0,75 0,49 0,98 1,10

: W166Y 0,65 0,70 0,73 0,78 0,81 0,96 1,16

: S169A 1,10 1,14 1,17 1,30 1,17 1,35 0,85

: S169C 1,05 1,37 1,33 1,43 1,54 1,47 0,74

: S169D 0,91 1,17 1,21 1,26 1,36 1,42 0,71

: S169E 1,24 1,36 1,37 1,59 1,65 1,81 0,67

: S169F 1,04 1,33 1,01 1,13 1,15 1,36 0,74

: S169G 1,05 0,90 0,97 0,99 0,99 1,22 0,97

: S169I 0,84 0,82 0,84 1,02 1,18 1,00 0,93

: S169K 0,81 0,85 0,78 0,94 0,88 1,03 1,00

: S169L 0,82 0,65 0,83 0,95 0,99 1,00 1,09

: S169M 0,98 0,71 1,05 1,17 0,98 1,17 0,92

: S169N 0,88 1,09 1,28 1,35 1,43 1,41 0,76

: S169P 0,55 0,85 0,74 1,10 1,25 0,96 0,78

: S169Q 1,08 1,18 1,27 1,43 1,43 1,54 0,75

: S169R 0,95 0,88 1,01 1,13 1,08 1,26 0,96

: S169T 0,78 0,75 0,87 0,96 0,92 0,79 1,07

: S169V 0,78 0,88 0,78 1,01 1,10 1,00 0,94

: S169Y 0,91 0,87 1,00 1,11 0,97 1,10 0,93

: K171C 1,20 1,53 1,27 1,46 1,71 1,56 0,54

: K171D 1,22 1,28 1,11 1,32 1,03 1,49 0,75

: K171E 1,18 1,46 1,26 1,33 1,61 1,36 0,65

: K171G 1,03 1,06 0,87 0,91 1,08 1,29 0,80

: K171H 0,90 0,76 0,82 0,90 0,93 0,94 1,20

: K171L 0,70 0,76 0,84 0,88 0,88 0,86 1,05

: K171M 1,11 1,32 1,25 1,34 1,43 1,08 0,67

: K171P 0,99 1,09 1,19 1,31 1,36 1,32 0,73

: K171Q 1,08 1,15 1,05 1,26 1,66 1,37 0,67

: K171R 1,01 0,96 0,96 1,08 1,10 1,42 0,92

: K171S 1,12 0,97 0,86 0,96 0,90 1,17 0,93

: K171T 1,00 0,88 0,87 0,93 0,96 1,03 1,09

: K171V 0,87 0,92 0,81 0,92 1,13 0,97 0,89

: K171W 0,74 0,74 0,59 0,82 0,88 0,86 1,03

: K171Y 0,86 0,73 0,70 0,90 0,96 1,06 0,92

: R179A 0,88 0,88 1,28 1,47 1,62 1,55 0,83

: R179G 0,53 0,56 0,93 1,05 1,02 1,09 1,05

: R179H 0,82 0,78 1,07 1,19 1,25 1,32 1,00

: R179L 0,71 0,62 0,79 0,93 1,00 1,28 0,99

: R179M 0,81 1,14 1,24 1,51 1,58 1,52 0,66

: R179P 0,33 0,50 1,14 1,33 1,42 1,61 0,79

: R179Q 1,07 0,98 1,03 1,27 1,31 1,39 0,82

: R179S 0,86 0,62 0,94 1,12 1,11 1,21 1,02

: R179T 0,97 0,78 1,00 1,16 1,31 1,32 0,94

: R179V 0,90 0,89 0,84 1,03 1,26 1,12 0,91

: R179W 0,81 0,70 0,92 1,19 1,17 1,71 0,87

: R179Y 0,64 0,49 0,81 0,95 0,89 1,22 1,06

: G180A 0,82 0,75 1,37 0,96 1,25 1,45 0,76

: G180C 0,43 0,46 1,29 0,82 1,35 1,56 0,73

: G180D 0,50 0,54 1,39 0,99 1,37 1,36 0,81

: G180F 0,32 0,32 1,19 1,03 0,90 1,75 0,72

: G180H 0,38 0,36 0,95 0,80 0,89 1,00 1,12

: G180I 0,21 0,21 0,87 0,73 1,17 1,09 0,84

: G180K 0,13 0,16 0,77 ND 0,99 1,02 1,26

: G180L 0,22 0,25 1,02 0,72 0,81 0,94 1,38

: G180N 0,46 0,52 1,41 1,13 1,24 0,89 0,81

: G180P 0,42 0,45 1,39 ND 1,46 1,74 0,75

G180R 1,27 0,83 ND ND

-: 0,82

-: 12,79

-: 0,03

: G180S 0,82 0,70 0,98 0,79 0,90 0,92 0,96

: G180T 0,46 0,37 0,91 0,76 1,02 0,77 1,07

: G180V 0,25 0,18 0,89 ND 1,01 0,98 0,96

: G180Y 0,29 0,34 0,91 0,75 1,03 1,11 1,03

: I181A 1,16 1,15 1,60 1,19 1,45 1,48 0,78

: I181C 1,18 1,21 1,79 ND 1,10 1,35 0,68

: I181D 1,19 1,29 1,61 1,22 1,64 1,19 0,74

: I181E 1,44 1,47 1,54 1,27 1,48 1,55 0,72

: I181F 1,11 1,04 1,20 0,92 1,24 0,84 0,87

: I181G 0,69 0,59 1,20 1,02 1,15 1,12 0,94

: I181H 0,88 0,73 1,13 ND 0,95 0,95 0,98

: I181K 0,58 0,43 1,15 ND 0,96 0,87 1,04

: I181L 0,76 0,75 1,09 ND 0,91 0,78 1,01

: I181P 1,04 1,07 1,35 ND 1,30 1,34 0,85

: I181R 0,49 0,47 0,78 0,87 1,43 1,64 0,87

: I181S 0,93 0,83 1,09 0,80 1,02 1,15 0,97

: I181T 0,80 0,75 1,02 0,85 0,94 1,13 1,09

: I181V 1,20 1,04 1,39 1,12 1,18 1,16 0,81

: I181Y 0,83 0,69 1,06 0,89 0,94 0,87 0,95

: G182A 0,82 0,87 1,36 1,14 1,24 1,11 0,72

: G182C 1,18 1,14 1,73 1,58 1,96 1,42 0,45

: G182D 0,79 0,71 1,40 1,17 1,40 1,56 0,77

: G182E 0,68 0,64 1,45 1,26 1,73 1,43 0,66

: G182F 1,30 1,21 1,10 1,06 1,50 1,46 0,46

: G182H 0,64 0,53 1,01 ND 1,13 1,22 1,01

G182K

-: 0,04

-: 0,01

-: 0,15

ND 0,07

-: 0,08

0,91

: G182L 0,53 0,48 1,12 ND 1,26 0,86 0,70

: G182P 0,61 0,47 1,45 1,23 1,57 1,40 0,73

: G182R 0,77 0,69 1,32 0,99 1,30 1,56 0,81

: G182S 0,68 0,57 0,99 0,87 1,16 1,10 0,85

: G182T 0,49 0,49 1,00 0,89 1,22 1,12 0,84

: G182V 0,61 0,46 1,26 1,12 1,38 1,18 0,66

: G182Y 0,61 0,48 0,85 0,88 1,00 0,96 0,84

: K183A 0,20 0,17 1,19 1,20 1,58 1,99 0,66

: K183C 0,18 0,19 1,35 1,24 1,38 2,02 0,62

: K183E 0,14 0,02 1,20 1,10 1,37 1,55 0,72

K183F 0,15

-: 0,05

1,11 1,08 1,61 2,04 0,59

: K183G 0,15 0,13 0,96 ND 1,24 1,35 0,94

: K183H 0,27 0,15 0,93 0,84 1,31 1,26 0,86

: K183L 0,05 0,10 0,91 0,93 1,15 1,44 0,86

: K183M 0,14 0,18 1,42 1,40 1,60 2,40 0,58

: K183P 0,03 0,17 1,27 1,06 1,73 1,64 0,58

: K183Q 0,12 0,14 1,30 1,21 1,51 2,11 0,71

: K183R 0,20 0,11 1,03 1,00 1,13 2,07 0,82

: K183S 0,15 0,18 0,92 0,83 1,18 1,33 0,93

: K183T 0,20 0,01 1,10 1,11 1,16 1,71 0,80

: K183V 0,10 0,07 0,82 0,89 1,38 1,73 0,62

: K183W 0,07 0,13 0,66 0,77 1,23 1,09 0,70

: K183Y 0,08 0,14 0,66 0,73 1,10 1,32 0,88

: W187A 0,45 0,36 1,67 1,77 1,21 1,02 0,90

: W187C 0,48 0,40 1,23 1,49 1,19 1,13 0,88

: W187E 0,62 0,51 1,18 1,22 1,14 1,08 1,04

: W187G 0,16 0,13 0,57 0,86 0,86 0,73 1,13

: W187I 0,70 0,57 0,83 0,86 0,78 0,82 1,29

: W187K 0,16 0,16 0,85 0,90 0,71 0,64 1,72

: W187L 0,69 0,69 0,72 0,78 0,75 0,66 1,29

: W187N 0,53 0,62 1,29 1,41 1,10 1,08 0,91

: W187P 0,17 0,14 0,29 1,65 1,19 1,15 0,85

: W187Q 0,41 0,35 1,27 1,30 1,09 0,92 1,03

: W187R 0,29 0,28 0,96 1,19 0,92 0,92 1,08

: W187S 0,40 0,28 1,01 1,07 0,86 0,76 1,25

W187V 0,20

-: 0,60

-: 0,25

0,12 0,26 0,77 0,20

: G194A 1,33 1,26 1,40 1,36 1,55 1,18 0,68

: G194E 1,28 1,12 1,13 1,10 1,37 1,25 0,79

: G194H 1,09 1,02 0,91 0,92 1,10 0,72 0,97

: G194K 0,77 0,75 0,80 0,80 1,01 0,68 1,18

: G194L 0,74 0,64 0,81 0,85 0,97 0,78 1,01

: G194M 1,38 1,33 1,65 1,48 1,40 1,19 0,69

: G194P 0,04 0,01 0,00 2,12 1,14 0,37 0,78

: G194R 1,04 0,96 0,98 1,05 1,08 0,86 1,01

: G194S 1,08 1,02 1,14 1,09 0,94 0,70 1,03

: G194T 0,93 0,77 0,87 0,92 1,05 0,71 1,07

: G194V 1,26 1,08 0,97 1,01 1,14 0,80 0,84

: G194W 0,61 0,51 0,60 0,62 0,75 0,48 1,31

: P209A 1,22 1,30 1,67 1,68 1,52 1,20 0,68

: P209C 1,24 1,20 1,01 1,00 1,37 1,29 0,58

: P209D 1,35 1,33 1,41 1,57 1,39 1,30 0,76

: P209E 1,34 1,25 1,31 1,47 1,34 1,35 0,82

: P209F 1,23 1,36 1,22 1,48 1,51 1,50 0,62

: P209G 1,09 0,92 1,10 1,09 0,98 0,91 1,01

: P209H 1,02 0,91 1,20 1,15 0,97 1,00 1,00

: P209I 0,94 0,85 1,01 1,03 0,91 0,84 0,95

: P209K 1,24 0,95 1,22 1,23 0,99 1,03 0,98

: P209L 0,83 0,92 1,00 1,06 1,02 1,02 0,87

: P209M 1,34 1,34 1,48 1,61 1,81 1,18 0,65

: P209N 1,65 2,42 0,99 1,11 2,77 2,36 0,21

P209Q

-: 0,73

-: 0,45

ND ND

-: 0,20

0,55

-: 0,12

: P209R 1,38 1,03 1,41 1,45 1,08 1,22 0,91

: P209S 1,14 1,02 1,13 1,21 1,02 0,86 0,89

: P209T 1,12 1,10 1,37 1,35 1,35 0,97 0,84

: P209V 0,98 0,83 1,10 0,93 1,16 1,04 0,82

: P209W 0,99 1,06 1,03 1,10 1,16 0,86 0,80

: P209Y 0,64 0,73 0,53 0,76 0,96 1,10 0,82

: N224A 0,65 1,07 1,11 1,13 1,47 1,19 0,81

: N224C 0,91 1,07 1,05 1,08 1,22 1,00 0,82

: N224D 0,81 1,10 0,96 1,08 0,85 0,75 0,82

: N224E 0,93 1,78 0,68 0,91 1,68 1,83 0,31

: N224F 0,79 1,11 0,81 0,93 1,33 1,31 0,67

: N224G 0,72 0,80 0,82 0,87 0,72 0,97 1,26

: N224H 0,60 0,80 0,74 0,84 0,66 0,83 1,20

: N224I 0,71 0,95 0,85 0,99 0,95 0,97 0,86

: N224K 0,56 0,64 0,78 0,81 0,58 0,78 1,42

: N224L 0,55 0,72 0,69 0,75 0,89 0,73 1,11

: N224M 0,84 1,07 1,07 1,13 1,22 1,27 0,73

: N224P 1,21 1,26 0,87 1,03 1,04 1,19 0,83

: N224Q 0,97 1,03 0,98 0,98 1,12 1,07 0,90

: N224R 0,89 1,22 0,65 0,76 1,15 1,34 0,53

: N224S 0,91 0,84 0,88 0,93 0,78 0,82 1,11

: N224T 0,90 0,86 0,93 0,95 0,78 0,99 1,17

: N224V 0,83 0,88 0,78 0,89 0,92 0,89 0,92

: N224W 0,82 0,87 0,70 0,80 0,79 0,88 1,02

: N224Y 0,92 1,03 0,81 0,89 0,87 0,77 0,93

: S242A 1,44 1,56 1,59 1,45 1,19 1,10 0,72

: S242C 1,73 1,99 1,84 1,93 1,97 1,06 0,46

: S242D 1,36 1,51 1,45 1,43 1,29 1,11 0,81

: S242G 1,24 1,20 1,29 1,22 1,12 0,92 0,93

: S242I 1,36 1,12 1,14 1,24 1,43 1,34 0,55

: S242K 0,80 0,70 0,92 0,92 0,99 0,86 1,26

: S242L 0,77 0,75 1,26 1,08 1,06 0,99 0,93

: S242M 1,56 1,70 1,48 1,78 1,54 1,10 0,55

: S242Q 1,44 1,62 1,28 1,34 1,34 1,14 0,84

: S242R 0,98 0,82 1,14 1,15 1,02 1,07 1,05

: S242T 1,06 0,93 0,90 0,91 1,08 0,71 0,99

: S242V 1,19 1,00 0,90 1,00 1,28 0,94 0,65

: P245A 1,53 1,58 1,74 1,69 1,46 1,09 0,68

: P245C 1,18 1,01 1,45 1,43 1,25 1,07 0,63

: P245D 1,52 1,36 1,65 1,61 1,45 1,53 0,77

: P245E 1,39 1,24 1,28 1,40 1,24 0,80 0,95

: P245F 1,28 1,35 1,13 1,15 1,23 0,93 0,77

: P245H 1,11 0,94 1,16 1,06 1,03 0,75 1,09

: P245I 0,81 0,61 1,05 0,96 0,93 0,90 0,97

: P245L 0,82 0,71 0,92 0,92 1,05 0,90 0,98

: P245M 1,18 1,20 1,76 1,74 1,60 1,27 0,67

: P245N 1,70 1,40 1,62 1,60 1,40 1,42 0,79

: P245Q 1,49 1,22 1,61 1,52 1,26 0,99 0,96

: P245R 1,37 1,23 1,19 1,26 1,47 1,08 0,88

: P245S 1,16 1,01 1,20 1,21 1,07 0,88 1,07

: P245T 1,31 0,99 1,26 1,23 1,13 0,97 0,92

: P245V 1,03 0,95 0,97 1,00 0,94 0,75 1,00

: P245Y 0,89 0,87 1,09 0,99 0,88 0,65 1,15

: G256A 1,13 1,22 1,07 1,22 1,09 1,29 0,70

: G256C 0,94 1,02 0,83 0,95 0,92 1,05 0,64

: G256D 0,98 1,00 1,18 1,17 1,01 1,15 0,95

: G256E 0,84 0,87 0,81 0,86 0,71 1,24 1,04

: G256H 0,71 0,74 0,74 0,77 0,83 0,70 1,18

: G256I 0,75 0,93 0,43 0,54 0,96 0,78 0,71

: G256K 0,58 0,60 0,56 0,65 0,68 0,84 1,38

: G256L 0,60 0,68 0,56 0,66 0,76 0,86 0,91

: G256M 1,15 1,07 0,97 1,13 1,14 1,24 0,67

: G256N 0,94 0,97 1,18 1,23 1,05 1,01 0,98

: G256P 1,50 1,45 0,71 0,89 1,51 1,67 0,46

: G256R 1,02 0,96 0,86 0,96 1,08 0,32 0,91

: G256S 0,96 0,96 0,79 0,87 0,82 0,98 0,95

: G256T 0,90 0,93 0,62 0,67 0,87 0,80 0,96

: G256V 0,89 0,84 0,77 0,77 1,07 1,11 0,72

: G256W 0,74 0,77 0,53 0,60 0,78 0,84 0,81

: D269A 1,71 1,92 1,19 1,67 1,38 2,24 0,23

: D269C 1,67 1,68 1,02 1,35 1,95 2,39 0,28

D269F

-: 8,17

-: 9,85

2,60 1,57

-: 14,68

-: 4,97

0,02

: D269G 1,18 1,30 0,68 0,96 1,59 1,43 0,37

: D269H 0,88 0,93 0,86 1,01 1,21 1,07 0,56

D269I

-: 4,21

-: 1,61

-: 2,68

-: 0,84

1,26 3,06 0,03

: D269K 0,61 0,49 0,73 0,93 0,98 1,08 0,68

: D269M 2,30 4,29 1,94 2,82 6,32 9,02 0,02

: D269N 1,20 1,07 1,39 1,58 1,07 1,36 0,68

: D269P 1,10 1,31 0,98 1,54 2,14 2,17 0,19

: D269Q 1,53 1,50 1,31 1,60 1,53 1,51 0,44

: D269R 1,11 1,09 0,80 1,25 1,59 1,26 0,39

: D269S 0,82 0,86 0,93 0,96 0,89 0,91 1,07

: D269T 0,76 0,98 0,78 0,96 1,43 1,43 0,30

: D269Y 1,05 0,91 0,73 1,06 1,46 1,47 0,20

: N271A 1,26 1,33 1,32 1,38 1,07 1,21 0,79

: N271D 1,25 1,29 1,25 1,37 1,21 1,35 0,80

: N271F 1,75 1,69 1,17 1,33 1,37 1,75 0,64

: N271H 0,79 0,76 0,84 0,80 0,89 0,91 1,10

: N271I 1,19 1,10 1,12 1,21 1,16 1,42 0,67

: N271K 0,79 0,75 0,92 0,93 0,94 1,20 1,15

: N271L 0,98 0,95 1,24 1,07 0,93 0,93 0,81

: N271M 1,25 1,29 1,40 1,44 1,16 1,59 0,68

: N271P 1,42 1,54 1,12 1,23 1,61 1,59 0,40

: N271S 0,99 1,03 0,96 1,04 1,02 1,10 0,97

: N271T 0,91 0,89 1,00 0,99 0,90 0,83 0,98

: N271V 0,70 0,88 0,80 1,01 1,07 1,08 0,76

: N271W 0,99 0,93 0,83 0,96 1,02 0,69 0,80

: N271Y 0,95 0,87 0,86 0,96 0,84 0,94 0,78

: T278A 1,17 1,21 1,25 1,41 1,11 1,35 0,84

: T278E 0,92 0,80 0,99 1,13 1,06 1,35 0,88

T278G

-: 1,12

0,26

-: 4,08

-: 1,79

3,31 1,75 0,04

: T278H 0,89 0,89 0,92 1,02 0,94 1,03 1,00

: T278I 0,89 0,87 0,81 0,86 0,82 0,89 1,10

: T278K 0,84 0,75 0,91 0,96 0,82 0,91 1,08

: T278L 0,82 0,80 1,02 0,99 0,82 0,93 0,96

: T278M 1,26 1,35 1,27 1,47 1,32 1,35 0,70

: T278N 1,22 1,19 1,17 1,30 1,00 1,35 0,86

: T278P 1,78 1,71 1,06 1,79 2,30 3,46 0,19

: T278R 1,13 1,07 1,00 1,24 1,10 1,47 0,83

: T278S 0,91 0,92 0,86 1,00 0,99 1,01 1,06

: T278W 0,92 0,99 0,84 1,00 1,04 1,08 0,85

: T278Y 0,76 0,84 0,79 0,90 0,72 0,87 1,04

: N281A 1,06 1,16 1,13 1,25 1,06 1,07 0,82

: N281D 1,08 1,33 1,09 1,22 1,41 1,29 0,61

: N281G 0,78 0,79 0,93 0,93 0,82 0,90 1,21

: N281H 0,76 0,82 0,83 0,87 0,73 0,63 1,10

: N281I 0,84 0,81 0,79 0,84 0,79 0,78 1,17

: N281L 0,66 0,72 0,77 0,78 0,58 0,55 1,43

: N281M 1,15 1,12 0,98 1,12 0,93 1,08 0,84

: N281P 1,15 1,18 1,09 1,18 1,05 0,89 0,85

: N281Q 1,22 1,33 1,00 1,13 1,10 1,16 0,62

: N281R 1,03 1,05 0,98 1,02 0,95 0,97 0,96

: N281S 0,90 0,91 0,88 0,89 0,72 1,01 1,09

N281T

-: 0,21

1,17

-: 0,65

-: 0,27

-: 0,63

-: 0,72

0,14

: N281V 0,85 0,88 0,80 0,87 0,76 1,07 0,86

: N281Y 0,79 0,84 0,75 0,80 0,59 0,73 1,18

: G302C 1,40 1,39 1,42 1,50 1,34 1,39 0,66

: G302D 1,10 1,14 1,13 1,17 1,14 0,96 0,88

: G302E 1,25 1,34 1,43 1,42 1,38 1,28 0,75

: G302F 1,26 1,51 1,02 1,22 1,42 1,77 0,50

: G302H 0,95 0,94 0,94 0,92 0,80 0,84 1,09

: G302I 1,34 1,31 1,13 1,25 1,63 1,52 0,67

: G302L 0,84 0,86 0,92 0,98 0,78 0,86 0,98

: G302M 1,31 1,35 1,35 1,51 1,31 1,52 0,69

: G302N 1,38 1,39 1,48 1,48 1,17 1,18 0,70

: G302P 1,24 1,29 1,32 1,43 1,23 1,03 0,59

: G302R 1,13 1,19 1,06 1,14 0,99 0,94 0,89

: G302S 1,05 1,11 0,91 0,96 0,87 0,99 1,01

: G302T 0,89 0,92 0,94 0,95 0,77 0,70 1,05

: G302V 1,08 1,16 1,09 1,15 0,76 0,96 0,88

: G302W 0,79 0,75 0,85 0,83 0,80 0,75 1,30

: G302Y 0,91 0,98 0,91 0,99 0,75 0,92 0,93

: A304D 1,19 1,30 1,42 1,44 1,16 1,22 0,75

: A304E 1,70 1,57 1,41 1,47 1,45 1,45 0,69

: A304F 1,14 1,14 1,27 1,18 0,86 0,87 1,02

: A304H 0,85 0,85 0,77 0,83 0,81 0,68 1,15

: A304L 0,92 0,95 0,91 0,96 0,80 0,74 1,00

: A304M 1,18 1,21 1,45 1,49 0,98 1,18 0,72

: A304N 1,42 1,41 1,30 1,44 1,43 1,28 0,71

: A304P 1,24 1,30 1,24 1,35 1,49 1,34 0,77

: A304R 1,14 1,16 1,05 1,13 0,93 1,03 0,90

: A304S 0,84 0,94 0,80 1,15 0,87 0,71 0,67

: A304T 1,00 1,07 0,89 0,99 0,98 0,75 0,92

: A304V 1,16 1,18 1,13 1,21 0,94 0,70 0,81

: A304W 0,88 0,89 0,89 0,93 0,73 0,94 1,07

: A304Y 0,89 0,93 0,87 0,95 0,66 0,77 1,01

: R308A 1,52 1,58 1,23 1,51 1,40 1,34 0,52

: R308C 1,61 2,01 0,97 1,22 1,95 1,87 0,39

: R308D 2,54 2,88 1,75 2,01 3,24 2,75 0,24

: R308E 1,54 1,66 1,15 1,34 1,42 1,45 0,53

: R308F 1,91 2,67 0,69 1,30 1,80 1,55 0,18

: R308G 1,27 1,29 0,81 0,95 1,02 1,10 0,59

: R308H 1,10 1,08 0,77 0,92 1,06 0,97 0,66

: R308I 1,13 1,55 0,57 0,76 0,92 0,84 0,43

: R308K 1,00 0,97 1,00 0,99 0,99 0,92 0,95

: R308L 0,97 1,33 0,36 0,67 0,93 0,19 0,33

: R308M 1,94 2,07 1,31 1,66 1,65 1,92 0,38

: R308N 1,72 1,86 1,09 1,37 1,94 1,71 0,41

: R308P 4,38 4,55 1,93 2,52 5,05 3,89 0,12

: R308S 1,06 1,00 0,84 0,97 0,84 0,87 1,00

: R308T 1,36 1,34 0,91 1,08 1,16 1,24 0,73

: R308V 1,31 1,47 0,62 0,88 1,06 0,97 0,42

: R308W 0,92 1,50 0,34 0,70 1,29 1,01 0,31

: R308Y 0,90 1,28 0,46 0,70 0,92 1,14 0,41

: T321A 1,07 1,20 0,95 1,19 1,44 1,33 0,84

: T321C 1,35 1,36 0,92 1,09 1,63 1,10 0,52

: T321F 1,00 0,96 0,90 1,00 1,14 1,07 1,03

: T321H 0,89 0,85 0,81 0,90 1,03 1,37 1,14

: T321I 0,81 0,87 0,66 0,77 1,13 0,93 0,83

: T321L 0,74 0,77 0,67 0,75 0,91 0,96 1,11

: T321P 1,23 1,25 1,08 1,18 1,69 1,22 0,79

: T321Q 1,12 1,15 1,05 1,10 1,14 1,27 0,93

: T321R 1,02 0,92 1,02 0,96 1,09 0,96 1,04

: T321S 1,02 0,91 0,88 0,99 1,14 0,84 1,08

: T321V 0,95 0,92 0,72 0,81 1,34 0,43 0,84

: T321Y 0,76 0,82 0,69 0,77 1,23 0,79 1,04

: Q358A 1,07 1,42 1,63 1,45 1,54 1,31 0,65

: Q358C 1,95 2,35 1,34 1,85 2,83 1,62 z0,26

: Q358D 1,35 1,37 1,21 1,29 1,55 1,10 0,79

: Q358E 1,35 1,22 1,27 1,57 1,02 0,74

: Q358F 1,35 1,32 1,05 1,14 1,49 1,19 0,71

: Q358G 1,15 1,03 0,90 0,96 1,10 1,06 0,74

: Q358H 1,05 0,99 0,95 0,97 1,15 1,40 0,94

: Q358L 0,92 1,06 1,05 1,06 1,24 0,84 0,83

: Q358M 1,12 1,37 1,42 1,41 1,52 1,17 0,72

: Q358N 1,27 1,37 1,32 1,42 1,63 1,06 0,73

: Q358P 1,27 1,33 1,10 1,23 1,72 1,17 0,65

: Q358R 1,03 1,07 1,08 1,07 1,18 1,15 0,91

: Q358S 1,09 0,99 1,02 1,04 1,01 0,91 0,93

: Q358T 1,05 1,05 1,04 1,00 1,17 1,10 0,95

: Q358V 1,15 1,18 1,02 1,13 1,35 1,35 0,67

: P378C 28,49 39,29 11,48 19,82 40,84 34,77 0,05

: P378D 1,13 1,20 1,15 1,18 1,12 0,99 0,88

: P378F 1,84 2,17 0,62 1,01 2,97 0,36 0,15

: P378G 1,21 1,20 1,00 1,06 1,44 1,30 0,75

: P378H 0,90 0,94 0,80 0,85 1,11 0,50 1,06

: P3781 1,16 1,20 1,03 1,15 1,33 1,26 0,62

: P378L 0,78 0,89 0,88 0,97 1,08 0,79 0,82

: P378N 1,31 1,39 1,19 1,37 1,42 0,97 0,71

: P378R 0,94 0,93 1,10 1,07 1,05 1,03 1,28

: P378S 1,15 1,09 0,99 1,04 1,08 1,11 0,90

: P378T 0,83 0,96 0,90 0,93 0,87 0,73 1,04

: P378V 1,08 1,08 1,09 1,10 1,15 0,94 0,87

: P378Y 0,87 0,92 0,78 0,91 1,11 0,97 0,67

: S382A 1,05 1,33 1,16 1,30 1,57 1,17 0,76

: S382C 1,20 1,19 1,01 1,12 1,27 1,05 0,87

: S382D 1,43 1,42 1,19 1,34 1,35 1,41 0,74

: S382E 1,23 1,39 1,14 1,27 1,47 1,23 0,83

: S382G 1,05 1,06 0,90 0,96 0,96 0,95 1,02

: S382H 1,10 1,02 0,96 0,99 1,10 0,98 1,00

: S3821 1,03 1,07 0,82 0,88 1,07 0,96 0,79

: S382K 0,94 0,84 0,95 0,98 1,12 0,78 1,09

: S382L 0,93 0,93 0,69 0,82 0,95 0,70 0,79

: S382M 1,51 1,84 1,25 1,51 2,20 1,47 0,54

: S382N 1,39 1,43 1,15 1,35 1,55 1,16 0,72

: S382P 1,41 1,42 1,22 1,33 1,65 1,25 0,70

: S382R 1,23 1,19 0,97 1,17 1,14 0,78 0,91

: S382T 1,18 1,15 0,98 1,08 1,30 1,14 0,90

: S382V 1,13 1,07 0,85 0,98 1,22 0,89 0,8]

: S382W 1,08 1,03 0,90 0,98 1,19 0,94 0,98

: K383A 1,26 1,16 1,24 1,35 1,17 0,86 0,66

: K383C 1,85 2,15 0,60 1,01 1,16 0,02 0,16

: K383D 1,14 1,17 1,16 1,13 1,04 0,89 0,69

: K383E 1,04 0,98 0,98 1,00 1,00 0,82 0,94

: K383F 1,43 1,44 0,93 1,01 1,47 0,86 0,50

: K383H 0,80 0,78 0,79 0,84 0,97 1,03 0,96

: K383L 0,64 0,66 0,50 0,60 0,66 0,92 0,76

: K383M 1,32 1,19 0,94 1,10 1,20 1,01 0,57

: K383N 1,27 1,20 0,98 1,11 1,07 1,15 0,64

: K383P 1,89 2,46 1,17 1,37 1,82 2,31 0,22

: K383Q 1,03 0,98 1,01 1,06 0,95 1,15 0,94

: K383R 1,02 0,91 1,00 0,95 1,10 0,84 0,99

: K383S 0,92 0,92 0,87 0,92 0,97 0,74 0,86

: K383T 0,79 0,76 0,83 0,84 0,90 0,83 0,98

: K383W 0,70 0,78 0,62 0,68 0,74 0,39 0,61

: K383Y 0,62 0,72 0,78 0,75 0,73 0,67 0,87

: T398A 1,28 1,18 1,34 1,43 1,37 1,17 0,73

: T398C 1,58 1,46 1,20 1,39 1,61 1,35 0,46

: T398D 1,29 1,24 1,33 1,33 0,88 1,42 0,75

: T398E 1,33 1,24 1,31 1,32 1,17 1,38 0,81

: T3981 0,81 0,87 0,91 0,96 0,91 0,86 1,04

: T398K 0,92 0,76 0,99 0,97 0,97 0,66 1,06

: T398L 0,76 0,68 0,85 0,87 0,86 1,14 0,99

: T398M 1,29 1,24 1,39 1,38 1,18 1,03 0,75

: T398N 1,96 1,88 1,34 1,58 1,23 1,31 0,37

: T398P 1,38 1,29 1,33 1,35 0,97 1,29 0,77

: T398Q 1,47 1,41 1,61 1,52 1,46 1,51 0,74

: T398R 1,16 1,08 1,25 1,16 1,25 1,02 0,98

: T398S 1,03 0,94 1,08 1,05 0,92 0,67 1,07

: T398V 1,00 1,06 1,20 1,19 1,03 0,96 0,87

: H405A 1,61 1,64 1,45 1,54 1,54 1,15 0,56

: H405C 1,92 2,06 1,69 1,91 2,68 1,40 0,33

: H405D 1,45 1,44 1,25 1,30 1,37 1,21 0,47

: H405F 2,03 2,09 1,28 1,41 3,15 1,98 0,20

: H405G 1,16 1,20 1,10 1,14 1,50 1,14 0,72

: H405K 0,71 0,58 0,87 0,89 1,05 0,64 0,72

: H405L 0,79 0,89 0,77 0,94 0,97 0,72 0,49

: H405M 1,65 1,66 1,28 1,51 1,67 1,22 0,41

: H405N 1,42 1,26 1,37 1,42 1,43 1,09 0,69

H405P

-: 12,67

-: 11,60

-: 0,88

-: 2,21

-: 6,12

-: 0,26

-: 0,03

: H405Q 1,50 1,53 1,33 1,42 1,76 1,33 0,59

: H405R 1,54 1,56 1,22 1,36 1,29 0,84 0,51

: H405S 1,09 1,00 1,05 1,03 1,10 0,91 0,90

: H405T 0,99 0,94 0,86 0,89 0,96 0,77 0,87

: H405W 0,86 0,83 0,43 0,64 1,32 0,50 0,35

: H405Y 0,96 1,07 0,84 0,93 1,37 0,96 0,50

: T417A 1,55 1,30 1,42 1,39 1,28 1,05 0,71

: T417D 1,55 1,28 1,40 1,43 1,14 1,34 0,80

: T417E 1,22 1,07 1,16 1,17 1,12 1,07 0,89

: T417H 0,98 0,89 0,91 0,95 1,07 0,89 0,98

: T4171 1,00 0,99 0,79 0,84 0,90 0,82 0,82

: T417L 0,87 0,79 0,88 0,89 0,98 1,03 0,92

: T417M 1,65 1,65 1,39 1,52 1,82 1,41 0,49

: T417P 1,38 1,25 1,34 1,35 1,26 1,12 0,74

: T417Q 1,47 1,24 1,21 1,24 1,40 1,26 0,84

: T417R 1,34 1,15 1,36 1,31 1,13 1,08 0,85

: T417S 1,10 0,95 1,01 1,03 0,96 1,13 1,02

: T417V 0,88 0,86 0,85 0,92 0,97 0,94 0,97

: T417W 0,97 0,84 0,72 0,89 1,01 0,77 0,90

: E418A 1,16 1,16 1,32 1,29 1,44 0,99 0,83

: E418C 1,14 1,24 0,98 1,10 1,21 0,73 0,66

: E418D 0,94 0,94 1,06 1,11 0,98 0,84 0,96

: E418G 0,68 0,70 0,81 0,82 0,82 0,58 1,17

: E418H 0,71 0,73 0,76 0,80 0,87 0,75 1,04

: E418I 0,80 0,75 0,76 0,79 1,09 0,70 0,97

: E418K 0,68 0,62 0,68 0,71 0,77 0,79 1,27

: E418L 0,69 0,64 0,72 0,78 0,39 0,47 1,08

: E418M 0,96 0,95 1,01 1,07 1,33 0,81 0,86

: E418N 1,00 1,01 1,18 1,20 1,11 0,87 0,83

: E418P 1,04 1,03 1,15 1,19 1,09 0,72 0,87

: E418Q 1,11 1,13 1,05 1,16 1,22 0,76 0,84

: E418R 1,08 1,01 0,95 1,03 1,26 1,01 0,86

: E418S 1,03 0,94 0,80 0,85 0,94 0,85 0,86

: E418T 0,87 0,80 0,82 0,84 0,91 0,50 1,09

: E418V 0,71 0,65 0,66 0,82 0,83 0,34 1,22

: E418Y 0,80 0,77 0,65 0,79 0,88 0,59 0,81

: P420A 1,16 1,17 1,41 1,49 1,36 0,97 0,81

: P420C 1,17 1,32 1,37 1,47 1,09 1,02 0,70

: P420D 1,29 1,25 1,37 1,38 1,35 0,90 0,75

: P420E 1,32 1,27 1,32 1,35 1,45 0,79 0,75

: P420H 1,05 0,95 0,95 1,01 1,11 0,69 0,98

: P420I 0,98 0,95 0,87 0,95 1,07 0,62 0,98

: P420L 0,85 0,82 0,87 0,91 1,07 0,74 0,97

: P420M 1,37 1,41 1,33 1,29 1,28 0,75 0,73

: P420N 1,42 1,38 1,30 1,41 1,50 0,95 0,73

P420R 0,49

-: 5,15

-: 1,38

-: 0,61

-: 11,09

-: 1,99

-: 0,01

: P420S 1,01 0,88 1,10 1,09 0,93 0,81 1,11

: P420T 0,97 0,87 0,94 0,95 0,68 0,87 1,10

: P420V 1,11 1,06 1,10 1,12 1,21 0,77 0,84

: P420W 0,72 0,69 0,71 0,75 0,80 0,54 1,29

: P420Y 0,90 0,83 0,80 0,76 1,05 0,85 0,96

: G421A 1,36 1,28 1,23 1,30 1,31 0,79 0,79

: G421D 1,23 1,28 1,43 1,38 1,28 0,99 0,72

: G421E 1,44 1,43 1,47 1,46 1,48 1,23 0,66

: G421F 1,23 1,19 1,13 1,13 1,50 0,75 0,79

: G421H 0,91 0,81 0,80 0,84 0,69 0,71 1,19

: G421I 1,19 1,13 0,97 1,08 1,38 0,80 0,65

: G421L 0,80 0,77 0,91 0,95 1,24 0,74 0,97

: G421N 1,28 1,30 1,23 1,34 1,49 0,82 0,75

: G421P 1,20 1,22 1,22 1,27 1,41 0,83 0,74

: G421Q 1,31 1,27 1,27 1,29 1,30 1,15 0,75

: G421R 1,17 1,04 1,05 1,09 1,08 0,85 1,00

: G421S 1,11 1,02 1,05 1,04 1,05 0,80 0,97

: G421T 1,04 0,91 0,95 0,98 1,05 0,86 1,05

: G421W 0,84 0,85 0,86 0,94 0,94 0,74 0,96

: G421Y 0,98 0,86 0,89 0,94 1,12 0,64 0,95

: P432A 1,40 1,30 1,44 1,53 1,64 1,26 0,75

: P432D 1,77 1,59 1,72 1,77 1,95 1,24 0,61

: P432E 1,39 1,29 1,40 1,41 1,33 1,19 0,77

: P432H 1,14 1,07 0,83 1,01 1,35 0,97 0,80

: P432K 1,21 0,96 1,05 1,08 1,22 1,02 0,91

: P432L 1,06 0,90 0,98 0,98 1,26 0,63 0,97

: P432M 1,48 1,47 1,72 1,71 2,15 1,45 0,65

: P432N 1,31 1,38 1,28 1,41 1,59 1,02 0,73

: P432Q 1,62 1,39 1,46 1,69 1,46 0,70

: P432R 1,60 1,35 1,36 1,43 1,27 1,21 0,78

: P432S 1,16 1,02 0,94 1,00 1,07 0,78 1,04

: P432T 1,19 0,99 1,33 1,13 1,27 1,08 0,98

: P432Y 1,14 0,98 0,82 0,94 1,21 0,69 0,90

: W437C 0,83 0,77 1,09 1,15 0,89 0,84 1,01

: W437D 0,97 0,85 1,12 1,15 0,98 0,97 1,08

: W437E 0,99 1,00 0,79 0,87 0,95 0,76 0,59

: W437F 1,01 0,81 0,94 1,00 0,74 0,80 1,22

: W437G 0,83 0,72 0,82 0,82 0,78 0,66 1,42

: W437H 0,65 0,64 0,83 0,84 0,78 0,71 1,52

: W437L 0,64 0,60 0,73 0,75 0,59 0,68 1,55

: W437M 1,03 0,86 1,01 1,06 0,83 0,63 1,11

: W437N 1,01 0,94 1,02 1,06 0,87 1,07 1,04

: W437Q 1,05 0,90 1,08 1,11 0,90 0,77 1,12

: W437R 0,91 0,83 1,07 1,02 0,83 0,53 1,19

: W437S 0,96 0,75 0,99 0,96 0,86 0,90 1,24

: W437T 0,78 0,71 0,92 0,89 0,77 0,71 1,32

: W437V 0,75 0,73 0,90 0,87 0,81 0,87 1,36

: W437Y 0,66 0,59 0,78 0,77 0,64 0,68 1,50

: Q443A 1,24 1,01 1,35 1,32 1,08 1,08 0,83

: Q443C 1,27 1,23 1,16 1,22 1,02 1,22 0,80

: Q443F 1,26 1,14 1,18 1,20 1,10 1,15 0,86

: Q443G 1,12 0,94 1,11 1,02 1,01 1,00 1,08

: Q443K 0,79 0,75 0,93 0,90 0,83 0,76 1,10

: Q443L 0,84 0,81 1,07 1,02 0,89 0,85 1,09

: Q443N 1,22 1,18 1,41 1,53 1,21 1,23 0,77

: Q443P 1,02 0,97 1,08 1,16 1,03 0,64 0,92

: Q443R 1,06 1,03 1,03 1,10 0,99 0,98 0,98

: Q443S 0,89 0,82 0,95 0,94 0,84 0,87 1,20

: Q443T 1,01 0,76 0,88 0,89 0,89 0,69 1,15

: Q443V 1,02 0,90 1,09 1,10 1,23 1,03 0,95

: Q443W 0,57 0,59 0,57 0,63 0,65 0,63 0,87

: Q443Y 0,82 0,87 0,95 0,97 0,97 0,86 0,92

: G446A 1,00 0,91 1,25 1,26 0,97 1,08 0,95

: G446C 1,39 1,31 1,84 1,78 1,40 1,23 0,73

: G446D 1,12 0,99 1,15 1,25 1,15 0,97 0,93

: G446F 1,34 1,37 1,00 1,15 1,03 1,22 0,75

: G446H 0,93 0,80 0,65 0,70 0,84 0,83 1,32

: G446I 1,22 1,07 0,97 1,04 1,39 1,05 0,70

: G446K 0,97 0,83 0,80 0,86 0,70 0,87 1,10

: G446L 0,80 0,78 0,86 0,88 0,94 0,85 1,07

: G446M 1,21 1,05 0,85 0,99 1,06 1,16 0,87

: G446N 1,17 1,08 1,05 1,21 1,07 1,07 0,88

: G446P 1,21 1,09 1,07 1,16 1,09 0,95 0,74

: G446Q 1,28 1,21 1,16 1,23 1,09 1,01 0,83

: G446R 0,37 0,07 0,71 1,10 0,22 0,65 0,75

: G446S 1,07 0,95 0,95 0,95 0,75 1,01 1,11

: G446T 1,03 0,88 0,69 0,81 0,91 0,96 1,09

: G446V 1,17 1,09 0,91 0,98 1,14 0,90 0,82

: G446W 0,85 0,72 0,83 0,89 0,92 0,80 1,05

: G446Y 0,88 0,76 1,02 1,00 0,83 0,91 1,09

: G454A 1,33 1,61 1,60 1,14 1,26 0,88

: G454C 1,33 1,18 1,15 1,20 1,14 1,37 0,78

: G454D 1,40 1,30 1,27 1,36 1,18 1,09 0,76

: G454E 1,36 1,21 1,08 1,19 0,99 0,91 0,83

: G454H 0,92 0,83 0,89 0,95 0,83 0,83 1,10

: G454I 0,87 0,79 0,77 0,82 0,88 0,75 1,02

: G454K 0,86 0,80 0,99 0,97 0,82 0,81 1,13

G454L 0,12

-: 034

-: 0,62

-: 0,26

0,50

-: 0,62

0,11

: G454M 1,39 1,26 1,14 1,42 1,26 1,30 0,68

: G454N 1,20 1,09 1,07 1,20 1,11 1,10 0,91

: G454P 1,41 1,34 1,14 1,29 1,16 0,96 0,77

: G454R 1,25 1,09 0,99 1,12 1,07 1,01 0,92

: G454S 0,83 0,80 0,83 0,90 0,89 0,79 1,17

: G454T 1,04 0,93 0,90 0,98 0,99 0,94 1,02

: G454V 1,20 1,07 1,05 1,10 1,18 0,89 0,93

: S457A 1,05 0,95 1,22 1,27 1,23 1,21 0,89

: S457C 1,27 1,23 , 0,72 0,72 1,53 1,44 0,59

: S457D 1,02 0,89 1,05 1,16 0,93 0,81 0,99

: S457E 1,10 0,95 0,97 1,06 0,97 0,79 0,95

: S457G 0,82 0,71 0,82 0,87 0,80 0,88 1,21

: S457H 0,83 0,72 0,81 0,90 0,89 1,12 1,17

: S457K 0,74 0,63 0,79 0,86 0,76 0,62 1,37

: S457L 0,67 0,61 0,68 0,79 0,64 0,63 1,27

: S457M 1,07 0,98 0,96 1,08 1,03 0,99 0,92

: S457N 1,08 0,92 1,10 1,19 1,13 1,15 0,86

: S457P 1,29 1,21 1,09 1,18 1,30 1,19 0,88

: S457Q 1,10 1,01 1,06 1,13 1,14 0,96 0,91

: 5457R 1,58 1,31 0,89 1,10 1,59 1,89 0,42

: S457T 0,88 0,70 0,94 0,94 0,85 1,01 1,18

: S457V 0,89 0,82 0,83 0,88 0,84 0,78 1,11

: S457W 0,87 0,69 0,64 0,74 0,84 0,60 1,05

: S457Y 0,81 0,70 0,70 0,80 0,80 0,79 1,15

: T459A 1,10 1,03 1,25 1,34 1,46 1,18 0,83

: T459D 1,20 1,17 1,19 1,24 1,37 1,44 0,82

: T459G 1,15 1,01 0,98 0,97 0,81 1,36 1,08

: T459I 1,05 0,95 0,95 1,01 1,04 1,04 1,02

: T459K 1,04 0,91 0,86 0,90 0,80 0,72 1,08

: T459L 0,93 0,83 1,19 1,10 0,91 0,81 1,04

: T459Q 1,46 1,43 1,40 1,47 1,29 1,24 0,72

: T459R 1,09 1,00 1,09 1,09 0,90 0,97 1,05

: T459S 0,99 1,00 0,85 0,87 1,04 0,90 1,06

: T459V 1,11 1,02 0,92 0,99 1,07 1,35 0,93

: T459Y 1,10 1,02 0,97 1,06 1,14 0,74 0,92

: T461A 1,40 1,44 1,16 1,28 1,74 1,18 0,47

: T461D 1,26 1,09 1,21 1,25 1,25 1,10 0,92

: T461E 1,52 1,44 1,49 1,43 1,22 1,06 0,74

: T461F 1,31 1,25 1,14 1,12 0,79

: T461G 1,09 1,03 1,08 1,04 1,16 1,14 0,98

: T461I 1,11 1,00 0,99 1,05 1,03 1,33 0,93

: T461K 0,89 0,75 0,78 0,91 4,98 0,99 1,01

: T461L 0,92 0,85 1,03 1,02 1,15 0,91 0,87

: T461N 1,18 1,18 1,35 1,37 1,36 1,30 0,81

: T461P 1,19 1,10 1,37 1,33 1,14 1,17 0,92

: T461R 1,19 1,04 1,13 1,18 1,11 0,91 0,99

: T461S 1,12 1,04 0,87 0,88 1,03 0,90 0,88

: T461V 0,95 1,00 1,01 1,05 1,11 1,28 0,87

: T461W 0,97 0,82 0,77 0,86 0,75 0,67 0,87

: T461Y 1,02 0,93 0,90 1,02 1,01 1,11 0,87

: S464D 1,45 1,23 1,24 1,31 1,51 1,21 0,73

: S464E 0,95 0,98 1,04 1,06 1,06 1,23 1,03

: S464G 0,94 0,86 0,92 1,00 0,98 0,97 1,04

: S464H 0,88 0,84 0,82 0,87 0,99 1,04 1,10

: S464I 0,94 0,80 0,78 0,83 0,96 1,15 1,00

: S464K 0,94 0,85 0,88 0,93 0,93 0,81 0,97

: S464L 0,77 0,81 0,79 0,91 0,88 0,86 1,02

: S464M 1,32 1,27 1,35 1,50 1,18 1,42 0,81

: S464N 1,15 1,03 1,16 1,25 1,18 1,38 0,85

: S464P 1,42 1,38 1,32 1,42 1,40 1,56 0,76

: S464Q 1,33 1,30 1,12 1,29 1,28 1,21 0,80

: S464V 0,94 0,96 0,94 1,02 1,12 1,33 0,89

: S464W 1,06 0,95 0,94 1,08 0,98 0,84 1,01

: S464Y 0,81 0,71 1,01 1,02 0,75 0,84 1,33

: G474A 1,03 1,20 1,25 1,35 1,12 1,27 0,81

: G474C 1,05 1,30 1,18 1,31 1,55 1,04 0,66

: G474D 1,13 1,26 1,35 1,41 1,26 1,28 0,78

: G474E 1,13 1,13 1,17 1,27 1,16 1,23 0,87

: G474F 1,23 1,34 1,20 1,29 1,22 1,47 0,80

: G474H 0,86 0,95 0,94 1,02 1,06 1,11 1,07

: G474I 0,79 0,99 0,91 0,97 0,95 0,81 0,99

: G474K 0,81 0,82 0,92 0,97 1,06 0,97 1,07

: G474L 0,70 0,75 0,81 0,87 0,88 0,91 1,12

: G474M 1,18 1,26 1,24 1,40 1,20 1,05 0,74

: G474N 1,14 1,02 1,09 1,16 1,29 1,29 0,89

: G474P 1,53 1,45 1,25 1,38 1,39 0,36 0,72

: G474Q 1,19 1,14 1,26 1,33 1,35 1,37 0,79

: G474R 1,15 1,17 1,16 1,29 1,31 1,41 0,82

: G474S 0,87 0,89 0,97 0,99 1,00 0,93 1,09

: G474T 0,97 1,01 1,13 1,06 1,03 1,00 1,01

: G474V 0,88 0,91 1,03 1,02 1,03 0,94 1,01

: R483A 1,25 1,23 1,35 1,43 1,43 1,34 0,74

: R483C 1,19 1,17 1,73 1,51 1,19 1,59 0,70

: R483F 1,08 1,49 1,36 1,23 1,51 1,18 0,57

: R483G 1,07 1,13 1,07 1,12 1,14 1,08 0,86

: R483K 0,82 0,73 0,86 0,90 0,91 0,69 1,12

: R483L 1,10 1,03 1,29 1,20 1,06 0,93 0,94

: R483M 1,31 1,50 1,42 1,56 1,51 1,26 0,66

: R483N 1,17 1,32 1,46 1,39 1,34 1,09 0,75

: R483P 1,19 1,17 1,37 1,35 1,17 1,05 0,83

: R483Q 1,38 1,48 1,84 1,67 1,72 1,51 0,65

: R483S 0,99 1,05 0,92 0,96 1,04 0,94 1,02

: R483T 1,10 1,03 1,04 0,98 0,98 0,93 0,93

: R483V 1,11 1,18 1,25 1,26 1,25 1,20 0,80

: R483Y 0,81 0,86 1,07 1,06 1,04 0,81 0,96

[0388] Resultará evidente que un gran número de sustituciones produjeron variantes de α-amilasas que tenían una o varias propiedades mejoradas en comparación con la α-amilasa natural. Estas sustituciones se incluyen en las presentes composiciones y métodos.

Ejemplo 24. Propiedad alterada de variantes de AmyS 5

[0389] Este ejemplo muestra que algunas variantes de α-amilasa de G. stearothermophilus (AmyS) (descritas en el Ejemplo 22) tienen una propiedad alterada en relación con la α-amilasa original. Se llevó a cabo un cribado de estabilidad térmica de alto rendimiento de variantes AmyS como se describe en el Ejemplo 3. Los índices de rendimiento de la actividad (medidos como ensayo con BODIPY) y de la actividad residual (después de la tensión térmica) se muestran en las Tablas 24-1, 24-2, 24-3. 10

Tabla 24-1: Posiciones en proteínas AmyS con mutaciones (se muestran en la columna llamada “variante”) que tienen índices de rendimiento tanto de la actividad como de la actividad residual después de tensión por calor mejores que la AmyS natural.

Variante: Actividad Actividad residual

72 D: 1,0300361 1,0701945

74 A: 1,0821966 1,2443197

74 E: 1,0425346 1,0348158

74 G: 1,1272413 1,0873821

74 H: 1,0489031 1,0047597

74I: 1,0441329 1,0204416

74 Y: 1,0962024 1,0243028

86 E: 1,0744425 1,0082956

86 K: 1,0320588 1,0003874

115 E: 1,0371929 1,0263233

115 K: 1,0983963 1,1179136

115 L: 1,0304852 1,2220073

115 N: 1,0617811 1,0373701

115 Q: 1,0585819 1,0086197

115 R: 1,0362569 1,0196812

115 Y: 1,0818022 1,0155115

124 A: 1,0066154 1,0764058

124 K: 1,0875013 1,3977188

124 N: 1,2073767 1,1957849

124 Q: 1,0581528 1,1748222

124 R: 1,0401245 1,2046408

125 N: 1,2111343 1,111989

132 A: 1,0229275 1,3339209

135 F: 1,0125922 1,1400675

145 A: 1,0535347 1,269397

146 A: 1,0159296 1,2695343

Variante: Actividad Actividad residual

146 D: 1,0111003 1,0989512

146 E: 1,0209598 1,076157

146 T: 1,0557131 1,0905141

146 W: 1,0503671 1,0446909

148 A: 1,1550962 1,3714229

148 E: 1,0257123 1,1367377

148 F: 1,0047267 1,0833811

148 R: 1,1439066 1,0724962

153 A: 1,0933406 1,1903028

153 D: 1,047218 1,0763254

153 G: 1,0314126 1,0393344

153 H: 1,0243746 1,0325474

153 N: 1,0749307 1,1537286

153 P: 1,1090313 1,1653113

153 R: 1,0695773 1,050884

159 A: 1,2514424 1,8489959

159 C: 1,1389324 1,4229765

159 D: 1,3042895 1,616517

159 E: 1,3048703 1,6426287

159 F: 1,0692526 1,2740874

159 G: 1,309088 1,4806394

159 H: 1,2239861 1,4766606

159 K: 1,3024788 1,6188749

159 L: 1,2438467 1,7685564

159 N: 1,4021695 1,747298

159 R: 1,3445318 1,6062932

159 S: 1,3352659 1,5322275

159 T: 1,2115923 1,5982316

159 V: 1,1075763 1,5364844

169 L: 1,2709 1,221157

169 M: 1,0720854 1,2525822

169 Y: 1,1519097 1,3009779

179 A: 1,2856782 1,4150905

179 Q: 1,0837406 1,0777175

180 A: 1,223674 1,1463487

181 A: 1,5853606 2,5498838

181 C: 1,0805237 1,2359592

181 D: 1,2451756 1,4958763

181 E: 1,2126846 1,3673333

181 F: 1,1174172 1,0714025

181 L: 1,0562715 1,2603028

181 M: 1,0553459 1,1115696

181 N: 1,0657087 1,058626

181 P: 1,3407541 1,8191875

181 Q: 1,1827757 1,3094913

181 R: 2,1023852 1,000651

181 V: 1,2072805 1,2882775

181 Y: 1,1468422 1,2888335

187 L: 1,0631177 1,1713174

242 D: 1,053295 1,2659451

242 E: 1,1904636 1,4089496

242 G: 1,0897161 1,0670134

Variante: Actividad Actividad residual

259 M: 1,054788 1,1174398

261 L: 1,1311136 1,2682418

271 K: 1,0660617 1,1281026

271 V: 1,0912656 1,3024768

278 A: 1,1681249 1,3749858

278 H: 1,2287582 1,3214257

278 K: 1,2908668 1,3351968

278 N: 1,2587781 1,4816971

278 R: 1,2602246 1,3802029

278 S: 1,0407916 1,051006

281 A: 1,0778757 1,302493

281 I: 1,0773434 1,0691046

281 L: 1,0664433 1,5428781

281 M: 1,2357293 1,317267

281 P: 1,1452343 1,1634661

281 R: 1,1498741 1,1898966

281 Y: 1,0366211 1,0814182

302 C: 1,0627926 1,0743991

302 D: 1,3067743 1,3085968

302 E: 1,0492343 1,1151221

302 M: 1,0807557 1,2463993

304 D: 1,1358974 1,304862

304 E: 1,1872403 1,2138013

304 F: 1,1250781 1,0476505

304 M: 1,2316987 1,2224245

304 N: 1,0270711 1,0584592

304 P: 1,0166456 1,0403283

304 R: 1,0960387 1,0336549

304 V: 1,0716606 1,0416779

304 W: 1,1600113 1,0109269

304 Y: 1,3289811 1,1964204

308 A: 1,0074309 1,189004

321 A: 1,0826055 1,2311805

321 H: 1,384587 1,4691649

321 Q: 1,3306703 1,3485614

321 R: 1,2446359 1,3138378

321 S: 1,1483705 1,1251132

321 Y: 1,0396471 1,1263643

333 Q: 1,425789 1,6656427

378 D: 1,0880667 1,2202146

378 N: 1,0064817 1,2616767

378 R: 1,0264777 1,2826859

378 T: 1,042994 1,0795534

382 D: 1,1628676 1,2206133

382 G: 1,0050534 1,009576

382 K: 1,1896345 1,178075

382 N: 1,0241429 1,1576205

382 P: 1,001145 1,0672392

398 A: 1,0127464 1,2067063

418 A: 1,070915 1,3701437

418 M: 1,101424 1,3091549

418 N: 1,1440828 1,4650527

Variante: Actividad Actividad residual

420 A: 1,1288416 1,2216203

420 D: 1,0368387 1,065286

420 M: 1,011372 1,1274183

420 N: 1,0213745 1,1440374

421 E: 1,010536 1,0961403

421 H: 1,0434891 1,0576175

421 L: 1,0197128 1,0679988

421 N: 1,092512 1,1299631

421 Q: 1,0784982 1,1126707

421 R: 1,142674 1,2396538

421 T: 1,0098565 1,023113

432 A: 1,1828859 1,4534375

432 D: 1,1261465 1,2701694

432 E: 1,0932052 1,1438228

432 K: 1,0432215 1,1145887

432 L: 1,1040571 1,2896033

432 M: 1,1530369 1,3947422

432 N: 1,1373288 1,2843802

432 Q: 1,2305257 1,3438957

432 R: 1,1226193 1,2108348

432 S: 1,1383528 1,1690319

432 T: 1,0946975 1,1651163

432 Y: 1,0242088 1,2209025

437 C: 1,0389223 1,0550093

437 D: 1,0648095 1,2263069

437 F: 1,0884338 1,0761389 ,

437 G: 1,1270339 1,2057266

437 H: 1,0624587 1,2128077

437 L: 1,0706178 1,2702869

437 M: 1,1727007 1,3357945

437 N: 1,0678835 1,1245993

437 Q: 1,0533035 1,1845926

437 R: 1,0211609 1,01587

437 S: 1,0996009 1,0937657

437 V: 1,0035949 1,1373234

437 Y: 1,2190374 1,428939

443 G: 1,039287 1,0340347

443 L: 1,0229234 1,0966951

443 P: 1,0219417 1,0948128

446 A: 1,2002798 1,498028

446 D: 1,0773299 1,1176728

446 H: 1,0897531 1,071114

446 K: 1,039616 1,0263734

446 N: 1,1867752 1,1501356

446 R: 1,0179243 1,035122

446 S: 1,00426 1,0219768

446 Y: 1,1205486 1,2525673

459 I: 1,0404304 1,0379194

459 M: 1,0320006 1,1066777

459 Y: 1,0131462 1,0198803

461 P: 1,084833 1,1869717

464 D: 1,0164453 1,0297077

Variante: Actividad Actividad residual

464 H: 1,0355113 1,0962268

464 L: 1,0084324 1,0510274

464 M: 1,0026999 1,1589373

464 N: 1,0727228 1,1205096

464 Q: 1,0719588 1,2199585

464 Y: 1,1888873 1,3747167

474 A: 1,1556971 1,3935021

474 D: 1,0692943 1,1879003

474 E: 1,1729152 1,3481142

474 F: 1,0633952 1,1462803

474 H: 1,0620029 1,1722857

474 I: 1,0766474 1,1352128

474 K: 1,1240341 1,2036886

474 L: 1,110407 1,267509

474 M: 1,1869843 1,3422689

474 N: 1,1135684 1,2124349

474 P: 1,0761861 1,2293237

474 Q: 1,2580448 1,3477339

474 R: 1,1994238 1,3506214

474 S: 1,2348915 1,2615358

474 T: 1,1757697 1,1841873

474 V: 1,0823992 1,2078523

Tabla 24-2: Posiciones en proteínas AmyS con mutaciones (se muestran en la columna llamada “variante”) que tienen índices de rendimiento de la actividad residual después de tensión por calor al menos 20 % mejores que la AmyS natural e índices de rendimiento de expresión o actividad de partida de al menos la mitad que la AmyS natural. 5

Variante: Actividad Actividad Residual

74A: 1,0821966 1,2443197

115L: 1,0304852 1,2220073

124K: 1,0875013 1,3977188

124R: 1,0401245 1,2046408

132A: 1,0229275 1,3339209

132C: 0,9072598 1,2271522

135A: 0,9014583 1,2604591

145A: 1,0535347 1,269397

146A: 1,0159296 1,2695343

148A: 1,1550962 1,3714229

148N: 0,8803735 1,202166

159A: 1,2514424 1,8489959

159C: 1,1389324 1,4229765

159D: 1,3042895 1,616517

159E: 1,3048703 1,6426287

159F: 1,0692526 1,2740874

159G: 1,309088 1,4806394

159H: 1,2239861 1,4766606

159K: 1,3024788 1,6188749

159L: 1,2438467 1,7685564

159N: 1,4021695 1,747298

159R: 1,3445318 1,6062932

159S: 1,3352659 1,5322275

Variante: Actividad Actividad Residual

159T: 1,2115923 1,5982316

159V: 1,1075763 1,5364844

169A: 0,9976004 1,3149706

169L: 1,2709 1,221157

169M: 1,0720854 1,2525822

169Y: 1,1519097 1,3009779

179A: 1,2856782 1,4150905

181A: 1,5853606 2,5498838

181C: 1,0805237 1,2359592

181D: 1,2451756 1,4958763

181E: 1,2126846 1,3673333

181L: 1,0562715 1,2603028

181P: 1,3407541 1,8191875

181Q: 1,1827757 1,3094913

181V: 1,2072805 1,2882775

181Y: 1,1468422 1,2888335

242A: 0,8658592 1,3402797

242D: 1,053295 1,2659451

242E: 1,1904636 1,4089496

242Q: 0,9905304 1,8848517

261L: 1,1311136 1,2682418

271A: 0,9883235 1,3367718

271V: 1,0912656 1,3024768

278A: 1,1681249 1,3749858

278H: 1,2287582 1,3214257

278K: 1,2908668 1,3351968

278N: 1,2587781 1,4816971

278R: 1,2602246 1,3802029

281A: 1,0778757 1,302493

281L: 1,0664433 1,5428781

281M: 1,2357293 1,317267

302D: 1,3067743 1,3085968

302M: 1,0807557 1,2463993

304D: 1,1358974 1,304862

304E: 1,1872403 1,2138013

304M: 1,2316987 1,2224245

321A: 1,0826055 1,2311805

321H: 1,384587 1,4691649

321Q: 1,3306703 1,3485614

321R: 1,2446359 1,3138378

333Q: 1,425789 1,6656427

378D: 1,0880667 1,2202146

378N: 1,0064817 1,2616767

378R: 1,0264777 1,2826859

382D: 1,1628676 1,2206133

398A: 1,0127464 1,2067063

418A: 1,070915 1,3701437

418M: 1,101424 1,3091549

418N: 1,1440828 1,4650527

420A: 1,1288416 1,2216203

421R: 1,142674 1,2396538

432A: 1,1828859 1,4534375

Variante: Actividad Actividad Residual

432D: 1,1261465 1,2701694

432L: 1,1040571 1,2896033

432M: 1,1530369 1,3947422

432N: 1,1373288 1,2843802

432Q: 1,2305257 1,3438957

432R: 1,1226193 1,2108348

432Y: 1,0242088 1,2209025

437D: 1,0648095 1,2263069

437G: 1,1270339 1,2057266

437H: 1,0624587 1,2128077

437L: 1,0706178 1,2702869

437M: 1,1727007 1,3357945

437Y: 1,2190374 1,428939

446A: 1,2002798 1,498028

446Y: 1,1205486 1,2525673

454A: 0,9816646 1,2570919

: 1,0719588 1,2199585

464Y: 1,1888873 1,3747167

474A: 1,1556971 1,3935021

474E: 1,1729152 1,3481142

474K: 1,1240341 1,2036886

474L: 1,110407 1,267509

474M: 1,1869843 1,3422689

474N: 1,1135684 1,2124349

474P: 1,0761861 1,2293237

474Q: 1,2580448 1,3477339

474R: 1,1994238 1,3506214

474S: 1,2348915 1,2615358

474V: 1,0823992 1,2078523

Tabla 24-3: Posiciones en proteínas AmyS con mutaciones (se muestran en la columna llamada “variante”) que tienen índices de rendimiento de la actividad o la expresión al menos 20 % mayores que la AmyS natural

Variante: Actividad Actividad Residual

124N: 1,2073767 1,1957849

125A

1,372718

-: 0,3461869

125K

1,2754087

-: 0,3195654

125N: 1,2111343 1,111989

130A

1,2829276

-: 0,1606582

130S

1,2547959

-: 0,2396474

159A: 1,2514424 1,8489959

159D: 1,3042895 1,616517

159E: 1,3048703 1,6426287

159G: 1,309088 1,4806394

159H: 1,2239861 1,4766606

159K: 1,3024788 1,6188749

159L: 1,2438467 1,7685564

159N: 1,4021695 1,747298

159R: 1,3445318 1,6062932

159S: 1,3352659 1,5322275

159T: 1,2115923 1,5982316

166F: 1,3226117 0,9751853

Variante: Actividad Actividad Residual

166G

1,3251188

-: 0,8989095

166H: 1,5608888 0,889625

166S

1,5553953

-: 0,4698927

166Y: 1,3161377 0,9404254

169L: 1,2709 1,221157

179A: 1,2856782 1,4150905

179P

1,2367832

-: 0,2832651

180A: 1,223674 1,1463487

180D: 1,3732003 0,5446904

180H

1,3854073

-: 0,9190277

180K

1,4038831

-: 1,1078033

180L

1,6414819

-: 0,6936105

180N

1,2646998

-: 1,0108408

180T

1,4553893

-: 0,8759486

180V

1,2190216

-: 1,0611484

180Y: 1,3113267 0,6162484

181A: 1,5853606 2,5498838

181D: 1,2451756 1,4958763

181E: 1,2126846 1,3673333

181G: 1,2893058 0,9117403

181P: 1,3407541 1,8191875

181R: 2,1023852 1,000651

181S: 1,2285225 0,9373869

181V: 1,2072805 1,2882775

187A

1,3658382

-: 0,221251

187C

1,3181513

-: 0,2335241

187K

1,2523832

-: 0,2685104

187N: 1,2632558 0,127576

187P

1,4102122

-: 0,2495879

187Q

1,2477941

-: 0,2008265

187R

1,3445711

-: 0,2482154

187S

1,2513011

-: 0,2208563

242H: 1,280464 0,7629545

242N: 1,29758 0,8729278

278H: 1,2287582 1,3214257

278K: 1,2908668 1,3351968

278N: 1,2587781 1,4816971

278R: 1,2602246 1,3802029

281M: 1,2357293 1,317267

302D: 1,3067743 1,3085968

304M: 1,2316987 1,2224245

304Y: 1,3289811 1,1964204

321H: 1,384587 1,4691649

321Q: 1,3306703 1,3485614

321R: 1,2446359 1,3138378

333Q: 1,425789 1,6656427

432Q: 1,2305257 1,3438957

437Y: 1,2190374 1,428939

446A: 1,2002798 1,498028

474Q: 1,2580448 1,3477339

474S: 1,2348915 1,2615358

[0390] Basándose en los datos de rendimiento relativo y en los datos de estabilidad de las posiciones AmyS descritas en las Tablas 23-1, 24-1, 24-2, y en la Tabla 24-3, las posiciones de AmyS se clasificaron como restrictivas frente a no restrictivas como sigue: Las posiciones no restrictivas tienen ≥ 20 % de mutaciones neutras para al menos una propiedad. Estas posiciones son buenas candidatas para la mutación cuando se preparan α-amilasas modificadas ya que las mutaciones en estas posiciones tienen una alta probabilidad de 5 mejorar el rendimiento. Las posiciones restrictivas tienen < 20 % de mutaciones neutras para actividad y estabilidad. Estas posiciones generalmente se dejan solas (es decir, no se mutan) cuando se modifican variantes de α-amilasas, puesto que la mutación en estas posiciones tiende a reducir el rendimiento, en vez de incrementarlo. Todas las posiciones/sitios descritos en la Tabla 23-1 son no restrictivos.

Ejemplo 25. Genotecas de posición adicionales en la proteína AmyS 10

[0391] Además de las variantes de AmyS descritas en el Ejemplo 22, se generaron genotecas de posición en sitios adicionales en α-amilasa de G. stearothermophilus con un truncamiento (SEQ ID Nº 2). Las genotecas las produjo Geneart (Geneart GmbH, Josef-Engert-strasse 11, D-93053 Regensburg, Alemania). La Tabla 25-1 muestra las variantes de sitio que se generaron.

Tabla 25-1: Variantes de sitio generadas en AmyS

N5: A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y

G6: A,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

E13: A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

W14: A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,S,T,V,Y

Y15: A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W

L16: A,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

D18: A,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

G20: A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

K25: A,C,D,E,F,G,H,L,M,N,P,Q,R,S,T,Y

A27: C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

E29: A,D,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y

L36: A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

T39: C,D,E,F,G,H,K,M,N,P,Q,R,S,V,W

T50: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y

R52: A,C,D,E,G,H,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y

S53: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,T,V,W,Y

D54: A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

E67: A,C,D,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y

K71: A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

T73: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,V,W,Y

R75: A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,P,Q,S,T,V,W,Y

K77: A,C,D,E,F,G,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W

T80: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y

K81: A,C,D,E,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

Q83: A,C,D,E,G,G,H,I,L,M,P,R,S,T,V,W,Y

L85: A,C,D,E,G,H,I,K,N,P,Q,R,S,T,W,Y

A90: C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,O,Q,R,S,T,V,W,Y

H92: C,D,E,F,G,K,L,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

H106: A,C,D,E,G,I,K,L,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

K107: A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

D111: A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

T113: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,V,W

E114: A,C,D,F,G,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W,Y

E120: A,C,D,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

V121: A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,P,Q,R,S,T,W,Y

R126: A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,T,V,W,Y

Q128: A,C,D,E,G,H,I,K,L,N,P,R,S,T,V,W,Y

S131: A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,R,T,W,Y

T133: A,C,D,E,F,G H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y

Tabla 25-1: Variantes de sitio generadas en AmyS

Q137: A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,P,R,S,T,V,W,Y

A138: C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

W139: A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,Y

K141: A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

D143: A,C,E,G,H,I,K,L,M,N,P,T,V,W,Y

R147: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y

N149: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W

T150: A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,Q,R,S,V,Y

Y151: A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W

S152: A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,Q,R,T,V,W,Y

K155: A,C,D,E,G,H,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

H160: A,C,D,E,F,G,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

D165: A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

E168: A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

L172: A,C,D,E,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

S173: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,T,V,W,Y

K177: A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y

E188: A,C,D,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y

T191: A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W

E192: A,C,D,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

N193: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,R,S,T,W,Y

Y196: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,R,S,T,V,W

L199: A,E,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

M200: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,S,T,V,W

Y201: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W

A202: C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y

T213: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W

K216: A,D,E,F,G,H,I,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y

N217: A,C,E,F,G,H,I,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y

K220: A,C,D,E,F,G,H,I,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

W221: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,V,Y

N227: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y

R232: A,C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y

A235: C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

K237: A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y

H238: A,C,D,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,Y

K240: A,D,E,F,G,H,I,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

D246: A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,Y

S249: A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,P,Q,R,T,V,W,Y

Y250: A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W

R252: A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,Y

S253: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,T,V,W,Y

Q254: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,V,W,Y

T255: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,V,W,Y

K257: A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W

P258: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

Y268: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W

K272: A,C,D,E,F,G,H,I,M,N,P,R,S,T,V,W,Y

H274: A,C,D,E,F,G,I,K,L,N,P,Q,R,S,T,W,Y

N275: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y

K279: C,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y

T283: A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,V,W,Y

Tabla 25-1: Variantes de sitio generadas en AmyS

S285: A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,Q,R,T,V,W,Y

N293: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y

K294: A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

T297: C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y

K300: A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W

S301: A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y

D306: A,C,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

T309: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,v,W,Y

T312: A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y

N313: A,C,D,B,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,V,W

K317: A,C,D,E,F,G,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

D318: A,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

Q319: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y

P320: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y

L338: A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y

Q339: A,C,D,E,F,G,K,L,M,P,R,S,T,V,W,Y

S340: A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,T,V,Y

D343: A,C,E,F,H,I,L,M,N,P,Q,R,T,W,Y

W345: A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V

C363: A,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

Y366: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,,M,N,P,Q,R,S,T,V,W

Y369: A,C,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,T,V,W

Y370: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W

Y375: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W

S379: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y

K381: A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

D385: A,C,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,S,T,V,W

P386: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y

R391: A,C,E,G,H,K,L,N,P,Q,S,T,V,W,Y

R392: A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y

D393: A,C,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

Y394: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,V,W

H400: A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q.R,S,T,V,W,Y

Y402: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W

L403: A,C,D,E,FG,H,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

D404: A,C,E,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y

S406: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,T,V,Y

D407: C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

G410: A,C,D,E,F,H,I,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y

R413: A,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y

E414: A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y

V416: A,C,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y

K419: A,C,D,E,F,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

S422: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y

I427: A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

G433: A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,W,R,S,T,V,Y

K436: A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

Y439: A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W

K442: A,C,F,G,H,I,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

A445: C,D,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,S,T,V,W

K447: A,C,D,F,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

V448: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y

Tabla 25-1: Variantes de sitio generadas en AmyS

Y450: A,C,D,E,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W

L452: A,C,D,E,F,G,H,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y

N455: A,C,D,E,G,H,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y

N463: A,D,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y

D465: A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

E469: A,C,D,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

K471: A,C,D,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y

N473: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y

S476: A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y

Ejemplo 26. Propiedades alteradas de las variantes descritas en el Ejemplo 25

[0392] Este ejemplo muestra que las variantes de alfa-amilasa de G. stearothermophilus (AmyS) (descritas en el Ejemplo 25) pueden tener una propiedad alterada en relación con la α-amilasa original. Se llevó a cabo un cribado de estabilidad térmica de alto rendimiento de variantes AmyS como se describe en el Ejemplo 3. Los 5 índices de rendimiento de la actividad (medidos como ensayo con BODIPY) y de la actividad residual (después de la tensión térmica) se muestran en las Tablas 26-1, 26-2, 26-3.

Tabla 26-1: Posiciones en proteínas AmyS con mutaciones (se muestran en la columna llamada “variante”) que tienen índices de rendimiento tanto de la actividad como de la actividad residual después de tensión por calor mejores que la AmyS natural. 10

Variante: Actividad Actividad residual

006A: 1,59 1,10

006D: 1,64 1,14

006E: 1,93 1,08

006I: 1,47 1,23

006L: 1,61 1,15

006M: 1,60 1,11

006N: 1,61 1,21

006P: 2,47 1,10

006Q: 1,34 1,26

006S: 1,86 1,12

006T: 2,01 1,21

006V: 1,54 1,29

006W: 1,32 1,13

006Y: 1,88 1,07

014F: 1,25 1,06

014T: 1,22 1,22

014Y: 1,71 1,08

015A: 1,48 1,05

015H: 1,85 1,01

016E: 1,21 1,09

025C: 1,46 1,33

025D: 1,03 1,06

025H: 1,06 1,03

025Q: 1,07 1,24

027N: 1,00 1,06

036K: 1,05 1,01

036M: 1,05 1,05

039C: 1,05 1,09

039D: 1,47 1,15

039E: 1,32 1,15

039G: 1,05 1,23

039H: 1,10 1,16

Variante: Actividad Actividad residual

039K: 1,10 1,12

039N: 1,64 1,14

039Q: 1,43 1,20

039R: 1,10 1,01

039S: 1,02 1,15

050G: 1,18 1,00

050N: 1,12 1,20

050Q: 1,08 1,31

050S: 1,09 1,07

052M: 1,00 1,01

052T: 1,00 1,11

053A: 1,00 1,03

053H: 1,00 1,12

053K: 1,10 1,03

053T: 1,02 1,25

067G: 1,13 1,01

067H: 1,03 1,04

071R: 1,10 1,10

075A: 1,14 1,05

075M: 1,04 1,04

085E: 1,02 1,09

085M: 1,04 1,01

085S: 1,04 1,02

090H: 1,03 1,05

090M: 1,02 1,02

113L: 1,08 1,08

133P: 1,08 1,41

138P: 1,15 1,07

138S: 1,02 1,12

138T: 1,05 1,16

139Y: 1,63 1,14

141M: 1,01 1,23

141N: 1,02 1,11

143G: 1,09 1,13

143V: 1,01 1,00

150M: 1,00 1,05

160N: 1,02 1,11

165N: 1,10 1,16

172A: 1,06 1,14

172R: 1,06 1,16

173K: 1,03 1,17

188P: 1,16 1,40

193K: 1,17 1,28

193Y: 1,10 1,89

201H: 1,44 1,06

201M: 1,21 1,16

213Q: 1,02 1,12

213R: 1,05 1,05

213S: 1,08 1,10

216E: 1,30 1,03

216Q: 1,34 1,04

221F: 1,28 1,07

Variante: Actividad Actividad residual

221I: 1,23 1,33

221M: 1,35 1,16

221N: 1,57 1,11

221S: 1,40 1,34

221V: 1,31 1,13

221Y: 1,36 1,14

227A: 1,02 1,01

227D: 1,06 1,01

227E: 1,06 1,03

227G: 1,09 1,05

227K: 1,13 1,00

235R: 1,14 1,03

246E: 1,03 1,18

249K: 1,02 1,15

249R: 1,03 1,07

250C: 1,12 1,03

250E: 1,33 1,13

250F: 1,28 1,29

250G: 1,33 1,09

250I: 1,27 1,35

250K: 1,48 1,07

250L: 1,32 1,02

250M: 1,39 1,35

250N: 1,40 1,05

250Q: 1,54 1,01

250S: 1,41 1,02

252A: 1,08 1,12

252E: 1,12 1,09

252K: 1,21 1,19

252Q: 1,04 1,16

252S: 1,01 1,04

253D: 1,04 1,07

253K: 1,01 1,10

253N: 1,03 1,06

258D: 1,10 1,33

258G: 1,02 1,30

258H: 1,13 1,38

258K: 1,11 1,29

258N: 1,01 1,07

258Q: 1,13 1,31

258R: 1,13 1,02

258S: 1,08 1,12

258T: 1,10 1,27

258Y: 1,08 1,16

268F: 1,07 1,28

268G: 1,21 1,03

268S: 1,22 1,06

274Y: 1,07 1,05

283K: 1,01 1,14

283S: 1,06 1,02

283Y: 1,04 1,01

285F: 1,02 1,18

Variante: Actividad Actividad residual

285Q: 1,22 1,38

285W: 1,08 1,13

293H: 1,05 1,12

293K: 1,41 1,42

293Q: 1,06 1,14

293T: 1,12 1,10

297R: 1,14 1,03

301G: 1,05 1,02

301K: 1,05 1,08

309K: 1,08 1,18

309R: 1,08 1,12

312A: 1,00 1,01

312G: 1,07 1,18

313R: 1,13 1,19

313S: 1,05 1,25

318H: 1,10 1,12

318S: 1,37 1,11

318T: 1,32 1,40

318Y: 1,33 1,10

319A: 1,13 1,02

319G: 1,03 1,14

319K: 1,52 1,10

319R: 1,44 1,18

319V: 1,08 1,07

319W: 1,08 1,05

319Y: 1,41 1,04

320S: 1,03 1,16

320T: 1,28 1,11

320Y: 1,03 1,05

338A: 1,29 1,36

338G: 1,34 1,38

338I: 1,32 1,12

338M: 1,27 1,20

338P: 1,23 1,11

338S: 1,51 1,13

338T: 1,05 1,42

338V: 1,55 1,14

339A: 1,13 1,08

339G: 1,21 1,17

339H: 1,04 1,03

339K: 1,13 1,26

339P: 1,24 1,02

339S: 1,02 1,02

339T: 1,01 1,35

340A: 1,43 1,23

340H: 1,45 1,12

340I: 1,07 1,07

340M: 1,20 1,24

340N: 1,75 1,10

340Q: 1,76 1,21

340T: 1,14 1,21

343E: 1,07 1,00

Variante: Actividad Actividad residual

343P: 1,03 1,30

343Q: 1,01 1,14

343R: 1,03 1,25

345D: 1,15 1,10

345E: 1,24 1,06

345H: 1,10 1,15

345M: 1,01 1,02

345N: 1,10 1,07

345Q: 1,10 1,26

345S: 1,12 1,01

345T: 1,15 1,15

345V: 1,02 1,16

366H: 1,12 1,07

366Q: 1,49 1,03

366S: 1,02 1,07

369M: 1,02 1,06

370A: 1,21 1,03

370G: 1,18 1,21

370N: 1,41 1,04

370S: 1,50 1,06

370T: 1,10 1,07

370V: 1,13 1,05

375A: 1,39 1,03

375L: 1,07 1,03

375T: 1,04 1,25

379A: 1,02 1,01

385Q: 1,01 1,02

392K: 1,09 1,10

394K: 1,07 1,09

394L: 1,11 1,22

394Q: 1,13 1,09

394S: 1,15 1,11

394W: 1,16 1,11

402T: 1,02 1,32

403R: 1,01 1,36

403V: 1,00 1,34

413A: 1,06 1,02

419A: 1,29 1,36

419I: 1,32 1,12

419M: 1,27 1,20

419P: 1,23 1,11

419S: 1,51 1,13

419T: 1,05 1,42

419V: 1,55 1,14

422N: 1,03 1,12

433A: 1,08 1,27

433K: 1,05 1,27

433M: 1,01 1,23

433Y: 1,01 1,26

442G: 1,02 1,23

442H: 1,04 1,07

442N: 1,03 1,39

Variante: Actividad Actividad residual

442P: 1,03 1,11

442Q: 1,05 1,11

442R: 1,01 1,33

442S: 1,07 1,24

442T: 1,06 1,34

442Y: 1,08 1,24

445G: 1,01 1,21

447A: 1,06 1,09

447L: 1,01 1,06

448D: 1,02 1,15

448F: 1,01 1,48

448G: 1,05 1,26

448H: 1,03 1,37

448K: 1,07 1,20

448L: 1,08 1,04

448Q: 1,16 1,18

448S: 1,10 1,20

448Y: 1,27 1,33

450R: 1,02 1,22

450S: 1,01 1,22

452A: 1,06 1,08

452G: 1,00 1,07

452K: 1,08 1,11

452M: 1,09 1,13

452N: 1,28 1,06

452T: 1,18 1,02

452V: 1,14 1,14

452Y: 1,07 1,17

455A: 1,04 1,07

455G: 1,00 1,23

455H: 1,01 1,05

455K: 1,08 1,10

455R: 1,02 1,13

463A: 1,06 1,25

463G: 1,00 1,04

463L: 1,01 1,16

463M: 1,08 1,24

469A: 1,01 1,16

469D: 1,02 1,22

469F: 1,00 1,11

469Q: 1,04 1,03

469T: 1,06 1,15

469V: 1,08 1,15

469Y: 1,09 1,35

471A: 1,09 1,09

471D: 1,06 1,01

471F: 1,05 1,10

471G: 1,12 1,13

471I: 1,02 1,22

471N: 1,12 1,04

471T: 1,09 1,11

471V: 1,11 1,28

Variante: Actividad Actividad residual

471Y: 1,36 1,15

473K: 1,02 1,02

473M: 1,00 1,11

473R: 1,05 1,08

473T: 1,04 1,04

476A: 1,02 1,51

476M: 1,08 1,58

476Q: 1,03 1,13

476R: 1,08 1,01

476T: 1,01 1,78

Tabla 26-2: Posiciones en proteínas AmyS con mutaciones (se muestran en la columna llamada “variante”) que tienen índices de rendimiento de la actividad residual después de tensión por calor al menos 20 % mejores que la AmyS natural e índices de rendimiento de expresión o actividad de partida de al menos la mitad que la AmyS natural. 5

Actividad residual

Actividad

Variante

Tabla 26-3: Posiciones en proteínas AmyS con mutaciones (se muestran en la columna llamada “variante”) que tienen índices de rendimiento de la actividad o la expresión al menos 20 % mayores que la AmyS natural

Actividad

Variante

La Tabla 26-4 muestra los valores de índice de rendimiento (Pi) para 2666 variantes de AmyS en 152 posiciones. Los índices de rendimiento menores o iguales que 0,05 en el ensayo de la actividad se fijaron a 0,05 y se indicaron en negrita y en cursiva en la Tabla 26-4. Además, para la medición de la estabilidad, si el índice de rendimiento de la actividad en los ensayos de estabilidad fue menor o iagual que 0,05, el índice de rendimiento de estabilidad asociada se fijó a 0,05. 25

Tabla 26-4: Índices de rendimiento de las mediciones de la estabilidad y la actividad de las variantes AmyS

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: N005A 0,95 0,32

: N005C 0,98 0,29

: N005E 1,04 0,43

: N005F 0,79 0,15

: N005G 0,88 0,34

: N005H 0,89 0,43

: N005I 1,00 0,10

: N005K 0,90 0,34

: N005L 1,04 0,10

: N005M 0,84 0,18

: N005P 1,10 0,40

: N005Q 1,07 0,58

: N005R 0,94 0,40

: N005S 0,98 0,35

: N005T 0,83 0,35

: N005V 0,88 0,16

: N005W 0,94 0,07

: N005Y 1,07 0,21

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: G006A 1,10 1,59

: G006D 1,14 1,64

: G006E 1,08 1,93

: G006H 0,95 2,29

: G006I 1,23 1,47

: G006K 0,93 2,36

: G006L 1,15 1,61

: G006M 1,11 1,60

: G006N 1,21 1,61

: G006P 1,10 2,47

: G006Q 1,26 1,34

: G006R 0,98 1,28

: G006S 1,12 1,86

: G006T 1,21 2,01

: G006V 1,29 1,54

: G006W 1,13 1,32

: G006Y 1,07 1,88

: E013A 0,32 1,01

: E013C 0,22 0,68

: E013D 0,08 1,03

: E013F 0,05 0,81

: E013G 0,18 1,00

: E013H 0,60 1,10

: E013I 0,15 0,87

: E013K 0,22 1,22

: E013L 0,20 1,02

: E013M 0,20 0,96

: E013N 0,05 0,05

: E013P 0,05 0,37

: E013Q 0,21 0,96

: E013R 0,28 1,04

: E013S 0,28 0,92

: E013T 0,19 0,79

: E013V 0,19 0,76

: E013W 0,05 0,76

: E013Y 0,89 0,93

: W014A 0,95 0,77

: W014C 0,91 0,71

: W014D 0,81 0,59

: W014E 0,95 1,07

: W014F 1,06 1,25

: W014G 0,97 0,88

: W014H 0,05 0,05

: W014I 1,12 0,40

: W014K 1,01 0,69

: W014L 0,88 0,15

: W014M 1,18 0,84

: W014N 0,92 0,99

: W014P 0,84 0,98

: W014Q 0,94 0,67

: W014R 0,97 0,67

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: W014S 0,97 1,02

: W014T 1,22 1,22

: W014V 1,17 0,81

: W014Y 1,08 1,71

: Y015A 1,05 1,48

: Y015C 0,70 1,15

: Y015D 0,77 1,82

: Y015E 0,68 1,96

: Y015G 0,69 1,89

: Y015H 1,01 1,85

: Y015I 0,63 0,91

: Y015K 0,74 1,58

: Y015L 0,67 0,76

: Y015M 0,72 1,12

: Y015N 0,99 1,88

: Y015P 0,57 1,59

: Y015Q 0,80 1,74

: Y015R 0,72 1,60

: Y015S 0,58 1,78

: Y015T 0,87 1,47

: Y015W 0,95 1,44

: L016A 0,81 1,31

: L016D 0,93 1,12

: L016E 1,09 1,21

: L016F 2,17 0,98

: L016G 0,61 1,35

: L016H 0,96 1,21

: L016I 0,79 1,12

: L016K 0,79 1,41

: L016M 0,94 1,15

: L016N 0,92 1,32

: L016P 0,35 1,30

: L016Q 0,96 1,33

: L016R 0,71 1,28

: L016S 0,94 1,19

: L016T 0,87 1,32

: L016V 0,87 1,16

: L016W 0,75 0,99

: L016Y 0,97 1,10

: D018A 1,08 0,89

: D018F 0,68 0,58

: D018G 0,88 0,87

: D018H 0,84 0,84

: D018I 0,79 0,70

: D018K 0,88 0,65

: D018L 0,60 0,72

: D018N 0,73 1,01

: D018P 0,84 1,04

: D018Q 0,80 1,00

: D018R 0,81 0,65

: D018S 0,81 0,93

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: D018T 0,81 0,91

: D018V 0,89 0,77

: D018W 0,72 0,51

: D018Y 0,72 0,87

: G020A 0,79 0,25

: G020C 0,58 0,24

: G020D 0,92 0,96

: G020E 0,89 0,95

: G020F 0,65 0,13

: G020H 0,75 0,11

: G020I 0,96 0,28

: G020K 0,05 0,05

: G020L 0,05 0,05

: G020M 0,69 0,10

: G020N 0,78 0,09

: G020P 0,05 0,05

: G020Q 0,61 0,07

: G020R 0,05 0,05

: G020S 0,05 0,05

: G020T 0,82 0,09

: G020V 0,77 0,19

: G020W 0,80 0,69

: G020Y 0,05 0,05

: K025A 1,22 0,82

: K025C 1,33 1,46

: K025D 1,06 1,03

: K025E 1,07 0,95

: K025F 1,00 0,58

: K025G 1,27 0,97

: K025H 1,03 1,06

: K025L 1,12 0,64

: K025M 1,03 0,61

: K025N 0,91 1,06

: K025P 0,98 0,55

: K025Q 1,24 1,07

: K025R 1,08 0,96

: K025S 1,07 0,98

: K025T 1,14 0,89

: K025Y 0,98 0,65

: A027C 0,79 0,55

: A027D 1,01 0,95

: A027E 0,93 0,95

: A027F 0,88 0,85

: A027G 1,20 0,98

: A027H 1,05 1,00

: A027I 1,05 0,87

: A027K 0,86 1,01

: A027L 1,06 0,86

: A027M 1,21 0,88

: A027N 1,06 1,00

: A027P 1,13 0,43

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: A027Q 1,00 0,96

: A027R 1,11 0,89

: A027S 1,16 0,97

: A027T 1,20 0,90

: A027V 1,20 0,82

: A027W 1,13 0,76

: A027Y 0,97 0,28

: E029A 1,05 0,50

: E029D 0,94 1,11

: E029G 0,75 0,37

: E029H 0,83 0,83

: E029K 1,05 0,89

: E029L 0,76 0,22

: E029M 0,76 0,15

: E029N 1,02 0,89

: E029P 0,87 0,33

: E029Q 1,04 0,86

: E029R 1,09 0,92

: E029S 0,97 0,83

: E029T 0,95 0,59

: E029W 0,74 0,10

: E029Y 0,05 0,05

: L036A 0,95 0,85

: L036C 0,83 0,43

: L036D 0,91 0,27

: L036E 0,90 0,40

: L036F 1,14 0,90

: L036G 0,92 0,34

: L036H 0,92 0,77

: L036I 1,17 0,89

: L036K 1,01 1,05

: L036M 1,05 1,05

: L036N 1,02 0,68

: L036P 0,90 0,06

: L036Q 1,40 0,78

: L036R 1,12 0,76

: L036S 1,25 0,69

: L036T 1,11 0,64

: L036V 0,88 0,97

: L036W 0,92 0,63

: L036Y 1,07 0,91

: T039C 1,09 1,05

: T039D 1,15 1,47

: T039E 1,15 1,32

: T039F 1,16 0,48

: T039G 1,23 1,05

: T039H 1,16 1,10

: T039K 1,12 1,10

: T039M 1,18 0,54

: T039N 1,14 1,64

: T039P 1,11 0,26

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: T039Q 1,20 1,43

: T039R 1,01 1,10

: T039S 1,15 1,02

: T039V 1,30 0,82

: T039W 1,11 0,25

: T050A 1,09 0,98

: T050C 1,03 0,34

: T050D 0,87 0,91

: T050E 0,05 0,05

: T050F 0,86 0,43

: T050G 1,00 1,18

: T050H 0,97 0,82

: T050I 1,24 0,61

: T050K 1,13 0,80

: T050L 1,22 0,67

: T050M 1,32 0,62

: T050N 1,20 1,12

: T050P 1,03 0,99

: T050Q 1,31 1,08

: T050R 1,13 0,79

: T050S 1,07 1,09

: T050V 1,02 0,79

: T050W 0,90 0,18

: T050Y 1,14 0,42

: R052A 0,99 1,02

: R052C 0,87 0,62

: R052D 0,76 0,85

: R052E 0,77 0,97

: R052G 0,96 0,93

: R052H 0,91 0,99

: R052K 0,93 1,02

: R052L 1,10 0,98

: R052M 1,01 1,00

: R052N 0,95 0,99

: R052P 1,05 0,95

: R052Q 0,05 0,05

: R052S 1,21 0,92

: R052T 1,11 1,00

: R052V 1,14 0,95

: R052W 1,00 0,83

: R052Y 0,99 0,96

: S053A 1,03 1,00

: S053C 0,73 0,58

: S053D 0,75 0,83

: S053E 1,05 0,88

: S053F 0,87 0,85

: S053G 1,14 0,93

: S053H 1,12 1,00

: S053I 0,99 1,12

: S053K 1,03 1,10

: S053L 0,93 0,96

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: S053M 0,96 0,97

: S053P 0,88 1,00

: S053Q 0,94 0,94

: S053R 0,83 1,15

: S053T 1,25 1,02

: S053V 1,11 0,94

: S053W 1,09 0,84

: S053Y 0,94 0,93

: D054A 0,34 0,88

: D054C 0,64 0,38

: D054E 0,05 0,05

: D054F 0,05 0,60

: D054G 0,11 0,97

: D054H 0,11 1,04

: D054I 0,30 0,83

: D054K 0,05 1,08

: D054L 0,05 0,89

: D054M 0,11 0,88

: D054N 0,94 1,05

: D054P 0,05 1,03

: D054Q 0,05 0,05

: D054R 0,06 0,89

: D054S 0,38 0,96

: D054T 0,17 0,95

: D054V 0,17 0,77

: D054W 0,05 0,05

: D054Y 0,05 0,64

: E067A 0,05 0,05

: E067C 1,08 0,75

: E067D 0,90 1,07

: E067G 1,01 1,13

: E067H 1,04 1,03

: E067K 0,98 0,94

: E067L 0,97 0,95

: E067M 0,93 0,91

: E067N 1,32 0,95

: E067P 0,05 0,05

: E067Q 0,93 0,95

: E067R 1,01 0,90

: E067S 1,23 1,00

: E067T 0,99 0,98

: E067W 0,05 0,05

: E067Y 1,11 0,93

: K071A 0,72 0,81

: K071C 0,80 0,61

: K071D 0,69 0,71

: K071E 0,80 0,84

: K071F 0,47 0,61

: K071G 0,74 0,91

: K071H 0,96 0,88

: K071I 0,83 0,75

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K071L 0,55 0,61

: K071M 0,80 0,68

: K071N 1,11 0,89

: K071P 0,92 0,86

: K071Q 0,98 0,77

: K071R 1,10 1,10

: K071S 0,99 0,97

: K071T 0,95 0,83

: K071V 0,94 0,84

: K071W 0,82 0,91

: K071Y 0,52 0,71

: T073A 0,97 1,11

: T073C 0,91 0,60

: T073D 0,89 1,02

: T073E 0,75 1,08

: T073F 0,73 0,99

: T073G 0,79 1,12

: T073H 0,86 0,88

: T073I 0,66 1,02

: T073K 0,20 0,97

: T073L 0,47 1,17

: T073M 0,59 0,64

: T073N 0,73 1,08

: T073P 0,57 0,98

: T073R 0,40 1,11

: T073S 0,87 1,10

: T073V 0,67 1,09

: T073W 0,83 1,07

: T073Y 0,79 1,10

: R075A 1,05 1,14

: R075C 0,88 0,85

: R075D 0,87 0,99

: R075E 0,86 1,01

: R075F 0,76 0,92

: R075G 0,79 1,04

: R075H 0,85 1,07

: R075I 0,86 1,01

: R075L 0,88 1,04

: R075M 1,04 1,04

: R075P 0,90 0,93

: R075Q 0,90 0,95

: R075S 0,66 0,60

: R075T 0,98 0,88

: R075V 0,78 0,94

: R075W 0,75 0,93

: R075Y 0,68 1,04

: K077A 0,38 0,98

: K077C 0,28 0,51

: K077D 0,05 0,59

: K077E 0,11 0,77

: K077F 0,20 0,72

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K077G 0,13 0,76

: K077I 0,16 1,00

: K077L 0,54 0,98

: K077M 0,58 0,99

: K077N 0,05 0,05

: K077P 0,05 0,61

: K077Q 0,07 0,86

: K077R 0,77 1,07

: K077S 0,11 0,89

: K077T 0,05 0,86

: K077V 0,05 0,83

: K077W 0,05 0,77

: T080A 0,88 1,01

: T080C 0,91 0,69

: T080D 1,22 0,86

: T080E 0,71 0,92

: T080F 1,10 0,50

: T080G 1,02 0,93

: T080H 1,01 0,95

: T080I 1,29 0,82

: T080K 0,90 0,86

: T080L 0,82 0,98

: T080M 0,97 0,95

: T080N 0,90 1,00

: T080P 0,88 0,88

: T080Q 0,87 0,88

: T080R 0,99 0,76

: T080S 0,83 1,09

: T080V 0,87 0,87

: T080W 0,77 0,89

: T080Y 0,72 0,97

: K081A 0,87 0,94

: K081C 0,84 0,74

: K081D 0,96 0,83

: K081E 0,69 0,92

: K081G 0,86 0,81

: K081H 0,73 1,03

: K081I 0,82 0,79

: K081L 0,87 1,01

: K081M 0,93 1,04

: K081N 0,05 0,05

: K081P 0,90 0,79

: K081Q 0,84 1,03

: K081R 0,90 1,04

: K081S 0,74 0,98

: K081T 0,80 0,93

: K081V 0,66 1,03

: K081W 0,60 0,98

: K081Y 0,89 1,20

: Q083A 1,20 0,98

: Q083C 1,79 0,17

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: Q083D 0,94 0,92

: Q083E 0,98 0,95

: Q083F 0,87 0,80

: Q083G 0,76 1,01

: Q083H 0,78 0,86

: Q083I 0,69 0,85

: Q083L 0,77 0,91

: Q083M 0,91 0,96

: Q083P 1,01 0,82

: Q083R 0,91 0,90

: Q083S 0,75 0,99

: Q083T 0,84 0,84

: Q083V 0,73 0,80

: Q083W 0,82 0,78

: Q083Y 0,71 0,93

: L085A 0,94 1,06

: L085C 0,90 0,63

: L085D 0,84 1,04

: L085E 1,09 1,02

: L085G 0,85 0,90

: L085H 0,73 1,02

: L085I 0,89 0,88

: L085K 0,96 0,93

: L085M 1,01 1,04

: L085N 1,10 0,89

: L085P 1,01 0,72

: L085Q 0,91 0,99

: L085R 0,96 1,01

: L085S 1,02 1,04

: L085T 0,83 1,12

: L085W 0,93 0,95

: L085Y 0,70 1,08

: A090C 1,00 0,65

: A090D 1,12 0,92

: A090E 1,20 0,92

: A090F 0,99 0,76

: A090G 1,04 0,87

: A090H 1,05 1,03

: A090I 0,90 0,83

: A090K 0,93 1,04

: A090L 0,76 0,92

: A090M 1,02 1,02

: A090N 1,02 0,98

: A090P 1,39 0,10

: A090Q 0,94 0,93

: A090R 0,90 0,90

: A090S 1,16 0,99

: A090T 0,78 0,88

: A090V 0,79 0,87

: A090W 0,69 0,84

: A090Y 0,83 0,96

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: H092C 0,75 0,29

: H092D 1,06 0,69

: H092E 0,88 0,76

: H092F 0,92 0,28

: H092G 0,86 0,81

: H092K 0,89 0,98

: H092L 0,43 0,12

: H092N 0,85 0,78

: H092P 0,05 0,05

: H092Q 0,80 0,89

: H092R 0,75 0,96

: H092S 0,70 0,87

: H092T 0,68 0,47

: H092V 0,70 0,28

: H092W 0,83 0,44

: H092Y 0,71 0,63

: H106A 0,32 0,19

: H106C 0,33 0,06

: H106D 0,58 0,07

: H106E 0,05 0,05

: H106G 0,16 0,17

: H106I 0,05 0,05

: H106K 0,05 0,05

: H106L 0,05 0,06

: H106N 0,14 0,08

: H106P 0,59 0,06

: H106Q 0,07 0,39

: H106R 0,05 0,05

: H106S 0,05 0,20

: H106T 0,05 0,05

: H106V 0,05 0,05

: H106W 0,05 0,05

: H106Y 0,05 0,05

: K107A 0,46 0,81

: K107C 0,42 0,67

: K107D 0,32 0,51

: K107E 0,35 0,70

: K107F 0,42 0,66

: K107G 0,23 0,76

: K107H 0,34 0,94

: K107I 0,29 0,69

: K107L 0,53 0,75

: K107M 0,60 0,79

: K107N 0,43 0,88

: K107P 0,05 0,65

: K107Q 0,63 0,74

: K107R 1,05 0,71

: K107S 0,30 0,78

: K107T 0,38 0,72

: K107V 0,41 0,70

: K107W 0,05 0,44

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K107Y 0,40 0,64

: D111A 0,55 0,95

: D111C 0,71 0,60

: D111E 0,87 1,01

: D111F 0,63 0,65

: D111G 0,74 0,90

: D111H 0,50 0,85

: D111I 0,56 0,91

: D111K 0,45 0,62

: D111L 0,44 0,86

: D111M 0,65 1,00

: D111N 0,97 0,87

: D111P 0,78 0,71

: D111Q 0,77 0,95

: D111R 0,53 0,07

: D111S 0,67 0,91

: D111T 0,61 1,02

: D111V 0,58 1,02

: D111W 0,42 0,54

: D111Y 0,49 0,92

: T113A 0,89 0,97

: T113C 0,80 0,82

: T113D 0,94 0,95

: T113E 0,92 0,91

: T113F 0,76 0,92

: T113G 0,88 1,08

: T113H 0,88 0,96

: T113I 1,14 0,88

: T113K 0,93 1,13

: T113L 1,08 1,08

: T113M 0,83 0,99

: T113P 1,05 0,96

: T113Q 0,88 1,05

: T113R 0,88 1,03

: T113V 1,12 0,94

: T113W 1,06 0,88

: E114A 0,54 0,97

: E114C 0,62 0,76

: E114D 0,71 0,82

: E114F 0,36 0,92

: E114G 0,59 1,01

: E114H 0,49 0,92

: E114I 0,54 0,86

: E114L 0,43 0,97

: E114M 0,77 0,97

: E114N 0,67 0,88

: E114P 0,37 0,37

: E114R 0,35 0,84

: E114T 0,54 0,94

: E114V 0,43 0,85

: E114W 0,31 0,94

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: E114Y 0,26 0,93

: E120A 0,29 1,20

: E120C 0,24 0,89

: E120D 0,05 1,02

: E120F 0,05 0,88

: E120G 0,05 1,14

: E120H 0,09 0,90

: E120I 0,60 0,87

: E120L 0,20 0,97

: E120M 0,39 0,96

: E120N 0,16 1,02

: E120P 0,05 1,12

: E120Q 0,66 1,10

: E120R 0,12 1,12

: E120S 0,08 1,07

: E120T 0,22 1,06

: E120V 0,53 0,93

: E120W 0,15 0,81

: E120Y 0,07 0,98

: V121A 0,05 1,04

: V121C 0,92 0,55

: V121D 0,05 0,91

: V121E 0,05 0,93

: V121F 0,05 0,77

: V121G 0,05 0,92

: V121H 0,05 0,05

: V121I 0,05 0,79

: V121L 0,05 0,98

: V121M 0,05 0,97

: V121P 0,05 1,22

: V121Q 0,05 0,97

: V121R 0,05 1,01

: V121S 0,05 0,95

: V121T 0,07 0,92

: V121W 0,05 0,62

: V121Y 0,05 0,88

: R126A 0,05 0,05

: R126D 0,05 0,46

: R126E 0,05 0,82

: R126F 0,05 1,03

: R126G 0,05 0,89

: R126H 0,05 1,06

: R126I 0,05 0,95

: R126L 0,05 0,97

: R126M 0,05 1,01

: R126N 0,05 1,07

: R126P 0,05 0,67

: R126Q 0,05 0,65

: R126T 0,05 0,83

: R126V 0,05 0,99

: R126W 0,05 1,06

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: R126Y 0,05 1,01

: Q128A 0,05 0,05

: Q128C 0,42 0,95

: Q128D 0,15 1,05

: Q128E 0,90 1,00

: Q128G 0,05 0,99

: Q128H 0,34 1,05

: Q128I 0,90 0,89

: Q128K 0,52 1,15

: Q128L 0,47 0,97

: Q128N 0,12 1,05

: Q128P 0,05 1,03

: Q128R 0,31 1,14

: Q128S 0,28 1,02

: Q128T 0,05 0,05

: Q128V 0,86 0,97

: Q128W 0,07 0,76

: Q128Y 0,13 0,86

: S131A 0,05 1,15

: S131C 0,05 0,98

: S131D 0,26 1,08

: S131E 0,05 1,14

: S131F 0,05 0,92

: S131G 0,24 0,86

: S131H 0,05 1,13

: S131I 0,05 0,05

: S131K 0,05 1,13

: S131M 0,05 0,99

: S131N 0,76 1,02

: S131P 0,05 1,05

: S131R 0,05 1,05

: S131T 0,49 0,90

: S131W 0,05 0,82

: S131Y 0,05 0,90

: T133A 0,95 1,13

: T133C 0,49 0,97

: T133D 1,03 0,99

: T133E 0,82 1,02

: T133F 0,17 0,97

: T133G 0,47 0,84

: T133H 0,41 1,19

: T133I 0,86 0,96

: T133K 0,47 0,85

: T133L 0,41 1,06

: T133M 0,51 1,05

: T133N 0,68 1,13

: T133P 1,41 1,08

: T133Q 0,63 1,10

: T133R 0,18 1,13

: T133S 0,72 1,08

: T133V 1,25 0,92

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: T133W 0,14 0,98

: T133Y 0,41 1,01

: Q137A 0,92 0,97

: Q137C 1,09 0,77

: Q137D 0,89 0,96

: Q137E 1,06 0,87

: Q137F 0,85 0,86

: Q137G 1,13 0,94

: Q137H 0,95 1,05

: Q137I 0,93 0,22

: Q137L 1,20 0,82

: Q137M 1,30 0,83

: Q137P 0,07 1,05

: Q137R 0,95 1,05

: Q137S 1,45 0,98

: Q137T 1,12 0,91

: Q137V 1,02 0,86

: Q137W 1,06 0,88

: Q137Y 0,94 0,89

: A138C 0,05 0,05

: A138D 0,05 0,37

: A138E 0,05 0,54

: A138G 0,90 1,02

: A138H 0,05 0,60

: A138I 0,23 0,90

: A138K 0,05 0,15

: A138L 0,05 0,90

: A138M 0,05 0,94

: A138N 0,50 0,94

: A138P 1,07 1,15

: A138Q 0,13 0,69

: A138R 0,05 0,15

: A138S 1,12 1,02

: A138T 1,16 1,05

: A138V 1,17 0,87

: A138W 0,05 0,27

: A138Y 0,14 0,97

: W139A 0,82 0,89

: W139C 0,75 0,39

: W139D 0,93 1,40

: W139E 0,81 0,97

: W139G 0,79 0,74

: W139H 0,97 1,59

: W139I 0,74 0,58

: W139K 0,68 0,42

: W139L 0,78 0,59

: W139M 0,87 1,00

: W139N 1,13 0,85

: W139Q 0,82 0,79

: W139R 0,96 1,29

: W139S 0,93 1,04

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: W139T 0,71 0,87

: W139V 0,72 0,66

: W139Y 1,14 1,63

: K141A 1,09 0,73

: K141C 1,03 0,85

: K141D 0,89 0,98

: K141E 3,48 0,92

: K141F 0,89 0,80

: K141G 1,18 0,96

: K141H 1,13 0,99

: K141I 1,40 0,87

: K141L 1,22 0,85

: K141M 1,23 1,01

: K141N 1,11 1,02

: K141P 1,07 0,96

: K141Q 1,28 0,97

: K141R 1,23 0,99

: K141S 1,21 0,98

: K141T 1,17 0,94

: K141V 1,21 1,00

: K141W 1,16 0,87

: K141Y 1,17 0,88

: D143A 0,95 1,04

: D143C 1,11 0,84

: D143E 1,12 0,98

: D143G 1,13 1,09

: D143H 0,91 0,98

: D143I 1,05 0,94

: D143K 0,86 0,96

: D143L 0,05 0,05

: D143M 0,86 1,05

: D143N 1,10 0,99

: D143P 0,98 0,84

: D143T 0,05 0,05

: D143V 1,00 1,01

: D143W 1,00 0,99

: D143Y 0,75 0,15

: R147A 0,73 0,25

: R147C 0,05 0,05

: R147D 0,66 0,07

: R147E 0,05 0,05

: R147F 0,05 0,05

: R147G 0,74 0,11

: R147H 0,81 0,21

: R147I 0,05 0,05

: R147K 1,05 0,48

: R147L 0,05 0,05

: R147M 0,65 0,07

: R147N 0,91 0,30

: R147P 0,05 0,05

: R147Q 0,88 0,30

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: R147S 0,90 0,39

: R147T 0,90 0,10

: R147V 0,05 0,05

: R147W 0,05 0,05

: R147Y 0,05 0,05

: N149A 0,94 0,93

: N149D 0,89 0,95

: N149E 0,98 0,93

: N149F 1,09 0,85

: N149G 0,90 0,93

: N149H 1,01 0,98

: N149I 1,15 0,83

: N149K 0,90 0,88

: N149L 0,88 0,94

: N149M 0,05 0,05

: N149Q 1,00 0,93

: N149R 0,80 0,95

: N149S 0,94 1,03

: N149V 1,06 0,87

: N149W 1,01 0,87

: T150A 0,90 0,96

: T150C 1,03 0,72

: T150D 0,82 0,87

: T150E 4,54 0,87

: T150F 0,05 0,05

: T150G 0,99 0,86

: T150I 0,82 0,93

: T150K 0,86 0,96

: T150L 0,83 0,07

: T150M 1,05 1,00

: T150N 0,98 1,08

: T150Q 0,83 0,99

: T150R 0,99 1,04

: T150S 0,77 0,96

: T150V 0,90 0,93

: T150Y 1,18 1,00

: Y151A 0,96 0,87

: Y151C 0,80 0,67

: Y151D 0,99 0,71

: Y151E 0,76 0,71

: Y151F 0,96 0,88

: Y151G 1,17 0,79

: Y151H 1,04 0,87

: Y151I 1,22 0,78

: Y151L 1,05 0,90

: Y151M 1,02 0,83

: Y151N 0,98 0,91

: Y151P 0,89 0,77

: Y151Q 1,07 0,75

: Y151R 1,05 0,76

: Y151S 0,85 0,80

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: Y151T 1,04 0,80

: Y151V 1,14 0,80

: Y151W 1,16 0,79

: S152A 0,95 0,88

: S152C 0,83 0,75

: S152D 0,05 0,05

: S152E 1,09 0,71

: S152F 0,75 0,22

: S152G 1,25 0,91

: S152H 0,99 0,71

: S152I 0,81 0,22

: S152K 0,74 0,58

: S152M 0,05 0,05

: S152N 1,20 0,43

: S152Q 0,71 0,21

: S152R 0,89 0,86

: S152T 1,16 0,99

: S152V 0,79 0,42

: S152W 0,73 0,22

: S152Y 0,91 0,26

: K155A 1,10 0,85

: K155C 0,92 0,72

: K155D 0,94 0,85

: K155E 0,82 0,79

: K155G 1,05 0,58

: K155H 1,04 0,84

: K155L 1,05 0,89

: K155M 0,91 0,91

: K155N 1,18 0,90

: K155P 0,99 0,94

: K155Q 0,84 0,90

: K155R 1,20 0,93

: K155S 1,22 0,85

: K155T 1,12 0,76

: K155V 1,01 0,85

: K155W 1,09 0,88

: K155Y 1,21 0,80

: H160A 0,89 0,89

: H160C 0,84 0,98

: H160D 0,89 0,69

: H160E 0,86 0,52

: H160F 0,77 0,79

: H160G 0,82 0,36

: H160I 0,36 0,58

: H160L 1,03 0,92

: H160M 0,56 0,97

: H160N 1,11 1,02

: H160P 0,05 0,05

: H160Q 0,98 0,47

: H160R 0,54 0,62

: H160S 0,05 0,05

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: H160T 1,01 0,91

: H160V 0,76 0,74

: H160W 0,26 0,66

: H160Y 0,86 0,89

: D165A 0,53 0,12

: D165C 1,01 0,07

: D165E 1,14 0,07

: D165F 0,09 0,07

: D165G 0,63 0,20

: D165H 0,46 0,18

: D165I 0,06 0,15

: D165K 0,07 0,14

: D165L 0,30 0,11

: D165M 0,58 0,10

: D165N 1,16 1,10

: D165P 0,05 0,05

: D165Q 0,53 0,11

: D165R 0,08 0,11

: D165S 0,83 0,43

: D165T 0,05 0,50

: D165V 0,05 0,15

: D165W 0,05 0,05

: D165Y 0,31 0,07

: E168A 0,83 0,92

: E168C 0,83 0,50

: E168D 0,82 0,57

: E168F 0,69 0,59

: E168G 0,92 0,75

: E168H 0,84 0,90

: E168I 1,08 0,71

: E168K 0,05 0,05

: E168L 0,80 0,92

: E168M 1,12 0,80

: E168N 0,97 0,83

: E168P 0,05 0,05

: E168Q 0,88 0,87

: E168R 1,18 0,90

: E168S 0,95 0,83

: E168T 0,83 0,16

: E168V 0,89 0,73

: E168W 1,23 0,66

: E168Y 0,76 0,82

: L172A 1,14 1,06

: L172C 1,07 0,89

: L172D 0,83 0,91

: L172E 0,97 1,01

: L172G 0,50 0,60

: L172H 0,93 1,06

: L172I 0,97 0,90

: L172K 0,98 1,12

: L172M 0,86 0,91

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: L172N 0,91 0,96

: L172P 0,17 0,83

: L172Q 1,00 0,89

: L172R 1,16 1,06

: L172S 0,78 1,01

: L172T 0,82 0,94

: L172V 1,02 0,88

: L172W 1,09 0,92

: L172Y 1,06 0,98

: S173A 0,92 0,74

: S173C 0,82 0,57

: S173D 0,63 0,71

: S173E 1,07 0,65

: S173F 0,82 0,25

: S173G 0,73 0,78

: S173H 0,85 0,66

: S173I 1,20 0,59

: S173K 1,17 1,03

: S173L 0,75 0,20

: S173M 1,05 0,48

: S173N 1,02 0,84

: S173Q 1,08 0,84

: S173R 0,88 1,03

: S173T 1,33 0,86

: S173V 1,12 0,46

: S173W 0,86 0,20

: S173Y 0,90 0,25

: K177A 0,05 1,20

: K177C 0,05 0,76

: K177D 0,05 1,07

: K177E 0,05 1,08

: K177F 0,05 1,01

: K177G 0,05 1,03

: K177H 0,05 1,07

: K177I 0,05 0,89

: K177L 0,89 0,91

: K177M 0,10 0,90

: K177N 0,05 1,15

: K177P 0,05 1,11

: K177Q 0,08 1,07

: K177R 0,47 1,09

: K177S 0,05 1,00

: K177T 0,05 1,01

: K177W 0,05 1,07

: K177Y 0,05 0,97

: E188A 0,05 1,10

: E188C 0,05 0,85

: E188D 0,05 1,21

: E188F 0,05 1,08

: E188G 0,05 1,17

: E188H 0,05 1,00

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: E188I 0,05 1,11

: E188K 0,05 1,02

: E188M 0,05 1,08

: E188N 0,05 1,06

: E188P 1,40 1,16

: E188Q 0,05 1,06

: E188S 0,05 1,10

: E188T 0,05 1,17

: E188V 0,05 1,08

: E188W 0,05 1,07

: E188Y 0,05 1,02

: T191A 0,49 1,11

: T191C 0,13 1,07

: T191D 0,91 1,03

: T191F 0,05 1,02

: T191G 0,19 1,09

: T191H 0,05 1,27

: T191I 0,18 1,06

: T191K 0,05 1,33

: T191L 0,05 1,08

: T191M 0,06 1,09

: T191N 0,76 1,13

: T191P 0,99 1,07

: T191Q 0,18 1,17

: T191R 0,05 1,20

: T191S 0,72 1,05

: T191V 0,16 1,02

: T191W 0,05 0,91

: E192A 0,05 1,26

: E192C 0,55 1,12

: E192D 0,42 1,50

: E192G 0,05 1,38

: E192H 0,05 0,78

: E192I 0,05 1,00

: E192K 0,05 0,33

: E192M 0,05 1,19

: E192N 0,05 1,35

: E192P 0,05 1,33

: E192Q 0,22 1,55

: E192R 0,05 0,37

: E192S 0,05 1,47

: E192T 0,10 1,35

: E192V 0,05 1,25

: E192W 0,05 1,17

: E192Y 0,05 1,30

: N193A 0,05 0,98

: N193C 0,73 0,62

: N193D 0,05 0,95

: N193E 0,05 0,74

: N193F 1,71 0,98

: N193G 0,05 0,96

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: N193H 1,10 0,92

: N193I 0,05 0,78

: N193K 1,28 1,17

: N193L 1,22 0,78

: N193M 0,81 0,96

: N193P 0,05 0,90

: N193R 0,87 0,97

: N193S 0,05 1,15

: N193T 0,05 0,86

: N193W 1,09 0,73

: N193Y 1,89 1,10

: Y196A 0,74 1,57

: Y196C 0,05 1,36

: Y196D 0,29 1,29

: Y196E 0,05 1,29

: Y196F 0,74 1,38

: Y196G 0,05 1,09

: Y196H 0,05 1,92

: Y196I 0,05 1,61

: Y196K 0,05 1,29

: Y196L 0,05 1,14

: Y196N 0,54 0,94

: Y196P 0,05 1,50

: Y196R 0,05 1,29

: Y196S 0,36 1,59

: Y196T 0,05 1,65

: Y196V 0,05 1,55

: Y196W 0,05 0,57

: L199A 0,16 0,42

: L199E 0,05 0,34

: L199G 0,05 0,31

: L199H 0,05 0,18

: L199I 0,14 0,30

: L199K 0,22 0,15

: L199M 0,30 0,14

: L199N 0,05 0,07

: L199P 0,05 0,05

: L199Q 0,05 0,20

: L199R 0,05 0,23

: L199S 0,05 0,29

: L199T 0,12 0,35

: L199V 0,61 0,13

: L199W 0,05 0,05

: L199Y 0,05 0,05

: M200A 1,03 0,68

: M200C 0,84 0,53

: M200D 0,71 0,81

: M200E 0,54 0,55

: M200F 0,05 0,25

: M200G 0,23 0,41

: M200H 0,05 0,05

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: M200I 1,14 0,57

: M200K 0,05 0,05

: M200L 0,68 1,11

: M200N 0,46 0,72

: M200P 0,05 0,05

: M200Q 0,78 0,77

: M200S 0,61 1,11

: M200T 0,80 0,61

: M200V 0,97 0,56

: M200W 0,05 0,05

: Y201A 0,90 1,41

: Y201C 1,22 0,14

: Y201D 0,60 0,73

: Y201E 0,81 1,36

: Y201F 0,85 0,81

: Y201G 0,56 1,63

: Y201H 1,06 1,44

: Y201I 1,35 0,11

: Y201K 0,89 0,08

: Y201L 1,05 0,18

: Y201M 1,16 1,21

: Y201N 1,15 0,31

: Y201P 0,05 0,05

: Y201Q 1,11 0,79

: Y201R 0,87 0,06

: Y201S 0,74 1,11

: Y201T 0,65 0,39

: Y201V 0,05 0,05

: Y201W 0,73 0,08

: A202C 0,97 0,57

: A202D 0,83 0,93

: A202E 0,49 0,85

: A202F 0,05 0,68

: A202G 0,45 0,83

: A202H 0,05 1,30

: A202I 0,50 1,02

: A202K 0,37 0,12

: A202L 0,46 0,95

: A202M 0,32 0,84

: A202N 0,53 1,08

: A202P 0,05 0,72

: A202Q 0,47 1,01

: A202R 0,05 0,05

: A202S 0,69 0,79

: A202T 0,63 1,07

: A202V 0,82 1,02

: A202Y 0,05 0,43

: T213A 1,11 0,98

: T213C 0,97 0,77

: T213D 1,12 0,91

: T213E 1,11 0,88

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: T213F 1,13 0,75

: T213G 1,11 0,91

: T213H 0,92 1,00

: T213I 0,05 0,05

: T213K 0,90 1,11

: T213L 1,26 0,75

: T213M 1,26 0,78

: T213N 1,11 0,91

: T213P 0,94 0,91

: T213Q 1,12 1,02

: T213R 1,05 1,05

: T213S 1,10 1,08

: T213V 1,35 0,76

: T213W 1,17 0,68

: K216A 0,66 0,24

: K216D 0,05 0,05

: K216E 1,03 1,30

: K216F 0,05 0,05

: K216G 0,83 1,20

: K216H 0,90 1,28

: K216I 0,05 0,05

: K216L 0,05 0,05

: K216M 0,97 1,39

: K216P 0,91 0,97

: K216Q 1,04 1,34

: K216R 0,77 1,32

: K216S 0,97 1,28

: K216T 0,99 1,22

: K216V 0,95 1,07

: K216W 1,00 1,13

: K216Y 0,79 1,31

: N217A 1,10 0,87

: N217C 0,81 0,78

: N217E 0,05 0,73

: N217F 0,90 0,88

: N217G 0,95 0,90

: N217H 1,09 0,90

: N217I 1,08 0,76

: N217L 1,09 0,82

: N217M 0,97 0,80

: N217P 0,97 0,73

: N217Q 1,31 0,74

: N217R 1,19 0,87

: N217S 1,05 0,87

: N217T 1,01 0,87

: N217V 1,18 0,69

: N217W 0,99 0,80

: N217Y 0,05 0,05

: K220A 1,06 0,79

: K220C 1,05 0,75

: K220D 1,02 0,88

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K220E 1,12 0,88

: K220F 1,03 0,78

: K220G 1,10 0,84

: K220H 1,12 0,81

: K220I 1,13 0,81

: K220M 1,05 0,75

: K220N 1,17 0,80

: K220P 1,33 0,89

: K220Q 1,21 0,87

: K220R 1,26 0,83

: K220S 1,30 0,81

: K220T 0,05 0,09

: K220V 1,21 0,82

: K220W 1,01 0,81

: K220Y 1,08 0,84

: W221A 0,88 1,54

: W221C 0,95 1,09

: W221D 0,84 1,31

: W221E 0,05 0,05

: W221F 1,07 1,28

: W221G 0,05 0,05

: W221H 0,05 0,05

: W221I 1,33 1,23

: W221K 0,05 0,05

: W221L 0,88 1,50

: W221M 1,16 1,35

: W221N 1,11 1,57

: W221P 0,05 0,05

: W221R 0,93 1,29

: W221S 1,34 1,40

: W221V 1,13 1,31

: W221Y 1,14 1,36

: N227A 1,01 1,02

: N227C 0,92 0,95

: N227D 1,01 1,06

: N227E 1,03 1,06

: N227F 0,72 0,81

: N227G 1,05 1,09

: N227H 0,95 1,13

: N2271 1,03 0,76

'227: N227K 1,00 1,13

: N227L 0,84 0,75

: N227M 0,84 0,87

: N227P 1,08 0,88

: N227Q 0,94 1,00

: N227R 0,89 1,03

: N227S 0,96 0,95

: N227T 1,06 0,96

: N227V 1,05 0,84

: N227W 1,07 0,81

: N227Y 1,01 0,85

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: R232A 0,05 0,05

: R232C 0,40 0,14

: R232D 0,05 0,05

: R232E 0,41 0,12

: R232G 0,06 0,23

: R232H 0,66 0,34

: R232K 0,52 0,47

: R232M 0,62 0,12

: R232N 0,05 0,05

: R232P 0,05 0,05

: R232Q 0,54 0,12

: R232S 0,59 0,16

: R232T 0,76 0,17

: R232V 0,70 0,15

: R232W 0,05 0,05

: R232Y 0,05 0,05

: A235C 0,86 0,53

: A235D 0,70 0,98

: A235E 0,93 0,84

: A235F 1,01 0,68

: A235G 1,17 0,78

: A235H 0,80 1,01

: A235I 1,07 0,84

: A235K 0,93 1,14

: A235L 0,89 0,97

: A235M 0,99 0,91

: A235N 0,78 1,03

: A235P 0,97 0,48

: A235Q 1,01 0,89

: A235R 1,03 1,14

: A235S 0,92 1,00

: A235T 0,05 0,05

: A235V 1,01 0,86

: A235W 0,98 0,60

: A235Y 0,91 0,93

: K237A 0,05 0,78

: K237C 0,05 0,57

: K237D 0,05 0,08

: K237E 0,05 0,74

: K237F 0,05 0,09

: K237G 0,05 1,21

: K237H 0,05 0,26

: K237I 0,05 0,40

: K237L 0,05 0,57

: K237M 0,05 0,46

: K237N 0,05 0,43

: K237P 0,05 0,30

: K237Q 0,05 0,77

: K237R 0,48 0,88

: K237T 0,05 0,69

: K237V 0,05 0,54

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K237W 0,05 0,05

: K237Y 0,05 0,05

: H238A 0,05 0,62

: H238C 0,05 0,63

: H238D 0,05 0,75

: H238F 0,05 0,05

: H238G 0,05 0,73

: H238I 0,05 0,18

: H238K 0,05 0,05

: H238L 0,05 0,25

: H238M 0,05 0,36

: H238N 0,21 0,83

: H238P 0,05 0,57

: H238Q 0,05 1,18

: H238R 0,05 0,05

: H238T 0,05 0,74

: H238V 0,05 0,52

: H238Y 0,05 0,05

: K240A 0,05 1,13

: K240D 0,05 1,19

: K240E 0,05 1,19

: K240F 0,05 0,90

: K240G 0,05 1,22

: K240H 0,05 1,17

: K240I 0,05 0,99

: K240M 0,31 1,13

: K240N 0,05 1,37

: K240P 0,05 1,69

: K240Q 0,12 1,21

: K240R 0,27 1,41

: K240S 0,05 1,07

: K240T 0,05 1,23

: K240V 0,05 1,09

: K240W 0,05 1,01

: K240Y 0,05 1,11

: D246A 0,73 1,03

: D246E 1,18 1,03

: D246F 0,67 1,02

: D246G 0,61 1,09

: D246H 0,71 1,05

: D246I 0,75 0,85

: D246K 0,36 1,18

: D246L 0,81 0,91

: D246M 0,80 0,92

: D246N 0,68 0,97

: D246P 0,47 0,81

: D246Q 0,78 0,98

: D246R 0,24 1,31

: D246S 0,97 1,01

: D246T 0,83 1,14

: D246Y 0,90 0,96

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: S249A 1,06 0,97

: S249C 0,93 0,74

: S249D 0,98 0,94

: S249E 1,27 0,92

: S249F 0,91 0,74

: S249G 0,91 0,94

: S249H 1,04 0,93

: S249K 1,15 1,02

: S249L 1,14 0,82

: S249M 0,95 0,77

: S249P 1,09 0,80

: S249Q 1,20 0,94

: S249R 1,07 1,03

: S249T 1,17 0,91

: S249V 1,01 0,74

: S249W 1,13 0,77

: S249Y 1,07 0,87

: Y250A 0,99 1,21

: Y250C 1,03 1,12

: Y250D 0,97 1,29

: Y250E 1,13 1,33

: Y250F 1,29 1,28

: Y250G 1,09 1,33

: Y250I 1,35 1,27

: Y250K 1,07 1,48

: Y250L 1,02 1,32

: Y250M 1,35 1,39

: Y250N 1,05 1,40

: Y250P 0,71 1,05

: Y250Q 1,01 1,54

: Y250R 0,99 1,55

: Y250S 1,02 1,41

: Y250T 0,05 0,05

: Y250V 0,05 0,05

: Y250W 0,99 1,35

: R252A 1,12 1,08

: R252C 0,97 0,81

: R252D 0,89 0,86

: R252E 1,09 1,12

: R252F 1,01 0,89

: R252G 0,76 1,00

: R252I 1,07 0,97

: R252K 1,19 1,21

: R252L 1,32 0,96

: R252M 0,98 0,96

: R252N 1,15 0,97

: R252P 0,72 0,83

: R252Q 1,16 1,04

: R252S 1,04 1,01

: R252T 1,09 0,99

: R252V 1,01 0,94

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: R252Y 1,14 0,86

: S253A 1,09 0,97

: S253D 1,07 1,04

: S253E 0,05 0,05

: S253F 1,19 0,82

: S253G 1,18 0,92

: S253H 1,13 0,97

: S253I 1,13 0,84

: S253K 1,10 1,01

: S253L 1,09 0,79

: S253M 0,05 0,05

: S253N 1,06 1,03

: S253P 0,95 0,90

: S253Q 1,13 0,93

: S253T 1,14 0,97

: S253V 1,15 0,90

: S253W 1,04 0,87

: S253Y 1,34 0,94

: Q254A 0,98 0,88

: Q254C 0,94 0,66

: Q254D 1,10 0,90

: Q254E 1,29 0,89

: Q254F 1,23 0,74

: Q254G 1,15 0,77

: Q254H 1,04 0,94

: Q254I 1,12 0,91

: Q254K 1,00 0,99

: Q254L 1,09 0,82

: Q254M 0,94 0,89

: Q254N 1,17 0,90

: Q254R 1,05 0,98

: Q254S 1,07 0,98

: Q254T 1,21 0,65

: Q254V 1,31 0,92

: Q254W 1,17 0,69

: Q254Y 1,03 0,87

: T255A 1,09 0,73

: T255C 0,89 0,78

: T255D 0,05 0,05

: T255E 1,09 0,64

: T255F 1,30 0,68

: T255G 1,15 0,73

: T255H 1,10 0,74

: T255I 1,18 0,70

: T255K 1,27 0,83

: T255L 0,97 0,73

: T255M 0,98 0,72

: T255N 0,83 0,76

: T255P 0,77 0,59

: T255R 1,12 0,85

: T255S 1,10 0,84

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: T255V 1,17 0,70

: T255W 1,27 0,74

: T255Y 1,02 0,72

: K257A 1,08 0,67

: K257C 0,89 0,49

: K257D 1,16 0,75

: K257E 1,15 0,76

: K257F 1,03 0,92

: K257G 0,97 0,73

: K257H 1,12 0,69

: K257I 1,09 0,59

: K257L 1,26 0,74

: K257M 1,29 0,79

: K257N 1,16 0,83

: K257P 0,62 0,38

: K257Q 1,18 0,82

: K257R 1,03 0,89

: K257S 1,29 0,71

: K257T 1,04 0,77

: K257V 1,31 0,78

: K257W 0,99 0,72

: P258A 0,97 1,08

: P258C 1,17 0,85

: P258D 1,33 1,10

: P258E 0,95 1,05

: P258F 0,96 0,75

: P258G 1,30 1,02

: P258H 1,38 1,13

: P258I 1,27 0,25

: P258K 1,29 1,11

: P258L 1,08 0,61

: P258M 1,09 0,91

: P258N 1,07 1,01

: P258Q 1,31 1,13

: P258R 1,02 1,13

: P258S 1,12 1,08

: P258T 1,27 1,10

: P258V 1,29 0,80

: P258W 1,14 0,87

: P258Y 1,16 1,08

: Y268A 0,86 1,39

: Y268C 0,47 1,10

: Y268D 0,59 1,44

: Y268E 0,55 1,47

: Y268F 1,28 1,07

: Y268G 1,03 1,21

: Y268H 0,87 1,24

: Y268I 0,05 0,05

: Y268K 0,78 1,90

: Y268L 0,72 1,10

: Y268M 0,97 1,15

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: Y268N 0,69 1,51

: Y268P 0,78 1,41

: Y268Q 0,71 1,30

: Y268R 0,76 1,49

: Y268S 1,06 1,22

: Y268T 0,99 1,12

: Y268V 0,88 0,99

Y268W

-: 0,97

1,07

: K272A 0,05 0,73

: K272C 0,05 0,68

: K272D 0,05 0,86

: K272E 0,05 0,85

: K272F 0,05 0,56

: K272G 0,05 0,60

: K272H 0,05 0,78

: K272I 0,05 0,81

: K272M 0,05 0,77

: K272N 0,05 0,67

: K272P 0,05 0,38

: K272R 0,90 0,86

: K272S 0,05 0,79

: K272T 0,05 0,99

: K272V 0,05 0,64

: K272W 0,05 0,48

: K272Y 0,05 0,66

: H274A 0,66 1,40

: H274C 0,65 0,68

: H274D 0,64 1,20

: H274E 0,86 1,14

: H274F 0,88 1,00

: H274G 0,56 1,36

: H274I 0,76 1,39

: H274K 0,85 1,60

: H274L 0,87 1,40

: H274N 0,67 1,50

: H274P 0,05 0,50

: H274Q 0,84 1,47

: H274R 0,80 1,50

: H274S 0,67 1,28

: H274T 0,69 1,38

: H274W 1,26 0,79

: H274Y 1,05 1,07

: N275A 0,32 1,01

: N275C 0,22 0,68

: N275D 0,08 1,03

: N275E 0,05 0,98

: N275F 0,05 0,81

: N275G 0,18 1,00

: N275H 0,60 1,10

: N275I 0,15 0,87

: N275K 0,22 1,22

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: N275L 0,20 1,02

: N275M 0,20 0,96

: N275P 0,05 0,37

: N275Q 0,21 0,96

: N275R 0,28 1,04

: N275S 0,28 0,92

: N275T 0,19 0,79

: N275V 0,19 0,76

: N275W 0,05 0,76

: N275Y 0,89 0,93

: K279C 0,05 0,54

: K279E 0,05 0,91

: K279F 0,05 0,70

: K279G 0,05 0,85

: K279H 0,05 0,36

: K2791 0,05 0,68

: K279L 0,05 0,52

: K279M 0,05 0,71

: K279N 0,05 0,91

: K279P 0,05 0,46

: K279Q 0,05 0,86

: K279S 0,05 0,94

: K279T 0,05 0,92

: K279V 0,05 0,78

: K279W 0,05 0,76

: K279Y 0,05 0,78

: T283A 1,06 0,97

: T283C 1,16 0,78

: T283D 0,92 1,03

: T283E 0,95 1,01

: T283G 0,97 1,01

: T283H 1,09 0,84

: T283I 1,10 0,72

: T283K 1,14 1,01

: T283L 1,07 0,76

: T283M 1,26 0,93

: T283N 1,29 0,96

: T283P 0,46 0,56

: T283R 0,82 1,08

: T283S 1,02 1,06

: T283V 1,23 0,81

: T283W 1,07 0,75

: T283Y 1,01 1,04

: S285A 0,93 0,80

: S285C 0,73 0,61

: S285D 0,91 1,09

: S285E 1,33 0,89

: S285F 1,18 1,02

: S285H 0,98 1,10

: S285I 0,84 0,52

: S285K 1,16 0,84

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: S285L 0,85 0,54

: S285M 0,98 0,76

: S285Q 1,38 1,22

: S285R 0,84 0,96

: S285T 0,98 0,79

: S285V 0,70 0,63

: S285W 1,13 1,08

: S285Y 0,97 1,49

: N293A 1,02 0,93

: N293C 0,78 0,69

: N293D 1,08 0,89

: N293E 0,87 0,92

: N293F 0,89 0,70

: N293G 1,31 0,92

: N293H 1,12 1,05

: N293I 0,94 0,75

: N293K 1,42 1,41

: N293L 0,87 0,81

: N293M 0,95 1,07

: N293P 0,97 0,40

: N293Q 1,14 1,06

: N293R 0,86 1,37

: N293S 0,93 0,95

: N293T 1,10 1,12

: N293V 1,04 0,82

: N293W 1,09 0,78

: N293Y 1,19 0,74

: K294A 0,83 0,92

: K294C 0,83 0,50

: K294D 0,82 0,57

: K294E 0,83 0,68

: K294F 0,69 0,59

: K294G 0,92 0,75

: K294H 0,84 0,90

: K294I 1,08 0,71

: K294L 0,80 0,92

: K294M 1,12 0,80

: K294N 0,97 0,83

: K294P 0,05 0,05

: K294Q 0,88 0,87

: K294R 1,18 0,90

: K294S 0,95 0,83

: K294T 0,83 0,16

: K294V 0,89 0,73

: K294W 1,23 0,66

: K294Y 0,76 0,82

: T297C 0,86 0,53

: T297D 0,70 0,98

: T297E 0,93 0,84

: T297F 1,01 0,68

: T297G 1,17 0,78

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: T297H 0,80 1,01

: T297I 1,07 0,84

: T297K 0,93 1,14

: T297L 0,89 0,97

: T297M 0,99 0,91

: T297N 0,78 1,03

: T297P 0,97 0,48

: T297Q 1,01 0,89

: T297R 1,03 1,14

: T297S 0,92 1,00

: T297V 1,01 0,86

: T297W 0,98 0,60

: T297Y 0,91 0,93

: K300A 0,99 0,79

: K300C 0,95 0,39

: K300D 0,91 0,61

: K300E 0,86 0,78

: K300F 0,74 0,63

: K300G 0,98 0,62

: K300H 1,04 0,83

: K300I 1,02 0,82

: K300L 0,91 0,73

: K300M 1,17 0,80

: K300N 1,02 0,80

: K300P 0,05 0,05

: K300Q 0,90 0,86

: K300R 1,20 0,92

: K300S 0,93 0,80

: K300T 1,16 0,87

: K300V 1,15 0,84

: K300W 0,97 0,57

: S301A 1,10 0,89

: S301E 1,12 0,94

: S301F 1,44 0,68

: S301G 1,02 1,05

: S301H 1,12 0,87

: S301I 1,28 0,74

: S301K 1,08 1,05

: S301L 1,09 0,97

: S301M 1,09 0,87

: S301N 1,16 0,64

: S301P 1,21 0,61

: S301Q 1,18 0,95

: S301R 1,35 0,89

: S301T 1,23 0,85

: S301V 1,18 0,81

: S301W 1,27 0,75

: S301Y 1,10 0,80

: D306A 0,82 0,40

: D306C 0,74 0,30

: D306E 0,80 0,71

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: D306F 0,71 0,10

: D306G 0,76 0,26

: D306H 0,84 0,35

: D306I 0,80 0,18

: D306K 0,77 0,41

: D306L 0,78 0,18

: D306N 1,15 0,89

: D306P 0,82 0,39

: D306Q 1,03 0,43

: D306R 0,82 0,27

: D306S 0,81 0,50

: D306T 0,88 0,29

: D306V 0,99 0,22

: D306W 0,05 0,05

: D306Y 0,94 0,12

: T309A 0,05 0,05

: T309C 1,15 0,59

: T309D 1,27 0,89

: T309E 0,95 0,91

: T309F 1,15 0,80

: T309G 1,17 1,00

: T309H 0,94 0,97

: T309I 1,17 0,82

: T309K 1,18 1,08

: T309L 1,15 0,95

: T309M 1,15 0,97

: T309N 1,20 0,99

: T309P 0,93 0,20

: T309Q 1,19 0,98

: T309R 1,12 1,08

: T309S 1,00 1,04

: T309V 1,38 0,95

: T309W 1,08 0,77

: T309Y 1,11 0,94

: T312A 1,01 1,00

: T312C 0,99 0,70

: T312D 1,03 0,96

: T312E 1,15 0,95

: T312F 1,05 0,92

: T312G 1,18 1,07

: T312H 1,30 0,99

: T312K 0,83 0,25

: T312L 1,08 0,95

: T312M 0,98 0,91

: T312N 1,04 0,99

: T312P 0,74 0,85

: T312Q 1,05 0,94

: T312R 1,13 1,00

: T312S 1,29 0,99

: T312V 1,40 0,87

: T312W 1,14 0,83

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: T312Y 1,31 0,92

: N313A 1,01 0,93

: N313C 0,95 0,63

: N313D 0,95 0,51

: N313E 1,05 0,90

: N313F 1,06 0,64

: N313G 1,25 0,96

: N313H 1,25 0,94

: N313I 1,44 0,55

: N313K 1,12 0,85

: N313L 1,21 0,85

: N313M 1,02 0,89

: N313P 1,05 0,81

: N313Q 1,00 1,00

: N313R 1,19 1,13

: N313S 1,25 1,05

: N313V 1,28 0,74

: N313W 1,01 0,67

: N313Y 1,10 0,90

: K317A 0,98 0,94

: K317C 0,83 0,54

: K317D 0,82 0,86

: K317E 0,78 0,91

: K317F 0,92 0,84

: K317G 0,91 0,88

: K317L 1,10 0,86

: K317M 1,02 0,95

: K317N 1,03 0,92

: K317P 0,86 0,80

: K317Q 0,76 0,94

: K317R 0,78 0,89

: K317S 1,04 0,93

: K317T 0,94 0,88

: K317V 1,00 0,93

: K317W 1,08 0,83

: K317Y 1,05 0,93

: D318A 0,93 1,38

: D318E 0,90 1,09

: D318F 0,78 1,22

: D318G 0,91 1,39

: D318H 1,12 1,10

: D318I 0,75 1,40

: D318K 0,65 1,73

: D318L 1,00 1,31

: D318M 0,90 1,26

: D318N 0,92 1,19

: D318P 0,61 0,37

: D318Q 0,93 1,14

: D318R 0,71 1,54

: D318S 1,11 1,37

: D318T 1,40 1,32

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: D318V 0,81 1,34

: D318W 0,90 1,07

: D318Y 1,10 1,33

: Q319A 1,02 1,13

: Q319C 0,73 1,38

: Q319D 0,85 1,31

: Q319E 0,98 1,20

: Q319F 0,87 1,11

: Q319G 1,14 1,03

: Q319H 0,94 1,28

: Q319I 0,94 1,32

: Q319K 1,10 1,52

: Q319L 0,95 1,11

: Q319M 0,90 1,09

: Q319N 0,91 1,12

: Q319P 1,13 0,57

: Q319R 1,18 1,44

: Q319S 0,91 1,12

: Q319T 0,98 1,10

: Q319V 1,07 1,08

: Q319W 1,05 1,08

: Q319Y 1,04 1,41

: P320A 1,02 0,96

: P320C 1,01 0,75

: P320D 0,74 0,91

: P320E 1,04 0,85

: P320F 0,76 0,77

: P320G 1,00 1,00

: P320H 1,00 1,18

: P320I 0,86 0,80

: P320K 0,96 1,23

: P320L 0,87 0,83

: P320M 1,04 0,60

: P320Q 0,95 1,08

: P320R 0,79 1,25

: P320S 1,16 1,03

: P320T 1,11 1,28

: P320V 1,08 0,88

: P320W 0,90 1,03

: P320Y 1,05 1,03

: L338A 1,36 1,29

: L338C 1,24 0,67

: L338D 1,00 0,94

: L338E 0,87 0,65

: L338F 0,90 0,17

: L338G 1,38 1,34

: L338H 0,05 0,05

: L338I 1,12 1,32

: L338K 0,05 0,05

: L338M 1,20 1,27

: L338P 1,11 1,23

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: L338Q 0,96 0,61

: L338R 0,05 0,05

: L338S 1,13 1,51

: L338T 1,42 1,05

: L338V 1,14 1,55

: L338W 0,98 0,14

: L338Y 1,15 0,11

: Q339A 1,08 1,13

: Q339C 0,88 0,79

: Q339D 0,93 0,11

: Q339E 1,07 0,84

: Q339F 0,86 0,55

: Q339G 1,17 1,21

: Q339H 1,03 1,04

: Q339K 1,26 1,13

: Q339L 1,12 0,70

: Q339M 0,93 0,81

: Q339P 1,02 1,24

: Q339R 0,81 0,35

: Q339S 1,02 1,02

: Q339T 1,35 1,01

: Q339V 1,23 0,76

: Q339W 0,05 0,05

: Q339Y 1,14 0,78

: S340A 1,23 1,43

: S340C 0,74 0,75

: S340D 0,97 1,63

: S340E 0,92 1,58

: S340F 0,83 0,82

: S340H 1,12 1,45

: S340I 1,07 1,07

: S340K 0,99 1,76

: S340L 0,05 0,05

: S340M 1,24 1,20

: S340N 1,10 1,75

: S340P 0,69 0,81

: S340Q 1,21 1,76

: S340T 1,21 1,14

: S340V 1,00 1,09

: S340Y 1,02 0,97

: D343A 0,96 0,35

: D343C 1,32 0,74

: D343E 1,00 1,07

: D343F 0,91 0,79

: D343H 0,98 1,02

: D343I 1,27 0,88

: D343L 0,95 1,08

: D343M 0,99 1,02

: D343N 1,05 0,88

: D343P 1,30 1,03

: D343Q 1,14 1,01

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: D343R 1,25 1,03

: D343T 1,08 0,98

: D343W 1,00 0,64

: D343Y 1,29 0,82

: W345A 1,05 0,90

: W345C 0,97 0,43

: W345D 1,10 1,15

: W345E 1,06 1,24

: W345F 1,07 0,55

: W345H 1,15 1,10

: W345I 1,28 0,90

: W345K 0,05 0,05

: W345L 1,07 0,99

: W345M 1,02 1,01

: W345N 1,07 1,10

: W345P 1,00 0,94

: W345Q 1,26 1,10

: W345S 1,01 1,12

: W345T 1,15 1,15

: W345V 1,16 1,02

: C363A 0,84 1,06

: C363D 0,87 1,74

: C363E 0,99 1,34

: C363F 0,83 1,03

: C363G 0,61 0,83

: C363H 0,78 0,76

: C363I 0,92 0,63

: C363L 0,73 0,89

: C363M 0,97 1,36

: C363N 0,92 1,86

: C363P 0,05 0,05

: C363Q 0,88 1,78

: C363R 0,05 0,05

: C363S 0,88 1,35

: C363T 1,15 0,18

: C363V 1,02 0,99

: C363W 0,35 0,70

: C363Y 0,92 0,12

: Y366A 0,96 1,14

: Y366C 0,46 0,37

: Y366D 0,52 1,18

: Y366E 0,91 1,18

: Y366F 0,91 0,87

: Y366G 0,94 1,08

: Y366H 1,07 1,12

: Y366I 0,85 0,87

: Y366K 0,72 0,82

: Y366L 0,77 0,61

: Y366M 0,92 0,79

: Y366N 1,03 0,91

: Y366P 0,54 0,78

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: Y366Q 1,03 1,49

: Y366R 0,96 0,96

: Y366S 1,07 1,02

: Y366T 1,01 0,91

: Y366V 1,04 0,94

: Y366W 1,11 0,99

: Y369A 0,05 0,05

: Y369C 0,44 0,16

: Y369E 0,98 0,87

: Y369F 1,03 0,79

: Y369G 0,86 0,33

: Y369H 0,89 0,78

: Y369I 1,33 0,91

: Y369K 1,07 0,80

: Y369M 1,06 1,02

: Y369P 0,49 0,20

: Y369Q 1,07 0,79

: Y369R 1,11 0,95

: Y369S 0,89 0,60

: Y369T 1,28 0,68

: Y369V 1,17 0,91

: Y369W 1,09 0,95

: Y370A 1,03 1,21

: Y370C 0,44 0,19

: Y370D 0,48 1,35

: Y370E 0,98 1,35

: Y370F 0,90 0,73

: Y370G 1,21 1,18

: Y370H 0,96 1,36

: Y370I 0,99 1,00

: Y370K 0,93 1,65

: Y370L 0,93 0,88

: Y370M 0,91 1,04

: Y370N 1,04 1,41

: Y370P 0,44 0,67

: Y370Q 0,87 1,51

: Y370S 1,06 1,50

: Y370T 1,07 1,10

: Y370V 1,05 1,13

: Y370W 0,94 0,91

: Y375A 1,03 1,39

: Y375C 0,59 0,48

: Y375D 0,96 1,52

: Y375E 0,96 1,48

: Y375F 0,90 1,00

: Y375G 0,90 0,98

: Y375H 0,98 1,16

: Y375I 0,94 1,06

: Y375K 0,96 1,43

: Y375L 1,03 1,07

: Y375M 0,98 1,05

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: Y375N 0,92 1,48

: Y375P 0,92 0,89

: Y375Q 0,92 1,56

: Y375R 0,77 1,61

: Y375S 0,92 1,29

: Y375T 1,25 1,04

: Y375W 0,98 0,88

: S379A 1,01 1,02

: S379C 0,60 0,44

: S379D 0,92 0,96

: S379E 0,99 1,01

: S379F 0,48 0,43

: S379G 0,90 0,91

: S379H 0,05 0,05

: S379I 0,80 0,70

: S379K 1,00 1,12

: S379L 0,84 0,56

: S379M 0,87 0,80

: S379N 1,03 0,98

: S379P 0,61 0,39

: S379Q 0,94 0,98

: S379R 0,96 1,01

: S379T 1,07 0,95

: S379V 0,90 0,75

: S379W 0,70 0,35

: S379Y 0,92 0,59

: K381A 0,85 0,78

: K381C 0,86 0,35

: K381D 0,87 0,65

: K381E 0,93 0,81

: K381F 0,96 0,20

: K381G 0,96 0,82

: K381H 1,13 0,73

: K381I 0,98 0,36

: K381L 0,95 0,38

: K381M 0,93 0,56

: K381N 0,87 0,68

: K381P 1,18 0,39

: K381Q 1,03 0,90

: K381R 1,20 0,95

: K381S 1,18 0,89

: K381T 1,01 0,60

: K381V 1,00 0,43

: K381W 0,90 0,22

: K381Y 0,87 0,63

: D385A 1,01 0,88

: D385C 0,05 0,05

: D385E 0,89 1,05

: D385F 0,73 0,54

: D385G 1,05 0,88

: D385H 0,96 0,99

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: D385I 0,46 0,15

: D385K 1,00 1,06

: D385L 0,96 0,47

: D385N 0,91 0,96

: D385P 0,05 0,05

: D385Q 1,02 1,01

: D385R 0,86 0,95

: D385S 1,10 1,00

: D385T 1,22 0,92

: D385V 0,85 0,43

: D385W 0,98 0,53

: P386A 0,90 0,80

: P386C 0,72 0,69

: P386D 0,85 0,94

: P386E 0,94 0,87

: P386F 0,72 0,66

: P386G 1,02 0,77

: P386H 0,89 0,93

: P386I 1,12 0,73

: P386K 1,22 0,87

: P386L 0,96 0,73

: P386M 0,94 0,70

: P386N 0,91 0,86

: P386Q 0,95 0,86

: P386S 0,83 0,82

: P386T 1,00 0,54

: P386V 1,11 0,79

: P386W 0,90 0,44

: P386Y 0,91 0,78

: R391A 0,58 0,22

: R391C 0,28 0,12

: R391E 0,05 0,08

: R391G 0,42 0,16

: R391H 0,59 0,29

: R391K 0,88 0,59

: R391L 0,05 0,05

: R391N 0,71 0,38

: R391P 0,05 0,05

: R391Q 0,62 0,28

: R391S 0,05 0,33

: R391T 0,67 0,25

: R391V 0,24 0,09

: R391W 0,05 0,05

: R391Y 0,05 0,05

: R392A 0,89 0,73

: R392C 0,74 0,66

: R392E 0,79 0,46

: R392F 1,03 0,43

: R392G 0,99 0,65

: R392H 0,86 0,96

: R392I 1,08 0,57

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: R392K 1,10 1,09

: R392L 0,91 0,63

: R392M 1,07 0,72

: R392N 0,89 0,90

: R392P 0,67 0,31

: R392Q 1,12 0,75

: R392S 1,00 0,73

: R392T 1,00 0,91

: R392V 0,89 0,48

: R392W 0,68 0,23

: R392Y 1,00 0,60

: D393A 0,98 0,77

: D393C 0,69 0,48

: D393E 0,92 0,81

: D393F 0,84 0,61

: D393G 1,08 0,75

: D393H 0,88 0,75

: D393I 0,05 0,05

: D393K 1,09 0,80

: D393L 1,04 0,70

: D393N 0,05 0,05

: D393P 0,05 0,05

: D393Q 1,00 0,82

: D393R 0,88 0,64

: D393S 0,92 0,91

: D393T 1,12 0,90

: D393V 1,04 0,63

: D393W 0,95 0,66

: D393Y 1,01 0,66

: Y394A 0,91 0,86

: Y394D 0,98 0,84

: Y394E 0,92 1,03

: Y394F 1,07 0,98

: Y394G 1,13 0,85

: Y394H 1,04 0,99

: Y394I 1,11 0,95

: Y394K 1,09 1,07

: Y394L 1,22 1,11

: Y394M 0,74 0,23

: Y394N 1,00 1,01

: Y394P 0,05 0,05

: Y394Q 1,09 1,13

: Y394S 1,11 1,15

: Y394V 3,00 0,75

: Y394W 1,11 1,16

: H400A 1,24 0,89

: H400C 1,16 0,73

: H400D 1,05 0,82

: H400E 0,99 0,95

: H400F 1,01 0,94

: H400G 0,90 0,83

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: H400I 1,04 0,91

: H400K 0,92 1,03

: H400L 0,90 0,88

: H400M 1,01 0,91

: H400N 1,26 0,92

: H400P 0,05 0,05

: H400Q 0,96 0,94

: H400R 1,03 0,87

: H400S 0,94 0,92

: H400T 0,95 0,88

: H400V 1,28 0,91

: H400W 1,17 0,80

: H400Y 1,15 0,92

: Y402A 1,07 0,97

: Y402C 0,92 0,76

: Y402D 0,90 0,80

: Y402E 1,09 0,77

: Y402F 0,89 0,82

: Y402G 0,92 0,81

: Y402H 1,21 0,91

: Y402I 1,36 0,75

: Y402K 0,95 0,84

: Y402L 1,09 0,49

: Y402M 1,14 0,88

: Y402N 1,06 0,86

: Y402P 1,03 0,28

: Y402Q 0,98 0,83

: Y402R 1,16 0,75

: Y402T 1,32 1,02

: Y402V 1,40 0,95

: Y402W 1,24 0,89

: L403A 1,20 0,89

: L403C 1,10 0,98

: L403D 1,03 0,95

: L403E 1,26 0,93

: L403F 1,03 0,74

: L403G 1,22 0,96

: L403H 1,10 0,90

: L403M 1,11 0,99

: LA03N 0,98 0,95

: L403P 0,78 0,47

: L403Q 1,24 0,98

: L403R 1,36 1,01

: L403S 1,17 1,00

: L403T 1,53 0,99

: L403V 1,34 1,00

: L403W 1,15 0,85

: L403Y 1,16 0,97

: D404A 1,12 0,73

: D404C 1,28 0,61

: D404E 1,38 0,78

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: D404G 1,25 0,77

: D404I 1,20 0,84

: D404K 1,10 0,83

: D404L 1,09 0,91

: D404M 1,13 0,76

: D404N 1,13 0,98

: D404P 1,05 0,56

: D404Q 1,17 0,91

: D404R 1,15 0,77

: D404S 1,19 0,99

: D404V 1,28 0,79

: D404W 1,05 0,76

: D404Y 1,08 0,81

: S406A 0,99 0,99

: S406C 1,11 0,85

: S406D 0,93 1,02

: S406E 0,95 0,91

: S406F 0,86 0,88

: S406G 0,93 0,86

: S406H 0,88 0,98

: S406I 0,92 0,91

: S406K 0,95 0,82

: S406L 0,94 0,98

: S406M 0,89 0,90

: S406N 1,09 0,94

: S406P 0,91 0,93

: S406Q 0,05 0,05

: S406T 1,18 0,97

: S406V 1,14 0,87

: S406Y 0,99 0,80

: D407C 1,14 0,41

: D407E 0,82 0,59

: D407F 0,88 0,35

: D407G 1,10 0,38

: D407H 0,85 0,63

: D4071 1,05 0,22

: D407K 1,00 0,44

: D407L 0,91 0,18

: D407M 1,05 0,37

: D407N 1,11 0,96

: D407P 0,05 0,05

: D407Q 0,94 0,53

: D407R 0,78 0,36

: D407S 0,93 0,65

: D407T 1,06 0,49

: D407V 0,93 0,29

: D407W 1,06 0,20

: D407Y 0,85 0,38

: G410A 0,90 1,00

: G410C 1,04 0,81

: G410D 0,05 0,05

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: G410E 0,05 0,05

: G410F 0,96 0,22

: G410H 0,93 0,34

: G4101 0,05 0,05

: G410L 0,05 0,05

: G410M 1,13 0,35

: G410N 0,99 0,27

: G410P 0,05 0,05

: G410Q 1,05 0,14

: G410R 0,98 0,27

: G410T 1,08 0,70

: G410V 1,10 0,42

: G410W 0,05 0,05

: G410Y 0,92 0,49

: R413A 1,02 1,06

: R413D 0,71 0,40

: R413E 0,86 0,67

: R413G 1,19 0,33

: R413H 1,06 0,95

: R413I 0,96 0,75

: R413K 1,08 0,95

: R413L 1,02 0,96

: R413M 0,81 0,81

: R413N 0,93 0,72

: R413P 0,05 0,05

: R413Q 0,81 0,35

: R413S 0,85 0,87

: R413T 0,05 0,74

: R413V 0,93 0,73

: R413W 0,92 0,41

: R413Y 0,73 0,49

: E414A 1,06 0,70

: E414C 1,05 0,55

: E414D 1,13 0,75

: E414F 0,81 0,59

: E414G 0,82 0,68

: E414H 0,89 0,65

: E414I 0,98 0,60

: E414K 0,96 0,65

: E414L 1,16 0,71

: E414M 0,88 0,72

: E414N 0,99 0,57

: E414P 0,85 0,60

: E414Q 0,85 0,70

: E414R 1,00 0,65

: E414S 0,91 0,63

: E414T 0,79 0,67

: E414W 1,03 0,25

: E414Y 0,78 0,58

: V416A 0,93 0,67

: V416C 0,94 0,61

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: V416D 1,05 0,71

: V416F 0,05 0,05

: V416H 0,92 0,78

: V416I 0,83 0,74

: V416K 0,71 0,65

: V416L 0,96 0,81

: V416M 1,06 0,78

: V416N 0,92 0,66

: V416P 1,18 0,53

: V416Q 1,02 0,74

: V416R 1,02 0,29

: V416S 1,15 0,46

: V416T 1,01 0,65

: V416W 0,83 0,55

: V416Y 0,89 0,69

: K419A 1,36 1,29

: K419C 1,24 0,67

: K419D 1,00 0,94

: K419E 0,87 0,65

: K419F 0,90 0,17

: K419H 0,05 0,05

: K419I 1,12 1,32

: K419L 0,05 0,05

: K419M 1,20 1,27

: K419N 0,05 0,05

: K419P 1,11 1,23

: K419Q 0,96 0,61

: K419R 0,05 0,05

: K419S 1,13 1,51

: K419T 1,42 1,05

: K419V 1,14 1,55

: K419W 0,98 0,14

: K419Y 1,15 0,11

: S422A 0,64 0,97

: S422C 0,96 0,71

: S422D 0,97 0,96

: S422E 1,31 0,78

: S422F 0,96 0,71

: S422G 1,20 0,99

: S422H 1,06 0,66

: S422I 1,11 0,85

: S422K 1,16 0,96

: S422L 0,99 0,74

: S422M 1,04 0,94

: S422N 1,12 1,03

: S422P 0,84 0,70

: S422Q 0,15 0,82

: S422R 1,02 0,94

: S422T 0,97 0,92

: S422V 1,17 0,88

: S422W 0,96 0,70

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: S422Y 1,09 0,92

: L427A 0,93 0,66

: L427C 1,02 0,68

: L427D 0,05 0,05

: L427E 0,86 0,27

: L427F 0,89 0,30

: L427G 0,63 0,26

: LA27H 0,05 0,05

: L427I 1,08 0,64

: L427K 0,05 0,05

: L427M 0,86 0,79

: L427N 0,76 0,31

: L427P 1,13 0,06

: L427Q 0,95 0,53

: L427R 0,05 0,05

: L427S 0,78 0,27

: L427T 0,80 0,70

: L427V 0,82 0,72

: L427W 0,05 0,05

: L427Y 0,05 0,05

: G433A 1,27 1,08

: G433C 1,15 0,69

: G433D 1,05 0,96

: G433E 0,92 0,99

: G433F 1,04 0,92

: G433H 1,27 0,99

: G433I 1,37 0,86

: G433K 1,27 1,05

: G433L 1,30 0,90

: G433M 1,23 1,01

: G433N 1,07 0,75

: G433P 1,13 0,95

: G433Q 0,78 0,99

: G433R 1,00 0,91

: G433S 1,17 0,96

: G433T 1,17 0,90

: G433V 1,27 0,95

: G433Y 1,26 1,01

: K436A 0,92 0,94

: K436C 0,90 0,84

: K436D 0,86 0,93

: K436E 0,70 0,87

: K436F 0,81 0,64

: K436G 0,84 0,77

: K436H 1,09 0,89

: K436I 1,08 0,81

: K436L 1,01 0,78

: K436M 0,76 0,85

: K436N 0,98 0,92

: K436P 0,88 0,71

: K436Q 1,01 0,96

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K436R 1,06 0,79

: K436S 0,75 0,92

: K436T 0,95 0,90

: K436V 0,98 0,87

: K436W 1,07 0,71

: K436Y 0,99 0,80

: Y439A 1,02 0,78

: Y439D 1,01 0,85

: Y439E 0,05 0,05

: Y439F 0,77 0,78

: Y439G 1,01 0,77

: Y439H 0,96 0,73

: Y439I 0,05 0,05

: Y439K 0,96 0,74

: Y439L 0,05 0,05

: Y439M 1,04 0,77

: Y439N 0,96 0,83

: Y439P 0,87 0,85

: Y439Q 0,90 0,88

: Y439R 0,75 0,80

: Y439S 0,94 0,82

: Y439T 0,84 0,79

: Y439V 1,04 0,70

: Y439W 0,86 0,72

: K442A 1,38 0,98

: K442C 0,05 0,05

: K442F 1,04 0,97

: K442G 1,23 1,02

: K442H 1,07 1,04

: K442I 1,13 0,93

: K442N 1,39 1,03

: K442P 1,11 1,03

: K442Q 1,11 1,05

: K442R 1,33 1,01

: K442S 1,24 1,07

: K442T 1,34 1,06

: K442V 1,20 0,99

: K442W 1,32 0,98

: K442Y 1,24 1,08

: A445C 0,98 0,83

: A445D 1,04 0,87

: A445G 1,21 1,01

: A445H 0,90 0,93

: A445I 1,25 0,84

: A445K 1,20 0,11

: A445L 1,17 0,92

: A445N 1,20 0,91

: A445P 0,91 0,77

: A445Q 0,05 0,05

: A445R 0,91 0,89

: A445S 1,16 0,94

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: A445T 1,29 0,88

: A445V 1,27 0,93

: A445W 1,25 0,80

: K447A 1,09 1,06

: K447C 1,11 0,87

: K447D 1,00 0,99

: K447F 1,09 0,84

: K447G 1,06 0,94

: K447H 1,13 0,92

: K447I 1,22 0,91

: K447L 1,06 1,01

: K447M 1,07 0,96

: K447N 1,43 0,97

: K447Q 1,34 1,00

: K447R 1,10 0,96

: K447S 0,90 0,92

: K447T 1,21 0,37

: K447V 0,69 0,86

: K447W 1,31 0,89

: K447Y 1,21 0,96

: V448A 0,98 0,96

: V448C 1,36 0,98

: V448D 1,15 1,02

: V448E 0,05 0,05

: V448F 1,48 1,01

: V448G 1,26 1,05

: V448H 1,37 1,03

: V448I 1,44 0,97

: V448K 1,20 1,07

: V448L 1,04 1,08

: V448M 1,13 0,97

: V448N 1,24 0,70

: V448P 0,84 1,19

: V448Q 1,18 1,16

: V448R 0,05 0,05

: V448S 1,20 1,10

: V448T 0,05 0,05

: V448W 1,08 0,89

: V448Y 1,33 1,27

: Y450A 0,95 0,94

: Y450C 1,22 0,84

: Y450D 1,19 0,95

: Y450E 1,01 0,92

: Y450G 1,02 0,93

: Y450H 1,23 0,90

: Y450K 1,18 0,94

: Y450L 0,93 0,69

: Y450M 1,29 0,89

: Y450N 1,23 0,96

: Y450P 0,75 0,30

: Y450Q 1,00 0,95

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: Y450R 1,22 1,02

: Y450S 1,22 1,01

: Y450T 1,32 0,96

: Y450V 0,05 0,05

: Y450W 1,21 0,95

: L452A 1,08 1,06

: L452C 1,00 1,01

: L452D 0,98 1,08

: L452E 0,75 0,55

: L452F 0,79 0,93

: L452G 1,07 1,00

: L452H 1,05 0,99

: L452K 1,11 1,08

: L452M 1,13 1,09

: L452N 1,06 1,28

: L452P 1,02 0,78

: L452Q 0,92 1,22

: L452R 0,93 1,26

: L452S 0,86 1,21

: L452T 1,02 1,18

: L452V 1,14 1,14

: L452Y 1,17 1,07

: N455A 1,07 1,04

: N455C 0,85 0,89

: N455D 1,07 0,97

: N455E 1,14 0,94

: N455G 1,23 1,00

: N455H 1,05 1,01

: N455I 1,23 0,95

: N455K 1,10 1,08

: N455L 1,06 0,97

: N455M 0,95 0,96

: N455P 1,36 0,93

: N455Q 0,96 0,91

: N455R 1,13 1,02

: N455S 1,04 0,91

: N455T 1,16 0,90

: N455V 1,26 0,89

: N455W 1,12 0,76

: N455Y 1,08 0,15

: N463A 1,25 1,06

: N463D 0,97 1,02

: N463F 1,04 0,87

: N463G 1,04 1,00

: N463H 1,12 0,99

: N463I 0,05 0,05

: N463K 1,07 1,00

: N463L 1,16 1,01

: N463M 1,24 1,08

: N463P 0,93 1,05

: N463Q 0,98 1,04

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: N463R 0,95 0,93

: N463S 1,27 0,96

: N463T 1,38 0,91

: N463V 1,32 0,86

: N463W 1,45 0,74

: N463Y 1,20 0,90

: D465A 0,76 1,06

: D465C 0,84 0,74

: D465E 0,95 0,93

: D465F 0,78 0,89

: D465G 1,35 0,92

: D465H 1,06 0,92

: D465I 1,37 0,85

: D465K 1,53 0,88

: D465L 1,14 0,95

: D465M 1,06 0,98

: D465N 1,32 0,93

: D465P 1,13 0,71

: D465Q 0,86 0,94

: D465R 1,18 0,90

: D465S 0,87 0,98

: D465T 1,42 0,92

: D465V 1,24 0,93

: D465W 1,00 0,83

: D465Y 1,06 0,93

: E469A 1,16 1,01

: E469C 1,03 0,86

: E469D 1,22 1,02

: E469F 1,11 1,00

: E469G 1,19 1,00

: E469H 1,04 0,96

: E469K 1,16 0,96

: E469L 1,10 0,98

: E469M 0,05 0,05

: E469N 1,19 0,47

: E469P 0,85 1,05

: E469Q 1,03 1,04

: E469R 1,01 0,75

: E469S 0,91 1,08

: E469T 1,15 1,06

: E469V 1,15 1,08

: E469W 1,24 0,97

: E469Y 1,35 1,09

: K471A 1,09 1,09

: K471C 1,04 0,91

: K471D 1,01 1,06

: K471F 1,10 1,05

: K471G 1,13 1,12

: K471H 1,00 1,10

: K471I 1,22 1,02

: K471L 0,99 1,07

Posición: Variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K471M 0,95 1,14

: K471N 1,04 1,12

: K471P 0,84 0,98

: K471Q 0,90 1,08

: K471R 0,77 1,33

: K471S 0,97 1,01

: K471T 1,11 1,09

: K471V 1,28 1,11

: K471Y 1,15 1,36

: N473A 1,03 0,99

: N473C 1,15 0,74

: N473D 1,14 0,98

: N473E 1,20 0,99

: N473F 1,10 0,83

: N473G 1,35 0,99

: N473H 1,02 0,91

: N4731 0,66 0,45

: N473K 1,02 1,02

: N473L 0,05 0,97

: N473M 1,11 1,00

: N473P 1,01 0,95

: N473Q 1,13 0,99

: N473R 1,08 1,05

: N473S 1,15 0,98

: N473T 1,04 1,04

: N473V 0,05 0,05

: N473W 0,85 0,64

: N473Y 1,23 0,86

: S476A 1,51 1,02

: S476C 0,91 0,89

: S476D 0,98 0,91

: S476E 1,08 0,91

: S476F 1,09 0,87

: S476G 1,22 0,97

: S476H 1,07 0,96

: S476I 1,03 0,78

: S476K 1,01 0,97

: S476L 1,46 0,93

: S476M 1,58 1,08

: S476N 1,61 0,98

: S476P 1,02 0,62

: S476Q 1,13 1,03

: S476R 1,01 1,08

: S476T 1,78 1,01

: S476V 1,21 0,89

: S476W 1,43 0,78

: S476Y 1,79 0,94

[0393] La Tabla 26-5 enumera las variantes de AmyS que son mutaciones combinables (2250) para las 152 posiciones. Estas variantes tienen valores de índice de rendimiento ≥ 0,5 para al menos una propiedad (actividad o estabilidad) y > 0,05 para ambas propiedades.

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: N005A 0,95 0,32

: N005C 0,98 0,29

: N005E 1,04 0,43

: N005F 0,79 0,15

: N005G 0,88 0,34

: N005H 0,89 0,43

: N005I 1,00 0,10

: N005K 0,90 0,34

: N005L 1,04 0,10

: N005M 0,84 0,18

: N005P 1,10 0,40

: N005Q 1,07 0,58

: N005R 0,94 0,40

: N005S 0,98 0,35

: N005T 0,83 0,35

: N005V 0,88 0,16

: N005W 0,94 0,07

: N005Y 1,07 0,21

: G006A 1,10 1,59

: G006D 1,14 1,64

: G006E 1,08 1,93

: G006H 0,95 2,29

: G006I 1,23 1,47

: G006K 0,93 2,36

: G006L 1,15 1,61

: G006M 1,11 1,60

: G006N 1,21 1,61

: G006P 1,10 2,47

: G006Q 1,26 1,34

: G006R 0,98 1,28

: G006S 1,12 1,86

: G006T 1,21 2,01

: G006V 1,29 1,54

: G006W 1,13 1,32

: G006Y 1,07 1,88

: E013A 0,32 1,01

: E013C 0,22 0,68

: E013D 0,08 1,03

: E013G 0,18 1,00

: E013H 0,60 1,10

: E013I 0,15 0,87

: E013K 0,22 1,22

: E013L 0,20 1,02

: E013M 0,20 0,96

: E013Q 0,21 0,96

: E013R 0,28 1,04

: E013S 0,28 0,92

: E013T 0,19 0,79

: E013V 0,19 0,76

: E013W 0,05 0,76

: E013Y 0,89 0,93

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

Tabla 26-5: Mutaciones combinables en AmyS

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: W014A 0,95 0,77

: W014C 0,91 0,71

: W014D 0,81 0,59

: W014E 0,95 1,07

: W014F 1,06 1,25

: W014G 0,97 0,88

: W014I 1,12 0,40

: W014K 1,01 0,69

: W014L 0,88 0,15

: W014M 1,18 0,84

: W014N 0,92 0,99

: W014P 0,84 0,98

: W014Q 0,94 0,67

: W014R 0,97 0,67

: W014S 0,97 1,02

: W014T 1,22 1,22

: W014V 1,17 0,81

: W014Y 1,08 1,71

: Y015A 1,05 1,48

: Y015C 0,70 1,15

: Y015D 0,77 1,82

: Y015E 0,68 1,96

: Y015G 0,69 1,89

: Y015H 1,01 1,85

: Y015I 0,63 0,91

: Y015K 0,74 1,58

: Y015L 0,67 0,76

: Y015M 0,72 1,12

: Y015N 0,99 1,88

: Y015P 0,57 1,59

: Y015Q 0,80 1,74

: Y015R 0,72 1,60

: Y015S 0,58 1,78

: Y015T 0,87 1,47

: Y015W 0,95 1,44

: L016A 0,81 1,31

: L016D 0,93 1,12

: L016E 1,09 1,21

: L016F 2,17 0,98

: L016G 0,61 1,35

: L016H 0,96 1,21

: L016I 0,79 1,12

: L016K 0,79 1,41

: L016M 0,94 1,15

: L016N 0,92 1,32

: L016P 0,35 1,30

: L016Q 0,96 1,33

: L016R 0,71 1,28

: L016S 0,94 1,19

: L016T 0,87 1,32

: L016V 0,87 1,16

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: L016W 0,75 0,99

: L016Y 0,97 1,10

: D018A 1,08 0,89

: D018F 0,68 0,58

: D018G 0,88 0,87

: D018H 0,84 0,84

: D018I 0,79 0,70

: D018K 0,88 0,65

: D018L 0,60 0,72

: D018N 0,73 1,01

: D018P 0,84 1,04

: D018Q 0,80 1,00

: D018R 0,81 0,65

: D018S 0,81 0,93

: D018T 0,81 0,91

: D018V 0,89 0,77

: D018W 0,72 0,51

: D018Y 0,72 0,87

: G020A 0,79 0,25

: G020C 0,58 0,24

: G020D 0,92 0,96

: G020E 0,89 0,95

: G020F 0,65 0,13

: G020H 0,75 0,11

: G020I 0,96 0,28

: G020M 0,69 0,10

: G020N 0,78 0,09

: G020Q 0,61 0,07

: G020T 0,82 0,09

: G020V 0,77 0,19

: G020W 0,80 0,69

: K025A 1,22 0,82

: K025C 1,33 1,46

: K025D 1,06 1,03

: K025E 1,07 0,95

: K025F 1,00 0,58

: K025G 1,27 0,97

: K025H 1,03 1,06

: K025L 1,12 0,64

: K025M 1,03 0,61

: K025N 0,91 1,06

: K025P 0,98 0,55

: K025Q 1,24 1,07

: K025R 1,08 0,96

: K025S 1,07 0,98

: K025T 1,14 0,89

: K025Y 0,98 0,65

: A027C 0,79 0,55

: A027D 1,01 0,95

: A027E 0,93 0,95

: A027F 0,88 0,85

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: A027G 1,20 0,98

: A027H 1,05 1,00

: A027I 1,05 0,87

: A027K 0,86 1,01

: A027L 1,06 0,86

: A027M 1,21 0,88

: A027N 1,06 1,00

: A027P 1,13 0,43

: A027Q 1,00 0,96

: A027R 1,11 0,89

: A027S 1,16 0,97

: A027T 1,20 0,90

: A027V 1,20 0,82

: A027W 1,13 0,76

: A027Y 0,97 0,28

: E029A 1,05 0,50

: E029D 0,94 1,11

: E029G 0,75 0,37

: E029H 0,83 0,83

: E029K 1,05 0,89

: E029L 0,76 0,22

: E029M 0,76 0,15

: E029N 1,02 0,89

: E029P 0,87 0,33

: E029Q 1,04 0,86

: E029R 1,09 0,92

: E029S 0,97 0,83

: E029T 0,95 0,59

: E029W 0,74 0,10

: L036A 0,95 0,85

: L036C 0,83 0,43

: L036D 0,91 0,27

: L036E 0,90 0,40

: L036F 1,14 0,90

: L036G 0,92 0,34

: L036H 0,92 0,77

: L036I 1,17 0,89

: L036K 1,01 1,05

: L036M 1,05 1,05

: L036N 1,02 0,68

: L036P 0,90 0,06

: L036Q 1,40 0,78

: L036R 1,12 0,76

: L036S 1,25 0,69

: L036T 1,11 0,64

: L036V 0,88 0,97

: L036W 0,92 0,63

: L036Y 1,07 0,91

: T039C 1,09 1,05

: T039D 1,15 1,47

: T039E 1,15 1,32

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: T039F 1,16 0,48

: T039G 1,23 1,05

: T039H 1,16 1,10

: T039K 1,12 1,10

: T039M 1,18 0,54

: T039N 1,14 1,64

: T039P 1,11 0,26

: T039Q 1,20 1,43

: T039R 1,01 1,10

: T039S 1,15 1,02

: T039V 1,30 0,82

: T039W 1,11 0,25

: T050A 1,09 0,98

: T050C 1,03 0,34

: T050D 0,87 0,91

: T050F 0,86 0,43

: T050G 1,00 1,18

: T050H 0,97 0,82

: T050I 1,24 0,61

: T050K 1,13 0,80

: T050L 1,22 0,67

: T050M 1,32 0,62

: T050N 1,20 1,12

: T050P 1,03 0,99

: T050Q 1,31 1,08

: T050R 1,13 0,79

: T050S 1,07 1,09

: T050V 1,02 0,79

: T050W 0,90 0,18

: T050Y 1,14 0,42

: R052A 0,99 1,02

: R052C 0,87 0,62

: R052D 0,76 0,85

: R052E 0,77 0,97

: R052G 0,96 0,93

: R052H 0,91 0,99

: R052K 0,93 1,02

: R052L 1,10 0,98

: R052M 1,01 1,00

: R052N 0,95 0,99

: R052P 1,05 0,95

: R052S 1,21 0,92

: R052T 1,11 1,00

: R052V 1,14 0,95

: R052W 1,00 0,83

: R052Y 0,99 0,96

: S053A 1,03 1,00

: S053C 0,73 0,58

: S053D 0,75 0,83

: S053E 1,05 0,88

: S053F 0,87 0,85

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: S053G 1,14 0,93

: S053H 1,12 1,00

: S053I 0,99 1,12

: S053K 1,03 1,10

: S053L 0,93 0,96

: S053M 0,96 0,97

: S053P 0,88 1,00

: S053Q 0,94 0,94

: S053R 0,83 1,15

: S053T 1,25 1,02

: S053V 1,11 0,94

: S053W 1,09 0,84

: S053Y 0,94 0,93

: D054A 0,34 0,88

: D054C 0,64 0,38

: D054G 0,11 0,97

: D054H 0,11 1,04

: D054I 0,30 0,83

: D054M 0,11 0,88

: D054N 0,94 1,05

: D054R 0,06 0,89

: D054S 0,38 0,96

: D054T 0,17 0,95

: D054V 0,17 0,77

: E067C 1,08 0,75

: E067D 0,90 1,07

: E067G 1,01 1,13

: E067H 1,04 1,03

: E067K 0,98 0,94

: E067L 0,97 0,95

: E067M 0,93 0,91

: E067N 1,32 0,95

: E067Q 0,93 0,95

: E067R 1,01 0,90

: E067S 1,23 1,00

: E067T 0,99 0,98

: E067Y 1,11 0,93

: K071A 0,72 0,81

: K071C 0,80 0,61

: K071D 0,69 0,71

: K071E 0,80 0,84

: K071F 0,47 0,61

: K071G 0,74 0,91

: K071H 0,96 0,88

: K071I 0,83 0,75

: K071L 0,55 0,61

: K071M 0,80 0,68

: K071N 1,11 0,89

: K071P 0,92 0,86

: K071Q 0,98 0,77

: K071R 1,10 1,10

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K071S 0,99 0,97

: K071T 0,95 0,83

: K071V 0,94 0,84

: K071W 0,82 0,91

: K071Y 0,52 0,71

: T073A 0,97 1,11

: T073C 0,91 0,60

: T073D 0,89 1,02

: T073E 0,75 1,08

: T073F 0,73 0,99

: T073G 0,79 1,12

: T073H 0,86 0,88

: T073I 0,66 1,02

: T073K 0,20 0,97

: T073L 0,47 1,17

: T073M 0,59 0,64

: T073N 0,73 1,08

: T073P 0,57 0,98

: T073R 0,40 1,11

: T073S 0,87 1,10

: T073V 0,67 1,09

: T073W 0,83 1,07

: T073Y 0,79 1,10

: R075A 1,05 1,14

: R075C 0,88 0,85

: R075D 0,87 0,99

: R075E 0,86 1,01

: R075F 0,76 0,92

: R075G 0,79 1,04

: R075H 0,85 1,07

: R075I 0,86 1,01

: R075L 0,88 1,04

: R075M 1,04 1,04

: R075P 0,90 0,93

: R075Q 0,90 0,95

: R075S 0,66 0,60

: R075T 0,98 0,88

: R075V 0,78 0,94

: R075W 0,75 0,93

: R075Y 0,68 1,04

: K077A 0,38 0,98

: K077C 0,28 0,51

: K077E 0,11 0,77

: K077F 0,20 0,72

: K077G 0,13 0,76

: K077I 0,16 1,00

: K077L 0,54 0,98

: K077M 0,58 0,99

: K077Q 0,07 0,86

: K077R 0,77 1,07

: K077S 0,11 0,89

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K077V 0,05 0,83

: T080A 0,88 1,01

: T080C 0,91 0,69

: T080D 1,22 0,86

: T080E 0,71 0,92

: T080F 1,10 0,50

: T080G 1,02 0,93

: T080H 1,01 0,95

: T080I 1,29 0,82

: T080K 0,90 0,86

: T080L 0,82 0,98

: T080M 0,97 0,95

: T080N 0,90 1,00

: T080P 0,88 0,88

: T080Q 0,87 0,88

: T080R 0,99 0,76

: T080S 0,83 1,09

: T080V 0,87 0,87

: T080W 0,77 0,89

: T080Y 0,72 0,97

: K081A 0,87 0,94

: K081C 0,84 0,74

: K081D 0,96 0,83

: K081E 0,69 0,92

: K081G 0,86 0,81

: K081H 0,73 1,03

: K081I 0,82 0,79

: K081L 0,87 1,01

: K081M 0,93 1,04

: K081P 0,90 0,79

: K081Q 0,84 1,03

: K081R 0,90 1,04

: K081S 0,74 0,98

: K081T 0,80 0,93

: K081V 0,66 1,03

: K081W 0,60 0,98

: K081Y 0,89 1,20

: Q083A 1,20 0,98

: Q083C 1,79 0,17

: Q083D 0,94 0,92

: Q083E 0,98 0,95

: Q083F 0,87 0,80

: Q083G 0,76 1,01

: Q083H 0,78 0,86

: Q083I 0,69 0,85

: Q083L 0,77 0,91

: Q083M 0,91 0,96

: Q083P 1,01 0,82

: Q083R 0,91 0,90

: Q083S 0,75 0,99

: Q083T 0,84 0,84

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: Q083V 0,73 0,80

: Q083W 0,82 0,78

: Q083Y 0,71 0,93

: L085A 0,94 1,06

: L085C 0,90 0,63

: L085D 0,84 1,04

: L085E 1,09 1,02

: L085G 0,85 0,90

: L085H 0,73 1,02

: L085I 0,89 0,88

: L085K 0,96 0,93

: L085M 1,01 1,04

: L085N 1,10 0,89

: L085P 1,01 0,72

: L085Q 0,91 0,99

: L085R 0,96 1,01

: L085S 1,02 1,04

: L085T 0,83 1,12

: L085W 0,93 0,95

: L085Y 0,70 1,08

: A090C 1,00 0,65

: A090D 1,12 0,92

: A090E 1,20 0,92

: A090F 0,99 0,76

: A090G 1,04 0,87

: A090H 1,05 1,03

: A090I 0,90 0,83

: A090K 0,93 1,04

: A090L 0,76 0,92

: A090M 1,02 1,02

: A090N 1,02 0,98

: A090P 1,39 0,10

: A090Q 0,94 0,93

: A090R 0,90 0,90

: A090S 1,16 0,99

: A090T 0,78 0,88

: A090V 0,79 0,87

: A090W 0,69 0,84

: A090Y 0,83 0,96

: H092C 0,75 0,29

: H092D 1,06 0,69

: H092E 0,88 0,76

: H092F 0,92 0,28

: H092G 0,86 0,81

: H092K 0,89 0,98

: H092N 0,85 0,78

: H092Q 0,80 0,89

: H092R 0,75 0,96

: H092S 0,70 0,87

: H092T 0,68 0,47

: H092V 0,70 0,28

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: H092W 0,83 0,44

: H092Y 0,71 0,63

: H106D 0,58 0,07

: H106P 0,59 0,06

: K107A 0,46 0,81

: K107C 0,42 0,67

: K107D 0,32 0,51

: K107E 0,35 0,70

: K107F 0,42 0,66

: K107G 0,23 0,76

: K107H 0,34 0,94

: K107I 0,29 0,69

: K107L 0,53 0,75

: K107M 0,60 0,79

: K107N 0,43 0,88

: K107Q 0,63 0,74

: K107R 1,05 0,71

: K107S 0,30 0,78

: K107T 0,38 0,72

: K107V 0,41 0,70

: K107Y 0,40 0,64

: D111A 0,55 0,95

: D111C 0,71 0,60

: D111E 0,87 1,01

: D111F 0,63 0,65

: D111G 0,74 0,90

: D111H 0,50 0,85

: D111I 0,56 0,91

: D111K 0,45 0,62

: D111L 0,44 0,86

: D111M 0,65 1,00

: D111N 0,97 0,87

: D111P 0,78 0,71

: D111Q 0,77 0,95

: D111R 0,53 0,07

: D111S 0,67 0,91

: D111T 0,61 1,02

: D111V 0,58 1,02

: D111W 0,42 0,54

: D111Y 0,49 0,92

: T113A 0,89 0,97

: T113C 0,80 0,82

: T113D 0,94 0,95

: T113E 0,92 0,91

: T113F 0,76 0,92

: T113G 0,88 1,08

: T113H 0,88 0,96

: T113I 1,14 0,88

: T113K 0,93 1,13

: T113L 1,08 1,08

: T113M 0,83 0,99

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: T113P 1,05 0,96

: T113Q 0,88 1,05

: T113R 0,88 1,03

: T113V 1,12 0,94

: T113W 1,06 0,88

: E114A 0,54 0,97

: E114C 0,62 0,76

: E114D 0,71 0,82

: E114F 0,36 0,92

: E114G 0,59 1,01

: E114H 0,49 0,92

: E114I 0,54 0,86

: E114L 0,43 0,97

: E114M 0,77 0,97

: E114N 0,67 0,88

: E114R 0,35 0,84

: E114T 0,54 0,94

: E114V 0,43 0,85

: E114W 0,31 0,94

: E114Y 0,26 0,93

: E120A 0,29 1,20

: E120C 0,24 0,89

: E120H 0,09 0,90

: E120I 0,60 0,87

: IE120L 0,20 0,97

: E120M 0,39 0,96

: E120N 0,16 1,02

: E120Q 0,66 1,10

: E120R 0,12 1,12

: E120S 0,08 1,07

: E120T 0,22 1,06

: E120V 0,53 0,93

: E120W 0,15 0,81

: E120Y 0,07 0,98

: V121C 0,92 0,55

: V121T 0,07 0,92

: Q128C 0,42 0,95

: Q128D 0,15 1,05

: Q128E 0,90 1,00

: Q128H 0,34 1,05

: Q128I 0,90 0,89

: Q128K 0,52 1,15

: Q128L 0,47 0,97

: Q128N 0,12 1,05

: Q128R 0,31 1,14

: Q128S 0,28 1,02

: Q128V 0,86 0,97

: Q128W 0,07 0,76

: Q128Y 0,13 0,86

: S131D 0,26 1,08

: S131G 0,24 0,86

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: S131N 0,76 1,02

: S131T 0,49 0,90

: T133A 0,95 1,13

: T133C 0,49 0,97

: T133D 1,03 0,99

: T133E 0,82 1,02

: T133F 0,17 0,97

: T133G 0,47 0,84

: T133H 0,41 1,19

: T133I 0,86 0,96

: T133K 0,47 0,85

: T133L 0,41 1,06

: T133M 0,51 1,05

: T133N 0,68 1,13

: T133P 1,41 1,08

: T133Q 0,63 1,10

: T133R 0,18 1,13

: T133S 0,72 1,08

: T133V 1,25 0,92

: T133W 0,14 0,98

: T133Y 0,41 1,01

: Q137A 0,92 0,97

: Q137C 1,09 0,77

: Q137D 0,89 0,96

: Q137E 1,06 0,87

: Q137F 0,85 0,86

: Q137G 1,13 0,94

: Q137H 0,95 1,05

: Q137I 0,93 0,22

: Q137L 1,20 0,82

: Q137M 1,30 0,83

: Q137P 0,07 1,05

: Q137R 0,95 1,05

: Q137S 1,45 0,98

: Q137T 1,12 0,91

: Q137V 1,02 0,86

: Q137W 1,06 0,88

: Q137Y 0,94 0,89

: A138G 0,90 1,02

: A138I 0,23 0,90

: A138N 0,50 0,94

: A138P 1,07 1,15

: A138Q 0,13 0,69

: A138S 1,12 1,02

: A138T 1,16 1,05

: A138V 1,17 0,87

: A138Y 0,14 0,97

: W139A 0,82 0,89

: W139C 0,75 0,39

: W139D 0,93 1,40

: W139E 0,81 0,97

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: W139G 0,79 0,74

: W139H 0,97 1,59

: W139I 0,74 0,58

: W139K 0,68 0,42

: W139L 0,78 0,59

: W139M 0,87 1,00

: W139N 1,13 0,85

: W139Q 0,82 0,79

: W139R 0,96 1,29

: W139S 0,93 1,04

: W139T 0,71 0,87

: W139V 0,72 0,66

: W139Y 1,14 1,63

: K141A 1,09 0,73

: K141C 1,03 0,85

: K141D 0,89 0,98

: K141E 3,48 0,92

: K141F 0,89 0,80

: K141G 1,18 0,96

: K141H 1,13 0,99

: K141I 1,40 0,87

: K141L 0,85

: K141M 1,23 1,01

: K141N 1,11 1,02

: K141P 1,07 0,96

: K141Q 1,28 0,97

: K141R 1,23 0,99

: K141S 1,21 0,98

: K141T 1,17 0,94

: K141V 1,21 1,00

: K141W 1,16 0,87

: K141Y 1,17 0,88

: D143A 0,95 1,04

: D143C 1,11 0,84

: D143E 1,12 0,98

: D143G 1,13 1,09

: D143H 0,91 0,98

: D143I 1,05 0,94

: D143K 0,86 0,96

: D143M 0,86 1,05

: D143N 1,10 0,99

: D143P 0,98 0,84

: D143V 1,00 1,01

: D143W 1,00 0,99

: D143Y 0,75 0,15

: R147A 0,73 0,25

: R147D 0,66 0,07

: R147G 0,74 0,11

: R147H 0,81 0,21

: R147K 1,05 0,48

: R147M 0,65 0,07

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: R147N 0,91 0,30

: R147Q 0,88 0,30

: R147S 0,90 0,39

: R147T 0,90 0,10

: N149A 0,94 0,93

: N149D 0,89 0,95

: N149E 0,98 0,93

: N149F 1,09 0,85

: N149G 0,90 0,93

: N149H 1,01 0,98

: N149I 1,15 0,83

: N149K 0,90 0,88

: N149L 0,88 0,94

: N149Q 1,00 0,93

: N149R 0,80 0,95

: N149S 0,94 1,03

: N149V 1,06 0,87

: N149W 1,01 0,87

: T150A 0,90 0,96

: T150C 1,03 0,72

: T150D 0,82 0,87

: T150E 4,54 0,87

: T150G 0,99 0,86

: T150I 0,82 0,93

: T150K 0,86 0,96

: T150L 0,83 0,07

: T150M 1,05 1,00

: T150N 0,98 1,08

: T150Q 0,83 0,99

: T150R 0,99 1,04

: T150S 0,77 0,96

: T150V 0,90 0,93

: T150Y 1,18 1,00

: Y151A 0,96 0,87

: Y151C 0,80 0,67

: Y151D 0,99 0,71

: Y151E 0,76 0,71

: Y151F 0,96 0,88

: Y151G 1,17 0,79

: Y151H 1,04 0,87

: Y151I 1,22 0,78

: Y151L 1,05 0,90

: Y151M 1,02 0,83

: Y151N 0,98 0,91

: Y151P 0,89 0,77

: Y151Q 1,07 0,75

: Y151R 1,05 0,76

: Y151S 0,85 0,80

: Y151T 1,04 0,80

: Y151V 1,14 0,80

: Y151W 1,16 0,79

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: S152A 0,95 0,88

: S152C 0,83 0,75

: S152E 1,09 0,71

: S152F 0,75 0,22

: S152G 1,25 0,91

: S152H 0,99 0,71

: S1521 0,81 0,22

: S152K 0,74 0,58

: S152N 1,20 0,43

: S152Q 0,71 0,21

: S152R 0,89 0,86

: S152T 1,16 0,99

: S152V 0,79 0,42

: S152W 0,73 0,22

: S152Y 0,91 0,26

: K155A 1,10 0,85

: K155C 0,92 0,72

: K155D 0,94 0,85

: K155E 0,82 0,79

: K155G 1,05 0,58

: K155H 1,04 0,84

: K155L 1,05 0,89

: K155M 0,91 0,91

: K155N 1,18 0,90

: K155P 0,99 0,94

: K155Q 0,84 0,90

: K155R 1,20 0,93

: K155S 1,22 0,85

: K155T 1,12 0,76

: K155V 1,01 0,85

: K155W 1,09 0,88

: K155Y 1,21 0,80

: H160A 0,89 0,89

: H160C 0,84 0,98

: H160D 0,89 0,69

: H160E 0,86 0,52

: H160F 0,77 0,79

: H160G 0,82 0,36

: H160I 0,36 0,58

: H160L 1,03 0,92

: H160M 0,56 0,97

: H160N 1,11 1,02

: H160Q 0,98 0,47

: H160R 0,54 0,62

: H160T 1,01 0,91

: H160V 0,76 0,74

: H160W 0,26 0,66

: H160Y 0,86 0,89

: D165A 0,53 0,12

: D165C 1,01 0,07

: D165E 1,14 0,07

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: D165G 0,63 0,20

: D165M 0,58 0,10

: D165N 1,16 1,10

: D165Q 0,53 0,11

: D165S 0,83 0,43

: E168A 0,83 0,92

: E168C 0,83 0,50

: E168D 0,82 0,57

: E168F 0,69 0,59

: E168G 0,92 0,75

: E168H 0,84 0,90

: E168I 1,08 0,71

: E168L 0,80 0,92

: E168M 1,12 0,80

: E168N 0,97 0,83

: E168Q 0,88 0,87

: E168R 1,18 0,90

: E168S 0,95 0,83

: E168T 0,83 0,16

: E168V 0,89 0,73

: E168W 0,66

: E168Y 0,76 0,82

: L172A 1,14 1,06

: L172C 1,07 0,89

: L172D 0,83 0,91

: L172E 0,97 1,01

: L172G 0,50 0,60

: L172H 0,93 1,06

: L172I 0,97 0,90

: L172K 0,98 1,12

: L172M 0,86 0,91

: L172N 0,91 0,96

: L172P 0,17 0,83

: L172Q 1,00 0,89

: L172R 1,16 1,06

: L172S 0,78 1,01

: L172T 0,82 0,94

: L172V 1,02 0,88

: L172W 1,09 0,92

: L172Y 1,06 0,98

: S173A 0,92 0,74

: S173C 0,82 0,57

: S173D 0,63 0,71

: S173E 1,07 0,65

: S173F 0,82 0,25

: S173G 0,73 0,78

: S173H 0,85 0,66

: S173I 1,20 0,59

: S173K 1,17 1,03

: S173L 0,75 0,20

: S173M 1,05 0,48

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: S173N 1,02 0,84

: S173Q 1,08 0,84

: S173R 0,88 1,03

: S173T 1,33 0,86

: S173V 1,12 0,46

: S173W 0,86 0,20

: S173Y 0,90 0,25

: K177L 0,89 0,91

: K177M 0,10 0,90

: K177Q 0,08 1,07

: K177R 0,47 1,09

: E188P 1,16

: T191A 0,49 1,11

: T191C 0,13 1,07

: T191D 0,91 1,03

: T191G 0,19 1,09

: T191I 0,18 1,06

: T191M 0,06 1,09

: T191N 0,76 1,13

: T191P 0,99 1,07

: T191Q 0,18 1,17

: T191S 0,72 1,05

: T191V 0,16 1,02

: E192C 0,55 1,12

: E192D 0,42 1,50

: E192Q 0,22 1,55

: E192T 0,10 1,35

: N193C 0,73 0,62

: N193F 1,71 0,98

: N193H 1,10 0,92

: N193K 1,28 1,17

: N193L 1,22 0,78

: N193M 0,81 0,96

: N193R 0,87 0,97

: N193W 1,09 0,73

: N193Y 1,89 1,10

: Y196A 0,74 1,57

: Y196D 0,29 1,29

: Y196F 0,74 1,38

: Y196N 0,54 0,94

: Y196S 0,36 1,59

: L199V 0,61 0,13

: M200A 1,03 0,68

: M200C 0,84 0,53

: M200D 0,71 0,81

: M200E 0,54 0,55

: M200I 1,14 0,57

: M200L 0,68 1,11

: M200N 0,46 0,72

: M200Q 0,78 0,77

: M200S 0,61 1,11

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: M200T 0,80 0,61

: M200V 0,97 0,56

: Y201A 0,90 1,41

: Y201C 1,22 0,14

: Y201D 0,60 0,73

: Y201E 0,81 1,36

: Y201F 0,85 0,81

: Y201G 0,56 1,63

: Y201H 1,06 1,44

: Y201I 1,35 0,11

: Y201K 0,89 0,08

: Y201L 1,05 0,18

: Y201M 1,16 1,21

: Y201N 1,15 0,31

: Y201Q 1,11 0,79

: Y201R 0,87 0,06

: Y201S 0,74 1,11

: Y201T 0,65 0,39

: Y201W 0,73 0,08

: A202C 0,97 0,57

: A202D 0,83 0,93

: A202E 0,49 0,85

: A202G 0,45 0,83

: A202I 0,50 1,02

: A202L 0,46 0,95

: A202M 0,32 0,84

: A202N 0,53 1,08

: A202Q 0,47 1,01

: A202S 0,69 0,79

: A202T 0,63 1,07

: A202V 0,82 1,02

: T213A 1,11 0,98

: T213C 0,97 0,77

: T213D 1,12 0,91

: T213E 1,11 0,88

: T213F 1,13 0,75

: T213G 1,11 0,91

: T213H 0,92 1,00

: T213K 0,90 1,11

: T213L 1,26 0,75

: T213M 1,26 0,78

: T213N 1,11 0,91

: T213P 0,94 0,91

: T213Q 1,12 1,02

: T213R 1,05 1,05

: T213S 1,10 1,08

: T213V 1,35 0,76

: T213W 1,17 0,68

: K216A 0,66 0,24

: K216E 1,03 1,30

: K216G 0,83 1,20

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K216H 0,90 1,28

: K216M 0,97 1,39

: K216P 0,91 0,97

: K216Q 1,04 1,34

: K216R 0,77 1,32

: K216S 0,97 1,28

: K216T 0,99 1,22

: K216V 0,95 1,07

: K216W 1,00 1,13

: K216Y 0,79 1,31

: N217A 1,10 0,87

: N217C 0,81 0,78

: N217F 0,90 0,88

: N217G 0,95 0,90

: N217H 1,09 0,90

: N217I 1,08 0,76

: N217L 1,09 0,82

: N217M 0,97 0,80

: N217P 0,97 0,73

: N217Q 1,31 0,74

: N217R 1,19 0,87

: N217S 1,05 0,87

: N217T 1,01 0,87

: N217V 1,18 0,69

: N217W 0,99 0,80

: K220A 1,06 0,79

: K220C 1,05 0,75

: K220D 1,02 0,88

: K220E 1,12 0,88

: K220F 1,03 0,78

: K220G 1,10 0,84

: K220H 1,12 0,81

: K220I 1,13 0,81

: K220M 1,05 0,75

: K220N 1,17 0,80

: K220P 1,33 0,89

: K220Q 1,21 0,87

: K220R 1,26 0,83

: K220S 1,30 0,81

: K220V 1,21 0,82

: K220W 1,01 0,81

: K220Y 1,08 0,84

: W221A 0,88 1,54

: W221C 0,95 1,09

: W221D 0,84 1,31

: W221F 1,07 1,28

: W221I 1,33 1,23

: W221L 0,88 1,50

: W221M 1,16 1,35

: W221N 1,11 1,57

: W221R 0,93 1,29

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: W221S 1,34 1,40

: W221V 1,13 1,31

: W221Y 1,14 1,36

: N227A 1,01 1,02

: N227C 0,92 0,95

: N227D 1,01 1,06

: N227E 1,03 1,06

: N227F 0,72 0,81

: N227G 1,05 1,09

: N227H 0,95 1,13

: N227I 1,03 0,76

: N227K 1,00 1,13

: N227L 0,84 0,75

: N227M 0,84 0,87

: N227P 1,08 0,88

: N227Q 0,94 1,00

: N227R 0,89 1,03

: N227S 0,96 0,95

: N227T 1,06 0,96

: N227V 1,05 0,84

: N227W 1,07 0,81

: N227Y 1,01 0,85

: R232H 0,66 0,34

: R232K 0,52 0,47

: R232M 0,62 0,12

: R232Q 0,54 0,12

: R232S 0,59 0,16

: R232T 0,76 0,17

: R232V 0,70 0,15

: A235C 0,86 0,53

: A235D 0,70 0,98

: A235E 0,93 0,84

: A235F 1,01 0,68

: A235G 1,17 0,78

: A235H 0,80 1,01

: A235I 1,07 0,84

: A235K 0,93 1,14

: A235L 0,89 0,97

: A235M 0,99 0,91

: A235N 0,78 1,03

: A235P 0,97 0,48

: A235Q 1,01 0,89

: A235R 1,03 1,14

: A235S 0,92 1,00

: A235V 1,01 0,86

: A235W 0,98 0,60

: A235Y 0,91 0,93

: K237R 0,48 0,88

: H238N 0,21 0,83

: K240M 0,31 1,13

: K240Q 0,12 1,21

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K240R 0,27 1,41

: D246A 0,73 1,03

: D246E 1,18 1,03

: D246F 0,67 1,02

: D246G 0,61 1,09

: D246H 0,71 1,05

: D246I 0,75 0,85

: D246K 0,36 1,18

: D246L 0,81 0,91

: D246M 0,80 0,92

: D246N 0,68 0,97

: D246P 0,47 0,81

: D246Q 0,78 0,98

: D246R 0,24 1,31

: D246S 0,97 1,01

: D246T 0,83 1,14

: D246Y 0,90 0,96

: S249A 1,06 0,97

: S249C 0,93 0,74

: S249D 0,98 0,94

: S249E 1,27 0,92

: S249F 0,91 0,74

: S249G 0,91 0,94

: S249H 1,04 0,93

: S249K 1,15 1,02

: S249L 1,14 0,82

: S249M 0,95 0,77

: S249P 1,09 0,80

: S249Q 1,20 0,94

: S249R 1,07 1,03

: S249T 1,17 0,91

: S249V 1,01 0,74

: S249W 1,13 0,77

: S249Y 1,07 0,87

: Y250A 0,99 1,21

: Y250C 1,03 1,12

: Y250D 0,97 1,29

: Y250E 1,13 1,33

: Y250F 1,29 1,28

: Y250G 1,09 1,33

: Y250I 1,35 1,27

: Y250K 1,07 1,48

: Y250L 1,02 1,32

: Y250M 1,35 1,39

: Y250N 1,05 1,40

: Y250P 0,71 1,05

: Y250Q 1,01 1,54

: Y250R 0,99 1,55

: Y250S 1,02 1,41

: Y250W 0,99 1,35

: R252A 1,12 1,08

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: R252C 0,97 0,81

: R252D 0,89 0,86

: R252E 1,09 1,12

: R252F 1,01 0,89

: R252G 0,76 1,00

: R252I 1,07 0,97

: R252K 1,19 1,21

: R252L 1,32 0,96

: R252M 0,98 0,96

: R252N 1,15 0,97

: R252P 0,72 0,83

: R252Q 1,16 1,04

: R252S 1,04 1,01

: R252T 1,09 0,99

: R252V 1,01 0,94

: R252Y 1,14 0,86

: S253A 1,09 0,97

: S253D 1,07 1,04

: S253F 1,19 0,82

: S253G 1,18 0,92

: S253H 1,13 0,97

: S253I 1,13 0,84

: S253K 1,10 1,01

: S253L 1,09 0,79

: S253N 1,06 1,03

: S253P 0,95 0,90

: S253Q 1,13 0,93

: S253T 1,14 0,97

: S253V 1,15 0,90

: S253W 1,04 0,87

: S253Y 1,34 0,94

: Q254A 0,98 0,88

: Q254C 0,94 0,66

: Q254D 1,10 0,90

: Q254E 1,29 0,89

: Q254F 1,23 0,74

: Q254G 1,15 0,77

: Q254H 1,04 0,94

: Q254I 1,12 0,91

: Q254K 1,00 0,99

: Q254L 1,09 0,82

: Q254M 0,94 0,89

: Q254N 1,17 0,90

: Q254R 1,05 0,98

: Q254S 1,07 0,98

: Q254T 1,21 0,65

: Q254V 1,31 0,92

: Q254W 1,17 0,69

: Q254Y 1,03 0,87

: T255A 1,09 0,73

: T255C 0,89 0,78

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: T255E 1,09 0,64

: T255F 1,30 0,68

: T255G 1,15 0,73

: T255H 1,10 0,74

: T255I 1,18 0,70

: T255K 1,27 0,83

: T255L 0,97 0,73

: T255M 0,98 0,72

: T255N 0,83 0,76

: T255P 0,77 0,59

: T255R 1,12 0,85

: T255S 1,10 0,84

: T255V 1,17 0,70

: T255W 1,27 0,74

: T255Y 1,02 0,72

: K257A 1,08 0,67

: K257C 0,89 0,49

: K257D 1,16 0,75

: K257E 1,15 0,76

: K257F 1,03 0,92

: K257G 0,97 0,73

: K257H 1,12 0,69

: K257I 1,09 0,59

: K257L 1,26 0,74

: K257M 1,29 0,79

: K257N 1,16 0,83

: K257P 0,62 0,38

: K257Q 1,18 0,82

: K257R 1,03 0,89

: K257S 1,29 0,71

: K257T 1,04 0,77

: K257V 1,31 0,78

: K257W 0,99 0,72

: P258A 0,97 1,08

: P258C 1,17 0,85

: P258D 1,33 1,10

: P258E 0,95 1,05

: P258F 0,96 0,75

: P258G 1,30 1,02

: P258H 1,38 1,13

: P258I 1,27 0,25

: P258K 1,29 1,11

: P258L 1,08 0,61

: P258M 1,09 0,91

: P258N 1,07 1,01

: P258Q 1,31 1,13

: P258R 1,02 1,13

: P258S 1,12 1,08

: P258T 1,27 1,10

: P258V 1,29 0,80

: P258W 1,14 0,87

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: P258Y 1,16 1,08

: Y268A 0,86 1,39

: Y268C 0,47 1,10

: Y268D 0,59 1,44

: Y268E 0,55 1,47

: Y268F 1,28 1,07

: Y268G 1,03 1,21

: Y268H 0,87 1,24

: Y268K 0,78 1,90

: Y268L 0,72 1,10

: Y268M 0,97 1,15

: Y268N 0,69 1,51

: Y268P 0,78 1,41

: Y268Q 0,71 1,30

: Y268R 0,76 1,49

: Y268S 1,06 1,22

: Y268T 0,99 1,12

: Y268V 0,88 0,99

: Y268W 0,97 1,07

: K272R 0,90 0,86

: H274A 0,66 1,40

: H274C 0,65 0,68

: H274D 0,64 1,20

: H274E 0,86 1,14

: H274F 0,88 1,00

: H274G 0,56 1,36

: H274I 0,76 1,39

: H274K 0,85 1,60

: H274L 0,87 1,40

: H274N 0,67 1,50

: H274Q 0,84 1,47

: H274R 0,80 1,50

: H274S 0,67 1,28

: H274T 0,69 1,38

: H274W 1,26 0,79

: H274Y 1,05 1,07

: N275A 0,32 1,01

: N275C 0,22 0,68

: N275D 0,08 1,03

: N275G 0,18 1,00

: N275H 0,60 1,10

: N275I 0,15 0,87

: N275K 0,22 1,22

: N275L 0,20 1,02

: N275M 0,20 0,96

: N275Q 0,21 0,96

: N275R 0,28 1,04

: N275S 0,28 0,92

: N275T 0,19 0,79

: N275V 0,19 0,76

: N275W 0,05 0,76

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: N275Y 0,89 0,93

: T283A 1,06 0,97

: T283C 1,16 0,78

: T283D 0,92 1,03

: T283E 0,95 1,01

: T283G 0,97 1,01

: T283H 1,09 0,84

: T283I 1,10 0,72

: T283K 1,14 1,01

: T283L 1,07 0,76

: T283M 1,26 0,93

: T283N 1,29 0,96

: T283P 0,46 0,56

: T283R 0,82 1,08

: T283S 1,02 1,06

: T283V 1,23 0,81

: T283W 1,07 0,75

: T283Y 1,01 1,04

: S285A 0,93 0,80

: S285C 0,73 0,61

: S285D 0,91 1,09

: S285E 1,33 0,89

: S285F 1,18 1,02

: S285H 0,98 1,10

: S285I 0,84 0,52

: S285K 1,16 0,84

: S285L 0,85 0,54

: S285M 0,98 0,76

: S285Q 1,38 1,22

: S285R 0,84 0,96

: S285T 0,98 0,79

: S285V 0,70 0,63

: S285W 1,13 1,08

: S285Y 0,97 1,49

: N293A 1,02 0,93

: N293C 0,78 0,69

: N293D 1,08 0,89

: N293E 0,87 0,92

: N293F 0,89 0,70

: N293G 1,31 0,92

: N293H 1,12 1,05

: N293I 0,94 0,75

: N293K 1,42 1,41

: N293L 0,87 0,81

: N293M 0,95 1,07

: N293P 0,97 0,40

: N293Q 1,14 1,06

: N293R 0,86 1,37

: N293S 0,93 0,95

: N293T 1,10 1,12

: N293V 1,04 0,82

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: N293W 1,09 0,78

: N293Y 1,19 0,74

: K294A 0,83 0,92

: K294C 0,83 0,50

: K294D 0,82 0,57

: K294E 0,83 0,68

: K294F 0,69 0,59

: K294G 0,92 0,75

: K294H 0,84 0,90

: K294I 1,08 0,71

: K294L 0,80 0,92

: K294M 1,12 0,80

: K294N 0,97 0,83

: K294Q 0,88 0,87

: K294R 1,18 0,90

: K294S 0,95 0,83

: K294T 0,83 0,16

: K294V 0,89 0,73

: K294W 1,23 0,66

: K294Y 0,76 0,82

: T297C 0,86 0,53

: T297D 0,70 0,98

: T297E 0,93 0,84

: T297F 1,01 0,68

: T297G 1,17 0,78

: T297H 0,80 1,01

: T297I 1,07 0,84

: T297K 0,93 1,14

: T297L 0,89 0,97

: T297M 0,99 0,91

: T297N 0,78 1,03

: T297P 0,97 0,48

: T297Q 1,01 0,89

: T297R 1,03 1,14

: T297S 0,92 1,00

: T297V 1,01 0,86

: T297W 0,98 0,60

: T297Y 0,91 0,93

: K300A 0,99 0,79

: K300C 0,95 0,39

: K300D 0,91 0,61

: K300E 0,86 0,78

: K300F 0,74 0,63

: K300G 0,98 0,62

: K300H 1,04 0,83

: K300I 1,02 0,82

: K300L 0,91 0,73

: K300M 1,17 0,80

: K300N 1,02 0,80

: K300Q 0,90 0,86

: K300R 1,20 0,92

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K300S 0,93 0,80

: K300T 1,16 0,87

: K300V 1,15 0,84

: K300W 0,97 0,57

: S301A 1,10 0,89

: S301E 1,12 0,94

: S301F 1,44 0,68

: S301G 1,02 1,05

: S301H 1,12 0,87

: S301I 1,28 0,74

: S301K 1,08 1,05

: S301L 1,09 0,97

: S301M 1,09 0,87

: S301N 1,16 0,64

: S301P 1,21 0,61

: S301Q 1,18 0,95

: S301R 1,35 0,89

: S301T 1,23 0,85

: S301V 1,18 0,81

: S301W 1,27 0,75

: S301Y 1,10 0,80

: D306A 0,82 0,40

: D306C 0,74 0,30

: D306E 0,80 0,71

: D306F 0,71 0,10

: D306G 0,76 0,26

: D306H 0,84 0,35

: D306I 0,80 0,18

: D306K 0,77 0,41

: D306L 0,78 0,18

: D306N 1,15 0,89

: D306P 0,82 0,39

: D306Q 1,03 0,43

: D306R 0,82 0,27

: D306S 0,81 0,50

: D306T 0,88 0,29

: D306V 0,99 0,22

: D306Y 0,94 0,12

: T309C 1,15 0,59

: T309D 1,27 0,89

: T309E 0,95 0,91

: T309F 1,15 0,80

: T309G 1,17 1,00

: T309H 0,94 0,97

: T309I 1,17 0,82

: T309K 1,18 1,08

: T309L 1,15 0,95

: T309M 1,15 0,97

: T309N 1,20 0,99

: T309P 0,93 0,20

: T309Q 1,19 0,98

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: T309R 1,12 1,08

: T309S 1,00 1,04

: T309V 1,38 0,95

: T309W 1,08 0,77

: T309Y 1,11 0,94

: T312A 1,01 1,00

: T312C 0,99 0,70

: T312D 1,03 0,96

: T312E 1,15 0,95

: T312F 1,05 0,92

: T312G 1,18 1,07

: T312H 1,30 0,99

: T312K 0,83 0,25

: T312L 1,08 0,95

: T312M 0,98 0,91

: T312N 1,04 0,99

: T312P 0,74 0,85

: T312Q 1,05 0,94

: T312R 1,13 1,00

: T312S 1,29 0,99

: 1312V 1,40 0,87

: T312W 1,14 0,83

: T312Y 1,31 0,92

: N313A 1,01 0,93

: N313C 0,95 0,63

: N313D 0,95 0,51

: N313E 1,05 0,90

: N313F 1,06 0,64

: N313G 1,25 0,96

: N313H 1,25 0,94

: N313I 1,44 0,55

: N313K 1,12 0,85

: N313L 1,21 0,85

: N313M 1,02 0,89

: N313P 1,05 0,81

: N313Q 1,00 1,00

: N313R 1,19 1,13

: N313S 1,25 1,05

: N313V 1,28 0,74

: N313W 1,01 0,67

: N313Y 1,10 0,90

: K317A 0,98 0,94

: K317C 0,83 0,54

: K317D 0,82 0,86

: K317E 0,78 0,91

: K317F 0,92 0,84

: K317G 0,91 0,88

: K317L 1,10 0,86

: K317M 1,02 0,95

: K317N 1,03 0,92

: K317P 0,86 0,80

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K317Q 0,76 0,94

: K317R 0,78 0,89

: K317S 1,04 0,93

: K317T 0,94 0,88

: K317V 1,00 0,93

: K317W 1,08 0,83

: K317Y 1,05 0,93

: D318A 0,93 1,38

: D318E 0,90 1,09

: D318F 0,78 1,22

: D318G 0,91 1,39

: D318H 1,12 1,10

: D318I 0,75 1,40

: D318K 0,65 1,73

: D318L 1,00 1,31

: D318M 0,90 1,26

: D318N 0,92 1,19

: D318P 0,61 0,37

: D318Q 0,93 1,14

: D318R 0,71 1,54

: D318S 1,11 1,37

: D318T 1,40 1,32

: D318V 0,81 1,34

: D318W 0,90 1,07

: D318Y 1,10 1,33

: Q319A 1,02 1,13

: Q319C 0,73 1,38

: Q319D 0,85 1,31

: Q319E 0,98 1,20

: Q319F 0,87 1,11

: Q319G 1,14 1,03

: Q319H 0,94 1,28

: Q319I 0,94 1,32

: Q319K 1,10 1,52

: Q319L 0,95 1,11

: Q319M 0,90 1,09

: Q319N 0,91 1,12

: Q319P 1,13 0,57

: Q319R 1,18 1,44

: Q319S 0,91 1,12

: Q319T 0,98 1,10

: Q319V 1,07 1,08

: Q319W 1,05 1,08

: Q319Y 1,04 1,41

: P320A 1,02 0,96

: P320C 1,01 0,75

: P320D 0,74 0,91

: P320E 1,04 0,85

: P320F 0,76 0,77

: P320G 1,00 1,00

: P320H 1,00 1,18

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: P320I 0,86 0,80

: P320K 0,96 1,23

: P320L 0,87 0,83

: P320M 1,04 0,60

: P320Q 0,95 1,08

: P320R 0,79 1,25

: P320S 1,16 1,03

: P320T 1,11 1,28

: P320V 1,08 0,88

: P320W 0,90 1,03

: P320Y 1,05 1,03

: L338A 1,36 1,29

: L338C 1,24 0,67

: L338D 1,00 0,94

: L338E 0,87 0,65

: L338F 0,90 0,17

: L338G 1,38 1,34

: L338H 0,05 0,05

: L338I 1,12 1,32

: L338M 1,20 1,27

: L338P 1,11 1,23

: L338Q 0,96 0,61

: L338S 1,13 1,51

: L338T 1,42 1,05

: L338V 1,14 1,55

: L338W 0,98 0,14

: L338Y 1,15 0,11

: Q339A 1,08 1,13

: Q339C 0,88 0,79

: Q339D 0,93 0,11

: Q339E 1,07 0,84

: Q339F 0,86 0,55

: Q339G 1,17 1,21

: Q339H 1,03 1,04

: Q339K 1,26 1,13

: Q339L 1,12 0,70

: Q339M 0,93 0,81

: Q339P 1,02 1,24

: Q339R 0,81 0,35

: Q339S 1,02 1,02

: Q339T 1,35 1,01

: Q339V 1,23 0,76

: Q339Y 1,14 0,78

: S340A 1,23 1,43

: S340C 0,74 0,75

: S340D 0,97 1,63

: S340E 0,92 1,58

: S340F 0,83 0,82

: S340H 1,12 1,45

: S340I 1,07 1,07

: S340K 0,99 1,76

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: S340M 1,24 1,20

: S340N 1,10 1,75

: S340P 0,69 0,81

: S340Q 1,21 1,76

: S340T 1,21 1,14

: S340V 1,00 1,09

: S340Y 1,02 0,97

: D343A 0,96 0,35

: D343C 1,32 0,74

: D343E 1,00 1,07

: D343F 0,91 0,79

: D343H 0,98 1,02

: D343I 1,27 0,88

: D343L 0,95 1,08

: D343M 0,99 1,02

: D343N 1,05 0,88

: D343P 1,30 1,03

: D343Q 1,14 1,01

: D343R 1,25 1,03

: D343T 1,08 0,98

: D343W 1,00 0,64

: D343Y 1,29 0,82

: W345A 1,05 0,90

: W345C 0,97 0,43

: W345D 1,10 1,15

: W345E 1,06 1,24

: W345F 1,07 0,55

: W345H 1,15 1,10

: W345I 1,28 0,90

: W345L 1,07 0,99

: W345M 1,02 1,01

: W345N 1,07 1,10

: W345P 1,00 0,94

: W345Q 1,26 1,10

: W345S 1,01 1,12

: W345T 1,15 1,15

: W345V 1,16 1,02

: C363A 0,84 1,06

: C363D 0,87 1,74

: C363E 0,99 1,34

: C363F 0,83 1,03

: C363G 0,61 0,83

: C363H 0,78 0,76

: C363I 0,92 0,63

: C363L 0,73 0,89

: C363M 0,97 1,36

: C363N 0,92 1,86

: C363Q 0,88 1,78

: C363S 0,88 1,35

: C363T 1,15 0,18

: C363V 1,02 0,99

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: C363W 0,35 0,70

: C363Y 0,92 0,12

: Y366A 0,96 1,14

: Y366D 0,52 1,18

: Y366E 0,91 1,18

: Y366F 0,91 0,87

: Y366G 0,94 1,08

: Y366H 1,07 1,12

: Y366I 0,85 0,87

: Y366K 0,72 0,82

: Y366L 0,77 0,61

: Y366M 0,92 0,79

: Y366N 1,03 0,91

: Y366P 0,54 0,78

: Y366Q 1,03 1,49

: Y366R 0,96 0,96

: Y366S 1,07 1,02

: Y366T 1,01 0,91

: Y366V 1,04 0,94

: Y366W 1,11 0,99

: Y369E 0,98 0,87

: Y369F 1,03 0,79

: Y369G 0,86 0,33

: Y369H 0,89 0,78

: Y369I 1,33 0,91

: Y369K 1,07 0,80

: Y369M 1,06 1,02

: Y369P 0,49 0,20

: Y369Q 1,07 0,79

: Y369R 1,11 0,95

: Y369S 0,89 0,60

: Y369T 1,28 0,68

: Y369V 1,17 0,91

: Y369W 1,09 0,95

: Y370A 1,03 1,21

: Y370D 0,48 1,35

: Y370E 0,98 1,35

: Y370F 0,90 0,73

: Y370G 1,21 1,18

: Y370H 0,96 1,36

: Y370I 0,99 1,00

: Y370K 0,93 1,65

: Y370L 0,93 0,88

: Y370M 0,91 1,04

: Y370N 1,04 1,41

: Y370P 0,44 0,67

: Y370Q 0,87 1,51

: Y370S 1,06 1,50

: Y370T 1,07 1,10

: Y370V 1,05 1,13

: Y370W 0,94 0,91

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: Y375A 1,03 1,39

: Y375C 0,59 0,48

: Y375D 0,96 1,52

: Y375E 0,96 1,48

: Y375F 0,90 1,00

: Y375G 0,90 0,98

: Y375H 0,98 1,16

: Y375I 0,94 1,06

: Y375K 0,96 1,43

: Y375L 1,03 1,07

: Y375M 0,98 1,05

: Y375N 0,92 1,48

: Y375P 0,92 0,89

: Y375Q 0,92 1,56

: Y375R 0,77 1,61

: Y375S 0,92 1,29

: Y375T 1,25 1,04

: Y375W 0,98 0,88

: S379A 1,01 1,02

: S379C 0,60 0,44

: S379D 0,92 0,96

: S379E 0,99 1,01

: S379G 0,90 0,91

: S379I 0,80 0,70

: S379K 1,00 1,12

: S379L 0,84 0,56

: S379M 0,87 0,80

: S379N 1,03 0,98

: S379P 0,61 0,39

: S379Q 0,94 0,98

: S379R 0,96 1,01

: S379T 1,07 0,95

: S379V 0,90 0,75

: S379W 0,70 0,35

: S379Y 0,92 0,59

: K381A 0,85 0,78

: K381C 0,86 0,35

: K381D 0,87 0,65

: K381E 0,93 0,81

: K381F 0,96 0,20

: K381G 0,96 0,82

: K381H 1,13 0,73

: K381I 0,98 0,36

: K381L 0,95 0,38

: K381M 0,93 0,56

: K381N 0,87 0,68

: K381P 1,18 0,39

: K381Q 1,03 0,90

: K381R 1,20 0,95

: K381S 1,18 0,89

: K381T 1,01 0,60

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K381V 1,00 0,43

: K381W 0,90 0,22

: K381Y 0,87 0,63

: D385A 1,01 0,88

: D385E 0,89 1,05

: D385F 0,73 0,54

: D385G 1,05 0,88

: D385H 0,96 0,99

: D385K 1,00 1,06

: D385L 0,96 0,47

: D385N 0,91 0,96

: D385Q 1,02 1,01

: D385R 0,86 0,95

: D385S 1,10 1,00

: D385T 1,22 0,92

: D385V 0,85 0,43

: D385W 0,98 0,53

: P386A 0,90 0,80

: P386C 0,72 0,69

: P386D 0,85 0,94

: P386E 0,94 0,87

: P386F 0,72 0,66

: P386G 1,02 0,77

: P386H 0,89 0,93

: P386I 1,12 0,73

: P386K 1,22 0,87

: P386L 0,96 0,73

: P386M 0,94 0,70

: P386N 0,91 0,86

: P386Q 0,95 0,86

: P386S 0,83 0,82

: P386T 1,00 0,54

: P386V 1,11 0,79

: P386W 0,90 0,44

: P386Y 0,91 0,78

: R391A 0,58 0,22

: R391H 0,59 0,29

: R391K 0,88 0,59

: R391N 0,71 0,38

: R391Q 0,62 0,28

: R391T 0,67 0,25

: R392A 0,89 0,73

: R392C 0,74 0,66

: R392E 0,79 0,46

: R392F 1,03 0,43

: R392G 0,99 0,65

: R392H 0,86 0,96

: R392I 1,08 0,57

: R392K 1,10 1,09

: R392L 0,91 0,63

: R392M 1,07 0,72

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: R392N 0,89 0,90

: R392P 0,67 0,31

: R392Q 1,12 0,75

: R392S 1,00 0,73

: R392T 1,00 0,91

: R392V 0,89 0,48

: R392W 0,68 0,23

: R392Y 1,00 0,60

: D393A 0,98 0,77

: D393C 0,69 0,48

: D393E 0,92 0,81

: D393F 0,84 0,61

: D393G 1,08 0,75

: D393H 0,88 0,75

: D393K 1,09 0,80

: D393L 1,04 0,70

: D393Q 1,00 0,82

: D393R 0,88 0,64

: D393S 0,92 0,91

: D393T 1,12 0,90

: D393V 1,04 0,63

: D393W 0,95 0,66

: D393Y 1,01 0,66

: Y394A 0,91 0,86

: Y394D 0,98 0,84

: Y394E 0,92 1,03

: Y394F 1,07 0,98

: Y394G 1,13 0,85

: Y394H 1,04 0,99

: Y394I 1,11 0,95

: Y394K 1,09 1,07

: Y394L 1,22 1,11

: Y394M 0,74 0,23

: Y394N 1,00 1,01

: Y394Q 1,09 1,13

: Y394S 1,11 1,15

: Y394V 3,00 0,75

: Y394W 1,11 1,16

: H400A 1,24 0,89

: H400C 1,16 0,73

: H400D 1,05 0,82

: H400E 0,99 0,95

: H400F 1,01 0,94

: H400G 0,90 0,83

: H400I 1,04 0,91

: H400K 0,92 1,03

: H400L 0,90 0,88

: H400M 1,01 0,91

: H400N 1,26 0,92

: H400Q 0,96 0,94

: H400R 1,03 0,87

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: H400S 0,94 0,92

: H400T 0,95 0,88

: H400V 1,28 0,91

: H400W 1,17 0,80

: H400Y 1,15 0,92

: Y402A 1,07 0,97

: Y402C 0,92 0,76

: Y402D 0,90 0,80

: Y402E 1,09 0,77

: Y402F 0,89 0,82

: Y402G 0,92 0,81

: Y402H 1,21 0,91

: Y402I 1,36 0,75

: Y402K 0,95 0,84

: Y402L 1,09 0,49

: Y402M 1,14 0,88

: Y402N 1,06 0,86

: Y402P 1,03 0,28

: Y402Q 0,98 0,83

: Y402R 1,16 0,75

: Y402T 1,32 1,02

: Y402V 1,40 0,95

: Y402W 1,24 0,89

: L403A 1,20 0,89

: L403C 1,10 0,98

: L403D 1,03 0,95

: L403E 1,26 0,93

: L403F 1,03 0,74

: L403G 1,22 0,96

: L403H 1,10 0,90

: L403M 1,11 0,99

: L403N 0,98 0,95

: L403P 0,78 0,47

: L403Q 1,24 0,98

: L403R 1,36 1,01

: L403S 1,17 1,00

: L403T 1,53 0,99

: L403V 1,34 1,00

: L403W 1,15 0,85

: L403Y 1,16 0,97

: D404A 1,12 0,73

: D404C 1,28 0,61

: D404E 1,38 0,78

: D404G 1,25 0,77

: D404I 1,20 0,84

: D404K 1,10 0,83

: D404L 1,09 0,91

: D404M 1,13 0,76

: D404N 1,13 0,98

: D404P 1,05 0,56

: D404Q 1,17 0,91

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: D404R 1,15 0,77

: D404S 1,19 0,99

: D404V 1,28 0,79

: D404W 1,05 0,76

: D404Y 1,08 0,81

: S406A 0,99 0,99

: S406C 1,11 0,85

: S406D 0,93 1,02

: S406E 0,95 0,91

: S406F 0,86 0,88

: S406G 0,93 0,86

: S406H 0,88 0,98

: S406I 0,92 0,91

: S406K 0,95 0,82

: S406L 0,94 0,98

: S406M 0,89 0,90

: S406N 1,09 0,94

: S406P 0,91 0,93

: S406T 1,18 0,97

: S406V 1,14 0,87

: S406Y 0,99 0,80

: D407C 1,14 0,41

: D407E 0,82 0,59

: D407F 0,88 0,35

: D407G 1,10 0,38

: D407H 0,85 0,63

: D407I 1,05 0,22

: D407K 1,00 0,44

: D407L 0,91 0,18

: D407M 1,05 0,37

: D407N 1,11 0,96

: D407Q 0,94 0,53

: D407R 0,78 0,36

: D407S 0,93 0,65

: D407T 1,06 0,49

: D407V 0,93 0,29

: D407W 1,06 0,20

: D407Y 0,85 0,38

: G410A 0,90 1,00

: G410C 1,04 0,81

: G410F 0,96 0,22

: G410H 0,93 0,34

: G410M 1,13 0,35

: G410N 0,99 0,27

: G410Q 1,05 0,14

: G410R 0,98 0,27

: G410T 1,08 0,70

: G410V 1,10 0,42

: G410Y 0,92 0,49

: R413A 1,02 1,06

: R413D 0,71 0,40

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: R413E 0,86 0,67

: R413G 1,19 0,33

: R413H 1,06 0,95

: R413I 0,96 0,75

: R413K 1,08 0,95

: R413L 1,02 0,96

: R413M 0,81 0,81

: R413N 0,93 0,72

: R413Q 0,81 0,35

: R413S 0,85 0,87

: R413V 0,93 0,73

: R413W 0,92 0,41

: R413Y 0,73 0,49

: E414A 1,06 0,70

: E414C 1,05 0,55

: E414D 1,13 0,75

: E414F 0,81 0,59

: E414G 0,82 0,68

: E414H 0,89 0,65

: E414I 0,98 0,60

: E414K 0,96 0,65

: E414L 1,16 0,71

: E414M 0,88 0,72

: E414N 0,99 0,57

: E414P 0,85 0,60

: E414Q 0,85 0,70

: E414R 1,00 0,65

: E414S 0,91 0,63

: E414T 0,79 0,67

: E414W 1,03 0,25

: E414Y 0,78 0,58

: V416A 0,93 0,67

: V416C 0,94 0,61

: V416D 1,05 0,71

: V416H 0,92 0,78

: V416I 0,83 0,74

: V416K 0,71 0,65

: V416L 0,96 0,81

: V416M 1,06 0,78

: V416N 0,92 0,66

: V416P 1,18 0,53

: V416Q 1,02 0,74

: V416R 1,02 0,29

: V416S 1,15 0,46

: V416T 1,01 0,65

: V416W 0,83 0,55

: V416Y 0,89 0,69

: K419A 1,36 1,29

: K419C 1,24 0,67

: K419D 1,00 0,94

: K419E 0,87 0,65

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K419F 0,90 0,17

: K419H 0,05 0,05

: K419I 1,12 1,32

: K419M 1,20 1,27

: K419P 1,11 1,23

: K419Q 0,96 0,61

: K419S 1,13 1,51

: K419T 1,42 1,05

: K419V 1,14 1,55

: K419W 0,98 0,14

: K419Y 1,15 0,11

: S422A 0,64 0,97

: S422C 0,96 0,71

: S422D 0,97 0,96

: S422E 1,31 0,78

: S422F 0,96 0,71

: S422G 1,20 0,99

: S422H 1,06 0,66

: S422I 1,11 0,85

: S422K 1,16 0,96

: S422L 0,99 0,74

: S422M 1,04 0,94

: S422N 1,12 1,03

: S422P 0,84 0,70

: S422Q 0,15 0,82

: S422R 1,02 0,94

: S422T 0,97 0,92

: S422V 1,17 0,88

: S422W 0,96 0,70

: S422Y 1,09 0,92

: L427A 0,93 0,66

: L427C 1,02 0,68

: LA27E 0,86 0,27

: L427F 0,89 0,30

: L427G 0,63 0,26

: L427I 1,08 0,64

: L427M 0,86 0,79

: L427N 0,76 0,31

: L427P 1,13 0,06

: L427Q 0,95 0,53

: L427S 0,78 0,27

: L427T 0,80 0,70

: L427V 0,82 0,72

: G433A 1,27 1,08

: G433C 1,15 0,69

: G433D 1,05 0,96

: G433E 0,92 0,99

: G433F 1,04 0,92

: G433H 1,27 0,99

: G433I 1,37 0,86

: G433K 1,27 1,05

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: G433L 1,30 0,90

: G433M 1,23 1,01

: G433N 1,07 0,75

: G433P 1,13 0,95

: G433Q 0,78 0,99

: G433R 1,00 0,91

: G433S 1,17 0,96

: G433T 1,17 0,90

: G433V 1,27 0,95

: G433Y 1,26 1,01

: K436A 0,92 0,94

: K436C 0,90 0,84

: K436D 0,86 0,93

: K436E 0,70 0,87

: K436F 0,81 0,64

: K436G 0,84 0,77

: K436H 1,09 0,89

: K436I 1,08 0,81

: K436L 1,01 0,78

: K436M 0,76 0,85

: K436N 0,98 0,92

: K436P 0,88 0,71

: K436Q 1,01 0,96

: K436R 1,06 0,79

: K436S 0,75 0,92

: K436T 0,95 0,90

: K436V 0,98 0,87

: K436W 1,07 0,71

: K436Y 0,99 0,80

: Y439A 1,02 0,78

: Y439D 1,01 0,85

: Y439F 0,77 0,78

: Y439G 1,01 0,77

: Y439H 0,96 0,73

: Y439K 0,96 0,74

: Y439M 1,04 0,77

: Y439N 0,96 0,83

: Y439P 0,87 0,85

: Y439Q 0,90 0,88

: Y439R 0,75 0,80

: Y439S 0,94 0,82

: Y439T 0,84 0,79

: Y439V 1,04 0,70

: Y439W 0,86 0,72

: K442A 1,38 0,98

: K442F 1,04 0,97

: K442G 1,23 1,02

: K442H 1,07 1,04

: K442I 1,13 0,93

: K442N 1,39 1,03

: K442P 1,11 1,03

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: K442Q 1,11 1,05

: K442R 1,33 1,01

: K442S 1,24 1,07

: K442T 1,34 1,06

: K442V 1,20 0,99

: K442W 1,32 0,98

: K442Y 1,24 1,08

: A445C 0,98 0,83

: A445D 1,04 0,87

: A445G 1,21 1,01

: A445H 0,90 0,93

: A445I 1,25 0,84

: A445K 1,20 0,11

: A445L 1,17 0,92

: A445N 1,20 0,91

: A445P 0,91 0,77

: A445R 0,91 0,89

: A445S 1,16 0,94

: A445T 1,29 0,88

: A445V 1,27 0,93

: A445W 1,25 0,80

: K447A 1,09 1,06

: K447C 1,11 0,87

: K447D 1,00 0,99

: K447F 1,09 0,84

: K447G 1,06 0,94

: K447H 1,13 0,92

: K447I 1,22 0,91

: K447L 1,06 1,01

: K447M 1,07 0,96

: K447N 1,43 0,97

: K447Q 1,34 1,00

: K447R 1,10 0,96

: K447S 0,90 0,92

: K447T 1,21 0,37

: K447V 0,69 0,86

: K447W 1,31 0,89

: K447Y 1,21 0,96

: V448A 0,98 0,96

: V448C 1,36 0,98

: V448D 1,15 1,02

: V448F 1,48 1,01

: V448G 1,26 1,05

: V448H 1,37 1,03

: V448I 1,44 0,97

: V448K 1,20 1,07

: V448L 1,04 1,08

: V448M 1,13 0,97

: V448N 1,24 0,70

: V448P 0,84 1,19

: V448Q 1,18 1,16

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: V448S 1,20 1,10

: V448W 1,08 0,89

: V448Y 1,33 1,27

: Y450A 0,95 0,94

: Y450C 1,22 0,84

: Y450D 1,19 0,95

: Y450E 1,01 0,92

: Y450G 1,02 0,93

: Y450H 1,23 0,90

: Y450K 1,18 0,94

: Y450L 0,93 0,69

: Y450M 1,29 0,89

: Y450N 1,23 0,96

: Y450P 0,75 0,30

: Y450Q 1,00 0,95

: Y450R 1,22 1,02

: Y450S 1,22 1,01

: Y450T 1,32 0,96

: Y450W 1,21 0,95

: LA52A 1,08 1,06

: L452C 1,00 1,01

: L452D 0,98 1,08

: L452E 0,75 0,55

: LA52F 0,79 0,93

: L452G 1,07 1,00

: L452H 1,05 0,99

: L452K 1,11 1,08

: L452M 1,13 1,09

: L452N 1,06 1,28

: L452P 1,02 0,78

: LA52Q 0,92 1,22

: L452R 0,93 1,26

: L452S 0,86 1,21

: L452T 1,02 1,18

: L452V 1,14 1,14

: L452Y 1,17 1,07

: N455A 1,07 1,04

: N455C 0,85 0,89

: N455D 1,07 0,97

: N455E 1,14 0,94

: N455G 1,23 1,00

: N455H 1,05 1,01

: N455I 1,23 0,95

: N455K 1,10 1,08

: N455L 1,06 0,97

: N455M 0,95 0,96

: N455P 1,36 0,93

: N455Q 0,96 0,91

: N455R 1,13 1,02

: N455S 1,04 0,91

: N455T 1,16 0,90

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: N455V 1,26 0,89

: N455W 1,12 0,76

: N455Y 1,08 0,15

: N463A 1,25 1,06

: N463D 0,97 1,02

: N463F 1,04 0,87

: N463G 1,04 1,00

: N463H 1,12 0,99

: N463K 1,07 1,00

: N463L 1,16 1,01

: N463M 1,24 1,08

: N463P 0,93 1,05

: N463Q 0,98 1,04

: N463R 0,95 0,93

: N463S 1,27 0,96

: N463T 1,38 0,91

: N463V 1,32 0,86

: N463W 1,45 0,74

: N463Y 1,20 0,90

: D465A 0,76 1,06

: D465C 0,84 0,74

: D465E 0,95 0,93

: D465F 0,78 0,89

: D465G 1,35 0,92

: D465H 1,06 0,92

: D465I 1,37 0,85

: D465K 1,53 0,88

: D465L 1,14 0,95

: D465M 1,06 0,98

: D465N 1,32 0,93

: D465P 1,13 0,71

: D465Q 0,86 0,94

: D465R 1,18 0,90

: D465S 0,87 0,98

: D465T 1,42 0,92

: D465V 1,24 0,93

: D465W 1,00 0,83

: D465Y 1,06 0,93

: E469A 1,16 1,01

: E469C 1,03 0,86

: E469D 1,22 1,02

: E469F 1,11 1,00

: E469G 1,19 1,00

: E469H 1,04 0,96

: E469K 1,16 0,96

: E469L 1,10 0,98

: E469N 1,19 0,47

: E469P 0,85 1,05

: E469Q 1,03 1,04

: E469R 1,01 0,75

: E469S 0,91 1,08

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: E469T 1,15 1,06

: E469V 1,15 1,08

: E469W 1,24 0,97

: E469Y 1,35 1,09

: K471A 1,09 1,09

: K471C 1,04 0,91

: K471D 1,01 1,06

: K471F 1,10 1,05

: K471G 1,13 1,12

: K471H 1,00 1,10

: K471I 1,22 1,02

: K471L 0,99 1,07

: K471M 0,95 1,14

: K471N 1,04 1,12

: K471P 0,84 0,98

: K471Q 0,90 1,08

: K471R 0,77 1,33

: K471S 0,97 1,01

: K471T 1,11 1,09

: K471V 1,28 1,11

: K471Y 1,15 1,36

: N473A 1,03 0,99

: N473C 1,15 0,74

: N473D 1,14 0,98

: N473E 1,20 0,99

: N473F 1,10 0,83

: N473G 1,35 0,99

: N473H 1,02 0,91

: N4731 0,66 0,45

: N473K 1,02 1,02

: N473M 1,11 1,00

: N473P 1,01 0,95

: N473Q 1,13 0,99

: N473R 1,08 1,05

: N473S 1,15 0,98

: N473T 1,04 1,04

: N473W 0,85 0,64

: N473Y 1,23 0,86

: S476A 1,51 1,02

: S476C 0,91 0,89

: S476D 0,98 0,91

: S476E 1,08 0,91

: S476F 1,09 0,87

: S476G 1,22 0,97

: S476H 1,07 0,96

: S476I 1,03 0,78

: S476K 1,01 0,97

: S476L 1,46 0,93

: S476M 1,58 1,08

: S476N 1,61 0,98

: S476P 1,02 0,62

POS: variante PI de la estabilidad PI de la actividad

: S476Q 1,13 1,03

: S476R 1,01 1,08

: S476T 1,78 1,01

: S476V 1,21 0,89

: S476W 1,43 0,78

: S476Y 1,79 0,94

Ejemplo 27. Posiciones restrictivas frente a no restrictivas

[0394] Basándose en los datos de rendimiento relativo y estabilidad de las posiciones de AmyS descritas en el Ejemplo 26, las posiciones de AmyS se clasificaron como “restrictivas” frete a “no restrictivas” como sigue: Las posiciones no restrictivas tienen ≥ 20 % de mutaciones neutras para al menos una propiedad; y las posiciones 5 restrictivas tienen < 20 % de mutaciones neutras para actividad y estabilidad. Las posiciones no restrictivas son buenas candidatas para la mutación para diseñar α-amilasas con función mejorada debido a que un gran número de mutaciones tienen un rendimiento o tolerado (para mantener un rendimiento cercano al de la enzima natural) o mejorado. Las posiciones restrictivas no son buenas candidatas para la mutación puesto que generalmente no toleran las mutaciones. Se pueden mejorar las propiedades de cualquier amilasa combinando mutaciones en 10 posiciones no restrictivas. La Tabla 27-1 muestra las dos posiciones restrictivas identificadas en AmyS (% = porcentaje de variantes evaluadas que cumplieron con la definición de mutación neutra). La Tabla 27-2 muestra las 150 posiciones no restrictivas identificadas en AmyS (% = porcentaje de variantes evaluadas que cumplieron con la definición de mutación neutra; ≥ 20 % de mutaciones neutras para al menos una propiedad). Se espera que las posiciones restrictivas y no restrictivas se conserven entre las diferentes α-amilasas. 15

Tabla 27-1. Posiciones restrictivas en AmyS

Posición: Aminoácido natural % del PI de la estabilidad >0,5 % del PI de la actividad >0,5

: H 18 % 0 %

: L 13 % 0 %

Tabla 27-2. Posiciones no restrictivas en AmyS

: N 100 % 6 %

: G 100 % 100 %

: E 11 % 89 %

: W 100 % 84 %

: Y 100 % 100 %

: L 94 % 100 %

: D 100 % 100 %

: G 95 % 16 %

: K 100 % 100 %

: A 100 % 89 %

: E 100 % 53 %

: L 100 % 74 %

: T 100 % 80 %

: T 95 % 74 %

: R 94 % 94 %

: s 100 % 100 %

: D 11 % 79 %

: E 94 % 81 %

: K 95 % 100 %

: T 83 % 100 %

: R 100 % 100 %

: K 24 % 94 %

: T 100 % 100 %

: K 100 % 94 %

: Q 100 % 94 %

: L 100 % 100 %

: A 100 % 95 %

: H 94 % 56 %

: K 21 % 95 %

: D 74 % 95 %

: T 100 % 100 %

: E 50 % 94 %

: E 17 % 100 %

: V 6 % 94 %

: R 6 % 88 %

: Q 29 % 88 %

: S 13 % 94 %

: T 53 % 100 %

: Q 94 % 94 %

: A 39 % 72 %

: W 100 % 88 %

: K 100 % 100 %

: D 93 % 80 %

: R 95 % 0 %

: N 100 % 93 %

: T 100 % 88 %

: Y 100 % 100 %

: S 94 % 47 %

: K 100 % 100 %

: H 89 % 78 %

: D 47 % 11 %

: E 89 % 84 %

: L 94 % 100 %

: S 100 % 67 %

: K 6 % 100 %

: E 6 % 100 %

: T 24 % 100 %

: E 6 % 88 %

: N 53 % 100 %

: Y 18 % 100 %

Ejemplo 28. Reducción de la viscosidad de las variantes de AmyS

[0395] Se monitorizó la reducción de la viscosidad de diferentes lotes de harina de maíz (saco A, C, E, G) de las variantes de AmyS como se describe en el Ejemplo 6 y se comparó con la reducción de la viscosidad de SPEZYME® Xtra (Genencor). Los resultados se muestran en la Figura 32A y en la Tabla 28-1. Se pueden 5 identificar variantes de AmyS mejoradas en el ensayo de viscosímetro mediante un número de criterios: viscosidad pico disminuida, viscosidad final disminuida, o una dosis de enzima disminuida requerida para producir viscosidades pico o finales similares en relación con la dosis requerida para la enzima natural. En la Tabla 28-1 se muestran en negrita las propiedades mejoradas de las variantes de AmyS.

Tabla 28-1; Reducción de la viscosidad de la harina de maíz de las variantes AmyS en comparación con Xtra


: dosis (ug) viscosidad pico viscosidad final

saco de harina de maíz A: Xtra (UFC) 30,0

: I181A 27,5

: I181P 27,5


: dosis (us) viscosidad pico viscosidad final

saco de harina de maíz C: Xtra 30,0

: I181C 30,0

: I181E 30,0

: I181Y 30,0

: S242A 30,0

: S242Q 30,0


: dosis (ug) viscosidad pico viscosidad final

saco de harina de maíz E: Xtra 15,0

: S242A 15,0

: S242E 15,0

: S242Q 15,0


: dosis (ug) viscosidad pico viscosidad final

saco de harina de maíz G: Xtra 20,0

: S242Q 20,0

: G132A 20,0

: N193Y 20,0

: E188P 20,0

Ejemplo 29. Reducción de la viscosidad de las variantes de AmyS en presencia de fitasa

[0396] La reducción de la viscosidad de la harina de maíz de la AmyS N193Y se monitorizó con y sin la adición de Fitasa BP111 como se describe en el Ejemplo 6 con las siguientes modificaciones. El efecto de la reducción de la viscosidad se midió con pH 5.2, pH 5.5 y 5.8. Los resultados se muestran en la Figura 32B y C. La adición 5 de Fitasa (BP111) a la AmyS N193Y aporta mejoras significativas a la capacidad de la variante para reducir la viscosidad en el Viscosímetro.

[0397] Aunque la invención se ha descrito en relación con los modos de realización preferidos específicos, debería entenderse que la invención como se reivindica no debería limitarse indebidamente a dichos modos de realización específicos. De hecho, se pretende que varias modificaciones de los modos descritos para llevar a 10 cabo la invención, que son obvias para los expertos en la materia, estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

Reivindicaciones

1. Una variante de polipéptido que tiene actividad de α-amilasa en la que la variante de polipéptido tiene al menos una característica alterada que mejora el rendimiento de la enzima, comprendiendo la variante de polipéptido:

una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con 5 respecto a un polipéptido de α-amilasa parental seleccionado de entre AmyS que tienen la secuencia de SEQ ID Nº: 1 o una variante truncada de AmyS que tiene la secuencia de SEQ ID Nº 2, y

que tiene al menos la siguiente mutación en un residuo de aminoácido correspondiente al del polipéptido de α-amilasa parental como se determina alineando las variantes de polipéptidos con el polipéptido parental, donde la mutación cambia el residuo de aminoácido a partir del de los polipéptidos parentales, 10 y

donde la mutación es una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en 188P y 188D.
2. Variante según la reivindicación 1, en la que la sustitución es 188P y la variante ha mejorado la termoestabilidad en comparación con el polipéptido parental. 15
3. Variante según la reivindicación 1, en la que la sustitución es 188D y la variante presenta actividad o expresión aumentada en comparación con el polipéptido parental.
4. Variante según la reivindicación 1, en la que la sustitución es E188P y la variante presenta reducción aumentada de la viscosidad en un ensayo de licuefacción de almidón en comparación con el polipéptido parental.
5. Variante según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, en la que la mutación está presente en 20 combinación con glutamina en la posición 242, o en la que la mutación está presente en combinación con una deleción en las posiciones 179 y 180.
6. Variante según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, en la que el polipéptido parental incluye un truncamiento de los 29 residuos de aminoácidos en la posición C-terminal.
7. Variante según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4, en la que la sustitución es E188P. 25
8. Composición de limpieza que comprende el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7.
9. Composición de licuefacción de almidón que comprende los polipéptidos según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7.
10. Método para hidrolizar un sustrato de almidón soluble utilizando una variante de α-amilasa, que comprende la puesta en contacto del sustrato de almidón con una variante de α-amilasa según cualquiera de las 30 reivindicaciones de la 1 a la 7.
11. Método según la reivindicación 10, en el que la variante incluye una sustitución que introduce uno o varios de los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo consistente en I181A, I181P, I181C, I181E, I181Y, S242A, S242E, S242Q, G132A, y N193Y.
12. Método según la reivindicación 10 u 11, que comprende además la puesta en contacto del sustrato de 35 almidón con una fitasa antes de la puesta en contacto con la variante de α-amilasa o de forma simultánea.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 12, en el que el sustrato de almidón hidrolizado se fermenta en etanol.
14. Método para la producción de edulcorante, comprendiendo el método la puesta en contacto de un sustrato de almidón con una variante de α-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7. 40
15. Utilización de una variante de α-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7 en:

(i) el desaprestado de textiles, tejidos y prendas; o

(ii) en la producción de pulpa de celulosa y papel.

Dibujos

Figura 1

Figura 1 (cont.)

Figura 1 (cont.)

Figura 1 (cont.)

Figura 3

% de actividad residual media de S242

alfa amilasa madura

Figura 2

Figura 4A

Figura 4B

Figura 4C

Figura 4D

Figura 4E

Figura 4F

Figura 4G

Figura 4H

Figura 4I

S242Q p/Ca2+

S242A p/Ca2+

Xtra p/Ca2+

Temperatura (°C)

Temperatura (°C)

Figura 6

Figura 5

Perfil de actividad (15 % almidón, 70-85C ramp)

% Relativo a S242Q

% Relativo a Liq SC

Perfil de actividad (15 % almidón, 70-85C ramp)

Figura 7

Figura 8

Figura 9

Figura 10

t en s

M en µNm

Tiempo (Minutos post-jet)

Progresión de DE 32 % suspensión de maíz molido entero vinaza como 30 % de diluyente pretratamiento 158-185 °F, 10 min. chorro grande @ 225 °F 3 min. tiempo de retención secundario 185 °F durante 90 min.

Figura 11

Figura 12

Tiempo (Minutos post-jet)

Viscosidad 32 % suspensión de maíz molido entero vinaza como 30 % de diluyente pretratamiento 158-185 °F, 10 min. chorro grande @ 225 °F 3 min. tiempo de retención secundario 185 °F durante 90 min.

Figura 13

Tiempo de incubación, min a 90C

Figura 14

Viscosidad (cP)

Tiempo de incubación, min a 90C

Figura 15

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Figura 16

Tiempo de incubación, min a 90C

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Fitasa

Viscosidad (cP)

Tiempo de incubación, min a 90C

Figura 17

Figura 18

Tiempo de incubación, min a 90C

Figura 19

Tiempo de incubación, min a 90C

Viscosidad (cP)

Proceso convencional - pH 5.8 (Licuado A)

Figura 20

DDGS, % ds

Sulfato

Sin fosfato

% IP 6

Ácido fítico

almidón

Producción de alcohol Galón/Bushel

1,92 mg/gds

0,23 mg/gds

1,20

1,33

0,6

0,2

9,28

7,25

2,69

2,70

Sin proceso de ajuste de pH, pH 5.2 3+1 AAU (dosis fraccionada), 4 FTU BP-17, con jet cooking, 225 °F (Licuado B)

Condiciones de licuefacción

índice de progresión de DE a 90C

Figura 21

% de reducción de ácido fítico como IP6

índice de progresión de DE a 90C

% de reducción de ácido fítico como IP6

Tiempo de incubación, min a 85 C

Figura 22

Cambio de carga

Figura 23

Original

Variantes

blanco

Variantes

Original

blanco

Cambio de carga

Figura 24

Actividad específica relativa (almidón con BODIPY)

Original

Variantes

Cambio de carga

Figura 25

Figura 26

Actividad de hidrólisis de almidón con BODIPY específica relativa

Limpieza de micromuestra de almidón de maíz relativa

Expresión en tubo de agitación relativa

Expresión en tubo de agitación relativa

Original (AmyS-S242Q)

Variantes

Original

Figura 27

Actividad específica relativa (almidón con BODIPY)

Título de enzima relativa

Cambio de carga

Cambio de carga

Variantes

Título de enzima relativa

A488 - blanco

Variantes

Original

Cambio de carga

Cambio de carga

Figura 28

Actividad de fracción restante

Viscosidad final [µNm]

Figura 30

Cambio de carga

Carga neta en relación con AmyS natural

Figura 29

Actividad de micromuestra de almidón de arroz

pKa aparente

Cambio de carga

Figura 31

Cambio de carga

Figura 32

t en s

M en µNm

Viscosidad pico y final (torsión Nm)

Viscosidad pico o final (torsión Nm)

N193Y sola

dosis de N193Y (ug)

pico

pico

Reducción de la viscosidad de N193Y con BP111

fitasa (FTU) & AA (ug)

Figura 32 (cont.)