ES2527997T3 - Modificación del ADN inducida por el efector TAL - Google Patents

Abstract

Un método para modificar el material genético de una célula, que comprende: (a) proporcionar una célula que contiene una secuencia de ADN diana; y (b) introducir en la célula un vector que codifica una endonucleasa de efector de tipo activador de la transcripción (TAL), comprendiendo la endonucleasa de efector TAL: (i) un dominio de endonucleasa que puede romper un ADN de cadena doble, donde el dominio de endonucleasa procede de una endonucleasa de restricción de tipo II, y (ii) un dominio de efector TAL que comprende una pluralidad de secuencias de repetición de efector TAL que, combinadas, se unen a una secuencia de nucleótidos específica de la secuencia de ADN diana, de tal modo que la endonucleasa de efector TAL rompe la secuencia de ADN diana dentro de, o adyacente a, la secuencia de nucleótidos específica de la célula o de su progenie.

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DESCRIPCIÓN

Modificación del ADN inducida por el efector TAL

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos de modificación genética dirigida (del inglés “gene targeting”), y particularmente a métodos que incluyen el uso de secuencias efectoras de tipo activador de transcripción (TAL, del inglés “transcription activator-like”).

Antecedentes

La capacidad para modificar cromosomas mediante recombinación homóloga (modificación genética dirigida) ha sido una meta largo tiempo perseguida por los biólogos. Por ejemplo, en plantas, los métodos de modificación genética dirigida pueden ayudar a discernir la función de genes vegetales, abriendo nuevas posibilidades para la mejora de cultivos. Por ejemplo, con los métodos de modificación genética dirigida es posible llevar a cabo la cirugía genética requerida para reosquestar rutas metabólicas para crear cultivos de alto valor, que incluyen semillas con perfiles alterados de aceites o carbohidratos, alimentos con cualidades nutricionales mejoradas, o plantas con resistencia incrementada frente a enfermedades y estrés. En animales (p.ej. mamíferos), la modificación genética dirigida puede usarse para el tratamiento de una enfermedad. Por ejemplo, la modificación genética dirigida puede usarse para diseñar correcciones en genes que sean defectuosos debido a diversos tipos de mutaciones. Ha sido difícil alcanzar métodos eficientes para dicha modificación génica dirigida.

Sumario

Los efectores TAL de bacterias patógenas vegetales del género Xanthomonas desempeñan funciones importantes en la enfermedad, o en la activación de defensas, uniéndose a ADN hospedante y activando genes hospedantes específicos de efector (véase, p.ej., Gu et al. (2005) Nature 435: 1122; Yang et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

103: 10503; Kay et al. (2007) Science 318: 648; Sugio et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 10720; y Römer et al. (2007) Science 318: 645). La especificidad depende de un número variable con el efector de repeticiones de aminoácidos imperfectas, normalmente 34 (Schornack et al. (2006) J. Plant Physiol. 163: 256). Existen polimorfismos principalmente en las posiciones de repetición 12 y 13, que en la presente memoria se denominan diresiduo-variable de repetición (RVD, del inglés “repeat variable-diresidue”).

La presente invención se basa en parte en el hecho de que los RVDs de efectores TAL se corresponden con los nucleótidos de sus sitios diana de un modo directo y lineal, un RVD por nucleótido, con alguna degeneración y sin dependencia de contexto aparente. Este sorprendente descubrimiento representa un nuevo mecanismo para el reconocimiento proteína-ADN que permite la predicción de sitios diana para nuevos efectores TAL específicos de diana. Tal como se describe en la presente memoria, estas proteínas pueden ser útiles en investigación y biotecnología como nucleasas quiméricas dirigidas que pueden facilitar la recombinación homóloga en modificaciones genómicas (p.ej., para añadir o potenciar rasgos útiles para biocombustibles o productos biorrenovables en plantas). Dichas proteínas también podrían ser útiles, por ejemplo, como factores de transcripción, y especialmente para aplicaciones terapéuticas que requieran un nivel muy elevado de especificidad, tal como los agentes terapéuticos contra patógenos (p.ej. virus), como ejemplos no limitativos.

En un aspecto, la presente descripción presenta un método para modificar el material genético de una célula, que comprende (a) proporcionar una célula que contiene una secuencia de ADN diana; y (b) introducir una enzima modificadora de ADN-efector de tipo de activador de transcripción (TAL) en la célula, comprendiendo dicha enzima modificadora de ADN-efector TAL (i) un dominio enzimático modificador de ADN que pueda modificar ADN de cadena doble, y (ii) un dominio de efector TAL que comprenda una pluralidad de secuencias de repetición de efector TAL que, combinadas, se unan a una secuencia de nucleótidos específica de la secuencia de ADN diana, de tal modo que la enzima modificadora de ADN-efector TAL modifique el ADN diana en, o adyacente a, la secuencia de nucleótidos específica de la célula o de su progenie. El método puede comprender además proporcionar a la célula un ácido nucleico que comprende una secuencia homóloga a al menos una porción de la secuencia de ADN diana, de tal modo que se produzca la recombinación homóloga entre la secuencia de ADN diana y el ácido nucleico. La célula puede ser una célula eucariótica, una célula de mamífero, una célula vegetal o una célula procariótica. El ADN diana puede ser ADN cromosomal. La introducción puede comprender transfectar la célula con un vector que codifica la enzima modificadora de ADN-efector TAL, inyectar mecánicamente la enzima modificadora de ADNefector TAL al interior de la célula como una proteína, administrar la enzima modificadora de ADN-efector TAL al interior de la célula como una proteína mediante un sistema de secreción bacteriana de tipo III, o introducir la enzima modificadora de ADN-efector de TAL en el interior de la célula como una proteína mediante electroporación. La enzima modificadora de ADN puede ser una endonucleasa (p.ej., una endonucleasa de restricción de tipo II, tal como FokI).

El dominio de efector TAL que se une a una secuencia de nucleótidos específica dentro del ADN diana puede comprender 10 o más repeticiones de unión a ADN, y preferiblemente 15 o más repeticiones de unión a ADN. Cada repetición de unión a ADN puede incluir un diresiduo-variable de repetición (RVD) que determina el reconocimiento

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de un par base en la secuencia de ADN diana, donde cada repetición de unión a ADN es responsable del reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN diana, y donde el RVD comprende uno o más de: HD para reconocer C; NG para reconocer T; NI para reconocer A; NN para reconocer G ó A; NS para reconocer A ó C ó G ó T; N* para reconocer C ó T, donde * representa un hueco en la segunda posición del RVD; HG para reconocer T; H* para reconocer T, donde * representa un hueco en la segunda posición del RVD; IG para reconocer T; NK para reconocer G; HA para reconocer C; ND para reconocer C; HI para reconocer C; HN para reconocer G; NA para reconocer G; SN para reconocer G ó A; e YG para reconocer T. Cada repetición de unión a ADN puede comprender un RVD que determina el reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN diana, donde cada repetición de unión a ADN es responsable del reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN diana, y donde el RVD comprende uno o más de: HA para reconocer C; ND para reconocer C; HI para reconocer C; HN para reconocer G; NA para reconocer G; SN para reconocer G ó A; YG para reconocer T; y NK para reconocer G, y uno o más de: HD para reconocer C; NG para reconocer T; NI para reconocer A; NN para reconocer G ó A; NS para reconocer A ó C ó G ó T; N* para reconocer C ó T, donde * representa un hueco en la segunda posición del RVD; HG para reconocer T; H* para reconocer T, donde * representa un hueco en la segunda posición del RVD; e IG para reconocer T.

En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para generar un ácido nucleico que codifica un efector TAL específico de una secuencia de nucleótidos seleccionada, que comprende: (1) linealizar un plásmido de partida con PspXI, comprendiendo dicho plásmido de partida una secuencia de nucleótidos que codifica un primer dominio de repetición de ADN de efector TAL que tiene un diresiduo-variable de repetición (RVD) específico del primer nucleótido de la secuencia de nucleótidos seleccionada, donde el primer dominio de repetición de unión a ADN de efector TAL tiene un sitio único PspXI en su extremo 3’; (2) ligar en el sitio PspXI del plásmido de partida un módulo de ADN que codifica uno o más dominios de repetición de unión a ADN de efector TAL que tienen RVDs específicos de el(los) siguiente(s) nucleótidos(s) de la secuencia de nucleótidos seleccionada, donde el módulo de ADN tiene extremos XhoI pegajosos; y (3) repetir las etapas (1) y (2) hasta que el ácido nucleico codifica un efector TAL capaz de unirse a la secuencia de nucleótidos seleccionada. El método puede comprender además, tras ligar, la determinación de la orientación del módulo de ADN en el sitio PspXI. El método puede comprender repetir las etapas (1) y (2) entre una y 30 veces.

En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para generar un ácido nucleico que codifica una endonucleasa de efector de tipo activador de transcripción (TALEN, del inglés “transcription activator-like effector endonuclease”), que comprende (a) identificar una primera secuencia de nucleótidos en el genoma de una célula; y

(b) sintetizar un ácido nucleico que codifica una TALEN que comprende (i) una pluralidad de repeticiones de unión a ADN que, combinadas, se unen a la primera secuencia de nucleótidos única, y (ii) una endonucleasa que genera un corte de cadena doble en una posición dentro de, o adyacente a, la primera secuencia de nucleótidos, donde cada repetición de unión a ADN comprende un RVD que determina el reconocimiento de un par base del ADN diana, donde dicha repetición de unión a ADN es responsable del reconocimiento de un par base del ADN diana, y donde la TALEN comprende uno o más de los siguientes RVDs: HD para reconocer C; NG para reconocer T; NI para reconocer A; NN para reconocer G ó A; NS para reconocer A ó C ó G ó T; N* para reconocer C ó T; HG para reconocer T; H* para reconocer T; IG para reconocer T; NK para reconocer G; HA para reconocer C; ND para reconocer C; HI para reconocer C; HN para reconocer G; NA para reconocer G; SN para reconocer G ó A; e YG para reconocer T.

La TALEN puede comprender uno o más de los siguientes RVDs: HA para reconocer C; ND para reconocer C; HI para reconocer C; HN para reconocer G; NA para reconocer G; SN para reconocer G ó A; YG para reconocer T; y NK para reconocer G, y uno o más de: HD para reconocer C; NG para reconocer T; NI para reconocer A; NN para reconocer G ó A; NS para reconocer A ó C ó G ó T; N* para reconocer C ó T; HG para reconocer T; H* para reconocer T; e IG para reconocer T.

La primera secuencia de nucleótidos puede cumplir al menos uno de los siguientes criterios: i) tiene una longitud mínima de 15 bases y está orientada de 5’ a 3’ con una T inmediatamente antes del sitio del extremo 5’; ii) no tiene una T en la primera (5’) posición o una A en la segunda posición; iii) finaliza en T en la última (3’) posición y no tiene una G en la penúltima posición; y iv) tiene una composición de bases de 0-63% de A, 11-63% de C, 0-25% de G y 242% de T.

El método puede comprender identificar una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos en el genoma de la célula, donde la primera y segunda secuencias de nucleótidos cumplen al menos uno de los criterios definidos antes y están separadas por 15-18 pb. La endonucleasa puede generar un corte de cadena doble entre la primera y segunda secuencias de nucleótidos.

En otra realización, la presente descripción presenta una TALEN que comprende un dominio de endonucleasa y un dominio de unión a ADN de efector TAL específico de un ADN diana, donde el dominio de unión a ADN comprende una pluralidad de repeticiones de unión a ADN, comprendiendo cada repetición un RVD que determina el reconocimiento de un par base del ADN diana, donde cada repetición de unión a ADN es responsable del reconocimiento de un par base del ADN diana, y donde la TALEN comprende uno o más de los siguientes RVDs: HD para reconocer C; NG para reconocer T; NI para reconocer A; NN para reconocer G ó A; NS para reconocer A ó C ó G ó T; N* para reconocer C ó T; HG para reconocer T; H* para reconocer T; IG para reconocer T; NK para reconocer G; HA para reconocer C; ND para reconocer C; HI para reconocer C; HN para reconocer G; NA para 3 10

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reconocer G; SN para reconocer G ó A; e YG para reconocer T. La TALEN puede comprender uno o más de los siguientes RVDs: HA para reconocer C; ND para reconocer C; HI para reconocer C; HN para reconocer G; NA para reconocer G; SN para reconocer G ó A; YG para reconocer T; y NK para reconocer G, y uno o más de: HD para reconocer C; NG para reconocer T; NI para reconocer A; NN para reconocer G ó A; NS para reconocer A ó C ó G ó T; N* para reconocer C ó T; HG para reconocer T; H* para reconocer T; e IG para reconocer T. El dominio de endonucleasa puede proceder de endonucleasa de restricción de tipo II (p.ej., FokI).

En otro aspecto adicional, la presente invención presenta una TALEN que comprende un dominio de endonucleasa y un dominio de efector TAL, donde la secuencia de aminoácidos de dicha TALEN se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 33 a SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 72 y la SEQ ID NO: 73.

La presente descripción también presenta un método para generar un animal, que comprende: proporcionar una célula eucariótica que comprenda una secuencia de ADN diana en la cual se desea introducir una modificación genética; generar un corte de cadena doble dentro de la secuencia de ADN diana con una TALEN que comprende un dominio de endonucleasa y un dominio de efector TAL que se une a la secuencia de ADN diana; y generar un animal a partir de la célula o de su progenie en la que se ha producido un corte de cadena doble. El método puede comprender además introducir en la célula un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia homóloga a al menos una porción del ADN diana, donde la introducción se da en condiciones que permitan que se produzca la recombinación homóloga entre el ácido nucleico exógeno y la secuencia de ADN diana en la célula o en su progenie; y generar un animal a partir de la célula o de su progenie en la que se ha producido la recombinación homóloga. El animal puede ser un mamífero. La modificación genética puede comprender una sustitución, una inserción o una eliminación.

En otro aspecto adicional, la presente descripción presenta un método para generar una planta, que comprende proporcionar una célula vegetal que comprende una secuencia de ADN diana en la cual se desea introducir una modificación genética preseleccionada; generando un corte de cadena doble dentro de la secuencia de ADN diana con una TALEN que comprende un dominio de endonucleasa y un dominio de efector TAL que se une a la secuencia de ADN diana; y generar una planta a partir de la célula o de su progenie en la que se ha producido el corte de cadena doble. El método puede comprender además la introducción en la célula vegetal de un ácido nucleico exógeno que comprenda una secuencia homóloga a al menos una porción de la secuencia de ADN diana, donde la introducción se realiza en condiciones que permitan que se produzca la recombinación homóloga entre el ácido nucleico exógeno y la secuencia de ADN diana de la célula o de su progenie, y generar una planta a partir de la célula o de su progenie en la que la se ha producido la recombinación homóloga.

En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para la recombinación genética dirigida en una célula, que comprende introducir en la célula un ácido nucleico que codifique una endonucleasa de efector TAL dirigida a una secuencia diana de ADN seleccionada; inducir la expresión de la endonucleasa de efector TAL dentro de la célula; e identificar una célula en la que la secuencia diana de ADN seleccionada exhiba una mutación. La mutación puede seleccionarse del grupo que consiste en eliminación de material genético, inserción de material genético, y ambos, eliminación e inserción de material genético. El método puede comprender además la introducción de ADN de donante en la célula. La célula puede ser una célula de insecto, una célula vegetal, una célula de pez o una célula de mamífero.

En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para generar un efector TAL que tiene capacidad de modificación dirigida mejorada para una diana de ADN, que comprende la generación de un ácido nucleico que codifica un efector TAL que comprende el dominio de unión de ADN que tiene una pluralidad de repeticiones de unión a ADN, donde cada repetición comprende un RVD que determina el reconocimiento de un par base del ADN diana, donde cada repetición de unión de ADN es responsable del reconocimiento de un par base en el ADN diana, donde la generación comprende incorporar un ácido nucleico que codifica una secuencia de repetición de unión a ADN variante 0ª con especificidad para A, C ó G, eliminando de este modo el requisito de tener una T en la posición -1 del sitio de unión.

En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para generar un efector TAL que tenga una capacidad de modificación dirigida mejorada para una diana de ADN, que comprende generar un ácido nucleico que codifica un efector TAL que comprende un dominio de unión a ADN que tiene una pluralidad de repeticiones de unión a ADN, donde cada repetición comprende un RVD que determina el reconocimiento de un par base del ADN diana, donde cada repetición de unión a ADN es responsable del reconocimiento de un par base en el ADN diana, donde la generación comprende incorporar uno o más ácidos nucleicos que codifican dominios de unión a ADN de efector TAL que contienen RVDs con especificidad mejorada para G, y donde dichos RVDs se seleccionan del grupo que consiste en RN, R*, NG, NH, KN, K*, NA, NT, DN, D*, NL, NM, EN, E*, NV, NC, QN, Q*, NR, NP, HN, H*, NK, NY, SN, S*, ND, NW, TN, T*, NE, NF, YN, Y* y NQ, donde * indica un hueco en la segunda posición del RVD.

La presente descripción también presenta un método para producir un polipéptido que reconozca selectivamente al menos un par base de una secuencia de ADN diana, que comprende sintetizar un polipéptido que comprenda un dominio de repetición, donde el dominio de repetición comprende al menos una unidad de repetición derivada de un efector de tipo activador de transcripción (TAL), donde la unidad de repetición comprende una región hipervariable que determina el reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN diana, donde la unidad de repetición es

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responsable del reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN, y donde la región hipervariable comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en: (a) HD para reconocimiento de C/G; (b) NI para reconocimiento de A/T; (c) NG para reconocimiento de T/A; (d) NS para reconocimiento de C/G ó A/T ó T/A ó G/C; (e) NN para reconocimiento de G/C ó A/T; (f) IG para reconocimiento de T/A; (g) N para reconocimiento de C/G; (h) HG para reconocimiento de C/G ó T/A; (i) H para reconocimiento de T/A; y (j) NK para reconocimiento de G/C. Adicionalmente, esta invención presenta un polipéptido producido mediante el método anterior, y un ADN que comprende una secuencia codificadora para el polipéptido producido mediante el método. También se presenta una casete de expresión que comprende un promotor ligado operativamente al ADN mencionado anteriormente, y una célula hospedante no humana que comprende la casete de expresión. En otro aspecto, la presente invención presenta un organismo no humano transformado que comprende la casete de expresión.

En otro aspecto adicional, la presente descripción presenta un método para reconocer selectivamente un par base en una secuencia de ADN mediante un polipéptido, que comprende construir un polipéptido que comprende un dominio de repetición, donde el dominio de repetición comprende al menos una unidad de repetición derivada de un efector TAL, donde la unidad de repetición comprende una región hipervariable que determina el reconocimiento de un par base en la secuencia de ADN, donde la unidad de repetición es responsable del reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN, y donde la región hipervariable comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en (a) HD para el reconocimiento de C/G; (b) NI para el reconocimiento de A/T; (c) NG para el reconocimiento de T/A; (d) NS para el reconocimiento de C/G ó A/T ó T/A ó G/C; (e) NN para el reconocimiento de G/C ó A/T; (f) IG para el reconocimiento de T/A; (g) N para el reconocimiento de C/G; (h) HG para el reconocimiento de C/G ó T/A; (i) H para el reconocimiento de T/A; y (j) NK para el reconocimiento de G/C.

La presente descripción también presenta un método de modular la expresión de un gen diana en una célula, donde se proporcionan células que contienen un polipéptido en el que el polipéptido comprende un dominio de repetición, donde el dominio de repetición comprende al menos una unidad de repetición derivada de un efector TAL, donde la unidad de repetición comprende una región hipervariable que determina el reconocimiento de un par base de una secuencia de ADN, donde la unidad de repetición es responsable del reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN, y donde la región hipervariable comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en (a) HD para el reconocimiento de C/G; (b) NI para el reconocimiento de A/T; (c) NG para el reconocimiento de T/A; (d) NS para el reconocimiento de C/G ó A/T ó T/A ó G/C; (e) NN para el reconocimiento de G/C ó A/T; (f) IG para el reconocimiento de T/A; (g) N para el reconocimiento de C/G; (h) para el reconocimiento de C/G ó T/A; (i) H para el reconocimiento de T/A; y (j) NK para el reconocimiento de G/C.

En otro aspecto, la presente descripción presenta un polipéptido que comprende un dominio de repetición, donde el dominio de repetición comprende al menos una unidad de repetición derivada de un efector TAL, donde la unidad de repetición comprende una región hipervariable que determina el reconocimiento de un par base en una secuencia de ADN, donde la unidad de repetición es responsable del reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN, y donde la región hipervariable comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste en (a) HD para el reconocimiento de C/G; (b) NI para el reconocimiento de A/T; (c) NG para el reconocimiento de T/A; (d) NS para el reconocimiento de C/G ó A/T ó T/A ó G/C; (e) NN para el reconocimiento de G/C ó A/T; (f) IG para el reconocimiento de T/A; (g) N para el reconocimiento de C/G; (h) HG para el reconocimiento de C/G ó T/A; (i) H para el reconocimiento de T/A; y (j) NK para el reconocimiento de G/C. La presente descripción también presenta un ADN que comprende una secuencia codificadora para el polipéptido mencionado anteriormente.

En otro aspecto, la presente descripción presenta un ADN que es modificado para incluir un par base localizado en una secuencia de ADN dina de tal modo que el par base pueda ser reconocido específicamente por un polipéptido que comprende un dominio de repetición, donde el dominio de repetición comprende al menos una unidad de repetición derivada de un efector TAL, donde la unidad de repetición comprende una región hipervariable que determina el reconocimiento de un par base en la secuencia de ADN, donde la unidad de repetición es responsable del reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN, y donde, para recibir un reconocimiento determinado y selectivo por la región hipervariable, el par base se selecciona a partir del grupo que consiste en (a) C/G para el reconocimiento por HD; (b) A/T para el reconocimiento por NI; (c) T/A para el reconocimiento por NG; (d) CT ó A/T ó T/A ó G/C para el reconocimiento por NS; (e) G/C ó A/T para el reconocimiento por NN; (f) T/A para el reconocimiento por IG; (g) C/G ó T/A para el reconocimiento por N; (h) T/A para el reconocimiento por HG; (i) T/A para el reconocimiento por H; y (j) G/C para el reconocimiento por NK. También se presenta un vector que comprende el ADN mencionado anteriormente, una célula hospedante no humana que comprende el ADN, y un organismo no humano transformado que comprende el ADN.

En otro aspecto adicional, la presente descripción presenta un método para producir un ADN que comprende una secuencia de ADN diana que es reconocida selectivamente por un polipéptido que comprende un dominio de repetición, donde el dominio de repetición comprende al menos una unidad de repetición derivada de un efector TAL, donde la unidad de repetición comprende una región hipervariable que determina el reconocimiento de un par base en la secuencia de ADN diana, y donde la unidad de repetición es responsable del reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN diana, comprendiendo el método la síntesis de un ADN que comprende un par base que es capaz de ser reconocido por la unidad de repetición, donde el par base se selecciona del grupo que consiste en (a) C/G para el reconocimiento por HD; (b) A/T para el reconocimiento por NI; (c) T/A por el reconocimiento por

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NG; (d) CT ó A/T ó T/A ó G/C para el reconocimiento por NS; (e) G/C ó A/T para el reconocimiento por NN; (f) T/A para el reconocimiento por IG; (g) C/G ó T/A para el reconocimiento por N; (h) T/A para el reconocimiento por HG; (i) T/A por el reconocimiento por H; y (j) G/C por el reconocimiento por NK.

En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para modificar el material genético de una célula vegetal. El método puede incluir (a) introducir en la célula vegetal (i) un primer ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos diana modificada, donde la secuencia de nucleótidos diana modificada comprende una o más modificaciones en la secuencia de nucleótidos con respecto a una correspondiente secuencia de nucleótidos diana presente en la célula vegetal, y donde la secuencia de nucleótidos diana comprende además un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de efector TAL (TALEN) específica de secuencia; y (ii) un segundo ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la endonucleasa de efector de tipo activador de transcripción (TAL) específica de secuencia; (b) generar una planta que contenga la célula vegetal; (c) analizar células, semillas o tejidos obtenidos de la planta, o de su progenie, para la recombinación en la secuencia de nucleótidos diana. El método puede incluir además introducir en la célula vegetal (iii) un tercer ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un marcador seleccionable; y determinar si la planta o su progenie expresan el marcador seleccionable. El método puede incluir además la etapa de realizar un escrutinio de la planta o de su progenie para determinar la ausencia del marcador seleccionable. La secuencia de nucleótidos que codifica el marcador seleccionable puede o no estar flanqueada en uno o en ambos lados por una secuencia que es similar o idéntica a una secuencia que es endógena a la célula vegetal (p.ej., una secuencia en el sitio de ruptura para una secuencia nucleasa específica de secuencia). La secuencia de nucleótidos que codifica el marcador seleccionable puede estar flanqueada en ambos lados por sitios de reconocimiento para una recombinasa específica de secuencia. El método puede incluir además la etapa de cruzar la planta, con o sin la etapa de realizar el escrutinio de la progenie resultante del cruce para determinar la ausencia del marcador seleccionable. El primer y el segundo ácidos nucleicos recombinantes pueden introducirse simultáneamente en la célula vegetal. Se puede linealizar uno o ambos ácidos nucleicos recombinantes antes de la etapa de introducción. El primer y el segundo ácidos nucleicos recombinantes pueden estar presentes en la misma construcción.

En otro aspecto, la presente invención presenta otro método para modificar el material genético de una célula. El método puede incluir proporcionar una célula primaria que contiene una secuencia de ADN diana cromosomal en la que se desea que se produzca una recombinación homóloga; proporcionar una TALEN que comprende un dominio de endonucleasa que puede romper ADN de cadena doble, y un dominio de efector TAL que comprende una pluralidad de secuencias de repetición de efector TAL que, combinadas, se unen a una secuencia de nucleótidos específica del ADN diana de la célula; y poner en contacto la secuencia de ADN diana con la TALEN de la célula de tal modo que la TALEN rompa ambas cadenas de una secuencia de nucleótidos que esté dentro de, o adyacente a, la secuencia de ADN diana de la célula. El método puede incluir además proporcionar un ácido nucleico que comprende una secuencia homóloga a al menos una porción del ADN diana, de tal modo que se produzca una recombinación homóloga entre la secuencia de ADN diana y el ácido nucleico. La secuencia de ADN diana puede ser endógena respecto a la célula. La célula puede ser una célula vegetal, una célula de mamífero, una célula de pez, una célula de insecto o líneas celulares derivadas de dichos organismos para cultivos in vitro o células primarias tomadas directamente de tejido vivo y estabilizado para cultivo in vitro. La puesta en contacto puede incluir transfectar la célula con un vector que comprende una secuencia de codificación de TALEN, y expresar la proteína TALEN en la célula, inyectar mecánicamente una proteína TALEN en la célula, administrar una proteína de endonucleasa de efector TAL al interior de la célula por medio del sistema de secreción bacteriano de tipo III, o introducir una proteína TALEN en la célula mediante electroporación. El dominio de endonucleasa puede ser de una endonucleasa de restricción de tipo II (p.ej., FokI). El dominio de efector TAL que se une a una secuencia de nucleótidos específica del ADN diana puede incluir 10 o más repeticiones de unión a ADN, más preferiblemente 15 o más repeticiones de unión a ADN. La célula puede proceder de un organismo procariótico o eucariótico.

En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para diseñar una TALEN específica de secuencia capaz de romper ADN en una posición específica. El método puede incluir identificar una primera secuencia de nucleótidos cromosomal endógena única adyacente a una segunda secuencia de nucleótidos en la que se desea introducir un corte de cadena doble; y diseñar una TALEN específica de secuencia que comprende (a) una pluralidad de dominios de repetición de unión a ADN que, combinados, se unen a la primera secuencia de nucleótidos cromosomal endógena única, y (b) una endonucleasa que genera un corte de cadena doble en la segunda secuencia de nucleótidos.

La presente descripción también presenta una TALEN que comprende un dominio de endonucleasa y un dominio de unión a ADN de efector TAL específico para una secuencia de ADN particular. La TALEN puede incluir además una cola de purificación. El dominio de endonucleasa puede ser de endonucleasa de restricción de tipo II (p.ej., FokI).

En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para generar un animal modificado genéticamente en el que se ha introducido un ácido nucleico deseado. El método puede incluir proporcionar una célula primaria que comprende una secuencia de ADN diana cromosomal endógena en la que se desea introducir el ácido nucleico; generar un corte de cadena doble dentro de la secuencia de ADN diana cromosomal endógena con una TALEN que comprende un dominio de endonucleasa y un dominio de efector TAL que se une a la secuencia de ADN diana cromosomal endógena; introducir un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia homóloga a al menos

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una porción del ADN diana cromosomal endógeno dentro de la célula primaria en condiciones que permitan que se produzca una recombinación homóloga entre el ácido nucleico exógeno y el ADN diana cromosomal endógeno; y generar un animal a partir de la célula primaria en la que se ha producido la recombinación homóloga. El animal puede ser un mamífero. La secuencia homóloga puede ser una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que altera un gen tras recombinación homóloga, una secuencia de nucleótidos que reemplaza un gen tras recombinación homóloga, una secuencia de nucleótidos que introduce una mutación puntual en un gen tras recombinación homóloga, y una secuencia de nucleótidos que introduce un sitio de regulación tras recombinación homóloga.

En otro aspecto adicional, la presente descripción presenta un método para generar una planta modificada genéticamente en la que se ha introducido un ácido nucleico deseado. El método puede incluir proporcionar una célula vegetal que comprende una secuencia de ADN diana endógena en la cual se desea introducir el ácido nucleico; generar un corte de cadena doble dentro de la secuencia de ADN diana endógena con una TALEN que comprende un dominio de endonucleasa y un dominio de efector TAL que se una a la secuencia de nucleótidos diana endógena; introducir un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia homóloga a al menos una porción del ADN diana endógeno dentro de la célula vegetal en las condiciones que permitan que se produzca la recombinación homóloga entre el ácido nucleico exógeno y el ADN diana endógeno; y generar una planta a partir de la célula vegetal en la que se ha producido la recombinación homóloga.

En otro aspecto, la presente descripción presenta un método para la recombinación genética dirigida en una célula. El método puede incluir introducir en la célula una molécula de ácido nucleico que codifica una TALEN dirigida a una secuencia de ADN diana seleccionada; inducir la expresión de la TALEN dentro de la célula; e identificar una célula en la que la secuencia de ADN diana exhiba una mutación. La mutación se puede seleccionar del grupo que consiste en una eliminación de material genético, una inserción de material genético, y ambas, una eliminación y una inserción de material genético. El método puede incluir adicionalmente introducir ADN donante en la célula. La célula puede ser una célula de insecto, una célula vegetal, una célula de pez o una célula de mamífero.

En otro aspecto adicional, la presente descripción presenta un método para generar un ácido nucleico que codifica una TALEN específica de secuencia, que comprende (1) seleccionar un plásmido de partida que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un primer dominio de repetición de unión a ADN de efector TAL que tiene un RVD específico para el primer nucleótido de una secuencia de nucleótidos seleccionada, donde el primer dominio de repetición de unión a ADN de efector TAL tiene un sitio PspXI único en su extremo 3’; (2) linealizar el plásmido de partida con PspXI; (3) ligar en el sitio PspXI un módulo de ADN que codifica uno o más dominios de repetición de unión a ADN de efector TAL que tengan RVDs específicos para el(los) siguiente(s) nucleótidos de la secuencia de nucleótidos seleccionada, donde el módulo de ADN tiene extremos XhoI pegajosos; y (4) repetir las etapas (2) y (3) hasta que el ácido nucleico codifique una TALEN capaz de unirse a la secuencia de nucleótidos seleccionada. En algunos casos, el método puede incluir adicionalmente, tras la ligadura de la etapa (3), la comprobación de la orientación del módulo de ADN en el sitio PspXI.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado utilizado habitualmente por los especialistas en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria para llevar a la práctica la invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente especificación, que incluye definiciones, prevalece. Adicionalmente, los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

En las figuras anexas y en la descripción incluida a continuación se presentan los detalles de una o más realizaciones de la invención. Otras características, objetivos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y de las figuras, y a partir de las reivindicaciones.

Descripción de las figuras

Figuras 1A-1D: muestran la cifra de reconocimiento de ADN-efector TAL. La Figura 1A es un diagrama de un efector TAL genérico, que muestra la región de repetición (cajas abiertas) y una secuencia de repetición representativa (SEQ ID NO: 1) con el RVD subrayado. La Figura 1B es un diagrama que muestra las mejoras coincidencias de estructura (alineamientos de baja entropía) para varios RVDs de efector TAL y secuencias promotoras de gen diana (SEQ ID NO: 2-11). Un asterisco indica una eliminación en el residuo 13. La Figura 1C es un diagrama que muestra asociaciones RVD-nucleótido en los alineamientos de B, más diez alineamientos más obtenidos por escaneo de todos los promotores de arroz con 40 efectores TAL de X. oryzae adicionales, reteniendo para cada efector el mejor alineamiento para el cual se activó el gen en dirección 5’ durante la infección. La Figura 1D es un diagrama que muestra las frecuencias de nucleótidos de flanqueo para los 20 sitios diana de efector TAL. Las posiciones están referidas al extremo 5’ del sitio diana; N, longitud del sitio diana. Los logos fueron generados con WebLogo.

Figuras 2A y 2B: proporcionan evidencias de que OsHenI es activado por TalIc de Xanthomonas oryzae pv. cepa de oryzicola BLS256. La Figura 2A es una imagen de resultados semicuantitativos de RT-PCR, que muestra la abundancia de tránscrito relativa de OsHenI, con un gen de actina como referencia, en hojas de arroz 24 horas después de inoculación con mutante de intercambio de marcador BLS256 M51, M51 que porta el vector de cósmido

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vacío (ev), M51 que porta el cósmido pIJF92, que contiene tal1a, tal1b y tal1c, y la cepa natural (WT, del inglés “wild type”). La Figura 2B es un esquema basado en el mapeo de la mutación de intercambio de marcador sencillo en M51 por rescate y secuenciamiento de un fragmento XmaI que contiene marcador. Se muestra la región de genoma, las coordenadas del fragmento rescatado, y las coordenadas del fragmento genómico BLS256 contenido en el cósmido pIJF92.

Figura 3: es una secuencia de aminoácidos AvrBs3 de referencia (SEQ ID NO: 12).

Figura 4: es una secuencia de ácido nucleico AvrBs3 de referencia (SEQ ID NO: 13).

Figura 5: es un mapa de un vector de expresión de nucleasa TAL.

Figura 6: es un mapa de un plásmido de informador de diana.

Figura 7: es un diagrama esquemático de la arquitectura de nucleasas TAL. Los sitios de reconocimiento del dominio de unión de ADN TAL están representados con letras mayúsculas, mientras que la secuencia espaciadora se presenta en minúsculas.

Figura 8: es la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16) de 17 y media repeticiones en tándem del dominio de reconocimiento AvrBs3. Están recuadrados los aminoácidos hipervariables de las posiciones 12 y 13.

Figura 9: es un diagrama que muestra un esquema para un ensayo de levaduras para evaluar la eficacia de TAL.

Figura 10: es un gráfico que representa los resultados de un ensayo de levadura de nucleasa TAL AvrBs3.

Figura 11: es un diagrama que muestra una representación esquemática de módulos sencillos, dobles o triples de repetición de AsvBs3 y un vector de clonación.

Figuras 12A y 12B: muestra una única repetición de efector TAL representativa (Figura 12A), así como una repetición truncada representativa (Figura 12B) que está presente en el extremo de la región repetida en la mayoría de los efectores TAL. Se muestran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos codificados. Ns representa nucleótidos que codifican los RVDs, que están indicados como “XX”. Se proporcionan números para las posiciones de aminoácido. Las secuencias se toman desde tal1c.

Figura 13: es un esquema que presenta el gen tal1c y el proceso mediante el cual se reduce la región de repetición a una única repetición truncada, que da como resultado el pCS487, también mostrado. M, sitio MscI; S, sitio SphI.

Figura 14: es un esquema que muestra la introducción de una mutación traduccionalmente silenciosa en el extremo de la repetición truncada original del pCS487 para crear un sitio PspXI y XhoI, produciendo pCS489. Se muestran las secuencias de los codones 18-21 de la repetición original (SEQ ID NO: 21) y de la repetición mutada (SEQ ID NO: 23). La secuencia de aminoácidos codificada (SEQ ID NO: 22) no se vio alterada por la mutación. Los nucleótidos mutados están en cursiva.

Figura 15: es un mapa de pCS488, que es un plásmido resistente a canamicina que codifica solo las porciones N-y C-terminales de tal1c, sin la región de repetición, en el vector de entrada de Pórtico pENTR-D (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Figura 16: es un mapa del plásmido de inicio de repetición sencilla designado como pCS493, que codifica una repetición que tiene el RVD NI. Otros tres plásmidos, designados pCS494, pCS495 y pCS496, eran idénticos excepto para los RVDs que codifican (proporcionados a la derecha).

Figura 17A: muestra secuencias de nucleótidos y de aminoácidos codificados para un único módulo de repetición dentro del RVN NI. El extremo 5’ cohesivo compatible XhoI, el sitio MscI y el extremo 3’ cohesivo compatible PspXI/XhoI están subrayados. El RVD y los nucleótidos que lo codifican están en negrita. Se construyeron otros tres módulos de repetición idénticos al mostrados excepto por las secuencias codificadoras de RVD, que codifican HD, NI y NG, respectivamente.

Figura 17B: es un plásmido de módulo de repetición sencilla designado como pCS502, que contiene la secuencia codificadora de repetición mostrada en la Figura 17A. También se generaron los plásmidos designados pCS503, pCS504 y pCS505, y son idénticos al pCS502 excepto en los RVDs que codifican (proporcionados a la derecha).

Figura 18A: muestra secuencias de nucleótidos y de aminoácidos codificados para un módulo de repetición sencilla con RVD NI, en el que las sustituciones de nucleótidos (en cursiva) previenen la reconstitución del sitio XhoI en el extremo 5’ tras ligación en el sitio PspXI/XhoI y destruyen el sitio MscI interno. El RVD y sus nucleótidos codificadores están en negrita. Se construyeron tres módulos de repetición adicionales idénticos al mostrado excepto por las secuencias codificadoras de RVD, que codificaban HD, NI y NG, respectivamente.

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Figura 18B: es un esquema de un módulo de tres repeticiones construido ligando secuencialmente módulos de repetición adicionales en un único plásmido de módulo de repetición. El sitio MscI de la primera repetición y el sitio PspXI del extremo 3’ permanecen únicos, y el módulo entero está flanqueado por dos sitios XhoI.

Figura 19: es una lista del conjunto completo de plásmidos de módulos de una, dos y tres repeticiones.

Figura 20: es un diagrama de flujo que muestra las etapas de un método que puede usarse para ensamblar cualquier secuencia de repeticiones en la cadena principal de tal1c para generar un gen efector TAL a medida.

Figuras 21A y 21B: son esquemas que muestran el ensamblaje de módulos de repetición en la construcción de endonucleasas TAL que se atacarán a las secuencias de nucleótidos mostradas. En la Figura 21A, los módulos de repetición procedentes de plásmidos designados pCS519, pCS524, pCS537, pCS551, pCS583 y pCS529 se añaden secuencialmente a la secuencia del plásmido de partida designado pCS493, dando como resultado los plásmidos designados pMAT55, pMAT56, pMAT57, pMAT58, pMAT59 y pMAT60. En la Figura 21B, los módulos de repetición procedentes de plásmidos designados pCS530, pCS533, pCS522 y pCS541 se añaden secuencialmente a la secuencia del plásmido designado pMAT1, dando como resultado los plásmidos designados pMAT61, pMAT62, pMAT63 y pMAT64.

Figura 22A: es un esquema de una proteína de efector TAL. Se fusionaron fragmentos BamHI (denotados como B’s) con el dominio catalítico de la endonucleasa FokI para crear TALENs. N, extremo-N; NLS, señal de localización nuclear; B, sitio BamHI, AD, dominio de activación ácida.

Figura 22B: es un gráfico que representa la actividad de las TALENs construidas con efectores TAL AvrBs3 y pthXoI. Avr-FokI, TALEN AvrBs3; Pth-FokI, TALEN PthXoI, Avr-FokI y Pth-FokI, fusiones de AvrBs3 y PthXoI con una versión catalíticamente inactiva de FokI (Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-10575); ZFN, nucleasa de dedo de zinc que contiene el dominio de unión de ADN Zif268 (Porteus y Baltimore (2003) Science 300: 763).

Figura 23: es una secuencia de aminoácidos de PthXoI de referencia (SEQ ID NO: 31).

Figura 24: es una secuencia de ácido nucleico de PthXoI de referencia (SEQ ID NO: 32).

Figura 25: es un diagrama del vector pFZ85.

Figura 26: muestra la secuencia de aminoácidos de avrBs3_TALEN (SEQ ID NO: 33).

Figura 27: muestra la secuencia de aminoácidos de pthXoI_TALEN (SEQ ID NO: 34).

Figura 28A: es un gráfico que representa la actividad de TALENs AvrBs3 y PthXoI sobre dianas con diferentes longitudes de espaciador. ZFN, nucleasa de dedo de zinc derivada de Zif268.

Figura 28B: es un gráfico que representa la actividad de una TALEN heterodimérica. Se muestra la actividad en levadura que contiene vectores de expresión PthXoI-FokI y AvrBs3-FokI y un plásmido con una diana que consiste en los sitios de reconocimiento de cada uno, en orientación de cabeza a cola, separados por 15 pb (Avr-FokI, Pth-FokI). También se muestra como referencia la actividad de TALENS AvrBs3 (Avr-FokI) y PthXoI (Pth-FokI) individualmente y Zif268 (ZFN) sobre sus respectivas dianas. Como control negativo, se evaluó para actividad LacZ (denotado como (-)) un cultivo de levadura solo con el plásmido de sitio diana para Avr-FokI, Pth-FokI.

Figura 29A: es una tabla que muestra las secuencias RVD de TALENs a medida individuales y sus respectivas secuencias de reconocimiento.

Figura 29B: es un gráfico que representa la actividad de TALENs a medida. (-), control negativo solo con plásmidos de sitio diana; ZFN, control positivo de nucleasa de dedo de zinc.

Figura 30: es una representación de las frecuencias de nucleótidos y RVD en los extremos de 20 dianas y pares de efector TAL.

Figura 31: es un esquema del sistema de cierre Golden Gate [Engler et al. (2008) PLoS One 3:e3647; y Engler et al. (2009) PLoS One 4:e5553].

Figuras 32A y 32B: representan un conjunto de 58 plásmidos para montaje y clonación de conjuntos de codificación de repeticiones de efector TAL a medida usando la estrategia de clonación Golden Gate como se describe en la presente memoria. Tet, gen de resistencia a tetraciclina, un marcador para selección de plásmido; spec, gen de resistencia a espectomicina, un marcador para selección de plásmido; amp, gen de resistencia de ampicilina, un marcador para selección de plásmido.

Figura 33: es un esquema de un método para montar y clonar sistemas de codificación de repetición de efector TAL a medida mediante la estrategia Golden Gate usando el conjunto de plásmidos mostrados en la Figura 32. Con fines ilustrativos, se muestra el montaje de un sistema de repetición arbitrario. Spec, gen de resistencia a espectomicina,

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un marcador para selección de plásmido; amp, gen de resistencia a ampicilina, un marcador para selección de plásmidos.

Figuras 34A-34U: muestran las secuencias de aminoácidos de TALENs generadas como se describe en el Ejemplo 9 de la presente memoria. Figura 34A, TALEN124-telomerasa; Figura 34B, TALEN105-punto muerto; Figura 34C, TALEN58-adh1; Figura 34D, TALEN63-adh1; Figura 34E, TALEN68-adh1; Figura 34F, TALEN73-adh1; Figura 34G, TALEN89-adh1; Figura 34H, TALEN106-punto muerto; Figura 34I, TALEN64-adh1; Figura 34J, TALEN69-adh1; Figura 34K, TALEN74-adh1; Figura 34L, TALEN90-tt4; Figura 34M, TALEN121-telomerasa; Figura 34N, TALEN126telomerasa; Figura 34O, TALEN107-punto muerto; Figura 34P, TALEN117-punto muerto; Figura 34Q, TALEN 131telomerasa; Figura 34R, TALEN136-telomerasa; Figura 34S, TALEN60-adh1; Figura 34T, TALEN85-tt4; Figura 34U, TALEN102-punto muerto.

Figura 35: es un gráfico que representa la actividad TALEN medida a través del ensayo de levadura usando monómeros de TALEN a medida de longitud creciente (de 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17 ó 18 unidades). Las TALENs fueron dirigidas a genes de Arabidopsis y pez cebra, tal como se indica.

Figura 36A: es un diagrama que muestra dos secuencias diana de ADN diferentes procedentes del gen ADH1 de Arabidopsis que son atacadas por dos pares de TALEN.

Figura 36B: es un gráfico que representa los datos del ensayo de levadura para pares de TALEN funcionales dirigidos al gen ADH1 de Arabidopsis.

Figura 37A: es un esquema de un ensayo de endonucleasa de restricción usado para detectar mutaciones inducidas por TALEN en protoplastos de Arabidopsis.

Figura 37B: muestra las secuencias de nueve clones procedentes de ADN no digerido en el ensayo de endonucleasa de restricción. Seis de los clones tienen mutaciones introducidas por unión de extremos no homóloga (NHEJ, del inglés “non-homologous end-joining”).

Figura 38A: muestra secuencias de repetición 0ª de varios efectores TAL distintos filogenéticamente, AvrHah1 de Xanthomonas gardneri, AvrBs3 de X. campestris pv. Vesicatoria, PthXoI de X. oryzae pv. Oryzae, PthA de X. citri, y Tal 1c de X. oryzae pv. Oryzicola. Las posiciones polimórficas está recuadradas.

Figura 38B: es un esquema que muestra las repeticiones 0ª y 1ª de PthXoI. La repetición “0ª” precede inmediatamente a la repetición 1ª, muestra un 35% de identidad, y tiene una estructura secundaria predicha similar. El RVD de la 1ª repetición y los residuos análogos candidatos de la repetición 0ª están subrayados. *, hueco; H, hélice; E, extendido. La estructura se predijo usando JPred (Cole et al. (2008) Nucl. Acids Res. 36: W197-W201).

Figura 39: muestra un ensayo de transferencia western blot de proteína total aislada de células 293T de riñón embriónicas humanas transfectadas con plásmidos que codifican proteínas de efector TAL marcadas con V5 AvrBs3, PthXoI y Tal 1c, tal como se indica, después de inmunodetección con un anticuerpo antiV5 de ratón. La actina inmunomarcada se muestra como un control para una carga equivalente en cada banda.

Figura 40A: muestra la secuencia de aminoácidos de TALEN-HPRT-3254-17, y la Figura 40B muestra la secuencia de aminoácidos de TALEN-HPRT-3286-20r.

Figura 41A: es un esquema que muestra el sitio marcado con TALEN en el gen HPRT cromosomal humano. Se indican los sitios de unión para las TALEN HPRT-3254-17 y HPRT-3286-20r, el sitio Bpu10I en el espaciador entre dichos sitios, y los sitios de cebador para amplificación de la región. Las coordenadas de la parte inferior proporcionan la distancia en pares base desde el primer nucleótido de la secuencia codificadora.

Figura 41B: muestra los resultados de digestión de Bpu10I de productos de amplificación PCR de la región mostrada en la Figura 41A usando ADN genómico aislado de células tratadas con TALEN y células no tratadas como plantilla. Antes de la amplificación el ADN genómico fue digerido con Bpu10I. Los fragmentos de ADN fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron usando bromuro de etidio.

Descripción detallada

La presente solicitud de patente proporciona materiales y métodos relacionados con el reconocimiento de ADN específico de secuencia mediado por efectores TAL. Tal como se describe en la presente memoria, las secuencias de aminoácidos primarias de efectores TAL dictan las secuencias de nucleótidos a las que se unen. Los inventores han descubierto que las relaciones entre las secuencias de aminoácidos de efector TAL y sus secuencias diana de ADN son directas, lo que permite la predicción del sitio diana para efectores TAL, y también permite la personalización del efector TAL que se une a secuencias de nucleótidos particulares. Dicha predicción y personalización pueden emplearse para a una variedad de propósitos. En un ejemplo, secuencias particulares de efector TAL pueden fusionarse a secuencias de endonucleasa, permitiendo el ataque de endonucleasas a secuencias de ADN específicas, y el posterior corte del ADN en las secuencias diana, o cerca de ellas. Los cortes (es decir, rupturas de cadena doble) en el ADN pueden aumentar drásticamente la frecuencia de recombinación

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homóloga. Por tanto, en combinación con construcciones de ADN que portan secuencias que tienen un alto grado de similitud de secuencia con respecto a una secuencia de ADN diana, las TALENS pueden usarse para facilitar la mutagénesis sitodirigida en genomas complejos, es decir, para bloquear o alterar una función génica, o para añadir genes u otras secuencias con gran precisión y alta eficacia.

Por tanto, incluidos en la materia objeto proporcionada en la presente memoria se encuentran, entre otros, materiales y métodos para fabricar organismos modificados genéticamente (que incluyen, sin limitación, plantas, hongos, Drosophila, nematodos, pez cebra, ratones, otros mamíferos y humanos). Dichos métodos pueden incluir, por ejemplo, transfectar una célula con varios ácidos nucleicos recombinantes. Por ejemplo, se puede transformar una célula (p.ej., una célula eucariótica) con una primera construcción de ácido nucleico recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos donante que incluye alteraciones relativas a una secuencia de nucleótidos diana correspondiente que se encuentra en la célula, y una segunda construcción de ácido nucleico recombinante que codifica una TAL-nucleasa. En algunas realizaciones, la célula también puede transformarse con una tercera construcción de ácido nucleico recombinante que codifica un marcador seleccionable. Se puede incorporar una secuencia de ácido nucleico procedente de la construcción de ácido nucleico donante en el genoma de la célula transformada como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, las células vegetales producidas usando los métodos descritos en la presente memoria pueden cultivarse para producir plantas que tengan la secuencia de nucleótidos donante alterada incorporada en sus genomas. Las semillas de dichas plantas pueden usarse para producir plantas que tengan un fenotipo tal como, por ejemplo, una característica de crecimiento alterada (p.ej., resistencia o tolerancia mejoradas frente a varios factores de estrés bióticos y abióticos), apariencia alterada (p.ej., color o altura alterados), o composición alterada (p.ej., niveles incrementados o disminuidos de carbono, nitrógeno, aceite, proteína, carbohidratos (p.ej., azúcar o almidón), aminoácidos, ácidos grasos o metabolitos secundarios) con respecto a las plantas sin modificar.

Polinucleótidos y Polipéptidos

En la presente memoria se presentan ácidos nucleicos y polipéptidos aislados. Los términos “ácido nucleico” y “polinucleótido” se usan de forma intercambiable, y se refiere tanto a ARN como a ADN, que incluye ADNc, ADN genómico, ADN sintético (p.ej., sintetizado químicamente), y ADN (o ARN) que contiene análogos de ácido nucleico. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional. Un ácido nucleico puede ser de cadena doble o de cadena sencilla (es decir, una cadena sentido o una cadena sencilla antisentido). Los ejemplos no limitativos de polinucleótidos incluyen genes, fragmentos génicos, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosomal, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico, y cebadores, así como análogos de ácido nucleico.

Los polipéptidos de la presente invención (tal como la enzima modificadora de ADN-efector TAL como ejemplo no limitativo) pueden ser introducidos en una célula usando un vector que codifica dichos polipéptidos, por ejemplo, o como polipéptidos per se usando vectores de administración asociados o combinados con cualesquier técnicas de permeabilización celular, tal como sonoporación o electroporación, o variantes de estas técnicas.

Tal como se usa en la presente memoria, “aislado”, cuando se usa en referencia a un ácido nucleico, se refiere a un ácido nucleico que está separado de otros ácidos nucleicos presentes en un genoma, p.ej., un genoma vegetal, que incluye ácidos nucleicos que normalmente flanquean uno o ambos lados del ácido nucleico en el genoma. El término “aislado”, tal como se usa en la presente memoria con respecto a ácidos nucleicos también incluye cualquier secuencia que no existe de forma natural, ya que dichas secuencias que no existen de forma natural no se dan en la naturaleza y no presentan secuencias inmediatamente contiguas dentro de un genoma natural.

Un ácido nucleico aislado puede ser, por ejemplo, una molécula de ADN, siempre que las secuencias de ácido nucleico que se encuentran normalmente flanqueando inmediatamente dicha molécula de ADN en un genoma natural hayan sido eliminados o estén ausentes. De este modo, un ácido nucleico aislado incluye, sin limitación, una molécula de ADN que existe como molécula separada (p.ej., un ácido nucleico sintetizado químicamente, o un ADNc

o fragmento de ADN genómico producido mediante PCR o tratamiento de endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias, así como ADN que se incorpora en un vector, un plásmido replicante autónomamente, un virus (p.ej., un pararetrovirus, un retrovirus, lentivirus, adenovirus o virus del herpes), o el ADN genómico de un procarionte o eucarionte. Adicionalmente, un ácido nucleico aislado puede incluir un ácido nucleico recombinante tal como una molécula de ADN que es parte de un ácido nucleico híbrido o de fusión. Un ácido nucleico que existe entre de cientos a millones de otros ácidos nucleicos en bibliotecas de ADNc o en bibliotecas genómicas, por ejemplo, o láminas de gel que contienen un digesto de restricción de ADN genómico, no se considera un ácido nucleico aislado.

Un ácido nucleico puede fabricarse, por ejemplo, mediante síntesis química o reacción en cadena de polimerasa (PCR). PCR se refiere a un procedimiento o técnica en donde se amplifican ácidos nucleicos diana. La PCR se puede usar para amplificar secuencias específicas a partir de ADN, así como de ARN, incluyendo secuencias procedentes de ADN genómico total o ARN celular total. Se describen varios métodos de PCR, por ejemplo, en PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach y Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Generalmente, la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá se emplea para

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diseñar oligonucleótidos cebadores que son idénticos o similares en secuencia a las cadenas opuestas de la plantilla que se va a amplificar. También se dispone de varias estrategias de PCR mediante las cuales se pueden introducir modificaciones de secuencia de nucleótidos específicas de sitio en un ácido nucleico plantilla.

Los ácidos nucleicos aislados se pueden obtener mediante mutagénesis. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico donante puede ser mutada usando técnicas estándares, que incluyen la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos y la mutagénesis sitodirigida mediante PCR. Véase, Short Protocols in Molecular Biology, Capítulo 8, Green Publishing Associates y John Wiley & Sons, editado por Ausubel et al., 1992.

El término “polipéptido” tal como se usa en la presente memoria se refiere a un compuesto de dos o más subunidades de aminoácido independientemente de su modificación post-traduccional (p.ej., fosforilación o glicosilación). Las subunidades pueden estar unidas mediante enlaces peptídicos u otros enlaces tales como, por ejemplo, enlaces de éster o éter. El término “aminoácido” se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo los isómeros ópticos D/L.

Por “aislado” o “purificado” en relación a un polipéptido se entiende que el polipéptido está separado en un grado determinado de los componentes celulares con los que se encuentra normalmente en la naturaleza (p.ej., otros polipéptidos, lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos). Un polipéptido purificado puede producir una única banda principal en un gel de poliacrilamida no reductor. Un polipéptido purificado puede ser puro al menos en aproximadamente un 75% (p.ej., puro en al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ó 100%). Los polipéptidos purificados se pueden obtener, por ejemplo, mediante extracción desde una fuente natural, por síntesis química, o mediante producción recombinante en una célula hospedante o planta transgénica, y pueden purificarse usando, por ejemplo, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación, cromatografía de exclusión de tamaño y cromatografía de intercambio iónico. La extensión de la purificación puede medirse usando cualquier método apropiado, que incluye, sin limitación, cromatografía en columna, electroforesis de gel de poliacrilamida, o cromatografía de líquidos de alta resolución.

Construcciones Recombinantes

En la presente memoria también se proporcionan construcciones de ácido nucleico recombinante (p.ej., vectores). Un vector es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, en el cual se puede insertar otro segmento de ADN de tal modo que se posibilite la replicación del segmento insertado. Generalmente, un vector es capaz de replicación cuando se asocia con los elementos de control apropiados. Las cadenas principales de vectores adecuados incluyen, por ejemplo, las usadas rutinariamente en la técnica, tal como plásmidos, virus, cromosomas artificiales, BACs, YACs o PACs. El término “vector” incluye vectores de clonación y de expresión, así como vectores víricos y vectores de integración. Un “vector de expresión” es un vector que incluye una o más secuencias de control de la expresión, y una “secuencia de control de la expresión” es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y/o la traducción de otra secuencia de ADN. Los vectores de expresión adecuados incluyen, sin limitación, plásmidos y vectores víricos derivados, por ejemplo, de bacteriófagos, baculovirus, virus de mosaico del tabaco, virus de herpes, citomegalovirus, retrovirus, virus vaccinia, adenovirus y virus adenoasociados. Comercialmente se encuentran disponibles numerosos vectores y sistemas de expresión, en corporaciones tales como Novagen (Madison, WI), Clontech (Palo Alto, CA), Stratagene (La Jolla, CA) e Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, CA).

Los términos “región reguladora”, “elemento de control” y “secuencia de control de la expresión” se refieren a secuencias de nucleótidos que influyen en el inicio y la velocidad de la traducción, y la estabilidad y/o movilidad del producto tránscrito o polipéptido. Las regiones reguladoras incluyen, sin limitación, secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta, sitios de reconocimiento de proteínas, elementos inducibles, elementos de control de promotor, secuencias de unión de proteínas, regiones 5’ y 3’ no traducidas (UTRs, del inglés “untranslated regions”), sitios de inicio transcripcional, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, intrones y otras regiones reguladoras que pueden residir dentro de las secuencias codificadoras, tal como señales secretoras, secuencias de localización nuclear (NLS, del inglés “Nuclear Localization Sequences”) y sitios de ruptura de proteasa.

Tal como se usa en la presente memoria, “ligado operativamente” significa incorporado en una construcción genética de tal modo que las secuencias de control de la expresión efectivamente controlen la expresión de una secuencia codificadora de interés. Una secuencia codificadora está “ligada operativamente” y “bajo el control” de secuencias de control de la expresión en una célula cuando la ARN polimerasa es capaz de transcribir la secuencia codificadora en ARN, el cual si es ARNm entonces puede ser traducido en la proteína codificada por la secuencia codificadora. Por tanto, una región reguladora puede modular, p.ej., regular, facilitar o conducir, la transcripción en la célula vegetal, planta o tejido vegetal en el que se desea expresar un ácido nucleico diana modificado.

Un promotor es una secuencia de control de la expresión compuesta por una región de una molécula de ADN, típicamente dentro de los 100 nucleótidos por encima del punto (en dirección 5’) en el cual comienza la transcripción (generalmente cerca del sitio de inicio para la ARN polimerasa II). Los promotores están implicados en el reconocimiento y la unión de ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar y modular la transcripción. Para poner una secuencia codificadora bajo el control de un promotor, habitualmente es necesario posicionar el sitio de inicio de

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la traducción del marco de lectura traduccional del polipéptido entre uno y cincuenta nucleótidos por debajo del promotor (dirección 3’). Sin embargo, un promotor puede posicionarse hasta aproximadamente 5.000 nucleótidos por encima (dirección 5’) del sitio de inicio de la traducción, o aproximadamente 2.000 nucleótidos por encima del sitio de inicio de la transcripción. Un promotor comprende habitualmente al menos un promotor de núcleo (basal). Un promotor también puede incluir al menos un elemento de control tal como un elemento por encima. Dichos elementos incluyen regiones de activación por encima (UARs) y, opcionalmente, otras secuencias de ADN que afectan a la transcripción de un polinucleótido tal como un elemento sintético por encima.

La elección de promotores a incluir depende de varios factores, que incluyen, aunque sin limitación, la eficiencia, la seleccionabilidad, la inducibilidad, el nivel de expresión deseado y la especificidad de célula o tejido. Por ejemplo, se pueden usar promotores específicos de tejidos, órganos y células que confieren transcripción solo, o predominantemente, en un tipo de tejido, órgano o célula particulares, respectivamente. En algunas realizaciones, los promotores específicos de tejidos vegetativos tales como el tallo, el parénquima, el meristemo de suelo, el lazo vascular, el cambium, el floema, la corteza, el meristemo apical de brote, el meristemo lateral de brote, el meristemo apical de raíz, el meristemo lateral de raíz, el primordium de hoja, el mesofilo de hoja o la epidermis de hoja, pueden ser regiones reguladoras adecuadas. En algunas realizaciones, pueden ser útiles los promotores que son esencialmente específicos de semillas (“promotores preferenciales de semillas”). Los promotores específicos de semillas pueden promover la transcripción de un ácido nucleico ligado operativamente en tejido de endoesperma y cotiledón durante el desarrollo de la semilla. Alternativamente, los promotores constitutivos pueden promover la transcripción de un ácido nucleico ligado operativamente en la mayoría o en todos los tejidos de una planta, a lo largo del desarrollo de la planta. Otras clases de promotores incluyen, aunque sin limitación, promotores inducibles, tal como los promotores que confieren transcripción en respuesta a estímulos externos tales como agentes químicos, estímulos del desarrollo o estímulos ambientales.

Un promotor basal es la secuencia mínima necesaria para el ensamblaje de un complejo de transcripción requerido para el inicio de la transcripción. Los promotores basales frecuentemente incluyen un elemento de “caja TATA” que puede estar localizado entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos por encima (dirección 5’) del sitio de inicio de la transcripción. Los promotores basales también pueden incluir un elemento de “caja CCAAT” (típicamente la secuencia CCAAT) y/o una secuencia GGGCG, que pueden estar localizadas entre aproximadamente 40 y aproximadamente 200 nucleótidos, típicamente entre aproximadamente 60 y aproximadamente 120 nucleótidos, por encima del sitio de inicio de la transcripción.

Los ejemplos no limitativos de promotores que pueden incluirse en las construcciones de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria incluyen la región de inicio de la transcripción 35S del virus de mosaico de coliflor (CaMV), los promotores 1’ ó 2’ derivados de ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, promotores procedentes de un gen específico de hoja de maíz descrito por Busk ((1977) Plant J. 11: 1285-1295), genes relacionados con kn1 procedentes de maíz y otras especies, y regiones de inicio de la transcripción de varios genes vegetales tales como el promotor de maíz ubiquitina-1.

Se transcribe una región 5’ no traducida (UTR), pero no se traduce, y cae entre el sitio de inicio del tránscrito y el codón de inicio de la traducción y puede incluir el nucleótido +1. Se puede posicionar una UTR 3’ entre el codón de terminación de la traducción y el extremo del tránscrito. Las UTRs pueden tener funciones particulares tales como aumentar la estabilidad del mensaje de ARNm o la atenuación de la traducción. Los ejemplos de UTRs 3’ incluyen, aunque sin limitación, señales de poliadenilación y secuencias de terminación de la transcripción. Una región de poliadenilación en el extremo 3’ de una región codificadora también puede ligarse operativamente a una secuencia codificadora. La región de poliadenilación puede derivarse del gen natural, de otros varios genes vegetales o de un ADN-T de Agrobacterium.

Los vectores proporcionados en la presente memoria también pueden incluir, por ejemplo, orígenes de replicación y/o regiones de unión de estructura (SARs, del inglés “scaffold attachment regions”). Adicionalmente, un vector de expresión puede incluir una secuencia etiqueta diseñada para facilitar la manipulación o la detección (p.ej., purificación o localización) del polipéptido expresado. Las secuencias etiqueta, tal como las secuencias de proteína fluorescente verde (GFP, del inglés “green fluorescent protein”), glutationa S-transferasa (GST), la polihistidina, cmyc, hemaglutinina o la etiqueta FlagTM (Kodak, New Haven, CT) se expresan típicamente como una fusión con el polipéptido codificado. Dichas etiquetas pueden insertarse en cualquier sitio del polipéptido, incluyendo tanto el extremo carboxilo como el extremo amino.

Por “vector de administración” o “vectores de administración” se entiende cualquier vector de administración que puede ser usado en la presente invención para poner en contacto celular o administrar al interior de células o a compartimentos subcelulares agentes/compuestos químicos y moléculas (proteínas y ácidos nucleicos) necesarios en la presente invención. Esto incluye, aunque sin limitación, los vectores de administración liposomales, los vectores de administración víricos, los vectores de administración de fármacos, los vehículos químicos, los vehículos poliméricos, lipoplexos, poliplexos, dendrímeros, microburbujas (agentes de contraste de ultrasonidos), nanopartículas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de administración permiten la administración de moléculas, compuestos químicos, macromoléculas (genes, proteínas), u otros vectores tales como plásmidos, péptidos desarrollados por Diatos. En estos casos, los vectores de administración son vehículos

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moleculares. Por “vector de administración” o “vectores de administración” también se entiende métodos de administración para llevar a cabo la transfección.

Los términos “vector” o “vectores” se refieren a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha ligado. Un “vector” en la presente invención incluye, aunque sin limitación, un vector vírico, un plásmido, un vector ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede consistir en un ácido nucleico cromosomal, no cromosomal, semi-sintético o sintético. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma (vector episomal) y/o de expresión de ácidos nucleicos a los cuales están unidos (vectores de expresión). Los especialistas en la técnica conocen una gran cantidad de vectores adecuados y se encuentran disponibles comercialmente.

Los vectores víricos incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (p.ej., virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa tales como ortomixovirus (p.ej., virus de la gripe), rabdovirus (p.ej., virus de la rabia y de estomatitis vesicular), paramixovirus (p.ej., sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN de cadena doble que incluyen adenovirus, herpesvirus (p.ej., virus de Herpes Simple de tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus), y varicela (p.ej., vaccinia, varicela de ave de corral y varicela de canario). Otros virus incluyen el virus Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Los ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma aviar, virus de tipo B y tipo C de mamífero, virus de tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, en Fundamental Virology, Tercera Edición, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).

Por “vector lentiviral” se entiende vectores de lentivirus basados en VIH que son muy prometedores para la administración de genes debido a su relativamente grande capacidad de empaquetamiento, su inmunogenicidad reducida y su capacidad para transducir de forma estable con una alta eficacia un amplio rango de tipos celulares diferentes. Los vectores lentivirales se generan normalmente después de una transfección transitoria de tres (empaquetamiento, envoltura y transferencia) o más plásmidos en el interior de células productoras. Como el VIH, los vectores lentivirales entran en la célula diana a través de la interacción de glicoproteínas superficiales víricas con receptores sobre la superficie celular. Al entrar, el ARN vírico sufre una transcripción inversa, que está mediada por el complejo de transcriptasa inverso vírico. El producto de la transcripción inversa es un ADN vírico lineal de cadena doble, que es el sustrato de la integración vírica en el ADN de las células infectadas. Dichos vectores lentivirales pueden ser “integrativos” o “no integrativos”.

Por “vectores lentivirales integrativos (o LV)”, se entiende aquellos vectores, como ejemplo no limitativo, que son capaces de integrarse en el genoma de una célula diana.

Por el contrario, por “vectores lentivirales no integrativos (o NILV)” se entiende vectores de administración génica eficientes que no se integran en el genoma de una célula diana a través de la acción de la integrasa del virus.

Un tipo de vector preferido es un episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación cromosomal. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación y/o expresión autónoma de los ácidos nucleicos a los cuales están unidos. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que están ligados operativamente son preferidos en la presente memoria como vectores de expresión. Un vector de acuerdo a la presente invención comprende, aunque sin limitación, un vector YAC (cromosoma artificial de levadura), BAC (artificiación bacteriana), un vector de baculovirus, un fago, un fagémido, un cósmido, un vector vírico, un plásmido, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede consistir en ADN cromosomal, no cromosomal, semi-sintético o sintético. En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinantes a menudo se encuentran en la forma de “plásmidos” que generalmente se refieren a lazos de ADN de cadena doble que, en su forma de vector, no están unidos al cromosoma. Los especialistas en la técnica conocen una gran cantidad de vectores adecuados. Los vectores pueden comprender marcadores seleccionables, por ejemplo: neomicina fosfotransferasa, histidinol deshidrogenasa, dihidrofolato reductasa, higromicina fosfotransferasa, timidina cinasa de virus de herpes simple, adenosina desaminasa, glutamina sintetasa e hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa para el cultivo de células eucarióticas; TRP1 para S. cerevisiae; resistencia a tetraciclina, rifampicina o ampicilina en

E. coli. Preferiblemente dichos vectores son vectores de expresión, donde una secuencia que codifica un polipéptido de interés se coloca bajo el control de elementos de control transcripcionales y traduccionales apropiados para permitir la producción o la síntesis de dicho polipéptido. Por tanto, dicho polinucleótido está incluido en una casete de expresión. Más particularmente, el vector comprende un origen de replicación, un promotor ligado operativamente a dicho polinucleótido codificador, un sitio de unión de ribosoma, un sitio de separación de ARN (cuando se usa ADN genómico), un sitio de poliadenilación y un sitio de terminación de la transcripción. También puede comprender elementos potenciadores o silenciadores. La selección del promotor dependerá de la célula en la que se expresa el polipéptido. Los promotores adecuados incluyen promotores específicos de tejido y/o inducibles. Los ejemplos de promotores inducibles son: promotor de metalotionina eucariótico que es inducido por niveles incrementados de metales pesados, promotor lacZ procariótico que se induce en respuesta a isopropil-β-D-tiogalacto-piranósido (IPTG) y promotor de choque térmico eucariótico que se induce por un aumento de temperatura. Los ejemplos de promotores específicos de tejidos son la creatina cinasa de músculo esquelético, el antígeno específico de próstata (PSA), la α-tripsina proteasa, las proteínas A y B de tensioactivo humano (SP), la β-caseína y los genes de proteína de suero ácido.

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Los promotores inducibles pueden ser inducidos por patógenos o por estrés, más preferiblemente por estrés de tipo frío, calor, luz UV o concentraciones iónicas elevadas (revisado en Potenza et al (2004) In vitro Cell Dev Biol 40: 122). El promotor inducible se puede inducir mediante productos químicos [revisado en Moore et al. (2006); Padidam (2003); (Wang et al. (2003); y (Zuo y Chua (2000)].

Los vectores de administración y los vectores se pueden asociar o combinar con cualesquier técnicas de permeabilización celular tal como sonoporación o electroporación o variantes de dichas técnicas.

Cabe destacar que puede haber presente más de una región reguladora en un polinucleótido recombinante, p.ej., intrones, potenciadores, regiones de activación en dirección 5’, y elementos inducibles.

Las construcciones de ácido nucleico recombinante pueden incluir una secuencia de polinucleótidos insertada en un vector adecuado para la transformación de células (p.ej., células vegetales o células animales). Los vectores recombinantes pueden fabricarse usando, por ejemplo, técnicas de ADN recombinantes (véase, p.ej., Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Una secuencia de ácido nucleico recombinante como la descrita en la presente memoria puede integrarse en el genoma de una célula a través de recombinación ilegítima (es decir, aleatoria, no homóloga, no específica de sitio),

o una secuencia de ácido nucleico recombinante como la descrita en la presente memoria puede adaptarse para integrarse en el genoma de una célula por recombinación homóloga. Las secuencias de ácido nucleico adaptadas para integración vía recombinación homóloga están flanqueadas en ambos lados por secuencias que son similares o idénticas a las secuencias de nucleótido diana endógenas, lo que facilita la integración del ácido nucleico recombinante en el(los) sitio(s) particular(es) en el genoma que contiene las secuencias de nucleótido diana endógenas. Las secuencias de ácido nucleico adaptadas para la integración vía recombinación homóloga también pueden incluir un sitio de reconocimiento para una nucleasa específica de secuencia. Alternativamente, el sitio de reconocimiento para una nucleasa específica de nucleasa puede localizarse en el genoma de la célula que va a ser transformada. Las secuencias de ácido nucleico donantes descritas a continuación típicamente son adaptadas para la integración vía recombinación homóloga.

En algunas realizaciones, también se puede adaptar un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable para integrarse vía recombinación homóloga, y por tanto puede estar flanqueado en ambos lados por secuencias que son similares o idénticas a las secuencias endógenas dentro del genoma vegetal (p.ej., secuencias endógenas en el sitio de ruptura para una nucleasa específica de secuencia). En algunos casos, el ácido nucleico que contiene la secuencia codificadora para un marcador seleccionable también puede incluir un sitio de reconocimiento para una nucleasa específica de secuencia. En estas realizaciones, el sitio de reconocimiento para la nucleasa específica de secuencia puede ser el mismo o diferente al contenido dentro de la secuencia de ácido nucleico donante (es decir, puede ser reconocido por la misma nucleasa como secuencia de ácido nucleico donante, o reconocido por una nucleasa diferente de la secuencia de ácido nucleico donante).

En algunos casos, se puede adaptar una secuencia de ácido nucleico recombinante para integrarse en el genoma de una célula vía recombinación específica de sitio. Tal como se usa en la presente memoria, recombinación “específica de sitio” se refiere a la recombinación que se produce cuando una secuencia de ácido nucleico es dirigida a un(os) sitio(s) particular(es) dentro de un genoma no por homología entre secuencias en el ácido nucleico recombinante y secuencias del genoma, sino más bien por la acción de enzimas recombinasa que reconocen secuencias de ácido nucleico específicas y catalizan el intercambio recíproco de cadenas de ADN entre dichos sitios. Por tanto, recombinación específica de sitio se refiere a la ruptura y ligadura mediadas por enzima de dos secuencias de nucleótidos definidas. Se puede usar cualquier sistema de recombinación específico de sitio adecuado, incluyendo, por ejemplo, el sistema Cre-lox o el sistema FLP-FRT. En dichas realizaciones, se puede introducir un ácido nucleico que codifica una enzima recombinasa en una célula además de una secuencia de nucleótidos donante y una secuencia codificadora de nucleasa, y en algunos casos, una secuencia de marcador seleccionable. Véase, p.ej., la Patente de EE.UU. nº 4.959.317.

Endonucleasas específicas de secuencia

En la presente memoria se proporcionan nucleasas específicas de secuencia y ácidos nucleicos recombinantes que codifican las endonucleasas específicas de secuencia. Las endonucleasas específicas de secuencia pueden incluir dominios de unión de ADN de efector TAL y dominios de endonucleasa. Por tanto, los ácidos nucleicos que codifican dichas endonucleasas específicas de secuencia pueden incluir una secuencia de nucleótidos procedentes de un efector TAL específico de secuencia ligado a una secuencia de nucleótidos procedente de una nucleasa.

Los efectores TAL son proteínas de bacterias patogénicas vegetales que son inyectadas por el patógeno en la célula vegetal, donde viajan hasta el núcleo y actúan como factores de transcripción para activar genes vegetales específicos. La secuencia de aminoácidos primaria de un efector TAL dicta la secuencia de nucleótidos a la que se une. Por tanto, los sitios diana se pueden predecir para efectores TAL, y los efectores TAL también pueden generarse o modificarse para el propósito de unión a secuencias de nucleótidos particulares, tal como se describe en la presente memoria.

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Fusionadas a las secuencias de ácido nucleico que codifican efector TAL se encuentran secuencias que codifican una nucleasa o una porción de una nucleasa, típicamente un dominio de ruptura no específica procedente de una endonucleasa de restricción de tipo II tal como FokI (Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2256-1160). Otras endonucleasas útiles pueden incluir, por ejemplo, HhaI, HindIII, NotI, BbvCI, EcoRI, BglI y AlwI. El hecho de que algunas endonucleasas (p.ej., FokI) solo actúen como dímeros se puede capitalizar para potenciar la especificidad de diana del efector TAL. Por ejemplo, en algunos casos todos los monómeros FokI pueden fusionarse a una secuencia de efector TAL que reconozca una secuencia diana de ADN diferente, y solo cuando los dos sitios de reconocimiento estén en estrecha proximidad los monómeros inactivos se reúnen para crear una enzima funcional. Requiriendo la unión de ADN para activar la nucleasa, se puede crear una enzima de restricción altamente específica de sitio.

Una TALEN específica de secuencia como la proporcionada en la presente memoria puede reconocer una secuencia particular dentro de una secuencia de nucleótidos diana preseleccionada presente en una célula. Por tanto, en algunas realizaciones, se puede escanear una secuencia de nucleótidos para sitios de reconocimiento de nucleasa, y se puede seleccionar una nucleasa particular en base a la secuencia diana. En otros casos, se puede generar una TALEN para dirigir a una secuencia celular concreta. Se puede insertar una secuencia de nucleótidos que codifique la TALEN deseada en cualquier vector de expresión adecuado, y puede ligarse a una o más secuencias de control de expresión. Por ejemplo, una secuencia codificadora de nucleasa puede ligarse operativamente a una secuencia de promotor que conducirá a la expresión constitutiva de la endonucleasa en la especie vegetal que va a ser transformada. Alternativamente, una secuencia codificadora de endonucleasa se puede ligar operativamente a una secuencia promotora que conducirá a la expresión condicional (p.ej., expresión bajo determinadas condiciones nutricionales). Por ejemplo, se puede usar para expresión constitutiva un promotor 35S de virus de mosaico de coliflor. Otros promotores constitutivos incluyen, aunque sin limitación, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de ubiquitina y el promotor de actina. En algunas realizaciones, se puede usar un promotor inducido por estrógenos artificial para expresión condicional, y se pueden lograr niveles elevados de transcripción cuando se expone una planta a estrógenos. Otros promotores condicionales que pueden usarse incluyen, por ejemplo, promotores génicos de choque térmico inducible, y promotores regulados por luz tal como el que procede del gen que codifica la subunidad grande de ribulosa bifosfato carboxilasa.

Para propósitos de terapia, se administra la enzima modificadora de ADN-efector TAL de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable en una cantidad terapéuticamente efectiva. Se dice que dicha combinación debe administrarse en una “cantidad terapéuticamente efectiva” si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio en la fisiología del receptor. En el presente contexto, un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un descenso en la gravedad de uno o más síntomas de la enfermedad tratada y una corrección de genoma de la lesión o anormalidad. Los vectores que comprenden el ataque a ADN y/o ácido nucleico que codifica una enzima modificadora de ADN-efector TAL se pueden introducir en una célula mediante una variedad de métodos (p.ej., inyección, captación directa, bombardeo de proyectiles, liposomas, electroporación). Las enzimas modificadoras de ADN-efector TAL pueden expresarse de forma estable o transitoria en células usando vectores de expresión. Las técnicas de expresión de células eucarióticas son bien conocidas por los especialistas en la técnica. (Véase Current Protocols in Human Genetics: Capítulo 12 “Vectors For Gene Therapy” y Capítulo 13 “Delivery Systems for Gene Therapy”).

En un aspecto adicional de la presente invención, la enzima modificadora de ADN-efector TAL es sustancialmente no inmunogénica, es decir, engendra poca o ninguna respuesta inmunológica adversa. Según la invención, se puede usar una variedad de métodos para aliviar o eliminar reacciones inmunológicas nocivas de este tipo. En una realización preferida, la enzima modificadora de ADN-efector TAL está sustancialmente libre de N-formil metionina. Otro modo de evitar reacciones inmunológicas no deseadas es conjugar la enzima modificadora de ADN-efector TAL con polietilen glicol (“PEG”) o polipropilen glicol (“PPG”) (preferiblemente de 500 a 20.000 daltons de peso molecular medio (MW)). La conjugación con PEG o PPG, tal como describe Davis et al. (Patente de EE.UU. nº 4.179.337) por ejemplo, puede proporcionar conjugados con enzima modificadora de ADN-efector TAL no inmunogénicos, fisiológicamente activos y solubles en agua, con actividad antivírica. Métodos similares que también usan un copolímero de polietilen-polipropilen glicol se describen en Saifer et al. (Patente de EE.UU. nº 5.006.333).

Vectores donantes

En la presente memoria también se proporcionan ácidos nucleicos recombinantes que incluyen secuencias de nucleótidos donantes. Una secuencia de nucleótidos donante puede incluir una secuencia variante que tiene una o más modificaciones (es decir, sustituciones, eliminaciones o inserciones) con respecto a una secuencia de nucleótidos diana preseleccionada que se encuentra endógenamente dentro del genoma de una célula que va a ser transformada (también denominada en la presente memoria “secuencia de nucleótidos diana modificada”). La secuencia variante dentro del ácido nucleico donante típicamente está flanqueada en ambos lados por secuencias que son similares o idénticas a la secuencia de nucleótidos diana endógena dentro de la célula. Las secuencias flanqueantes pueden tener cualquier longitud adecuada, y típicamente tienen al menos 50 nucleótidos de longitud (p.ej., al menos 50 nucleótidos, al menos 75 nucleótidos, al menos 100 nucleótidos, al menos 200 nucleótidos, al menos 250 nucleótidos, al menos 300 nucleótidos, al menos 500 nucleótidos, al menos 750 nucleótidos, al menos

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1000 nucleótidos, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 5000 nucleótidos, entre aproximadamente 100 y 2500 nucleótidos, entre aproximadamente 100 y 1000 nucleótidos, entre aproximadamente 100 y 500 nucleótidos, entre aproximadamente 200 y aproximadamente 500 nucleótidos, o entre aproximadamente 250 y 400 nucleótidos). Por tanto, se puede producir la recombinación homóloga entre la construcción de ácido nucleico donante recombinante y la diana endógena en ambos lados de la secuencia variante, de tal modo que el genoma celular resultante contiene la secuencia variante dentro del contexto de secuencias endógenas procedentes, por ejemplo, del mismo gen. Se puede generar una secuencia de nucleótidos para dirigirla a cualquier secuencia adecuada dentro de un genoma. En una planta, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos donante se puede dirigir a un gen biosintético de lípidos, un gen biosintéticos de carbohidratos, un gen de proteína de almacenamiento de semilla, un gen de resistencia a enfermedades o plagas, un gen de tolerancia a estrés, un gen de tolerancia a sequía, o un gen que produce un anti-nutricional. Adicionalmente, la secuencia de nucleótidos donante contiene un sitio de reconocimiento para una nucleasa específica de secuencia, tal como se describe en la presente memoria.

Marcadores seleccionables

Algunos de los métodos proporcionados en la presente memoria incluyen el uso de un tercer ácido nucleico recombinante que codifica un marcador seleccionable o escrutable. Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que da como resultado un rasgo seleccionable puede incorporarse en un vector de expresión que contiene una o más secuencias de control de expresión. Por ejemplo, un vector de expresión puede incluir una secuencia que codifica un marcador seleccionable ligado operativamente a una secuencia promotora que conducirá a la expresión constitutiva en la célula vegetal que va a ser transformada. Los marcadores seleccionables adecuados pueden incluir, sin limitación, polipéptidos que confieren resistencia a un antibiótico tal como kanamicina, G418, bleomicina, ampicilina o higromicina, o un herbicida tal como glufosinato, clorosulfurón o fosfinotricina.

En realizaciones para uso en plantas, por ejemplo, un marcador seleccionable puede conferir resistencia a un herbicida que inhibe el punto de crecimiento o meristemo, tal como imidazolinona o una sulfonilurea. Los ejemplos de polipéptidos en esta categoría codifican para enzimas ALS y AHAS mutantes como se describe, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. nº 5.767.366 y 5.928.937. Las Patentes de EE.UU. nº 4.761.373 y 5.013.659 están dirigidas a plantas resistentes a varios herbicidas de imidazolinona y sulfonamida. La Patente de EE.UU. nº 4.975.374 se refiere a células vegetales y a plantas que contienen un gen que codifica una glutamina sintasa (GS) mutante resistente a la inhibición por herbicidas que se sabe que inhiben la GS, p.ej., fosfinotricina y metionina sulfoximina. La Patente de EE.UU. nº 5.162.602 describe plantas resistentes a la inhibición por herbicidas de ciclohexanodiona y ácido ariloxifenoxipropanoico. La resistencia es conferida por una acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa) alterada.

Los polipéptidos para resistencia a glifosato (vendido bajo el nombre comercial de Roundup®) también son adecuados para uso en plantas. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. nº 4.940.835 y 4.769.061. La Patente de EE.UU. nº 5.554.798 describe plantas de maíz resistentes a glifosato transgénicas, en las que la resistencia es conferida por una 5-enolpiruvil-3-fosfosikimato (EPSP) sintasa alterada. Dichos polipéptidos pueden conferir resistencia a composiciones herbicidas de glifosato que incluyen, sin limitación, sales de glifosato tales como la sal de trimetilsulfonio, la sal de isopropilamina, la sal sódica, la sal de potasio y la sal de amonio. Véase, p.ej., las Patentes de EE.UU. nº 6.451.735 y 6.451.732.

Los polipéptidos para resistencia a compuestos de fosfono tales como glufosinato amonio o fosfinotricina, y los ácidos piridinoxi o fenoxi propiónicos y ciclohexona también son adecuados. Véase, por ejemplo, la Publicación Europea nº 0 242 246, así como las Patentes de EE.UU. nº 5.879.903, 5.276.268 y 5.561.236.

Otros herbicidas incluyen aquellos que inhiben la fotosíntesis, tales como triacina y benzonitrilo (nitrilasa). Véase, p.ej., la Patente de EE.UU. nº 4.810.648. Otros herbicidas incluyen el ácido 2,2-dicloropropiónico, setoxidim, haloxifop, herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfonilurea, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de striacina y bromoxinil. También son adecuados los herbicidas que confieren resistencia a una enzima protox. Véase, p.ej., la Publicación de Patente de EE.UU. nº 20010016956 y la Patente de EE.UU. nº 6.084.155.

En algunas realizaciones, se puede adaptar un ácido nucleico recombinante que codifica un marcador seleccionable para integrarse en el genoma de una célula (p.ej., una célula vegetal o una célula animal) mediante recombinación específica de sitio. Por ejemplo, una secuencia que codifica un marcador seleccionable puede estar flanqueada por secuencias de reconocimiento para una recombinasa tal como, p.ej., Cre o FLP. En otras realizaciones, se puede adaptar un ácido nucleico recombinante que codifica un marcador seleccionable para la integración en un genoma vegetal mediante recombinación homóloga. En dichos ácidos nucleicos, la secuencia que codifica el marcador seleccionable puede estar flanqueada por secuencias similares o idénticas a secuencias de nucleótidos endógenas encontradas dentro del genoma de la célula vegetal en la que se introduce el ácido nucleico recombinante. Al menos una de las secuencias endógenas puede estar en el sitio de ruptura para una nucleasa específica de secuencia. El ácido nucleico que codifica el marcador seleccionable también puede contener un sitio de reconocimiento para una nucleasa específica de secuencia. La nucleasa puede ser la misma nucleasa específica de secuencia que la dirigida a la secuencia de nucleótidos donante, o una nucleasa específica de secuencia diferente de la dirigida a la secuencia de nucleótidos donante. En otras realizaciones adicionales, se puede adaptar un ácido nucleico recombinante que codifica un marcador seleccionado para su integración en el genoma de una célula vegetal por recombinación ilegítima. Dichos ácidos nucleicos típicamente carecen de secuencias flanqueantes y de sitios de

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reconocimiento de nucleasa que están contenidos dentro de ácidos nucleicos adaptados para recombinación homóloga o específica de sitio, tal como se describe en la presente memoria.

Métodos

Una o más de las construcciones proporcionadas en la presente memoria pueden usarse para transformar células y/o una enzima modificadora de ADN se puede introducir en células, de tal modo que se genera un organismo modificado genética (p.ej., una planta o un animal). Por tanto, también se proporcionan organismos y células modificados genéticamente que contienen los ácidos nucleicos y/o los polipéptidos descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, una célula transformada tiene una construcción de ácido nucleico recombinante integrada en su genoma, es decir, puede ser transformada de forma estable. Las células transformadas de forma estable típicamente retienen la secuencia de ácido nucleico introducida en cada división celular. Una construcción puede integrarse de un modo homólogo, de tal modo que una secuencia de nucleótidos endógena a la célula transformada es reemplazada por la construcción, donde la construcción contiene una secuencia que corresponde a la secuencia endógena, pero que contiene una o más modificaciones con respecto a la secuencia endógena. Cabe destacar que aunque una planta o animal que contiene dicha secuencia endógena modificada puede denominarse en la presente memoria “organismo modificado genéticamente” (GMO, del inglés “genetically modified organism”), la secuencia endógena modificada no se considera un transgén. Una construcción también puede integrarse de un modo ilegítimo, tal como cuando se integra aleatoriamente al genoma de la célula transformada.

Alternativamente, una célula puede ser transformada transitoriamente, de tal modo que la construcción no se integra en su genoma. Por ejemplo, un vector plásmido que contiene una secuencia codificadora de TALEN se puede introducir en una célula, de tal modo que la secuencia codificadora de TALEN es expresada pero el vector no se integra de forma estable al genoma. Las células transformadas transitoriamente pierden parte o toda la construcción de ácido nucleico introducida en cada división celular, de tal modo que el ácido nucleico introducido no puede ser detectado en células hijas tras un número suficiente de divisiones celulares. No obstante, la expresión de la secuencia que codifica TALEN es suficiente para lograr la recombinación homóloga entre una secuencia donante y una secuencia diana endógena. Tanto las células transformadas transitoriamente como las transformadas de forma estable pueden ser útiles en los métodos descritos en la presente memoria.

Particularmente, con respecto a las células vegetales modificadas genéticamente, las células usadas en los métodos descritos en la presente memoria pueden constituir una parte o la totalidad de una planta entera. Dichas plantas pueden cultivarse de un modo adecuado para la especie en consideración, tanto en una cámara de cultivo, un invernadero o un campo. Las plantas modificadas genéticamente pueden cultivarse según se desee para un propósito particular, p.ej., para introducir un ácido nucleico recombinante en otras líneas, para transferir un ácido nucleico recombinante a otras especies o para selección adicional de otros rasgos deseables. Alternativamente, las plantas modificadas genéticamente pueden propagarse vegetativamente para aquellas especies susceptibles a tales técnicas. La progenie incluye los descendentes de una planta o línea vegetal particular. La progenie de un planta dada incluye las semillas formadas en las plantas de las generaciones F1, F2, F3, F4, F5, F6 y posteriores, o en semillas formadas en las plantas de las generaciones BC1, BC2, BC3 y posteriores, o semillas formadas en las plantas de las generaciones F1BC1, F1BC2, F1BC3 y posteriores. Las semillas producidas por una planta modificada genéticamente pueden cultivarse y continuación cruzarse (o cruzarse exteriormente y luego consigo mismas) para obtener semillas homocigotas para la construcción de ácido nucleico.

Las células modificadas genéticamente (p.ej., células vegetales o células animales) pueden cultivarse en cultivo en suspensión, o cultivo de tejido u órgano, si se desea. Para los propósitos de los métodos proporcionados en la presente invención, se pueden usar técnicas de cultivo de tejido sólido y/o líquido. Cuando se usa un medio sólido, las células se pueden colocar directamente sobre el medio o pueden colocarse sobre una película de filtro que a continuación se pone en contacto con el medio. Cuando se usa un medio líquido, las células se pueden colocar en un dispositivo de flotación, p.ej., una membrana porosa que entra en contacto con el medio líquido. El medio sólido se prepara típicamente a partir del medio líquido añadiendo agar. Por ejemplo, un medio sólido puede ser un medio Murashige y Skoog (MS) que contiene agar y una concentración adecuada de un auxina, p.ej., ácido 2,4diclorofenoxiacético (2,4-D), y una concentración adecuada de una citoquinina, p.ej., quinetina.

Se puede transformar una célula con una construcción de ácido nucleico recombinante o con una pluralidad (p.ej., 2, 3, 4 ó 5) de construcciones de ácido nucleico recombinante. Si se utilizan múltiples construcciones, pueden transformarse simultánea o secuencialmente. Las técnicas para transformar una amplia variedad de especies son conocidas en la técnica. Los polinucleótidos y/o vectores recombinantes descritos en la presente memoria pueden introducirse en el genoma de un hospedante usando cualquiera de una serie de métodos conocidos, que incluyen electroporación, microinyección y métodos biolísticos. Alternativamente, se pueden combinar polinucleótidos o vectores con regiones flanqueantes de ADN-T adecuadas e introducidos en un vector hospedante de Agrobacterium tumefaciens convencional. Dichas técnicas de transformación mediadas por Agrobacterium tumefaciens, que incluyen desarmar y usar vectores binarios, son bien conocidas en la técnica. Otras técnicas de transferencia génica y de transformación incluyen transformación de protoplastos a través de calcio o PEG, captación mediada por electroporación de ADN desnudo, transfección mediada por liposomas, electroporación, transformación mediada por vector vírico, y bombardeo de microproyectiles (véase, p.ej., las Patentes de EE.UU. nº 5.538.880, 5.204.253,

5.591.616 y 6.329.571). Si una célula vegetal o cultivo de tejido se usan como tejido receptor para la transformación,

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las plantas se pueden regenerar a partir de cultivos transformados usando técnicas conocidas por los especialistas en la técnica.

En algunas realizaciones, se puede introducir una enzima modificadora de ADN (p.ej., una TALEN) directamente en una célula. Por ejemplo, un polipéptido puede introducirse en una célula mediante inyección mecánica, mediante administración vía sistema de secreción bacteriana de tipo III, electroporación, o mediante transferencia mediada por Agrobacterium. Véase, p.ej., Vergunst et al. (2000) Science 290: 979-982 para una discusión del sistema de transporte VirB/D4 de Agrobacterium, y su uso para mediar la transferencia de un complejo de nucleoproteína T en el interior de células vegetales.

Adicionalmente, con respecto a las plantas, los polinucleótidos, vectores y polipéptidos descritos en la presente memoria pueden introducirse en una serie de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas y sistemas de células vegetales, que incluyen dicotiledóneas tales como alazor, alfalfa, soja, café, amaranto, colza (de alto contenido en ácido erúcico y canola), cacahuete o girasol, así como plantas monocotiledóneas tales como palma de aceite, caña de azúcar, banana, pasto sudán, maíz, trigo, centeno, cebada, avena, arroz, mijo o sorgo. También son adecuadas las gimnoespermas tales como abeto y pino.

Por tanto, los métodos descritos en la presente memoria se pueden utilizar con plantas dicotiledóneas que pertenecen, por ejemplo, de los órdenes Magniolales, Illiciales, Laurales, Piperales, Aristochiales, Nymphaeales, Ranunculales, Papeverales, Sarraceniaceae, Trochodendrales, Hamamelidales, Eucomiales, Leitneriales, Myricales, Fagales, Casuarinales, Caryophyllales, Batales, Polygonales, Plumbaginales, Dilleniales, Theales, Malvales, Urticales, Lecythidales, Violales, Salicales, Capparales, Ericales, Diapensales, Ebenales, Primulales, Rosales, Fabales, Podostemales, Haloragales, Myrtales, Cornales, Proteales, Santales, Rafflesiales, Celastrales, Euphorbiales, Rhamnales, Sapindales, Juglandales, Geraniales, Polygalales, Umbellales, Gentianales, Polemoniales, Lamiales, Plantaginales, Scrophulariales, Campanulales, Rubiales, Dipsacales y Asterales. Los métodos descritos en la presente memoria también se pueden utilizar con plantas monocotiledóneas tales como las que pertenecen a los órdenes Alismatales, Hydrocharitales, Najadales, Triuridales, Commelinales, Eriocaulales, Restionales, Poales, Juncales, Cyperales, Typhales, Bromeliales, Zingiberales, Arecales, Cyclanthales, Pandanales, Arales, Lilliales y Orchidales, o con plantas que pertenecen a Gymnospermae, p.ej., Pinales, Ginkgoales, Cycadales y Gnetales.

Los métodos pueden usarse para un amplio rango de especies vegetales, que incluyen especies de los géneros de dicotiledóneas Atropa, Alseodaphne, Anacardium, Arachis, Beilschmiedia, Brassica, Carthamus, Cocculus, Croton, Cucumis, Citrus, Citrullus, Capsicum, Catharanthus, Cocos, Coffea, Cucurbita, Daucus, Duguetia, Eschscholzia, Ficus, Fragaria, Glaucium, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hyoscyamus, Lactuca, Landolphia, Linum, Litsea, Lycopersicon, Lupinus, Manihot, Majorana, Malus, Medicago, Nicotiana, Olea, Parthenium, Papaver, Persea, Phaseolus, Pistacia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Senecio, Sinomenium, Stephania, Sinapis, Solanum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Vicia, Vinca, Vitis y Vigna; los géneros de monocotiledóneas Allium, Andropogon, Aragrostis, Asparagus, Avena, Cynodon, Elaeis, Festuca, Festulolium, Heterocallis, Hordeum, Lemna, Lolium, Musa, Oryza, Panicum, Pannesetum, Phleum, Poa, Secale, Sorghum, Triticum y Zea; o los géneros de gimnoespermas Abies, Cunninghamia, Picea, Pinus y Pseudotsuga.

Una célula, callo, tejido o planta transformados pueden identificarse y aislarse seleccionando o realizando un escrutinio de las células modificadas para rasgos o actividades particulares, p.ej., aquellos codificados por genes marcadores o genes de resistencia a antibióticos. Dichas metodologías de escrutinio y selección son bien conocidas por los especialistas en la técnica. Adicionalmente, se pueden usar métodos físicos y bioquímicos para identificar transformantes. Estos incluyen análisis Southern o amplificación PCR para la detección de un polinucleótido; análisis de Northern blot, protección de S1 ARNasa, extensión de cebadores, o amplificación de RT-PCR para detectar tránscritos de ARN; ensayos enzimáticos para detectar actividad enzimática o de ribozimas de polipéptidos y polinucleótidos; y electroforesis de gel de proteínas, análisis Western blot, inmunoprecipitación, e inmunoensayos ligados a enzima para detectar polipéptidos. También pueden usarse otras técnicas tales como hibridación in situ, tinción enzimática e inmunotinción para detectar la presencia o la expresión de polipéptidos y/o polinucleótidos. Los métodos para llevar a cabo todas las técnicas referidas son bien conocidos. Los polinucleótidos que se incorporan de forma estable en células vegetales pueden introducirse en otras plantas usando, por ejemplo, técnicas de cultivo estándares.

En el contexto de la presente invención, “células eucarióticas” se refiere a una célula o línea celular fúngica, de levadura, vegetal o animal, derivada de los organismos enumerados a continuación y establecidos para cultivo in vitro. Más preferiblemente, los hongos pueden ser del género Aspergillus, Penicillium, Acremonium, Trichoderma, Chrysoporium, Mortierella, Kluyveromyces o Pichia. Más preferiblemente, los hongos pueden ser de las especies Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Acremonium chrysogenum, Trichoderma reesei, Mortierella alpine, Chrysosporium lucknowense, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris o Pichia ciferrii.

En la presente invención la planta puede ser del género Arabidopsis, Nicotiana, Solanum, Lactuca, Brassica, Oryza, Asparagus, Pisum, Medicago, Zea, Hordeum, Secale, Triticum, Capsicum, Cucumis, Cucurbita, Citrullis, Citrus o Sorghum. Más preferiblemente, la planta puede ser de la especie Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabaccum,

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Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Solanum melongena, Solanum esculentum, Lactuca saliva, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Oryza glaberrima, Oryza sativa, Asparagus officinalis, Pisum satiyum, Medicago sativa, Zea mays, Hordeum vulgare, Secale cereal, Triticum aestivum, Triticum durum, Capsicum sativus, Cucurbita pepo, Citrullus lanatus, Cucumis melo, Citrus aurantifolia, Citrus máxima, Citrus medica o Citrus reticulata.

En la presente invención la célula animal puede ser del género Homo, Rattus, Mus, Sus, Bos, Danio, Canis, Felis, Equus, Salmo, Oncorhynchus, Gallus, Meleagris, Drosophila o Caenorhabditis; más preferiblemente, la célula animal puede ser de la especie Homo sapiens, Rattus norvegicus, Mus musculus, Sus scrofa, Bos taurus, Danio rerio, Canis lupus, Felis catus, Equus caballus, Oncorhynchus mykiss, Gallus gallus o Meleagris gallopavo; la célula animal puede ser una célula de las especies de pez de Salmo salar, pez teleósteo o pez cebra, como ejemplos no limitativos. La célula animal de la presente invención puede ser también una célula de insecto de Drosophila melanogaster como ejemplo no limitativo; la célula animal también puede ser una célula de gusano de Caenorhabditis elegans como ejemplo no limitativo.

En la presente invención, la célula puede ser una célula vegetal, una célula de mamífero, una célula de pez, una célula de insecto o líneas celulares derivadas de estos organismos para cultivos in vitro, o células primarias tomadas directamente de tejido vivo y establecidas para cultivo in vitro. Como ejemplos no limitativos, las líneas celulares pueden seleccionarse del grupo que consiste en células CHO-K1; células HEK293; células Caco2; células U2-OS; células NIH 3T3; células NSO; células SP2; células CHO-S; células DG44; células K-562; células U-937; células MRC5; células IMR90; células Jurkat; células HepG2; células HeLa; células HT-1080; células HCT-116; células Huh7; células Huvec; células Molt 4.

Todas estas líneas celulares pueden modificarse mediante el método de la presente invención para proporcionar modelos de líneas celulares para producir, expresar, cuantificar, detectar, estudiar un gen o una proteína de interés; estos modelos también pueden usarse para escrutar moléculas biológicamente activas de interés en investigación y producción en varios campos tales como productos químicos, biocombustibles, agentes terapéuticos y agronomía, como ejemplos no limitativos.

La presente descripción también proporciona métodos para emplear los dominios de unión de ADN específicos de secuencia dentro de efectores TAL, por ejemplo, para alterar el material genético dentro de las células, para modular la expresión génica, y para atacar secuencias patogénicas, p.ej., en terapias antivíricas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos para modificar material genético celular. En algunas realizaciones, los métodos incluyen la introducción de un polipéptido que contiene un dominio de unión de ADN de efector TAL, o un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, al interior de una célula. El dominio de unión de ADN de efector TAL puede fusionarse a una porción o a la totalidad de una enzima modificadora de ADN (p.ej., una endonucleasa). En algunas realizaciones, los métodos incluyen la introducción de dos o más ácidos nucleicos recombinantes en una célula. Un primer ácido nucleico recombinante contiene una secuencia de nucleótidos donante que incluye una o más modificaciones (es decir, sustituciones, eliminaciones o inserciones) con respecto a una secuencia de nucleótidos diana preseleccionada correspondiente que se encuentre en la célula. La secuencia de nucleótidos donante puede sufrir recombinación homóloga con la secuencia de nucleótidos diana endógena, de tal modo que la secuencia endógena o una porción de la misma es reemplazada por la secuencia donante o porción de la misma. La secuencia de nucleótidos diana típicamente incluye un sitio de reconocimiento para una TALEN específica de secuencia. En algunos casos, una secuencia de nucleótidos diana puede incluir sitios de reconocimiento para dos o más TALENs distintas (p.ej., dos secuencias diana opuestas que son distintas, de tal modo que se pueden usar TALENs que tengan distinta especificidad de unión de secuencia de ADN). En tal caso, la especificidad de la ruptura de ADN puede incrementarse en comparación con los casos en los que se usa una única secuencia (o múltiples copias de la misma secuencia diana).

Un segundo ácido nucleico recombinante contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una TALEN específica de secuencia que se une al sitio de reconocimiento en la secuencia de nucleótidos diana. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos donante y la secuencia de nucleótidos que codifica la nucleasa específica de secuencia pueden estar contenidas en la misma construcción de ácido nucleico. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos donante y la secuencia codificadora de TALEN pueden estar contenidas en construcciones separadas, o el polipéptido de TALEN puede ser producido e introducido directamente en una célula.

En algunas realizaciones, también se puede usar un tercer ácido nucleico recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos que contiene un marcador seleccionable. El segundo y tercer ácidos nucleicos recombinantes pueden sufrir recombinación con secuencias endógenas e integrarse de este modo en el genoma de la célula. Estos eventos de recombinación puede ser ilegítimos (es decir, aleatorios), o pueden producirse a través de recombinación homóloga o a través de recombinación específica de sitio. Los ácidos nucleicos recombinantes pueden ser transformados simultánea o secuencialmente en la célula, y pueden ser linealizados antes de la transformación.

Cuando la célula es una célula vegetal, los métodos proporcionados en la presente memoria pueden incluir además etapas tales como la generación de una planta que contenga la célula transformada, la generación de una progenie de la planta, la selección o escrutinio de plantas que expresen el marcador seleccionable (si se incluye), la generación de progenie de las plantas seleccionadas, y la evaluación de las plantas (p.ej., tejido, semillas, células precursoras o plantas completas) o de la progenie de las plantas para recombinación en la secuencia de nucleótidos

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diana. En algunos casos, los métodos pueden incluir el cruce externo de las plantas seleccionadas para eliminar el marcador seleccionable y/o el escrutinio de plantas cruzadas para determinar la ausencia de la nucleasa específica de secuencia.

En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos para modificar el material genético de una célula, p.ej., una célula procariótica, una célula animal o una célula vegetal. Los métodos pueden incluir introducir en la célula un primer ácido nucleico recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos diana modificada que incluye una o más modificaciones en la secuencia de nucleótidos con respecto a una correspondiente secuencia de nucleótidos presente en la célula, así como un sitio de reconocimiento para una TALEN específica de secuencia, y un segundo ácido nucleico recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la TALEN específica de secuencia. Cuando la célula es una célula vegetal, se puede generar una planta que contiene la célula, y se pueden analizar células, semillas o tejido obtenidos de la planta (o de su progenie) para determinar si hay recombinación en la secuencia de nucleótidos diana. El primer y segundo ácidos nucleicos recombinantes pueden transformarse simultáneamente o secuencialmente en el interior de la célula, y uno o ambos pueden ser linealizados antes de la transformación. En algunos casos, el primer y segundo ácidos nucleicos recombinantes pueden estar presentes en la misma construcción.

En algunos casos, el método también puede incluir la introducción en la célula de un tercer ácido nucleico recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un marcador seleccionable, y determinar si la célula, un organismo generado a partir de la célula, o la progenie de la misma, expresa el marcador seleccionable. El método puede incluir además el escrutinio de la célula, el organismo o su progenie para determinar la ausencia del marcador seleccionable. La secuencia de nucleótidos que codifica el marcador seleccionable puede o no estar flanqueada en ambos lados por secuencias de nucleótidos que son similares o idénticas a las secuencias de nucleótidos endógenas a la célula en el sitio de ruptura para una segunda nucleasa específica de secuencia, o por sitios de reconocimiento para una recombinasa específica de secuencia. En algunos casos, el método también puede incluir la etapa de cruzar de manera externa el organismo. La progenie de los cruces puede someterse a escrutinio para determinar la ausencia del marcador seleccionable.

La presente descripción también proporciona métodos para modificar el material genético de una célula (p.ej., una célula vegetal o una célula animal), que comprenden proporcionar una célula que contiene una secuencia de ADN diana, p.ej., una secuencia cromosomal, mitocondrial o de cloroplasto, en la que se desea que se produzca la recombinación homóloga, siempre que una TALEN que contenga un dominio de enzima modificadora de ADN (p.ej., un dominio de endonucleasa) y un dominio de efector TAL que tiene una pluralidad de repeticiones de efector TAL que, en combinación, se unen a una secuencia de nucleótidos específica dentro de la secuencia de ADN diana, proporcionar un ácido nucleico que contenga una secuencia homóloga a al menos una porción del ADN diana, y poner en contacto la secuencia de ADN diana de la célula con la endonucleasa TAL de tal modo que se rompan ambas cadenas de una secuencia de nucleótidos dentro o adyacente a la secuencia de ADN diana de la célula. Dicha ruptura puede potenciar la frecuencia de la recombinación homóloga en la secuencia de ADN diana. La secuencia de ADN diana puede ser endógena a la célula. Los métodos pueden incluir la introducción en la célula de un vector que contiene un ADNc que codifica la endonucleasa TAL, y la expresión de una proteína de endonucleasa TAL en la célula. En algunos casos, la propia proteína de endonucleasa TAL puede ser introducida en la célula, por ejemplo, mediante inyección mecánica, mediante administración a través de un sistema de secreción bacteriano de tipo III, mediante electroporación o mediante transferencia mediada por Agrobacterium.

Los métodos descritos en la presente memoria puede usarse en una variedad de situaciones. En agricultura, por ejemplo, los métodos descritos en la presente memoria son útiles para facilitar la recombinación homóloga en un sitio diana y pueden usarse para eliminar un transgén integrado previamente (p.ej., un transgén de resistencia a herbicida) de una línea, variedad o híbrido vegetal. Los métodos descritos en la presente memoria también pueden usarse para modificar un gen endógeno de tal modo que la enzima codificada por el gen confiera resistencia a herbicida, p.ej., modificación de un gen de 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato (EPSP) sintasa endógena de tal modo que la enzima modificada confiera resistencia a herbicidas de glifosato. Como ejemplo adicional, los métodos descritos en la presente memoria son útiles para facilitar la recombinación homóloga en regiones reguladoras para uno o más genes endógenos en una ruta metabólica vegetal o de animal (p.ej., biosíntesis de ácidos grasos), de tal modo que la expresión de dichos genes se ve modificada de un modo deseado. Los métodos descritos en la presente memoria son útiles para facilitar la recombinación homóloga en un animal (p.ej., una rata o un ratón) en uno o más genes endógenos de interés implicados, como ejemplos no limitativos, en rutas metabólicas y de señalización interna tal como los que codifican marcadores de superficie celular, genes identificados por estar ligados a una enfermedad particular, y cualesquier genes conocidos por ser responsables de un fenotipo particular de una célula animal.

La presente descripción también proporciona métodos para diseñar efectores TAL específicos de secuencia capaces de interactuar con secuencias de ADN particulares (p.ej., TALENs capaces de romper ADN en localizaciones específicas). Los métodos pueden incluir la identificación de una secuencia de nucleótidos diana (p.ej., una secuencia cromosomal endógena, una secuencia de ADN mitocondrial o una secuencia de ADN de cloroplasto) en la cual se desea tener unión de efector TAL (p.ej., una secuencia adyacente a una segunda secuencia de nucleótidos en la cual se desea introducir un corte de cadena doble), y diseñar un efector TAL específico de

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secuencia que contenga una pluralidad de repeticiones de unión de ADN que, combinadas, se unan a la secuencia diana. Tal como se describe en al presente memoria, los efectores TAL incluyen una serie de repeticiones imperfectas que determinan la especificidad con la que interaccionan con ADN. Cada repetición se une a una única base, dependiendo de la secuencia de di-aminoácido particular en los residuos 12 y 13 de la repetición. Por tanto, modificando las repeticiones con un efector TAL (p.ej., usando técnicas estándares o las técnicas descritas en la presente memoria), se puede atacar a sitios de ADN particulares. Dichos efectores TAL modificados pueden usarse, por ejemplo, como factores de transcripción dirigidos a secuencias de ADN particulares. En la Figura 1A se muestra un diagrama de un efector TAL genérico, con la región de repetición indicada con cajas abiertas, y el RVD de la secuencia de repetición representativa (SEQ ID NO: 1) subrayado.

Los ejemplos de RVDs y sus correspondientes nucleótidos diana se muestran en la Tabla 1A (Véase también la Publicación PCT nº WO 2010/079430).

Tabla 1A

RVD

Nucleótido

HD

C

NG

T

NI

A

NN

G ó A

NS

A ó C ó G

N*

C ó T

HG

T

H*

T

IG

T

* Denota un hueco en la secuencia de repetición correspondiente a una carencia de un residuo de aminoácido en la segunda posición del RVD.

En la Tabla 1B se muestran otros RVDs y sus correspondientes nucleótidos diana:

Tabla 1B

RVD

Nucleótido

HA

C

ND

C

NK

G

HI

C

HN

G

NA

G

SN

G ó A

YG

T

Cuando se desea tener una ruptura de ADN específica de secuencia, por ejemplo, se puede diseñar una TALEN específica de secuencia que contenga (a) una pluralidad de dominios de repetición de unión a ADN que, combinados, se unan a la secuencia de nucleótidos cromosomal endógena, y (b) una endonucleasa que genere un corte de cadena doble en la segunda secuencia de nucleótidos. Dicha ruptura de ADN específica de secuencia puede ser útil para potenciar la recombinación homóloga, tal como se describe en la presente memoria. Otros usos para las TALENs incluyen, por ejemplo, como agentes terapéuticos contra virus. Las TALENs pueden modificarse para atacar a secuencias víricas particulares, rompiendo el ADN vírico y reduciendo o eliminando la virulencia.

Los materiales y métodos proporcionados en la presente memoria pueden usarse para modificar la secuencia de un gen particular de un modo dirigido. Un gen puede contener una pluralidad de secuencias a las cuales se podría dirigir un efector TAL modificado. Sin embargo, tal como se describe en la presente memoria, determinadas secuencias diana pueden ser atacadas de forma más efectiva. Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 9, las secuencias que tienen características particulares pueden ser atacadas de forma más efectiva por efectores TAL. Por tanto, los métodos proporcionados en la presente memoria pueden incluir la identificación de secuencias diana que cumplan criterios particulares. Éstas incluyen secuencias que: i) tienen una longitud mínima de 15 bases y una orientación de 5’ a 3’ con una T inmediatamente precedente al sitio del extremo 5’; ii) no tienen una T en la primera

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posición (5’) o una A en la segunda posición; iii) acaban en T en la última posición (3’) y no tienen una G en la siguiente a la última posición; y iv) tienen una composición de bases de 0-63% de A, 11-63% de C, 0-25% de G y 242% de T.

Puesto que las TALENs descritas en la presente memoria generalmente funcionan como dímeros, algunas realizaciones de los métodos proporcionados en la presente memoria pueden incluir la identificación de una primera secuencia de nucleótidos genómica y una segunda secuencia de nucleótidos genómica en una célula, donde la primera y la segunda secuencias de nucleótidos cumplen al menos uno de los criterios establecidos antes y están separadas por 15-18 pb. En algunos casos, un polipéptido de TALEN se puede unir a cada una de las secuencias de nucleótidos, y la endonucleasa contenida en la TALEN puede provocar la ruptura en el espaciador de 15-18 pb.

La presente descripción también proporciona métodos para generar animales modificados genéticamente en los que se ha introducido un ácido nucleico deseado. Dichos métodos pueden incluir la obtención de una célula que contenga una secuencia de ADN diana cromosomal endógena en la que se desea introducir el ácido nucleico, la introducción en la célula de una TALEN para generar un corte de cadena doble en la secuencia de ADN diana cromosomal endógena, la introducción en la célula de un ácido nucleico exógeno que contenga una secuencia homóloga a al menos una porción del ADN diana cromosomal endógeno, donde la introducción se realiza en las condiciones que permitan que se produzca la recombinación homóloga entre el ácido nucleico exógeno y el ADN diana cromosomal endógeno, y la generación de un animal a partir de la célula primaria en la que se ha producido la recombinación homóloga. El ácido nucleico homólogo puede incluir, p.ej., una secuencia de nucleótidos que altere un gen tras la recombinación homóloga, una secuencia de nucleótidos que reemplace un gen tras la recombinación homóloga, una secuencia de nucleótidos que introduzca una mutación puntual en un gen tras la recombinación homóloga, o una secuencia de nucleótidos que introduzca un sitio regulador tras la recombinación homóloga.

Los métodos proporcionados en la presente memoria también pueden usarse para generar plantas modificadas genéticamente en las que se ha introducido un ácido nucleico deseado. Dichos métodos pueden incluir la obtención de una célula vegetal que contenga una secuencia de ADN diana endógena en la que se desea introducir el ácido nucleico, la introducción de una TALEN para generar un corte de cadena doble en la secuencia de ADN diana endógena, la introducción en la célula vegetal de un ácido nucleico exógeno que contenga una secuencia homóloga a al menos una porción del ADN diana endógeno, donde la introducción se realiza en las condiciones que permitan que se produzca la recombinación homóloga entre el ácido nucleico exógeno y el ADN diana endógeno, y la generación de una planta a partir de la célula vegetal en la que se ha producido la recombinación homóloga.

El ADN de las células generadas por los métodos de recombinación homóloga facilitada por TALEN proporcionados en la presente memoria es modificado, en comparación a las células que no han sufrido dichos métodos, y las células que contienen el ADN modificado se denominan “modificadas genéticamente”. Cabe destacar, no obstante, que los organismos que contienen dichas células pueden no ser considerados como GMO para fines regulatorios, ya que dicha modificación implica una recombinación homóloga y no la integración aleatoria de un transgén. Por tanto, el uso de métodos facilitados por TALEN descritos en la presente memoria para generar modificaciones genéticas puede ser ventajoso en el sentido de que, por ejemplo, se pueden evitar los procedimientos regulatorios estándares junto al tiempo y coste asociados.

Otros métodos de recombinación genética dirigida, tal como se proporciona en la presente memoria, pueden incluir la introducción en una célula (p.ej., una célula vegetal, célula de insecto, célula de pez teleósteo o célula animal) una molécula de ácido nucleico que codifica una TALEN dirigida a una secuencia diana de ADN seleccionada, inducir la expresión de la TALEN dentro de la célula, e identificar una célula recombinante en la que la secuencia diana de ADN seleccionada exhibe una mutación (p.ej., una eliminación de material genético, una inserción de material genético, o ambas, una eliminación y una inserción de material genético). También se puede introducir un ADN donante en la célula.

En algunas realizaciones, se puede usar una TALEN monomérica. Las TALENs descritas en la presente memoria normalmente actúan como dímeros a través de un sitio de reconocimiento bipartito con un espaciador, de tal modo que dos dominios de efector TAL están fusionados cada uno de ellos a un dominio catalítico de la enzima de restricción FokI, los sitios de reconocimiento de ADN para cada TALEN resultante están separados por una secuencia espaciadora, y la unión de cada monómero de TALEN con el sitio de reconocimiento permite que la FokI dimerice y cree un salto de cadena doble dentro del espaciador (véase, p.ej., Moscou y Bogdanove (2009) Science

326: 1501). También pueden construirse TALENs monoméricas, sin embargo, de tal modo que los efectores TAL se fusionan a una nucleasa que no requiere dimerización para funcionar. Una nucleasa de este tipo, por ejemplo, es una variante de cadena sencilla de FokI en la que dos monómeros se expresan como un único polipéptido (Minczuk et al. (2008) Nucleic Acids Res. 36: 3926-3938). Otras nucleasa monoméricas naturales o modificadas también pueden servir para esta función. El dominio de reconocimiento de ADN usado para una TALEN monomérica puede derivarse de un efector TAL natural. Alternativamente, el dominio de reconocimiento de ADN puede modificarse para reconocer una diana de ADN específica. Las TALENs de cadena sencilla modificadas pueden ser más fáciles de construir y poner en servicio, ya que solo requieren un dominio de reconocimiento de ADN modificado.

En algunas realizaciones, se puede generar una nucleasa específica de secuencia de ADN dimérica usando dos dominios de unión de ADN diferentes (p.ej., un dominio de unión de efector TAL y un dominio de unión de otro tipo

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de molécula). Como se ha establecido anteriormente, las TALENs descritas en la presente memoria normalmente actúan como dímeros a través de un sitio de reconocimiento bipartito con un espaciador. Esta arquitectura de nucleasa también puede usarse para nucleasas específicas de diana generadas a partir de, por ejemplo, un monómero de TALEN y un monómero de nucleasa de dedo de zinc. En tal caso, los sitios de reconocimiento de ADN para los monómeros de nucleasa de TALEN y de dedo de zinc pueden estar separados por un espaciador de longitud apropiada. La unión de los dos monómeros puede permitir que la FokI se dimerice y cree un salto de cadena doble dentro de la secuencia espaciadora. Los dominios de unión de ADN diferentes a los dedos de zinc, tal como homeodominios, repeticiones myb o cremalleras de leucina, también pueden ser fusionadas con FokI y actuar como pareja de un monómero de TALEN para crear una nucleasa funcional.

En algunas realizaciones, se puede usar un efector TAL para dirigir otros dominios de proteína (p.ej., dominios de proteína no nucleasa) a secuencias de nucleótidos específicas. Por ejemplo, se puede ligar un efector TAL a un dominio de proteína procedente de, sin limitación, una enzima que interaccione con ADN (p.ej., una metilasa, una topoisomerasa, una integrasa, una transposasa o una ligasa), un activador o represor de la transcripción, o una proteína que interaccione o modifique otras proteínas tales como las histonas. Las aplicaciones de dichas fusiones de efector TAL incluyen, por ejemplo, crear o modificar elementos reguladores epigenéticos, hacer inserciones, eliminaciones o reparaciones específicas de sitio en ADN, controlar la expresión génica, y modificar la estructura de cromatina.

En algunas realizaciones, el espaciador de la secuencia diana puede seleccionarse o variarse para modular la especificidad y la actividad de TALEN. Los resultados presentados en la presente memoria para TALENs que actúan como dímeros a través de un sitio de reconocimiento bipartito con un espaciador demuestran que las TALENs pueden actuar con un rango de longitudes del espaciador, y que la actividad de las TALENs varía con la longitud del espaciador. Véase, p.ej., el Ejemplo 6 incluido más adelante. La flexibilidad en la longitud del espaciador indica que la longitud del espaciador puede elegirse para atacar a secuencias concretas (p.ej., de un genoma) con una elevada especificidad. Además, la variación de actividad observada para diferentes longitudes de espaciador indica que la longitud de espaciador puede seleccionarse para alcanzar un nivel deseado de actividad de TALEN.

En algunas realizaciones, la actividad de TALEN se puede modular variando el número y la composición de las repeticiones dentro de el(los) dominio(s) de unión a ADN. Tal como se describe en el Ejemplo 7 de la presente memoria, por ejemplo, una TALEN basada en PthXoI mostró mayor actividad que una TALEN basada en AvrBs3. La PthXoI difiere de la AvrBs3 tanto en el número como en la composición de RVD de sus repeticiones. Adicionalmente, los sitios de reconocimiento de ADN naturales correspondientes a estas proteínas difieren en su divergencia respecto a las respectivas secuencias de reconocimiento predichas en base a la cifra de ADN de efector TAL descrita por Moscou y Bogdanove (ver cita anterior). Adicionalmente, varias TALENs a medida de la misma longitud (12 RVDs) pero con diferente composición de RVD, difirieron en su actividad, y una TALEN a medida de 13 RVD presentó mayor actividad que una TALEN a medida de 12 RVD. Por tanto, no solo se pueden diseñar las TALENs para reconocer una secuencia de ADN de interés, sino que (1) el número de repeticiones puede variarse para modular la actividad, (2) se pueden seleccionar diferentes sitios de unión para alcanzar diferentes niveles de actividad, y (3) la composición de los RVDs y su ajuste en el sitio diana (según la cifra) pueden variarse para modular la actividad de la TALEN.

Cuando la TALEN está en una forma heterodimérica, por ejemplo con dos monómeros diferentes que incluyen cada uno un dominio de efector TAL y un dominio catalítico de nucleasa FokI, los RVDs se pueden encontrar en número equivalente en cada uno de los dos dominios de efector TAL, o cada dominio puede presentar un número diferente de RVDs. Por ejemplo, si se usa un total de 22 RVDs para unir ADN en una TALEN heterodimérica particular, se pueden encontrar 11 repeticiones en cada uno de los dos dominios de efector TAL; alternativamente, se pueden encontrar 10 repeticiones en uno de los dos dominios de efector TAL y 12 en el otro. La presente invención también abarca TALEN con un dominio de enzima modificadora de ADN que actúa como un monómero. En este caso, todos los RVDs se pueden encontrar en un único dominio de efector TAL, que está fusionado a la enzima monomérica. En este caso, a fin de tener una unión eficaz, el número de RVDs debe ser equivalente al número total de RVDs que se encontraría en una TALEN dimérica equivalente. Por ejemplo, en lugar de tener 10 repeticiones en dos dominios de efector TAL diferentes (como en el caso de una TALEN dimérica), uno tendría 20 repeticiones en un único dominio de efector TAL (como en el caso de una TALEN monomérica).

En un aspecto adicional de la invención, el número total de repeticiones en la TALEN dimérica o monomérica es de al menos 14. En otro aspecto adicional de la invención, el número total de repeticiones en la TALEN dimérica o monomérica es de al menos 20. En otro aspecto adicional de la invención, el número total de repeticiones en la TALEN dimérica o monomérica es de al menos 24. En otro aspecto adicional de la invención, el número total de repeticiones en la TALEN dimérica o monomérica es de al menos 30.

Esta solicitud de patente también proporciona métodos para genera proteínas de efector TAL que tienen una capacidad mejorada para atacar a un ADN diana. Los métodos pueden incluir, por ejemplo, la generación de un ácido nucleico que codifica un efector TAL que tiene un dominio de unión de ADN con una pluralidad de repeticiones de unión de ADN, conteniendo cada repetición un RVD que determina el reconocimiento de un par base del ADN diana, donde cada repetición de unión de ADN es responsable del reconocimiento de un par base del ADN diana. Tal como se describe en el Ejemplo 12 de esta memoria, relajar el requisito de una T en la posición -1 del sitio de

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unión puede potenciar la capacidad de ataque dirigido de proteínas de efector TAL modificadas. Por tanto, la generación de un efector TAL que codifica ácido nucleico puede incluir la incorporación de un ácido nucleico que codifica una variante 0ª de secuencia de repetición de unión a ADN con especificidad por A, C ó G, eliminando de este modo el requisito de una T en la posición -1 del sitio de unión.

Adicionalmente, se proporcionan métodos en la presente memoria para generar efectores TAL que tienen una capacidad de ataque mejorada para un ADN diana. Dichos métodos pueden incluir la generación de un ácido nucleico que codifica un efector TAL que comprende un dominio de unión a ADN que tiene una pluralidad de repeticiones de unión de ADN, conteniendo cada repetición un RVD que determina el reconocimiento de un par base del ADN diana. Tal como se describe en el Ejemplo 12 de la presente memoria, la especificidad de NN (el RVD más común que reconoce G) resulta de forma general débil y puede variar con el contexto, pero determinados RVDs pueden tener una especificidad mejorada para G. Por tanto, los métodos proporcionados en la presente memoria pueden incluir el uso de RVDs alternativos que pueden tener una especificidad más robusta por G. Por ejemplo, se puede usar uno o más RVDs seleccionados del grupo que consiste en RN, R*, NG, NH, KN, K*, NA, NT, DN, D*, NL, NM, EN, E*, NV, NC, QN, Q*, NR, NP, HN, H*, NK, NY, SN, S*, ND, NW, TN, T*, NE, NF, YN, Y* y NQ, donde el asterisco indica un hueco en la segunda posición del RVD.

Artículos de Fabricación

La presente descripción también proporciona artículos de fabricación que contienen, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican TALENs, polipéptidos de TALEN, composiciones que contienen dichas moléculas de ácido nucleico o polipéptidos, o líneas celulares modificadas con endonucleasa TAL. Dichos artículos se pueden usar, por ejemplo, como herramientas de investigación, o terapéuticamente.

En algunas realizaciones, un artículo de fabricación puede incluir semillas de plantas generadas usando los métodos proporcionados en la presente memoria. Las semillas pueden ser condicionadas usando medios conocidos en la técnica y envasadas usando materiales de envase bien conocidos en la técnica para preparar un artículo de fabricación. Un envase de semilla puede tener una etiqueta, p.ej., una etiqueta o marca asegurada sobre el material de envase, una etiqueta impresa en el material de envase o una etiqueta insertada dentro del envase. La etiqueta puede indicar que las semillas contenidas dentro del envase pueden producir un cultivo de plantas modificadas genéticamente, y puede describir los rasgos que se han alterado con la modificación genética con respecto a plantas no modificadas.

Otras definiciones

-Los residuos de aminoácidos o las subunidades de una secuencia de polipéptido se designan en la presente memoria según el código de una letra, en el que, por ejemplo, Q significa un residuo de Gln o Glutamina, R significa un residuo de Arg o Arginina y D significa un residuo de Asp o ácido Aspártico.

-Sustitución de aminoácidos significa reemplazar un residuo de aminoácido por otro, por ejemplo reemplazar un residuo de Arginina por un residuo de Glutamina en una secuencia de péptidos es una sustitución de aminoácidos.

-Los nucleótidos se designan de la siguiente manera: se usa el código de una letra para designar la base de un nucleótido: a es adenina, t es timina, c es citosina y g es guanina. Para los nucleótidos degenerados, r representa g ó a (nucleótidos de purina), k representa g ó t, s representa g ó c, w representa a ó t, m representa a ó c, y representa t ó c (nucleótidos de pirimidina), d representa g, a ó t, v representa g, a ó c, b representa g, t ó c, h representa a, t ó c, y n representa g, a, t ó c.

-El término “enzima modificadora de ADN” se refiere a cualquier proteína que sea capaz de modificar el material genético de una célula, sea cual sea el nivel de modificación de ADN (ruptura, interacción covalente, interacción mediada por agua…). Las proteínas que interaccionan con ADN (p.ej., una metilasa, una topoisomerasa, una integrasa, una transposasa o una ligasa), los activadores o los represores de la transcripción, otras proteínas tales como las histonas, y las nucleasas quedan incluidas en el significado de “enzima modificadora de ADN”. Cuando está comprendida en una en una enzima modificadora de ADN-efector TAL, la enzima modificadora de ADN es referida como el dominio de enzima modificadora de ADN.

-El término “nucleasa” pretende incluir exonucleasas y endonucleasas.

-El término “endonucleasa” se refiere a cualquier tipo o variante de enzima capaz de catalizar la hidrólisis (ruptura) de enlaces entre ácidos nucleicos dentro de una molécula de ADN o ARN, preferiblemente una molécula de ADN. Los ejemplos no limitativos de endonucleasas incluyen endonucleasas de restricción de tipo II tales como FokI, HhaI, HindIII, NotI, BbvCI, EcoRI, BglI y AlwI. Las endonucleasas comprenden también endonucleasas de corte inmaduro cuando tienen típicamente un sitio de reconocimiento de polinucleótidos de aproximadamente 12-45 pares base (pb) de longitud, más preferiblemente de 14-45 pb. Las endonucleasas de corte inmaduro aumentan significativamente HR induciendo roturas de ADN de cadena doble (DSBs, del inglés “double-strand breaks”) en una posición definida (Rouet, Smih et al. 1994; Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud y Silva 2007). Las endonucleasas de corte inmaduro pueden, por ejemplo, ser una endonucleasa albergadora (Paques y Duchateau,

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2007), una nucleasa de anillo de zinc quimérica (ZFN, del inglés “Zinc-Finger Nuclease”) que da como resultado la fusión de dominios de anillo de zinc modificados con el dominio catalítico de una enzima de restricción tal como FokI (Porteus y Carroll, 2005) o una endonucleasa química (Eisenschmidt, Lanio et al. 2005; Arimondo, Thomas et al. 2006; Simon, Cannata et al. 2008). En las endonucleasas químicas, se conjuga un elemento de ruptura químico o peptídico con un polímero de ácidos nucleicos u otro ADN que reconozca una secuencia diana específica, consiguiendo de este modo dirigir la actividad de ruptura a una secuencia específica. Las endonucleasas químicas también abarcan nucleasas sintéticas como los conjugados de ortofenantrolina, una molécula de ruptura de ADN, y los oligonucleótidos que forma tripletes (TFOs, del inglés “triplex-forming oligonucleotides”), conocidos por unirse a secuencias de ADN específicas (Kalish y Glazer, 2005). Dichas endonucleasas químicas quedan comprendidas en el término “endonucleasa”, según la presente invención. Los ejemplos de tales endonucleasas incluyen I-Sce I, I-Chu I, I-Cre I, I-Csm I, PI-Sce I, PI-Tli I, PI-Mtu I, I-Ceu I, I-Sce II, I-Sce III, HO, PI-Civ I, PI-Ctr I, PI-Aae I, PI-Bsu I, PI-Dha I, PI-Dra I, PI-Mav I, PI-Mch I, PI-Mfu I, PI-Mfl I, PI-Mga I, PI-Mgo I, PI-Min I, PI-Mka I, PI-Mle I, PI-Mma I, PI-Msh I, PI-Msm I, PI-Mth I, PI-Mtu I, PI-Mxe I, PI-Npu I, PI-Pfu I, PI-Rma I, PI-Spb I, PI-Ssp I, PI-Fac I, PI-Mja I, PI-Pho I, PI-Tag I, PI-Thy I, PI-Tko I, PI-Tsp I, I-Msol.

Las endonucleasas según la presente invención pueden ser parte de una endonucleasa de efector de tipo activador de la transcripción (TAL) (TALEN).

-Por “TALEN” se entiende una proteína que comprende un dominio de unión de efector de tipo activador de la transcripción (TAL) y un dominio de endonucleasa, dando como resultado la fusión de ambos dominios una “TALEN monomérica”. Algunas TALEN monoméricas pueden ser funcionales per se mientras que otras requieren de dimerización con otra TALEN monomérica. La dimerización puede dar como resultado una TALEN homodimérica cuando ambas TALEN monoméricas son idénticas o pueden dar como resultado una TALEN heterodimérica cuando ambas TALEN monoméricas son diferentes. Dos TALEN monoméricas son diferentes, por ejemplo, cuando sus números de RVDs son diferentes y/o cuando el contenido (es decir, la secuencia de aminoácidos) de al menos un RVD es diferente. Por “enzima modificadora de ADN-efector TAL” se entiende una proteína que comprende un dominio de unión de efector tipo activador de la transcripción y un dominio de enzima modificadora de ADN.

Por “variante” se entiende una proteína “variante”, es decir, una proteína que no existe de forma natural en la naturaleza y que se obtiene mediante ingeniería genética o mediante mutagénesis aleatoria, es decir, una proteína modificada. Dicha proteína variante puede, por ejemplo, obtenerse por sustitución de al menos un residuo de la secuencia de aminoácidos de una proteína que existe de forma natural por un aminoácido diferente. Dicha(s) sustitución(es) puede(n), por ejemplo, introducirse mediante mutagénesis sitodirigida y/o mutagénesis aleatoria.

Por “célula” ó “células” se entiende cualesquier células vivas procarióticas o eucarióticas, líneas celulares derivadas de dichos organismos para cultivos in vitro, células primarias de origen animal o vegetal.

Por “célula primaria” o “células primarias” se entienden células tomadas directamente de tejido vivo (es decir, material de biopsia) y establecidas para cultivo in vitro, que han sido sometidas a muy pocos doblamientos de población y que, por tanto, son más representativas de los componentes funcionales y características principales de los tejidos de los que derivan, en comparación con líneas celulares tumorigénicas continuas o inmortalizadas artificialmente. Dichas células representan por tanto un modelo más valioso para el estado in vivo al que se refieren.

-Por “homóloga” se entiende una secuencia con identidad suficiente con respecto a otra para conducir a una recombinación homóloga entre secuencias, más particularmente que tenga al menos un 95% de identidad, preferiblemente un 97% de identidad y más preferiblemente un 99%.

-“Identidad” se refiere a identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o polipéptidos. La identidad se puede determinar comparando una posición de cada secuencia que puede estar alineada para propósitos de comparación. Cuando una posición de la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces loas moléculas son idénticas en dicha posición. Un grado de similitud o identidad entre secuencias de ácido nucleico o aminoácidos es función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en las posiciones compartidas por las secuencias de ácido nucleico. Se pueden usar varios algoritmos y/o programas de alineamiento para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST, que se encuentran disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, WI), y se pueden usar, p.ej., con los parámetros establecidos por defecto.

-Por “mutación” se entiende la sustitución, eliminación, inserción de uno o más nucleótidos/aminoácidos en una secuencia de polinucleótidos (ADNc, gen) o de polipéptidos. Dicha mutación puede afectar a la secuencia codificadora de un gen o a su secuencia reguladora. También puede afectar a la estructura de la secuencia genómica o a la estructura/estabilidad del ARNm codificado.

-Por “gen” se entiende la unidad básica de herencia, que consiste en un segmento de ADN dispuesto de un modo lineal a lo largo de un cromosoma, que codifica para una proteína específica o segmento de proteína. Un gen incluye típicamente un promotor, una región 5’ no traducida, una o más secuencias codificadoras (exones), opcionalmente intrones, una región 3’ no traducida. El gen puede comprender además un terminador, potenciadores y/o silenciadores.

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-El término “gen de interés” se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico conocido o putativo.

-Tal como se usa en la presente memoria, el término “localización” es la localización física específica de una secuencia de ADN (p.ej. de un gen) en un cromosoma. El término “localización” se refiere normalmente a la localización física específica de una secuencia diana de un cromosoma.

-Por “proteína de fusión” se entiende el resultado de un proceso bien conocido en la técnica que consiste en la unión de dos o más genes que originalmente codifican para proteínas separadas, dando como resultado la traducción de dicho “gen de fusión” un único polipéptido con propiedades funcionales derivadas de cada una de las proteína originales.

-Por “dominio catalítico” se entiende el dominio o módulo de proteína de una enzima que contiene el sitio activo de dicha enzima; por sitio activo se entiende la parte de dicha enzima en la se produce la catálisis del sustrato. Las enzimas, así como sus dominios catalíticos, se clasifican y se nombran según la reacción que catalizan. El número de la Comisión de Enzimas (número EC, del inglés “Enzyme Commission”) es un esquema de clasificación numérica para enzimas, en base a las reacciones químicas que catalizan (en internet en chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/). Dentro del alcance de la presente descripción, se puede usar cualquier dominio catalítico como pareja y se puede fusionar a un dominio de efector TAL para generar una proteína de fusión quimérica, dando como resultado una enzima modificadora de ADN-efector TAL. Los ejemplos no limitativos de dichos dominios catalíticos pueden ser aquellos de MmeI, EsaSSII, CstMI, NucA, EndA de Escherichia coli, NucM, EndA de Streptococcus pneumonia, SNasa de Staphylococcus aureus, SNasa de Staphylococcus hyicus, SNasa de Shigella flexneri, yncB de Bacillus subtilis, Endodesoxirribonucleasa I de Enterobacteria fago T7, EndoG bovina, proteína mutS de reparación de discordancia de ADN ttSmr, dominio de ruptura de Metnasa.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran dentro de los conocimientos de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, 2000, Wiley and Son Inc., Biblioteca del Congreso, EE.UU.); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, (Sambrook et al., 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Patente de EE.UU. nº 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (Harries y Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (Hames y Higgins eds. 1984); Culture of Animal Cells (Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); la serie Methods in Enzymology (Abelson y Simon eds-in-chief, Academic Press, Inc., Nueva York), específicamente, Vols. 154 y 155 (Wu et al., eds) y Vol. 185, “Gene Expression Technology” (Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller y Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (Weir y Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

La descripción incluida anteriormente de la invención proporciona un modo y un proceso de fabricación y uso de la misma tales que cualquier persona especialista en la técnica es capaz de fabricar y usar la misma, proporcionándose dicha capacitación en particular para la materia objeto de las reivindicaciones anexas, que constituyen una parte de la descripción original.

Tal como se ha usado anteriormente, las frases “seleccionado del grupo que consiste en”, “elegido entre” y otras similares, incluyen mezclas de los materiales especificados.

Cuando en la presente memoria se establece un límite numérico, se incluyen los puntos de los extremos. Asimismo, se incluyen específicamente todos los valores y subintervalos dentro de un límite o rango numérico, tal como si se indicara expresamente.

La descripción anterior se presenta para permitir a un especialista en la técnica que pueda preparar y usar la invención, y se proporciona en el contexto de una aplicación particular y sus requerimientos. Por tanto, esta invención no pretende estar limitada a las realizaciones mostradas, sino que debe considerarse en su más amplio alcance, en consistencia con los principios y características descritos en la presente memoria.

Habiendo sido descrita de forma general la invención, se puede obtener un mayor entendimiento de la misma en referencia a determinados ejemplos específicos, que se proporcionan en la presente memoria para propósitos meramente ilustrativos, quedando descrita adicionalmente la invención en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones a menos que se especifique lo contrario.

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EJEMPLOS

Ejemplo 1 – Una cifra gobierna el reconocimiento de ADN-efector TAL

Para determinar si existe una correspondencia lineal, uno-a-uno, entre los RVDs y los nucleótidos contiguos en el sitio diana de TAL, la región promotora predicha (es decir, las 1.000 pb inmediatamente precedentes al sitio de inicio traduccional anotado) del gen diana conocido para cada uno de los diez efectores TAL fue escaneada con la secuencia de RVD de efector TAL para determinar alineamientos que minimizaran la entropía (la aleatoriedad) en las asociaciones de RVD-nucleótido. Se usó la siguiente fórmula para cuantificar la entropía, donde R es el conjunto de RVDs para el efector, D es el conjunto de cuatro nucleótidos (A, C, G, T), y fi,j representa la frecuencia observada con la que el RVD in se asocia con el nucleótido jn:

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En cada promotor había presentes múltiples sitios de baja entropía. Para el efector AvrBs3, sin embargo, sólo uno fue mapeado en el fragmento de promotor upa20 de 54 pb identificado previamente como suficiente y necesario para la activación, y coincidió con la caja UPA común a los genes activados directamente por AvrBs3 (Kay et al., ver cita anterior). Asimismo, para los efectores PthXoI y AvrXa27, sólo un sito de cada uno solapó un polimorfismo entre los alelos activado y no activado de sus respectivas dianas, Os8N3 y Xa27. A lo largo de los alineamientos de estos tres sitios, las asociaciones RVD-nucleótido fueron consistentes, así que se seleccionaron los alineamientos restantes en base a dichas asociaciones, dando como resultado exactamente un sitio por par diana-efector TAL (Figura 1B y Tabla “). Cada sitio está precedido por una T (Figura 1D).

Para establecer la especificidad conferida por las asociaciones RVD-nucleótido, se generó primero una matriz de peso en base a las frecuencias de todas las asociaciones RVD-nucleótido observadas a lo largo de los diez alineamientos de sitio diana-efector TAL de entropía mínima (Figura 1B). A continuación, se usó la matriz de peso para escanear la región promotora, los 1.000 pb precedentes al inicio traduccional, de cada modelo de gen no redundante en arroz, Oryza sativa spp. Japonica cv. Nipponbare (OsaI, Release 6.0, rice.plantbiology.msu.edu) para obtener las mejores coincidencias con los cinco efectores TAL del patógeno de arroz Xanthomonas oryzae (AvrXa27, PthXo1, PthXo6, PthXo7 y Tal1c). Para AvrXa27, se incluyó la secuencia por encima de Xa27 (Nº de acceso de GenBank AY986492). Esta secuencia por encima no está presente en Nipponbare. Las frecuencias de asociación observadas fueron pesadas a un 90% y el restante 10% se distribuyó igualmente a frecuencias de todas las posibles asociaciones. Los alineamientos se clasificaron usando una puntuación de matriz de peso (eje y), tomados como el log negativo de la puntuación de frecuencia derivada de las frecuencias de asociación de RVDnucleótido de la Figura 1B. Por tanto, cuanto menor es la puntuación, mejor es la coincidencia. Para PthXo1, PthXo6, PthXo7 y Tal1c, el gen diana identificado experimentalmente fue la mejor, o casi la mejor, coincidencia. Mejores coincidencias no estaban precedidas por una T, no estaban representadas en el microsistema usado para identificar la diana, o carecían de intrones y evidencias EST. El escaneo de secuencias promotoras complementarias inversas no produjo alineamientos con mejores puntuaciones que los sitios directos para las dianas conocidas. Este resultado no implica que los efectores TAL se unan a la cadena positiva, sino que indica que actúan en una dirección directa respecto a la cadena positiva. La diana conocida del quinto efector, AvrXa27, es el gen de resistencia contra enfermedad Xa27 (Gu et al., ver cita anterior). La peor puntuación para esta coincidencia (5.368) puede reflejar una adaptación de hospedante calibrada o reciente y sub-óptima. Los sitios con mejores puntuaciones probablemente comprenden genes atacados por AvrXa27 para patogénesis.

Usando nuevamente la matriz de peso, se obtuvieron diez alineamientos adicionales escaneando todos los promotores de arroz con 40 efectores TAL de X. oryzae adicionales y que retienen los mejores alineamientos para los que el gen por debajo fue activado durante la infección basada en datos de microsistemas públicos (PLEXdb.org, acceso OS3) (Tabla 3). Como con el conjunto inicial, una T precede cada sitio, y ningún sitio de cadena inversa dio una mejor puntuación. Las frecuencias de asociación RVD-nucleótido del total de 20 alineamientos se muestran en la Figura 1C. Constituyen una cifra sorprendentemente simple.

Las frecuencias de RVD-nucleótido del conjunto expandido de 20 alineamientos de nucleótido de efector TAL se usaron para generar una nueva matriz de peso, y se escribió un guión computacional en Python v2.5 (www.python.org). El guión se puede usar para escanear cualquier colección de secuencias de ADN para determinar coincidencias con un efector TAL particular, con un factor de peso definible por el usuario para asociaciones RVDnucleótido observadas frente a no observadas. Véase Moscou y Bogdanove (ver cita anterior).

Hay algo de degeneración en la cifra. Las asociaciones fuertes pueden representar anclas que tengan en cuenta la mayor parte de la afinidad de unión, proporcionando las asociaciones débiles una medida de flexibilidad. Alternativamente, puede haber implicados efectos de vecindad. Se investigó esta última posibilidad determinando las frecuencias de asociación de nucleótidos de cada RVD condicionado en el RVD con cualquier lado y comparándolas con las frecuencias observadas totales – en otras palabras, clasificando los emparejamientos RVD-nucleótidos según el RVD colindante a la izquierda o a la derecha, y comparando las frecuencias relativas de cada para así clasificado con la frecuencia global para dicho par. Las frecuencias de las asociaciones RVD-nucleótido clasificadas

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por vecindad no se desviaron significativamente del total de frecuencias observadas, lo que sugiere que las asociaciones son independientes del contexto.

Las secuencias que flanquean los 20 sitios diana no revelaron nucleótidos conservados excepto la T en -1, pero tienden a ser ricos en C a continuación del sitio y pobres en G a su través (Figura 1D). Con pocas excepciones, los sitios comienzan dentro de los 60 pb por encima del inicio transcripcional anotado, y ninguno está más cerca de 87 pb del inicio traduccional (Tabla 2 y Tabla 3). En los Ejemplos 4 y 5 se describen reglas adicionales que gobiernan las asociaciones RVD/nucleótido.

Dados estos resultados, ahora es posible la predicción de dianas de efector TAL en un genoma y la construcción de dianas de novo. La capacidad para predecir sitios acelerará la identificación de genes de hospedante importantes para enfermedades. La capacidad de construir dianas permite pensar en el diseño de genes de resistencia durable que respondan a efectores TAL conservados o múltiples. También es posible el diseño a medida de efectores TAL para activación génica arbitraria o para atacar proteínas fusionadas para modificación de ADN, tal como se describe en la presente memoria.

Tabla 2

Características de sitio diana predicho para pares diana-efector TAL identificados experimentalmente

Efector TAL

Fuente RVDs Gen diana TcS Caja TATA TIS

AvrXa271

Xanthomonas oryzae pv. oryzae PXO99A 17 Xa27 (arroz) 27 -7 87

AvrBs32

X. campestris pv. vesicatoria 18 Bs3 (pimiento) 59 1 123

AvrBs33

X. campestris pv. vesicatoria 18 UPA20 (pimiento) 72 1 150

AvrBs33Δrep164,5

AvrBs3 modificado 14 Bs3-E (pimiento) 85 1 136

AvrBs33Δrep1094

AvrBs3 modificado 15 Bs3 (pimiento) 59 1 123

AvrHah16

X. gardneri 14 Bs3 (arroz) 59 1 121

PthXo17

X. oryzae pv. oryzae PXO99A 24 Os8N3 (pimiento) 79 46 251

PthXo68

X. oryzae pv. oryzae PXO99A 23 OsTFX1 (arroz) 31 -780 136

PthXo78

X. oryzae pv. oryzae PXO99A 22 OsTFIIAγ1 (arroz) 333 44 469

Tal1c

X. oryzae pv. oryzicola BLS256 16 OsHEN1 (arroz) 10 -265 217

RVDs, diresiduos variables de repetición; TcS, sitio de inicio transcripcional anotado; TIS, sitio de inicio traduccional. Las localizaciones son relativas al extremo 5’ del sitio diana. 1 Gu et al., ver cita anterior. 2 Kay et al. (2007) Science 318: 648 3 Römer et al. (2007) Science 318: 645 4 Herbers et al. (1992) Nature 356: 172 5 Römer et al. (2009) Plant Physiol. 6 Schornack et al. (2008) New Phytologist 179: 546 7 Yang et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 10503 8 Sugio et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

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Tabla 3

Candidatos a diana de efector TAL de Xanthomonas oryzae en arroz activado durante infección.

Efector

Cepa RVDs Localización de arroz r TcS Caja TATA TIS q Ratio de cambio

Tal1c

BLS256 16 OsHen1 1 10 -265 217 0,01 3,3

Tal2c

BLS256 27 Os03g03034 15 -16 -145 143 0,01 5,2

Tal2d

BLS256 16 Os04g49194 9 27 n.p. 102 3,9E-07 29,7

Tal3b

BLS256 18 Os05g27590 42 34 -1 1042 3,4E-08 8,5

Tal4a

BLS256 26 Os03g37840 1 152 221 363 2,2E-04 2,6

Tal4b

BLS256 14 Os09g32100 72 68 n.p. 271 8,0E-03 3,6

Tal4c

BLS256 23 Os06g37080 18 31 n.p. 151 2,7E-10 17,1

Tal6

BLS256 20 Os07g47790 16 -15 -70 93 3,6E-02 21,6

PthXo1

PXO99A 24 Os8N3 1 79 46 251 1,0E-08 84,2

PthXo6

PXO99A 23 OsTFX1 2 31 -780 136 3,5E-03 2,8

PthXo7

PXO99A 22 OsTFIIAγ1 7 333 44 469 1,60E-06 4,5

Tal9a

PXO99A 20 OsHen1 1 44 -3 93 0,13 8,2

Tal17a/8a

PXO99A 18 Os01g68740 2 32 -197 102 1,8E-01 1,7

Tal17b/8b

PXO99A 20 Os01g40290 57 -2 -276 206 1,8E-01 1,7

RVDs, diresiduos de repetición variable; r, rango fuera de 58.918 modelos de genes escaneados, en base a la puntuación de la matriz de peso de RVD; TcS, sitio de inicio transcripcional anotado; n.p., no presente; TIS, sitio de inicio traduccional. Las localizaciones son relativas al extremo 5’ del sitio diana. Los valores q son para una comparación a través de cinco punto temporales y hasta 96 horas tras inoculación, replicados cuatro veces; la ratio de cambio proporcionada corresponde a 96 horas (PLEXdb, acceso OS3).

Ejemplo 2 – Las TALENs pueden actuar en levadura

Construcción de plásmido: la secuencia codificadora de proteína del efector TAL, AvrBs3, fue obtenida por digestión de un plásmido con BamHI. Se escindió un fragmento de ADN que codificaba principalmente el dominio de repetición con SphI. La secuencia de aminoácidos de AvrBs3 se puede encontrar con el nº de acceso de GENBANK P14727 y la SEQ ID NO: 12 (Figura 3), y la secuencia de ácido nucleico bajo el nº de acceso X16130 y la SEQ ID NO: 13 (Figura 4). En la Figura 4, los sitios BamHI y SphI están en negrita y subrayados. Los fragmentos BamHI y SphI de AvrBs3 fueron clonados en el vector de expresión de nucleasa pDW1789_TAL (Figura 5) adyacente a las secuencias que codifican el dominio de nucleasa FokI. Para clonar el sitio diana AvrBs3 en el plásmido informador diana, dos oligos de ADN complementario, que contenían dos sitios de reconocimiento de AvrBs3 en una orientación invertida con una secuencia espaciadora de 18 pb entre medias, fueron sintetizados con salientes BglII y SpeI en los extremos 5’ y 3’, respectivamente. Se prepararon otros plásmidos que tenían sitios de reconocimiento con longitudes de espaciador de 6, 9, 12 y 15 pb. Los oligos de ADN ligados fueron clonados en el plásmido informador, pCP5 (Figura 6), que fue digerido con BglII y SpeI.

Ensayo de levadura: Los plásmidos indicadores diana fueron transformados en la cepa de levadura YPH499 (una cepa MAT α), y los transformantes fueron seleccionados en medio sintético completo que carecía de triptófano (SC-W). Los plásmidos de expresión de TALEN fueron transformados en YPH500 (una cepa MAT α); y los transformantes fueron llevados a placa en medio SC que carecía de histidina (SC-H). Se cultivaron colonias de levadura que portaban el plásmido indicador diana y colonias que portaban el plásmido de expresión de TALEN durante una noche a 30ºC en medio SC-W y SC-H líquido, respectivamente. Los cultivos se ajustaron a la misma DO600, y se mezclaron 200 µL de cada uno con 200 µL de medio YPD. La mezcla se incubó a 30ºC durante 4 horas para permitir que los dos tipos de cepa de levadura se acoplaran. El cultivo mixto fue centrifugado y resuspendido en 5 mL de medio SC-W-H a 30ºC durante una noche o hasta que la DO600 alcanzó un rango de 0,5-1. Las células fueron recolectadas y se llevaron a cabo ensayos cuantitativos de β-galactosidasa como se ha descrito (Townsend et al. (2009) Nature 459: 442-445).

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Resultados: La fusión TAL-FokI es una nucleasa específica de sitio que consiste en el dominio de reconocimiento de ADN de TAL y el dominio de ruptura de ADN de FokI no específico. El dominio de reconocimiento de ADN de TAL puede modificarse para unirse a diferentes secuencias de ADN. Tal como se describe en el Ejemplo 1 de la presente memoria, la especificidad de reconocimiento de ADN de los efectores TAL, una nueva clase de dominio de unión a ADN, ha sido descifrada. En particular, el dominio de unión de ADN de efectores TAL contiene un número diverso de repeticiones tándem de 34 aminoácidos, que pueden reconocer y unirse a secuencias de ADN específicas. Las secuencias de aminoácidos de las repeticiones son conservadas excepto por dos residuos adyacentes altamente variables en las posiciones 12 y 13 de las repeticiones. Dichas posiciones juntas especifican nucleótidos individuales en el sitio de unión de ADN, una repetición por nucleótido. La arquitectura de las TALENs se ilustra en la Figura 7. Las TALENs actúan como dímeros, estando compuesto cada monómero por repeticiones de reconocimiento de ADN de TAL modificado fusionadas con un dominio de ruptura no específico procedente de endonucleasa FokI. Las repeticiones de reconocimiento de ADN pueden modificarse para unirse a secuencias de ADN diana dentro de un genoma de interés. Los monómeros de nucleasa TAL se unen a uno o dos medios-sitios de ADN que están separados por una secuencia espaciadora. Dicho espaciamiento permite que los monómeros FokI dimericen y creen un salto de ADN de cadena doble (DSB) en la secuencia espaciadora entre los medios-sitios.

Para explorar el potencial del dominio de reconocimiento de ADN de efector TAL, se llevaron a cabo experimentos para determinar si los efectores TAL nativos pueden actuar como nucleasas cuando están fusionados al dominio de nucleasa FokI. Se llevó a cabo el ensayo basado en levadura usando una construcción de expresión de nucleasa TAL y una construcción de informador diana. Tal como se ilustra en la Figura 5, la cadena principal de la construcción de expresión de nucleasa contiene un dominio de nucleasa FokI y una señal de localización nuclear Nterminal (NLS) bajo el control del promotor de levadura TEF1. Varios sitios de restricción están localizados entre el dominio de nucleasa FokI y la estructura de NLS para facilitar la clonación de varios efectores TAL. La construcción de informador diana tiene un gen informador lacZ alterado con una duplicación de 125 pb de secuencia codificadora, tal como se muestra en la Figura 6. La duplicación flanquea un gen URA3 y una secuencia diana (compuesta por dos medios sitios y una secuencia espaciadora) reconocida por dominios de unión a ADN de TAL. Si la TALEN se une y genera saltos de cadena doble de ADN (DSBs) en el sitio diana, dichos saltos, en levadura, se reparan predominantemente por recombinación homóloga entre las secuencias lacZ duplicadas a través de maduración de cadena sencilla (Haber (1995) Bioessays 17: 609). La recombinación da como resultado la reconstitución de un gen lacZ funcional y la pérdida de URA3 (que confiere resistencia de ácido 5-fluoroorótico). La actividad de ruptura relativa de las TALENs se midió determinando la actividad enzimática de lacZ.

En estos estudios, se clonó un efector TAL nativo, AvrBs3, que tenía una región de repetición de nucleasa central como la fijada en la SEQ ID NO: 16 (Figura 8) en el vector de expresión de nucleasa, y los sitios diana de AvrBs3 (dos sitios de unión dispuestos en una orientación invertida) con una secuencia espaciadora de 18 pb fueron clonados en el vector indicador diana. El ensayo de levadura se llevó a cabo usando el esquema mostrado en la Figura 9 y descrito más adelante. Los resultados mostraron que la actividad lacZ de las células de levadura transformadas con el plásmido de nucleasa de AvrBs3 y el plásmido de indicador diana fue significativamente mayor (15,8 veces superior) que la de las células de levadura que contenían solo el plásmido de indicador diana (Figura 10). No se observó actividad con las fusiones de nucleasa hechas solo con el fragmento SphI que codifica predominantemente el dominio de repetición. Esto indicó que las secuencias diferentes al dominio de unión de ADN son requeridas para la actividad de TALEN. Los plásmidos indicadores con longitudes de espaciador de 6 y 9 pb tampoco mostraron actividad, lo que indica que el espacio entre los dos sitios de unión es crítico para permitir que la FokI se dimerice. Estos datos indican que la nucleasa TAL de AvrBs3 puede actuar como una nucleasa específica de sitio que rompe su secuencia diana cognato en levadura.

Ejemplo 3 – Montaje modular de repeticiones de efector TAL para TALENs a medida

Los oligonucleótidos complementarios correspondientes a los 102 pares base de cada una de las cuatro repeticiones de efector TAL individuales, que especifican cada una un nucleótido diferentes, fueron sintetizados, madurados y clonados en un vector de clonación bacteriano de elevada copia, individualmente y en combinaciones de 2 y 3 repeticiones en todas las permutaciones para producir 4 módulos de repetición sencillos, 16 dobles y 64 triples, usando técnicas estándares de digestión y ligación (p.ej., como se ilustra en la Figura 11). La secuencia codificadora de efector TAL deseada se monta introduciendo los módulos apropiados secuencialmente en un vector de clonación bacteriano de alta copia preparado para Gateway que contiene una forma truncada del gen tal1c que carece de la región de repetición central excepto por la media repetición final característica. Por ejemplo, se puede montar una secuencia codificadora de efector TAL de 18 repeticiones introduciendo secuencialmente 5 módulos triples y 1 módulo doble en el vector tal1c truncado.

Ejemplo 4 – Un sistema para el montaje modular de repeticiones de efector TAL

Se desarrollaron plásmidos y métodos para genera genes que codifican efectores TAL a medida. La especificidad funcional de efectores TAL viene determinada por los RVDs de las repeticiones, tal como se describe en la presente memoria; otros polimorfismos en las repeticiones y en cualquier sitio de las proteínas son raros e inconsecuentes en lo que se refiere a la especificidad funcional. Por tanto, se generaron genes de efector TAL a medida reemplazando la región de repetición de un gen de efector TAL arbitrario con repeticiones que contienen los RVDs deseados. Las secuencias repetidas fuera de los RVDs coincidieron con una secuencia de consenso (ver más adelante). Los

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fragmentos de ADN que codifican repeticiones de efector TAL fueron montadas secuencialmente en módulos que codifican una, dos o tres repeticiones, y los módulos fueron clonados en un gen de efector TAL del cual se eliminaron las repeticiones originales. Cada repetición codificada, con la excepción de la última (media) repetición, tenía la secuencia LTPDQVVAIASXXGGKQALETVQRLLPVLCQDHG (SEQ ID NO: 18; Figura 12A). La última (media) repetición tenía la secuencia LTPDQVVAIASXXGGKQALES (SEQ ID NO: 20, Figura 12B). En ambas secuencias, “XX” indica la localización del RVD. Los RVDs usados en las repeticiones modulares fueron NI, HD, NN y NG, que especifican la unión a A, C, G y T, respectivamente. En los experimentos descritos más adelante se usó el gen tal1c de Xanthomonas oryzae pv. oryzicola cepa BLS256, con sus repeticiones eliminadas, como “cadena principal” para construir genes de efector TAL a medida.

El método descrito en la presente memoria incluye cinco componentes: (1) generación de plásmidos de inicio de repetición sencilla; (2) generación de plásmidos de módulo de repetición sencilla; (3) generación de módulos de repetición múltiple; (4) generación de un conjunto completo de plásmidos de módulo de una, dos y tres repeticiones; y (5) montaje de secuencias codificadoras de efector TAL a medida.

Para generar plásmidos de inicio de repetición sencilla, se digirió el gen tal1c con MscI y se religó para eliminar la región de repetición entera excepto por la primera parte de la primera repetición y la última parte de la última repetición truncada, dando como resultado el plásmido designado pCS487 (Figura 13). El gen resultante codificaba el RVD NI y, como la mayoría de los genes de efector TAL, contenía dos sitios SphI que flanqueaban la región de repetición. El gen no contenía ningún sitio XhoI.

A continuación, se introdujo una mutación traduccionalmente silenciosa en pCS487 para crear un sitio PspXI único, que abarca un sitio XhoI único centrado en los codones 19 y 20. La mutación se muestra en la Figura 14, que muestra las secuencias de nucleótidos original y alterada para los codones 18-21 (SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 23, respectivamente), las cuales codifican ambas la secuencia de aminoácidos ALES (SEQ ID NO: 22). El plásmido resultante se designó pCS489.

Mediante mutagénesis adicional, se generaron tres construcciones adicionales con los RVDs HD, NN y NG, para crear los plásmidos designados pCS490, pCS491 y pCS492, respectivamente. El fragmento SphI que abarca la región de repetición modificada fue transferida de pCS489, pCS490, pCS491 y pCS492 al plásmido resistente a canamicina designado pCS488 (Figura 15), que codificaba solo las porciones N-y C-terminal de tal1c, sin la región de repetición, en el vector de entrada Gateway pENTR-D (Invitrogen, Carlsbad, CA). Esta transferencia dio como resultado los plásmidos de inicio de repetición sencilla designados pCS493 (Figura 16), pCS494, pCS495 y pCS496, respectivamente. El sitio PspXI/XhoI de la repetición truncada permaneció único en dichos plásmidos. El gen de efector TAL de pCS488 y todos sus derivados estaba precedido por secuencias de Shine-Dalgarno y Kozak para una traducción eficaz en procariontes y eucariontes, respectivamente.

A continuación se construyeron plásmidos de módulo de repetición sencilla. Se generó un plásmido para cada uno de los cuatro RVDs elegidos (NI, HD, NN y NG). Cada plásmido presentó un extremo 5’ cohesivo compatible que reconstituyó un sitio XhoI pero no uno PspXI cuando se ligó en un sitio PspXI, y un extremo 3’ cohesivo compatible que reconstituyó tanto un sitio XhoI como un sitio PspXI. Se generaron los plásmidos mediante clonación de oligonucleótidos madurados sintéticos complementarios con salientes (Figura 17A) en el sitio PspXI/XhoI de pBluescript SL-, dando como resultado los plásmidos designados pCS502 (Figura 17B), pCS503, pCS504 y pCS505, respectivamente. Cada plásmido permitió la introducción de repeticiones adicionales en el extremo 3’ del módulo de repetición sencilla en el sitio único PspXI reconstituido, o para escisión del módulo de repetición usando los sitios XhoI reconstituidos.

Se generaron módulos de repetición sencillos adicionales, uno para cada uno de NI, HD, NN y NG. Cada uno tenía un extremo 5’ cohesivo compatible que no reconstituía un sitio PspXI o XhoI cuando se ligaba en un sitio PspXI, un extremo 3’ cohesivo compatible que reconstituía tanto un sitio XhoI como uno PspXI, y una sustitución de nucleótido traduccionalmente silenciosa que destruía el sitio interno MscI (Figura 18A). Estos módulos fueron generados madurando oligonucleótidos sintéticos complementarios con salientes. La ligadura de cualquier de dichos módulos de repetición sencilla adicional en el sitio único PspXI/XhoI de un plásmido de módulo de repetición sencilla (pCS502, pCS503, pCS504 ó pCS505) no produjo ningún sitio XhoI nuevo en la unión 5’, sino la restauración del sitio único 3’ PspXI/XhoI, de tal modo que los plásmidos resultantes pudieran ser linealizados para la introducción de más repeticiones adicionales mediante corte con PspXI. La reiteración de este proceso dio como resultado módulos que contenían repeticiones múltiples (Figura 18B). Adicionalmente, cada módulo de repetición múltiple entero podría ser escindido usando XhoI. Puesto que el sitio MscI fue destruido en los módulos de repetición sencilla adicional, el sitio MscI de la repetición inicial permaneció único, y fue útil para comprobar la orientación tras la posterior subclonación del módulo de repetición múltiple.

Se clonaron módulos de repetición sencilla adicionales iterativamente en los plásmidos de módulo de repetición sencilla para generar, junto con los plásmidos de módulo de repetición sencilla, un conjunto completo de todos los módulos de una, dos y tres repeticiones posibles, para un total de 84 plásmidos designados pCS502 a pCS585 (Figura 19). Los módulos que contienen más de tres repeticiones (p.ej., cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez repeticiones) se generan del mismo modo.

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A continuación se diseñó un método para montar cualquier secuencia de repeticiones en la “cadena principal” de tal1c para generar un gen de efector TAL a medida. El método incluía las siguientes etapas, que también se representan en la Figura 20:

(1)

Elegir un plásmido de inicio de repetición sencilla con la primera repetición deseada (pCS493, pCS494, pCS495 ó pCS495, que codifican los RVDs NI, HD, NN ó NG, respectivamente);

(2)

Linealizar el plásmido con PspXI;

(3)

Aislar el módulo para la(s) siguiente(s) repetición(es) a partir del plásmido de módulo apropiado (pCS502 hasta pCS585) usando XhoI;

(4)

Ligar;

(5)

Comprobar la orientación mediante digestión con MscI y confirmar la secuencia a partir del extremo 3’ usando un cebador basado en vector; y

(6)

Repetir las etapas 2-5 hasta que todas las repeticiones estén montadas.

Ejemplo 5 – Biblioteca de plásmidos para el montaje modular de TALENs

El montaje de repeticiones de TALEN tal como se describen en la presente memoria (p.ej., usando las etapas mostradas en la Figura 20) da como resultado numerosos plásmidos intermedios que contienen números crecientes de repeticiones. Cada uno de estos plásmidos es almacenado de tal modo que se genera una biblioteca de plásmidos para el montaje modular de TALENs (pMATs). Por ejemplo, las Figuras 21A y 21B muestran el montaje de módulos de repetición en la construcción de endonucleasas TAL que se dirigirán a las secuencias de nucleótidos mostradas. En la Figura 21A, los módulos de repetición a partir de los plásmidos designados pCS519, pCS524, pCS537, pCS551, pCS583 y pCS529, se añaden secuencialmente a la secuencia del plásmido de inicio designado pCS493, dando como resultado los plásmidos designados pMAT55, pMAT56, pMAT57, pMAT58, pMAT59 y pMAT60. En la Figura 21B, los módulos de repetición procedentes de los plásmidos designados pCS530, pCS533, pCS522 y pCS541 se añaden secuencialmente a la secuencia del plásmido designado pMAT1, dando como resultado plásmidos designados pMAT61, pMAT62, pMAT63 y pMAT64.

Ejemplo 6 – Generación y evaluación de TALENs a medida

El dominio de reconocimiento de ADN TAL se usó para crear TALENs que reconocen y rompen dianas de ADN particulares (Figura 22A), usando el sistema descrito en los Ejemplos 4 y 5. Para determinar la función de TALEN, se adaptó un ensayo de levadura en el que la actividad de LacZ sirve como indicador de ruptura de ADN (Townsend et al., ver cita anterior). En este ensayo, se juntan un plásmido diana y un plásmido de expresión de TALEN en la misma célula mediante emparejamiento. El plásmido diana tiene un gen informador lacZ con una duplicación de 125 pb de secuencia codificadora. La duplicación flanquea un sitio diana reconocido por una TALEN dada. Cuando se produce una ruptura de ADN de cadena doble en el sitio diana, es reparada a través de maduración de cadena sencilla entre las secuencias duplicadas, lo que crea un gen lacZ funcional cuya expresión puede medirse usando ensayos estándares de β-galactosidasa que proporcionan una lectura cuantificable (Figura 22A). Se ha demostrado que este ensayo es una buena predicción de la capacidad de una ZFN para crear mutaciones cromosomales mediante NHEJ o para estimular la recombinación homóloga para la edición de genes en eucariontes superiores (Townsend et al., ver cita anterior; y Zhang et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: 12028-12033).

Se usaron dos efectores TAL bien caracterizados – AvrBs3 procedente del patógeno de pimiento Xanthomonas campestris pv. vesicatoria y PthXoI procedente del patógeno de arroz X. oryzae pv. oryzae (Bonas et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 218: 127-136; y Yang et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 10503-10508). La secuencia de aminoácidos de AvrBs3 puede encontrarse bajo el nº de acceso GENBANK P14727 y la SEQ ID NO: 12 (Figura 3), y la secuencia de ácido nucleico bajo el nº de acceso X16130 y SEQ ID NO: 13 (Figura 4). La secuencia de aminoácidos de PthXoI puede encontrarse bajo el nº de acceso GENBANK ACD58243 y SEQ ID NO: 31 (Figura 23), y la secuencia de ácido nucleico bajo el nº de acceso CP000967, ID de gen 6305128, y SEQ ID NO: 32 (Figura 24). La secuencia de aminoácidos de PthXoI bajo el nº de acceso GENBANK ACD58243 está truncada en el extremo N debido a una anotación incorrecta en el codón de inicio. La secuencia completa se presenta en la Figura 23.

Los dominios de repetición de ambos AvrBs3 y PthXoI están codificados completamente dentro de un fragmento de SphI conservado (Figuras 4 y 24). Ambos genes codificadores-efector TAL también tienen un fragmento de restricción BamHI que abarca la secuencia codificadora correspondiente al dominio de repetición y 287 aminoácidos antes y 231 aminoácidos después (Figuras 4 y 24; véase también la Figura 22A). Ausente del fragmento BamHI está el dominio de activación transcripcional de efector TAL. Tanto los fragmentos SphI como los fragmentos BamHI se fusionaron en un fragmento de ADN que codifica FokI que está presente en el vector de expresión de nucleasa pFZ85 (Figura 25). Las proteínas de fusión entre la nucleasa FokI y los fragmentos BamHI codificados por AvrBs3 y PthXo1 se muestran en las Figuras 26 y 27; SEQ ID Nos: 33 y 34.

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Los monómeros de FokI deben dimerizarse para poder romper, pero la longitud de espaciador apropiada entre los dos sitios de reconocimiento de ADN no está clara. Para ZFNs, en los que el sistema de dedo de zinc está separado del FokI por un ligando de 4-7 aminoácidos, el espaciador típico entre los dos sitios de reconocimiento tiene 5-7 pb (Handel et al. (2009) Mol. Ther. 17: 104-111). Puesto que, por ejemplo, 235 aminoácidos separan el dominio de repetición de FokI en las construcciones TALEN de BamHI usadas en la presente memoria, se usó una variedad de longitudes de espaciador tanto para las construcciones BamHI como para las SphI (6, 9, 12, 15 y 18 pb). Como control positivo, se usó una nucleasa de dedo de zinc bien caracterizada con un dominio de unión de ADN derivado del factor de transcripción de ratón Zif268 (Porteus y Baltimore (2003) Science 300: 763). Como controles negativos, se fusionaron los dominios de efector TAL con una variante de FokI catalíticamente inactiva o se evaluaron con dianas de ADN no cognato.

Se emparejaron tipos celulares haploides que contenían el plásmido de expresión de TALEN o el plásmido diana en 200 µL de cultivo de una noche en medio YPD a 30ºC. Tras 4 horas, se reemplazó el medio YPD con 5 mL de medio selectivo y se incubó durante una noche a 30ºC. Los cultivos emparejados fueron lisados, se añadió sustrato de ONPG, y se leyó la absorbancia a 415 nm usando un lector de placas de 96 pocillos (Townsend et al., ver cita anterior). Se calcularon los niveles de β-galactosidasa en función de la velocidad de ruptura de sustrato. Los resultados obtenidos con construcciones informadoras diana que tenían un espaciador de 15 pb separando los dos sitios de reconocimiento se muestran en la Figura 22B. Todas las construcciones de expresión de nucleasa derivadas del fragmento SphI, que codificaba principalmente el sistema de repeticiones, no mostraron actividad, lo que indica que se requieren secuencias de aminoácido adicionales a las del sistema de repetición para funcionar (Figura 22B). Sin embargo, se observó una actividad robusta para las TALENs AvrBs3 y PthXo1 derivadas del fragmento de BamHI (Figura 22B). La actividad de la TALEN PthXo1 se aproximó a la del control positivo de ZFN. La actividad requería el dominio FokI funcional y fue específica para la diana de ADN reconocida por una TALEN dada.

También se llevaron a cabo experimentos para evaluar varias distancias entre los sitios de unión de efector TAL (11 variantes de longitud entre 12 y 30 pb), a fin de identificar las longitudes de espaciador que permiten que la FokI se dimerice de la forma más efectiva (Figura 28A). Ambas enzimas mostraron dos longitudes de espaciador óptimas – una de 15 pb y otra de 21 pb (AvrBs3) o de 24 pb (PthXo1). Para PthXo1, se observó actividad para todas las longitudes de espaciador evaluadas de 13 pb o más. Sin embargo, algunas longitudes de espaciador para AvrBs3 no mostraron actividad, lo que sugiere que la longitud de espaciador es crítica para determinadas TALENs.

Los experimentos anteriores evaluaron la actividad de TALENs homodiméricas, que se unen a dos secuencias de reconocimiento idénticas colocadas opuestas en ambos lados del espaciador. Puesto que es poco probable que existan sitios palindrómicos de forma natural en dianas genómicas, se llevaron a cabo experimentos para evaluar si las TALENs podían funcionar como heterodímeros. Los sitios AvrBs3 y PthXo1 fueron colocados en orientación de cabeza a cola en cada uno de los lados de un espaciador de 15 pb. Se midió como control la actividad de TALENs AvrBs3 y PthXo1 de forma individual y Zif268 sobre sus respectivas dianas. Como control negativo, se evaluó la actividad de LacZ de un cultivo de levadura solo con el plásmido de sitio diana para el sitio heterodimérico. La actividad resultante de la TALEN heterodimérica se aproximó al promedio de las actividades observadas con las dos enzimas homodiméricas (Figura 28B).

Para evaluar si los dominios de repetición se pueden ensamblar para dirigir TALENs a secuencias cromosomales arbitrarias, se eligieron dos genes que habían sido atacados previamente para mutagénesis con ZFNs – ADH1 de Arabidopsis y gridlock de pez cebra (Foley et al (2009) PLos One 4: e4348; y Zhang et al., ver cita anterior). Se llevó a cabo una búsqueda de 12-13 pb de las regiones codificadoras que estaban precedidas por una T 5’ y con una composición de nucleótidos similar a la de los sitios de unión de efector TAL identificada por Moscou y Bogdanove (ver cita anterior). En ADH1 y gridlock, tales sitios se dan de promedio cada 7-9 pb. Se seleccionaron cuatro sitios de 12 pb en ADH1 (en las posiciones 360, 408, 928 y 975 de la secuencia génica cromosomal) y un sitio de 13 pb en gridlock (en la posición 2356 de la secuencia génica cromosomal; Figura 29A). Los dominios de repetición de efector TAL fueron construidos para reconocer estas dianas, usando los RVDs más abundantes de los efectores TAL nativos (NI para A, HD para C, NN para G y NG para T). Para construir TALENs a medida, se sintetizaron repeticiones con dichos RVDs individualmente y se ensamblaron en módulos de uno, dos o tres repeticiones, tal como se describe en los Ejemplos 4 y 5. Estos módulos fueron ligados secuencialmente en un derivado del gen tal1c (Moscou y Bogdanove, ver cita anterior) del cual se habían eliminado las repeticiones originales, y los fragmentos BamHI de dichos efectores TAL modificados fueron fusionados con secuencias que codifican el dominio catalítico de FokI en pFZ85 (Figura 25). Se crearon cinco TALENs a medida dirigidas a ADH1 de Arabidopsis y a gen gridlock de pez cebra.

Las TALENs a medida resultantes fueron evaluadas en el ensayo de levadura como TALENs homodiméricas (es decir, se duplicó el sitio de unión de ADN idéntico en orientación inversa en uno de los lados de un espaciador de 16-18 pb), aunque cabe destacar que sería necesario construir TALENs heterodiméricas para dirigir la ruptura a dianas de ADN que existan de forma natural. Se eligieron las longitudes de espaciador en base a la distancia más próxima a 15 pb desde el extremo 3’ del siguiente sitio candidato colindante (y opuesto). Se usaron espaciadores de dieciséis pb para ADH1-360-12, ADH1-408-12r, y espaciadores de 18 pb para ADH1-928-12, ADH1-975-12r, y gridlock-2356-13r. Se llevó a cabo el ensayo de levadura como se ha descrito anteriormente.

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Se observó una actividad robusta de nucleasa para las TALENs ADH1-360-12 y gridlock-2356-13r (Figura 29B). La TALEN ADH1-928-12 presentó una actividad modesta que no obstante fue significativa sobre los controles negativos. Para cada TALEN que dio resultados positivos, la actividad de nucleasa fue específica de la diana cognato. Estos resultados indican que se pueden crear nuevas TALENs funcionales por montaje de dominios de repetición a medida.

Ejemplo 7 – Los pares de diana natural y efector TAL muestran una tendencia general y posicional en composición de nucleótidos y RVDs

Las 20 parejas de diana y efector TAL analizadas por Moscou y Bogdanove (ver anterior) fueron evaluadas en relación a tendencia en la composición general y en efectos posicionales sobre las frecuencias de nucleótidos o RVDs. Se observó que los sitios (en la cadena positiva) generalmente eran ricos en A y C, y pobres en G. El porcentaje promedio de A fue de 31 ± 16% (1 desviación estándar). El porcentaje promedio de C fue de 37 ± 13%. El porcentaje promedio de G fue de 9 ± 8%, y el porcentaje promedio de T fue de 22 ± 10%. Puesto que los alineamientos varían en longitud, el análisis de efectos posicionales se restringió a las cinco posiciones de cada extremo. Sorprendentemente, la tendencia en las secuencias de diana resultó evidente para A y contra T en las posiciones 1 y 3, y para T en la posición N y posiblemente 2. G fue particularmente raro en la posición N-1. Dicha tendencia se reflejó comprobando los RVDs en los efectores, siendo NI el más común en las posiciones 1 y 3, no NG en la posición 1, casi siempre NG en la posición N, e infrecuentemente NN en la posición N-1 (Figura 30).

Ejemplo 8 – Método y reactivos para el montaje rápido y clonación de sistemas de repetición de efector TAL a medida

El método de clonación Golden Gate [Engler et al. (2008), ver cita anterior; y Engler et al. (2009), ver cita anterior] emplea la capacidad de las endonucleasas de restricción de tipo IIS (p.ej., BsaI) para cortar fuera de sus sitios de reconocimiento para crear salientes a medida para una ligadura ordenada de múltiples fragmentos de ADN simultáneamente. Usando este método, se pueden fusionar varios fragmentos de ADN en un sistema en un orden específico y clonarse en un vector de destino deseado en una única reacción (Figura 31).

En base al sistema Golden Gate se desarrolló un método y reactivos para el montaje a medida de sistemas codificadores de repeticiones de efector TAL. Cuando los sitios BsaI se posicionan en uno de los lados de una secuencia codificadora de repetición de efector TAL, la ruptura libera un fragmento de repetición flanqueado por salientes de 4 pb. Debido a que el sitio de ruptura no es específico de secuencia, por escalonamiento, se pueden liberar clones de repetición con salientes ordenados complementarios (extremos pegajosos), permitiendo el montaje ordenado de sistemas multi-repetición.

Se generó una biblioteca de 58 plásmidos (Figuras 32A y 32B) para permitir el montaje simultáneo de hasta 10 unidades de repetición en “subsistemas”, seguido del montaje simultáneo de uno, dos o tres de dichos subsistemas junto con una repetición truncada final en un sistema a medida completa. Se sintetizaron diez conjuntos escalonados de cuatro fragmentos, cada fragmento en un conjunto que codifica un módulo de repetición con uno de los cuatro RVDs más comunes diferente, HD, NG, NI y NN, y se clonaron en un vector que portaba el gen de resistencia a tetraciclina, para un total de 40 plásmidos. Se sintetizaron cuatro fragmentos más que codificaban la repetición de efector TAL truncada terminal de 20 aminoácidos, cada fragmento codificando uno de los cuatro RVDs más comunes diferente, y se clonaron en un vector diferente ç que portaba gen de resistencia a espectomicina para producir cuatro plásmidos más, designados como “plásmidos de última repetición”, Figura 32A). Todos los fragmentos de los conjuntos escalonados están flanqueados por sitios BsaI del vector, de tal modo que la ruptura con BsaI libera los fragmentos con diferentes extremos pegajosos lo que permite el montaje en el orden apropiado; es decir, el saliente del extremo 3’ de un fragmento para el módulo de repetición 1 es complementario solo con el saliente del extremo 5’ del fragmento para el módulo de repetición 2, el saliente del extremo 3’ del módulo de repetición 2 es complementario solo al saliente del extremo 5’ del módulo de repetición 3, y así sucesivamente. Los fragmentos de los plásmidos de la última repetición están flanqueados por sitios de una endonucleasa de restricción de Tipo IIS diferente, Esp3I. Se construyeron catorce plásmidos adicionales, descritos a continuación, como vectores destino para recibir subsistemas ensamblados.

El primer vector de destino, el plásmido pFUS_A se construyó para recibir el primer subsistema de 10 repeticiones para ser montado en un sistema final de 21 o menos repeticiones (contando la repetición truncada final). Se construyó el pFUS_A de tal modo que la ruptura por BsaI crea un saliente en un lado complementario al saliente del extremo 5’ del primer módulo de repetición y un saliente en el otro lado complementario al saliente del extremo 3’ del 10º módulo de repetición. Para recibir un segundo subsistema de 10 o menos repeticiones que va a ser montado en dicho sistema final, se construyeron los plásmidos vectores de destino pFUS_B1, pFUS_B2, pFUS_B3, pFUS_B4, pFUS_B5, pFUS_B6, pFUS_B7, pFUS_B8, pFUS_B9 y pFUS_B10, que cuando se rompen con BsaI tienen salientes complementarios respectivamente al saliente del extremo 5’ del primer módulo de repetición y el extremo 3’ del módulo de repetición para la correspondiente posición numerada (p.ej., el saliente de pFUS_B6 para el extremo 3’ del subconjunto coincide con el saliente de los cuatro fragmentos de módulo de repetición para la posición 6). Los sistemas clonados en la serie pFUS_A y pFUS_B de plásmidos están flanqueados por sitios Esp3I del vector y cuando son liberados por digestión con Esp3I los sistemas tienen salientes complementarios únicos que les permiten ligarse en orden junto con un fragmento de repetición truncado final en el vector destino pTAL, que codifica

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una TALEN que carece de la región de repetición. Se construyó el pTAL de tal modo que la ruptura con Esp3I permite la inserción del sistema de repetición en la localización correcta y en la orientación correcta en virtud a un saliente de un extremo que es complementario al saliente del extremo 5’ del primer subsistema de repetición y un saliente en el otro extremo complementario al saliente del extremo 3’ del fragmento de repetición truncado final (Figura 33).

Los dos plásmidos de vector destino finales, pFUS_A30A y pFUS_A30B, fueron construidos para recibir los primeros y los segundos diez subsistemas de repetición para ser montados en un sistema final de 22-31 repeticiones. pFUS_A30A y pFUS_A30B fueron construidos de tal modo que la digestión con Esp3I libera los sistemas con los salientes complementarios apropiados de tal modo que los sistemas se pueden ligar en orden junto con un tercer sistema de un vector pFUS_B y un fragmento de repetición truncado procedente de un último plásmido de repetición, liberado de forma similar por digestión con Esp3I, en pTAL (Figura 32).

Todos los vectores de destino tienen un gen LacZ clonado entre los sitios de endonucleasa de restricción de Tipo IIS, lo que permite un escrutinio azul-blanco para obtener recombinantes. Excepto para pTAL, que porta un gen para resistencia a ampicilina, todos los vectores de destino portan un gen para resistencia a espectinomicina.

Para construir rápidamente un sistema de repetición de efector TAL a medida usando estos reactivos, se estableció el siguiente método. En la primera etapa, se mezclan los plásmidos de módulo de RVD individual apropiados para los subsistemas necesarios de diez o menos repeticiones junto con el vector de destino apropiado en un tubo. Se añaden T4 ADN ligasa y endonucleasa BsaI y la reacción se incuba en una máquina de PCR durante 10 ciclos de 5 minutos a 37ºC y 10 minutos a 16ºC, las respectivas temperaturas óptimas para las dos enzimas. A continuación la mezcla de reacción es tratada con la nucleasa PLASMID-SAFETM para hidrolizar todos los fragmentos de ADNds lineales a fin de evitar la clonación de sistemas incompletos más cortos por recombinación in vivo, y a continuación la mezcla se usa para transformar células de E. coli químicamente competentes. Los plásmidos recombinantes resultantes se aíslan y se confirman las construcciones correctas. Entonces, en la segunda etapa, los plásmidos confirmados de la primera etapa se mezclan con el plásmido de última repetición apropiado y pTAL, y se lleva a cabo el ciclo de reacciones de digestión y ligadura como en la primera etapa. Finalmente, los productos de reacción se introducen en E. coli, y la construcción de sistema final de longitud completa se aísla y se confirma. El protocolo puede ser completado por una persona en un periodo de tiempo de una semana.

Las construcciones de expresión para las TALENs 85, 102 y 117 de la Tabla 4A, así como las TALENs HPRT-325417 y HPRT-3286-20r, descritas más adelante en el Ejemplo 14, se prepararon usando el método y los reactivos descritos en este ejemplo.

Ejemplo 9 – Los datos de TALENs a medida muestran un apoyo inicial a “reglas” y una correlación entre el número de RVDs y la actividad

El ejemplo 6 describe experimentos llevados a cabo para modificar el dominio de unión de ADN de TALEN para que pueda reconocer secuencias de ADN únicas. Tal como se ha descrito, dichas TALENs a medida reconocen sitios en los genes ADH1 de Arabidopsis y gridlock de pez cebra. Se modificaron dominios de unión de ADN de efector TAL a medida adicionales para reconocer no solo sitios en dichos genes, sino también en el gen TT4 de Arabidopsis, y telomerasa de pez cebra (Foley et al., ver cita anterior; y Zhang et al., ver cita anterior). Estas TALENs a medida se prepararon usando los métodos descritos en los Ejemplos 3, 4 y 8. Al modificar las TALENs a medida, se adoptaron las tendencias composicionales y posicionales observadas como principios de diseño o “reglas”. En primer lugar, se llevó a cabo una búsqueda de secuencias en las regiones codificadoras que estuvieran precedidas por una T 5’ y con una longitud de al menos 15 pb, y que tuvieran una composición de nucleótidos consistente con los promedios anotados anteriormente. Específicamente, solo se seleccionaron los sitios con 0-63% de A, 11-63% de C, 0-25% de G y 2-42% de T. Dichos sitios se presentaban de media cada 7-9 pb. A continuación se seleccionaron sitios que conformaban las tendencias posicionales observadas descritas anteriormente. A partir de este conjunto, se identificaron dos pares de sitios de unión en cada gen que tenían una longitud de 15-19 pb y que estaban separados por 15-18 pb, de tal modo que la unión de las TALENs modificadas permitiera a la FokI dimerizarse. Los métodos de montaje modular (Ejemplos 3 y 4) generaron construcciones de longitud parcial.

En total, 21 TALENs intermedias y de longitud completa diseñadas para atacar 16 secuencias de nucleótidos, cada una con un sistema de nueve repeticiones o más. Las secuencias de aminoácidos de dichas TALENs fueron evaluadas para determinar su capacidad para romper ADN usando el ensayo de levadura descrito en los Ejemplos 2 y 6. Los datos de actividad se muestran en la Figura 35 y se resumen en la Tabla 4A.

Algunas de las TALENs intermedias, de longitud parcial, se corresponden con dianas que rompen las reglas de composición de nucleótidos y de T terminal. La Tabla 4A muestra la longitud, la conformidad respecto a estas dos reglas, y la actividad relativa a la de ZFN268 para cada TALEN. Esto sugiere que existe un número mínimo de RVDs necesarios antes de que una diana de ADN pueda ser reconocida in vivo. Además, la conformidad respecto a las reglas parece ser importante. De las seis TALENs que no muestran actividad detectable, dos violaban la regla de la composición de diana, dos no acababan en NG, y otra rompía ambas reglas (una obedecía las dos reglas). Tres de las ocho TALENs con actividad inferior al 25% de ZFN268 violaban una de las reglas, y una de cuatro TALENs con actividad 25-50% de ZFN268 no tenían una secuencia de RVD que acabara en NG. Cabe destacar que las TALENs

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con actividad de 50% o superior que la de ZFN268 obedecían todas las reglas, y para TALENs de la misma longitud, las que rompían las reglas generalmente presentaban menos actividad que los sistemas que obedecían. En consistencia con la tendencia general en relación a la longitud, incluso para intermedios que no rompían reglas, las correspondientes TALENs de longitud completa tenían mayor actividad (Tabla 4A y Figura 35). La variación en la

5 longitud de espaciador debida a diferencias de longitud de TALEN en la misma diana puede haber contribuido a esta observación, pero se tolera un determinado intervalo de longitudes de espaciador (Christian et al., ver cita anterior).

En los datos resultaron evidentes algunas complejidades. Por ejemplo, la actividad varió entre las TALENs que obedecían las reglas con la misma longitud, algunos sistemas cortos presentaron actividad moderadamente alta, y algunos sistemas largos que obedecían las reglas tenían poca o ninguna actividad (Tabla 4B). Sin embargo, los

10 resultados proporcionan soporte para las conclusiones de que 1) generalmente un mayor número de repeticiones da como resultado una mayor actividad, y 2) la conformidad con respecto a las reglas de tendencia de composición y posición es importante para la actividad. Por lo tanto, se derivan los siguientes principios de diseño.

 Los sitios de unión de efector TAL se diseñan para tener un mínimo de 15 bases y orientados de 5’ a 3’ con una T inmediatamente precedente al sitio del extremo 5’.

15  Un sitio puede no tener una T en la primera (5’) posición o una A en la segunda posición.

 Un sito debe acabar en T (3’), y puede no tener una G en la posición siguiente a la última.

 La composición de bases del sitio debe entrar dentro de los rangos especificados (promedio ± dos desviaciones estándar): A 0-63%, C 11-63%, G 0-25% y T 2-42%.

Tabla 4A

20 Actividad, conformidad respecto a las reglas, y longitud de TALENs evaluadas en el ensayo de levadura.

Gen

TALEN Nombres en Christian et al. (ver citaanterior) RVDs Actividad % de GATC Extremos en NG Secuencia de RVD1

telomerasa

124 9 - N S HD NN NN NG NG NG NN HD NG

gridlock

105 10 + N N NI HD HD HD HD NG HD NG HD HD

ADH1

58 ADH1-360-12 12 ++ S N NI NG HD NI NI NN NI NG NG HD NG HD

ADH1

63 ADH1-40812r 12 - S N HD HD HD NI NN NI NI NN NG NI NI NI

ADH1

68 ADH1-928-12 12 + S S HD HD NN NN NI NG NN HD NG HD HD NG

ADH1

73 ADH1-97512r 12 - N N NI NN NI HD NI NI NI HD HD NI HD NI

TT4

89 12 - S N NN NN HD NI HD NG NN HD NG NI NI HD

gridlock

106 gridlock-235613r 13 ++ S S NI HD HD HD HD NG HD NG HD HD NN HD NG

ADH1

64 15 + S S HD HD HD NI NN NI NI NN NG NI NI NI HD NI NG

ADH1

69 15 +++ S S ND ND NN NN NI NG NN HD NG HD HD NG HD NG NG

ADH1

74 15 ++ S S NI NN NI HD NI NI NI HD HD NI HD NI NI HD NG

TT4

90 15 - S S NN NN HD NI HD NG NN HD NG NI NI HD HD HD NG

telomerasa

121 15 + S S HD NG NG NN NG HD HD NN HD NI NG NN NI NG NG

telomerasa

126 15 - N S HD NN NN NG NG NG

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NN HD NG NI NG HD NN NG NG

gridlock

107 16 ++++ S S NI HD HD HD HD NG HD NG HD HD NN HD NG NG HD NG

gridlock

117 16 ++ S S HD HD HD NN NN NI NI NN HD HD NN NI HD NN HD NG

telomerasa

131 16 + S S NI NG NG HD HD HD HD NI HD NN NI NN HD NG HD NG

telomerasa

136 17 + N S NI NN NI HD NI NN NN NI NI NN NG NN NN NI NN HD NG

ADH1

60 18 +++++ S S NI NG HD NI NI NN NI HG NG HD NG HD NG NG HD NI HD NG

TT4

85 18 + S S NI HD NG HD HD NN HD HD NG NN NI NI NN HD NI HD NI NG

gridlock

102 18 + S N NN NN HD NG HD NI HD HD NG NI HD NI NI HD NN NI HD NI

1 Las secuencias diana evaluadas consisten en repeticiones invertidas de la correspondiente secuencia de nucleótidos, donde HD, NG, NI y NN corresponden a C, T, A y G, respectivamente, separadas por una secuencia espaciadora de 16-18 pb.

Tabla 4B

5 Extracto de la Tabla 4A, clasificada por nivel de actividad

RVDs

Actividad % de GATC Extremos en NG

9

- n s

12

- s n

12

- n n

12

- s n

15

- s s

15

- n s

10

+ n n

12

+ s s

15

+ s s

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+ s s

16

+ s s

17

+ n s

18

+ s s

18

+ s n

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++ s n

13

++ s s

15

++ s s

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++ s s

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+++ s s

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++++ s s

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+++++ s s

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Ejemplo 10 – Los pares de TALEN heterodiméricas rompen sus secuencias diana naturales pretendidas en el ensayo de levadura

Los datos de los Ejemplos 2, 6 y 9 demuestran que las TALENs a medida pueden modificarse para reconocer nuevas secuencias de ADN diana. Los datos de actividad de levadura para las TALENs a medida fueron recogidos usando monómeros de TALEN individuales que reconocían un sitio diana homodimérico. Es decir, la secuencia diana de la TALEN se duplicó en orientación inversa en cada lado de un espaciador de 15-18 pb. La ruptura de secuencias cromosomales endógenas, sin embargo, generalmente requeriría que dos TALENs a medida diferentes reconocieran dos secuencias diferentes en cada lado de un espaciador. Como se ha descrito en el Ejemplo 6, esta capacidad se demostró para las TALENs AvrBs3 y PthXo1 juntas usando un sitio diana quimérico correspondiente en el ensayo de levadura. Evaluamos si dos TALENs a medida diferentes reconocerían y romperían una secuencia de ADN natural. Usando el ensayo de levadura descrito en el Ejemplo 2, se evaluó la actividad de dos TALENs diseñadas para romper dos secuencias dianas en el gen ADH1 de Arabidopsis. Las secuencias de ADN de los sitios diana y las correspondientes TALENs se muestran en la Figura 36A. Las secuencias de aminoácidos de las TALENs se proporcionan en la Figura 34. La actividad de beta-galactosidasa obtenida en el ensayo de levadura se representa en el gráfico mostrado en la Figura 36B. La actividad de las TALENs sobre su secuencia diana natural estaba significativamente por encima de los controles negativos, lo que indica que las TALENs pueden ser modificadas para reconocer y romper secuencias de ADN diana endógenas.

Ejemplo 11 – Las TALENs rompen genes nativos en Arabidopsis e introducen mutaciones por unión de extremos no homóloga imprecisa

Uno de los pares de TALEN activos diseñado para reconocer una secuencia diana en el gen ADH1 de Arabidopsis fue evaluado para determinar si podía unirse, romper y mutar ADN cromosomal. Cada una de las TALENs de ADH1 que comprenden dicho par (pTALENs 69 y 74) fue clonada en el vector de expresión pFZ14, que coloca a las TALENs bajo el control del promotor 35S constitutivo (Zhang et al., ver cita anterior). Las construcciones resultantes fueron introducidas a continuación en protoplastos de Arabidopsis mediante electroporación. Tras 48 horas, se aisló ADN genómico y se digirió con Tth111I. Un sitio de ruptura de Tth111I se localiza en la secuencia espaciadora entre de los dos sitios de reconocimiento de TALEN (Figura 37A). Sería de esperar que la ruptura del ADN cromosomal por parte de la TALEN introdujera mutaciones por unión de extremos no homóloga imprecisa (NHEJ, del inglés “imprecise non-homologous end-joining”), lo que daría como resultado un fallo en la ruptura por parte de Tth111I. A continuación se amplificó mediante PCR un fragmento de 375 pb que abarca el sitio de reconocimiento de la TALEN. El producto de PCR fue digerido de nuevo con Tth111I para eliminar la mayor parte del ADN genómico remanente que no había sido modificado mediante NHEJ mediada por TALEN. Los productos de digestión fueron llevados entonces a un análisis en gel de agarosa. Se observó un producto de PCR no roto, y dichos productos de PCR no rotos son diagnósticos de actividad de nucleasa (en este caso actividad de TALEN) en la secuencia diana endógena (Zhang et al., ver cita anterior). El ADN no cortado fue clonado y analizado mediante secuenciamiento de ADN. El secuenciamiento de nueve clones independientes reveló que seis portaban mutaciones introducidas mediante NHEJ (Figura 37B). Por tanto, las TALENs rompen localizaciones cromosomales endógenas e introducen saltos y mutaciones de ADN de cadena doble.

Ejemplo 12 – Potenciamiento de la capacidad de ataque dirigido

En el núcleo de la cifra de ADN de efector TAL, los cuatro RVDs más comunes tienen todos una aparente especificidad uno-a-uno para los cuatro nucleótidos, en base a las frecuencias de asociación. Esto es especialmente así para HD, NG y NI, pero menos para NN (Figura 1C). El NN se asocia más frecuentemente con G, pero también comúnmente con A, y algunas veces con C ó T. Para un efector TAL montado aleatoriamente con NN en cuatro localizaciones de una secuencia de 13 RVDs, el tener G en todas las posiciones correspondientes de una diana artificial proporcionó la mejor actividad (Boch et al. (2009) Science 326: 1509-1512). A redujo la actividad, aunque no la eliminó, y C y T eliminaron la actividad detectable. Se observó una pérdida drástica de actividad cuando C, T ó A fueron sustituidos por G tan solo en la primera posición del sitio de unión para el efector PthXoI de 24 RVDs, que es un NN (Romer et al. (2010) New Phytol. 187: 1048-1057). Sin embargo, esto contrasta con la observación de que el mucho más corto AvrHah1 (14 RVDs) comienza con un NN que se alinea con A, y el efector PthXo6 de 23 RVDs tiene tres NNs en fila en las posiciones 4-6, alineadas todas con A, y aún así estas dos proteínas son altamente activas (véase, Schornack et al. (2008) New Phytol. 179: 546-556; y Romer et al., ver cita anterior). Por tanto, la especificidad de NN por G parece ser de forma general débil y puede variar con el contexto.

La invariancia observada en la timina inmediatamente precedente a los sitios diana de efector TAL es un requisito para varios efectores [Boch et al., ver cita anterior; Romer et al., ver cita anterior; y Romer et al. (2009) Plant Physiol.

150: 1697-1712]. La secuencia de aminoácidos inmediatamente precedente a la región de repetición en los efectores TAL, que está altamente conservada (Figura 38A), comparte una similitud significativa con la repetición, tanto en secuencia de aminoácidos como en estructura secundaria predicha (Figura 38B y Bodganove et al. (2010) Curr. Opin. Plant Biol. 13: 394-401). Se planteó la hipótesis de que esta secuencia, denominada repetición 0ª, es la base para el requisito de T en la posición -1 del sitio de unión, y que los residuos en la posición análoga a RVD (Figura 38B) especifican el nucleótido.

10

15

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25

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45

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En base a estos descubrimientos, se planteó la hipótesis de que mediante la incorporación de repeticiones con alta especificidad para G, y relajando el requisito de T en -1, se puede potenciar la capacidad de ataque dirigido de las proteínas de efector TAL. Se iniciaron experimentos para evaluar RVDs nuevos y poco frecuentes para una especificidad más robusta por G de la que muestra el NN, y para reemplazar los residuos análogos a RVDs de la repetición 0ª por RVDs comunes.

RVDs nuevos y poco frecuentes para especificidad robusta por G: Los módulos descritos anteriormente (véase, p.ej., el Ejemplo 4) usaron cuatro RVDs particulares (NI, HD, NN y NG) para especificar la unión a las cuatro bases de nucleótidos (A, C, G y T, respectivamente). También son útiles las repeticiones que contienen otros RVDs, y pueden tener una especificidad y/o afinidad mejoradas por las cuatro bases en comparación con NI, HD, NN y NG. Para mejorar la especificidad por G, se construyeron varias repeticiones que codifican RVDs nuevos y poco frecuentes. Los RVDs poco frecuentes NK, HN y NA se asociaron con G, lo que sugiere que N puede ser importante como uno u otro de los residuos (Figura 1C). Por tanto, se construyó una amplio conjunto de derivados que codifican repeticiones que tienen los RVDs mostrados en la Tabla 5. La columna de la izquierda enumera RVDs que tienen un aminoácido polar (R, K, D, E, Q, H, S, T ó Y) en la posición 12 y N en la posición 13. Las columnas de la derecha presentan combinaciones de N en la primera posición con cualquiera de los 17 aminoácidos restantes (G, L, V, R, K, D, E, Q, H, T, M, C, P, Y, W ó F) en la segunda posición del RVD. Para tener en cuenta la posibilidad de una mayor especificidad sin N, también se prepararon repeticiones con un aminoácido polar (R, K, D, E, Q, H, S, T ó Y) en la posición 12 y un hueco (*) en la posición 13 (columna del medio).

Se evalúan los nuevos RVDs artificiales para determinar su función en un ensayo basado en un gen indicador cuantitativo para la actividad de activación transcripcional de los efectores TAL, tal como un ensayo de expresión transitoria mediado por Agrobacterium en Nicotiana benthamiana basado en GUS o indicador de luciferasa dual, o en el ensayo de TALEN basado en indicador lacZ en Saccharomyces cerevisiae, descrito antes (ver, p.ej., el Ejemplo 2). Los módulos de repetición que contienen RVDs que van a ser evaluados se incorporan en un efector TAL o TALEN con niveles medibles de sub-saturación de actividad, y se evalúan las proteínas resultantes para establecer diferencias de actividad en un conjunto de dianas de ADN con permutaciones integradas en los cuatro nucleótidos de las posiciones correspondientes. En particular, comenzando con la(s) variante(s) de PthXo1 mínimamente activa(s) en los ensayos de levadura y con plantas y que responde(n) a faltas de coincidencia en tres repeticiones añadidas, las TALENs que contienen cada una de las repeticiones nuevas y poco frecuentes (en tríos homoméricos) son evaluadas in vivo contra dianas con G en todas las posiciones correspondientes. Para cualquiera que muestre un incremento de actividad, se repiten los ensayos con dianas permutadas con los otros nucleótidos en dichas posiciones, para determinar la especificidad.

Tabla 5. RVDs que van a ser evaluadosª

Polar+N

Polar* N+todos

RN

R* NG NH

KN

K* NA NT

DN

D* NL NM

EN

E* NV NC

QN

Q* NR NP

HN

H* NK NY

SN

S* ND NW

TN

T* NE NF

YN

Y* NQ

ª Se conocen las frecuencias de asociación de N*, NG y NS nt. Un asterisco representa un hueco correspondiente a la 2ª posición del RVD (es decir, la 13ª posición de la secuencia de repetición de consenso).

Sustituciones comunes de RVD para la posición análoga de RVD de la repetición 0ª para relajar la especificidad de T en la posición -1: Las predicciones de estructura secundaria y de alineamiento de la repetición 0ª y las secuencias de consenso de repetición sugirieron que las posiciones ocupadas por KR* (un asterisco denota un hueco) en la repetición 0ª eran análogas al RVD y por tanto fueron los residuos que especifican T a -1. Se construyeron variantes de PthXo1 con sustituciones de HD, NG, NI y NN para KR, y de forma separada para R*, en la construcción de “cadena principal” de Tal1c descrita anteriormente. Las actividades de dichas variantes fueron comparadas con el efector natural en los ensayos con levadura y plantas usando dianas con los nucleótidos correspondientes a la posición -1, a saber, C, T, A y G, respectivamente. Se construyen variantes adicionales de PthXo1 que tienen S, el residuo en la posición 11 de la secuencia de repetición de consenso, sustituido por K de la posición 11 de la repetición 0ª. Y se construyeron otras variantes que tenían dicha sustitución combinada con una sustitución de K, el residuo de la posición 16 de la secuencia de repetición de consenso, por V de la posición 15 de la repetición 0ª (Tabla 6). Se puede incluir una caja TATA proximal para la actividad de efector TAL. Adicionalmente, la PthXo1 es útil para este experimento debido a que, al contrario que la AvrBs3, para la cual la T a -1 parece ser parte de una

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caja TATA, la caja TATA más próxima al sitio de unión de PthXo1 está 46 pb hacia abajo y no se vería perturbada por modificaciones en -1.

Si las modificaciones anteriores no dan como resultado una capacidad de ataque dirigido mejorada para G o una capacidad mejorada para atacar secuencias precedidas por nucleótidos diferentes a T, entonces se evalúa un conjunto más amplio de RVDs artificiales para determinar la especificidad por G, y se ensayan otras sustituciones diferentes a los RVDs comunes para la repetición 0ª.

Tabla 6. Construcciones de repetición 0ª que se preparan y se evalúan en relación a la especificidad por dianas con A, C, G ó T en la posición -1.

Secuencia de repetición 0ª nativa(especifica T a -1)

Sustitución que especifica T Sustitución que especifica A Sustitución que especifica C Sustitución que especifica G

…KIA*KRGGV…(74)†

…KIA*NGGGV…(75) …KIA*NIGGV…(76) …KIA*HDGGV…(77) …KIA*NNGGV…(78)

…KIA*KRGGV…(79)

…KIASNGGGV…(80) …KIASNIGGV…(81) …KIASHDGGV…(82) …KIASNNGGV…(83)

…KIAKR*GGV…(84)

…KIAKNGGGV…(85) …KIAKNIGGV…(86) …KIAKHDGGV…(87) …KIAKNNGGV…(88)

…KIA*KRGGV…(89)

…KIASNGGGK…(90) …KIASNIGGK…(91) …KIASHDGGK…(92) …KIASNNGGK…(93)

Los RVDs candidatos y sustituidos están en negrita. Otras sustituciones o modificaciones están subrayadas. Los 10 asteriscos denotan un hueco relativo a la secuencia de repetición de consenso.

† SEQ ID NO:

Ejemplo 13 – -Nuevos RVDs específicos de nucleótidos predichos

Se observó que cuando los RVDs enumerados en las Tablas 1A y 1B eran agrupados por el segundo residuo de aminoácido del RVD (es decir, el 13º de toda la repetición), había una correlación casi perfecta de dicho aminoácido 15 con el(los) nucleótido(s) especificado(s) por el RVD, independientemente del aminoácido de la primera posición del RVD (Tabla 7). Por tanto, los RVDs que finalizan en un hueco (denotado por un asterisco) especifican C ó T, ó T; los RVDs que finalizan en D especifican C; los RVDs que finalizan en G especifican T; y los RVDs que finalizan en N especifican G ó A, ó G. También se observó que los aminoácidos de la posición 1 del RVD eran H, I, N, S ó Y. Estas observaciones sugerían que la especificidad del RVD está determinada por el residuo de la segunda posición,

20 independientemente de si el residuo de la primera posición es H, I, N, S ó Y. Por tanto, se predijeron las especificidades para varios RVDs nuevos (es decir, aún no observados) que combinan residuos observados en la segunda posición con los residuos H, I, S, N ó Y en la especifican C; se predijo que SG especifica T; y se predijo que IN e YN especifican G ó A, ó G. Asimismo, aunque solo había un ejemplo de K en el segunda posición, en base a la especificidad observada para NK, se predijo que HK, IK, SK e YK especifican G.

25 Estos nuevos RVDs se evalúan y se comparan con RVDs existentes en términos de función y especificidad en ensayos de actividad de TALEN y efector TAL cuantitativos, tal como se describe en los Ejemplos 2 y 11.

Tabla 71

RVDs agrupados y ordenados por su segundo residuo

1er residuo

2º residuo Nucleótido

N

* C ó T

H

* T

H

A C

N

A G

H

D C

N

D C

H

G T

I

G T

N

G T

Y

G T

N

I A

H

I C

5

10

15

20

25

30

35

40

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N

K G

H

N G

S

N G ó A

N

N

G ó A1

N

S A ó C ó G1

1 Un asterisco denota un hueco. Los grupos RVD con especificidades similares están recuadrados con línea gruesa.

Ejemplo 14 – Las TALENs a medida rompen dianas endógenas en células animales e introducen mutaciones por unión de extremos no homóloga imprecisa

Para evaluar si las TALENs podían ser usadas para mutagénesis dirigida en células animales, en primer lugar se evaluó la expresión de los efectores TAL AvrBs3, PthXo1 y Tal1c en células 293T de riñón embriónicas humanas (HEK, del inglés “human embryonic kidney”). Se eliminó el codón de parada de los genes que codifican AvrBs3, PthXo1 y Tal1c y los genes fueron subclonados en vector de expresión de mamífero pcDNA3.2/V5-DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA) en marco con la secuencia hacia abajo en la que el vector codifica el epítopo V5 para inmunodetección de proteínas. El pcDNA3.2/V5-DEST coloca el gen de efector TAL bajo el control del promotor de citomegalovirus humano constitutivo (CMV, del inglés “constitutive human cytomegalovirus”). Las células HEK 293T fueron transfectadas usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) con los resultantes plásmidos de forma individual, y tras 24 horas se aislaron las proteínas totales de cada lote transfectado de células y se sometieron a electroforesis de gel de poliacrilamida, análisis de Western blot e inmunomarcaje usando anticuerpos de ratón anti-V5. Las proteínas marcadas fueron detectadas con un conjugado de peroxidasa de rábano-anticuerpo anti-ratón de cabra usando el kit quimioluminiscente SuperSignal Weat Pico (ThermoScientific, Inc.). La carga equivalente se confirmó mediante inmunomarcaje y detección de actina. Todas las proteínas de efector TAL se expresaron de forma detectable sin degradación aparente (Figura 39).

A continuación, se diseño un par de TALENs como se describe en el Ejemplo 9 para dirigirlas a una secuencia del gen HPRT humano endógeno, y se denominaron HPRT-3254-17 y HPRT-3286-20r (Figura 40A y Figura 40B). El plásmido pTALEN141 que codifica la HPRT-3254-17 y el plásmido pTALEN142 que codifica la HPRT-3286-20r fueron construidos usando el método basado en clonación Golden Gate y los reactivos descritos en el Ejemplo 8. Los genes de TALEN fueron subclonados a continuación en el vector de expresión de mamífero pCDNA3.1(-) (Invitrogen, Inc.), que los coloca bajo el control del promotor CMV constitutivo, dando lugar a los plásmidos pTALEN141M y pTALEN142M. A continuación se transfectaron células HEK 293T con pTALEN141M y pTALEN142M, tanto de forma conjunta como separada con pCDNA3.1(-) como control negativo. Tras 72 horas, se aisló el ADN genómico y se digirió con la endonucleasa de restricción Bpu10I. Existe un sitio Bpu10I en el espaciador que separa los sitios de unión de HPRT-3254-17 y HPRT-3286-20r del HPRT (Figura 41A). Después de la digestión con Bpu10I, se usó PCR para amplificar un fragmento de 244 pb que se extendía del sitio atacado por la TALEN tanto de las muestras tratadas con TALEN como de las muestras de control. El fragmento esperado fue amplificado a partir de ambas muestras, lo que indica que la digestión con Bpu10I del ADN genómico había sido incompleta. Sin embargo, una digestión posterior de los productos de PCR con Bpu10I dio como resultado la ruptura completa del producto amplificado de la muestra de control, pero una ruptura incompleta del producto de la muestra tratada con TALEN (Figura 41B). La presencia de un producto PCR resistente a la ruptura en la muestra tratada con TALEN proporciona evidencias de que el sitio Bpu10I endógeno había sido mutado in vivo como resultado de una reparación imperfecta por unión de extremos no homóloga de una ruptura de cadena doble mediada por TALEN en el sitio pretendido del HPRT. Por tanto, las TALENs pueden usarse para mutagénesis dirigida en células de mamífero.

Claims (28)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

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   REIVINDICACIONES

   1. Un método para modificar el material genético de una célula, que comprende:

   (a)

   proporcionar una célula que contiene una secuencia de ADN diana; y

   (b)

   introducir en la célula un vector que codifica una endonucleasa de efector de tipo activador de la transcripción (TAL), comprendiendo la endonucleasa de efector TAL:

   (i)

   un dominio de endonucleasa que puede romper un ADN de cadena doble, donde el dominio de endonucleasa procede de una endonucleasa de restricción de tipo II, y

   (ii)

   un dominio de efector TAL que comprende una pluralidad de secuencias de repetición de efector TAL que, combinadas, se unen a una secuencia de nucleótidos específica de la secuencia de ADN diana,

   de tal modo que la endonucleasa de efector TAL rompe la secuencia de ADN diana dentro de, o adyacente a, la secuencia de nucleótidos específica de la célula o de su progenie.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, que además comprende proporcionar a la célula un ácido nucleico que comprende una secuencia homóloga a al menos una porción de la secuencia de ADN diana, de tal modo que se produzca la recombinación homóloga entre la secuencia de ADN diana y el ácido nucleico.

3. 3.

   El método de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 2, en el que la célula es una célula de mamífero.

4. 4.

   El método de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 2, en el que la célula es una célula vegetal.

5. 5.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la introducción comprende transfectar la célula con un vector que codifica la endonucleasa de efector TAL.

6. 6.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la endonucleasa de restricción de tipo II es FokI.

7. 7.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el dominio de efector TAL que se une a una secuencia de nucleótidos específica dentro de la secuencia de ADN diana comprende 10 ó más secuencias de repetición de efector TAL, más preferiblemente 15 ó más secuencias de repetición de efector TAL.

8. 8.

   El método de la reivindicación 7, en el que la secuencia de repetición de efector TAL comprende un diresiduo variable de repetición (RVD) que determina el reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN diana, donde cada secuencia de repetición de efector TAL es responsable del reconocimiento de un par base de la secuencia de ADN diana, y donde el RVD comprende uno o más de:

   HD para reconocer C; NG para reconocer T; NI para reconocer A; NN para reconocer G; NS para reconocer A; HG para reconocer T; IG para reconocer T; NK para reconocer G; HA para reconocer C; ND para reconocer C; HI para reconocer C; HN para reconocer G; y NA para reconocer G.

9. 9.

   Un método para generar un ácido nucleico que codifica una endonucleasa de efector TAL, comprendiendo dicho método:

   (a) identificar una primera secuencia de nucleótidos única en el genoma de una célula; y 43

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   (b)

   sintetizar un ácido nucleico que codifica una endonucleasa de efector TAL que comprende (i) una pluralidad de secuencias de repetición de efector TAL que, combinadas, se unen a la primera secuencia de nucleótidos única, y

   (ii)

   una endonucleasa que genera una ruptura de cadena doble en, o adyacente a, la primera secuencia de nucleótidos, donde cada secuencia de repetición de efector TAL comprende un RVD que determina el reconocimiento de un par base del ADN diana, donde cada secuencia de repetición de efector TAL es responsable del reconocimiento de un par base del ADN diana, y donde la endonucleasa de efector TAL comprende uno o más de los siguientes RVDs:

   HD para reconocer C; NG para reconocer T; NI para reconocer A; NN para reconocer G; NS para reconocer A; HG para reconocer T; IG para reconocer T; NK para reconocer G; HA para reconocer C; ND para reconocer C; HI para reconocer C; HN para reconocer G; y NA para reconocer G.
10. 10. El método de la reivindicación 9, en el que la primera secuencia de nucleótidos cumple al menos uno de los

    siguientes criterios: i) tiene un mínimo de 15 bases de longitud y está orientada de 5’ a 3’ con una T precediendo de forma inmediata al sitio del extremo 5’;

    ii) no tiene una T en la primera (5’) posición o una A en la segunda posición; iii) acaba en T en la última (3’) posición y no tiene una G en la siguiente a la última posición; y iv) tiene una composición de bases de 0-63% de A, 11-63% de C, 0-25% de G y 2-42% de T.

11. 11.

    El método de la reivindicación 9 ó de la reivindicación 10, que comprende además la identificación de una segunda secuencia de nucleótidos en el genoma de la célula, donde la primera y la segunda secuencias de nucleótidos están separadas por 15-18 pb.

12. 12.

    El método de la una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la endonucleasa genera una ruptura de cadena doble entre la primera y la segunda secuencias de nucleótidos.

13. 13.

    Un monómero de endonucleasa de efector TAL que comprende un dominio de endonucleasa y un dominio de unión de ADN de efector TAL específico de una diana de ADN, donde el dominio de endonucleasa procede de una endonucleasa de restricción de tipo II, donde el dominio de unión de ADN comprende una pluralidad de secuencias de repetición de efector TAL, comprendiendo cada secuencia de repetición de efector TAL un RVD que determina el reconocimiento de un par base de la diana de ADN, y donde cada secuencia de repetición de efector TAL es responsable del reconocimiento de un par base de la diana de ADN.

14. 14.

    El monómero de endonucleasa de efector TAL de la reivindicación 13, donde la endonucleasa de restricción de tipo II es FokI.

15. 15.

    El monómero de endonucleasa de efector TAL de la reivindicación 14, donde dicho monómero actúa como un dímero con otro monómero a través de un sitio de reconocimiento bipartito con un espaciador, lo que permite que la FokI se dimerice y cree una ruptura de cadena doble en dicha diana de ADN dentro de dicho espaciador.

16. 16.

    El monómero de endonucleasa de efector TAL de la reivindicación 13, donde el monómero de endonucleasa de efector TAL comprende uno o más de los siguientes RVDs:

    44 5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

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    HD para reconocer C; NG para reconocer T; NI para reconocer A; NN para reconocer G; NS para reconocer A; HG para reconocer T; IG para reconocer T; NK para reconocer G; HA para reconocer C; ND para reconocer C; HI para reconocer C; HN para reconocer G; y NA para reconocer G.

17. 17.

    El monómero de endonucleasa de efector TAL de la reivindicación 13, donde la secuencia de aminoácidos de dicha endonucleasa de efector TAL tiene al menos un 95% de identidad con respecto a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 33 a SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 73.

18. 18.

    Un método para generar un animal no humano, que comprende:

    i) proporcionar una célula eucariótica que comprende una secuencia de ADN diana en la cual se desea introducir una modificación genética, donde la célula comprende un ácido nucleico que codifica una endonucleasa de efector TAL según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17;

    ii) generar una ruptura de cadena doble dentro de la secuencia de ADN diana con la endonucleasa de efector TAL; y

    iii) generar un animal no humano a partir de la célula, o de su progenie, en la cual se ha producido la ruptura de cadena doble.
19. 19. El método de la reivindicación 18, que además comprende:

    introducir en la célula un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia homóloga a al menos una porción del ADN diana, donde la introducción se realiza en las condiciones que permitan que se produzca una recombinación homóloga entre el ácido nucleico exógeno y la secuencia de ADN diana de la célula o de su progenie; y

    generar un animal no humano a partir de la célula, o de su progenie, en la que se ha producido la recombinación homóloga.

20. 20.

    Un método para generar una planta, que comprende: i) proporcionar una célula vegetal que comprende una secuencia de ADN diana en la cual se desea introducir una

    modificación genética preseleccionada, donde la célula vegetal comprende un ácido nucleico que codifica una endonucleasa de efector TAL según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17; ii) generar una ruptura de cadena doble dentro de la secuencia de ADN diana con la endonucleasa de efector TAL; y iii) generar una planta a partir de la célula, o de su progenie, en la cual se ha producido la ruptura de cadena doble.

21. 21.

    El método de la reivindicación 20, que además comprende:

    introducir en la célula vegetal un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia homóloga a al menos una porción de la secuencia de ADN diana, donde la introducción se realiza en las condiciones que permitan que se produzca una recombinación homóloga entre el ácido nucleico exógeno y la secuencia de ADN diana de la célula o de su progenie; y

    generar una planta a partir de la célula, o de su progenie, en la que se ha producido la recombinación homóloga.
22. 22. Un método para la recombinación genética dirigida en una célula, que comprende: 45

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    i) introducir en la célula un ácido nucleico que codifica una endonucleasa de efector TAL según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, donde dicha endonucleasa de efector TAL está dirigida a una secuencia de ADN diana seleccionada;

    ii) inducir la expresión de la endonucleasa de efector TAL dentro de la célula; y

    5 iii) identificar una célula en la que la secuencia de ADN diana seleccionada exhiba una mutación.

23. 23.

    El método de la reivindicación 22, en el que la mutación se selecciona del grupo que consiste en eliminación de material genético, inserción de material genético y ambas, eliminación e inserción de material genético.

24. 24.

    El método de la reivindicación 22, que además comprende introducir ADN donante en la célula.

25. 25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que la célula es una célula de insecto, una 10 célula vegetal, una célula de pez o una célula de mamífero.
26. 26. Un ácido nucleico que codifica una endonucleasa de efector TAL que comprende (i) un dominio de endonucleasa que puede romper ADN de cadena doble, donde el dominio de endonucleasa procede de una endonucleasa de restricción de tipo II, y (ii) un dominio de efector TAL que comprende una pluralidad de secuencias de repetición de efector TAL que, combinadas, se unen a una secuencia de ADN diana seleccionada.

    15 27. El ácido nucleico de la reivindicación 26, donde dicho dominio de endonucleasa procede de FokI.

27. 28.

    Una casete de expresión que comprende un promotor ligado operativamente al ácido nucleico de la reivindicación 26 ó de la reivindicación 27.

28. 29.

    Una célula hospedante que comprende la casete de expresión de la reivindicación 28.

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