ES2531630T3

ES2531630T3 - Composiciones de insulina de acción súper rápida

Info

Publication number: ES2531630T3
Application number: ES09739183.3T
Authority: ES
Inventors: Gregory I. Frost; Igor Bilinsky; Daniel Vaughn; Barry Sugarman
Original assignee: Halozyme Inc
Current assignee: Halozyme Inc
Priority date: 2008-04-28
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2015-03-18
Anticipated expiration: 2029-04-28
Also published as: US20140135682A1; PL2300046T3; SG10201404218VA; JP2016034959A; MX2010011849A; RS53945B1; HRP20150313T1; AU2009241795B2; WO2009134380A8; CA2722628A1; EP2705850B1; CL2009001014A1; SI2300046T1; BRPI0911782A2; US8318154B2; PE20141384A1; KR101516534B1; UY31789A1; EP2300046B1; HK1195728A1

Abstract

Una composición de insulina de acción súper rápida, que comprende: una concentración terapéuticamente eficaz de un análogo de insulina de acción rápida para mantener los niveles de glucosa en sangre normales, donde: el análogo de insulina de acción rápida es insulina glulisina o insulina aspart; los niveles de glucosa en sangre son niveles de glucosa en sangre postprandiales; y una concentración de una enzima degradante de hialuronano suficiente para hacer que la composición sea una composición de insulina de acción súper rápida tras la administración, donde la composición de insulina de acción súper rápida tiene un inicio de acción que se asemeja estrechamente a la liberación de insulina postprandial endógena de un sujeto no diabético; y la composición de insulina de acción súper rápida se formula para una vía de administración seleccionada de entre la administración subcutánea, intramuscular, intradérmica e intraperitoneal.

Description

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En un ejemplo, se consigue el control o la prevención de la obesidad en un sujeto diabético administrando a un sujeto diabético obeso o un sujeto diabético en riesgo de obesidad una dosificación terapéuticamente eficaz de una insulina de acción rápida en combinación con enzima degradante de hialuronano. La composición puede administrarse exacta o aproximadamente en el momento de la comida y

5 a) la cantidad de enzima degradante de hialuronano es suficiente para hacer que la insulina de acción rápida administrada sea una insulina de acción súper rápida; y b) la dosificación de la insulina de acción rápida consigue sustancialmente el mismo grado de eliminación de glucosa prandial durante los primeros 40 minutos después de la administración que una dosificación mayor de la misma insulina de acción rápida administrada de la misma manera en ausencia de la enzima degradante de hialuronano. La dosificación de la insulina de acción rápida en la composición de insulina de acción súper rápida, en comparación con la dosis mayor de insulina de acción rápida, tiene una tendencia reducida a provocar hipoglucemia y obesidad postprandial. Los sujetos diabéticos pueden tener diabetes de Tipo 2, y la cantidad de insulina de acción rápida administrada al sujeto puede reducirse en comparación con cuando se administra la

15 insulina de acción rápida de la misma manera en ausencia de una enzima degradante de hialuronano. Por ejemplo, la cantidad de insulina de acción rápida administrada a un sujeto diabético de Tipo 2 puede reducirse en al menos o aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o más.

También se describen métodos para reducir o prevenir el aumento de peso asociado con terapia de insulina prandial administrando por vía subcutánea a un sujeto diabético en riesgo de aumento de peso por terapia de insulina prandial, exacta o aproximadamente en el momento de la comida, una composición de insulina que contiene una insulina de acción rápida y una enzima degradante de hialuronano, de modo que la cantidad de insulina de acción rápida administrada para tratar la hiperglucemia postprandial en el sujeto se reduce en comparación con la cantidad de la misma insulina de acción rápida requerida para tratar la hiperglucemia cuando se administra de la misma

25 manera en ausencia de la enzima degradante de hialuronano. La cantidad reducida de insulina de acción rápida hace que la composición que contiene la enzima degradante de hialuronano tenga menos probabilidad de provocar aumento de peso en el sujeto. Por ejemplo, puede administrarse a un sujeto diabético de Tipo 2 una composición de insulina como se ha descrito anteriormente que contiene una cantidad de insulina de acción rápida que es al menos

o aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 % menor que la cantidad de la misma insulina de acción rápida requerida para tratar la hiperglucemia cuando se administra de la misma manera en ausencia de la enzima degradante de hialuronano. En algunos casos, la composición de insulina se administra en un régimen crónico de terapia de insulina prandial.

Se describen en el presente documento métodos para reducir o prevenir el aumento de peso en un sujeto diabético

35 administrando a un sujeto diabético en riesgo de aumento de peso por terapia de insulina prandial, un ciclo de terapia de insulina prandial subcutánea durante un periodo de al menos treinta días. Las dosificaciones de insulina prandial administradas en el transcurso de la terapia contienen una combinación de una insulina de acción rápida y una enzima degradante de hialuronano. La cantidad de enzima degradante de hialuronano en cada dosificación es suficiente para hacer que la insulina de acción rápida sea una composición de insulina de acción súper rápida, y la cantidad de insulina de acción rápida contenida en la dosificación para tratar la hiperglucemia postprandial del sujeto es menor que una cantidad de la misma insulina de acción rápida requerida para tratar la hiperglucemia en ausencia de la enzima degradante de hialuronano. Dicho ciclo de terapia de insulina prandial puede dar como resultado un menor aumento de peso que un ciclo similar de terapia usando dosificaciones mayores de insulina de acción rápida en ausencia de enzima degradante de hialuronano.

45 También se describen métodos para controlar los niveles de glucosa en un sujeto administrando al sujeto una dosificación prandial de composición de insulina de acción súper rápida, donde:

a) la composición de insulina de acción súper rápida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una insulina de acción rápida y una enzima degradante de hialuronano; b) la insulina de acción rápida es una insulina regular; c) la dosificación se administra, o se recomienda para su administración prandial o preprandial, más cercana al momento de la comida que la misma o una mayor dosificación de la misma insulina regular de acción rápida administrada por la misma vía de administración en ausencia de una enzima degradante de hialuronano; y

55 d) la dosificación de la composición de insulina de acción súper rápida tiene al menos el mismo efecto terapéutico que la insulina regular de acción rápida sin la enzima degradante de hialuronano.

La composición de insulina de acción súper rápida por ejemplo se administra o se recomienda para su administración menos de o aproximadamente 20 minutos antes de una comida, hasta menos de o aproximadamente 10 o 20 minutos después de una comida. Típicamente, la dosificación de la insulina de acción rápida en la composición de insulina de acción súper rápida es menor o igual que la dosificación de la insulina de acción rápida administrada por la misma vía en ausencia de la enzima degradante de hialuronano.

En la práctica de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, las composiciones pueden

65 administrarse por cualquier vía adecuada y usando cualquier dispositivo o recipiente adecuado, tal como mediante jeringa, bolígrafo de insulina, bomba de insulina o sistema de bucle cerrado. Las composiciones o combinaciones

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posición 7 de la cadena A y la posición 7 de la cadena B, un segundo entre la posición 20 de la cadena A y la posición 19 de la cadena B, y un tercero entre las posiciones 6 y 11 de la cadena A. La referencia a insulina incluye polipéptidos de preproinsulina, proinsulina e insulina en formas monocatenarias o bicatenarias, formas truncadas de las mismas que tienen actividad e incluye variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por 5 variantes de corte y empalme y otras variantes, tales como análogos de insulina, incluyendo polipéptidos que tienen al menos un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con el polipéptido precursor expuesto en SEC ID Nº: 101 o la forma madura del mismo. Los análogos de insulina ejemplares incluyen los expuestos en las SEC ID Nº: 147-149, 152 y los que contienen una cadena A expuesta en las SEC ID Nº: 150, 156, 158, 160, 162 y 164 y/o una cadena B expuesta en las SEC ID Nº:

10 151, 153-155, 157, 159, 161, 163 y 165.

Los polipéptidos de insulina ejemplares son aquellos de origen mamífero, incluyendo humano. Se exponen secuencias de aminoácidos de insulina de origen humano en las SEC ID Nº: 101-104. Los análogos de insulina ejemplares incluyen aquellos expuestos en las SEC ID Nº: 147-149, 152 y los que contienen una cadena A

15 expuestos en las SEC ID Nº: 150, 156, 158, 160, 162 y 164 y/o una cadena B expuestos en las SEC ID Nº: 151, 153155, 157, 159, 161, 163 y 165. Los polipéptidos de insulina también incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero sin limitación, cualquiera de los polipéptidos precursores de insulina expuestos en las SEC ID Nº: 105-146. La referencia a una insulina incluye insulinas monoméricas y multiméricas, incluyendo insulinas hexaméricas, así como insulinas humanizadas.

20 Tal como se usa en el presente documento "insulina acción rápida" se refiere a cualquier insulina o composición de insulina de acción rápida para administración aguda a un sujeto diabético en respuesta a una afección hiperglucémica real, percibida o anticipada en el sujeto que surge en el momento de, o en un periodo de aproximadamente cuatro horas después de, la administración de la insulina de acción rápida (tal como una afección

25 hiperglucémica prandial resultante de o que se anticipa que resulta de, el consumo de una comida), por lo que la insulina de acción rápida es capaz de prevenir, controlar o aliviar la afección hiperglucémica aguda. Típicamente una composición de insulina de acción rápida muestra niveles de insulina máximos transcurridas exacta o aproximadamente no más de cuatro horas después de la administración subcutánea a un sujeto. Las composiciones de insulina de acción rápida incluyen insulinas recombinantes e insulinas aisladas (también denominadas insulinas

30 "regulares") tales como la insulina comercializada como Humulin® R, insulinas porcinas o insulinas bovinas, así como análogos de insulina diseñados para ser de acción rápida según los cambios de aminoácidos. Las preparaciones de insulina regulares ejemplares incluyen, pero sin limitación, insulinas regulares humanas, tales como las que se venden con las marcas comerciales Humulin® R, Novolin® R y Velosulin®, insulina humana, inyección de USP e insulina humana, USP, así como formulaciones ácidas de insulina, tales como, por ejemplo,

35 insulina Toronto, insulina Antigua e insulina Transparente, e insulinas de cerdo regulares, tales como Iletin II® (insulina porcina). Los análogos de insulina de acción rápida ejemplares incluyen, por ejemplo, insulina lispro (por ejemplo insulina Humalog®), insulina aspart (por ejemplo, insulina NovoLog®) e insulina glulisina (por ejemplo insulina Apidra®), la composición de insulina de acción rápida comercializada como VIAject® y VIAtab® (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 7.279.457). Aunque la expresión "insulina de acción rápida" no abarca

40 "insulinas de acción basal", las composiciones de insulina de acción súper rápida descritas en el presente documento pueden incluir opcionalmente, además de una insulina de acción rápida, una o más insulinas de acción basal.

Tal como se usa en el presente documento, una insulina humana, se refiere a una insulina que es sintética o se

45 produce de forma recombinante basándose en el polipéptido humano, incluyendo variantes alélicas y análogos del mismo.

Tal como se usan en el presente documento, las insulinas humanas de acción rápida o composiciones de insulina de acción rápida humana incluyen cualquier insulina humana o composición de una insulina humana que sea de acción

50 rápida, pero excluye insulinas no humanas, tales como insulina regular de cerdo.

Tal como se usan en el presente documento, las expresiones "insulinas de acción basal" o "insulinas basales" se refieren a las insulinas administradas para mantener un nivel de insulina basal como parte de un régimen de tratamiento general para tratar una afección crónica tal como diabetes. Típicamente, una insulina de acción basal se 55 formula para mantener un nivel de insulina aproximadamente en estado estacionario mediante la liberación controlada de insulina cuando se administra periódicamente (por ejemplo una vez o dos veces al día). Las insulinas de acción basal incluyen insulinas cristalinas (por ejemplo NPH y Lente®, insulina protamina, insulina surfen), análogos de insulina basal (insulina glargina, HOE 901, NovoSol Basal) y otras formulaciones químicas de la insulina (por ejemplo, suspensiones en goma arábiga, lecitina u oleosas) que retardan la velocidad de absorción de la 60 insulina regular. Tal como se usa en el presente documento, las insulinas de acción basal pueden incluir insulinas que se entiende típicamente que son de acción prolongada (alcanzando típicamente una concentración máxima relativamente baja, teniendo a la vez una duración máxima de acción por encima de aproximadamente 20-30 horas)

o acción intermedia (provocando típicamente concentraciones de insulina máxima aproximadamente a las 4-12

horas después de la administración). 65

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Tal como se usa en el presente documento, una enzima degradante de hialuronano se refiere a una enzima que cataliza la escisión de un polímero de hialuronano (también denominado ácido hialurónico o HA) en fragmentos de menor peso molecular. Son enzimas degradantes de hialuronano ejemplares las hialuronidasas, y condroitinasas y liasas particulares que tienen la capacidad de despolimerizar el hialuronano. Las condroitinasas ejemplares que son 5 enzimas degradantes de hialuronano incluyen, pero sin limitación, condroitín ABC liasa (también conocida como condroitinasa ABC), condroitín AC liasa (también conocido como condroitín sulfato liasa o condroitín sulfato eliminasa) y condroitín C liasa. La condroitín ABC liasa comprende dos enzimas, condroitín-sulfato-ABC endoliasa (CE 4.2.2.20) y condroitín-sulfato-ABC exoliasa (EC 4.2.2.21). Unas condroitín-sulfato-ABC endoliasas y condroitínsulfato-ABC exoliasas incluyen, pero sin limitación, las de Proteus vulgaris y de Flavobacterium heparinum (la condroitín-sulfato-ABC endoliasa de Proteus vulgaris se expone en SEC ID Nº: 98; Sato et al. (1994) Appl Microbiol. Biotechnol. 41 (1):39-46). Las enzimas condroitinasa AC ejemplares de las bacterias incluyen, pero sin limitación, las de Flavobacterium heparinum, Victivallis vadensis, expuestas en SEC ID Nº: 99, y Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444). Las enzimas condroitinasas C ejemplares de las bacterias incluyen, pero sin

15 limitación, las de Streptococcus y Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem.251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133).

Tal como se usa en el presente documento, la hialuronidasa se refiere a una clase de enzimas degradantes de hialuronano. Las hialuronidasas incluyen hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1), hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36) e hialuronidasas de tipo mamífero (EC 3.2.1.35). Las hialuronidasas incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero sin limitación, murinas, caninas, felinas, leporinas, aviares, bovinas, ovinas, porcinas, equinas, piscinas, raninas, bacterianas y cualquiera de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Las hialuronidasas no humanas ejemplares incluyen hialuronidasas de vacas (SEC ID Nº: 10, 11, 64 y BH55 (Patentes de Estados Unidos Nº 5.747.027 y 5.827.721), avispa amarilla (SEC ID Nº: 12 y 13), 25 abeja melífera (SEC ID Nº: 14), Dolichovespula maculata (SEC ID Nº: 15), avispa cartonera (SEC ID Nº: 16), ratón (SEC ID Nº: 17-19, 32), cerdo (SEC ID Nº: 20-21), rata (SEC ID Nº: 22-24, 31), conejo (SEC ID Nº: 25), oveja (SEC ID Nº: 26, 27, 63 y 65), orangután (SEC ID Nº: 28), mono cynomolgus (SEC ID Nº: 29), cobaya (SEC ID Nº: 30), Arthrobacter sp. (cepa FB24) (SEC ID Nº: 67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEC ID Nº: 68), Propionibacterium acnes (SEC ID Nº: 69), Streptococcus agalactiae ((SEC ID Nº: 70); 18RS21 (SEC ID Nº: 71); serotipo Ia (SEC ID Nº: 72); serotipo III (SEC ID Nº: 73)), Staphylococcus aureus (cepa COL) (SEC ID Nº: 74); cepa MRSA252 (SEC ID Nº: 75 y 76); cepa MSSA476 (SEC ID Nº: 77); cepa NCTC 8325 (SEC ID Nº: 78); cepa RF122 bovina (SEC ID Nº: 79 y 80); cepa USA300 (SEC ID Nº: 81), Streptococcus pneumoniae ((SEC ID Nº: 82); cepa ATCC BAA-255/R6 (SEC ID Nº: 83); serotipo 2, cepa D39/NCTC 7466 (SEC ID Nº: 84), Streptococcus pyogenes (serotipo M1) (SEC ID Nº: 85); serotipo M2, cepa MGAS10270 (SEC ID Nº: 86); serotipo M4, cepa MGAS10750 (SEC ID Nº: 87); serotipo M6 (SEC

35 ID Nº: 88); serotipo M12, cepa MGAS2096 (SEC ID Nº: 89 y 90); serotipo M12, cepa MGAS9429 (SEC ID Nº: 91); serotipo M28 (SEC ID Nº: 92); Streptococcus suis (SEC ID Nº: 93-95); Vibrio fischeri (cepa ATCC 700601/ES114 (SEC ID Nº: 96)), y la enzima hialuronidasa de Streptomyces hyaluronolyticus, que es específica para el ácido hialurónico y no escinde condroitina o condroitina sulfato (Ohya, T. y Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607). Las hialuronidasas también incluyen las de origen humano. Las hialuronidasas humanas ejemplares incluyen HYAL1 (SEC ID Nº: 36), HYAL2 (SEC ID Nº: 37), HYAL3 (SEC ID Nº: 38), HYAL4 (SEC ID Nº: 39), y PH20 (SEC ID Nº: 1). También se incluyen entre las hialuronidasas hialuronidasas solubles, incluyendo, PH20 ovina y bovina, PH20 humana soluble y rHuPH20 soluble. Son ejemplos de hialuronidasas solubles bovinas u ovinas disponibles en el mercado Vitrase® (hialuronidasa ovina) y Amphadase® (hialuronidasa bovina).

45 La referencia a enzimas degradantes de hialuronano incluye polipéptidos precursores de enzimas degradantes de hialuronano y polipéptidos maduros de enzimas degradantes de hialuronano (tales como aquellos a los que se ha retirado una secuencia señal), formas truncadas de los mismos que tienen actividad, e incluye variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de corte y empalme y otras variantes, incluyendo polipéptidos que tienen al menos un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con los polipéptidos precursores expuestos en las SEC ID Nº: 1 y 10-48, 63-65, 67-100 o la forma madura de los mismos. Por ejemplo, la referencia a enzima degradante de hialuronano también incluye las variantes de polipéptidos precursores de PH20 humana expuestas en las SEC ID Nº: 50-51. Las enzimas degradantes de hialuronano también incluyen las que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y las que no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Dichas modificaciones

55 incluyen, pero sin limitación, pegilación, albuminación, glucosilación, farnesilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación y otras modificaciones polipeptídicas conocidas en la técnica.

Tal como se usa en el presente documento, una hialuronidasa soluble se refiere a un polipéptido caracterizado por su solubilidad en condiciones fisiológicas. Las hialuronidasas solubles pueden distinguirse, por ejemplo, por su reparto en la fase acuosa de una solución de Triton X-114 calentada a 37 ºC (Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem.,

256: 1604-7). Las hialuronidasas ancladas a membrana, tales como las ancladas a lípidos, se repartirán en la fase rica en detergente, pero se repartirán en la fase acuosa o escasa en detergente después del tratamiento con Fosfolipasa C. Se incluyen entre las hialuronidasas solubles las hialuronidasas ancladas a membrana en las que una

o más regiones asociadas con el anclaje de la hialuronidasa a la membrana se ha retirado o modificado, donde la

65 forma soluble conserva la actividad hialuronidasa. Las hialuronidasas solubles incluyen hialuronidasas solubles recombinantes y las contenidas en o purificadas a partir de fuentes naturales, tales como, por ejemplo, extractos de

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SÍMBOLO

1-Letra: 3-Letras AMINOÁCIDO

E: Glu ácido glutámico

Z: Glx Glu y/o Gln

W: Trp Triptófano

R: Arg Arginina

D: Asp ácido aspártico

N: Asn asparagina

B: Asx Asn y/o Asp

C: Cys Cisteína

X: Xaa Desconocido u otro

Debería observarse que todas las secuencias de restos de aminoácidos representadas en el presente documento por fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional de amino terminal a carboxilo terminal. Además, se define en general que la expresión “resto de aminoácido” incluye los aminoácidos

5 enumerados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y aminoácidos modificados y no habituales, tales como los indicados en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e incorporados en el presente documento por referencia. Además, debería observarse que un guion al comienzo o final de una secuencia de restos de aminoácidos indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o más restos de aminoácidos, con un grupo amino terminal tal como NH2 o con un grupo carboxilo terminal tal como COOH.

10 Tal como se usa en el presente documento, “aminoácidos de origen natural” se refiere a los 20 aminoácidos L que aparecen en polipéptidos.

Tal como se usa en el presente documento, “aminoácido no natural” se refiere a un compuesto orgánico que tiene

15 una estructura similar a un aminoácido natural pero que se ha modificado estructuralmente para imitar la estructura y reactividad de un aminoácido natural. Los aminoácidos de origen no natural incluyen por lo tanto, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos de origen natural e incluyen, pero sin limitación, los isoestereómeros D de aminoácidos. Se describen en el presente documento aminoácidos no naturales ejemplares y se conocen por los expertos en la materia.

20 Tal como se usa en el presente documento, una construcción de ADN es una molécula de ADN lineal o circular, mono o bicatenaria, que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera no hallada en la naturaleza. Las construcciones de ADN existen como resultado de la manipulación humana e incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.

25 Tal como se usa en el presente documento, un segmento de ADN es una parte de una molécula de ADN mayor que tiene atributos específicos. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido específico es una parte de una molécula de ADN mayor, tal como un plásmido o fragmento plasmídico, que, cuando se lee en la dirección 5’ a 3’, codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido específico.

30 Tal como se usa en el presente documento, el término polinucleótido significa un polímero mono o bicatenario de desoxirribonucleótidos o bases ribonucleotídicas leídas del extremo 5’ al 3’. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse a partir de fuentes naturales, sintetizarse in vitro, o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula polinucleotídica se proporciona en el presente

35 documento con respecto a nucleótidos (abreviado “nt”) o pares de bases (abreviado “pb”). El término nucleótido se usa para moléculas mono y bicatenarias donde el contexto lo permita. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias se usa para indicar longitud general y se entenderá que es equivalente a la expresión pares de bases. Se reconocerá por los expertos en la materia que las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente en su longitud y que los extremos de las mismas pueden estar escalonados; por lo tanto todos los

40 nucleótidos dentro de una molécula polinucleotídica bicatenaria pueden no estar emparejados. Dichos extremos no emparejados no excederán, en general, de 20 nucleótidos de longitud.

Tal como se usa en el presente documento, “similitud” entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la relación entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos. La

45 similitud puede basarse en el grado de identidad y/u homología de secuencias de restos y los restos contenidos en las mismas. Se conocen por los expertos en la materia métodos para evaluar el grado de similitud entre proteínas o ácidos nucleicos. Por ejemplo, en un método para evaluar la similitud de secuencia, se alinean dos secuencias de

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aminoácidos o nucleótidos de manera que produzcan un nivel máximo de identidad entre las secuencias. “Identidad” se refiere al grado en que las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son invariantes. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos, y en cierto grado las secuencias de nucleótidos, también tiene en cuenta diferencias conservativas y/o sustituciones frecuentes en aminoácidos (o nucleótidos). Las diferencias conservativas son

5 aquellas que conservan las propiedades físico químicas de los restos implicados. Los alineamiento pueden ser globales (alineamiento de las secuencias comparadas sobre la longitud completa de las secuencias e incluyendo todos los restos) o locales (el alineamiento de una parte de las secuencias que incluye solamente la región o las regiones más similares).

La “identidad” en sí misma tiene un significado reconocido en la técnica y puede calcularse usando técnicas publicadas. (Véase, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer,

15 Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Aunque existen varios métodos para medir la identidad entre dos polinucleótidos o polipéptidos, el término “identidad” se conoce bien por los expertos en la materia (Carillo, H. y Lipton, D., SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)).

Tal como se usa en el presente documento, homólogo (con respecto a secuencias de ácido nucleico y/o aminoácidos) significa aproximadamente mayor que o igual al 25 % de homología de secuencia, típicamente mayor que o igual al 25 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %; el porcentaje preciso puede especificarse si es necesario. Para los fines del presente documento los términos “homología” e “identidad” se usan con frecuencia de forma intercambiable, a no ser que se indique de otro modo. En general, para la determinación del porcentaje de homología o identidad, se alinean secuencias de modo que se obtenga la coincidencia de mayor orden (véase, por 25 ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Mediante homología de secuencia, se determina el número de aminoácidos conservados por programas de algoritmos de alineamiento convencionales, y pueden usarse con penalizaciones de hueco por defecto establecidas por cada proveedor. Las moléculas de ácido nucleico sustancialmente homólogas hibridarían típicamente a rigurosidad moderada o a alta rigurosidad por toda la longitud del ácido nucleico de interés. También se contemplan moléculas de ácido nucleico que contienen codones degradados en lugar de codones en la molécula de ácido

35 nucleico que hibrida.

Si dos moléculas cualesquiera tienen secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos que son al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % “idénticas” u “homólogas” puede determinarse usando algoritmos informáticos conocidos tales como el programa “FASTA”, usando, por ejemplo, los parámetros por defecto como en Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (otros programas incluyen el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F., et al., J Molec Biol 215: 403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Por ejemplo, la función BLAST de la base de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica puede usarse para determinar la identidad. 45 Otros programas disponibles en el mercado o públicamente incluyen el programa “MegAlign” de DNAStar (Madison, WI) y el programa “Gap” del Grupo de Informática Genética de la Universidad de Wisconsin (UWG) (Madison WI). El porcentaje de homología o identidad de proteínas y/o moléculas de ácido nucleico puede determinarse, por ejemplo, comparando la información de secuencia usando un programa informático GAP (por ejemplo, Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, como se revisa en Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482). Brevemente, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos), que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por defecto para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, como se describe en Schwartz y Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND

55 STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización para huecos de los extremos.

Por lo tanto, tal como se usa en el presente documento, el término “identidad” u “homología” representa una comparación entre un polipéptido o polinucleótido de ensayo y uno de referencia. Tal como se usa en el presente documento, la expresión al menos “un 90 % idéntico a” se refiere a porcentajes de identidad del 90 al 99,99 en relación a la secuencia de ácido nucleico o aminoácidos de referencia del polipéptido. La identidad a un nivel del 90 % o más es indicativa del hecho de que, suponiendo para fines de ejemplificación que se comparan un polipéptido de ensayo y de referencia de una longitud de 100 aminoácidos, no más del 10 % (es decir, 10 de 100) de los 65 aminoácidos en el polipéptido de ensayo difieren de los del polipéptido de referencia. Pueden realizarse comparaciones similares entre polinucleótidos de ensayo y de referencia. Dichas diferencias pueden representarse

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como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente solo en la longitud completa de un polipéptido o pueden agruparse en una o más localizaciones de diversas longitudes hasta el máximo permisible, por ejemplo diferencia de 10/100 aminoácidos (de aproximadamente 90 % de identidad). Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones o deleciones de ácido nucleico o aminoácidos. Al nivel de homologías o identidades por encima de

5 aproximadamente 85-90 %, el resultado debería ser independiente del programa y los parámetros de hueco expuestos; dichos altos niveles de identidad pueden evaluarse fácilmente, con frecuencia mediante alineamiento manual sin depender de un programa informático.

Tal como se usa en el presente documento, una secuencia alineada se refiere al uso de homología (similitud y/o identidad) para alinear posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Típicamente, se alinean dos o más secuencias que están relacionadas por un 50 % o más de identidad. Un conjunto de secuencias alineadas se refiere a 2 o más secuencias que se alinean en posiciones correspondientes y puede incluir alinear secuencias derivadas de ARN, tales como EST y otros ADNc, alineados con secuencia de ADN genómico.

15 Tal como se usa en el presente documento, “cebador” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede actuar como un punto de inicio de la síntesis de ADN dirigida por molde en condiciones apropiadas (por ejemplo, en presencia de cuatro nucleósido trifosfatos diferentes y un agente de polimerización, tal como ADN polimerasa, ARN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada. Se apreciará que una determinada molécula de ácido nucleico puede actuar como una “sonda” y como un “cebador”. Un cebador, sin embargo, tiene un grupo hidroxilo 3’ para extensión. Un cebador puede usarse en una diversidad de métodos, incluyendo, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR de transcriptasa inversa (RT), PCR de ARN, LCR, PCR múltiple, PCR saliente (panhandle), PCR de captura, PCR de expresión, RACE 3’ y 5’, PCR in situ, PCR mediada por ligamiento y otros protocolos de amplificación.

25 Tal como se usa en el presente documento, “par de cebadores” se refiere a un conjunto de cebadores que incluye un cebador 5’ (cadena arriba) que hibrida con el extremo 5’ de una secuencia para amplificar (por ejemplo por PCR) y un cebador 3’ (cadena abajo) que hibrida con el complemento del extremo 3’ de la secuencia a amplificar.

Tal como se usa en el presente documento, “hibrida específicamente” se refiere a la hibridación, por formación de pares de bases complementarias, de una molécula de ácido nucleico (un oligonucleótido) con una molécula de ácido nucleico diana. Los expertos en la materia están familiarizados con parámetros in vitro e in vivo que afectan a la hibridación específica, tal como longitud y composición de la molécula particular. Los parámetros particularmente relevantes para hibridación in vitro incluyen además temperatura de hibridación y lavado, composición del tampón y concentración salina. Son condiciones de lavado ejemplares para retirar moléculas de ácido nucleico unidas de

35 forma no específica a alta rigurosidad SSPE 0,1 x, SDS 0,1 %, 65 ºC y a rigurosidad media son SSPE 0,2 x, SDS 0,1 %, 50 ºC. Se conocen en la técnica condiciones de rigurosidad equivalentes. El experto en la materia puede ajustar fácilmente estos parámetros para conseguir hibridación específica de una molécula de ácido nucleico con una molécula de ácido nucleico diana apropiada para una aplicación particular. Complementario, cuando se refiere a dos secuencias de nucleótidos, significa que las dos secuencias de nucleótidos son capaces de hibridar, típicamente con menos del 25 %, 15 % o 5 % de emparejamientos erróneos entre nucleótidos opuestos. Si es necesario, se especificará el porcentaje de complementariedad. Típicamente las dos moléculas se seleccionan de modo que hibriden en condiciones de alta rigurosidad.

Tal como se usa en el presente documento, sustancialmente idéntico para un producto significa suficientemente

45 similar a la propiedad de interés si está suficientemente poco cambiada de modo que pueda usarse el producto sustancialmente idéntico en lugar del producto.

Tal como se usa en el presente documento, también se entiende que las expresiones “sustancialmente idéntico” o “similar” varían con el contexto como se entiende por los expertos en la materia relevante.

Tal como se usa en el presente documento, una variante alélica o variación alélica se refiere a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural mediante mutación, y puede dar como resultado polimorfismos fenotípicos dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos 55 que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. La expresión “variante alélica” también se usa en el presente documento para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Típicamente la forma de referencia del gen codifica una forma de tipo silvestre y/o forma predominante de un polipéptido de una población o un único miembro de referencia de una especie. Típicamente, las variantes alélicas, que incluyen variantes entre y dentro de las especies típicamente tienen al menos un 80 %, 90 % o más de identidad de aminoácidos con una forma de tipo silvestre y/o predominante de la misma especie; el grado de identidad depende del gen y si la comparación es entre especies o dentro de las especies. En general, las variantes alélicas intraespecie tienen al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad o más con una forma de tipo silvestre y/o predominante, incluyendo una identidad del 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor con una forma de tipo silvestre y/o predominante de un polipéptido. La referencia a una variante alélica en el presente documento se refiere en general

65 a variaciones en proteínas entre miembros de la misma especie.

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Tal como se usa en el presente documento, “alelo”, que se usa de forma intercambiable en el presente documento con “variante alélica” se refiere a las formas alternativas de un gen o partes del mismo. Los alelos ocupan el mismo locus o posición en cromosomas homólogos. Cuando un sujeto tiene dos alelos idénticos de un gen, se dice que el sujeto es homocigoto para ese gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos alelos diferentes de un gen, se dice que el

5 sujeto es heterocigoto para el gen. Los alelos de un gen específico pueden diferir entre sí en un único nucleótido o varios nucleótidos, y pueden incluir modificaciones tales como sustituciones, deleciones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen también puede ser una forma de un gen que contiene una mutación.

Tal como se usa en el presente documento, las variantes de especies se refieren a variantes en polipéptidos entre diferentes especies, incluyendo diferentes especies de mamífero, tales como ratón y ser humano.

Tal como se usa en el presente documento, una variante de corte y empalme se refiere a una variante producida mediante el procesamiento diferencial de un transcrito primario de ADN genómico que da como resultado más de un tipo de ARNm.

15 Tal como se usa en el presente documento, la modificación es en referencia a la modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o de una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico e incluye deleciones, inserciones y reemplazos de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente. Los métodos para modificar un polipéptido son rutinarios para los expertos en la materia, tales como el uso de metodologías de ADN recombinante.

Tal como se usa en el presente documento, el término promotor significa una parte de un gen que contiene secuencias de ADN que posibilitan la unión de ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Se encuentran habitualmente, pero no siempre, secuencias promotoras en las regiones 5’ no codificantes de genes.

25 Tal como se usa en el presente documento, un polipéptido o una proteína aislada o purificada o parte biológicamente activa de la misma está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o tejido del que se deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Puede determinarse que las preparaciones están sustancialmente libres si aparecen libres de impurezas fácilmente detectables como se determina por métodos convencionales de análisis, tales como cromatografía en capa fina (TLC), electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), usados por los expertos en la materia para evaluar dicha pureza, o suficientemente puras de modo que la purificación adicional no altere de forma detectable las propiedades físicas y químicas, tales como actividades enzimáticas y biológicas de la sustancia. Se conocen métodos para purificar los compuestos para

35 producir compuestos sustancialmente químicamente puros por los expertos en la materia. Un compuesto sustancialmente químicamente puro, sin embargo, puede ser una mezcla de estereoisómeros. En dichos casos, la purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.

La expresión sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas en las que la proteína está separada de componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de forma recombinante. En una realización, la expresión sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente un 30 % (en peso seco) de proteínas no enzimáticas (también denominadas en el presente documento proteína contaminante), en general menos de aproximadamente el 20 % de proteínas no enzimáticas o el 10 % de proteínas no enzimáticas o menos de aproximadamente el 5 % de proteínas no

45 enzimáticas. Cuando la proteína enzimática se produce de forma recombinante, también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente o el 20 %, 10 % o 5 % del volumen de la preparación de proteína enzimática.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye preparaciones de proteínas enzimáticas en las que la proteína está separada de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. La expresión incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente el 30 % (en peso seco) 20 %, 10 %, 5 % o menos de precursores químicos o productos químicos o componentes no enzimáticos.

55 Tal como se usa en el presente documento, sintético, con referencia a, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico sintética o un gen sintético o un péptido sintético se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula polipeptídica que se produce por métodos recombinantes y/o por métodos de síntesis química.

Tal como se usa en el presente documento, la producción por medios recombinantes usando métodos de ADN recombinante significa el uso de los métodos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por ADN clonado.

Tal como se usa en el presente documento, el vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se usan para introducir un ácido nucleico heterólogo en células para la expresión o replicación del mismo. Los vectores

65 típicamente siguen siendo episómicos, pero pueden diseñarse para efectuar la integración de un gen o parte del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, tales

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TABLA 2: Tipos de Insulinas

Tipo: Nombre de la marca Inicio Máximo Duración Aplicación

Acción Rápida: Análogos deinsulina: Lispro (por ejemplo Humalog®); Aspart (por ejemplo, NovoLog®); Glulisina 5-15 minutos 45-90 minutos 3-4 horas Control de glucosa postprandial

Acción Rápida: Insulina regular: Regular Insulin (por ejemplo, Humulin® R; Novolin® R; Velosulin® Human) 30 minutos -1 hora 2-5 horas 5-8 horas Control de glucosa postprandial

Acción Intermedia: Lente® (por ejemplo, Humulin® L, Novolin® L); NPH (por ejemplo, Humulin® N, Novolin® N); 1-3 horas 6-12 horas 20-24 horas Complementación de insulina basal

Larga Duración: Ultralente (por ejemplo Humulin® U); glargina; detemir (un análogo) 4-6 horas 18-28 horas 28 horas Complementación de insulina basal

Mezclas: Humulin® 50/50; Humulin® 70/30; Novolin® 70/30; Humalog® Mix 75/25 Varía Varía Varía

Las insulinas más habitualmente usadas son insulinas de acción rápida, que incluyen insulina regular (es decir insulina nativa o de tipo silvestre, incluyendo variantes alélicas y de especie de la misma) y análogos de insulina de 5 acción rápida. Para los fines del presente documento, la referencia a insulina es una insulina de acción rápida, a no ser que se indique específicamente de otro modo.

Insulina de acción rápida

10 Se proporcionan en el presente documento composiciones de insulina de acción súper rápida que contienen una insulina de acción rápida y una enzima degradante de hialuronano soluble. En general, estas composiciones de insulina de acción súper rápida se absorben después de la administración subcutánea y son detectables y tienen un inicio de la acción en la sangre en el periodo de 30 minutos o menos. Las insulinas de acción rápida que pueden usarse para obtener una composición de insulina de acción súper rápida como se describe en el presente

15 documento incluyen insulina regular, que es la insulina de tipo silvestre o nativa. Las insulinas de acción rápida también incluyen análogos de insulina. En virtud de su velocidad de absorción rápida en comparación con insulinas de acción basal, las insulinas de acción rápida se usan predominantemente para fines de control postprandial. Se exponen insulinas de acción rápida ejemplares en la Tabla 3 posterior. Las insulinas de acción rápida también incluyen cualquiera conocida en la técnica, tal como, pero sin limitación, cualquier preparación de insulina y

20 dispositivos desvelados en la Patente de Estados Unidos 7279457 y Publicaciones de Patente de Estados Unidos 20070235365, 20080039368, 20080039365, 20070086952, 20070244467 y 20070191757. Cualquier insulina de acción rápida puede hacerse de acción súper rápida por co-formulación y/o co-administración con una enzima degradante de hialuronano. Una formulación de composición de insulina de acción súper rápida también puede incluir además una mezcla de una insulina de acción rápida con una insulina intermedia o de acción larga, además

25 de una enzima degradante de hialuronano.

TABLA: 3 – INSULINAS DE ACCIÓN RÁPIDA

Nombre: Especie Cadena A (SEC ID Nº) Cadena B (SEC ID Nº) Nombre Comercial

Insulina Regular: Humana SEC ID Nº:103 SEC ID Nº:104 por ejemplo Humulin®; Novolin® R; Velosulin®

Insulina Regular: Porcina 88-108 de SEC ID Nº:123 25-54 de SEC ID Nº:123 Iletin II®;

Insulina Aspart: Análogo Humano SEC ID Nº:103 SEC ID Nº:147 Novolog®

Insulina Lispro: Análogo Humano SEC ID Nº:103 SEC ID Nº:148 Humalog®

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terminal. En la Tabla 4 a continuación, se proporcionan la longitud (en aminoácidos) de los polipéptidos precursores y maduros, y el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen las secuencias de aminoácidos ejemplares de los polipéptidos precursores y maduros de las proteínas PH20 truncadas en el extremo C terminal. El polipéptido de PH20 de tipo silvestre también se incluye en la Tabla 4 para comparación.

Tabla 4. Polipéptidos de PH20 truncada en el extremo C terminal ejemplares

Polipéptido: Precursor (aminoácidos) Precursor SEC ID Nº Maduro (aminoácidos) Maduro SEC ID Nº

tipo silvestre: 509 1 474 2

SPAM1-FIVS: 497 191 462 235

SPAM1-MFIV: 496 225 461 269

SPAM1-TMFI: 495 192 460 236

SPAM1-ATMF: 494 226 459 270

SPAM1-SATM: 493 193 458 237

SPAM1-LSAT: 492 227 457 271

SPAM1-TLSA: 491 194 456 238

SPAM1-PSTL: 489 195 454 239

SPAM1-SPST: 488 228 453 272

SPAM1-STLS: 490 196 455 240

SPAM1-ASPS: 487 197 452 241

SPAM1-NASP: 486 229 451 273

SPAM1-YNAS: 485 198 450 242

SPAM1-FYNA: 484 199 449 243

SPAM1-IFYN: 483 46 448 48

SPAM1-QIFY: 482 3 447 4

SPAM1-PQIF: 481 45 446 5

SPAM1-EPQI: 480 44 445 6

SPAM1-EEPQ: 479 43 444 7

SPAM1-TEEP: 478 42 443 8

SPAM1-ETEE: 477 41 442 9

SPAM1-METE: 476 200 441 244

SPAM1-PMET: 475 201 440 245

SPAM1-PPME: 474 202 439 246

SPAM1-KPPM: 473 203 438 247

SPAM1-LKPP: 472 204 437 248

SPAM1-FLKP: 471 205 436 249

SPAM1-AFLK: 470 206 435 250

SPAM1-DAFL: 469 207 434 251

SPAM1-IDAF: 468 208 433 252

SPAM1-CIDA: 467 40 432 47

SPAM1-VCID: 466 209 431 253

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insulina (es decir, insulina lispro Humalog o insulina Humulin R) y los niveles de glucosa. Se usó un procedimiento de Pinza Hiperinsulinémica-Euglucémica para mantener los niveles de glucosa en plasma entre 90-110 mg/dl de modo que pudieran administrarse preparaciones de insulina sin provocar hipoglucemia.

5 El procedimiento consistía en obtener inicialmente el peso y la altura del sujeto y medir los signos vitales después de reposar en una posición sentado durante 5 minutos. Se colocaron ambos brazos en almohadillas calientes para dilatar las venas y se insertaron después catéteres IV. Se colocó un catéter en la vena antecúbica de un brazo para infusión de Dextrosa 20 % mediante dos llaves de interrupción separadas. El otro catéter intra-arterial se colocó en el otro brazo para tomar muestras de sangre arterializada para mediciones de glucosa. Puede retirarse la

10 almohadilla caliente del sitio de infusión de glucosa, pero el sitio de catéter retrógrado se mantuvo a 65 ºC. Se obtuvo una muestra de sangre inicial para medir la glucosa de línea basal 30 minutos antes de la inyección de las preparaciones de insulina. Se tomaron muestras de sangre 10 minutos y 1 minuto antes de la inyección de insulina lispro Humalog, insulina lispro Humalog/rHuPH20, insulina Humulin R o insulina Humulin R/rHuPH20, después cada 3 minutos durante los primeros 60 minutos, cada 15 minutos desde 60 minutos a 3 horas, después cada hora

15 en lo sucesivo hasta 6 horas. Se analizaron los niveles de glucosa de cada sujeto en todo el procedimiento usando un Analizador de Glucosa YSI 2300 (YSI Inc.) y se ajustó la velocidad de infusión de glucosa (GIR) según sea necesario para mantener la glucosa en plasma entre 90-110 mg/dl. Se analizaron los niveles en circulación de insulina usando un ensayo radioinmunoabsorbente (RIA) que cuantifica los niveles de insulina lispro Humalog e insulina Humulin R (Millipore BioPharma Services Division, St. Charles MO).

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C. Efecto de la co-administración de rHuPH20 en la farmacocinética de la insulina de acción rápida

Se midieron varios parámetros para determinar el efecto de la co-administración de rHuPH20 en la farmacocinética de la composición de insulina de acción rápida insulina lispro Humalog e insulina Humulin R. Estos incluyeron la

25 concentración de insulina medida máxima durante el intervalo de dosificación seleccionado (Cmáx); tiempo hasta Cmáx (tmáx); y área bajo las curvas de concentración frente a tiempo (ABC), que se evaluaron para diversos intervalos temporales.

1. Efecto de la co-administración de rHuPH20 e insulina Humalog en la farmacocinética de insulina

30 Se evaluó la concentración de insulina para cada intervalo temporal después de la administración de insulina lispro Humalog o insulina lispro Humalog /rHuPH20 por RIA, y se expone en las Tablas 5 y 6, respectivamente. También se proporciona la ABC para los diferentes intervalos temporales (de 0 minutos a x minutos; por ejemplo, ABC0-3 minutos, ABC0-6 minutos, ABC0-9 minutos, etc.), así como la biodisponibilidad relativa (Frel), que se calcula como la [ABC0-x

35 (insulina Humulin R +rHuPH20)] / [ABC0-x (insulina Humulin R sola)]*100. También se presenta la pendiente creciente, que se determina calculando el cambio en la media geométrica de los niveles de insulina sobre un intervalo temporal, así como el cambio de pendiente medio que es un promedio suavizado de tres valores de la pendiente creciente.

40 Tabla 5. Concentración de insulina en la sangre después de administración de insulina lispro Humalog

Insulina inmunorreactiva (pmol/l)

Tiempo (min): Media Mediana DT ET Media Geo. Pendiente Creciente ABC(0-x) Cambio de pendiente(promedio)

(min): (pmol/l) (pmol/l.min) (pmol/l.min) (pmol/l.min)

0: 72,4 64,8 35,2 10,2 65,2

3: 78,7 67,8 31,8 9,6 73,2 2,67 208

6: 82,3 84,8 24,9 7,5 79,0 1,93 436 2,85

9: 96,9 86,3 36 10,8 90,8 3,94 691 2,72

12: 108,0 102,0 54,2 16,4 97,7 2,28 973 3,63

15: 126,3 110,6 75,5 21,8 111,7 4,67 1287 5,16

18: 160,9 146,1 116 33,5 137,2 8,52 1661 6,71

21: 194,0 143,6 175,8 50,7 158,1 6,95 2104 8,21

24: 233,9 172,0 228,5 66,0 185,6 9,17 2619 7,25

27: 273,4 198,7 296,5 85,6 202,5 5,63 3201 10,1

30: 324,9 242,3 332,9 96,1 249,0 15,51 3879 13,47

33: 388,1 302,3 359,2 108,3 306,8 19,26 4712 15,43

36: 417,0 325,4 343,8 103,6 341,3 11,51 5685 16,68

39: 485,4 355,2 419,7 121,2 399,1 19,26 6795 12,2

42: 495,2 354,7 381,9 110,3 416,6 5,83 8019 13,93

45: 552,6 430,4 408,6 118,0 466,7 16,71 9344 9,11

48: 553,6 451,4 387,3 111,8 481,1 4,78 10766 9,9

51: 576,7 483,9 384,9 111,1 505,7 8,2 12246 9,83

68

Insulina inmunorreactiva (pmol/l)

(min): (pmol/l) (pmol/l.min) (pmol/l.min) (pmol/l.min)

54: 612,8 504,7 306,3 88,4 555,2 16,5 13837 3,27

57: 594,1 476,6 400,1 115,5 510,5 -14,9 15436 -0,47

60: 551,3 460,1 258,5 74,6 501,4 -3,03 16954

75: 596,4 595,1 214,5 64,7 561,1 3,98 24923

90: 573,6 556,5 193,1 55,8 541,6 -1,3 33193

105: 584,8 575,7 131,4 37,9 571,8 2,01 41543

120: 566,4 558,9 92,2 26,6 559,3 -0,83 50026

135: 530,3 536,4 76,1 22,0 525,4 -2,26 58162

150: 533,6 515,7 92,3 26,6 526,6 0,08 66052

165: 491,6 486,8 96,9 28,0 482,8 -2,92 73623

180: 463,1 467,1 93,3 26,9 454,2 -1,9 80650

240: 348,6 332,3 97,8 28,2 335,7 -1,98 104350

300: 261,1 255,5 81,6 23,6 248,7 -1,45 121882

360: 190,4 181,9 49,5 14,3 184,2 -1,08 134867

Tabla 6. Concentración de insulina en la sangre después de la co-administración de insulina lispro Humalog y rHuPH20

Insulina inmunorreactiva (pmol/l)

Tiempo (min): Media Mediana DT ET Media Geo. Pendiente Creciente ABC(0-x) Cambio de pendiente(promedio) Frel

(min): (pmol/l) (pmol/l.min) (pmol/l.min) (pmol/l.min) (%)

0: 70,5 66,3 32,8 9,5 64,3

3: 97,0 80,7 36,6 11,0 91,5 9,09 234 113

6: 144,7 112,2 92,4 27,8 126,7 11,73 561 9,68 129

9: 183,9 117,3 156,9 45,3 151,4 8,22 978 11,91 142

12: 254,4 161,1 252,9 73,0 198,7 15,78 1503 15,21 154

15: 354,6 216,8 391,1 112,9 263,6 21,63 2197 20,13 171

18: 442,8 293,2 475,4 137,2 332,5 22,97 3091 28,43 186

21: 539,4 387,6 400,5 115,6 454,6 40,7 4271 33,51 203

24: 651,7 489,4 426,4 123,1 565,2 36,86 5801 40,17 221

27: 759,8 621,2 390,2 112,6 694,0 42,94 7690 35,71 240

30: 839,7 705,4 414,5 119,7 775,9 27,31 9895 37,81 255

33: 958,2 791,4 360,4 104,0 905,4 43,17 12417 33,44 263

36: 1040,5 890,4 352,4 101,7 994,9 29,83 15267 30,15 269

39: 1118,0 940,3 445,8 128,7 1047,3 17,47 18331 18,89 270

42: 1138,7 991,1 431,6 124,6 1075,5 9,38 21515 20,93 268

45: 1239,1 1181,6 408,6 118 1183,3 35,93 24903 12,26 267

48: 1234,0 1128,7 497,1 143,5 1157,6 -8,53 28414 6,46 264

51: 1173,8 1124,0 326,9 94,4 1133,6 -8,01 31851 -12,3 260

54: 1095,6 1070,5 236,6 68,3 1072,6 -20,34 35160 -57,21 254

57: 924,7 961,4 433,0 125,0 642,7 -143,29 37733 -16,71 244

60: 1055,0 1006,7 363,8 105,0 983,2 113,48 40172 237

75: 926,2 890,4 218,2 63,0 905,2 -5,2 54335 218

90: 818,2 788,9 212,1 61,2 793,7 -7,43 67077 202

105: 689,7 667,7 175,3 50,6 666,6 -8,47 78029 188

120: 586,5 571,2 145,3 41,9 569,5 -6,48 87300 175

135: 492,5 482,9 124,2 35,8 478,0 -6,1 95157 164

150: 423,0 432,4 127,4 36,8 405,3 -4,85 101781 154

165: 371,6 363,2 114,8 33,1 354,7 -3,37 107481 146

180: 342,0 339,6 95,4 27,5 329,3 -1,69 112610 140

240: 232,4 248,8 83,0 24,0 218,1 -1,85 129033 124

300: 178,3 146,6 75,0 21,7 164,1 -0,9 140501 115

360: 148,7 135,1 62,6 18,1 136,6 -0,46 149523 111

La Cmáx (pmol/l), tmáx (minutos) y ABC0-360 (min*pmol/l) para insulina lispro Humalog e insulina lispro Humalog coadministrada con rHuPH20 se proporciona en la Tabla 7. La ABC para los diferentes intervalos temporales se proporciona en la Tabla 8. Los resultados indican que los sujetos recibieron la dosis de insulina lispro

69

Humalog/rHuPH20 tuvieron mayor exposición a insulina lispro Humalog en intervalos temporales tempranos que los que se dosificaron con insulina lispro Humalog solamente. La Tabla 9 proporciona un sumario de los parámetros PK específicos para cada secuencia de dosificación (por ejemplo, PK para insulina lispro Humalog/rHuPH20 administrada 1ª (1) o 2ª (2) y ambas (todas)), y un sumario estadístico que demuestra que la secuencia de 5 dosificación no tuvo ningún efecto en la farmacocinética observada. El análisis estadístico determinó el p-valor de la diferencia en la PK observada usando los diferentes grupos de tratamiento (es decir, insulina lispro Humalog frente a insulina lispro Humalog/rHuPH20), y la diferencia en la PK observada usando las diferentes secuencias de dosificación (es decir insulina lispro Humalog sola primero y después la insulina lispro Humalog/rHuPH20, frente a insulina lispro Humalog/rHuPH20 primero y después insulina lispro Humalog sola). También se proporciona en la

10 tabla la biodisponibilidad relativa (Frel) que se calcula como la [ABC0-360 (insulina lispro Humalog/rHuPH20)] / [ABC0360 (insulina lispro Humalog sola)]*100.

Para la PK de insulina, se redujo la mediana de tmáx en 54 % con la co-administración de rHuPH20, de 105 a 48 min (p=0,0006), un efecto visto en los 12 sujetos. La Cmáx media aumentó 87 % de 697 pmol/l cuando se administró a los 15 sujetos solamente insulina lispro Humalog hasta 1.300 pmol/l (p=0,0003) con co-administración de rHuPH20. La ABC0-360 min aumentó 11 % de 134.867 a 149.523 min*pmol/l, mientras que en intervalos temporales más tempranos las diferencias fueron más pronunciadas (es decir ABC0-30 min y ABC0-60 min aumentaron 155 % y 140 %, respectivamente). La variabilidad entre sujetos (DT/Media) en tmáx mejoró del 34 % cuando los sujetos recibieron insulina lispro Humalog sola al 17 % cuando los sujetos recibieron insulina lispro Humalog en combinación con

20 rHuPH20. Este ejemplo demuestra que la insulina lispro Humalog por co-administración con una enzima degradante de hialuronano (rHuPH20) se convirtió en una insulina de acción súper rápida como se describe en el presente documento.

Tabla 7. Farmacocinética de la insulina después de inyección subcutánea de insulina lispro Humalog con y 25 sin co-administración de rHuPH20

Tratamiento: Sujeto ID Cmáx (pmol/l) tmáx (pmol/l) ABC0-360 (min*pmol/l) Frel

Humalog solamente: 1 590 105 136000

2: 496 57 126000

3: 562 105 106000

4: 721 90 150000

5: 972 54 154000

6: 449 150 105000

7: 1770 39 174000

8: 795 75 156000

9: 672 120 138000

10: 502 120 113000

11: 851 105 183000

12: 631 150 160000

N: 12 12 12

Media: 751 98 142000

DT: 357 36 25600

Mediana: 652 105 144000

Media Geométrica: 697 91 139000

Media Geométrica de % CV: 38,8 44 18,8

Humalog con rHuPH20: 1 1090 54 192000 141

2: 1310 57 161000 128

3: 1640 48 172000 162

4: 853 48 146000 97

5: 1140 45 130000 84

6: 971 57 139000 132

7: 2000 30 152000 87

8: 2420 48 186000 119

9: 1320 45 135000 98

10: 930 57 123000 109

11: 1590 39 189000 103

12: 1080 48 179000 112

N: 12 12 12 12

Media: 1360 48 159000 114

DT: 473 8 24500 23

Mediana: 1230 48 157000 110

Media Geométrica: 1300 47 157000 112

70

Media Geométrica de % CV: 32,8 19 15,7

Tabla 8. ABC de intervalo temporal en la media geométrica de las concentraciones de insulina para insulina lispro Humalog sola o co-administrada con rHuPH20

Intervalo temporal: ABC (min*pmol/l)

Humalog solamente: Humalog con rHuPH20 Porcentaje de diferenciaa

0-15: 1287 2197 70,7

0-21: 2104 4271 103,0

0-30: 3879 9895 155,1

0-45: 9344 24903 166,5

0-60: 16954 40172 136,9

0-75: 24923 54335 118,0

0-90: 33193 67077 102,1

0-120: 50026 87300 74,5

0-150: 66052 101781 54,1

0-180: 80650 112610 39,6

0-360: 134867 149523 10,8

aPorcentaje de diferencia: (ABC0-x [rHuPH20] – ABC0-x [sin rHuPH20] / (ABC0-x [sin rHuPH20])

Tabla 9. Efecto de la secuencia de dosificación de insulina lispro Humalog en la farmacocinética observada.

Tratamiento: Secuencia de dosificación Cmáx tmáx ABCtodas

Humalog: 1 media 688 94 140000

DT: 172 38 21000

ET: 70 16 8600

2: media 814 102 143500

DT: 491 37 31600

ET: 200 15 12900

Todas: media 751 98 141800

DT: 357 36 25700

ET: 103 10 7400

Humalog con rHuPH20: 1 media 1239 48 156800

DT: 456 11 27800

ET: 186 4 11400

2: media 1485 49 160500

DT: 498 4 23300

ET: 203 2 9500

Todas: media 1362 48 158700

DT: 473 8 24500

ET: 137 2 7100

p-valor de la diferencia de tratamiento: 0,0003 0,0006 0,0760

p-valor del efecto del grupo de secuencias: 0,7889 0,7783 0,9948

2. Efecto de la co-administración de rHuPH20 e insulina Humulin R en la farmacocinética de la insulina

En el estadio 2, los pacientes recibieron primero la dosis de insulina Humulin R/rHuPH20 y segundo la dosis de

10 insulina Humulin R sola, o bien primero la dosis de insulina Humulin R sola y después la dosis de insulina Humulin R/rHuPH20 habitualmente 7 días después. La concentración de la insulina en cada punto temporal después de la administración de insulina Humulin R o insulina Humulin R co-administrada con rHuPH20 se proporciona en las Tablas 10 y 11, respectivamente. La ABC para los diferentes intervalos temporales (es decir ABC para de 0 a x minutos (ABC(0-x)); por ejemplo ABC0-3 minutos, ABC0-6 minutos, ABC0-9 minutos, etc.), (Tablas 10, 11 y 12), así

15 como la biodisponibilidad relativa (Frel) que se calcula como la [ABC0-x (insulina Humulin R/rHuPH20)] / [ABC0-x (insulina Humulin R sola)]*100. También se presenta la pendiente creciente, que se determina calculando el cambio en la media geométrica de los niveles de insulina durante un intervalo temporal, así como el cambio de pendiente medio, que es un promedio suavizado de cinco valores de la pendiente creciente.

71

Tabla 10. Concentración de insulina en sangre después de la administración de insulina Humulin R

Insulina inmunorreactiva (pmol/l)

Tiempo (min): Media Mediana DT ET Media Geo. Pendiente creciente ABC (0x) Cambio de pendiente (promedio)

0: 67,4 59,2 29,8 8,3 62,4

3: 62,3 59,5 26,9 7,5 58,3 -1,38 181

6: 70,3 62,8 29,7 8,2 65,4 2,37 366

9: 70,1 64,9 26,1 7,2 66,0 0,22 564 0,75

12: 71,1 66,3 28,8 8,0 66,5 0,15 762 1,72

15: 79,2 74,8 32,3 9,0 73,6 2,38 973 2,18

18: 89,8 86,8 34,2 9,5 84,1 3,47 1209 3,29

21: 104,2 103,4 36,5 10,1 98,1 4,68 1482 4,92

24: 123,3 130,5 46,1 13,9 115,3 5,75 1802 6,39

27: 149,8 143,2 57,6 16,0 140,2 8,3 2186 7,59

30: 179,4 171,3 59,6 16,5 169,5 9,75 2650 7,45

33: 208,9 202,8 69,9 19,4 198,0 9,5 3202 8,02

36: 223,9 238,6 79,6 22,1 209,9 3,97 3813 7,30

39: 248,3 231,6 78,7 21,8 235,6 8,57 4482 6,12

42: 261,4 265,9 79,7 22,1 249,8 4,74 5210 4,57

45: 272,3 274,1 78,1 21,7 261,2 3,81 5976 3,90

48: 279,8 280,0 87,6 24,3 266,6 1,78 6768 3,00

51: 278,6 262,5 77,2 21,4 268,4 0,59 7570 3,04

54: 292,2 255,0 84,3 23,4 280,5 4,06 8394 2,49

57: 313,7 278,3 110,6 30,7 295,4 4,95 9258

60: 316,2 280,3 111,2 30,8 298,6 1,05 10149

75: 349,0 320,4 132,7 36,8 325,5 1,79 14829

90: 358,0 298,9 152,1 42,2 329,5 0,27 19741

105: 364,8 363,6 128,5 35,6 344,9 1,03 24798

120: 372,9 339,6 111,2 30,8 358,8 0,92 30076

135: 400,8 402,8 123,6 34,3 382,6 1,59 35636

150: 423,1 490,9 165,2 45,8 391,9 0,62 41445

165: 423,9 424,9 164,1 45,5 392,6 0,04 47329

180: 412,6 447,9 148,0 41,1 386,2 -0,43 53169

240: 336,0 309,9 90,4 26,1 325,8 -1,01 74528

300: 308,6 292,8 77,0 21,4 299,7 -0,43 93292

360: 242,9 238,7 64,5 17,9 234,5 -1,09 109319

Tabla 11. Concentración de insulina en sangre después de co-administración de insulina Humulin R y rHuPH20

Insulina inmunorreactiva (pmol/l)

Tiempo (min): Media Mediana DT ET Media Geo. Pendiente creciente ABC (0x) Cambio de pendiente(promedio) Frel

0: 55,0 56,9 14,6 4,1 53,2

3: 94,7 95,6 20,3 5,6 92,5 13,08 219 121

6: 148,3 142,9 40,6 11,3 141,7 16,42 570 156

9: 194,2 174,7 43,7 12,1 189,9 16,07 1067 13,2 189

12: 223,1 227,3 66,1 18,3 213,2 7,76 1672 16,3 219

15: 262,2 250,1 75,6 21,0 251,3 12,69 2369 16,67 244

18: 352,8 331,6 108,1 30,0 336,9 28,54 3251 17,25 269

21: 402,0 381,5 96,6 26,8 391,7 18,27 4344 18,16 293

24: 463,7 437,6 126,5 38,1 448,6 18,97 5605 10,86 311

27: 504,5 506,6 135,6 37,6 485,6 12,33 7006 17,39 321

30: 492,0 477,1 210,5 58,4 414,3 -23,79 8356 17,64 315

33: 614,5 620,5 146,8 40,7 597,8 61,16 9874 14,5 308

36: 675,7 676,6 167,1 46,3 656,3 19,51 11755 19,13 308

39: 690,4 649,8 194,2 53,9 666,1 3,28 13739 21,57 307

42: 805,2 786,4 244,9 67,9 772,6 35,49 15897 12,53 305

45: 772,3 741,5 235,2 65,2 737,9 -11,57 18162 11,13 304

48: 809,8 811,3 204,4 56,7 785,7 15,95 20448 10,65 302

51: 847,7 822,0 209,2 58,0 823,2 12,5 22861 6,13 302

54: 854,1 800,2 222,3 61,6 825,9 0,88 25335 5,77 302

57: 894,5 840,2 242,6 67,3 864,5 12,87 27870 301

72

imagen58

imagen59

Tabla 13. Velocidades de infusión de glucosa después de administración de insulina lispro Humalog

GIR (Velocidad de infusión IV, ml/h)

Tiempo: Media Mediana DT ET Pendiente creciente ABC(0-x)

(min): (ml/h) (ml/h*min) (min*ml/h)

0: 3,1 0 7,4 2,1

3: 8,4 0 13,6 3,9 1,78 17

6: 9,8 0 16,3 4,7 0,44 45

9: 10,8 0 16,0 4,6 0,36 75

12: 10,8 0 16,0 4,6 0 108

15: 11,0 0 16,4 4,7 0,06 141

18: 11,3 0 17,1 4,9 0,08 174

21: 14,1 9,0 16,3 4,7 0,94 212

24: 15,9 13,0 15,9 4,6 0,61 257

27: 20,9 20,5 19,7 5,7 1,67 312

30: 24,3 22,0 20,4 5,9 1,11 380

33: 29,7 29,5 16,2 4,7 1,81 461

36: 35,8 37,5 18,0 5,2 2,03 559

39: 42,0 39,5 20,3 5,9 2,08 676

42: 50,1 46,0 27,3 7,9 2,69 814

45: 55,7 48,0 32,9 9,5 1,86 972

48: 63,0 55,5 37,2 10,7 2,44 1150

51: 68,3 57,5 42,0 12,1 1,75 1347

54: 76,6 69,0 53,2 15,4 2,78 1565

57: 85,7 75,5 69,4 20,0 3,03 1808

60: 97,7 82,5 90,0 26,0 4 2083

75: 112,3 80,0 77,2 22,3 0,97 3657

90: 130,7 93,0 77,3 22,3 1,23 5479

105: 142,3 114,0 73,0 21,1 0,78 7527

120: 155,3 122,0 79,7 23,0 0,86 9759

135: 166,4 143,5 76,1 22,0 0,74 12171

150: 170,7 148,0 75,4 21,8 0,28 14699

165: 175,8 151,5 74,6 21,5 0,34 17297

180: 178,4 162,5 73,8 21,3 0,18 19954

240: 184,9 167,0 88,3 25,5 0,11 30854

300: 141,3 130,0 67,4 19,4 -0,73 40641

360: 110,3 105,0 50,8 14,7 -0,52 48191

Tabla 14. Velocidades de infusión de glucosa después de co-administración de insulina lispro Humalog y rHuPH20

GIR (Velocidad de infusión IV)

Tiempo: Media Mediana DT ET Pendiente creciente ABC(0-x) Frel

(min): (ml/h) (ml/h*min) (min*ml/h) (%)

0: 5,4 0 9 2,6

3: 8,8 0 13,5 3,9 1,15 21 124

6: 15,8 10 18,1 5,2 2,31 58 131

9: 11,8 0 14,8 4,3 -1,31 100 132

12: 13,6 0 17,2 5,0 0,58 138 128

15: 17,0 10 18,6 5,6 1,14 184 131

18: 20,9 25 19,1 5,8 1,3 240 138

21: 26,3 27 23,6 7,1 1,79 311 147

24: 33,8 29,5 27,1 7,8 2,52 401 156

27: 43,9 40 32,7 9,4 3,36 518 166

30: 53,8 49,5 36,2 10,5 3,31 665 175

33: 68,1 59 43,5 12,6 4,75 847 184

36: 82,1 68,5 49,4 14,3 4,67 1073 192

39: 104,0 80 64,5 18,6 7,31 1352 200

42: 115,5 89 64,7 18,7 3,83 1681 207

45: 127,9 96,5 64,1 18,5 4,14 2046 210

48: 134,8 104 66,8 19,3 2,31 2440 212

51: 142,6 107,5 72,1 20,8 2,58 2856 212

54: 145,8 112 70,6 20,4 1,08 3289 210

75

GIR (Velocidad de infusión IV)

Tiempo: Media Mediana DT ET Pendiente creciente ABC(0-x) Frel

(min): (ml/h) (ml/h*min) (min*ml/h) (%)

57: 146,8 121 60,7 17,5 0,31 3728 206

60: 159,2 124,5 71,1 20,5 4,14 4187 201

75: 174,6 138,5 84,8 24,5 1,03 6690 183

90: 186,3 176 77,0 22,2 0,78 9397 172

105: 182,3 147 78,9 22,8 -0,27 12162 162

120: 180,2 131,5 83,5 24,1 -0,14 14881 152

135: 183,8 132 88,8 25,6 0,24 17611 145

150: 184,8 139 87,1 25,2 0,06 20375 139

165: 185,0 143,5 88,8 25,6 0,02 23148 134

180: 181,8 139,5 85,1 24,6 -0,22 25899 130

240: 139,7 129,5 75,1 21,7 -0,7 35541 115

300: 98,6 85 61,2 17,7 -0,68 42689 105

360: 87,7 65 62,6 18,1 -0,18 48276 100

La GIRmáx, tmáx y AUG-GIR para diversos intervalos temporales también se determinaron para estos sujetos y se presentan en las Tablas 15 y 16. La Tabla 17 proporciona un sumario de los parámetros PD para cada secuencia de dosificación (por ejemplo GIR PD para insulina lispro Humalog/rHuPH20 administrada 1ª (1) o 2ª (2) y ambas 5 (todas), y un análisis estadístico para determinar si la secuencia de dosificación afectaba a la farmacodinámica observada. El análisis estadístico determinó el p-valor de la diferencia en la PD observada usando los grupos de tratamiento diferentes (es decir, insulina lispro Humalog sola frente a insulina lispro Humalog/rHuPH20) y la diferencia en la PK usando las diferentes secuencias de dosificación (es decir insulina lispro Humalog sola primera y después la insulina lispro Humalog/rHuPH20, frente a insulina lispro Humalog/rHuPH20 primero y después

10 insulina lispro Humalog sola).

Tabla 15. Farmacodinámica de la insulina después de la inyección de insulina lispro Humalog subcutánea con y sin co-administración de rHuPH20

Tratamiento: Sujeto ID GIRmáx 50 % de GIRmáx tGIR50 % temprano (min) tGIR50 % tardío (min)

Humalog solamente: 1 137 68,5 83 NC

2: 326 163 98 NC

3: 247 124 68 NC

4: 178 89,0 83 NC

5: 119 59,5 68 330

6: 158 79,0 98 NC

7: 350 175 53 270

8: 90,0 45,0 47 NC

9: 115 57,5 83 330

10: 180 90,0 68 330

11: 132 66,0 56 NC

12: 382 191 68 330

N: 12 12 12 5

Media: 201 101 72 318

DT: 100 50,2 17 27

ET: 29,0 14,5 5 12

Mediana: 168 84,0 68 330

Media Geométrica: 181 90,4 70 317

Media Geométrica del % CV: 50,5 50,5 24 9

76 77

Humalog con rHuPH20: 1 126 63,0 44 270

2: 320 160 32 270

3: 385 193 44 270

4: 200 100 83 360

5: 149 74,5 50 270

6: 260 130 NC NC

7: 223 112 26 330

8: 109 54,5 29 210

9: 154 77,0 42 210

10: 257 129 38 270

11: 138 69,0 38 NC

12: 336 168 47 330

N: 12 12 11 10

Media: 221 111 43 279

DT: 91,1 45,6 15 49

ET: 26,3 13,2 5 16

Mediana: 212 106 42 270

Media Geométrica: 205 102 41 275

Media Geométrica del % CV: 43,8 43,8 32 18

NC = No calculado

Tabla 16. Farmacodinámica de la insulina después de inyección de insulina lispro Humalog subcutánea con y sin co-administración de rHuPH20-intervalo de GIR-ABC

Tratamiento: Sujeto ID GIRmáx tmáx GIR ABC (min*ml/h)

0-60 min: 0-120 min 0-180 min 0-240 min 0-360 min

Humalog: 1 137 240 1040 5400 13200 21400 33800

2: 326 150 3300 14000 33100 52200 82800

3: 247 240 1770 13500 27100 41400 66500

4: 178 240 1940 8570 18600 29200 46500

5: 119 180 1050 5340 11400 18500 28700

6: 158 240 752 4780 12600 21800 39200

7: 350 60 4920 22100 37600 50900 68900

8: 90,0 135 1490 5390 10500 15500 23100

9: 115 165 590 4200 10500 17100 25800

10: 180 180 2030 9090 18700 29400 44400

11: 132 240 2880 8070 14600 22000 35600

12: 382 240 3240 16700 31600 50800 83000

N: 12 12 12 12 12 12 12

Media: 201 193 2080 9760 20000 30900 48200

DT: 100 58 1280 5640 9800 14200 21600

ET: 29,0 17 371 1630 2830 4090 6250

Mediana: 168 210 1850 8320 16600 25600 41800

Intervalo: 292 180 4330 17900 27100 36800 59900

Media Geométrica: 181 181 1740 8470 18000 28100 44000

Media Geométrica del % CV: 50,5 42,5 71,9 59,1 50,1 47,3 46,9

Tratamiento: Sujeto ID GIRmáx tmáx GIR ABC (min*ml/h)

0-60 min: 0-120 min 0-180 min 0-240 min 0-360 min

Humalog con rHuPH20: 1 126 60 2180 8600 15400 21200 28500

2: 320 135 7800 24500 43400 58800 72300

3: 385 75 5330 25800 43500 58100 77000

4: 200 90 3020 11400 19300 28100 43200

5: 149 165 1990 9250 17600 24100 31400

6: 260 360 2100 9780 16300 22200 36400

7: 223 135 6590 19300 32200 42400 55500

8: 109 57 3670 10200 15900 19900 24200

9: 154 75 2250 10300 16500 21300 27300

10: 257 150 6070 18800 34000 48100 62600

11: 138 165 3640 10600 18700 26000 36800

12: 336 165 5610 19900 38200 56300 84100

N: 12 12 12 12 12 12 12

Media: 221 136 4190 14900 25900 35500 48300

DT: 91,1 82 2010 6350 11400 15900 21200

ET: 26,3 24 582 1830 3290 4600 6120

Mediana: 212 135 3650 11000 19000 27000 40000

Intervalo: 276 303 5810 17200 28100 38900 59800

Media Geométrica: 205 118 3750 13700 23800 32500 44200

Media Geométrica del % CV: 43,8 57,5 52,9 42,8 44,6 46,1 46,0

NC = no calculado

Tabla 17. Efecto de la secuencia de dosificación de insulina lispro Humalog en la farmacodinámica observada

Tratamiento: Secuencia de dosificación Cmáx tmáx GIR ABC (min*ml/h)

0-60 min: 0-120 min 0-180 min 0-240 min 0-360 min

Humalog sola: 1 Media 213 185 1910 9860 20700 32580 51650

DT: 123 45 1130 5470 11030 17460 28930

ET: 50 18 460 2230 4500 7130 11810

2: Media 189 200 2260 9670 19220 29120 44730

DT: 81 73 1510 6340 9380 11300 12810

ET: 33 30 620 2590 3830 4610 5230

todas: Media 201 193 2080 9760 19960 30850 48190

DT: 100 58 1280 5640 9790 14140 21630

ET: 29 17 370 1630 2830 4080 6250

Humalog y rHuPH20: 1 Media 201 160 3930 13080 22650 31330 43830

DT: 58 105 1950 4720 8240 11210 12870

ET: 24 43 800 1930 3370 4580 5260

2: Media 242 112 4440 16660 29180 39750 52720

DT: 118 49 2230 7650 13860 19760 27830

ET: 48 20 910 3120 5660 8070 11360

todas: Media 221 136 4190 14870 25920 35540 48280

DT: 91 82 2010 6340 11390 15940 21190

ET: 26 24 580 1830 3290 4600 6120

p-valor de la diferencia del tratamiento: 0,3502 0,0627 0,0002 0,0011 0,0044 0,0484 0,9746

p-valor del efecto del grupo de secuencia: 0,5517 0,3445 0,9365 0,5879 0,5219 0,5075 0,5403

78

Los datos PD de la velocidad de infusión de glucosa apoyaron los hallazgos de PK, que mostraban un tiempo hasta efecto máximo (tGIRmáx) reducido en 36 % cuando se administró a los pacientes insulina lispro Humalog en combinación con rHuPH20 (mediana 135 minutos) en comparación con la insulina lispro Humalog sola (mediana 210 minutos) y el efecto metabólico máximo (GIRmáx) aumentó en 13 % de una media de 181 ml/h cuando los 5 sujetos recibieron insulina lispro Humalog sola hasta 205 ml/h cuando los sujetos recibieron insulina lispro Humalog y rHuPH20 (p=0,35). El tiempo hasta el efecto semi-máximo temprano (tGIR50 % temprano) se redujo en 38 % de una mediana de 68 cuando se administró a los pacientes insulina lispro Humalog sola hasta 42 min cuando se administró a los pacientes insulina lispro Humalog en combinación con rHuPH20 (p=0,0006)

10 2. Efecto de la co-administración de rHuPH20 e insulina Humulin R en la farmacodinámica de GIR

En el estadio 2, los pacientes recibieron bien primero la dosis de insulina Humulin R/rHuPH20 y segundo la dosis de insulina Humulin R sola o bien primero la dosis de insulina Humulin R sola y después la dosis de insulina Humulin R/rHuPH20 habitualmente 7 días después. Se calculó la velocidad de infusión de glucosa para cada

15 intervalo temporal después de la administración de insulina Humulin R sola o insulina Humulin R/rHuPH20 y se presenta en las Tablas 18 y 19, respectivamente. También se calcularon la ABC y la cantidad relativa de glucosa infundida sobre diversos tiempos (Grel). También se presenta la pendiente creciente, que se determina calculando el cambio de GIR sobre un intervalo temporal.

20 Tabla 18. Velocidades de infusión de glucosa después de administración de insulina Humulin R

GIR

Tiempo (min): Media Mediana DT ET Pendiente creciente ABC(0-x)

(min): (ml/h) (ml/h*min) (min*ml/h)

0: 8,5 0 11 3,1

3: 15,0 7 17 4,7 2,17 35

6: 15,7 12 17,4 4,8 0,23 81

9: 18,0 21 17,8 4,9 0,77 132

12: 18,8 21 17,8 4,9 0,28 187

15: 20,4 21 18,9 5,3 0,51 246

18: 20,5 21 19 5,3 0,05 307

21: 22,2 21 18,5 5,1 0,56 371

24: 22,9 27 18,2 5 0,23 439

27: 24,1 30 18,5 5,1 0,38 510

30: 28,4 30 21 5,8 1,44 588

33: 29,3 32 20 5,5 0,31 675

36: 30,9 32 19,6 5,4 0,54 765

39: 32,7 32 19,8 5,5 0,59 861

42: 34,8 34 20,4 5,7 0,72 962

45: 40,2 37 21,6 6 1,77 1075

48: 42,2 40 19,4 5,4 0,67 1198

51: 44,3 39 19,3 5,4 0,72 1328

54: 47,8 47 17,5 4,8 1,18 1466

57: 51,5 49 17,6 4,9 1,23 1615

60: 56,9 63 19,3 5,3 1,79 1778

75: 72,5 77 27,4 7,6 1,04 2749

90: 83,6 85 41,7 11,6 0,74 3920

105: 92,8 97 47,3 13,1 0,62 5243

120: 102,6 99 50,1 13,9 0,65 6709

135: 119,4 105 55,1 15,3 1,12 8374

150: 127,5 109 57,2 15,9 0,54 10226

165: 138,9 136 55,8 15,5 0,76 12223

180: 146,2 147 61,5 17,1 0,48 14362

240: 178,9 193 61,2 17 0,55 24114

300: 172,0 176 59,1 16,4 -0,12 34642

360: 150,3 164 45,4 12,6 -0,36 44311

79

Tabla 19. Velocidades de infusión de glucosa después de la administración de insulina Humulin R y rHuPH20

GIR

Tiempo (min): Media Mediana DT ET Pendiente creciente ABC(0-x) Grel

(min): (ml/h) (ml/h*min) (min*ml/h) (%)

0: 7,4 0 12,5 3,5

3: 16,0 12 15 4,2 2,86 35 100

6: 17,5 19 15,2 4,2 0,51 85 105

9: 20,1 24 15,3 4,3 0,85 142 108

12: 21,8 24 14,7 4,1 0,59 205 109

15: 24,8 26 14,4 4 1 275 112

18: 30,6 32 13,2 3,7 1,92 358 116

21: 36,4 35 15,7 4,4 1,92 458 123

24: 48,2 45 13,4 3,7 3,95 585 133

27: 54,8 47 16,2 4,5 2,21 740 145

30: 65,9 66 21,6 6 3,69 921 157

33: 74,3 74 25,8 7,2 2,79 1132 168

36: 82,1 78 28,4 7,9 2,59 1366 179

39: 91,8 87 28,2 7,8 3,26 1627 189

42: 99,8 91 33,1 9,2 2,67 1915 199

45: 110,5 109 36,8 10,2 3,56 2230 208

48: 121,5 124 42,4 11,8 3,67 2578 215

51: 133,7 134 49,7 13,8 4,05 2961 223

54: 143,4 145 54,4 15,1 3,23 3377 230

57: 153,5 162 62,8 17,4 3,38 3822 237

60: 164,6 172 73,8 20,5 3,69 4299 242

75: 184,8 178 99 27,5 1,34 6920 252

90: 179,7 194 62,1 17,2 -0,34 9653 246

105: 183,9 211 60,5 16,8 0,28 12380 236

120: 191,1 220 64,1 17,8 0,48 15193 226

135: 206,5 216 66 18,3 1,03 18174 217

150: 215,5 206 64 17,8 0,6 21339 209

165: 202,9 214 62,4 17,3 -0,84 24477 200

180: 197,4 214 57,1 15,8 -0,37 27479 191

240: 181,5 183 64,2 17,8 -0,26 38847 161

300: 117,5 116 44,6 12,4 -1,07 47819 138

360: 86,5 80 28,7 8 -0,52 53939 122

3. Comparación de la farmacodinámica de la insulina lispro Humalog e insulina Humulin R con y sin co5 administración de rHuPH20

Se comparó la farmacodinámica de insulina lispro Humalog e insulina Humulin R con y sin co-administración de rHuPH20. Se evaluó el efecto relativo de la co-administración de rHuPH20 en la farmacodinámica de cada tipo de insulina. La Figura 2 presenta una representación de las velocidades de infusión de glucosa en cada intervalo

10 temporal. Se observó que la co-administración de rHuPH20 y Humalog o Humulin desplazó notablemente las velocidades de infusión de glucosa en función del tiempo hacia arriba y a la izquierda en comparación con cuando las insulinas se administraron sin rHuPH20, de forma similar al desplazamiento en las representaciones de la concentración de insulina en función del tiempo. La velocidad de infusión máxima aumentó ligeramente de una medida de 201 a 221 ml/h para Humalog y de 187 a 203 ml/h para Humulin R co-administrada con rHuPH20 en

15 relación con el control. De forma similar, el tiempo de GIR máxima se redujo de 193 a 136 minutos para Humalog y de 253 a 206 minutos para Humulin R co-administrada con rHuPH20 en relación con el control. El inicio de la acción, como se midió por el tiempo hasta la GIR semi-máxima temprana (tGIR50 % temprana) se redujo de 72 a 43 minutos para Humalog y de 113 a 83 minutos para Humulin R co-administrada con rHuPH20 en relación con el control.

20 Los carbohidratos del momento de la comida se digieren en gran medida y se introducen en la circulación sistémica durante las primeras pocas horas (por ejemplo, de dos a cuatro) después de una comida dependiendo del tipo de carbohidrato, y por lo tanto, la GIR acumulativa durante las primeras 2 o 3 horas (por ejemplo, de 0 a 120 minutos) es particularmente relevante. El volumen acumulativo de una solución de glucosa 190,6 mg/ml suministrada durante

25 las primeras 2 horas aumentó de 163 a 248 ml para Humalog y de 112 a 226 ml para Humulin R co-administrada con rHuPH20 en relación con el control. El metabolismo de glucosa en exceso después de completarse la digestión de carbohidratos en el momento de la comida puede conducir a incidentes hipoglucémicos. El volumen acumulativo

80

imagen60

imagen61

imagen62

Se administró una dosis media de 5,7 (±3,0) de insulina lispro Humalog®, con o sin rHuPH20 (0,2 g/U de insulina). Se administró una dosis media de 6,2 (±3,5) de insulina Humulin®, con o sin rHuPH20 (0,2 g/U de insulina). Los sitios de inyección para insulinas co-administradas con rHuPH20 fueron los siguientes: la inyección para la Visita 2A fue en la región abdominal media izquierda, para la siguiente visita (Visita 2B o Visita 3 si la Visita 2B no fue

5 necesaria) se usó la región abdominal media derecha y para la siguiente visita se usó la región abdominal media izquierda, alternando los sitios de inyección posteriores en consecuencia. La aguja de inyección se colocó a un ángulo de 45 grados y se mantuvo en el pliegue cutáneo durante 10 segundos.

En un periodo de 10 minutos después de la dosificación del fármaco del estudio, los pacientes consumieron un

10 alimento líquido (Ensure) que proporcionaba 60 g de carbohidratos. La comida líquida se ingirió completamente en un periodo de 10 minutos. Se midió la glucosa en sangre durante las siguientes 8 horas en puntos temporales específicos. Se realizaron mediciones de glucosa en sangre adicionales para fines de seguridad según fue necesario.

15 5. Toma de muestras y evaluación

Durante el periodo de pre-dosificación y después de la dosificación, se controló la concentración de glucosa en sangre por mediciones de glucosa en sangre frecuentes usando el analizador de glucosa YSI STAT2300 en los puntos temporales específicos de -60, -30, -20, -10, 0, 3, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110,

20 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 255, 270, 285, 300, 315, 330, 345, 360, 375, 390, 415, 420, 430, 445, 460, 475 y 480 minutos. Se extrajeron muestras de sangre en serie para la determinación de insulina en suero a -30, -30, -10, 0, 3, 6, 9, 12, 15, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300, 360, 420 y 480 minutos.

25 B. Farmacocinética de insulina Humulin® R e insulina lispro Humalog ® con y sin rHuPH20

La farmacocinética para tanto la insulina lispro Humalog®/rHuPH20 como la insulina Humulin® R/rHuPH20 mostró exposición acelerada pero en general comparable comparadas entre sí sin rHuPH20. La Tabla 19a expone un sumario de diversos parámetros PK para 12 pacientes. Este fue un análisis provisional que se realizó antes de 30 recogerse los datos de todos los pacientes. Por lo tanto, solamente los datos de 12 de los 21 pacientes contribuyeron a este análisis. También se incluye el efecto de la co-administración con rHuPH20 que se muestra por % de control, calculado por [media (geométrica o aritmética) del valor PK para insulina con rHuPH20] / [media (geométrica o aritmética) del valor PK para insulina sola] x 100). La Media Geométrica y el p-valor para datos transformados logarítmicamente para los parámetros Cmáx y ABC, aunque están basados en la media aritmética y 35 valores no transformados para tmáx y t50% temprana y tardía. El criterio de valoración primario, la exposición de insulina total durante la primera hora (ABC0-60), aumentó 135 % para insulina lispro Humalog®/rHuPH20 en comparación con insulina lispro Humalog® sola (p=0,0197) y 304 % para insulina Humulin® R/rHuPH20 sobre insulina Humulin® R sola (p=0,0005). La T50 temprana se redujo de 19,9 a 12,6 min (p=0,0002) para insulina lispro Humalog® y de 40,1 a 14,8 (p=0,033) para insulina Humulin® R. tmáx se redujo de 43,8 a 27,9 min (p=0,002) para

40 insulina lispro Humalog® y 96,7 a 52,1 (p=0,086) para regular; T50% tardía se redujo de 98,6 a 68,6 min (p=0,0001) para insulina lispro Humalog® y 219,2 a 111,2 (p=0,008), insulina Humulin® R.

Tabla 19a. Farmacocinética de la insulina administrada con o sin rHuPH20 en un estudio de comida líquida

Insulina lispro Humalog® (N= 12): Insulina Humulin® R (N= 12)

-rHuPH20: + rHuPH20 Efecto de rHuPH20 -rHuPH20 + rHuPH20 Efecto de rHuPH20

Mediana (Intervalo)
Mediana (Intervalo): % de control (pvalor)a Mediana (Intervalo) Mediana (Intervalo) % de control (pvalor)a

Dosis de Insulina (U): 6 (3, 16) 6 (3, 16) 6 (2,18) 6 (2,18)

t50% temprano(min): 20,2 (13,3, 25,6) 13,6 (6,3, 18,2) 63 % (p= 0,0002) 27,3 (14,6, 146,0) 16,2 (3,9, 22,9) 60 % (p= 0,0329)

tmáx (min): 45 (30, 60) 30 (15, 45) 67 % (p= 0,0015) 60 (20, 240) 45 (20, 150) 75 % (p= 0,0856)

t50% tardío (min): 86,6 (69,2, 135,0) 71,0 (42,5, 93,9) 82 % (p= 0,0001) 172,0 (91,8, 370,0) 104,5 (67,2, 173,0) 61 % (p= 0,0066)

Cmáx (pmol/ L*U): 40,7 (25,5, 76,2) 53,2 (31,2, 101,5) 126 % (p=0,0394) 21,1 (6,0, 52,3) 38,5 (21,7, 76,8) 186 % (p= 0,0047)

84

Intervalo de ABC (min*pmol/l*U)

0-60: 1373 (947, 3113) 2310 (1238, 3683) 135 % (p = 0,0197) 583 (150, 1860) 1495 (856, 3600) 304 % (p = 0,0005)

0-último: 3840 (1673, 5133) 3452 (2133, 6375) 105 % (p= 0,7332) 3633 (745, 6500) 4021 (2417, 5656) 133 % (p= 0,1679)

0-inf: 4016 (1783, 5667) 3491 (2167, 6650) 102 % (p= 0,9004) 3867 (990, 11467) 4143 (2433, 5700) 105 % (p= 0,8366)

a Análisis de la varianza usando un modelo mixto con efecto fijo para el tratamiento. Una matriz de covarianza no estructurada entre mediciones repetidas, realizada en valores transformados logarítmicamente para los parámetros ABC y Cmáx, y datos no transformados para parámetros tmáx y t50%. Los valores de 0 se establecieron en 1 antes de la transformación logarítmica.

La Tabla 19b expone un sumario de diversos parámetros PK para todos los 21 pacientes que completaron el estudio, mostrando la media y la desviación típica. Los análisis PK en la Tabla 19b se realizaron en datos de concentración insulina lispro Humalog® o insulina Humulin® R individual con la línea basal restada (donde la línea

5 basal fue la medición en el tiempo 0) frente al tiempo usando el enfoque no compartimental (regla trapezoidal lineal para cálculo de ABC). Se usaron criterios de selección de usuario WinNonlin en la determinación de Lambda z, la constante de velocidad de eliminación, en la que se basó la semivida, ABC INFobs, MRT, CL y Vz. Todas las mediciones menores de 20,0 pM se establecieron en cero para fines de cálculo de PK.

10 La adición de rHuPH20 a inyección de insulina lispro Humalog® o insulina Humulin® R aumentó la exposición de insulina temprana. La media de Cmáx con línea basal normalizada para la dosis restada aumentó 74 % de 46,6 a 81,2 pmol/l con adición de rHuPH20 a una insulina lispro Humalog®, y 122 % de 25,4 a 56,5 pmol/l para insulina Humulin® R. Para el criterio de valoración PK primario, ABC0-60min, la co-administración con rHuPH20 aumentó la exposición de insulina lispro Humalog® temprana en 75 % de 1.690 a 2.950 min*pmol/l/UI y aumentó la exposición

15 de insulina Humulin® R temprana en 210 % de 649 a 2.010 min*pmol/l/UI en relación con la administración de control sin enzima. La biodisponibilidad tras la co-administración con rHuPH20 no se vio alterada significativamente en relación con la inyección de control de insulina lispro Humalog® sola: 98 % para ABC0-inf y 116 % para ABC0-último. La biodisponibilidad relativa fue de 120 % para ABC0-inf y 174 % para ABC0-último con co-administración de insulina Humulin® R con rHuPH20 en relación con la administración de control sin enzima (media geométrica de datos con

20 línea basal normalizada para la dosis restada usados para estos cálculos; datos no mostrados). La co-administración tanto de insulina como de lispro con rHuPH20 aceleró Tmáx y T50% temprano y tardío en comparación con la inyección de control sin rHuPH20.

El tiempo hasta la concentración de insulina máxima fue más rápido para la inyección de insulina lispro Humalog®

25 con rHuPH20, con una media aritmética tmáx a 38,8 minutos, frente a 47,1 minutos con inyección de insulina lispro Humalog® sin rHuPH20. La inyección subcutánea de insulina Humulin® R con rHuPH20 dio como resultado un tmáx de 58,3 minutos, en comparación con 104 minutos sin rHuPH20.

Tabla 19b. Farmacocinética de insulina administrada con o sin rHuPH20 en un estudio de comida líquida

Insulina lispro Humalog® (N= 21): Insulina Humulin® R (N= 21)

-rHuPH20: + rHuPH20 -rHuPH20 + rHuPH20

Media: DT Media DT Media DT Media DT

Cmáx (pmol/l *U): 46,6 23,3 81,2 92,9 25,4 13,1 56,5 52,1

ABC última (min*pmol/l *U): 4440 2360 8470 19400 3850 1840 6570 8690

ABC0-inf (min*pmol/l *U): 4680 2580 4410 1700 4200 1620 4810 1580

ABC0_15 (min*pmol/l *U): 82,1 105 262 183 36 43,6 188 172

ABC0_30 (min*pmol/l *U): 485 394 1190 1080 171 125 698 461

ABC0_45 (min*pmol/l *U): 1080 681 2190 1980 395 269 1340 763

ABC0_60 (min*pmol/l *U): 1690 926 2950 2530 649 422 2010 1070

ABC0_90 (min*pmol/l *U): 2680 1320 4050 3800 1210 693 3140 1520

ABC0_120 (min*pmol/l *U): 3370 1620 4980 6080 1770 934 4050 2320

ABC0_180 (min*pmol/l *U): 4070 1900 5980 9120 2810 1170 4900 3040

85

Insulina lispro Humalog® (N= 21): Insulina Humulin® R (N= 21)

-rHuPH20: + rHuPH20 -rHuPH20 + rHuPH20

Media: DT Media DT Media DT Media DT

ABC0_240 (min*pmol/l *U): 4310 2060 7230 14200 3560 1280 5230 3450

ABC0_36 (min*pmol/l *U): 4500 2440 7950 16900 4190 1540 5950 6040

ABC0_480 (min*pmol/l *U): 4540 2450 8520 19300 4280 1630 6910 9950

ABC15_480 (min*pmol/l *U): 4460 2360 8270 19200 4250 1620 6720 9870

ABC30_480 (min*pmol/l *U): 4050 2140 7330 18300 4110 1610 6210 9690

ABC45_480 (min*pmol/l *U): 3460 1960 6340 17500 3890 1600 5560 9480

ABC60_480 (min*pmol/l *U): 2850 1810 5570 16900 3630 1620 4890 9220

ABC90_480 (min*pmol/l *U): 1860 1490 4470 15600 3080 1600 3770 8820

ABC120_480 (min*pmol/l *U): 1160 1190 3540 13300 2520 1550 2850 7910

ABC180_480 (min*pmol/l *U): 473 782 2540 10300 1480 1350 2000 7090

ABC240_480 (min*pmol/l *U): 223 525 1300 5130 726 903 1680 6620

Lambda_z (1/min): 0,0214 0,0094 0,0253 0,00905 0,0224 0,0118 0,0249 0,0118

HL_Lambda_z (min): 38,7 16,3 31,8 14,1 40,8 21,4 36,2 24,8

tmáx (min): 47,1 15,2 38,8 40,2 104 65 58,3 32,5

t50% temprano (min): 21,1 5,83 13,9 3,34 38,7 31,6 18,5 10,8

t50% tardío (min): 112 30,5 81,9 45,2 214 70,7 118 30,8

Vz F obs (l): 87,4 52,2 67,1 30,2 117 141 70,5 50,5

Cl F obs (l/min): 1,56 0,668 1,56 0,582 1,81 1,27 1,37 0,435

MRT última (min): 86,1 23,3 72,4 34,3 131 50,5 93,6 43,7

MRTINF_obs (min): 97,6 31,6 73,6 27 144 38,2 90,7 33,5

C. Comparación de la Respuesta Glucémica a Exposición a Comida después de Insulina Humana Regular e Insulina Lispro con y sin rHuPH20

5 La respuesta glucémica a una exposición a comida se mejoró cuando se administró insulina lispro Humalog® o insulina Humulin® R con rHuPH20 en comparación con cuando las insulinas se administraron solas. La Tabla 19c expone los parámetros farmacodinámicos como se miden de 12 pacientes. La co-administración de insulina lispro Humalog® o insulina Humulin® R con rHuPH20 dio como resultado niveles de glucosa en sangre postprandiales reducidos en relación con la inyección de control sin rHuPH20. La glucosa en sangre máxima observada en el

10 periodo postprandial de 4 horas se redujo desde 186 hasta 154 mg/dl cuando se administró insulina dispro Humalog® con rHuPH20 en comparación con insulina lispro Humalog® sola (p=0,0213) y de 212 a 166 mg/dl cuando se administró insulina Humulin® R con rHuPH20 en comparación con insulina Humulin® R sola (p=0,0406). La glucosa postprandial de 2 horas (PPG) y el área de excursión total mayor de 140 mg/dl se redujeron de forma similar. El área de excursión total menor de 70 mg/dl fue mínimo y similar para todos los artículos de ensayo, con

15 una tendencia menor hacia área aumentada para insulina lispro Humalog® y área reducida para insulina Humulin® R con co-administración de rHuPH20.

86

Tabla 19c. Farmacodinámica de la insulina administrada con o sin rHuPH20 en un estudio de comida líquida

Insulina lispro Humalog® (N= 12): Insulina Humulin® R (N= 12)

-rHuPH20 Mediana (Intervalo): + rHuPH20 Mediana (Intervalo) % Control (p valor)a -rHuPH20 Mediana (Intervalo) + rHuPH20 Mediana (Intervalo) % Control (p valor)a

BGmáx (mg/dl): 186 (127, 270) 154 (98, 196) 83 % (p= 0.0213) 212 (128, 343) 166 (137,274) 79 % (p= 0.0406)

tBGmáx (min): 70 (30, 120) 95 (20, 240) 136 % (p= 0.1854) 90 (45, 120) 70 (45, 140) 78 % (p= 0.5744)

PPG de 2 horas (mg/dl): 156 (70, 239) 124 (74, 194) 80 % (p= 0.0862) 192 (101,329) 132 (79,207) 69 % (p= 0.0084)

ABC > 140 (mg*min/dl): 3573 (0, 15758) 400 (0, 6864) 11 % (p= 0.0693) 5254 (0, 35013) 847 (2, 14513) 16 % (p= 0.2105)

ABC < 70 (mg*min/dl): 0 (0,0) 0 (0, 642) 0 % (p= 0.0958) 347 (0, 1148) 0 (0, 939) 0 % (p= 0.2803)

a ensayo de t, par de muestras relacionadas, de 2 colas

D. Seguridad

5 No se han presentado acontecimientos adversos graves (AE). El AE más habitualmente indicado fue glucosa en sangre reducida/hipoglucemia (147 acontecimientos). De los 147 acontecimientos de glucosa en sangre reducida/hipoglucemia, 21 se consideraron posiblemente o probablemente relacionados con rHuPH20. 17 acontecimientos se clasificaron como de intensidad moderada, 4 de los cuales se consideraron posiblemente relacionados con rHuPH20. Los 126 acontecimientos restantes se clasificaron como de intensidad leve. Todos los

10 otros AE se produjeron con menos del 5 % de frecuencia en este estudio.

Todos los episodios de hipoglucemia (definidos como tener un valor de glucosa en sangre de > 70 mg/dl), independientemente de los síntomas se capturaron como AE en este estudio.

15 E. Sumario

La co-administración de insulina lispro Humalog® o insulina Humulin® R con rHuPH20 dio como resultado exposición a insulina más temprana con parámetros de tmáx más temprano, t50% temprano y t50% tardío, así como mayor concentración de insulina máxima en relación con inyecciones de control sin rHuPH20, sin un cambio 20 significativo en la biodisponibilidad. Esta exposición a insulina más temprana condujo a menor hiperglucemia postprandial, con niveles de glucosa a las 0-4 horas máximos reducidos, niveles de glucosa postprandial de 2 horas reducidos y menos excursiones hiperglucémicas como se mide por ABC > 140 mg/dl. Las excursiones hipoglucémicas, como se midió por ABC < 70 mg/dl, fueron mínimas y similares para todos los artículos de ensayo, con una tendencia menor hacia área aumentada para insulina lispro Humalog® y área reducida para insulina

25 humana regular (insulina Humulin® R) tras co-administración con rHuPH20.

Ejemplo 1c.

Farmacocinética y farmacodinamia de insulina Humulin® R o insulina lispro Humalog® administrada por vía 30 subcutánea con o sin dosis diversas dosis de rHuPH20 recombinante en sujetos humanos sanos

Como parte de un estudio de un único centro, de fase I, abierto, ciego sencillo (sujetos ciegos a los contenidos de cada inyección), de 4 estadios para determinar la farmacocinética, farmacodinamia (o glucodinámica; GD), seguridad, tolerabilidad, y relación óptima de rHuPH20: insulina, se administró una serie de relaciones de dosis de

35 rHuPH20 por vía subcutánea (SC) con dosis de insulina regular (insulina Humulin® R) o insulina lispro Humalog®, y se evaluó la farmacocinética (PK) y relación óptima de rHuPH20: insulina determinando tmáx, Cmáx, ABC0t, y biodisponibilidad relativa basándose en las concentraciones de insulina en suero recogidas en puntos temporales específicos.

40 Se evaluó el efecto de la co-administración de diversas dosis de rHuPH20 en la farmacocinética y la farmacodinámica (o glucodinámica (GD)) de insulina Humulin® R administrada por vía subcutánea o insulina lispro

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Humalog® tomando muestras sanguíneas para medir los niveles de insulina y glucosa. Se usó un procedimiento de Pinza Hiperinsulinémica-Euglucémica (como se ha descrito en el Ejemplo 1) para mantener los niveles de glucosa en plasma entre 90 y 110 mg/dl. Se evaluaron las concentraciones de insulina para determinar los parámetros PK de insulina: tmáx, t50% temprano, t50% tardío, ABC0t y ABCtfinal (donde t = 30, 60, 90, 120, 180, 240, 360 y 480 minutos 5 después de inyección), ABC0todas, ABC0inf, Cmáx, biodisponibilidad relativa (en comparación con sin rHuPH20) y variabilidad entre y dentro de sujetos basándose en el coeficiente de variación para todos los parámetros PK. Se midió la velocidad de infusión de glucosa (GIR) para mantener la euglucemia durante la pinza y se usó para determinar los siguientes parámetros GD: tGIRmáx, tGIR50% temprano, tGIR50% tardío, GIR ABC0t, y GIR ABCtfinal (donde t = 30, 60, 90, 120, 180, 240, 360 y 480 minutos después de la inyección), GIR ABCttodas, y cGIRmáx, y la

10 variabilidad entre y dentro de sujetos basándose en el coeficiente de variación para todos los parámetros GD. También se evaluó la seguridad y tolerabilidad local de cada una de las inyecciones SC.

A. Administración de insulina Humulin® R con o sin diversas dosis de rHuPH20

15 Se administró a voluntarios sanos 30 l o 120 l de insulina Humulin® R (diluida a 100 U/ml) con una concentración final de rHuPH20 de 0 g/ml, 1,25 g/ml, 5 g/ml, 10 g/ml, 20 g/ml u 80 g/ml (aproximadamente 0 U/ml, 150 U/ml, 600 U/ml, 1.200 U/ml, 2.400 U/ml o 9.600 U/ml, respectivamente). Por lo tanto, se administró a los voluntarios 30 l que contenían 3 U de insulina Humulin® R con aproximadamente 0, 4,5, 18, 36, 72 o 288 Unidades de rHuPH20, o 120 l que contenían 12 U de insulina Humulin® R con aproximadamente 0, 18, 72, 144, 288 o 1.152

20 Unidades de rHuPH20. La Tabla 19d expone los parámetros farmacocinéticos medidos para los sujetos que recibieron 12 U de insulina. Los parámetros PK característicos de la co-administración de hialuronidasa (tmáx temprano y t1/2máx, Cmáx mayor y exposición sistémica temprana por ejemplo ABC0-60min) aumentaron de forma comparable para todas las concentraciones de rHuPH20 ensayadas en comparación con cuando se administró insulina sola. Los perfiles de velocidad de infusión de glucosa (GIR) para todas las concentraciones de rHuPH20

25 fueron diferentes del placebo (es decir 0 g/ml) con un aumento característico de las velocidades tempranas y reducción de la infusión de glucosa tardía. Sobre las dosis ensayadas, todas las concentraciones de rHuPH20 fueron similarmente eficaces, y no se observó una dosis no eficaz.

Tabla 19d. Parámetros PK de insulina para 12 U de insulina Humulin® R con diversas dosis de rHuPH20

Variable (Unidades): Estadística Cantidad de rHuPH20

0 g/ml: 1,25 g/ml 5 g/ml 10 g/ml 20 g/ml 80 g/ml

Cmáx(pmol/l): N 4 4 4 4 4 4

Media Geométrica: 192,3 418,1 355,7 323,4 371,0 352,2

% de CV: 22,9 33,2 23,7 45,6 32,4 35,5

Mediana: 179,5 432,0 334,0 276,0 353,0 371,0

tmáx (minutos): N 4 4 4 4 4 4

Media Aritmética (DT): 121,5 (125,42) 108,8 (33,26) 71,3 (14,36) 93,8 (39,45) 75,0 (21,21) 101,3 (41,31)

% de CV: 103 30,6 20,2 42,1 28,3 40,8

Mediana: 90,0 105,0 67,5 82,5 82,5 97,5

t50%temprano (minutos): N 4 4 4 4 4 4

Media Aritmética (DT): 41,3 (25,67) 33,3 (9,14) 22,3 (6,97) 30,4 (9,58) 24,7 (3,99) 33,5 (15,10)

% de CV: 62,2 27,4 31,2 31,5 16,2 45,1

Mediana: 30,3 33,5 25,4 29,3 25,0 34,2

t50%tardío (minutos): N 4 4 4 4 4 4

Media Aritmética (DT): 359,0 (28,28) 196,3 (47,35) 209,8 (47,08) 194,5 (69,25) 210,8 (50,09) 193,8 (43,26)

% de CV: 7,9 24,1 22,4 35,6 23,8 22,3

Mediana: 359,0 201,0 204,0 174,5 231,0 187,0

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Variable (Unidades): Estadística Cantidad de rHuPH20

0 g/ml: 1,25 g/ml 5 g/ml 10 g/ml 20 g/ml 80 g/ml

ABC0-60 (min*pmol/l): N 4 4 4 4 4 4

Media Geométrica: 4606,8 11299,9 11679,1 9078,3 12193,6 9514,5

% de CV: 51,8 38,6 27,6 63,2 44,1 67,0

Mediana: 4635,0 10475,0 11865,0 7190,0 11425,0 9885,0

ABCúltimo (min*pmoI/): N 4 4 4 4 4 4

Media Geométrica: 59362,0 76639,9 75575,6 64666,6 70945,2 65635,2

% de CV: 20,0 11,2 10,6 18,3 24,5 22,1

Mediana: 57750,0 76550,0 76450,0 64100,0 68150,0 63100,0

B. Administración de insulina lispro Humalog® con o sin diversas dosis de rHuPH20

Se administró a voluntarios sanos 30 l o 120 l de insulina lispro Humalog® (diluida a 50 U/ml) con una

5 concentración final de 0 g/ml, 0,078 g/ml, 0,3 g/ml, 1,2 g/ml, 5 g/ml o 20 g/ml de rHuPH20 (aproximadamente 0 U/ml, 9,36 U/ml, 36 U/ml, 144 U/ml, 600 U/ml o 2.400 U/ml, respectivamente). Por lo tanto, se administró a los voluntarios 30 l que contenían 1,5 U de insulina lispro Humalog® con aproximadamente 0, 0,28, 1,08, 4,32, 18 o 72 Unidades de rHuPH20, o 120 l que contenían 6 U de insulina lispro Humalog® con aproximadamente 0, 1,12, 4,32, 17,28, 72 o 288 Unidades de rHuPH20. La Tabla 19e expone los parámetros farmacocinéticos medidos para los

10 sujetos que recibieron 6 U de insulina lispro Humalog®. Sobre las dosis ensayadas, todas las concentraciones de rHuPH20 mayores de 0,3 g/ml fueron eficaces de forma similar.

Tabla 19e. Parámetros PK de insulina para 6 U de insulina lispro Humalog® con diversas dosis de rHuPH20

Variable (unidades): Estadística Cantidad de rHuPH20

0 g/ml: 0,08 g/ml 0,31 g/ml 1,25 g/ml 5 g/ml 20 g/ml

Cmáx (pmol/l): N 4 4 4 4 4 4

Media Geométrica: 381,8 355,9 435,1 483,7 579,5 463,6

% de CV: 13 21 26 23 29 32

Mediana: 385 376 463 506 532 438,8

tmáx (minutos): N 4 4 4 4 4 4

Media Aritmética (DT): 67,5 (8,7) 36,3 (10,3) 33,8 (7,5) 41,3 (14,4) 33,8 (7,5) 40,0 (15,8)

% de CV: 13 28 22 35 22 40

Mediana: 67,5 37,5 30 37,5 30 37,5

t50% temprano (minutos): N 4 4 4 4 4 4

Media Aritmética (DT): 25,9 (2,8) 15,6 (2,6) 15,2 (3,2) 17,0 (1,0) 16,0 (4,5) 15,6 (0,8)

% de CV: 11 17 21 6 28 5

Mediana: 26,1 16,4 14,8 16,5 15,7 15,8

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Variable (unidades): Estadística Cantidad de rHuPH20

0 g/ml: 0,08 g/ml 0,31 g/ml 1,25 g/ml 5 g/ml 20 g/ml

t50%tardío (minutos): N 4 4 4 4 4 4

Media Aritmética (DT): 120,0 (10,5) 85,6 (17,4) 92,8 (23,5) 85,4 (20,9) 80,4 (11,6) 77,1 (21,8)

% de CV: 9 20 25 25 14 28

Mediana: 120 79,8 88,0 82,2 83,1 77,2

ABC0-60 (min*pmol/l): N 4 4 4 4 4 4

Media Geométrica: 11658 14886 18299 19494 23424 18523

% de CV: 18 20 22 17 27 25

Mediana: 11600 16150 19400 20050 22150 17650

ABCúltimo (min*pmoI/): N 4 4 4 4 4 4

Media Geométrica: 38590 30890 41165 39504 47405 36705

% de CV: 9 10 33 14 17 12

Mediana: 39200 30950 36350 38150 4610 35700

Ejemplo 2

5 Generación de una línea celular que expresa rHuPH20 soluble

Se usó el plásmido HZ24 (expuesto en SEC ID Nº: 52) para transfectar ovario de hámster chino (células CHO) (véase, por ejemplo Solicitudes de Patente de Estados Unidos Nº 10.795.095, 11/065.716 y 11/238.171). El vector plasmídico HZ24 para expresión de rHuPH20 soluble contiene una cadena principal de vector pCI (Promega), ADN 10 que codifica los aminoácidos 1482 de hialuronidasa PH20 humana (SEC ID Nº: 49), un sitio de entrada ribosómica interno (IRES) del virus ECMV (Clontech) y el gen de la dihidrofolato reductasa de ratón (DHFR). La cadena principal del vector pCI también incluye ADN que codifica el gen de resistencia a Beta-lactamasa (AmpR), un origen fl de replicación, una región promotora/potenciadora temprana inmediata de citomegalovirus (CMV), un intrón quimérico y una señal de poliadenilación tardía de SV40 (SV40). El ADN que codifica la construcción de rHuPH20 soluble 15 contiene un sitio NheI y una secuencia consenso de Kozak antes del ADN que codifica la metionina en la posición del aminoácido 1 de la secuencia señal de 35 aminoácidos nativa de PH20 humana, y un codón de parada después del ADN que codifica la tirosina correspondiente a la posición de aminoácido 482 de la hialuronidasa PH20 humana (expuesta en SEC ID Nº: 1), seguido de un sitio de restricción BamHI. La construcción pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24), por lo tanto, da como resultado una única especie de ARNm conducida por el promotor de CMV

20 que codifica los aminoácidos 1-482 de PH20 humana (expuesta en SEC ID Nº: 3) y los aminoácidos 1-186 de dihidrofolato reductasa de ratón (expuesta en SEC ID Nº: 53), separada por el sitio de entrada ribosómica interno (IRES).

Se sembraron células CHO DG44 no transfectadas que crecían en medio CD-CHO modificado por GIBCO para

25 células DHFR(-), complementado con glutamina 4 mM y Pluronic F68/L 18 ml/l (Gibco) a 0,5 x 106 células/ml en un matraz de agitación en preparación para la transfección. Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 5 % en un incubador humidificado, agitando a 120 rpm. Se ensayaron células CHO DG44 no transfectadas con crecimiento exponencial con respecto a viabilidad antes de la transfección.

30 Se sedimentaron sesenta millones de células viables del cultivo de células CHO DG44 no transfectadas y se resuspendieron a una densidad de 2 x 107 células en 0,7 ml de tampón de transfección 2x (2x HeBS: HEPES 40 mM, pH 7,0, NaCl 274 mM, KCl 10 mM, Na2HPO4 1,4 mM, dextrosa 12 mM). A cada alícuota de células resuspendidas, se añadieron 0,09 ml (250 g) del plásmido HZ24 lineal (linealizado por digestión durante una noche con Cla I (New England Biolabs) y las soluciones de ADN/células se transfirieron a cubetas de electroporación BTX

35 (Gentronics) de 0,4 cm de hueco a temperatura ambiente. Se realizó electroporación de control negativo sin ADN plasmídico mezclado con las células. Las mezclas de células/plásmidos se sometieron a electroporación con una

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de profundidad, una cápsula de 0,65 m de profundidad, una cápsula de 0,22 m y finalmente a través de un filtro de

2.000 cm2 Sartopore de 0,22 m y a una bolsa de almacenamiento estéril de 100 l. El cultivo se concentró 10x usando dos TFF con filtros MWCO de 30 kDa de polietersulfona espirales (Millipore), seguido de un intercambio de tampón 6x con HEPES 10 mM, Na2SO4 25 mM, pH 7,0 a un filtro final de 0,22 m en una bolsa de almacenamiento estéril de 20 l. La Tabla 22 proporciona datos de control relacionados con las etapas de cultivo celular, recogida, concentración e intercambio de tampón.

Tabla 22. Datos de control para las etapas de cultivo celular, recogida, concentración e intercambio de tampón

Parámetro: HUA0406C HUA04010C HUA0415C HUA0420C

Tiempo desde la descongelación hasta inocular el biorreactor de 100 l (días): 21 19 17 18

Densidad de inoculación de 100 l (x 106 células/ml): 0,45 0,33 0,44 0,46

Tiempo de duplicación en crecimiento logarítmico (h): 29,8 27,3 29,2 23,5

Densidad celular máxima (x 106 células/ml): 5,65 8,70 6,07 9,70

Viabilidad de recogida (%): 41 48 41 41

Título de recogida (U/ml): 1964 1670 991 1319

Tiempo en biorreactor de 100 l (días): 13 13 12 13

Volumen de recogida clarificado (ml): 81800 93300 91800 89100

Ensayo enzimático de recogida clarificada (U/ml): 2385 1768 1039 1425

Ensayo enzimático concentrado (U/ml): 22954 17091 8561 17785

Ensayo enzimático concentrado con tampón intercambiado (U/ml): 15829 11649 9915 8679

Ensayo enzimático concentrado con tampón intercambiado filtrado (U/ml): 21550 10882 9471 8527

Volumen de concentrado con tampón intercambiado (ml): 10699 13578 12727 20500

Relación de concentración de unidades enzimáticas/recogida: 0,87 0,96 1,32 1,4

10 Se preparó una columna de intercambio iónico de Q Sepharose (Pharmacia) (3 l de resina, altura = 20 cm, diámetro = 14 cm). Se recogieron muestras de lavado para una determinación de pH, conductividad y ensayo de endotoxina (LAL). La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM, Na2SO4 20 mM, pH 7,5. La recogida diafiltrada, concentrada se cargó en la columna Q a un caudal de 100 cm/h. La columna se lavó con 5 volúmenes de

15 columna de Tris 10 mM, Na2SO4 20 mM, pH 7,5 y HEPES 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,0. La proteína se eluyó con HEPES 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7,0 y se filtró a través de un filtro final de 0,22 m a una bolsa estéril.

A continuación se realizó una cromatografía de interacción hidrófoba de Fenil-Sepharose (Pharmacia). Se preparó una columna de Fenil-Sepharose (PS) (9,1 l de resina, altura = 29 cm, diámetro = 20 cm). La columna se equilibró

20 con 5 volúmenes de columna de fosfato potásico 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, CaCl2 0,1 mM, pH 7,0. El eluato de proteína de antes se complementó con sulfato de amonio 2 M, fosfato potásico 1 M y soluciones de reserva de CaCl2 1 M hasta concentraciones finales de 5 mM, 0,5 M y 0,1 mM, respectivamente. La proteína se cargó en la columna de PS a un caudal de 100 cm/h. Se añadió fosfato potásico 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M y CaCl2 0,1 mM pH 7,0 a 100 cm/h. El flujo continuo se pasó a través de un filtro final de 0,22 m a una bolsa estéril.

25 La proteína purificada por PS se cargó después en una columna de aminofenil boronato (ProMedics) (6,3 l de resina, altura = 20 cm, diámetro = 20 cm) que se había equilibrado con 5 volúmenes de columna de fosfato potásico 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M. La proteína se pasó a través de la columna a un caudal de 100 cm/h, y la columna se lavó con fosfato potásico 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0. La columna se lavó después con bicina 20 mM, NaCl

30 100 mM, pH 9,0 y la proteína se eluyó con HEPES 50 mM, NaCl 100 mM pH 6,9 a través de un filtro estéril y a una bolsa estéril de 20 l. El eluato se ensayó con respecto a carga biológica, concentración proteica y actividad enzimática.

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Tabla 30

Diferencia de Proceso: rHuPH20 soluble de Gen1 rHuPH20 soluble de Gen2

superpuesto y a chorro.

20 l de volumen operativo: Volumen operativo de 32 l

Volumen operativo final en el biorreactor: Aproximadamente 100 l en un biorreactor de 125 l (volumen de cultivo inicial + 65 l) Aproximadamente 300 l en un biorreactor de 400 l (volumen de cultivo inicial + 260 l)

Medio de cultivo en el biorreactor final: Sin rHuInsulina rHuInsulina 5,0 mg/l

Volumen de suministro de medio: Cambio de escala al 4 % del volumen de cultivo celular del biorreactor es decir 3,4, 3,5 y 3,7 l, dando como resultado un volumen de biorreactor diana de ∼92 l. Cambio de escala al 4 % del volumen de cultivo celular del biorreactor es decir 10,4, 10,8, 11,2 y 11,7 l, dando como resultado un volumen de biorreactor diana de ∼303 l.

Suministro de medio: Medio de suministro Nº 1: CD CHO + Glucosa 50 g/l + GlutaMAX™-1 8 mM Medio de suministro Nº 1: CD CHO 4x + Glucosa 33 g/l + Glutamax 32 mM + Yeastolato 16,6 g/l + rHuInsulina 33 mg/l

Suministro Nº 2 (CD CHO + Glucosa 50 g/l + GlutaMAX 8 mM + Butirato Sódico 1,1 g/l: Suministro Nº 2: CD CHO 2x + Glucosa 33 g/l + Glutamax 16 mM + Yeastolato 33,4 g/l + Butirato Sódico 0,92 g/l

Suministro Nº 3: CD CHO + Glucosa 50 g/l + GlutaMAX 8 mM + Butirato Sódico 1,1 g/l: Suministro Nº 3: CD CHO 1x + Glucosa 50 g/l + Glutamax 10 mM + Yeastolato 50 g/l + Butirato Sódico 1,80 g/l

Suministro Nº 4: CD CHO 1x + Glucosa 33 g/l + Glutamax 6,6 mM + Yeastolato 50 g/l + Butirato Sódico 0,92 g/l

Filtración de cultivo celular del biorreactor: Cuatro filtros de polietersulfona (8,0 m, 0,65 m, 0,22 m y 0,22 m) en serie 1er estadio – Cuatro módulos en paralelo, cada uno con una capa de tierras diatomeas graduadas a 4-8 m y una capa de tierras diatomeas graduadas a 1,4-1,1 m, seguido de una membrana de celulosa

2º estadio – Módulo individual que contiene una capa de tierras diatomeas graduadas a 0,4-0,11 m y una capa de tierras diatomeas graduadas a < 0,1 m, seguido de una membrana de celulosa

3er estadio – Filtro de polietersulfona de 0,22 m

Bolsa de almacenamiento de 100 l: Bolsa de almacenamiento de 300 l

El cultivo celular recogido se complementa con EDTA 10 mM, Tris 10 mM a un pH de 7,5

Concentración e intercambio de tampón antes de la cromatografía: Concentrado con 2 TFF con filtro de polietersulfona espiral de MWCO de 30 K Millipore Concentrado usando cuatro filtros de MWCO de 30 K TFF Sartorius Sartoslice

Intercambio de tampón del concentrado 6x con HEPES 10 mM, NaCl 25 mM, pH 7,0: Intercambio de tampón del Concentrado 10x con Tris 10 mM, Na2SO4 20 mM, pH 7,5

Bolsa de almacenamiento estéril de 20 l: Bolsa de almacenamiento estéril de 50 l

Inactivación viral antes de la cromatografía: Ninguna Inactivación viral realizada con la adición de un Triton X-100 1 %, Tributil Fosfato 0,3 %, pH 7,5

1ª Etapa de purificación (Q sepharose): Sin lectura de absorbancia Mediciones A280 al comienzo y al final

Filtración viral después de la cromatografía: Filtro Pall DV-20 (20 nm) Filtro Vilosart Sartorius (20 nm)

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Ciclo: Día de Dosificación Día del Estudio Tratamiento de grupo nº 1 Tratamiento de grupo nº 2

5: 8 insulina lispro Humalog insulina Humulin R

2: 6 10 insulina Humulin R/rHuPH20 insulina lispro Humalog/rHuPH20

7: 12 insulina Humulin R insulina lispro Humalog

8: 14 insulina lispro Humalog/rHuPH20 insulina Humulin R/rHuPH20

9: 26 insulina lispro Humalog insulina Humulin R

3: 10 28 insulina Humulin R/rHuPH20 insulina lispro Humalog/rHuPH20

11: 30 insulina lispro Humalog/rHuPH20 insulina Humulin R/rHuPH20

12: 32 insulina Humulin R insulina lispro Humalog

B. Niveles de insulina en suero

Se determinaron las concentraciones de IRI en suero para cada muestra de suero por interpolación de una curva

5 patrón usando el software de análisis de ensayo StatLIA® (Brendan Technologies, Carlsbad, CA). La Tabla 37 proporciona una concentración de IRI después de la administración de insulina lispro Humalog®, insulina lispro Humalog®/rHuPH20, insulina Humulin® R o insulina Humulin® R/rHuPH20. La Tabla 37 expone los niveles de IRI de línea basal, como se miden en las muestras de presangrados. Estas líneas basales se restaron después de las concentraciones de IRI reales medidas en cada punto temporal para determinar la concentración de IRI ajustado a

10 línea basal.

Los perfiles de concentración de IRI en suero media-tiempo para cada tratamiento (como se ve cuando se representa en una gráfica con la concentración de IRI en el eje Y frente al tiempo en el eje X) fue similar durante múltiples ciclos. En todos los ciclos de dosificación, la farmacocinética de insulina lispro Humalog® e insulina

15 Humulin® R se aceleró cuando se coadministraron por vía subcutánea en la formulación de rHuPH20. Cualquier diferencia observada entre los tratamientos fue sustancialmente igual entre los ciclos de tratamiento, lo que indica que las diferencias observadas se debieron al tratamiento y fueron estables entre los ciclos, sobre aproximadamente 5 semanas de ensayo.

20 Tabla 37. Perfiles de concentración de IRI en suero-tiempo

Tiempo (minutos): Concentración de IRI media (pM) y desviación típica (DT)

insulina lispro Humalog®: insulina lispro Humalog®/rHuPH20 insulina Humulin® R insulina Humulin® R/ rHuPH20

Media: DT Media DT Media DT Media DT

0 (línea basal de presangrado): 37,0 52,3 45,0 37,5 20,9 27,3 19,2 23,8

Concentraciones de IRI ajustadas a línea basal

0
0
0
0
0
0
0
0

3: 8,1 25,2 65,5 79,3 0,7 3,0 113,0 109,7

6: 20,6 46,1 110,3 84,6 2,9 7,1 161,6 119,4

9: 21,5 40,9 166,0 122,5 3,7 10,9 168,1 136,2

12: 40,6 71,6 143,0 99,0 7,3 20,7 166,0 118,0

15: 52,3 78,4 262,2 215,5 11,2 32,8 155,6 114,8

20: 80,4 125,6 265,3 169,2 22,6 33,7 210,8 172,4

25: 93,6 92,5 263,3 190,0 40,7 48,2 253,0 171,9

30: 119,7 116,7 335,2 220,4 61,3 55,1 224,1 146,5

45: 193,9 139,7 296,1 183,3 105,6 103,8 253,1 188,1

60: 164,0 106,8 206,5 150,3 107,0 91,4 172,4 115,3

107

imagen77

insulina lispro Humalog®: insulina Humulin® R

sola: con rHuPH20 % control de P valor sola con rHuPH20 % control de P valor

0-30 min: 1,65  2,07 5,84  3,59 763 0,0198 0,56  0,73 5,33  3,30 1429 0,0027

0-1 h: 6,7  4,8 14,2  8,6 214 0,2776 3,4  2,5 12,1  7,3 246 0,2003

0-última: 18,0  8,8 26,6  14,6 146 0,1195 21,3  12,1 26,9  16,0 116 0,5312

0-infinito: 24,3  8,6 c 32,2  17,1a 117 0,5176 45,0  41,2c 32,6  16,7a 88 0,6118

1-4 h: 12,2  6,8 12,9  7,8 106 0,8410 18,2  10,3 15,0  10,1 72 0,2259

2-4 h: 4,9  3,2 6,0  4,9 215 0,3763 12,0  7,8 6,8  5,4 32 0,1930

a N = 15 b N = 4 c N = 13

Tabla 39. Parámetros PK de insulina después de administración subcutánea de insulina lispro Humalog® solo o insulina Humulin® R con rHuPH20.

insulina Humalog®: lispro insulina Humulin® R con rHuPH20 % de insulina lispro Humalog® P valor

Cmáx (pmol/l): 250  140 360  180 143 0,0944

t50 % Temprano (min): 36  20a 10  8a29 0,0141

tmáx (min): 58  26 38  41 64 0,1631

t50 % Tardío (min): 110  42a 70  41a 64 0,0092

Intervalo de ABC (min x nmol/l)

0-15 min: 0,35  0,64 2,06  1,28 2698 <0,0001

0-30 min: 1,65  2,07 5,33  3,32 744 0,0212

0-1 h: 6,7  4,8 12,1  7,3 189 0,3646

0-última: 18,0  8,8 26,9  16,0 146 0,1196

0-infinito: 24,3  8,6b 32,6  16,6a 128 0,3179

1-4 h: 12,2  6,8 15,0  10,1 121 0,4801

2-4 h: 4,9  3,2 6,9  5,4 290 0,2203

a N= 15 b N= 13

5 D. Sumario

La coadministración de insulina Humulin® R o insulina lispro Humalog® con rHuPH20 en cerdos alteró significativamente los parámetros PK específicos en relación con inyecciones de control (es decir insulina Humulin® R o insulina lispro Humalog® sola). Específicamente, la exposición máxima (Cmáx) se aumentó 163 % para insulina 10 lispro Humalog® (p = 0,0251) y 165 % para insulina Humulin® R (p = 0,0218) cuando se administró con rHuPH20 en relación con los controles respectivos. El inicio de la acción (t50 % Temprano) se aceleró de 36 a 11 minutos para insulina lispro Humalog® (p = 0,0182) y 61 a 10 minutos para insulina Humulin® R (p <0,0001). El tiempo de efecto máximo (tmáx) se aceleró de 58 a 39 minutos para insulina lispro Humalog® (p = 0,1963) y de 94 a 38 minutos para insulina Humulin® R (p = 0,0004). El t50 % Tardío se aceleró de 110 a 52 minutos para insulina lispro Humalog® (p = 15 0,0002) y de 170 a 70 minutos para insulina Humulin® R (p <0,0001). La exposición total (ABCinf) no se alteró de

109

imagen78

Tabla 40. Protocolo de dosificación

Ciclo: Dosis Día Grupo 1 Grupo 2

1
1: 0 Insulina-PH20 U100 Insulina U20

2
2: Insulina-PH20 U20 Insulina U100

3: 4 Insulina U100 Insulina-PH20 U20

4: 6 Insulina U20 Insulina-PH20 U100

2: 5 8 Insulina-PH20 U20 Insulina U100

6: 10 Insulina U20 Insulina-PH20 U100

7: 12 Insulina-PH20 U100 Insulina U20

8: 14 Insulina U100 Insulina-PH20 U20

B. Niveles de insulina en suero

5 Las concentraciones de IRI en suero se determinaron para cada muestra de suero por interpolación de una curva patrón usando software de análisis de ensayo StatLIA® (Brendan Technologies, Carlsbad, CA). La Tabla 41 proporciona la concentración de IRI en suero media después de la administración de Insulina U20, Insulina U100, Insulina-PH20 U20 e Insulina-PH20 U100. La Tabla 41 expone los niveles de IRI de línea basal, como se mide en las muestras de presangrado. Estas líneas basales se restaron después de las concentraciones de IRI reales

10 medidas en cada punto temporal para determinar la concentración de IRI ajustada a línea basal.

Se compararon los perfiles de concentración de insulina-tiempo después de cada ciclo de dosificación para cada grupo de tratamiento. Los perfiles de concentración de IRI en suero media-tiempo para cada artículo de ensayo, como se observa cuando se representa en una gráfica con la concentración de IRI en el eje Y frente al tiempo en el 15 eje X, fue similar sobre ambos ciclos. En ambos ciclos de dosificación, la PK de la insulina se aceleró cuando se coadministró por vía subcutánea con la formulación de rHuPH20 para ambas concentraciones. Se construyeron modelos estadísticos adicionales que incluían efectos fijos para el tratamiento, secuencia, ciclo, la interacción de tratamiento por ciclo, y animal dentro de la secuencia para los datos de los ciclos 1 y 2 para parámetros PK primarios y secundarios (los parámetros PK primarios incluyeron: Área Bajo la Curva (ABC) para ventanas de tiempo

20 asignadas, Cmáx, tmáx, t50 % Temprano y t50 %Tardío; los parámetros PK secundarios incluían ventanas de tiempo más detalladas para ABC, MRT (último e infinito), Lambda z, HL Lambda z, Eliminación y Volumen de Distribución) y mostraron que no había efectos sistemático de secuencia, ciclo o animal, ni había una interacción entre el ciclo y el tratamiento para ninguna de estas variables.

25 Tabla 41. Perfiles de concentración de IRI en suero-tiempo

Insulina U20: Insulina U100 Insulina-PH20 U20 Insulina-PH20 U100

Media: DT Media DT Media DT Media DT

0 (línea basal presangrado): de 91,6 53,0 89,0 49,6 114,3 55,8 71,8 48,4

Concentraciones de IRI ajustadas a línea basal

0: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

3: 139,7 472,2 63,1 73,4 2,2 5,6 49,4 41,3

6: 74,2 234,6 178,7 269,3 8,1 17,6 88,8 73,7

9: 206,3 594,2 122,0 101,3 12,9 30,9 144,5 85,0

12: 93,0 166,7 181,5 150,5 36,9 58,0 182,1 138,6

15: 83,1 116,2 214,4 151,5 58,6 76,9 225,3 165,6

20: 136,3 180,8 367,1 590,3 85,1 109,6 251,8 133,3

25: 139,1 147,7 247,3 161,1 174,5 262,2 285,7 142,8

30: 238,0 292,2 294,1 183,9 169,2 224,9 357,3 199,9

111

Insulina U20: Insulina U100 Insulina-PH20 U20 Insulina-PH20 U100

Media: DT Media DT Media DT Media DT

45: 203,3 117,5 249,0 133,5 134,3 147,6 234,7 115,8

60: 185,5 127,6 174,8 101,8 102,5 65,1 252,1 169,1

90: 106,1 67,7 131,2 128,1 85,4 87,8 222,7 144,7

120: 70,8 71,9 73,0 47,0 70,9 61,7 153,7 54,8

180: 78,0 92,3 64,2 119,3 87,4 101,3 69,4 59,1

240: 25,7 32,2 26,0 44,7 23,0 36,9 23,3 26,5

C. Farmacocinética de insulina

Se usó el perfil de concentración de insulina-tiempo después de restar la concentración de insulina de línea basal

5 (Tabla 41, anterior) para calcular los siguientes parámetros PK: incluyendo tmáx, Cmáx, t50 % Temprano, t50 % Tardío y ABCintervalo. Se moderaron los datos de IRI en suero frente al tiempo por análisis no compartimental usando el WinNonlin Professional modelo 200 (versión 5.2 Pharsight Corp., Mountain View, CA) y los parámetros PK calculados. Se realizaron cálculos de estadística y comparaciones estadísticas entre grupos usando SAS versión

9.1.3 (SAS Institute, Cary, NC). Todos los análisis se realizaron usando un modelo mixto con efectos fijos para el

10 tratamiento. Se asumió una matriz de covarianza simétrica de compuestos entre observaciones repetidas para cada animal. Se realizaron análisis para Cmáx y todos los criterios de valoración de ABC usando valores transformados de forma logarítmica con valores de cero reemplazados por 1 antes de la transformación logarítmica (cero en la escala logarítmica). Los criterios de valoración basados en el tiempo se analizaron en la escala lineal original.

15 Se proporciona un sumario de la farmacocinética de la insulina después de administración subcutánea de Insulina U20, Insulina U100, Insulina-PH20 U20 e Insulina-PH20 U100, en la Tabla 42. Los diversos parámetros PK para cada insulina suministrada sola o con rHuPH20 se muestran como la media  DT. El % de control para cada parámetro (% de control = [valor PK para la insulina con rHuPH20] / [valor PK para insulina sola] x 100) también se proporciona en la tabla. Los cálculos del % de control se basaron en la media geométrica y p valor para datos

20 transformados de forma logarítmica para parámetros Cmáx y ABC, mientras que los cálculos del % de control se basaron en la media aritmética y los valores no transformados para tmáx y t50 % Temprano y Tardío. N =16 cerdos a no ser que se indique otra cosa.

Tabla 42. Parámetros PK de insulina después de la administración subcutánea con o sin rHuPH20

Insulina 20 U/ml: Insulina 100 U/ml

Insulina 20U: InsulinarHuPH20 20U % de control P valor Insulina 100U InsulinarHuPH20 100U % de control P valor

Cmáx (pmol/l): 429  508 462  567 106 0,8439 238  237 420  208 237 0,0095

t50 % Temprano (min): 23  14b 12  5 52 0,1622 35  38c 12  7 34 0,0063

tmáx (min): 57  42 39  21 68 0,2462 64  49 47  29 74 0,2775

t50 % Tardío (min): 84  38b 77  45 92 0,7689 109  64c 112  53 103 0,9315

Intervalo de ABC (min x nmol/l)

0-15 min: 1,61  4,37 1,95  1,73 1920 0,0045 0,27  0,40 1,75  1,02 7104 <0,0001

0-30 min: 0,79  6,24 6,35  5,90 623 0,0567 2,14  2,83 5,89  2,89 2400 0,0015

0-1 h: 10,02  8,60 13,75  8,92 179 0,2073 6,19  6,78 13,98  6,0 489 0,0012

112

imagen79

Ejemplo 13

Efecto de la concentración salina en rHuPH20 en presencia de metilparabeno

5 Se evaluó el efecto de NaCl en la estabilidad de rHuPH20 con y sin el conservante metilparabeno, a temperatura acelerada (40 ºC). Se prepararon doce formulaciones diferentes combinando rHuPH20 (10 mg/ml en histidina/HCl, pH 6,5, NaCl 130 mM) con seis concentraciones diferentes de NaCl, con o sin Metilparabeno (Fluka). Cada formulación contenía rHuPH20 10 mg/ml, Tris 25 mM, pH 7,3, Tween 80 0,01 % y NaCl 0,50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM o 250 mM con o sin metilparabeno 0,2 %. Las soluciones se separaron en alícuotas en frascos de vidrio de

10 tipo I de 2 ml con tapones de goma y se sellaron con tapas de alúmina durante el estudio. Se almacenó un conjunto de frascos a 40 ºC durante cuatro días y el otro conjunto se mantuvo en la nevera a 2-8 ºC para actuar como un control positivo. Las muestras se ensayaron después con respecto a actividad hialuronidasa (enzimática). Para evaluar el nivel de agregados, se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) usando una columna G2000 SWXL (Tosoh Bioscience) con las siguientes condiciones con PBS 1 X como tampón de ejecución y un

15 caudal establecido en 1 ml/minuto.

En la Tabla 43 se exponen los resultados del estudio, incluyendo actividad hialuronidasa (enzimática), % de pico principal (es decir el porcentaje de rHuPH20 que estaba contenido en el pico principal) y % de pico agregado (es decir el porcentaje de rHuPH20 que estaba contenido en el pico atribuido a los agregados). Se observó que la 20 estabilidad de rHuPH20 era sensible a la concentración de NaCl. En general, cuando las formulaciones se incubaron a 40 ºC, a medida que se reducía la concentración de NaCl, la actividad enzimática de rHuPH20 se redujo. Sin embargo, cuando se almacenó en nevera a 2-8 ºC, la rHuPH20 conservó la actividad enzimática independientemente de la formulación. A temperatura elevada, cuando NaCl se eliminó completamente de la solución, se perdió la actividad completa de rHuPH20, tanto si hubo metilparabeno como si no. La pérdida de

25 actividad enzimática se redujo a medida que aumentaba la concentración de NaCl. Hubo una diferencia significativa en la actividad enzimática (ensayo de t de muestras relacionadas, P=0,0228) entre muestras con y sin metilparabeno añadido.

Se observó una correlación similar de la concentración de NaCl y los niveles agregados de rHuPH20. Los niveles

30 agregados aumentaron con la concentración de NaCl decreciente cuando las muestras se almacenaron a temperatura elevada. No hubo esencialmente ningún cambio con o sin metilparabeno añadido cuando se almacenó a 2-8 ºC. Las formulaciones almacenadas a -40 ºC que contenían metilparabeno formaron significativamente más agregado que las formulaciones que no contenían metilparabeno (ensayo de t de muestras relacionadas, P=0,0058).

35 Por lo tanto, tanto la actividad enzimática como el porcentaje de monómero de rHuPH20 como se evaluó por SEC se redujeron significativamente en formulaciones que contenían metilparabeno en comparación con las formulaciones que no contenían metilparabeno. Además, dentro del intervalo de concentración de NaCl ensayado (0-250 mM), hubo una relación directa entre la concentración de NaCl y el aumento de la estabilidad de rHuPH20.

40 Tabla 43. Actividades enzimáticas y resultados de SEC de las muestras almacenadas 4 días a 40 ºC y 4 ºC.

Formulación: Actividad enzimática (U/ml) % de pico principal % de pico agregado

4 ºC: 40 ºC 4 ºC 40 ºC 4 ºC 40 ºC

Sin NaCl, MP 0,2 %: 12410 <LOD 99,65 0 0,35 100

NaCl 50 mM, MP 0,2%: 12470 2990 99,22 2,86 0,78 97,14

NaCl 100 mM, MP 0,2 %: 12380 3530 100 13,32 0 86,68

NaCl 150 mM, MP 0,2 %: 13510 6200 100 26,31 0 73,69

NaCl 200 mM, MP 0,2 %: 11250 6220 99,49 51,84 0,51 48,16

NaCl 250 mM, MP 0,2 %: 10740 7340 100 65,55 0 34,45

Sin NaCl, sin MP: 10430 <LOD 99,4 0 0,6 100

NaCl 50 mM, sin MP: 12370 3070 99,34 22,05 0,66 77,95

NaCl 100 mM, sin MP: 12580 9930 99,47 72,81 0,53 27,19

NaCl 150 mM, sin MP: 12750 11180 99,48 88,16 0,52 11,84

NaCl 200 mM, sin MP: 13660 13340 99,64 96,22 0,36 3,78

NaCl 250 mM, sin MP: 11370 11090 100 98,05 0 1,95

LOD= límite de detección

114

imagen80

Cresol 0,2 %; parabeno 0,2 %; fenol 0,2 % y F68 0,1 %; o fenol 0,2 % y benzoato 1 mM. Cada una de estas formulaciones se preparó a pH 7, 7,25 y 7,5, dando como resultado un total de 30 artículos de ensayo (15 artículos de ensayo insulina lispro Humalog®/rHuPH20 y 15 artículos de ensayo insulina aspart Novolog®/rHuPH20). Los artículos de ensayo se almacenaron después a 5 ºC, 30 ºC, 35 ºC y 25 ºC con agitación durante 4 semanas. La

5 actividad enzimática de rHuPH20 se evaluó en todas las condiciones. La solubilidad de la insulina se evaluó por RP-HPLC para artículos de ensayo almacenados a 5 ºC y 25 ºC con agitación.

Se observó que la actividad de rHuPH20 no se vio afectada por conservante o pH después de 4 semanas a 5 ºC. En condiciones de tensión de agitación (20 ºC), la actividad de rHuPH20 no se vio afectada cuando se coformuló con

10 insulina aspart Novolog® y cualquiera de los conservantes a cualquiera de los pH ensayados. Por el contrario, en algunas formulaciones con insulina lispro Humalog®, tal como cuando se formula con fenol 0,02 %, m-cresol o fenol/benzoato, la actividad de rHuPH20 después de 6 horas se redujo en hasta el 75 %, más típicamente a medida que aumentaba el pH. Esta pérdida de actividad se correlacionó con la precipitación de insulina lispro Humalog®.

15 La Tabla 45 expone la actividad de rHuPH20 conservada en cada uno de los artículos de ensayo después de incubación a 30 ºC y 35 ºC. Se observó una ligera pérdida de actividad de rHuPH20 a un promedio de aproximadamente 85 % de actividad original a 30 ºC. Se observó una pérdida mayor a 35 ºC, particularmente, por ejemplo, en artículos de ensayo que contenían m-Cresol 0,2 % o parabeno 0,2 % a medida que aumentaba el pH.

20 La insulina aspart Novolog® permaneció estable y soluble en todas las formulaciones en todas las condiciones de almacenamiento. Aunque la solubilidad de insulina lispro Humalog® se conservó a pH 7,5 después de 4 semanas a 5 ºC, la insulina lispro Humalog® se precipitó a pH menor (7,0 y 7,25) a esta temperatura. También se observó precipitación en condiciones de tensión de agitación después de 6 horas.

25 Tabla 45. Actividad de rHuPH20 que permanece después de 4 semanas a 30 ºC y 35 ºC en formulaciones de análogo de insulina/rHuPH20

Formulación: pH Actividad de rHuPH20 restante (%)

30 ºC: 35 ºC

insulina lispro Humalog®: insulina aspart Novolog® insulina Humalog® lispro insulina aspart Novolog®

Fenol: 7,0 92 92 77 74

7,25: 89 92 71 69

7,5: 91 92 69 60

m-Cresol: 7,0 82 78 40 29

7,25: 85 81 29 21

7,5: 77 71 11 9

Parabeno: 7,0 90 89 29 34

7,25: 90 89 20 22

7,5: 81 79 8 10

Fenol/F68: 7,0 93 94 81 68

7,25: 91 92 75 61

7,5: 90 73 63 13

Fenol/benzoato: 7,0 90 88 73 67

7,25: 91 87 71 63

7,5: 88 86 64 58

Ya que resultarán evidentes para los expertos en la materia modificaciones, se pretende que la presente invención se limite solamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

116

Claims

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