ES2534773T3 - Reactivo de lisis, unión y/o lavado que se puede usar para el aislamiento y/o la purificación de ácidos nucleicos - Google Patents

Reactivo de lisis, unión y/o lavado que se puede usar para el aislamiento y/o la purificación de ácidos nucleicos Download PDF

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Abstract

Reactivo de lisis, unión y/o lavado que comprende: - al menos un compuesto caotrópico, - al menos un compuesto de tampón seleccionado preferentemente del grupo que comprende tris(hidroximetil)aminometano, N-(tri(hidroximetil)metil)glicina, N,N-bis(2-hidroxietil)-glicina, ácido 3-(Nmorfolino) propanosulfónico, ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etanosulfónico), ácido piperazin-1,4-bis(2- etanosulfónico), ácido N-ciclohexil-2-aminoetanosulfónico, ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico y/o tampón fosfato y - al menos un tensioactivo no iónico basado en polioxietileno que es un éter de alcohol graso de polioxietileno seleccionado del grupo cetiléter de polioxietileno, esteariléter de polioxietileno y/u oleiléter de polioxietileno en el intervalo de >= 8 % en peso/volumen a <= 30 % en peso/volumen en relación con el volumen total del reactivo.

Description

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Los ejemplos de éteres de alcohol cetílico, oleílico o estearílico de polioxietileno adecuados están seleccionados, preferentemente, del grupo que comprende cetiléter de polioxietileno (2) (Brij 52), cetiléter de polioxietileno (10) (Brij 56), cetiléter de polioxietileno (20) (Brij 58), esteariléter de polioxietileno (2) (Brij 72), esteariléter de polioxietileno (10) (Brij 76), esteariléter de polioxietileno (20) (Brij 78), oleiléter de polioxietileno (2) (Brij 92), 5 oleiléter de polioxietileno (10) (Brij 97), oleiléter de polioxietileno (20) (Brij 98) y/o esteariléter de polioxietileno
(100) (Brij 700).
De acuerdo con una forma de realización preferente de la invención, el éter de alcohol graso de polioxietileno comprende un constituyente de polioxietileno que contiene de 2 a 150 unidades de (CH2CH2O).
10 El éter de alcohol graso de polioxietileno está seleccionado del grupo que comprende cetiléter de polioxietileno, esteariléter de polioxietileno y/u oleiléter de polioxietileno. En esta forma de realización están comprendidos con menor preferencia éteres de alcohol laurílico del polioxietileno, por ejemplo, lauriléter de polioxietileno (4) (Brij 30) o lauriléter de polioxietileno (23) (Brij 35) en la composición lisis y/o unión. Preferentemente, por tanto, la composición
15 de lisis y/o unión no contiene ninguna de estas sustancias.
Se prefieren éteres de alcohol cetílico, oleílico o estearílico de polioxietileno seleccionados, preferentemente, del grupo que comprende cetiléter de polioxietileno (10) (Brij 56), cetiléter de polioxietileno (20) (Brij 58), esteariléter de polioxietileno (20) (Brij 78) y/u oleiléter de polioxietileno (20) (Brij 98). Se prefieren en particular éteres de
20 alcohol cetílico u oleílico de polioxietileno seleccionados, preferentemente, del grupo que comprende cetiléter de polioxietileno (10) (Brij 56), cetiléter de polioxietileno (20) (Brij 58) y/u oleiléter de polioxietileno (20) (Brij 98).
Además son adecuados alcoholes cetílicos, estearílicos u oleílicos polietoxilados que están disponibles, por ejemplo, con las denominaciones INCI Ceteth, Steareth u Oleth.
25 De acuerdo con una forma de realización preferente del procedimiento, la composición de lisis y/o unión comprende tensioactivo no iónico en el intervalo de  0,2 % (peso/volumen) a ≤ 30 % (peso/volumen), preferentemente en el intervalo de  3 % (peso/volumen) a ≤ 10 % (peso/volumen), preferentemente en el intervalo de  3,2 % (peso/volumen) a ≤ 8 % (peso/volumen) en relación con el volumen total de la composición.
30 Esto ha resultado adecuado en particular para composiciones de lisis y para mezclas de composiciones de lisis y unión.
De acuerdo con una forma de realización preferente del procedimiento, el compuesto caotrópico de la composición
35 de lisis y/o unión es una sal de sodio o guanidinio seleccionada, preferentemente, del grupo que comprende ioduro sódico, perclorato sódico, clorhidrato de guanidinio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio y/o una mezcla de dos o varias sales de los mismos. Preferentemente, el compuesto caotrópico es una sal de guanidinio seleccionada, preferentemente, del grupo que comprende clorhidrato de guanidinio, tiocianato de guanidinio y/o isotiocianato de guanidinio.
40 En particular ha resultado adecuada una combinación de los compuestos caotrópicos que se han mencionado anteriormente y los tensioactivos no iónicos basados en polioxietileno contenidos de acuerdo con la invención para la lisis de células de virus y el aislamiento de ácidos nucleicos de células de virus.
45 Han resultado adecuadas concentraciones del compuesto caotrópico de la composición de lisis y/o unión en el intervalo de  0,1 M a ≤ 10 M. Preferentemente, la concentración del compuesto caotrópico se encuentra en el intervalo de  1 M a ≤ 8 M, preferentemente en el intervalo de  3 M a ≤ 7 M, de forma particularmente preferente en el intervalo de  4 M a ≤ 6 M.
50 De acuerdo con una forma de realización preferente del procedimiento, la composición de lisis y/o unión comprende al menos un compuesto de tampón seleccionado del grupo que comprende tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), N(tri(hidroximetil)metil)glicina (tricina), N,N-bis(2-hidroxietil)-glicina (BICIN), ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2etanosulfónico) (HEPES), ácido piperazin-1,4-bis(2-etanosulfónico) (PIPES), ácido N-ciclohexil-2aminoetanosulfónico (CHES), ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico
55 (MOPS) y/o tampón fosfato.
De acuerdo con otra forma de realización preferente del procedimiento, la composición de lisis y/o unión comprende al menos un compuesto de tampón seleccionado del grupo que comprende tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES) y/o tampón fosfato. De acuerdo con otra forma de
60 realización aún más preferente del procedimiento, la composición de lisis y/o unión comprende al menos un compuesto de tampón seleccionado del grupo que comprende tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) y/o ácido N-(2hidroxietil)piperazin-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES).
El lisado de la muestra biológica se puede realizar a temperatura ambiente, por ejemplo, a de 15 ºC a 25 ºC, o a 65 temperatura elevada, por ejemplo, a temperaturas en el intervalo de  37 ºC a ≤ 75 ºC.
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En formas de realización preferentes, la composición de lisis puede presentar además enzimas, por ejemplo, proteinasa K, proteasa (por ejemplo, proteasa QIAGEN), zimolasa, liticasa, acromopeptidasa, lisostafina, lisozima y, en función de la aplicación, nucleasas, por ejemplo, DNasa y/o RNasa.
5 La inmovilización del ácido o los ácidos nucleicos liberados en una matriz a base de uno o varios compuestos de óxido de silicio se realiza en presencia de un compuesto caotrópico y/o un alcanol ramificado o no ramificado.
Preferentemente, la composición de unión comprende un alcanol ramificado o no ramificado. De acuerdo con una forma de realización preferente, el alcanol ramificado o no ramificado es un alcohol con uno a cinco átomos de carbono seleccionado, preferentemente, del grupo que comprende metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, nbutanol, iso-butanol, sec-butanol, terc-butanol, n-pentanol, iso-pentanol y/o mezclas de los mismos.
De acuerdo con una forma de realización preferente, la composición de unión comprende alcanol ramificado o no ramificado en el intervalo de  1 % en volumen a ≤ 80 % en volumen, preferentemente en el intervalo de  5 % en
15 volumen a ≤ 70 % en volumen, preferentemente en el intervalo de  10 % en volumen a ≤ 60 % en volumen, más preferentemente en el intervalo de  15 % en volumen a ≤ 50 % en volumen en relación con el volumen total de la composición de unión.
De acuerdo con una forma de realización preferente de la invención, una mezcla de la composición de unión comprende el reactivo de lisis y opcionalmente uno o varios aditivos adicionales, preferentemente alcanol ramificado
o no ramificado en el intervalo de  1 % en volumen a ≤ 80 % en volumen, preferentemente en el intervalo de  5 % en volumen a ≤ 70 % en volumen, preferentemente en el intervalo de  15 % en volumen a ≤ 50 % en volumen en relación con el volumen total de la mezcla.
25 Para el aislamiento de los ácidos nucleicos, la muestra se pone en contacto con una matriz a base de uno o varios compuestos de óxido de silicio, tales como dióxido de silicio (sílice), silicato, vidrio y/o gel de sílice y se incuba durante un tiempo suficiente para la unión. La matriz puede estar presente en las configuraciones habituales conocidas por el estado de la técnica tales como, por ejemplo, en forma de partículas, como membrana o filtro. Para una separación más sencilla, las partículas preferentemente presentan propiedades magnéticas. Para ácidos nucleicos pueden ser apropiados tiempos de incubación entre 10 segundos y 30 minutos. Han resultado ventajosos tiempos de incubación en un intervalo de 1 minuto a 20 minutos, en particular de aproximadamente 10 minutos.
Para el aislamiento de ácidos nucleicos se usan preferentemente partículas magnéticas que presentan una envoltura de gel de sílice. Para el aislamiento de los ácidos nucleicos se usan preferentemente partículas magnéticas que
35 presentan una envoltura de gel de sílice y que presentan un tamaño de partícula medio en el intervalo de  1 m a ≤ 25 m, preferentemente en el intervalo de  5 m a≤ 15 m y, de forma particularmente preferente, en el intervalo de  6 m a ≤ 10 m, preferentemente con una distribución de tamaño estrecha. Para el aislamiento de ácidos nucleicos se usan además preferentemente partículas magnéticas que presentan una envoltura de gel de sílice y que presentan un tamaño de partícula medio en el intervalo de  1 m a ≤ 5 m, preferentemente con una distribución de tamaño estrecha.
En otra forma de realización preferente, las partículas magnéticas o magnéticamente atraíbles son partículas que presentan un núcleo magnético basado en óxido de hierro, seleccionado preferentemente del grupo que comprende magnetita (Fe3O4), magemita (-Fe2O3) y/o ferritas.
45 Las partículas de sílice magnéticas que se pueden usar ventajosamente están descritas, por ejemplo, en la solicitud internacional de patente WO 01/71732, a la que se hace referencia en su totalidad por la presente.
En una forma de realización preferente se puede usar una matriz a base de uno o varios compuestos de óxido de silicio en forma de partículas magnéticas o magnéticamente atraíbles con una superficie de sílice.
Preferentemente se realiza la unión a temperaturas en el intervalo de  15 ºC a ≤ 75 ºC, preferentemente en el intervalo de  20 ºC a ≤ 70 ºC, de forma particularmente preferente en el intervalo de  46 ºC a ≤ 65 ºC, mucho más preferentemente de  50 ºC a ≤ 60 ºC. La unión se puede realizar también a temperatura ambiente, por ejemplo, a 
55 15 ºC a ≤ 28 ºC.
Después de la incubación se separan los ácidos nucleicos unidos a la matriz a base de uno o varios compuestos de óxido de silicio de la composición de lisis y/o unión. Con el uso de partículas de sílice magnéticas, esto se puede conseguir con ayuda de un campo magnético. Por ejemplo, las partículas magnéticas se pueden atraer hacia la pared del recipiente en el que ha tenido lugar la incubación, recogerse en puntas de pipeta adecuadas mediante aplicación de un campo magnético o inmovilizarse en varillas magnéticas protegidas por envolturas de plástico. Son etapas de procedimiento adecuadas para la retirada de la composición de lisis y/o unión, por ejemplo, el pipeteado o aspiración del líquido o la elevación de las partículas magnéticas en puntas de pipeta o en varillas magnéticas o el descenso de la preparación de lisis y/o unión, permaneciendo las partículas magnéticas separadas a la misma
65 altura.
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Opcionalmente, el ácido o los ácidos nucleicos inmovilizados sobre la matriz se pueden lavar antes de la separación. La etapa de lavado tiene lugar preferentemente mediante incubación de una solución de lavado con las partículas cargadas, realizándose preferentemente una resuspensión de las partículas, por ejemplo, mediante agitación o aplicación de un campo magnético. La solución de lavado contaminada se retira preferentemente al igual que la
5 composición de lisis y/o unión que permanece después de la unión, en particular una mezcla de composición de lisis y/o unión.
Como reactivo de lavado se puede usar un tampón de lavado convencional o cualquier otro medio adecuado. En general se prefieren reactivos de lavado con una fuerza iónica de baja a moderada, por ejemplo, una solución de tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) 10 mM. Además se pueden usar tampones de lavado que presentan mayores concentraciones de sales, por ejemplo, una solución de clorhidrato de guanidinio 4-6 M. Los reactivos de lavado de acuerdo con la invención que se han descrito anteriormente representan también reactivos de lavado adecuados.
Además se pueden usar reactivos de lavado que contienen alcohol, por ejemplo, soluciones acuosas de alcoholes
15 con uno a cinco átomos de carbono, preferentemente soluciones acuosas de etanol, en particular soluciones acuosas de etanol al 50-100 por ciento.
Preferentemente, el ácido o los ácidos nucleicos inmovilizados sobre la matriz se lavan varias veces, por ejemplo de 2 a 4 veces, preferentemente con distintos reactivos de lavado. En formas de realización preferentes se realiza el lavado en primer lugar con reactivos de lavado con una fuerza iónica de baja a moderada y a continuación con una solución acuosa de etanol al 70-100 por ciento.
En particular un uso de partículas magnéticas posibilita una realización sencilla de etapas de separación y/o lavado mediante la agregación magnética de las partículas.
25 Después de la última etapa de lavado o una etapa de enjuagado con agua (“water rinse”) se puede efectuar una etapa de secado de las partículas preferentemente magnéticas, por ejemplo, al vacío o mediante evaporación o dejando evaporar el líquido.
De acuerdo con la etapa d) del procedimiento, los ácidos nucleicos unidos se pueden separar de la matriz. La separación de los ácidos nucleicos se denomina también elución.
También puede ser preferente usar los ácidos nucleicos unidos a la matriz, en particular a partículas magnéticas, sin separación, por ejemplo, para PCR u otros métodos de amplificación, procedimientos de detección de ADN o
35 procedimientos de identificación de ADN.
El ácido nucleico unido se puede separar mediante un reactivo de elución con un reducido contenido de sal de las partículas. Como reactivo de elución con un reducido contenido de sal se pueden usar en particular reactivos con un contenido de sal de menos de 0,1 mol/l. De forma particularmente preferente, el reactivo de elución contiene el compuesto de tampón tris(hidroximetil)aminometano (Tris). Además, es particularmente adecuada para la elución agua desmineralizada, opcionalmente con uno o varios aditivos, por ejemplo, complejantes tales como etilendiamina-tetraacetato (EDTA), azida y/o compuestos de tampón, por ejemplo, tris(hidroximetil)aminometano (Tris).
45 En particular mediante el uso de la composición de lisis y/o unión resulta un procedimiento particularmente ventajoso para el aislamiento de ácidos nucleicos de muestras biológicas, en particular para el aislamiento de ADN de virus.
Resultan ventajas en particular a partir de los buenos rendimientos que se pueden obtener después incluso de almacenamiento de los reactivos de lisis y/o unión.
La presente invención se refiere además a un kit para el aislamiento y/o la purificación de ácidos nucleicos de una muestra biológica que contiene ácidos nucleicos que comprende un reactivo de lisis, unión y/o lavado de acuerdo con la invención.
55 En formas de realización preferentes, el kit puede contener además una matriz a base de uno o varios compuestos de óxido de silicio, en particular una matriz a base de uno o varios compuestos de óxido de silicio en forma de partículas magnéticas o magnéticamente atraíbles con una superficie de sílice. Las partículas de sílice magnéticas contenidas preferentemente están descritas, por ejemplo, en la solicitud internacional de patente WO 01/71732 a la que se hace referencia en su totalidad por la presente.
En otra forma de realización preferente, el kit puede contener además reactivos de lavado y/o elución adecuados, en particular un reactivo de lavado de acuerdo con la invención.
En otra forma de realización preferente, el kit en lugar de partículas de sílice magnéticas puede contener otros 65 materiales de soporte silanizados, preferentemente columnas de centrífuga con membranas de sílice.
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Ejemplo 3: Extracción de ADN viral después de almacenamiento del reactivo de lisis
Los reactivos de lisis B que contenían isotiocianato de guanidinio, tris(hidroximetil)aminometano y el 20 % (p/v) de Brij 58 (empresa Sigma) y A, en el que el Brij 58 estaba sustituido por el 20 % (p/v) de Tween 20 (empresa 5 Fluka), se almacenaron respectivamente en recipientes cerrados durante 10 semanas a 50 ºC.
A continuación, mediante el uso de la plataforma de automatización disponible en el mercado QIAsymphony (empresa Qiagen) mediante el protocolo automatizado para la purificación de ácido nucleico viral de muestras de plasma se extrajo el ácido nucleico viral.
10 De acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 2 se extrajo de respectivamente 1000 l de la muestra de plasma el ADN viral mediante el uso de la plataforma de automatización disponible en el mercado QIAsymphony (empresa Qiagen), usándose para diferentes preparaciones reactivo de lisis B almacenado respectivamente durante 10 semanas a 50 ºC que contenía isotiocianato de guanidinio, tris(hidroximetil)aminometano y el 20 % (p/v) de Brij 58
15 (empresa Sigma) y reactivo de lisis A, en el que el Brij 58 estaba sustituido por el 20 % (p/v) de Tween 20 (empresa Fluka). Como referencia sirvió un reactivo de lisis A que se almacenó a temperatura ambiente durante aproximadamente 4 semanas.
Se constató que los eluidos que se obtuvieron mediante el uso del reactivo de lisis A almacenado a 50 ºC estaban 20 intensamente enturbiados, mientras que los eluidos que se obtuvieron mediante el uso del reactivo de lisis B eran claros.
De los eluidos obtenidos, respectivamente 6 l y 24 l se sometieron a una PCR en tiempo real (RT) específica para VHB. A partir de los valores medios representados en la Figura 3 de los valores de CT se puede observar que la 25 extracción mediante el uso del reactivo de lisis B de acuerdo con la invención y el reactivo de unión C obtuvo un mayor rendimiento.
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Claims (1)

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