ES2538078T3 - Bacteria productora de alcohol isopropílico y método para producir alcohol isopropílico - Google Patents
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Abstract
Escherichia coli productora de alcohol isopropilico que comprende al menos un gen de sacarosa hidrolasa que pertenece a un grupo de genes de sistema no PTS de sacarosa, y un sistema de produccion de alcohol isopropilico conferido o mejorado en donde la Escherichia coli productora de alcohol isopropilico es una Escherichia coli a la que se ha conferido actividad acetoacetato descarboxilasa, actividad alcohol isopropilico deshidrogenasa, actividad CoA transferasa, y actividad tiolasa.
Description
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E10817144
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secuencia de base del gen obtenido de Clostridium acetobutylicum o Bacillus polymyxa. Un ADN con la secuencia de base del gen procedente de Clostridium acetobutylicum es de particular preferencia.
En la presente invención, la alcohol isopropílico deshidrogenasa hace referencia a un nombre genérico de enzimas que se clasifican según el número de código enzimático: 1.1.1.80 en base al informe de la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB), y que catalizan una reacción de producción de alcohol isopropílico a partir de acetona. Ejemplos de la enzima incluyen aquellas procedentes de bacterias del género Clostridium, tales como Clostridium beijerinckii.
Como gen de la alcohol isopropílico deshidrogenasa a ser introducido en la bacteria hospedadora de la presente invención, puede utilizarse un ADN con la secuencia de base de un gen que codifica la alcohol isopropílico deshidrogenasa obtenida a partir de cualquiera de los organismos de origen de las enzimas detallados anteriormente, o una secuencia de ADN sintético que se sintetiza en base a una secuencia de base conocida del gen. Ejemplos preferidos incluyen aquellos procedentes de bacterias del género Clostridium, tales como ADN con la secuencia de base del gen procedente de Clostridium beijerinckii.
En la presente invención, la CoA transferasa hace referencia a un nombre genérico de enzimas que se clasifican según el número de código enzimático: 2.8.3.8 en base al informe de la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB), y que catalizan una reacción de producción de acetoacetato a partir de acetoacetil CoA.
Ejemplos de la enzima incluyen aquellas procedentes de bacterias del género Clostridium, tales como Clostridium acetobutylicum y Clostridium beijerinckii, bacterias del género Roseburia, tales como Roseburia intestinalis, bacterias del género Faecalibacterium tales como Faecalibacterium prausnitzii, bacterias del género Coprococcus, bacterias del género Trypanosoma tales como Trypanosoma brucei, y bacterias del género Escherichia tales como Escherichia coli.
Como gen de la CoA transferasa a ser introducido en la bacteria hospedadora de la presente invención, puede utilizarse un ADN con la secuencia de base de un gen que codifica la CoA transferasa obtenida a partir de cualquiera de los organismos de origen de las enzimas detallados anteriormente, o una secuencia de ADN sintético que se sintetiza en base a una secuencia de base conocida del gen. Ejemplos preferidos incluyen un ADN con la secuencia de base del gen procedente de una bacteria del género Clostridium tal como Clostridium acetobutylicum, una bacteria del género Roseburia, tal como Roseburia intestinalis, una bacteria del género Faecalibacterium tal como Faecalibacterium prausnitzii, una bacteria del género Coprococcus, una bacteria del género Trypanosoma tal como Trypanosoma brucei, o una bacteria del género Escherichia tal como Escherichia coli. Un ADN con la secuencia de base del gen procedente de una bacteria del género Clostridium o una bacteria del género Escherichia es de mayor preferencia, y un ADN con la secuencia de base del gen procedente de Clostridium acetobutylicum o Escherichia coli es de particular preferencia.
En la presente invención, la tiolasa hace referencia a un nombre genérico de enzimas que se clasifican según el número de código enzimático: 2.3.1.9 en base al informe de la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB), y que catalizan una reacción de producción de acetoacetil CoA a partir de acetil CoA.
Ejemplos de la enzima incluye aquellas procedentes de bacterias del género Clostridium tales como Clostridium acetobutylicum y Clostridium beijerinckii, bacterias del género Escherichia tales como Escherichia coli, bacterias de la especie Halobacterium, bacterias del género Zoogloea tales como Zoogloea ramigera, bacterias de la especie Rhizobium, bacterias del género Bradyrhizobium tales como Bradyrhizobium japonicum, bacterias del género Candida tales como Candida tropicalis, bacterias del género Caulobacter tales como Caulobacter crescentus, bacterias del género Streptomyces tales como Streptomyces collinus, y bacterias del género Enterococcus tales como Enterococcus faecalis.
Como gen de la tiolasa a ser introducido en la bacteria hospedadora de la presente invención, puede utilizarse un ADN con la secuencia de base de un gen que codifica la tiolasa obtenida a partir de cualquiera de los organismos de origen de las enzimas detallados anteriormente, o una secuencia de ADN sintético que se sintetiza en base a una secuencia de base conocida del gen. Ejemplos preferidos incluyen un ADN con la secuencia de base del gen procedente de una bacteria del género Clostridium tal como Clostridium acetobutylicum o Clostridium beijerinckii, una bacteria del género Escherichia tal como Escherichia coli, una bacteria de la especie Halobacterium, una bacteria del género Zoogloea tal como Zoogloea ramigera, una bacteria de la especie Rhizobium, una bacteria del género Bradyrhizobium tal como Bradyrhizobium japonicum, una bacteria del género Candida tal como Candida tropicalis, una bacteria del género Caulobacter tal como Caulobacter crescentus, una bacteria del género Streptomyces tal como Streptomyces collinus, o una bacteria del género Enterococcus tal como Enterococcus faecalis. Un ADN con la secuencia de base del gen obtenido a partir de una bacteria del género Clostridium o una bacteria del género Escherichia es de mayor preferencia, y un ADN con la secuencia de base del gen procedente de Clostridium acetobutylicum o Escherichia coli es de particular preferencia.
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El alcance del término “conferir” o “mejora” de la habilidad tal como se utiliza en la presente invención incluye la introducción de un gen que codifica una enzima desde el exterior de la célula bacteriana de la bacteria hospedadora al interior de la célula bacteriana, y además incluye una expresión elevada del gen de una enzima mediante la mejora de la actividad del promotor de un gen de la enzima que la bacteria hospedadora posee en el genoma de la misma, o mediante la sustitución por otro promotor.
En la presente invención, la Escherichia coli a la que se ha conferido la actividad enzimática hace referencia a una Escherichia coli a la que ha sido conferida la actividad enzimática desde el exterior de la célula bacteriana hacia el interior de la célula bacteriana utilizando un método determinado. Una Escherichia coli de este tipo puede ser producida utilizando un método de, por ejemplo, introducción de un gen que codifica la enzima y proteína desde el exterior de la célula bacteriana hacia el interior de la célula bacteriana utilizando la técnica de recombinación genética tal como se describe anteriormente.
En la presente invención, Escherichia coli, de la cual se mejora la actividad enzimática, hace referencia a una Escherichia coli de la cual se mejora la actividad enzimática mediante un método determinado. Una Escherichia coli de este tipo puede ser producida utilizando un método de, por ejemplo, introducción de un gen que codifica la enzima y la proteína desde el exterior de la célula bacteriana hacia el interior de la célula bacteriana utilizando un plásmido y utilizando la técnica de recombinación genética tal como se describe anteriormente, u ocasionando expresiones elevadas de un gen de la enzima que la Escherichia coli hospedadora posee en el genoma de la misma mediante la mejora de la actividad del promotor del gen de la enzima o su sustitución por otro promotor.
En la presente invención, Escherichia coli significa Escherichia coli que puede ser realizada para tener la habilidad para producir alcohol isopropílico a partir de una materia prima procedente de las plantas utilizando un medio determinado, independientemente de si la Escherichia coli tiene o no originalmente la habilidad para producir alcohol isopropílico a partir de una materia prima procedente de plantas.
Aquí, la Escherichia coli en la que los respectivos genes se van a introducir puede no tener la habilidad de producción de alcohol isopropílico, y puede ser cualquier Escherichia coli que permita la introducción o modificación de los respectivos genes.
La Escherichia coli puede ser, más preferiblemente, una Escherichia coli a la que se ha conferido por adelantado la habilidad de la producción de alcohol isopropílico. Utilizando una Escherichia coli de este tipo, puede producirse alcohol isopropílico de una manera más eficaz. Especialmente, de acuerdo con la presente invención, la habilidad de asimilación de sacarosa puede ser conferida a la Escherichia coli que no tiene la habilidad innata de asimilación de sacarosa, por lo que puede producirse alcohol isopropílico de manera eficaz a partir de sacarosa. Ejemplos de Escherichia coli que no tiene la habilidad innata de asimilación de sacarosa incluyen la cepa k12, cepa B, cepa C, y cepas obtenidas a partir de las mismas.
Un ejemplo de Escherichia coli productora de alcohol isopropílico de ese tipo es una bacteria productora de alcohol isopropílico a la que se ha conferido actividad acetoacetato descarboxilasa, actividad alcohol isopropílico deshidrogenasa, actividad CoA transferasa, y actividad tiolasa para que sea capaz de producir alcohol isopropílico a partir de una materia prima procedente de plantas, y que se describe en la publicación WO 2009/008377.
Un método para producir alcohol isopropílico de acuerdo con la presente invención incluye producir alcohol isopropílico a partir de una materia prima procedente de plantas que contiene sacarosa utilizando la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico descrita anteriormente. Más específicamente, el método incluye un proceso en el que la Escherichia coli productora de alcohol isopropílico descrita anteriormente se pone en contacto con una materia prima procedente de plantas que contienen sacarosa y se cultiva, y un proceso de recogida en el cual se recoge el alcohol isopropílico generado como resultado del contacto.
La materia prima procedente de plantas en el método de producción de alcohol isopropílico descrito anteriormente puede ser, sin una limitación en particular, cualquier materia prima procedente de plantas que contenga sacarosa que sea una fuente de carbono obtenida a partir de una planta. En la presente invención, materia prima procedente de plantas hace referencia a órganos tales como raíces, cañas, tallos, ramas, hojas, flores, y semillas, organismos vegetales que incluyen órganos vegetales, y productos de descomposición de los órganos vegetales, y además abarca fuentes de carbono que pueden ser utilizadas como fuentes de carbono por microorganismos durante su cultivo de entre las fuentes de carbono obtenidas de los organismos vegetales, órganos vegetales, o productos de descomposición de los mismos.
Las fuentes de carbono incluidas en tales materias primas procedentes de plantas incluyen en general, además de sacarosa, azúcares tales como almidón, glucosa, fructosa, xilosa, y arabinosa, o productos de descomposición de plantas herbáceas o leñosas o hidrolizados de celulosa, cada uno de los cuales contiene los ingredientes anteriores en grandes cantidades, y combinaciones de las mismas. Las fuentes de carbono en la presente invención pueden además incluir glicerina o ácidos grasos procedentes de aceites vegetales.
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μg/ml de cloranfenicol, y se cultivó durante la noche a 30ºC. Las células bacterianas obtenidas se aplicaron en una placa de agar LB con un contenido de 10 μg/ml de cloranfenicol, y se cultivaron a 42ºC, y se obtuvieron colonias. Las colonias obtenidas se cultivaron a 30ºC durante 2 horas en un medio líquido LB que no contenía antibiótico, y se aplicó en una placa de agar que no contenía antibiótico, como resultado de lo cual se obtuvieron colonias que crecen a 42ºC.
De las colonias resultantes, 100 colonias se recogieron aleatoriamente, cada una de las cuales se cultivó entonces en una placa de agar LB libre de antibióticos y una placa de agar LB con un contenido de 10 μg/ml de cloranfenicol. Se seleccionaron clones sensibles al cloranfenicol, y, de los ADN cromosómicos de los clones seleccionados, se amplificó por PCR un fragmento de aproximadament 790 pb que incluía el promotor GAPDH y atoD, y se seleccionó una cepa en la que una región promotora atoD fue reemplazada por el promotor GAPDH. Entonces, un clon que cumplía las anteriores condiciones se denominó una cepa insertada con el genoma GAPp-atoD con el ato-D eliminado de la cepa B de Escherichia coli.
La cepa B de B de Escherichia coli (ATCC 11303) se encuentra disponible de la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection), que es un banco de células, microorganismos, y genes.
[Ejemplo 4]
(Construcción del Vector de expresión para el gen de acetoacetato descarboxilasa procedente de una bacteria del género Clostridium y el gen del alcohol isopropílico deshidrogenasa procedente de una bacteria del género Clostridium, y un transformante con el vector de expresión)
Una acetoacetato descarboxilasa de una bacteria del género Clostridium se describe en el número de accesión de GenBank M55392 y una alcohol isopropílico deshidrogenasa de la misma se describe en el número de accesión de GenBank AF157307.
Para obtener el gen de alcohol isopropílico deshidrogenasa, se realizó una amplificación mediante un método por PCR utilizando el ADN genómico de Clostridium beijerinckii NRRL B-593 como plantilla y utilizando AATATGCATGCTGGTGGAACATATGAAAGGTTTTGCAATGCTAGG (SEQ ID NO: 3) y gcggatccttataatataactactgctttaattaagtc (SEQ ID NO: 22). El fragmento de ADN resultante fue digerido con enzimas de restricción SphI y BamHI, como resultado de lo cual se obtuvo un alcohol isopropílico deshidrogenasa de aproximadamente 1,1 kpb. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido mediante la digestión del plásmido pBRgapP previamente preparado con enzimas de restricción SphI y BamHI, y los fragmentos mezclados se ligaron utilizando una ligasa. Después de esto, se transformó una célula competente de la cepa DH5� de Escherichia coli (ADN-903: Toyobo Co., Ltd.) con el producto de ligamiento, y se obtuvo un transformante que creció en una placa de agar LB que contenía 50 μg/mL de ampicilina. La colonia obtenida se cultivó a 37ºC durante la noche en un medio líquido LB con un contenido de 50 μg/mL de ampicilina, y se recuperó un plásmido de las células bacterianas obtenidas, y se confirmó que el IPAdh se introdujo de forma adecuada. El plásmido se denominó pGAP-IPAdh.
Para obtener el gen de la acetoacetato descarboxilasa, se realizó una amplificación mediante un método por PCR utilizando el ADN genómico de Clostridium acetobutylicum ATCC824 como plantilla y utilizando caggatccgctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc (SEQ ID NO: 23) y ggaattcggtaccttacttaagataatcatatataacttcagc (SEQ ID NO: 24). El fragmento de ADN resultante fue digerido con enzimas de restricción BamHI y EcoRI, como resultado de lo cual se obtuvo una acetoacetato descarboxilasa de aproximadamente 700 pb. El fragmento de ADN obtenido se mezcló con un fragmento obtenido mediante la digestión del plásmido pGAP-IPAdh previamente preparado con enzimas de restricción BamHI y EcoRI, y los fragmentos mezclados se ligaron utilizando una ligasa. Se transformó una célula competente de la cepa DH5� de Escherichia coli (ADN-903: Toyobo Co., Ltd.) con el producto de ligamiento, y se obtuvo un transformante que creció en una placa de agar LB que contenía 50 μg/mL de ampicilina. La colonia obtenida se cultivó a 37ºC durante la noche en un medio líquido LB con un contenido de 50 μg/mL de ampicilina. Se recuperó un plásmido de las células bacterianas obtenidas, y se confirmó que el adc se introdujo de forma adecuada. El plásmido se denominó pGAP-Ia.
Una célula competente de una cepa insertada con el genoma GAPp-atoD con el ato-D eliminado de la cepa B de Escherichia coli preparada en el Ejemplo 3, se transformó con el plásmido pGAP-Ia, y fue cultivada a 37ºC durante la noche en una placa de agar LB con un contenido de 50 μg/mL de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo una cepa insertada con el genoma de pGAP-Ia/GAPp-atoD de Escherichia coli.
La cepa ATCC824 de Clostridium acetobutylicum y la cepa B de Escherichia coli se encuentran disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo, que es un banco de células, microorganismos, y genes. La NRRL B-593 de Clostridium beijerinckii está disponible de la Colección de cultivos VTT, que es un banco de células y microorganismos.
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[Ejemplo 5]
(Construcción del Vector de expresión del gen de acetoacetato descarboxilasa procedente de una bacteria del género Clostridium, del gen de alcohol isopropílico deshidrogenasa procedente de una bacteria del género Clostridium, y del gen de Invertasa procedente de Escherichia Coli 0157, y un transformante con el vector de expresión)
La secuencia de base total del ADN genómico de la cepa O157 de Escherichia Coli se conoce (número de accesión de GenBank AE005174), y la secuencia de base de un gen (de aquí en adelante abreviado en ocasiones como cscA) que codifia la invertasa de la cepa O157 de Escherichia Coli ha sido también descrita. Específicamente, el cscA se describe en 3274383 a 3275816 de la secuencia del genoma de la cepa O157 de Escherichia Coli registrada con el número de accesión de GenBank AE005174.
Para obtener cscA, se realizó una amplificación mediante un método por PCR utilizando el ADN genómico de la cepa O157 de Escherichia Coli como plantilla y utilizando ATGGTACCGCTGGTGGAACATATGACGCAATCTCGATTGCATG (SEQ ID NO: 25) y CGAATTCTTAACCCAGTTGCCAGAGTGC (SEQ ID NO: 26). El fragmento de ADN resultante fue digerido con las enzimas de restricción Kpnl y EcoRI, como resultado de lo cual se obtuvo un fragmento de cscA de aproximadamente 1470 pb. El fragmento de ADN se mezcló con un fragmento obtenido mediante la digestión del pGAP-Ia, que había sido previamente preparado en el Ejemplo 4 (el vector de expresión para el gen de acetoacetato descarboxilasa procedente de la bacteria del género Clostridium y el gen de alcohol isopropílico deshidrogenasa procedente de la bacteria del género Clostridium), con enzimas de restricción Kpnl y EcoRI, y los fragmentos mezclados se ligaron utilizando una ligasa. Después de eso, se transformó una célula competente de la cepa DH5� de Escherichia coli (ADN-903: Toyobo Co., Ltd.) con el producto de ligamiento, y se obtuvo un transformante que creció en una placa de agar LB que contenía 50 μg/mL de ampicilina. Se recuperó un plásmido de las células bacterianas obtenidas, y se confirmó que el cscA se introdujo de forma adecuada. Este plásmido se denominó pGAP-Ia-cscA.
Una célula competente de la cepa insertada con el genoma GAPp-atoD con el ato-D eliminado de la cepa B de Escherichia coli preparada en el Ejemplo 3, se transformó con el plásmido pGAP-Ia-cscA, y se cultivó a 37ºC durante la noche en una placa de agar LB con un contenido de 50 μg/mL de ampicilina, como resultado de lo cual se obtuvo una cepa insertada con el genoma de pGAP-Ia-cscA/GAPp-atoD de Escherichia coli.
El genoma de la Escherichia coli 0157 está disponible del Instituto de Materiales y Medidas de Referencia.
[Ejemplo 6]
(Producción de Alcohol isopropílico a partir de sacarosa mediante una cepa insertada con el genoma de pGAP-IacscA/GAPp-atoD de Escherichia coli, utilizando un tanque de cultivo de 3 L)
Utilizando la cepa insertada con el genoma de pGAP-Ia-cscA/GAPp-atoD de Escherichia coli obtenida en el Ejemplo 5, la producción de alcohol isopropílico fue examinada en la misma forma que en el Ejemplo 2.
Además, se midieron las cantidades de sacarosa, glucosa, y fructosa acumuladas en el tanque de cultivo, y los resultados se muestran en la Tabla 1.
Como resultado, 48 horas después del inicio del cultivo, se observó una acumulación de 31,4 g/L de alcohol isopropílico. Cada uno de los valores medidos es una suma de las cantidades en el líquido de cultivo y el agua de separación después del cultivo.
[Tabla 1]
- Tiempo hr
- Cantidad añadida de 40% de sacarosa g Azúcar residual Cantidad de acumulación de alcohol isopropílico g/L
- Sacarosa g/L
- Glucosa g/L Fructosa g/L
- 0
- 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00
- 3
- 23,6 22,07 0,00 0,00 0,00
- 6
- 67,2 46,05 0,02 0,03 0,43
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- 152,1 78,28 0,76 0,00 6,43
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