ES2539042T3 - Procedimiento de identificación de si un paciente será respondedor o no a inmunoterapia - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de identificación de un paciente respondedor o no respondedor a inmunoterapia de cáncer que comprende las etapas de: a) analizar una muestra derivada del paciente que contiene células tumorales o cancerosas para determinar la expresión diferencial de CCL5, y b) caracterizar el paciente a partir del cual se derivó la muestra como un respondedor o no respondedor, basándose en los resultados de la etapa (a), en el que el paciente se caracteriza como respondedor si la expresión de CCL5 está regulada hacia arriba, en el que la caracteriación se realiza por referencia o comparación a un patrón y en el que la muestra derivada del paciente se obtuvo antes de que el paciente recibiera la inmunoterapia de cáncer.

Description

Procedimiento de identificación de si un paciente será respondedor o no a inmunoterapia
Campo de la invención
La presente invención se refiere a perfiles de expresión génica; y novedosos procedimientos de diagnóstico. La invención además se refiere al tratamiento de pacientes con cáncer, caracterizados como un respondedor por su perfil de expresión génica, tales como pacientes que padecen tumores que expresan Mage.
Antecedentes
Los melanomas son tumores que se originan a partir de células de melanocitos en la epidermis. Los pacientes con melanoma maligno en metástasis distante (fase IV de acuerdo con la Clasificación de la Comisión de Juntas Americana sobre cáncer (AJCC)) tienen un tiempo mediano de supervivencia de un año, con una tasa de supervivencia a largo plazo del 5% solamente. Incluso la quimioterapia convencional para el melanoma en fase IV tiene tasas de respuesta terapéutica del 8 -25% solamente, pero sin efecto en la supervivencia global. Los pacientes con metástasis regional (fase III) tienen una supervivencia mediana de dos a tres años con una oportunidad muy baja de supervivencia a largo plazo, incluso después de un control quirúrgico adecuado de la metástasis primaria y regional (Balch y col., 1992). La mayoría de los pacientes con melanoma de fase I a III han eliminado su tumor quirúrgicamente, pero estos pacientes mantienen un riesgo sustancial de recaída. De este modo permanece una necesidad de prevenir la progresión del melanoma, y tener pautas de tratamiento mejorados para melanoma metastático y tratamientos adyuvantes para pacientes a los que se les ha extirpado un tumor primario.
Existen dos tipos de cáncer de pulmón: cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC). Los nombres simplemente describen el tipo de célula encontrado en los tumores. NSCLC incluye carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, y carcinoma de células grandes y es responsable de aproximadamente el 80% de los cánceres de pulmón. NSCLC es difícil de curar y los tratamientos disponibles tienden a tener el objetivo de prolongar la vida, tanto como sea posible, y aliviar los síntomas de la enfermedad. NSCLC es el tipo más común de cáncer de pulmón y está asociado a escasos resultados (Gatzmeier y col., 1994). De todos los pacientes con NSCLC, solamente aproximadamente el 25% tienen enfermedad loco-regional en el momento del diagnóstico y todavía son capaces de escisión quirúrgica (fases IB, IIA o IIB de acuerdo con la clasificación AJCC). Sin embargo, más del 50% de estos pacientes recaerán en dos años después de la completa resección quirúrgica. Por lo tanto existe una necesidad de proporcionar mejor tratamiento para estos pacientes.
La quimioterapia tradicional se basa en la administración de sustancias tóxicas al paciente y se basa, en parte, en la captación agresiva del agente tóxico por las células tumorales / cancerosas. Estas sustancias tóxicas afectan de manera adversa al sistema inmune del paciente, dejando al paciente físicamente debilitado y susceptible a infección.
Se sabe que no todos los pacientes con cáncer responden a los tratamientos de cáncer actuales. Se cree que solamente el 30% o menos de personas que padecen cáncer responderán a cualquier tratamiento dado. Los cánceres que no responden al tratamiento se describen como resistentes. En muchos casos no han existido procedimientos de confianza para establecer si los pacientes responderán al tratamiento. Sin embargo, la administración de tratamiento a pacientes que son tanto respondedores como no respondedores debido a que no se pueden diferenciar, es un uso ineficaz de recursos e, incluso peor, puede ser perjudicial para el paciente porque, como ya se ha descrito, muchos tratamientos de cáncer tienen efectos secundarios significativos, tales como inmunosupresión grave, emesis y/o alopecia. Se cree que en numerosos casos los pacientes reciben tratamiento, cuando no es necesario o cuando no será eficaz.
Las células que incluyen células cancerosas / tumorales expresan muchos cientos incluso miles de genes.
Se ha hecho una gran cantidad de trabajo en los últimos tiempos para ayudar en la diagnosis y prognosis de pacientes con cáncer, por ejemplo para identificar aquellos pacientes que no requieren tratamiento adicional debido a que no tienen riesgo de metástasis, reaparición o progresión de la enfermedad.
El documento WO 2006/124836 identifica ciertas marcas de expresión génica en varias rutas oncogénicas, definiendo por lo tanto la prognosis del paciente y sensibilidad a los agentes terapéuticos que dirigen estas rutas. Los oncogenes específicos son; Myc, Ras, E2, S3, Src y beta-catenina.
El documento US 2006/0265138 describe un procedimiento de generación de un perfil genético, generalmente para identificar los tumores primarios de manera que se pueda proporcionar tratamiento apropiado.
El documento US 2006/0240441 y el documento US 2006/0252057 describen procedimientos para diagnosticar cáncer de pulmón basándose en la expresión diferencial de ciertos genes.
El documento US 2006/0234259 se refiere a la identificación y uso de ciertos perfiles de expresión génica de relevancia para el cáncer de próstata.
El documento WO 2006/103442 describe los perfiles de expresión génica expresados en un subconjunto de tumores positivos para el receptor de estrógeno receptor (ER), que actúan, como una marca predictiva para la respuesta a ciertas terapias de hormonas tales como tamoxifina y también ciertas quimioterapias.
El documento WO 2006/093507 describe un perfil génico útil para caracterizar un paciente con cáncer colorrectal por tener una buena prognosis o una mala prognosis, en el que los pacientes con una buena prognosis son adecuadas para quimioterapia.
El documento WO 2006/092610 describe un procedimiento para controlar la progresión de melanoma basándose en la expresión diferencial de ciertos genes y marcadores novedosos para la enfermedad, en particular TSBY1, CYBA y MT2A.
El documento WO 2005/049829 describe un conjunto aislado de genes marcadores que se pueden emplear para predecir la sensibilidad de ciertos cánceres a un agente quimioterapéutico, que es un inhibidor de la quinasa receptora erbB, tal como gefitinib.
En general, estos casos se refieren a marcadores para uno o más cánceres basándose en marcadores biológicos para la identificación y / o progresión del cáncer. En algunos casos estas rutas están moduladas por los llamados oncogenes. La diagnosis que emplea las técnicas anteriores permite que los pacientes que es probable que recaigan y /o padezcan metástasis sean identificados y dirigidos para terapia adicional. En otros casos se identifica un marcador específico relevante para la resistencia a un tratamiento específico.
Está actualmente en investigación, por numerosos grupos, una nueva generación de tratamientos de cáncer basados en antígenos, péptidos, ADN y similares. La estrategia detrás de muchas de estas terapias, a menudo se denominan como inmunoterapia de cáncer, es estimular el sistema inmune del paciente en la lucha contra el cáncer. Estas terapias probablemente sean ventajosas debido a que los efectos secundarios, al tomar tales tratamientos, se espera que sean mínimos en comparación con los efectos secundarios encontrados actualmente en los pacientes sometidos a tratamiento de cáncer. Un antígeno usado en una inmunoterapia de cáncer se puede denominar como un ASCI, que es un agente inmunoterapéutico de cáncer específico de antígeno.
A principio de los años 80, Van Pel y Boon publicaron el descubrimiento de las células T citolíticas dirigidas contra un primer antígeno compartido presente en las células tumorales. Esto condujo a la caracterización del antígeno que participa, específico de tumor: Melanoma AGE-1 (MAGE-1, posteriormente renombrado MAGE-A1). A esto siguió la identificación de un gran número de genes que comparten el mismo patrón de expresión: se expresan en un amplio intervalo de tipos de tumores tales como, melanoma, cánceres de pulmón, vejiga, mama, cabeza y cuello. No se expresan en células normales, excepto en los testículos. Sin embargo, esta expresión en los testículos normalmente no conduce a la expresión de antígeno, ya que estas células de líneas germinales no expresan las moléculas de MHC clase I. A partir de su perfil de expresión peculiar, el nombre de genes de cáncer de testículos (CT) se propuso para estos genes.
Los antígenos MAGE son antígenos codificados por la familia de genes de antígeno asociados a melanoma (MAGE). Los genes MAGE se expresan predominantemente sobre las células de melanoma (incluyendo melanoma maligno) y algunos otros cánceres incluyendo NSCLC (cáncer de pulmón de células no pequeñas), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, carcinoma de células transicionales de vejiga y carcinoma de esófago, pero no son detectables en los tejidos normales excepto en los testículos y placenta (Gaugler y col Human gene MAGE-3 codes for an antígen recognized on a melanoma by autologous cytolytic T lymphocytes J Exp Med. 1994 Mar 1;179 (3):921 -930); Weynants y col Expresión of mage genes by non-small-cell lung carcinomas Int. J Cancer. 1994 Mar 15;56(6):826 -829, Patard y col Int J. Cancer 64: 60, 1995). MAGE-A3 se expresa en el 69% de melanomas (Gaugler, 1994), y también se puede detectar en el 44% de NSCLC (Yoshimatsu 1988), 48% de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, el 34% de carcinoma de células transicionales de vejiga, el 57% de carcinoma de esófago, el 32% de cánceres de colon y el 24% de cánceres de mama (Van Pel, y col Genes coding for tumor antigens recognized by cytolytic T lymphocytes Immunological Reviews 145, 229 -250, 1995, 1995.); Inoue 1995; Fujie 1997; Nishimura 1997). Los cánceres que expresan las proteínas MAGE se conocen como tumores asociados a Mage.
Sumario
Los inventores han desarrollado un procedimiento de selección e identificación de pacientes como adecuados para el tratamiento con inmunoterapia del cáncer, y un agente inmunoterapéutico de cáncer específico de antígeno para su uso en el tratamiento de dichos pacientes.
En una realización, la invención proporciona un procedimiento de identificación de un paciente respondedor o no
respondedor a inmunoterapia del cáncer que comprende las etapas: a) analizar una muestra derivada del paciente que contiene células cancerosas o tumorales para la expresión diferencial de CCL5, y b) caracterización del paciente del que se deriva la muestra como respondedor o no respondedor en base a los resultados de la etapa (a), en la que el paciente se caracteriza como un respondedor si la expresión de CCL5 se regula hacia arriba, en la que la caracterización se realiza por referencia o comparación con un patrón y en la que la muestra derivada del paciente se obtiene antes de que el paciente reciba la inmunoterapia del cáncer.
En un segundo aspecto de la primera realización, la invención proporciona un procedimiento de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en el que el patrón es una muestra con un resultado clínico conocido. En un tercer aspecto de la primera realización, la invención proporciona un procedimiento de acuerdo con el segundo aspecto de la invención en el que la comparación se realiza usando un algoritmo.
En una segunda realización, la invención proporciona un agente inmunoterapéutico del cáncer específico de antígeno para su uso en el tratamiento de un paciente, en la que el paciente se caracteriza antes del comienzo del tratamiento como un respondedor en base a la expresión diferencial de al menos un gen de activación inmune, en la que el gen de activación inmune es CCL5 y en la que el agente inmunoterapéutico del cáncer específico de antígeno es un antígeno MAGE capaz de producir una respuesta inmune específica de MAGE.
En un segundo aspecto de la segunda realización, la invención proporciona un agente inmunoterapéutico del cáncer específico de antígeno para su uso en el tratamiento para un paciente de acuerdo con el primer aspecto de la segunda realización, en la que el agente inmunoterapéutico comprende además un adyuvante apropiado.
En un cuarto aspecto de la primera realización, la invención proporciona un procedimiento de acuerdo con el primer, segundo y tercer aspecto de la primera realización, en la que la terapia o inmunoterapia es inmunoterapia del cáncer específica de antígeno MAGE.
Breve descripción de las Figuras, Secuencias y Tablas
La Figura 1 es una representación en diagrama de un agrupamiento jerárquico usando análisis de Spotfire que une el resultado clínico de 31 pacientes que resultan ser respondedores (definidos en esta memoria descriptiva para incluir respondedor, respondedor mixto y enfermedad estable) o no-respondedores, a la inmunoterapia de Mage en el ensayo clínico de MAGE008, con el perfil de gen identificado por análisis de microdisposición y que emplea los 148 conjuntos de sondas superiores. La Figura 2 es una representación en diagrama del mismo análisis de la Figura 1, en la que el agrupamiento jerárquico se realizó usando el análisis de BaldiBH que usa 100 conjuntos de sondas. La Figura 3 es una representación en diagrama del mismo análisis de la Figura 1, en la que el agrupamiento jerárquico se realizó usando la lista génica de Arrayminer Classmaker. La Figura 4 es un diagrama de Venn que representa la comparación de las listas de genes usados en la Figura 1, la Figura 2 y la Figura 3. La Figura 5 es una representación visual del perfil de la expresión de diversos genes (36 conjuntos de sondas) para 30 pacientes diferentes (los pacientes están a lo largo del eje X y los diversos conjuntos de sondas se extienden a lo largo del eje Y). La Figura 5a es una representación visual de la expresión de 2 genes para 30 pacientes diferentes (pacientes a lo largo del eje X). La Figura 6 muestra el Análisis de Componente Principal usando los genes PRF1, GZMB, GNLY, CD8A, PRKCQ, FOXP3, IFNG, CCL5, GPR171 y TRBV19. La Figura 7 es una representación visual del perfil de la expresión de diversos genes (41 conjuntos de sondas) para 33 pacientes diferentes (los números de identificación de pacientes están a lo largo del eje X) a partir del ensayo clínico de MAGE008 que usa el adyuvante AS15. La Figura 8 es una representación en diagrama de agrupamiento jerárquico para los pacientes en el brazo AS15 del ensayo clínico de MAGE008. La Figura 9 es una representación visual del perfil de la expresión de diversos genes (41 conjuntos de sondas) para 33 pacientes diferentes (los números de identificación de pacientes están a lo largo del eje X) a partir del ensayo clínico de MAGE008 que usa el adyuvante AS02b. La Figura 10 es una representación en diagrama de agrupamiento jerárquico para los pacientes en el brazo AS02b del ensayo clínico de MAGE008.
En los mapas térmicos en esta memoria descriptiva los genes regulados hacia arriba se representan en rojo que en la escala de gris se tienden a presentar por sombras más oscuras. Las sombras más claras en la escala de gris tienden a presentar verde en el mapa térmico (genes que no están regulados hacia arriba).
Sec ID Nº 1 Marco abierto de lectura 190 del cromosoma 6
Sec ID Nº 2 Sustrato 1 de Lyn específico de células hematopoyéticas
Sec ID Nº 3 Receptor 2 de interleuquina, gamma (inmunodeficiencia combinada grave)
Sec ID Nº 4 Antígeno CD52 (antígeno CAMPATH-1) /// antígeno CD52 (antígeno CAMPATH-1)
Sec ID Nº 5 Antígeno CD2 (p50), receptor de glóbulos rojos de oveja /// antígeno CD2 (p50), receptor de
glóbulos rojos de oveja Sec ID Nº 6 Ubiquitina D Sec ID Nº 7 transductor de señal y activador de la transcripción 4 Sec ID Nº 8 Granzima K (granzima 3; triptasa II) /// granzima K (granzima 3; triptasa II) Sec ID Nº 9 Antígeno CD3G, polipéptido gamma (complejo TiT3) Sec ID Nº10 Receptor 171 acoplado a la proteína G Sec ID Nº 11 Proteína quinasa C, beta 1 Sec ID Nº 12 Complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DR alfa /// complejo de
histocompatibilidad principal, clase II, DR alfa
Sec ID Nº 13 Complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ beta 1 /// Complejo de
histocompatibilidad principal, clase II, DQ beta 1
Sec ID Nº 14 Alcohol deshidrogenasa IB (clase I), polipéptido beta
Sec ID Nº 15 Constante del receptor alfa de células T /// Constante del receptor alfa de células T
Sec ID Nº 16 Antígeno CD69 (p60, antígeno de activación temprana de las células T)
Sec ID Nº 17 Proteína quinasa C, theta
Sec ID Nº 18 variable 19 del receptor beta células T /// constante 1 de receptor beta células T
Sec ID Nº 19 Locus del receptor alfa de células T /// variable 2 de receptor delta células T /// variable 20
de receptor alfa células T /// unión 17 de receptor alfa células T /// constante de receptor alfa de células T Sec ID Nº 20 Constante 2 del receptor gamma de células T Sec ID Nº 21 variable 21 -1 del receptor beta de células T /// variable 19 del receptor beta de células T ///
variable 5 – 4 del receptor beta de células T /// variable 3 -1 del receptor beta de células T /// receptor
beta constante 1 de células T
Sec ID Nº 22 locus del receptor alfa de células T Sec ID Nº 23 variable 19 de receptor beta de células T /// variable 19 de receptor beta de células T /// constante 1 de receptor beta de células T /// constante 1 del receptor beta de células T
Sec ID Nº 24 Antígeno CD3D, polipéptido delta (complejo TiT3) Sec ID Nº 25 constante 2 de receptor gamma de células T /// variable 9 de receptor gamma de células T /// similar a la región PT-gamma-1/2 de la cadena C del receptor gamma de células T /// similar al
precursor de la región PT-gamma-1/2 de la cadena V del receptor gamma de células T /// proteína del marco de lectura alterno de TCR gamma Sec ID Nº 26 Pirina y familia del dominio HIN, elemento 1 Sec ID Nº 27 adaptador 1 de transmembrana asociado al receptor de células T Sec ID Nº 28 elemento 7 de la familia SLAM Sec ID Nº 29 Marco abierto de lectura 7 del Cromosoma 4 Sec ID Nº 30 Complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ alfa 1 Sec ID Nº 31 Locus transcrito Sec ID Nº 32 Amfifisina (síndrome de Stiff-Man con autoantígeno de 128 kDa del cáncer de mama) Sec ID Nº 33 Lectina -1 asociada a las células dendríticas. Cada una de las secuencias anteriores se
proporciona en la Tabla 1A más adelante
Sec ID Nº 34 Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión del fragmento de la lipoproteína D, fragmento Mage3, y cola de histidina
Sec ID Nº 35 Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión del fragmento de la lipoproteína D, fragmento Mage3 y colas de histidina
Sec ID Nº 36 a 43 (encontrado en la descripción) son secuencias de péptidos relevantes para MAGE A3.
Sec ID Nº 44 a 48 son ejemplos de secuencias de oligonucleótidos que contienen un motivo CpG.
Sec ID Nº 49 a 84 (enumeradas en la Tabla 1B) son conjuntos de sondas adecuados para hibridarse a los genes enumerados en la tabla 1.
Tablas 1 a 4, 11 y12 proporciona la lista de genes que están regulados de manera diferencial de acuerdo con la presente solicitud.
Tabla 1A proporciona el listado de secuencia de nucleótidos para cada uno de los genes enumerados en la tabla 1. Tabla 1B proporciona el número identificador del conjunto de sondas (un número de referencia único para la sonda) de sondas (y la secuencia de las mismas) en el que cada sonda es adecuada para identificar genes particulares enumerados en la Tabla 1. Tabla 3A une los genes (y las secuencias de los mismos) de la Tabla 3 y las sondas adecuadas para identificar dichos genes. Tabla 5 proporciona la lista de genes, cebadores y sondas adecuados para uso en el análisis de PCR. Tabla 6 es una lista del gen incluido en la disposición del perfil inmune de TaqMan® (Q-PCR). Tabla 7 proporciona una lista de genes de acuerdo con un aspecto de la solicitud. Tabla 7A proporciona la relación de media geométrica entre los grupos de respondedores y no respondedores para los genes enumerados en la Tabla 7. Tabla 8 proporciona una matriz de correlación para 30 genes. Tabla 9 proporciona una lista de genes de acuerdo con un aspecto de la solicitud. Tabla 9A resultados de la regresión logística para ciertos genes enumerados en la Tabla 9. Tabla 10 muestra el porcentaje de clasificación correcta usando un modelo de regresión logística para los genes enumerados en la Tabla 9. Tabla 11 proporciona una lista de genes de acuerdo con un aspecto de la invención. Tablas 11A y 11B muestran el nivel de expresión génica (basándose en los resultados de 41 conjuntos de sondas) para diversos pacientes. Tablas 12 y 13 muestran las listas de genes que forman aspectos adicionales de la invención. Tabla 14 proporciona una correlación entre los niveles de expresión génica proporcionados en las Tablas 11A y 11B con los resultados clínicos para dichos pacientes.
Anexos Aa C son el código de ordenador para ayudar con el análisis estadístico de las muestras.
El gen MAGE-1 pertenece a una familia de 12 genes estrechamente relacionados, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE 12, localizados sobre el cromosoma X y que comparten entre sí el 64% a 85% de homología en su secuencia de codificación (De Plaen, 1994). Éstos se conocen algunas veces como MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11, MAGE A12 (La familia MAGE A).
Los otros dos grupos de proteínas también son parte de la familia MAGE aunque relacionados más distantemente. Estos son el grupo MAGE B y MAGE C. La familia MAGE B incluye MAGE B1 (también conocido como MAGE Xp1, y DAM 10), MAGE B2 (también conocido como MAGE Xp2 y DAM 6) MAGE B3 y MAGE B4 -la familia Mage C actualmente incluye MAGE C1 y MAGE C2. En términos generales, una proteína de MAGE A se puede definir como que contiene una marca de la secuencia central localizada hacia el extremo C-terminal de la proteína (por ejemplo con respecto a MAGE A1 una proteína de 309 aminoácidos, la marca central corresponde al aminoácido 195-279).
No se deduce simplemente que si el tumor expresa, por ejemplo, Mage el paciente responderá a inmunoterapia basada en un antígeno Mage.
Exposición de la invención
El análisis realizado sobre cánceres / tumores de pacientes antes de recibir inmunoterapia, tal como inmunoterapia Mage, identificó que ciertos genes se expresaron de manera diferencial en pacientes que respondieron bien al tratamiento, en comparación con aquellos pacientes que no respondieron a la inmunoterapia. Los presentes inventores han descubierto una marca / perfil de gen que predice la respuesta probable del paciente a una inmunoterapia apropiada. Más específicamente los presentes inventores han descubierto una marca de gen que predice la supervivencia mejorada después de tratamiento con inmunoterapia específica del antígeno Mage.
De este modo la invención proporciona un perfil génico, de una muestra derivada de un paciente, que es indicativo de una probabilidad aumentada de que el paciente sea un respondedor (o como alternativa un no respondedor) a una inmunoterapia de cáncer, tal como inmunoterapia de Mage, en la que el perfil comprende la expresión diferencial de al menos un gen de activación inmune.
La presente invención proporciona un perfil de predicción en contraste con un perfil de diagnóstico o de pronóstico.
Aunque no se desea estar unido a ninguna teoría se propone la hipótesis de que la marca del gen identificada es de hecho indicativa de una respuesta inmune / inflamatoria, tal como infiltración / activación de células T en los pacientes que se designan como respondedores, por ejemplo, la marca puede representar un marcador de activación de las células T. La presencia de esta respuesta se cree que ayuda al cuerpo del paciente a luchar contra la enfermedad, tal como cáncer, después de la administración de la inmunoterapia por lo tanto haciendo que un paciente sea más sensible a dicha inmunoterapia.
De este modo la marca de la presente invención no se localiza sobre marcadores / genes asociados específicamente a la diagnosis y/o prognosis de la enfermedad relevante, por ejemplo, cáncer tal como oncogenes, sino que por el contrario predice si el paciente responderá a una inmunoterapia apropiada, tal como inmunoterapia de cáncer.
El perfil génico identificado en esta memoria descriptiva para cáncer y los procedimientos para identificar el mismo se cree que son indicadores del microentorno del tumor. El correcto microentorno del tumor parece ser clave para si el paciente responde a la inmunoterapia apropiada de cáncer. La inmunoterapia en el contexto de la invención significa terapia basada en la estimulación de una respuesta inmune, en general a un antígeno, en el que la respuesta da como resultado el tratamiento, mejora y/o retraso de la progresión de una enfermedad asociada a él. Tratamiento en este contexto no incluiría normalmente tratamiento profiláctico.
Inmunoterapia de cáncer en el contexto de esta memoria descriptiva significa inmunoterapia para el tratamiento de cáncer. En un aspecto la inmunoterapia se basa en un antígeno de cáncer de testículos, tal como Mage (descrito en más detalle más adelante).
Esta invención se puede usar para identificar pacientes con cáncer que es probable que respondan a la inmunoterapia apropiada, por ejemplo, pacientes con melanoma, cáncer de mama, de vejiga, de pulmón, NSCLC, de cabeza y de cuello, carcinoma de células escamosas, carcinoma de colon y carcinoma de esófago, tal como en pacientes con cánceres que expresan MAGE. En una realización, la invención se puede usar en un escenario de adyuvante (después de la operación, por ejemplo sin enfermedad) en tales cánceres, particularmente de pulmón y melanoma. La invención también encuentra utilidad en el tratamiento de cánceres en el escenario metastático.
De este modo, en un primer aspecto la invención proporciona un indicador de marca de un paciente con cáncer, designado un respondedor o no respondedor al tratamiento con una inmunoterapia apropiada, comprendiendo la marca la expresión diferencial de CCL5. A modo de ejemplo, en un aspecto adicional, la solicitud proporciona una marca que comprende expresión diferencial de uno o más genes seleccionados entre los genes de activación inmune /respuesta inmune / respuesta inflamatoria, por ejemplo, el grupo de genes indicadores de la infliltración / activación de células T, tal como un gen enumerado (o una lista de genes que comprende o está constituida por) los enumerados en la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 y/o 13 tal como la Tabla 1 ó 2.
La expresión diferencial en el contexto de la presente invención significa que el gen está regulado hacia arriba o regulado hacia abajo en comparación con su expresión normal. Los procedimientos estadísticos para calcular la diferenciación génica se describen más adelante.
El gen de activación inmune se pretende que signifique un gen que facilita, incrementa o estimula una respuesta inmune apropiada. El gen de respuesta inmune y el gen de activación inmune se usan de una manera indistinta en esta memoria descriptiva.
Una técnica importante para el análisis de los genes expresados por las células, tales como células cancerosas / tumorales, es una microdisposición de ADN (también conocida como la tecnología de microprocesador de gen), donde cientos o más secuencias de sondas (tales como 55.000 conjuntos de sondas) se unen a una superficie de vidrio. Las secuencias de sondas son en general todas de 25 meros o 60 meros y son secuencias de genes conocidos. Estas sondas están en general dispuestas en un conjunto de 11 sondas individuales (un conjunto de sondas) y están fijadas en un patrón predeterminado sobre la superficie de vidrio. Una vez expuestas a una muestra biológica apropiada estas sondas se hibridizan al ARN o ADN relevante de un gen particular. Después de lavar, el microprocesador se “lee” mediante un procedimiento adecuado y se registra una cantidad tal como la intensidad de color. La expresión diferencial de un gen particular es proporcional a la medida / intensidad registrada. Esta tecnología se describe en más detalle más adelante.
Una vez que se ha identificado un gen / perfil diana existen varios procedimientos analíticos para medir si el gen (s) se expresa (n) de manera diferencial. Estas técnicas analíticas incluyen reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real, también llamada reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR o Q-PCR), que se usa para cuantificar y amplificar de manera simultánea una parte específica de una molécula de ADN dada presente en la muestra.
El procedimiento sigue el patrón general de la reacción en cadena de la polimerasa, pero el ADN se cuantifica después de cada ronda de amplificación (el aspecto de “tiempo real”). Dos procedimientos comunes de cuantificación son el uso de tintes fluorescentes que se intercalan con el ADN de doble cadena, y sondas de oligonucleótidos de ADN modificado que presentan fluorescencia cuando se hibridizan con un ADN complementario.
La idea básica detrás de la reacción en cadena de la polimerasa de tiempo real es que cuanto más abundante sea un ADNc particular (y de este modo ARNm) en una muestra, más pronto se detectará durante los ciclos repetidos de amplificación. Existen diversos sistemas que permiten la amplificación de ADN a seguir y a menudo implican el uso de un tinte fluorescente que se incorpora en las moléculas de ADN recientemente sintetizadas durante la amplificación de tiempo real. Las máquinas de reacción en cadena de la polimerasa de tiempo real, que controlan el proceso de termociclación, pueden detectar después la abundancia de ADN fluorescente, y de esta manera el progreso de amplificación de una muestra dada. Típicamente, la amplificación de un ADNc dado con el tiempo sigue una curva, con una fase plana inicial, seguido de una fase exponencial. Finalmente a medida que los reactivos del experimento se agotan, la síntesis de ADN y se ralentiza y la curva exponencial se aplana dando una meseta.
Como alternativa el ARNm o producto proteico del (de los) gen (es) diana se puede medir mediante análisis de transferencia de Northern, transferencia de Western y/o inmunohistoquímica.
En un aspecto el análisis para identificar el perfil/marca se realiza en una muestra de paciente en el que se expresa un antígeno de cáncer de testículos.
Si un gen está siempre regulado hacia arriba, o regulado hacia abajo en pacientes que se considera que son respondedores (o como alternativa no respondedores) entonces este único gen se puede usar para establecer si el paciente es un respondedor o un no respondedor una vez que se establece un umbral y siempre que la separación de los dos grupos sea adecuada.
Cuando se analiza un único gen, por ejemplo, mediante Q-PCR entonces la expresión génica se puede normalizar con referencia a un gen que permanece constante, por ejemplo genes con el símbolo H3F3A, GAPDH, TFRC, GUSB o PGK1. La normalización se puede realizar restando el valor obtenido para el gen constante del valor obtenido para el gen bajo consideración. Se puede establecer un umbral representando gráficamente una medida de la expresión del gen relevante para cada paciente. En general los respondedores y no respondedores se agruparán alrededor de un eje/punto focal diferente. Se puede establecer un umbral en el hueco entre los agrupamientos mediante procedimientos estadísticos clásicos o simplemente representando gráficamente una “línea del mejor ajuste” para establecer el campo medio entre los dos grupos. Los valores, por ejemplo, por encima del umbral predefinido se pueden designar como respondedores, y los valores, por ejemplo, por debajo del umbral predefinido se pueden designar como no respondedores.
A modo de ejemplo, en un aspecto la solicitud describe un perfil génico para identificar un respondedor que comprende uno o más de dichos genes en el que el 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ó 100% del (de los) gen (es) está (n) regulado (s) hacia arriba.
Los genes enumerados en la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 y/o 13 tal como la Tabla 1, 2 y/o 3 están generalmente regulados hacia arriba en los respondedores.
La robustez del procedimiento predictivo de la invención se puede además mejorar para tamaños de muestra mayores empleando 2, 3, 4, 5, 6, etc. genes de la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 y/o 13 tal como la Tabla 1 ó 2.
Además, una vez que al menos dos genes expresados de manera diferencial estén incluidos en la marca entonces se pueden usar procedimientos de agrupamiento estadísticos para diferenciar los respondedores de los no respondedores. Los procedimientos para el agrupamiento estadístico y software para los mismos se describen más adelante.
Un parámetro usado en la cuantificación de la expresión diferencial de los genes es el cambio en número de veces, que es una medida métrica para comparar el nivel de expresión del ARNm de un gen entre dos condiciones experimentales distintas. Su definición aritmética difiere entre los investigadores. Sin embargo, cuanto mayor es el cambio en número de veces más probable es que se separe de manera adecuada la expresión diferencial de los genes relevantes, haciendo más fácil de decidir en qué categoría (respondedor o no respondedor) se encuentra el paciente.
El cambio en número de veces puede, por ejemplo, ser al menos 10, al menos 15, al menos 20 ó 30.
Otro parámetro también usado para cuantificar la expresión diferencial es el valor de “p”. Se cree que cuanto menor es el valor de más probable es que se exprese de manera diferencial el gen, que lo hará que sea un buen candidato
para uso en los perfiles de la invención. Los valores de P, pueden, por ejemplo, incluir 0,1 ó menos, tal como 0,05 o menos, en particular 0,01 o menos. Los valores de p como se usa en esta memoria descriptiva incluyen valores de “P” corregidos y/o valores de “P” sin corregir.
A modo de ejemplo, en un aspecto, la solicitud describe un procedimiento para la detección de una marca de gen en una muestra biológica, comprendiendo el procedimiento el análisis de la expresión de al menos 5 genes como se establece en la Tabla 1. Como alternativa uno o más genes se pueden seleccionar entre la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 y/o 13 tal como la Tabla 1 ó 2.
De este modo en un aspecto la invención proporciona un procedimiento para identificar un paciente respondedor o no respondedor a la inmunoterapia de cáncer, que comprende las etapas:
a.
analizar una muestra derivada de expresión diferencial de CCL5. un paciente que contiene células tumorales o cancerosas para la
b.
caracterizar al paciente como un respondedor o no respondedor en base a los resultados de la etapa (a), en la que la caracterización se realiza por referencia o comparación con un patrón y en la que la muestra derivada del paciente se obtiene antes de que el paciente reciba la inmunoterapia del cáncer.
Respondedor en el contexto de la presente invención incluye las personas en las que el cáncer / tumor (es) está erradicado (s), reducido (s) o mejorado (s) (respondedor mixto o respondedor parcial) o simplemente estabilizado(s) de manera que la enfermedad no progrese. En los respondedores en los que el cáncer está estabilizado el período de estabilización es tal que la calidad de vida y/o la esperanza de vida de los pacientes aumenta (por ejemplo enfermedad estable durante más de 6 meses) en comparación con un paciente que no recibe tratamiento.
La respuesta clínica parcial con respecto al cáncer es aquella en la que los tumores / cánceres responden al tratamiento, por ejemplo donde el cáncer se reduce en el 30, 40, 50, 60% o más. El respondedor clínico mixto con respecto al cáncer se define como aquel en el que alguno de los tumores/cánceres responden al tratamiento y/u otros permanecen sin cambiar o progresar.
Las definiciones convencionales están disponibles para los respondedores, respondedores parciales y respondedores mixtos al tratamiento de cáncer. Estas definiciones convencionales se aplican en esta memoria descriptiva salvo que en el contexto esté claro que no se aplican.
Como se usa en esta memoria descriptiva, los procedimientos para predecir una respuesta clínica favorable o para identificar los sujetos que más probablemente responden a la terapia, no significa que implique un 100% de capacidad predictiva, sino que indica que los sujetos con ciertas características es más probable que experimenten una respuesta clínica favorable a una terapia especificada que los sujetos que carecen de tales características. Sin embargo, como será evidente para los expertos en la técnica, algunos individuos identificados que experimentan más probablemente una respuesta clínica favorable pueden no obstante no demostrar respuesta clínica medible al tratamiento. De manera similar, algunos individuos que se predice que son no respondedores pueden no obstante mostrar una respuesta clínica favorable al tratamiento.
Como se usa en esta memoria descriptiva, una ‘respuesta favorable’ (o ‘respuesta clínica favorable’) a, por ejemplo, un tratamiento anticáncer se refiere a una respuesta biológica o física que está reconocida por los expertos en la técnica por indicar una disminución de la velocidad de crecimiento del tumor, comparada con el crecimiento del tumor que se producirían con un tratamiento alternativo o en ausencia de cualquier tratamiento. “Respuesta clínica favorable” como se usa en esta memoria descriptiva no es sinónimo de una cura, pero incluye respuesta parcial, Respuesta Mixta o Enfermedad Estable. Una respuesta clínica favorable a la terapia puede incluir una disminución de los síntomas experimentada por el sujeto, un incremento en el tiempo de supervivencia esperado o logrado, una disminución de la velocidad de crecimiento del tumor, cese de crecimiento del tumor (enfermedad estable), regresión en el número o masa de lesiones metastáticas, y/o regresión de la masa tumoral global (cada una comparada con la que se produciría en la ausencia de terapia, o en respuesta a una terapia alternativa).
Los pacientes en necesidad de tratamiento para, por ejemplo, un tumor que expresa Mage, cuyas células tumorales tienen una marca de gen descrita en esta memoria descriptiva como una marca “Respondedora” es más probable que tengan respuesta clínica favorable, comparados con los pacientes cuyas células tumorales muestran una marca de gen descrita en esta memoria descriptiva como una marca “No Respondedora”, cuando se trata con inmunoterapia específica de Mage. No-respondedor en el contexto de la presente invención incluye personas cuyos síntomas, es decir, cánceres / tumores no están mejorados o estabilizados.
Opcionalmente la caracterización del paciente como un respondedor o no respondedor se puede realizar por referencia a un “patrón” o conjunto de entrenamiento. El patrón puede ser el perfil de una persona / paciente que se sabe que es un respondedor o no respondedor o como alternativa puede ser un valor numérico. Tales patrones predeterminados se pueden proporcionar en cualquier forma adecuada, tal como una lista impresa o diagrama,
programa software de ordenador, u otro medio.
El conjunto de entrenamiento en el contexto de la presente memoria descriptiva se pretende que se refiera a un grupo de muestras para las que los resultados clínicos pueden estar correlacionados con el perfil del gen y se pueden emplear para entrenamiento de un modelo / programa estadístico apropiado para identificar respondedores y /o no respondedores para muestras nuevas. Las Tablas 11A, 11B y 14 contienen la información de conjuntos de entrenamiento relevantes para el modelo de conjuntos de 41 sondas descrito en el ejemplo 4.
En un aspecto se emplea un modelo matemático / algoritmo / procedimiento estadístico para caracterizar al paciente como respondedor o no-respondedor.
A modo de ejemplo, en un aspecto, la solicitud describe un perfil basado en uno o más genes de activación inmune, tal como 5 o más de tales genes.
A modo de ejemplo, en un aspecto, la solicitud describe un perfil basado en los genes de la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 y/o 13 tal como la Tabla 1 ó 2.
A modo de ejemplo, en un aspecto, la solicitud describe un perfil basado en 489 sondas (enumeradas en la Tabla 4B) y/o aproximadamente 480 genes como se enumera en la Tabla 4.
De acuerdo con un aspecto, la presente solicitud proporciona una marca gen indicadora de la supervivencia mejorada de pacientes con cánceres que expresan Mage después del tratamiento con inmunoterapia específica de Mage. Esta marca de gen, de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30, ó 31, genes de los genes descritos en la Tabla 1, se caracteriza por la expresión diferencial comparada con la marca del gen de pacientes de tumores que expresan MAGE que no responden a inmunoterapia de cáncer específica de antígeno de Mage. La supervivencia mejorada es probable que sea un corolario de una respuesta a la inmunoterapia administrada, si el paciente es de hecho un respondedor.
TABLAS CON LISTAS DE GENES
En un aspecto, la solicitud se refiere a uno o más genes enumerados en la Tabla 1
Tabla 1
Título del gen Sec Id nº
1.1 marco abierto de lectura 190 del cromosoma 6 1
1.2 sustrato 1 de Lyn específico de las células hematopoyéticas 2
1.3 receptor de la interleuquina 2, gamma (inmunodeficiencia combinada grave) 3
1.4 antígeno CD52 (antígeno CAMPATH-1) /// antígeno CD52 (antígeno CAMPATH-4 1)
1.5 antígeno CD2 (p50), receptor de glóbulos rojos de oveja /// antígeno CD2 (p50), 5 receptor de glóbulos rojos de oveja
1.6 ubiquitina D 6
1.7 transductor de señal y activador de la transcripción 4 7
1.8 granzima K (granzima 3; triptasa II)/// granzima K (granzima 3; triptasa II) 8
1.9 antígeno CD3G, polipéptido gamma (complejo TiT3) 9
1.10 receptor 171 acoplado a la proteína G 10
1.11 Proteína quinasa C, beta 1 11
1.12 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DR alfa /// complejo de 12 histocompatibilidad principal, clase II, DR alfa
1.13 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ beta 1 /// complejo de 13 histocompatibilidad principal, clase II, DQ beta 1
1.14 alcohol deshidrogenasa IB (clase I), beta polipéptido 14
1.15 Constante del receptor alfa de células T /// Constante del receptor alfa de células 15 T
1.16 antígeno CD69 (p60, antígeno de activación temprana de células T) 16
1.17 Proteína quinasa C, theta 17
1.18 variable 19 del receptor beta de células T /// constante 1 del receptor beta de 18 células T
1.19 locus del receptor alfa de células T /// variable 2 del receptor delta de células T /// 19 variable 20 del receptor alfa de células T /// unión 17 del receptor alfa de células T /// constante del receptor alfa de células T
1.20 constante 2 del receptor gamma de células T 20
1.21 variable 21-1 del receptor beta de células T /// variable 19 del receptor beta de 21 células T /// variable 5-4 del receptor beta de células T /// variable 3-1 del receptor beta de células T /// constante 1 del receptor beta de células T
1.22 locus del receptor alfa de células T 22
1.23 variable 19 del receptor beta de células T /// variable 19 del receptor beta de 23 células T /// constante 1 del receptor beta de células T /// constante 1 del receptor beta de células T
1.24 antígeno CD3D, delta polipéptido (complejo TiT3) 24
1.25 constante 2 del receptor gamma de células T /// variable 9 del receptor gamma de 25 células T /// similar a la región PT-gamma-1/2 de la cadena C del receptor gamma de células T /// similar al precursor de la región PT-gamma-1/2 de la cadena V del receptor gamma de células T /// proteína del marco de lectura alternativo de TCR gamma
1.26 pirina y familia del dominio HIN, elemento 1 26
1.27 adaptador 1 de transmembrana asociado al receptor de células T 27
1.28 elemento 7 de la familia SLAM 28
1.29 marco abierto de lectura 7 del cromosoma 4 29
1.30 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ alfa 1 30
1.31 Locus trascrito 31
1.32 Amfifisina (síndrome de Stiff-Man con autoantígeno de 128kDa de cáncer de 32 mama)
1.33 lectina 1 asociada a células dendríticas
La Tabla 1A al final de esta memoria descriptiva proporciona la secuencia de nucleótidos completa para cada uno de los genes anteriores. A modo de ejemplo, en un aspecto, la solicitud describe un perfil basado en la expresión diferencial de 1 o más de los 62 genes identificados en la bibliografía, que se refiere a la infiltración y activación inmune. A modo de ejemplo, en otro aspecto la solicitud describe un perfil basado en los genes enumerados en la Tabla 2.
Tabla 2: Símbolo del gen Título del gen Sec Id nº
2.1 HLA-DQA1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ alfa 1 30
2.2 TRBV3-1 variable 3-1 del receptor beta de células T 21
2.3 IL2RG 3
receptor de interleuquina 2, gamma (inmunodeficiencia combinada grave)
2.4 CD2 antígeno CD2 (p50), receptor de glóbulos rojos de oveja 5
2.5 GPR171 receptor 171 acoplado a la proteína G 10
2.6 ADH1B alcohol deshidrogenasa IB (clase I), beta polipéptido 14
2.7 CD69 antígeno CD69 (p60, antígeno de activación temprana de células T) 16
2.8 TRBV19 variable 19 receptor beta de células T 18
2.9 TRAT1 adaptador 1 de transmembrana asociada al receptor de células T 27
2.10 C4orf7 marco abierto de lectura 7 del cromosoma 4 29
2.11 PRKCB1 proteína quinasa C, beta 1 11
2.12 CD3D antígeno CD3D, delta polipéptido (complejo TiT3) 24
2.13 UBD ubiquitina D 6
A modo de ejemplo, en un aspecto, la solicitud proporciona la lista de genes en la Tabla 3.
Tabla 3 Símbolo del gen Título del gen
3.1 CD52 molécula de CD52 /// molécula de CD52
3.2 UBD receptor de ácido gamma-aminobutírico (GABA) B, 1 /// ubiquitina D
3.3 STAT4 transductor de señal y activador de la transcripción 4
3.4
GZMK granzima K (granzima 3; triptasa II) /// granzima K (granzima 3; triptasa II)
3.5 GPR171 receptor 171 acoplado a la proteína G
3.6 PRKCQ proteína quinasa C, theta
3.7 TRA@ /// TRDV2 ///
locus del receptor alfa de células T /// variable 2 del receptor delta de TRAV20 /// TRAC
células T /// variable 20 del receptor alfa de células T /// constante del receptor alfa de células T
3.8 TRGC2 /// TRGV2 /// constante 2 del receptor gamma de células T /// variable 2 del TRGV9 /// TARP /// receptor gamma de células T /// variable 9 del receptor gamma de LOC642083 células T /// proteína del marco de lectura alternativo de TCR gamma /// proteína hipotética LOC642083
3.9
variable 21-1 del receptor beta de células T /// variable 19 del
TRBV21-1 /// TRBV19 TRBV5-4 /// TRBV3-1 ///
/// receptor beta de células T /// variable 5-4 del receptor beta de células T /// variable 3-1 del receptor beta de células T /// constante 1 del receptor beta de células T /// similar al precursor de la región
CTL-L17 de la cadena V del receptor beta de células T
3.10 TRBV19 /// TRBC1 variable 19 del receptor beta de células T /// variable 19 del receptor beta de células T /// constante 1 del receptor beta de células T /// constante 1 del receptor beta de células T
3.11 CD3D molécula CD3d, delta (complejo CD3-TCR)
3.12 TRAT1 adaptador 1 de transmembrana asociado al receptor de células T
A modo de ejemplo, en un aspecto, la solicitud proporciona un perfil basado en uno o más genes de la Tabla 4
Tabla 4 Símbolo del gen Título del gen
4.1 FLJ20647 NA 4,2 NAV1 navegador 1 de neuronas
4.3 GPR171 receptor 171 acoplado a la proteína G
4.4 CCL14 ligando 14 de la quimioquina (motivo C-C)
4.5 C1S componente 1 de complemento, subcomponente s
4.6 CXCL2 ligando 2 de quimioquina (motivo C-X-C)
4.7 TRBV3-1 variable 3-1 del receptor beta de células T
4.8 TRDV2 variable 2 del receptor delta de células T
4.9 RUFY3 RUN y dominio FYVE que contiene 3
4.10 DOCK8 dedicador de citoquinesis 8
4.11 GCH1 GTP ciclohidrolasa 1 (distonía sensible a dopa)
4.12 CENTD3 centaurina, delta 3
4.13 ACSL5 elemento 5 de la familia de larga cadena de la acil-CoA sintetasa
4.14 AMICA1 molécula de adhesión, interactúa con el antígeno 1 de CXADR
4.15 IL2RG receptor de la interleuquina 2, gamma (inmunodeficiencia combinada grave)
4.16 TNFAIP3 factor de necrosis tumoral, proteína 3 inducida por alfa
4.17 PSCDBP homología de pleckstrina, Sec7 y dominios enrollados en espiral, proteína de unión
4.18 ESR1 receptor 1 de estrógeno
4.19 TRBC1 constante 1 del receptor beta de células T
4.20 CD52 antígeno CD52 (antígeno CAMPATH-1)
4.21 LOC442535 NA
4.22 TRBV19 variable 19 del receptor beta de células T
4.23
IL7R receptor de la interleuquina 7
4.24
TRAC constante del receptor alfa de células T
4.25
NCF2 factor 2 citosólico de neutrófilos (65kDa, enfermedad granulomatosa
crónica, autosómica 2)
4.26
LOC92689 NA
4.27
GZMK c("granzima K (granzima 3", " triptasa II)")
4.28
NA NA (gen identificado por la sonda 235831_at)
4.29
RAB34 RAB34, familia de oncogenes del elemento RAS
4.30
DPT dermatopontina
4.31
PVT1 homólogo del oncogén Pvt1, activador MYC (ratón)
4.32
TRGC2 constante 2 del receptor gamma de células T
4.33
GIMAP5 GTPasa, elemento 5 de la familia IMAP
4.34
CD52 antígeno CD52 (antígeno CAMPATH-1)
4.35
CD3D antígeno CD3d, polipéptido delta (complejo TiT3)
4.36
TMEM132C proteína 132C de transmembrana
4.37
NFKBIA factor nuclear del potenciador de genes de polipéptidos ligeros kappa
en inhibidor de células B, alfa
4.38
TRA@ locus del receptor alfa de células T
4.39
TRAT1 adaptador 1 de transmembrana asociada al receptor de células T
4.41
RAB34 RAB34, familia de oncogenes del elemento RAS
4.42
CD69 antígeno CD69 (p60, antígeno de activación temprana de células T)
4.43
DOCK8 dedicador de citoquinesis 8
4.45
IRF8 factor 8 de regulación de interferón
4.46
KLRB1 subfamilia B del receptor de tipo lectina de células asesinas ,
elemento 1
4.47
NA NA
4.48
ITGA3 integrina, alfa 3 (antígeno CD49C, subunidad alfa 3 del receptor VLA
3)
4.49
MAP3K8 Proteína quinasa quinosa quinasa 8 activada por mitógenos
4.50
C1orf162 marco abierto de lectura 162 del cromosoma 1
4.51
UBD ubiquitina D
4.52
TRGV9 variable 9 del receptor gamma de células T
4.54
ARHGAP9 proteína 9 que activa la Rho GTPasa
4.55
TIFA NA
4.56
DPT dermatopontina
4.57
NA NA (gen identificado por la sonda 1569942_at)
4.58
GIMAP4 GTPasa, elemento 4 de la familia IMAP
4.59
HCLS1 substrato 1 de Lyn específico de las células hematopoyéticas
4.60
PRKCH proteína quinasa C, eta
4.61
STAT4 transductor y activador de señal de transcripción 4
4.62
HLA-DQA1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ alfa 1
4.63
ADRB2 adrenérgico, beta-2-, receptor, superficie
4.64
NA NA
4.65
CTSW catepsina W (limfopaína)
4.66
MYH11 miosina, polipéptido 11 pesado, músculo liso
4.67
GIMAP6 GTPasa, elemento 6 de la familia IMAP
4.68
HLA-DQB1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ beta 1
4.69
CD8A antígeno CD8, polipéptido alfa (p32)
4.70
TNFAIP3 factor de necrosis tumoral, proteína 3 inducida por alfa
4.71
CP ceruloplasmina (ferroxidasa)
4.72
SMOC2 unión 2 de calcio modular relacionado con SPARC
4.73
C20orf24 marco abierto de lectura 24 del cromosoma 20
4.74
C16orf54 marco abierto de lectura 54 del cromosoma 16
4.75
CD2 antígeno CD2 (p50), receptor de glóbulos rojos de oveja
4.76
SLIT3 homólogo 3 dividido (Drosophila)
4.77
BAALC cerebro y leucemia aguda, citoplásmico
4.78
TRIB3 homólogo 3 de tribbles (Drosophila)
4.79
LOC440160 NA
4.80
C6orf190 marco abierto de lectura 190 del cromosoma 6
4.81
TAGAP proteína de activación de la GTPasa de activación de células T
4.82
FAM92A1 familia con similitud de secuencia 92, elemento A1
4.83
PSTPIP2 proteína 2 de interacción de la prolina -serina -treonina fosfatasa
4.84
PTPRC proteína tirosina fosfatasa, tipo de receptor, C
4.85
HLA-DRA complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DR alfa
4.86
EFCAB2 EF-calcio de la mano que se une al dominio 2
4.87
TNFAIP8 factor de necrosis tumoral, proteína 8 inducida por alfa
4.88
SLIC1 NA
4.89
CD1C antígeno CD1c
4.90
TRAF3IP3 TRAF3 que interactúa con la proteína 3 1
4.95
IGJ polipéptido de la inmunoglogulina J, proteína de engarce para la
inmunoglobulina alfa y polipéptidos mu
4.96
PLEK pleckstrina
4.98
TMEM44 proteína 44 de transmembrana
4.99
TRA@ locus del receptor alfa de células T
4.100
EBI2 gen 2 inducido por el virus de Epstein-Barr (receptor acoplado a la
proteína G específica de linfocitos)
4.101
SAMSN1 dominio SAM, dominio SH3 y señales de localización nuclear, 1
4.102
KIAA1794 KIAA1794
4.103
ALDH2 familia de la aldehído deshidrogenasa 2 (mitocondrial)
4.104
CDC42SE2 efector 2 pequeño de CDC42
4.105
GFRA1 receptor alfa 1 de la familia GDNF
4.106
ITK quinasa de las células T inducible por IL2
4.107
HLA-DRA complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DR alfa
4.108
GIMAP7 GTPasa, elemento 7 de la familia IMAP
4.109
FLJ20273 NA
4.110
PTPN6 proteína tirosina fosfatasa, tipo 6 no-receptor
4.111
PTGER3 receptor 3 de la prostaglandina E (subtipo EP3)
4.113
LGALS2 lectina, unión de galactósido, soluble, 2 (galectina 2)
4.114
HMOX1 hemo oxigenasa (desciclación) 1
4.115
NA NA (gen identificado por la sonda 227995_at)
4.116
ZNFN1A1 proteína de dedos de cinc, subfamilia 1A, 1 (Ikaros)
4.117
CSF2RB receptor del factor 2 de estimulación de colonias, beta, baja afinidad
(granulocito-macrófago)
4.118
PCSK5 subtilisina de la proproteína convertasa /tipo 5 de kexina
4.119
CCDC69 dominio enrollado en espiral que contiene 69
4.120
CDC42SE2 Efector 2 pequeño de CDC42
4.121
GZMA granzima A (granzima 1, serina esterasa 3 asociada a linfocitos de
células T citotóxicos)
4.122
C3 componente 3 de complemento
4.124
C15orf48 marco acierto de lectura 48 del cromosoma 15
4.125
RARRES3 respondedor del receptor del ácido retinoico (inducido 3 de tazaroteno)
3
4.126
LOC283537 NA
4.127
CXCL12 ligando 12 de la quimioquina (motivo C-X-C) (factor 1 derivado de
células del estroma)
4.129
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 231882_at)
4.130
SOD2 dismutasa 2 de superóxidos, mitocondrial
4.131
CTSS catepsina S
4.132
CTBP2 proteína 2 de unión C-terminal
4.133
BCL11B CLL de células B/linfoma 11B (proteína de dedos de cinc)
4.134
CCL22 ligando 22 de quimioquina (motivo C-C)
4.135
ACSL5 elemento 5 de la familia de cadena larga de la acil-CoA sintetasa
4.136
DOC1 NA
4.137
SLC31A2 familia 31 del vehículo de soluto (transportadores de cobre), elemento
2
4.138
POPDC3 dominio Popeye que contiene 3
4.140
SQRDL tipo sulfuro quinona reductasa (levadura)
4.141
RASGEF1B familia del dominio RasGEF, elemento 1B
4.142
FGL2 fibrinógeno-de tipo 2
4.143
C10orf128 marco abierto de lectura 128 del cromosoma 10
4.144
IL10RA receptor de la interleuquina 10, alfa
4.145
EGFL6 dominio de tipo EGF, múltiple 6
4.146
IL18 interleuquina 18 (factor de inducción gamma del interferón)
4.147
ARHGAP30 proteína 30 que activa la Rho GTPasa
4.148
PALMD palmdelfina
4.149
RASSF5 familia 5 del dominio de asociación Ras (RalGDS/AF-6)
4.150
GATA3 proteína 3 de unión a GATA
4.166
ADCY7 adenilato ciclasa 7
4.167
MS4A6A membrana-de extensión 4-dominios, subfamilia A, elemento 6A
4.168
CPA3 carboxipeptidasa A3 (mastocitos)
4.169
PIM1 pim-1 oncogén
4.170
CCL19 ligando 19 de quimioquina (motivo C-C)
4.171
SYK tirosina quinasa de bazo
4.173
SIT1 umbral de señalización que regula el adaptador 1 de transmembrana
4.174
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 228812_at)
4.175
NAP1L2 proteína 1 del ensamblaje de nucleosoma 1-tipo 2
4.176
CCL13 ligando 13 de quimioquina (motivo C-C)
4.177
SLA Src-tipo adaptador
4.178
NOD3 NA
4.179
PRKCH proteína quinasa C, eta
4.180
TRD@ locus del receptor delta de las células T
4.181
BAALC cerebro y leucemia aguda, citoplásmico
4.182
RP1-93H18.5 NA
4.183
FLJ20701 NA
4.184
SH3TC2 dominio SH3 y repeticiones 2 de tetratricopéptido
4.185
CCR2 receptor 2 de quimioquina (motivo Motivo C-C)
4.186
CCL5 ligando 5 de quimioquina (motivo C-C)
4.187
HLA-DPA1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DP alfa 1
4.189
PECAM1 molécula de adhesión a plaquetas/células endoteliales (antígeno
CD31)
4.190
AMIGO2 molécula de adhesión con el dominio 2 de tipo Ig
4.191
CCDC69 dominio enrollado en espiral que contiene 69
4.192
CLEC7A familia 7 del dominio de lectina de tipo C, elemento A
4.193
P2RY14 receptor P2Y purinérgico, acoplado a la proteína G, 14
4.194
PIK3AP1 proteína 1 del adaptador de fosfoinositido-3-quinasa
4.195
ADH1B alcohol deshidrogenasa IB (clase I), polipéptido beta
4.196
TOP1MT topoisomerasa (ADN) I, mitocondrial
4.197
CD276 antígeno CD276
4.198
HLA-DQB1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ beta 1
4.199
JAM2 molécula 2 de adhesión de unión
4.200
C1S componente 1 de complemento, subcomponente s
4.201
MS4A6A membrana-de extensión 4-dominios, subfamila A, elemento 6A
4.202
TGFBR3 factor de crecimiento de transformación, receptor III beta (betaglicano,
300kDa)
4.203
ITGAL c("integrina, alfa L (antígeno CD11A (p180), antígeno 1 asociado a la
función de linfocito", " polipéptido alfa)")
4.204
IL1R1 receptor de interleuquina 1 receptor, tipo I
4.205
MS4A6A membrana-de extensión 4-dominios, subfamila A, elemento 6A
4.206
HLA-DRB1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DR beta 1
4.207
GIMAP2 GTPasa, elemento 2 de la familia IMAP
4.208
ZC3H12D 12D que contiene tipo CCCH de dedos de cinc
4.209
PCDH9 protocadherina 9
4.210
SLAMF7 elemento 7 de la familia SLAM
4.211
MGC7036 NA
4.212
RGS18 regulador de la señalización 18 de la proteína G
4.213
HLA-DQA1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ alfa 1
4.214
CD53 antígeno CD53
4.215
MPEG1 NA
4.216
SSBP4 proteína 4 de unión a ADN de una cadena
4.217
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 231262_at)
4.218
CDH19 cadherina 19, tipo 2
4.219
CTBP2 proteína 2 de unión C-terminal
4.221
FAM107B familia con similitud de secuencia 107, elemento B
4.222
IGKC constante kappa de inmunoglobulina
4.223
ITGAM integrina, alfa M (subunidad del receptor 3 del componente 3 de
complemento)
4.224
CKAP1 proteína 1 asociada a citoesqueleto
4.225
HLA-DRB1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DR beta 1
n4.227
MGC16291 NA
4.228
DDEF2 factor 2 de potenciación del desarrollo y diferenciación
4.229
TNFAIP2 factor de necrosis tumoral, proteína 2 inducida por alfa
4.230
CXCL14 ligando de quimioquina (motivo C-X-C)
4.231
CD209 antígeno CD209
4.232
COL9A3 colágeno, tipo IX, alfa 3
4.233
ANKRD22 dominio 22 de repetición de ankirina
4.234
NCKAP1L tipo proteína 1 asociada a NCK
4.235
CMKOR1 receptor 1 huérfano de quimioquina
4.236
HLA-DRB5 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DR beta 5
4.237
LCP1 proteína citosólica de linfocitos (L-plastina)
4.238
ADH1B alcohol deshidrogenasa IB (clase I), beta polipéptido
4.239
CXXC5 dedo 5 de CXXC
4.240
GJA7 proteína de unión de hueco, alfa 7, 45kDa (conexina 45)
4.241
FGD2 FYVE, RhoGEF y dominio PH que contiene 2
4.242
MAN1A1 mannosidasa, alfa, clase 1A, elemento 1
4.243
C6orf115 marco abierto de lectura 115 del cromosoma 6
4.245
CXCL9 ligando 9 de quimioquina (motivo C-X-C)
4.247
NPR3 receptor C de péptido natriurético /guanilato ciclasa C (receptor C de
péptido atrionatriurético)
4.248
FYB proteína de unión de FYN (FYB-120/130)
4.249
VCAM1 molécula 1 de adhesión de células vasculares
4.250
FLI1 integración 1 del virus de leucemia de Friend
4.251
CXXC5 CXXC dedo 5 de CXXC
4.252
TRAM2 proteína 2 de membrana asociada a la translocación
4.254
SHC4 familia SHC (que contiene el dominio de homología a Src), elemento 4
4.255
SLC9A9 familia 9 del vehículo de soluto (intercambiador sodio/hidrógeno),
elemento 9
4.256
PTPRC proteína tirosina quinasa, tipo de receptor, C
4.257
PTGER4 receptor 4 de la prostaglandina E (subtipo EP4)
4.258
LILRB1 receptor de tipo inmunoglobulina de leucocitos, subfamila B (con
dominios TM y ITIM), elemento 1
4.259
PRDM1 dominio PR que contiene 1, con dominio ZNF
4.261
ARHGAP15 proteína 15 que activa la Rho GTPasa
4.262
SLC5A3 familia 5 de vehículo de soluto (transportadores de inositol), elemento
3
4.263
DOCK9 dedicador de citoquinesis 9
4.264
GPSM1 modulador 1 de señalización de la proteína G (tipo AGS3, C. elegans)
4.265
CCL5 ligando 5 de quimioquina (motivo C-C)
4.266
GLIPR1 1 relacionado con la patogénesis de GLI (glioma)
4.267
APOL3 apolipoproteina L, 3
4.268
HLA-DMB complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DM beta
4.269
SYNPO2 sinaptopodina 2
4.270
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 221651_x_at)
4.271
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 231929_at)
4.272
RP1-93H18.5 NA
4.273
CASP1 caspasa 1, cisteína peptidase relacionada con apoptosis
(interleuquina 1, beta, convertasa)
4.274
PRKCQ proteína quinasa C, theta
4.275
IL1R2 receptor de la interleuquina 1, tipo II
4.276
CARD15 familia del dominio del reclutamiento de caspasa , elemento 15
4.277
ARHGDIB inhibidor (GDI) beta de la disociación de Rho GDP
4.278
HLA-DRB4 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DR beta 4
4.279
SART2 antígeno de carcinoma de células escamosas reconocido por las
células T 2
4.280
LSP1 proteína 1 específica de leucocitos
4.281
AMPD3 adenosina monofosfato desaminasa (isoforma E)
4.282
SEMA4F dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio de
transmembrana (TM) y dominio citoplásmico corto, (semaforina) 4F
4.283
ISOC1 dominio isocorismatasa que contiene 1
4.285
HPS3 síndrome 3 de Hermansky-Pudlak
4.288
HOXB7 homeobox B7
4.290
ZNFN1A1 proteína de dedos de cinc, subfamila 1A, 1 (Ikaros)
4.291
ARHGAP9 proteína 9 que activa la Rho GTPasa
4.292
GATA2 proteína 2 de unión a GATA
4.293
AP2B1 complejo 2 de proteína relacionada con el adaptador, subunidad de
beta 1
4.294
CTSC catepsina C
4.295
PLK2 quinasa 2 de tipo polo (Drosophila)
4.296
CD4 antígeno CD4 (p55)
4.297
GGTA1 glicoproteína, alfa-galactosiltransferasa 1
4.298
GADD45B detención del crecimiento inducible del daño del ADN, beta
4.300
FLJ10847 NA
4.301
KIF21B elemento 21B de la familia de quinesina
4.302
CCND2 ciclina D2
4.303
PRG1 proteoglicano 1, gránulo secretor
4.304
SLC40A1 familia 40 de vehículo de soluto (transportador regulado por soluto),
elemento 1
4.307
CRIP1 proteína 1 rica en cistina (intestinal)
4.308
LOC283070 NA
4.309
SIGLEC1 lectina 1 de tipo Ig de unión a ácido siálico ,
4.310
ZNF11B proteína 11B de dedos de cinc de sialoadhesina
4.311
CXCR4 receptor 4 de quimioquina (motivo Motivo C-X-C)
4.312
HLA-DMA complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DM alfa
4.313
MRC1 receptor de manosa, C tipo 1
4.315
LMO2 dominio solamente 2 de LIM (tipo 1 de rhombotina)
4.315
DENND2D dominio DENN/MADD que contiene 2D
4.316
CCL18 ligando 18 de quimioquina (motivo C-C) (pulmonar y regulado por la
activación)
4.317
P2RY13 receptor P2Y purinérgico, acoplado a la proteína G, 13
4.319
ANGPTL1 tipo 1 de angiopoyetina
4.320
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 230391_at)
4.322
C8orf51 marco abierto de lectura 51 del cromosoma 8
4.323
GIMAP8 GTPasa, elemento 8 de la familia IMAP
4.324
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 227780_s_at)
4.325
JAK2 Janus quinasa 2 (una proteína tirosina quinasa)
4.326
TNFSF10 superfamilia del factor de necrosis tumoral (ligando), elemento 10
4.327
C1R componente 1 de complemento, subcomponente r
4.328
ACPL2 tipo 2 de la fosfatasa ácida
4.329
TNFRSF19 factor de necrosis tumoral receptor superfamilia, elemento 19
4.331
LRP12 proteína 12 relacionada con la lipoproteína de baja densidad
4.332
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 1557116_at)
4.334
PRKCB1 proteína quinasa C, beta 1
4.335
IPO11 importina 11
4.336
DLGAP1 discos, proteína 1 asociada a homólogos grandes (Drosophila)
4.337
PRKAR2B proteína quinasa, dependiente de AMPc, regulador, tipo II, beta
4.338
MAP3K8 proteína quinasa 8 activada por mitógenos
4.339
EVI2B sitio 2 B de integración viral ecotrópico
4.340
GBP1 proteína 1 de unión a guanilato, inducible por interferón, 67kDa
4.341
CXCL10 ligando 10 de quimioquina (motivo C-X-C)
4.342
CAMK2N1 inhibidor 1 de la proteína quinasa II dependiente de calcio/calmodulina
4.343
MED12L mediador de la transcripción de la ARN polimerasa II, de tipo homólogo
a la subunidad 12 (levadura)
4.344
ID2 inhibidor de ADN que se une a 2, proteína de hélice -bucle -hélice
negativa dominante
4.345
CTBP2 proteína 2 de unión C-terminal
4.346
IGLJ3 unión 3 de inmunoglobulina lambda
4.347
GBP4 proteína 4 de unión a guanilato
4.348
LOC439949 NA
4.349
FBXO16 proteína 16 de la casilla F
4.350
PRF1 perforina 1 (proteína que forma poros)
4.351
TRAM2 proteína 2 de membrana asociada a traslocación
4.352
LYN Homólogo de encogen relacionado con sarcoma viral de v-yes-1
Yamaguchi
4.353
CENTD1 centaurina, delta 1
4.355
FLJ20273 NA
4.356
TFEC factor de transcripción EC
4.357
PPP1R16B proteína fosfatasa 1, subunidad reguladora (inhibidor) 16B
4.358
CD48 antígeno CD48 (proteína de membrana de las células B)
4.359
HLA-DPB1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DP beta 1
4.361
GTPBP5 proteína 5 de unión a GTP (supuesta)
4.362
GBP5 proteína 5 de unión a guanilato
4.363
MAP1B proteína 1B asociada a microtúbulos
4.364
EXTL3 exostosas (múltiple)-tipo 3
4.365
CORO1A coronina, proteína de unión a actina, 1A
4.366
PDGFRL tipo receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas
4.367
RP9 retinitis pigmentosa 9 (autosómica dominante)
4.368
RHOU familia del gen homólogo de ras, elemento U
4.369
MTAC2D1 dominio de C2 de dirección de membrana (tándem) que contiene 1
4.370
CCL8 ligando 8 de quimioquina (Motivo C-C)
4.371
CECR1 región del cromosoma del síndrome del ojo de gato, candidato 1
4.373
SLC40A1 familia 40 del vehículo de soluto (transportador regulado por hierro),
elemento 1
4.374
ADCY6 adenilato ciclasa 6
4.375
CP ceruloplasmina (ferroxidasa)
4.376
EDG1 diferenciación endotelial, receptor acoplado a la proteína G de
esfingolípido, 1
4.377
RGS3 regulador de la señalización 3 de la proteína G
4.379
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 228339_at)
4.380
ABHD5 dominio abhidrolasa que contiene 5
4.381
MS4A7 membrana-de extensión 4-dominios, subfamila A, elemento 7
4.382
PRKCH proteína quinasa C, eta
4.384
LOC286071 NA
4.385
BLNK engarce de células B
4.386
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 242546_at)
4.387
PCDHGC3 subfamila C de protocadherina gamma, 3
4.390
CAMSAP1L1 proteína 1 asociada a la espectrina regulada por calmodulina-tipo 1
4.391
NPY1R receptor Y1 del neuropéptido Y
4.392
CD274 antígeno CD274
4.393
PGM5 fosfoglucomutasa 5
4.394
PLCG2 fosfolipasa C, gamma 2 (específica de fosfatidilinositol)
4.395
TNFSF10 superfamilia del factor de necrosis tumoral (ligando), elemento 10
4.397
BTG2 familia BTG, elemento 2
4.398
LAMP3 proteína 3 de membrana asociada a lisosomas
4.399
IGLC1 constante 1 de inmunoglobulina lambda (marcador Mcg)
4.400
SIPA1L1 tipo 1 asociado 1 a la proliferación inducida por señal
4.401
AIF1 factor 1 inflamatorio de trasplante homólogo
4.402
IGLC2 constante 2 de la inmunoglobulina lambda (marcador Kern-Oz)
4.403
B2M beta-2-microglobulina
4.404
CLEC7A familia 7 del dominio de lectina de tipo C, elemento A
4.405
MGC17330 NA
4.406
IGF1R receptor del factor 1 de crecimiento de tipo insulina
4.407
HIVEP1 proteína 1 de unión al potenciador de tipo 1 del virus de
inmunodeficiencia humano
4.408
FKBP14 proteína 14 de unión de FK506, 22 kDa
4.409
LAPTM5 proteína 5 de membrana asociada a la extensión asociada a lisosomas
4.410
ABI3BP familia del gen ABI, proteína de unión al elemento 3 (NESH)
4.411
HLA-E complejo de histocompatibilidad principal, clase I, E
4.412
ARL4C 4C de tipo del factor de ribosilación de ADP
4.413
ASS argininosuccinato sintetasa
4.415
ITGB3 integrina, beta 3 (glicoproteína IIIa de plaquetas, antígeno CD61)
4.416
SYK tirosina quinasa de bazo
4.417
RAC2 substrato 2 de la toxina botulínica C3 relacionada con ras (familia rho,
proteína Rac2 de unión de GTP pequeña)
4.418
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 1557222_at)
4.419
CD3G antígeno CD3g, polipéptido gamma (complejo TiT3)
4.420
IGF1 factor 1 de crecimiento de tipo insulina (somatomedina C)
4.421
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 228858_at)
4.422
CYB5A citocromo b5 tipo A (microsomal)
4.42
TTC25 dominio 25 de repetición de tetratricopéptido
4.440
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 226865_at)
4.441
HS3ST3B1 heparan sulfato (glucosamina) 3-O-sulfotransferasa 3B1
4.442
CXorf9 marco abierto de lectura 9 del cromosoma X
4.443
EVI2A sitio de integración viral ecotrópico 2A
4.445
NFAM1 proteína de activación de NFAT con motivo 1 de ITAM
4.446
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 242874_at)
4.447
ATP5J ATP sintasa, H+ complejo F0 mitocondrial, de transporte, , subunidad
F6
4.450
CYLD cilindromatosis (síndrome de tumor de turbante)
4.451
GIMAP6 GTPasa, elemento 6 de la familia IMAP
4.452
MFAP4 proteína 4 asociada a microfibrilas
4.453
TUBB2B tubulina, beta 2B
4.454
NELL2 NEL-tipo 2 (pollo)
4.455
NA NA
4.456
IL1RN antagonista del receptor de la interleuquina 1
4.458
SYK tirosina quinasa de bazo
4.459
ADAMDEC1 tipoADAM, decisina 1
4.460
AOC3 amina oxidasa, 3 que contiene cobre (proteína 1 de adhesión vascular)
4.461
SAMHD1 dominio SAM y dominio 1 de HD
4.463
SLC22A3 familia 22 del vehículo de soluto (transportador de monoamina
extraneuronal), elemento 3
4.465
IGLV3-25 variable 3-25 de inmunoglogulina lambda
4.466
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 1556185_a_at)
4.467
RAB11FIP1 proteína de interacción de la familia RAB11 (clase I)
4.468
PER2 homólogo 2 del período (Drosophila)
4.469
TTL tirosina ligasa de tubulina
4.470
SIAHBP1 NA
4.471
LAPTM5 proteína 5 de membrana de multiextensión asociada a lisosomas
4.472
FLJ22536 NA
4.473
RP6-213H19.1 NA
4.474
NA NA (gen identificado por el conjunto de sondas 235804_at)
4.475
NCF4 factor 4 citosólico de neutrófilos, 40kDa
4.476
EPSTI1 interacción 1 de estroma epitelial (mama)
En las tablas enumeradas en la presente memoria descriptiva el gen dado se puede enumerar más de una vez, por ejemplo como un gen específico o como un agrupamiento de genes. La Tabla 4 anterior se genera a partir de los conjuntos de sondas enumerados en la Tabla 4A más adelante. A menudo existen múltiples conjuntos de sondas para cada gen y de esta manera cuando se ha usado más de un conjunto de sondas para identificar un gen particular entonces el gen aparece más de una vez en la Tabla 4. Se ha hecho un intento para eliminar la duplicación puntuando a través de los genes que aparecen más de una vez en la Tabla 4. Los genes seleccionados de la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 y/o 13 incluyendo las combinaciones de los mismos. En un aspecto adicional la solicitud proporciona todos los genes de la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 ó 13 o las combinaciones de hecho de los mismos.
Uno o más genes incluyen 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70. 71-75, 76-80, 81-85, 86-90, 91-95, 96-100, 101-105, 106-110, 111-115. 116-120, 121-125, 126-130, 131135, 136-140, 141-145, 146-150, 151-155, 156-160, 161-165, 166-170, 171-175, 176-180, 181-185, 186-190, 191195, 196-200, 201-205, 206-210, 211-215, 216-220, 221-225, 226-230, 231-235, 236-240, 241-245, 246-250, 251255, 256-260, 261-265, 266-270, 271-275, 276-280, 281-285, 286-290, 291-295, 296-300, 301-305, 306-310, 311315, 316-320, 321-325, 326-330, 331-335, 336-340, 341-345, 346-350, 351-355, 356-360, 361-365, 366-370, 371375, 376-380, 381-385, 386-390, 391-395, 396-400, 401-405, 406-410, 411-415, 416-420, 421-425, 426-430, 431435, 436-440, 441-445, 446-450, 451-455, 456-460, 461-465, 466-470, 471-475, 476-480, según sea apropiado y las combinaciones de los mismos.
PCR es una técnica más sensible que la microdisposición y por lo tanto puede detectar niveles más bajos de genes expresados de manera diferencial.
En particular los siguientes genes son adecuados para análisis por PCR: IL7R, CD3D, CD3E, CD52, UBD, GPR171, GMZK, PRKCQ, STAT4, TRDV2, TRAT1, TRBV19, CD69, INDO, CD45R, CD45RO, FOXP3, CD20, CCL5, FASLG, GNLY, GZMB, PRF1, IFNG, ICOS, TBX21, CD8A, CD3E, CXCL10, CXCL11, IRF1, TLR7 y CXCR3.
En un aspecto el gen (es) empleado (s) se selecciona (n) entre el grupo constituido por: CCL5, TRAT1, STAT4, PRKCQ, GPR171, UBD, CD52, CD3D, PRF1, CD8A, CXCL10, CD69, TRBV19, TRDV2, IL7R, GZMK y CD45R.
En un aspecto el gen (s) empleados (s) se selecciona (n) entre el grupo constituido por: FASLG, GNLY, GZMB, IFNG, ICOS, TBX21, CD3E, CXCL11, CXCR3, CD20, FOXP3, INDO, IRF1 y TLR7.
El gen (es) FOXP3 y/o PRF1 es/son particularmente adecuados para análisis de PCR de acuerdo con la invención.
Las dianas adecuadas para inmunohistoquímica incluyen CD3, CD8, CD86, LAMP, CD20, CD45RO, CXCR3, CXL10/11, CD69, granzima B, IDO, células B, y productos génicos de uno o más genes de la familia NK, familia HLA, familia del receptor de células T y/o célula T activada.
En un aspecto adicional de la invención se proporciona un indicador de señal de gen de un no respondedor, por
ejemplo, en el que CCL5 no se expresa de manera diferencial y/o está regulado hacia abajo y/o no está regulado hacia arriba.
De acuerdo con un aspecto adicional, la presente solicitud describe un indicador de señal de gen de un incremento de probabilidad de que un paciente responda favorablemente a una inmunoterapia apropiada, que a su vez es probable que dé como resultado una supervivencia apropiada, por ejemplo con cánceres que expresan Mage después de tratamiento con inmunoterapia específica de Mage. Esta marca de gen, de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ó 31 genes de los genes descritos en la Tabla 1, se caracteriza por la expresión diferencial comparada con la señal de gen de pacientes de tumores que expresan Mage que no responden a inmunoterapia específica de Mage.
Los genes predictivos corresponden principalmente a la expresión de y a menudo la regulación hacia arriba de genes relacionados con la infiltración y activación inmune. Estos genes incluyen HLA clase II, receptor gamma de la Interleuquina-2, genes del receptor de células T (TRBV19, TRAT1, TRGC2), granzima, y CD69.
A modo de ejemplo, se proporciona una señal de gen, presente en pacientes, por ejemplo, con o que habían tenido tumores que expresan MAGE, que responden al tratamiento, en los que uno o más, por ejemplo, al menos 5, adecuadamente 6, 7, 8, 9, 10 de los genes de Tabla 2 se expresan de manera diferencial:
Como se muestra en la Fig 5a a continuación, la caracterización de respondedores y no respondedores se puede basar en la expresión diferencial de solamente uno o dos genes, tales como TCR, CD3 y/o IL-7.
Otros genes que se cree que son particularmente adecuados en los procedimientos que emplean solamente uno o dos genes incluyen: IL7R, CD3D, CD3E, CD52, UBD, GPR171, GMZK, PRKCQ, STAT4, TRDV2, TRAT1, TRBV19, CD69, INDO, CD45R, CD45RO, FoxP3, CD20, CCL5, FASLG, GNLY, GZMB, PRF1, IFNG, ICOS, TBX21, CD8A, CD3E, CXCL10, CXCL11, TRF1, TLR7 y CXCR3, que pueden requerir el uso de técnicas analíticas sensibles de manera apropiada.
La solicitud en esta memoria descriptiva describe el uso de todas las permutaciones de los genes enumerados en esta memoria descriptiva para identificación de dicha señal/perfil.
La solicitud también describe los equivalentes funcionales de los genes enumerados en esta memoria descriptiva, por ejemplo como se caracteriza por la clasificación jerárquica de genes tal como se describe por Hongwei Wu y col 2007(Hierarchical classification of equivalent genes in prokaryotes-Nucliec Acid Research Advance Access).
Aunque sin desear estar unido a ninguna teoría, se cree que no necesariamente el gen per se es elquees característico de la señal, sino que es la función del gen la que es fundamentalmente importante. De este modo un gen funcionalmente equivalente a un gen de activación inmune tal como los enumerados anteriormente, por ejemplo en la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 ó 13 también se puede emplear en la señal, véase por ejemplo, Journal of the National Cáncer Institute Vol 98, Nº 7, 5 de abril de 2006.
Los genes se identificaron mediante sondas específicas y en la Tabla 1, etc. Por ejemplo, usando técnicas tales como análisis de transferencia de Northern, reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), hibridación in situ, inmunoprecipitación, hibridación de transferencia de Western, o inmunohistoquímica. De acuerdo con el procedimiento, se pueden obtener células de un sujeto y compararse los niveles de la proteína, o ARNm, de los genes analizados con el de un paciente no respondedor. Los pacientes que expresan de manera diferencial uno o más, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ó 31 genes seleccionados de la Tabla 1 u otra realización de la invención son aquellos que se puede predecir que se benefician de la inmunoterapia, por ejemplo inmunoterapia de cáncer, tal como inmunoterapia de cáncer específica de Mage. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que se hibrida a una localización dada en una microdisposición se dice que se expresa de manera diferencial si la señal de hibridación es, por ejemplo, mayor que la señal de hibridación en la misma localización en una disposición idéntica hibridada con una muestra de ácido nucleico obtenida de un sujeto que no responde de manera clínica a inmunoterapia específica de Mage.
Los resultados de 30 pacientes que se han sometido al perfil génico se muestran en la figura 5. Esto demuestra de manera gráfica que la señal del gen de la presente invención se alinea con respuesta clínica a inmunoterapia de cáncer específica de antígeno de Mage.
Como alternativa el paciente de cáncer se puede caracterizar como un respondedor o no respondedor a una inmunoterapia a partir de la inspección visual de una sección de tejido derivada del cáncer o tumor. Un respondedor es probable que sea un paciente con una infiltración de células de respuesta inmune en el microentorno de cáncer/tumor.
La invención también proporciona un procedimiento de generación de un perfil génico nuevo no descrito específicamente en esta memoria descriptiva, basándose en la expresión diferencial de uno o más genes de
respuesta/activación inmune, para indicar si es probable que un paciente sea un respondedor o no respondedor para la inmunoterapia apropiada, por ejemplo inmunoterapia de cáncer tal como inmunoterapia de Mage que comprende las etapas de:
a) analizar al menos dos muestras derivas de paciente para la expresión diferencial de uno o más genes
de activación inmune, donde el grupo de muestra comprende tanto respondedores como no
respondedores a una inmunoterapia apropiada, y
b) correlacionar la misma con el resultado clínico, después del tratamiento adecuado, de pacientes de los que se derivan las muestras, e
c) identificar uno o más genes que se expresan de manera diferencial en respondedores y no respondedores.
Después de que se haya identificado el nuevo perfil la invención también se extiende al análisis de una muestra no caracterizada previamente, designando la muestra como respondedores o no respondedores (según sea apropiado) y si se desea administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una inmunoterapia apropiada, por ejemplo inmunoterapia de cáncer tal como inmunoterapia de Mage a uno o más pacientes designados como respondedores.
La invención también proporciona un procedimiento de generación de un perfil génico basado en la expresión diferencial de una o más secuencias de genes en la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 y/o 13 para indicar si es probable que un paciente sea un respondedor o no respondedor a la inmunoterapia que comprende las etapas de:
a) analizar al menos dos muestras derivadas de paciente para la expresión diferencial de
(i)
una o más secuencias de genes descritas en la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 y/o 13 y
(ii)
opcionalmente una o más secuencias de genes no descritas en la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 y/o 13,
en la que el grupo de muestra comprende tanto respondedores como no respondedores a una inmunoterapia apropiada; b) correlacionar la expresión diferencial de dichas una o más secuencias de genes con resultado clínico, después de tratamiento apropiado, de pacientes a partir de los que se derivan las muestras, e c) identificar uno o más genes que se expresan de manera diferencial en respondedores y no respondedores.
Después de que se haya identificado el perfil la solicitud también describe el análisis de una muestra no caracterizada previamente, designando la misma como respondedores o no respondedores (según sea apropiado) y si se desea administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una inmunoterapia apropiada, por ejemplo inmunoterapia de cáncer tal como inmunoterapia de Mage a uno o más pacientes designados como respondedores.
La solicitud también proporciona un kit de diagnóstico que comprende al menos un componente para realizar un análisis en una muestra derivada de paciente para identificar un perfil de acuerdo con la invención, los resultados del cual se pueden usar para designar un paciente a partir del que se derivó la muestra como un respondedor o no respondedor a la inmunoterapia.
El kit puede comprender materiales/reactivos para PCR (tal como QPCR), análisis de microdisposición, inmunohistoquímica u otra técnica analítica que se pueda usar para acceder a la expresión diferencial de uno o más genes.
A modo de ejemplo, en un aspecto, la solicitud proporciona un kit de diagnóstico que comprende un conjunto de sondas capaces de hibridarse al ARNm o ADNc de uno o más, tal como al menos 5 genes como se establece en la Tabla 1 o como alternativa en las Tablas 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 y/o 13, por ejemplo un kit de diagnóstico que comprende un conjunto de sondas capaces de hibridarse al ARNm o ADNc de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 genes como se establece en la Tabla 1. En otra realización esta solicitud se refiere a kits de diagnóstico. Por ejemplo, kits de diagnóstico que contienen tales microdisposiciones que comprenden un sustrato de microdisposición y sondas que son capaces de hibridarse al ARNm o ADNc expresados a partir de, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16,17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30 o 31 genes de, por ejemplo la Tabla 1 o cualquier otra realización de la invención que son capaces de demostrar la señal del gen de la solicitud.
En un aspecto la solicitud proporciona microdisposiciones adaptadas para la identificación de una señal de acuerdo con la invención.
A modo de ejemplo, en un aspecto, la solicitud también se extiende a sustratos y sondas adecuadas para hibridarse a un resto de ARNm o ADNc expresado de uno o más genes empleados en la solicitud, por ejemplo de la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 ó 13.
Las microdisposiciones comercialmente disponibles contienen muchas más sondas de las que se requieren para caracterizar la expresión diferencial de los genes bajo consideración en cualquier momento, para ayudar a la precisión del análisis. De este modo uno o más conjuntos de sondas pueden reconocer el mismo gen.
De este modo en una realización se usan múltiples sondas o conjuntos de sondas para identificar si un gen de activación inmune se expresa de manera diferencial, tal como regulado hacia arriba.
El kit de diagnóstico puede, por ejemplo comprender sondas, que se disponen en una microdisposición.
Específicamente, las microdisposiciones preparadas, por ejemplo, que contienen uno o más conjuntos de sondas descritos en esta memoria descriptiva, se pueden preparar fácilmente por compañías tales como Affimetrix, proporcionando por lo tanto un ensayo específico y opcionalmente reactivos para identificar el perfil, como se describe en la presente solicitud.
En una realización las microdisposiciones o kits de diagnóstico serán capaces de manera adicional de ensayar para detectar la presencia o ausencia del gen que expresa el antígeno de cáncer de testículos relevante tal como gen de Mage.
De este modo en un aspecto la solicitud proporciona una sonda y/o conjunto de sondas adecuados para dicha hibridación, en condiciones apropiadas. La solicitud también describe el uso de sondas, por ejemplo como se describe en esta memoria descriptiva o equivalentes funcionales de las mismas, para la identificación de un perfil génico de acuerdo con la presente solicitud.
La solicitud en esta memoria descriptiva describe el uso de todas las permutaciones enumeradas en esta memoria descriptiva (o análogos funcionales de las mismas) para la identificación de dicha señal.
En un aspecto la solicitud describe el uso de una sonda para la identificación de la expresión diferencial de al menos un producto génico de un gen de activación inmune para establecer si un perfil génico de acuerdo con la presente invención está presente en una muestra derivada de paciente.
La Tabla 1B desvela conjuntos de sondas a partir de las que se puede diseñar sondas de típicamente 25 meros de longitud y que son adecuados para identificar el ARNm (o su ADNc) expresado a partir de, por ejemplo los genes de la Tabla 1 (o como alternativa la Tabla 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 ó 13). Tales sondas y conjuntos de sondas son un aspecto de la presente solicitud. Típicamente cada conjunto de sondas puede comprender aproximadamente o exactamente 11 secuencias individuales de aproximadamente 25 nucleótidos exactamente, que corresponden precisamente a una realización de secuencias del conjunto de sondas.
Por consiguiente, en un aspecto, esta solicitud describe sondas de oligonucleótidos y cebadores capaces de reconocer el ARNm (o su ADNc) expresado de los genes de la Tabla 1, (o como alternativa la Tabla 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 ó 13) y kits de diagnóstico basados en estas sondas y cebadores. Tales kits pueden incluir sondas o kits para la detección de un gen Mage.
En un aspecto, la solicitud proporciona un perfil basado en la expresión diferencial de uno o más de los genes de la Tabla 3 identificable por una o más de las siguientes 13 sondas: 204661_at, 205890_s_at, 206118_at, 206666_at, 207651_at, 210038_at, 210972_x_at, 211144_x_at, 211796_s_at, 213193_x_at, 213539_at, 217147_s_at, 34210_at.
Detalles adicionales de estas sondas y los genes diana de las mismas se proporcionan en la Tabla 3A más adelante. La hibridación se realizará en general en condiciones rigurosas, tales como 3X SSC, SDS al 0,1%, a 50 °C.
Una vez que el gen (s)/perfil diana se ha/se han identificado entonces estará dentro de la capacidad de los expertos en la técnica diseñar sondas alternativas que se hibriden a la misma diana. Por lo tanto la solicitud también se extiende a sondas, que en condiciones apropiadas miden la misma expresión diferencial del (de los) gen (es) de la presente solicitud para proporcionar una señal/perfil como se ha descrito.
La solicitud también se extiende al uso de la sonda relevante en análisis de si un paciente con cáncer será un respondedor o no respondedor al tratamiento con una inmunoterapia apropiada.
La solicitud también describe el uso (y procesamiento que emplea el mismo) de microdisposiciones conocidas para la identificación de dicha señal.
Una sonda de ácido nucleico puede ser al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 o más nucleótidos de longitud y puede comprender el gen de longitud completa. Las sondas para uso descritas en la solicitud son aquellas que son capaces de hibridarse específicamente al ARNm (o su ADNc) expresado a partir de los genes enumerados en la Tabla 1 (o Tabla 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 ó 13) en condiciones rigurosas.
La presente solicitud describe además un procedimiento de selección de los efectos de un fármaco en un tejido o muestra celular que comprende la etapa de analizar el perfil de expresión de, por ejemplo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30 ó 31 genes seleccionados de la Tabla 1 o cualquier otra realización de la solicitud descrita en esta memoria descriptiva antes y después de tratamiento de fármaco. La solicitud por lo tanto proporciona un procedimiento para seleccionar un fármaco, que alteraría el perfil génico a ése de un paciente que tiene supervivencia mejorada después de tratamiento con, por ejemplo, inmunoterapia de cáncer específico de antígeno de Mage (es decir, que altera el perfil génico a ése de un respondedor), para permitir que el paciente se beneficie de, por ejemplo, inmunoterapia de cáncer específico de antígeno de Mage.
La presente solicitud además describe un procedimiento de diagnosis de un paciente que comprende, por ejemplo, la etapa de analizar el perfil de expresión de, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16,17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30 ó 31 genes seleccionados entre la Tabla 1 o cualquier otra realización de la solicitud descrita en esta memoria descriptiva y compararlo con un patrón para diagnosticar si el paciente se beneficiaría de la inmunoterapia específica de Mage.
La solicitud incluye un procedimiento de diagnosis de un paciente que comprende la etapa de analizar el perfil de expresión de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ó 31 genes seleccionados de la Tabla 1 u otra realización de la solicitud de una muestra de tejido de tumor proporcionada por un paciente y determinar si se expresan 5 o más de dichos genes.
De este modo, en aplicaciones clínicas, las muestras de tejido de un paciente humano se pueden seleccionar para evaluar la presencia y/o ausencia de la expresión de, por ejemplo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ó 31 genes seleccionados de la Tabla 1 o cualquier otra realización de la solicitud descrita en esta memoria descriptiva.
En el contexto de la presente solicitud, la muestra puede ser cualquier tejido o fluido biológico derivado de un paciente potencialmente en necesidad de tratamiento. La muestra se puede derivar de esputo, sangre, orina, o de tejidos sólidos tales como biopsia de un tumor primario o metástasis, o de secciones de tejidos previamente separados.
Las muestras pueden comprender o consistir en, por ejemplo, núcleos de biopsia con aguja, muestras de resección quirúrgica o tejido de ganglios linfáticos. Estos procedimientos incluyen la obtención de biopsia, que está opcionalmente fraccionada mediante sección en criostato para enriquecer las células tumorales hasta aproximadamente el 80% de la población de células total. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos extraídos de estas muestras se pueden amplificar usando técnicas bien conocidas en la técnica. Los niveles de marcadores seleccionados (por ejemplo los productos génicos de la tabla 1) se pueden detectar y se pueden comparar con grupos estadísticamente válidos de, por ejemplo, pacientes no respondedores positivos a Mage.
Para cáncer, la muestra biológica contendrá células cancerosas o tumorales y pueden, por ejemplo, derivarse del cáncer o tumores tales como una muestra reciente (que incluye muestras congeladas) o una muestra que se ha conservado en parafina. Habiendo dicho esto, las muestras conservadas en parafina pueden sufrir degradación y el perfil observado se puede modificar. Una persona que trabaje en este campo es capaz de compensar estos cambios observados recalibrando los parámetros del perfil.
Microdisposiciones
Una microdisposición es una disposición de regiones discretas, típicamente ácidos nucleicos que están separadas entre sí y se disponen típicamente a una densidad de entre aproximadamente 100/cm2 y 1000/cm2, pero se pueden disponer a densidades mayores tales como 10000 /cm2. El principio de un experimento de microdisposición, es que el ARNm de una línea celular o tejido dado se usa para generar una muestra marcada, típicamente ADNc marcado, denominada la ‘diana’, que se hibrida en paralelo a un gran número de secuencias de ácido nucleico, típicamente secuencias de ADN, inmovilizadas sobre una superficie en una disposición ordenada.
Decenas de miles de muestras de transcripciones se pueden detectar y cuantificar de manera simultánea. Aunque se han desarrollado muchos sistemas de microdisposición diferentes los sistemas más comúnmente usados hoy se pueden dividir en dos grupos, de acuerdo con el material dispuesto: microdisposiciones de ADN complementario (ADNc) y microdisposiciones de oligonucleótidos. El material dispuesto se ha denominado en general la sonda ya que es equivalente a la sonda usada en un análisis de transferencia de Northern. Las sondas para disposiciones de ADNc son usualmente productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) generados a partir de genotecas de ADNc o colecciones de clones, usando cebadores o bien específicos de vectores o específicos de genes, y se imprimen en portaobjetos de vidrio o membranas de nylon como manchas en localizaciones definidas. Las manchas son típicamente de 10 -300 mm de tamaño y se espacian aproximadamente a la misma distancia aparte. Usando esta técnica, las disposiciones que están constituidas por más de 30.000 ADNc se pueden ajustar en la superficie
de un portaobjetos de microscopio convencional. Para las disposiciones de oligonucleótidos, 20 -25 meros cortos se sintetizan in situ, o bien mediante fotolitografía sobre galleta de silicio (disposiciones de oligonucleótidos de alta densidad de Affymetrix o mediante tecnología de inyección de tinta (desarrollada por Rosetta Inpharmatics, y con licencia de Agilent Technologies). Como alternativa, se pueden imprimir oligonucleótidos presintetizados sobre portaobjetos de vidrio. Los procedimientos basados en oligonucleótidos sintéticos ofrecen la ventaja que debido a que la información de secuencias sola es suficiente para generar el ADN a disponer, no se requiere manipulación que consuma tiempo de fuentes de ADNc. También se pueden diseñar sondas para representar la parte más dada de una transcripción única, haciendo posible la detección de los genes estrechamente relacionados o variantes de ayuste. Aunque los oligonucleótidos cortos pueden dar como resultado una hibridación específica y una sensibilidad reducida, la disposición de oligonucleótidos presintetizados más largos (50 -100 meros) se ha desarrollado recientemente para contrarrestar estas desventajas.
De este modo cuando se realiza una microdisposición para determinar si un paciente presenta una señal de gen de la presente solicitud se realizan las siguientes etapas: obtener ARNm de la muestra y preparar dianas de ácido nucleico, poner en contacto la disposición en condiciones, típicamente como se sugiere por los fabricantes de la microdisposición (condiciones de hibridación rigurosas de manera adecuada tales como 3X SSC, SDS al 0,1%, a 50 °C) para unir las sondas correspondientes en la disposición, lavar si es necesario para retirar las dianas de ácido nucleico no unido y analizar los resultados.
Se apreciará que el ARNm se puede enriquecer para secuencias de interés tales como aquellas en la tabla 1 ó 2 (u otra realización de la solicitud) mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como la síntesis de ADNc específico de cebador. La población se puede ampliar adicionalmente, por ejemplo, usando tecnología de PCR. Las dianas o sondas se marcan para permitir la detección de la hibridación de la molécula diana a la microdisposición. Las etiquetas adecuadas incluyen etiquetas isotópicas o fluorescentes que se pueden incorporar en la sonda.
En una realización alternativa, un paciente se puede diagnosticar para determinar si su tumor expresa la señal del gen de la invención utilizando un kit de diagnóstico basado en la tecnología de PCR, en particular PCR Cuantitativa (para revisión véase Ginzinger D Experimental haematology 30 (2002) p 503 -512 y Giuliette y col Methods, 25 p 386 (2001).
En un aspecto alternativo, la solicitud proporciona un procedimiento que además comprende las etapas de analizar una muestra derivada de tumor para determinar qué antígeno (s) es/son expresado(s) por el tumor y por lo tanto permitiendo la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una inmunoterapia de cáncer específica de antígeno apropiada, por ejemplo donde resulta que el tumor es MAGE, tal como Mage A3, el tratamiento apropiado positivo puede, por ejemplo, incluir la administración de inmunoterapia específica de antígeno Mage A3.
Una muestra tal como tejido de tumor de un paciente se considera que presenta la señal del gen de la solicitud si uno o más genes de la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 y/o 13 se expresan de manera diferencial (tal como regulado hacia arriba), por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ,16,17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30 ó 31 genes de por ejemplo de la Tabla 1 u otra realización de la solicitud se expresan y se pueden detectar mediante análisis de microdisposición u otro análisis apropiado por ejemplo como se describe en esta memoria descriptiva. El tejido del tumor preferiblemente muestra la expresión de al menos 5 genes seleccionados de la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 y/o 13, más preferiblemente 10 genes, particularmente 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 genes de la Tabla 1, 2, 3, 4, 7, 9, 11, 12 ó 13.
Agentes inmunoterapéuticos
En un aspecto adicional la invención proporciona un procedimiento de tratamiento de un paciente respondedor con una inmunoterapia de cáncer apropiada, tal como inmunoterapia de cáncer de testículos, después de la identificación del mismo como un respondedor al mismo.
De este modo la invención proporciona un procedimiento de tratamiento de un paciente que comprende la etapa de administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una inmunoterapia de cáncer, tal como inmunoterapia de cáncer de Mage, después de caracterizar primero el paciente como un respondedor basado en la expresión diferencial de CCL5, por ejemplo como se muestra mediante el análisis apropiado de una muestra derivada del paciente. En particular en la que el paciente se caracteriza como un respondedor basado en una o más realizaciones descritas en esta memoria descriptiva.
En un aspecto, la inmunoterapia comprende un adyuvante apropiado (inmunoestimulante), véase la descripción más adelante.
En todavía una realización adicional de la invención se proporciona un procedimiento de tratamiento de un paciente que padece de, por ejemplo, un tumor que expresa Mage, comprendiendo el procedimiento la determinación de si el paciente expresa la señal del gen de la invención y después la administración de, por ejemplo, la inmunoterapia específica de Mage. El paciente se puede tratar con, por ejemplo, inmunoterapia específica de Mage para evitar o
mejorar la repetición de la enfermedad, después de recibir primero tratamiento tal como resección por cirugía de un tumor u otro tratamiento terapéutico o de radioterapia.
Un aspecto adicional de las solicitudes es un procedimiento de tratamiento de un paciente que padece un tumor que expresa Mage, comprendiendo el procedimiento la determinación de si el tumor del paciente expresa al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ,16,17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30 ó 31 genes seleccionados de la Tabla 1 (u otra realización de la solicitud) de una muestra de tejido de tumor dada por un paciente y después administrar una inmunoterapia específica de Mage a dicho paciente.
También se proporciona un procedimiento de tratamiento de un paciente susceptible de repetición de tumor que expresa Mage, que se ha tratado para eliminar/tratar un tumor de expresión de Mage, comprendiendo el procedimiento la determinación de si el tumor del paciente expresa al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30 ó 31 genes seleccionados en la Tabla 1 (u otra realización de la solicitud) de una muestra de tejido dada por un paciente y después administrar un agente inmunoterapéutico específico de Mage.
La invención también proporciona un procedimiento de tratamiento o uso que emplea:
•
agente inmunoterapéutico específico de MAGE que comprende un antígeno de MAGE o péptido del mismo,
•
antígeno de MAGE que comprende una proteína o péptido de MAGE-A3
•
antígeno de MAGE que comprende el péptido EVDPIGHLY,
•
antígeno de MAGE o péptido fusionado o conjugado a una proteína vehículo, por ejemplo en el que la proteína vehículo se selecciona entre proteína D, NS1 o CLytA o fragmentos de los mismos, y/o
•
agente inmunoterapéutico específico de MAGE que comprende además un adyuvante, por ejemplo en el que el adyuvante comprende una o más combinaciones de: 3D-MPL; sales de aluminio; oligonucleótidos que contienen CpG; adyuvantes que contienen saponina tales como QS21 ó ISCOMs; emulsiones aceite en agua; y liposomas.
La solicitud describe el uso de una inmunoterapia tal como una inmunoterapia de cáncer, en particular inmunoterapia de Mage en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un paciente tal como un paciente de cáncer designado como respondedor, a éste.
Se observó que un paciente inicialmente caracterizado como un no respondedor se caracterizó posteriormente como respondedor después de la terapia de radiación. De manera interesante los inventores también creen que es posible inducir un perfil de respondedor en al menos algún no respondedor, por ejemplo sometiendo al paciente a terapia de radiación, o administrando un estimulante inflamatorio tal como interferón (por ejemplo imiquimod tal como administrado por vía tópica) o un agonista de TLR 3 (por ejemplo como se describe en el documento WO 2006/054177), 4, 7, 8 o agonista TLR 9 (por ejemplo que contiene un motivo CpG, en particular la administración de una dosis alta del mismo tal como 0,1 a 75 mg por Kg administrado, por ejemplo semanalmente). Véase por ejemplo Krieg, A. M., Efler, S. M., Wittpoth, M., Al Adhami, M. J. & Davis, H. L. La inducción de inmunidad innata sistémica de tipo TH1 en voluntarios normales después de la administración subcutánea pero no intravenosa de CPG 7909, un agonista de TLR9 de oligodesoxinucleótido CpG de clase B. J. Immunother. 27, 460 -471 (2004).
La dosis alta de CpG puede, por ejemplo ser inhalada o administrarse por vía subcutánea.
Aunque sin desear estar unido a ninguna teoría, se propone la hipótesis, de que la terapia de radiación estimulaba una respuesta inflamatoria/respuesta inmune sistémica, que una vez que se ha desencadenado hace que el paciente (o tejido de tumor en él) más sensible a inmunoterapia.
La solicitud además describe el uso de inmunoetrapia específica de Mage en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pacientes que padecen tumor que expresa Mage o pacientes que han recibido tratamiento (por ejemplo, cirugía, quimioterapia o radioterapia) para eliminar/tratar un tumor que expresa Mage, expresando dicho paciente la señal del gen de la invención.
Después se puede administrar la inmunoterapia una vez que se ha inducido el perfil de los respondedores.
En un aspecto la solicitud describe el uso de inmunoterapia específica de Mage en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pacientes que padecen tumor que expresa Mage, dicho paciente caracterizado por su expresión de tumor de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ,16,17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30 ó 31 genes seleccionados de la Tabla 1, o como alternativa otras realizaciones de la solicitud.
La solicitud también describe el uso de inmunoterapia específica de Mage en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de pacientes susceptibles a repetición de tumor que expresa Mage, dicho paciente caracterizado por su expresión de tumor de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ó 31 genes seleccionados de la Tabla 1, o como alternativa otras realizaciones de la invención.
De manera ventajosa, la invención puede permitir a los médicos dirigir las poblaciones de pacientes que obtengan un beneficio clínico de la recepción de una inmunoterapia apropiada. Se espera que después de la selección de al menos el 60% de pacientes tales como el 70, 75, 80, 85% o más de pacientes considerados/caracterizados como respondedores recibirán un beneficio clínico de la inmunoterapia, que es un incremento significativo sobre los niveles actuales observados con la terapia tal como terapia de cáncer en general.
De manera ventajosa si la inmunoterapia de cáncer se proporciona de manera concomitante o posterior a la quimioterapia puede ayudar en la inducción de respuestas inmunes, que se pueden haber eliminado por la quimioterapia.
Los Agentes Inmunoterapéuticos de Cáncer Específicos de Antígeno (abreviadamente en inglés ASCI) adecuados para uso en la invención pueden incluir los capaces de inducir una respuesta inmune específica de Mage. Tales agentes inmunoterapéuticos pueden ser capaces de inducir una respuesta inmune a un producto génico de Mage, por ejemplo un antígeno Mage -A tal como Mage -A3. El agente inmunoterapéutico en general contendrá al menos un epítope de un producto génico de Mage. Tal epítope puede estar presente como un antígeno de péptido opcionalmente unido de manera covalente a un vehículo y opcionalmente en la presencia de un adyuvante. Como alternativa se pueden usar fragmentos de proteínas mayores. Por ejemplo, el agente inmunoterapéutico para uso en la invención puede comprender un antígeno que corresponde a o comprende los aminoácidos 195-279 de MAGE-A1. Los fragmentos y péptidos para uso deben sin embargo, cuando están presentes de manera adecuada, ser capaces de inducir una respuesta inmune específica de Mage. Los ejemplos de péptidos que se pueden usar en la presente invención incluyen el nonapéptido EVDPIGHLY [Sec ID Nº 36] de MAGE-3.A1 (véase Marchand y col., International Journal of Cáncer 80(2), 219 -230), y los siguientes péptidos de MAGE-A3:
FLWGPRALV;[Sec. Id Nº 37]
MEVDPIGHLY;[Sec. Id Nº 38]
VHFLLLKYRA;[Sec. Id Nº 39]
LVHFLLLKYR;[Sec. Id Nº 40]
LKYRAREPVT;[Sec. Id Nº 41]
ACYEFLWGPRALVETS; y [Sec. Id Nº 42]
TQHFVQENYLEY;[Sec. Id Nº 43]
Los ASCIs alternativos incluyen antígenos de cáncer de testículos tales como PRAME, LAGE 1, LAGE 2, y otros, por ejemplo cuyos detalles se pueden obtener a partir de www.cancerimmunity.org/CTdatabase. La inmunoterapia de cáncer se puede basar, por ejemplo en uno o más de los antígenos descritos más adelante.
En una realización de la presente invención, el antígeno a usar puede consistir en o comprender un antígeno de tumor MAGE, por ejemplo, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11 o MAGE 12. Los genes que codifican estos antígenos de MAGE antígenos se localizan en el cromosoma X y comparten entre sí 64 a 85% de homología en su secuencia de codificación (De Plaen, 1994). Los antígenos se conocen algunas veces como MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A 10, MAGE A11 y/o MAGE A12 (la familia MAGE A). En una realización, el antígeno es MAGE A3.
En una realización, se puede usar un antígeno de una de dos familias adicionales MAGE: el grupo MAGE B y grupo MAGE C. La familia MAGE B incluye MAGE B1 (también conocido como MAGE Xp1, y DAM 10), MAGE B2 (también conocido como MAGE Xp2 y DAM 6) MAGE B3 y MAGE B4 -la familia Mage C actualmente incluye MAGE C1 y MAGE C2.
En términos generales, una proteína MAGE se puede definir como que contiene una señal de secuencia central localizada hacia el extremo C-terminal de la proteína (por ejemplo con respecto a MAGE A1, una proteína de 309 amino ácidos, la señal central corresponde a los aminoácidos 195 -279).
El patrón de consenso de la señal central se describe de esta manera como sigue, en el que x representa cualquier aminoácido, los residuos de módulos inferiores se conservan (se permiten variantes conservadoras) y los residuos de módulos superiores se conservan perfectamente.
Señal de secuencia central
LixvL(2x)l(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x)VqexYLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv
Las sustituciones conservadoras son bien conocidas y en general instaladas como las matrices de puntuación por defecto en programas de alineamiento de secuencias. Estos programas incluyen PAM250 (Dayhoft M.O. y col., (1978), “A model of evolutionary changes in proteins”, en “Atlas of Protein sequence y structure” 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345 -352), National Biomedical Research Foundation, Washington, y Blosum 62 (Steven Henikoft y Jorja G. Henikoft (1992), “Amino acid substitution matricies from protein blocks”), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915 -10919.
En términos generales, la sustitución con los siguientes grupos son sustituciones conservadoras, pero las sustituciones entre grupos se consideran no conservadoras. Los grupos son:
i) Aspartato/asparagina/glutamato/glutamina
ii) Serina/treonina
iii) Lisina/arginina
iv) Fenilalanina/tirosina/triptófano
iv) Leucina/isoleucina/valina/metionina
v) Glicina/alanina
En general y en el contexto de esta invención, una proteína MAGE será aproximadamente 50% o más idéntica, tal como 70, 80, 90, 95 ó 99% idéntica, en esta región central con los aminoácidos 195 a 279 de MAGE A1.
Los derivados de la proteína MAGE también se conocen en la técnica, véase: el documento WO 99/40188. Tales derivados son adecuados para uso en formulaciones de vacunas terapéuticas (agente inmunoterapéutico) que son adecuados para el tratamiento de un intervalo de tipos de tumores.
Se han identificado diversos epítopes de CTL sobre la proteína MAGE-3. Uno de tales epítopes, MAGE-3.A1, es una secuencia nonapeptídica localizada entre los aminoácidos 168 y 176 de la proteína MAGE-3 que constituye un epítope específico para los CTLs cuando están presentes en asociación con la molécula HLA.A1 de clase I de MHC. Recientemente dos epítopes adicionales de CTL se han identificado sobre la secuencia de péptidos de la proteína MAGE-3 por su capacidad para armar una respuesta CTL en un cultivo mixto de células de melanoma y linfocitos autólogos. Estos epítopes tienen motivos específicos de unión para los alelos HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) y HLA.B44 (Herman, 1996) respectivamente.
En una realización de la presente invención, la proteína Mage puede comprender un tiol libre derivado. Tales antígenos se han descrito en el documento WO 99/40188. En particular se pueden usar derivados carboxiamidados o carboximetilados.
En una realización de la presente invención, el antígeno asociado a tumor comprende una molécula de la proteína D de Mage-A3. La secuencia de nucleótidos y aminoácidos para esta molécula se muestra en la Sec. Id nº 35. Este antígeno y los resumidos más adelante se describen en más detalle en el documento WO 99/40188.
En realizaciones adicionales de la presente invención, el antígeno asociado a tumor puede comprender cualquiera de las siguientes proteínas de fusión:
Una proteína de fusión del fragmento de lipoproteína D, fragmento de MAGE1, y cola de histidina; proteína de fusión de NS1-MAGE3, y cola de histidina; proteína de fusión de CLYTA-MAGE1-Histidina; proteína de fusión de CLYTA-MAGE3-Histidina.
Una realización adicional de la presente solicitud comprende la utilización de un agente inmunoterapéutico de ácido nucleico, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica antígenos asociados a tumores específicos de Mage, como se describe en esta memoria descriptiva.
Tales secuencias se pueden insertar en un vector de expresión adecuado y usarse para la vacunación de ADN/ARN. Los vectores microbianos que expresan el ácido nucleico también se pueden usar como agentes inmunoterapéuticos distribuidos por vectores. Tales vectores incluyen por ejemplo, poxvirus, adenovirus, alfavirus y listeria.
Las técnicas recombinantes convencionales para obtener secuencias de ácidos nucleicos, y la producción de vectores de expresión se describen en Maniatis y col., Molecular Cloning -A Laboratory Manual; Cold Spring
Harbor, 1982 -1989.
Para los agentes inmunoterapéuticos basados en proteínas, las proteínas de la presente invención se proporcionan
o bien en forma de líquido o en una forma liofilizada.
En general se espera que cada dosis humana comprenderá 1 a 1000 µg de proteína, y preferiblemente 30 -300 pg.
El (los) procedimiento (s) como se describe (n) en esta memoria descriptiva puede (n) comprender un adyuvante de vacuna, y/o citoquina o quimioquina inmunoestimuladora.
Los adyuvantes de vacuna adecuados para uso en la presente invención están comercialmente disponibles tales como, por ejemplo, Adyuvante Incompleto y Adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck Adjuvant 65 (Merck y Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); las sales de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) p fosfato de aluminio; las sales de calcio, hierro o cinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforilo lípido A y quil A. También se pueden usar como adyuvantes citoquinas, tales como GM-CSF o interleuquina-2, -7, ó -12, y quimioquinas.
En las formulaciones puede ser deseable que la composición de adyuvante induzca una respuesta inmune predominantemente del tipo Th1. Los niveles altos de citoquinas de tipo Th1 (por ejemplo, IFN-γ, TNFα, IL-2 y IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células a un antígeno administrado. De acuerdo con una realización, en la que una respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de citoquinas de tipo Th1 se incrementarán hasta un grado mayor que el nivel de las citoquinas de tipo Th2. Los niveles de estas citoquinas se pueden determinar fácilmente usando ensayos convencionales. Para una revisión de las familias de citoquinas, véase Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145 -173, 1989. De acuerdo con lo anterior, los adyuvantes adecuados que se pueden usar para inducir una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo una combinación de monofosforilo lípido A tal como monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) junto con una sal de aluminio. 3D-MPL u otros ligandos del receptor 4 de tipo toll (TLR4) tales como aminoalquil glucosaminida fosfatos como se describe en los documentos WO 98/50399, WO 01/34617 y WO 03/065806 también se pueden usar solos para generar una respuesta predominantemente de tipo Th1.
Otros adyuvantes conocidos, que pueden preferiblemente inducir una respuesta inmune de tipo TH1, incluyen los agonistas de TLR9 tales como oligonucleótidos que contienen CpG sin metilar. Los oligonucleótidos se caracterizan porque el dinucleótido CpG es no metilado. Tales oligonucleótidos se conocen bien y se describen en, por ejemplo el documento WO 96/02555.
Los oligonucleótidos adecuados incluyen:
OLIGO 1: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) [Sec Id nº 44]
OLIGO 2: TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) [Sec Id nº 45]
OLIGO 3: ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG [Sec Id nº 46]
OLIGO 4 TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006, CpG 7909) [Sec Id nº 47]
OLIGO 5 TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) [Sec Id nº 48]
Los oligonucleótidos que contienen CpG también se pueden usar solos o en combinación con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema potenciado implica la combinación de un oligonucleótido que contiene CpG y un derivado de saponina particularmente la combinación de CpG y QS21 como se describe en los documentos WO 00/09159 y WO 00/62800.
La formulación puede adicionalmente comprender una emulsión de aceite en agua y/o tocoferol.
Otro adyuvante adecuado es saponina, por ejemplo QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), que se puede usar sola o en combinación con otros adjuvantes. Por ejemplo, un sistema potenciador implica la combinación de un monofosforilo lípido A y derivado de saponina, tal como la combinación de QS21 y 3D-MPL como se ha descrito en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica donde la QS21 se inactiva con colesterol, como se describe en el documento WO 96/33739. Otras formulaciones adecuadas comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Una formulación de adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en, por ejemplo, una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.
En otra realización, los adyuvantes se pueden formular en una composición liposomal.
La cantidad de 3D-MPL usado es en general pequeña, pero dependiendo de la formulación de agentes inmunoterapéuticos pueden estar en la región de 1 – 1000 µg por dosis, preferiblemente 1 -500µg por dosis, y más preferiblemente entre 1 y 100 µg por dosis.
En una realización, el sistema adyuvante comprende tres inmunoestimulantes: un oligonucleótido CpG, 3D–MPL, y QS21 o bien presentada en una formulación liposomal o una emulsión aceite en agua tal como se describe en el documento WO 95/17210.
La cantidad de CpG u oligonucleótidos inmunoestimuladores en los adyuvantes o agentes inmunoterapéuticos de la presente invención es generalmente pequeña, pero dependiendo de la formulación de agentes inmunoterapéuticos puede estar en la región de 1 – 1000 µg por dosis, preferiblemente 1 – 500 µg por dosis, y más preferiblemente entre 1 a 100 µg por dosis.
La cantidad de saponina para uso en los adyuvantes de la presente invención pueden estar en la región de 1 – 1000 µg por dosis, preferiblemente 1 -500 µg por dosis, más preferiblemente 1 – 250 µg por dosis, y más preferiblemente entre 1 y 100 µg por dosis.
En general, se espera que cada dosis de ser humano comprenda 0,1 -1000 µg de antígeno, preferiblemente 0,1 500 µg, preferiblemente 0.1 -100 µg, lo más preferiblemente 0,1 a 50 µg. Una cantidad óptima para un agente inmunoterapéutico se puede determinar mediante estudios convencionales que implican la observación de respuestas inmunes apropiadas en sujetos vacunados. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de recuerdo espaciadas adecuadamente.
Otros adyuvantes adecuados incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), Ribi Detox, RC-529 (GSK, Hamilton, MT) y otros aminoalquil glucosaminida 4-fosfatos (AGPs).
De acuerdo con lo anterior se proporciona una composición inmunogénica para uso en el procedimiento de la presente invención que comprende un antígeno como se describe en esta memoria descriptiva y un adyuvante, en la que el adyuvante comprende uno o más de 3D-MPL, QS21, un oligonucleótido CpG, un polietilenéter o éster o una combinación de dos o más genes de los adyuvantes. El antígeno dentro de la composición inmunogénica se puede presentar en una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite en un vehículo de emulsión o en una formulación liposomal.
En una realización, el adyuvante puede comprender uno o más de 3D-MPL, QS21 y un oligonucleótido CpG inmunoestimulador. En una realización los tres inmunoestimulantes están presentes. En otra realización 3D-MPL y QS21 están presentes en una emulsión de aceite en agua, y en la ausencia de un oligonucleótido CpG.
Una composición para uso en el procedimiento de la presente invención puede comprender una composición farmacéutica que comprende antígeno asociado a tumor como se describe en esta memoria descriptiva, o una proteína de fusión, en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Ejemplos
Ejemplo 1
Ensayo clínico de melanoma Mage MAGE008:
En este ensayo en marcha, la proteína recMAGE-A3 (proteína de fusión recombinante de mage como se muestra en la Sec Id nº 35) se combina con dos adyuvantes inmunológicamente diferenciales: o bien AS02B (QS21, MPL) o AS15 (QS21, MPL y CpG7909). Los objetivos eran diferenciar entre los adyuvantes en términos de perfil de seguridad, respuesta clínica y respuesta inmunológica.
En este experimento se preparan dos composiciones de adyuvante de mezclas de dos inmunostimulantes:
1.
QS21 (purificada, molécula de saponina de origen natural del árbol suramericano Quillaja Saponaria Molina), y
2.
MPL (derivado destoxificado del lípido A de monofosforilo lípido A 3 de-O-acetilado, derivado de S. minnesota LPS).
AS02B es una emulsión de aceite en agua de QS21 y MPL.
En modelos animales estos adyuvantes se ha mostrado de manera exitosa que inducen respuestas inmunes mediadas por células tanto de tipo humoral como de tipo TH1, que incluyen células CD4 y CD8 T-que producen IFNα (Moore y col., 1999; Gérard y col., 2001). Además, la inyección de proteína recombinante formulada en este tipo de adyuvante conduce a la inducción de una respuesta antitumoral sistémica: de hecho, se mostró que los
animales vacunados están protegidos contra exposiciones con células tumorales murinas modificadas por ingeniería genética para expresar el antígeno de tumor, y tumores de retroceso se mostró que estaban altamente infiltrados por células CD8, CD4 y NK y por macrófagos.
El segundo sistema de adyuvantes es AS15: contiene un tercer inmunoestimulante, a saber CpG7909 (conocido por otra parte CpG 2006 supra), además de MPL y QS21, en una formulación de liposomas.
En modelos animales (principalmente ratones), se ha mostrado que la adición de CpG7909 mejora además las respuestas inmunes y antitumorales inducidas (Krieg y Davis, 2001; Ren y col., 2004). Los oligodesoxinucleótidos CpG (ODNs) estimulan directamente la activación de células dendríticas mediante el desencadenamiento de TLR9. Además, en ratones, la aplicación sistémica de CpG7909 incrementa de gran manera la infiltración de células T en tumores (Meidenbauer y col., 2004).
Compendio del estudio
1. Diseño
El ensayo MAGE008 es:
•
abierto
•
aleatorio
•
de dos brazos (AS02B vs. AS15)
•
con 68 pacientes en total.
Como se ha descrito anteriormente, la proteína recMAGE-A3 se combina con el sistema de adyuvantes o bien AS02B o AS15.
2.
Población de pacientes
La proteína recMAGE-A3 se administra a pacientes con melanoma metastático progresivo con lesiones de piel y/o de ganglios linfáticos regionales o distantes (fase III y fase IV M1a no eliminable por cirugía). La expresión del gen MAGE-A3 por el tumor se determinó mediante PCR cuantitativa. Los pacientes seleccionados no recibieron tratamiento previo para melanoma (recMAGE-A3 se produce como una primera línea de tratamiento) y no tenían enfermedad visceral.
3.
Programa de inmunización
Procedimiento de programas de tratamiento
Escenario de adyuvantes
El procedimiento de programa de tratamiento para uso en enfermedad en un escenario de adyuvantes (después de la operación) puede comprender la administración de un antígeno como se describe en esta memoria descriptiva de acuerdo con los siguientes programas: Administración de antígeno a intervalos de tres semanas para las primeras 5 a 8 vacunaciones, seguido de intervalo de tres meses para las siguientes 8, 9 o más vacunaciones.
El antígeno se puede administrar en el marco del tiempo exacto indicado, o el antígeno se puede proporcionar 1, 2, 3 ó 4 días antes o después del intervalo exacto, según se requiera o como sea práctico. Un ejemplo de este programa se muestra en la tabla más adelante:
Inducción: 5 vacunaciones a intervalos de 3 semanas por ejemplo las semanas 0, 3, 6, 9, 12 o las semanas 0, 6, 9, 12
Mantenimiento: 9 vacunaciones a intervalos de tres meses
Como alternativa, las vacunaciones se pueden administrar inicialmente a intervalos de 2 semanas, por ejemplo 6 inyecciones a intervalos de dos semanas seguido de la terapia de mantenimiento apropiada.
Enfermedad activa
El procedimiento del programa de tratamiento para uso en enfermedad activa o no eliminable por cirugía, por ejemplo en cáncer de melanoma, que comprende: la administración de un antígeno como se ha descrito en esta memoria descriptiva a intervalos de dos o tres semanas durante los primeros seis meses a un año de tratamiento.
Un programa puede comprender el siguiente patrón de inyecciones: el antígeno se puede proporcionar a intervalos de dos semanas durante las primeras 4 a 10 vacunaciones, seguido de intervalos de 3 semanas durante las siguientes 4 a 10 vacunaciones, después a intervalos de 6 semanas durante las próximas 3 a 7 vacunaciones. El tratamiento a largo plazo puede después continuar con vacunaciones a intervalos de tres meses durante 3 a 5 vacunaciones, seguido de intervalos de 6 meses durante las próximas 3 a 5 vacunaciones.
El antígeno se puede administrar en el marco del tiempo exacto, o el antígeno se puede administrar 1, 2, 3 ó 4 días antes o después del intervalo exacto, según se requiera o sea práctico.
Un ejemplo de este programa se muestra más adelante:
Ciclo 1:
6 vacunaciones a intervalos de 2 semanas (semanas 1, 3, 5, 7, 9, 11)
Ciclo 2:
6 vacunaciones a intervalos de 3 semanas (semanas 15, 18, 21, 24, 27, 30)
Ciclo 3:
4 vacunaciones a intervalos de 6 semanas (semanas 34, 40, 46, 52)
Tratamiento a largo plazo:
4 vacunaciones a intervalos de 3 meses, por ejemplo seguido de
4 vacunaciones a intervalos de 6 meses
Para ambas pautas de tratamiento anteriores se pueden proporcionar vacunaciones adicionales después de tratamiento, según se requiera.
Con el fin de seleccionar los participantes potenciales en el ensayo clínico anterior los inventores recibieron biopsias del tumor, antes de la inmunización, en forma de muestras de tumor congeladas. A partir de estas muestras se extrajo ARN para la PCR cuantitativa. La calidad de este ARN purificado era extremadamente alta y era adecuada para análisis de microdisposición. Por lo tanto se analizaron las muestras de tumor mediante microdisposiciones. El objetivo era identificar un conjunto de genes asociados a la respuesta clínica de manera que los pacientes que probablemente se beneficiaran de este agente inmunoterapéutico de cáncer específico de antígeno se identificaran y se seleccionaran apropiadamente. La identificación del perfil génico se ha realizado solamente sobre biopsias de pacientes que firmaron el consentimiento informado para los análisis de microdisposición.
Materiales y Procedimientos
Muestras de tumor
30 muestras de tumor (antes de la vacunación) se usaron a partir del ensayo clínico de melanoma de Mage008 Mage-3. Éstas se conservaron por congelación reciente en la solución de ARN de estabilización RNAposterior.
Purificación de ARN
Se purificó ARN total tumoral usando el procedimiento Tripure – extracción Tripure (Roche Nº de cát. 1 (1 667 165). Los protocolos proporcionados se siguieron posteriormente mediante el uso de un Mini kit RNeasy – protocolo de limpieza con tratamiento con ADNasa (Qiagen Cat. No. 74106).
http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/PDF/RNAStabilizationAndPurification/FromAnimalAndPlantTissuesBac teriaYeastAndFungi/RNY_Mini/1035969_HB.pdf.
www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/napi_man/pdf/chapter4/page_152-158.pdf
Control de calidad de ARN
La cuantificación de ARN se completó inicialmente usando una densidad óptica de 260nm y un kit de ensayo de ARN Quant-IT Ribo-Green (Invitrogen -Molecular probes R11490). http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp11490.pdf.
La calidad de los picos de ARN de ribosoma 28s y 18s se determinó mediante el uso de un bioanalizador Agilent.
Marcaje de ARN y amplificación para análisis de microdisposiciones
Debido al tamaño pequeño de la biopsia recibido durante el estudio clínico se usó un procedimiento de amplificación junto con el marcaje del ARN para el análisis de microdispoosición.
El kit Nugen 3’ ovation biotin (marcaje de 50 ng de ARN -Ovation biotin system Cat; 2300-12, 2300-60)
http://www.nugeninc.com/html/03_products2.html
Se usó una entrada de partida de 50 ng de ARN total.
Microprocesadores de microdisposiciones
Los microprocesadores génicos Affymetrix HU-U133.Plus 2.0 se utilizaron ya que éstos eran los microprocesadores más actualizados (basados en el proyecto de genoma humano) disponibles del proveedor. Estos microprocesadores cubren aproximadamente 47.000 transcripciones génicas potenciales.
Hibridación de microdisposiciones y selección
Los procesadores hibridizados se lavaron y se exploraron de acuerdo con los protocolos convencionales de Affymetrix: los protocolos de análisis de la expresión de procesador de genes Affymetrix se pueden descargar de http://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression_manual.affx.
El explorador que ha de usarse con la estación de trabajo de microdisposición de Affymetrix es http://www.affymetrix.com/products/instruments/specific/scanner_3000.affx
Normalización de datos
Los datos explorados fluorescentes se normalizaron después usando RMA para permitir las comparaciones entre microprocesadores individuales. La siguiente referencia describe este procedimiento.
Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay YD, Antonellis KJ, Scherf U, Speed TP. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 2003 Abril;4(2):249 -64.
Análisis de datos
Se usaron tres procedimientos independientes para generar las listas génicas para distinguir pacientes respondedores de pacientes no respondedores. Los procedimientos son 1. Spotfire, 2. Baldi BH y 3. Arrayminer.
El procedimiento de análisis Baldi están disponibles de los siguientes sitios web.
http://www.igb.uci.edu/~pfbaldi/software_and_servers.htm.
El software spotfire se puede comprar de este sitio http://www.spotfire.com. El software arrayminer está disponible para la compra en
http://www.optimaldesign.com/ArrayMiner/ArrayMiner.htm.
Todos los análisis de datos se realizaron con el uso del software estadístico R (disponible en www.r-project.org) y diversos paquetes Bioconductor para R (disponible en www.bioconductor.org).
Los datos brutos se procesaron previamente para la corrección de fondo, normalización y resumen de sondas por el RMA (Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay YD, Antonellis KJ, Scherf U, Speed TP. Exploration, normalization, y summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 2003 Apr;4 (2): 249 64)
La expresión génica diferencial entre cualquiera de los dos grupos se computó mediante dos procedimientos estadísticos diferentes, los procedimientos RankProduct (Breitling, R., Armengaud, P., Amtmann, A., y Herzyk, P.(2004) Rank Products: A simple, yet powerful, new method to detect differentially regulated genes in replicated microarray experiments, FEBS Letter, 57383 -92) y CyberT (P. Baldi y A.D. Long, "A Bayesian Framework for the Analysis of Microarray Expression Data: Regularized t-Test y Statistical Inferences of Gene Changes", Bioinformatics, 17, 6, 509 -519, (2001)).
En cada uno de ellos, una corrección para el ensayo múltiple se realizó con el procedimiento de Benjamini-Hochberg (Y. Benjamini y Y. Hochberg, Controlling the falso discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing, J. Roy. Stat. Soc. B 57 (1995)), y el umbral del 5% se eligió para la velocidad de descubrimiento falsa; de este modo, los genes tenían que tener unos valores de p corregidos menores o iguales a 0,05 que se consideran como expresados de manera diferencial.
Baldi-BH es equivalente a CyberT seguido de corrección Benjamini-Hochberg.
1. Análisis spotfire
Los resultados de los análisis de las muestras de los pacientes (a partir del programa de investigación clínica
llamado Mage008) se resumen en la figura 1.
Como una primera etapa, la comparación supervisada se realiza con el fin de encontrar un grupo de genes capaces de agruparse. Dos pacientes que mostraban respuesta clínica (paciente 67 y 59) entraron dentro del agrupamiento de no respondedores. Dos pacientes que no eran no respondedores (paciente 3 y 39) entraron dentro del agrupamiento designado como respondedores. Los pacientes respondedores también se encontraron dentro del agrupamiento de sobrecruzamiento (es decir las áreas de superposición en la figura). Sin embargo, existen dos pacientes que son no respondedores que entran dentro de esta área de superposición.
En la Figura 1 Los RESPONDEDORES eran los pacientes 27 y 38 (respondedores clínicos plenos/completos), los pacientes 2, 10, 20, 26-1, 26-2, 59 y 67 (respondedores mixtos) y pacientes 19, 23, 65 y 75 (enfermedad estable). NON-RESPONDEDORES en la Figura 1 eran los pacientes 3, 5, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 28, 30, 36, 37, 39, 52, 55, 56, 60 y 66.
2. Análisis Baldi BH
Este software se diseña para la clasificación estadística de genes supervisada en experimentos de microdisposiciones. Se identificó una lista de los 100 genes más significativos que definía los dos grupos. Véase la figura 2 a continuación. El agrupamiento es más eficaz que con el software spotfire, encontrándose la mayoría de los respondedores en la agrupación de los respondedores. Sin embargo los autores siguen observando los mismos pacientes no respondedores. (pacientes 3, 39), y los pacientes respondedores (67 y 59) que se localizan dentro de los agrupamientos equivocados.
En la figura 2 RESPONDEDORES eran los pacientes 27 y 38 (respondedores clínicos plenos/completos), los pacientes 2, 10, 20, 26-1, 26-2, 59 y 67 (respondedores mixtos) y los pacientes 19, 23, 65 y 75 (enfermedad estable). NO-RESPONDEDORES en la Figura 2 eran los pacientes 3, 5, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 28, 30, 36, 37, 39, 52, 55, 56, 60 y 66.
3. Análisis de Arrayminer
Este software clasifica genes usando un procedimiento de “entrenamiento y ensayo”. En este procedimiento el primer software identifica un conjunto discriminante de marcadores para las clases de entrenamiento, similar a un estudio de validación cruzada clásico.
Aquí debido al análisis existe solamente el agrupamiento respondedor o no respondedor, sin área de superposición. Aquí de nuevo existe una clasificación errónea de muestras, en particular los pacientes 59 y 67 que respondían al tratamiento pero en este análisis estaban en el agrupamiento de no respondedores. Los pacientes 3, 14, 39, 52 y 66 eran no respondedores pero se localizaron en el agrupamiento de respondedores usando este análisis.
En la figura 3 RESPONDEDORES eran los pacientes 27 y 38 (respondedores clínicos plenos/completos), los pacientes 10, 20, 26-1, 26-2, 59 y 67 (respondedores mixtos y pacientes) 19, 23, 65 y 75 (enfermedad estable). NON-RESPONDEDORES en la figura 3 eran los pacientes 3, 5, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 28, 30, 36, 37, 39, 52, 55, 56, 60 y 66.
Combinación de los tres procedimientos
Los tres procedimientos se usaron juntos para encontrar un conjunto común de sondas de genes que definirán la señal con una alta significación. Se creó un diagrama de Venn comparando todos los resultados. Véase la figura 4. Se encontró una lista de 36 conjuntos de sondas que eran comunes con los tres programas. (Tabla 1B). Estos 36 conjuntos de sondas se usaron después para un agrupamiento supervisado de los pacientes que respondían y no respondían. Los genes que se identifican por los 36 conjuntos de sondas forman un aspecto específico de la invención.
Definición de cambio en número de veces
En los programas tales como Arrayminer, se puede calcular el cambio en número de veces de la expresión génica. Esto se muestra en la Tabla 1B y es el cambio en la expresión génica media entre dos grupos, por ejemplo respondedor frente a no respondedor. Se calcula el valor estadístico unido al cambio en número de veces y es más significativo en los genes en los que el nivel de expresión es menos variable entre los pacientes en cada grupo, y la diferencia entre los grupos es mayor.
Expresión génica mostrada en un mapa térmico
La figura 5 es un mapa térmico (representación en diagrama del nivel de expresión de diversos genes para un paciente dado), en los que se pueden ver la expresión individual de los genes representados en los ejes Y mediante una casilla de color y los pacientes en los ejes X. Los valores de expresión de cada gen en todas las muestras se
normalizan hasta una media de cero y una desviación típica de 1, y estos valores normalizados se codifican en un gradiente de colores.
Las disposiciones de Affymetrix tienen 11 pares de sondas disponibles para interrogar cada gen. De manera ideal, la intensidad de señal de todas estas sondas debe ser igual ya que todas ellas interrogan el mismo gen. Sin embargo, existen enormes diferencias entre las sondas individuales en un conjunto de sondas. El patrón de las señales de sonda en un conjunto de sondas se llama “patrón de respuesta de sonda”. El software Robust Multiarray Average" (RMA) usa algoritmos basados en modelos para incorporar la información de múltiples microdisposiciones para calcular la expresión de un gen. Después de la corrección apropiada para el fondo, y normalización cuantil de las intensidades de sonda, el patrón de la respuesta de sonda se ajusta sobre múltiples disposiciones de un modelo aditivo en el software RMA. Estos algoritmos usan los modelos ajustados para detectar sondas de comportamiento anormal, que posteriormente se excluyen para calcular la expresión génica. Por lo tanto, la expresión génica de estos algoritmos basados en modelos se puede esperar que proporcionen resultados más reproducibles. El RMA usa un modelo estocástico para estimar la expresión génica que es potencialmente una forma mejor de estimación de la expresión génica.
Figura 4: Los 36 conjuntos de sondas predictivos corresponden principalmente a la regulación hacia arriba de los genes relacionados con la infiltración y activación inmune. Estos genes incluyen el receptor gamma de la interleuquina – 2, HLA clase II, genes receptores de células T (TRBV19, TRAT1, TRGC2), granzima, y CD69.
Incremento en la eficacia de tratamiento
Como se describe en esta memoria descriptiva, la determinación del perfil del gen ha permitido la identificación de un subconjunto de pacientes que probablemente responden al tratamiento recMAGE-A3. Este subconjunto corresponde a ~30% de la población de pacientes. Los pacientes que tienen el perfil del gen muestran niveles de eficacia mucho más altos de los que se podrían obtener. De hecho, con la identificación temprana de los pacientes susceptibles para la inmunización de anti-MAGE-A3, la eficacia del tratamiento probablemente se incrementará hasta niveles mucho más altos que los tratamientos de cáncer actuales. Esto puede conducir a un mejor acatamiento del paciente. Por ejemplo, en 100 pacientes con melanoma, se encontró que 60 expresaban MAGE-A3. Si todos estos pacientes recibían inyecciones de recMAGE-A3, 10 de ellos respondieron; alcanzando una tasa de eficacia del 15%. Sin embargo, si el perfil del gen se realiza sobre 60 pacientes que expresan MAGE-A3, solamente 14 de ellos de los que se predijo que eran susceptibles a este tratamiento recibieron inyecciones de recMAGE-A3. Los otros 46 pacientes recibieron otro tratamiento. 10 de estos 14 pacientes responderán al tratamiento, alcanzando una tasa de eficacia del 71%.
Perfil génico en otros tipos de tumores
Esta determinación del perfil de gen también se ha realizado en un estudio NSCLC. Sin embargo, como este estudio es ciego, solamente están disponibles los datos preliminares. Se cree que la señal observada en el melanoma también está presente en NSCLC, fases IB y II. Los datos preliminares sugieren que aproximadamente el 30% de los pacientes presentan una señal de perfil génico característico de la respuesta inmune y la infiltración de células inmunes y que sugieren que responderán a tratamiento ASCI.
La figura 5 muestra un perfil de expresión de 30 pacientes individuales para un número de genes.
La Fig 5a muestra los perfiles de expresión para 31 pacientes de dos genes.
Ejemplo 2:
Predicción del resultado clínico de pacientes que usan planteamientos de aprendizaje de máquina.
Materiales y Procedimientos
Muestras de tumores, purificación de ARN, control de calidad, etiquetado y amplificación para análisis de microdisposiciones
Se usaron muestras de tumores (antes de la vacunación) de un ensayo clínico de melanoma de Mage-3 (MAGE008). Se conservaron, se preparó ARN, se etiquetó y se amplificó como en el Ejemplo 1 anterior. Se comprobó la calidad de las muestras de ARN antes de hibridación al procesador del gen. En este Ejemplo, solamente se usaron los datos de las muestras que se consideraron que se hibridaban de manera adecuada al procesador del gen (61 muestras en total).
Procesadores de microdisposiciones, hibridaciones y exploración.
Como en la sección de materiales y procedimientos del primer ejemplo anterior (denominado en esta memoria descriptiva como Ejemplo 1), se emplearon procesadores de genes Affymetrix HG-U133.Plus2.0, y se hibridaron y
se exploraron como se describe en esta memoria descriptiva.
Procesamiento y normalización de datos.
La imagen de datos explorada fluorescente se procesó y se normalizó usando una implementación R 2.3.1 [1] del algoritmo GCRMA [2, 3].
5 Filtración no específica de matriz de expresión génica
Antes del cálculo de la expresión diferencial, se filtró la matriz de expresión génica de una manera no específica (es decir, independientemente de los grupos experimentales). Se usaron 4 procesos:
1. Filtración panp: se derivaron llamadas que indican si un gen se expresa en una muestra dada (llamada presente, P) o no (llamada ausente, A) para todas las mediciones de disposiciones usando el
10 procedimiento panp implementado en el paquete panp R [4]. Solamente se mantuvieron los conjuntos de sondas que muestran al menos una llamada P a lo largo de las muestras experimentales para cálculos posteriores.
2. Filtración SD: se calcularon las desviaciones típicas (SD) de cada conjunto de sondas para todas las
muestras, solamente se mantuvieron conjuntos de sondas que tenían SD por encima del percentil 75 de 15 todas las SD.
3.
Filtración IQR: se calcularon los intervalos interquartila (IQR) de cada conjunto de sondas para todas las muestras, solamente se mantuvieron conjuntos de sondas que tenían IQR por encima del 7º cuantil de todos los IQR.
4.
Filtración SH: las SD de cada conjunto de sondas se calcularon para todas las muestras, el punto medio
20 de la media de los valores más pequeños de la muestra de SD (el intervalo más corto que contiene todos los datos) como se calcula usando la función de la media de los valores más pequeños de la muestra del paquete genefilter [5] en R 2.3.1, solamente se mantuvieron conjuntos de sondas que tenían SD por encima de la media de los valores más pequeños de la muestra para cálculos posteriores.
Cálculo de la expresión diferencial
25 La expresión diferencial entre los grupos de pacientes que muestran un beneficio clínico después de la vacunación
o no (posteriormente denominados grupos Respondedor (R) o No Respondedor (NR) se calculó en el programa R
2.3.1 de acuerdo con 2 procedimientos estadísticos:
1.
ensayo de t regular, como se implementó en el paquete genefilter, y
2.
Un ensayo de t modificado (regularizado, moderado), para explicar las deficientes explicaciones de la
30 varianza específica de gen en el ensayo de t estándar, tal como el procedimiento de Jain y col [6], implementado en el paquete LPE R [7], o el procedimiento de Smyth [8], implementado en el paquete limma R [9], o el procedimiento de Baldi y Long [10], también conocido como Cyber-T [11].
La corrección para el ensayo múltiple controlando la tasa de descubrimiento falsa (FDR) al 5% se realizó en R 2.3.1 con el procedimiento de Benjamini-Hochberg [12] implementado en el paquete multtest [13].
35 Normalizaciones del perfil génico
Para preparar los conjuntos de sondas que tienen niveles bajos y altos de expresión comparable y para poner énfasis en los perfiles diferenciales mejor que los perfiles absolutos, se normalizaron además los datos al nivel de conjunto de sondas. Se usaron dos esquemas de normalización de nivel de gen:
1. Normalización IQR, donde cada medición del conjunto de sondas se resta de su media sobre las muestras 40 y se divide por su IQR.
2. Normalización de puntuación Z, donde cada medición del conjunto de sondas se resta de su media sobre las muestras y se divide por su SD.
Algoritmos de aprendizaje de máquinas
Los 14 algoritmos de aprendizajes de máquina (o reglas predictivas) con interfase en el paquete MLInterfaces [14]
45 que se desarrollan en el programa R 2.3.1 se usaron para entrenar modelos predictivos de resultados clínicos y para predecir los resultados clínicos del paciente de Mage008, en las listas de indicadores calculadas por los procesos de normalización de genes, de la expresión diferencial, de filtración no específica. Estos algoritmos eran, knn (vecino más próximo a k, kNN, función del paquete de clase), nnet (retículo neural), gbm (regresión de recuerdo
generalizada), lvq1 (cuantificación 1 del vector de aprendizaje), naiveBayes (clasificador de bayes ingenuo), svm (máquina del vector de soporte), lda (algoritmo lineal discriminante), rpart (partición repetitiva), stat.diag.da (análisis diagonal discriminante), randomforest (bosque al azar), bagging, ipredknn (paquete ipred de la forma de función vecina más próxima a k, equivalente al paquete de la clase de la forma knn), slda (análisis estabilizado lineal discriminante), pamr (partición alrededor de medoides, también conocido clasificador centroide más próximo a shrunken). Se usaron parámetros por defecto para todos los algoritmos excepto para la regla kNN donde incluso se ensayaron los valores de k que variaban entre 1 y 7. Se usó esquema de validación cruzada de orden 1 (LOO) de interfases ML codificadas en la función xval para la validación cruzada cuando era apropiado, sin volver a calcular la lista de indicadores en cada bucle de validación cruzada. La clasificación errónea se calculó promediando el número de muestras predichas erróneamente con el número total de cada grupo o clase de pacientes (o bien R o NR).
Alguna de las reglas predictivas de interfase de MLIinterfaces (nnet, lda, naiveBayes) se usaron fuera del paquete MLInterfaces como llamada directa para posibilitar el uso de los clasificadores relacionados en conjuntos de datos externos independientemente de los datos usados para entrenar los modelos.
Se empleó el algoritmo MiPP [15, 16], implementado en la genoteca MiPP R y se desarrolló en R 2.3.1, para reducir el número de conjuntos de sondas implicadas en las listas de indicadores. Los mejores indicadores fuera de la lista remitida se seleccionaron como optimización de la validación cruzada de 10 veces de predicciones de análisis lineal discriminante de un conjunto de entrenamiento y reducir posteriormente a indicadores que proporcionan un error de clasificación errónea global optimizada de las predicciones de análisis lineal discriminante de un conjunto de ensayo. El error de clasificación errónea global optimizada se calculó como la relación del número total de pacientes clasificados erróneamente al total de pacientes del conjunto.
Resultados
Estratificación de la muestra de los pacientes para las definiciones de las secciones de entrenamiento y ensayo.
Una subparte de 31 muestras del conjunto de 61 muestras se usó para entrenar y ensayar el modelo de clasificación en un primer intento; las 30 muestras restantes se mantuvieron para evaluaciones de modelos posteriores. Se definieron varias secciones de entrenamiento y ensayo a partir de la subparte del conjunto de datos de 31 muestras. Se usaron las secciones de entrenamiento para calcular la lista de indicadores (es decir, los genes expresados diferencialmente para su uso en la predicción de resultados clínicos de muestras de pacientes) y para establecer los pesos del algoritmo de aprendizaje de máquina para la predicción de los resultados clínicos. Las secciones de ensayo permitieron la evaluación del comportamiento del modelo independientemente de los pacientes usados para construir el modelo predictivo. Las evaluaciones del modelo también se abordaron en las secciones de entrenamiento de acuerdo con un procedimiento de validación cruzada.
Las secciones de entrenamiento y ensayo de la subparte del conjunto de datos de las 31 muestras se definieron como sigue:
1.
Una primera sección de entrenamiento que contiene 5 Respondedores y 5 No Respondedores, dejando 21 pacientes la sección de ensayo;
2.
Una segunda sección de entrenamiento de 10 Respondedores y 11 No Respondedores, dejando 10 pacientes para la sección de ensayo;
3.
Una última sección de entrenamiento que contiene los 31 pacientes (13 Respondedores y 18 No Respondedores). En esta última estratificación no se deja ningún paciente para la sección de ensayos, el modelo de clasificación solamente se evaluaría mediante un procedimiento de validación cruzada.
Identificación del procedimiento de cálculo de expresión diferencial para realizar mejor la clasificación.
Los datos de expresión génica se procesaron previamente y se normalizaron de acuerdo con Material y Procedimientos teniendo en cuenta el conjunto de datos completo. Las expresiones diferenciales (DE) entre los grupos Respondedores y No Respondedores se calcularon para cada sección de entrenamiento / ensayo de acuerdo con diversos procedimientos.
El marco de cálculo de DE se construyó como sigue:
1.
Filtración no específica de la matriz de expresión génica: filtración panp, o no, seguida de filtración o bien SD, IQR o SH, o ninguna.
2.
Cálculo de DE: o bien el ensayo de t o un ensayo de t modificado (regularizado, moderado), tal como el procedimiento de Jain y col, implementado en el paquete LPE R, o el procedimiento de Smyth,
implementado en el paquete limma R, o el procedimiento de Baldi y Long (Cyber-T), seguido de la corrección de ensayo múltiple, o no.
3. Normalizaciones del perfil génico: normalizaciones o bien IQR o de puntuación Z, o ninguna.
Se seleccionaron los procedimientos que minimizan las tasas de clasificación errónea global tanto en las estratificaciones de entrenamiento como en las de ensayo. La tasa de clasificación errónea se obtuvo comparando el resultado clínico predicho proporcionado por una regla predictiva kNN al rendimiento clínico dado.
Se encontraron siete procedimientos DE como que minimizan la tasa de clasificación errónea de acuerdo con la regla kNN:
Ensayo de t sin corrección para ensayo múltiple e independientemente de la filtración panp;
Filtro SH, ensayo de t sin corrección para ensayo múltiple e independientemente de la filtración panp;
Filtro SD, ensayo de t sin corrección para ensayo múltiple;
Filtro SD, ensayo de t sin corrección para ensayo múltiple, normalización de puntuación Z;
Filtro IQR, ensayo de t sin corrección para ensayo múltiple, normalización IQR.
Las tasas de clasificación errónea global minimizada para estos procedimientos eran como sigue:
0% en la estratificación de 5 Respondedores a 5 Non-Respondedores, como se evalúa mediante validación cruzada de orden 1, por lo tanto todos los pacientes se clasificaron correctamente.
20% en la sección de ensayo de 21 pacientes, proporcionada por la predicción directa de estos pacientes del modelo definido del conjunto de entrenamiento de 5 Respondedores a 5 No Respondedores. El 80% de los pacientes se predijo correctamente.
12% para la segregación de 13 Respondedores a 18 No Respondedores, como se determinó por validación cruzada, siendo el 88% de los pacientes predicho correctamente.
Los comportamientos de la otra estratificación de entrenamiento/ensayo no resultó ser informativa (es decir sin procedimiento de DE que converge a una tasa de clasificación errónea minimizada), por lo tanto no mencionadas.
Se prefirió el ultimo procedimiento, filtro IQR, ensayo de t sin corrección para ensayo múltiple, normalización IQR, ya que las tasas de clasificación errónea minimizadas se obtuvieron con un valor mayor de k (k = 5) que los otros seis procedimientos (k = 3). Se anticipó que trabajando con valores mayores de k facilitaría la transposición del modelo predictivo en escenarios adicionales, ya que los valores de k generan modelos más simples que se supone que están menos desviados hacia un conjunto de entrenamiento.
Este procedimiento generó una lista de indicadores de 489 conjuntos de sondas de Affymetrix. La lista de indicadores se proporciona en la Tabla 4A, como identificaciones del conjunto de sondas de Affymetrix junto con los nombres de genes y símbolos.
Validación externa: evaluación independiente del mejor modelo de predicción de resultados clínicos.
El mejor cálculo de DE y procedimiento de tratamiento de expresión génica (filtro IQR, ensayo de t sin corrección para ensayo múltiple, normalización IQR) se usó para construir un modelo predictivo de kNN (k = 5) de la sección de entrenamiento de 13 Respondedores/18 No respondedores.
El resultado clínico de los pacientes independientes que se habían dejado fuera previamente se predijo directamente a partir de este modelo. De estos 30 pacientes independientes solamente 15 eran informativos (es decir que tenían un resultado clínico caracterizado). La tasa de clasificación errónea se calculó en base a estos 15 pacientes informativos para la evaluación del modelo.
De acuerdo con este modelo predictivo, la tasa de clasificación errónea era el 34%, por lo tanto el 66% de pacientes independientes tenía su resultado clínico correctamente predicho.
Mejora del modelo de predicción del resultado clínico mediante otras reglas de clasificación.
En base al mejor procedimiento de DE (y normalización de expresión) como se selecciona con una regla kNN, las reglas de clasificación adicional (predictivas) se ensayaron para incrementar eventualmente el comportamiento del modelo predictivo. Además de kNN, se determinaron otras 13 reglas. Para cada procedimiento de DE seleccionado que se realizó para la regla kNN, cada regla adicional se entrenó sobre la sección de 13 Respondedores/18 No
respondedores del conjunto de datos, su comportamiento predictivo se evaluó en el conjunto de entrenamiento mediante validación cruzada y sobre el conjunto independiente de muestras de 30 pacientes mediante predicción directa.
Las reglas de clasificación adicionales no mejoraban la tasa de clasificación errónea, como se determina mediante validación cruzada en el conjunto de entrenamiento, quedando la menor sin cambiar al 12% de muestras predichas erróneamente (88% de los pacientes asignados a su resultado clínico correcto).
Sin embargo, para el procedimiento de DE anteriormente mencionado, la regla de la retícula neural no mejoró la tasa de clasificación errónea en el conjunto independiente de 15 pacientes informativos de los 30 disponibles, reduciéndola del 34%, como se proporciona por la regla KNN, al 30% (es decir, un paciente adicional predicho correctamente), mientras que se mantiene el menor en la evaluación de validación cruzada del conjunto de entrenamiento. La regla de retícula neural permite después la predicción correcta del 70% de los pacientes independientemente de las usadas para entrenar el modelo.
Además, en una evaluación adicional del comportamiento de modelo predictivo, cuando los resultados clínicos estaban disponibles para las muestras de los 30 pacientes externos, es decir cuando todos los pacientes independientes eran informativos para el cálculo de tasa de clasificación errónea, el error de clasificación errónea más bajo llegó a ser el 26%, que es que el 74% de pacientes se clasificaron correctamente. Este mejor comportamiento obtenido en un conjunto de datos más amplio en términos de número de muestras informativas se proporcionó mediante una regla lda. Una regla naivesBayes también fue capaz de proporcionar una tasa de clasificación errónea del 28%, la predicción de manera correcta del resultado clínico del 72% de pacientes. Sin embargo, la tasa de clasificación errónea usando las reglas kNN y nnet llegó a ser el 35% y el 41% respectivamente. Este comportamiento se basa en el uso de la lista de genes y sondas de la Tabla 4A.
Implementación de los clasificadores preferidos que predice el resultado clínico de biopsias de pacientes adicionales
Para hacer uso en muestras de melanoma metastático del clasificador de la retícula neural ejemplificada, produciendo el 30% de la clasificación errónea en el conjunto de 15 muestras externas informativa, se puede usar el siguiente código R en una sesión R (un programa estadístico):
genoteca(nnet)
conjunto.siembra(1234)
predicción(nn, datos, tipo=”clase”)
donde
-
datos es el marco de datos que contiene los datos de expresión del indicador 489 (Tabla 4A) de las
muestras para clasificar (muestra de GCRMA normalizada y gen de IQR normalizado). Las muestras se
organizan en columnas y los indicadores en filas;
-
nn es el objeto R de la clase nnet mostrada en el Apéndice A.
el clasificador lda (análisis lineal discriminante) se reproduciría programando el siguiente trozo del código R: genoteca(MASS) predicción(lda, datos, tipo=”clases”)
donde datos es como se ha descrito previamente; lda es el objeto R de la clase lda mostrado en el Apéndice B.
El clasificador naïve Bayes funciona en la siguiente codificación de R: genoteca(e1071) predicción(nb, datos, tipo=”clase”)
donde datos es como se ha descrito previamente;
nb es el objeto R de la clase naiveBayes mostrado en el Apéndice C.
Reducción del tamaño de la lista de indicadores de los 489 conjuntos de sondas mientras se mantiene un comportamiento de clasificación idéntico.
Se usó el algoritmo MiPP para determinar si era posible reducir el número de indicadores implicado en el filtro de IQR, ensayo de t sin corrección para ensayo múltiple, normalización de IQR, basado en el modelo predictivo mientras se mantiene la misma tasa de clasificación errónea. De hecho, cuando se trabaja en una lista de indicadores más corta sería más conveniente a efectos de seguimiento de clasificador, por ejemplo tal como la transposición de un formato basado en microdisposiciones a un formato RT-PCR cuantitativo. Los datos de microdisposición de los 489 conjuntos de sondas se remitió al procedimiento MiPP: se seleccionaron conjuntos de 11 sondas de clasificación en la sección de entrenamiento 13 R / 18 NR como siendo suficiente para lograr un error de clasificación errónea global más bajo, y 4 conjuntos de sondas fuera de éstos se identificaron además como mínimo en los datos de 30 muestras externas informativas para obtener la tasa de clasificación errónea global más baja para los pacientes independientes.
La lista de indicadores de los 4 conjuntos de sondas se usó después en predicciones de validación cruzada de orden 1 de la estratificación 13 R / 18 NR de los datos como conjunto de entrenamiento y dirigen la predicción de la sección de 30 pacientes informativos como conjunto de ensayo externo de todas las 14 reglas predictivas. La realización de LOO se incrementó para la mayoría de las reglas (siendo tan alto como el 3% de tasa de clasificación errónea para lda y naiveBayes, entre otros), mientras la tasa de clasificación errónea se estableció en el 28% del conjunto de datos externos bajo las reglas svm y gbm.
La siguiente tabla muestra la identidad de los genes implicados en el modelo de 4 conjuntos de sondas:
ID Conjunto
de Sonda
Símbolo del gen Nombre del gen
207651_at
GPR171 receptor 171 acoplado a la proteína G
205392_s_at
CCL14 ligando 14 de quimioquina (motivo C-C)
212233_at
MAP1B proteína 1 B asociada a microtúbulos
206204_at
GRB14 proteína 14 unida al receptor del factor de crecimiento.
Ejemplo 3:
Predicción del resultado clínico de los pacientes que usan Reacción en Cadena de la Polimerasa (Q-PCR)
Material y Procedimientos
Muestras de tumor y purificación de ARN.
Se usaron 30 muestras de tumor (antes de la vacunación) del ensayo clínico de melanoma MAGE-A3 (MAGE008). Éstas se conservaron y se extrajo el ARN como en el ejemplo 1 anterior.
Síntesis de ADNc y amplificación de PCR cuantitativa
Se retro – transcribieron 2 µg se ARN total en ADNc usando transcriptasa inversa de M-MLV (Invitrogen) y oligo(dT)
o cebadores al azar.
Los diferentes genes de interés se amplificaron mediante PCR cuantitativa usando la química de TaqMan y sistema de detección de 7900 secuencias (Applied Biosystems).
Se amplificaron los genes usando placas de 96 pocillos convencionales o el TaqMan® Immune Profiling Array (TaqMan Low density arrays -TLDA -Applied Biosystems). Los TLDA están listos para usar placas de 384 pocillos recubiertas previamente con cebadores y sondas.
El aparato 7900 es un sistema completamente integrado para la detección en tiempo real de PCR que incluía un ciclador térmico de 96 pocillos o de TLDA, un láser para inducir fluorescencia, un detector de dispositivo acoplado a carga, un ordenador y un software de detección de secuencias a tiempo real.
En placas convencionales de 96 pocillos, el ADNc correspondiente a 50 ng del ARN total se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando el Kit TF,TAQMAN,PCR CORE REAGENT (Applied Biosystems). Los cebadores y las sondas se enumeran en la Tabla 5.
Para el TaqMan® Immune Profiling Array, se amplificó el ADNc correspondiente a solamente 1 ng de ARN mediante reacción en cadena de la polimerasa usando el KIT TF,TAQMAN,PCR CORE REAGENT (Applied Biosystems). Los genes incluidos en la disposición se enumeran en la Tabla 6.
Procesamiento y normalización de datos
Todos los datos de PCR se normalizaron contra H3F3A (placas de 96 pocillos convencionales) o la media geométrica de los genes constitutivos GUSB y PGK1 (TLDA) (también denominados genes constantes). Los valores de expresión se transformaron después en log.
Análisis estadístico univariado
Se realizaron los análisis de varianza (ANOVA1) usando el software SAS para seleccionar significativamente los genes capaces de diferenciar grupos de respondedor de no respondedor. El primer grupo se compuso de 14 pacientes respondedores, el segundo se compuso de 15 pacientes no respondedores. Cada gen se analizó independientemente de los otros.
Los genes IL7R, CD3D, CD52, UBD, GPR171, GMZK, PRKCQ, STAT4, TRDV2, TRAT1, TRBV19, CD69, INDO1, CD45R, CD45RO, FoxP3, CD20, CCL5, FASLG, GNLY, GZMB, PRF1, IFNG, ICOS, TBX21, CD8A, CD3E, CXCL10, CXCL11, IRF1, TLR7 y CXCR3 se seleccionaron para determinar su capacidad para diferenciar ambos grupos. El valor de p era <0,0001 para cada gen. Para cada gen, se probó una diferencia significativa entre medias (respondedor/no respondedor). Las relaciones de la media geométrica entre ambos grupos se calcularon también para todos los genes (Tabla 7A) y varían entre 3,4 y 21,2.
Análisis de correlación
Se calculó una matriz de correlación (Tabla 8) entre 30 genes que muestra que todos los genes están muy bien correlacionados.
Modelo de regresión logística
Se realizó un análisis mediante regresión logística usando Proc logistic (sofware SAS). Se usa a menudo el análisis
de regresión logística para investigar la relación entre respuestas binarias y un conjunto de variables explicativas. El número de predictores es demasiado grande y el uso de todas las regresiones posibles no es factible. Así, se empleó la selección por etapas. Este procedimiento proporciona un modelo con un buen valor (alto) para un criterio especificado: puntuación Chi – cuadrado. Esto es análogo al uso de SSE o R2 en regresión lineal múltiple.
La información modelo es:
Datos: 29 pacientes y 111 genes.
Variable de respuesta: estado clínico
Número de nivel de respuesta: 2 (respondedor -no respondedor)
Modo: logit binario
Técnica de optimización: puntuación de Fisher El modelo que proporciona el mayor valor de la puntuación de Chi -cuadrado (Chi -cuadrado = 16 y valor de p < 0,0001) es: Logit (p) = 7,69 + 5,07 log(PRF1), siendo p la probabilidad de ser respondedor Coeficiente B0 (7,69) y B1 (5,07) son significativos (p < 0,005) Se puede usar otro criterio para usar la bondad del criterio Relación de probabilidad: 23,1429 (chi-cuadrado) y < 0,001 (valor de p) Wald:6,9250 (chi-cuadrado) y < 0,001 (valor de p)
Similar en regresión lineal, se computa un R2: 0,55. De los 111 genes, 18 (con solamente un predictor) se enumeran en la Tabla 9. Cuanto mayor es el R2(%) y puntuación de chi-cuadrado mejor es el modelo/gen.
Usando el modelo PRF1, es posible clasificar correctamente el 86,6 % de los pacientes.
La Tabla 10 proporciona el porcentaje de clasificación correcta calculado usando el modelo de regresión logística para otros genes.
La combinación de más de 1 gen no mejoró el comportamiento de clasificación.
Análisis Genex
Los 30 pacientes también se clasificaron usando PCA (Principal Component Analysis) y análisis de retícula neural del software Genex con los genes PRF1, GZMB, GNLY, CD8A, PRKCQ, FOXP3, IFNG, CCL5, GPR171 y TRBV19.
Para el análisis de retícula neural, se usaron 5 pacientes respondedores (Paciente ID números 27, 53, 65, 119, 127) y 5 pacientes no respondedores (Paciente ID números 8, 60, 66, 81, 160) como conjunto de entrenamiento. Los 20 pacientes restantes se usaron como conjunto de entrenamiento.
La figura 6 muestra el Análisis de Componente Principal usando los genes PRF1, GZMB, GNLY, CD8A, PRKCQ, FOXP3, IFNG, CCL5, GPR171 y TRBV19.
Se puede observar que los respondedores se agrupan en el lado izquierdo de la figura 6 y los no respondedores se agrupan en el lado derecho de la figura. Los pacientes etiquetados 85, 3 y 154 se clasifican erróneamente. Por lo tanto, el porcentaje de clasificación “correcta” es 85% usando el PCA. El planteamiento de retícula neural confirma un intervalo de clasificación correcta del 85%.
Comparación: Microdisposición para los datos de Q-PCR. 17 genes (Tabla 12) evaluados por la tecnología Q-PCR estaban ya presentes en las listas de genes de microdisposiciones. Estos genes son por lo tanto capaces de discriminar pacientes respondedores de no respondedores independientemente de la tecnología usada para
detectarlos.
Tabla 12 Genes presentes en microdisposiciones y lista Q-PCR.
Símbolo del gen
Título del gen
CCL5
Ligando 5 de quimioquina (motivo C-C)
TRAT1
adaptador 1 de transmembrana asociado a receptor de células T
STAT4
Transductor de señal y activador de la transcripción 4
PRKCQ
proteína quinasa C, theta
GPR171
receptor 171 acoplado a la proteína G
UBD
ubiquitina D
CD52
Molécula CD52
CD3D
Molécula CD3d, delta (complejo CD3-TCR)
PRF1
perforina 1 (proteína formadora de poros)
CD8A
Molécula CD8a
CXCL10
Ligando 10 de quimioquina (Motivo C-X-C)
CD69
Molécula CD69
TRBV19
variable 19 del receptor beta de células T
TRDV2
variable 2 del receptor delta de células T
IL7R
Receptor de interleuquina 7
GZMK
granzima K
PROTEINA-TIROSINA FOSFATASA, TIPO DE RECEPTOR, C (PTPRC) CD45R
Catorce genes (Tabla 13) eran capaces de discriminar pacientes respondedores de no respondedores usando la tecnología Q-PCR , que no estaban presentes en las listas de genes de microdisposiciones. Esto se puede deber a 5
la sensibilidad aumentada de la tecnología Q-PCR comparada con la microdisposición.
Tabla 13. Gen usado para clasificar los pacientes que usan tecnología de Q-PCR, ausente en las listas de genes de microdisposiciones.
Símbolo del
Título del Gen
gen
FASLG
Ligando Fas (superfamilia TNF, elemento 6)
GNLY
granulisina
granzima B (granzima 2, serina esterase 1 asociada a linfocitos T citotóxicos) GZMB
IFNG interferón, gamma
ICOS co-estimulator de células T inducible
TBX21 casilla 21 de T
CD3E molécula CD3e, epsilon (complejo CD3-TCR)
CXCL11 Ligando 11 de quimioquina (Motivo C-X-C)
CXCR3 Receptor 3 de quimioquina (Motivo C-X-C)
CD20 molécula CD20
FOXP3 forkhead box P3
INDO indolamina-pirrol 2,3 dioxigenasa
IRF1 factor 1 regulador de interferón
TLR7 Receptor 7 de tipo toll Algunos genes están ausentes en la señal de microdisposiciones, pero se sabe que se expresan por medio de células inmunológicas, y de este modo también son capaces de predecir el resultado clínico de los pacientes. La presencia de una infiltración inmune en el tejido tumoral parece que sea el hecho biológico más importante para predecir el resultado clínico de los pacientes en lugar de solamente una lista limitada de genes.
Por ejemplo, PRF1 y CD8A están presentes en las listas de genes de microdisposiciones y se expresan por los linfocitos CD8 T. Los infocitos CD8 T expresan también IFNG, que están ausentes en las listas de genes de microdisposiciones. No obstante, una buena predicción de la respuesta clínica se logró usando este gen por PCR.
El número de pacientes clasificados erróneamente usando datos de microdisposiciones permanece en el mismo intervalo que el agrupamiento y enfoques KNN que usan datos de microdisposición. Por lo tanto se pueden usar diferentes tecnologías y softwares para clasificar los pacientes. Ejemplo 4: Predicción del resultado clínico de pacientes usando planteamiento de agrupamiento jerárquico. Material y Procedimientos
Muestras de tumores y purificación de ARN.
Se usaron 67 muestras de tumores (antes de la vacunación) del ensayo clínico de melanoma de MAGE-A3 (MAGE008). Éstas se conservaron, se preparó el ARN, se controló la cantidad, se etiquetó y se amplificó como en el Ejemplo 1 anterior. La cantidad de las muestras de ARN se comprobó antes de la hibridación al procesador del gen.
Procesadores de microdisposición, hibridaciones y exploración
Como en la sección de material y procedimientos (denominada en esta memoria descriptiva como el Ejemplo 1), se emplearon los procesadores de gen Affymetrix HG-U133.Plus2.0, y se hibridaron y se exploraron como en el Ejemplo 1.
Procesamiento y normalización de datos.
La imagen de datos explorada fluorescente se procesó y se normalizó usando una implementación R 2.3.1 del algoritmo GCRMA como se describe en el Ejemplo 2.
Selección de la lista de genes
Se seleccionaron 41 conjuntos de sondas para discriminar pacientes respondedores de no respondedores usando el software Arrayminer descrito en el Ejemplo 1.
Los parámetros de análisis eran:
•
Evaluación de entrenamiento y de ensayo
•
Pre-definición de 2 clases
a.
Clases de Respondedor: PID2, PID65, PID75, PID20, PID10, PID19, PID23, PID26, PID27, PID38, PID67
b.
Clases de Non Respondedor: PID14, PID52, PID66, PID37, PID16, PID13, PID55, PID56, PID5, PID60, PID8
en las que PID se refiere al número de identificación del paciente (es decir la etiqueta numérica dada al paciente)
•
Número máximo de marcadores por clase: 25
•
Número de marcadores por pareja: 1
•
Permiten marcadores de multiclases: Sí
•
Usan clasificación de KNN: No se usó el procedimiento de votación registrado.
Se obtuvo una lista de 50 conjuntos de sondas. Se retiraron 9 conjuntos de sondas debido al estado de ausencia en todas las muestras. Las intensidades de los 41 conjuntos de sondas para los 22 pacientes enumerados anteriormente se enumeran en las Tablas 11A y 11B.
Predicción del estado clínico
El estado clínico de los 67 pacientes se predijo usando el planteamiento de agrupamiento jerárquico del software Spotfire.
Los datos se normalizaron con respecto a los genes usando un cálculo de puntuación Z disponible en Spotfire antes de realizar el agrupamiento jerárquico.
Las opciones de cálculo del agrupamiento jerárquico eran:
•
Procedimiento de agrupamiento: enlace completo
•
Medición de la similitud: distancia euclídea
•
Función de ordenación: valor medio
Este agrupamiento se realizó para pacientes incluidos en los brazos AS15 (Figura 7 y 8) o AS02B (Figura 9 y 10).
Usando el planteamiento de agrupamiento jerárquico, aproximadamente el 58% de los pacientes tienen la señal de respondedor independientemente del grupo de adyuvante.
El 100% y 87,5% de pacientes con un beneficio clínico se agruparon respectivamente en los grupos AS15 y AS02b. El 71% y 52% de pacientes con una enfermedad progresiva se agruparon respectivamente en los grupos AS15 y AS02b.
En el agrupamiento de beneficio clínico, el 28% y 55% de los pacientes tiene una enfermedad progresiva respectivamente en los grupos AS15 y AS02b. El porcentaje de pacientes con un perfil génico respondedor de acuerdo con la invención, que lograron un beneficio clínico a la vacunación de MAGE-A3 cuando se usó el adyuvante AS15, era mayor que el porcentaje que logró un beneficio clínico a la vacunación de MAGE-A3 cuando se empleó en la formulación el adyuvante AS02b.
Ejemplo 5
Inducción de un perfil de respondedor.
La biopsia inicial (muestreada antes de la irradiación) del paciente 59 no tenía la señal del respondedor mientras que su segunda biopsia (muestreada después de la irradiación) tenía la señal del respondedor (datos no mostrados) que sugieren que la irradiación de lesiones puede inducir la señal de respondedor.
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Tabla 4A: Tabla de unión de la identificación del conjunto de sondas y la lista de genes de la Tabla 4.
ID del conjunto de sondas
Símbolo del gen Nombre del gen
218802_at
FLJ20647 NA (no aplicable)
224774_s_at
NAV1 navegador 1 de neuronas
207651_at
GPR171 Receptor 171 acoplado a la proteína G
205392_s_at
CCL14 ligando 14 de quimioquina (motivo C-C )
1555229_a_at
C1S componente 1 de complemento, subcomponente s
209774_x_at
CXCL2 Ligando 2 de quimioquina (Motivo C-X-C)
211796_s_at
TRBV3-1 variable 3-1 del receptor beta de células T
210972_x_at
TRDV2 variable 2 del receptor delta de células T
210251_s_at
RUFY3 Dominio RUN y FYVE domain que contiene 3
225502_at
DOCK8 dedicador de citoquinesis 8
204224_s_at
GCH1 Ciclohidrolasa 1 de GTP (distonía sensible a dopa)
218950_at
CENTD3 centaurina, delta 3
218322_s_at
ACSL5 elemento 5 de la familia de cadena larga de la acil-CoA sintetasa
228094_at
AMICA1 Molécula de adhesión, interactúa con el antígeno 1 de CXADR
204116_at
IL2RG receptor de interleuquina 2, gamma (inmunodeficiencia combinada grave)
202643_s_at
TNFAIP3 factor de necrosis tumoral, proteína 3 inducida por alfa
209606_at
PSCDBP homología de pleckstrina, Sec 7 y dominios enrollados en espiral, proteína de unión
205225_at
ESR1 receptor 1 de estrógeno
213193_x_at
TRBC1 Constante 1 del receptor beta de células T
204661_at
CD52 Antígeno CD52 (Antígeno CAMPATH-1)
216920_s_at
LOC442535 NA
210915_x_at
TRBV19 Variable 19 del receptor beta de células T
226218_at
IL7R receptor de interleuquina 7
209670_at
TRAC constante del receptor alfa de células T
209949_at
NCF2 Factor 2 citosólico de neutrófilos (65kDa, enfermedad granulomatosa crónica, autosómica 2)
226697_at
LOC92689 NA
206666_at
GZMK c ("granzima K (granzima 3", " triptasa II)")
235831_at
NA NA
1555630_a_at
RAB34 RAB34, familia de oncogenes del elemento RAS
207977_s_at
DPT dermatopontina
1558290_a_at
PVT1 Homólogo del oncogen Pvt1, activador MYC (ratón)
215806_x_at
TRGC2 constante 2 del receptor gamma de células T
64064_at
GIMAP5 GTPasa, elemento 5 de la familia IMAP
34210_at
CD52 Antígeno CD52 (Antígeno CAMPATH-1)
213539_at
CD3D Antígeno CD3d, polipéptido delta (Complejo TiT3)
232313_at
TMEM132C proteína 132C de transmembrana
201502_s_at
NFKBIA Factor nuclear del potenciador del polipéptido ligero kappa en inhibidor de células B, alfa
211902_x_at
TRA@ Locus del receptor alfa de células T
217147_s_at
TRAT1 Adaptador 1 de transmembrana asociado al receptor de células T
211144_x_at
LOC442535 NA
224710_at
RAB34 RAB34, familia de oncogenes del elemento RAS
209795_at
CD69 Antígeno CD69 (p60, antígeno de activación de células T temprana)
232843_s_at
DOCK8 dedicador de citoquinesis 8
218805_at
GIMAP5 GTPasa, elemento 5 de la familia IMAO
204057_at
IRF8 factor 8 regulador de interferón
214470_at
KLRB1 subfamilia B del receptor de tipo lectina de células asesinas, elemento 1
236280_at
NA NA
201474_s_at
ITGA3 integrina, alfa 3 (antígeno CD49C, alfa 3 subunidad del receptor VLA3)
235421_at
MAP3K8 quinasa 8 de quinasa de la proteína quinasa activada por mitógenos
228532_at
C1orf162 marco abierto de lectura 162 del cromosoma 1
205890_s_at
UBD ubiquitina D
209813_x_at
TRGV9 Variable 9 del receptor gamma de células T
224772_at
NAV1 navegador 1 de neuronas
224451_x_at
ARHGAP9 protein 9 de activación de la Rho GTPasa
226117_at
TIFA NA
213068_at
DPT dermatopontina
1569942_at
NA NA
219243_at
GIMAP4 GTPasa, Elemento 4 de la familia IMAP
202957_at
HCLS1 sustrato 1 de Lyn específico de células hematopoyéticas
218764_at
PRKCH Proteína quinasa C, eta
206118_at
STAT4 transductor y activador de señal de la transcripción 4
236203_at
HLA-DQA1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ alfa 1
206170_at
ADRB2 adrenérgico, beta-2-, receptor, superficie
239237_at
NA NA
214450_at
CTSW catepsina W (linfodolor)
201497_x_at
MYH11 miosina, polipéptido pesado 11, músculo liso
219777_at
GIMAP6 GTPasa, elemento 6 de la familia IMAP
211654_x_at
HLA-DQB1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ beta 1
205758_at
CD8A Antígeno CD8, polipéptido alfa (p32)
202644_s_at
TNFAIP3 factor de necrosis tumoral, proteína 3 inducida por alfa
1558034_s_at
CP ceruloplasmina (ferroxidasa)
223235_s_at
SMOC2 unión 2 de calcio modular relacionado con SPARC
232234_at
C20orf24 marco abierto de lectura 24 del cromosoma 20
1559584_a_at
C16orf54 marco abierto de lectura 54 del cromosoma 16
205831_at
CD2 Antígeno CD2 (p50), receptor de glóbulos rojos de oveja
203812_at
SLIT3 homólogo 3 de abertura (Drosophila)
222780_s_at
BAALC cerebro y leucemia aguda, citoplásmico
218145_at
TRIB3 homólogo 3 de tribbles (Drosophila)
242881_x_at
LOC440160 NA
1558972_s_at
C6orf190 marco abierto de lectura 190 del cromosoma 6
229723_at
TAGAP Proteína de activación de la GTPasa de activación de las células T
235391_at
FAM92A1 familia con similitud de secuencia 92, elemento A1
219938_s_at
PSTPIP2 Proteína 2 que interactúa con la prolina-serina-treonina fosfatasa
212587_s_at
PTPRC proteína tirosina fosfatasa, tipo de receptor, C
210982_s_at
HLA-DRA complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DR alfa
211200_s_at
EFCAB2 dominio 2 de unión a calcio de mano EF
210260_s_at
TNFAIP8 factor de necrosis tumoral, proteína 8 inducida por alfa
228869_at
SLIC1 NA
205987_at
CD1C Antígeno CD1c
213888_s_at
TRAF3IP3 Proteína 3 que interactúa con TRAF3
212671_s_at
HLA-DQA1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ alfa 1
242986_at
NAV1 navegador 1 de neuronas
212999_x_at
HLA-DQB1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ beta 1
212588_at
PTPRC proteína tirosina fosfatasa, tipo de receptor, C
212592_at
IGJ polipéptido de inmunoglobulina J, proteína de engarce para inmunoglobulina alfa y polipéptidos mu
203471_s_at
PLEK pleckstrina
209671_x_at
TRA@ Locus del receptor alfa de células T
228054_at
TMEM44 Proteína de transmembrana 44
216191_s_at
TRA@ Locus del receptor alfa de células T
205419_at
EBI2 gen 2 inducido del virus de Epstein-Barr (receptor acoplado a la proteína G específica de linfocitos)
220330_s_at
SAMSN1 Dominio SAM, dominio SH3 y señales de localización nuclear, 1
213008_at
KIAA1794 KIAA1794
201425_at
ALDH2 Familia de la aldehído deshidrogenasa 2 (mitocondrial)
1552613_s_at
CDC42SE2 CDC42 efector 2 pequeño de CDC42
205696_s_at
GFRA1 receptor alfa 1 de la familia GDNF
211339_s_at
ITK quinasa de células T inducible por IL2
208894_at
HLA-DRA complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DR alfa
228071_at
GIMAP7 GTPasa, elemento 7 de la familia IMAP
222496_s_at
FLJ20273 NA
206687_s_at
PTPN6 proteína tirosina fosfatasa, tipo 6 no receptor
210375_at
PTGER3 Receptor de la prostaglandina E 3 (subtipo EP3)
219440_at
RAI2 inducido 2 de ácido retinoico
208450_at
LGALS2 lectina, union de galactósido, soluble, 2 (galectina 2)
203665_at
HMOX1 hemo oxigenasa (desciclación) 1
227995_at
NA NA
227346_at
ZNFN1A1 proteína de dedo de cinc, subfamilia 1A, 1 (Ikaros)
205159_at
CSF2RB receptor del factor 2 de estimulación de colonias, beta, baja afinidad (granulocito-macrófago)
205559_s_at
PCSK5 Subtilisina de proproteína convertasa / tipo 5 de klexina
212886_at
CCDC69 dominio enrollado en espiral que contiene 69
1552612_at
CDC42SE2 Efector 2 pequeño de CDC42
205488_at
GZMA granzima A (granzima 1, citotóxica serina esterasa 3 asociada a linfocitos T)
217767_at
C3 componente 3 de complemento
208296_x_at
TNFAIP8 factor de necrosis tumoral, proteína 8 inducida por alfa
223484_at
C15orf48 marco abierto de lectura 48 del cromosoma 15
204070_at
RARRES3 respondedor del receptor de ácido retinoico (inducido por tazaroteno) 3
214719_at
LOC283537 NA
209687_at
CXCL12 ligando 12 de quimioquina (Motivo C-X-C) (factor 1 derivado de estroma)
224773_at
NAV1 navegador 1 de neuronas
231882_at
NA NA
215223_s_at
SOD2 superóxido dismutasa 2, mitocondrial
232617_at
CTSS catepsina S
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CTBP2 proteína de unión 2 C-terminal
219528_s_at
BCL11B B-célula CLL/linfoma 11B (proteína de dedo de cinc)
207861_at
CCL22 Ligando 22 de quimioquina (motivo C-C)
222592_s_at
ACSL5 elemento 5 de la familia de la acil-CoA sintetasa de larga cadena
1554966_a_at
DOC1 NA
204204_at
SLC31A2 familia 31 del vehículo de soluto (transportadores de cobre), elemento 2
219926_at
POPDC3 Dominio popeye que contiene 3
204135_at
DOC1 NA
217995_at
SQRDL Tipo sulfuro quinona reductasa (levadura)
230233_at
RASGEF1B familia del dominio RasGEF, elemento 1B
227265_at
FGL2 tipo 2 de fibrinógeno
228372_at
C10orf128 marco abierto de lectura 128 del cromosoma 10
204912_at
IL10RA Receptor de interleuquina 10, alfa
219454_at
EGFL6 Dominio de tipo EGF, multiple 6
206295_at
IL18 interleuquina 18 (factor de inducción gamma de interferón)
226219_at
ARHGAP30 proteína 30 de activación de la Rho GTPasa
218736_s_at
PALMD palmdelfina
223322_at
RASSF5 familia 5 del dominio de asociación de RAS Ras (RalGDS/AF-6)
209603_at
GATA3 proteína de unión 3 de GATA
204687_at
DKFZP564O08 23 NA
222895_s_at
BCL11B B-célula CLL/linfoma 11B (proteína de dedo de cinc)
201010_s_at
TXNIP proteína de interacción de tioredoxina
226818_at
DTX4 Homólogo deltex 4 (Drosophila)
208335_s_at
DARC Grupo sanguíneo de Duffy, receptor de quimioquina
213566_at
RNASE6 ribonucleasa, familia de RNasa A, k6
205685_at
CD86 Antígeno CD86 (ligando 2 del antígeno CD28, antígeno B7-2)
201531_at
ZFP36 proteína de dedo de cinc 36, C3H tipo, homólogo (ratón)
202391_at
BASP1 Abundante en cerebro, proteína 1 de señal aunida a membrana
201804_x_at
CKAP1 proteína 1 asociada a citoesqueleto
206082_at
HCP5 HLA complejo P5
206204_at
GRB14 proteína 14 de unión al receptor del factor de crecimiento
228563_at
GJA7 Proteína de unión gap, alfa 7, 45kDa (conexina 45)
219054_at
FLJ14054 NA
205844_at
VNN1 vanina 1
203741_s_at
ADCY7 adenilato ciclasa 7
223280_x_at
MS4A6A Dominios de extensión – 4 de membrana, subfamilia A, elemento 6A
205624_at
CPA3 carboxipeptidasa A3 (mastocitos)
209193_at
PIM1 Oncogen pim-1
210072_at
CCL19 ligando 19 de ºquimioquina (Motivo C-C)
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SYK tirosina quinasa de bazo
216155_at
NAV1 navegador 1 de neuronas
205484_at
SIT1 adaptador 1 de transmembrana que regula el umbral de señalización
228812_at
NA NA
219368_at
NAP1L2 tipo 2 de la proteína 1 del ensamblaje de nucleosoma
206407_s_at
CCL13 ligand 13 de quimioquina (Motivo C-C)
203761_at
SLA Adaptador de tipo Src
236295_s_at
NOD3 NA
206099_at
PRKCH Proteína quinasa C, eta
217143_s_at
TRD@ Locus delta del receptor de células T
218899_s_at
BAALC cerebro y leucemia aguda, citoplásmico
229391_s_at
RP1-93H18.5 NA
219093_at
FLJ20701 NA
219710_at
SH3TC2 Dominio SH3 y repeticiones 2 de tetratricopéptido 2
206978_at
CCR2 Receptor 2 de quimioquina (Motivo C-C)
204655_at
CCL5 ligando 5 de quimioquina (Motivo C-C)
211991_s_at
HLA-DPA1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DP alfa 1
223922_x_at
MS4A6A dominios de extensión -4 de membrana, subfamilia A, elemento 6A
208983_s_at
PECAM1 Molécula de adhesión de plaquetas/células endoteliales (antígeno CD31)
222108_at
AMIGO2 Molécula de adhesión con el dominio 2 de tipo Ig
1553102_a_at
CCDC69 dominio enrollado en espiral que contiene 69
221698_s_at
CLEC7A familia 7 del dominio lectina de tipo C, elemento A
206637_at
P2RY14 receptor P2Y purinérgico, Acoplado a la proteína G, 14
226459_at
PIK3AP1 proteína 1 del adaptador de quinasa de fosfoinosítido -3
209613_s_at
ADH1B alcohol deshidrogenasa IB (clase I), polipéptido beta
225802_at
TOP1MT topoisomerasa (DNA) I, mitocondrial
224859_at
CD276 Antígeno CD276
209480_at
HLA-DQB1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ beta 1
219213_at
JAM2 Molécula 2 de adhesion de unión
208747_s_at
C1S componente 1 de complemento, subcomponentes
224356_x_at
MS4A6A dominios de extensión -4 de membrana, subfamilia A, elemento 6A
226625_at
TGFBR3 factor de crecimiento de transformación, beta receptor III (betaglicano, 300kDa)
1554240_a_at
ITGAL c("integrina, alfa L (antígeno CD11A (p180), antígeno 1 asociado a la función de linfocitos ", " polipéptido alfa)")
202948_at
IL1R1 Receptor de interleuquina 1, tipo I
219666_at
MS4A6A dominios de extensión -4 de membrana, subfamilia A, elemento 6A
215193_x_at
HLA-DRB1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DR beta 1
232024_at
GIMAP2 GTPasa, elemento 2 de la familia IMAP
1559263_s_at
ZC3H12D Tipo CCCH de dedo de cinc que contiene 12D
219737_s_at
PCDH9 protocadherina 9
222838_at
SLAMF7 elemento 7 de la familia SLAM
227983_at
MGC7036 NA
223809_at
RGS18 regulador de la señalización 18 de la proteína G
213831_at
HLA-DQA1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ alfa 1
203416_at
CD53 Antígeno CD53
226841_at
MPEG1 NA
228552_s_at
SSBP4 ADN de una sola cadena que se une a la proteína 4
231262_at
NA NA
206898_at
CDH19 cadherina 19, tipo 2
210835_s_at
CTBP2 proteína de unión 2 C-terminal
227584_at
NAV1 navegador 1 de neuronas
223059_s_at
FAM107B familia with sequence similarity 107, elemento B
221671_x_at
IGKC constante de inmunoglobulina kappa
205786_s_at
ITGAM integrina, alfa M (subunidad del componente 3 de complemento receptor 3)
216194_s_at
CKAP1 protein 1 asociada a citoesqueleto
209312_x_at
HLA-DRB1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DR beta 1
235639_at
CDH19 cadherina 19, tipo 2
233562_at
MGC16291 NA
232476_at
DDEF2 factor 2 de potenciación del desarrollo y diferenciación
202510_s_at
TNFAIP2 factor de necrosis tumoral, proteína 2 inducida por alfa
222484_s_at
CXCL14 ligando 14 de quimioquina (Motivo C-X-C)
207277_at
CD209 antígeno CD209
204724_s_at
COL9A3 colágeno, tipo IX, alfa 3
239196_at
ANKRD22 dominio 22 de repetición de anquirina
209734_at
NCKAP1L Tipo de proteína 1 asociada a NCK
212977_at
CMKOR1 receptor 1 huérfano de quimioquina
204670_x_at
HLA-DRB5 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DR beta 5
208885_at
LCP1 proteína citosólica de linfocitos 1 (L-plastina)
209612_s_at
ADH1B alcohol deshidrogenasa IB (clase I), polipéptido beta
233955_x_at
CXXC5 CXXC dedo 5
228776_at
GJA7 Proteína de unión gap, alfa 7, 45kDa (conexina 45)
1553906_s_at
FGD2 dominio de FYVE, RhoGEF y PH que contiene 2
221760_at
MAN1A1 mannosidasa, alfa, clase 1A, elemento 1
223361_at
C6orf115 marco abierto de lectura 115 del cromosoma 6
229390_at
RP1-93H18.5 NA
203915_at
CXCL9 ligando 9 de quimioquina (Motivo C-X-C)
223058_at
FAM107B Familia con similitud de secuencia 107, elemento B
219789_at
NPR3 receptor C de péptido natriurético/guanilato ciclasa C (receptor C de péptido atrionatriurético)
205285_s_at
FYB proteína de unión FYN (FYB-120/130)
203868_s_at
VCAM1 molécula 1 de adhesión a las células vasculares
204236_at
FLI1 integración 1 de virus de leucemia de Friend
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CXXC5 CXXC dedo 5
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TRAM2 proteína 2 de membrana asociada a traslocación
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IGKC Constante de inmunoglobulina kappa
235238_at
SHC4 Familia SHC (que contiene dominio de homología 2 de Src) familia, elemento 4
227791_at
SLC9A9 familia 9 de vehículo de soluto (intercambiador de sodio/hidrógeno), elemento 9
207238_s_at
PTPRC proteína tirosina fosfatasa, tipo de receptor, C
204897_at
PTGER4 Receptor 4 de la prostaglandina E (subtipo EP4)
213975_s_at
LILRB1 Receptor de tipo de inmunoglobulina de leucocitos, subfamilia B (con dominios TM y ITIM), elemento 1
228964_at
PRDM1 dominio de PR que contiene 1, con dominio ZNF
228362_s_at
RP1-93H18.5 NA
244061_at
ARHGAP15 Proteína 15 de activación de Rho GTPasa
1553313_s_at
SLC5A3 familia 5 de vehículo de soluto (transportadores de inositol), elemento 3
212538_at
DOCK9 dedicador de citoquinesis 9
226043_at
GPSM1 Modulador 1 de señalización de la proteína G (tipo AGS3, C. elegans)
1405_i_at
CCL5 ligando 5 de quimioquina (Motivo C-C)
204222_s_at
GLIPR1 relacionado 1 con la patogénesis GLI (glioma)
221087_s_at
APOL3 apolipoproteína L, 3
203932_at
HLA-DMB complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DM beta
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SYNPO2 sinaptopodina 2
221651_x_at
NA NA
231929_at
NA NA
229543_at
RP1-93H18.5 NA
211367_s_at
CASP1 caspasa 1, cisteína peptidasa relacionada con apoptosis (interleuquina 1, beta, convertasa)
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PRKCQ Proteína quinasa C, theta
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IL1R2 Receptor de interleuquina 1, tipo II
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CARD15 familia del dominio del reclutamiento de caspasa, elemento 15
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ARHGDIB Inhibidor beta de la disociación de Rho GDP (GDI) beta
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HLA-DRB4 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DR beta 4
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SART2 Antígeno de carcinoma de células escamosas reconocido por las células T
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LSP1 proteína 1 específica de linfocitos
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AMPD3 adenosina monofosfatasa deaminasa (isoforma E)
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SEMA4F Dominio sema, dominio de inmunoglobulina (Ig), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplásmico corto, (semaforina) 4F
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ISOC1 dominio de isocorismatasa que contiene 1
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CCL5 ligando 5 de quimioquina (Motivo C-C)
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HPS3 síndrome 3 de Hermansky-Pudlak
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HLA-DPA1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DP alfa 1
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HLA-DQB1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DQ beta 1
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HOXB7 homeobox B7
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FGL2 tipo 2 de fibrinógeno
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ZNFN1A1 proteína de dedo de cinc, subfamilia 1A, 1 (Ikaros)
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ARHGAP9 proteína 9 de activación de la Rho GTPasa
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GATA2 proteína de unión 2 GATA
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AP2B1 complejo 2 de proteína relacionada con el adaptador, subunidad beta 1
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CTSC catepsina C
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PLK2 Quinasa 2 de tipo polo (Drosophila)
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CD4 antígeno CD4 (p55)
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GADD45B Inducible de la detención de crecimiento y daño de ADN, beta
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GADD45B Inducible de la detención de crecimiento y daño de ADN, beta
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FLJ10847 NA
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KIF21B elemento 21B de la familia de quinesina
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CCND2 ciclina D2
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PRG1 proteoglicano 1, gránulo secretor
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SLC40A1 familia 40 de vehículo de soluto (transportador regulado por hierro), elemento 1
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HLA-DPA1 complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DP alfa 1
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SOD2 superóxido dismutasa 2, mitocondrial
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CRIP1 Proteína rica en cisteína 1 (intestinal)
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LOC283070 NA
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SIGLEC1 lectina 1 de tipo Ig de unión a ácido siálico, sialoadhesina
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ZNF11B proteína de dedo de cinc 11B
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CXCR4 receptor 4 de quimioquina (Motivo C-X-C)
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HLA-DMA complejo de histocompatibilidad principal, clase II, DM alfa
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MRC1 Receptor de manosa, C tipo 1
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CASP1 caspasa 1, peptidasa de cisteína relacionada con apoptosis (interleuquina 1, beta, convertasa)
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DENND2D dominio DENN/MADD que contiene 2D
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CCL18 ligando 18 de quimioquina (Motivo C-C) (pulmonar y regulado por la activación)
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P2RY13 receptor P2Y purinércico, Acoplado a la proteína G, 13
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CCL18 quimioquina (Motivo C-C) ligand 18 (pulmonar y regulado por la activación)
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ANGPTL1 tipo 1 de angiopeptina
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204846_at
CP ceruloplasmina (ferroxidasa)
204642_at
EDG1 Diferenciación endotelial, receptor acoplado a la proteína G de esfingolípido, 1
239744_at
RGS3 regulador 3 de la señalización 3 de la proteína G
206545_at
CD28 antígeno CD28 (Tp44)
228339_at
NA NA
218739_at
ABHD5 dominio abhidrolasa que contiene 5
224358_s_at
MS4A7 dominios de extensión -4 de membrana, subfamilia A, elemento 7
1559425_at
PRKCH Proteína quinasa C, eta
231577_s_at
GBP1 proteína de unión 1 de guanilato, inducible de interferón, 67kDa
231032_at
LOC286071 NA
207655_s_at
BLNK Engarce de células B
242546_at
NA NA
211066_x_at
PCDHGC3 subfamilia C de protoadherina gamma, 3
216714_at
CCL13 ligando 13 de quimioquina (Motivo C-C)
1562031_at
JAK2 Janus quinasa 2 (una proteína tirosina quinasa)
212763_at
CAMSAP1L1 Proteína asociada a espectrina regulada por calmodulina tipo 1
205440_s_at
NPY1R receptor Y1 del neuropéptido Y
227458_at
CD274 antígeno CD274
226303_at
PGM5 fosfoglucomutasa 5
204613_at
PLCG2 fosfolipasa C, gamma 2 (específico de fosfatidilinositol)
202688_at
TNFSF10 Superfamilia del factor de necrosis tumoral (ligando), elemento 10
221477_s_at
SOD2 superóxido dismutasa 2, mitocondrial
201236_s_at
BTG2 familia BTG, elemento 2
205569_at
LAMP3 proteína 3 de membrana asociada a lisosomas
215121_x_at
IGLC1 constante 1 de inmunoglobulina lambda (marcador Mcg)
202255_s_at
SIPA1L1 Asociado a la proliferación inducida por señal 1 tipo 1
215051_x_at
AIF1 factor 1 inflamatorio de transplante homólogo
209138_x_at
IGLC2 constante 2 de inmunoglobulina lambda (marcador Kern-Oz-)
232311_at
B2M beta-2-microglobulina
1555756_a_at
CLEC7A Familia 7 del dominio de lectina de tipo C, elemento A
221756_at
MGC17330 NA
238544_at
IGF1R receptor del factor 1 de crecimiento de tipo insulina
204512_at
HIVEP1 proteína de unión 1 potenciadora del tipo I del virus de inmunodeficiencia humana
230728_at
FKBP14 proteína de unión 14 de FK506, 22 kDa
201720_s_at
LAPTM5 proteína 5 de membrana de multiextensión asociada a lisosomas
223395_at
ABI3BP Familia del gen ABI, proteína de unión del elemento 3 (NESH)
200905_x_at
HLA-E complejo de histocompatibilidad principal, clase I, E
202207_at
ARL4C factor de ribosilación de ADP-tipo 4C
207076_s_at
ASS argininosuccinato sintetasa
211368_s_at
CASP1 caspasa 1, cisteína peptidasa relacionada con apoptosis (interleuquina 1, beta, convertasa)
204628_s_at
ITGB3 integrina, beta 3 (glicoproteina IIIa de plaquetas, antígeno CD61)
207540_s_at
SYK tirosine quinasa de bazo
213603_s_at
RAC2 substrato 2 de la toxina botulínica C3 relacionada con ras (familia rho, proteína de unión Rac2 de GTP pequeña)
1557222_at
NA NA
206804_at
CD3G antígeno CD3g, polipéptido gamma (Complejo TiT3)
209542_x_at
IGF1 factor 1 de crecimiento de tipo insulina (somatomedina C)
228858_at
NA NA
207843_x_at
CYB5A citocromo b5 tipo A (microsomal)
223924_at
TTC25 dominio 25 de repetición de tetratricopéptido
1552497_a_at
SLAMF6 Elemento 6 de la familia SLAM
241701_at
ARHGAP21 proteína 21 de activación de la Rho GTPasa
213819_s_at
FLOT1 flotillina 1
213095_x_at
AIF1 factor 1 inflamatorio de transplante homólogo
228153_at
IBRDC2 dominio IBR que contiene 2
213007_at
KIAA1794 KIAA1794
217525_at
OLFML1 olfactomedina-tipo 1
204220_at
GMFG Factor de maduración de glia, gamma
203508_at
TNFRSF1B factor de necrosis tumoral receptor superfamilia, elemento 1B
217629_at
NA NA
226659_at
DEF6 Expresado diferencialmente en homólogo FDCP 6 (ratón)
200904_at
HLA-E complejo de histocompatibilidad principal, clase I, E
206571_s_at
MAP4K4 quinasa de la quinasa de la proteína quinasa activada por mitógenos quinasa 4
232746_at
CMKOR1 receptor 1 huérfano de quimioquina
1563461_at
NA NA
204233_s_at
CHKA colina quinasa alfa
226865_at
NA NA
227361_at
HS3ST3B1 heparan sulfato (glucosamine) 3-O-sulfotransferasa 3B1
204923_at
CXorf9 marco abierto de lectura 9 del cromosoma X
204774_at
EVI2A sitio 2a de integración viral ecotrópico
202270_at
GBP1 proteína de unión de guanilato 1, inducible por interferón, 67kDa
243099_at
NFAM1 Proteína de activación de NFAT con el motivo 1 de ITAM
242874_at
NA NA
229127_at
ATP5J ATP sintasa, H+ transportador, complejo mitocondrial F0, subunidad F6
224771_at
NAV1 navegador 1 de neuronas
215379_x_at
IGLC2 constante 2 de inmunoglobulina lambda (Kern-Oz-marker)
222142_at
CYLD cilindromatosis (síndrome de tumor de turbante)
229367_s_at
GIMAP6 GTPasa, elemento 6 de la familia de IMAP
212713_at
MFAP4 proteína 4 asociada a microfibrilas
214023_x_at
TUBB2B tubulina, beta 2B
203413_at
NELL2 NEL-tipo 2 (pollo)
236583_at
NA NA
212657_s_at
IL1RN Antagonista del receptor de la interleuquina 1
227231_at
KIAA1211 NA
244023_at
SYK tirosina quinasa de bazo
206134_at
ADAMDEC1 tipo ADAM, decisina 1
204894_s_at
AOC3 amina oxidasa, cobre que contiene 3 (vascular adhesion protein 1)
204502_at
SAMHD1 Dominio SAM y dominio 1 HD
218002_s_at
CXCL14 ligando 14 de quimioquina (Motivo C-X-C)
205421_at
SLC22A3 familia de vehículo de soluto 22 (transportador de monoamina extraneuronal), elemento 3
215561_s_at
IL1R1 receptor de interleuquina 1, tipo I
217138_x_at
IGLV3-25 variable 3-25 de inmunoglobulina lambda
1556185_a_at
NA NA
219681_s_at
RAB11FIP1 proteína 1 de interacción de la familia RAB11 (clase I)
205251_at
PER2 homólogo 2 de período (Drosophila)
224896_s_at
TTL tubulina tirosine ligase
209899_s_at
SIAHBP1 NA
201721_s_at
LAPTM5 proteína 5 de la membrana de multiextensión asociada a lisosomas
241671_x_at
FLJ22536 NA
218499_at
RP6-213H19.1 NA
235804_at
NA NA
207677_s_at
NCF4 factor 4 citosólico de neutrófilos, 40kDa
227609_at
EPSTI1 interacción 1 de estroma epitelial (mama)
227035_x_at
LOC441212 NA
206385_s_at
ANK3 ankirina 3, nodo de Ranvier (anquirina G)
1565602_at
PCDH9 protocadherian 9
228908_s_at
C21orf86 marco abierto de lectura 86 del cromosoma 21
223952_x_at
DHRS9 deshidrogenasa/reductasa (familia SDR) elemento 9
38149_at
ARHGAP25 proteína 25 de activación de la Rho GTPasa
235688_s_at
TRAF4 factor 4 asociado al receptor de TNF
214181_x_at
LST1 transcripción 1 específica de leucocitos
222725_s_at
PALMD palmdelfina
1555852_at
TAP1 transportador 1, módulo de unión a ATP, sub-familia B (MDR/TAP)
210319_x_at
MSX2 Homólogo 2 de msh homeobox (Drosophila)
220485_s_at
SIRPG proteína gamma reguladora de señal
Tabla 7A Relación de la media geométrica entre grupos respondedores y no respondedores
Gen
Relación LL UL
CCL5
7,83 3,09 19,84
FASLG
7,57 2,77 20,70
GNLY
8,82 3,61 21,56
GZMB
12,15 4,38 33,71
PRF1
11,07 4,85 25,28
IFNG
21,19 5,36 83,86
ICOS
13,44 3,44 52,51
TBX21
13,93 3,63 53,41
CD8A
11,60 4,22 31,90
CD3E
12,78 3,55 46,04
CXCL11
4,71 1,44 15,35
CXCL10
7,39 2,56 21,39
CXCR3
16,96 3,10 92,90
CD20
9,46 1,35 66,42
FOXP3
5,57 2,58 12,04
INDO
13,62 2,89 64,20
CD45Ro
4,02 1,84 8,79
CD45R
4,92 1,90 12,77
CD69
5,84 2,00 17,06
TRBV19
11,15 3,56 34,94
TRAT1
9,67 2,77 33,80
TRDV2
7,05 2,79 17,82
STAT4
3,41 1,75 6,65
PRKCQ
7,41 3,24 16,94
GMZK
9,20 2,60 32,49
GPR171
5,25 2,47 11,17
UBD
14,68 3,95 54,65
CD52
6,17 1,96 19,41
CD3D
10,03 3,07 32,77
IL7R
6,49 2,08 20,26
IRF1
5,54 2,83 10,83
TLR7
3,44 1,50 7,89
Tabla 8 (abajo). Matriz de correlación entre 30 genes
Tabla 9A 18 mejores modelos obtenidos por regresión logística.
Predictor
R2 (%) Puntuación de Chi-cuadrado
PRF1
55 16
IRF1
50 14
GZMB
46 14
GNLY
45 14
CD8A
46 14
PRKCQ
45 14
FOXP3
42 13
IFNG
52 13
CCL5
45 13
GPR171
41 12
TRBV19
44 11
CD3E
39 11
TBX21
44 11
FASLG
39 11
CXCL10
35 10
ICOS
39 10
CXCR3
35 9
CXCL11
22 6
Tabla10 Porcentaje de clasificación correcta calculada usando el modelo de regresión logística para algunos genes.
Modelo
Porcentaje de pacientes clasificados correctamente
PRF1
86,6%
IRF1
89,7%
GZMB
82,8%
GNLY
82,8%
CD8A
82,8%
PRKCQ
89,7%
FOXP3
86,2%
IFNG
89,7%
CCL5
79,3%
GPR171
82,8%
TRBV19
86,2%
CDE3
75,9%
TBX21
82,8%
FASLG
75,9%
CXCL10
75,9%
ICOS
75,9%
CXR3
75,9%
CXCL11
72,4%

Tabla 14 Correlación de números de identidad de pacientes y resultado clínico después de inmunoterapia de MAGE
Nº de ID del paciente
Enfermedad progresiva Enfermedad estable Respondedores MIxtos Respondedores Demasiado temprano
160
19 20 38 138
30
77 67 136 91
8
127 2 75 124
109
65 11 120 150
60
119 53 27 163
55
23 59 118 122
100
145 96
37
10
52
26/1
81
14
66
106
133
129
74
113
36
9
155
15
5
56
16
13
98
28
108
71
145
121
80
132
3
85
135
134
82
154
39
Apéndice A: objeto R de clase nnet para la predicción de los resultados clínicos de la retícula neural de pacientes.
$nsunidades
[1]
493
$decay
[1]
0
$entropy
[1]
VERDADERO
$softmax
[1]
FALSO
$censurado
[1]
FALSO
$valor
[1]
9,930496e-05
$wts
[1]
-7,822649e-01 -2,605320e-01 -3,445762e-01 1,193835e+00 7,980130e-01
[6]
-1,454517e-01 -3,852555e-01 -6,038561e-01 3,628980e-01 1,214178e-01
[11]
6,302635e-01 1,163077e+00 -1,348927e+00 4,313002e-01 -3,439181e-01
[16]
1,354545e+00 -5,330816e-01 9,006249e-04 -3,553966e-01 -7,807184e-01
[21]
-2,792791e-01 -3,170041e-01 -7,652292e-01 7,708915e-02 -8,561736e-01
[26]
5,142947e-01 -2,484503e-01 9,726332e-01 1,778460e-01 -2,21F09e+00
[31]
1,533794e-01 -9,241165e-01 -1,623889e+00 -1,673846e-01 -3,942404e-01
[36]
4,839469e-02 -6,068823e-01 -7,231734e-01 2,776973e-01 9,486888e-01
[41]
-3,606490e-01 -9,814695e-02 -4,978396e-01 6,743036e-01 -6,715348e-01
[46]
3,743046e-01 1,127027e+00 2,424162e-01 -2,472467e-01 5,103072e-01
[51]
-2,249262e-01 9,216276e-02 -7,811338e-02 6,543984e-02 -9,300402e-01
[56]
-1,723861e-01 8,450912e-01 -1,112637e-01 -1,340432e+00 -4,579130e-01
[61]
-2,000303e-01 -6,724820e-01 3,185803e-02 -8,755603e-01 -1,432133e-01
[66]
1,734187e-01 -9,095931e-01 -5,779322e-01 -6,239654e-01 5,350169e-01
[71]
2,660352e-02 7,575969e-01 -5,857182e-01 7,047356e-01 2,619782e-01
[76]
7,365027e-02 1,085127e+00 -6,649458e-01 1,526824e-02 9,521713e-01
[81]
2,953514e-01 -5,496499e-02 -7,349885e-01 4,766398e-01 -4,030412e-01
[86]
8,509923e-01 -2,896527e-02 -4,922158e-02 -1,075633e+00 2,852051e-01
[91]
-2,040135e-01 7,087471e-01 -7,626716e-01 4,932172e-02 -1,068290e+00
[96]
4,525142e-01 -3,426858e-01 -5,564159e-01 4,206087e-01 3,702788e-01
[101]
-8,482293e-01 2,445519e-01 -2,423795e-01 -7,502546e-01 -2,448160e-01
[106]
-1,029814e-01 -4,534969e-01 -5,680071e-01 -2,278669e-01 -4,914741e-01
[111]
-2,408882e-02 -1,122049e+00 1,637105e+00 -8,674111e-01 -3,993925e-01
[116]
6,766219e-01 -2,590604e-01 -1,128037e-01 -5,454970e-01 3,117549e-01
[121]
6,807225e-01 1,767702e+00 1,749150e+00 1,576723e+00 1,000372e+00
[126]
-3,135498e-01 -3,461115e-01 -1,577623e-01 -3,688724e-03 -5,169024e-01
[131]
5,209675e-01 6,239938e-01 -6,562843e-01 3,318594e-01 1,073695e+00
[136]
3,852917e-01 7,445331e-01 6,147421e-01 3,486045e-02 2,328786e-01
[141]
5,865109e-01 8,789772e-01 2,735659e-01 2,179924e-01 6,546454e-01
[146]
-7,425786e-02 2,332181e-01 2,026860e-02 1,920527e+00 -2,199749e-01
$wts $wts $wts
[151]
-2,861057e-01 -6,113327e-01 -7,327236e-01 7,630948e-01 -6,725150e-01
[156]
8,195715e-01 1,354855e-01 7,557001e-01 -6,311882e-01 4,028033e-01
[161]
-1,095942e-01 2,675720e-02 9,191105e-02 -5,412179e-01 -4,676564e-01
[166]
-7,538073e-02 -8,129017e-01 -4,018241e-01 -2,996730e-01 -5,965576e-01
[171]
9,892726e-01 5,105776e-01 1,052146e+00 -2,957608e-01 -4,917327e-01
[176]
2,512329e-01 -1,016831e-01 1,099494e-02 -6,844977e-01 5,180294e-01
[181]
5,463099e-02 -5,062577e-01 5,281003e-01 -5,333424e-01 9,727653e-01
[186]
-8,865765e-01 5,137428e-01 -1,480626e-01 -1,719326e-01 7,033034e-01
[191]
5,484301e-01 4,860635e-01 -4,432808e-01 6,295423e-01 6,296338e-01
[196]
3,257622e-01 5,230624e-01 3,651660e-01 7,889078e-01 -1,381056e-02
[201]
1,092450e-01 9,362120e-01 -9,812814e-02 5,535681e-01 1,927306e-01
[206]
4,132113e-01 2,483396e-01 -4,509187e-01 -5,662541e-01 6,316726e-01
[211]
-1,081482e+00 -2,642237e-01 5,756106e-01 7,014808e-01 8,240274e-02
[216]
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8,032399e-01 -7,391342e-02 -1,458280e-01 1,475066e-01 -2,016509e-01
[761]
-1,116992e+00 2,565951e-01 -1,417568e+00 -4,075312e-01 -4,624426e-01
[766]
-3,892320e-01 9,233114e-02 8,039994e-01 1,708351e-01 3,140843e-01
[771]
1,558756e-01 4,926293e-01 -1,257969e+00 -7,845624e-01 1,556651e-01
[776]
-1,152795e+00 -1,463677e+00 -8,108185e-01 -8,317870e-02 -1,456545e-01
[781]
6,954507e-01 -8,047871e-01 -8,898140e-01 -1,254371e+00 -6,563698e-01
[786]
3,967049e-01 9,335104e-01 1,299258e-02 -2,453240e-01 -5,841076e-01
[791]
-1,658272e-01 -1,326827e+00 8,844022e-01 -6,606743e-01 4,137678e-01
[796]
7,360620e-02 -1,241175e+00 1,066117e+00 -1,086576e-01 7,812635e-01
[801]
-5,793264e-01 3,664636e-02 5,461605e-01 -1,468411e-01 -1,200992e+00
[806]
7,664790e-02 -9,648972e-01 8,464096e-02 8,781079e-01 -1,329100e-01
$wts
[811]
-3,140853e-01 -3,603208e-01 5,330240e-01 9,776989e-01 1,754023e-01
[816]
-3,932540e-02 1,381857e+00 4,967358e-01 2,445305e-01 2,033007e-02
[821]
-1,660898e+00 -3,826148e-01 -1,350548e-01 2,055229e-01 -4,826541e-01
[826]
-3,437897e-02 -1,131522e+00 -2,924096e-01 1,078663e+00 -3,618922e-01
[831]
-3,795694e-01 7,062471e-01 1,818627e-01 3,360420e-02 -5,509515e-01
[836]
2,820342e-01 -5,169129e-01 -7,298595e-01 6,831575e-02 -4,718518e-01
[841]
-1,177961e-01 3,261549e-01 9,243626e-01 -9,539287e-01 -8,574709e-01
[846]
8,404623e-01 -1,477904e+00 7,161732e-01 -7,213226e-02 -1,072695e+00
[851]
1,099245e+00 3,907082e-02 4,707593e-01 -1,037259e+00 -6,337726e-01
[856]
-6,489972e-01 -8,105587e-01 -1,132535e-01 5,618367e-01 1,120736e+00
[861]
-1,589420e-01 -4,736779e-01 -3,492589e-01 -5,292510e-01 7,552729e-02
[866]
6,245302e-01 -1,599877e+00 1,961020e+00 -5,986310e-01 7,907619e-01
[871]
9,258619e-01 4,602164e-01 -4,456243e-01 2,256970e-01 1,180578e+00
[876]
-2,202471e-01 -1,595068e+00 -7,650998e-01 1,068712e-01 3,886734e-03
[881]
3,158598e-02 -7,733971e-01 1,905452e-01 -6,009153e-01 2,211837e-01
[886]
-5,134809e-02 -8,393086e-01 -1,087550e+00 -3,173469e-01 -1,101492e+00
[891]
4,972408e-01 1,799967e-01 -2,447001e-01 -8,741257e-01 2,992654e-01
[896]
-9,245988e-01 9,044085e-02 9,133224e-01 7,446155e-01 -7,193918e-01
[901]
9,205514e-02 -1,402019e+00 4,976776e-01 -6,959568e-01 4,945441e-01
[906]
1,286614e-01 -8,543565e-01 -3,603456e-02 4,664471e-01 -7,580873e-03
[911]
-3,060679e-01 -6,700308e-01 4,941296e-04 -8,978372e-01 -6,954622e-01
[916]
-3,736479e-01 1,754756e-02 1,567201e+00 8,573695e-01 3,966870e-01
[921]
-2,215584e-02 -1,169949e-01 4,257213e-01 -2,346597e-01 7,421774e-01
[926]
-5,966420e-01 5,751260e-02 -2,472787e-01 2,334021e-01 1,300946e+00
[931]
2,341594e-01 1,049020e+00 -3,269379e-01 -1,269805e-01 -6,880527e-01
[936]
-3,229197e-01 7,076868e-01 -3,403887e-01 1,676770e-01 -7,620830e-02
[941]
3,558033e-01 1,459493e-01 -6,244181e-01 1,770295e-01 -1,216517e-01
[946]
7,426668e-01 -1,385593e-01 -6,277839e-01 -1,879113e-01 9,488544e-02
[951]
2,351063e-01 1,073347e+00 -4,874189e-01 3,801474e-01 -6,690750e-01
[956]
-6,047573e-01 -3,134005e-01 -6,000130e-01 -3,197655e-01 6,631834e-01
[961]
-6,356578e-01 -5,904780e-01 1,097918e+00 6,007569e-01 -2,505695e+00
[966]
-5,697962e-01 5,674896e-01 4,245279e-01 -1,060281e-01 -1,130024e-01
[971]
1,595858e+00 1,516974e-01 -3,702457e-02 -1,700967e-01 -3,641777e-01
[976]
-1,604025e-01 -1,447675e+00 -1,008405e+00 3,365701e-01 2,348416e-01
[981]
-1,189562e+01 2,427842e+01 -2,275821e+01
$ Valores ajustados
[,1]
1
9,999958e-01 17 4,189989e-06
2
0,000000e+00 18 -6,820198e-06
3
0,000000e+00 19 -6,825022e-06
4
0,000000e+00 20 -3,118923e-05
5
0,000000e+00 21 0,000000e+00
6
9,999958e-01 22 0,000000e+00
7
9,999958e-01 23 4,189989e-06
8
9,999958e-01 24 0,000000e+00
9
9,999958e-01 25 0,000000e+00
10
9,999958e-01 26 4,189989e-06
11
9,999958e-01 27 0,000000e+00
12
0,000000e+00 28 4,189989e-06
13
9,999958e-01 29 4,189989e-06
14
0,000000e+00 30 0,000000e+00
15
0,000000e+00 31 0,000000e+00
16
0,000000e+00
17
9,999958e-01 $lev
18
6,820198e-06 [1] "NR" "R"
19
6,825022e-06
20
3,118923e-05
21
0,000000e+00 $llamada
22
0,000000e+00 nnet.fórmula (fórmula = f ~ ., datos = datos, MaxNWts = 10000, maxit = 250,
23
9,999958e-01
24
0,000000e+00
25
0,000000e+00 tamaño = 2, salto = FALSO, rango = 0.7, decaimiento= 0, Hess = FALSO,
26
9,999958e-01
27
0,000000e+00
28
9,999958e-01 trace = RASTRO, abstol = 1e-04, reltol = 1e-08, metric = "euclidean",
29
9,999958e-01
30 31
0,000000e+00 0,000000e+00 subconjunto = entrenamiento)
$residuales
[,1]
1
4,189989e-06
2
0,000000e+00
3
0,000000e+00
4
0,000000e+00
5
0,000000e+00
6
4,189989e-06
7
4,189989e-06
8
4,189989e-06
9
4,189989e-06
10
4,189989e-06
11
4,189989e-06
12
0,000000e+00
13
4,189989e-06
14
0,000000e+00
15
0,000000e+00
16
0,000000e+00
Apéndice B: objeto R de la clase lda para la predicción de resultados clínicos de análisis discriminantes
lineales de pacientes.
$ antes
NR
R
0,5862069
0,4137931
$ recuentos
NR R
17
12
COLUMNA 2
$escala
X213007_at -3,352605e-02
LD1
X213008_at -4,189798e-03
X1405_i_at
5,944209e-03 X213068_at 2,658290e-02
X1552497_a_at
-1,489159e-03 X213095_x_at 1,421934e-02
X1552612_at
1,928010e-03 X213193_x_at 2,914348e-03
X1552613_s_at
-3,948620e-03 X213475_s_at -4,914118e-04
X1553102_a_at
2,035336e-02 X213537_at -8,357035e-03
X1553132_a_at
-1,048751e-02 X213539_at 7,487953e-03
X1553313_s_at
-3,034153e-02 X213560_at -4,020759e-03
X1553906_s_at
-1,834813e-02 X213566_at 5,845149e-03
X1554240_a_at
1,365655e-02 X213603_s_at -5,088264e-03
X1554966_a_at
3,759930e-03 X213618_at 1,305106e-02
X1555229_a_at
8,797787e-02 X213652_at 8,548287e-03
X1555630_a_at
-2,791031e-02 X213819_s_at 8,196495e-03
X1555756_a_at
1,654466e-02 X213831_at 1,631173e-02
X1555759_a_at
1,036814e-03 X213888_s_at 8,134177e-05
X1555812_a_at
1,278876e-02 X213975_s_at -2,095655e-02
X1555852_at
-3,512472e-03 X214023_x_at -2,237865e-02
X1556185_a_at
3,025315e-02 X214038_at 2,389479e-02
X1556579_s_at
4,497852e-02 X214181_x_at -8,976012e-03
X1557116_at
4,611121e-03 X214450_at 1,788553e-02
X1557222_at
2,410949e-02 X214470_at 2,213217e-02
X1558034_s_at
2,790575e-02 X214617_at 1,563590e-02
X1558290_a_at
-1,523617e-02 X214669_x_at 1,972879e-03
X1558586_at
-4,151460e-02 X214677_x_at 3,809399e-03
X1558972_s_at
5,561221e-04 X214719_at 1,439531e-03
X1559263_s_at
7,463183e-03 X215051_x_at 1,072135e-02
X1559425_at
1,864440e-03 X215121_x_at 4,118073e-03
X1559584_a_at
-5,820026e-03 X215193_x_at 2,105556e-04
X1562031_at
9,246741e-03 X215223_s_at 1,530709e-02
X1563461_at
-2,064194e-02 X215379_x_at 7,064224e-03
X1563473_at
4,011858e-03 X215561_s_at -2,385977e-02
X1565602_at
-4,884858e-02 X215806_x_at 1,767858e-02
X1568736_s_at
-2,773483e-02 X216155_at -3,705145e-02
X1568822_at
2,099681e-03 X216191_s_at 4,747897e-02
X1569942_at
6,739294e-03 X216194_s_at -4,006836e-02
X200612_s_at
-6,365853e-02 X216714_at 2,405266e-02
X200904_at
6,387716e-03 X216841_s_at 8,716417e-03
X200905_x_at
5,294827e-03 X216920_s_at 3,911396e-03
X200953_s_at
-8,671791e-03 X217028_at 5,128469e-03
X201010_s_at
4,474642e-03 X217138_x_at 9,357220e-03
X201137_s_at
-1,506315e-02 X217143_s_at 7,546655e-03
X201220_x_at
-2,667959e-02 X217147_s_at -1,958024e-02
X201236_s_at
1,404961e-02 X217478_s_at -1,327997e-02
X201425_at
1,554231e-02 X217525_at -1,717356e-02
X201474_s_at
-6,107372e-03 X217629_at 7,854937e-03
X201487_at
2,472156e-02 X217767_at -5,238491e-03
X201497_x_at
7,254710e-04 X217995_at -6,809023e-03
X201502_s_at
5,696526e-03 X218002_s_at 9,869321e-03
X201531_at
1,148431e-02 X218035_s_at 1,245016e-03
X201566_x_at
1,794849e-02 X218145_at -3,291834e-02
X201720_s_at
1,570380e-03 X218170_at -7,323517e-03
COLUMNA 2
X201721_s_at
-9,613928e-03 X218322_s_at -8,250237e-03
X201804_x_at
-2,053567e-02 X218499_at 5,140903e-04
X201859_at
-1,376084e-04 X218736_s_at 2,138520e-02
X201939_at
-3,369784e-02 X218739_at 2,714745e-03
X202207_at
-1,196899e-02 X218764_at -9,158772e-03
X202255_s_at
-4,340999e-02 X218802_at 5,152377e-02
X202269_x_at
-1,833048e-02 X218805_at -2,574003e-03
X202270_at
-8,686638e-03 X218854_at 3,989147e-03
X202368_s_at
-2,233262e-02 X218899_s_at -3,411423e-02
X202369_s_at
-1,278489e-02 X218950_at -4,336176e-02
X202391_at
-5,586253e-03 X219054_at 4,975575e-03
X202510_s_at
1,200980e-02 X219093_at 2,082412e-02
X202625_at
1,449689e-02 X219213_at -4,341432e-03
X202643_s_at
2,057522e-02 X219243_at 2,233332e-03
X202644_s_at
2,044322e-02 X219368_at -1,134073e-03
X202687_s_at
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-2,759634e-03 X242458_at -1,194306e-02
X212067_s_at
-9,461685e-03 X242546_at 4,355118e-03
X212233_at
8,400376e-03 X242874_at 5,607680e-03
COLUMNA 2
X212538_at
7,226797e-03 X242881_x_at -6,062508e-03
X212587_s_at
-5,979921e-03 X242986_at 2,749620e-03
X212588_at
-7,824565e-04 X243099_at 1,186699e-02
X212592_at
3,516261e-03 X244023_at -1,018460e-02
X212657_s_at
2,978857e-02 X244061_at 1,229564e-03
X212671_s_at
-2,602076e-02 X32128_at 2,935196e-02
X212713_at
3,233683e-02 X34210_at 3,776762e-03
X212763_at
-3,275778e-03 X38149_at 4,937711e-04
X212886_at
3,683799e-03 X64064_at -3,336735e-03
X212977_at
9,877644e-03
X212998_x_at
5,090511e-03
X212999_x_at
3,695828e-02
Continúa en la columna 2
$lev
[1]
"NR" "R"
$svd
[1]
7.995862
$N
[1]
$call
29
lda (fórmula = f ~ ., datos = datostr)
Apéndice C: objeto R de la clase naiveBayes para la predicción de resultados clínicos de naïve Bayes de
pacientes.
$ apriori
Columna 2
Y
Y
[,1] [,2]
NR R
NR -0,3674984 0,5888660
17 12
R 0,3219144 0,5336377
tablastablas$X1405_i_at
tablas$X213539_at
X1405_i_at
X213539_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,1639258 0,5851902 NR -0,3813796 0,5040301
R
0,6748740 0,6631486 R 0,3415072 0,2577433
tablas$X1552497_a_at
tablas$X213560_at
X1552497_a_at
X213560_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,3029996 0,6800071 NR -0,5055000 0,7230271
R
0,6607734 0,8223674 R 0,2766383 0,2303920
tablas$X1552612_at
tablas$X213566_at
X1552612_at
X213566_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,2523340 0,5485271 NR -0,2311022 0,5691307
R
0,4450904 0,5434438 R 0,3719339 0,4376776
tablas$X1552613_s_at
tablas$X213603_s_at
X1552613_s_at
X213603_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,2165343 0,5894093 NR -0,3061774 0,6126919
R
0,4800677 0,4432806 R 0,3508772 0,5262723
tablas$X1553102_a_at
tablas$X213618_at
X1553102_a_at
X213618_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
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R
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tablas$X1553132_a_at
tablas$X213652_at
X1553132_a_at
X213652_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,1377405 0,3946696 NR -0,2586966 0,4605599
R
0,4961300 0,4509575 R 0,3270410 0,8177604
tablas$X1553313_s_at
tablas$X213819_s_at
X1553313_s_at
X213819_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
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R
-0,3838373 0,3940848 R -0,64986825 0,9085849
tablas$X1553906_s_at
tablas$X213831_at
X1553906_s_at
X213831_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,3915645 0,6474232 NR -0,3533186 0,4215363
R
0,2882052 0,3076821 R 0,1563120 0,3886529
tablas$X1554240_a_at
tablas$X213888_s_at
X1554240_a_at
X213888_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
0,01780307 0,4865912 NR -0,2086168 0,5349552
R
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tablas$X1554966_a_at
tablas$X213975_s_at
X1554966_a_at
X213975_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,1357018 0,3678133 NR -0,4990363 0,6803409
R
0,6662706 0,6833596 R 0,1878550 0,2710180
tablas$X1555229_a_at
tablas$X214023_x_at
X1555229_a_at
X214023_x_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,2263265 0,3882668 NR 0,1848739 0,7174998
R
0,5467680 0,4361597 R -0,4325008 0,4810479
tablas$X1555630_a_at
tablas$X214038_at
X1555630_a_at
X214038_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
0,2005512 0,3578418 NR -0,3255701 0,6706608
R
-0,6088957 0,7683101 R 0,3599967 0,6048520
$ apriori
Columna 2
tablas$X1555756_a_at
tablas$X214181_x_at
X1555756_a_at
X214181_x_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,2186897 0,5247142 NR -0,3415893 0,6522400
R
0,4061700 0,5187056 R 0,2853699 0,2763122
tablas$X1555759_a_at
tablas$X214450_at
X1555759_a_at
X214450_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
0,08037061 0,5249017 NR -0,1562932 0,2807857
R
0,85078348 0,7360755 R 0,8434281 0,8613678
tablas$X1555812_a_at
tablas$X214470_at
X1555812_a_at
X214470_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,4493812 0,8437685 NR -0,2839688 0,4885156
R
0,4087372 0,6145611 R 0,4212807 0,3750679
tablas$X1555852_at
tablas$X214617_at
X1555852_at
X214617_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,3431720 0,6409197 NR -0,3487562 0,4518071
R
0,3060830 0,4160286 R 0,2125207 0,4242197
tablas$X1556185_a_at
tablas$X214669_x_at
X1556185_a_at
X214669_x_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,3542416 0,4573215 NR -0,1915274 0,4981106
R
0,3876607 0,8113095 R 0,3359622 0,4156267
tablas$X1556579_s_at
tablas$X214677_x_at
X1556579_s_at
X214677_x_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,08046679 0,2880584 NR -0,2087490 0,4787112
R
0,58371780 0,7445854 R 0,3128333 0,3867513
tablas$X1557116_at
tablas$X214719_at
X1557116_at
X214719_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,4470538 0,6892889 NR -0,4511937 0,6070570
R
0,3267151 0,4124078 R 0,2711287 0,3505487
tablas$X1557222_at
tablas$X215051_x_at
X1557222_at
X215051_x_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,04818824 0,402835 NR -0,3597073 0,8514825
R
0,74360000 0,863980 R 0,4054302 0,3092948
tablas$X1558034_s_at
tablas$X215121_x_at
X1558034_s_at
X215121_x_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,2487822 0,4220782 NR -0,1634545 0,4642640
R
0,4252406 0,4675114 R 0,3410072 0,4014670
tablas$X1558290_a_at
tablas$X215193_x_at
X1558290_a_at
X215193_x_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
0,3179399 0,5555339 NR -0,2667421 0,7134086
R
-0,4890204 0,4786095 R 0,4777644 0,4030902
tablas$X1558586_at
tablas$X215223_s_at
X1558586_at
X215223_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,2298781 0,4177707 NR -0,3883071 0,4910665
R
0,3950435 0,5416909 R 0,2565276 0,4364856
tablas$X1558972_s_at
tablas$X215379_x_at
X1558972_s_at
X215379_x_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,2797971 0,5418070 NR -0,09709331 0,4452099
R
0,4745703 0,5335784 R 0,39542823 0,4092484
tablas$X1559263_s_at
tablas$X215561_s_at
X1559263_s_at
X215561_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,3833393 0,5703645 NR -0,2711632 0,4077480
R
0,3494365 0,4676936 R 0,7072055 0,9320206
tablas$X1559425_at
tablas$X215806_x_at
X1559425_at
X215806_x_at
$ apriori
Columna 2
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,2287316 0,5560199 NR -0,007773052 0,3665788
R
0,4282525 0,4558128 R 0,661454102 0,4785205
tablas$X1559584_a_at
tablas$X216155_at
X1559584_a_at
X216155_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,4622881 0,5846900 NR 0,5119447 0,6151164
R
0,3021721 0,4028788 R -0,1726881 0,3347342
tablas$X1562031_at
tablas$X216191_s_at
X1562031_at
X216191_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,3551523 0,4862453 NR -0,01479148 0,4433394
R
0,1736934 0,4872335 R 0,67109688 0,5079869
tablas$X1563461_at
tablas$X216194_s_at
X1563461_at
X216194_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
0,3566529 0,5512415 NR 0,1641682 0,3935104
R
-0,2706966 0,6822506 R -0,3667475 0,4613841
tablas$X1563473_at
tablas$X216714_at
X1563473_at
X216714_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,4074615 0,5896901 NR -0,1657215 0,6600958
R
0,2254661 0,4096997 R 0,5669961 0,9931878
tablas$X1565602_at
tablas$X216841_s_at
X1565602_at
X216841_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
0,4490349 0,6371381 NR -0,2378813 0,7063683
R
-0,1986003 0,5670284 R 0,5838156 0,5499012
tablas$X1568736_s_at
tablas$X216920_s_at
X1568736_s_at
X216920_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
0,6111740 0,9655418 NR -0,3626922 0,5129860
R
-0,1669456 0,3464934 R 0,4424685 0,4026252
tablas$X1568822_at
tablas$X217028_at
X1568822_at
X217028_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
0,4611639 0,6061123 NR -0,3936253 0,7242766
R
-0,1089934 0,3960131 R 0,2813510 0,3842826
tablas$X1569942_at
tablas$X217138_x_at
X1569942_at
X217138_x_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
0,4441859 0,7007245 NR 0,06341764 0,4690319
R
-0,2886340 0,3295043 R 0,61978484 0,5049407
tablas$X200612_s_at
tablas$X217143_s_at
X200612_s_at
X217143_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
0,2054340 0,4467337 NR -0,1709594 0,6329777
R
-0,4553481 0,5048914 R 0,6395395 0,5675738
tablas$X200904_at
tablas$X217147_s_at
X200904_at
X217147_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,2660950 0,4738856 NR -0,1919006 0,3907915
R
0,3014091 0,4032104 R 0,4594408 0,3635919
tablas$X200905_x_at
tablas$X217478_s_at
X200905_x_at
X217478_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,1327891 0,5236164 NR -0,3453566 0,7688595
R
0,4735567 0,3948498 R 0,5037971 0,4475461
tablas$X200953_s_at
tablas$X217525_at
X200953_s_at
X217525_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,2814847 0,8261769 NR -0,2639411 0,8866455
R
0,5757425 0,6362976 R 0,6075298 0,5960824
tablas$X201010_s_at
tablas$X217629_at
X201010_s_at
X217629_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,3613038 0,7929993 NR -0,1348654 0,671148
$ apriori
Columna 2
R
0,4944130 0,2677128 R 0,8011176 1,134701
tablas$X201137_s_at
tablas$X217767_at
X201137_s_at
X217767_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,3646008 0,7012958 NR -0,4316702 0,6383017
R
0,3957589 0,4949475 R 0,3296425 0,3962954
tablas$X201220_x_at
tablas$X217995_at
X201220_x_at
X217995_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
0,08672472 0,5177988 NR -0,6500190 1,0622844
R
-0,48143253 0,5513205 R 0,3656452 0,3596701
tablas$X201236_s_at
tablas$X218002_s_at
X201236_s_at
X218002_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,1198028 0,5613972 NR -0,2371548 0,4549764
R
0,5331348 0,5322952 R 0,3590465 0,5928193
tablas$X201425_at
tablas$X218035_s_at
X201425_at
X218035_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
-0,5116596 0,7193710 NR -0,3792486 0,6876336
R
0,4964073 0,5304284 R 0,3685478 0,4296116
tablas$X201474_s_at
tablas$X218145_at
X201474_s_at
X218145_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
0,6028068 0,6299064 NR 0,5407030 0,7961511
R
-0,2457276 0,3007111 R -0,5330237 0,7914334
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$ apriori
Columna 2
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X202207_at
X218950_at
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Y
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X219213_at
Y
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$ apriori
Columna 2
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X219666_at
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X219710_at
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X219737_s_at
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X220485_s_at
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$ apriori
Columna 2
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X221081_s_at
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X221087_s_at
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X203932_at
X221477_s_at
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X221651_x_at
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X204116_at
X221698_s_at
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X204118_at
X221756_at
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X204135_at
X221760_at
Y
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X204204_at
X222108_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
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X204220_at
X222142_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
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X204222_s_at
X222484_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
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X204224_s_at
X222496_s_at
Y
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NR
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R
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X204233_s_at
X222592_s_at
Y
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NR
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tablas$X222725_s_at
X204236_at
X222725_s_at
$ apriori
Columna 2
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
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tablas$X222780_s_at
X204249_s_at
X222780_s_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
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$ apriori
Columna 2
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Y
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NR
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R
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$ apriori
Columna 2
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$ apriori
Columna 2
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$ apriori
Columna 2
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$ apriori
Columna 2
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X231262_at
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X209312_x_at
X231577_s_at
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X209480_at
X231882_at
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X209542_x_at
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X209603_at
X232001_at
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tablas$X232024_at
X209606_at
X232024_at
Y
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X209612_s_at
X232234_at
Y
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tablas$X232311_at
X209613_s_at
X232311_at
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X209670_at
X232313_at
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Y
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NR
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X209685_s_at
X232543_x_at
Y
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NR
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X232617_at
Y
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NR
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X232746_at
Y
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X232843_s_at
Y
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$ apriori
Columna 2
NR
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R
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X233123_at
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X235238_at
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X235306_at
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X235391_at
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X235421_at
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X235639_at
Y
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X210251_s_at
X235688_s_at
Y
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X235804_at
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X210319_x_at
X235831_at
Y
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X210375_at
X236203_at
Y
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$ apriori
Columna 2
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X210554_s_at
X236280_at
Y
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tablas$X236295_s_at
X210835_s_at
X236295_s_at
Y
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tablas$X236583_at
X210915_x_at
X236583_at
Y
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X210982_s_at
X238439_at
Y
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X238488_at
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X238544_at
Y
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Y
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X211339_s_at
X239237_at
Y
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X239744_at
Y
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X241671_x_at
Y
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Y
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tablas$X242546_at
X211742_s_at
X242546_at
$ apriori
Columna 2
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tablas$X242874_at
X211796_s_at
X242874_at
Y
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X211902_x_at
X242881_x_at
Y
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X211990_at
X242986_at
Y
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X211991_s_at
X243099_at
Y
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tablas$X244023_at
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X244023_at
Y
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X212233_at
X244061_at
Y
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tablas$X32128_at
X212538_at
X32128_at
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tablas$X34210_at
X212587_s_at
X34210_at
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NR
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tablas$X212588_at
tablas$X38149_at
X212588_at
X38149_at
Y
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tablas$X212592_at
tablas$X64064_at
X212592_at
X64064_at
Y
[,1] [,2] Y [,1] [,2]
NR
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R
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tablas$X212657_s_at
X212657_s_at
niveles
Y
[,1] [,2] [1] "NR" "R"
NR
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R
0,2570024 0,4217927 naiveBayes.defecto(x = X, y = Y, laplace = laplace)
tablas$X212671_s_at
X212671_s_at
Y
[,1] [,2]
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R
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tablas$X212713_at
X212713_at
Y
[,1] [,2]
N R
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$ apriori
Columna 2
R
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tablas$X212763_at
X212763_at
Y
[,1] [,2]
N R
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R
-0,6529463 0,9707572
tablas$X212886_at
X212886_at
Y
[,1] [,2]
N R
-0,3765371 0,7892555
R
0,6201350 0,6611937
tablas$X212977_at
X212977_at
Y
[,1] [,2]
N R
-0,4688782 0,8767720
R
0,5293928 0,6187406
tablas$X212998_x_at
X212998_x_at
Y
[,1] [,2]
N R
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R
0,5296660 0,3118830
tablas$X212999_x_at
X212999_x_at
Y
[,1] [,2]
N R
-0,2290011 0,4910183
R
0,4331640 0,3718106
tablas$X213007_at
X213007_at
Y
[,1] [,2]
N R
0,2632353 0,6401111
R
-0,3996142 0,4037179
tablas$X213008_at
X213008_at
Y
[,1] [,2]
N R
0,4761995 0,7015473
R
-0,4947303 0,8235263
tablas$X213068_at
X213068_at
Y
[,1] [,2]
N R
-0,1758656 0,4044001
R
0,4193472 0,3911686
tablas$X213095_x_at
X213095_x_at
Y
[,1] [,2]
N R
-0,3502315 0,8054069
R
0,3616843 0,3443190
tablas$X213193_x_at
X213193_x_at
Y
[,1] [,2]
N R
-0,2370856 0,4636341
R
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tablas$X213475_s_at
X213475_s_at
Y
[,1] [,2]
N R
-0,2137215 0,4617051
R
0,4040370 0,4908631
tablas$X213537_at
X213537_at
Continúa en la COLUMNA 2
Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de fragmento de Lipoproteína D, fragmento de Mage3, y cola de histidina, y su respectiva secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 34 y 35)

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de identificación de un paciente respondedor o no respondedor a inmunoterapia de cáncer que comprende las etapas de:
    a) analizar una muestra derivada del paciente que contiene células tumorales o cancerosas para determinar la expresión diferencial de CCL5, y
    b) caracterizar el paciente a partir del cual se derivó la muestra como un respondedor o no respondedor, basándose en los resultados de la etapa (a), en el que el paciente se caracteriza como respondedor si la expresión de CCL5 está regulada hacia arriba, en el que la caracteriación se realiza por referencia o comparación a un patrón y en el que la muestra derivada del paciente se obtuvo antes de que el paciente recibiera la inmunoterapia de cáncer.
  2. 2.
    Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el patrón es una muestra con un resultado clínico conocido.
  3. 3.
    Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la comparación se realiza usando un algoritmo.
  4. 4.
    Un agente inmunoterapéutico de cáncer específico de antígeno para su uso en el tratamiento de un paciente, en el que el paciente está caracterizado antes del comienzo del tratamiento como un respondedor en base a la expresión diferencial de al menos un gen de activación inmune, en el que el gen de activación inmune es CCL5 y en el que el agente inmunoterapéutico de cáncer específico de antígeno es un antígeno MAGE capaz de provocar una respuesta inmune específica de MAGE.
  5. 5.
    Un agente inmunoterapéutico de cáncer específico de antígeno para su uso en el tratamiento de un paciente de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el agente inmunoterapéutico comprende además un adyuvante apropiado.
  6. 6.
    Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en el que la terapia o inmunoterapia es inmunoterapia de cáncer específica de antígeno de MAGE.
    Figura 1
    Agrupamiento jerárquico “señal del respondedor MAGE008”
    Los mejores 148 conjuntos de sondas
    Agrupamiento respondedor Agrupamiento de sobrecruzamiento Agrupamiento no respondedor
    Figura 2
    Agrupamiento jerárquico “señal del respondedor MAGE008”
    BaldiBH Top 100 PS
    Agrupamiento respondedor Agrupamiento de sobrecruzamiento Agrupamiento no respondedor
    Figura 3
    Software Arrayminer – ClaseMaker (5Respuestas/5 No respondedores)
    Agrupamiento respondedor Agrupamiento no respondedor
    Figura 4
    Comparación lista de genes
    “señal de respondedor MAGE008”
    Software Arrayminer -Classmaker
    Figura 5
    Figura 5A
    RESPONDEDOR NO RESPONDEDOR
    FIGURA 6
    Análisis del componente principal que usa los genes PRF1, GZMB, GNLY, CD8A, PRKCQ, FOXP3, IFNG, CCL5, GPR171 y TRBV19
    Figura 7 Agrupamiento jerárquico de pacientes incluidos en el brazo AS15.
    Demasiado temprano
    Respondedor
    Respondedor mixto
    Enfermedad estable
    Enfermedad progresiva
    Figura 8 Agrupamiento jerárquico de pacientes incluidos en el brazo AS15.
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