ES2539931T3

ES2539931T3 - Cepa hospedante bacteriana que comprende un gen spr mutante y que tiene actividad reducida de Tsp

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Publication number: ES2539931T3
Application number: ES11701216.1T
Authority: ES
Inventors: Mark Ellis; David Paul Humphreys
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2010-01-14
Filing date: 2011-01-13
Publication date: 2015-07-07
Anticipated expiration: 2031-01-13
Also published as: CA2786335A1; US20150132828A1; AU2011206584B2; SMT201500145B; CN105505845A; GB201000587D0; JP2013516964A; PT2524043E; SG182301A1; US20120295309A1; DK2524043T3; HRP20150659T1; CY1116480T1; PL2524043T3; CA2786335C; WO2011086136A1; US9587227B2; SI2524043T1; CN102762732B; RS54084B1

Abstract

Una celula bacteriana Gram negative recombinante que comprende un gen spr mutante, que codifica una proteina spr UniprotKB/SwissProt P0AFV4, que tiene una mutaciOn en uno o mas aminoacidos seleccionada de N31Y, R62C, 170T, Q73R, C94A, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D, V135G, L136P, G140C, R144C, H145A, G147C y H157A, y en donde la celula tiene actividad reducida de la proteina Tsp, proteasa especifica de la cola, comparada con una celula de tipo natural.

Description

Cepa hospedante bacteriana que comprende un gen spr mutante y que tiene actividad reducida de Tsp

La invención se refiere a una cepa hospedante bacteriana recombinante, en particular E. coli. La invención también se refiere a un método para producir una proteína de interés en dicha célula.

Antecedentes de la invención

Las células bacterianas, tales como E. coli, se usan habitualmente para producir proteínas recombinantes. Hay muchas ventajas en el uso de células bacterianas, tales como E. coli, para producir proteínas recombinantes, en particular debido a la naturaleza versátil de las células bacterianas como células hospedantes que permiten la inserción de genes mediante plásmidos. E. coli se ha usado para producir muchas proteínas recombinantes, incluyendo insulina humana.

A pesar de las muchas ventajas del uso de células bacterianas para producir proteínas recombinantes, todavía hay limitaciones significativas, que incluyen la dificultad de producir proteínas sensibles a proteasas. Las proteasas tienen una función importante en la renovación de proteínas viejas, dañadas o mal plegadas en el periplasma y citoplasma de E. coli. Las proteasas bacterianas actúan para degradar la proteína recombinante de interés, reduciendo así a menudo significativamente el rendimiento de la proteína activa.

Se han identificado una serie de proteasas bacterianas. En E. coli se han identificado proteasas, que incluyen Proteasa 111 (ptr), DegP, OmpT, Tsp, prlC, ptrA, ptrB, pepA-T, tsh, espc, eatA, c1pP e Ion.

La Tsp (también conocida como Prc) es una proteasa periplásmica de 60 kDa. El primer sustrato conocido de la Tsp fue la proteína de unión a penicilina 3 (PBP3) ("Determination of the c1eavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli"; Nagasawa H, Sakagami Y, Suzuki A, Suzuki H, Hara H, Hirota Y. J Bacterio/. 1989 Nov; 171 (11 ):5890-3 y "Cloning, mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3"; Hara H, Yamamoto Y, Higashitani A, Suzuki H, Nishimura Y. J Bacterio/. 1991 Aug;173 (15):4799-813), pero más tarde se descubrió que la Tsp también podía escindir las proteínas de la cola del fago, y por lo tanto, se renombró como proteasa específica de cola (Tsp, por sus siglas en inglés Tail Specific Protease) (Silber et al., Proc. Nat!. Acad. Sci. USA, 89: 295-299 (1992)). Silber et al. ("Deletion of the prc(tsp) gene provides evidence for additionaUail-specific proteolytic activity in Escherichia coli K12"; Silber, K.R., Sauer, R.T.; Mo/ Gen Genet 1994242:237-240) describe una cepa de eliminación de prc (KS1000) en donde la mutación se creó sustituyendo un segmento del gen prc por un fragmento que comprendía un marcador Kanr.

La reducción de la actividad de la Tsp (prc) es deseable para reducir la proteolisis de proteínas de interés. Sin embargo, se ha encontrado que las células que carecen de la proteasa prc presentan crecimiento termosensible a osmolalidad baja. Hara et al., aislaron revertientes termorresistentes que contenían mutaciones supresoras (spr) extragénicas (Hara et al., Microbia/Drug Resistance, 2: 63-72 (1996)). Spr es una proteasa periplásmica unida a membrana de 18 kDa y los sustratos de la spr son Tsp y peptidoglicanos en la membrana extema implicados en la hidrólisis de la pared celular durante la división celular. El gen de spr se denomina UniProtKB/SwissProt POAFV4 (SPR_ECOLl).

Se han descrito cepas deficientes en proteasa mejoradas que comprenden el gen spr mutante. Chen et al. describen la construcción de cepas de E. coli que llevan diferentes combinaciones de mutaciones en prc (Tsp) y otra proteasa, DegP, creadas por amplificación de regiones en la dirección 5' y la dirección 3' del gen y ligándolas entre sí en un vector que comprende marcadores de selección y una mutación sprW174R ("High-Ievel accumulation ot a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli requires a triple-mutant (t.DegP t.prc sprW174R) host strain" (Chen C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Andersen DC, Battersby JE, Champion KM. Biotechno/ Bioeng. 2004 Mar 5;85(5):463-74). Se encontró que la combinación de las mutaciones t.DegP, t.prc y sprW174R proporcionaba los niveles mayores de cadena ligera de anticuerpo, cadena pesada de anticuerpo y F(ab')2-LZ. El documento EP1341899 describe una cepa de E. coli que es deficiente en DegP y prc cromosómicos que codifican proteasas DegP y Prc, respectivamente, y albergan un gen spr mutante que codifica un proteína que suprime fenotipos de crecimiento presentados por cepas que albergan mutantes de prc.

La presente invención proporciona nuevas cepas bacterianas que llevan mutantes de spr alternativos que proporcionan medios ventajosos para producir proteínas recombinantes.

Resumen de la invención

En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una célula bacteriana Gram negativa recombinante que comprende un gen spr mutante que codifica una proteína spr que tiene una mutación en uno o más aminoácidos seleccionados de N31, R62, 170,073, C94, S95, \/98, 099, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147 y H157, yen donde la célula tiene actividad reducida de la proteína Tsp comparada con una célula de tipo natural.

En una realización, el genoma de la célula es isogénico con una célula bacteriana de tipo natural excepto por el gen spr mutado y la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp comparada con una célula de tipo natural.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una célula bacteriana Gram negativa recombinante que tiene actividad reducida de la proteína Tsp comparada con una célula de tipo natural y que comprende un gen spr mutante que codifica la proteína spr, en donde el genoma de la célula es isogénico con una célula bacteriana de tipo natural excepto por la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp comparada con una célula de tipo natural y el gen spr mutado.

Las células proporcionadas por el primer y segundo aspectos de la presente invención muestra fenotipos de producción de proteínas y crecimiento ventajosos.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una proteína de interés que comprende expresar la proteína de interés en una célula bacteriana Gram negativa recombinante como se ha definido antes. .

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra el perfil de crecimiento de cepas MXE008 y MXE009 que expresan Fab' anti-TNFa comparado con cepas W311 Ode tipo natural y MXE001 que expresan Fab' anti-TNFa.

La figura 2 muestra la expresión de Fab' antiTNFa de MXE008 y MXE009 comparado con W3110 de tipo natural y MXE001.

La figura 3 muestra el perfil de crecimiento de cepas MXE008 y MXE009 que expresan Fab' anti-TNFa comparado con cepas W311 Oy MXE001de control que expresan Fab' anti-TNFa.

La figura 4 muestra el rendimiento de Fab' anti-TNFa del periplasma (símbolos sombreados) y el líquido sobrenadante (símbolos en blanco) de cepas de E. coli MXE008 y MXE009 comparado con W3110 y MXE001de control.

La figura 5 muestra el perfil de crecimiento de cepas MXE0012 y MXE017 que expresan Fab' anti-TNFa comparado con cepas W3110 y MXE001de tipo natural que expresan Fab' anti-TNFa.

La figura 6 muestra la expresión de Fab' anti-TNFa en MXE012 y MXE017 comparado con W311 Ode tipo natural y MXE001.

La figura 7 muestra el perfil de crecimiento de W311 O, MXE001 y MXE008 durante una fermentación de producción de Fab' anti-TNFa.

La figura 8 muestra la acumulación periplásmica de Fab' anti-TNFa (líneas y símbolos negros) y acumulación en el medio de Fab' anti-TNFa (Hneas de trazos y símbolos blancos) para W3110, MXE001 (.Msp) y MXE008 (~tsp spr 0112A) durante una fermentación de producción de Fab' antiTNFa.

La figura 9 muestra los resultados de un ensayo de AONbc de las cepas W311 O, MXE001, MXE008 y MXE012.

La figura 10 muestra los resultados de un ensayo de proteínas de las cepas W3110, MXE001, MXE008 y MXE012.

La figura 11a muestra el extremo 5' de la proteína ptr (proteasa 111) de tipo natural y ptr (proteasa 111) mutada inactivada y secuencias de genes.

La figura 11b muestra el extremo 5' de la proteína Tsp de tipo natural y Tsp mutada inactivada y secuencias de genes.

La figura 11c muestra una región de la proteína OegP de tipo natural y OegP mutada y secuencias de genes.

Breve descripción de las secuencias

SEO ID NO: 1 es la secuencia de AON del gen Tsp de tipo natural que incluye 6 nucleótidos ATGAAC en la dirección 5' del codón de inicio.

SEO ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de la proteína Tsp de tipo natural.

SEO ID NO: 3 es la secuencia de AON del gen Tsp mutado inactivado que incluye los 6 nucleótidos ATGAAT en la dirección 5' del codón de inicio.

SEO ID NO: 4 es la secuencia de AON del gen de Proteasa 111 de tipo natural.

SEO ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos de la proteína Proteasa 111 de tipo natural.

SEO ID NO: 6 es la secuencia de AON de un gen de Proteasa 111 mutado inactivado. SEO ID NO: 7 es la secuencia de AON del gen OegP de tipo natural. SEO ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos de la proteína OegP de tipo natural. SEO ID NO: 9 es la secuencia de AON de un gen OegP mutado. SEO ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos de la proteína OegP mutada.

SEO ID NO: 11 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-TNF.

SEO ID NO: 12 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo antiTNF.

SEO ID NO: 13 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de un anticuerpo anti-TNF. SEO ID NO: 14 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de un anticuerpo anti-TNF. SEO ID NO: 15 es la secuencia del cebador oligonucleótido 3' para la región del gen Tsp mutado que comprende el

sitio de restricción Ase 1.

SEO ID NO: 16 es la secuencia del cebador oligonucleótido 5' para la región del gen Tsp mutado que comprende el sitio de restricción Ase 1. SEO ID NO: 17 es la secuencia del cebador oligonucle6tido 3' para la región del gen Proteasa 111 mutado que

comprende el sitio de restricción Ase 1.

SEO ID NO: 18 es la secuencia del cebador oligonucleótido 5' para la región del gen Proteasa 111 mutado que comprende el sitio de restricción Ase l. SEO ID NO: 19 es la secuencia del cebador oligonucleótido 5' para la región del gen Oegp mutado que comprende

el sitio de restricción Ase 1.

SEO ID NO: 20 es la secuencia del cebador oligonucleótido 3' para la región del gen OegP mutado que comprende el sitio de restricción Ase 1. SEO ID NO: 21 es la secuencia del gen spr de tipo natural que incluye la secuencia señal que son los primeros 26

restos de aminoácidos.

SEO ID NO: 22 es la secuencia del gen spr no mutado sin la secuencia señal.

SEO ID NO: 23 es la secuencia de nucleótidos de una secuencia de OmpT mutada que comprende las mutaciones 0210A y H212A

SEO ID NO: 24 es la secuencia de aminoácidos de una secuencia de OmpT mutada que comprende las mutaciones 0210A y H2'12A

SEO ID NO: 25 es la secuencia de nucleótidos de una secuencia de OmpT mutada inactivada. SEO ID NO: 26 muestra la secuencia de aminoácidos de CORH1 de hTNF40. SEO ID NO: 27 muestra la secuencia de aminoácidos de CORH2 de hTNF40 que es una COR híbrida en donde los

6 aminoácidos C-terminales son de la secuencia de COR H2 de un anticuerpo de la línea germinal del subgrupo 3 humano y los cambios de aminoácidos de la secuencia que resulta de esta hibridación están subrayados como sigue: WINTYIGEPI Y~OSVKG.

SEO ID NO: 28 muestra la secuencia de aminoácidos de CORH3 de hTNF40. SEO ID NO: 29 muestra la secuencia de aminoácidos de CORL 1 de hTNF40. SEO ID NO: 30 muestra la secuencia de aminoácidos de CORL2 de hTNF40. SEO ID NO: 31 muestra la secuencia de aminoácidos de CORL3 de hTNF40. SEO ID NO: 32 muestra la secuencia de aminoácidos de CORH2 de hTNF40.

SEO ID NO: 33 muestra la secuencia del adaptador oligonucleótido OmpA

SEO ID NO: 34 muestra el casete de oligonucleótido que codifica la secuencia intergénica 1 (IGS1) para la expresión de Fab en E. eoli.

SEO ID NO: 35 muestra el casete de oligonucleótido que codifica la secuencia intergénica 2 (IGS2) para la expresión de Fab en E. eoli.

SEO ID NO: 36 muestra el casete de oligonucleótido que codifica la secuencia intergénica 3 (IGS3) para la expresión de Fab en E. eoli.

SEO ID NO: 37 muestra el casete de oligonucleótido que codifica la secuencia intergénica 4 (IGS4) para la expresión de Fab en E. eoli.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención

Los autores de la presente invención han proporcionado una célula bacteriana Gram negativa recombinante adecuada para expresar una proteína de interés que comprende un gen spr mutado y la célula tiene actividad reducida de la proteína Tsp comparada con una célula de tipo natural.

En el primer aspecto de la invención, las nuevas mutaciones en el spr proporcionan nuevas cepas que tienen fenotipo de crecimiento celular mejorado comparado con células bacterianas de tipo natural y células que llevan un gen Tsp mutado.

Los autores de la . presente invención han identificado nuevas mutaciones de spr que son capaces de suprimir el fenotipo de crecimiento de una célula que comprende un gen Tsp mutado. Los autores de la invención han encontrado sorprendentemente que las células que llevan el nuevo spr mutado y que tienen actividad reducida de Tsp, presentan mayor velocidad de crecimiento y mayor duración de la supervivencia celular comparado con una célula de tipo natural o una célula que comprende un gen Tsp mutado. Específicamente, las células que llevan las nuevas mutaciones de spr y que tienen actividad reducida de Tsp presentan fenotipo de lisis celular reducido comparado con células que llevan un gen Tsp mutado. Por consiguiente, las nuevas cepas reducen la pérdida de proteína de las células y permiten la acumulación periplásmica prolongada comparado con células que llevan un gen Tsp mutado.

Además, las células que llevan el nuevo spr mutante y que tienen actividad reducida de Tsp presentan mayor rendimiento de una proteína de interés comparado con una célula bacteriana de tipo natural o una célula que comprende un gen Tsp mutado. El rendimiento de proteínas mejorado puede ser rendimiento de proteínas periplásmicoy/o rendimiento de proteínas en el liquido sobrenadante. En una realización, las células de la presente invención presentan rendimiento de proteínas periplásmico mejorado comparado con una célula que lleva un gen Tsp mutado, debido a la pérdida reducida de la célula. Las células bacterianas recombinantes pueden ser capaces de una mayor velocidad de producción de una proteína de interés, y por lo tanto, la misma cantidad de una proteína de interés se puede producir en un tiempo más corto comparado con una célula bacteriana de tipo natural o una célula que comprende un gen Tsp mutado. La mayor velocidad de producción de una proteína de interés puede ser especialmente significativa a lo largo del periodo de crecimiento inicial de la célula, por ejemplo, a lo largo de las primeras, 5, 10,20 o 30 horas después de inducción de la expresión de proteína.

Las células de acuerdo con la presente invención, preferiblemente expresan un rendimiento máximo en el periplasma y/o en el medio de aproximadamente1 ,O gIl, 1,5 gIl, 1,8 gIl, 2,0 gIl, 2,4 gIl, 2,5 gIl, 3,0 gIl, 3,5 gIl o 4,0 gIl de una proteína de interés.

Las células proporcionadas por el primer y segundo aspectos de la presente invención tienen actividad reducida de proteasa Tsp comparado con una célula de tipo natural, lo cual puede reducir la proteolisis de una proteína de interés, en particular proteínas de interés que son proteolíticamente sensibles a la Tsp. Por lo tanto, las células proporcionadas por el primer y segundo aspectos de la presente invenCión pueden proporcionar rendimientos mayores de proteínas intactas, ~referiblemente de la proteína de interés, y un rendimiento menor, o preferiblemente nada, de fragmentos proteolfticos de proteína, preferiblemente de la proteína de interés, comparado con una célula bacteriana de tipo natural.

En el segundo aspecto de la invención y una realización preferida del primer aspecto de la invención, las células llevan solo mutaciones mínimas en el genoma necesarias para introducir una o más mutaciones de spr y la modificación necesaria para reducir la actividad de la proteína Tsp comparado con una célula de tipo natural. La célula bacteriana solo difiere de una célula bacteriana de tipo natural por la una o más mutaciones del gen spr y la modificación necesaria para reducir la actividad de la proteína Tsp comparado con una célula de tipo natural. Las células no llevan ninguna otra mutación que pueda tener efectos pe~udiciales en el crecimiento celular y/o la capacidad para expresar una proteína de interés. Por consiguiente, una o más de las células hospedantes recombinantes de la presente invención pueden presentar caracterfsticas de expresión de proteínas mejorada y/o de crecimiento mejorado comparado con células que comprenden mutaciones adicionales genéticamente diseñadas en la secuencia genómica. Las células proporcionadas por la presente invención también son más adecuadas para usar para producir proteína terapéuticas comparadas con células que comprenden además alteraciones del genoma celular.

El experto en la técnica podrá ensayar fácilmente un clon de célula candidata para ver si tiene el rendimiento deseado de una proteína de interés, usando métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo un método de fermentación, ELlSA, HPLC de proteína G. Los métodos de fermentación adecuados se describen en Humphreys O P, et al. (1997). "Formation of dimeric Fabs in E. coli: effect of hinge size and isotype, presence of interchain disulphide bond, Fab' expression levels, tail piece sequences and growth conditions". J. IMMUNOL. METH. 209: 193202; Backlund E. Reeks O. Markland K. We.r N. Bowering L. Larsson G. "Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichia coli, Journal Artide". Ayuda no gubernamental a la investigación, EE.UU., Joumal of Biotechnology. 135(4):358-65,31 de julio de 2008; Champion KM. Nishihara JC. Joly JC. Arnott O. "Similarity ofthe Escherichia coli proteome upon completion of different biopharmaceutical fermentation processes". [Artículo de revista] Proteomics. 1(9): 1133-48, 2001 Sep; y Horn U. Strittmatter W. Krebber A. Knupfer U. Kujau M. Wenderoth R. Muller K. Matzku S. Pluckthun A. Riesenberg O. "High volumetric yields of functional dimeric miniantibodies in Escherichia coli, using an optimized expression vector and high-cell-density fermentation under non-limited growth conditions", Artículo de revista. Ayuda no gubernamental a la investigación, EE.UU., Applied Microbiology & Biotechnology. 46(5-6):524-32, diciembre1996. El experto en la técnica también podrá ensayar fácilmente la proteína secretada para ver si la proteína está plegada correctamente usando métodos bien conocidos en la técnica, tales como HPLC de proteína G, dicroísmo circular, RMN, cristalografía de rayos X y métodos de medición de afinidad de epítopos.

La presente invención ahora se describirá con más detalle. Todas las realizaciones descritas en la presente memoria se refieren al primer, segundo y tercer aspectos de la presente invención salvo que se exponga específicamente de otra forma.

Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan de forma intercambiable en la presente memoria, salvo que el contexto indique otra cosa. "Péptido" se refiere a 10 o menos aminoácidos.

El término "polinucleótido" indyuye un gen, AON, AONc, ARN, ARNm etc., salvo que el contexto indique otra cosa.

Como se usa en la presente memoria, el término "comprende" en el contexto de la presente memoria descriptiva debe interpretarse como "induye".

La célula no mutada o célula de control en el contexto de la presente invención significa una célula del mismo tipo que la célula Gram negativa recombinante de la invención, en donde la célula no se ha modificado para llevar la actividad reducida de proteína Tsp y para llevar el gen spr mutante. Por ejemplo, una célula no mutada será una célula de tipo natural y se puede obtener de la misma población de células hospedantes que las células de la invención antes de modificación para introducir cualquier mutación.

La expresión "célula", "línea celular", "célula de cultivo" y "cepa" se usan de forma intercambiable.

La expresión "fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado" en el contexto de la presente invención, significa el fenotipo presentado por una célula que alberga un gen Tsp mutante. Típicamente, las células que comprenden un gen Tsp mutante pueden producir lisis, en especial con altas densidades celulares. La lisis de estas células hace que cualquier proteína recombinante se pierda al Ifquido sobrenadante. Las células que llevan el gen Tsp mutado también pueden mostrar crecimiento termosensible a baja osmolalidad. Por ejemplo, las células no presentan o presentan velocidad reducida de crecimiento o las células mueren en medio hipotónico a una temperatura alta, tal como 40°C o más.

El término "isogénico' en el contexto de la presente invención significa que el genoma de la célula de la presente invención tiene sustancialmente la misma o la misma secuencia genómica comparada con una célula de tipo natural de la cual deriva la célula, excepto por el gen spr mutado y la modificación necesaria para reducir la actividad de proteína Tsp comparado con una célula de tipo natural. En esta realización, el genoma de la célula no comprende mutaciones adicionales que no se encuentran de forma natural o de ingeniería genética. En una realización, la célula de acuerdo con la presente invención puede tener sustancialmente la misma secuencia genómica compara con la célula de tipo natural excepto por el gen spr mutado y la modificación necesaria para reducir la actividad de proteína Tsp comparado con una célula de tipo natural teniendo en cuenta cualquier mutación natural que pueda haber. En una realización, la célula de acuerdo con la presente invención puede tener exactamente la misma secuencia genómica comparada con la célula de tipo natural excepto por el gen spr mutado y la modificación necesaria para reducir la actividad de proteína Tsp comparado con una célula de tipo natural.

La expresión "de tipo natural" en el contexto de la presente invención, significa una cepa de una célula bacteriana Gram negativa como puede encontrarse en la naturaleza o se puede aislar del entorno, que no lleva ninguna mutación genéticamente diseñada. Un ejemplo de una cepa de tipo natural de E. coli es W311 O, tal como la cepa K12 de W3110.

Se puede usar cualquier bacteria Gram negativa adecuada como célula parental para producir la célula recombinante de la presente invención, Las bacterias Gram negativas adecuadas induyen Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens, Erwinia carotovora, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii y E. coli. Preferiblemente, la célula parental es E. coli. Se puede usar cualquier cepa de E. coli en la presente invención, pero preferiblemente se usa una cepa W3110 de tipo natural, tal como K-12 W311 O.

Un inconveniente asociado con las cepas bacterianas deficientes en proteasa previamente creadas y usadas para expresar proteínas recombinantes, es que comprenden mutaciones adicionales de genes implicados en el metabolismo celular y la replicación de AON, tales como, por ejemplo, phoA, fhuA, lac, rec, gal,ara, arg, thi y pro en cepas de E. coli. Estas mutaciones pueden tener muchos efectos perjudiciales en la célula hospedante, induyendo efectos en el crecimiento celular, estabilidad, rendimiento de la expresión de la proteína recombinante y toxicidad. Las cepas que tienen una o más de estas mutaciones genómicas, en particular las cepas que tienen un número alto de estas mutaciones pueden presentar una pérdida de competencia que reduce la velocidad de crecimiento bacteriano a un nivel que no es adecuado para la producción industrial de proteínas. Además, cualquiera de las mutaciones genómicas anteriores puede afectar a otros genes en cis y/o en trans de formas dañinas impredecibles, alternado de esta forma el fenotipo de la cepa, capacidad y perfil de proteínas. Además, el uso de células muy mutadas en general no es adecuado para producir proteínas recombinantes para uso comercial, en particular para productos terapéuticos, porque dichas cepas en general tienen rutas metabólicas defectuosas y por lo tanto pueden crecer poco o nada en medios mínimos o químicamente definidos.

La célula de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención es isogénica con una célula bacteriana de tipo natural excepto por el gen spr mutado y la modificación necesaria para reducir la actividad de proteína Tsp comparado con una célula de tipo natural. La célula de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención preferiblemente también es isogénica con una célula bacteriana de tipo natural excepto por el gen spr mutado y la modificación necesaria para reducir la actividad de proteína Tsp comparado con una célula de tipo natural. Solo se hacen mutaciones mínimas en el genoma de la célula para introducir las mutaciones. Las células no llevan ninguna otra mutación que pueda tener efectos perjudiciales en el crecimiento celular y/o en la capacidad para expresar una proteína de interés. Por consiguiente, una o más de las células hospedantes recombinantes de la presente invención pueden presentar expresión de proteína mejorada y/o características de crecimiento mejoradas comparadas con células que comprenden además mutaciones genéticamente diseñadas de la secuencia genómica. Las células proporcionadas por la presente invención también son más adecuadas para usar en la producción de proteínas terapéuticas comparadas con células que comprenden alteraciones adicionales del genoma celular.

En una realización preferida, la célula es isogénica con una célula de E. coli detipo natural, tal como la cepa W3110, excepto por el gen spr mutado y la modificación necesaria para reducir la actividad de proteína Tsp comparado con una célula de tipo natural.

La célula de la presente invención puede diferir además de una célula de tipo natural comprendiendo un polinudeótido que codifica una proteína de interés. La secuencia del polinudeótido que codifica la proteína de interés puede ser exógena o endógena. El polinucleótido que codifica la proteína de interés puede estar contenido en un vector de expresión adecuado transformado en la célula y/o integrado en el genoma de la célula hospedante. En la realización donde el polinudeótido que codifica la proteína de interés se inserta en el genoma hospedante, la célula de la presente invención también diferirá de una célula de tipo natural por la secuencia de polinucleótido que codifica la proteína de interés insertada. Preferiblemente, el polinudeótido es un vector de expresión en la célula, produciendo así alteración mínima en el genoma de la célula hospedante.

La proteína spr es una proteína periplásmica unida a membrana de E. coli.

La secuencia de aminoácidos de tipo natural de la proteína spr se"muestra en la SEO ID NO: 21 con la secuencia señal en el extremo N y en la SEO ID NO: 22 sin la secuencia señal de 26 aminoácidos (de acuerdo con el número de acceso en UniProt POAFV4). La numeración de aminoácidos de la secuencia de la proteína spr en la presente invención induye la secuencia señal. Por consiguiente, el aminoácido 1 de la proteína spr es el primer aminoácido (Met) mostrado en la SEO ID NO: 21.

El gen spr mutado preferiblemente es el gen spr cromosómico de la célula.

El gen spr mutado codifica una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. Las células que llevan un gen Tsp mutado pueden tener una buena velocidad de crecimiento celular pero una limitación de estas células es su tendencia a la lisis, en especial con densidades celulares altas. Por consiguiente, el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado es una tendencia a la lisis, en especial con densidades celulares altas. Las células que llevan un gen Tsp mutado también muestran crecimiento termosensible con baja osmolalidad. Sin embargo, las mutaciones spr que llevan las células de la presente invención, cuando se introducen en una célula que tiene actividad reducida de Tsp suprimen el fenotipo de Tsp reducido y, por lo tanto, la célula presenta lisis reducida, en particular con una densidad celular alta. El fenotipo de crecimiento de una célula lo puede medir fácilmente un experto en la técnica durante la técnica de fermentación en matraz agitado o de densidad celular alta. La supresión del fenotipo de liSIS celular también puede verse a partir la velocidad de crecimiento y/o producción de proteína recombinante mejorados, en particular en el periplasma, presentados por una célula que lleva el mutante de spr y que tiene actividad reducida de Tsp comparado con una célula que lleva el mutante de Tsp y un spr de tipo natural.

Las células de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención y una realización preferida del segundo aspecto, comprenden un gen spr mutante que codifica una proteína spr que tiene l,Ina mutación en uno o más aminoácidos seleccionados de N31, R62, 170, 073, C94, S95, V98, 099, R100, L108, Y115, 0133, V135, L 136, G140, R144, H145, G147 YH157, preferiblemente una mutación en uno o más aminoácidos seleccionados de C94, 895, V98, Y115, 0133, V135, H145, G147 YH157.

La mutación de uno o más de los aminoácidos anteriores puede ser cualquier mutación de aminoácido adecuada en 1, 2 o 3 de los nudeótidos que codifican el aminoácido. La mutación cambia el resto de aminoácido en cualquier aminoácido adecuado que de como resultado una proteína spr mutada capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. La mutación de aminoácido puede cambiar el aminoácido por uno que tenga un tamaño diferente y/o tenga propiedades químicas diferentes comparadas con el aminoácido de tipo natural.

En una realización, el gen spr mutante codifica una proteína spr que tiene una o más mutaciones seleccionadas de C94A, 895F, V98E, Y115F, 0133A, V1350 o G, H145A, G147C y H157A.

En una realización, la mutación es en 1,2 o 3 de la triada catalítica de los restos de aminoácidos C94, H145, y H157 ("80lution NMR 8tructure of the NlpC/P60 Oomain of Lipoprotein 8pr from Escherichia coli 8tructural Evidence for a Novel Cysteine Peptidase Catalytic Triad", Biochemistry, 2008, 47, 9715-9717).

Por consiguiente, el gen spr mutado puede comprender:

•: una mutación de C94; o

•: una mutación de H145; o

•: una mutación de H 157; o

•: una mutación de C94 y H 145; o

•: una mutación de C94 y H157; o

•: una mutación de H145 y H157; o

•: una mutación de C94, H145 y H157.

En esta realización, la proteína spr preferiblemente no tiene ninguna mutación adicional.

Uno, dos o tres de C94, H145 y H157 pueden estar mutados en cualquier aminoácido adecuado que de como resultado una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. Por ejemplo, 1, 2 o 3 de C94, H145 y H157 pueden estar mutados en un aminoácido pequeño tal como Gly o Ala. Por consiguiente, la proteína spr puede tener 1, 2 o 3 de las mutaciones C94, H145 y H157. Preferiblemente, el gen spr comprende la mutación de aminoácido H145A, que se ha encontrado que produce una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado.

La designación de un mutante por sustitución en la presente memoria consiste en una letra seguida de un número seguido de una letra. La primera letra designa el aminoácido en la proteína de tipo natural. El número se refiere a la posición del aminoácido donde se está haciendo la sustitución de aminoácido, y la segunda letra designa el aminoácido que se usa para sustituir el aminoácido de tipo natural.

En una realización preferida, la proteína spr mutante comprende una mutación en uno o más aminoácidos seleccionados de N31, R62, 170,073,895, V98, 099, R100, L 108, Y115, 0133, V135, L136, G140, R144 y G147, preferiblemente una mutación en uno o más aminoácidos seleccionados de 895, V98, Y115, 0133, V135 y G147. En esta realización, la proteína spr preferiblemente no tiene ninguna mutación adicional. Por consiguiente, el gen spr mutado puede comprender

•: una mutación de N31; o

•: una mutación de R62; o

•: una mutación de 170; o

•: una mutación de 073; o

•: una mutación de 895; o

•: una mutación de V98; o

•: una mutación de 099; o

•: una mutación de R100; o

•: una mutación de L 108; o

•: una mutación de Y115; o

•: una mutación de 0133; o

•: una mutación de V 135; o

•: una mutación de L 136; o 5 • una mutación de G140; o

•: una mutación de R144; o

•: una mutación de G147. En una realización la proteína spr mutante comprende múltiples mutaciones de los aminoácidos:

•: S95 y Y115; o 10 • N31, 073, R100 YG140; o

•: 073, R100 YG140; o

•: R100 YG140; o

•: 073 YG140; o

•: 073 YR100; o 15 • R62, 099 YR144; o

• 099 YR144.

Uno o más de los aminoácidos N31, R62, 170, 073, S95, V98, 099, R100, L108, Y115, 0133, V135, L 136, G140,

R144 y G147 se puede mutar en cualquier aminoácidos que de como resultado una proteína spr capaz de suprimir

el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. Por ejem plo, uno o más de N31, R62, 170, 073, S95,

20 V98, 099, R100, L 108, Y115, 0133, V135, L 136, G140 YR144 se puede mutar en un aminoácido pequeño tal como Gly o Ala.

En una realización preferida la proteína spr comprende una o más de las siguientes mutaciones: N31Y, R62C, 170T, 073R, S95F, V98E, 099P, R100G, L 108S, Y115F, 0133A, V1350 o V135G, L 136P, G140C, R144C y G147C. Preferiblemente, la proteína spr comprende una o más de las siguientes mutaciones: S95F, V98E, Y115F, 0133A,

25 V1350 o V135G y G147C. En esta realización, preferiblemente la proteína spr no tiene ninguna mutación adicional.

En una realización, la proteína spr tiene una mutación seleccionada de N31Y, R62C, 170T, 073R, S95F, V98E, 099P, R100G, L 108S, Y115F, 0133A, V1350 o V135G, L 136P, G140C, R144C y G147C. En esta realización, preferiblemente la proteína spr no tiene ninguna mutación adicional.

En una realización adicional, la proteína spr tiene múltiples mutaciones seleccionadas de:

30 • S95F yY115F

•: N31Y, 073R, R100G YG140C;

•: 073R, R100G YG140C;

•: R100G YG140C;

• 073R YG140C; 35 • 073R YR100G;

•: R62C, 099P y R144C; o

•: 099P YR144C.

Preferiblemente, el gen spr mutante codifica una proteína spr que tiene una mutación seleccionada de H145A, H157A Y0133A

40 En el segundo aspecto de la presente invención, se puede hacer cualquier mutación o mutaciones en el gen spr que den como resultado una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. Preferiblemente, la proteína spr puede tener una o más de las siguientes mutaciones N31Y, R62C, 170T, Q73R, C94A S95F, V98E, Q99P, R100G, L 108S, Y115F, 0133A, V1350, V135G, L 136P, G140C, R144C, H145A, G147C, H157A y W174R. En una realización, la proteína spr no comprende la mutación W174R. Preferiblemente, el gen spr comprende una o más mutaciones descritas antes con respecto al primer aspecto de la presente invención.

Las células de acuerdo con la presente invención tienen actividad reducida de proteína Tsp comparada con una célula de tipo natural. La expresión "actividad reducida de proteína Tsp comparada con una célula de tipo natural" significa que la actividad de Tsp en la célula es menor comparada con la actividad de Tsp en una célula de tipo natural. La célula se puede modificar por cualquier medio adecuado para reducir la actividad de Tsp.

En una realización, la actividad reducida de Tsp es a partir de la modificación del polinucleótido endógeno que codifica la Tsp y/o secuencias reguladoras de expresión asociadas. La modificación puede reducir o detener la transcripción y traducción del gen Tsp o puede proporcionar una proteína Tsp expresada que tiene actividad reducida de proteasa compara con la proteína Tsp de tipo natural.

En una realización, se modifica una secuencia reguladora de expresión asociada para reducir la expresión de Tsp. Por ejemplo, el promotor para el gen Tsp se puede mutar para prevenir la expresión del gen.

En una realización preferida, las células de acuerdo con la presente invención llevan un gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp que tiene actividad reducida de proteasa o un gen Tsp mutado inactivado.

Preferiblemente, el gen Tsp cromosómico está mutado.

Como se usa en la presente memoria, el "gen Tsp" significa un gen que codifica la proteasa Tsp (también conocida como Prc) que es-una proteasa periplásmica capaz de actuar en la proteína 3 de unión a penicilina (PBP3) y proteínas de la cola de fago. La secuencia de un gen Tsp de tipo natural se muestra en la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de la proteína Tsp de tipo natural se muestra en la SEQ ID NO: 2.

La referencia al gen Tsp mutado o gen Tsp mutado que codifica la Tsp, se refiere a un gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp que tiene actividad reducida de proteasa o un gen Tsp mutado inactivado, salvo que se indique lo contrario.

La expresión "gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp que tiene actividad reducida de proteasa" en el contexto de la presente invención significa que el gen Tsp mutado no tiene la actividad de proteasa completa comparado con el gen de Tsp no mutado de tipo natural.

Preferiblemente, el gen Tsp mutado codifica una proteína Tsp que tiene 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos o 5% o menos de la actividad de proteasa de una proteína Tsp no mutada de tipo natural. Más preferiblemente, el gen Tsp mutado codifica una proteína Tsp que no tiene actividad de proteasa. En esta realización, la célula no es deficiente en Tsp cromosómico, es decir, la secuencia del gen Tsp no se ha eliminado o mutado para prevenir la expresión de cualquier forma de la proteína Tsp.

Se puede introducir cualquier mutación adecuada en el gen Tsp con el fin de producir una proteína que tenga actividad reducida de proteasa. La actividad de proteasa de una proteína Tsp expresada a partir de una bacteria Gram-negativa la puede ensayar fácilmente el experto en la técnica por cualquier método adecuado en la técnica, tal como el método descrito en Keiler et al. ("Identification of Active Site Residues of the Tsp Protease*" THE JOURNAL OF BIOLOG/CAL CHEMISTRYVol. 270, No. 48, presentado el1 de diciembre, pág. 28864-28868,1995 Kenneth C. Keiler y Robert T. Sauer) en donde se ensayó la actividad de proteasa de Tsp.

Keiler et al. (véase antes) han descrito que la Tsp tiene un sitio activo que comprende 105 restos S430, 0441 y K455 Y 105 restos G375, G376, E433 Y T452 son importantes para mantener la estructura de la Tsp. Keiler et al (véase antes) describen que han encontrado que 105 genes de Tsp mutados S430A, 0441 A, K455A, K455H, K455R, G375A G376A, E433A y T452A no tienen actividad de proteasa detectable. Se describe además que el gen Tsp mutado S430C presentaba aproximadamente 5-10% de la actividad natural. Por consiguiente, la mutación de Tsp para producir una proteína que tenga actividad de proteasa reducida puede comprender una mutación, tal como una mutación de aminoácido en uno o más de 105 restos S430, 0441, K455, G375, G376, E433 YT 452. Preferiblemente, la mutación de Tsp para producir una proteína que tenga actividad reducida de proteasa puede comprender una mutación, tal comouna mutación de aminoácido en 1, 2 o 3 de 105 restos del sitio activo S430, 0441 y K455.

Por consiguiente, el gen Tsp mutado puede comprender:

•: una mutación de 5430; o

•: una mutación de 0441; o

•: una mutación de K455; o

•: una mutación de S430 y 0441; o

•: una mutación de 5430 y K455; o

•: una mutación de 0441 y K455; o

•: una mutación de S430, 0441 y K455.

Uno o más de S430, 0441, K455, G375, G376, E433 Y T452 se pueden mutar en cualquier aminoácido adecuado que de como resultado una proteína que tenga actividad de proteasa reducida. Los ejemplos de mutaciones 5 adecuadas son S430A, S430C, 0441 A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A YT452A. El gen Tsp mutado puede comprender 1, 2 o 3 mutaciones en los restos del sitio activo, por ejemplo, el gen puede comprender:

•: S430A o S430C; y/o

•: 0441A; y/o

•: K455A o K455H o K455R.

Preferiblemente, el gen Tsp tiene la mutación puntual S430A o S430C.

La expresión "gen Tsp mutado inactivado" en el contexto de la presente invención significa que el gen comprende una o más mutaciones que previenen la expresión de la proteína Tsp codificada-por el gen de tipo natural, para proporcionar una célula deficiente en proteína Tsp. El gen inactivado puede ser parcial o completamente transcrito pero no traducido en la proteína codificada. El gen Tsp mutado inactivado se puede mutar de cualquier forma

15 adecuada, por ejemplo por una o más mutaciones por eliminación, inserción, puntual, de aminoácido, terminadora y de cambio del marco de lectura, para que no se produzca expresión de la proteína. Por ejemplo, el gen se puede inactivar por inserción de una secuencia de AON extraña, tal como un marcador de resistencia a antibiótico, en la secuencia que codifica el gen.

En una realización preferida, el gen Tsp no se muta por inserción de una secuencia de AON extraña, tal COmo un marcador de resistencia a antibiótico, en la secuencia que codifica el gen. En esta realización, el gen Tsp puede comprender una mutación en el codón de inicio del gen y/o uno o más codones de parada situados en la dirección 3' del codón de inicio del gen y en la dirección 5' del codón de parada del gen, de modo que se previene la expresión de la proteína Tsp. La mutación en el codón de inicio puede ser una mutación de aminoácido de 1, 2 o 3 de los nucleótidos del codón de inicio. Alternativa o adicionalmente, el codón de inicio se puede mutar por una mutación de

25 cambio del marco de lectura por inserción o eliminación. El gen Tsp comprende dos codones ATG en el extremo 5' de la secuencia cOdificante, uno o ambos codones ATG se PlJeden mutar por una mutación de aminoácido. El gen Tsp se puede mutar en el segundo codón ATG (codón 3) en TCG, como se muestra en la figura 11 b. El gen Tsp puede comprender alternativa o adicionalmente uno o más codones de parada situados en la dirección 3' del codón de inicio del gen y en la dirección 5' del codón de parada del gen. Preferiblemente el gen Tsp mutado inactivado comprende tanto una mutación de aminoácido en el codón de inicio como uno o más codones de parada insertados. En una realización preferida, el gen Tsp se muta para eliminar "T' del quinto codón produciendo de esta forma un cambio del marco de lectura que da como resultado codones de parada en los codones 11 y 16, como se muestra en la figura 11 b. En una realización preferida, el gen Tsp se muta para insertar un sitio de restricción Ase I para crear un tercer codón de parada en el marco de lectura en el codón 21, COmo se muestra en la figura 11 b.

35 En una realización preferida, el gen Tsp mutado inactivado tiene la secuencia de AON de la SEO ID NO: 3, que incluye 6 nucleótidos ATGAAT en la dirección 5' del codón de inicio. Las mutaciones que se han hecho en la secuencia de Tsp mutado inactivado de la SEO ID NO: 3 se muestran en la figura 11b. En una realización, el gen Tsp mutado tiene la secuencia de AON de los nucleótidos 7 a 2048 de la SEO ID NO: 3.

En una realización, la célula bacteriana Gram negativa recombinante comprende además un polinucleótido recombinante que codifica OsbC. El polinucleótido que codifica OsbC puede estar presente en un vector de expresión adecuado transformado en la célula y/o integrado en el genoma de la célula hospedante. En la realización donde el polinucleótido que codifica OsbC se inserta en el genoma del hospedante, la célula de la presente invención también diferirá de la célula de tipo natural debido a la secuencia de polinucleótido insertada que codifica OsbC. Preferiblemente, el polinucleótido que codifica OsbC está en un vector de expresión en la célula produciendo

45 así una alteración mínima en el genoma de la célula hospedante.

Como se usa en la presente memoria, un "polipéptido recombinante" se refiere a una proteína que se construye o produce usando tecnología de AON recombinante. La secuencia del polinucleótido que codifica OsbC puede ser idéntica a la secuencia endógena que codifica OsbC encontrada en células bacterianas. Alternativamente, la secuencia del polinucleótido recombinante que codifica OsbC es una versión mutada de la secuencia de OsbC de tipo natural, por ejemplo, que tiene un sitio de restricción eliminado, tal como un sitio de EcoRl, y/o una secuencia que codifica un marcador de his.

La OsbC es una proteína procariota encontrada en el periplasma de E. eoli que cataliza la formación de enlaces disulfuro en E. eoli. OsbC tiene un secuencia de aminoácidos de 236 de longitud (incluyendo el péptido señal) y un peso molecular de 25,6 kOa (UniProt No. POAEG6). OsbC se identificó por primera vez en 1994 (Missiakas et al. 55 "The Escherichia coli dsbC (xprA) gene encodes a periplasmic 'protein involved in disulfide bond formation", The EMBO Jouma/vol13, nO 8, pág. 2013-2020, 1994, YShevchik et al. "Characterization of OsbC, a periplasmic protein

of Erwinia chrysanthem i and Escherichia coli with disulfide isomerase activity", The EMBO Joumal vol 13, n" 8, pág. 2007-2012,1994).

En una realización preferida de la presente invención, la célula bacteriana Gram negativa recombinante comprende además un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad de chaperona y actividad reducida de proteasa y/o un gen ptr mutado, en donde el gen ptr mutado codifica una proterna proteasa 111 que tiene actividad reducida de proteasa o es un gen ptr mutado inactivado y/o un gen OmpT mutado, en donde el gen OmpT mutado codifica una proteína OmpT que tiene actividad reducida de proteasa o es un gen OmpT mutado inactivado.

En una realización, la presente invención proporciona una célula bacteriana Gram negativa recombinante que comprende

a.: un gen spr mutado

b.: un gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp que tiene actividad reducida de proteasa o un gen Tsp mutado inactivado; y

e un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad de chaperona y actividad reducida de proteasa y/o un OmpT mutado en donde el gen OmpT mutado codifica una proteína OmpT que tiene actividad reducida de proteasa o es un gen OmpT mutado inactivado.

Preferiblemente, en esta realización el genoma de la célula es isogénico con una célula bacteriana de tipo natural excepto por las mutaciones anteriores.

En una realización, la presente invención proporciona una célula bacteriana Gram negativa recombinante que comprende:

a.: un gen' spr mutado

c.: un gen ptr mutado, en donde el gen ptr mutado codifica una proteína proteasa 111 que tiene actividad reducida de proteasa o es un gen ptr mutado inactivado y/o un OmpT mutado en donde el gen OmpT mutado codifica una proteína OmpT que tiene actividad reducida de proteasa o es un gen OmpT mutado inactivado.

En una realización, la presente invención proporciona una célula que comprende

a.: un gen spr mutado;

c.: un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad de chaperona y actividad reducida de proteasa;

d.: un gen ptr mutado. en donde el gen ptr mutado codifica una proteína proteasa 111 que tiene actividad reducida de proteasa o es un gen ptr mutado inactivado; y

e.: opcionalmente un OmpT mutado en donde el gen OmpT mutado codifica una proteína OmpT que tiene actividad reducida de proteasa o es un gen OmpT mutado inactivado.

En una realización de la presente invención, la célula lleva un gen DegP mutado. Como se usa en la presente memoria, "DegP" significa un gen que codifica la proteína DegP (también conocida como HtrA), que tiene función doble como una chaperona y como una proteasa ('Families of serine peptidases"; Rawlings ND, Barrett A, J. Methods Enzymol. 1994;244:19-61). La secuencia del gen DegP no mutado se muestra en la SEO ID NO: 7 y la secuencia de la proteína DegP no mutada se muestra en la SEO ID NO: 8.

A bajas temperaturas la DegP funciona como una chaperona y a altas temperaturas la DegP tiene preferencia para funcionar como una proteasa ("A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein". Cel/, Volume 97, Issue 3, páginas 339 -347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M, y "The proteolytic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low tem peratu res" , Skorko-Glonek J. et al Microbiology 2008, 154, 3649-3658).

En las realizaciones donde la célula comprende la mutación de DegP, la mutación de DegP en la célula proporciona un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad de chaperona pero no actividad de proteasa completa. . . 1

La expresión "que tiene actividad de chaperona" en el contexto de la presente invención significa que la proteína

5 DegP mutada tiene la misma o sustancialmente la misma actividad de chaperona comparada con la proteína DegP no mutada de tipo natural. Preferiblemente, el gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene 50% o más, 60% o más, 70% o más, 80% o más, 90% o más o 95% o más, de la actividad de chaperona de una proteína DegP no mutada de tipo natural. Más preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP que tiene la misma actividad de chaperona comparada con la DegP de tipo natural.

La expresión "que tiene actividad reducida de proteasa" en el contexto de la presente invención significa que la proteína DegP mutada no tiene la actividad de proteasa completa comparada con la proteína DegP no mutada de tipo natural. Preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP que tiene 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos o 5% o menos de la actividad de proteína de una proteína DegP no mutada de tipo natural. Más preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP que no tiene

15 actividad de proteasa. La célula no es deficiente en DegP cromosómico, es decir, las secuencias del gen DegP no se han eliminado o mutado para prevenir la expresión de cualquier forma de proteína DegP.

Se puede introducir cualquier mutación adecuada en el gen OegP con el fin de producir una proteína que tenga actividad de chaperona y actividad reducida de proteasa. La actividad de proteasa y chaperona de una proteína DegP expresada en una bacteria Gram negativa la puede ensayar fácilmente el experto en la técnica por cualquier método adecuado tal como el método descrito por Spiess et al., en donde se ensayan las actividades de proteasa y chaperona de la DegP en MaIS, un sustrato natural de la OegP ("A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein". Cel/, Volume 97, Issue 3, páginas 339 -347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M) y también el método descrito en "The proteolytic activity of the HtrA (OegP) protein from Escherichia coli at low temperatures", Skorko-Glonek J et al., Microbiology 2008, 154, 3649-3658.

25 La OegP es una serina proteasa y tiene un centro activo que consiste en una triada de restos de aminoácidos catalítica de His105, Asp135 y Ser210 ("Families of serine peptidases", Methods Enzymol., 1994, 244:19-61 Rawlings N y Barrett A). La mutación de DegP para producir una proteína que tiene actividad de chaperona y actividad reducida de proteasa puede comprender una mutación, tal como una mutación de aminoácido en 1, 2 o 3 de His105, Asp135 y Ser210.

Por consiguiente, el gen OegP mutado puede comprender:

•: una mutación de His1 05; o

•: una mutación de Asp 135; o

•: una mutación de Ser210; o

•: una mutación de His105 y Asp 135; o

35 • una mutación de His105 y Ser210; o

•: una mutación de Asp135 y Ser210; o

•: una mutación de His105, Asp135 y Ser210.

Se pueden mutar 1,2 o 3 de His105, Asp135 y Ser210 en cualquier aminoácido adecuado que de como resultado una proteína que tenga actividad de chaperona y actividad reducida de proteasa. Por ejemplo, 1, 2 o 3 de His105, Asp135 y Ser21 Ose pueden mutar en un aminoácido pequeño tal como Gly o Ala. Una mutación adecuada adicional es cambiar 1, 2 o 3 de His105, Asp135 y Ser210 por un aminoácido que tenga propiedades opuestas tal como mutar la Asp135 en Lys o Arg, mutar la His105 polar en un aminoácido no polar tal como Gly, Ala, Val o Leu, y mutar la Ser210 hidrófila pequeña en un resto grande o hidrófobo tal como Val, Leu, Phe o Tyr. Preferiblemente, el gen OegP comprende la mutación puntual S210A, como se muestra en la figura 11 c, que se ha encontrado que produce una

45 proteína que tiene actividad de chaperona pero no actividad de proteasa ("A Temperature-Oependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein". Cel/, Volume 97, Issue 3, páginas 339 -347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M).

OegP tiene dos dominios POZ, POZ1 (restos 260-358) y POZ2 (restos 359-448), que median la interacción proteínaproteína ("A Temperature-Oependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein". Cel/, Volume 97, Issue 3, páginas 339 -347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M). En una realización de la presente invención, el gen degP se muta para eliminar el dominio POZ1 y/o el dominio POZ2. La eliminación de POZ1 y POZ2 da como resultado la pérdida completa de actividad de proteasa de la proteína OegP y menor actividad de chaperona comparada con la proteína degP de tipo natural, mientras que la eliminación de PDZ1 o POZ2 da como resultado una actividad de proteasa de 5% y actividad de chaperona similar comparada con la proteína OegP de tipo natural ("A Temperature-Oependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein". Gel/, Volume 97, Issue 3, páginas 339 -347. Spiess C, Seil A, Ehrmann M).

El gen OegP mutado también puede comprender un sitio de restricción silencioso que no se encuentra de forma natural, tal como Ase I con el fin de ayudar en los métodos de identificación y cribado, por ejemplo, como se muestra en la figura 11c.

La secuencia preferida del gen OegP mutado que comprende la mutación puntual S210A y un sitio de restricción Ase I marcador se proporciona en la SEO ID NO: 9, y la secuencia de la proteína codificada se muestra en la SEO ID NO: 10. Las mutaciones que se han hecho en la secuencia de OegP mutada de la SEO ID NO: 9 se muestran en la figura 11 c.

En las realizaciones de la presente invención, en donde la célula comprende un gen OegP mutado que codifica una proteína OegP que tiene actividad de chaperona y actividad reducida de proteasa, una o más de las células proporcionadas por la presente invención pueden proporcionar rendimiento mejorado de proteínas plegadas correctamente de la célula con respecto a células mutadas en donde el gen OegPse ha mutado en OegP inactivado que previene la expresión de OegP, tal como OegP deficiente cromosómico. En una célula que comprende un gen OegP mutado inactivado que previene la expresión de OegP, la actividad de chaperona de la OegP se pierde completamente, mientras que en la célula de acuerdo con la presente invención, se retiene la actividad de chaperona de la OegP mientras que se pierde la actividad completa de proteasa. En estas realizaciones, una o más células de acuerdo con la presente invención tienen una actividad de proteasa menor para prevenir la proteolisis de la proteína mientras que mantienen la actividad de chaperona para permitir el plegado correcto y el transporte de la proteína en la célula hospedante.

El experto en la técnica podrá ensayar fácilmente la proteína secretada para ver si la proteína está correctamente plegada, usando métodos bien conocidos en la técnica, tal como HPLC de proteína G, dicroísmo circular, RMN, cristalografía de rayos X y métodos de medición de afinidad de epítopos.

En estas realizaciones, una o más células de acuerdo con la presente invención pueden tener crecimiento celular mejorado comparado con células que llevan un gen OegP mutado inactivado que previene la expresión de la OegP. Sin querer estar unido por la teoría, se puede presentar crecimiento celular mejorado debido a la actividad de chaperona que retiene la proteasa OegP que puede aumentar la capacidad de la célula para procesar todas las proteínas que requieren actividad de chaperona. Por lo tanto, se puede aumentar la producción de proteínas correctamente plegadas necesarias para el crecimiento celular y la reproducción en una o más células de la presente invención comparada con células que llevan la mutación de inactivación de OegP, mejorando de esta forma las rutas celulares que regulan el crecimiento. Además, las cepas deficientes en la proteasa OegP conocidas en general son sensibles ala temperatura y típicamente no crecen a temperaturas mayores que aproximadamente 28°C. Sin embargo, las células de acuerdo con la presente invención no son sensibles a la temperatura y pueden crecer a temperaturas de 28°C o superiores, induyendo temperaturas de aproximadamente 300C a aproximadamente 37°C, que se usan típicamente en la producción a escala industrial de proteínas a partir de bacterias.

En una realización de la presente invención, la célula lleva un gen ptr mutado. Como se usa en la presente memoria, "gen ptr" significa un gen que codifica la proteasa 111, una proteasa que degrada proteínas de alto peso molecular. La secuencia del gen ptr no mutado se muestra en la SEO ID NO: 4 y la secuencia de la proteína proteasa 111 no mutada se muestra en la SEO ID NO: 5.

La referencia al gen ptr mutado o gen ptr mutado que codifica la proteasa 111, se refiere a un gen ptr mutado que codifica una proteína proteasa 111 que tiene actividad reducida de proteasa o un gen ptr mutado inactivado, salvo que se indique otra cosa.

La expresión "gen ptr mutado que codifica una proteína proteasa 111 que tiene actividad reducida de proteasa" en el contexto de la presente invención, significa que el gen ptr mutado no tiene actividad de proteasa completa comparado con el gen ptr no mutado de tipo natural.

Preferiblemente, el gen ptr mutado codifica una proteasa 111 que tiene 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos o 5% o menos, de la actividad de proteasa de una proteína proteasa 111 no mutada de tipo natural. Más preferiblemente, el gen ptr mutado codifica una proteína proteasa 111 que no tiene actividad de proteasa. En esta realización, la célula no es deficiente en ptr cromosómica, es decir, la secuencia del gen ptr no se ha eliminado o mutado para prevenir la expresión de cualquier forma de la proteína proteasa 111.

Se puede introducir cualquier mutación adecuada en el gen ptr con el fin de producir una proteína proteasa 111 que tenga actividad reducida de proteasa. La actividad de proteasa de una proteína proteasa 111 expresada en una bacteria Gram negativa la puede ensayar fácilmente un experto en la técnica, mediante cualquier método adecuado en la técnica.

La expresión "gen ptr mutado inactivado" en el contexto de la presente invención significa que el gen comprende una

o más mutaciones haciendo así que no haya expresión de la proteína codificada por el gen para proporcionar una célula deficiente en la proteína codificada por el gen mutado inactivado. El gen inactivado puede ser parcial o completamente transcrito pero no traducido en la proteína codificada. El gen ptr mutado inactivado se puede mutar de cualquier forma adecuada, por ejemplo, por una o más mutaciones por eliminación, inserción, puntuales, de aminoácido, terminadora y de cambio del marco de lectura, para hacer que no haya expresión de la proteína. Por ejemplo, el gen se puede inactivar por inserción de una secuencia de AON extraña, tal como un marcador de resistencia a antibiótico, en la secuencia que codifica el gen.

En una realización preferida, el gen no se muta por inserción de una secuencia de AON extraña, tal como un marcador de resistencia a antibiótico, en la secuencia que codifica el gen. Preferiblemente, el gen de proteasa 111 comprende una mutación en el codón de inicio del gen y/o uno o más codones de parada situados en la dirección 3' del codón de inicio del gen y en la dirección 5' del codón de parada del gen, de modo que se previene la expresión de la proteína proteasa 111.

Una mutación en el codón de parada del gen inactivado diana produce la pérdida de función del codón de inicio y por lo tanto asegura que el gen diana no comprende un codón de inicio adecuado al comienzo de la secuencia codificante. La mutación en el codón de inicio puede ser una mutación de aminoácido de 1, 2 o los tres nucleótidos del codón de inicio. Alternativa o adicionalmente, el codón de inicio se puede mutar por una mutación de cambio del marco de lectura por inserción o eliminación.

En una realización preferida, el gen ptr se muta para cambiar el codón de inicio ATG en An, como se muestra en la figura 11a.

El gen ptr mutado inactivado puede comprender alternativa o adicionalmente uno o más codones de parada situados en la dirección 3' del codón de inicio del gen y en la dirección 5' del codón de parada del gen. Preferiblemente, el gen ptr mutado inactivado comprende una mutación de aminoácido en el codón de inicio y uno o más codones de parada insertados.

El uno o más codones de parada insertados preferiblemente son codones de parada dentro del marco de lectura. Sin embargo, el uno o más codones de parada insertados pueden ser alternativa o adicionalmente codones de parada fuera del marco de lectura. Pueden ser necesarios uno o más codones de parada fuera del marco de lectura para detener la traducción cuando un codón de inicio fuera del marco de lectura se cambia a un codón de inicio dentro del marco de lectura por una mutación de cambio del marco de lectura por inserción o eliminación. El uno o más codones de parada se pueden introducir por cualquier mutación adecuada, induyendo una mutación puntual terminadora y una mutación de cambio del marco de lectura. El uno o más codones de parada preferiblemente se introducen por una mutación de cambio del marco de lectura y/o una mutación por inserción, preferiblemente por sustitución de un segmento de la secuencia del gen por una secuencia que comprende un codón de parada. Por ejemplo, se puede insertar un sitio de restricción Ase /, que comprende el codón de parada TM.

En una realización preferida, el gen ptr se muta para insertar un codón de parada en el marco de lectura mediante inserción de un sitio de restricción de Ase 1, como se muestra en la figura 11á. En una realización preferida, el gen ptr mutado inactivado tiene la secuencia de AON de la SEO ID NO: 6. Las mutaciones que se han hecho en la secuencia del gen ptr mutado inactivado de la SEO ID NO: 6 se muestran en la figura 11 a.

Las mutaciones de inactivación descritas antes son ventajosas porque producen una alteración mínima o no producen alteración del AON cromosómico en la dirección 5' o dirección 3' del sitio del gen inactivado diana y por lo tanto no requieren la inserción y retención de AON extraño, tal como marcadores de resistencia a antibióticos, que pueden afectar a la idoneidad de la célula para la expresión de una proteína de interés, en particular proteínas terapéuticas. Por consiguiente, una o más de las células de acuerdo con la presente invención pueden presentar características de crecimiento y/o expresión de proteína mejoradas comparadas con las células en donde el gen de la proteasa se ha inactivado por inserción de AON extraño en la secuencia codificante del gen.

En una realización, las células de acuerdo con la presente invención llevan un gen OmpT mutado. Como se usa en la presente memoria, "gen OmpT" significa un gen que codifica la proteasa OmpT (proteasa T de membrana externa) que es una proteasa de la membrana externa. La secuencia del gen OmpT no mutado de tipo natural es SWISS-PROT P09169.

La referencia a un gen OmpT mutado o gen OmpT mutado que codifica la OmpT, se refiere a un gen OmpT mutado que codifica una proteína OmpT que tiene actividad reducida de proteasa o un gen OmpT mutado inactivado, salvo que se indique otra cosa.

La expresión "gen OmpT mutado que codifica una proteína OmpT que tiene actividad reducida de proteasa" en el contexto de la presente invención, significa que el gen OmpT mutado no tiene actividad de proteasa completa comparado con el gen OmpT no mutado de tipo natural. El gen OmpT mutado puede codificar una proteína OmpT que tiene 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos o 5% o menos, de la actividad de proteasa de una proteína OmpT no mutada de tipo natural. El gen OmpT mutado puede codificar una proteína OmpT que no tiene actividad de proteasa. En esta realización, la célula no es deficiente en OmpT cromosómica, es decir, la secuencia del gen OmpT no se ha eliminado o mutado para prevenir la expresión de cualquier forma de la proteína OmpT.

Se puede introducir cualquier mutación adecuada en el gen OmpT con el fin de producir una proteína que tenga actividad reducida de proteasa. La actividad de proteasa de una proteína OmpT expresada en una bacteria Gram negativa la puede ensayar fádlmente un experto en la técnica, mediante cualquier método adecuado en la técnica, tal como el método descrito en Kramer et al. ("Identification of essential addic residues of outer membrane protease OmpT supports a novel active site", FEBS Letters 505 (2001) 426-430) Y Oekker et al. ("Substrate Specitifidty of the Integral Membrane Protease OmpT Oetermined by Spatially Addressed Peptide Libraries", Biochemistry 2001, 40, 1694-1701).

Se ha descrito en Kramer et al. ("Identification of active site serine and histidine residues in Escherichia coli outer membrane protease OmpT", FEBS Letters 2000 468,220-224) que en la OmpT la sustitudón de serinas, histidinas y restos áddos por alaninas da como resultado una actividad reducida en -10 veces para Glu27, Asp97, Asp208 o His101, actividad reducida en -500 veces para Ser99 y actividad redudda en -10000 veces para Asp83, Asp85, Asp210 o His212. Vandeputte-Rutten et al. ("Crystal Structure of the Outer Membrane Protease OmpT from Escherichia coli suggests a novel catalytic site", The EMBO Jouma/2001, Vol 20 No 18 5033-5039) describen que tiene un sitio activo que comprende una pareja Asp83-Asp85 y una pareja His212-Asp21 Opairo Además Kramer et al. ("Lipopolysaccharide regions involved in the activation of Escherichia coli outer membrane protease OmpT", Eur.

J. Biochem. FEBS 2002, 269, 1746-1752) describe que las mutaciones 0208A, 0210A, H212A, H212N, H212Q, G216K1K217G, K217T Y R218L en el bucle L4 dan todas como resultado la pérdida pardal o casi completa de actividad enzimática.

Por consiguiente, la mutadón de OmpT para produdr una proteína que tiene actividad reducida de proteasa puede comprender una mutación, tal como una mutación de aminoácido en uno o más de los restos E27, 043, 083, 085, 097, S99, H101 E111, E136, E193, 0206, 0208, 0210, H212 G216, K217, R218 YE250.

Uno o más de E27, 043, 083, 085, 097, S99, H101 E111, E136, E193, 0206, 0208, 0210, H212 G216, K217, R218 y E250 se puede mutar por cualquier aminoácido adecuado que de como resultado una proteína que tenga actividad reducida de proteasa. Por ejemplo, uno o más de E27, 043, 083, 085, 097, S99, H101 E111, E136, E193, 0206, 0208,0210, H212, G216, K217, R218 YE250 se pueden mutar en alanina. Los ejemplos de mútaciones adecuadas son E27A, 043A, 083A, 085A, .D97A, S99A, H101A E111A, E136A, E193A, 0206A, 0208A, 0210A, H212A, H212N, H212Q, G216K, K217G, K217T, R218L y E250A En una realización, el gen OmpT mutado comprende las mutadones 0210A y H212A. Una secuencia de OmpT mutada que comprende las mutaciones 0210A y H212A se muestra en la SEQ ID NO: 23.

La expresión "gen OmpT mutado inactivado" en el contexto de la presente invendón significa que el gen comprende una o más mutaciones haciendo así que no haya expresión de la proteína codificada por el gen para proporcionar una célula deficiente en la proteína codificada por el gen mutado inactivado. El gen inactivado puede ser pardal o completamente transcrito pero no traduddo en la proteína codificada. El gen OmpT mutado inactivado se puede mutar de cualquier forma adecuada, por ejemplo, por una o más mutadones por eliminación, inserdón, puntuales, de aminoáddo, terminadora y de cambio del marco de lectura, para hacer que no haya expresión de la proteína. Por ejemplo, el gen se puede inactivar por inserción de una secuencia de AON extraña, tal como un marcador de resistencia a antibiótico, en la secuenda que codifica el gen.

En una realización el gen OmpT comprende una mutación en el codón de inicio del gen y/o uno o más codones de parada situados en la dirección 3' del codón de inicio del gen y en la dirección 5' del codón de parada del gen, de modo que se previene la expresión de la proteína OmpT. La mutación en el codón de inicio puede ser una mutación de aminoácido de 1, 2 o los tres nucleótidos del codón de inido. Se muestra una secuenda de OmpT inactivado mutado adecuada se muestra en la SEQ ID NO: 24. Alternativa o adidonalmente, el codón de inicio se puede mutar por una mutación de cambio del marco de lectura por inserción o eliminación.

En una realización, la célula bacteriana Gram negativa de acuerdo con la presente invendón no lleva un gen OmpT mutado inactivado, tal como siendo deficiente en OmpT cromosómico.

En una realización, la célula bacteriana Gram negativa de acuerdo con la presente invendón no lleva un gen degP mutado inactivado, tal como siendo deficiente en degP cromosómico. En una realización, la célula bacteriana Gram negativa de acuerdo con la presente invendón no lleva un gen degP mutado.

En una realización, la célula bacteriana Gram negativa de acuerdo con la presente invención no lleva un gen ptr mutado inactivado, tal como siendo defidente en ptr cromosómico.

Muchas mutaciones genéticamente diseñadas que incluyen mutadones de inactivación implican el uso de marcadores de resistenda a antibióticos que permiten la selección e identificación de células mutadas satisfactoriamente. Sin embargo, como se ha discutido antes, hay una serie de desventajas en el uso de marcadores de resistenda a antibióticos.

Una realización adidonal de la presente invendón supera las desventajas anteriores del uso de marcadores de resistenda a antibióticos, en donde el gen Tsp mutado, el gen spr mutado y opdonalmente el gen OegP mutado y/o un gen ptr mutado y/o un gen OmpT mutado, se mutan para comprender uno o más sitios de restricción marcadores. Los sitios de restricción se diseñan genéticamente en el gen y no son de tipo natural. Los sitios de restricción marcadores son ventajosos porque permiten el cribado y la identificación de células modificadas correctamente, que comprenden las mutaciones cromosómicas requeridas. Las células que se han modificado para llevar uno o más genes de proteasa mutados se pueden analizar por PCR del AON genómico de lisatos celulares, usando parejas de oligonucleótidos diseñados para amplificar una región del ADN genómico que comprende un sitio de restricción marcador que no se encuentra de forma natural. Después, el ADN am plificado se puede analizar por electroforesis en gel de agarosa antes y después de incubación con una enzima de restricción adecuada capaz de digerir el AON en el sitio de restricción marcador que no se encuentra de forma natural. La presencia de fragmentos de AON después de incubación con la enzima de restricción confirma que las células se han modificado satisfactoriamente para llevar uno o más genes mutados.

En la realización en donde la célula lleva un gen ptr mutado inactivado que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6, las secuencias de cebadores oligonucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, se pueden usar para amplificar la región del ADN que comprende el sitio de restricción Ase I que no se encuentra de forma natural, del AON genómico de las células transformadas. El AON genómico amplificado después se puede incubar con la . enzima de restricción Ase I y después analizar por electroforesis en gel para confirmar la presencia del gen ptr mutado en el AON genómico.

En la realización en donde la célula comprende un gen Tsp mutado inactivado que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 o los nucleótidos 7 a 2048 de la SEQ ID NO: 3, las secuencias de cebadores oligonucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, se pueden usar para amplificar la región del ADN que comprende el sitio de restricción Ase I que no se encuentra de forma natural, del ADN genómico de las células transformadas. El ADN genómico amplificado después se puede incubar con la enzima de restricción Ase I y después analizar por electroforesis en gel para confirmar la presencia del gen Tsp mutado en el AON genómico.

En la realización en donde la célula comprende un gen OegP mutado que tiene la secuencia de AON de la SEQ ID NO: 9, las secuencias de cebadores oligonucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, se pueden usar para amplificar la región del AON que comprende el sitio de restricción Ase I que no se encuentra de forma natural, del ADN genómico de las células transformadas. El ADN genómico amplificado después se puede incubar con la enzima de restricción Ase I y después analizar por electroforesis en gel para confirmar la presencia del gen OegP mutado en el AON genómico.

El uno o más sitios de restricción se pueden introducir mediante cualquier mutación adecuada incluyendo una o más mutaciones por eliminación, inserción, puntuales, de aminoácido, terminadora y de cambio del marco de lectura. Un sitio de restricción se puede introducir mediante la mutación del codón de inicio y/o mutación para introducir uno o más codones de parada, como se ha descrito antes. Esta realización es ventajosa porque el sitio de restricción marcador es un marcador directo y único de las mutaciones de inactivación introducidas.

Se puede introducir un sitio de restricción marcador que comprende un codón de parada dentro del marco de lectura, tal como un sitio de restricción Ase /. Esto es particularmente ventajoso porque el sitio de restricción insertado sirve tanto como un sitio de restricción marcador como un codón de parada para prevenir la transcripción completa de la secuencia codificante del gen. Por ejemplo, en la realización en donde se introduce un codón de parada en el gen ptr por introducción de un sitio Ase /, esto también Crea un sitio de restricción, como se muestra en la figura 11a. Por ejemplo, en la realización en donde se introduce un codón de parada en el gen Tsp en el codón 21 por introducción de un sitio Ase /, esto también crea un sitio de restricción, como se muestra en la figura 11 b.

Un sitio de restricción marcador se puede insertar por la mutación en el codón de inicio y opCionalmente una o más mutaciones puntuales adicionales. En esta realización el sitio de restricción marcador preferiblemente es un sitio de restricción de EcoR /. Esto es particularmente ventajoso porque la mutación en el codón de inicio también crea un sitio de restricción marcador. Por ejemplo, en la realización en donde el codón de inicio del gen ptr se cambia por An, esto crea un sitio marcador EcoR /, como se muestra en la figura 11 a. Por ejemplo, en la realización en donde el codón de inicio (codón 3) del gen Tsp se cambia de ATG en TCG, como se muestra en la figura 1 b, una mutación puntual adicional del codón 2 de AAC a AAT y la mutación del codón 3 ATG en TCG crea un sitio de restricción marcador de EcoR /, como se muestra en la figura 11 b.

En la realización de la presente invención en donde la célula lleva un gen OmpT mutado, el uno o más sitios de restricción se pueden introducir por cualquier mutación adecuada incluyendo una o más mutaciones por eliminación, inserción, puntuales, de aminoácido, terminadora y de cambio del marco de lectura. Por ejemplo, en la realización en donde el gen OmpT comprende las mutaciones 0210A y H212A. estas mutaciones introducen un sitio de restricción de Hindlll silencioso que se puede usar como un marcador de selección.

En el gen DegP o el gen spr, se puede introducir un sitio de restricción marcador usando cambios de codones silenciosos. Por ejemplo, un sitio Ase / se puede usar como un sitio de restricción marcador silencioso, en donde el codón de parada T AA está fuera del marco de lectura, como se muestra en la figura 11 c para el gen OegP mutado.

En las realizaciones de la presente invención, en donde el gen ptr y/o el gen Tsp se mutan para codificar una proteasa 111 o Tsp que tienen actividad reducida de proteasa, se pueden introducir uno o más sitios de restricción marcadores usando cambios de codones silenciosos.

La célula bacteriana Gram negativa recombinante de acuerdo con la presente invención se puede producir por cualquier medio adecuado. El experto en la técnica conoce técnicas que se pueden usar para sustituir una secuencia de gen del cromosoma por una secuencia del gen mutada. Se pueden usar vectores adecuados que permiten la integración en el cromosoma del hospedante por recombinación homóloga.

Los métodos de sustitución de genes adecuados se describen, por ejemplo, en Hamilton et al. ("New Method for Generating Deletions and Gene Replacements in Escherichia coli", Hamilton C. M. et al., Joumal of Bacteriology Sept. 1989, Vol. 171, No. 9 P 4617-4622), Skorupski et al. ("Positive selection vectors for allelic exchange", Skorupski K and Taylor R. K., Gene, 1996, 169, 47-52), Kiel et al. ("A general method for the construction of Escherichia coli mutants by homologous recombination and plasmid segregation", Kiel J.A.K.W. et al, Mol Gen Genet 1987, 207:294301), Blomfield et al. ("Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature sensitive pSC101 replicon", Blomfield 1. C. et al., Molecular Microbiology 1991, 5(6), 1447-1457) Y Ried et al. ("An nptl-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in Gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis", Ried J. L. Y Collmer A, Gene 57 (1987) 239-246). Un plásmido adecuado que permite la recombinación homóloga/sustitución es el plásmido pK03 (Link et al., 1997, Joumal of Bacteriology, 179, 6228-6237).

Las cepas mutadas satisfactoriamente se pueden identificar usando métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo secuenciación de ADN por PCR de colonia y cartografía de enzimas de restricción por PCR de colonia.

En la realización en donde la célula comprende dos o más genes cromosómicos mutados, los genes mutados se pueden introducir en la bacteria Gram negativa en el mismo o diferentes vectores.

En una realización la célula bacteriana Gram negativa de acuerdo con la presente invención no lleva un gen Omp T mutado inactivado, tal como siendo deficiente en OmpT cromosómico.

La célula de acuerdo con la presente invención puede comprender además una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína de interés. La secuencia de polinucleótido que codifica la proteína de interés puede ser exógena o endógena. La secuencia de polinucleótido que codifica la proteína de interés puede estar integrada en el cromosoma del hospedante o puede estar en un vector no integrada, típicamente un plásmido.

En una realización, la célula de acuerdo con la presente invención expresa una proteína de interés. "Proteína de interés' en el contexto de la presente memoria descriptiva se pretende que se refiera al polipéptido para la expresión, normalmente un polipéptido recombinante. Sin embargo, la proteína de interés puede ser una proteína endógena expresada a partir de un gen endógeno en la célula hospedante.

Como se usa en la presente memoria, un "polipéptido recombinante" se refiere a una proteína que se construye o produce usando tecnología de ADN recombinante. La proteína de interés puede ser una secuencia exógena idéntica a una proteína endógena o una versión mutada de la misma, por ejemplo, con actividad biológica atenuada, o un fragmento de la misma, expresada a partir de un vector exógeno. Alternativamente, la proteína de interés puede ser cualquier proteína adecuada incluyendo una proteína terapéutica, profiláctica o de diagnóstico.

En una realización, la proteína de interés es útil en el tratamiento de enfermedades o trastornos incluyendo enfermedades y trastornos inflamatorios, enfermedades y trastornos inmunitarios, trastornos fibróticos y cáncere.

La expresión "enfermedad inflamatoria" o "trastorno" y "enfermedad o trastorno inmunitario" incluye artritis reumatoide, artritis psoriásica, enfermedad de Still, enfermedad de Muckle-Wells, psoriasis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, LES (lupus eritematoso sistémico), asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, esclerosis múltiple, vasculitis, diabetes mellitus tipo 1, trasplante y enfermedad de injerto contra huésped.

La expresión "trastorno fibrótico" incluye fibrosis pulmonar idiopática (IPF), esclerosis sistémica (o esclerodermia), fibrosis renal, nefropatía diabética, nefropatía por IgA, hipertensión, enfermedad renal en fase terminal, fibrosis peritoneal (diálisis peritoneal ambulatoria continua), cirrosis hepática, degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), retinopatía, fibrosis cardiaca reactiva, cicatrices, queloides, quemaduras, úlceras de la piel, angioplastia, cirugía de derivación coronaria, artroplastia y cirugía de cataratas.

El término "cáncer" incluye un nuevo crecimiento maligno que surge de epitelio, encontrado en la piel o, más comúnmente, el revestimiento de órganos del cuerpo, por ejemplo: mama, ovario, próstata, pulmón, riMn, páncreas, estómago, vejiga o intestino. Los cánceres tienden a infiltrarse en los tejidos adyacentes y a diseminarse (metastatizar) a órganos distantes, por ejemplo: a los huesos, hígado, pulmones o el cerebro.

La proteína puede ser un polipéptido sensible a proteolisis, es decir, proteínas que tienen tendencia a escindirse, susceptibles de escisión, o escindidas por una o más proteasas de bacterias Gram negativas, tal como E. cOli, en estado natural o durante la secreción. En una realización, la proteína de interés es sensible a la proteolisis por una proteasa seleccionada de DegP, proteasa 111 y Tsp. En una realización, la proteína de interés es sensible a la proteolisis por la proteasa Tsp. En una realización, la proteína de interés es sensible a la proteo lisis por las proteasas DegP y proteasa 111. En una realización, la proteína de interés es sensible a la proteolisis por las proteasas DegP y Tsp. En una realización, la proteína de interés es sensible a la proteolisis por las proteasas Tsp y proteasa

111. En una realización, la proteína de interés es sensible a la proteolisis por las proteasas OegP, proteasa 111 y Tsp.

Preferiblemente, la proteína es un polipéptido eucariota.

La proteína de interés expresada por las células de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo, un inmunógeno, una proteína de fusión que comprende dos proteínas heterólogas o un anticuerpo. Los anticuerpos para usar como la proteína de interés incluyen anticuerpos monoclonales, multivalentes, multiespecíficos, humanizados, completamente humanos o quiméricos. El anticuerpo puede ser de cualquier especie, pero preferiblemente procede de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano o un fragmento humanizado. El anticuerpo puede proceder de cualquier clase (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgO o IgA) o subclase de molécula de inmunoglobulina y se puede obtener de cualquier especie incluyendo, por ejemplo, ratón, rata, tiburón, conejo, cerdo, hámster, camello, llama, cabra o ser humano. Partes del fragmento de anticuerpo se pueden obtener de más de una especie, por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser quiméricos. En un ejemplo, las regiones constantes son de una especie y las regiones variables de otra.

El anticuerpo puede ser una molécula de anticuerpo completa que tiene las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o un fragmento de la misma, p. ej., VH, VL, VHH, Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2, Fv, fragmento scFv, Fab-Fv, o anticuerpo de especificidad doble, tal como Fab-dAb, como se describe en el documento PCT/GB2008/003331.

El anticuerpo puede ser específico para cualquier antrgeno diana. El antrgeno puede ser una proteína asociada a la célula, por ejemplo, una proteína de superficie celular en células tales como células bacterianas, células de levaduras, linfocitos T, células endoteliales o células tumorales, o puede ser una proteína soluble. Los antígenos de interés también pueden ser cualquier proteína relevante en medicina, tal como las proteínas que son reguladas por aumento durante la enfermedad o infección, por ejemplo, receptores y/o sus correspondientes ligandos. Los ejemplos particulares de proteínas de superficie celular incluyen las moléculas de adhesión, por ejemplo, integrinas tales como integrinas r..1, p. ej., VLA-4, E-selectina, P-selectina o L-selectina, C02, C03, C04, C05, C07, C08, C011a, C011b, C018, C019, C020, C023, C025, C033, C038, C040, C040L, CD45, COW52, C069, C0134 (OX40), ICOS, BCMP7, C0137, C027L, COCP1, CSF1 o CSF1-Receptor, OPCR1, OPCR1, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, similar a nectina 2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, OTO, antígeno carcinoembrionario (CEA), globulina de la grasa de la leche humana (HMFG1 and 2), antígenos de MHC de clase I y MHC de clase 11, KOR y VEGF, y donde sea adecuado, receptores de los mismos.

Los antígenos solubles incluyen interleuquinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL16 o IL-17, tal como 1L17A y/o IL 17F, antígenos víricos, por ejemplo antrgenos del virus sincitial respiratorio o de citomegalovirus, inmunoglobulinas, tal como IgE, interferones tales como interferón a, interferón ~ o interferón y, factor de necrosis tumoral TNF (anteriormente conocido como factor de necrosis tumoral-a), factor de necrosis tumoral-~, factores estimuladores de colonias tales como G-CSF o GMCSF, y factores de crecimiento derivados de plaquetas tales como POGF-a y POGF-~, y donde sea adecuado receptores de los mismos. Otros antrgenos incluyen antígenos de superficie celular bacteriana, toxinas bacterianas, virus tales como influenza, EBV, HepA, B y C, agentes de bioterrorismo, radionúclidos y metales pesados, veneno de serpiente y araña y toxinas.

En una realización, el anticuerpo se puede usar para alterar funcionalmente la actividad del antígeno de interés. Por ejemplo, el anticuerpo puede neutralizar, antagonizar o hacer de agonista de la actividad de dicho antígeno, directa o indirectamente.

La presente invención también proporciona una célula bacteriana Gram negativa recombinante que comprende un gen Tsp mutado, en donde el gen Tsp mutado codifica una proteína Tsp que tiene actividad reducida de proteasa o es un gen Tsp mutado inactivado, un gen spr mutante que codifica una spr mutante y una secuencia de polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión al antfgeno del mismo específico para el TNF.

En una realización preferida, la proteína de interés expresada por las células de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo anti-TNF, más preferiblemente un Fab' anti-TNF, como se describe en el documento W001/094585 (cuyo contenido se incorpora en la presente memoria por referencia).

En una realización, el anticuerpo que tiene especificidad por el TNFa humano, comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende una COR que tiene una secuencia mostrada en la SEO ID NO: 26 para CORH1, la secuencia mostrada en la SEO ID NO: 27 o SEO ID NO:32 para CORH2 o la secuencia mostrada en la SEO ID NO: 28 para CORH3.

En una realización, el anticuerpo comprende una cadena ligera en donde el dominio variable comprende una COR que tiene la secuencia mostrada en la SEO ID NO: 29 para CORL 1, la secuencia mostrada en la SEO ID NO: 30 para CORL2 o la secuencia mostrada en la SEO ID NO:31 para CORL3.

Las COR dadas en las SEO ID NO: 26 y 28 a 32 a las que se ha hecho referencia antes, proceden de un anticuerpo monoclonal de ratón hTNF40. Sin embargo, la SEO ID NO: 27 consiste en una COR híbrida. La COR híbrida comprende parte de la COR2 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de ratón hTNF40 (SEO ID NO: 32) y

parte de la COR2 de la cadena pesada de una secuencia de la región V de la línea germinal del grupo 3 humano.

En una realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada en donde el dominio variable comprende una COR que tiene la secuencia mostrada en la SEO ID NO: 26 para CORH1, la secuencia mostrada en la SEO ID NO: 27 o SEO ID NO: 32 para CORH2 o la secuencia mostrada en la SEO ID NO: 28 para CORH3 y una cadena ligera en donde el dominio variable comprende una COR que tiene la secuencia mostrada en la SEO ID NO: 29 para CORL 1, la secuencia mostrada en la SEO ID NO:30 para CORL2 o la secuencia mostrada en la SEO ID NO:31 para CORL3.

En una realización, el anticuerpo comprende la SEO ID NO: 26 para CORH1, SEO ID NO: 27 o SEO ID NO: 32 para CORH2, SEO ID NO: 28 para CORH3, SEO ID NO: 29 para COR1, SEO ID NO: 30 para CORL2 and SEO ID NO: 31 para CORL3. Preferiblemente, el anticuerpo comprende la SEO ID NO: 27 para CORH2.

El anticuerpo anti-TNF preferiblemente es una molécula de anticuerpo con COR injertada. En una realización preferida, el dominio variable comprende las regiones armazón aceptoras humanas y COR donadoras no humanas.

Preferiblemente, la molécula de anticuerpo tiene especificidad por el TNF humano (anteriormente conocido como TNFa), en donde la cadena ligera comprende la región variable de la cadena ligera de SEO ID NO: 11 y la cadena pesada comprende la región variable de la cadena pesad de SEO ID NO: 12.

El anticuerpo anti-TNF preferiblemente es un fragmento Fab o Fab'.

Preferiblemente, la molécula de anticuerpo que tiene especificidad por el TNF humano es un Fab', y tiene una secuencia de la cadena ligera que comprende la o consiste en la SEO ID NO: 13 y una secuencia de la cadena pesada que comprende o consiste en la SEO ID NO: 14.

Después de la expresión, los fragmentos de anticuerpo pueden ser procesados más, por ejemplo, por conjugación con otra entidad tal como una molécula efectora.

La expresión molécula efectora como se usa en la presente memoria incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas (tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano o vegetal y fragmentos de las mismas, p. ej., ricina y fragmentos de la misma), proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, poHmeros sintéticos o naturales, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, p. ej., AON, ARN y fragmentos de los mismos, radionúclidos, en particular radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que se pueden detecta(por espectroscopía de RMN o ESR. El efector molecular se puede unir al anticuerpo o fragmento del mismo por cualquier método adecuado, por ejem plo, un fragmento de anticuerpo se puede modificar para unir al menos una molécula efectora, como se describe en los documentos W005/003171 o W005/003170 (cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria por referencia). Los documentos W005/003171 o W005/003170 también describen moléculas efectoras adecuadas.

En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo, tal como Fab, es PEGilado para generar un producto con las propiedades requeridas, por ejemplo similar a los anticuerpos enteros, si se requiere. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un Fab' anti-TNFa PEGilado, como se describe en el documento W001/094585, preferiblemente teniendo unido a uno de los restos de cisteína en el extremo C-terminal de la cadena pesada un grupo derivado de lisilmaleimida, en donde cada uno de los dos grupos amino del resto lisilo tiene unido covalentemente al mismo un resto metoxipolietilenglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da, de modo que el peso molecular medio total de los restos de metoxipolietilenglicol es aproximadamente 40.000 Da, más preferiblemente el grupo derivado de lisil-maleimida es el [1-[[[2-[[3-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)-1-oxopropil]amino]etil]amino]-carbonil]-1,5pentanodiil]bis(iminocarbonilo).

La célula también puede comprender secuencias de polinucleótidos adicionales que codifican una o más proteínas de interés adicionales.

En una realización, una o más proteínas del hospedante E. coli que en el tipo natural se sabe que copurifican con la proteína recombinante de interés durante la purificación, se seleccionan para la modificación genética, como describen Humphreys et al. "Engineering of Escherichia coli to improve the purification of periplasmic Fab' fragments: changing the pi of the chromosomally encoded PhoS/PstS protein", Protein Expression and Purificafion 37 (2004) 109-118 Yel documento W004/035792 (cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria por referencia). El uso de dichas proteínas de hospedante modificadas mejora el procedimiento de purificación de las proteínas de interés, en especial anticuerpos, producidas en E. coli alterando las propiedades físicas de las proteínas de E. co/i seleccionadas, de modo que ya no copurifiquen con el anticuerpo recombinante. Preferiblemente, la proteína de E. coli que se altera se selecciona de una o más de la proteína de unión a fosfato (PhoS/PstS), proteína de unión a dipéptido (OppA), proteína de unión a maltosa (MBP) y tiorredoxina.

En una realización, se altera una propiedad física de una proteína del hospedante contaminante por la adición de un marcador aminoácido en el extremo C o extremo N. En una realización preferida, la propiedad física que se altera es el punto isoeléctrico y el marcador aminoácido es un marcador poli (ácido aspártico) unido al extremo C. En una realización, las proteínas de E. coli alteradas por la adición de dicho marcador son la proteína de unión a dipéptido (OppA), proteína de unión a maltosa (MBP), tiorredoxina y proteína de unión a fosfato (PhoS/PstS). En una realización específica, el pi de la proteína de unión a fosfato (PhoS/PstS) de E. coli se reduce de 7,2 a 5,1 por adición de un marcador poli(ácido aspártico) (poliO), que contiene 6 restos ácido aspártico en el extremo C.

También se prefiere la modificación de restos específicos de la proteína contaminante de E. coli, para alterar sus propiedades físicas, sea sola o en combinación con la adición de marcadores N o e terminales. Dichos cambios pueden incluir inserciones o eliminaciones para alterar el tamaño de la proteína o sustituciones de aminoácidos para alterar el pi o la hidrofobicidad. En una realización, estos restos están situados en la superficie de la proteína. En una realización preferida, se alteran los restos de la superficie de la proteína PhoS con el fin de reducir el pi de la proteína. Preferiblemente, se evitan los restos que se han implicado como importantes en la unión de fosfato (Bass, US5.304.472) con el fin de mantener una proteína PhoS funcional. Preferiblemente, los restos lisina que se proyectan hacia fuera de la superficie de la proteína o están en o cerca de grupos grandes de restos básicos son el objetivo. En una realización, la proteína PhoS tiene un marcador de poli-hexa-(ácido aspártico) unido al extremo C, mientras que los restos de la superficie en el lado opuesto de la molécula son objetivo para la sustitución. Preferiblemente, los restos lisina seleccionados se sustituyen por ácido glutámico o ácido aspártico para conferir un cambio de pi potencial mayor que cuando se cambian restos neutros por ácidos. La designación de un mutante por sustitución en la presente memoria, consiste en una letra seguida de un número seguido de una letra. La primera letra designa el aminoácido en la proteína de tipo natural. El número se refiere a la posición del aminoácido donde se está haciendo la sustitución de aminoácido, y la segunda letra designa el aminoácido que se usa para sustituir el aminoácido de tipo natural. En mutaciones preferidas de PhoS en la presente invención, los restos lisina (K) 275, 107, 109, 110, 262, 265, 266, 309, 313 se sustituyen por ácido glutámico (E) o glutamina (O), como mutaciones individuales o combinadas, además de que la lisina (K)318 se puede sustituir por ácido aspártico (O) como mutación individual o combinada. Preferiblemente, las mutaciones individuales son K262E, K265E Y K266E. Preferiblemente, las mutaciones combinadas son K265/266E y K110/265/266E. Más preferiblemente, todas las mutaciones se combinan con el marcador poli(ácido aspártico) (poliO) unido al extremo C y opcionalmente también con la sustitución K3180. En una realización preferida, las mutaciones producen una reducción del pi en al menos 2 unidades. Preferiblemente, las mutaciones de la presente invención reducen el pi de PhoS desde 7,2 a entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5,5. En una realización de la presente invención, el pi de la proteína PhoS de E. coli se reduce de 7,2 a aproximadamente 4,9, aproximadamente 4,8 y aproximadamente 4,5, usando las mutaciones poliO K3180, poliO K265/266E Y poliO K110/265/266E, respectivamente.

El polinudeótido que codifica la proteína de interés puede ser expresado como una fusión con otro polipéptido, preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N del polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada debería ser una que sea reconocida y procesada por la célula hospedante. Para células hospedantes procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal del polipéptido natural o uno eucariota, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota. Las secuencias señal adecuadas incluyen OmpA, PhoA, LamB, PeIB, OsbA y OsbC.

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes citados antes, usa técnicas de ligado convencionales. Los plásmidos o fragmentos de AON aislados son escindidos, diseñados y vueltos a ligar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

En una realización, se usa un casete de expresión en la presente invención para llevar el polinucleótido que codifica la proteína de interés, que típicamente comprende una o más secuencias codificantes de proteínas que codifican una o más proteínas de interés y una o más secuencias reguladoras de la expresión. La una o más secuencias reguladoras de la expresión pueden incluir un promotor. La una o más secuencias reguladoras de la expresión también pueden incluir un promotor. La una o más secuencias reguladoras de la expresión también pueden incluir una región 3' no traducida tal como una secuencia de terminación. Los promotores adecuados se describen con más detalle más adelante.

En una realización, la célula de acuerdo con la presente invención comprende un vector, tal como un plásmido. El vector preferiblemente comprende uno o más casetes de expresión como se han definido antes.

En la realización donde la proteína de interés es un anticuerpo que comprende tanto las cadenas pesadas como ligeras, la línea celular se puede transfectar con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de la cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de la cadena pesada.

El vector para usar en la presente invención se puede producir por inserción de un casete de expresión como se ha definido antes, en un vector adecuado. Alternativamente, las secuencias reguladoras de expresión para dirigir la expresión de la secuencia de polinudeótido que codifica una proteína de interés, pueden estar contenidas en el vector y por lo tanto puede ser necesaria solo la región codificante del polinudeótido para completar el vector.

Los ejemplos de vectores que se pueden usar para transformar la célula hospedante con un polinudeótido de acuerdo con la invención induyen:

-: un plásmido, tal como pBR322 o pACYC184, y/o

-: un vector vírico tal como fago bacteriano 21 -un elemento genético transponible tal como un transposón

Están disponibles muchas formas de vectores de expresión. Dichos vectores normalmente comprenden un origen de replicación de ADN plasmídico, un marcador seleccionable por antibiótico, un promotor y un terminador de la transcripción separado por un sitio de clonación múltiple (casete de expresión) y una secuencia de ADN que codifica un sitio de unión al ribosoma.

Los promotores usados en la presente invención se pueden unir al polinucleótido relevante directamente o alternativamente se pueden situar en una posición adecuada, por ejemplo, en un vector de modo que cuando el polipéptido relevante se inserta, el promotor relevante puede actuar en el mismo. En una realización, el promotor se coloca antes de la parte codificante del pOlinucleótido en el que actúa, por ejemplo, un promotor relevante antes de cada parte codificante del polinucleótido. "Antes" como se usa en la presente memoria se pretende que implique que el promotor se coloca en el extremo del cebador 5 con respecto a la parte de polinucleótido codificante.

Los promotores pueden ser endógenos o exógenos para las células hospedantes. Los promotores adecuados incluyen Lac, tac, trp, PhoA, Ipp, Arab, Tet y T7.

Uno o más promotores usados pueden ser promotores inducibles.

Las unidades de expresión para usar en sistemas bacterianos en general también contienen una secuencia de Shine-Dalgarno (S. D.) de ribosoma operativamente unida al ADN que codifica el polipéptido de interés.

En realizaciones de la presente invención en donde una 'secuencia de polinucle6tido comprende dos o más secuencias codificantes para dos o más proteínas de interés, por ejemplo una cadena ligera de anticuerpo y cadena pesada de anticuerpo, la secuencia de polinudeótido puede comprender una o más secuencias de sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), que permiten el inicio de la traducción en el medio de un ARNm. Una secuencia de IRES puede estar situada entre secuencias del polinucle6tido codificantes para potenciar la traducción separada del ARNm para producir las secuencias de polipéptido codificadas.

El vector de expresión preferiblemente también comprende un mensaje bicistrónico para producir el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, como se describe en los documentos WO 03/048208 o W02007/039714 (cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria por referencia). Preferiblemente, el cistrón en la dirección 5' contiene ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo y el cistrón en la dirección 3' contiene ADN que codifica la correspondiente cadena pesada, y la secuencia intergénica dicistrónica (IGS) preferiblemente comprende una secuencia seleccionada de IGS1 (SEO ID NO: 34), IGS2 (SEO ID NO: 35), IGS3 (SEO ID NO: 36) y IGS4 (SEO ID NO: 37).

Los terminadores pueden ser endógenos o exógenos para las células hospedantes. Un terminador adecuado es rrnB.

Se pueden encontrar reguladores transcripcionales adicionales adecuados que incluyen promotores y terminadores y métodos para dirigir proteínas en "Strategies for Achieving High-Level Expressiorí of Genes in Escherichia coli" Sawas C. Makrides, Microbiological Reviews, Sept 1996, pág. 512-538.

La molécula de anticuerpo puede ser secretadas de la célula o dirigida el periplasma mediante secuencias señal adecuadas. Alternativamente, las moléculas de anticuerpo se pueden acumular dentro del citoplasma de la célula. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo se dirige al periplasma.

Las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria con referencia al polinucleótido se aplican igualmente a realizaciones alternativas de la invención, por ejemplo, vectores, casetes de expresión y/o células hospedantes que comprenden los componentes usados en las mismas, siempre que el aspecto relevante se puede aplicar a las mismas.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir una proteína recombinante de interés que comprende expresar la proteína recombinante de interés en una célula bacteriana Gram negativa recombinante como se ha descrito antes en el primer y segundo aspectos de la presente invención.

La célula bacteriana Gram negativa y la proteína de interés usados preferiblemente en el método de la presente invención, se han descrito antes en detalle.

Cuando el polinucleótido que codifica la proteína de interés es exógeno, el polinucleótido se puede incorporar en la célula hospedante usando cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Típicamente, el polinucleótido se incorpora como parte de un vector de expresión que se transforma en la célula. Por consiguiente, en un aspecto, la célula de acuerdo con la presente invención comprende un casete de expresión que comprende el polinucle6tido que codifica la proteína de interés.

La secuencia de polinucleótido se puede transformar en una célula usando técnicas convencionales, por ejemplo usando cloruro de rubidio, PEG o electroporación.

El método de acuerdo con la presente invención también puede usar un sistema de selección para facilitar la selección de células estables que se han· transformado satisfactoriamente con el polinucleótido· que codifica la proteína de interés. El sistema de selección típicamente usa la contransformación de una secuencia de polinucleótido que codifica un marcador de selección. En una realización, cada polinucleótido transformado en la célula comprende además una secuencia de polinucleótido que codifica uno o más marcadores de selección. Por consiguiente, la transformación del polinucleótido que codifica la proteína de interés y el uno o más polinucleótidos que codifican el marcador se produce juntos y el sistema de selección se puede usar para seleccionar aquellas células que producen las proteínas deseadas.

Las células que pueden expresar uno o más marcadores pueden sobrevivir/crecer/multiplicarse en determinadas condiciones impuestas artificialmente, por ejemplo, la adición de una toxina o antibiótico, debido a las propiedades de las que están dotados el polipéptido/gen o componente del polipéptido del sistema de selección incorporado en las mismas (p. ej., resistencia a antibiótico). Las células que no pueden expresar el uno o más marcadores no pueden sObrevivir/crecer/multiplicarse en las condiciones impuestas artificialmente. Las condiciones impuestas artificialmente se pueden elegir para que sean más o menos fuertes, según sea necesario.

Se puede usar cualquier sistema de selección adecuado en la presente invención. Típicamente, el sistema de selección se puede basar en incluir en el vector uno o más genes que proporcionan resistencia a un antibiótico conocido, por ejemplo, un gen de resistencia a tetraciclina, cloranfenicol, kanamicina o ampicilina. Las células que crecen en presencia de un antibiótico relevante se pueden seleccionar puesto que expresan tanto el gen que da resistencia al antibiótico como la proteína deseada.

En una realización, el método de acuerdo con la invención comprende además la etapa de cultivar la célula transformada en un medio para de esta forma expresar la proteína de interés.

Se puede usar un sistema de expresión inducible o un promotor constitutivo en la presente invención para expresar la proteína de interés. Los sistemas de expresión inducibles y promotores constitutivos adecuados son bien conocidos en la técnica.

Se puede usar cualquier medio adecuado para cultivar la célula transformada. El medio puede estar adaptado para un sistema de selección específico, por ejemplo, el medio puede comprender un antibiótico, para permitir que crezcan en el medio solo las células que se han transformado satisfactoriamente.

Las células obtenidas del medio se pueden someter a cribado y/o purificación adicionales según se requiera. El método puede comprender además una o más etapas para extraer y purificar la proteína de interés, según se requiera.

El polipéptido se puede recuperar de la cepa, incluyendo el citoplasma, periplasma o líquido sobrenadante.

El o los métodos específicos usados para purificar una proteína dependen del tipo de proteína. Los métodos adecuados incluyen el fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía de interacción hidrófoba; cromatografía en sílice; cromatograffa en una resina de intercambio iónico tal como S-SEPHAROSE y DEAE; cromatoenfoque; precipitación con sulfato amónico; y filtración en gel.

Los anticuerpos se pueden separar de forma adecuada del medio de cultivo y/o extraer del citoplasma y/o extraer del periplasma por procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía con proteína G, cromatograffa con proteína L, resinas tiofílicas, de modo mixto, marcador His, marcador FLAG, cromatograffa de hidroxiapatito, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía de afinidad, sulfato amóniGQ, etanol o fraccionamiento/precipitación con PEG, membranas de intercambio ¡6nico, cromatografía de adsorción en lecho expandido (ESA) o cromatografía en lecho móvil simulado.

El método puede incluir también una etapa adicional de medición de la cantidad de expresión de la proteína de interés y selección de las células que tienen niveles de expresión altos de la proteína de interés.

El método puede incluir también una o más etapas de procesamiento corriente abajo, tales como PEGilación de la proteína de interés, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

Se pueden llevar a cabo una o más etapas del método descrito en la presente memoria en combinación en un recipiente adecuado tal como un biorreactor.

Ejemplos

Ejemplo 1 -Generación de cepa de células MXE001 (~Tsp)

La cepa MXE001 se generó como sigue:

El casete de Tsp se movió como fragmentos de restricción de Sal I y Not I a plásmidos pK03 de restricción similar. El plásmido pK03 usa el mutante sensible a la temperatura del origen de replicación pSC101 (RepA) junto con un marcador de cloranfenicol para forzar y seleccionar los sucesos de integración cromosómica. El gen sacB que codifica levansacarosa es letal para el crecimiento de E. coli en sacarosa y por lo tanto Gunto con el marcador de cloranfenicol y el origen pSC101) se usa para forzar y seleccionar sucesos de desintegración y curado de plásmidos. Esta metodología ha sido descrita previamente (Hamilton et al., 1989, Joumal o, Bacteriology, 171, 4617-4622 Y Blomfield et al., 1991, Molecular Microbiology, 5, 1447-1457). El sistema pK03 elimina todos los marcadores selectivos del genoma del hospedante excepto para el gen insertado.

Se construyeron los siguientes plásmidos.

pMXE191 que comprende el gen Tsp mutado inactivado como se muestra en la SEO ID NO: 3 que comprende los marcadores de restricción EcoR I y Ase l.

Después, el plásmido se transformó en células E. coli W3110 competentes electrocompetentes preparadas usando el método encontrado en Miller, E.M. y Nickoloff, J.A., "Escherichia coli electrotransformation," en Mefhods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995).

Día 1, se mezclaron 40 ¡JI de células E. coli con (10 pg) 1 ¡JI de AON de pK03 en una cubeta de electroporación BioRad de 0,2 cm enfriada, a 2500 V, 25¡JF Y200 O. Se añadieron inmediatamente 1000 ¡JI de 2xPY, las células se recuperaron por agitación a 250 rpm en un incubador a 30°C durante 1 h. Se hicieron diluciones seriadas 1/10 de las células en 2xPY antes de sembrar partes alícuotas de 100 ¡JI en placas de agar 2xPY que contenían cloranfenicol 20 ¡Jg/ml previamente calentadas a 30°C y 43°C. Las placas se incubaron durante la noche a 30°C y 43°C.

Día 2, el número de colonias desarrolladas a 30°C daba un cálculo de la eficacia de la electroporación, mientras que las colonias que sobrevivieron al crecimiento a 43°C representan potenciales sucesos de integración. Las colonias individuales de la placa a 43°C se recogieron y se volvieron a suspender en 10 mi de 2xPY. Se sembraron 100 ¡JI de estos en placas de agar 2xPY que contenían sacarosa al 5% (p/v) precalentadas a 30°C para generar colonias individuales. Las placas se incubaron durante la noche a 30°C.

Día 3, las colonias aquí representan los potenciales sucesos de desintegración y curado plasmídico simultáneos. Si los sucesos de desintegración y curado se producían pronto en el crecimiento, entonces el conjunto de la masa de colonias será clónica. Se recogieron colonias individuales y las copias se sembraron en agar 2xPY que contenía cloranfenicol 20 ¡Jg/ml o sacarosa al 5% (plv). Las placas se incubaron durante la noche a 30°C.

Día 4, las colonias que crecían en sacarosa y morían en cloranfenicol representan los sucesos potenciales de sustitución cromosómica y de curado plasmídico. Estas se recogieron y se cribaron por PCR con un oligonucleótido específico de la mutación. Las colonias que generaron una banda de PCR positiva del tamaño correcto se sacaron para producir colonias individuales en agar 2xPY que contenía sacarosa al 5% (plv) Y las placas se incubaron durante la noche a 30°C.

Día 5, las colonias individuales de E. coli positivas por PCR, sensibles a cloranfenicol y resistentes a sacarosa, se usaron para hacer células químicamente competentes, preparaciones en glicerol, y actúan como moldes en la PCR para una reacción de PCR con oligonucleótidos flanqueadores 5' y 3' para generar el producto de la PCR para la secuenciación directa de AON usando la pollmerasa Taq.

La cepa celular MXE001 se ensayó para confirmar la modificación satisfactoria del AON genómico que lleva el gen Tsp mutado por amplificación por PCR de la región del gen Tsp que comprende un sitio de restricción Ase I no natural, como se muestra en las figuras 1a, 1b y 1c, usando cebadores oligonucleótidos. Las regiones amplificadas del AON después se analizaron por electroforesis en gel antes y después de incubación con la enzima de restricción Ase I para confirmar la presencia del sitio de restricción Ase I no natural en los genes mutados. Este método se lleva a cabo como sigue:

Se usaron los siguientes oligonucleótidos para amplificar, usando la PCR, el AON genómico de preparados de lisados celulares de E. coli de MXE001 y W311 o:

6284 Tsp 3' 5'-GCATCATMTTTTCTTTTTACCTC-3' (SEO ID NO: 15)

6283 Tsp 5' 5'-GGGAAATGMCCTGAGCMAACGC-3' (SEO ID NO: 16)

Los lisados se prepararon calentando una colonia individual de células durante 10 min a 95°C en 20 ¡JI de 1x tampón de PCR. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y después se centrifugó a 13.200 rpm durante 10 mino El líquido sobrenadante se separó y se marcó como "Iisato celular".

Cada cepa se amplificó usando la pareja de oligonucleótidos de Tsp.

El AON se amplificó usando un procedimiento de PCR convencional.

5 ¡JI tampón x 10 (Roche)

1 ¡JI mezcla de dNTP (Roche, mezcla 10 mM)

1,5¡J1 oligonudeótido 5' (5 pmol) 1,5 ¡JI oligonudeótido 3' (5 pmol) 2 ¡JI lisato celular 0,5 ¡JI ADN polimerasa Taq (Roche 5 U/¡JI)

5 38,5 ¡JI HO Ciclo de PCR

94°C 1 minuto 94°C 1 minuto) 55 1 minuto) repetido durante 30 ciclos

10 72 1 minuto) 72 10 minutos Una vez completadas las reacciones, se separaron 25 ¡JI a un nuevo tubo de microfuga para la digestión con Ase 1. A

los 25 ¡JI de reacción de PCR se anadieron 19 ¡JI de H20, 5 ¡JI de tampón 3 (NEB), 1 ¡JI de Ase I (NEB), se mezdaron y se incubaron a 37°C durante 2 horas.

15 Al resto de la reacción de PCR se añadieron 5 ¡JI de tampón de carga (x6) y se cargaron 200 ¡JI en un gel de agarosa de 200 mi de TAE al 0,8% (lnvitrogen) más bromuro de etidio (5 ¡JI de disolución madre de 10 mg/ml) y se ejecutó a 100 voltios durante 1 hora. Se cargaron en la banda final 10 ¡JI de marcador de tamaño (marcador Perfect DNA 0,112 kB, Novagen).

Una vez completadas las digestiones con Ase 1, se añadieron 10 ¡JI de tampón de carga (x6) y se cargaron 200 ¡JI en

20 un gel de agarosa con TAE al 0,8% (lnvitrogen) más bromuro de etidio (5 ¡JI de disolución madre de 10 mg/ml) y se ejecutó a 100 voltios durante 1 hora. Se cargaron en la banda final 10 ¡JI de marcador de tamaño (marcador Perfect DNA 0,1-12 kB, Novagen). Ambos geles se visualizaron usando un transluminador de UV.

El fragmento genómico amplificado mostró la banda de tamaño correcto de 2,8 kb para la Tsp. Después de digestión con Ase 1, esto confirmó la presencia de los sitios Ase I introducidos en la cepa deficiente en Tsp MXE001 pero no 25 en la de control W311 o. MXE001: el ADN genómico se amplificó usando el conjunto de cebadores de Tsp y el ADN resultante se digirió con Ase I para producir bandas de 2,2 y 0,6 Kpb.

El ADN amplificado por PCR de W311 Ono era digerido por la enzima de restricción Ase 1.

Ejemplo 2 -Generación de mutantes de spr

Las mutaciones de spr se generaron y seleccionaron usando un ensayo de complementación.

30 El gen spr se mutó usando el kit de PCR de diversidad de mutagénesis aleatoria de Clontech®, que introdujo de 1 a 2 mutaciones por 1000 pb. El ADN de la PCR de spr mutado se donó en un vector de expresión inducible [pTTO CDP870] que expresa Fab' CDP870 junto con el mutante de spr. Después este ligado se electrotransformó en una cepa de E.co/i MXE001 (1::. Tsp) preparada usando el método encontrado en Miller, E.M. y Nickoloff, J.A., "Escherichia coli electrotransformation," en Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa,

35 NJ, 105 (1995). Se usó el siguiente protocolo, se añadieron 40 ¡JI de MXE001 electrocompetente, 2,5 ¡JI del ligado (100 pg de ADN) a una cubeta de electroporación de 0,2 cm, se llevó a cabo la electrotransformación usando un BioRad Genepulser Xcell con las siguientes condiciones, 2500 V, 25 ¡JF Y 200 Q. Después de la electrotransformación se añadió 1 mi de SOC (Invitrogen) (precalentado a 3rC) y las células se dejaron recuperar a 37°C durante 1 h con agitación suave.

40 Las células se sembraron en agar Hypotonic (extracto de levadura 5 g/l, triptona 2,5 gil, agar 15 g/l (todos Difco)) y se incubaron a 40°C. Las células que formaban colonias se volvieron a sembrar en HLB a 43°C para confirmar el restablecimiento de la capacidad de crecer en condiciones osmóticas bajas a alta temperatura de la cepa MXE001. Se preparó el ADN plasmídico a partir de los dones seleccionados y se secuenció para identificar las mutaciones de spr.

45 Usando este método, se aislaron 8 mutaciones simples, una doble y dos mutaciones múltiples en la proteína spr, que complementaban el fenotipo de I::.Tsp como sigue:·

1. V98E

2.D133A 25

3.: V135D

4.: V135G

5.: G147C

6. S95F y Y115F 5 7.170T

8.: N31T, Q73R, R100G,G140C

9.: R62C, Q99P, R144C 10. L 108S

11. L 136P

Ejemplo 3 -Generación de cepas de células de E. coli mutantes que llevan mutaciones de spr

10 Las mutaciones individuales 1 a 5 identificadas en el ejemplo 2 y tres mutaciones de triadas catalíticas de spr (C94A, H145A, H157A) Y W174R se usaron para generar nuevas cepas usando la cepa de E. coli W3110 de tipo natural (genotipo: FLAM-IN (rrnD-rrnE)1 rph1 (ATCC nO 27325)) para crear cepas con spr mutado o la cepa MXEOO1 del ejemplo 1 para hacer cepas combinadas de .t.Tsp/spr mutante.

Se generaron las siguientes cepas de células de E. coli mutantes usando un sistema de vector de sustitución de gen

15 usando el plásmido de recombinación homóloga/sustitución pK03 (Link et al., 1997, Jouma/ of Bacteri%gy, 179, 6228-6237), como se describe en el ejemplo 1 para la generación de MXEOO1.

Tabla 1

Cepas de células de E. coli mutantes: Genotipo Vectores de spr

MXE001: .t.Tsp

MXE008: .t.Tsp, spr D133A pMXE339, pK03 spr D133A (-Sall)

MXE009: .t.Tsp, spr H157A pMXE345, pK03 spr H157A (-Sall)

MXE010: spr G147C pMXE338, pK03 spr G147C (-Sall)

MXE011: spr C94A pMXE343, pK03 spr C94A (-Sall)

MXE012: spr H145A pMxE344, pK03 spr H145A (-Sall)

MXE013: sprW174R pMXE346, pK03 sprW174R (-Sall)

MXE014: .t.Tsp, spr V135D pMXE340, pK03 spr V135D (-Sall)

MXE015: .t.Tsp, spr V98E pMXE342, pK03 spr V98E (-Sall)

MXE016: .t.Tsp, spr C94A pMXE343, pK03 spr C94A (-Sall)

MXE017: .t.Tsp, spr H145A pMXE344, pK03 spr H145A (-Sall)

MXE018: .t.Tsp, spr V135G pMXE341, pK03 spr V135G (-Sall)

Los casetes de integración de spr mutante se movieron como fragmentos de restricción de Sal 1, Not I en plásmidos 20 pK03 de restricción similar.

El plásmido usa el mutante sensible a la temperatura del origen de replicación pSC101 (RepA) junto con un marcador de cloranfenicol para forzar y seleccionar los sucesos de integración cromosómica. El gen sacB que codifica levansacarosa es letal para el crecimiento de E. coli en sacarosa y por lo tanto üunto con el mercador de cloranfenicol y el origen pSC101) se usa para forzar y seleccionar sucesos de desintegración y curado de plásmidos. Esta metodología ha sido descrita previamente (Hamilton et al., 1989, Jouma/ of Bacterio/ogy, 171,4617-4622 Y Blomfield et al., 1991, Mo/ecu/ar Microbi%gy, 5, 1447-1457). El sistema pK03 elimina todos los marcadores selectivos del genoma del hospedante excepto para el gen insertado.

Se construyeron los vectores pK03 citados a continuación que comprenden los genes spr mutados que incluían una mutación silenciosa dentro de la secuencia de spr que elimina un sitio de restricción Sall para la identificación de

clones. pMXE336, pK03 spr S95F (-Sall) pMXE337, pK03 spr Y115F (-Sall) pMXE338, pK03 spr G147C (-Sall)

5 pMXE339, pK03 spr D133A (-Sall) pMXE340, pK03 sprV135D (-Sall) pMXE341, pK03 sprV135G (-Sall) pMXE342, pK03 spr V98E (-Sall) pMXE343, pK03 spr C94A (-Sall)

10 pMXE344, pK03 spr H145A (-Sall) pMXE345, pK03 spr H157A (-Sall) pMXE346, pK03 sprW174R (-Sall)

Estos plásmidos después se transformaron en células W3110 de E. coli químicamente competentes preparadas usando el método encontrado en Miller, E.M. y Nickoloff, JA, "Escherichia coli electrotransformation," en Methods in 15 MOlecular Biology, vol. 47, Nickoloff, JA (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995), o en la cepa MXE001 del ejemplo 1 para hacer cepas combinadas de t.Tsp/spr mutante, como se muestra en la tabla 1.

Día 1, se mezdaron 40 !JI de células de E. coli electrocompetentes o células MXE001con (10 pg) 1 !JI de ADN de pK03 en una cubeta de electroporación BioRad de 0,2 cm enfriada, a 2500 V, 25 !JF Y 200 o. Se añadieron inmediatamente 1000 !JI de 2xPY, las células se recuperaron por agitación a 250 rpm en un incubador a 30°C

20 durante 1 h. Se hicieron diluciones seriadas 1/10 de las células en 2xPY antes de sembrar partes alícuotas de 100 !JI en placas de agar 2xPY que contenían doranfenicol 20 !Jg/ml previamente calentadas a 30°C y 43°C. Las placas se incubaron durante la noche a 30°C y 43°C.

Día 2, el número de colonias desarrolladas a 30°C daba un cálculo de la eficacia de la electroporación, mientras que las colonias que sobrevivieron al crecimiento a 43°C representan potenciales sucesos de integración. Las colonias

25 individuales de la placa a 43°C se recogieron y se volvieron a suspender en 10 mi de 2xPY. Se sembraron 100 !JI de estos en placas de agar 2xPY que contenían sacarosa al 5% (p/v) precalentadas a 30°C para generar colonias individuales. Las placas se incubaron durante la noche a 30°C.

Día 3, las colonias aquí representan los potenciales sucesos de desintegración y curado plasmídico simultáneos. Si los suceSos de desintegración y curado se producían pronto en el crecimiento, entonces el conjunto de la masa de 30 colonias será dónico. Se recogieron colonias individuales y las copias se sembraron en placa en agar 2xPY que contenía doranfenicol 20 !Jg/ml o sacarosa al 5% (plv). Las placas se incubaron durante la noche a 30°C.

Día 4, las colonias que crecían en sacarosa y morian en doranfenicol representan los suceSos potenciales de sustitución cromosómica y de curado plasmídico. Estas se recogieron y se cribaron por PCR más digestión de restricción para la pérdida de un sitio Sall. Las colonias que generaban una banda de PCR positiva del tamaño

35 correcto y resistencia a la digestión por Sall se sacaron para producir colonias individuales en agar 2xPY que contenía sacarosa al 5% (plv) Ylas placas se incubaron durante la noche a 30°C.

Día 5, las colonias individuales de E. coli positivas por PCR, sensibles a cloranfenicol y resistentes a sacarosa, se usaron para hacer células químicamente competentes, preparaciones en glicerol, y actúan como moldes en la PCR para una reacción de PCR con oligonudeótidos flanqueadores 5' y 3' para generar el producto de la PCR para la

40 secuenciación directa de ADN usando la polimerasa Taq para confirmar la mutación correcta.

Ejemplo 4 -Expresión de Fab' anti-TNF en las cepas de spr mutante

Las cepas de spr mutante MXE008, MXE009, MXE012 y MXE017 proporcionadas en el ejemplo 3 y la cepa MXE001 proporcionada en el ejemplo 1, se transformaron con el plásmido pMXE117 (pTTO CDP870 IGS2), se construyó un vector de expresión para el Fab' CDP870 (un Fab' anti-TNF que tiene una secuencia de la cadena ligera mostrada

45 en la SEO ID NO: 13 y una secuencia de la cadena pesada mostrada en la SEO ID NO: 14), usando las metodologías de donación de restricción convencionales que se pueden encontrar en Sambrook et al. 1989, "Molecular doning: a laboratory manual". CSHL press, N.Y. El plásmido pMXE117 (pTTO CDP870 040.4 IGS17) contenía las siguientes características: un promotor tac fuerte y una secuencia de operador lac. Los genes de la cadena pesada y ligera de Fab se transcribieron como un mensaje dicistrónico individual. El ADN que codifica el

50 péptido señal de la proteína OmpA de E. coli se fusionó en el extremo 5' de las secuencias de genes tanto de la cadena ligera como de la pesada, que dirigían la traslocación de los polipéptidos al periplasma de E. coli. La transcripción se terminó usando un terminador de transcripción doble rmB t1t2. El gen laclq codificaba la proteína represora Lac I expresada de forma constitutiva. Esto reprimía la transcripción a partir del promotor tac hasta que se inducía la desrepresión por la presencia de alolactasa o IPTG. El origen de replicación usado era p15A. que mantenía un número de copias bajo. El plásmido contenía un gen de resistencia a tetracidina para la selección por antibiótico.

La transformación de las cepas se llevó a cabo usando el método encontrado en Chung C.T et al. "Transformation and storage of bacterial cells in the same solution". PNAS 86:2172-2175 (1989).

Ejemplo 5 -Expresión de un Fab' anti-TNFa en cepas de E. coli mutadas usando cultivos en matraces agitados

Las cepas de spr mutante MXE008, MXE009, MXE012 y MXE017 se ensayaron en un experimento de matraz agitado comparando el crecimiento y expresión de un Fab' anti-TNFa frente a W3110 y MXE001.

El protocolo experimental de matraz agitado usado se llevó a cabo como sigue:

Experimento en matraz agitado de 5 mi

Se recogió una colonia individual en 5 mi de LB más tetracidina 10 ~g/ml y se cultivó durante la noche a 30°C con agitación a 250 rpm.

El cultivo de la noche se usó para inocular 100 mi más tetraciclina hasta 00600 de 0,1 (es decir para DO de 4, 100/4x01 = 2,5 mi en 100 mi).

Se usaron tubos de cultivo 3x5 mi para cada punto de medición necesario usando este cultivo primario. Se usó 1 cultivo de referencia para ensayar la medición de DO.

Los cultivos se agitaron a 30°C a 250 rpm siguiendo el crecimiento primero visualmente y después tomando muestra del cultivo de referencia para tomar los cultivos a 006000,5 (normalmente.aproximadamente 2 h). Se añadió IPTG a cada tubo de cultivo hasta una concentración 200 ~M (25 ~I de 0,04 M) una vez que el cultivo había alcanzado una DO mayor que 0,5.

Los tubos de cultivo se retiraron en los tiempos de medición requeridos, p. ej. 1h, 2 h, después de inducción y se mantuvieron sobre hielo.

DespuéS de centrifugación a 13.200 rpm durante 5 min, el sedimento celular se volvió a suspender en 200 ~I de tampón de extracción periplásmico (Tris.CI100 mM/EDTA 10 mM pH 7,4). Los extractos periplásmicos se agitaron a 250 rpm durante la noche a 30°C. Al día siguiente, los extractos se centrifugaron durante 10 min a 13.200 rpm, el líquido sobrenadante se separó por decantación y se almacenó a -20°C como "extracto periplásmico". El sedimento celular agotado se descartó.

Cuantificación por ELlSA

Placas de ELlSA de 96 pocillos se revistieron durante la noche a 4°C con AB141 (CH1 de conejo anti-humano, UCB) a 2 ~g.mr1 en PBS. Después de lavar 3x con 300 ~I de tampón de muestra/conjugado (PBS, BSA al 0,2% (p/v) , Tween 20 al 0,1 % (v/v)) , se llevaron a cabo diluciones seriadas de ~de las muestras y las referencias en la placa en 100 ~I de tampón de muestra/conjugado, y la placa se agitó a 250 rpm a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar 3x con 300 ~I de tampón de lavado (PBS, Tween 20 al 0,1% (vlv)) , se añadieron 100 ~I del anticuerpo de revelado 6062 (anticuerpo de conejo anti-lgG kappa humana conjugado con HRP, The Binding Site, Birmingham, Reino Unido), después de dilución 1/1000 en tampón de muestra/conjugado. Después la placa se agitó a 250 rpm a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar con 3x 300 ~I de tampón de lavado, se añadieron 100 ~I de sustrato MB (mezcla 50:50 de solución de TMB (Calbiochem): dH20) y se registró la ~usando un lector de placa automático. La concentración de Fab' en los extractos periplásmicos se calculó por comparación con las referencias de Fab' purificadas del isotipo adecuado.

La figura 1 muestra el crecimiento mejorado de MXE008 y MXE009 comparado con W3110 de tipo natural y MXE001.

La figura 2 muestra la expresión mejorada de Fab' a partir de cepas MXE008 y MXE009 comparado con W311 Ode tipo natural y MXE001.

La figura 5 muestra el crecimiento mejorado de MXE0012 y MXE017 comparado con W3110 de tipo natural y MXE001.

La figura 6 muestra la expresión mejorada de Fab' a partir de cepas MXE001 y MXE017 comparado con W311 Ode tipo natural y MXE001.

•

Ejemplo 6 -Crecimiento de cepas de E. coli con spr mutado y expresión de Fab' en cepas de E. coli mutadas usando fermentaciones de alta densidad

Las cepas MXE008, MXE009, MXE001 y células W3110 de tipo natural se transformaron con el plásmido pMXE117 ensayado en experimentos de fermentación comparando el crecimiento y la expresión de un Fab' anti-TNFa.

Medio de crecimiento

El medio de crecimiento de fermentación se basó en el medio SM6E (descrito en Humphreys et al., 2002, "Protein Expression and Purification", 26, 309-320) con NaH2P04.H20 3,86 gil Y glicerol 112 gil.

Inóculo. Los cultivos de inóculo se cultivaron en el mismo medio complementado con tetracidina 10 IJg/ml. Los cultivos se incubaron a 30°C con agitación, durante aproximadamente 22 horas.

Fermentación. Los fermentadores (volumen total de 2,5 litros) se sembraron con cultivo de inóculo a 00600 de 0,30,5. La temperatura se mantuvo a 300 C durante la fase de crecimiento y se redujo a 25°C antes de la inducción. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo por encima de 30% de saturación del aire mediante agitación variable y flujo de aire. El pH del cultivo se controló a 7,0 mediante valoración automática con NH40H al 15% (vlv) y H2S04 conc. al 10% (v/v). La formación de espuma se controló mediante la adición de solución Struktol J673 al 10% (vlv) (Schill and Seilacher). Se hicieron una serie de adiciones en diferentes etapas de la fermentación. Cuando la concentración de biomasa alcanzó aproximadamente 00600 40, se añadieron sales de magnesio y NaH2P04.H20. Se hicieron adiciones adicionales de NaH2P04.H20 antes de y durante la fase de inducción para asegurar que el fosfato se mantenía en exceso. Cuando el glicerol presente al principio de la fermentación se había reducido (aproximadamente 00600 75) se aplicó una alimentación continua de glicerol al 80% (p/p). En el mismo punto en la fermentación, se aplicó una alimentación de IPTG 170 IJM. El inicio de la alimentación de IPTG se consideró como el inicio de la inducción. Las fermentaciones típicamente se llevaron a cabo durante 64-120 horas a velocidades de alimentación de glicerol en el intervalo entre 0,5 y 2,5 mi/h.

Medición de la concentración de biomasa y velocidad de crecimiento. La concentración de biomasa se determinó midiendo la densidad óptica de los cultivos a 600 nm.

Extracción periplásmica. Las células se recogieron de las muestras de cultivo por centrifugación. La fracción de líquido sobrenadante se retuvo (a -20°C) para el posterior análisis. La fracción de sedimento celular se volvió a suspender al volumen de cultivo original en tampón de extracción (Tris-HCI 100 mM, EDTA 10 mM; pH 7,4). DespuéS de incubación a 60°C durante aproximadamente 16 horas, el extrado se darificó por centrifugación y la fracción de líquido sobrenadante se retuvo (a -20°C) para el análisis.

Cuantificación de Fab'. Las concentraciones de Fab' en los extrados periplásmicos y líquidos sobrenadantes de cultivos se determinó mediante ELlSA de ensamblaje de Fab' como se describe en Humphreys et al., 2002, "Protein Expression and Purification", 26, 309-320, Yusando HPLC de proteína G. Una columna HiTrap Protein-G HP de 1 mi (GE-Healthcare o equivalente) se cargó con el analito (pH aproximadamente neutro, 30°C, filtrado 0,2 IJm) a 2 ml/min, la columna se lavó con fosfato 20 mM, NaCI 50 mM a pH 7,4 Ydespués se eluyó el Fab' usando una inyección de glicina 50 mM /HCI a pH 2,7. El Fab' eluido se midió por A280 en un sistema de HPLC Agilent 1100 o 1200 y se cuantificó por referencia a una curva patrón de una proteína Fab' purificada de concentración conocida.

La figura 3 muestra el perfil de crecimiento de MXE008 y MXE009 comparado con W3110 y MXE001 de control, que muestra que los perfiles de crecimiento son sustancialmente los mismos para MXE001, MXE008 y MXE009 a lo largo de las primeras -26 horas y son todos mayores comparados con W3110. Después de -26 horas la velocidad de crecimiento disminuye para MXE001 debido a la lisis celular. Sin embargo, las cepas de células de spr mutante MXEOOa y MXE009 continúan mostrando una buena velocidad de crecimiento y no se produce lisis después de 26 horas.

La figura 4 muestra el rendimiento total de Fab' del periplasma (símbolos sombreados) y del líquido sobrenadante (símbolos blancos) de cepas de E. coli MXE008 YMXE009 comparado con W3110 y MXE001 de control. Las cepas MXE008 y MXE009 muestran mayor expresión periplásmica de Fab' comparada con MXE001 y W3110. Además, MXE001 y también MXE008 y MXE009 muestran niveles menores de Fab' en el líquido sobrenadante comparados con MX EOO 1 , que muestra lisis celular reducida en MXE008 y MXE009 comparada con MXEOO1.

La figura 7 muestra el perfil de crecimiento de MXE001 y MXEOO8 durante una fermentación de producción de Fab'. Los datos ilustran un pequeño aumento de la velocidad de crecimiento inicial de la cepa MXE008 con mutante spr Lltsp respedo a la cepa MXE001 Lltsp durante la acumulación de biomasa y una supervivencia significativamente muy aumentada de MXE008 con respedo a la cepa MXE001 en las últimas -20 horas de fermentación.

La figura 8 muestra la acumulación periplásmica de Fab' (líneas y simbolos negros) y la acumulación de Fab' en el medio (líneas de trazos y símbolos blancos) para W3110, MXE001 (Lltsp) YMXE008 (Lltsp spr D112A) durante una fermentación de producción de Fab'. Los datos ilustran un pequeño aumento en la acumulación periplásmica de Fab' inicial para la cepa MXE008 con respedo a la cepa MXEOO1, que se vuelve más pronunciadO durante la segunda mitad de la fase de acumulación de Fab'. La adición de la mutación de spr en MXE008 a la mutación Msp en MXE001 contrarresta sustandalmente el fenotipo-de "pérdida" observado con las cepas MXE001 con ~tsp. Esta característica mejorada produce un mayor rendimiento periplásmico para la cepa MXE008 con respecto a la cepa MXE001 y menor acumulación del Fab' perdido en el medio de cultivo para la cepa MXE008 con respecto a la cepa MXE001.

Ejemplo 7 -Determinación de la pérdida de ADN y cantidad de proteínas totales en las cepas

Ensayo de ADNbc

La pérdida de ADN bicatenario en el líquido sobrenadante de las cepas W3110, MXE001, MXE008 Y MXE012 se determinó usando el kit de ensayo de ADNbc Quant-IT Picogreen (Invitrogen, Ref: P11496). Se preparó una curva patrón diluyendo el patrón de ADN propordonado en el intervalo de 1-1000 ng/ml. Las muestras se diluyeron en tampón de TE, de modo que la lectura de fluorescencia estuviera en el intervalo lineal del método (de 500 a 1000 veces). En una placa de 96 pocillos, se mezdaron 100 fJl de muestra diluida o de patrón con 100 fJl del reactivo Picogreen, y la placa se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. Los recuentos de fluorescencia se midieron durante 0,1 s usando un filtro de excitación a 485 nm, y un filtro de emisión a 535 nm. Los resultados se muestran en la figura 9.

Ensayo de proteínas:

La concentración de proteínas totales de las cepas W3110, MXE001, MXE008 YMXE012 se determinó usando el kit de ensayo Coomassie Plus Bradford (Pierce, Ref: 23236). Se hizo una curva patrón diluyendo patrón de albúmina de suero bovino en un intervalo de 25-1000 fJg/ml. Las muestras se diluyeron en agua, de modo que la densidad óptica estuviera dentro del intervalo lineal del método (de 5 a 10 veces), y se mezclaron 33 fJl de la muestra o el patrón con 1 mi de reactivo de Coomassie. Después de incubar durante 10 min a temperatura ambiente, se leyó la 00595 nm en un espectrofotómetro con reactivo de Coomassie como blanco. La concentración de proteínas totales se calculó basándose en la curva patrón. Los resultados se muestran en la figura 10.

Aunque esta invendón se ha mostrado y descrito en particular con referencia a las realizaciones preferidas, los expertos en la técnica entenderán que se pueden hacer diferentes cambios en la forma y el detalle sin salirse del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> UCB PHARMA S.A.

5 <120> CEPA HOSPEDANTE BACTERIANA

<130> G0104-WO

<150> GB1000587.4 10 <151>

<160> 37

<170> Patentln version 3.5 15

<210> 1

<211> 2049

<212> ADN

<213> E. coli 20

<400> 1

atgaac;atgt tttttaggct taccgcgtta gctggcctgc ttgcaatagc aggccagacc 60 ttcgctgtag aagatatcac gcgtgctgat caaattccgg tattaaagga agagacgcag 120 catgcgacgg taagtgagcg cgtaacgtcg cgcttcaccc gttctcatta tcgccagttc 180 gacctcgatc aggcattttc ggccaaaatc tttgaccgct acctgaatct gctcgattac 240 agccacaacg tgctgctggc aagcgatgtt gaacagttcg cgaaaaagaa aaccgagtta 300 ggcgatgaac tgcgttcagg caaactcgac gttttctacg atctctacaa tctggcgcaa 360 aagcgccgtt ttgagcgtta ccagtacgct ttgtcggtac tggaaaagcc gatggatttc 420 accggcaacg acacttataa ccttgaccgc agcaaagcgc cctggccgaa aaacgaggct 480 gagttgaacg cgctgtggga cagtaaagtc aaattcgacg agttaagcct gaagctgaca 540 ggaaaaacgg ataaagaaat tcgtgaaacc ctgactcgcc gctacaaatt tgccattcgt 600 cgtctggcgc aaaccaacag cgaagatgtt ttctcgctgg caatgacggc gtttgcgcgt 660 gaaatcgacc cgcataccaa ctatctttcc ccgcgtaata ccgaacagtt caacactgaa 720 atgagtttgt cgctggaagg tattggcgca gtgctgcaaa tggatgatga ctacaccgtt 780 atcaattcga tggtggcagg tggtccggca gcgaagagta aagctatcag cgttggtgac 840 aaaattgtcg gtgttggtca aacaggcaag ccgatggttg acgtgattgg ctggcgtctt 900 gatgatgtgg ttgccttaat taaagggccg aagggcagta aagttcgtct ggaaatttta 960 cctgctggta aagggaccaa gacccgtact gtaacgttga cccgtgaacg tattcgtctc 1020 gaagaccgcg cggttaaaat gtcggtgaag accgtcggta aagagaaagt cggcgtgctg 1080 gatattccgg gcttctatgt gggtttgaca gacgatgtca aagtgcaact gcagaaactg 1140 gaaaaacaga atgtcagcag cgtcatcatc gacctgcgta gcaatggcgg tggggcgtta 1200

actgaagccg tatcgctctc cggtctgttt attcctgcgg gtcccattgt tcaggtccgc' 1260 gataacaacg gcaaggttcg tgaagatagc gataccgacg gacaggtttt ctataaaggc 1320 ccgctggtgg tgctggttga ccgcttcagt gctt.cggctt cagaaatctt tgccgcggca 1380 atgcaggatt acggtcgtgc gctggttgtg ggtgaaccga cgtttggtaa aggcaccgtt 1440 cagcaatacc gttcattgaa ccgtatttac gatcagatgt tacgtcctga atggccagcg 1500 ctgggttctg tgcagtacac gatccagaaa ttctatcgcg ttaacggcgg cagtacgcaa 1560 cgtaaaggcg taacgccaga catcatcatg ccgacgggta atgaagaaac ggaaacgggt 1620 gagaaattcg aagataacgc gctgccgtgg gatagcattg atgccgcgac ttatgtgaaa 1680 tcaggagatt taacggcctt tgaaccggag ctgctgaagg aacataatgc gcgtatcgcg 1740 aaagatcctg agttccagaa catcatgaag gatatcgcgc gcttcaacgc tatgaaggac 1800 aagcgcaata tcgtttctct gaattacgct gtgcgtgaga aagagaataa tgaagatgat 1860 gcgacgcgtc tggcgcgttt gaacgaacgc tttaaacgcg aaggtaaacc,ggagttgaag 1920 aaactggatg atctaccgaa agattaccag gagccggatc cttatctgga tgagacggtg 1980 aatatcgcac tcgatctggc gaagcttgaa aaagccagac ccgcggaaca acccgctccc 2040 gtcaagtaa 2049

<210> 2

<211> 682 5 <212> PRT

<213> E. coli

<400> 2

Met-Asn Met Phe Phe Arg Leu Thr Ala Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ile 1 5 10 15

Ala Gly Gln Thr Phe Ala Val Glu Asp Ile Thr Arg Ala Asp Gln Ile 20 25 30

Pro Val Leu Lys Glu Glu Thr Gln His Ala Thr Val Ser Glu Arg Val 35 40 45

Thr Ser Arg Phe Thr Arg Ser His Tyr Arg Gln Phe Asp Leu Asp Gln 50 55 60

Ala Phe Ser Ala Lys Ile Phe Asp Arg Tyr Leu Asn Leu Leu Asp Tyr 65 70 75 80

Ser His Asn Val Leu Leu Ala Ser Asp Val Glu Gln Phe Ala Lys Lys 10 85 90 95

Lys Thr Glu Leu Gly Asp Glu Leu Arg Ser Gly Lys Leu Asp Val Phe 100 105 110

Tyr Asp Leu Tyr Asn Leu Ala Gln Lys Arg Arg Phe Glu Arg Tyr Gln 115 120 125

Tyr Ála Leu Ser Val Leu Glu Lys Pro Met Asp Phe Thr Gly Asn Asp 130 135 140

Thr Tyr Asn Leu Asp Arg Ser Lys Ala Pro Trp Pro Lys Asn Clu Ala 145 150 155 160

Glu Leu Asn Ala Leu Trp Asp Ser Lys Val Lys Phe Asp Glu Leu Ser 165 170 175

Leu Lys Leu Thr Gly Lys Thr Asp Lys Glu lle Arg Glu Thr Leu Thr 180 185 190

Arg Arg Tyr Lys Phe Ala lle Arg Arg Leu Ala Gln Thr Asn Ser Glu 195 200 205

Asp Val Phe Ser Leu Ala Met Thr Ala Phe Ala Arg Glu lle Asp Pro 210 215 220

His Thr Asn Tyr Leu Ser Pro Arg Asn Thr Glu Gln Phe Asn Thr Glu 225 230 235 240

Met Ser Leu Ser Leu Glu Gly lle Gly Ala Val Leu Gln Met Asp Asp 245 250 255

Asp Tyr Thr Val Ile Asn Ser Met Val Ala Gly Gly Pro Ala Ala Lys 260 265 270

Ser Lys Ala 11e Ser Val Gly Asp Lys lle Val Gly Val Gly Gln Thr 275 280 285

Gly Lys Pro Met Val Asp Val lle Gly Trp Arg Leu Asp Asp Val Val 290 295 300

Ala Leu lle Lys Gly Pro Lys Gly Ser Lys Val Arg Leu Glu lle Leu 305 310 315 320

Pro Ala G1y Lys Gly Thr Lys Thr Arg Thr Val Thr Leu Thr Arg Glu 325 330 335

Arg Ile Arg Leu Glu Asp Arg Ala Val Lys Met Ser Val Lys Thr Val 340 345 350

Gly Lys Glu Lys Val Gly Val Leu Asp Ile Pro Gly Phe Tyr Val Gly 355 360 365

Leu Thr Asp Asp Val Lys Val Gln Leu Gln Lys Leu Glu Lys Gln Asn 370 375 380

Val Ser Ser Val Ile Ile Asp Leu Arg Ser Asn Gly Gly Gly Ala Leu 385 390 395 400

Thr Glu Ala Val Ser Leu Ser Gly Leu Phe Ile Pro Ala Gly Pro Ile 405 410 415

Val Gln Val Arg Asp Asn Asn Gly Lys Val Arg Glu Asp Ser Asp Thr 420 425 430

ASp Gly Gln Val Phe Tyr Lys Gly Pro Leu Val Val Leu Val Asp Arg 435 440 445

Phe Ser Ala Ser Ala Ser Glu Ile Phe Ala Ala Ala Met Gln Asp Tyr 450 455 460

Gly Arg Ala Leu Val Val Gly Glu Pro Thr Phe Gly Lys Gly Thr Val 465 470 475 480

Gln Gln Tyr Arg Ser Leu Asn Arg Ile Tyr Asp Gln Met Leu Arg Pro 485 490 495

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Arg Val Asn Gly Gly Ser Thr Gln Arg Lys Gly Val Thr Pro Asp Ile 515 520 525

Ile Met Pro Thr Gly Asn Glu Glu Thr Glu Thr Gly Glu Lys Phe Glu 530 535 540

ASp Asn Ala Leu Pro Trp Asp Ser Ile Asp Ala Ala Thr Tyr Val Lys 545 550 555 560

Ser Gly Asp Leu Thr Ala Phe Glu Pro Glu Leu Leu Lys Glu His Asn 565 570 575

Ala Arg Ile Ala Lys Asp Pro Glu Phe Gln Asn Ile Met Lys Asp Ile

580 585 590 Ala Arg Phe Asn Ala Met Lys Asp Lys Arg Asn Ile Val Ser Leu Asn 595 600 605 Tyr Ala Val Arg Glu Lys Glu Asn Asn Glu Asp Asp Ala Thr Arg Leu 610 615 620 Ala Arg Leu Asn Glu Arg Phe Lys Arg Glu Gly Lys Pro Glu Leu Lys

Lys Leu Asp Asp

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<210> 3

<211> 2048

<212> ADN

<213> E. coli

<400> 3

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Gln Pro Ala Pro Val Lys 680

atgaattcgt ttttaggctt accgcgttag ctggcctgct tgcaatagca ggccagacat 60 taattgtaga agatatcacg cgtgctgatc aaattccggt attaaaggaa gagacgcagc 120 atgcgacggt aagtgagcgc gtaacgtcgc gcttcacccg ttctcattat cgccagttcg 180 acctcgatca ggcattttcg gccaaaatct ttgaccgcta cctgaatctg ctcgattaca 240 gccacaacgt gctgctggca agcgatgttg aacagttcgc gaaaaagaaa accgagttag 300 gcgatgaact gcgttcaggc aaactcgacg ttttctacga tctctacaat ctggcgcaaa 360 agcgccgttt tgagcgttac cagtacgctt tgtcggtact ggaaaagccg atggatttca 420 ccggcaacga cacttataac cttgaccgca gcaaagcgcc ctggccgaaa aacgaggctg 480 agttgaacgc gctgtgggac agtaaagtca aattcgacga gttaagcctg aagctgacag 540 gaaaaacgga taaagaaatt cgtgaaaccc tgactcgccg ctacaaattt gccattcgtc 600 gtctggcgca aaccaacagc gaagatgttt tctcgctggc aatgacggcg tttgcgcgtg 660 aaatcgaccc gcataccaac tatctttccc cgcgtaatac cgaacagttc aacactgaaa 720 tgagtttgtc gctggaaggt attggcgcag tgctgcaaat ggatgatgac tacaccgtta 780 tcaattcgat ggtggcaggt ggtccggcag cgaagagtaa agctatcagc gttggtgaca 840

aaattgtcgg tgttggtcaa acaggcaagc cgatggttga cgtgattggc tggcgtcttg 900 atgatgtggt tgccttaatt aaagggccga agggcagtaa agttcgtctg gaaattttac 960 ctgctggtaa agggaccaag acccgtactg taacgttgac ccgtgaacgt attcgtctcg 1020 aagaccgcgc ggttaaaatg tcggtgaaga ccgtcggtaa agagaaagtc ggcgtgctgg 1080 atattccggg cttctatgtg ggtttgacag acgatgtcaa agtgcaactg cagaaactgg 1140 aaaaacagaa tgtcagcagc gtcatcatcg acctgcgtag caatggcggt ggggcgttaa 1200 ctgaagccgt atcgctctcc ggtctgttta ttcctgcggg tcccattgtt caggtccgcg 1260 ataacaacgg caaggttcgt gaagatagcg ataccgacgg acaggttttc tataaaggcc 1320 cgctggtggt gctggttgac cgcttcagtg cttcggcttc agaaatcttt gccgcggcaa 1380 tgcaggatta cggtcgtgcg ctggttgtgg gtgaaccgac gtttggtaaa ggcaccgttc 1440 agcaataccg ttcattgaac cgtatttacg atcagatgtt acgtcctgaa tggccagcgc 1500 tgggttctgt gcagtacacg atccagaaat tctatcgcgt taacggcggc agtacgcaac 1560 gtaaaggcgt aacgccagac atcatcatgc cgacgggtaa tgaagaaacg gaaacgggtg 1620 agaaattcga agataacgcg ctgccgtggg atagcatt<;fa tgccgcgact tatgtgaaat 1680 caggagattt aacggccttt gaaccggagc tgctgaagga acataatgcg cgtatcgcga 1740 aagatcctga gttccagaac atcatgaagg atatcgcgcg cttcaacgct atgaaggaca 1800 agcgcaatat cgtttctctg aattacgctg tgcgtgagaa agagaataat gaagatgatg 1860 cgacgcgtct ggcgcgtttg aacgaacgct ttaaacgcga aggtaaaccg gagttgaaga 1920 aactggatga tctaccgaaa gattaccagg agccggatcc ttatctggat gagacggtga 1980 atatcgcact cgatctggcg aagcttgaaa aagccagacc cgcggaacaa cccgctcccg 2040 tcaagtaa 2048

<210> 4

<211> 2889 5 <212> AON

<213> E. coli

<400> 4

atgccccgca gcacctggtt caaagcatta ttgttgttag ttgccctttg ggcaccctta 60 agtcaggcag aaacgggatg gcagccgatt caggaaacca tccgtaaaag tgataaagat 120 aaccgccagt atcaggctat acgtctggat aacggtatgg tggtcttgct ggtttctgat 180 ccgcaggcag ttaaatcgct ctcggcgctg gtggtgcccg ttgggtcgct ggaagatccc 240 gaggcgtacc aggggctggc acattacctt gaacatatga gtctgatggg gtcgaaaaag 300 tacccgcagg ctgacagtct ggccgaatat ctcaaaatgc acggcggtag tcacaatgcc 360

agcactgcgc cgtatcgcac ggctttctat ctggaagttg agaacgacgc cttgcctggt 420 gcggtagacc gcctggccga tgctattgct gaacctttgc tcgacaagaa atatgccgaa 480 cgtgagcgta atgcggtgaa cgctgaatta accatggcgc gtacgcgtga cgggatgcgc 540 atggcacagg tcagcgcaga aaccattaac ccggcacacc ccggttcaaa gttttctggt 600 ggtaacctcg aaactttaag cgacaaacct ggtaatccgg tgcagcaggc gctgaaagat 660 ttccacgaga agtactattc cgccaatttg atgaaggcgg ttatttacag taataaaccg 720 ctgccggagt tggcaaaaat ggcggcggac acctttggtc gcgtgccgaa caaagagagc 780 aaaaaaccgg aaatcaccgt gccggtagtc accgacgcgc aaaagggcat tatcattcat 840 tacgtccctg cgctgccgcg taaagtgttg cgcgttgagt ttcgcatcga taacaactca 900 gcgaagttcc gtagtaaaac cgatgaattg attacctatc tgattggcaa tcgcagccca 960 ggtacacttt ctgactggct gcaaaagcag ggattagttg agggcattag cgccaactcc 1020 gatcctatcg tcaacggcaa cagcggcgta ttagcgatct ctgcgtcttt aaccgataaa 1080 ggcctggcta atcgcgatca ggttgtggcg gcaattttta gctatctcaa tctgttacgt 1140 gaaaaaggca ttgataaaca atacttcgat gaactggcga atgtgctgga tatcgacttc 1200 cgttatccgt cgatcacccg tgatatggat tacgtcgaat ggctggcaga taccatgatt .1260 cgcgttcctg ttgagcatac gctggatgca gtcaatattg ccgatcggta cgatgctaaa 1320 gcagtaaagg aacgtctggc gatgatgacg ccgcagaatg cgcgtatctg gtatatcagc 1380 ccgaaagagc cgcacaacaa aacggcttac tttgtcgatg cgccgtatca ggtcgataaa 1440 atcagcgcac aaactttcgc cgactggcag aaaaaagccg ccgacattgc gctctctttg 1500 ccagagctta acccttatat tcctgatgat ttctcgctga ttaagtcaga gaagaaatac 1560 gaccatccag agctgattgt tgatgagtcg aatctgcgcg tggtgtatgc gccaagccgt 1620 tattttgcca gcgagcccaa agctgatgtc agcctgattt tgcgtaatcc gaaagccatg 1680 gacagcgccc gcaatcaggt gatgtttgcg ctcaatgatt atctcgcagg gctggcgctt 1740 gatcagttaa gcaaccaggc gtcggttggt ggcataagtt tttccaccaa cgctaacaac 1800 ggccttatgg ttaatgctaa tggttacacc cagcgtctgc cgcagctgtt ccaggcattg 1860 ctcgaggggt actttagcta taccgctacg gaagatcagc ttgagcaggc gaagtcctgg 1920 tataaccaga tgatggattc cgcagaaaag ggtaaagcgt ttgagcaggc gattatgccc 1980 gcgcagatgc tctcgcaagt gccgtacttc tcgcgagatg aacggcgtaa aattttgccc 2040 tccattacgt tgaaagaggt gctggcctat cgcgacgcct taaaatcagg ggctcgacca 2100 gagtttatgg ttatcggcaa catgaccgag gcccaggcaa caacgctggc acgcgatgtg 2160 caaaaacagt tgggcgctga tggttcagag tggtgtcgaa acaaagatgt agtggtcgat 2220

aaaaaacaat ccgtcatctt tgaaaaagcc ggtaacagca ccgactccgc actggcagcg 2280 gtatttgtac cgactggcta cgatgaatac accagctcag cctatagctc tctgttgggg 2340 cagatcgtac agccgtggtt ctacaatcag ttgcgtaccg aagaacaatt gggctatgcc 2400 gtgtttgcgt ttccaatgag cgtggggcgt cagtggggca tgggcttcct tttgcaaagc 2460 aatgataaac agccttcatt cttgtgggag cgttacaagg cgtttttccc aaccgcagag 2520 gcaaaattgc gagcgatgaa gccagatgag tttgcgcaaa tccagcaggc ggtaattacc 2580 cagatgctgc aggcaccgca aacgctcggc gaagaagcat cgaagttaag taaagatttc 2640 gatcgcggca atatgcgctt cgattcgcgt gataaaatcg tggcccagat aaaactgctg 2700 acgccgcaaa aacttgctga tttcttccat caggcggtgg tcgagccgca aggcatggct 2760 attctgtcgc agatttccgg cagccagaac gggaaagccg aatatgtaca ccctgaaggc 2820 tggaaagtgt gggagaacgt cagcgcgttg cagcaaacaa tgcccctgat gagtgaaaag 2880 aatgagtga 2889

<210> 5

<211> 962 5 <212> PRT

<213> E. coli

<400> 5

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Trp Ala Pro Leu Ser G1n Ala G1u Thr Gly Trp Gln Pro Ile Gln Glu 20 25 30

Thr Ile Arg Lys Ser Asp Lys Asp Asn Arg Gln Tyr Gln Ala Ile Arg 35 40 45

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65 70 75 80

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Met His Gly Gly Ser His Asn Ala Ser Thr Ala Pro Tyr Arg Thr Ala

115 120 125

Phe Tyr Leu Glu Val Glu Asn Asp Ala Leu Pro Gly Ala Val Asp Arg 130 135 140

Leu Ala Asp Ala 11e Ala Glu Pro Leu Leu Asp Lys Lys Tyr Ala Glu 145 150 155 160

Arg Glu Arg Asn Ala Val Asn Ala Glu Leu Thr Met Ala Arg Thr Arg 165 170 175

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Tyr Tyr Ser Ala Asn Leu Met Lys Ala Val 11e Tyr Ser Asn Lys Pro 225 230 235 240

Leu Pro Glu Leu Ala Lys Met Ala Ala Asp Thr Phe Gly Arg Val Pro 245 250 255

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Ser Lys Thr Asp Glu Leu 11e Thr Tyr Leu Ile Gly Asn Arg Ser Pro 305 310 315 320

Gly Thr Leu Ser Asp Trp Leu Gln Lys G1n Gly Leu Val Glu Gly 11e 325 330 335

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11e Ser Ala Ser Leu Thr Asp Lys Gly Leu Ala Asn Arg Asp Gln Val

360 365

Val Ala Ala Ile Phe Ser Tyr Leu Asn Leu Leu Arg Glu Lys Gly Ile 370 375 380

Asp Lys Gln Tyr Phe Asp Glu Leu Ala Asn Val Leu Asp Ile Asp Phe 385 390 395 400

Arg Tyr Pro Ser Ile Thr Arg Asp Met Asp Tyr Val Glu Trp Leu Ala 405 410 415

Asp Thr Met Ile Arg Val Pro Val Glu His Thr Leu Asp Ala Val Asn 420 425 430

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His Asn Lys Thr Ala Tyr Phe Val Asp Ala Pro Tyr Gln Val Asp Lys 465 410 475 480

Ile Ser Ala Gln Thr Phe Ala Asp Trp Gln Lys Lys Ala Ala Asp 11e 485 490 495

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,

Ser Thr Asp Ser Ala Leu Ala Ala Val Phe Val Pro Thr Gly Tyr Asp 755 760 765

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Asn Glu

<210> 6

<211>2915 5 <212> AON

<213> E. coli

<400> 6

attccccgca gcacctggtt caaagcatta ttgttgttag ttgccctttg ggcacattaa tgtcaggcag aaacgggatg gcagccgatt caggaaacca tccgtaaaag tgataaagat aaccgccagt atcaggctat acgtctggat aacggtatgg tggtcttgct ggtttctgat ccgcaggcag ttaaatcgct ctcggcgctg gtggtgcccg ttgggtcgct ggaagatccc gaggcgtacc aggggctggc acattacctt gaacatatga gtctgatggg gtcgaaaaag tacccgcagg ctgacagtct ggccgaatat ctcaaaatgc acggcggtag tcacaatgcc agcactgcgc cgtatcgcac ggctttctat ctggaagttg agaacgacgc cttgcctggt gcggtagacc gcctggccga tgctattgct gaacctttgc tcgacaagaa atatgccgaa cgtgagcgta atgcggtgaa cgctgaatta accatggcgc gtacgcgtga cgggatgcgc atggcacagg tcagcgcaga aaccattaac ccggcacacc ccggttcaaa gttttctggt ggtaacctcg aaactttaag cgacaaacct ggtaatccgg tgcagcaggc gctgaaagat

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660

ttccacgaga agtactattc cgccaatttg atgaaggcgg ttatttacag taataaaccg 720 ctgccggagt tggcaaaaat ggcggcggac acctttggtc gcgtgccgaa caaagagagc 7BO aaaaaaccgg aaatcaccgt gccggtagtc accgacgcgc aaaagggcat tatcattcat B40 tacgtccctg cgctgccgcg taaagtgttg cgcgttgagt ttcgcatcga taacaactca 900 gcgaagttcc gtagtaaaac cgatgaattg attacctatc tgattggcaa tcgcagccca 960 ggtacacttt ctgactggct gcaaaagcag ggattagttg agggcattag cgccaactcc 1020 gatcctatcg tcaacggcaa cagcggcgta ttagcgatct ctgcgtcttt aaccgataaa 1080 ggcctggcta atcgcgatca ggttgtggcg gcaattttta gctatctcaa tctgttacgt 1140 gaaaaaggca ttgataaaca atacttcgat gaactggcga atgtgctgga tatcgacttc 1200 cgttatccgt cgatcacccg tgatatggat tacgtcgaat ggctggcaga taccatgatt 1260 cgcgttcctg ttgagcatac gctggatgca gtcaatattg ccgatcggta cgatgctaaa 1320 gcagtaaagg aacgtctggc gatgatgacg ccgcagaatg cgcgtatctg gtatatcagc 1380 ccgaaagagc cgcacaacaa aacggcttac tttgtcgatg cgccgtatca ggtcgataaa 1440 atcagcgcac aaactttcgc cgactggcag aaaaaagccg ccgacattgc gctctctttg 1500 ccagagctta acccttatat tcctgatgat ttctcgctga ttaagtcaga gaagaaatac 1560 gaccatccag agctgattgt tgatgagtcg aatctgcgcg tggtgtatgc gccaagccgt 1620 tattttgcca gcgagcccaa agctgatgtc agcctgattt tgcgtaatcc gaaagccatg 16BO gacagcgccc gcaatcaggt gatgtttgcg ctcaatgatt atctcgcagg gctggcgctt 1740 gatcagttaa gcaaccaggc gtcggttggt ggcataagtt tttccaccaa cgctaacaac lBOO ggccttatgg ttaatgctaa tggttacacc cagcgtctgc cgcagctgtt ccaggcattg 1B60 ctcgaggggt actttagcta taccgctacg gaagatcagc ttgagcaggc gaagtcctgg 1920 tataaccaga tgatggattc cgcagaaaag ggtaaagcgt ttgagcaggc gattatgccc 1980 gcgcagatgc tctcgcaagt gccgtacttc tcgcgagatg aacggcgtaa aattttgccc 2040 tccattacgt tgaaagaggt gctggcctat cgcgacgcct taaaatcagg ggctcgacca 2100 gagtttatgg ttatcggcaa catgaccgag gcccaggcaa caacgctggc acgcgatgtg 2160 caaaaacagt tgggcgctga tggttcagag tggtgtcgaa acaaagatgt agtggtcgat 2220 aaaaaacaat ccgtcatctt tgaaaaagcc ggtaacagca ccgactccgc actggcagcg 2280 gtatttgtac cgactggcta cgatgaatac accagctcag cctatagctc tctgttgggg 2340 cagatcgtac agccgtggtt ctacaatcag ttgcgtaccg aagaacaatt gggctatgcc 2400 gtgtttgcgt ttccaatgag cgtggggcgt cagtggggca tgggcttcct tttgcaaagc 2460 aatgataaac agccttcatt cttgtgggag cgttacaagg cgtttttccc aaccgcagag 2520

gcaaaattgc gagcgatgaa gccagatgag tttgcgcaaa tccagcaggc ggtaattacc 2580 cagatgctgc aggcaccgca aacgctcggc gaagaagcat cgaagttaag taaagatttc 2640 gatcgcggca atatgcgctt cgattcgcgt gataaaatcg tggcccagat aaaactgctg 2700 acgccgcaaa aacttgctga tttcttccat caggcggtgg tcgagccgca aggcatggct 2760 attctgtcgc agatttccgg cagccagaac gggaaagccg aatatgtaca ccctgaaggc 2820 tggaaagtgt gggagaacgt cagcgcgttg cagcaaacaa tgcccctgat gagtgaaaag 2880 aatgagtgat gtcgccgaga cactagatcc tttgc 2915

<210> 7

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<213> E. coli

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gagatgagca acaaaggcaa agatcagggc gtggtagtga acaacgtgaa aacgggcact 1260 ccggctgcgc agatcggcct gaagaaaggt gatgtgatta ttggcgcgaa ccagcaggca 1320 gtgaaaaaca tcgctgaact gcgtaaagtt ctcgacagca aaccgtctgt gctggcactc 1380 aacattcagc gcggcgacag caccatctac ctgttaatgc agtaa 1425

<210> 8 <211>474

<212> PRT

<213> E. coli 5

<400> 8

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Leu Ala Leu Ser Pro Leu Ser Ala Thr Ala Ala Glu Thr Ser Ser Ala 20 25 30

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Met Pro Ser Val Val Ser 1le Asn Val Glu Gly Ser Thr Thr Val Asn 50 55 60

Thr Pro Arg Met Pro Arg Asn Phe Gln Gln Phe Phe Gly Asp Asp Ser 65 70 75 80

Pro Phe Cys Gln Glu Gly Ser Pro Phe Gln Ser Ser Pro Phe Cys Gln 85 90 95

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Leu Gly Ser Gly Val 1le 1le Asp Ala Asp Lys Gly Tyr Val val Thr 115 120 125

Asn Asn His Val Val Asp Asn Ala Thr Val 1le Lys Val Gln Leu Ser 130 135 140

Asp Gly Arg Lys Phe Asp Ala Lys Met Val Gly Lys Asp Pro Arg Ser 145 150 155 160

Asp Ile Ala Leu Ile Gln Ile Gln Asn Pro Lys Asn Leu Thr Ala 1le 165 170 175

Lys Met Ala Asp Ser Asp Ala Leu Arg Val Gly Asp Tyr Thr Val Ala 180 185 190

Ile Gly Asn Pro Phe Gly Leu Gly Glu Thr Val Thr Ser Gly Ile Val 195 200 205

Ser Ala Leu Gly Arg Ser Gly Leu Asn Ala Glu Asn Tyr Glu Asn Phe 210 215 220

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Val Asn Leu Asn Gly Glu Leu Ile Gly I1e Asn Thr Ala Ile Leu Ala 245 250 255

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Val Lys Asn Leu Thr Ser Gln Met Val Glu Tyr Gly Gln Val Lys Arg 275 280 285

Gly Glu Leu Gly Ile Met Gly Thr Glu Leu Asn Ser Glu Leu Ala Lys 290 295 300

Ala Met Lys Val Asp Ala Gln Arg Gly Ala Phe Val Ser Gln Val Leu 305 310 315 320

Pro Asn Ser Ser Ala Ala Lys Ala Gly Ile Lys Ala Gly Asp Val Ile 325 330 335

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Glu Met Ser Asn Lys Gly Lys Asp Gln Gly Val Val Val Asn Asn Val 405 410 415

Lys Thr Gly Thr Pro Ala Ala Gln Ile Gly Leu Lys Lys Gly Asp Val

420 425 430

Ile Ile Gly Ala Asn Gln Gln Ala Val Lys Asn Ile Ala Glu Leu Arg 435 440 445

Lys Val Leu Asp Ser Lys Pro Ser Val Leu Ala Leu Asn Ile Gln Arg 450 455 460

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<211> 1425 5 <212> AON

<213> E. coli

<400> 9

atgaaaaaaa ccacattagc actgagtgca ctggctctga gtttaggttt ggcgttatct 60 ccgctctctg caacggcggc tgagacttct tcagcaacga cagcccagca gatgccaagc 120 cttgcaccga tgctcgaaaa ggtgatgcct tcagtggtca gcattaacgt agaaggtagc 180 acaaccgtta atacgccgcg tatgccgcgt aatttccagc agttcttcgg tgatgattct 240 ccgttctgcc aggaaggttc tccgttccag agctctccgt tctgccaggg tggccagggc 300 ggtaatggtg gcggccagca acagaaattc atggcgctgg gttccggcgt catcattgat 360 gccgataaag gctatgtcgt caccaacaac cacgttgttg ataacgcgac ggtcattaaa 420 gttcaactga gcgatggccg taagttcgac gcgaagatgg ttggcaaaga tccgcgctct 480 gatatcgcgc tgatccaaat ccagaacccg aaaaacctga ccgcaattaa gatggcggat 540 tctgatgcac tgcgcgtggg tgattacacc gtagcgattg gtaacccgtt tggtctgggc 600 gagacggtaa cttccgggat tgtctctgcg ctggggcgta gcggcctgaa tgccgaaaac 660 tacgaaaact tcatccagac cgatgcagcg attaatcgtg gtaacgccgg tggtgcgctg 720 gttaacctga acggcgaact gatcggtatc aacaccgcga tcctcgcacc ggacggcggc 780 aacatcggta tcggttttgc tatcccgagt aacatggtga aaaacctgac ctcgcagatg 840 gtggaatacg gccaggtgaa acgcggtgag ctgggtatta tggggactga gctgaactcc 900 gaactggcga aagcgatgaa agttgacgcc cagcgcggtg ctttcgtaag ccaggttctg 960 cctaattcct ccgctgcaaa agcgggcatt aaagcgggtg atgtgatcac ctcactgaac 1020 ggtaagccga tcagcagctt tgccgcactg cgtgctcagg tgggtactat gccggtaggc 1080 agcaaactga ccctgggctt actgcgcgac ggtaagcagg ttaacgtgaa cctggaactg 1140 cagcagagca gccagaatca ggttgattcc agctccatct tcaacggcat tgaaggcgct 1200

gagatgagca acaaaggcaa agatcagggc gtggtagtga acaacgtgaa aacgggcact 1260 ccggctgcgc agatcggcct gaagaaaggt gatgtgatta ttggcgcgaa ccagcaggca 1320 gtgaaaaaca tcgctgaact gcgtaaagtt ctcgacagca aaccgtctgt qctggcactc 1380 aacattcagc gcggcgacag caccatctac ctgttaatgc agtaa 1425

<210> 10 <211>474

<212> PRT

<213> E. coli

<400> 10

Met Lys Lys Thr Thr Leu Ala Leu Ser Ala Leu Ala Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15

Leu Ala Leu Ser Pro Leu Ser Ala Thr Ala Ala Glu Tnr Ser Ser Ala 20 25 30

Thr Thr Ala Gln Gln Met Pro Ser Leu Ala Pro Met Leu Glu Lys Val 35 40 45

Met Pro Ser Val Val Ser 11e Asn Val Glu Gly Ser Thr Thr Val Asn 50 55 60

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Gly Gly Gln Gly Gly Asn Gly Gly Gly Gln Gln Gln Lys Phe Met Ala 100 105 110

Leu Gly Ser Gly Val 11e 11e Asp Ala Asp Lys Gly Tyr Val Val Thr 115 120 125

Asn Asn His Val Val ASp Asn Ala Thr Val 11e Lys Val Gln Leu Ser 130 135 140

Asp Gly Arg Lys Phe Asp Ala Lys Met Val Gly Lys Asp Pro Arg Ser 145 150 155 160

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Lys Met Ala Asp Ser Asp Ala Leu Arg Val Gly Asp Tyr Thr Val Ala

180 185 190

11e Gly Asn Pro Phe Gly Leu Gly Glu Thr Val Thr Ser Gly 11e Val 195 200 205

Ser Ala Leu Gly Arg Ser Gly Leu Asn Ala Glu Asn Tyr Glu Asn Phe 210 215 220

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225 230 235 240

Val Asn Leu Asn Gly Glu Leu Ile Gly Ile Asn Thr Ala Ile Leu Ala 245 250 255

Pro Asp Gly Gly Asn 1le Gly 11e Gly Phe Ala Ile Pro Ser Asn Met 260 265 270

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Pro Asn Ser Ser Ala Ala Lys Ala Gly 11e Lys Ala Gly Asp Val 11e 325 330 335

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Gln Val Gly Thr Met Pro Val Gly Ser Lys Leu Thr Leu Gly Leu Leu 355 360 365

Arg Asp Gly Lys Gln Val Asn Val Asn Leu Glu Leu Gln Gln Ser Ser 370 375 380

Gln Asn Gln Val Asp Ser Ser Ser 11e Phe Asn Gly Ile Glu Gly Ala 385 390 395 400

Glu Met Ser Asn Lys Gly Lys Asp Gln Gly Val Val Val Asn Asn Val 405 410 415

Lys Thr Gly Thr Pro Ala Ala Gln 11e Gly Leu Lys Lys Gly Asp Val 420 425 430

11e 11e Gly Ala Asn Gln Gln Ala Val Lys Asn 11e Ala Glu Leu Arg 435 440 445

Lys Val Leu ASp Ser Lys Pro Ser Val Leu Ala Leu Asn 11e Gln Arg 450 455 460

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<210> 11

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 11 10

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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<400> 12

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<210> 13

<211> 214 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cadena Ligera Injertada 10

<400> 13

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<210> 14

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cadena Pesada Injertada 10

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

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Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 1le Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195: 200

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10: <220> <223> Cebador oligonudeótido <400> 15

gcatcataat tttcttttta ccte: 24

15: <210> 16 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

20: <220> <223> Cebador oligonudeótido

<400> 16

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 220

gggaaatgaa cctgagcaaa acgc

<210> 17

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleótido

<400> 17

gtgccaggag atgcagcagc ttgc

. <210> 18

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artifidal

<220>

<223> Cebador oligonucleótido

<400> 18

tttgcagcca gtcagaaagt 9 21

<210> 19

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artifidal

<220>

<223> Cebador oligonucleótido

<400> 19

ctgcctgcga ttttcgccgg aacg

<210> 20

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleótido

<400> 20

cgcatggtac gtgccacgat atcc

<210> 21

<211> 188

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 21

2:4

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Ser Ser Gly Val I1e Ile Ser Ser Met A5n Glu Pro Tyr Trp Ly5 Lys 165 170 175

Arg Tyr Asn Glu Ala Arg Arg Val Leu Ser Arg Ser 180 185

<210> 22

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<213> Escherichia coli

<400> 22

Cys Ser Ala Asn Asn Thr Ala Lys Asn Met His pro Glu Thr Arg Ala 10 1 5 10 15

Val: Gly Ser Glu Thr Ser Ser 20 Leu Gln Ala 25 Ser Gln Asp Glu 30 Phe Glu

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Ala Asp Trp Lys Gly Val Arg Tyr Arg 50 55: Leu Gly Gly Ser Thr 60 Lys Lys

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Arg Ser

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atgcgggcga aacttctggg aatagtcctg acaaccccta ttgcgatcag ctcttttgct: 60

tctaccgaga ctttatcgtt tactcctgac aacataaatg cggacattag tcttggaact: 120

ctgagcggaa aaacaaaaga gcgtgtttat ctagccgaag aaggaggccg: aaaagtcagt 180

caactcgact ggaaattcaa taacgctgca attattaaag gtgcaattaa ttgggatttg: 240

atgccccaga tatctatcgg ggctgctggc tggacaactc tcggcagccg aggtggcaat: 300

atggtcgatc aggactggat ggattccagt aaccccggaa cctggacgga tgaaagtaga: 360

caccctgata cacaactcaa ttatgccaac gaatttgatc tgaatatcaa aggctggctc: 420

ctcaacgaac ccaattaccg cctgggactc atggccggat atcaggaaag ccgttatagc: 480

tttacagcca gaggtggttc: ctatatctac agttctgagg agggattcag agatgatatc 540

ggctccttcc cgaatggaga aagagcaatc ggctacaaac aacgttttaa aatgccctac: 600

attggcttga ctggaagtta tcgttatgaa gattttgaac tcggtggcac: atttaaatac 660

agcggctggg tggaatcatc tgataacgct gaagcttatg acccgggaaa aagaatcact: 720

tatcgcagta aggtcaaaga ccaaaattac tattctgttg cagtcaatgc aggttattac: 780

gtcacaccta acgcaaaagt ttatgttgaa ggcgcatgga atcgggttac gaataaaaaa: 840

ggtaatactt cactttatga tcacaataat aacacttcag actacagcaa aaatggagca: 900

ggtatagaaa actataactt catcactact gctggtctta agtacacatt: t 951

5: <210> 24 <211>317 <212> PRT <213> Secuencia Artificial

10: <220> <223> Secuencia OmpT mutada <400> 24

Met Arg Ala Lys 1: Leu 5 Leu G1y Ile Val Leu Thr Thr 10 Pro Ile Ala Ile 15

Ser Ser.Phe Ala Ser Thr Glu Thr Leu 20 25: Ser Phe Thr Pro Asp Asn 30 I1e

Asn Ala Asp 35: Ile Ser Leu Gly Thr Leu 40 Ser Gly Lys Thr Lys 45 Glu Arg

Val Tyr 50: Leu Ala Glu Glu Gly Gly Arg Lys Val 55 Ser Gln 60 Leu Asp Trp

Lys 65: Phe Asn Asn Ala Ala 70 Ile Ile Lys Gly Ala 75 Ile Asn Trp Asp Leu 80

Met: Pro Gln Ile Ser 85 Ile Gly Ala Ala Gly Trp Thr Thr Leu Gly Ser 90 95

Arg Gly Gly Asn Met Val Asp Gln Asp Trp Met Asp 100 105: Ser Ser Asn 110 Pro

Gly Thr Trp Thr Asp Glu Ser Arg Bis Pro Asp Thr Gln Leu Asn Tyr 115 120 125

Ala Asn Glu Phe Asp Leu Asn Ile Lys Gly Trp Leu Leu Asn Glu Pro 130 135 140

Asn Tyr Arg Leu Gly Leu Met Ala Gly Tyr Gln Glu Ser Arg Tyr Ser 145 150 155 160

Phe Thr Ala Arg Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Ser Ser Glu Glu Gly Phe 165 170 175

Arg Asp Asp Ile Gly Ser Phe Pro Asn Gly Glu Arg Ala Ile Gly Tyr 180 185 190

Lys Gln Arg Phe Lys Met Pro Tyr Ile Gly Leu Thr Gly Ser Tyr Arg 195 200 205

Tyr Glu Asp Phe Glu Leu Gly Gly Thr Phe Lys Tyr Ser Gly Trp Val 210 215 220

Glu Ser Ser Asp Asn Ala Glu Ala Tyr Asp Pro Gly Lys Arg Ile Thr 225 230 235 240

Tyr Arg Ser Lys Val Lys Asp Gln Asn Tyr Tyr Ser Val Ala Val Asn 245 250 255

Ala Gly Tyr Tyr ValThr Pro Asn Ala Lys Val Tyr Val Glu G1y Ala 260 265 270

Trp Asn Arg Val Thr Asn Lys Lys Gly Asn Thr Ser Leu Tyr Asp Bis 275 280 285

Asn Asn Asn Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Asn Gly Ala Gly Ile Glu Asn 290 295 300

Tyr Asn Phe Ile Thr Thr Ala Gly Leu Lys Tyr Thr Phe 305 310 315

<210> 25

<211> 954 5 <212>AON

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia OmpT mutada 10

<400> 25

attcgggcga aacttctggg aatagtcctg acaaccccta ttgcgatcag ctcttttgct 60 tctaccgaga ctttatcgtt tactcctgac aacataaatg cggacattag tcttggaact 120 ctgagcggaa aaacaaaaga gcgtgtttat ctagccgaag aaggaggccg aaaagtcagt 160 caactcgact ggaaattcaa taacgctgca attattaaag gtgcaattaa ttgggatttg 240 atgccccaga tatctatcgg ggctgctggc tggacaactc tcggcagccg aggtggcaat 300 atggtcgatc aggactggat ggattccagt aaccccggaa cctggacgga tgaaagtaga 360 caccctgata cacaactcaa ttatgccaac gaatttgatc tgaatatcaa aggctggctc 420 ctcaacgaac ccaattaccg cctgggactc atggccggat atcaggaaag ccgttatagc 480 tttacagcca gaggtggttc ctatatctac agttctgagg agggattcag agatgatatc 540 ggctccttcc cgaatggaga aagagcaatc ggctacaaac aacgttttaa aatgccctac 600 attggcttga ctggaagtta tcgttatgaa gattttgaac tcggtggcac atttaaatac 660 agcggctggg tggaatcatc tgataacgat gaacactatg acccgggaaa aagaatcact 720 tatcgcagta aggtcaaaga ccaaaattac tattctgttg cagtcaatgc aggttattac 780 gtcacaccta acgcaaaagt ttatgttgaa ggcgcatgga atcgggttac gaataaaaaa 640 ggtaatactt cactttatga tcacaataat aacacttcag actacagcaa aaatggagca 900 ggtatagaaa actataactt catcactact gctggtctta agtacacatt ttaa 954

<210> 26

<211> 5 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial:hTNF40 CDRH1 10

<400> 26

Asp Tyr Gly Met Asn 1 5

15 <210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial 20 <220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial:hTNF40 CDRH2 hfbrida humana

<400> 27

Trp I1e Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro 25 1 5

Gly

<210> 28 30 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys 10 15

35 <223> Descripción de la Secuencia Artificial:hTNF40 CDRH3 15

<400> 28

Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial:hTNF40 CDRL 1

<400> 29

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 1 5 10

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial:hTNF40 CDRL2

<400> 30

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial:hTNF40 CDRL3

<400> 31

Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu Thr 1 5

<210> 32

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción of Secuencia Artificial:hTNF40 CDRH2

<400> 32

Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Val Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 33

<211> 84

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Adaptador oligonucleótido OmpA

<400> 33

tcgagttcta gataacgagg cgtaaa~aat gaaaaagaca gctatcgcaa ttgcagtggc 60

I

cttggctctg acgtacgagt cagg 84

<210> 34

<211> 67

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> casete-1 IGS

<400> 34 gagctcacca gtaacaaaaa gttttaatag aggagagtgt taatgaagaa gactgctata 60 gcaattg 67

<210> 35

<211> 69

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> casete-2 IGS

<400> 35 gagctcacca gtaacaaaaa gttttaatag aggggagtgt taaaatgaag aagactgcta 60 tagcaattg 69

<210> 36 <211>81

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> casete-3 IGS

<400> 36

gagctcacca gtaacaaaaa gctttaatag aggagagtgt tgaggaggaa aaaaaaatga 60 agaaaactgc tatagcaatt g 81

<210> 37

<211> 81

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> casete-4 IGS

<400> 37 gagctcacca gtaacaaaaa gttttaatag aggagagtgt tgacgaggat tatataatga 60 agaaaactgc tatagcaatt g 81

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Una célula bacteriana Gram negativa recombinante que comprende un gen spr mutante, que codifica una proteína spr UniprotKB/SwissProt POAFV4, que tiene una mutación en uno o más aminoácidos seleccionada de N31Y, R62C, 170T, 073R, C94A, S95F, V98E, 099P, R100G, L 108S, Y115F, D133A, V135D, V135G, L 136P, G140C, R144C, H145A, G147C y H157A, yen donde la célula tiene actividad reducida de la proteína Tsp, proteasa específica de la cola, comparada con una célula de tipo natural.
2.-Una célula según la reivindicación 1, en donde el gen spr mutante codifica una proteína spr que tiene las mutaciones S95F y Y115F.
3.-Una célula según las reivindicaciones 1 o 2, en donde la célula comprende además uno o más de los siguientes genes mutados:

a) un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad de chaperona y actividad reducida de proteasa;

b) un gen ptr mutado, en donde el gen ptr codifica una proteína proteasa 111 que tiene actividad reducida de proteasa

o es un gen ptr mutado inactivado; y

c) un gen OmpT mutado, en donde el gen OmpT mutado codifica una proteína OmpT que tiene actividad reducida de proteasa o es un gen OmpT mutado inactivado.
4.-Una célula según la reivindicación 1, 2 o 3, en donde la célula Comprende un gen Tsp mutado, proteasa específica de la cola, que codifica una proteína Tsp que tiene actividad reducida de proteasa o es un gen Tsp

mutado inactivado.
5.-Una célula según la reivindicación 4, en donde el genoma de la célula es isogénico con una célula bacteriana de tipo natural excepto por el gen spr mutado y el gen Tsp mutado.
6.-Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el célula tiene un gen Tsp mutado inactivado, que comprende una mutación en el codón de inicio del gen y/o uno o más codones de parada situados en la dirección 3' del codón de inicio del gen y en la dirección 5' del codón de parada del gen.
7.-Una célula según la reivindicación 6, en donde el gen Tsp mutado inactivado comprende un sitio de restricción marcador creado por una mutación de aminoácido en el codón de inicio del gen y opcionalmente una o más mutaciones puntuales.
8.-Una célula según la reivindicación 7, en donde el gen Tsp mutado inactivado comprende la SEO ID NO: 3.
9.-Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la célula es E. coli.
10.-Una célula según cualquier reivindicación precedente, en donde la célula comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína de interés.
11.-Una célula según la reivindicación 10, en donde la proteína de interés es un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo.
12.-Una célula según la reivindicación 11, en donde el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es especifico para el TNF.
13.-Un método para producir una proteína de interés que comprende cultivar una célula bacteriana Gram negativa recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en un medio de cultivo en condiciones eficaces para expresar la proteína recombinante de interés y recuperar la proteína recombinante de interés del periplasma de la célula bacteriana Gram negativa recombinante y/o del medio de cultivo.
14.-Un método según la reivindicación 13, en donde el método comprende además recuperar la proteína de interés de la célula.
15.-Un método según la reivindicación 14, en donde la proteína de interés se recupera del periplasma y/o del líquido sobrenadante.