ES2704425T3 - Célula anfitriona bacteriana recombinante para la expresión de proteínas - Google Patents

Abstract

Una célula bacteriana gram negativa recombinante que comprende: a. un gen spr mutante que codifica una proteína spr que tiene una mutación en uno o más aminoácidos seleccionados entre D133, H145, H157, N31, R62, 170, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, V135, L136, G140, R144 y G147 y b. un vector de expresión que comprende un gen que expresa o expresa en exceso una o más proteínas capaces de facilitar el plegamiento de proteínas seleccionadas entre FkpA, Skp o una combinación de FkpA y Skp, en donde la célula tiene una actividad de proteína Tsp reducida en comparación con una célula de tipo salvaje y en donde la célula no comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC y en donde la célula bacteriana es isogénica con respecto a una célula de E. coli de tipo salvaje, excepto por el gen spr mutado y la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje.

Description

DESCRIPCIÓN

Célula anfitriona bacteriana recombinante para la expresión de proteínas

La invención se refiere a una célula anfitriona bacteriana recombinante, concretamente E. coli. La invención también se refiere a un método para producir una proteína de interés en tal célula.

Antecedentes de la invención

Las células bacterianas, tales como E. coli, se utilizan comúnmente para producir proteínas recombinantes. Hay muchas ventajas en el uso de células bacterianas, tales como E. coli, para producir proteínas recombinantes, particularmente debido a la naturaleza versátil de las células bacterianas como células anfitrionas que permiten la inserción de genes a través de plásmidos. E. coli se han utilizado para producir muchas proteínas recombinantes, incluyendo insulina humana.

A pesar de las muchas ventajas de utilizar células bacterianas para producir proteínas recombinantes, todavía existen limitaciones significativas, incluida la dificultad de producir proteínas sensibles a la proteasa. Las proteasas desempeñan un papel importante en el recambio de proteínas viejas, dañadas o mal plegadas en el periplasma y el citoplasma de E. coli. Las proteasas bacterianas actúan degradando la proteína recombinante de interés, lo que a menudo reduce significativamente el rendimiento de la proteína activa.

Se han identificado varias proteasas bacterianas. En E. coli se han identificado proteasas que incluyen proteasa III (ptr), DegP, OmpT, Tsp, prlC, ptrA, ptrB, pepA-T, tsh, espc, eatA, clpP y Ion.

Tsp (también conocida como Prc) es una proteasa periplásmica de 60 kDa. El primer sustrato conocido de Tsp fue la proteína de unión a penicilina 3 (PBP3) (Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli; Nagasawa H, Sakagami Y, Suzuki A, Suzuki H, Hara H, Hirota Y. J Bacteriol. 1989 Nov;171(11):5890-3 y Cloning, mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3; Hara H, Yamamoto Y, Higashitani A, Suzuki H, Nishimura Y. J Bacteriol. 1991 Aug;173 (15):4799-813) pero más tarde se descubrió que la Tsp también era capaz de escindir las proteínas de la cola del fago y, por lo tanto, se le cambió el nombre a Proteasa Específica de la Cola (Tsp) (Silber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 295-299 (1992)). Silber et al. (Deletion of the prc(tsp) gene provides evidence for additional tail-specific proteolytic activity in Escherichia coli K-12; Silber, K.R., Sauer, R.T.; Mol Gen Genet 1994 242:237-240) describen una cepa de deleción de prc (KS1000) en donde la mutación se creó reemplazando un segmento del gen prc por un fragmento que comprende un marcador Kanr.

La reducción de la actividad de Tsp (prc) es deseable para reducir la proteólisis de las proteínas de interés. Sin embargo, se encontró que las células que carecen de proteasa prc muestran un crecimiento termosensible a baja osmolaridad. Hara et al. aislaron reversores termorresistentes que contenían mutaciones supresoras extragénicas (spr) (Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996)). Spr es una proteasa periplásmica unida a membrana de 18 kDa y los sustratos de spr son Tsp y peptidoglicanos en la membrana externa implicados en la hidrólisis de la pared celular durante la división celular. El gen spr se denomina UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4 (SPR_ECOLI). Se han descrito cepas mejoradas deficientes en proteasa que comprenden un gen spr mutante. Chen et al describen la construcción de cepas de E. coli que portan diferentes combinaciones de mutaciones en prc (Tsp) y otra proteasa, DegP, creadas amplificando las regiones aguas arriba y aguas abajo del gen y ligando estas entre sí en un vector que comprende marcadores de selección y una mutación sprW174R (la acumulación de alto nivel de un fragmento de anticuerpo recombinante en el periplasma de Escherichia coli requiere una cepa anfitriona triple mutante (ADegP Aprc sprW174R) (Chen C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Andersen DC, Battersby JE, Campeón KM. Biotechnol Bioeng. 5 de marzo de 2004; 85(5):463-74). Se encontró que la combinación de las mutaciones ADegP, Aprc y sprW174R proporcionaba los niveles más altos de cadena ligera de anticuerpo, cadena pesada de anticuerpo y F(ab')2-LZ. El documento EP1341899 describe una cepa de E. coli que es deficiente en DegP y prc cromosómicos que codifican las proteasas DegP y Prc, respectivamente, y alberga un gen spr mutante que codifica una proteína que suprime los fenotipos de crecimiento exhibidos por las cepas que albergan mutantes de prc.

Otras cepas mejoradas deficientes en proteasas que contienen mutaciones en Tsp y spr se han descrito en el documento WO2011/086136, yen el documento WO 2012/013930.

Las cepas descritas en el documento WO02/48376 son lac y no puede crecer en cultivos donde se emplee timidina, fucosa o maltosa como fuente de carbono. Esto puede ser una grave desventaja para las cepas destinadas a su uso a escala comercial. Puede haber desventajas adicionales asociadas con las cepas, por ejemplo, la falta de producción de fosfatasa alcalina. Esta última es una proteína periplásmica implicada en la utilización de fosfato de los medios de cultivo.

Ciertas proteínas exhiben actividad peptidil-prolil isomerasa y/o isomerasa y/o actividad chaperona y se ha encontrado que proporcionan propiedades ventajosas cuando se emplean en líneas celulares empleadas para la expresión de proteínas recombinantes.

La presente invención proporciona nuevas cepas bacterianas que portan mutaciones tanto Tsp como spr y al menos un gen que codifica una proteína o proteínas capaces de facilitar el plegamiento de proteínas que proporcionan medios ventajosos para producir proteínas recombinantes.

Compendio de la invención

En la presente memoria se describe una célula bacteriana gram negativa recombinante que comprende:

a. un gen spr mutante que codifica una proteína spr que tiene una mutación en uno o más aminoácidos seleccionados entre D133, H145, H157, N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, V135, L136, G140, R144 y G147 y

b. un gen o genes capaces de expresar o expresar en exceso una o más proteínas capaces de facilitar el plegamiento de proteínas, tales como FkpA, Skp, SurA, PPiAy PPiD

en donde la célula ha reducido la actividad de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje.

Adicionalmente se describe una célula bacteriana gram negativa recombinante que codifica:

a. un gen spr mutante que codifica una proteína spr que tiene una mutación en uno o más aminoácidos seleccionados entre D133, H145, H157, N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, V135, L136 , G140, R144 y G147,

b. un gen o genes capaces de expresar o expresar en exceso una o más proteínas capaces de facilitar el plegamiento de proteínas, tales como FkpA, Skp, SurA, PPiAy PPiD,

c. un gen capaz de expresar una proteína de interés, por ejemplo un anticuerpo o fragmento de unión del mismo

en donde la célula ha reducido la actividad de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje y el resto del ADN genómico celular es isogénico con respecto a la célula de tipo salvaje de la que se obtuvo la célula recombinante.

En un caso, el genoma de la célula es isogénico con respecto a una célula bacteriana de tipo salvaje, excepto para el gen spr mutado, la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje y el gen o genes que expresan una proteína capaz de facilitar el plegamiento de la proteína. En la presente memoria se describe adicionalmente una célula bacteriana gram negativa recombinante que tiene una actividad reducida de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje y que comprende un gen spr mutante que codifica una proteína spr, en donde el genoma de la célula es isogénico con respecto a una célula bacteriana de tipo salvaje, excepto para la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje, el gen spr mutado y el gen o genes introducidos para expresar una proteína capaz de facilitar el plegamiento de la proteína.

Las células descritas en la presente memoria muestran ventajosos fenotipos de producción de proteínas y crecimiento.

Adicionalmente, se describe en la presente memoria un método para producir una proteína de interés que comprende expresar la proteína de interés en una célula bacteriana gram negativa recombinante como se define anteriormente.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 muestra los resultados de las fermentaciones en la escala de 5 L realizadas con varias combinaciones de células anfitrionas y "chaperona". W3110 es una cepa de E. coli de tipo salvaje. Las diversas combinaciones fueron: tipo salvaje sin chaperona; tipo salvaje con FkpA y Skp; spr mutante MXE016 y A Tsp como se publicó en el documento WO2011/086l36; MXE016 y FkpA; MXE016 y Skp; MXE016 y FkpA y Skp; MXE017 descrito en el documento WO2011/086136; MXE017 y FkpA y Skp

Figura 2 muestra los resultados de los experimentos de variación de la velocidad de alimentación a velocidades de alimentación posteriores a la inducción de 5,4, 6,0 y 7,0 g/h, para MXE016, la mayoría del Fab' adicional obtenido a velocidades de alimentación más altas se perdió en el sobrenadante.

Figuras 3A, B muestran la viabilidad celular (3A) y los títulos de Fab' (3B) para MXE016 /- FkpA.

Figura 4 muestra los datos de recuperación primarios para la producción a escala piloto de 20 L.

Figura 5 muestra la recuperación primaria en gel teñido con SDS-PAGE en condiciones no reductoras de una producción a escala piloto de 20 L. Aparte de las bandas relacionadas con FkpA, el perfil de la proteína parece muy similar entre las dos cepas.

Figura 6 muestra una transferencia Western de etiqueta de His en condiciones no reductoras para un procedimiento a escala piloto de 20 L. Se detectó FkpA completa y correspondía a la banda de aprox. 30 kDa y no se detectó ninguna señal en MXE016 sola como se esperaba.

Figura 7A-C muestra diversas mutaciones en diversos genes.

Figura 7D muestra una representación esquemática de la creación de un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una cadena ligera de un anticuerpo (LC), una cadena pesada de un anticuerpo (HC), una secuencia de polinucleótidos FkpA y/o un polinucleótido Skp Figura 8 Muestra varias secuencias de polinucleótidos y aminoácidos.

Breve descripción de las secuencias

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ADN del gen Tsp de tipo salvaje que incluye los 6 nucleótidos ATGAAC aguas arriba del codón de inicio.

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de la proteína Tsp de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 3 es la secuencia de ADN de un gen Tsp desactivado mutado que incluye los 6 nucleótidos ATGAAT aguas arriba del codón de inicio.

SEQ ID NO: 4 es la secuencia de ADN del gen de la proteasa III de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos de la proteína Proteasa III de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 6 es la secuencia de ADN de un gen de proteasa III desactivado mutado.

SEQ ID NO: 7 es la secuencia de ADN del gen DegP de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos de la proteína DegP de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 9 es la secuencia de ADN de un gen DegP mutado.

SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos de una proteína DegP mutada.

SEQ ID NO: 11 es la secuencia del cebador oligonucleotídico 5' para la región del gen DegP mutado que comprende el sitio de restricción AseI.

SEQ ID NO: 12 es la secuencia del cebador oligonucleotídico 3' para la región del gen DegP mutado que comprende el sitio de restricción AseI.

SEQ ID NO: 13 es la secuencia del cebador oligonucleotídico 5' para la región del gen Tsp mutado que comprende el sitio de restricción AseI.

SEQ ID NO: 14 es la secuencia del cebador oligonucleotídico 3' para la región del gen de la proteasa III mutado que comprende el sitio de restricción AseI.

SEQ ID NO: 15 es la secuencia del cebador oligonucleotídico 5' para la región del gen de la proteasa III mutado que comprende el sitio de restricción AseI.

SEQ ID NO: 16 es la secuencia del cebador oligonucleotídico 3' para la región del gen Tsp mutado que comprende el sitio de restricción AseI.

SEQ ID NO: 17 es la secuencia de ADN del gen spr de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 18 es la secuencia del gen spr de tipo salvaje que incluye la secuencia señal que consiste en los primeros 26 residuos de aminoácido.

SEQ ID NO: 19 es la secuencia del gen spr no mutado sin la secuencia de señal.

SEQ ID NO: 20 es la secuencia de nucleótidos de una secuencia OmpT mutada que comprende mutaciones D210A y H212A.

SEQ ID NO: 21 es la secuencia de aminoácidos de una secuencia OmpT mutada que comprende mutaciones D210A y H212A.

SEQ ID NO: 22 es la secuencia de nucleótidos de una secuencia OmpT desactivada mutada.

SEQ ID NO: 23 muestra la secuencia del adaptador oligonucleotídico OmpA.

SEQ ID NO: 24 muestra el casete de oligonucleótidos que codifica la secuencia intergénica 1 (IGS1) para la expresión de Fab en E. coli.

SEQ ID NO: 25 muestra el casete de oligonucleótidos que codifica la secuencia intergénica 2 (IGS2) para la expresión de Fab en E. coli.

SEQ ID NO: 26 muestra el casete de oligonucleótidos que codifica la secuencia intergénica 3 (IGS3) para la expresión de Fab en E. coli.

SEQ ID NO: 27 muestra el casete de oligonucleótidos que codifica la secuencia intergénica 4 (IGS4) para la expresión de Fab en E. coli.

SEQ ID NO: 28 es la secuencia de ADN del gen FkpA de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 29 es la secuencia de proteínas del gen FkpA de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 30 es la secuencia de ADN del gen FkpA etiquetado con his.

SEQ ID NO: 31 es la secuencia de proteínas del gen FkpA etiquetado con his.

SEQ ID NO: 32 es la secuencia de ADN del gen skp de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 33 es la secuencia de proteínas del gen skp de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 34 es la secuencia de ADN del gen skp etiquetado con his.

SEQ ID NO: 35 es la secuencia de proteínas del gen skp etiquetado con his.

SEQ ID NO: 36 a 74 muestran varias secuencias de aminoácidos y ADN de anticuerpos contra FcRn o fragmentos de los mismos, que son adecuados para la expresión en la línea celular de la presente invención. En particular, SEQ ID NO: 50 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-FcRn de cadena ligera 1519gH20 y SEQ ID NO: 58 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-FcRn de cadena pesada 1519gH20.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención

Los autores de la presente invención han proporcionado células bacterianas gram negativas recombinantes mejoradas adecuadas para expresar una proteína recombinante de interés.

En una realización, la proteína es un anticuerpo o fragmento de unión del mismo, en particular un anticuerpo terapéutico.

En particular, los autores de la presente invención han proporcionado células bacterianas gram negativas recombinantes mejoradas adecuadas para expresar una proteína recombinante de interés incorporando uno o más genes, que codifican una proteína para facilitar el plegamiento de proteínas, en células bacterianas gram negativas que portan un gen Tsp mutado y un gen spr mutado.

En una realización, el gen o los genes, que codifican la proteína para facilitar el plegamiento de la proteína, se integran en el genoma de las células, por ejemplo para proporcionar una línea celular estable. En una realización, una proteína recombinante para su expresión (tal como una proteína terapéutica) se transfecta a una línea celular estable para proporcionar la expresión de la proteína recombinante deseada.

En una realización, el gen o los genes, que codifican una proteína para facilitar el plegamiento de proteínas, se proporcionan en uno o más plásmidos, por ejemplo, los plásmidos se transfectan transitoriamente a una célula para proporcionar una línea celular de la presente descripción.

En una realización, el gen o los genes, que codifican una proteína para facilitar el plegamiento de proteínas, se proporcionan en un plásmido que también contiene la secuencia codificante para una proteína recombinante de interés.

En una realización, el gen o los genes, que codifican una proteína para facilitar el plegamiento de proteínas, se proporcionan en un plásmido que no contiene la secuencia codificante para una proteína recombinante de interés. En una realización, la invención proporciona nuevas cepas que tienen un fenotipo de crecimiento celular mejorado en comparación con células bacterianas de tipo salvaje y células que portan solo un gen Tsp mutado o un gen Tsp mutado y un gen spr mutado.

Las células de la presente invención poseen muchas ventajas. Los autores de la presente invención han encontrado sorprendentemente que las células de acuerdo con la presente descripción pueden exhibir una mayor viabilidad celular en comparación con una célula de tipo salvaje o una célula que comprende un gen Tsp mutado y un gen spr mutado.

La viabilidad celular tiene una particular importancia en términos prácticos porque las células que no son viables tienden a lisar y crear residuos de ADN en el cultivo. Estos residuos de ADN aumentan la dificultad, el coste y el gasto de purificar la proteína deseada. Por lo tanto, minimizar los residuos de ADN de las células no viables lisadas es un problema importante en la fabricación de proteínas recombinantes de manera eficaz, véase por ejemplo el documento US 6.258.560.

La viabilidad celular se puede medir mediante una cualquiera de varias técnicas de rutina, por ejemplo, empleando un colorante fluorescente y un análisis FACS o similar.

Específicamente, las células de acuerdo con la descripción generalmente exhiben un fenotipo de lisis celular reducida en comparación con las células que portan un gen Tsp mutado y un gen spr mutado.

Además, las nuevas cepas pueden reducir la pérdida de proteínas de las células y permitir una acumulación periplásmica prolongada en comparación con las células que portan un gen Tsp mutado y un gen spr mutado. Esto es particularmente importante porque, por ejemplo, cuando los niveles de expresión totales de la proteína diana son similares pero se acumula más proteína en el periplasma o se acumula menos proteína en el sobrenadante porque la cepa es menos permeable que las células con estas propiedades menos permeables, generalmente serán más adecuadas para la producción a escala de planta puesto que facilitan la recuperación de proteínas.

Adicionalmente, las células de acuerdo con la presente descripción pueden mostrar un mayor rendimiento de una proteína de interés en comparación con una célula bacteriana de tipo salvaje o una célula que comprende un gen Tsp mutado y un gen spr mutado en ausencia de un gen o genes que codifican una proteína tal como FkpA. El rendimiento de proteína mejorado puede ser el rendimiento de proteína periplásmica y/o el rendimiento de proteína sobrenadante. En una realización, las células de la presente invención muestran un rendimiento mejorado de la proteína periplásmica en comparación con una célula que porta un gen Tsp mutado y un gen spr mutado debido a una filtración reducida de la célula.

Las células bacterianas recombinantes pueden ser susceptibles de una mayor velocidad de producción de una proteína de interés y, por lo tanto, la misma cantidad de una proteína de interés se puede producir en un tiempo más corto en comparación con una célula bacteriana de tipo salvaje o una célula que comprende un gen Tsp mutado y un gen spr mutado. La mayor velocidad de producción de una proteína de interés puede ser especialmente significativa durante el período inicial de crecimiento de la célula, por ejemplo durante las primeras 5, 10, 20 o 30 horas después de la inducción de la expresión de proteínas.

Las células de acuerdo con la presente invención expresan preferiblemente un rendimiento máximo en el periplasma y/o medio de aproximadamente 1,0 g/l, 1,5 g/l, 1,8 g/l, 2,0 g/l, 2,4 g/l, 2,5 g/l, 3,0 g/L, 3,5 g/L o 4,0 g/L de una proteína de interés.

Además, la expresión de una proteína o proteínas que facilitan el plegamiento optimiza adicionalmente la expresión al maximizar la proteína proporcionada con un plegamiento adecuado. El experto en la técnica es consciente de que el plegamiento apropiado es esencial para la función biológica y, por lo tanto, el aislamiento de la proteína con el plegamiento deseado es de vital importancia. Esto es particularmente importante cuando la proteína se expresa en una célula gram negativa puesto que la proteína expresada no será natural para la célula y, por lo tanto, la célula puede no expresar automáticamente la proteína con el plegamiento adecuado. El plegamiento inadecuado puede expresarse en forma de agregación u otras impurezas. El aislamiento de la proteína deseada puede requerir una purificación extensa, lo que tiene implicaciones de coste y también puede dar como resultado un bajo rendimiento de la proteína deseada. Maximizar la cantidad de proteína plegada correctamente expresada minimiza la cantidad de purificación requerida y puede optimizar el rendimiento utilizable y, por lo tanto, es ventajoso.

Las ventajas asociadas con la expresión de una proteína que facilita el plegamiento incluyen uno o más de los siguientes: Título más alto (p.ej., aumentado a aproximadamente 1,05 g/L en comparación con 0,5 g/L del tipo salvaje); Mayor viabilidad en la cosecha (p.ej., >95%); Mayor título con mayor velocidad de alimentación (mejores perspectivas para el desarrollo del procedimiento); Títulos más altos a escalas de producción comercial, tales como una escala de 20 litros y una mayor viabilidad en la cosecha; y Un aclarado más fácil del extracto, en particular a una escala de 20 L.

Las células proporcionadas por la presente invención tienen una actividad proteasa reducida de Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje, lo que puede reducir la proteólisis de una proteína de interés, particularmente proteínas de interés que son proteolíticamente sensibles a Tsp. Por lo tanto, las células proporcionadas por la presente invención pueden proporcionar un mayor rendimiento de las proteínas intactas, preferiblemente de la proteína de interés y un rendimiento más bajo, o preferiblemente ningún fragmento proteolítico de proteínas, preferiblemente de la proteína de interés, en comparación con una célula bacteriana de tipo salvaje.

En la presente memoria se describen células que portan solo las mutaciones mínimas del genoma requeridas para introducir las modificaciones de acuerdo con la presente descripción. La célula bacteriana puede diferir solo de una célula bacteriana de tipo salvaje en una o más mutaciones del gen spr y la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje debido a que, por ejemplo, el gen o los genes que codifican una proteína para facilitar el plegamiento de proteínas puede introducirse transitoriamente en la célula, tal como en un plásmido. Las células descritas en la presente memoria no portan ninguna otra mutación que pueda tener efectos perjudiciales sobre el crecimiento de la célula y/o su capacidad para expresar una proteína de interés.

Por consiguiente, una o más de las células anfitrionas recombinantes descritas en la presente memoria pueden exhibir una expresión de proteína mejorada y/o características de crecimiento mejoradas en comparación con las células que comprenden mutaciones realizadas mediante ingeniería genética adicionales de la secuencia genómica. Las células descritas en la presente memoria también son más adecuadas para su uso para producir proteínas terapéuticas en comparación con células que comprenden alteraciones adicionales en el genoma celular.

El experto en la técnica podría fácilmente someter a prueba un clon de célula candidato para ver si tiene el rendimiento deseado de una proteína de interés utilizando métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo un método de fermentación, ELISA y HPLC con proteína G. Los métodos de fermentación adecuados son descritos por Humphreys D P, et al. (1997). en Formation of dimeric Fabs in E. coli: effect of hinge size and isotype, presence of interchain disulphide bond, Fab' expression levels, tail piece sequences and growth conditions. J. IMMUNOL. METH.

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La presente invención se describirá ahora con más detalle.

Los términos "proteína" y "polipéptido" se utilizan indistintamente en la presente memoria, a menos que el contexto indique lo contrario. Se pretende que "Péptido" se refiera a 10 aminoácidos o menos.

El término "polinucleótido" incluye un gen, ADN, ADNc, ARN, ARNm, etc., a menos que el contexto indique lo contrario.

'Actividad reducida', como se emplea en la presente memoria, se refiere a 'niveles más bajos de actividad enzimática, tal como la actividad enzimática de Tsp en comparación con la actividad enzimática correspondiente en una cepa de tipo salvaje cuando se mide en condiciones comparables en un ensayo adecuado. En una realización, la actividad reducida es 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos o 5% o menos de la actividad enzimática de un comparador de tipo salvaje. En una realización, el análisis para determinar los niveles de actividad enzimática se realiza concomitantemente cuando los resultados se van a emplear en una comparación directa.

Comparación directa, como se emplea en la presente memoria, se refiere al lugar donde se compara el valor numérico de dos o más resultados con el propósito de evaluar si hay una actividad reducida como se define en la presente memoria o clasificar los resultados de actividad obtenidos de un ensayo.

Como se emplea en la presente memoria, el término "que comprende" en el contexto de la presente memoria descriptiva debe interpretarse como "que incluye".

Célula de tipo salvaje, como se emplea en la presente memoria, se emplea indistintamente con una célula no mutada o una célula de control.

La célula no mutada o la célula de control en el contexto de la presente invención significan una célula del mismo tipo que la célula gram negativa recombinante de la invención en donde la célula no ha sido modificada para portar la actividad de la proteína Tsp reducida anteriormente y para portar el gen spr mutante. Por ejemplo, una célula no mutada puede ser una célula de tipo salvaje y se puede obtener de la misma población de células anfitrionas que las células de la invención antes de la modificación para introducir cualquier mutación.

Las expresiones "célula", "línea celular", "cultivo celular" y "cepa" se utilizan indistintamente.

La expresión "fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado" en el contexto de la presente invención significa el fenotipo mostrado por una célula que tiene un gen Tsp mutante. Normalmente, las células que comprenden un gen Tsp mutante se pueden lisar, especialmente a altas densidades celulares. La lisis de estas células hace que cualquier proteína recombinante se filtre al sobrenadante. Las células que portan el gen Tsp mutado también pueden mostrar un crecimiento termosensible a baja osmolaridad. Por ejemplo, las células no presentan una tasa de crecimiento reducida o nula o las células mueren en medios hipotónicos a alta temperatura, tal como a 40°C o más.

El término "isogénico" en el contexto de la presente invención significa que el genoma de la célula de la presente invención tiene sustancialmente la misma o la misma secuencia genómica en comparación con la célula de tipo salvaje a partir de la que se obtiene la célula, excepto por un gen spr mutado y la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje. En esta realización, el genoma de la célula no comprende otras mutaciones no naturales o realizadas mediante ingeniería genética. En una realización, la célula de acuerdo con la presente invención puede tener sustancialmente la misma secuencia genómica en comparación con la célula de tipo salvaje, excepto por el gen spr mutado y la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje, teniendo en cuenta cualquier mutación natural que se pueda producir. En una realización, la célula según la presente invención puede tener exactamente la misma secuencia genómica en comparación con la célula de tipo salvaje, excepto por el gen spr mutado y la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje.

El término "tipo salvaje" en el contexto de la presente invención significa una cepa de una célula bacteriana gram negativa como puede aparecer en la naturaleza o se puede aislar del medio ambiente, que no porta ninguna mutación realizada mediante ingeniería genética. Un ejemplo de una cepa de tipo salvaje de E. coli es W3110, tal como la cepa W3110 K-12.

Se puede utilizar cualquier bacteria gram negativa adecuada como célula parental para producir la célula recombinante de la presente invención. Las bacterias gram negativas adecuadas incluyen Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens, Erwinia carotovora, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii y E. coli. Preferiblemente la célula parental es E. coli. En la presente invención se puede utilizar cualquier cepa adecuada de E. coli pero preferiblemente se utiliza una cepa W3110 de tipo salvaje, tal como K-12 W3110.

Un inconveniente asociado con las cepas bacterianas deficientes en proteasas creadas previamente y utilizadas para expresar proteínas recombinantes es que comprenden mutaciones adicionales de genes implicados en el metabolismo celular y la replicación del ADN tales como, por ejemplo, phoA, fhuA, lac, rec, gal, ara, arg, thi y pro en cepas de E. coli. Estas mutaciones pueden tener muchos efectos perjudiciales sobre la célula anfitriona, incluyendo los efectos sobre el crecimiento celular, la estabilidad, el rendimiento de la expresión de proteínas recombinantes y la toxicidad. Las cepas que tienen una o más de estas mutaciones genómicas, particularmente las que tienen un alto número de estas mutaciones, pueden exhibir una pérdida de adaptabilidad que reduce la tasa de crecimiento bacteriano a un nivel que no es adecuado para la producción industrial de proteínas. Adicionalmente, cualquiera de las mutaciones genómicas anteriores puede afectar a otros genes en cis y/o en trans en formas dañinas impredecibles, lo que altera el fenotipo de la cepa, la adaptabilidad y el perfil de proteínas. Adicionalmente, el uso de células altamente mutadas no es generalmente adecuado para producir proteínas recombinantes para uso comercial, particularmente terapéuticas, porque tales cepas generalmente tienen vías metabólicas defectuosas y, por lo tanto, pueden crecer poco o nada en medios mínimos o químicamente definidos.

En una realización, una célula de acuerdo con la presente invención es isogénica con respecto a una célula bacteriana de tipo salvaje, excepto por el gen spr mutado y la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje. Solo se realizan mutaciones mínimas en el genoma de la célula para introducir las mutaciones. Las células no portan ninguna otra mutación que pueda tener efectos perjudiciales sobre el crecimiento de la célula y/o la capacidad de expresar una proteína de interés. Por consiguiente, una o más de las células anfitrionas recombinantes de la presente invención pueden exhibir una expresión de proteína mejorada y/o características de crecimiento mejoradas en comparación con las células que comprenden otras mutaciones realizadas mediante ingeniería genética en la secuencia genómica. Las células proporcionadas por la presente invención también son más adecuadas para su uso en la producción de proteínas terapéuticas en comparación con células que comprenden alteraciones adicionales en el genoma celular.

En una realización preferida, la célula es isogénica con respecto a una célula de E. coli de tipo salvaje, tal como la cepa W3110, excepto por el gen spr mutado y la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje.

La célula de la presente invención puede diferir adicionalmente de una célula de tipo salvaje al comprender un polinucleótido que codifica la proteína de interés. La secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína de interés puede ser exógena o endógena. El polinucleótido que codifica la proteína de interés puede estar contenido dentro de un vector de expresión adecuado transformado en la célula y/o integrado en el genoma de la célula anfitriona. En la realización donde el polinucleótido que codifica la proteína de interés se inserta en el genoma del anfitrión, la célula de la presente invención también se diferenciará de una célula de tipo salvaje debido a la secuencia de polinucleótido insertada que codifica la proteína de interés. Preferiblemente, el polinucleótido está en un vector de expresión en la célula, causando así una interrupción mínima del genoma de la célula anfitriona.

La proteína spr es una proteasa periplásmica unida a membrana de E. coli.

La secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de la proteína spr se muestra en SEQ ID NO: 21 con la secuencia señal en el extremo N y en SEQ ID NO: 22 sin la secuencia señal de 26 aminoácidos (según el Número de Acceso UniProt P0AFV4). La numeración de aminoácidos de la secuencia de la proteína spr en la presente invención incluye la secuencia señal. Por consiguiente, el aminoácido 1 de la proteína spr es el primer aminoácido (Met) que se muestra en SEQ ID NO: 21.

El gen spr mutado es el gen spr cromosómico de la célula.

El gen spr mutado codifica una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende adicionalmente un gen Tsp mutado. Las células que portan un gen Tsp mutado pueden tener una buena tasa de crecimiento celular, pero una limitación de estas células es su tendencia a la lisis, especialmente a altas densidades celulares. Por consiguiente, el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado es una tendencia a la lisis, especialmente a altas densidades celulares. Las células que portan un gen Tsp mutado también muestran un crecimiento termosensible a baja osmolaridad. Sin embargo, las mutaciones spr portadas por las células de la presente invención, cuando se introducen en una célula que tiene actividad reducida de Tsp, suprimen el fenotipo de Tsp reducido y, por lo tanto, la célula presenta una lisis reducida, particularmente a una densidad celular alta. El fenotipo de crecimiento de una célula puede ser medido fácilmente por un experto en la técnica durante un procedimiento en matraz de agitación o de fermentación de alta densidad celular. La supresión del fenotipo de lisis celular se puede observar a partir de la tasa de crecimiento mejorada y/o la producción de proteína recombinante, particularmente en el periplasma, exhibida por una célula que porta un mutante de spr y que tiene una actividad Tsp reducida en comparación con una célula que porta el mutante de Tsp y spr de tipo salvaje.

Las células de acuerdo con la presente invención comprenden un gen spr mutante que codifica una proteína spr que tiene una mutación en uno o más aminoácidos seleccionados entre N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147 y H157, preferiblemente una mutación en uno o más aminoácidos seleccionados entre C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147 y H157. En esta realización, la proteína spr preferiblemente no tiene otras mutaciones.

La mutación de uno o más de los aminoácidos anteriores puede ser cualquier mutación de cambio de sentido adecuada en uno, dos o tres de los nucleótidos que codifican el aminoácido. La mutación cambia el residuo de aminoácido por cualquier aminoácido adecuado que da como resultado una proteína spr mutada capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. La mutación de cambio de sentido puede cambiar el aminoácido por uno que es de un tamaño diferente y/o tiene propiedades químicas diferentes en comparación con el aminoácido de tipo salvaje.

En una realización, el gen spr mutante codifica una proteína spr que tiene una o más mutaciones seleccionadas entre C94A, S95F, V98E, Y115F, D133A, V135D o G, H145A, G147Cy H157A.

En una realización, la mutación es en uno, dos o tres de la tríada catalítica de residuos de aminoácido de C94, H145 y H157 (Solution NMR Structure of the NlpC/P60 Domain of Lipoprotein Spr from Escherichia coli Structural Evidence for a Novel Cysteine Peptidase Catalytic Triad, Biochemistry, 2008, 47, 9715-9717).

Por consiguiente, el gen spr mutado puede comprender: una mutación en C94; o una mutación en H145; o una mutación en H157; o una mutación en C94 y H145; o una mutación en C94 y H157; o una mutación en H145 y H157; o una mutación en C94, H145 y H157.

En esta realización, la proteína spr preferiblemente no tiene otras mutaciones.

Uno, dos o tres de C94, H145 y H157 se pueden mutar a cualquier aminoácido adecuado que dé como resultado una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. Por ejemplo, uno, dos o tres de C94, H145 y H157 se pueden mutar a un pequeño aminoácido tal como Gly o Ala. Por consiguiente, la proteína spr puede tener una, dos o tres de las mutaciones C94A, H145A y H157A. En una realización, el gen spr comprende la mutación de cambio de sentido C94A, que se ha encontrado que produce una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. En otra realización, el gen spr comprende la mutación de cambio de sentido H145A, que se ha encontrado que produce una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado.

La designación de un mutante de sustitución en la presente memoria consiste en una letra seguida de un número seguido de una letra. La primera letra designa el aminoácido en la proteína de tipo salvaje. El número se refiere a la posición del aminoácido donde se realiza la sustitución del aminoácido, y la segunda letra designa el aminoácido que se utiliza para reemplazar el aminoácido de tipo salvaje.

En una realización, la proteína spr mutante comprende una mutación en uno o más aminoácidos seleccionados entre N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 y G147, preferiblemente una mutación en uno o más aminoácidos seleccionados entre S95, V98, Y115, D133, V135 y G147. En esta realización, la proteína spr preferiblemente no tiene otras mutaciones. Por consiguiente, el gen spr mutado puede comprender: una mutación en N31; o una mutación en R62; o una mutación en 170; o una mutación en Q73; o una mutación en S95; o una mutación en V98; o una mutación en Q99; o una mutación en R100; o una mutación en L108; o una mutación en Y115; o una mutación en D133; o una mutación en V135; o una mutación en L136; o una mutación en G140; o una mutación en R144; o una mutación en G147.

En una realización, la proteína spr mutante comprende múltiples mutaciones en los aminoácidos: S95 e Y115; o N31, Q73, R100 y G140; o Q73, R100 y G140; o R100 y G140; o Q73 y G140; o Q73 y R100; o R62, Q99 y R144; o Q99 y R144.

Uno o más de los aminoácidos N31, R62, 170, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 y G147 se pueden mutar a cualquier aminoácido adecuado que dé como resultado una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. Por ejemplo, uno o más de N31, R62, 170, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140 y R144 se pueden mutar a un aminoácido pequeño tal como Gly o Ala.

En una realización, la proteína spr comprende una o más de las siguientes mutaciones: N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D o V135G, L136P, G140C, R144C y G147C. En una realización, la proteína spr comprende una o más de las siguientes mutaciones: S95F, V98E, Y115F, D133A, V135D o V135G y G147C. En esta realización, la proteína spr preferiblemente no tiene otras mutaciones.

En una realización, la proteína spr tiene una mutación seleccionada entre N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D o V135G, L136P, G140C, R144C y G147C. En esta realización, la proteína spr preferiblemente no tiene otras mutaciones.

En una realización adicional, la proteína spr tiene múltiples mutaciones seleccionadas de: S95F e Y115F; N31Y, Q73R, R100G y G140C; Q73R, R100G y G140C; R100G y G140C; Q73R y G140C; Q73R y R100G; R62C, Q99P y R144C; o Q99P y R144C.

En una realización, el gen spr mutado codifica una proteína spr que tiene una mutación C94A.

En una realización, el gen spr mutado codifica una proteína spr que tiene una mutación V103E.

En una realización, el gen spr mutado codifica una proteína spr que tiene una mutación D133A.

En una realización, el gen spr mutado codifica una proteína spr que tiene una mutación V135D.

En una realización, el gen spr mutado codifica una proteína spr que tiene una mutación V135A.

En una realización, el gen spr mutado codifica una proteína spr que tiene una mutación H145A.

En una realización, el gen spr mutado codifica una proteína spr que tiene una mutación G147C.

En una realización, el gen spr mutado codifica una proteína spr que tiene una mutación H157A.

En una realización, el gen spr mutante codifica una proteína spr que tiene una mutación seleccionada entre H145A, H157A y D133A.

En una realización de la presente invención, se pueden realizar cualquier mutación o mutaciones adecuadas en el gen spr que den como resultado una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. Preferiblemente, la proteína spr puede tener una o más de las siguientes mutaciones: N31Y, R62C, I70T, Q73R, C94A, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D, V135G, L136P, G140C, R144C, H145A, G147C, H157A y W174R. En una realización, la proteína spr no comprende la mutación W174R. Preferiblemente, el gen spr comprende una o más mutaciones comentadas anteriormente.

Las células según la presente invención tienen una actividad reducida de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje. La expresión "actividad reducida de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje" significa que la actividad de Tsp de la célula se reduce en comparación con la actividad de la Tsp de una célula de tipo salvaje. La célula puede ser modificada por cualquier medio adecuado para reducir la actividad de Tsp. En una realización, la actividad de Tsp reducida es a partir de la modificación del polinucleótido endógeno que codifica Tsp y/o secuencias de expresión reguladoras asociadas. La modificación puede reducir o detener la transcripción y traducción del gen Tsp o puede proporcionar una proteína Tsp expresada que tenga una actividad proteasa reducida en comparación con la proteína Tsp de tipo salvaje.

En una realización, una secuencia de expresión reguladora asociada se modifica para reducir la expresión de Tsp. Por ejemplo, el promotor del gen Tsp se puede mutar para evitar la expresión del gen.

En una realización preferida, las células de acuerdo con la presente invención portan un gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp que tiene actividad de proteasa reducida o un gen Tsp mutado desactivado.

Preferiblemente, el gen Tsp cromosómico está mutado.

Como se emplea en la presente memoria, "gen Tsp" significa un gen que codifica la proteasa Tsp (también conocida como Prc) que es una proteasa periplásmica capaz de actuar sobre la proteína de unión a la penicilina 3 (PBP3) y las proteínas de la cola del fago. La secuencia del gen Tsp de tipo salvaje se muestra en SEQ ID NO: 1 y la secuencia de la proteína Tsp de tipo salvaje se muestra en SEQ ID NO: 2.

La referencia al gen Tsp mutado o al gen Tsp mutado que codifica Tsp, se refiere a un gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp que tiene actividad proteasa reducida o un gen Tsp mutado desactivado, a menos que se indique lo contrario.

La expresión "gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp que tiene actividad proteasa reducida" en el contexto de la presente invención significa que el gen Tsp mutado no tiene la actividad proteasa completa en comparación con el gen Tsp no mutado de tipo salvaje.

Preferiblemente, el gen Tsp mutado codifica una proteína Tsp que tiene 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos o 5% o menos de la actividad de la proteasa de una proteína Tsp no mutada de tipo salvaje. Más preferiblemente, el gen Tsp mutado codifica una proteína Tsp que no tiene actividad proteasa. En esta realización, la célula no es deficiente en Tsp cromosómica, es decir, la secuencia del gen Tsp no se ha suprimido ni mutado para evitar la expresión de cualquier forma de proteína Tsp.

Se puede introducir cualquier mutación adecuada en el gen Tsp para producir una proteína que tenga actividad proteasa reducida. La actividad proteasa de una proteína Tsp expresada a partir de una bacteria gram negativa puede ser sometida a prueba fácilmente por un experto en la técnica mediante cualquier método adecuado en la técnica, tal como el método descrito por Keiler et al. (Identification of Active Site Residues of the Tsp Protease* THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 270, Núm. 48, Edición de 1 de diciembre, pág. 28864-28868, 1995 Kenneth C. Keiler y Robert T. Sauer) en donde se sometió a prueba la actividad proteasa de Tsp.

Keiler et al (supra) han informado de que Tsp tiene un sitio activo que comprende los residuos S430, D441 y K455 y los residuos G375, G376, E433 y T452 son importantes para mantener la estructura de Tsp. Keiler et al (supra) informan sobre el hallazgo de que los genes Tsp mutados S430A, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A y T452A no tienen actividad proteasa detectable. Adicionalmente, se informa de que el gen Tsp mutado S430C muestra aproximadamente 5-10% de actividad de tipo salvaje. Por consiguiente, la mutación Tsp para producir una proteína que tiene actividad proteasa reducida puede comprender una mutación, tal como una mutación de cambio de sentido en uno o más de los residuos S430, D441, K455, G375, G376, E433 y T452. Preferiblemente, la mutación Tsp para producir una proteína que tiene actividad proteasa reducida puede comprender una mutación, tal como una mutación de cambio sentido en uno, dos o los tres residuos del sitio activo S430, D441 y K455.

Por consiguiente, el gen Tsp mutado puede comprender: una mutación en S430; o una mutación en D441; o una mutación en K455; o una mutación en S430 y d441; o una mutación en S430 y K455; o una mutación en D441 y K455; o una mutación en S430, D441 y K455.

Uno o más de S430, D441, K455, G375, G376, E433 y T452 se pueden mutar a cualquier aminoácido adecuado que dé como resultado una proteína que tenga actividad proteasa reducida. Los ejemplos de mutaciones adecuadas son S430A, S430C, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A y T452A. El gen Tsp mutado puede comprender una, dos o tres mutaciones en los residuos del sitio activo, por ejemplo, el gen puede comprender: S430A o S430C; y/o D441A; y/o K455A o K455H o K455R.

Preferiblemente, el gen Tsp tiene la mutación puntual S430Ao S430C.

La expresión "gen Tsp mutado desactivado" en el contexto de la presente invención significa que el gen comprende una o más mutaciones que evitan la expresión de la proteína Tsp codificada por el gen de tipo salvaje para proporcionar una célula deficiente en la proteína Tsp. El gen desactivado se puede transcribir parcial o completamente, pero no se traduce a la proteína codificada. El gen Tsp mutado desactivado puede ser mutado de cualquier manera adecuada, por ejemplo, por una o más mutaciones por deleción, inserción, puntuales, de cambio de sentido, sin sentido y por desplazamiento de marco, para causar la no expresión de la proteína. Por ejemplo, el gen puede desactivar mediante la inserción de una secuencia de ADN foránea, tal como un marcador de resistencia a antibióticos, en la secuencia codificante del gen.

En una realización preferida, el gen Tsp no se muta mediante la inserción de una secuencia de ADN foránea, tal como un marcador de resistencia a antibióticos, en la secuencia codificante del gen. En esta realización, el gen Tsp puede comprender una mutación en el codón de inicio del gen y/o uno o más codones de parada situados aguas abajo del codón de inicio del gen y aguas arriba del codón de parada del gen evitando así la expresión de la proteína Tsp. La mutación del codón de inicio puede ser una mutación de cambio de sentido de uno, dos o los tres nucleótidos del codón de inicio. De forma alternativa o adicional, el codón de inicio se puede mutar por una mutación de desplazamiento de marco de inserción o de supresión. El gen Tsp comprende dos codones ATG en el extremo 5' de la secuencia codificante, uno o ambos codones ATG se pueden mutar mediante una mutación sin sentido. El gen Tsp se puede mutar en el segundo codón ATG (codón 3) a TCG. El gen Tsp puede comprender alternativamente o adicionalmente uno o más codones de parada situados aguas abajo del codón de inicio del gen y aguas arriba del codón de parada del gen. Preferiblemente, el gen Tsp mutado desactivado comprende tanto una mutación de cambio de sentido en el codón de inicio como uno o más codones de parada insertados. En una realización preferida, el gen Tsp se muta para eliminar "T" del quinto codón, lo que provoca un desplazamiento de marco que da como resultado codones de parada en los codones 11 y 16. En una realización preferida, el gen Tsp se muta para insertar un sitio de restricción Ase I para crear un tercer codón de parada en marco en el codón 21.

En una realización preferida, el gen Tsp mutado desactivado tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 3, que incluye los 6 nucleótidos ATGAAT aguas arriba del codón de inicio. En una realización, el gen Tsp mutado tiene la secuencia de ADN de los nucleótidos 7 a 2048 de SEQ ID NO: 3.

En la presente invención, las células también portan uno o más genes capaces de expresar o expresar en exceso una o más proteínas capaces de facilitar el plegamiento de proteínas. Los ejemplos incluyen proteínas tales como FkpA, Skp, SurA, PPiAy PPiD.

En una realización, la proteína para facilitar el plegamiento de proteínas es FkpA, Skp o una combinación de las mismas.

En una realización, la proteína para facilitar el plegamiento de proteínas se selecciona entre FkpA o una combinación de FkpA y Skp.

FkpA es una peptidil-prolil-cis-trans isomerasa con el número Swiss-Prot P45523.

Skp es una proteína chaperona con el número Swiss-Prot P0AEU7.

La proteína para facilitar el plegamiento de proteínas puede estar codificada por un gen en el genoma de las células o transfectarse de forma transitoria allí, por ejemplo, en un plásmido o una combinación de los mismos, según corresponda.

La célula bacteriana gram negativa recombinante de la invención no comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC.

En una realización de la presente invención, la célula bacteriana gram negativa recombinante comprende adicionalmente un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida y/o un gen ptr mutado, en donde el gen ptr mutado codifica una proteína Proteasa III que tiene actividad proteasa reducida o es un gen ptr mutado desactivado y/o un gen OmpT mutado, en donde el gen OmpT mutado codifica una proteína OmpT que tiene actividad proteasa reducida o es un gen OmpT mutado desactivado. En esta realización, el genoma de la célula es isogénico con respecto a una célula bacteriana de tipo salvaje, excepto por las mutaciones anteriores.

Como se emplea en la presente memoria, "DegP" significa un gen que codifica la proteína DegP (también conocida como HtrA), que tiene una doble función como chaperona y proteasa (Families of serine peptidases; Rawlings ND, Barrett AJ. Methods Enzymol. 1994;244:19-61). La secuencia del gen DegP no mutado se muestra en SEQ ID NO: 7 y la secuencia de la proteína DegP no mutada se muestra en SEQ ID NO: 8.

A bajas temperaturas, DegP funciona como una chaperona y a altas temperaturas DegP tiene una preferencia por funcionar como una proteasa (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volumen 97, Tema 3, Páginas 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M) y The proteolytic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J et al Microbiology 2008, 154, 3649-3658).

En las realizaciones en las que la célula comprende la mutación DegP, la mutación DegP en la célula proporciona un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad chaperona pero no actividad de proteasa completa.

La expresión "que tiene actividad chaperona" en el contexto de la presente invención significa que la proteína DegP mutada tiene la misma o sustancialmente la misma actividad chaperona en comparación con la proteína DegP no mutada de tipo salvaje. Preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP que tiene 50% o más, 60% o más, 70% o más, 80% o más, 90% o más o 95% o más de la actividad chaperona de una proteína DegP no mutada de tipo salvaje. Más preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP que tiene la misma actividad chaperona en comparación con la DegP de tipo salvaje.

La expresión "que tiene actividad de proteasa reducida" en el contexto de la presente invención significa que la proteína DegP mutada no tiene la actividad proteasa completa en comparación con la proteína DegP no mutada de tipo salvaje. Preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP que tiene 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos o 5% o menos de la actividad proteasa de una proteína DegP no mutada de tipo salvaje. Más preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP que no tiene actividad proteasa. La célula no es deficiente en DegP cromosómico, es decir, las secuencias del gen DegP no se han suprimido ni mutado para evitar la expresión de cualquier forma de proteína DegP.

Se puede introducir cualquier mutación adecuada en el gen DegP para producir una proteína que tenga actividad chaperona y actividad proteasa reducida. La actividad proteasa y chaperona de una proteína DegP expresada a partir de una bacteria gram negativa puede ser sometida a prueba fácilmente por un experto en la técnica mediante cualquier método adecuado, tal como el método descrito por Spiess et al., en donde las actividades proteasa y chaperona de DegP se sometieron a prueba en MalS, un sustrato natural de DegP (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volumen 97, Tema 3, Páginas 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M) y también el método descrito en The proteolytic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J et al Microbiology 2008, 154, 3649-3658.

DegP es una serina proteasa y tiene un centro activo que consiste en una tríada catalítica de residuos de aminoácido de His105, Asp135 y Ser210 (Families of serine peptidases, Methods Enzymol., 1994, 244:19-61 Rawlings N and Barrett A). La mutación DegP para producir una proteína que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida puede comprender una mutación, tal como una mutación de cambio de sentido en uno, dos o tres de His105, Asp135 y Ser210.

Por consiguiente, el gen DegP mutado puede comprender: una mutación en His105; o una mutación en Asp135; o una mutación en Ser210; o una mutación en His105 y Asp135; o una mutación en His105 y Ser210; o una mutación en Asp135 y Ser210; o una mutación en His105, Asp135 y Ser210.

Uno, dos o tres de His105, Asp135 y Ser210 se pueden mutar a cualquier aminoácido adecuado que dé como resultado una proteína que tenga actividad chaperona y actividad proteasa reducida. Por ejemplo, uno, dos o tres de His105, Asp135 y Ser210 se puede mutar a un pequeño aminoácido tal como Gly o Ala. Otra mutación adecuada es cambiar uno, dos o tres de His105, Asp135 y Ser210 a un aminoácido con propiedades opuestas, tal como Asp135 que se muta a Lys o Arg, siendo mutado His105 polar a un aminoácido no polar, tal como Gly, Ala, Val o Leu y siendo mutado Ser210 hidrófilo pequeño, a un residuo grande o hidrófobo, tal como Val, Leu, Phe o Tyr. Preferiblemente, el gen DegP comprende la mutación puntual S210A, como se muestra en la Figura 11c, que se ha encontrado que produce una proteína que tiene actividad chaperona pero no actividad proteasa (Un cambio dependiente de la temperatura de chaperona a proteasa en una proteína de choque térmico muy conservada. Cell, Volumen 97, Tema 3, Páginas 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M).

DegP tiene dos dominios PDZ, PDZ1 (residuos 260-358) y PDZ2 (residuos 359-448), que median la interacción proteína-proteína (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volumen 97, Tema 3, Páginas 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M). En una realización de la presente invención, el gen degP se muta para suprimir el dominio PDZ1 y/o el dominio PDZ2. La deleción de PDZ1 y PDZ2 da como resultado una pérdida completa de la actividad proteasa de la proteína DegP y una actividad chaperona reducida en comparación con la proteína DegP de tipo salvaje, mientras que la eliminación de PDZ1 o PDZ2 da como resultado una actividad proteasa de 5% y una actividad chaperona similar en comparación con la proteína DegP (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volumen 97, Tema 3, Páginas 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M).

El gen DegP mutado también puede comprender un sitio de restricción silencioso de origen no natural, tal como Ase I para ayudar a la identificación y a los métodos de escrutinio, por ejemplo, como se muestra en la Figura 7C.

La secuencia preferida del gen DegP mutado que comprende la mutación puntual S210A y un sitio marcador de restricción Ase I se proporciona en SEQ ID NO: 9 y la secuencia de la proteína codificada se muestra en SEQ ID NO: 10.

En las realizaciones de la presente invención en las que la célula comprende un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida, una o más de las células proporcionadas por la presente invención pueden proporcionar un rendimiento mejorado de proteínas plegadas correctamente a partir de la célula con respecto a células mutadas en donde el gen DegP ha sido mutado a DegP desactivado evitando la expresión de DegP, tal como DegP deficiente cromosómica. En una célula que comprende un gen DegP mutado desactivado que previene la expresión de DegP, la actividad chaperona de DegP se pierde completamente mientras que en la célula de acuerdo con la presente invención la actividad chaperona de DegP se conserva mientras se pierde la actividad proteasa completa. En estas realizaciones, una o más células de acuerdo con la presente invención tienen una actividad proteasa inferior para prevenir la proteolisis de la proteína mientras se mantiene la actividad chaperona para permitir el correcto plegamiento y transporte de la proteína en la célula anfitriona.

En estas realizaciones, una o más células según la presente invención pueden tener un crecimiento celular mejorado en comparación con las células que portan un gen DegP desactivado mutado que previene la expresión de DegP. Sin desear estar limitado por la teoría, se puede mostrar crecimiento celular mejorado debido a que la proteasa DegP retiene la actividad chaperona, lo que puede aumentar la capacidad de la célula para procesar todas las proteínas que requieren actividad chaperona. Por consiguiente, la producción de proteínas correctamente plegadas necesarias para el crecimiento y la reproducción de la célula pueden aumentar en una o más de las células de la presente invención en comparación con las células que tienen una mutación desactivada de DegP, mejorando así las vías celulares que regulan el crecimiento. Adicionalmente, las cepas conocidas con deficiencia de proteasa DegP son generalmente sensibles a la temperatura y no crecen típicamente a temperaturas superiores a aproximadamente 28°C. Sin embargo, las células de acuerdo con la presente invención no son sensibles a la temperatura y pueden crecer a temperaturas de 28°C o más, incluyendo temperaturas de aproximadamente 30°C a aproximadamente 37°C, que se utilizan típicamente para la producción a escala industrial de proteínas a partir de bacterias.

En una realización de la presente invención, la célula porta un gen ptr mutado. Como se emplea en la presente memoria, "gen ptr" significa un gen que codifica la Proteasa III, una proteasa que degrada proteínas de alto peso molecular. La secuencia del gen ptr no mutado se muestra en SEQ ID NO: 4 y la secuencia de la proteína Proteasa III no mutada se muestra en SEQ ID NO: 5.

La referencia al gen ptr mutado o al gen ptr mutado que codifica la Proteasa III, se refiere a un gen ptr mutado que codifica una proteína Proteasa III que tiene actividad proteasa reducida o un gen ptr mutado desactivado, a menos que se indique lo contrario.

La expresión "gen ptr mutado que codifica una proteína Proteasa III que tiene actividad proteasa reducida" en el contexto de la presente invención significa que el gen ptr mutado no tiene la actividad proteasa completa en comparación con el gen ptr no mutado de tipo salvaje.

Preferiblemente, el gen ptr mutado codifica una Proteasa III que tiene 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos o 5% o menos de la actividad proteasa de una proteína Proteasa III no mutada de tipo salvaje. Más preferiblemente, el gen ptr mutado codifica una proteína Proteasa III que no tiene actividad proteasa. En esta realización, la célula no es deficiente en ptr cromosómica, es decir, la secuencia del gen ptr no se ha suprimido ni mutado para evitar la expresión de cualquier forma de proteína Proteasa III.

Se puede introducir cualquier mutación adecuada en el gen ptr para producir una proteína Proteasa III que tenga actividad proteasa reducida. La actividad proteasa de una proteína Proteasa III expresada a partir de una bacteria gram negativa puede ser probada fácilmente por un experto en la técnica por medio de cualquier método adecuado en la técnica.

La expresión "gen ptr mutado desactivado" en el contexto de la presente invención significa que el gen comprende una o más mutaciones, no causando de ese modo expresión de la proteína codificada por el gen para proporcionar una célula deficiente en la proteína codificada por el gen mutado desactivado. El gen desactivado se puede transcribir parcial o completamente, pero no se traduce a la proteína codificada. El gen ptr mutado desactivado puede ser mutado de cualquier manera adecuada, por ejemplo, mediante una o más mutaciones de deleción, inserción, puntuales, de cambio de sentido, sin sentido y por desplazamiento de marco, para causar la no expresión de la proteína. Por ejemplo, el gen puede desactivar mediante la inserción de una secuencia de ADN foránea, tal como un marcador de resistencia a antibióticos, en la secuencia codificante del gen.

En una realización preferida, el gen no se muta mediante la inserción de una secuencia de ADN foránea, tal como un marcador de resistencia a antibióticos, en la secuencia codificante del gen. Preferiblemente, el gen de la Proteasa III comprende una mutación en el codón de inicio y/o uno o más codones de parada del gen situados aguas abajo del codón de inicio del gen y aguas arriba del codón de parada del gen, evitando así la expresión de la proteína Proteasa III.

Una mutación en el codón de inicio del gen desactivado diana provoca la pérdida de la función del codón de inicio y, por lo tanto, garantiza que el gen diana no comprenda un codón de inicio adecuado al comienzo de la secuencia codificante. La mutación del codón de inicio puede ser una mutación de cambio de sentido de uno, dos o los tres nucleótidos del codón de inicio. De forma alternativa o adicional, el codón de inicio se puede mutar mediante una mutación de desplazamiento de marco de inserción o de deleción.

En una realización preferida, el gen ptr se muta para cambiar el codón de inicio ATG a ATT.

El gen ptr mutado desactivado puede comprender alternativamente o adicionalmente uno o más codones de parada situados aguas abajo del codón de inicio del gen y aguas arriba del codón de parada del gen. Preferiblemente, el gen ptr mutado desactivado comprende tanto una mutación de cambio de sentido en el codón de inicio como uno o más codones de parada insertados.

Los uno o más codones de parada insertados son preferiblemente codones de parada en marco. Sin embargo, los uno o más codones de parada insertados pueden ser alternativamente o adicionalmente codones de parada fuera de marco. Es posible que se requieran uno o más codones de parada fuera de marco para detener la traducción cuando un codón de inicio fuera de marco se cambia por un codón de inicio en marco mediante una mutación de desplazamiento de marco de inserción o de deleción. Los uno o más codones de parada se pueden introducir mediante cualquier mutación adecuada incluyendo una mutación puntual sin sentido y una mutación de desplazamiento de marco. Los uno o más codones de parada se introducen preferiblemente mediante una mutación de desplazamiento de marco y/o una mutación de inserción, preferiblemente mediante la sustitución de un segmento de la secuencia del gen por una secuencia que comprende un codón de parada. Por ejemplo se puede insertar un sitio de restricción Ase I, que comprende el codón de parada TAA.

En una realización preferida, el gen ptr se muta para insertar un codón de parada en marco mediante la inserción de un sitio de restricción Ase I, como se muestra en la Figura 7A. En una realización preferida, el gen ptr mutado desactivado tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 6.

Las mutaciones desactivadas descritas anteriormente son ventajosas porque causan una interrupción mínima o nula en el ADN cromosómico aguas arriba o aguas abajo del sitio del gen desactivado diana y no requieren la inserción y retención de ADN foráneo, tales como marcadores de resistencia a antibióticos, que pueden afectar a la idoneidad de la célula para expresar una proteína de interés, particularmente proteínas terapéuticas. Por consiguiente, una o más de las células de acuerdo con la presente invención pueden exhibir características de crecimiento y/o expresión de proteínas mejoradas en comparación con las células en las que el gen de la proteasa se ha desactivado mediante inserción de ADN foráneo en la secuencia codificante del gen.

En una realización, las células según la presente invención portan un gen OmpT mutado. Como se emplea en la presente memoria, "gen OmpT" significa un gen que codifica la proteasa OmpT (proteasa T de la membrana externa) que es una proteasa de la membrana externa. La secuencia del gen OmpT no mutado de tipo salvaje es SWISS-PROT P09169.

La referencia a un gen OmpT mutado o un gen OmpT mutado que codifica OmpT, se refiere a un gen OmpT mutado que codifica una proteína OmpT que tiene actividad proteasa reducida o un gen OmpT mutado desactivado, a menos que se indique lo contrario.

La expresión "gen OmpT mutado que codifica una proteína OmpT que tiene actividad proteasa reducida" en el contexto de la presente invención significa que el gen OmpT mutado no tiene la actividad proteasa completa en comparación con el gen OmpT no mutado de tipo salvaje. El gen OmpT mutado puede codificar una proteína OmpT que tenga 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos o 5% o menos de la actividad de proteasa de una proteína OmpT no mutada de tipo salvaje. El gen OmpT mutado puede codificar una proteína OmpT que no tiene actividad proteasa. En esta realización, la célula no es deficiente en OmpT cromosómico, es decir, la secuencia del gen OmpT no se ha suprimido ni mutado para evitar la expresión de cualquier forma de proteína OmpT.

Se puede introducir cualquier mutación adecuada en el gen OmpT para producir una proteína que tenga actividad proteasa reducida. La actividad de proteasa de una proteína OmpT expresada a partir de una bacteria gram negativa puede ser sometida a prueba fácilmente por un experto en la técnica mediante cualquier método adecuado en la técnica, tal como el método descrito por Kramer et al. (Identification of essential acidic residues of outer membrane protease OmpT supports a novel active site, FEBS Letters 505 (2001) 426-430) y Dekker et al (Substrate Specitificity of the Integral Membrane Protease OmpT Determined by Spatially Addressed Peptide Libraries, Biochemistry 2001, 40, 1694-1701).

OmpT ha sido referida por Kramer et al. (Identification of active site serine and histidine residues in Escherichia coli outer membrane protease OmpT FEBS Letters 2000 468, 220-224) que describe que la sustitución de serinas, histidinas y residuos ácidos por alaninas da como resultado una actividad reducida ~10 veces para Glu27, Asp97, Asp208 o His101, actividad reducida ~500 veces para Ser99 y actividad reducida de ~10000 para Asp83, Asp85, Asp210 o His212. Vandeputte-Rutten et al (Crystal Structure of the Outer Membrane Protease OmpT from Escherichia coli suggests a novel catalytic site, The EMBO Journal 2001, Vol 20 Núm 185033-5039) por tener un sitio activo que comprende un par Asp83-Asp85 y un par His212-Asp210. Adicionalmente Kramer et al (Lipopolysaccharide regions involved in the activation of Escherichia coli outer membrane protease OmpT, Eur. J. Biochem. FEBS 2002, 269, 1746-1752) describe que las mutaciones D208A, D210A, H212A, H212N, H212Q, G216K/K217G, K217T y R218L en el bucle L4 dan como resultado una pérdida parcial o prácticamente completa de la actividad enzimática.

Por consiguiente, la mutación OmpT para producir una proteína que tiene actividad proteasa reducida puede comprender una mutación, como una mutación de cambio de sentido en uno o más de los residuos E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212G216, K217, R218y E250.

Uno o más de E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212, G216, K217, R218 y E250 se pueden mutar a cualquier aminoácido adecuado que dé como resultado una proteína que tenga actividad proteasa reducida. Por ejemplo, uno o más de E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212, G216, K217, R218 y E250 se pueden mutar a alanina. Los ejemplos de mutaciones adecuadas son E27A, D43A, D83A, D85A, D97A, S99A, H101A, E111A, E136A, E193A, D206A, D208A, D210A, H212A, H212N, H212Q, G216K, K217G, K217T, R218L y E250A. En una realización, el gen OmpT mutado comprende mutaciones D210A y H212A. Una secuencia de OmpT mutada adecuada que comprende mutaciones D210A y H212A se muestra en SEQ ID NO: 23.

La expresión "gen OmpT mutado desactivado" en el contexto de la presente invención significa que el gen comprende una o más mutaciones que no causan expresión de la proteína codificada por el gen para proporcionar una célula deficiente en la proteína codificada por el gen mutado desactivado. El gen desactivado se puede transcribir parcial o completamente, pero no se traduce a la proteína codificada. El gen OmpT mutado desactivado se puede mutar de cualquier manera adecuada, por ejemplo, mediante una o más mutaciones por deleción, inserción, puntuales, de cambio de sentido, sin sentido y de desplazamiento de marco, para causar la no expresión de la proteína. Por ejemplo, el gen se puede desactivar mediante la inserción de una secuencia de ADN foránea, tal como un marcador de resistencia a antibióticos, en la secuencia codificante del gen.

En una realización, el gen OmpT comprende una mutación en el codón de inicio y/o uno o más codones de parada del gen situados aguas abajo del codón de inicio del gen y aguas arriba del codón de parada del gen, evitando así la expresión de la proteína OmpT. La mutación del codón de inicio puede ser una mutación de cambio de sentido de uno, dos o los tres nucleótidos del codón de inicio. Una secuencia de OmpT desactivada mutada adecuada se muestra en SEQ ID NO: 24. Alternativamente, o adicionalmente, el codón de inicio se puede mutar mediante una mutación de desplazamiento de marco de inserción o de deleción.

En una realización, la célula bacteriana gram negativa según la presente invención no porta un gen ompT mutado desactivado, por ejemplo que es deficiente en ompT cromosómico.

En una realización, la célula bacteriana gram negativa según la presente invención no porta un gen degP mutado desactivado, por ejemplo que es deficiente en degP cromosómica. En una realización, la célula bacteriana gram negativa según la presente invención no porta un gen degP mutado.

En una realización, la célula bacteriana gram negativa según la presente invención no porta un gen ptr mutado desactivado, por ejemplo que es deficiente en ptr cromosómico.

Muchas mutaciones realizadas mediante ingeniería genética, incluyendo las mutaciones desactivadas, implican el uso de marcadores de resistencia a antibióticos que permiten la selección e identificación de células mutadas satisfactoriamente. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, existen varios inconvenientes en el uso de marcadores de resistencia a antibióticos.

En una realización adicional de la presente invención, la célula no comprende un marcador de resistencia a antibióticos y supera las desventajas anteriores de utilizar marcadores de resistencia a antibióticos en donde el gen Tsp mutado, el gen spr mutado y opcionalmente el gen DegP mutado y/o un gen ptr mutado y/o un gen OmpT mutado, se mutan para que comprendan uno o más sitios para marcadores de restricción. Los sitios de restricción están modificados genéticamente en el gen y son de origen no natural. Los sitios para marcadores de restricción son ventajosos porque permiten el escrutinio y la identificación de células correctamente modificadas que comprenden las mutaciones cromosómicas requeridas. Las células que se han modificado para que porten uno o más de los genes de proteasa mutados se pueden analizar mediante PCR de ADN genómico de productos lisados celulares utilizando pares de oligonucleótidos diseñados para amplificar una región del ADN genómico que comprende un sitio para un marcador de restricción de origen no natural. El ADN amplificado se puede analizar a continuación mediante electroforesis en gel de agarosa antes y después de la incubación con una enzima de restricción adecuada capaz de digerir el ADN en el sitio para el marcador de restricción de origen no natural. La presencia de fragmentos de ADN después de la incubación con la enzima de restricción confirma que las células se han modificado con éxito para que porten los uno o más genes mutados.

En la realización en donde la célula porta un gen ptr mutado desactivado que tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 6, las secuencias de cebadores oligonucleotídicos mostradas en SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 se pueden utilizar para amplificar la región del ADN que comprende el sitio de restricción Ase I de origen no natural del ADN genómico de células transformadas. El ADN genómico amplificado se puede incubar a continuación con la enzima de restricción Ase I y analizar mediante electroforesis en gel para confirmar la presencia del gen ptr mutado en el ADN genómico.

En la realización en donde la célula comprende un gen Tsp mutado desactivado que tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 3 o los nucleótidos 7 a 2048 de SEQ ID NO: 3, las secuencias del cebador oligonucleotídico mostradas en SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 se puede utilizar para amplificar la región del ADN que comprende el sitio de restricción Ase I de origen no natural del ADN genómico de las células transformadas. El ADN genómico amplificado se puede incubar a continuación con la enzima de restricción Ase I y analizar mediante electroforesis en gel para confirmar la presencia del gen Tsp mutado en el ADN genómico.

En la realización en donde la célula comprende un gen DegP mutado que tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 9, las secuencias de cebadores oligonucleotídicos mostradas en SEQ I^d NO: 19 y SEQ ID NO: 20 se pueden utilizar para amplificar la región del ADN que comprende el sitio de restricción Ase I de origen no natural del ADN genómico de las células transformadas. El ADN genómico amplificado se puede incubar a continuación con la enzima de restricción Ase I y analizar mediante electroforesis en gel para confirmar la presencia del gen DegP mutado en el ADN genómico.

Los uno o más sitios de restricción se pueden introducir mediante cualquier mutación adecuada, incluyendo una o más mutaciones por deleción, inserción, puntuales, de cambio de sentido, sin sentido y de desplazamiento de marco. Se puede introducir un sitio de restricción mediante la mutación del codón de inicio y/o la mutación para introducir los uno o más codones de parada, como se describió anteriormente. Esta realización es ventajosa puesto que el sitio para el marcador de restricción es un marcador directo y único de las mutaciones desactivadas introducidas.

Se puede insertar un sitio para un marcador de restricción que comprende un codón de parada en marco, tal como un sitio de restricción Ase I. Esto es particularmente ventajoso puesto que el sitio de restricción insertado sirve como un sitio para un marcador de restricción y un codón de parada para prevenir la transcripción completa de la secuencia codificante del gen. Por ejemplo, en la realización en donde se introduce un codón de parada en el gen ptr mediante la introducción de un sitio Ase I, esto también crea un sitio de restricción, como se muestra en la Figura 7A. Por ejemplo, en la realización en donde se introduce un codón de parada en el gen Tsp en el codón 21 mediante la introducción de un sitio Ase I, esto también crea un sitio de restricción, como se muestra en la Figura 7B.

Se puede insertar un sitio para un marcador de restricción mediante la mutación en el codón de inicio y, opcionalmente, una o más mutaciones puntuales adicionales. En esta realización, el sitio para el marcador de restricción es preferiblemente un sitio de restricción EcoR I. Esto es particularmente ventajoso puesto que la mutación al codón de inicio también crea un sitio para un marcador de restricción. Por ejemplo, en la realización en donde el codón de inicio del gen ptr se cambia a ATT, esto crea un sitio para el marcador EcoR I, como se muestra en la Figura 11a. Por ejemplo, en la realización en donde el codón de inicio (codón 3) del gen Tsp se cambia de ATG a TCG, como se muestra en la Figura 1b, una mutación puntual adicional del codón 2 de AAC a AAT y la mutación del codón 3 ATG a TCG crea un sitio para el marcador de restricción EcoR I, como se muestra en la Figura 7B. En la realización de la presente invención en donde la célula porta un gen OmpT mutado, los uno o más sitios de restricción se pueden introducir mediante cualquier mutación adecuada incluyendo mediante una o más mutaciones por deleción, inserción, puntuales, de cambio de sentido, sin sentido y por desplazamiento de marco. Por ejemplo, en la realización en donde el gen OmpT comprende las mutaciones D210Ay H212A, estas mutaciones introducen el sitio de restricción HindIII silencioso que se puede utilizar como un marcador de selección.

En el gen DegP o el gen spr, se puede introducir un sitio de restricción para el marcador utilizando cambios de codón silenciosos. Por ejemplo, se puede utilizar un sitio Ase I como sitio para marcador de restricción silencioso, en donde el codón de parada de TAA está fuera del marco, como se muestra en la Figura 7C para el gen DegP mutado.

En las realizaciones de la presente invención, en donde el gen ptr y/o el gen Tsp se mutan para codificar una Proteasa III o Tsp que tiene actividad proteasa reducida, se pueden introducir uno o más sitios para marcadores de restricción utilizando cambios de codón silenciosos.

La célula bacteriana gram negativa recombinante de acuerdo con la presente invención se puede producir por cualquier medio adecuado. El experto en la técnica conoce mecanismos adecuados que se pueden utilizar para reemplazar una secuencia de un gen cromosómico por una secuencia de un gen mutado. Se pueden emplear vectores adecuados que permitan la integración en el cromosoma anfitrión mediante recombinación homóloga. Los métodos de sustitución de genes adecuados son descritos, por ejemplo, por Hamilton C. M. et al., (New Method for Generating Deletions and Gene Replacements in Escherichia coli, Hamilton C. M. et al., Journal of Bacteriology sept. 1989, Vol. 171, Núm. 9 pág. 4617-4622), Skorupski et al (Positive selection vectors for allelic exchange, Skorupski K y Taylor R. K., Gene, 1996, 169, 47-52), Kiel et al (A general method for the construction of Escherichia coli mutants by homologous recombination and plasmid segregation, Kiel J.A.K.W. et al, Mol Gen Genet 1987, 207:294-301), Blomfield et al (Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature sensitive pSC101 replicon, Blomfield I. C. et al., Molecular Microbiology 1991, 5(6), 1447-1457) y Ried et al. (An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in Gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis, Ried J. L. y Collmer A., Gene 57 (1987) 239-246). A suitable plasmid which enables homologous recombination/replacement is the pKO3 plasmid (Link et al., 1997, Journal of Bacteriology, 179, 6228­ 6237).

Las cepas mutadas satisfactoriamente se pueden identificar utilizando métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo la secuenciación de ADN de PCR de colonias y el mapeo de enzimas de restricción de PCR de colonias. En la realización en donde la célula comprende dos o más genes cromosómicos mutados, los genes mutados pueden introducirse en la bacteria gram negativa en el mismo vector o en diferentes vectores.

En una realización, la célula bacteriana gram negativa según la presente invención no porta un gen ompT mutado desactivado, por ejemplo que es deficiente en ompT cromosómico.

En una realización, las células de acuerdo con la presente descripción solo contienen las tres mutaciones de caracterización de spr mutado, Tsp reducido y expresan FkpA, Skp o una combinación de FkpA y Skp.

En una realización, la línea celular según la presente descripción consiste en un gen Tsp mutado y un gen spr mutado, y un gen FkpA.

En una realización, la línea celular según la presente descripción consiste en un gen Tsp mutado y un gen spr mutado, y un gen Skp.

En una realización, la línea celular según la presente descripción consiste en un gen Tsp mutado y un gen spr mutado, un gen FkpA y un gen Skp.

En una realización, el gen o los genes capaces de expresar o expresar en exceso una o más proteínas capaces de facilitar el plegamiento de proteínas, tales como FkpA y Skp, se transforman transitoriamente en la célula, por ejemplo, en un vector de expresión que comprende opcionalmente una secuencia de polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento de unión del mismo.

En una realización, la secuencia de polinucleótido que codifica el anticuerpo y el polinucleótido que codifica FkpAy/o Skp se insertan en vectores de expresión separados.

Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la línea celular puede transformarse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, se puede utilizar un solo vector, incluyendo el vector secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada.

Alternativamente, la secuencia de polinucleótido que codifica el anticuerpo y el polinucleótido que codifica FkpA y/o Skp se insertan en un vector. Preferiblemente, el vector comprende las secuencias que codifican los polipéptidos de cadena ligera y pesada del anticuerpo.

La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que codifica FkpA y/o Skp y un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo específico para FcRn humano. El vector de expresión es un vector multicistrónico que comprende la secuencia de polinucleótidos que codifica FkpAy/o Skp y la secuencia de polinucleótidos que codifica el anticuerpo.

El vector multicistrónico se puede producir mediante un método de clonación ventajoso que permite la clonación secuencial repetida de secuencias de polinucleótidos en un vector. El método utiliza extremos cohesivos compatibles de un par de sitios de restricción, tales como los extremos "AT" de los sitios de restricción Ase I y Nde I. Una secuencia de polinucleótidos que comprende una secuencia codificante y que tiene extremos cohesivos compatibles, tal como un fragmento Asel-Ndel, se puede clonar en un sitio de restricción en el vector, tal como Nde I. La inserción de la secuencia de polinucleótidos destruye el sitio de restricción 5' pero crea un nuevo sitio de restricción 3', tal como Ndel, que a continuación se puede utilizar para insertar una secuencia de polinucleótidos adicional que comprende extremos cohesivos compatibles. Después se puede repetir el procedimiento para insertar secuencias adicionales. Cada secuencia de polinucleótido insertada en el vector comprende una secuencia no codificante 3' con respecto al codón de parada que puede comprender un sitio Ssp I para su escrutinio, una secuencia de unión a ribosoma de Shine Dalgarno, un espaciador rico en A y un sitio Ndel que codifica un codón de inicio.

En la Figura 7d se muestra una representación esquemática de la creación de un vector que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una cadena ligera de un anticuerpo (LC), una cadena pesada de un anticuerpo (HC), una secuencia polinucleotídica FkpA y una secuencia polinucleotídica adicional.

La célula de acuerdo con la presente invención comprende preferiblemente un vector de expresión como se define anteriormente.

Adicionalmente, en la presente memoria se describe un ejemplo en el que la célula también expresa una o más proteínas adicionales como sigue: una o más proteínas capaces de facilitar el plegamiento de proteínas, tales como, skp, SurA, PPiA y PPiD; y opcionalmente una o más proteínas capaces de facilitar la secreción o translocación de proteínas, tales como SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY y Lep; las una o más proteínas adicionales se pueden expresar a partir de uno o más polinucleótidos insertados en el mismo vector que el polinucleótido que codifica FkpA y/o la secuencia de polinucleótido que codifica el anticuerpo. Alternativamente, los uno o más polinucleótidos se pueden insertar en vectores separados.

El vector de expresión se puede producir insertando uno o más casetes de expresión como se definió anteriormente en un vector adecuado. Alternativamente, las secuencias de expresión reguladoras para dirigir la expresión de la secuencia polinucleotídica pueden estar contenidas en el vector de expresión y, por lo tanto, se puede requerirse solamente la región codificante del polinucleótido para completar el vector de expresión.

El polinucleótido que codifica FkpA y/o Skp y/o el polinucleótido que codifica el anticuerpo se insertan adecuadamente en un vector replicable, típicamente un vector de expresión de replicación autónoma, para la expresión en la célula bajo el control de un promotor adecuado para la célula. Se conocen muchos vectores en la técnica para este propósito y la selección del vector apropiado puede depender del tamaño del ácido nucleico y particularmente del tipo de célula.

Los ejemplos de vectores de expresión que se pueden emplear para transformar la célula anfitriona con un polinucleótido de acuerdo con la invención incluyen:

• un plásmido, tal como pBR322 o pACYC184, y/o

• un vector viral tal como el fago bacteriano

• un elemento genético transponible tal como un transposón

Tales vectores de expresión generalmente comprenden un origen plasmídico de la replicación del ADN, un marcador seleccionable para antibióticos, un promotor y un terminador transcripcional separados por un sitio de clonación múltiple (casete de expresión) y una secuencia de ADN que codifica un sitio de unión al ribosoma.

Los promotores empleados en la presente invención se pueden conectar al polinucleótido relevante de forma directa o alternativamente, se pueden ubicarse en una posición apropiada, por ejemplo en un vector, de manera que cuando se inserte el polipéptido relevante, el promotor relevante pueda actuar sobre el mismo. En una realización, el promotor está situado antes de la porción codificante del polinucleótido sobre el que actúa, por ejemplo, un promotor relevante antes de cada porción codificante de polinucleótido. Se pretende que "antes", como se emplea en la presente memoria, implique que el promotor está ubicado en el extremo 5 prima con respecto a la porción de polinucleótido codificante.

Los promotores pueden ser endógenos o exógenos con respecto a las células anfitrionas. Los promotores adecuados incluyen lac, tac, trp, phoA, Ipp, Arab, tet y T7.

Uno o más promotores empleados pueden ser promotores inducibles. En la realización en donde el polinucleótido que codifica FkpA y/o Skp y el polinucleótido que codifica el anticuerpo se insertan en un vector, las secuencias de nucleótidos que codifican FkpA y el anticuerpo pueden estar bajo el control de un único promotor o promotores separados. En la realización en donde las secuencias de nucleótidos que codifican FkpA y/o Skp y el anticuerpo están bajo el control de promotores separados, los promotores pueden ser promotores independientemente inducibles.

Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contienen generalmente una secuencia de Shine-Dalgamo (S.D.) conectada operativamente al ADN que codifica el polipéptido de interés. El promotor se puede eliminar del ADN de la fuente bacteriana mediante digestión con enzimas de restricción e insertar en el vector que contiene el ADN deseado.

El vector de expresión también comprende preferiblemente un mensaje dicistrónico para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en los documentos WO03/048208 o WO2007/039714 (cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria como referencia). Preferiblemente, el cistrón aguas arriba contiene el ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo y el cistrón aguas abajo contiene el ADN que codifica la cadena pesada correspondiente, y la secuencia intergénica dicistrónica (IGS) comprende preferiblemente una secuencia seleccionada entre IGS1 (SEQ ID NO: 23). IGS2 (SEC ID NO: 24), IGS3 (SEC ID NO: 25) e IGS4 (SEC ID NO: 26).

Los terminadores pueden ser endógenos o exógenos con respecto a las células anfitrionas. Un terminador adecuado es rrnB.

Otros reguladores transcripcionales adecuados que incluyen promotores y terminadores y métodos de direccionamiento de proteínas se pueden encontrar en "Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli" Savvas C. Makrides, Microbiological Reviews, sept 1996, pág. 512-538.

El polinucleótido FkpA insertado en el vector de expresión comprende preferiblemente el ácido nucleico que codifica las secuencias señal de FkpA y la secuencia codificante de FkpA. El vector contiene preferiblemente una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector replique en una o más células anfitrionas seleccionadas, preferiblemente replique independientemente del cromosoma anfitrión. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias.

En una realización, FkpA y/o Skp y/o la proteína de interés comprenden una etiqueta de histidina en el extremo N y/o el extremo C.

La molécula de anticuerpo puede ser secretada de la célula o dirigida al periplasma mediante secuencias señal adecuadas. Alternativamente, las moléculas de anticuerpo se pueden acumularse dentro del citoplasma de la célula. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo está dirigida al periplasma.

El polinucleótido que codifica el anticuerpo se puede expresarse como una fusión con otro polipéptido, preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N del polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada debe ser una que sea reconocida y procesada por la célula anfitriona. Para las células anfitrionas procarióticas que no reconocen ni procesan la secuencia señal nativo o de un polipéptido eucariótico, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariótica. Las secuencias señal adecuadas incluyen OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA y DsbC. En una realización en donde la célula comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una cadena pesada de anticuerpo y una secuencia de polinucleótidos que codifica una cadena ligera de anticuerpo, cada polinucleótido puede comprender una secuencia señal, tal como OmpA.

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes enumerados anteriormente emplea técnicas de ligación convencionales. Los plásmidos o fragmentos de a Dn aislados se escinden, se adaptan y se vuelven a ligar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos. Los métodos generales mediante los cuales se pueden construir los vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo son bien conocidos por los expertos en la técnica. A este respecto, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York y Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing. Se pueden utilizar técnicas convencionales de biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifican el anticuerpo. Las secuencias de ADN deseadas se pueden sintetizar completamente o en parte utilizando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Se pueden utilizar técnicas de mutagénesis dirigida y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según sea apropiado.

Las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria con referencia al polinucleótido se aplican igualmente a realizaciones alternativas de la invención, por ejemplo, vectores, casetes de expresión y/o células anfitrionas que comprenden los componentes empleados en la misma, en la medida en que el aspecto relevante puede aplicarse a la misma.

La célula de acuerdo con la presente invención puede comprender adicionalmente una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína de interés. La secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína de interés puede ser exógena o endógena. La secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína de interés puede integrarse en el cromosoma del anfitrión o puede no integrarse en un vector, típicamente un plásmido.

En una realización, la célula según la presente invención expresa una proteína de interés. Se pretende que "proteína de interés" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiera a un polipéptido para la expresión, generalmente un polipéptido recombinante. Sin embargo, la proteína de interés puede ser una proteína endógena expresada a partir de un gen endógeno en la célula anfitriona.

Como se emplea en la presente memoria, un "polipéptido recombinante" se refiere a una proteína que se construye o produce utilizando tecnología de ADN recombinante. La proteína de interés puede ser una secuencia exógena idéntica a una proteína endógena o una versión mutada de la misma, por ejemplo, con actividad biológica atenuada, o un fragmento de la misma, expresada a partir de un vector exógeno. Alternativamente, la proteína de interés puede ser una proteína heteróloga, normalmente no expresada por la célula anfitriona.

La proteína de interés puede ser cualquier proteína adecuada que incluya una proteína terapéutica, profiláctica o diagnóstica.

El experto en la técnica podría someter prueba fácilmente la proteína secretada para ver si la proteína se pliega correctamente utilizando métodos bien conocidos en la técnica, tales como HPLC con proteína G, dicroismo circular, RMN, cristalografía de rayos X y métodos de medición de afinidad de epítopos.

En una realización, la proteína de interés es útil en el tratamiento de enfermedades o trastornos que incluyen trastornos inmunológicos y/o enfermedades autoinmunitarias.

En una realización, la enfermedad autoinmunitaria se selecciona entre la encefalomielitis diseminada aguda (ADEM), leucoencefalitis hemorrágica necrotizante aguda, enfermedad de Addison, agammaglobulinemia, alopecia areata, amiloidosis, vasculitis asociada a ANCA, espondilitis anquilosante y nefritis anti-GBM/anti-TBM, síndrome antifosfolipídico (APS), angioedema autoinmunitario, anemia aplásica autoinmunitaria, disfunción autonómica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, hiperlipidemia autoinmunitaria, inmunodeficiencia autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del oído interno (AIE^d ), miocarditis autoinmunitaria, pancreatitis autoinmunitaria, retinopatía autoinmunitaria, púrpura trobocitopénica autoinmunitaria (ATP), enfermedad autoinmunitaria de la tiroides, urticaria autoinmunitaria, neuropatías axonales y neuronales, enfermedad de Balo, enfermedad de Behcet, penfigoide ampollar, cardiomiopatía, enfermedad de Castleman, enfermedad celiaca, enfermedad de chagas, síndrome de fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), ostomielitis multifocal recurrente crónica (CRMO), Síndrome de Churg-Strauss, pemfigoide catricial/pemfigoide de la mucosa benigno, enfermedad de Crohn, síndrome de Cogans, enfermedad de aglutinina fría, bloqueo cardíaco congénito, miocarditis por virus coxsackie, enfermedad CREST, crioglobulinemia mixta esencial, neuropatías desmielinizantes, dermatitis herperiforme, dermatomiositis, enfermedad de Devic, (neuromielitis óptica) cardiomiopatía dilatada, lupus discoide, síndrome de Dressler, endometriosis, fibrosis angiocéntrica eosinofílica, fascitis eosinofílica, eritema nudoso, encefalomielitis alérgica experimental, síndrome de Evans, fibromialgia, alveolitis fibrosante, arteritis de células gigantes (arteritis temporal), glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, granulomatosis con poliangiitis (GPA) véase Wegener, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, encefalitis de Hashimoto, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura de Henoch-Schonlein, herpes gestacional, hipogammaglobulinemia, nefritis tubulointersticial hipocomplementaria idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA, enfermedad relacionada con IgG4, enfermedad esclerosante relacionada con IgG4, lipoproteínas inmunorreguladoras, aneurisma aórtico inflamatorio, pseudotumor inflamatorio, miositis por cuerpos de inclusión, diabetes insulinodependiente (tipo 1), cistitis intersticial, artritis juvenil, diabetes juvenil, síndrome de Kawasaki, tumor de Kuttner, Síndrome de Lambert-Eaton, vasculitis leucocitoclástica, liquen plano, liquen escleroso, conjuntivitis leñosa, enfermedad por IgA lineal (LAD), lupus (SLE), enfermedad de Lyme, fibrosis mediastínica crónica, enfermedad de Meniere, poliangitis microscópica, síndrome de Mikulicz, enfermedad de tejido conectivo mixto (MCTD), úlcera de Mooren, enfermedad de Mucha-Habermann, fibroesclerosis multifocal, esclerosis múltiple, miastenia gravis, miositis, narcolepsia, neuromielitis óptica (de Devic), neutropenia, penfigoide cicatricial ocular, neuritis óptica, enfermedad de Ormond (fibrosis retroperitoneal), reumatismo palindrómico (PANDAS), trastornos neuropsiquiátricos Autoinmunitarias Pediátricos asociados con estreptococos), degeneración cerebelar paraneoplásica, polineuropatías paraproteinémicas, hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH), síndrome de Parry Romberg, síndrome de Parsonnage-Turner, pars planitis (uveítis periférica), pénfigo vulgar, periaortitis, periarteritis, neuropatía periférica, encefalomielitis perivenosa, anemia perniciosa, síndrome de POEMS, poliarteritis nodosa, síndromes poliglandulares autoinmunitarias de tipo I, II y III, polimialgia reumática, polimiositis, síndrome de infarto post-miocardio, síndrome postpericardiotomía, dermatitis por progesterona, cirrosis biliar primaria, colangiitis esclerosante primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fibrosis pulmonar idiopática, pioderma gangrenosa, aplasia pura de glóbulos rojos, fenómeno de Raynaud, distrofia simpática refleja, síndrome de Reiter, policondritis recurrente, síndrome de piernas inquietas, fibrosis retroperitoneal (enfermedad de Ormond), fiebre reumática, artritis reumatoide, tiroiditis de Riedel, sarcoidosis, síndrome de Schmidt, escleritis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, autoinmunopatía testicular y contra espermatozoides, síndrome de la persona rígida, endocarditis bacteriana subaguda (SBE), síndrome de Susac, oftalmía simpática, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), síndrome de Tolosa-Hunt, mielitis transversa, colitis ulcerosa enfermedad del tejido conectivo no diferenciado (UCTD), uveítis, vasculitis, dermatosis vesiculoampollar, vitíligo, macroglobulinemia de Waldenstrom, anemia hemolítica idiopática tipo caliente y granulomatosis de Wegener (ahora denominada Granulomatosis con Poliangiitis (GPA).

En una realización, el trastorno neurológico se selecciona entre polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), síndrome de Guillain-Barré, polineuropatías paraproteinémicas, neuromielitis óptica (NMO, trastornos del espectro NMO o enfermedades del espectro NMO) y miastenia gravis.

En una realización, el trastorno hematológico inmunológico se selecciona entre púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), anemia hemolítica idiopática tipo caliente, el síndrome de Goodpasture y incompatibilidad de donante en trasplante debido a anticuerpos anti-HLA

En una realización, la enfermedad se selecciona entre miastenia gravis, neuromielitis óptica, CIDP, síndrome de Guillaume-Barré, polineuropatía para-proteinémica, epilepsia refractaria, ITP/TTP, anemia hemolítica, síndrome de Goodpasture, incompatibilidad ABO, nefritis por Lupus, vasculitis renal, esclerodermia, alveolitis fibrosante, miocardiopatía dilatada, enfermedad de Grave, diabetes tipo 1, diabetes autoinmunitaria, pénfigo, esclerodermia, lupus, vasculitis ANCA, dermatomiositis, enfermedad de Sjogren y artritis reumatoide.

En una realización, el trastorno dermatológico se selecciona entre penfigoide ampollar, pénfigo vulgar, vasculitis asociada a ANCA y cardiomiopatía dilatada.

En una realización, los anticuerpos o fragmentos de acuerdo con la presente descripción se pueden emplear en la profilaxis o el tratamiento de enfermedades aloinmunitarias asociadas con el trasplante alogénico de órganos o tejidos o ciertas afecciones neonatales.

La proteína puede ser un polipéptido proteolíticamente sensible, es decir, proteínas que son propensas a ser escindidas, susceptibles de escindirse, o escindidas por una o más proteasas bacterianas gram negativas, tales como las de E. coli, ya sea en el estado nativo o durante la secreción. En una realización, la proteína de interés es proteolíticamente sensible a una proteasa seleccionada entre DegP, Proteasa III y Tsp. En una realización, la proteína de interés es proteolíticamente sensible a la proteasa Tsp. En una realización, la proteína de interés es proteolíticamente sensible a las proteasas DegP y Proteasa III. En una realización, la proteína de interés es proteolíticamente sensible a las proteasas DegP y Tsp. En una realización, la proteína de interés es proteolíticamente sensible a las proteasas Tsp y Proteasa III. En una realización, la proteína de interés es proteolíticamente sensible a las proteasas DegP, Proteasa III y Tsp.

Preferiblemente, la proteína es un polipéptido eucariótico.

La proteína de interés expresada por las células de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo, un inmunógeno, una proteína de fusión que comprende dos proteínas heterólogas o un anticuerpo. Los anticuerpos para uso como la proteína de interés incluyen anticuerpos monoclonales, multivalentes, multiespecíficos, humanizados, totalmente humanos o quiméricos. El anticuerpo puede ser de cualquier especie, pero preferiblemente se obtiene de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano o un fragmento humanizado. El anticuerpo se puede obtener de cualquier clase (p.ej., IgG, IgE, IgM, IgD o IgA) o subclase de molécula de inmunoglobulina y se puede obtener de cualquier especie, incluyendo por ejemplo ratón, rata, tiburón, conejo, cerdo, hámster, camello, llama cabra o ser humano. Partes del fragmento de anticuerpo se pueden obtener de más de una especie, por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser quiméricos. En un ejemplo, las regiones constantes son de una especie y las regiones variables de otra.

El anticuerpo puede ser una molécula de anticuerpo completa que tiene cadenas pesadas y ligeras completas o un fragmento de las mismas, p. ej. fragmento VH, VL, VHH, Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')², Fv, scFv o un anticuerpo de doble especificidad, tal como un Fab-dAb o Fab-Fv, como se describe en los documentos WO2009/040562 y WO2010/035012.

En una realización, la proteína es un Fab'.

El anticuerpo puede ser específico para cualquier antígeno diana. El antígeno puede ser una proteína asociada a células, por ejemplo, una proteína de la superficie celular en células tales como células bacterianas, células de levadura, células T, células endoteliales o células tumorales, o puede ser una proteína soluble. Los antígenos de interés también pueden ser cualquier proteína médicamente relevante, tal como aquellas proteínas reguladas al alza durante una enfermedad o infección, por ejemplo, receptores y/o sus ligandos correspondientes. Los ejemplos concretos de proteínas de la superficie celular incluyen moléculas de adherencia, por ejemplo integrinas tales como integrinas p1, p. ej. VLA-4, selectina E, selectina P o selectina L, CD2, CD3, CD4, CD5, c D7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 o Receptor de CSF1, DPCR1, DPCR1, dudulina 2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, nectina tipo 2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antígeno carcinoembrionario (CEA), globulina grasa de la leche humana (HMFG1 y 2), antígenos de clase I de MHC y clase II de MHC, KDR y VEGF, y en su caso, receptores de los mismos.

Los antígenos solubles incluyen interleuquinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL-16 o IL-17, tales como IL17A y/o IL17F, antígenos virales, por ejemplo, antígenos de virus sincitial respiratorio o citomegalovirus, inmunoglobulinas, tales como IgE, interferones, tales como interferón a, interferón p o interferón y, factor de necrosis tumoral TNF (antes denominado factor de necrosis tumoral a), factor de necrosis tumoral p, factores estimulantes de colonias tales como G-CSF o GM-CSF, y factores de crecimiento derivados de plaquetas tales como PDGF-a y PDGF-p y, cuando sea apropiado, receptores de los mismos. Otros antígenos incluyen antígenos de la superficie celular bacteriana, toxinas bacterianas, virus tales como influenza, EBV, HepA, B y C, agentes de bioterrorismo, radionúclidos y metales pesados, y venenos y toxinas de serpientes y arañas.

En una realización, el antígeno es FcRn.

Los anticuerpos para uso en la presente descripción se pueden obtener utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. El polipéptido/proteína FcRn que incluye proteínas de fusión y sus mutantes, incluidas las células (de forma recombinante o natural) que expresan el polipéptido (tales como células T activadas) se puede utilizar para producir anticuerpos que reconocen específicamente FcRn. El polipéptido puede ser el polipéptido "maduro" o un fragmento o derivado biológicamente activo del mismo. La proteína humana está registrada en Swiss-Prot con el número P55899. En una realización, el inmunógeno es la cadena alfa de FcRn o un fragmento de la misma.

Los polipéptidos, para su uso para inmunizar un anfitrión, se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica a partir de células anfitrionas modificadas genéticamente que comprenden sistemas de expresión o se pueden recuperar de fuentes biológicas naturales. En la presente solicitud, el término "polipéptidos" incluye péptidos, polipéptidos y proteínas. Estos se utilizan indistintamente a menos que se especifique lo contrario. El polipéptido FcRn puede ser, en algunos casos, parte de una proteína más grande, tal como una proteína de fusión, por ejemplo, fusionada con una etiqueta de afinidad.

Los anticuerpos generados contra el polipéptido FcRn se pueden obtener, cuando sea necesaria la inmunización de un animal, administrando los polipéptidos a un animal, preferiblemente un animal no humano, utilizando protocolos bien conocidos y rutinarios, véase por ejemplo Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Se pueden inmunizar muchos animales de sangre caliente, tales como conejos, ratones, ratas, ovejas, vacas, camellos o cerdos. Sin embargo, los ratones, conejos, cerdos y ratas son generalmente los más adecuados.

En una realización, el anticuerpo se puede utilizar para alterar funcionalmente la actividad del antígeno de interés. Por ejemplo, el anticuerpo puede neutralizar o ejercer un efecto antagónico o agonístico de la actividad de dicho antígeno, directa o indirectamente o simplemente bloquear la unión del ligando normal al mismo.

La presente invención también proporciona una célula bacteriana gram negativa recombinante que comprende un gen Tsp mutado, en donde el gen Tsp mutado codifica una proteína Tsp que tiene actividad proteasa reducida o es un gen Tsp mutado desactivado, un gen spr mutante que codifica una spr mutante, un gen capaz de expresar o expresar en exceso una o varias proteínas capaces de facilitar el plegamiento de proteínas y una secuencia de polinucleótidos que codifica un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo específico para FcRn. Se muestran varios anticuerpos y fragmentos anti-FcRn en las secuencias 36 a 74.

En una realización, la cadena pesada comprende 1, 2 o 3 CDR seleccionadas independientemente entre SEQ ID NO: 36, 37 y 38.

En una realización, la cadena ligera comprende 1, 2 o 3 CDR seleccionadas independientemente entre SEQ ID NO: 39, 40 y 41.

En una realización, la cadena pesada de anticuerpo comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 36 para CDR-H1, la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 37 para CDR-H2 y la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 38 para CDRH3.

En una realización, la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 39 para CDR-L1, la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 40 para CDR-L2 y la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 41 para CDRL3.

En una realización, la cadena pesada de anticuerpo comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 36 para CDR-H1, la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 37 para CDR-H2, la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 38 para CDRH3, la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 39 para CDR-L1, la secuencia proporcionada en SEQ ID N^o : 40 para CDR-L2 y la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 41 para CDRL3.

En una realización, la célula expresa una molécula de anticuerpo con una secuencia descrita en la presente memoria.

Las moléculas de anticuerpo incluyen anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos.

Adecuadamente, el anticuerpo humanizado según la presente invención tiene un dominio variable que comprende regiones marco aceptoras humanas, así como una o más de las CDR proporcionadas específicamente en la presente memoria. Por lo tanto, en una realización se proporciona un anticuerpo humanizado que se une a FcRn humano en donde los dominios variables comprenden regiones marco aceptoras humanas y CDR donadoras no humanas. En un ejemplo, el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 50 y el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 58. En un ejemplo, la cadena ligera comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 54 y la cadena pesada comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 62.

Después de la expresión, los fragmentos de anticuerpos pueden procesarse adicionalmente, por ejemplo, por conjugación con otra entidad, tal como una molécula efectora.

El término molécula efectora como se emplea en la presente memoria incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas (tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano o vegetal y sus fragmentos, p. ej., ricina y fragmentos de la misma), proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polímeros sintéticos o naturales, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, p. ej. ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionúclidos, particularmente radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos informadores, tales como compuestos fluorescentes o compuestos que se pueden detectar mediante espectroscopia de RMN o ESR. El efector molecular se puede anclar al anticuerpo o fragmento del mismo por cualquier método adecuado, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo se puede modificar para anclar al menos una molécula efectora como se describe en los documentos WO05/003171 o WO05/003170 (cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria como referencia). Los documentos WO05/003171 o WO05/003170 también describen moléculas efectoras adecuadas.

En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo, tal como un Fab, se PEGila para generar un producto con las propiedades requeridas, por ejemplo similares a los anticuerpos completos, si fuera necesario. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un Fab' anti-TNF-a PEGilado, como se describe en el documento WO01/094585, que tiene preferiblemente anclado a uno de los residuos de cisteína en el extremo C-terminal de la cadena pesada, un grupo derivado de lisil-maleimida en donde uno de los dos grupos amino del residuo de lisilo se ha conectado covalentemente a un residuo de metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da, de tal manera que el peso molecular medio total de los residuos de metoxipoli(etilenglicol) es de aproximadamente 40.000 Da, más preferiblemente el grupo derivado de lisil maleimida es [1-[[[2-[[3-2,5-dioxo-1-pirrolidinil)-1-oxopropil]amino]etil]amino]-carbonil]-1,5-pentanodiil]bis(iminocarbonilo).

En una realización, un Fab o Fab' según la presente descripción se conjuga con una molécula de albúmina de suero humano o una molécula de almidón.

La célula también puede comprender adicionalmente secuencias polinucleotídicas que codifican una o más proteínas de interés adicionales.

Además se describen en la presente memoria células en las que una o más proteínas del anfitrión E. coli que se sebe que en el tipo salvaje se purifican conjuntamente con la proteína recombinante de interés durante la purificación, se seleccionan para la modificación genética, como describen Humphreys et al. "Engineering of Escherichia coli to improve the purification of periplasmic Fab' fragments: changing the pI of the chromosomally encoded PhoS/PstS protein", Protein Expression and Purification 37 (2004) 109-118 y documento WO04/035792 (cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria como referencia). El uso de tales proteínas del anfitrión modificadas mejora el proceso de purificación de proteínas de interés, especialmente anticuerpos, producidos en E. coli alterando las propiedades físicas de proteínas de E. coli seleccionadas de manera que ya no se purifiquen simultáneamente con el anticuerpo recombinante. Preferiblemente la proteína de E. coli que se altera se selecciona entre una o más de las proteínas de unión a fosfato (PhoS/PstS), la proteína de unión a dipéptidos (DppA), la proteína de unión a maltosa (MBP) y la tiorredoxina.

En un ejemplo, se altera una propiedad física de una proteína del anfitrión contaminante mediante la adición de una etiqueta de aminoácido al extremo C o al extremo N terminal. En una realización preferida, la propiedad física que se altera es el punto isoeléctrico y la etiqueta de aminoácido es una etiqueta de ácido poli-aspártico anclada al extremo C-terminal. En una realización, las proteínas de E. coli alteradas por la adición de dicha etiqueta son la proteína de unión a dipéptidos (DppA), la proteína de unión a maltosa (MBP), la tiorredoxina, y la proteína de unión a fosfato (PhoS/PstS). En una realización específica, el pI de la proteína de unión a fosfato (PhoS/PstS) de E. coli se reduce de 7,2 a 5,1 mediante la adición de una etiqueta de ácido poli-aspártico (poliD), que contiene 6 residuos de ácido aspártico al extremo C-terminal.

También se describe la modificación de residuos específicos de la proteína de E. coli contaminante para alterar sus propiedades físicas, ya sea sola o combinada con la adición de etiquetas N o C-terminales. Tales cambios pueden incluir inserciones o deleciones para alterar el tamaño de la proteína o las sustituciones de aminoácidos para alterar el pI o el carácter hidrófobo. Estos residuos pueden estar localizados en la superficie de la proteína. En una realización concreta, los residuos de la superficie ilustrativos de la proteína PhoS se alteran con el fin de reducir el pI de la proteína. Los residuos que se ha determinado que son importantes en la unión del fosfato (Bass, documento US 5.304.472) se evitan con el fin de mantener una proteína PhoS funcional. Preferiblemente, se eligen como diana los residuos de lisina que se proyectan lejos de la superficie de la proteína o que están dentro o cerca de grandes grupos de residuos alcalinos. En un ejemplo, la proteína PhoS tiene una etiqueta de ácido poli(hexa)aspártico anclada al extremo C, mientras que los residuos de superficie en el extremo opuesto de la molécula se eligen como diana para la sustitución. Preferiblemente, los residuos de lisina seleccionados se sustituyen por ácido glutámico o ácido aspártico para conferir un mayor cambio potencial de pI que cuando se cambian residuos neutros por ácidos. La designación de un mutante de sustitución en la presente memoria consiste en una letra seguida de un número seguido de una letra. La primera letra designa el aminoácido en la proteína de tipo salvaje. El número se refiere a la posición del aminoácido donde se realiza la sustitución del aminoácido, y la segunda letra designa el aminoácido que se utiliza para reemplazar el aminoácido de tipo salvaje. En mutaciones preferidas de PhoS en la presente invención, los residuos de lisina (K) 275, 107, 109, 110, 262, 265, 266, 309, 313 están sustituidos por ácido glutámico (E) o glutamina (Q), como mutaciones únicas o combinadas. Además, la lisina (K) 318 se puede sustituir por ácido aspártico (D) como una mutación única o combinada. Preferiblemente, las mutaciones únicas son K262E, K265E y K266E. Preferiblemente, las mutaciones combinadas son K265/266E y K110/265/266E. Más preferiblemente, todas las mutaciones se combinan con la etiqueta de poli(ácido aspártico) (poliD) anclada al extremo C y, opcionalmente, también con la sustitución K318D. En un ejemplo adicional, las mutaciones dan como resultado una reducción de pI de al menos 2 unidades. Preferiblemente, las mutaciones reducen el pI de PhoS de 7,2 a entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5,5. En un ejemplo, el pI de la proteína PhoS de E. coli se reduce de 7,2 a aproximadamente 4,9, aproximadamente 4,8 y aproximadamente 4,5 utilizando las mutaciones polyD K318D, polyD K265/266E y polyD K110/265/266E respectivamente.

El polinucleótido que codifica la proteína de interés se puede expresar como una fusión con otro polipéptido, preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N del polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada debe ser una que sea reconocida y procesada por la célula anfitriona. Para las células anfitrionas procarióticas que no reconocen y procesan la secuencia señal del polipéptido nativo o eucariótico, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariótica. Las secuencias señal adecuadas incluyen OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbAy DsbC.

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes enumerados anteriormente emplea técnicas de ligación convencionales. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se escinden, se adaptan y se vuelven a ligar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

En una realización, se emplea un casete de expresión en la presente invención para que porte el polinucleótido que codifica la proteína de interés que comprende típicamente una o más secuencias codificantes de proteína que codifican una o más proteínas de interés y una o más secuencias de expresión reguladoras. Las una o más secuencias de expresión reguladoras pueden incluir un promotor. Las una o más secuencias de expresión reguladoras también pueden incluir una región no traducida 3' tal como una secuencia de terminación. Los promotores adecuados se comentan con más detalle a continuación.

En una realización, la célula de acuerdo con la presente invención comprende un vector, tal como un plásmido. El vector comprende preferiblemente uno o más de los casetes de expresión definidos anteriormente.

En la realización en la que la proteína de interés es un anticuerpo que comprende cadenas tanto pesadas como ligeras, la línea celular puede transfectarse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, se puede utilizar un solo vector, incluyendo el vector secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada.

El vector para su uso en la presente invención se puede producir insertando un casete de expresión como se definió anteriormente en un vector adecuado. Alternativamente, las secuencias de expresión reguladoras para dirigir la expresión de la secuencia polinucleotídica que codifica una proteína de interés pueden estar contenidas en el vector y, por lo tanto, se puede requerir solamente la región codificante del polinucleótido para completar el vector.

Los ejemplos de vectores que se pueden emplear para transformar la célula anfitriona con un polinucleótido de acuerdo con la invención incluyen: un plásmido, tal como pBR322 o pACYC184, y/o un vector viral tal como un fago bacteriano, un elemento genético transponible tal como un transposón.

Se encuentran disponibles muchas formas de vectores de expresión. Tales vectores generalmente comprenden un origen plasmídico de replicación del ADN, un marcador seleccionable para antibióticos, un promotor y un terminador de la transcripción separados por un sitio de clonación múltiple (casete de expresión) y una secuencia de ADN que codifica un sitio de unión al ribosoma.

Los promotores empleados en la presente invención se pueden conectar al polinucleótido relevante directamente o alternativamente se pueden ubicar en una posición apropiada, por ejemplo en un vector, de manera que cuando se inserta el polipéptido relevante, el promotor relevante puede actuar sobre el mismo. En una realización, el promotor está situado antes de la porción codificante del polinucleótido sobre el que actúa, por ejemplo, un promotor relevante antes de cada porción codificante de polinucleótido. Se pretende que "antes", como se emplea en la presente memoria, implique que el promotor está ubicado en el extremo 5 con respecto a la porción de polinucleótido codificante.

Los promotores pueden ser endógenos o exógenos con respecto a las células anfitrionas. Los promotores adecuados incluyen lac, tac, trp, phoA, Ipp, Arab, tet y T7.

Uno o más promotores empleados pueden ser promotores inducibles.

Las unidades de expresión para su uso en sistemas bacterianos también contienen generalmente una secuencia ribosómica de Shine-Dalgarno (S. D.) conectada operablemente al ADN que codifica el polipéptido de interés.

El vector de expresión también comprende preferiblemente un mensaje dicistrónico para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en los documentos WO 03/048208 o WO2007/039714 (cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria como referencia). Preferiblemente, el cistrón aguas arriba contiene ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo y el cistrón aguas abajo contiene ADN que codifica la cadena pesada correspondiente, y la secuencia intergénica dicistrónica (IGS) comprende preferiblemente una secuencia seleccionada entre IGS1 (SEQ ID NO: 38). IGS2 (SEC ID NO: 39), IGS3 (SEC ID NO: 40) e IGS4 (SEC ID NO: 41).

Los terminadores pueden ser endógenos o exógenos con respecto a las células anfitrionas. Un terminador adecuado es rrnB.

Otros reguladores transcripcionales adecuados que incluyen promotores y terminadores y métodos de direccionamiento de proteínas se pueden encontrar en "Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli" Savvas C. Makrides, Microbiological Reviews, septiembre de 1996, pág. 512-538.

La molécula de anticuerpo puede ser secretada de la célula o dirigida al periplasma mediante secuencias señal adecuadas. Alternativamente, las moléculas de anticuerpo se pueden acumular dentro del citoplasma de la célula. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo está dirigida al periplasma.

Las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria con referencia al polinucleótido se aplican igualmente a realizaciones alternativas de la invención, por ejemplo, vectores, casetes de expresión y/o células anfitrionas que comprenden los componentes empleados en la misma, en la medida en que el aspecto relevante pueda aplicarse a la misma.

La presente invención también proporciona un método para producir una proteína recombinante de interés que comprende expresar la proteína recombinante de interés en una célula bacteriana gram negativa recombinante como se describe anteriormente para la presente invención.

La célula bacteriana gram negativa y la proteína de interés empleadas preferiblemente en el método de la presente invención se describen en detalle anteriormente.

Cuando el polinucleótido que codifica la proteína de interés es exógeno, el polinucleótido se puede incorporar a la célula anfitriona utilizando cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Normalmente, el polinucleótido se incorpora como parte de un vector de expresión que se transforma en la célula. En consecuencia, en un aspecto, la célula de acuerdo con la presente invención comprende un casete de expresión que comprende el polinucleótido que codifica la proteína de interés.

La secuencia de polinucleótidos se puede transformar en una célula utilizando técnicas convencionales, por ejemplo empleando cloruro de rubidio, PEG o electroporación.

Como se describe adicionalmente en la presente memoria, el método también puede emplear un sistema de selección para facilitar la selección de células estables que se han transformado con éxito con el polinucleótido que codifica la proteína de interés. El sistema de selección típicamente emplea la co-transformación de una secuencia de polinucleótidos que codifica un marcador de selección. En un ejemplo, cada polinucleótido transformado en la célula comprende adicionalmente una secuencia de polinucleótido que codifica uno o más marcadores de selección. Por consiguiente, la transformación del polinucleótido que codifica la proteína de interés y los uno o más polinucleótidos que codifican el marcador se produce conjuntamente y el sistema de selección se puede emplear para seleccionar las células que producen las proteínas deseadas.

Las células capaces de expresar los uno o más marcadores son capaces de sobrevivir/crecer/multiplicarse bajo ciertas condiciones impuestas artificialmente, por ejemplo, la adición de una toxina o antibiótico, debido a las propiedades otorgadas por el componente polipéptido/gen o polipéptido del sistema de selección incorporado en el mismo (p.ej., resistencia a los antibióticos). Esas células que no pueden expresar los uno o más marcadores no pueden sobrevivir/crecer/multiplicarse en las condiciones impuestas artificialmente. Las condiciones impuestas artificialmente se pueden elegir para que sean más o menos rigurosas, según se requiera.

Se puede emplear cualquier sistema de selección adecuado en la presente invención. Típicamente, el sistema de selección se puede basar en la inclusión en el vector de uno o más genes que proporcionan resistencia a un antibiótico conocido, por ejemplo un gen de resistencia a la tetraciclina, cloranfenicol, kanamicina o ampicilina. Se pueden seleccionar las células que crecen en presencia de un antibiótico relevante ya que expresan tanto el gen que proporciona resistencia al antibiótico como la proteína deseada.

En una realización, el método según la presente invención comprende adicionalmente la etapa de cultivar la célula transformada en un medio para expresar de este modo la proteína de interés.

Se describen un sistema de expresión inducible o un promotor constitutivo que se pueden utilizar para expresar la proteína de interés. Los sistemas de expresión inducible y los promotores constitutivos adecuados son bien conocidos en la técnica.

Se puede utilizar cualquier medio adecuado para cultivar la célula transformada. El medio se puede adaptar para un sistema de selección específico, por ejemplo, el medio puede comprender un antibiótico, para permitir que solo las células que se han transformado con éxito crezcan en el medio.

Las células obtenidas del medio se pueden someter a una selección y/o purificación adicionales según se requiera. El método puede comprender adicionalmente una o más etapas para extraer y purificar la proteína de interés según se requiera.

El polipéptido se puede recuperar de la cepa, incluido el citoplasma, el periplasma o el sobrenadante.

En una realización, el anticuerpo se aísla del periplasma.

En una realización, la velocidad de alimentación posterior a la inducción está en el intervalo de 5 a 7,5 g/h, tal como aproximadamente 7 g/h.

El método o los métodos específicos utilizados para purificar una proteína dependen del tipo de proteína. Los métodos adecuados incluyen el fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación en etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía de interacción hidrófoba; cromatografía sobre sílice; cromatografía en una resina de intercambio iónico tal como S-SEPHAROSE y DEAE; cromatoenfoque; precipitación con sulfato de amonio; y filtración en gel.

Los anticuerpos se pueden separar adecuadamente del medio de cultivo y/o el extracto de citoplasma y/o el extracto de periplasma mediante procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de proteína G, cromatografía de proteína L, resinas de modo mixto, tiofílicas, etiqueta His, etiqueta FLAG, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía de afinidad, fraccionamiento/precipitación con sulfato de amonio, etanol o PEG, membranas de intercambio iónico, cromatografía de adsorción en lecho expandido (EBA) o cromatografía de lecho móvil simulada.

El método también puede incluir una etapa adicional para medir la cantidad de expresión de la proteína de interés y seleccionar las células que tienen altos niveles de expresión de la proteína de interés.

El método también puede incluir una o más etapas adicionales de procesamiento aguas abajo, tales como PEGilación de la proteína de interés, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

Una o más etapas del método descritas en la presente memoria se pueden realizar combinadas en un recipiente adecuado tal como un biorreactor.

Los anticuerpos y fragmentos de acuerdo con la presente descripción se pueden emplear en el tratamiento o la profilaxis.

Donde técnicamente se pueden combinar realizaciones apropiadas de la invención. Las realizaciones se describen en la presente memoria por comprender ciertas características/elementos. La descripción también se extiende a realizaciones separadas que consisten o consisten esencialmente en dichos características/elementos. Las referencias técnicas en la presente memoria, tales como patentes y solicitudes, se incorporan a la presente memoria como referencia.

La presente invención se describe adicionalmente a modo de ilustración solamente en los siguientes ejemplos, que se refieren a las figuras adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de líneas celulares

La generación de MXE016 y MXE017 se proporciona en el documento WO2011/086136.

Generación de plásmidos para expresión de Fab' anti-FcRn y Fab' anti-FcRn con FkpA, Fab' anti-FcRn con skp y Fab anti-FcRn con la expresión tanto de FkpA como de skp

Se construyó un plásmido que contenía las secuencias de las cadenas pesada y ligera de un Fab anti-FcRn (SEQ ID NO: 63 y 55, respectivamente. El plásmido PTTOD 1519.g57 Fab', se construyó utilizando metodologías de clonación de restricción convencionales que se pueden encontrar en Sambrook et al 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CSHL Press, N.Y. El plásmido PTTOD 1519.g57 Fab' contenía las siguientes características; un promotor tac fuerte y una secuencia del operador lac. El plásmido contenía un sitio de restricción EcoRI único después de la región codificante de la cadena pesada de Fab', seguido de una secuencia no codificante que contenía un sitio de unión a ribosoma fuerte y a continuación un sitio de restricción NdeI único.

Los genes de la cadena ligera, cadena pesada de Fab, se transcribieron como un solo mensaje policistrónico. El ADN que codificaba el péptido señal de la proteína OmpA de E. coli se fusionó al extremo 5' de las secuencias de los genes de las cadenas ligera y pesada, lo que dirigió la translocación de los polipéptidos al periplasma de E. coli. La transcripción se terminó utilizando un terminador de transcripción doble rrnB t1t2. El gen laclq codificaba la proteína represora lac I expresada constitutivamente. Esta transcripción reprimida desde el promotor tac hasta la desrepresión fue inducida por la presencia de alolactosa o IPTG. El origen de replicación utilizado fue p15A, que mantuvo un bajo número de copias. El plásmido contenía un gen de resistencia a la tetraciclina para la selección de antibióticos.

El plásmido PTTOD 1519.g57 Fab' FkpA, un vector de expresión para el Fab anti-FcRn y FkpA (un polipéptido periplásmico), se construyó ligando FkpA al extremo 3' de la secuencia Fab' de PTTOD 1519.g57 Fab' utilizando el Sitios EcoRI y NdeI (Véase la Figura 7d). El FkpA (SEQ ID N: 30) se construyó sintéticamente para eliminar 2 sitios Puv II, un sitio SfuI, un sitio BamHI y un EcoRI, de tal manera que la nueva construcción codificaba un sitio EcoRI 5' seguido de un sitio de unión ribosoma fuerte, seguido por el codón de inicio nativo, la secuencia señal y la secuencia madura de FkpA, terminando en una etiqueta His C-terminal y finalmente un sitio de unión a ribosoma fuerte seguido de un sitio NdeI no codificante. El fragmento de restricción EcoRI-NdeI se restringió y se ligó en el vector de expresión de modo que los tres polipéptidos: cadena ligera de Fab', cadena pesada de Fab' y FkpA se codificaron en un solo ARNm policistrónico.

El plásmido PTTOD 1519.g57 Fab' Skp, un vector de expresión para el Fab anti-FcRn y Skp (un polipéptido periplásmico), se construyó ligando skp al extremo 3' de la secuencia Fab' del plásmido PTTOD 1519.g57 Fab' utilizando los sitios EcoRI y NdeI. El skp (SEQ ID NO: 34) se construyó sintéticamente para eliminar 4 sitios Pst I y un sitio EcoRV, de modo que la nueva construcción codificaba un sitio EcoRI 5' seguido de un sitio de unión al ribosoma fuerte, seguido del codón de inicio nativo, la secuencia señal y la secuencia madura de Skp, terminando en una etiqueta His C-terminal y, finalmente, un sitio de unión a ribosoma fuerte seguido de un sitio NdeI no codificante. El fragmento de restricción EcoRI-NdeI se restringió y se ligó en el vector de expresión de modo que los tres polipéptidos: cadena ligera de Fab', cadena pesada de Fab' y skp se codificaron en un solo ARNm policistrónico. El plásmido PTTOD 1519.g57 Fab' FkpA Skp, un vector de expresión para el Fab anti-FcRn, FkpA y Skp (ambos polipéptidos periplásmicos) se construyó ligando Skp en el plásmido PTTOD 1519.g57 Fab' FkpA, en el extremo 3' de la secuencia de FkpA utilizando el sitio NdeI. El Skp (SEQ ID NO: 34) se construyó sintéticamente para eliminar 4 sitios Pst I y un sitio EcoRV, de manera que la construcción codificaba un sitio Ase I 5' incluyendo el codón de inicio nativo, la secuencia señal y la secuencia madura de skp, terminando en una etiqueta His C-terminal y finalmente un sitio NdeI no codificante. El fragmento de restricción AseI-NdeI se restringió y se ligó en el vector de expresión de manera que los cuatro polipéptidos: cadena ligera de Fab', cadena pesada de Fab', FkpA y Skp se codificaron en un solo ARNm policistrónico.

Fermentación de PTTOD 1519.g57 Fab', pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA, pTTOD 1519.g57 Fab' Skp y pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA skp en E. coli W3110, MXE012 (E. coli W3110 spr H145A), MXE016 (E. coli W3110 ATsp, spr C94A) y MXE017 (E. coli W3110 ATsp, spr H145A). Las cepas de E. coli W3110, MXE012, MXE016 y MXE017 se transformaron con los plásmidos pTTOD 1519.g57 Fab', pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA, pTTOD 1519.g57 Fab' Skp y pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA Skp generados en el Ejemplo 1. La transformación de las cepas se llevó a cabo utilizando el método encontrado en Chung C.T et al. Transformation and storage of bacterial cells in the same solution. PNAS 86:2172-2175 (1989). Estas cepas transformadas se sometieron a pruebe para determinar la expresión por fermentación.

Ejemplo 2: Efecto de las chaperonas en la expresión de Fab': Las cepas mostradas en la Figura 1 se sometieron a prueba en experimentos de fermentación de 1 L y 2,5 L que comparaban la expresión de Fab':

Medio de crecimiento, inóculo y etapas de fermentación. El proceso de fermentación se inició preparando un inóculo a partir de un vial del banco de células y amplificándolo a través de varias fases de precultivo (matraz y reactores) antes de sembrar el fermentador de producción. En el fermentador de producción, las células se cultivaron en medios definidos a alta densidad en modo de lotes y alimentación por lotes. Cuando se alcanzó la densidad celular deseada, la expresión del Fab' se indujo mediante la adición de IPTG. La expresión de Fab' está dirigida al espacio periplásmico de E. coli, donde Fab' se acumula a lo largo del curso de la fase de inducción. Se aplicó una fuente de alimentación de carbono durante la fase de inducción para controlar la expresión y el crecimiento celular. La temperatura, el oxígeno disuelto (pO²) y el pH se controlaron para mantener el cultivo en condiciones óptimas de cultivo.

Medición de la concentración de biomasa y tasa de crecimiento. La concentración de biomasa se determinó midiendo la densidad óptica de los cultivos a 600 nm.

Extracción periplásmica. Las células se recogieron de muestras de cultivo mediante centrifugación. La fracción de sobrenadante se retuvo (a -20°C) para un análisis adicional. La fracción de sedimento celular se resuspendió al volumen de cultivo original en tampón de extracción (Tris-HCl 100 mM, EDTA 10 mM; pH 7,4). Después de la incubación a 60°C durante aproximadamente 10 a 12 horas, el extracto se aclaró por centrifugación y la fracción de sobrenadante se utilizó recién obtenida o retenida (a -20°C) para el análisis.

Cuantificación de Fab'. Las concentraciones de Fab' en extractos periplásmicos y sobrenadantes de cultivo se determinaron utilizando HPLC con Proteína G. Se cargó una columna HP con Proteína G HiTrap de 1 ml (GE-Healthcare o equivalente) con analito (pH aproximadamente neutro, 30°C, filtrado a través de 0,2 pm) a 2 ml/min, la columna se lavó con fosfato 20 mM, NaCl 50 mM pH 7,4 y a continuación se eluyó Fab' utilizando una inyección de glicina/HCl 50 mM, pH 2,7. El Fab' eluido se midió mediante A280 en un sistema de HPLC Agilent 1100 o 1200 y se cuantificó mediante la referencia a una curva patrón de una proteína Fab' purificada de concentración conocida. La Figura 1 muestra los resultados de 46 fermentaciones a la escala de 5 L realizadas con varias combinaciones de células anfitrionas y "chaperona". W3110 es una cepa de E. coli de tipo salvaje. Las diversas combinaciones fueron: tipo salvaje sin chaperona, tipo salvaje con FkpA y Skp, spr mutante MXE016 y A Tsp publicados en el documento WO2011/086136, MXE016 y FkpA, MXE016 y Skp, MXE016 y FkpA y Skp, MXE017 descritos en el documento WO2011/086136, MXE017 y FkpA y Skp.

Los resultados muestran que MXE016, MXE016 y FkpA, MXE016 y FkpA y Skp, y MXE017 y FkpA y Skp mostraron los mejores niveles de expresión.

Ejemplo 3: Efecto de la velocidad de alimentación posterior a la inducción

El efecto de tres velocidades de alimentación posteriores a la inducción 5,4, 6,0 y 7,0 g/h se sometió a prueba en MXE016 y MXE016 FkpA.

Medio de crecimiento, inóculo y etapas de fermentación. El proceso de fermentación se inició preparando un inóculo a partir de un vial del banco de células y amplificándolo a través de varias etapas de precultivo (matraz y reactores) antes de sembrar el fermentador de producción. En el fermentador de producción, las células se cultivaron en medios definidos a alta densidad en modo de lotes y de alimentación por lotes. Cuando se alcanzó la densidad celular deseada, la expresión del Fab' se indujo mediante la adición de iPTG. La expresión de Fab' está dirigida al espacio periplásmico de E. coli, donde Fab' se acumula a lo largo del curso de la fase de inducción. Se aplicó una fuente de alimentación de carbono durante la fase de inducción para controlar la expresión y el crecimiento celular. En este experimento, la velocidad de alimentación se estableció en tres puntos de ajuste separados (que se muestran en la figura). La temperatura, el oxígeno disuelto (pO²) y el pH se controlaron para mantener el cultivo en condiciones óptimas de cultivo.

La Figura 2 muestra la cepa MXE016 transformada con plásmidos que no expresan chaperona ni FkpA. La figura muestra el efecto del aumento de la velocidad de alimentación posterior a la inducción sobre la producción y retención de Fab' en el periplasma con y sin FkpA. Los datos muestran que cuando la velocidad de alimentación aumenta sin la expresión de FkpA, el Fab' adicional producido se pierde en el sobrenadante. Este no es el caso con la expresión de FkpA donde el Fab' adicional producido a velocidades de alimentación más altas se retiene dentro del periplasma dando como resultado un título más alto.

Ejemplo 4: Análisis de rendimiento y viabilidad celular

Las Figuras 3A y B muestran el efecto sobre la viabilidad celular y el título de Fab' en MXE016 transformada con plásmidos que no expresan chaperona ni FkpA a escala de 20 L. La Figura 3A muestra que la viabilidad celular es más baja donde no está presente FkpA. 3b muestra que los títulos de Fab' fueron más altos y menos variables para MXE016 FkpA.

La Figura 4 muestra que el título más alto con MXE016 FkpA da como resultado 30% más de Fab' después de la recuperación del producto primario Fab.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Una célula bacteriana gram negativa recombinante que comprende:

a. un gen spr mutante que codifica una proteína spr que tiene una mutación en uno o más aminoácidos seleccionados entre D133, H145, H157, N31, R62, 170, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, V135, L136, G140, R144 y G147 y

b. un vector de expresión que comprende un gen que expresa o expresa en exceso una o más proteínas capaces de facilitar el plegamiento de proteínas seleccionadas entre FkpA, Skp o una combinación de FkpA y Skp,

en donde la célula tiene una actividad de proteína Tsp reducida en comparación con una célula de tipo salvaje y en donde la célula no comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC y en donde la célula bacteriana es isogénica con respecto a una célula de E. coli de tipo salvaje, excepto por el gen spr mutado y la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo salvaje.

2. Una célula según la reivindicación 1, en donde el gen spr mutante codifica una proteína spr que tiene una o más mutaciones seleccionadas entre D133A, H145A, H157A, N31Y, R62C, I70T, Q73R, C94A, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F , V135D, V135G, L136P, G140C, R144C y G147C.

3. Una célula según la reivindicación 1, en donde el gen spr mutante codifica una proteína spr que tiene las mutaciones C94 y H145A.

4. Una célula según la reivindicación 1, en donde el gen spr mutante codifica una proteína spr que tiene una mutación seleccionada entre D133A, H145Ay H157A.

5. Una célula según la reivindicación 1, en donde el gen spr mutante codifica una proteína spr que tiene una mutación seleccionada entre C94A.

6. Una célula según cualquier reivindicación precedente, en donde el gen spr mutante está integrado en el genoma de la célula.

7. Una célula según cualquier reivindicación precedente, en donde un gen que codifica una proteína capaz de facilitar el plegamiento de proteínas se transfecta transitoriamente a la célula.

8. Una célula según cualquier reivindicación precedente, en donde la proteína capaz de facilitar el plegamiento de proteínas es FkpA.

9. Una célula según cualquier reivindicación precedente, en donde la célula comprende adicionalmente uno o más de los siguientes genes mutados:

a. un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida;

b. un gen ptr mutado, en donde el gen ptr mutado codifica una proteína Proteasa III que tiene actividad de proteasa reducida o es un gen ptr mutado desactivado; y

c. un gen OmpT mutado, en donde el gen OmpT mutado codifica una proteína OmpT que tiene actividad proteasa reducida o es un gen OmpT mutado desactivado.

10. Una célula según cualquier reivindicación precedente, en donde la célula comprende un gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp que tiene actividad proteasa reducida o es un gen Tsp mutado desactivado.

11. Una célula según cualquier reivindicación precedente, en donde la célula tiene un gen Tsp mutado desactivado que comprende una mutación en el codón de inicio y/o uno o más codones de parada del gen situados aguas abajo del codón de inicio del gen y aguas arriba del codón de parada del gen.

12. Una célula según la reivindicación 11, en donde el gen Tsp mutado desactivado comprende un sitio para un marcador de restricción creado por una mutación de cambio de sentido en el codón de inicio del gen y opcionalmente una o más mutaciones puntuales adicionales.

13. Una célula según la reivindicación 12, en donde el gen Tsp mutado desactivado comprende SEQ ID NO: 3.

14. Una célula según cualquier reivindicación precedente, en donde la célula es E. coli.

15. Una célula según la reivindicación 14, en donde E coli es la cepa K12 o W3110.

16. Una célula según cualquier reivindicación precedente, en donde la célula comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína de interés seleccionada entre un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

17. Una célula según la reivindicación 16, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es específico para FcRn.

18. Un método para producir una proteína de interés que comprende cultivar una célula bacteriana gram negativa recombinante como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en un medio de cultivo en condiciones eficaces para expresar la proteína recombinante de interés y recuperar la proteína recombinante de interés del periplasma de la célula bacteriana gram negativa recombinante y/o del medio de cultivo.

19. Un método según la reivindicación 18, en donde el método comprende adicionalmente recuperar la proteína de interés de la célula.

20. Un método según la reivindicación 19, en donde la proteína de interés se recupera del periplasma y/o del sobrenadante.