ES2543393T3 - Derivado de insulina - Google Patents

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ES2543393T3 ES08846415.1T ES08846415T ES2543393T3 ES 2543393 T3 ES2543393 T3 ES 2543393T3 ES 08846415 T ES08846415 T ES 08846415T ES 2543393 T3 ES2543393 T3 ES 2543393T3
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Abstract

Un derivado de insulina que tiene una fórmula**Fórmula** en donde Ins es un resto de insulina parental y Q1-Q2-[CH2]n-X1-[CH2]n-Q3-[CH2]n -X2-[CH2]n-Q4-[CH2]n-X3- [CH2]n-Q5-[CH2]n-Z es un sustituyente y donde la Ins está unida al sustituyente por un enlace amídico entre el grupo α-amino del residuo aminoácido N-terminal de la cadena B de Ins o un grupo ε-amino de un residuo Lys presente en la cadena A o B de Ins y un grupo CO en Q1 o Q2 del sustituyente; cada n es independientemente 0, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6; Q1 es: - un residuo de aminoácido, residuo que forma, con su grupo ácido carboxílico, un grupo amida junto con el grupo α-amino del residuo de aminoácido N-terminal de la cadena B de Ins o junto con el grupo ε-amino de un residuo Lys presente en la cadena A o B de Ins, o - una cadena compuesta de dos, tres o cuatro residuos de α-aminoácido como se ha especificado arriba unidos entre sí por enlaces amídicos, cadena que está enlazada - por un enlace amídico - al grupo α-amino del residuo de aminoácido N-terminal de la cadena B de Ins o al grupo ε-amino de un residuo Lys presente en la cadena A o B de Ins, o - un enlace Q2 es: -CO-(CH2)2-NH-(CH2)2-, o -CO-CH2-NH-CH2- ; Q3 es: -(CH2)m- donde m es 12, 13, 14, 15 ó 16; X1 puede ser: - O; - -C>=O; - un enlace; - NCOR1, donde R1 puede ser H, -CH3 o -(CH2)1-6-CH3; o -**Fórmula** o donde R es hidrógeno, C1-3-alquilo, C2-3-alquenilo o C2-3-alquinilo; Q4, Q5, X2 y X3 son enlaces y todos los n son cero, y Z es: -COOH.

Description

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La célula hospedadora en la que se introduce la secuencia de DNA o el vector recombinante puede ser cualquier célula que sea capaz de producir el presente péptido e incluye bacterias, levaduras, hongos y células eucariotas superiores. Ejemplos de células hospedadoras adecuadas bien conocidas y utilizadas en la técnica son, sin limitación, E. coli, Saccharomyces cerevisiae, o linajes de células BHK o CHO de mamífero.
5 La molécula de insulina parental se convierte luego en los derivados de insulina de la invención por introducción del sustituyente relevante en la posición B1 o en la posición Lys seleccionada en la cadena B. El sustituyente puede introducirse por cualquier método conveniente y se describen muchos métodos en la técnica anterior para acilación de un grupo amino. Más detalles aparecerán en los ejemplos siguientes.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
Los derivados de insulina de esta invención de la fórmula reivindicada pueden administrarse, por ejemplo, por vía subcutánea, oral o pulmonar.
15 Para administración subcutánea, los compuestos de la fórmula se formulan análogamente a la formulación de insulinas conocidas. Adicionalmente, para administración subcutánea, los compuestos de la fórmula se administran análogamente a la administración de insulinas conocidas y, generalmente, los médicos están familiarizados con este procedimiento.
Los derivados de insulina de esta invención pueden administrarse por inhalación de una manera de dosificación eficaz para aumentar los niveles circulantes de insulina y/o reducir los niveles circulantes de glucosa. Dicha administración puede ser eficaz para tratamiento de trastornos tales como diabetes o hiperglucemia. El alcance de dosis eficaces de insulina requiere la administración de una dosis inhalada de derivado de insulina de esta invención
25 mayor que aproximadamente 0,5 μg/kg a aproximadamente 50 μg/kg. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser determinada por un técnico experto, que tendrá en cuenta factores que incluyen el nivel de insulina, los niveles de glucosa en sangre, el estado físico del paciente, el estado pulmonar del paciente, o análogos.
La administración por inhalación puede dar como resultado una farmacocinética comparable a la administración subcutánea de insulinas. Dispositivos de inhalación diferentes proporcionan típicamente farmacocinéticas similares cuando se comparan tamaños de partícula similares y niveles similares de deposición pulmonar.
Conforme a la invención, el derivado de insulina de esta invención puede suministrarse por cualquiera de una diversidad de dispositivos de inhalación conocidos en la técnica para administración de un agente terapéutico por 35 inhalación. Estos dispositivos incluyen inhaladores de dosis medidas, nebulizadores, generadores de polvo seco, pulverizadores, y análogos. El derivado de insulina de esta invención es suministrado por un inhalador o un pulverizador de polvo seco. Existen varias características deseables de un dispositivo de inhalación para administración del derivado de insulina de esta invención. Por ejemplo, el suministro por el dispositivo de inhalación es ventajosamente fiable, reproducible, y exacto. El dispositivo de inhalación debería suministrar partículas pequeñas, por ejemplo, inferiores a aproximadamente 10 μm, por ejemplo aproximadamente 1-5 μm, para respirabilidad satisfactoria. Algunos ejemplos específicos de dispositivos de inhalación disponibles comercialmente, adecuados para la práctica de esta invención son Turbohaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), inhalador Spiros™ (Dura), dispositivos comercializados por Inhale Therapeutics, AERx™ (Aradigm), el nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt), el nebulizador Acorn II® (Marquest Medical Products), el inhalador de dosis medidas
45 Ventolin® (Glaxo), el inhalador de polvo Spinhaler® (Fisons), o análogos.
Como reconocerán los expertos en la técnica, la formulación del derivado de insulina de esta invención, la cantidad de la formulación suministrada, y la duración de la administración de una sola dosis deben del tipo de dispositivo de inhalación empleado. Para sistemas de suministro de aerosoles, tales como nebulizadores, la frecuencia de administración y la duración del tiempo durante la cual el sistema permanece activado dependerán principalmente de la concentración del conjugado de insulina en el aerosol. Por ejemplo, pueden utilizarse periodos de administración más cortos a concentraciones mayores de conjugado de insulina en la solución nebulizadora. Dispositivos tales como inhaladores de dosis medidas pueden producir concentraciones de aerosol mayores, y pueden funcionar durante periodos más cortos a fin de suministrar la cantidad deseada del conjugado de insulina.
55 Los dispositivos tales como inhaladores de polvo suministran el agente activo hasta que una cantidad dada de agente es expulsada por el dispositivo. En este tipo de inhalador, la cantidad de derivado de insulina de esta invención en una cantidad dada del polvo determina la dosis suministrada en una sola administración.
El tamaño de partícula del derivado de insulina de esta invención en la formulación suministrada por el dispositivo de inhalación es crítico con respecto a la capacidad de insulina para llevar la misma a los pulmones, y a las vías aéreas inferiores o alvéolos. El derivado de insulina de esta invención puede formularse de tal modo que al menos aproximadamente 10% del conjugado de insulina suministrado se deposita en el pulmón, por ejemplo aproximadamente 10 a aproximadamente 20%, o más. Es sabido que la eficiencia máxima de deposición pulmonar para humanos que respiran por la boca se obtiene con tamaños de partícula de aproximadamente 2 μm a 65 aproximadamente 3 μm. Cuando los tamaños de partícula son superiores a aproximadamente 5 μm, la deposición
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Las composiciones que contienen derivados de insulina de esta invención pueden utilizarse en el tratamiento de estados que son sensibles a la insulina. Así, aquéllas pueden utilizarse en el tratamiento de la diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 e hiperglucemia, por ejemplo como la observada a veces en personas gravemente lesionadas y personas que han sufrido cirugía mayor. El nivel óptimo de dosis para cualquier paciente dependerá de una
5 diversidad de factores que incluyen la eficacia del derivado de insulina específico empleado, la edad, el peso corporal, la actividad física, y la dieta del paciente, en una posible combinación con otros fármacos, y de la gravedad del estado a tratar. Se recomienda que la dosis diaria del derivado de insulina de esta invención sea determinada para cada paciente individual por los expertos en la técnica de manera similar a lo que sucede para composiciones de insulina conocidas.
10 En caso adecuado, los derivados de insulina de esta invención pueden utilizarse en mezcla con otros tipos de insulina, v.g. análogos de insulina con un comienzo de acción más rápido. Ejemplos de tales análogos de insulina se describen, v.g., en las Solicitudes de Patente Europea que tienen los números de publicación EP 214826 (Novo Nordisk A/S), EP 375437 (Novo Nordisk A/S), y EP 383472 (Eli Lilly & Co.).
15 La presente invención se ilustra adicionalmente por los ejemplos que siguen que, sin embargo, no deben interpretarse como limitantes del alcance de protección.
Todos los encabezamientos y sub-encabezamientos se utilizan en esta memoria únicamente por conveniencia, y no 20 deben interpretarse como limitantes de la invención en modo alguno.
El uso de cualquiera y la totalidad de los ejemplos, o expresiones lingüísticas (v.g., "tal como"), proporcionado en esta memoria, debe entenderse meramente para esclarecer mejor la invención, y no establece limitación en cuanto al alcance de la invención a no ser que se reivindique lo contrario. Ninguna expresión lingüística en la memoria
25 descriptiva debería interpretarse como indicativa de que cualquier elemento no reivindicado sea esencial para la práctica de la invención.
La citación e incorporación de documentos de patente en esta memoria se hace únicamente por conveniencia, y no refleja aspecto alguno en cuanto a la validez, patentabilidad, y/o aplicabilidad de tales documentos de patente.
30 La invención incluye todas las modificaciones equivalentes de la materia objeto citada en las reivindicaciones adjuntas a esta memoria que son permitidas por la ley aplicable.
EJEMPLOS
35
Ejemplo 1
Síntesis de insulina humana NεB29{3-[2-(16-carboxihexadecilcarbamoil)-etilamino]-propionil}-desB30 40
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Paso 1: Ácido 3-(2-benciloxicarboniletilamino)-propiónico
Se añadió ácido 3-aminopropiónico (5 g, 56 milimoles) a etanol (50 mL), y se añadieron TEA (7,8 mL, 56 mmoles) y 45 agua (50 mL), y la mezcla se calentó a reflujo bajo nitrógeno. Se añadieron éster-bencílico de ácido acrílico ((9,1 g,
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(5 mL), se secó sobre MgSO4, y se secó a vacío. Se purificó por cromatografía flash (sílice) eluyendo con AcOEt/heptano (9:1) y AcOEt. Las fracciones apropiadas se agruparon y se concentraron a vacío para dar 58 mg. LCMS: m/z: 682 (M+1).
5 Paso 7: Insulina humana NεB29-{3-[2-(16-carboxihexadecilcarbamoil)-etilamino]-propionil}-desB30 Se disolvió insulina desB30 (126 mg, 0,022 milimoles) por adición de Na2CO3 100 mM (1,5 mL) y acetonitrilo (1,5 mL) en un matraz de 10 mL con fondo redondo. Se añadió éster-ter-butílico del ácido 17-(3-{ter-butoxicarbonil-[2(2,5-dioxopirrolidin-1-iloxicarbonil)-etil]-amino}-propionilamino-heptadecanoico (15 mg, 0,022 milimoles) en acetonitrilo (750 μl) y se añadió Na2CO3 (750 μl), con lo que la solución final era Na2CO3/100 nM/acetonitrilo 50:50.
10 La solución se agitó a la temperatura ambiente durante 1 hora. Se transfirió la solución a un tubo de centrífuga de 15 mL, lavando con agua Milli-Q (6 mL). La solución se enfrió sobre hielo, y el pH se ajustó a 5,1 por adición de HCl 1 N, lo que condujo a precipitación. El tubo se centrifugó a 5000 rpm durante 10 minutos a 10ºC. Se decantó el disolvente del sólido. Se añadió al sólido TFA/agua 95:5 (2,5 mL). La solución se vertió en un matraz RB, lavando con más TFA/agua 95:5 (2,5 mL). La solución se agitó durante 30 min a la temperatura ambiente, y se concentró a
15 vacío. Se añadió DCM y se separó dos veces, y el matraz se secó a vacío a la temperatura ambiente. El producto se purificó utilizando cromatografía de intercambio iónico. Columna: Resource Q 6 mL. Tampón A: TRIS 15 mM, acetato de amonio 30 mM, etanol 50% v/v, pH 7,5 con AcOH. Tampón B: TRIS 15 mM, acetato de amonio 300 mM, etanol 50% v/v, pH 7,5 con AcOH.
20 Se eluye con 4 mL/min de tampón A 2 CV, y luego con un gradiente de 0-80% tampón B sobre 12 CV.
La fracción apropiada se diluyó con agua y se acidificó a pH 2, después de lo cual se cargó en una columna Resource RPC de 3 mL en etanol al 20%, TFA al 0,1% y se eluyó con etanol 50%, TFA 0,1%. Las fracciones 25 apropiadas se agruparon, se diluyeron con agua y se liofilizaron para dar 15 mg. LCMS: m/z: 1529,7 (M/4 = 1529,3).
Ejemplo 2
30 Síntesis de insulina humana NεB29-{3-[2-(2-carboxitetradecarbamoil)-etilamino]-propionil}-desB30
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El compuesto del título se preparó de manera análoga a los métodos descritos en el Ejemplo 1, aunque el producto 35 final se purificó utilizando HPLC preparativa (columna C18 de 2 cm de diámetro, acetonitrilo/agua/TFA al 0,1%). LCMS: 1523,3 (M/4 = 1522,3).
Ejemplo 3
40 Síntesis de insulina humana NεB29-(2-{[(14-carboxitetradecilcarbamoil)-metil]-amino}-acetilo)desB30
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El éster-mono-ter-butílico del ácido hexadecanodioico puede activarse con TSTU de manera similar al método descrito en el Ejemplo 1, Paso 6. El producto puede hacerse reaccionar con Boc-Lys-OH en DMF a la temperatura ambiente durante 16 horas. Después de concentrar a vacío, puede añadirse AcOEt al residuo y la mezcla puede 5 lavarse con HCl 0,2 N. La fase orgánica se seca luego sobre MgSO4 y se concentra a vacío para dar el producto bruto, éster-ter-butílico del ácido 15-((S)-5-ter-butoxicarbonilamino-5-carboxipentilcarbamoíl)-pentadecanoico. Éste puede utilizarse sin purificación ulterior o purificarse por cromatografía flash. Este compuesto puede activarse con TSTU de manera similar al método descrito en el Ejemplo 1, Paso 6 para dar el éster-ter-butílico del ácido 15-[(S)-5ter-butoxi-carbonilamino-5-(2,5-dioxopirrolidin-1-iloxicarbonil)-pentil-carbamoíl]-pentadecanoico, y este compuesto
10 puede acoplarse a insulina y desprotegerse para dar el compuesto del título como se describe en el Ejemplo 1, Paso 7, utilizando HPLC preparativa para aislar el producto.
Ejemplo 5
15 Síntesis de insulina humana NεB29-{(S)-2-amino-3-[(S)-2-amino-3-(15-carboxipentadecanoilamino)-propionilamino]propionil}-desB30 El éster-ter-butílico del ácido 15-[(S)-2-ter-butoxicarbonilamino-2-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-iloxicarbonil)-etilcarbamoil] pentadecanoico se puede preparar de manera similar a la descrita para el éster-ter-butílico del ácido 15-[(S)-5-terbutoxicarbonilamino-5-(2,5-dioxopirrolidin-1-iloxicarbonil)pentilcarbamoil]pentadecanoico utilizando ácido (S)-3
20 amino-2-ter-butoxicarbonilaminopropiónico, y éste puede hacerse reaccionar con ácido (S)-3-amino-2-terbutoxicarbonilamino-propiónico en DMF a la temperatura ambiente durante 16 horas. Después de concentrar a vacío, puede añadirse AcOEt al residuo, y la mezcla puede lavarse con HCl 0,2 N. La fase orgánica se seca luego sobre MgSO4 y se concentra a vacío para dar el producto bruto, éster-ter-butílico del ácido 15-[(S)-2-terbutoxicarbonilamino-2-((S)-2-ter-butoxicarbonilamino-2-carboxietilcarbamoil)etilcarbamoil]pentadecanoico. Éste
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Este compuesto puede activarse con TSTU de manera similar al método descrito en el Ejemplo 1, Paso 6 para dar éster-ter-butílico del ácido 15-{(S)-2-ter-butoxicarbonilamino-2-[(S)-2-ter-butoxicarbonilamino-2-(2,5-dioxopirrolidin-130 iloxicarbonil)etilcarbamoil]etilcarbamoil}pentadecanoico, y este compuesto puede acoplarse a insulina para dar el compuesto del título como se describe en el Ejemplo 1, Paso 7 utilizando HPLC preparativa para aislar el producto.
Ejemplo 6
Síntesis de insulina humana NεB29-[(S)-6-amino-2-(15-carboxipentadecanoilamino)-hexanoil]-desB30
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El compuesto del título puede prepararse de manera similar a los métodos utilizados en el ejemplo 4.
Ejemplo 7
Síntesis de insulina humana NεB29-3-{[2-(15-carboxi-pentadecanoilamino)-etil]-metil-amino}-propionil-desB30
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15 -Se disolvieron 1-Boc-amino-2-metil-amino-etano (1 g, 4,75 mmol) y acrilato de ter-butilo (0,61 g, 4,75 mmol) en etanol (10 mL) con dietilamina (1,32 mL, 9,5 mmol) y se mantuvo a reflujo durante una noche. Se evaporó el disolvente a vacío, y se aisló el éster-ter-butílico del ácido 3-(Boc-aminoetil-metil-amino)-propiónico por adición de acetato de etilo (300 mL) y lavado 2 veces con carbonato de sodio al 5%, agua y salmuera, seguido por secado
20 sobre sulfato de magnesio y evaporación a vacío para dejar un aceite (630 mg, 44%). LCMS: m/z : 303,5 (M+H)1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 5,11 (bs, 1H), 3,20 (t, 2H), 2,65 (t, 2H), 2,46 (t, 2H), 2,37 (t, 2H), 2,21 (s, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,44 (s, 9H).
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Se trató el éster-ter-butílico del ácido 3-(Boc-aminoetil-metil-amino)-propiónico (630 mg, 2,1 mmol) con ácido trifluoroacético (6 mL) durante 2 horas. Se aisló la sal de ácido trifluoroacético del ácido 3-(aminoetil-metil-amino)propiónico por recristalización en THF para dar un polvo blanco, 974 mg (cuantitativo).
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luego con los tiempos de retención de las moléculas estándar siguientes: azul dextrano (>5 MDa, KAV 0,0), tiroglobulina (669 kDa, KAV 0,28) Ferritina (440 kDa, KAV 0,39), Ovoalbúmina (44,5 kDa, KAV 0,56), Ribonucleasa (13,7 kDa, KAV 0,69) y una segunda referencia de albúmina (66 kDa, KAV 0,53), hexámero de Co(III)insulina (35 kDa, KAV 0,61), e insulina monómera X2 (6 kDa, KAV 0,73).
Para determinar el valor KAV del derivado se utiliza la ecuación siguiente:
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10 donde t es el tiempo de retención para un pico dado, t0 es el tiempo de retención para azul dextrano, Vt es el volumen total de la columna (en este caso 2,4 mL), f es el flujo (en este caso 0,04 mL/min), y td es el tiempo de retención para azul dextrano sin la columna en el sistema.
El valor Kav indica el grado de autoasociación de un derivado, es decir un Kav grande similar al Kav para el
15 hexámero de Co(III)insulina y el monómero de insulina X2 exhibe poca o ninguna propensión del derivado a formar complejos grandes autoasociados, mientras que un Kav muy pequeño, próximo a cero o incluso negativo muestra gran propensión del derivado a autoasociación en complejos grandes solubles.
Datos de hidrofobicidad en los derivados de insulina conforme a la invención
20 La hidrofobicidad (índice de hidrofobicidad) de los derivados de insulina de la invención con relación a la insulina humana, k’rel, se midió en una columna HPLC LiChrosorb RP18 (5µm, 250x4 mm) por elución isocrática a 40 °C utilizando mezclas de A) tampón de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,3, que contenían 10% de acetonitrilo, y B) 50% de acetonitrilo en agua como eluyentes. La elución se monitorizó siguiendo la absorción UV del eluato a 214 nm. El tiempo en vacío, t0, se encontró por inyección de nitrato de sodio 0,1 mM. El tiempo de retención para la insulina
25 humana, thuman, se ajustó a 2t0 como mínimo variando la ratio entre las soluciones A y B. k'rel= (tderivado-t0)/(thuman-t0). Valores encontrados de k'rel para varios derivados de insulina conforme a la invención se dan en la Tabla 1.
Ensayo de Afinidad para Seroalbúmina Humana
30 Constante de fijación relativa del análogo 125I-TyrA14 para seroalbúmina humana inmovilizada en partículas Minileak y medida a 23 ºC (detemir = 1 en tampón salino).
Susceptibilidad de mezcla de las insulinas de acción prolongada y acción breve analizadas por cromatografía de exclusión por tamaños de mezclas de insulina
35 SEC: Susceptibilidad de mezcla de Insulina Aspart (3 Zn/6 insulina, glicerol 1,6%, fenol 16 mM y m-cresol 16 mM, cloruro de sodio 10 mM, fosfato 7 mM, pH 7,4) e insulina de acción prolongada (2,1 o 6 Zn/6 insulina) 30:70, medida por recogida de fracciones de SEC (como se ha descrito arriba) y cuantificación por HPLC de la presencia de insulinas de acción prolongada y acción rápida en la fracción de peso molecular alto (fracción 2, PM > HSA) y en la fracción de peso molecular bajo (fracción 3, PM = HSA), respectivamente.
40 Se recogen 4 fracciones para el tamaño de 16 min después del retardo, de las cuales la fracción 2 [16-32 min] (pico 1) contiene la forma asociada mayor que albúmina (32 min corresponden a KAV 0,46) y la fracción 3 (pico 2) contiene las formas dihexámera, hexámera, dímera y monómera de insulina.
45 HPLC: Cromatografía de fase inversa en un gradiente Zorbax Eclipse XDB-C18 2,1*15 mm (1,8 µm) eluido con tampón A: sulfato de sodio 0,2 M, fosfato de sodio 0,04 M, acetonitrilo 10 %, pH 7,2 y tampón B: acetonitrilo 70 % a 30 °C, 19-34 % B in 4,5 min. lineal, condición inicial repentina a los 5 min., tiempo de ejecución de 7 min., flujo de 0,5 mL/min., volumen de inyección de 14 µL y detección UV a 276 nm utilizando como referencia Insulina Aspart de 609 µM para ambos análogos.
50
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Claims (1)

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ES08846415.1T 2007-11-08 2008-11-07 Derivado de insulina Active ES2543393T3 (es)

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EP07120251A EP2058330A1 (en) 2007-11-08 2007-11-08 Insulin derivative
EP08161557 2008-07-31
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