ES2543907T3 - Aumento de los niveles de alcaloides nicotínicos - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para incrementar la nicotina en una planta de Nicotiana, que comprende sobreexpresar un gen NBB1 en relación con una planta de control, en el que dicho gen NBB1 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido en la SEQ ID NO: 2.
Description
E11187201
28-07-2015
[0060] Las “células no productoras de nicotina” se refieren a células de cualquier organismo que no producen nicotina ni alcaloides nicotínicos relacionados. Algunas células ilustrativas incluyen, pero no se limitan a células de plantas como Atropa belladona y Arabidopsis thaliana, así como células de insectos, mamíferos, levaduras, hogos,
5 algas o bacterias.
[0061] Un “análogo de nicotina” tiene la estructura básica de la nicotina, pero puede tener, por ejemplo, diferentes sustituyentes en el anillo. Por ejemplo, un análogo de la nicotina puede sustituir un hidrógeno (-H) por el grupo metilo (-CH3), con lo que se produce nornicotina, que es un análogo de la nicotina. Además de tener en común
10 una estructura similar con la nicotina, los análogos de nicotina pueden producir efectos fisiológicos similares. Por ejemplo, la cotinina se ha citado por sus efectos positivos en la mejora de la concentración y la memoria y, consiguientemente, es un análogo de la nicotina. Por consiguiente, los análogos de la nicotina se definen ampliamente para cubrir todos y cada uno de los compuestos que tienen una estructura y actividad funcional similar a la de la nicotina.
15
[0062] Recientemente, ha habido gran interés en la síntesis de análogos que reconozcan específicamente los receptores de la nicotina y proporcionen efectos terapéuticos para enfermedades neurodegenerativas y 20 discapacidades cognitivas. Por ejemplo, Targacept, una empresa farmacéutica formada como extensión de R. J. Reynolds Tobacco Company, se esfuerza en desarrollar y comercializar fármacos análogos de la nicotina, basados en la activación selectiva de receptores neuronales nicotínicos de acetilcolina (NNR). Dado que la presente invención proporciona una nueva enzima de la biosíntesis de nicotina, puede ser valioso el uso de NBB1 solo, o NBB1 y A622, para el desarrollo de nuevos análogos de nicotina. Por ejemplo, mediante el uso de los
25 procedimientos y construcciones de la invención, puede producirse un análogo de un alcaloide nicotínico al proporcionar un precursor análogo de la nicotina a un sistema de cultivo celular.
[0063] Adicionalmente, las enzimas pueden usarse para la síntesis in vitro de nicotina y compuestos relacionados. Es decir, pueden usarse A622 y NBB1 recombinantes para la síntesis o la síntesis parcial de un
30 alcaloide nicotínico y un análogo de un alcaloide nicotínico.
[0064] Se han identificado genes de biosíntesis de alcaloides nicotínicos en varias especies de plantas, como
35 por ejemplo, plantas de Nicotiana. Por consiguiente, la presente descripción abarca cualquier ácido nucleico, gen, polinucleótido o molécula de ADN, ARN, ARNm o ADNc aislada de una especie de plantas o producida sintéticamente que aumente la biosíntesis de alcaloides nicotínicos en Nicotiana. Adicionalmente, la expresión de tal secuencia de biosíntesis de alcaloides nicotínicos produce alcaloides nicotínicos en una célula no productora de nicotina, como una célula de un insecto. El ADN o ARN puede ser bicatenario o monocatenario. El ADN
40 monocatenario puede ser la hebra codificante, también denominada hebra sentido, o puede ser la hebra no codificante, también denominada hebra antisentido.
[0065] Se entiende que NBB1, A622, QPT y PMT incluyen las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 1, 1B, 3, 3B, 5, 5B, 7 y 7B, respectivamente, así como moléculas de ácido nucleico compuestas por variantes de SEQ ID NO: 45 1, 1B, 3, 3B, 5, 5B, 7 y 7B, con una o más bases suprimidas, sustituidas, insertadas o añadidas, en que las variantes codifican un polipéptido con actividad de biosíntesis de alcaloides nicotínicos. Por consiguiente, las secuencias con “secuencias de bases con una o más bases suprimidas, sustituidas, insertadas o añadidas” retienen la actividad fisiológica incluso cuando la secuencia aminoacídica codificada tiene uno o más aminoácidos sustituidos, suprimidos, insertados o añadidos. Adicionalmente, pueden existir múltiples formas de A622, NBB1, QTPasa y
50 PTMasa, que pueden deberse a la modificación postraduccional de un producto génico o a múltiples formas de los genes PMT, QPT, A622 o NBB1 respectivos. Las secuencias nucleotídicas que tienen tales modificaciones y que codifican una enzima de biosíntesis de alcaloides nicotínicos están incluidas dentro del alcance de la presente invención.
55 [0066] Por ejemplo, pueden suprimirse las regiones no traducidas de la cola de poli A o los extremos 5’ o 3’ y pueden suprimirse bases hasta llegar a la supresión de aminoácidos. También es posible sustituir bases, siempre que no se produzcan cambios en el marco de lectura. Asimismo pueden “añadirse” bases hasta llegar a añadir aminoácidos. Sin embargo, es esencial que ninguna de tales modificaciones resulte en la pérdida de la actividad enzimática de biosíntesis de alcaloides nicotínicos. Un ADN modificado en este contexto puede obtenerse por
11
E11187201
28-07-2015
Nicotiana spegazzinii, Nicotiana stocktonii, Nicotiana suaveolens, Nicotiana sylvestris, N. tabacum, Nicotiana thyrsiflora, Nicotiana tomentosa, Nicotiana tomentosiformis, Nicotiana trigonophylla, Nicotiana umbratica, Nicotiana undulata, Nicotiana velutina, Nicotiana wigandioides y Nicotiana x sanderae.
5 [0095] En la presente descripción, las “raíces capilares de tabaco” se refieren a raíces de tabaco que tienen ADN-T de un plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes integrado en el genoma y crecen en cultivo sin la adición de auxina u otras fitohormonas. Las raíces capilares de tabaco producen alcaloides nicotínicos al igual que las raíces de una planta de tabaco. Estos tipos de raíces se caracterizan por un crecimiento rápido, ramificación frecuente, plagiotropismo y la capacidad de sintetizar los mismos compuestos que las raíces de la planta intacta. David y col.,
10 Biotechnology 2: 73-76 (1984). Las raíces de las plantas solanáceas constituyen el lugar principal de biosíntesis de alcaloides tropánicos y, por lo tanto, los cultivos de raíces capilares son capaces de acumular altos niveles de estos metabolitos. Por ejemplo, véase Oksman-Caldentey & Arroo, "Regulation of tropane alkaloid metabolism in plants and plant cell cultures," en METABOLIC ENGINEERING OF PLANT SECONDARY METABOLISM 253-81 (Kluwer Academic Publishers, 2000).
15
[0096] La descripción contempla la manipulación por ingeniería genética de “células no productoras de nicotina” con una secuencia de ácido nucleico codificante de una enzima implicada en la producción de alcaloides
20 nicotínicos. Una célula no productora de nicotina se refiere a una célula de cualquier organismo que no produce nicotina. Algunas células ilustrativas incluyen, pero no se limitan a células de plantas como Atropa belladona, Arabidopsis thaliana, así como células de insectos, mamíferos, levaduras, hongos, algas o bacterias. Las células huésped adecuadas se discuten más detalladamente en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, California (1990).
25 [0097] Una “célula de insecto” se refiere a cualquier célula de un insecto que puede transformarse con un gen codificante de una enzima de la biosíntesis de nicotina y que es capaz de expresar la enzima o sus productos en cantidades recuperables. Algunas células de insectos ilustrativas incluyen las células Sf9 (ATCC CRL 1711).
30 [0098] Una “célula fúngica” se refiere a cualquier célula de un hongo que puede transformarse con un gen codificante de una enzima de la biosíntesis de nicotina y que es capaz de expresar la enzima o sus productos en cantidades recuperables. Algunas células fúngicas ilustrativas incluyen células de levaduras como Saccharomyces cerevisiae (Baldari y coI., 1987. EMBO J. 6: 229-234) y Pichia pastoris (por ejemplo, P. pastoris KM714, disponible de Invitrogen). También pueden usarse células de hongos filamentosos como Aspergillus y Trichoderma. Archer y
35 col., Antonie van Leeuwenhoek 65: 245-250 (2004).
[0099] Una “célula bacteriana” se refiere a cualquier célula bacteriana que puede transformarse con un gen codificante de una enzima de la biosíntesis de nicotina y que es capaz de expresar la enzima o sus productos en cantidades recuperables. Algunas células bacterianas ilustrativas incluyen E. coli, como la cepa de E. coli M15/rep4,
40 disponible comercialmente de QIAGEN.
[0100] Una “célula de mamífero” se refiere a cualquier célula de un mamífero que puede transformarse con un gen codificante de una enzima de la biosíntesis de nicotina y que es capaz de expresar la enzima o sus productos en cantidades recuperables. Algunas células de mamíferos ilustrativas incluyen las células de ovario de hámster 45 chino (CHO) o células COS. Las células de mamíferos pueden incluir también un ovocito fertilizado o una célula madre embrionaria no humana en la que se han introducido secuencias codificantes de una enzima de la biosíntesis de alcaloides nicotínicos. Tales células huésped pueden usarse después para crear animales transgénicos no humanos. Algunos ejemplos de sistemas para la expresión regulada de proteínas en células de mamíferos incluyen los sistemas de expresión génica Tet-Off y Tet-On de Clontech y sistemas similares. Gossen y Bujard, Proc. Natl.
50 Acad. Sci. USA 89: 5547-5551 (1992).
[0101] Una “célula de alga” se refiere a cualquier especie de alga que puede transformarse con un gen codificante de una enzima de la biosíntesis de nicotina sin afectar al desarrollo o la fisiología normal del alga. Algunas células de algas ilustrativas incluyen Chlamydomonas reinhardtii (Mayfield y Franklin, Vaccine 23: 1828
[0102] Dado que la producción de alcaloides nicotínicos en una célula de un insecto podría afectar negativamente al crecimiento y desarrollo del insecto, un sistema de expresión inducible puede mitigar los efectos adversos. Por ejemplo, las células de insecto pueden permitirse crecer primeramente en condiciones no inductoras
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