ES2544480T3

ES2544480T3 - Proceso para producir dipéptidos

Info

Publication number: ES2544480T3
Application number: ES08001324.6T
Authority: ES
Inventors: Shin-Ichi Hashimoto; Kazuhiko Tabata; Aya Hada; Hajime Ikeda
Original assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Current assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date: 2002-12-26
Filing date: 2003-12-29
Publication date: 2015-08-31
Anticipated expiration: 2023-12-29
Also published as: EP1908773B8; EP1433791A2; EP1983059A2; ATE392430T1; WO2004058960A1; EP1433791B1; DE60320362D1; KR20050084466A; EP1908773B1; US20090191589A1; JPWO2004058960A1; AU2003296151A1; EP1983059A3; ES2306835T3; EP1908773A2; HK1086296A1; CN100400660C; US8039236B2; CN1720325A; DE60320362T2

Abstract

Una proteína de las siguientes (a) o (b): (a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID Nº: 2 a 8; (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que muestra el 95 % de identidad o superior con la secuencia de aminoácidos que se muestra en cualquiera de las SEC ID Nº: 6 a 8 y que tiene la actividad de sintetizar un dipéptido aminoácido L-aminoácido L; considerando que se excluye una proteína con la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID Nº: 1.

Description

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Son ejemplos de los ADN que pueden obtenerse mediante el método descrito anteriormente ADN que tienen las secuencias de nucleótidos que se muestran en las SEC ID Nº: 9 a 16.

Los ejemplos de los vectores para la inserción del ADN descrito en este documento o ADN usado en el proceso de producción descrito en este documento incluyen pBluescriptll KS(+) (Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK(+) (Stratagene), pT7 Blue (Novagen. Inc.), pCR II (Invitrogen Corp.) y pCR-TRAP (Genhunter Corp.).

Como célula hospedadora, pueden usarse microorganismos que pertenecen al género Escherichia, etc. Los ejemplos de los microorganismos que pertenecen al género Escherichia incluyen Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli ATCC 12435, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli Nº 49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522 y Escherichia coli ME8415.

La introducción del ADN recombinante puede llevarse a cabo por cualquiera de los métodos para introducir ADN en el interior de las células hospedadoras anteriores, por ejemplo, el método que usa ion calcio [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69,2110 (1972)], el método de protoplastos (Solicitud de patente japonesa publicada no examinada Nº 248394/88) y electroporación [Nucleic Acids Res., 16, 6127(1988)].

Un ejemplo del microorganismo que lleva el ADN usado en el proceso de producción descrito en este documento obtenido mediante el método anterior es Escherichia coli NM522/pPE43, que es un microorganismo transformado con un ADN recombinante que comprende un ADN que tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID Nº: 1.

(ii) Proceso para producir una proteína de la presente invención

Puede producirse una proteína de la invención mediante la expresión en células hospedadoras del ADN de la presente invención o de un ADN usado en el proceso de producción de la presente invención, obtenido mediante los métodos descritos en el aparatado (i) anterior, usando los métodos que se describen en Molecular Cloning, Segunda Edición, Current Protocols in Molecular Biology, etc., por ejemplo, de la forma siguiente.

En base a un ADN descrito en este documento o a un ADN usado en el proceso de producción descrito en este documento, se prepara según sea necesario un fragmento de ADN de una longitud apropiada que comprende una región que codifica una proteína aplicada en los métodos de la presente invención. La productividad de la proteína puede mejorarse por reemplazo de un nucleótido en la secuencia de nucleótidos de la región que codifica la proteína de tal modo que se genere un codón más adecuado para la expresión en una célula hospedadora. Se reconocerá como parte de la invención que se está describiendo en este momento un ADN que comprende una secuencia de ácido nucleico de codón optimizado del mismo.

El fragmento de ADN puede insertarse cadena abajo de un promotor en un vector de expresión apropiado para preparar un ADN recombinante.

Puede obtenerse un transformante que produzca una proteína descrita en este documento mediante la introducción del ADN recombinante en el interior de una célula hospedadora apropiada para el vector de expresión.

Como célula hospedadora puede usarse cualquier célula bacteriana, célula de levadura, célula animal, célula de insecto, célula vegetal, etc. que sea capaz de expresar el gen deseado.

Los vectores de expresión que pueden emplearse son los capaces de una replicación autónoma o de la integración dentro del cromosoma en las células hospedadoras anteriores y que comprenden un promotor en una posición apropiada para la transcripción de un ADN descrito en este documento o de un ADN usado en el proceso descrito en este documento.

Cuando se usa un procariota tal como una bacteria como célula hospedadora, se prefiere que un ADN recombinante que comprende un ADN descrito en este documento o un ADN usado en el proceso de producción descrito en este documento sea un ADN recombinante que sea capaz de una replicación autónoma en el procariota y que comprenda, por ejemplo, un promotor, una secuencia de unión a ribosomas, un ADN de la presente invención o un ADN usado en el proceso de producción de la presente invención y una secuencia de terminación de la transcripción. El ADN recombinante puede comprender además un gen que regule el promotor.

Son ejemplos de vectores de expresión adecuados pBTrp2, pBTac1 y pBTac2 (productos de Boehringer Mannheim GmbH), pHelix1 (Roche Diagnostics Corp.), pKK233-2 (Amersham Pharmacia Biotech), pSE280 (Invitrogen Corp.), pGEMEX-1 (Promega Corp.), pQE-8 (Qiagen, Inc.), pET-3 (Novagen, Inc.), pKYP10 (Solicitud de patente japonesa publicada no examinada Nº 110600/83), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK(+), pBluescript II KS(-) (Stratagene), pTrs30 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)], pTrs32 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)], pPAC31 (WO98/12343), pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)],

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La introducción del vector recombinante puede llevarse a cabo por cualquiera de los métodos para introducir ADN en el interior de células vegetales, por ejemplo, el método que usa Agrobacterium (Solicitudes de patente japonesa publicadas no examinadas Nº 140885/84 y 70080/85, WO94/00977), electroporación (Solicitud de patente japonesa publicada no examinada Nº 251887/85) y el método que usa una pistola de partículas (pistola de genes) (Patentes

5 japonesas Nº 2606856 y 2517813).

Cuando el ADN se expresa en levaduras, una célula animal, una célula de insecto o una célula vegetal, puede obtenerse una proteína glicosilada.

10 La proteína descrita en este documento puede producirse mediante el cultivo del transformante obtenido como anteriormente en un medio, dejar que se forme una proteína descrita en este documento y que se acumule en el cultivo y recuperar la proteína a partir del cultivo.

El hospedador del transformante anterior para producir la descrita en este documento puede ser cualquier bacteria,

15 levadura, célula animal, célula de insecto, célula vegetal o similar, pero preferiblemente es una bacteria, más preferiblemente un microorganismo que pertenece al género Escherichia y, aún más preferiblemente, un microorganismo que pertenece a Escherichia coli.

El cultivo del transformante anterior en un medio puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales para el 20 cultivo del hospedador.

Para el cultivo del transformante obtenido mediante el uso de un procariota tal como Escherichia coli o de un eucariota tal como una levadura como hospedador, puede usarse cualquiera de los medios naturales y medios sintéticos en la medida en que sea un medio adecuado para el cultivo eficaz del transformante que contenga fuentes

25 de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, etc. que puedan asimilarse por el hospedador que se use.

Como fuentes de carbono puede usarse cualquier fuente de carbono que pueda asimilarse por el hospedador. Los ejemplos de fuentes de carbono adecuadas incluyen hidratos de carbono tales como glucosa, fructosa, sacarosa, melaza que las contiene, almidón y almidón hidrolizado; ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido

30 propiónico; y alcoholes tales como etanol y propanol.

Como fuentes de nitrógeno, pueden usarse amoniaco, sales de amonio de ácidos orgánicos o inorgánicos tales como cloruro de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio y fosfato de amonio y otros compuestos que contienen nitrógeno, así como peptona, extracto de carne, extracto de levadura, agua de macerado de maíz,

35 hidrolizado de caseína, torta de soja, hidrolizado de torta de soja y diversas células microbianas fermentadas y productos digeridos de las mismas.

Los ejemplos de las sales inorgánicas incluyen dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro sódico, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre y

40 carbonato cálcico.

El cultivo se lleva a cabo habitualmente en condiciones de aerobiosis, por ejemplo, mediante cultivo en agitación o cultivo rotativo sumergido bajo aireación. La temperatura de cultivo es preferiblemente de 15 a 40 ºC y el periodo de cultivo es habitualmente de 5 horas a 7 días. El pH se mantiene a de 3,0 a 9,0 durante el cultivo. El ajuste del pH se

45 lleva a cabo mediante el uso de un ácido orgánico o inorgánico, una solución alcalina, urea, carbonato cálcico, amoniaco, etc.

Si es necesario, pueden añadirse antibióticos tales como ampicilina y tetraciclina al medio durante el cultivo.

50 Cuando se cultiva un microorganismo transformado con un vector de expresión que comprende un promotor inducible, puede añadirse un inductor al medio si es necesario. Por ejemplo, en el caso de un microorganismo transformado con un vector de expresión que comprende el promotor de lac, puede añadirse isopropil--D-tiogalactopiranósido o similar al medio; en el caso de un microorganismo transformado con un vector de expresión que comprende el promotor de trp, puede añadirse ácido indoleacrílico o similar.

55 Para el cultivo del transformante obtenido mediante el uso de una célula animal como célula hospedadora, pueden usarse como los medios que se emplean en general, tales como medio RPMI1640 [J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)], MEM de Eagle [Science, 122, 501 (1952)], DMEM [Virology, 8, 396 (1959)] y medio 199 [Proc. Soc. Biol. Med., 73, 1 (1950)], medios preparados por adición de suero de ternero fetal o similar a estos medios, etc.

60 El cultivo se realiza habitualmente a un pH de 6 a 8, a de 25 a 40 ºC durante de 1 a 7 días en presencia de CO2 al 5 %.

Si es necesario, pueden añadirse antibióticos tales como kanamicina, penicilina y estreptomicina al medio durante el 65 cultivo.

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Para el cultivo del transformante obtenido mediante el uso de una célula de insecto como célula hospedadora, pueden usarse como los medios que se emplean en general, tales como medio TNM-FH (PharMingen. Inc.), medio Sf-900 II SFM (Life Technologies, Inc.), ExCell 400 y ExCell 405 (JRH Biosciences, Inc.) y medio de insectos de Grace [Nature. 195, 788 (1962)].

El cultivo se realiza habitualmente a un pH de 6 a 7, a de 25 a 30 ºC durante de 1 a 5 días.

Si es necesario, pueden añadirse antibióticos tales como gentamicina al medio durante el cultivo.

El transformante obtenido mediante el uso de una célula vegetal como célula hospedadora puede cultivarse en la forma de células como tales o después de la diferenciación en células de plantas u órganos de plantas. Para el cultivo de dicho transformante, pueden usarse como el medio medios que se emplean en general, tales como medio de Murashige-Skoog (MS) y medio White, medios preparados por adición de fitohormonas tales como auxina y citoquinina a estos medios, etc.

El cultivo se realiza habitualmente a un pH de 5 a 9 a de 20 a 40 ºC durante de 3 a 60 días.

Si es necesario pueden añadirse antibióticos tales como kanamicina e higromicina al medio durante el cultivo.

Puede producirse una proteína descrita en este documento, de acuerdo con un método de cultivo convencional, del transformante procedente de un microorganismo, una célula de insecto, una célula animal o una célula vegetal y que lleva un ADN recombinante, preparado por ligación de un ADN descrito en este documento o de un ADN usado en el proceso de producción descrito en este documento con un vector de expresión, permitiendo que la proteína se forme y se acumule, y la recuperación de la proteína a partir del cultivo.

Una proteína descrita en este documento puede producirse mediante la producción intracelular por células hospedadoras, la secreción extracelular por células hospedadoras o la producción en membranas externas por células hospedadoras y, dependiendo del método seleccionado, la estructura de la proteína producida se modifica convenientemente.

Cuando se produce una proteína descrita este documento en células hospedadoras o en membranas externas de células hospedadoras, es posible forzar que la proteína se secrete hacia el exterior de las células hospedadoras por aplicación del método de Paulson, et al. [J. Biol. Chem. 264, 17619 (1989)], del método de Lowe, et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989); Genes Develop., 4, 1288 (1990)], o de los métodos que se describen en la Solicitud de patente japonesa publicada no examinada Nº 336963/93, en el documento WO94/23021, etc.

Es decir, la secreción extracelular de una proteína descrita en este documento por células hospedadoras puede provocarse mediante su producción en la forma de una proteína en la que se añade un péptido señal cadena arriba de una proteína, que contiene el sitio activo de una proteína de la presente invención, mediante el uso de técnicas de ADN recombinante.

También es posible aumentar la producción de proteína mediante la utilización de un sistema de amplificación de genes que use un gen de dihidrofolato reductasa o similar, de acuerdo con el método que se describe en la Solicitud de patente japonesa publicada no examinada Nº 227075/90.

Además, puede producirse una proteína descrita en este documento usando un animal que tenga un gen introducido (un animal transgénico no humano) o una planta que tenga un gen introducido (planta transgénica) generados mediante la rediferenciación de células de animal o de planta que lleven el gen introducido.

Cuando un transformante que produce una proteína descrita en este documento es un animal o planta, la proteína puede producirse mediante la cría o el cultivo del animal o de la planta de una forma habitual, dejar que la proteína se forme y se acumule en el mismo y recuperar la proteína a partir del animal o planta.

La producción de una proteína aplicada en los métodos de la presente invención usando un animal puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la producción de la proteína en un animal generado por la introducción del gen de acuerdo con métodos conocidos [Am. J. Clin. Nutr., 63, 639S (1996); Am. J. Clin. Nutr., 63, 627S (1996); Bio/Technology, 9, 830 (1991)].

En el caso de un animal, una proteína descrita en este documento puede producirse, por ejemplo, mediante la cría de un animal transgénico no humano que lleve un ADN introducido descrito en este documento o un ADN usado en el proceso de producción, dejar que la proteína se forme y se acumule en el animal y recuperar la proteína a partir del animal. Los lugares en los que la proteína se forma y se acumula incluyen la leche (Solicitud de patente japonesa publicada no examinada Nº 309192/88), el huevo, etc., del animal. Como promotor en este proceso, puede usarse cualquier promotor capaz de funcionar en un animal. Los promotores preferidos incluyen promotores específicos de células de la glándula mamaria, tales como promotor de -caseína, promotor de -caseína, promotor de -lactoglobulina y promotor de la proteína ácida del suero descrita en el presente documento.

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promotor de trp.

Se amplificó por PCR un fragmento del gen ywfE usando el cebador A y el cebador B anteriores y, como molde, el ADN cromosómico de Bacillus subtilis. Se amplificó por PCR un fragmento de la región del promotor de trp usando el cebador C y el cebador D y, como molde, pTrS30. La PCR se llevó a cabo mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94 ºC durante un minuto, una reacción a 55 ºC durante 2 minutos y una reacción a 72 ºC durante 3 minutos, usando 40 Bl de una mezcla de reacción que comprendía 0,1 g del ADN cromosómico o 10 ng de pTrS30 como molde, 0,5 mol/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu (Stratagene), 4 l de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) (Stratagene) y 200 mol/l de cada dNTP (dATP, dGTP, dCTP y dTTP).

Un décimo de cada una de las mezclas de reacción resultantes se sometió a electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se había amplificado un fragmento de ADN de aproximadamente 1,4 Kb que se correspondía con el fragmento del gen ywfE y un fragmento de ADN de aproximadamente 0,3 kb que se correspondía con el fragmento de la región del promotor de trp, respectivamente, en la PCR que usaba el cebador A y el cebador B y en la PCR que usaba el cebador C y el cebador D. Después, la mezcla de reacción restante se mezcló con una cantidad equivalente de fenol/cloroformo (1 vol/1 vol) saturado con TE [Tris-HCl 10 mmol/l (pH 8,0), EDTA 1 mmol/l]. La solución resultante se centrifugó y la fase superior obtenida se mezcló con un volumen de dos veces de etanol frío y se dejó reposar a -80 ºC durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó para precipitar el ADN y el ADN obtenido se disolvió en 20 l de TE.

Las soluciones obtenidas de este modo (5 l de cada) se sometieron, respectivamente, a una reacción para escindir el ADN amplificado usando el cebador A y el cebador B con las enzimas de restricción Xhol y BamHI y a una reacción para escindir el ADN amplificado usando el cebador C y el cebador D con las enzimas de restricción EcoRl y Xhol. Los fragmentos de ADN se separaron mediante una electroforesis en gel de agarosa y se recuperó un fragmento de 1,4 kb que contenía ywfE y un fragmento de 0,3 kb que contenía la región del promotor de trp, respectivamente, usando el GENECLEAN II Kit (BIO 101).

El pTrs30 [un vector de expresión que contiene el promotor de trp preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407), 0,2 g] se escindió con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante una electroforesis en gel de agarosa y se recuperó un fragmento de ADN de 4,5 kb de la misma forma que anteriormente.

El fragmento de 1,4 kb que contenía ywfE, el fragmento de 0,3 kb que contenía la región del promotor de trp y el fragmento de ADN de 4,5 kb obtenidos anteriormente se sometieron a una reacción de ligación usando un kit de ligación (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 16 ºC durante 16 horas.

Se transformaron Escherichia coli NM522 (Stratagene) usando la mezcla de reacción de acuerdo con el método que usa ion calcio [Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 69, 2110 (1972)], se sembraron en medio de agar LB que contenía ampicilina 50 g/ml y se cultivaron durante una noche a 30 ºC.

Se extrajo un plásmido a partir de una colonia del transformante que creció en el medio, de acuerdo con un método conocido, y la estructura del plásmido se analizó usando enzimas de restricción, mediante las cuales se confirmó que se había obtenido un vector de expresión pPE43 que contenía ywfE ligado cadena abajo del promotor de trp.

Ejemplo 3

Producción de un dipéptido

Se inoculó Escherichia coli NM522 que llevaba pPE43 (Escherichia coli NM522/pPE43) obtenida en el Ejemplo 2 en 8 ml de medio LB que contenía ampicilina 50 g/ml en un tubo de ensayo grande y se cultivó a 28 ºC durante 17 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener células húmedas.

Se preparó una mezcla de reacción (0,1 ml) que comprendía células húmedas 60 mg/ml (concentración final), tampón fosfato potásico 120 mmol/I (pH 7,4), cloruro de magnesio 60 mmol/l, ATP 60 mmol/l, L-Ala 30 mmol/l, L-Gln 30 mmol/l y Nymeen S-215 al 0,4 % y la reacción se llevó a cabo a 37 ºC durante 3 minutos.

Después de la terminación de la reacción, el producto de reacción se derivó mediante el método de dinitrofenol y después se analizó mediante HPLC. El análisis de HPLC se llevó a cabo usando como columna de separación una columna Lichrosorb-RP-18 (Kanto Kagaku) y como eluyente ácido fosfórico al 1 % (v/v) y acetonitrilo al 25 % (v/v) a una velocidad de flujo de 0,7 ml/min. Como resultado, se confirmó que se formaba L-alanil-L-glutamina (L-Ala-L-Gln) 120 mg/l y que se acumulaba en la mezcla de reacción.

No se observó formación de L-Ala-L-Gln cuando la reacción se llevaba a cabo usando células de Escherichia coli NM522/pTrS31, que es una cepa de control que sólo lleva vector.

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(ii) Se llevaron a cabo reacciones en las mismas condiciones que en el apartado (i) anterior usando mezclas de reacción que tenían la misma composición que la mezcla de reacción del apartado (i) anterior, excepto por que se usaron 0,01 mg de la enzima y se usaron L-Phe, L-Met, L-Leu y L-Val, respectivamente, en lugar de L-Gln. Después de la terminación de las reacciones, los productos de reacción se analizaron de la misma forma que en

5 el Ejemplo 3 anterior, mediante la cual se confirmó que se formaban y se acumulaban los siguientes dipéptidos en las respectivas mezclas de reacción: sólo L-alanil-L-fenilalanina (L-Ala-L-Phe) a 7,0 g/l; L-alanil-L-metionina (L-Ala-L-Met) a 7,0 g/l y L-Ala-L-Ala a 0,03 g/l; L-alanil-L-leucina (L-Ala-L-Leu) a 5,0 g/l y L-Ala-L-Ala a 0,2 g/l; y L-alanil-L-valina (L-Ala-L-Val) a 1,6 g/l y L-Ala-L-Ala a 0,3 g/l.

10 (iii) Se llevaron a cabo reacciones en las mismas condiciones que en el apartado (i) anterior usando mezclas de reacción que tenían la misma composición que la mezcla de reacción del apartado (i) anterior, excepto por que se usaron 0,01 mg de la enzima, se usó Gly en lugar de L-Ala y se usaron L-Phe y L-Met, respectivamente, en lugar de L-Gln. Después de la terminación de las reacciones, los productos de reacción se analizaron de la misma forma que en el Ejemplo 3 anterior, mediante la cual se confirmó que se formaban glicil-L-fenilalanina

15 (Gly-L-Phe) a 5,2 g/l y glicil-L-metionina (Gly-L-Met) a 1,1 g/l y se acumulaban en las respectivas mezclas de reacción.

Cuando se excluía el ATP de las composiciones de las mezclas de reacción anteriores, no se formaban dipéptidos.

20 Los resultados anteriores revelaron que el producto génico de ywfE tiene la actividad de producir, en presencia de ATP, los siguientes dipéptidos: L-Ala-L-Gln más L-Ala-L-Ala, L-Ala-L-Phe, L-Ala-L-Met más L-Ala-L-Ala, L-Ala-L-Leu más L-Ala-L-Ala o L-Ala-L-Val más L-Ala-L-Ala a partir de L-Ala más L-Gin, L-Phe, L-Met, L-Leu o L-Val; y Gly-L-Phe

o Gly-L-Met a partir de Gly más L-Phe o L-Met.

25 Ejemplo 6

Producción de dipéptidos usando la enzima recombinante marcada con His (2)

Se preparó una mezcla de reacción (0,1 ml) que comprendía 0,04 mg de la enzima recombinante marcada con His

30 purificada obtenida en el Ejemplo 4, Tris-HCl 100 mmol/l (pH 8,0), cloruro de magnesio 60 mmol/l y ATP 60 mmol/l. A esta mezcla se añadieron respectivamente combinaciones de aminoácidos L, Gly o -Ala, que se muestran en la primera fila de la Tabla 1 y aminoácidos L, Gly o -Ala, que se muestran en la columna izquierda de la Tabla 1, para dar una concentración de 30 mmol/l de cada, y las mezclas resultantes se sometieron a una reacción a 37 ºC durante 16 horas. Después de la terminación de las reacciones, los productos de reacción se analizaron mediante

35 HPLC, mediante la cual se confirmó que se formaban los dipéptidos que se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1-1

Ala: Gln Glu Gly Val Leu Ile Pro

Ala: AlaAla AlaGln AlaAla AlaAla AlaGly AlaAla AlaVal AlaAla AlaLeu AlaAla AlaIle AlaAla AlaAla

Gln: x x GlyGln GlyGly x x x x

Glu: GlyGly

Gly: GlyGly GlyGly

Val

Leu

lie

Pro

Phe

Trp

Met

Ser

Thr

Cys

Asn

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Lys

Arg

His

Asp

αAB

β-Ala

cit

Tabla 1-2

Phe: Trp Met Ser Thr Cys Asn Tyr

Ala: AlaPhe AlaAla AlaTrp AlaAla AlaMet AlaSer AlaAla AlaThr AlaAla AlaAla AlaAsn AlaAla AlaTyr AlaAla

Gln: ○ x MetMet SerGln SerSer ThrGln ThrThr ○ x x

Glu

Gly: GlyPhe GlyGly ○ GlyMet GlyGly GlySer GlyGly SerGly SerSer GlyThr GlyGly ThrGly ThrThr GlyGly ○ GlyGly GlyTyr GlyGly

Val: x

Leu: MetMet ThrLeu

ILe: MetMet

Pro: MetMet SerSer ThrThr

Phe: MetPhe MetPhe MetMet SerPhe ThrPhe ThrThr

Trp

Met: MetMet SerMet ThrMet ThrThr MetMet ○ MetTyr MetMet

Ser: SerSer SerThr SerSer ThrSer ThrThr SerTyr SerSer

Thr: ThrThr

Cys

Asn

Tyr

Lys

Arg

His

Asp

α -AB

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Phe: Trp Met Ser Thr Cys Asn Tyr

β -Ala

Cit

Tabla 1-3

Lys: Arg His Asp α-AB β-Ala Cit Azaserina Teanina

Ala: AlaAla ○ AlaArg AlaAla AlaHis AlaAla AlaAla AlaAla ○ AlaAla ○ AlaAla ○ AlaAla ○

Gln: x x x x ○

Glu

Gly: GlyGly ○ GlyArg GlyGly GlyGly GlyGly ○ ○

Val

Leu

Ile

Pro

Phe: x ○

Trp

Met: MetMet ○ MetMet ○ ○

Ser: SerHis SerSer ○

Thr: ThrThr ○

Cys

Asn

Tyr

Lys

Arg: ○

His: β -AlaHis

Asp

α-AB

β-Ala

Cit: ○

Los dipéptidos formados mediante la reacción que usaba como sustratos dos (o una) clases de aminoácidos L, Gly o

5 -Ala que se muestran en la primera fila y en la columna izquierda de la Tabla 1 se muestran en la celda respectiva de la tabla. En la tabla, ○ significa que se formaba un dipéptido aunque no estaba identificada su secuencia; X significa que no estaba confirmada la formación de un dipéptido; y un espacio en blanco significa que la reacción no se llevó a cabo.

10 Ejemplo 7

Producción de un dipéptido usando la cepa que expresa la enzima recombinante marcada con His

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Se inoculó la Escherichia coli NM522/pQE60ywfE obtenida en el Ejemplo 4, en 8 ml de medio LB que contenía ampicilina 50 g/ml en un tubo de ensayo grande, y se cultivó a 28 ºC durante 17 horas. El cultivo resultante se inoculó en 50 ml de medio LB que contenía ampicilina 50 g/ml en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se cultivó a 30 ºC durante 3 horas. Después, se añadió isopropil--D-tiogalactopiranósido (IPTG) para dar una concentración final de 1 mmol/l, seguido de un cultivo adicional a 30 ºC durante 4 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener células húmedas.

Se añadió una mezcla de reacción (20 ml, pH 7,2) que comprendía células húmedas 200 g/l, glucosa 50 g/l, ácido fítico 5 g/l (diluido hasta la neutralidad con una solución de hidróxido sódico concentrada al 33 %), dihidrogenofosfato de potasio 15 g/l, sulfato de magnesio heptahidrato 5 g/l, Nymeen S-215 4 g/l, xileno 10 ml/l, L-Ala 200 mmol/l y L-Gln 200 mmol/l a un vaso de precipitados de 50 ml y la reacción se llevó a cabo a 32 ºC a 900 rpm durante 2 horas. Durante la reacción, el pH de la mezcla de reacción se mantuvo a 7,2 mediante el uso de hidróxido de potasio 2 mol/l.

El producto de reacción se analizó por el mismo método que en el Ejemplo 3, mediante el cual se confirmó que se acumulaba L-Ala-L-Gln a 25 mg/l.

Ejemplo 8

Clonación de genes que se corresponden con el gen ywfE de diversos microorganismos del género Bacillus y análisis de los mismos

En base a la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº: 9, se obtuvieron los genes que se correspondían con el gen ywfE que existe en Bacillus subtilis ATCC 15245, ATCC 6633, IAM 1213, IAM 1107, IAM 1214, ATCC 9466, IAM 1033 y ATCC 21555, Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 y Bacillus pumilus NRRL B-12025 de la siguiente forma.

Es decir, se inocularon respectivamente Bacillus subtilis ATCC 15245, ATCC 6633, IAM 1213, IAM 1107, IAM 1214, ATCC 9466, LAM 1033 y ATCC 21555, Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 y Bacillus pumilus NRRLB-12025 en medio LB y se sometieron a un cultivo estático durante una noche a 30 ºC. Después del cultivo, se aisló el ADN cromosómico de los respectivos microorganismos y se purificó de acuerdo con el método que usa fenol saturado descrito en Current Protocols in Molecular Biology.

Mediante el uso de un sintetizador de ADN (Model 8905, PerSeptive Biosystems, Inc.) se sintetizaron ADN que tenían las secuencias de nucleótidos que se muestran en las SEC ID Nº: 25 y 26 (en lo sucesivo, denominadas como cebador G y cebador H, respectivamente). El cebador G tiene una secuencia que contiene una región cadena arriba del codón de terminación de ywfE del ADN cromosómico de Bacillus subtilis 168 y el cebador H tiene una secuencia complementaria a una secuencia que contiene una región cadena abajo del codón de terminación de ywfE.

Se llevó a cabo una PCR usando cada uno de los ADN cromosómicos de Bacillus subtilis ATCC 15245, ATCC 6633, IAM 1213, IAM 1107, IAM 1214, ATCC 9466, IAM 1033 y ATCC 21555 y de Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022 como molde, y el cebador G y el cebador H anteriores como conjunto de cebadores. Es decir, la PCR se llevó a cabo mediante 30 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción 94 ºC durante 1 minuto, una reacción a 55 ºC durante 2 minutos y una reacción a 72 ºC durante 3 minutos, usando 40 l de una mezcla de reacción que comprendía 0,1 g del ADN cromosómico, 0,5 mol/l de cada uno de los cebadores, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu, 4 l de tampón para ADN polimerasa Pfu (10 x) y 200 mol/l de cada dNTP.

Un décimo de cada una de las mezclas de reacción resultantes se sometió a una electroforesis en gel de agarosa para confirmar que se amplificaba un fragmento de aproximadamente 1,4 kb que se correspondía con el fragmento de ywfE. Después, la mezcla de reacción restante se mezcló con una cantidad equivalente de fenol/cloroformo saturado con TE. La solución resultante se centrifugó y la fase superior obtenida se mezcló con un volumen de dos veces de etanol frío y se dejó reposar a -80 ºC durante 30 minutos. La solución resultante se centrifugó y el precipitado de ADN obtenido se disolvió en 20 l de TE.

Cada uno de los fragmentos de ADN de 1,4 kb obtenidos de este modo, procedentes de los ADN cromosómicos de las respectivas cepas, y el pCR-blunt (Invitrogen Corp.) se sometieron a una reacción de ligación usando un kit de ligación a 16 ºC durante 16 horas.

Se transformaron Escherichia coli NM522 usando cada mezcla de reacción de ligación de acuerdo con el método que usa ion calcio, se sembraron en medio de agar LB que contenía ampicilina 50 g/ml y se cultivaron durante una noche a 30 ºC.

Se extrajo un plásmido a partir de una colonia de cada transformante que creció en el medio, de acuerdo con un método conocido, y se analizó la estructura de cada plásmido usando enzimas de restricción. Como resultado, se

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Cada una de las soluciones obtenidas de este modo (5 l) se sometió a una reacción para escindir el ADN amplificado con las enzimas de restricción Ncol y BamHI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se recuperó un fragmento de ADN de 1,4 kb que contenía un gen que se correspondía con ywfE usando el GENECLEAN II Kit.

Por consiguiente, se escindieron 0,2 g del vector de expresión recombinante marcado con His C-terminal pQE60 con las enzimas de restricción Ncol y BamHI. Los fragmentos de ADN se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se recuperó un fragmento de ADN de 3,4 kb de la misma forma que anteriormente.

Cada uno de los fragmentos de ADN de 1,4 kb que contenía un gen que se correspondía con el ywfE de Bacillus subtilis 168 y el fragmento de ADN 3,4 kb obtenido anteriormente se sometieron a una reacción de ligación usando un kit de ligación a 16 ºC durante 16 horas.

Se extrajo un plásmido a partir de una colonia de cada transformante que creció en el medio, de acuerdo con un método conocido, y la estructura de cada plásmido se analizó usando enzimas de restricción. Como resultado, se confirmó que se obtenían los siguientes vectores de expresión génica marcados con His C-terminal: pQE60ywfE1 (un vector que contiene el gen procedente del ATCC 15245), pQE60ywfE2 (un vector que contiene el gen procedente del ATCC 6633), pQE60ywfE3 (un vector que contiene el gen procedente del IAM 1213), pQE60ywfE4 (un vector que contiene el gen procedente del IAM 1107), pQE60ywfE5 (un vector que contiene el gen procedente del IAM 1214), pQE60ywfE6 (un vector que contiene el gen procedente del ATCC 9466), pQE60ywfE7 (un vector que contiene el gen procedente del IAM 1033), pQE60ywfE8 (un vector que contiene el gen procedente del ATCC 21555), pQE60ywfE9 (un vector que contiene el gen procedente del IFO 3022) y pQE60ywfE10 (un vector que contiene el gen procedente del NRRL B-12025).

Las cepas de Escherichia coli NM522/pQE60ywfE1 a NM522/pQE60ywfE10 obtenidas anteriormente se inocularon, respectivamente, en 8 ml de medio LB que contenía ampicilina 50 g/ml en un tubo de ensayo grande y se cultivaron a 28 ºC durante 17 horas. Cada uno de los cultivos resultantes se inoculó en 50 ml de medio LB que contenía ampicilina 50 g/ml en un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se cultivaron a 30 ºC durante 3 horas. Después, se añadió isopropil--D-tiogalactopiranósido para dar una concentración final de 1 mmol/l, seguido de un cultivo adicional a 30 ºC durante 4 horas. El cultivo resultante se centrifugó para obtener células húmedas y las enzimas recombinantes marcadas con His se purificaron a partir de las células húmedas respectivas usando HisTrap, de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo.

Ejemplo 10

Producción de dipéptidos usando enzimas purificadas

Se prepararon mezclas de reacción (0,1 ml de cada) que comprendían 0,04 mg de las enzimas recombinantes respectivas obtenidas en el Ejemplo 9, Tris-HCl 100 mmol/l (pH 8,0), cloruro de magnesio 60 mmol/l, ATP 60 mmol/l, L-Ala 30 mmol/l y L-Gln 30 mmol/l y las reacciones se llevaron a cabo a 37 ºC durante 16 horas.

Después de la terminación de las reacciones, las mezclas de reacción se analizaron por el método que se describe en el Ejemplo 3, mediante el cual se confirmó que se formaban y se acumulaban de 3,0 a 3,5 g/l de L-Ala-L-Gln y de 0,25 a 0,3 g/l de L-Ala-L-Ala.

Cuando se excluía el ATP de las composiciones de las mezclas de reacción anteriores, no se formaban en absoluto ni L-Ala-L-Gln ni L-Ala-L-Ala.

Los resultados anteriores revelaron que todos los productos de los genes obtenidos en el Ejemplo 8 tienen la actividad de producir L-Ala-L-Gln y L-Ala-L-Ala a partir de L-Ala y L-Gln en presencia de ATP.

TEXTO LIBRE DE LISTADO DE SECUENCIAS

SEC ID Nº: 19 -Descripción de Secuencia Artificial: cebador SEC ID Nº: 20 -Descripción de Secuencia Artificial: cebador SEC ID Nº: 21 -Descripción de Secuencia Artificial: cebador SEC ID Nº: 22 -Descripción de Secuencia Artificial: cebador SEC ID Nº: 23 -Descripción de Secuencia Artificial: cebador SEC ID Nº: 24 -Descripción de Secuencia Artificial: cebador SEC ID Nº: 25 -Descripción de Secuencia Artificial: cebador SEC ID Nº: 26 -Descripción de Secuencia Artificial: cebador

Claims

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