ES2546332T3 - Extractos purificados de algas verde azuladas y método de uso - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende una forma seca de extracto acuoso o de solución salina amortiguada de Aphanizomenon flos aquae, en donde el extracto se enriquece con un Ligando de L-selectina; y Una forma seca de extracto etanólico de Aphanizomenon flos aquae.

Description

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descripción. Los términos singulares “uno”, “una”, y “el” incluyen los términos plurales a menos que el contexto claramente indique otra cosa. De manera similar, la palabra “o” pretende incluir “y” a menos que el contexto claramente indique otra cosa. Se debe entender, adicionalmente, además, que todos los tamaños de las bases o los tamaños de los aminoácidos, y todos los valores de los pesos moleculares o las masas moleculares, dados para los ácidos nucleicos o los polipéptidos son aproximados, y se suministran para descripción. El término “comprende” significa “incluye”. En caso de conflicto, la presente especificación, que incluye explicaciones de los términos, tendrá prevalencia. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Ligando de selectina aislado de células de algas verde azuladas.

Se describe aquí un extracto acuoso de algas verde azuladas, tales como la Aphanizomenon flos aquae (AFA), que esta enriquecida para un ligando de selectina, tal como un ligando de L-selectina. En una realización, el extracto es “Extracto A” un extracto acuoso que incluye compuestos polares rápidamente disueltos en el agua o solución salina, que están enriquecidos por un ligando de selectina, tal como el ligando de L-selectina. Este extracto se seca utilizando un proceso conocido, y se resuspende en una solución acuosa.

El Aphanizomenon flos aquae (AFA) se puede fraccionar. Se ha descrito el proceso para hacer crecer, cosechar, y concentrar células de algas verde azuladas. El AFA se puede aislar de cualquier fuente. La fuente puede ser una fuente natural de algas verde azuladas, tales como un lago (por ejemplo el Lago Klamath). La fuente también puede ser una fuente hecha de algas verde azuladas tales como un lago artificial o una fuente de agua. La fuente puede ser un ambiente producido para hacer crecer y cosechar algas verde azuladas comercialmente.

Las algas verde azuladas se pueden utilizar directamente, o se pueden almacenar como líquido, líquido congelado, secado por congelamiento, o secado utilizando el método descrito adelante. En una realización, las algas verde azuladas son cosechadas y secadas utilizando la tecnología REFRACTANCE WINDOWTM. El término tecnología “REFRACTANCE WINDOWTM” se refiere a un sistema en donde el secador utiliza las especificas propiedades del agua para llevar el agua hacia afuera del producto. En resumen, cuando se coloca agua sobre una fuente de calor, el calor se dispersa en el agua a través de convección. En la medida en que este absorbe calor, el agua transmite energía infrarroja al exterior en tres vías: evaporación, conducción y radiación. Si la superficie de la superficie del agua está cubierta por un medio transparente tal como plástico, la evaporación y su pérdida de calor asociada está bloqueada y solo ocurre conducción. La membrana plástica actúa como un espejo que refleja la energía infrarroja. Cuando un material húmedo, tal como las algas verde azuladas se colocan en una superficie plástica, el agua en el material crea una “ventanas” que permiten el paso de la energía infrarroja. Se cree que en este sistema el agua en el material permite que ocurra la radiación, conducción y evaporación, suministrando una transferencia de calor excepcionalmente efectiva. Sin embargo, después de pocos minutos, en la medida en que el material se seca, la “ventana” infrarroja se cierra y la conducción permanece como los únicos medios para la transferencia de calor. En razón a que el plástico es un pobre conductor del calor, se pierde poco calor y se transfiere al producto. Por lo tanto, cuando se seca con la tecnología REFRACTANCE WINDOWTM, las algas se exponen a calor solo brevemente.

En este sistema de secado, las algas liquidas (células suspendidas en solución) se colocan sobre la superficie de una correa transportadora del secador. La correa es mylar grado alimento (película de poliéster transparente) ubicada en la superficie del agua caliente. El calor proveniente del agua circulante se conduce a la correa y luego el agua presente en el producto se seca, acelerando suavemente el proceso natural de evaporación mientras que se protegen los nutrientes naturales. En la medida en que el producto se seca y el agua se evapora, el calor cesa de ser transmitido al producto. Sin estar unido por la teoría, esta evita la degradación de los polipéptidos, los ácidos nucleicos, los nutrientes y los pigmentos. Así, el proceso de secado mantiene la temperatura de las algas muy por debajo de la temperatura del agua circulante por debajo de la correa transportadora.

Otros sistemas de secado se pueden utilizar para producir algas secas. Generalmente, dos factores juegan un papel en la degradación de las algas: el grado de calor y el tiempo de exposición al calor. Aplicando una alta cantidad de calor durante un corto periodo de tiempo da como resultado una menor degradación de los componentes de las algas verde azuladas. En un ejemplo, se aplica calor, tal como una temperatura de aproximadamente 65ºC a 80ºC, tal como una temperatura de aproximadamente 70ºC a 75ºC, o aproximadamente 72ºC. El calor se puede aplicar durante una cantidad suficiente de tiempo para secar las algas, tales como aproximadamente 1 a aproximadamente 15 minutos, o aproximadamente 2 a aproximadamente 10 minutos, o durante aproximadamente 3 a aproximadamente 7 minutos. En un ejemplo, se aplica calor a las algas a 72ºC durante solamente 3 a 5 minutos. Este proceso es conocido por alguien medianamente versado en la materia, y se describe de manera completa en el sitio de la Rossha Enterprises, y se describe en Abonyi et al.,”Evaluation of Energy Efficiency and Quality Retention for the REFRACTANCE WINDOWTM Drying System: Research Report” Washington State University, Pullman, WA, December 30, 1999. Sin embargo, también se pueden utilizar células secadas por congelamiento.

Tal como se describe aquí, se puede preparar un extracto de células de algas verde azuladas de Aphanizomenon flos aquae (AFA) frescas, deshidratadas o preservadas. Las algas se pueden extraer con agua o una solución salina amortiguada adecuada. Por ejemplo, se utiliza agua o soluciones amortiguadas, en general de un pH neutro (aproximadamente pH 7.0 a aproximadamente pH 7.8, tal como aproximadamente pH 7.2 a aproximadamente pH

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donador. Los tejidos y los órganos se cosecharon tal como se describió anteriormente y se detectó la presencia de células que llevan GFP mediante citometría de flujo o microscopia fluorescente.

Ejemplo 11

Repoblación de células madre incrementadas de tejido traumatizado

Se utilizó un modelo de ratón para evaluar el anidamiento y la integración de células madre derivadas de medula ósea en tejido traumatizado.

Todos los donantes de medula son ratones macho adulto (de 8-10 semanas de edad), y todos los ratones receptores son hembras adultas (de 8-10 semanas de edad). Se evaluaron los dos grupos de ratones. Un grupo de receptores irradiados subletalmente recibió 6X106 células donadoras nucleadas por vía de inyección en la vena de la cola y se les permitió 2 semanas de recuperación. Los animales son entonces traumatizados ligeramente mediante la inserción de una aguja delgada en el musco de la pata trasera, el corazón, y el cerebro. Todos los animales recibieron alimentación normal durante todo el estudio. Y en el segundo grupo, ratones hembra son tratados idénticamente a los del primer grupo, pero se alimentaron con una dieta que incluye 0.5 a 15% p/v de fracción que contiene ligando de selectina de AFA.

Se sacrificaron dos ratones antes del trauma para evaluar los niveles de línea base de las células derivadas del macho. Posteriormente, los ratones se sacrificaron en los siguientes puntos de tiempo: 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, y 4 semanas. Se sacrificaron dos ratones para cada punto de tiempo, excepto para el punto de tiempo de 2 semanas donde se sacrificaron 6 ratones de cada grupo. El musculo de la pata trasera, como el corazón, y el tejido del cerebro se aislaron de los animales sacrificados. Se cortan secciones a través de las áreas traumatizadas, y se tiñen para células derivadas de macho utilizando análisis de marcador de superficie celular para la expresión del antígeno Hy o mediante hidrogenación in situ con fluorescencia utilizando sondas para el cromosoma Y. Alternativamente, los ratones donadores transgénicos que expresan GFP se utilizaran (similar al ejemplo #4).

Los datos obtenidos demostraron el efecto de consumir la fracción que contiene el ligando de selectina del AFA a la velocidad del reclutamiento de la célula madre luego del trauma.

Ejemplo 12

Reporte de caso para reparación de tejido

Un sujeto fue una fisicoculturista que había tenido un accidente hacía tres años. Un coche golpeo su carro en la puerta sobre el lado del conductor y se giraron varios músculos en su cadera y muslo. El tuvo una seria de cirugías para volver a unir varios músculos. A pesar de las cirugías exitosas el daño del musculo fue tan severo que permaneció con un dolor constante y no pudo reasumir su entrenamiento de levantamiento de pesas, ya que aún una sesión media de entrenamiento era seguida por hinchamiento y dolor, lo que le evitaría caminar durante varios días.

Ella ensayo muchas drogas antiinflamatorias, pero después de 18 meses ella aun no podía entrenar. Ella empezó a consumir una fracción de alga verde azulada que contenían un ligando de selectina. Dos semanas más tarde, ella reportó ser capaz de regresar al gimnasio, y después de dos meses de consumo, ella había reasumido el entrenamiento normal, indicando una reparación extensa del tejido muscular.

Ejemplo 13

Reporte de caso para reparación de tejido

Un sujeto de 55 años de edad fue por un sexto reemplazo de cadera –cuarto del lado izquierdo. En general, había muy pobre pronóstico y enormes dificultades involucradas.

El cirujano ortopédico reconstruyo la pelvis y el acetabeum. Sin embargo, antes de la cirugía al sujeto se le informo por el grupo de médicos que no había manera de que el cuerpo produjera el nuevo hueso necesario para el éxito de largo plazo del procedimiento. Se consideró que si el sujeto conseguía crecimiento de hueso probablemente sería menor que el que se requería para curación.

Al sujeto se le suministro una fracción de algas verde azuladas que contienen L-selectina poco después de la cirugía. El nuevo crecimiento de hueso fuerte apareció rápidamente y la recuperación fue rápida. El sujeto reportó que ellos ya no necesitaban las muletas y que fue capaz de soportar su propio peso en 6 semanas -comparado con 6 meses con la cirugía previa del sujeto. El sujeto reportó la confirmación de curación acelerada en cada revisión. El

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