ES2546800T3

ES2546800T3 - Molécula de anticuerpo mejorada contra el receptor de IL-6

Info

Publication number: ES2546800T3
Application number: ES09816184.7T
Authority: ES
Inventors: Tomoyuki Igawa; Shinya Ishii; Atsuhiko Maeda; Mika Sakurai; Tetsuo Kojima; Tatsuhiko Tachibana; Hirotake Shiraiwa; Hiroyuki Tsunoda; Yoshinobu Higuchi
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2009-09-25
Publication date: 2015-09-29
Anticipated expiration: 2029-09-25
Also published as: MY153908A; CN101849006B; US8562991B2; JP5661291B2; US20150166666A1; PL2330193T3; CA2699834A1; CN101849006A; HRP20150857T1; NL301152I1; AR127010A2; MA32707B1; CA2763039C; RU2430111C1; EP2330193A1; KR20110046385A; FR21C1054I1; US20230159648A1; US20240301075A1; NZ592214A

Abstract

Un anticuerpo anti-receptor de IL-6 de uno cualquiera de: (a) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 20 (región variable de VH3-M73) y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 23 (región variable de VL3); (b) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19 (región variable de VH4-M73) y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 22 (región variable de VL1); y (c) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21 (región variable de VH5-M83) y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 24 (región variable de VL5).

Description

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región variable de la cadena ligera que comprende CDR1 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 16 (CDR1 de VL5), CDR2 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 17 (CDR2 de VL5) y CDR3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 18 (CDR3 de VL5).

Los anticuerpos descritos anteriormente pueden usarse como anticuerpos anti-receptor de IL-6 humano que tienen 5 actividad de unión superior, farmacocinética excelente, seguridad excelente, inmunogenia reducida y/o propiedades fisicoquímicas superiores.

Regiones estructurales de anticuerpos humanos que van a asociarse a CDR como se describe en el presente documento se seleccionan de manera que la CDR forme un sitio de unión al antígeno favorable. Las FR que van a usarse para las regiones variables de la divulgación no están particularmente limitadas, y puede usarse cualquier FR; sin embargo, 10 preferentemente se usa FR derivada de ser humano. Es posible usar FR derivadas de ser humano que tienen una secuencia natural. Alternativamente, si se necesita, pueden introducirse sustitución, deleción, adición y/o inserción o semejantes de uno o más aminoácidos en la región estructural que tiene una secuencia natural de manera que la CDR forme un sitio de unión al antígeno adecuado. Secuencias de FR mutantes que tienen una propiedad deseada pueden seleccionarse, por ejemplo, midiendo y evaluando la actividad de unión a un antígeno para un anticuerpo que tiene una

15 FR con sustituciones de aminoácidos (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Mientras tanto, la región constante que va a usarse para un anticuerpo descrito en el presente documento no está particularmente limitada, y puede usarse cualquier región constante. Regiones constantes preferidas que van a usarse para los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, regiones constantes derivadas de ser humano (regiones constantes derivadas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, C, C y semejantes). Uno o más aminoácidos 20 pueden estar sustituidos, delecionados, añadidos y/o insertados en las regiones constantes derivadas de ser humano. Las regiones constantes de la cadena pesada derivadas de ser humano preferidas incluyen, por ejemplo, regiones constantes que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (región constante de VH4-M73), regiones constantes que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 (región constante VH3-M73) y regiones constantes que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 (región constante de VH5-M83), mientras que las regiones

25 constantes de la cadena ligera derivadas de ser humano preferidas incluyen, por ejemplo, regiones constantes que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 (VL1), regiones constantes que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 (VL3) y regiones constantes que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 (VL5).

Además, uno o más aminoácidos pueden estar sustituidos, delecionados, añadidos y/o insertados en la secuencia de

30 CDR descrita anteriormente. Se prefiere que una secuencia de CDR después de la sustitución, deleción, adición y/o inserción de uno o más aminoácidos tenga actividad equivalente a la secuencia de CDR antes de la alteración con respecto a la actividad de unión, actividad neutralizante, estabilidad, inmunogenia y/o farmacocinética. El número de aminoácidos que va a sustituirse, delecionarse, añadirse y/o insertarse no está particularmente limitado; sin embargo, es preferentemente tres aminoácidos o menos, más preferentemente dos aminoácidos o menos, y todavía más

35 preferentemente un aminoácido por CDR.

Los aminoácidos también pueden sustituirse, delecionarse, añadirse y/o insertarse por los métodos descritos anteriormente.

La divulgación también proporciona las regiones variables de (a) a (f) a continuación:

(a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 19 (región variable de 40 VH4-M73);

(b): una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 20 (región variable de VH3-M73);

(c): una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21 (región variable de VH5-M83);

45 (d) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 22 (región variable de VL1);

(e) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 23 (región variable de VL3); y

(f) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 24 (región variable de 50 VL5).

Las regiones variables descritas anteriormente pueden usarse como parte de un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano. Los anticuerpos anti-receptor de IL-6 humano en los que se usan tales regiones variables tienen actividad de unión

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superior, farmacocinética excelente, seguridad excelente, inmunogenia reducida y/o propiedades fisicoquímicas superiores.

Las regiones variables descritas anteriormente también pueden comprender sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de uno o más aminoácidos (por ejemplo, cinco aminoácidos o menos, preferentemente tres aminoácidos o 5 menos). Métodos para sustituir uno o más residuos de aminoácidos con otros aminoácidos de interés incluyen, por ejemplo, los métodos descritos anteriormente.

La divulgación también se refiere a polipéptidos que comprenden las regiones variables descritas anteriormente.

Además, la divulgación se refiere a los anticuerpos de (a) a (c) a continuación:

(a) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ

10 ID NO: 19 (región variable de VH4-M73) y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 22 (región variable de VL1);

(b) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 20 (región variable de VH3-M73) y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 23 (región variable de VL3); y

15 (c) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21 (región variable de VH5-M83) y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 24 (región variable de VL5).

Las regiones variables descritas anteriormente pueden usarse como parte de un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano. Los anticuerpos anti-receptor de IL-6 humano en los que se usan estas regiones variables tienen actividad de unión

20 superior, farmacocinética excelente, seguridad excelente, inmunogenia reducida y/o propiedades físicas superiores.

Las regiones variables descritas anteriormente también pueden comprender sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de uno o más aminoácidos (por ejemplo, cinco aminoácidos o menos, preferentemente tres aminoácidos o menos). Métodos para sustituir uno o más residuos de aminoácidos con otros aminoácidos de interés incluyen, por ejemplo, los métodos descritos anteriormente.

25 Mientras tanto, la región constante que va a usarse para un anticuerpo desvelado en el presente documento no está particularmente limitada, y puede usarse cualquier región constante. Las regiones constantes preferidas que van a usarse para los anticuerpos de la presente invención incluyen, por ejemplo, regiones constantes derivadas de ser humano (regiones constantes derivadas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, cadena , cadena  y semejantes). Uno o más aminoácidos pueden estar sustituidos, delecionados, añadidos y/o insertados en las regiones constantes derivadas de ser humano. Las

30 regiones constantes de la cadena pesada derivadas de ser humano preferidas incluyen, por ejemplo, regiones constantes que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 (región constante de VH4-M73), regiones constantes que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 (región constante VH3-M73) y regiones constantes que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 (región constante de VH5-M83), mientras que las regiones constantes de la cadena ligera derivadas de ser humano preferidas incluyen, por ejemplo, regiones constantes que

35 comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 (VL1), regiones constantes que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 (VL3) y regiones constantes que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 (VL5).

La divulgación también se refiere a las cadenas pesadas o ligeras de (a) a (f) a continuación:

(a) una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 25 (VH4-M73);

40 (b) una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 26 (VH3-M73);

(c): una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 27 (VH5-M83);

(d): una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 28 (VL1);

(e): una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 29 (VL3); y

(f): una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 30 (VL5).

45 Las cadenas pesadas y cadenas ligeras descritas anteriormente pueden usarse como parte de un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano. Los anticuerpos anti-receptor de IL-6 humano en los que se usan estas cadenas pesadas y cadenas ligeras tienen actividad de unión superior, farmacocinética excelente, seguridad excelente, inmunogenia reducida y/o propiedades fisicoquímicas superiores.

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Las cadenas pesadas y cadenas ligeras descritas anteriormente también pueden comprender sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de uno o más aminoácidos (por ejemplo, diez aminoácidos o menos, preferentemente cinco aminoácidos o menos, y más preferentemente tres aminoácidos o menos). Métodos para sustituir uno o más residuos de aminoácidos con otros aminoácidos de interés incluyen, por ejemplo, los métodos descritos anteriormente.

Pueden llevarse a cabo sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de uno o más aminoácidos para las regiones variables, regiones constantes, o ambas.

La divulgación también se refiere a los anticuerpos de (a) a (c) a continuación:

(a): un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 25 (VH4-M73) y una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 28 (VL1);

(b): un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 26 (VH3-M73) y una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 29 (VL3); y

(c): un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 27 (VH5-M83) y una cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 30 (VL5).

Los anticuerpos descritos anteriormente son anticuerpos anti-receptor de IL-6 humano que tienen actividad de unión superior, farmacocinética excelente, seguridad excelente, inmunogenia reducida y/o propiedades fisicoquímicas superiores.

Los anticuerpos descritos anteriormente también pueden comprender sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 20 aminoácidos o menos, preferentemente diez aminoácidos o menos, y más preferentemente cinco aminoácidos o menos). Métodos para sustituir uno o más residuos de aminoácidos con otros aminoácidos de interés incluyen, por ejemplo, los métodos descritos anteriormente.

Los anticuerpos descritos en el presente documento son preferentemente anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos humanizados también se denominan anticuerpos humanos reformados. Un anticuerpo humanizado tal se obtiene injertando una región determinante de la complementariedad (CDR) derivada de un mamífero no humano en la CDR de un anticuerpo humano. También se conocen técnicas de recombinación genética convencionales para la preparación de tales anticuerpos (véase la solicitud de patente europea nº EP 125023; y el documento WO 96/02576).

Específicamente, por ejemplo, una secuencia de ADN diseñada de forma que una CDR de interés y una región estructural (FR) de interés estén ligadas se sintetiza por PCR, usando varios oligonucleótidos preparados para tener porciones que se solapan con los extremos de tanto CDR como FR como cebadores (véase el método descrito en el documento WO 98/13388). Un anticuerpo humanizado se obtiene: ligando el ADN resultante a un ADN que codifica una región constante del anticuerpo humano o una región constante del anticuerpo humano modificado; insertando ésta en un vector de expresión; e introduciéndose ésta en un huésped para producir el anticuerpo (véase la solicitud de patente europea nº EP 239400 y la publicación de solicitud de patente internacional nº WO 96/02576).

Regiones estructurales del anticuerpo humano que van a enlazarse con CDR se seleccionan de manera que la CDR forme un sitio de unión al antígeno favorable. Si se necesita, puede introducirse sustitución de aminoácidos, deleción, adición y/o inserción en la región estructural de una región variable del anticuerpo.

Una región constante de anticuerpo humano, o una región constante de anticuerpo humano alterada en la que uno o más aminoácidos se han sustituido, delecionado, añadido y/o insertado en una región constante de anticuerpo humano, puede usarse como la región constante de un anticuerpo humanizado.

Por ejemplo, C1, C2, C3, C4, Cµ, C, C1, C2y C pueden usarse para la cadena H, y C y C pueden usarse para la cadena L. La secuencia de aminoácidos de C se muestra en SEQ ID NO: 38, y la secuencia de nucleótidos que codifica esta secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 37. La secuencia de aminoácidos de C1 se muestra en SEQ ID NO: 40, y la secuencia de nucleótidos que codifica esta secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO:

39. La secuencia de aminoácidos de C2 se muestra en SEQ ID NO: 42, y la secuencia de nucleótidos que codifica esta secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 41. La secuencia de aminoácidos de C4 se muestra en SEQ ID NO: 44, y la secuencia de nucleótidos que codifica esta secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 43.

Además, pueden modificarse las regiones C del anticuerpo humano para mejorar la estabilidad del anticuerpo o estabilidad de la producción de anticuerpos. Pueden usarse anticuerpos humanos de cualquier isotipo tales como IgG, IgM, IgA, IgE o IgD en la humanización de anticuerpos; sin embargo, IgG se usa preferentemente en el presente

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Pueden usarse IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, o similares, como IgG.

Los aminoácidos en la región variable (por ejemplo, CDR y FR) y región constante de un anticuerpo humanizado pueden delecionarse, añadirse, insertarse y/o sustituirse con aminoácidos después de la preparación. Los anticuerpos descritos en el presente documento también incluyen tales anticuerpos humanizados que comprenden sustituciones de aminoácidos y similares.

Los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen no solo anticuerpos divalentes como se ha representado por IgG, sino también anticuerpos monovalentes y anticuerpos multivalentes como se ha representado por IgM, en tanto que tengan actividad de unión al receptor de IL-6 y/o actividad neutralizante. Los anticuerpos multivalentes descritos en el presente documento incluyen anticuerpos multivalentes en los que los sitios de unión al antígeno son todos idénticos, y anticuerpos multivalentes en los que todos o algunos de los sitios de unión al antígeno son diferentes. Los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen no solo moléculas de anticuerpo completo, sino también minicuerpos y productos modificados de los mismos, en tanto que se unan a la proteína del receptor de IL-6.

Los minicuerpos son anticuerpos que comprenden un fragmento de anticuerpo que carece de una porción de un anticuerpo completo (por ejemplo, IgG completa o semejante), y no están particularmente limitados, en tanto que tengan actividad de unión al receptor de IL-6 y/o actividad neutralizante y comprendan un fragmento de anticuerpo que carece de una porción de un anticuerpo completo (por ejemplo, IgG completa o semejante). Los minicuerpos descritos en el presente documento no están particularmente limitados, en tanto que comprendan una porción de un anticuerpo completo. Sin embargo, los minicuerpos comprenden preferentemente VH o VL, y particularmente preferentemente comprenden tanto VH como VL. Otros minicuerpos preferibles descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, minicuerpos que comprenden CDR de anticuerpo. Los minicuerpos pueden comprender todas o algunas de las seis CDR de un anticuerpo.

Los minicuerpos descritos en el presente documento tienen preferentemente un peso molecular más pequeño que los anticuerpos completos. Sin embargo, los minicuerpos pueden formar multímeros, por ejemplo, dímeros, trímeros o tetrámeros, y así su peso molecular es algunas veces superior al de anticuerpos completos.

Específicamente, los fragmentos de anticuerpos incluyen, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. Mientras tanto, los minicuerpos incluyen, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv (Fv monocatenario), diacuerpos y sc(Fv)2 ((Fv)2 monocatenario). Los multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros y polímeros) de estos anticuerpos también están incluidos en los minicuerpos descritos en el presente documento.

Pueden obtenerse fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, tratando anticuerpos con enzimas para producir fragmentos de anticuerpos. Enzimas conocidas por generar fragmentos de anticuerpos incluyen, por ejemplo, papaína, pepsina y plasmina. Alternativamente, un gen que codifica tal fragmento de anticuerpo puede construirse, introducirse en un vector de expresión y expresarse en células huésped apropiadas (véase, por ejemplo, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178,476-496; Pluckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121,652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669; Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9,132-137).

Las enzimas digestivas escinden en sitios específicos de un fragmento de anticuerpo, dando fragmentos de anticuerpos de las estructuras específicas mostradas a continuación. Pueden aplicarse técnicas de ingeniería genética a tales fragmentos de anticuerpos enzimáticamente obtenidos para delecionar una porción arbitraria del anticuerpo.

Fragmentos de anticuerpos obtenidos usando las enzimas anteriormente digestivas son los siguientes.

Digestión con papaína: F(ab)2 o Fab

Digestión con pepsina: F(ab')2 o Fab'

Digestión con plasmina: Facb

Los minicuerpos descritos en el presente documento incluyen fragmentos de anticuerpos que carecen de una región arbitraria, en tanto que tengan actividad de unión al receptor de IL-6 y/o actividad neutralizante.

“Diacuerpo” se refiere a un fragmento de anticuerpo bivalente construido por fusión génica (Holliger P et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; documentos EP 404.097; WO 93/11161, etc.). Los diacuerpos son dímeros compuestos de dos cadenas de polipéptidos. En cada una de las cadenas de polipéptidos que forman un dímero, un VL y un VH están generalmente ligados por un conector en la misma cadena. En general, un conector en un diacuerpo es suficientemente corto de forma que VL y VH no puedan unirse entre sí. Específicamente, el número de residuos de aminoácidos que constituyen el conector es, por ejemplo, aproximadamente cinco residuos. Así, VL y VH codificadas

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gripe (HA), fragmento de c-myc humano, fragmento VSV-GP, fragmento p18HIV, marca T7, marca HSV, marca E, fragmento del antígeno T del SV40, marca Ick, fragmento de -tubulina, marca B y fragmento de proteína C. Los polipéptidos que van a fusionarse con los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, GST (glutatión-S-transferasa), HA (hemaglutinina de la gripe), región constante de inmunoglobulina, β-galactosidasa y MBP (proteína de unión a maltosa). Polinucleótidos comercialmente disponibles que codifican estos péptidos o polipéptidos pueden fusionarse con un polinucleótido que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento. Un polipéptido de fusión puede prepararse expresando el polinucleótido de fusión así preparado.

Además, los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden conjugarse con anticuerpos ligados a diversas moléculas tales como polímeros, que incluyen polietilenglicol (PEG) y ácido hialurónico; sustancias radiactivas; sustancias fluorescentes; sustancias luminiscentes; enzimas; y toxinas. Tales anticuerpos conjugados pueden obtenerse modificando químicamente los anticuerpos obtenidos. Métodos para la modificación de anticuerpos ya se han establecido en la materia (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.057.313 y US 5.156.840). Los “anticuerpos” descritos en el presente documento también incluyen tales anticuerpos conjugados.

Además, los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen anticuerpos con cadenas de azúcar alteradas.

Además, los anticuerpos usados en la divulgación pueden ser anticuerpos biespecíficos. Anticuerpo biespecífico se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables que reconocen diferentes epítopos en la misma molécula de anticuerpo. Un anticuerpo biespecífico descrito en el presente documento puede ser un anticuerpo biespecífico que reconoce diferentes epítopos sobre la molécula del receptor de IL-6, o un anticuerpo biespecífico en el que uno de los sitios de unión al antígeno reconoce el receptor de IL-6 y el otro sitio de unión al antígeno reconoce otra sustancia. Ejemplos de antígenos que se unen al otro sitio de unión al antígeno de un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo que reconoce el receptor de IL-6 descrito en el presente documento incluyen IL-6, TNF, TNFR1, TNFR2, CD80, CD86, CD28, CD20, CD19, IL-1, IL-β, IL-1R, RANKL, RANK, IL-17, IL-17R, IL-23, IL-23R, IL-15, IL-15R, BlyS, linfotoxina , linfotoxina β, ligando LIGHT, LIGHT, VL-4, CD25, IL-12, IL-12R, CD40, CD40L, BAFF, CD52, CD22, IL-32, IL-21, IL-21R, GM-CSF, GM-CSFR, M-CSF, M-CSFR, IFN-alfa, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, CCR5, APRIL y APRILR.

Se conocen métodos para producir anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse, por ejemplo, ligando dos tipos de anticuerpos que reconocen antígenos diferentes. Los anticuerpos que van a ligarse pueden ser media molécula que contiene cada una una cadena H y una cadena L, o un cuarto de molécula que contiene solo una cadena H. Alternativamente, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos productores de células de fusión fusionando hibridomas que producen diferentes anticuerpos monoclonales. Además, pueden producirse anticuerpos biespecíficos por técnicas de ingeniería genética.

Como se describe más adelante, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden diferenciarse en la secuencia de aminoácidos, peso molecular, punto isoeléctrico, presencia/ausencia de cadenas de azúcar y conformación, dependiendo del método de purificación, o la célula o huésped usado para producir los anticuerpos. Sin embargo, en tanto que el anticuerpo obtenido sea funcionalmente equivalente a un anticuerpo descrito en el presente documento, se incluye en la divulgación. Por ejemplo, cuando un anticuerpo descrito en el presente documento se expresa en células procariotas, por ejemplo, Escherichia coli, un residuo de metionina se añade al extremo N de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo original. Tales anticuerpos también están incluidos en los anticuerpos descritos en el presente documento.

Pueden producirse polipéptidos de anticuerpos anti-receptor de IL-6 y semejantes descritos en el presente documento por métodos conocidos para aquellos expertos en la materia.

Un anticuerpo anti-receptor de IL-6 puede prepararse, por ejemplo, por técnicas de recombinación genética conocidas para aquellos expertos en la materia basándose en la secuencia del anticuerpo anti-receptor de IL-6 obtenido. Específicamente, un anticuerpo anti-receptor de IL-6 puede prepararse construyendo un polinucleótido que codifica el anticuerpo basándose en la secuencia de un anticuerpo que reconoce el receptor de IL-6, insertando el polinucleótido en un vector de expresión y luego expresándolo en una célula huésped apropiada (véase por ejemplo, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178,476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121,663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

Así, la divulgación proporciona métodos de producción de (i) un polipéptido descrito en el presente documento, o (ii) un polipéptido codificado por un gen que codifica el polipéptido descrito en el presente documento, en el que los métodos comprenden la etapa de cultivar una célula huésped que comprende un vector en el que se introduce un polinucleótido que codifica el polipéptido descrito en el presente documento.

Más específicamente, la divulgación proporciona métodos de producción de un polipéptido descrito en el presente documento, que comprenden las etapas de:

(a) cultivar una célula huésped que comprende un vector en el que se introduce un gen que codifica el

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La actividad de unión del receptor de IL-6 de los anticuerpos obtenidos puede medirse por métodos conocidos para aquellos expertos en la materia. Métodos para medir la actividad de unión al antígeno de un anticuerpo incluyen, por ejemplo, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), enzimoinmunoanálisis (EIA), radioinmunoensayo (RIA) y métodos con anticuerpos fluorescentes. Por ejemplo, cuando se usa enzimoinmunoanálisis, muestras que contienen anticuerpo tales como anticuerpos purificados y sobrenadantes de cultivo de células productoras de anticuerpo se añaden a placas recubiertas de antígeno. Se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima tal como fosfatasa alcalina, y las placas se incuban. Después de lavar, se añade un sustrato de enzima tal como fosfato de p-nitrofenilo, y la absorbancia se mide para evaluar la actividad de unión al antígeno.

Composiciones farmacéuticas

La divulgación también describe composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido como se describe en el presente documento como principio activo. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden usarse en un método para tratar enfermedades asociadas a IL-6 tales como artritis reumatoide. Así, la divulgación también describe agentes para su uso en un método para tratar enfermedades tales como artritis reumatoide, que comprende un anticuerpo descrito anteriormente como principio activo. Ejemplos preferidos de enfermedades objetivo en la divulgación incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, artritis idiopática juvenil sistémica, enfermedad de Castleman, lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis lúpica, enfermedad de Crohn, linfoma, colitis ulcerosa, anemia, vasculitis, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Still, amiloidosis, esclerosis múltiple, trasplante, degeneración macular senil, espondilitis anquilosante, psoriasis, artritis psoriásica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), nefropatía por IgA, osteoartritis, asma, nefropatía diabética, EICH, endometriosis, hepatitis (NASH), infarto de miocardio, arteriosclerosis, septicemia, osteoporosis, diabetes, mieloma múltiple, cáncer de próstata, cáncer de riñón, linfoma no Hodgkin de linfocitos B, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de colon, caquexia por cáncer, neuroinvasión por cáncer, infarto de miocardio, neovascularización coroidea miópica, neovascularización coroidea idiopática, uveítis, tiroiditis crónica, hipersensibilidad retardada, dermatitis de contacto, dermatitis atópica, mesotelioma, polimiositis, dermatomiositis, panuveítis, uveítis anterior, uveítis intermedia, escleritis, queratitis, inflamación orbital, neuritis óptica, retinopatía diabética, vitreorretinopatía proliferativa, ojo seco e inflamación posoperatoria.

La expresión “para comprender un anticuerpo anti-receptor de IL-6 como principio activo” significa que comprende un anticuerpo anti-receptor de IL-6 como al menos uno de los principios activos, sin limitación particular en su contenido. Además, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden contener otros principios activos en combinación con los polipéptidos descritos anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden usarse no solo para fines terapéuticos, sino también para fines preventivos.

Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden formularse según métodos convencionales (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, última edición, Mark Publishing Company, Easton, EE.UU.). Si se necesita, pueden contener vehículos y/o aditivos farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, pueden incluir detergentes (por ejemplo, PEG y Tween), excipientes, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico), agentes colorantes, aromatizantes, conservantes, estabilizadores, agentes de tamponamiento (por ejemplo, ácido fosfórico, ácido cítrico y otros ácidos orgánicos), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), agentes de suspensión, agentes isotonizantes, aglutinantes, disgregantes, lubricantes, promotores de la fluidez y correctores. Sin embargo, los agentes descritos en el presente documento para su uso en un método para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias no se limitan a lo anterior y pueden contener apropiadamente otros vehículos convencionales. Específicamente, ejemplos incluyen ácido silícico anhidro ligero, lactosa, celulosa cristalina, manitol, almidón, carmelosa cálcica, carmelosa sódica, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, dietilaminoacetato de polivinilacetal, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicérido de ácido graso de cadena media, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 60, sacarosa, carboximetilcelulosa, almidón de maíz y sales inorgánicas. También pueden contener otros polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina e inmunoglobulina; y aminoácidos. Cuando se preparan disoluciones acuosas para su uso en inyección, los anticuerpos anti-receptor de IL-6 se disuelven, por ejemplo, en disoluciones isotónicas que contienen solución salina fisiológica, glucosa, u otros adyuvantes. Los adyuvantes incluyen, por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro sódico. Además, pueden combinarse agentes solubilizantes apropiados, por ejemplo, alcohol (etanol y similares), polialcohol (propilenglicol, PEG y similares) y tensioactivos no iónicos (polisorbato 80 y HCO-50).

Si fuera necesario, los polipéptidos pueden encapsularse en microcápsulas (microcápsulas hechas de hidroxicelulosa, gelatina, poli(metacrilato de metilo) y similares), o hechas en un sistema de administración de fármacos coloidales (liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, nanocápsulas, etc.) (véase, por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Science 16ª edición”, Oslo Ed. (1980)). Además, se conocen métodos para preparar agentes como agentes de liberación sostenida, y éstos pueden aplicarse a los polipéptidos (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12: 98-105; patente de EE.UU. nº 3.773.919; solicitud de patente europea (EP) nº 58.481; Sidman et al., Biopolymers (1983) 22:547-56; documento EP nº 133.988). Además, el

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