ES2312184T3 - Agentes preventivos terapeuticos para el tratamiento de esclerosis multiple, que contienen anticuerpos anti-receptores de il-6 antagonistas. - Google Patents
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Abstract
Utilización de un anticuerpo antagonista dirigido contra el receptor de la interleuquina-6 (IL-6) para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la esclerosis múltiple.
Description
Agentes preventivos terapéuticos para el
tratamiento de esclerosis múltiple, que contienen anticuerpos
anti-receptor de IL-6
antagonistas.
La presente invención se refiere a un agente
preventivo o terapéutico para el tratamiento de la esclerosis
múltiple que comprende un anticuerpo antagonista dirigido contra el
receptor de IL-6 como un ingrediente activo.
IL-6 es una citoquina llamada
también factor 2 estimulante de célula B (BSF-2) o
interferón \beta2. IL-6 fue descubierta como un
factor de diferenciación implicado en la activación de células B
linfáticas (Hirano, T. et al., Nature (1986) 324,
73-76). Después de esto, se comprobó que era una
citoquina multifuncional que influye en varias funciones de las
células (Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54,
1-78). Se ha descrito que IL-6
induce la maduración de las células T linfáticas (Lotz et
al., J. Exp. Immunol. 18: 1253-1258, 1988).
IL-6 transmite su actividad
biológica a través de dos tipos de proteínas en la célula. Una de
ellas es el receptor de IL-6, una proteína de unión
a ligando con un peso molecular de unos 80 kD, a la cual
IL-6 se une. El receptor de IL-6
existe no sólo en una forma de unión a membrana que penetra a través
y se expresa en la membrana celular sino también como un receptor
de IL-6 soluble del que consiste mayoritariamente la
región extracelular.
La otra proteína es una proteína de unión a
membrana, gp130, que tiene un peso molecular de unos 130 kD y que
está implicada en la transducción de señal. IL-6 y
el receptor de IL-6 forman el complejo
IL-6/receptor de IL-6 que, después
de unirse a gp130, transmite su actividad biológica a la célula
(Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967).
El antagonista de IL-6 es una
sustancia que inhibe la transducción de la actividad biológica de
IL-6. Como antagonista de IL-6, se
han conocido hasta ahora anticuerpos dirigidos contra
IL-6 (anticuerpos
anti-IL-6), anticuerpos dirigidos
contra el receptor de IL-6 (anticuerpos
anti-receptor de IL-6), y
anticuerpos dirigidos contra gp130 (anticuerpos
anti-gp130). Además, también son conocidos
antagonistas de IL-6 que están descritos en la
Solicitud de Patente Internacional WO 95-00852, la
Solicitud de Patente Internacional WO 95-11303, la
Solicitud de Patente Internacional WO 96-34104, la
Solicitud de Patente Internacional WO 96-18648, la
Solicitud de Patente Internacional WO 96-17869, la
Publicación de Patente Japonesa no examinada (Kokai) Nº
7(1995)-324097, y la Publicación de Patente
Japonesa no examinada (Kokai) Nº
8(1996)-311098.
El anticuerpo anti-receptor de
IL-6 ha sido descrito en varios informes (Norvick D.
et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146, Huang,
Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630,
la Solicitud de Patente Internacional WO 95-09873,
la Solicitud de Patente Francesa FR 2694767, la Patente de Estados
Unidos US 521628). Un anticuerpo PM-1 humanizado se
obtuvo mediante injerto de las regiones determinantes de la
complementaridad (CDRs) de un anticuerpo PM-1 de
ratón (Hirata et al., J. Immunology (1989) 143,
2900-2906), en un anticuerpo humano (la Solicitud de
Patente internacional WO 92-19759).
Por otra parte, en muchas enfermedades
autoinmunes y enfermedades alérgicas, hay células T que reconocen
antígenos específicos (células T sensibilizadas) y estas células T
sensibilizadas se sabe que están implicadas en la patología de
dichas enfermedades. Por ejemplo, es conocida la presencia de
células T sensibilizadas que se dirigen a la proteína básica de
mielina en la esclerosis múltiple (Zhang, J. et al., J. Exp.
Med. (1994) 179, 973-984), al antígeno S en la
uveitis (Nussenblatt, R. B. et al., Am. J. Ophthalmol (1980)
89, 173-179), a la tiroglobulina en la tiroiditis
crónica, a alimentos y acáridos en la dermatitis atópica (Kubota, Y.
et al., J. Dermatol. (1993) 20, 85-87, Kondo,
N. et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1993) 91,
658-668), a bacterias, virus, hongos, etc. en la
hipersensibilidad retardada, y a metales, a la laca Japonesa, etc.
en la dermatitis de contacto, y similares. El documento WO96/1120
describe el efecto terapéutico de un antagonista del anticuerpo
anti-receptor de IL-6 en un modelo
de artritis reumatoide. Gijbels et al., Molecular Medicine,
vol. 1, No. 7, 1995, establecen que el efecto reductor de la
enfermedad de los anticuerpos
anti-IL-6 en la EAE podría ser
causado por la neutralización de la actividad de
IL-6 o por el aumento de la actividad de
IL-6.
Además, es también posible inducir estados
patológicos similares a los de los seres humanos inmunizando a un
animal con estos antígenos o introduciendo células T sensibilizadas
específicas del antígeno en un animal no inmunizado. Basándose en
estos hechos, es posible que las células T sensibilizadas jueguen un
importante papel en las enfermedades anteriores. Actualmente, los
esteroides y/o los agentes inmunosupresores son utilizados para el
tratamiento de estas enfermedades, pero son tratamientos
sintomáticos y requieren la administración durante un largo periodo
de tiempo, que plantea eventualmente el problema de los efectos
secundarios.
No se ha conocido hasta ahora que los
antagonistas de IL-6 como se describen arriba
exhiban un efecto supresor sobre las células T sensibilizadas y un
efecto terapéutico sobre las enfermedades en las que están
implicadas las células T sensibilizadas.
La presente invención se refiere a un agente
preventivo o terapéutico para el tratamiento de la esclerosis
múltiple que comprende un anticuerpo antagonista dirigido contra el
receptor de IL-6 como ingrediente activo.
La presente invención también se refiere a un
agente preventivo o terapéutico para el tratamiento de la esclerosis
múltiple que comprende un anticuerpo monoclonal antagonista
dirigido contra el receptor de IL-6 como ingrediente
activo.
La presente invención también se refiere a un
agente preventivo o terapéutico para el tratamiento de la esclerosis
múltiple que comprende un anticuerpo monoclonal antagonista
dirigido contra el receptor de IL-6 humano como
ingrediente activo.
La presente invención también se refiere a un
agente preventivo o terapéutico para el tratamiento de la esclerosis
múltiple que comprende un anticuerpo monoclonal antagonista
dirigido contra el receptor de IL-6 de ratón como
ingrediente activo.
La presente invención también se refiere a un
agente preventivo o terapéutico para el tratamiento de la esclerosis
múltiple que comprende un anticuerpo PM-1 como
ingrediente activo.
La presente invención también se refiere a un
agente preventivo o terapéutico para el tratamiento de la esclerosis
múltiple que comprende un anticuerpo MR16-1 como
ingrediente activo.
La presente invención también se refiere a un
agente preventivo o terapéutico para el tratamiento de la esclerosis
múltiple que comprende un anticuerpo antagonista dirigido contra el
receptor de IL-6 que tiene la región constante
(región C) del anticuerpo humano como ingrediente activo.
La presente invención también se refiere a un
agente preventivo o terapéutico para el tratamiento de la esclerosis
múltiple que comprende un anticuerpo quimérico antagonista o un
anticuerpo humanizado dirigido contra el receptor de
IL-6 como ingrediente activo.
La presente invención también se refiere a un
agente preventivo o terapéutico para el tratamiento de la esclerosis
múltiple que comprende un anticuerpo PM-1
humanizado como ingrediente activo.
La Fig. 1 muestra una acción supresora sobre la
reacción de tipo tardío del edema de la almohadilla plantar del
ratón mediante MR16-1 después de la administración
simultánea de MR16-1 así como la sensibilización por
el bacilo de la tuberculosis.
Los antagonistas de IL-6
bloquean la transducción de señales por IL-6 e
inhiben la actividad biológica de IL-6. El
antagonista de IL-6 es un anticuerpo
anti-receptor de IL-6.
Los anticuerpos
anti-IL-6 se pueden obtener como
anticuerpos policlonales o monoclonales utilizando un método
conocido. Como anticuerpos anti-IL-6
se prefieren en particular anticuerpos monoclonales de origen
mamífero. Los anticuerpos monoclonales de origen mamífero incluyen
aquellos producidos mediante un hibridoma y un anticuerpo
recombinante producido por un huésped que ha sido transformado con
un vector de expresión que contiene genes del anticuerpo
manipulados por ingeniería genética. Estos genes, mediante la unión
a IL-6, inhiben la unión de IL-6 al
receptor de IL-6, y de esa manera bloquean la
transducción de señales de la actividad biológica de
IL-6 dentro de la célula.
Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen MH166
(Matsuda et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18,
951-956) y el anticuerpo SK2 (Sato, K. et
al., The 21st Nihon Mennekigakkai Soukai (Reunión General de la
Sociedad Japonesa de Inmunología), Academic Record (1991) 21, 166)
y los similares.
Un hibridoma que produce anticuerpo
anti-IL-6 puede construirse
básicamente utilizando un conocido procedimiento como se describe a
continuación. De esta forma, IL-6 puede ser
utilizado como un antígeno sensibilizador y se inmuniza por el
método convencional de inmunización. Las células inmunes obtenidas
así se fusionan con células madre conocidas en el proceso
convencional de fusión celular, y luego las células productoras de
anticuerpos monoclonales se rastrean por el método convencional de
rastreo para preparar el hibridoma deseado.
Específicamente, el anticuerpo
anti-IL-6 puede ser obtenido de la
siguiente manera. Por ejemplo, un antígeno humano utilizado como el
antígeno sensibilizador puede ser obtenido utilizando la secuencia
génica/la secuencia de aminoácidos de IL-6 descrita
en Eur. J. Biochem. (1987) 168, 543, J. Immunol. (1988) 140, 1534, o
Argic. Biol. (1990) 54, 2685.
Después de que una célula huésped apropiada se
transformara mediante la inserción de la secuencia del gen
IL-6 en un sistema vector de expresión conocido, la
proteína IL-6 de interés es purificada a partir de
la célula huésped o del sobrenadante del cultivo de la misma. La
proteína IL-6 purificada puede ser utilizada como
un antígeno sensibilizador. Alternativamente, una proteína de fusión
de la proteína IL-6 y otra proteína puede ser
utilizada como un antígeno sensibilizador.
Los anticuerpos anti-receptor de
IL-6 para uso en la presente invención pueden ser
obtenidos como anticuerpos policlonales o monoclonales utilizando
un método conocido. Como los anticuerpos
anti-receptor de IL-6 para uso en
la presente invención, se prefieren anticuerpos monoclonales, en
particular, de origen mamífero. Los anticuerpos monoclonales de
origen mamífero incluyen aquellos producidos por un hibridoma y
aquellos producidos por un huésped que ha sido transformado con un
vector de expresión que contiene los genes de anticuerpo manipulados
por ingeniería genética. Los anticuerpos, mediante la unión al
receptor de IL-6, inhiben la unión de
IL-6 al receptor de IL-6, y de esa
manera bloquean la transducción de la actividad biológica de
IL-6 dentro de la célula.
Ejemplos de tales anticuerpos incluyen el
anticuerpo MR16-1 (Saito, et al., J.
Immunology (1993) 147, 168-173), el anticuerpo
PM-1 (Hirata, et al., J. Immunology (1989)
143, 2900-2906), o el anticuerpo
AUK12-20, el anticuerpo AUK64-7 o
el anticuerpo AUK146-15 (Solicitud de Patente
internacional WO 92-19759), y los parecidos. Entre
ellos, el preferido es el anticuerpo PM-1.
Incidentalmente, la línea celular de hibridoma
que produce el anticuerpo PM-1 ha sido depositada
internacionalmente bajo las provisiones del Tratado de Budapest
como PM-1 el 10 de Julio de 1990, con el Instituto
Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, la Agencia de la
Ciencia Industrial y Tecnología, de 1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki,
Japón, como FERM BP-2998. Y la línea celular de
hibridoma que produce el anticuerpo MR16-1 ha sido
depositada internacionalmente bajo las provisiones del Tratado de
Budapest como hibridoma MR16-1 de
rata-ratón el 13 de Marzo de 1997, con el Instituto
Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, la Agencia de la
Ciencia Industrial y Tecnología, de 1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki,
Japón, como FERM BP-5875.
Los hibridomas que producen un anticuerpo
monoclonal pueden ser preparados básicamente utilizando un
procedimiento conocido como se describe a continuación. Así, el
receptor de IL-6 es utilizado como un antígeno
sensibilizador y se inmuniza de acuerdo con el método convencional
de inmunización. Las células inmunes así obtenidas son fusionadas
con células madre conocidas en el proceso convencional de fusión
celular, y entonces las células que producen los anticuerpos
monoclonales pueden ser rastreadas mediante el método convencional
de rastreo para preparar el hibridoma deseado.
Específicamente, el anticuerpo
anti-receptor de IL-6 puede ser
preparado de la siguiente manera. Por ejemplo, el receptor de
IL-6 humano utilizado como antígeno sensibilizador
para obtener anticuerpo, puede ser obtenido utilizando la secuencia
del gen/la secuencia de aminoácidos del receptor de
IL-6 descrita en la Solicitud de Patente Europea EP
325474, y el receptor de IL-6 de ratón se puede
obtener utilizando la descrita en la Publicación de Patente
japonesa no examinada (Kokai) 3 (1991)-155795.
Hay dos tipos de proteínas del receptor de
IL-6: el receptor de IL-6 expresado
en la membrana celular, y el receptor de IL-6
separado de la membrana celular (receptor de IL-6
soluble) (Yasukawa et al., J. Biochem. (1990) 108,
673-676). El anticuerpo del receptor de
IL-6 soluble se compone sustancialmente de la región
extracelular del receptor de IL-6 unida a la
membrana celular, y de esta manera es diferente del receptor de
IL-6 unido a la membrana por cuanto el último
carece de la región transmembrana o tanto de la región transmembrana
como de la región intracelular.
Después la secuencia del gen del receptor de
IL-6, fue insertada dentro de un sistema vector de
expresión conocido para transformar una célula huésped apropiada,
la proteína del receptor de IL-6 deseada puede ser
purificada a partir de la célula huésped o el sobrenadante del
cultivo de la misma utilizando un método conocido. La proteína del
receptor de IL-6 así purificada puede ser utilizada
como el antígeno sensibilizador. Alternativamente, las células que
están expresando la proteína del receptor de IL-6 o
una proteína de fusión de la proteína del receptor de
IL-6 y otra proteína pueden ser utilizadas como el
antígeno sensibilizador.
La E. coli que tiene un plásmido
pIBIBSF2R que contiene un ADNc que codifica el receptor de
IL-6 humano ha sido depositada internacionalmente
bajo las provisiones del Tratado de Budapest como
HB101-pIBIBSF2R el 9 de Enero de 1989, con el
Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, la Agencia de
la Ciencia Industrial y Tecnología, de 1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki,
Japón, como FERM BP-2232.
Los anticuerpos anti-gp130
pueden ser obtenidos como anticuerpos policlonales o monoclonales
utilizando un método conocido. Como anticuerpos
anti-gp130, se prefieren anticuerpos monoclonales de
origen mamífero en particular. Los anticuerpos monoclonales de
origen mamífero incluyen aquellos producidos por un hibridoma y
aquellos producidos por un huésped que ha sido transformado con un
vector de expresión que contiene los genes del anticuerpo
manipulados por ingeniería genética. Los anticuerpos, mediante la
unión a gp130, inhiben la unión del complejo
IL-6/receptor de IL-6 a gp130, y de
esta manera bloquean la transducción de la actividad biológica de
IL-6 dentro de la célula.
Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen el
anticuerpo AM64 (Publicación de Patente Japonesa no examinada
(Kokai) 3 (1991)-219894), el anticuerpo 4B11 y el
anticuerpo 2H4 (US55715113), el anticuerpo B-S12 y
el anticuerpo B-P8 (Publicación de Patente Japonesa
no examinada (Kokai) 8 (1996)-291199).
Un hibridoma que produce un anticuerpo
monoclonal puede ser básicamente construido utilizando un
procedimiento conocido como se describe a continuación. Así, gp130
puede ser utilizada como un antígeno sensibilizador y se inmuniza
por el método convencional de inmunización. Las células inmunes así
obtenidas son fusionadas con células madre conocidas mediante el
proceso convencional de fusión celular, y entonces los hibridomas
que producen anticuerpos monoclonales son escrutados mediante el
método convencional de escrutinio para preparar el hibridoma
deseado.
Específicamente, el anticuerpo monoclonal puede
ser obtenido de la siguiente manera. Por ejemplo, la gp130
utilizada como antígeno sensibilizador puede ser obtenida utilizando
la secuencia del gen/la secuencia de aminoácidos del receptor de
IL-6 descrita en la Solicitud de Patente Europea EP
411946.
Después una célula huésped apropiada fue
transformada mediante la inserción de la secuencia del gen gp130 en
un sistema conocido de vector de expresión, la proteína gp130 de
interés se purifica a partir de la célula huésped o a partir de
sobrenadante del medio de cultivo de la misma. La proteína gp130
purificada puede ser utilizada como antígeno sensibilizador.
Alternativamente, las células que están expresando la proteína del
receptor de IL-6 o una proteína de fusión de la
proteína gp130 y otra proteína pueden ser utilizadas como antígeno
sensibilizador.
Aunque los mamíferos a ser inmunizados con el
antígeno sensibilizador no están específicamente limitados, son
seleccionados preferentemente en consideración a su compatibilidad
con la célula madre para su uso en la fusión celular. Ellos
incluyen generalmente, aunque sin limitarse, a roedores tales como
ratones, ratas, hamsters y similares.
La inmunización de animales con un antígeno
sensibilizador se lleva a cabo utilizando un método conocido. Un
método general, por ejemplo, implica la administración
intraperitoneal o subcutánea de un antígeno sensibilizador al
mamífero. Específicamente, un antígeno sensibilizador que ha sido
diluido y resuspendido en una cantidad apropiada de solución salina
tamponada con fosfato (PBS) o suero fisiológico, etc. se mezcla,
como se desee, con una cantidad apropiada de un coadyuvante
corriente, por ejemplo adyuvante completo de Freund. Después de ser
emulsionado, es administrado preferentemente a un mamífero varias
veces cada 4 ó 21 días. Alternativamente un portador adecuado puede
ser usado en el momento de la inmunización del antígeno
sensibilizador.
Después de la inmunización y de la confirmación
del incremento de los niveles del anticuerpo deseado en el suero,
las células inmunes son extraídas del mamífero y son sometidas a la
fusión celular, en la que las células inmunes preferidas incluyen,
en particular, las células del bazo.
Las células de mieloma de mamífero como las
otras células madre que se sometieron a la fusión celular con las
células inmunes anteriormente mencionadas incluyen preferentemente
varias líneas celulares conocidas tales como P3X63Ag8.653 (J.
Immunol. (1979) 123: 1548-1550), P3X63Ag8U.1
(Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81:
1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein,
C., Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511-519)
MPC-11 (Margulies, D. H. et al., Cell (1976)
8: 405-415). SP2/0 (Shulman, M. et al.,
Nature (1978) 276 : 269-270), FO (de St. Groth, S.
F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35:
1-21), S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978)
148: 313-323), R210 (Galfre, G. et al.,
Nature (1979) 277: 131-133) y las similares.
La fusión celular entre las células inmunes
anteriores y las células de mieloma puede ser realizada
esencialmente de acuerdo con un método conocido tal como se
describe en Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C.
Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) y otros
similares.
Más específicamente, la fusión celular anterior
se lleva acabo en el caldo nutritivo convencional en presencia de,
por ejemplo, un acelerador de fusión celular. Como acelerador de
fusión celular puede ser usado, por ejemplo, polietilenglicol
(PEG), el virus Sendai (HVJ) y los similares, y, además, puede
añadirse como se desee un adyuvante como el dimetil sulfóxido, etc.
para incrementar la eficiencia de la fusión.
La proporción preferida de células inmunes y
células de mieloma para ser utilizada es, por ejemplo, de 1 a 10
veces más células inmunes que células de mieloma. Los ejemplos de
medios de cultivo para ser utilizados para la fusión celular
anterior incluyen el medio RPMI1640 y el medio de cultivo MEM
apropiados para el crecimiento de las líneas de células de mieloma
anteriores, y el medio convencional de cultivo utilizado para este
tipo de cultivo celular, y además podría añadirse un suplemento de
suero tal como suero fetal de ternera (FCS).
En la fusión celular, cantidades predeterminadas
de las células inmunes anteriores y de las células de mieloma son
bien mezcladas en el medio de cultivo anterior al que se le añadió
una solución de PEG previamente calentada a unos 37ºC, por ejemplo
una solución de PEG con una media de peso molecular de unos 1000 a
6000, a una concentración del 30 al 60% (p/v) y mezclada para
obtener las células fusionadas deseadas (hibridomas). Entonces,
mediante la repetición de la adición secuencial de un medio de
cultivo líquido apropiado y de centrifugación para retirar el
sobrenadante, los agentes de fusión celular, etc., que no son
deseables para el crecimiento del hibridoma, pueden ser
retirados.
Dicho hibridoma se selecciona mediante cultivo
en el medio convencional de selección, por ejemplo, el medio de
cultivo HAT (un medio de cultivo líquido que contiene hipoxantina,
aminopterina, y timidina. El cultivo en dicho medio de cultivo HAT
se continua generalmente durante un periodo de tiempo suficiente
para afectar la muerte de las otras células que no son las del
hibridoma deseado (células no fusionadas), generalmente de varios
días a varias semanas. Se realiza el método convencional de dilución
limitante, mediante el cual los hibridomas que producen el
anticuerpo deseado son escrutados y clonados monoclonalmente.
Además de obtener el hibridoma anterior mediante
la inmunización de un animal, distinto a un humano, con un
antígeno, es también posible sensibilizar linfocitos humanos in
vitro con el antígeno deseado o con las células que expresan el
antígeno deseado, y los linfocitos B sensibilizados resultantes son
fusionados con una célula humana de mieloma, por ejemplo U266, para
obtener el anticuerpo humano deseado que tenga actividad de unión
al antígeno deseado o a las células que expresan el antígeno deseado
(véase la Publicación de Patente Japonesa
Post-examinada (Kokoku) Nº 1
(1989)-59878). Además, un animal transgénico que
tenga un repertorio de todos los genes de anticuerpos humanos es
inmunizado con el antígeno o con las células que expresan el
antígeno para obtener el anticuerpo humano deseado por el método
descrito anteriormente (véase la Solicitud de Patente Internacional
WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO
96/33735).
Los hibridomas que producen el anticuerpo
monoclonal así construido pueden ser subcultivados en el medio de
cultivo líquido convencional, o pueden ser guardados por un periodo
prolongado de tiempo en nitrógeno líquido.
Para obtener anticuerpos monoclonales a partir
de dicho hibridoma, puede ser mencionado un método en el cual dicho
hibridoma se cultiva por el método convencional y los anticuerpos se
obtienen en el sobrenadante, o un método por el cual el hibridoma
se administra y crece en un mamífero compatible con dicho hibridoma
y los anticuerpos se obtienen como líquido ascítico. El método
anterior es adecuado para obtener anticuerpos de elevada pureza,
mientras que el último es adecuado para la producción de anticuerpos
a gran escala.
Específicamente el hibridoma que produce el
anticuerpo anti-receptor de IL-6
puede ser construido utilizando el método descrito en la
Publicación de Patente Japonesa no examinada (Kokai) 3
(1989)-139293. Puede ser construido mediante un
método en el que el hibridoma que produce el anticuerpo
PM-1, que fue depositado internacionalmente bajo
las provisiones del Tratado de Budapest como FERM
BP-2998 el 10 de Julio de 1990, con el Instituto
Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, la Agencia de la
Ciencia Industrial y Tecnología, de 1-3, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki,
Japón, se inyecta intraperitonelamente a ratones BALB/c (producidos
por CLEA, Japón) para producir el líquido ascítico a partir de los
cuales se purifica el anticuerpo PM-1, o: un método
en el que dicho hibridoma se cultiva en un medio de cultivo
apropiado tal como el medio RPMI1640 que contiene un 10% de de
suero fetal bovino y un 5% de BM-Condimed H1
(fabricado por Boehringer Mannheim), el medio de hibridoma SFM
(fabricado por GIBCO-BRL), el medio
PFH-II (fabricado por GIBCO-BRL) y
similares, y el anticuerpo PM-1 puede ser
purificado a partir del sobrenadante.
Un anticuerpo recombinante que fue producido
mediante la tecnología de gen recombinante, en la que un gen de
anticuerpo fue clonado a partir del hibridoma e integrado en un
vector apropiado, el cual fue luego introducido en un huésped,
puede ser utilizado en la presente invención como anticuerpo
monoclonal (véase, por ejemplo, Carl, A. K., Borrebaeck and James,
W. Larrick, "Anticuerpos monoclonales terapéuticos", publicado
en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990).
Específicamente, el ARNm que codifica la región
variable (V) del anticuerpo deseado se aisla a partir del hibridoma
que produce el anticuerpo. El aislamiento de ARNm se realiza
mediante la preparación de ARN total utilizando, por ejemplo, un
método conocido tal como el método de ultracentrífuga guanidina
(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18,
5294-5299), el método AGPC (Chmczynski, P. et
al., (1987) 162, 156-159), y entonces el ARNm
se purifica a partir del ARN total utilizando el kit de Purificación
de ARNm (fabricado por Pharmacia) y similares. Alternativamente, el
ARNm puede ser preparado directamente utilizando el kit de
purificación Quick Prep mRNA (fabricado por Pharmacia).
El ADNc de la región V del anticuerpo puede ser
sintetizado a partir del ARNm así obtenido utilizando una
transcriptasa reversa. El ADNc puede ser sintetizado utilizando el
kit AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA
Synthesis y similares. Alternativamente, para la síntesis y
amplificación del ADNc, puede ser utilizado el kit
5'-Ampli FINDER RACE (fabricado por Clontech) y el
método 5'- RACE (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A. (1998) 85, 8998-9002; Belyavsky, A.
et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17,
2919-2932) que emplea la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). El fragmento de ADN deseado se purifica a partir
del producto de la PCR obtenido y puede ser ligado al vector de
ADN. Además, a partir de éste se construye un vector recombinante y
luego se introduce en E. coli etc., a partir de la cual se
seleccionan las colonias para preparar el vector recombinante
deseado. La secuencia base del ADN deseado puede ser confirmada por
un método conocido tal como el método didesoxi.
Una vez que se ha obtenido el ADN que codifica
la región V del anticuerpo deseado, puede ligarse al ADN que
codifica la región constante (región C) del anticuerpo deseado, que
luego se integra en un vector de expresión. Alternativamente, el
ADN que codifica la región V del anticuerpo puede ser integrado en
el vector de expresión que ya contiene el ADN que codifica la
región C del anticuerpo.
Para producir el anticuerpo para ser usado en la
presente invención, el gen del anticuerpo es integrado como se
describe más abajo en un vector de expresión para ser luego
expresado bajo el control de la región reguladora de la expresión,
por ejemplo un aumentador y/o un promotor. Con posterioridad, el
vector de expresión puede ser transformado dentro de una célula
huésped y el anticuerpo puede entonces ser expresado en su
interior.
De acuerdo con la presente invención, el
anticuerpo recombinante alterado artificialmente tal como el
anticuerpo quimérico y el anticuerpo humanizado pueden ser
utilizados para el propósito de reducir la antigenicidad heteróloga
contra seres humanos. Estos anticuerpos alterados pueden ser
producidos utilizando métodos conocidos.
El anticuerpo quimérico puede ser obtenido
mediante la ligación del ADN ya obtenido que codifica la región V
del anticuerpo al ADN que codifica la región C del anticuerpo
humano, que es luego integrado en un vector de expresión e
introducido en un huésped para la producción del anticuerpo en su
interior (véase la Solicitud de Patente Europea EP 125023 y la
Solicitud de Patente Internacional WO 96/02576). Utilizando este
método conocido, puede ser obtenido el anticuerpo quimérico útil
para la presente invención.
Por ejemplo, el plásmido que contiene el ADN que
codifica la cadena L de la región V o la cadena H de la región V
del anticuerpo quimérico PM-1 se denominó como
pPM-k3 o pPM-h1 respectivamente, y
la E. coli que contiene el plásmido ha sido depositada
internacionalmente bajo las provisiones del Tratado de Budapest como
NCIMB 40366 y NCIMB 40362 respectivamente el 11 de Febrero de 1991,
con las Colecciones Nacionales de Bacterias Industriales y Marinas
Limitadas (véase la Solicitud de Patente Internacional WO
92-19759).
El anticuerpo humanizado, también llamado
anticuerpo humano reformado, ha sido realizado injertando las
regiones determinantes de complementaridad (CDRs) de un anticuerpo
de mamífero diferente al humano, por ejemplo el anticuerpo de
ratón, dentro de las CDRs del anticuerpo humano. También se conoce
la tecnología general de ADN recombinante para la preparación de
tales anticuerpos (véase la Solicitud de Patente Europea EP 125023
y la Solicitud de Patente Internacional WO 96/02576).
Específicamente, una secuencia de ADN que fue
designada para ligar la CDR del anticuerpo de ratón con la región
marco (FR) del anticuerpo humano se sintetiza por la técnica de PCR
a partir de varios oligonucleótidos divididos que tienen secciones
que solapan con cualquier otra en las terminaciones del mismo. El
ADN así obtenido se liga al ADN que codifica la región C del
anticuerpo humano y luego se integra en un vector de expresión, el
cual se introduce en un huésped para la producción del anticuerpo
(véase la Solicitud de Patente Europea EP 239400 y la Solicitud de
Patente Internacional WO 92-19759).
Para el FR del anticuerpo humano ligado mediante
CDR, se selecciona la región determinante de la complementaridad
que forma un sitio de unión a un antígeno favorable. Cuando se
desea, los aminoácidos en la región marco de la región variable del
anticuerpo pueden ser sustituidos de tal manera que la región que
determina la complementaridad del anticuerpo humano reformado pueda
formar un sitio de unión al antígeno apropiado (Sato, K. et
al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
Para el anticuerpo quimérico o el anticuerpo
humanizado, se utiliza la región C del anticuerpo humano. Como
región C del anticuerpo humano, pueden mencionarse aquí y pueden ser
utilizadas C\gamma y C\gamma1, C\gamma2, C\gamma3 y
C\gamma4, por ejemplo La región C del anticuerpo humano puede ser
modificada para mejorar la estabilidad del anticuerpo o la
producción del mismo.
Un anticuerpo quimérico consta de la región
variable del anticuerpo derivado de un mamífero diferente del
humano y de la región C derivada del anticuerpo humano, mientras que
el anticuerpo humanizado consta de la región determinante de la
complementaridad del anticuerpo derivado de un mamífero distinto del
humano y la región marco (FR) y la región C del anticuerpo derivado
del anticuerpo humano. Por consiguiente, la antigenicidad del mismo
en el cuerpo humano ha sido reducida de tal forma que es útil como
ingrediente activo de los agentes terapéuticos de la presente
invención.
Una realización preferida del anticuerpo
humanizado para uso en la presente invención incluye el anticuerpo
humanizado PM-1 (véase la Solicitud de Patente
Internacional WO 92-19759).
Los genes del anticuerpo construidos como se
describe anteriormente pueden ser expresados y obtenidos por un
método conocido. En el caso de las células de mamíferos, la
expresión puede ser realizada utilizando un ADN en el que un
promotor útil comúnmente utilizado, el gen del anticuerpo que va a
ser expresado, y la señal poli A en el extremo 3' aguas abajo del
mismo han sido operativamente unidos o un vector que contiene dicho
ADN. Los ejemplos del promotor/aumentador incluyen cytomegalovirus
humanos promotor temprano inmediato/aumentador.
Adicionalmente, como el promotor/aumentador que
puede ser utilizado para la expresión del anticuerpo para su uso en
la presente invención, existen promotores/aumentadores virales tales
como retrovirus, polioma virus, adenovirus, y virus de simios 40
(SV40), y promotores/aumentadores derivados de células de mamíferos
tal como el factor 1\alpha de alargamiento humano
(HEF1\alpha).
Por ejemplo, la expresión puede ser realizada
rápidamente mediante el método de Mulligan et al. (Nature
(1979) 277, 108) donde se utiliza el promotor/aumentador SV40, o
mediante el método de Mizushima et al. (Nucleic Acids Res.
(1990) 18, 5322), donde se utiliza el promotor/aumentador
HEF1\alpha.
En el caso de E. coli, la expresión puede
ser realizada uniendo operativamente un promotor útil comúnmente
utilizado, una secuencia señal para la secreción del anticuerpo, y
el gen del anticuerpo que se expresa, seguido de la expresión del
mismo. Como promotor, por ejemplo, pueden mencionarse aquí el
promotor lacz y el promotor araB. El método de Ward et al.
(Nature (1998) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6,
2422-2427) se puede utilizar cuando se usa el
promotor lacz y el método de Better et al. (Science (1988)
240, 1041-1043) se puede utilizar cuando se usa el
promotor araB.
Como secuencia señal para la secreción del
anticuerpo, cuando se produce en el periplasma de E. coli, se
puede utilizar la secuencia señal pelB (Lei, S. et al., J.
Bacteriol. (1987) 169, 4379). Después de separar el anticuerpo
producido en el periplasma, la estructura del anticuerpo se repliega
apropiadamente antes de su uso (véase, por ejemplo, el documento WO
96/30394).
Como origen de replicación, pueden utilizarse
los derivados del SV40, como los polioma virus, los adenovirus, el
virus del papiloma bovino (BPV) y los similares. Además, para la
amplificación del número de copias del gen en el sistema celular
huésped, los vectores de expresión pueden incluir como marcadores de
selección el gen de la aminoglicóxido transferasa (APH), el gen de
la timidina kinasa (TK), el gen de la xantina guaninafosforibosil
transferasa de E. coli (Ecogpt), el gen de la dihidrofolato
reductasa (dhfr) y los similares.
Para la producción del anticuerpo para su uso en
la presente invención, puede ser utilizado cualquier sistema de
producción. El sistema de producción de la preparación del
anticuerpo comprende el sistema de producción in vitro o el
sistema in vivo. Como sistema de producción in vitro,
se puede mencionar un sistema de producción que emplea células
eucariotas y el sistema de producción que emplea células
procariotas.
Cuando se utilizan las células eucariotas, hay
sistemas de producción que emplean células animales, células de
plantas, y células de hongos. Las células animales conocidas
incluyen (1) células de mamífero tales como las células CHO, las
células COS, las células de mieloma, las células del riñón de
hamster pequeño (BHK), las células HeLa, y las células Vero, (2)
las células de anfibio tales como oocitos de Xenopus, o (3)
las células de insecto tales como sf9, sf21, y Tn5. Las células de
plantas conocidas incluyen, por ejemplo, las derivadas de
Nicotiana tabacum, que están sometidas al cultivo de callos.
Las células de hongos conocidas incluyen levaduras tales como el
género Saccharomyces, más es-
pecíficamente Saccharomyces cerevisiae, u hongos filamentosos tales como el género Aspergillus, más específicamente Aspergillus niger.
pecíficamente Saccharomyces cerevisiae, u hongos filamentosos tales como el género Aspergillus, más específicamente Aspergillus niger.
Cuando se utilizan las células procariotas, hay
sistemas de producción que emplean células bacterianas. Las células
bacterianas conocidas incluyen Escherichia coli, (E.
coli) y Bacillus subtilis.
Mediante la introducción, vía transformación,
del gen del anticuerpo deseado en estas células y cultivando las
células transformadas in vitro, se puede obtener el
anticuerpo. El cultivo se realiza por los métodos conocidos. Por
ejemplo, como cultivo líquido se puede utilizar DMEM, MEM, RPMI1640,
e IMDM, y en combinación pueden usarse suplementos de suero tales
como el suero fetal de ternera (FCS). Además, los anticuerpos se
pueden producir in vivo mediante la implantación de células,
en las que se ha introducido el gen del anticuerpo, dentro de la
cavidad abdominal de un animal, y los similares.
Como sistemas de producción in vivo, se
pueden mencionar aquí los que emplean animales y los que emplean
plantas. Cuando se utilizan animales, hay sistemas de producción
que emplean mamíferos e insectos.
Como mamíferos, se pueden utilizar cabras,
cerdos, ovejas, ratones, y vacunos (Vicki Glaser, SPECTRUM
Biotechnology Applications, 1993). También se pueden utilizar
insectos, como los gusanos de seda.
Cuando se usan plantas, se puede utilizar, por
ejemplo, el tabaco.
Los genes del anticuerpo son introducidos en
esos animales o plantas, y los anticuerpos son producidos en dichos
animales o plantas, y recuperados. Por ejemplo, un gen de anticuerpo
es insertado en medio del gen que codifica una proteína que es
inherentemente producida en la leche tal como la caseína de cabra,
para preparar genes de fusión. Los fragmentos de ADN que contienen
el gen de fusión dentro del cual el gen del anticuerpo ha sido
insertado, son inyectados en un embrión de cabra, y el embrión es
introducido en una cabra hembra. El anticuerpo deseado es obtenido
de la leche producida por la cabra transgénica nacida de la cabra
que recibió el embrión o de un descendiente de la misma. Para
incrementar la cantidad de leche producida por la cabra transgénica
que contiene el anticuerpo deseado, se pueden suministrar hormonas a
la cabra transgénica de forma apropiada. (Ebert, K. M. et
al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
Cuando son utilizados gusanos de seda, un
baculovirus en el que ha sido insertado el gen del anticuerpo
deseado es inoculado en el gusano de seda, y el anticuerpo deseado
puede ser obtenido a partir del fluido corporal del gusano de seda
(Susumu, M. et al., Nature (1985) 315,
592-594). Además, cuando se utiliza el tabaco, el
gen del anticuerpo deseado es insertado en un vector de expresión
para plantas, por ejemplo pMON 530, y entonces el vector es
introducido en una bacteria tal como Agrobacterium
tumefaciens. La bacteria es entonces inoculada en el tabaco tal
como Nicotiana tabacum para obtener el anticuerpo deseado a
partir de las hojas del tabaco (Julian, K. - C. Ma et al.,
Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
Cuando el anticuerpo se produce en sistemas de
producción in vivo o in vitro, como se describe
anteriormente, el ADN que codifica la cadena pesada (cadena H) o la
cadena ligera (cadena L) del anticuerpo puede integrarse
separadamente en un vector de expresión y los huéspedes se
transforman simultáneamente, o el ADN que codifica la cadena H y la
cadena L puede integrarse en un vector de expresión sencillo y el
huésped se transforma con el mismo (véase la Solicitiud de Patente
Internacional WO 94-11523).
Los anticuerpos para uso en la presente
invención pueden ser fragmentos de anticuerpos o versiones
modificadas del mismo siempre que sean utilizados preferentemente.
Por ejemplo, como fragmentos de anticuerpo, pueden mencionarse Fab,
F(ab')2, Fv o la cadena sencilla de Fv (scFv) en la que los
Fv de la cadena H y de la cadena L se ligaron mediante un acoplador
apropiado. Los anticuerpos se trataron específicamente con una
enzima, por ejemplo, papaína o pepsina, para producir fragmentos de
anticuerpo, o se construyen genes que codifican estos fragmentos de
anticuerpo, y entonces se introducen en un vector de expresión, que
se expresa en una célula huésped apropiada (véase, por ejemplo, Co,
M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152,
2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods
in Enzymology (1989) 178, 476-496), Academic Press,
Inc.; Plueckthun, A. and Skerra, A., Methods in Enzymology (1989)
178, 476-496, Academic Press, Inc.; Lamoyi, E.,
Methods in Enzymology (1986) 121, 652-663;
Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1986) 121,
663-669; Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991)
9, 132-137).
El scFv puede obtenerse ligando la región V de
la cadena H y la región V de la cadena L del anticuerpo. En el
scFv, la región V de la cadena H y la región V de la cadena L se
ligan preferentemente mediante un acoplador, preferentemente un
péptido acoplador (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A. (1998) 85, 5879-5883). La región V de
la cadena H y la región V de la cadena L en el scFv pueden derivarse
a partir de cualquiera de los anticuerpos anteriormente
mencionados. Como péptido acoplador para la ligación de las regiones
V, puede utilizarse cualquier péptido de cadena sencilla que
comprenda, por ejemplo, 12-19 residuos de
aminoácidos.
El ADN que codifica scFv puede obtenerse
utilizando ADN que codifica la cadena H o la región V de la cadena
H del anticuerpo anterior y el ADN que codifica la cadena L o la
región V de la cadena L del anticuerpo anterior como molde,
mediante la amplificación de la porción del ADN que codifica la
secuencia de aminoácidos deseada entre las secuencias anteriores
por la técnica de PCR utilizando el par de iniciadores que
especifican las dos terminaciones del mismo, y por una
amplificación adicional de la combinación de ADN que codifica la
porción de unión del péptido y el par iniciador que define que
ambas terminaciones del mencionado ADN estén ligadas a la cadena H
y a la cadena L, respectivamente.
Una vez que se construyen los ADNs que codifican
el scFv, puede obtenerse un vector de expresión que los contiene y
un huésped transformado con dicho vector de expresión mediante los
métodos convencionales, y scFv puede obtenerse utilizando el
huésped resultante por los métodos convencionales.
Esos fragmentos de anticuerpo pueden producirse
mediante la obtención del mismo gen de una manera similar a la
mencionada anteriormente y permitiéndole que se exprese en un
huésped. "El anticuerpo" como se utiliza en la reivindicación
de la presente solicitud abarca estos fragmentos de anticuerpo.
Como anticuerpos modificados, pueden utilizarse
los anticuerpos asociados con varias moléculas tales como
polietilen glicol (PEG). "El anticuerpo" como se utiliza en la
reivindicación de la presente solicitud abarca estos anticuerpos
modificados. Estos anticuerpos modificados pueden obtenerse
modificando químicamente los anticuerpos así obtenidos. Estos
métodos han sido ya establecidos en la técnica.
Los anticuerpos producidos y expresados como se
describe anteriormente pueden separarse del interior o del exterior
de la célula huésped y luego pueden purificarse a homogeneidad. La
separación y la purificación del anticuerpo para su uso en la
presente invención pueden efectuarse mediante cromatografía de
afinidad. Como la columna utilizada para tal cromatografía de
afinidad, se puede mencionarse la columna de Proteína A y la
columna de Proteína G. Ejemplos de los portadores utilizados en la
columna de Proteína A son Hyper D, POROS, Sepharosa F. F. y los
similares. Alternativamente, los métodos utilizados
convencionalmente para la separación y la purificación de proteínas
pueden usarse sin ninguna limitación. La separación y la
purificación del anticuerpo para su uso en la presente invención
pueden realizarse combinando, apropiadamente, otra cromatografía
distinta a la cromatografía de afinidad mencionada anteriormente,
como la filtración, la ultrafiltración, el intercambio de sal, la
diálisis y similares. La cromatografía incluye, por ejemplo, la
cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía hidrofóbica,
la filtración en gel y similares. Estas cromatografías pueden
aplicarse dentro de HPLC. Alternativamente, puede utilizarse la
cromatografía en fase reversa.
La concentración del anticuerpo obtenido en el
apartado 2-1 puede determinarse mediante la medida
de la absorbancia o mediante el ensayo de inmunosorbente ligado a
enzima (ELISA) y los similares. Por tanto, cuando se emplea la
medición de la absorbancia, el anticuerpo para su uso en la presente
invención, o una muestra que contiene el anticuerpo, se diluye
apropiadamente con PBS (-) y luego se mide la absorbancia a 280 nm,
seguido del cálculo utilizando el coeficiente de absorción de 1,35
DO a 1 mg/ml. Cuando se utiliza el método de ELISA, la medición se
realiza como sigue. De este modo, 100 \mul de
anti-IgG humano de cabra (fabricado por TAGO)
diluido a 1 \mug/ml en tampón bicarbonato 0,1 M, a pH 9,6, se
añade a una placa de 96 pocillos (fabricada por Nunc), y se incuba
durante toda la noche a 4ºC para inmovilizar el anticuerpo.
Después del bloqueo, se añaden como estándar 100
\mul de cada uno de los anticuerpos apropiadamente diluidos para
su uso en la presente invención o una muestra que contiene el
anticuerpo, o 100 \mul de IgG humano (fabricado por CAPPEL) y se
incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado,
se añaden 100 \mul de anticuerpo anti-IgG humano
marcado con fosfatasa alcalina (fabricado por BIO SOURCE) diluido
5000 veces, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora.
Después del lavado, se añade la solución de substrato y se incuba,
seguido de la medición de la absorbancia a 405 nm utilizando el
LECTOR de MICROPLACA Modelo 3550 (fabricado por
Bio-Rad) para calcular la concentración del
anticuerpo deseado.
La IL-6 alterada tiene una
actividad de unión al receptor de IL-6 y no
transmite la actividad biológica de IL-6. De este
modo, la IL-6 alterada, aunque compite con
IL-6 para unirse al receptor de
IL-6, no transmite la actividad biológica de
IL-6, y de este modo bloquea la señal de
transducción por IL-6.
La IL-6 alterada puede
construirse mediante la introducción de una mutación reemplazando
restos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de
IL-6. La IL-6, la fuente de la
IL-6 alterada, puede ser de cualquier origen pero,
cuando hay que considerar la antigenicidad, es preferible la
IL-6 humana. Específicamente, la estructura
secundaria de IL-6 se predice utilizando un programa
conocido de modelado molecular de la secuencia de aminoácidos, por
ejemplo WHATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990), 8,
52-56), y se evaluarán los efectos completos del
resto de aminoácido que se reemplazará. Después de que se determinó
un resto de aminoácido apropiado, se introduce la mutación mediante
el método comúnmente utilizado de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), utilizando un vector que contiene la secuencia
base que codifica el gen IL-6 humano, para obtener
de ese modo un gen que codifica la IL-6 alterada.
Este se integra luego, como se desee, en un vector de expresión
apropiado, a partir del cual la IL-6 alterada puede
obtenerse de acuerdo con la expresión, producción y purificación de
dicho anticuerpo recombinante.
Ejemplos específicos de IL-6
alterada se describen en Brakenhoff et al., J. Biol. Chem.
(1994) 269, 86-93, y Savino et al., EMBO J.
(1994) 13, 1357-1367, documentos WO
96-18648, y WO 96-17869.
El péptido parcial de IL-6 o el
péptido parcial del receptor de IL-6 para su uso en
la presente invención tienen una actividad de unión al receptor de
IL-6 o a IL-6, respectivamente, y no
transmiten la actividad biológica de IL-6. De este
modo, el péptido parcial de IL-6 o el péptido
parcial del receptor de IL-6 se une al receptor de
IL-6 o a IL-6, respectivamente, y de
ese modo lo captura. Como resultado, no transmiten la actividad
biológica de IL-6, y bloquean la señal de
transducción de IL-6.
El péptido parcial de IL-6 o el
péptido parcial del receptor de IL-6 es un péptido
que comprende alguno o todos los aminoácidos de la secuencia de la
región implicada en la unión a IL-6 y al receptor de
IL-6 en la secuencia de aminoácidos de
IL-6 o del receptor de IL-6. Tal
péptido generalmente comprende 10-80,
preferiblemente 20-50, más preferiblemente
20-40 restos de aminoácidos.
\newpage
El péptido parcial de IL-6 o el
péptido parcial del receptor de IL-6 pueden
construirse especificando la región implicada en la unión a
IL-6 y al receptor de IL-6 en la
secuencia de aminoácidos de IL-6 o del receptor de
IL-6, y produciendo toda o parte de la secuencia de
aminoácidos mediante un método convencional tal como una tecnología
de ingeniería genética o un método de síntesis de péptido.
Para preparar el péptido parcial de
IL-6 o el péptido parcial del receptor de
IL-6 mediante una tecnología de ingeniería
genética, la secuencia de ADN que codifica el péptido deseado se
integra en un vector de expresión, a partir del cual el péptido
puede obtenerse de acuerdo con la expresión, la producción, y la
purificación de dicho anticuerpo recombinante.
La preparación del péptido parcial de
IL-6 o del péptido parcial del receptor de
IL-6 mediante el método de síntesis de péptido
puede ser realizada utilizando un método comúnmente utilizado en la
síntesis de péptido tal como la síntesis en fase sólida o la
síntesis en fase líquida. Específicamente podría ser utilizado el
método descrito en Zoku-iyakuhin no Kaihatsu (Sequel
to developement of Pharmaceuticals), Vol. 14, Peputido Gousei
(Peptide Synthesis), editado por Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten,
1991. El método de síntesis de fase sólida utilizado incluye, por
ejemplo, una reacción en la que el aminoácido que corresponde al
C-terminal del péptido a ser sintetizado se acopla
a un soporte que es insoluble en disolventes orgánicos, y luego un
aminoácido en el que un grupo \alpha-amino o un
grupo funcional de una cadena lateral que se ha protegido con un
grupo protector adecuado, se condensa con un aminoácido al mismo
tiempo en la dirección del C-terminal al
N-terminal, y una reacción en la que dicho grupo
protector del grupo \alpha-amino del aminoácido o
el péptido acoplado a la resina se elimina y se repite
alternativamente para alargar la cadena del péptido. Los métodos de
síntesis de péptidos en fase sólida se dividen en el método Boc y en
el método Fmoc dependiendo del tipo de grupo protector a ser
utilizado.
Después que la síntesis del péptido deseado está
completa, la cadena del péptido se separa del soporte mediante una
reacción de desprotección. Para la separación de la cadena del
péptido, se utiliza generalmente fluoruro de hidrógeno o sulfonato
de trifluorometano en el método Boc, y TFA en el método Fmoc. En el
método Boc, por ejemplo, la resina del péptido anterior se trata
con fluoruro de hidrógeno en presencia de anisol. Con posterioridad,
el grupo protector se elimina y el péptido se recupera mediante
separación del soporte. Mediante la liofilización de este, se puede
obtener el péptido crudo. Por otra parte, en el método Fmoc, el TFA,
por ejemplo, se utiliza de una manera similar a la anterior para
efectuar la reacción de desprotección y la reacción de separación
del péptido del soporte.
El péptido crudo así obtenido puede aplicarse a
la HPLC para su separación y purificación. Su elución puede
llevarse a cabo en un sistema de disolvente de
agua-acetonitrilo que se utiliza comúnmente para la
purificación de proteína bajo una condición óptima. La fracción que
corresponde al pico obtenido en el perfil de la cromatografía se
recoge y se liofilizada. La fracción del péptido así purificada se
identifica sometiéndola al análisis de peso molecular mediante
análisis por espectroscopía de masas, el análisis de la composición
de aminoácidos, o el análisis de la secuencia de aminoácidos, o los
similares.
Ejemplos específicos de péptido parcial de
IL-6 o de péptido parcial del receptor de
IL-6 se describen en la Publicación de Patente
Japonesa no examinada (Kokai) 2 (1990) - 188600, la Publicación de
Patente Japonesa no examinada (Kokai) 7 (1995) - 324097, la
Publicación de Patente Japonesa no examinada (Kokai) 8 (1996) -
311098, y la Publicación de Patente de los Estados Unidos US
5210075.
La actividad del antagonista de
IL-6 para su uso en la presente invención puede
evaluarse utilizando un método conocido convencionalmente. Por
ejemplo, IL-6 se añade a la célula
IL-6-dependiente MH60.BSF2 y la
actividad puede evaluarse utilizando la incorporación de
^{3}H-timidina a la célula
IL-6-dependiente en la coexistencia
con el antagonista de IL-6 como un índice.
Alternativamente, la evaluación puede ser efectuada añadiendo
IL-6 marcada con ^{125}I y una cantidad en exceso
de IL-6 no marcado a U266, una célula que expresa el
receptor de IL-6, y añadiendo el antagonista de
IL-6 al mismo tiempo y luego determinando la
IL-6 marcada con ^{125}I unida a la célula que
expresa el receptor de IL-6.
Para confirmar los efectos, un antagonista de
IL-6 puede suministrarse a un animal que se ha
sensibilizado con células T mediante contagio o a un animal al que
se le han introducido células T sensibilizadas, y se evaluan los
efectos supresores sobre las células T sensibilizadas.
Como antígeno sensibilizador para suministrarse
al animal, puede utilizarse, por ejemplo, el bacilo de la
tuberculosis.
Como animal para inmunizarse, se pueden utilizar
los animales que generalmente se usan en los experimentos, tales
como ratones, ratas, conejos, y los similares. El efecto puede
confirmarse mediante la observación del retraso en la reacción
inflamatoria inducido por la inoculación del mismo antígeno a un
animal al que se le suministró el antígeno.
\newpage
Como describen los ejemplos a continuación, en
la reacción tardía del edema de la almohadilla plantar del ratón,
se observó que la administración del anticuerpo
anti-receptor de IL6, dio como resultado la
supresión de la reacción tardía inflamatoria. Desde que se conoció
que las células T sensibilizadas están implicadas en la reacción
tardía del edema de la almohadilla plantar, se reveló que los
antagonistas de IL-6 tales como el anticuerpo
anti-receptor de IL-6 ejercen un
efecto inhibitorio sobre las células T sensibilizadas.
Los agentes preventivos o terapéuticos para el
tratamiento de la esclerosis múltiple de la presente invención se
pueden administrar, bien sistémica o localmente, mediante una ruta
parenteral, por ejemplo por inyección intravenosa tal como infusión
gota a gota, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, e
inyección subcutánea. Puede escogerse el método de administración
más apropiado, dependiendo de la edad y de las condiciones del
paciente. Para la administración la dosis efectiva se elige entre
0,01 mg a 100 mg por kg de peso corporal. Alternativamente, se
puede elegir la dosis entre 1 a 1000 mg, preferentemente de 5 a 50
mg por paciente.
Los agentes preventivos o terapéuticos para el
tratamiento de la esclerosis múltiple de la presente invención
pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables o aditivos
dependiendo de la ruta de administración. Los ejemplos de tales
portadores o aditivos incluyen agua, un disolvente orgánico
farmacéuticamente aceptable, colágeno, polivinil alcohol,
polivinilpirrolidona, un polímero de caboxivinilo,
carboximetilcelulosa sódica, poliacrílico de sodio, alginato
sódico, dextrano soluble en agua, carboximetilo de almidón sódico,
pectina, metilcelulosa, etilcelulosa, goma de xantano, goma
arábiga, caseína, gelatina, agar, diglicerina, propilenglicol,
vaselina, parafina, estearil alcohol, ácido esteárico, seroalbúmina
humana (HSA), manitol, sorbitol, lactosa, un surfactante
farmacéuticamente aceptado y los similares.
Los aditivos utilizados se eligen entre, pero no
están limitados a, los anteriores o combinaciones de los mismos
dependiendo de la forma de dosificación.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se explicará ahora con más
detalles con referencia a los Ejemplos de Trabajo, a los Ejemplos
de Referencia y a los Ejemplos Experimentales. Debería resaltarse,
sin embrago, que la presente invención no está limitada a ellos de
ningún modo.
Ejemplo
1
Células muertas desecadas de Mycobacterium
butyricum se añadieron a 2,5 mg/ml en adyuvante incompleto de
Freunds para preparar una emulsión, de la cual 0,2 ml se inyectaron
luego en ratones machos C57BL/6 para infectarlos. El día 14, 10 mg
de las células muertas desecadas de Mycobacterium butyricum
resuspendidas en suero fisiológico salino, se inyectaron
subcutáneamente en la almohadilla plantar derecha del animal para
provocar la reacción. Veinticuatro horas después, se midieron los
pesos de la almohadilla plantar izquierda y derecha y la diferencia
en los pesos se utilizó como un índice de la fuerza de la
reacción.
El anticuerpo MR16-1 a 0,125 mg,
0,5 mg, ó 2 mg se suministró intraperitonealmente, una sola vez,
simultáneamente con la inoculación. El grupo de control recibió IgG
de rata (KH-5) que tiene el mismo isotipo y el grupo
de ratones no sensibilizados recibió suero fisiológico salino de
una manera similar. Los resultados se muestran en la Figura 1.
La administración en una sola vez del anticuerpo
MR16-1 el día de la infección inhibió la reacción
del edema tardío de la almohadilla plantar del ratón, de modo que
dependía de la dosis.
Ejemplo de Referencia
1
El receptor de IL-6 soluble se
preparó mediante el método de PCR utilizando el plásmido pBSF2R.236
que contiene el ADNc que codifica el receptor de
IL-6 obtenido de acuerdo con el método de Yamasaki
et al., Science (1998) 241, 825-828. El
plásmido pBSF2R.236 fue digerido con una enzima de restricción Sph I
para obtener el ADNc del receptor de IL-6, el cual
se insertó luego en mp18 (fabricado por Amersham). Utilizando un
oligo iniciador diseñado para introducir un codon de parada en el
ADNc del receptor de IL-6, se introdujo una mutación
en el ADNc del receptor de IL-6 mediante el método
de PCR utilizando el Sistema de Mutagénesis in vitro
(fabricado por Amersham). El procedimiento dio como resultado la
introducción de un codon de parada en el aminoácido de la posición
345, y produjo el ADNc que codifica el receptor de
IL-6 soluble.
Para expresar el ADNc del receptor de
IL-6 soluble en células CHO, se ligó al plásmido pSV
(fabricado por Pharmacia) para obtener el plásmido pSVL344. El ADNc
del receptor de IL-6 soluble se cortó luego con Hind
III-Sal I y se insertó en el plásmido pECEdhfr que
contiene el ADNc de dhfr para obtener el plásmido pECEdhfr344 que
se puede expresar en las células CHO.
Diez \mug de plásmido pECEdhfr344 se
transfectaron a una línea celular dhfr-CHO,
DXB-11 (Urland et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. (1980) 77, 4216-4220) mediante el método
del fosfato cálcico (Chen et al., Mol. Cell. Biol. (1987) 7,
2745-2751). Las células CHO transfectadas se
cultivaron en un medio de selección \alpha MEM libre de
nucleósido que contiene glutamina 1 mM, 10% de FCS dializado, 1000
U/ml de penicilina, y 100 \mug/ml de estreptomicina.
Las células CHO seleccionadas fueron escrutadas
mediante el método de dilución limitante para obtener un único clon
de célula CHO. El clon de célula CHO se amplificó con metotrexato
(MTX) de 20 nM a 200 nM para obtener una línea celular CHO, 5E27
que produce el receptor IL-6 humano soluble. La
línea celular CHO 5E27 se cultivó en un medio Iscov modificado
Dulbecco (IMDM, fabricado por Gibco) que contiene un 5% de FBS. El
sobrenadante del cultivo se recogió y la concentración del receptor
de IL-6 soluble en el sobrenadante del cultivo se
determinó por ELISA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
2
Ratones BALB/c se inmunizaron con 10 \mug de
IL-6 recombinante (Hirano et al., Immunol.
Lett., 17: 41, 1988) junto con adyuvante completo de Freund, y esto
se repitió cada semana hasta que el anticuerpo
anti-IL-6 pudo ser detectado en el
suero. Las células inmunes se extrajeron del nodo linfático local y
luego se fusionaron con una línea de células de mieloma P3U1,
utilizando polietilenglicol 1500. Los hibridomas se seleccionaron
de acuerdo con el método de Oi et al. (Selective Methods in
Cellular Immunology, W. H. Freeman and Co., San Francisco, 351,
1980) que emplea el medio HAT, y se estableció el hibridoma que
produce el anticuerpo anti-IL-6
humano.
El hibridoma que produce el anticuerpo
anti-IL-6 humano se sometió al
ensayo de unión a IL-6 como se expresa a
continuación. De este modo, una placa de microtitulación de 96
pocillos hecha de polivinilo flexible (fabricado por Dynatech
Laboratories, Inc., Alexandria, VA) se recubrió con 100 \mul de Ig
anti-ratón de cabra (10 \mul/ml, fabricado por
Cooper Biomedical, Inc., Malvern, PA) en 0,1 M de tampón carbonato
de hidrógeno-carbonato, pH 9,6, toda la noche a
4ºC. Después, la placa se trató con PBS que contiene 1% de
seroalbúmina bobina a temperatura ambiente durante 2 horas. Después
del lavado con PBS, se añadió a cada pocillo 100 \mul del
sobrenadante del cultivo de hibridoma, y luego se incubó toda la
noche a 4ºC. La placa se lavó, se añadió a cada pocillo
IL-6 recombinante marcado con ^{125}I a una
concentración de 2000 cpm/0,5 ng/pocillo, y luego la radioactividad
de cada pocillo tras el lavado se determinó mediante un contador
gamma (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA). De
los 216 clones de hibridoma, 32 fueron positivos en el ensayo de
unión a IL-6. De estos clones, se obtuvo finalmente
el MH166.BSF2 estable. El anticuerpo
anti-IL-6 MH166 producido por dicho
hibridoma tiene un subtipo de IgG1 \kappa.
Luego, el clon de hibridoma MH166.BSF2 de ratón
IL-6 dependiente se utilizó para examinar una
actividad neutralizante por MH166 con respecto al crecimiento del
hibridoma. Las células MH166.BSF2 se dividieron en alícuotas a 1 x
10^{4}/200 \mul/pocillo, y a estas se añadieron las muestras que
contienen el anticuerpo MH166, se cultivaron durante 48 horas, se
añadieron 15,1 Ci/mM de timidina-^{3}H (New
England Nuclear, Boston, MA), y el cultivo se continuó durante 6
horas más. Las células se colocaron en un filtro de papel de vidrio
y se sometieron a un recolector automático (Labo Mash Science Co.,
Tokio, Japan). Como control, se utilizó anticuerpo
anti-IL-6 de conejo.
Como resultado, el anticuerpo MH166 inhibió la
incorporación de timidina-^{3}H de las células
MH166.BSF2 inducida por IL-6 de modo que dependía
de la dosis. Esto reveló que el anticuerpo MH166 neutraliza la
actividad de
IL-6.
IL-6.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
3
El anticuerpo anti-receptor de
IL-6 MT18 preparado por el método de Hirata et
al. (J. Immunol., 143, 2900-2906, 1989) se ligó
a Sepharosa 4B activada con CNBr (fabricada por Pharmacia Fine
Chemicals, Piscataway, NJ) y el receptor de IL-6 se
purificó de acuerdo con el régimen adjunto (Science (1998) 241,
825-828). Una línea celular de mieloma humano,
U266, se solubilizó con hypoclorito de fluoruro de
p-para-aminofenil metano sulfonilo
1 mM (fabricado por Wako Chemicals) que contiene 1% de digitonina
(fabricada por Wako Chemicals), trietanolamina 10 mM (pH 7,8) y
NaCl 0,15 M (tampón de digitonina), y se mezcló con el anticuerpo
MT18 unido a perlas de Sepharosa 4B. Luego, las perlas se lavaron
seis veces con el tampón de digitonina para preparar el receptor de
IL-6 parcialmente purificado.
Ratones BALB/c se inmunizaron cuatro veces cada
diez días con el anterior receptor de IL-6
parcialmente purificado obtenido a partir de 3 x 10^{9} células
U266, y luego se preparó un hibridoma utilizando un método estándar.
El sobrenadante del cultivo de hibridoma del pocillo con
crecimiento positivo se ensayó para su actividad de unirse al
receptor de IL-6 de acuerdo con el método descrito a
continuación. 5 x 10^{7} células U266 se marcaron con
metionina-^{35}S (2,5 mCi) y se disolvieron con el tampón de digitonina anterior. Las células U266 disueltas se mezclaron con un volumen de 0,04 ml de anticuerpo MT18 unido a perlas de Sepharosa 4B, y luego se lavaron seis veces con el tampón de digitonina. El receptor de IL-6 marcado con metionina-^{35}S se eluyó con 0,25 ml del tampón de digitonina (pH 3,4) y se neutralizó con 0,025 ml de Tris 1 M (pH 7,4).
metionina-^{35}S (2,5 mCi) y se disolvieron con el tampón de digitonina anterior. Las células U266 disueltas se mezclaron con un volumen de 0,04 ml de anticuerpo MT18 unido a perlas de Sepharosa 4B, y luego se lavaron seis veces con el tampón de digitonina. El receptor de IL-6 marcado con metionina-^{35}S se eluyó con 0,25 ml del tampón de digitonina (pH 3,4) y se neutralizó con 0,025 ml de Tris 1 M (pH 7,4).
Se mezclaron 0,05 ml del sobrenadante del
cultivo de hibridoma con 0,01 ml de Sepharosa Proteína G (fabricado
por Pharmacia). Después del lavado, la Sepharosa se incubó con 0,005
ml de la solución del receptor de IL-6 marcado con
^{35}S preparada como se describe anteriormente. El
inmunoprecipitado se analizó por SDS-PAGE para
averiguar el sobrenadante de cultivo de hibridoma que reacciona con
el receptor de IL-6. Como resultado, se estableció
el clon de hibridoma PM1 con reacción positiva. El anticuerpo
producido a partir del hibridoma PM-1 tiene un
subtipo de IgG\kappa.
La actividad inhibidora de unión a
IL-6 del anticuerpo producido por el hibridoma
PM-1 al receptor de IL-6 humano, se
estudió utilizando la línea de células de mieloma humano U266. Una
IL-6 recombinante humana se preparó a partir de
E. coli (Hirano et al., Immunol. Lett., 17: 41, 1988),
y se marcó con ^{125}I utilizando el reactivo de
Bolton-Hunter (New England Nuclear, Boston, MA)
(Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967). 4 x
10^{5} células U266 se cultivaron con un 70% (v/v) de sobrenadante
de cultivo de hibridoma PM-1 junto con 14.000 cpm
de IL-6 marcada con ^{125}I en presencia de un
exceso de 100 veces de IL-6 no marcada durante una
hora a temperatura ambiente. Setenta \mul de la muestra fueron
depositados sobre 300 \mul de FCS en un tubo de ultracentrífuga
de polietileno de 400 \mul. Después de la centrifugación, se
determinó la radioactividad de la célula.
El resultado reveló que el anticuerpo producido
por el hibridoma PM-1 inhibe la unión de
IL-6 con el receptor de IL-6.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de Referencia
4
Un anticuerpo monoclonal dirigido contra el
receptor de IL-6 de ratón se preparó de acuerdo con
el método descrito en Saito, et al., J. Immunol. (1993) 147,
168-173.
Las células CHO que producen el receptor de
IL-6 soluble de ratón se cultivaron en medio líquido
IMDM que contiene FCS al 10%. A partir del sobrenadante del
cultivo, se purificó el receptor de IL-6 soluble de
ratón utilizando el receptor de IL-6 soluble de
ratón RS12 (ver Saito, et al., arriba) y una columna de
afinidad fijada al gel Affigel 10 (Biorad).
El receptor de IL-6 soluble de
ratón (50 \mug) así obtenido se mezcló con adyuvante completo de
Freund, y luego se inyectó en el abdomen de ratas Wistar (Japan
Charles River). A partir de las 2 semanas los animales se
estimularon con adyuvante incompleto de Freund. En el día 45, las
ratas se sacrificaron, y las células del bazo a unos 2 x 10^{8}
se fusionaron con 1 x 10^{7} células de mieloma de ratón P3U1
utilizando PEG1500 al 50% (Boehringer Mannhein) de acuerdo con el
método convencional, y luego se escrutaron mediante el medio de
cultivo HAT.
Después de que se añadiera el sobrenadante del
cultivo a la placa recubierta con anticuerpo de conejo
anti-IgG de rata (Cappel), se hizo reaccionar con
el receptor de IL-6 soluble de ratón. Después,
utilizando anticuerpo de conejo anti-receptor de
IL-6 de ratón y anti-IgG de conejo
marcado con fosfatasa alcalina de oveja, se escrutaron por ELISA
los hibridomas que producían el anticuerpo dirigido contra el
receptor de IL-6 soluble de ratón. Después de que
se confirmó la producción del anticuerpo, los clones de hibridoma se
escrutaron dos veces más para obtener un solo clon de hibridoma. El
clon se denominó como MR16-1.
La actividad neutralizante del anticuerpo
producido por el hibridoma sobre la transducción de señal de la
IL-6 de ratón se examinó mediante la incorporación
de timidina-^{3}H utilizando células MH60.BSF2
(Matsuda et al., J. Immunol. (1988) 18,
951-956). Las células MH60.BSF2 se prepararon en una
placa de 96 pocillos a 1 x 10^{4} células/200 \mul/pocillo. A
la placa se le añadió IL-6 de ratón y anticuerpo
MR16-1 o anticuerpo RS12 a 12,3 - 1000 ng/ml, y
luego se cultivaron a 37ºC y CO_{2} al 5% durante 44 horas y luego
se añadió 1 \muCi/pocillo de timidina-H^{3}.
Después de 4 horas, se midió la incorporación de
timidina-H^{3}. Como resultado, el anticuerpo
MR16-1 suprimió la incorporación de
timidina-H^{3} a las células MH60.BSF2.
Por tanto, se demostró que el anticuerpo
producido por el hibridoma MR16-1 inhibe la unión de
IL-6 al receptor de IL-6.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la presente invención, se ha
mostrado que el anticuerpo anti-receptor de
IL-6, antagonista de IL-6, es útil
como un agente terapéutico para la esclerosis múltiple.
Instituto de depósito
Nombre: Instituto Nacional de Biociencia y
Tecnología Humana, Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología.
- Dirección: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón.
Microorganismo (1)
- Indicación: Hibridoma MR16-1 de rata-ratón
- Número de depósito: FERM BP-5875
- Fecha de depósito: 13 Marzo 1997
Microorganismo (2)
- Indicación: HB 101-pIBIBSF2R
- Número de depósito: FERM BP-2232
- Fecha de depósito: 9 Enero 1989
Microorganismo (3)
- Indicación: PM-1
- Número de depósito: FERM BP-2998
- Fecha de depósito: 12 Julio 1989
\vskip1.000000\baselineskip
Órgano de depósito
Nombre: Colección Nacional de bacterias
Industriales y Marinas Limitada
- Dirección: 23 St Machar Drive Aberdeen AB2 IRY
Microorganismo (4)
- Indicación: Escherichia coli DH5\alpha-pPM-k3
- Número de depósito: NCIMB 40366
- Fecha de depósito: 12 Febrero 1991
Microorganismo (5)
- Indicación: Escherichia coli DH5\alpha-pPM-h1
- Número de depósito: NCIMB 40362
- Fecha de depósito: 12 Febrero 1991
Claims (9)
1. Utilización de un anticuerpo antagonista
dirigido contra el receptor de la interleuquina-6
(IL-6) para la preparación de un medicamento para
la prevención o el tratamiento de la esclerosis múltiple.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1,
donde el antagonista del receptor de IL-6 es un
anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor de
IL-6.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2,
donde el antagonista del receptor de IL-6 es un
anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor de
IL-6 humano.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 2,
donde el antagonista del receptor de IL-6 es un
anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor de
IL-6 de ratón.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 3,
donde el antagonista del receptor de IL-6 es el
anticuerpo PM-1, que es producido por el hibridoma
identificado por el número de entrada al depósito FERM
BP-2998.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 4,
donde el antagonista del receptor de IL-6 es el
anticuerpo MR16-1, que es producido por el
hibridoma identificado con número de entrada al depósito FERM
BP-5875.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 5,
donde el antagonista del receptor de IL-6 es un
anticuerpo dirigido contra el receptor de IL-6 que
tiene la región constante del anticuerpo humano.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 3,
donde el antagonista del receptor de IL-6 es un
anticuerpo quimérico o humanizado dirigido contra el receptor de
IL-6.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8,
donde el antagonista del receptor de IL-6 es el
anticuerpo humanizado PM-1.
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