ES2549767T3

ES2549767T3 - Uso de anticuerpos de interleuquina-4 y composiciones de los mismos

Info

Publication number: ES2549767T3
Application number: ES10185626.8T
Authority: ES
Inventors: John D Pluenneke; Richard J Armitage; Jose Carlos Escobar; Arvia E Morris
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2001-05-25
Publication date: 2015-11-02
Anticipated expiration: 2021-05-25
Also published as: US8679487B2; WO2001092340A2; ATE551363T1; DE16192152T1; EP1283851A2; CY1118951T1; US9587026B2; US20180171016A1; EP2990420A1; US20090104662A1; MXPA02011682A; CA2409267C; EP1283851B1; PT2990420T; US20140154267A1; AU2001272925A1; US7186809B2; ES2614260T3; DK2990420T3; US20190023798A1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano capaz de inhibir una actividad biológica inducida por IL-4 que compite con un anticuerpo de referencia para la unión a una célula que expresa el receptor de IL-4 (IL-4R) humano, en el que: a) la cadena ligera del anticuerpo de referencia comprende la secuencia de SEQ ID NO:10 y la cadena pesada del anticuerpo de referencia comprende la secuencia de SEQ ID NO:12; o b) la cadena ligera del anticuerpo de referencia comprende la secuencia de SEQ ID NO:14 y la cadena pesada del anticuerpo de referencia comprende la secuencia de SEQ ID NO:16; o c) la cadena ligera del anticuerpo de referencia comprende la secuencia de SEQ ID NO:18 y la cadena pesada del anticuerpo de referencia comprende la secuencia de SEQ ID NO:20; o d) la cadena ligera del anticuerpo de referencia comprende la secuencia de SEQ ID NO:22 y la cadena pesada del anticuerpo de referencia comprende la secuencia de SEQ ID NO:24.

Description

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Uveítis autoinmune

La uveítis implica la inflamación de la úvea (que se considera generalmente que incluye el iris, cuerpo ciliar, y coroide, considerados conjuntamente). La secreción de IL-4 en exceso está implicada como que juega un papel en la patogénesis de esta enfermedad inflamatoria ocular que es una amenaza para la visión. El o los antagonistas de IL-4 pueden administrarse a un paciente con uveítis para reducir la gravedad de la enfermedad. En una realización, el o los antagonistas de IL-4 pueden administrarse a un individuo que tiene uveoretinitis autoinmune.

Enfermedad de Kawasaki

También conocida como el síndrome de ganglios infáticos mucocutáneos, la enfermedad de Kawasaki (KD) afecta principalmente a niños jóvenes. La enfermedad se caracteriza por cambios particulares en las membranas mucosas que recubren los labios y la boca, y por glándulas linfáticas agrandadas y sensibles. Los síntomas incluyen típicamente fiebre, conjuntivitis, inflamación de los labios y las membranas mucosas de la boca, glándulas hinchadas en la nuca y un sarpullido que cubre las manos y los pies, que da lugar a una piel endurecida, hinchada y descamada en las manos y los pies. En los niños con la Enfermedad de Kawasaki (KD), puede desarrollarse la inflamación de las arterias (vasculitis). Debido al efecto de la enfermedad en el sistema vascular, KD es la causa principal informada de enfermedad cardiaca adquirida en los niños.

Los antagonistas de IL-4 pueden administrarse a pacientes con Enfermedad de Kawasaki, para reducir los niveles elevados de IL-4 en el paciente. La secreción excesiva de IL-4 y una deficiencia en citoquinas de tipo TH1 contribuyen a la patogénesis de la enfermedad.

Esófago de Barrett

El esófago de Barrett es una afección caracterizada por la alteración (posterior a la irritación) de las células del tejido epitelial que recubre la parte inferior del esófago. El reflujo frecuente de los contenidos del estómago en el esófago, durante el tiempo, puede dar lugar al esófago de Barrett. Los pacientes con esófago de Barrett presentan riesgo de desarrollar cáncer de esófago (por ejemplo, adenocarcinoma). Aunque no se pretende la vinculación a un mecanismo particular de acción, la administración de un antagonista de IL-4 puede beneficiar a un paciente con esófago de Barrett mediante la supresión de una respuesta inmune de tipo TH2. Un antagonista de IL-4 puede administrarse a un paciente con esofagitis, para inhibir la progresión a esófago de Barrett.

Nefrosis

La nefrosis, también conocida como síndrome nefrótico, es una enfermedad renal que no es inflamatoria y no es maligna. En la afección conocida como nefrosis de cambio mínimo, el daño glomerular (que se cree que surge a partir de cambios estructurales en las células epiteliales viscerales glomerulares) resulta en anormalidades que incluyen proteinuria. Una respuesta inmune de tipo TH2 (especialmente secreción de las citoquinas de tipo TH2 IL-4 e IL-13) está implicada en jugar un papel en la patogénesis de nefrosis de cambio mínimo.

Otras indicaciones

Los ejemplos adicionales de afecciones que pueden tratarse incluyen pero no están limitados a las siguientes. Los antagonistas de IL-4 pueden emplearse para tratar o prevenir el síndrome hiper IgE, síndrome hipereosinófilo idiopático, reacciones alérgicas a la medicación, enfermedades ampollosas autoinmunes (por ejemplo, pénfigo vulgar o pénfigo bulloso), miastenia grave (una enfermedad muscular autoinmune) y síndrome de fatiga crónica. Los inhibidores de IL-4 pueden emplearse para tratar GVHD; los métodos particulares para tratar GVHD en terapia de combinación con otros agentes terapéuticos como se describe más adelante. Los inhibidores de IL-4 también encuentran uso en el tratamiento o prevención de hepatotoxicidad inducida por fármacos tales como diclofenac (un fármaco anti-inflamatorio no esteroideo).

Un antagonista de IL-4 puede emplearse como un adyuvante de tratamiento de inmunoterapia de alergia. Los antagonistas de IL-4 encuentran uso adicional como adyuvantes de vacunas, tales como adyuvantes para vacunas del cáncer y vacunas de enfermedades infecciosas. El uso de antagonistas de IL-4 es especialmente ventajoso cuando el favorecer una respuesta inmune de tipo TH1 sería beneficioso para prevenir o tratar la afección para la que se administra la vacuna. Los antagonistas de IL-4 pueden emplearse cuando se desea reducir una respuesta inmune mediada por anticuerpos y/o estimular una respuesta inmune mediada por células T.

Antagonistas de IL-4

Los antagonistas de IL-4 que pueden emplearse incluyen compuestos que inhiben una actividad biológica de IL-4. Las actividades biológicas inducidas por IL-4 que se van a inhibir por los anticuerpos de la invención, para uso en métodos proporcionados en la presente memoria, son actividades que directamente o indirectamente juegan un papel en la afección que se va a tratar.

Los ejemplos de antagonistas de IL-4 descritos en la presente memoria incluyen, pero no están limitados a, receptores de IL-4 (IL-4R), anticuerpos, otras moléculas de unión a IL-4, y muteínas de IL-4 como se discute

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Los ejemplos de polipéptidos IL-4R humanos solubles incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos que comprenden los residuos de aminoácidos x a y de SEQ ID NO:2, en el que x representa 1 ó -2 e y representa un número entero de 197 a 207. Los ejemplos incluyen polipéptidos que comprenden los residuos 1 a 207 ó -2 a 207 de SEQ ID NO:2.

Una preparación de proteína administrada como un antagonista de IL-4 puede comprender más de una forma de IL4R. Por ejemplo, la preparación puede comprender moléculas de polipéptido que consisten en los aminoácidos 1 a 207 de SEQ ID NO:2, así como polipéptidos que consisten en los aminoácidos -2 a 207 de SEQ ID NO:2.

Los polipéptidos IL-4R que surgen de las construcciones alternativas de ARNm, por ejemplo, que pueden atribuirse a diferentes eventos de corte y empalme de ARNm después de la transcripción, y que rinden traducciones de polipéptidos capaces de unir IL-4, están entre los polipéptidos IL-4R descritos en la presente memoria. Dichos ARNm de corte y empalme alternativos pueden dar lugar a polipéptidos solubles.

Los ejemplos adicionales de receptores de IL-4 que pueden emplearse en los métodos descritos en la presente memoria son variantes que tienen secuencias de aminoácidos que son sustancialmente similares a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 del receptor de interleuquina-4 nativo, o fragmentos de éste. Pueden emplearse los polipéptidos de receptor de IL-4 variantes que son capaces de funcionar como antagonistas de IL-4 en los métodos descritos en la presente memoria.

Pueden emplearse cualquiera de las diferentes técnicas de ensayo convencionales para confirmar que una forma dada de IL-4R (por ejemplo, un fragmento o variante de IL-4R) funciona como un antagonista de IL-4. Los ejemplos incluyen ensayos de unión o ensayos que ensayan la capacidad de un polipéptido IL-4R dado para inhibir la transducción de una señal biológica inducida por IL-4. Los ejemplos de ensayos in vitro adecuados se describen más adelante.

Los receptores de IL-4 "sustancialmente similares" incluyen aquellos que tienen secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico que varían de una secuencia nativa por una o más sustituciones, deleciones o adiciones, pero que retienen una actividad biológica deseada de la proteína IL-4R. Los ejemplos de moléculas de ácido nucleico que codifican receptores de IL-4 incluyen, pero no están limitadas a: (a) ADN obtenido de la región codificadora de un gen IL-4R de mamífero nativo; (b) ADN que es capaz de hibridar con un ADN de (a) bajo condiciones de astringencia moderadas y que codifica un IL-4R que tiene una actividad biológica de un IL-4R nativo; o (c) ADN que está degenerado como resultado del código genético a un ADN definido en (a) o (b) y que codifica un IL-4R que tiene una actividad biológica de un IL-4R nativo. Debido a la degeneración del código, existe una variación considerable en las secuencias de nucleótidos que codifican la misma secuencia de aminoácidos.

Las variantes pueden ocurrir naturalmente, tal como variantes alélicas o aquellas que surgen del corte y empalme alternativo del ARNm. Alternativamente, las variantes pueden prepararse por técnicas muy conocidas tal como mutagénesis in vitro.

Una secuencia variante identificada por Idzerda et al., supra, comprende un codón GTC que codifica el aminoácido valina (Val) en la posición 50, en lugar de isoleucina (Ile). La secuencia variante es idéntica por otra parte a la secuencia de SEQ ID NOS:1 y 2. En la presente memoria se proporcionan fragmentos de IL-4R, tal como fragmentos solubles, que comprenden Val en la posición 50.

En ejemplos particulares, una secuencia de ADN o de aminoácidos del receptor de IL-4 es al menos 80 por ciento idéntica a la secuencia de un IL-4R nativo. Preferiblemente, un ADN o polipéptido IL-4R comprende una secuencia que es al menos 90 por ciento idéntica a un ADN o secuencia de aminoácidos de IL-4R nativo. Un ejemplo es un IL4R humano que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 por ciento idéntica a la secuencia presentada en SEQ ID NO:2. Otro ejemplo es un IL-4R soluble que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80 por ciento idéntica a la secuencia del dominio extracelular de IL-4R humano. Los ejemplos adicionales son polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos 90 por ciento idénticas a la secuencia presentada en SEQ ID NO:2 o un fragmento de éstos. En un ejemplo particular, el polipéptido comprende no más de 10 sustituciones de aminoácidos. Los polipéptidos IL-4R que retienen la capacidad de unir IL-4 pueden identificarse en ensayos de unión convencionales.

El porcentaje de similitud o porcentaje de identidad puede determinarse, por ejemplo, comparando la información de la secuencia de ADN o aminoácidos usando el programa informático GAP, versión 6.0, disponible en la Universidad de Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineamiento de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981). Brevemente, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) para nucleótidos y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, como se describe por Schwartz y Dayhoff, ed., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, p. 353-358, 1979; (2) una

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Otros ejemplos de heterodímeros comprenden una subunidad de IL-4R (preferiblemente un fragmento soluble de la proteína de SEQ ID NO:2) y al menos una subunidad del receptor de IL-13. El receptor de IL-13 (IL-13R) forma un complejo y los polipéptidos IL-13R (tales como los polipéptidos designados IL-13R1 e IL-13R2) se describen en Zurawski et al., J. Biol. Chem. 270 (23), 13869, 1995; de Vries, J. Allergy Clin. Immunol. 102(2): 165, agosto 1998; Callard et al. Immunology Today, 17(3): 108, marzo 1996 y Patente U.S. 5.710.023. En un ejemplo, un heterodímero comprende un IL-4R humano soluble y un IL-13R soluble (preferiblemente una forma soluble del polipéptido descrito en la Patente U.S. 5.710.023 o IL-13R1). Los componentes de los heterodímeros pueden ser cualquier forma adecuada de los polipéptidos que retiene la actividad deseada, tal como fragmentos, variantes o proteínas de fusión (por ejemplo, fusiones de los polipéptidos de receptor solubles con polipéptidos Fc, péptidos de cremallera de leucina, conectores peptídicos o etiquetas de epítopo).

Los polipéptidos del receptor de IL-4 y las proteínas de fusión descritas en la presente memoria pueden prepararse por cualquiera de varias técnicas convencionales. Los polipéptidos IL-4R pueden purificarse de las células que expresan naturalmente el receptor (tal como las células discutidas en Park et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1669-673, 1987) o pueden producirse en sistemas de expresión recombinantes, usando técnicas muy conocidas. Los sistemas de expresión para usarse en la producción de IL-4R incluyen los descritos en la Patente U.S.

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Se conocen varios sistemas de expresión para usarse en la producción de proteínas recombinantes. En general, las células huésped se transforman con un vector de expresión recombinante que comprende ADN que codifica un polipéptido IL-4R deseado. Entre las células huésped que pueden emplearse están células procariotas, de levadura o eucariotas superiores. Los procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo E. coli o bacilos. Las células eucariotas superiores incluyen células de insecto y líneas celulares establecidas de origen mamífero. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), células L, células 293, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, líneas celulares BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular CVI/EBNA obtenida de la línea celular de riñón de mono verde africano CVI (ATCC CCL 70) como describen McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991). Los vectores de clonación y expresión apropiados para usarse con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero se describen por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985).

Las células transformadas se cultivan bajo condiciones que estimulan la expresión de IL-4R y el polipéptido se recupera por procedimientos de purificación de proteínas convencionales. Uno de dichos procedimientos de purificación incluye el uso de cromatografía de afinidad, por ejemplo, en una matriz que tiene IL-4 unida a ella. El IL4R expresado se depositará en la membrana celular o se secretará en el sobrenadante del cultivo, dependiendo del ADN de IL-4R seleccionado. Los polipéptidos que se contemplan para usarse en la presente memoria incluyen polipéptidos IL-4R de mamífero recombinantes sustancialmente homogéneos sustancialmente sin materiales endógenos contaminantes.

Anticuerpos

Los anticuerpos que funcionan como antagonistas de IL-4 pueden emplearse para uso en los métodos de la presente invención. Los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Los más preferidos son anticuerpos monoclonales humanos preparados usando ratones transgénicos, como se describe más adelante. Los anticuerpos humanos también pueden prepararse usando técnicas de exposición en fago.

Los ejemplos de anticuerpos adecuados son aquellos que interfieren con la unión de IL-4 a un receptor de IL-4. Dichos anticuerpos, referidos en la presente memoria como anticuerpos bloqueantes, pueden producirse frente a IL4R y cribarse en ensayos convencionales para la capacidad de interferir con la unión de IL-4 a los receptores de IL

4. Los ejemplos de ensayos adecuados son ensayos que ensayan los anticuerpos para la capacidad de inhibir la unión de IL-4 a células que expresan IL-4R o que ensayan los anticuerpos para la capacidad de reducir una respuesta biológica o celular que resulta de la unión de IL-4 a los receptores de IL-4 de la superficie celular.

Se ha indicado que IL-4R es un componente de determinados complejos del receptor de IL-13 con múltiples subunidades (Zurawski et al., J. Biol. Chem. 270 (23), 13869, 1995; de Vries, J. Allergy Clin Immunol. 102(2): 165, agosto 1998; y Callard et al. Immunol Today, 17(3): 108, marzo 1996). Así, algunos anticuerpos producidos frente a IL-4R pueden interferir con la unión de IL-13 a dichos complejos de receptor.

En una realización, los anticuerpos dirigidos frente a IL-4R bloquean la unión de IL-4 y también IL-13 a células. Los anticuerpos inhiben la actividad biológica inducida por IL-4 y también inhiben la actividad inducida por IL-13 y así pueden emplearse para tratar afecciones inducidas por una o las dos citoquinas. Los ejemplos de dichas afecciones incluyen pero no están limitadas a, afecciones mediadas por IgE, asma, afecciones alérgicas, rinitis alérgica, y dermatitis incluyendo dermatitis atópica.

Los anticuerpos que se unen a IL-4R e inhiben la unión de IL-4 pueden cribarse en varios ensayos convencionales para identificar aquellos anticuerpos que también interfieren con la unión de IL-13 a dichos complejos de receptor. Los anticuerpos pueden cribarse en ensayos de unión o ensayarse para la capacidad de inhibir una actividad

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La presente invención proporciona anticuerpos humanos que se unen a IL-4R. En una realización de la invención, los anticuerpos humanos producidos frente a IL-4R y producidos por técnicas que implican el uso de ratones transgénicos, bloquean la unión de IL-4 y también de IL-13 a las células. Dichos anticuerpos son antagonistas de IL4 y funcionan adicionalmente como antagonistas de IL-13.

Entre los usos de los anticuerpos dirigidos frente a un IL-4R está el uso en ensayos para detectar la presencia de polipéptidos IL-4R, bien in vitro o in vivo. Los anticuerpos también pueden emplearse para purificar proteínas IL-4R por cromatografía de inmunoafinidad. Aquellos anticuerpos que peden además bloquear la unión de IL-4 a IL-4R pueden usarse para inhibir una actividad biológica que resulta de dicha unión. Los anticuerpos bloqueantes encuentran uso en los métodos de la presente invención. Dichos anticuerpos que funcionan como antagonistas de IL-4 pueden emplearse para tratar cualquier afección inducida por IL-4, incluyendo pero no limitadas a asma y alergias, por ejemplo, rinitis alérgica, dermatitis de contacto y dermatitis atópica. En una realización, un anticuerpo monoclonal anti-IL-4R humano generado por procedimientos que implican la inmunización de ratones transgénicos se emplea para tratar dichas afecciones.

Los anticuerpos pueden emplearse en un procedimiento in vitro, o administrarse in vivo para inhibir una actividad biológica inducida por IL-4. Los trastornos causados o exacerbados (directamente o indirectamente) por la interacción de IL-4 con receptores de IL-4 de la superficie celular pueden por lo tanto tratarse. Un método terapéutico implica la administración in vivo de un anticuerpo bloqueante a un mamífero en una cantidad eficaz para reducir una actividad biológica inducida por IL-4.

Los anticuerpos de la invención incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos monoclonales completamente humanos que inhiben una actividad biológica de IL-4 y también inhiben una actividad biológica de IL-13. Una realización está dirigida a un anticuerpo monoclonal humano que bloquea al menos parcialmente la unión de IL-4 a una célula, y que bloquea al menos parcialmente la unión de IL-13 a una célula.

Los anticuerpos de la presente invención incluyen pero no están limitados a anticuerpos generados mediante la inmunización de un ratón transgénico con un inmunógeno que es un receptor de IL-4, en el que el ratón transgénico se selecciona de las cepas de ratones descritas en el ejemplo 3 más adelante. Los anticuerpos deseados son humanos. En una realización, el inmunógeno es un polipéptido de receptor de IL-4 humano. Las líneas celulares de hibridoma obtenidas del los ratones así inmunizados, en las que el hibridoma secreta un anticuerpo monoclonal que se une a IL-4R, también se proporcionan en la presente memoria. Los ejemplos de anticuerpos producidos mediante la inmunización de dichos ratones transgénicos son los anticuerpos monoclonales humanos designados 6-2 (descrito en el ejemplo 6), 12B5 (descrito en el ejemplo 8); y Mab 63, 1B7, 5A1 y 27A1 (todos descritos en el ejemplo 9). Los anticuerpos monoclonales 6-2, 12B5, 63, 1B7, 5A1 y 27A1 son anticuerpos completamente humanos y son capaces de inhibir la actividad de IL-4 y de IL-13. Los Mab 12B5, 63 y 1B7 son antagonistas preferidos de IL-4 humana y IL-13 humana.

Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo dado pueden identificarse usando el sistema descrito por Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, Publicación NIH no. 91-3242, 1991). Los ejemplos particulares de anticuerpos comprenden, en la región variable de su cadena ligera, al menos una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), o regiones hipervariables, encontradas en la cadena ligera de 6-2. Las CDR de 6-2 se discuten en el ejemplo 6. Así, entre los anticuerpos proporcionados en la presente memoria, están aquellos que comprenden de una a las tres de las secuencias siguientes en la región variable de la cadena ligera: residuos de aminoácidos 24-35 de SEQ D NO:6; residuos 51-57 de SEQ ID NO:6; y residuos 90-97 de SEQ ID NO:6. Los anticuerpos particulares proporcionados en la presente memoria comprenden, en la región variable de su cadena pesada, al menos una de las CDR encontradas en la cadena pesada de 6-2. Así entre los anticuerpos proporcionados en la presente memoria, están aquellos que comprenden de una a las tres de las secuencias siguientes en la región variable de la cadena pesada: residuos 31-35; residuos 50-66; y residuos 99-107 de SEQ ID NO:8.

Los anticuerpos monoclonales particulares de la invención pueden seleccionarse del grupo que consiste en un Mab que reacciona de manera cruzada con 12B5; un Mab que se une al mismo epítopo que 12B5; un Mab que compite con 12B5 para la unión a una célula que expresa IL-4R humano; y un Mab que posee una actividad biológica de 12B5. El anticuerpo puede tener una afinidad de unión para IL-4R humano que es sustancialmente equivalente a la afinidad de unión de 12B5 para IL-4R humano. Mab 12B5 es un anticuerpo IgG1. Los Mab de otros isotipos, obtenidos de 12B5, también están englobados por la presente invención. En realizaciones particulares, el isotipo del MAb es IgG1, IgG4 o IgM. La presente invención también proporciona líneas celulares de hibridoma que producen cualquiera de dichos anticuerpos monoclonales.

Un ejemplo de una actividad biológica de 12B5 es la capacidad de funcionar como un antagonista de IL-4 y como un antagonista de IL-13. En un ejemplo, un MAb de la invención posee actividad bloqueante de IL-4 sustancialmente equivalente a la de 12B5; y posee una actividad bloqueante de IL-13 sustancialmente equivalente a la de 12B5. Dicha actividad puede medirse en cualquier ensayo convencional adecuado (por ejemplo, como se mide en el ensayo de expresión de CD23 descrito en el ejemplo 5).

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En la presente memoria se proporcionan anticuerpos monoclonales IgG4 obtenidos de 12B5. Otro ejemplo está dirigido a anticuerpos monoclonales IgM obtenidos de 12B5. Los procedimientos para cambiar (alterar) la subclase o isotipo de un anticuerpo se conocen en el campo pertinente. Dichos procedimientos pueden implicar, por ejemplo, tecnología de ADN recombinante, mediante la cual el ADN que codifica las cadenas de polipéptido del anticuerpo que confieren la subclase deseada se sustituye por ADN que codifica la cadena de polipéptido correspondiente del anticuerpo parental.

La secuencia de ADN de la región variable de la cadena ligera de MAb 12B5 se presenta en SEQ ID NO:9 y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en SEQ ID NO:10. La secuencia de ADN para la región variable de la cadena pesada de MAb 12B5 se presenta en SEQ ID NO:11 y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en SEQ ID NO:12. Los anticuerpos de la presente invención pueden incluir anticuerpos monoclonales que comprenden, en su cadena ligera, los residuos 1 a 109 de SEQ NO:10; y anticuerpos que comprenden adicionalmente o alternativamente, en su cadena pesada, los residuos 1 a 115 de SEQ ID NO:12.

Los ejemplos particulares de anticuerpos de la presente invención pueden comprender, en la región variable de su cadena ligera, al menos una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), o regiones hipervariables, encontradas en la cadena ligera de 12B5. Las CDR de 12B5 se discuten en el ejemplo 8. Así, entre los anticuerpos descritos en la presente memoria, están aquellos que comprenden de una a las tres secuencias siguientes en la región variable de la cadena ligera: residuos de aminoácidos 24-35 de SEQ D NO:10; residuos 5157 de SEQ ID NO:10; y residuos 90-99 de SEQ ID NO:10. Los anticuerpos particulares descritos en la presente memoria comprenden, en la región variable de su cadena pesada, al menos una de las CDR encontradas en la cadena pesada de 12B5. Así entre los anticuerpos descritos en la presente memoria, están aquellos que comprenden de una a las tres secuencias siguientes en la región variable de la cadena pesada: residuos 31-35; residuos 50-65; y residuos 98-104 de SEQ ID NO:12.

Los anticuerpos monoclonales particulares de la invención pueden seleccionarse del grupo que consiste en Mab 27A1; un Mab que reacciona de manera cruzada con 27A1; un Mab que se une al mismo epítopo que 27A1; un Mab que compite con 27A1 para la unión a una célula que expresa IL-4R humano; y un Mab que posee una actividad biológica de 27A1. El anticuerpo puede tener una afinidad de unión para IL-4R humano que es sustancialmente equivalente a la afinidad de unión de 27A1 para IL-4R humano. 27A1 es un anticuerpo IgG1. Los Mab de otros isotipos, obtenidos de 27A1, también están englobados por la presente invención. La presente invención también proporciona líneas celulares de hibridoma que producen cualquiera de dichos anticuerpos monoclonales.

Un ejemplo de una actividad biológica de 27A1 es la capacidad de funcionar como un antagonista de IL-4 y como un antagonista de IL-13. En un ejemplo, un MAb de la invención posee actividad bloqueante de IL-4 sustancialmente equivalente a la de 27A1; y posee una actividad bloqueante de IL-13 sustancialmente equivalente a la de 27A1. Dicha actividad puede medirse en cualquier ensayo convencional adecuado (por ejemplo, como se mide en el ensayo de expresión de CD23 descrito en el ejemplo 5).

La secuencia de ADN de la región variable de la cadena ligera de de MAb 27A1 se presenta en SEQ ID NO:13 y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en SEQ ID NO:14. La secuencia de ADN para la región variable de la cadena pesada de MAb 27A1 se presenta como SEQ ID NO:15 y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en SEQ ID NO:16. Los anticuerpos de la presente invención pueden incluir anticuerpos monoclonales que comprenden, en su cadena ligera, los residuos 1 a 109 de SEQ NO:14; y anticuerpos que comprenden adicionalmente o alternativamente, en su cadena pesada, los residuos 1 a 116 de SEQ ID NO:16.

Los ejemplos particulares de anticuerpos de la presente invención pueden comprender, en la región variable de su cadena ligera, al menos una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), o regiones hipervariables, encontradas en la cadena ligera de 27A1. Las CDR de 27A1 se discuten en el ejemplo 9. Así, entre los anticuerpos descritos en la presente memoria, están aquellos que comprenden de una a las tres secuencias siguientes en la región variable de la cadena ligera: residuos de aminoácidos 24-35 de SEQ D NO:14; residuos 5157 de SEQ ID NO:14; y residuos 90-99 de SEQ ID NO:14. Los anticuerpos particulares descritos en la presente memoria comprenden, en la región variable de su cadena pesada, al menos una de las CDR encontradas en la cadena pesada de 27A1. Así entre los anticuerpos descritos en la presente memoria, están aquellos que comprenden de una a las tres secuencias siguientes en la región variable de la cadena pesada: residuos 31-35; residuos 50-66; y residuos 99-105 de SEQ ID NO:16.

Los anticuerpos monoclonales particulares de la invención pueden seleccionarse del grupo que consiste en Mab 5A1; un Mab que reacciona de manera cruzada con 5A1; un Mab que se une al mismo epítopo que 5A1; un Mab que compite con 5A1 para la unión a una célula que expresa IL-4R humano; y un Mab que posee una actividad biológica de 5A1. El anticuerpo puede tener una afinidad de unión para IL-4R humano que es sustancialmente equivalente a la afinidad de unión de 5A1 para IL-4R humano. 5A1 es un anticuerpo IgG1. Los Mab de otros isotipos, obtenidos de 5A1, también están englobados por la presente invención. La presente invención también proporciona líneas celulares de hibridoma que producen cualquiera de dichos anticuerpos monoclonales.

Un ejemplo de una actividad biológica de 5A1 es la capacidad de funcionar como un antagonista de IL-4 y como un antagonista de IL-13. En un ejemplo, un MAb de la invención posee actividad bloqueante de IL-4 sustancialmente

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Como puede verse en las Figuras 4 y 5, varios residuos están altamente conservados, respecto a que el residuo aparece en una posición correspondiente en los seis anticuerpos. Los anticuerpos particulares de la invención pueden comprender, en la región variable de su cadena ligera, residuos de aminoácidos que se encuentran en la posición correspondiente en al menos tres de las secuencias de la Figura 4. En determinados ejemplos, los anticuerpos comprenden residuos encontrados en una posición correspondiente en al menos cuatro, o al menos cinco, o al menos seis, de las secuencias de la Figura 4. Los anticuerpos particulares de la invención pueden comprender, en la región variable de su cadena pesada, residuos de aminoácidos que se encuentran en la posición correspondiente en al menos tres de las secuencias de la Figura 5. En determinados ejemplos, los anticuerpos comprenden residuos encontrados en una posición correspondiente en al menos cuatro, o al menos cinco, o al menos seis, de las secuencias de la Figura 5.

Los derivados de los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a IL-4R pueden prepararse, y cribarse para propiedades deseadas, por cualquiera de varias técnicas conocidas. Algunas de las técnicas implican el aislamiento del ADN que codifica una cadena de polipéptido (o parte de ésta) de un MAb de interés, y manipular el ADN mediante tecnología de ADN recombinante. El ADN puede fusionarse con otro ADN de interés, o alterarse (por ejemplo, por mutagénesis u otras técnicas convencionales) para añadir, delecionar o sustituir uno o más residuos de aminoácidos, por ejemplo.

El ADN que codifica polipéptidos de anticuerpo (por ejemplo, cadena pesada o ligera, región variable sólo o longitud completa) puede aislarse de células B de ratones que han sido inmunizados con IL-4R. El ADN puede aislarse por procedimientos convencionales tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La exposición en fagos es otro ejemplo de una técnica conocida mediante la cual pueden prepararse los derivados de anticuerpos. En una estrategia, los polipéptidos que son componentes de un anticuerpo de interés se expresan en cualquier sistema de expresión recombinante adecuado y se permite que los polipéptidos expresados se ensamblen para formar moléculas de anticuerpo.

Los anticuerpos de cadena única pueden formarse uniendo fragmentos de la región variable de la cadena pesada y ligera (región Fv) mediante un puente de aminoácidos (conector peptídico corto), lo que resulta en una única cadena de polipéptido. Dichos Fv de cadena única (scFv) se han preparado fusionando ADN que codifica un conector peptídico entre ADN que codifican los dos polipéptidos de la región variable (VL y VH). Los fragmentos de anticuerpo resultantes pueden formar dímeros o trímeros, dependiendo de la longitud de un conector flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al., Protein Engineering 10: 423, 1997). Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos de cadena única incluyen las descritas en la Patente U.S. 4.946.778; Bird (Science 242: 423, 1988); Huston et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879, 1988); y Ward et al. (Nature 334: 544, 1989). Los anticuerpos de cadena única obtenidos de anticuerpos proporcionados en la presente memoria (incluyendo pero no limitados a scFv obtenidos de los MAb 6-2, 12B5, 63, 1B7, 5A1 y 27A1) pueden estar englobados por la presente invención.

Se conocen técnicas para obtener un anticuerpo de una subclase o isotipo diferente de un anticuerpo de interés, es decir, cambio de subclase. Así, los anticuerpos monoclonales IgG1 o IgG4 pueden obtenerse de un anticuerpo monoclonal IgM, por ejemplo, y viceversa. Dichas técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que poseen las propiedades de unión a antígeno de un anticuerpo dado (el anticuerpo parental), pero también presentan propiedades biológicas asociadas con un isotipo o subclase de anticuerpo diferente de la del anticuerpo parental. Pueden emplearse técnicas de ADN recombinante. El ADN clonado que codifica polipéptidos de anticuerpo particulares puede emplearse en dichos procedimientos, por ejemplo, ADN que codifica la región constante de un anticuerpo del isotipo deseado.

En ejemplos particulares, los anticuerpos producidos frente a IL-4R tienen una afinidad de unión (Ka) para IL-4R de al menos 1 x 108. En otras realizaciones, los anticuerpos presentan una Ka de al menos 1 x 109 o al menos 1 x 1010.

También se contemplan derivados PEGilados de anticuerpos (modificados con polietilen glicol) y pueden prepararse por técnicas convencionales. En la presente memoria también se describen conjugados que comprenden un agente detectable (por ejemplo, de diagnóstico) o terapéutico, unido a un anticuerpo dirigido frente a IL-4R. Los ejemplos de dichos agentes son muy conocidos, e incluyen pero no están limitados a radionúclidos de diagnóstico, radionúclidos terapéuticos y fármacos citotóxicos. Los conjugados encuentran uso en procedimientos in vitro o in vivo.

Los ejemplos particulares de la invención están dirigidos a nuevas moléculas de ácido nucleico y polipéptidos. La información sobre la secuencia de ADN y aminoácidos se ha determinado para polipéptidos que son componentes de determinados anticuerpos de la presente invención, como de discute en los ejemplos 6, 8 y 9 más adelante. Entre los ácidos nucleicos está ADN aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:25. Entre los polipéptidos está un polipéptido purificado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:26. Para el uso in vivo, los polipéptidos están ventajosamente purificados. Un polipéptido puede purificarse individualmente o en la forma de un anticuerpo purificado del que el polipéptido es un componente.

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terapéuticos útiles. Se describe un método que comprende administrar a un paciente un antagonista de IL-4 en una cantidad y durante un tiempo suficiente para inducir una mejora sostenida sobre la línea base de un indicador que refleja la gravedad del trastorno particular.

Los anticuerpos que inhiben la unión tanto de IL-4 como de IL-13 a las células se discuten en la presente memoria. Un método para suprimir las actividades inducidas por IL-4 e inducidas por IL-13 en los seres humanos comprende administrar una cantidad eficaz de dicho anticuerpo. Así, pueden tratarse las afecciones inducidas por IL-4 o por IL13, o por ambas citoquinas.

Como se entiende en el campo pertinente, los antagonistas se administran a un paciente de una manera apropiada a la indicación. Los antagonistas pueden administrarse por cualquier técnica adecuada, incluyendo pero no limitada a, vía parenteral, tópica o por inhalación. Si se inyecta, el antagonista puede administrarse, por ejemplo, mediante rutas intra-articular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal o subcutánea, por inyección en bolo, o infusión continua. Se contempla la administración localizada, por ejemplo, en un sitio de la enfermedad o lesión, como también la administración transdérmica y liberación sostenida desde implantes. La administración por inhalación incluye, por ejemplo, la inhalación nasal u oral, el uso de un nebulizador, inhalación del antagonista en forma de aerosol, y semejantes. Otras alternativas incluyen gotas oculares; preparaciones orales incluyendo comprimidos, jarabes, pastillas o chicle; y preparaciones tópicas tales como lociones, geles, pulverizadores y pomadas.

Se contempla el uso de antagonistas de IL-4 en procedimientos ex vivo. Por ejemplo, la sangre de un paciente (fluido corporal que contiene IL-4) puede ponerse en contacto con un antagonista que se une a IL-4 ex vivo, reduciendo de esta manera la cantidad de IL-4 en el fluido cuando se devuelve al paciente. El antagonista puede unirse a una matriz insoluble adecuada o material de soporte sólido.

Ventajosamente, los antagonistas se administran en la forma de una composición que comprende al menos un antagonista de IL-4 según la invención y uno o más componentes adicionales tales como un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. La presente invención proporciona dichas composiciones que comprenden una cantidad efectiva de un antagonista de IL-4, para usarse en los métodos proporcionados en la presente memoria.

Las composiciones contienen antagonista(s) en cualquiera de las formas descritas en la presente memoria. El antagonista puede ser un anticuerpo completo o un derivado modificado por ingeniería de éste, por ejemplo.

Las composiciones pueden comprender, por ejemplo, un antagonista junto con un tampón, antioxidante tal como ácido ascórbico, polipéptido de bajo peso molecular (tal como los que tienen menos de 10 aminoácidos), proteína, aminoácido, carbohidrato tal como glucosa, sacarosa, o dextrinas, agentes quelantes tal como EDTA, glutatión, y otros estabilizadores y excipientes. La disolución salina tamponada neutra o disolución salina mezclada con albúmina de suero específica son ejemplos de diluyentes apropiados. Según estándares industriales apropiados, también pueden añadirse conservantes tales como alcohol bencílico. La composición puede formularse como un liofilizado usando las disoluciones de excipiente apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. Los componentes adecuados no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas. Los ejemplos adicionales de componentes que pueden emplearse en las formulaciones farmacéuticas se presentan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980.

Los kits para usarse por médicos incluyen un antagonista de IL-4 y una etiqueta u otras instrucciones para usarse para tratar cualquiera de las afecciones discutidas en la presente memoria. El kit incluye preferiblemente una preparación estéril de uno o más antagonistas de IL-4, que puede estar en la forma de una composición como se ha descrito anteriormente, y puede estar en uno o más viales.

Las dosificaciones y la frecuencia de administración pueden variar según factores tales como la ruta de administración, el antagonista particular empleado, la naturaleza y gravedad de la enfermedad que se va a tratar, si la afección es aguda o crónica y el tamaño y condición general del paciente. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse por procedimientos conocidos en la técnica pertinente, por ejemplo, en ensayos clínicos que pueden implicar estudios con escalada de la dosis.

Un antagonista puede administrarse una vez o repetidamente. En ejemplos particulares, el antagonista se administra durante un periodo de tiempo de al menos un mes o más, por ejemplo, durante uno, dos o tres meses o incluso indefinidamente. Para tratar afecciones crónicas, el tratamiento a largo plazo es generalmente el más eficaz. Sin embargo, para tratar afecciones agudas, la administración durante periodos más cortos, por ejemplo, de una a seis semanas, puede ser suficiente. En general, el antagonista se administra hasta que el paciente manifiesta un grado médicamente relevante de mejora sobre la línea base para el indicador o indicadores elegidos.

Los ejemplos particulares de la presente invención implican administrar un antagonista a una dosificación de aproximadamente 1 ng/kg/día hasta aproximadamente 10 mg/kg/día, más preferiblemente de aproximadamente 500 ng/kg/día hasta aproximadamente 5 mg/kg/día y lo más preferiblemente de aproximadamente 5 ug/kg/día hasta aproximadamente 2 mg/kg/día, a un paciente. En ejemplos adicionales, un antagonista se administra a adultos una vez a la semana, dos veces a la semana o tres o más veces a la semana, para tratar los trastornos médicos descritos en la presente memoria. Si se inyecta, la cantidad eficaz del antagonista por dosis en adultos puede variar

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de 1-20 mg/m2 y preferiblemente es aproximadamente 5-12 mg/m2. Alternativamente, puede administrarse una dosis plana; la cantidad puede variar de 5-100 mg/dosis. Un intervalo para una dosis plana es aproximadamente 20-30 mg por dosis. En un ejemplo de la invención, una dosis plana de 25 mg/dosis se administra repetidamente por inyección. Si se usa una ruta de administración diferente a la inyección, la dosis se ajusta apropiadamente según las prácticas médicas estándar. Un ejemplo de un régimen terapéutico implica inyectar una dosis de aproximadamente 20-30 mg de un antagonista una a tres veces a la semana durante un periodo de al menos tres semanas, aunque el tratamiento durante periodos más largos puede ser necesario para inducir el grado deseado de mejora. Para los pacientes pediátricos (edad 4-17), un régimen adecuado implica la inyección subcutánea de 0,4 mg/kg, hasta una dosis máxima de 25 mg de IL-4R, administrado dos o tres veces a la semana.

Los métodos descritos en la presente memoria implican la inyección subcutánea de 0,5 mg a 10 mg, preferiblemente de 3 a 5 mg, de un IL-4R soluble, una o dos veces a la semana. Otro ejemplo está dirigido a la administración pulmonar (por ejemplo, por nebulizador) de 3 o más mg de un IL-4R soluble una vez a la semana.

Los ejemplos de regímenes terapéuticos descritos en la presente memoria comprenden la inyección subcutánea de un IL-4R humano soluble una vez a la semana, a una dosis de 1,5 a 3 mg, para tratar sarcoidosis pulmonar, nefrosis de cambio mínimo, uveitis autoinmune, crisis de células falciformes, síndrome de Chrug-Strauss, síndrome de Sjogren, síndrome linfoproliferativo autoinmune, pre-eclampsia, anemia hemolítica autoinmune, esófago de Barrett, Enfermedad de Grave, Enfermedad de Kawasaki y tuberculosis cavitaria. La administración semanal de IL-4R se continúa hasta que los síntomas remiten. El tratamiento puede reiniciarse según se necesite o, alternativamente, pueden administrarse dosis de mantenimiento.

Un antagonista se administra al paciente en una cantidad y durante un tiempo suficiente para inducir una mejora preferiblemente una mejora sostenida, en al menos un indicador que refleja la gravedad del trastorno que se está tratando. Varios indicadores que reflejan la magnitud de la enfermedad del paciente pueden evaluarse para determinar si la cantidad y tiempo del tratamiento es suficiente. Dichos indicadores incluyen, por ejemplo, indicadores clínicamente reconocidos de la gravedad de la enfermedad, síntomas o manifestaciones del trastorno en cuestión. En la mayor parte de los casos, una mejora se considera que es sostenida si el paciente presenta la mejora en al menos dos ocasiones separadas por dos a cuatro semanas. El grado de mejora se determina generalmente por el médico del paciente, que puede hacer esta determinación tomando como base signos o síntomas y que también puede emplear cuestionarios que se administran al paciente, tales como cuestionarios sobre la calidad de vida desarrollados para una enfermedad dada.

Como un ejemplo, para tratar la hiperplasia benigna de la próstata, un inhibidor de IL-4 se administra al paciente en una cantidad y durante un tiempo eficaz en la regresión de la cicatriz o cicatrización completa. Las dosis de mantenimiento pueden proporcionarse o reiniciarse el tratamiento según se necesite.

Los niveles elevados de IL-4 están asociados con varios trastornos, como se ha discutido anteriormente. Los pacientes con un trastorno dado pueden cribarse, para identificar aquellos individuos que tienen niveles elevados de IL-4 o para identificar aquellos con una respuesta inmune de tipo TH2 elevada, identificando de esta manera a los pacientes que pueden beneficiarse más del tratamiento con un antagonista de IL-4. Así, los métodos de tratamiento proporcionados en la presente memoria comprenden opcionalmente una primera etapa de medir el nivel de IL-4 de un paciente. Un antagonista de IL-4 puede administrarse a un paciente en el que los niveles de IL-4 están elevados por encima de lo normal. Alternativamente o adicionalmente, un paciente puede pre-cribarse para determinar si el paciente tiene una respuesta inmune de tipo TH2 elevada, antes de la administración del antagonista(s) frente a una

o más citoquinas de tipo TH2.

Los niveles de IL-4 de un paciente (y, opcionalmente, de otras citoquinas de tipo TH2) pueden monitorizarse durante y/o después del tratamiento con un antagonista de IL-4, para detectar la reducción en los niveles de las citoquinas. Para algunos trastornos, la incidencia de niveles elevados de IL-4 y el equilibrio entre las respuestas inmunes de tipo TH1 y tipo TH2, puede variar según factores tales como el estadio de la enfermedad o la forma particular de la enfermedad. Pueden emplearse técnicas conocidas para medir los niveles de IL-4, por ejemplo, en el suero de un paciente y para evaluar las respuestas inmunes de tipo TH2. Los niveles de citoquinas en muestras de sangre pueden medirse por ELISA, por ejemplo.

Los ejemplos particulares descritos en la presente memoria implican el uso de dos o más antagonistas de IL-4 diferentes. En ejemplos adicionales, el antagonista(s) de IL-4 se administran solos o en combinación con otros agentes útiles para tratar la afección que padece el paciente. Los ejemplos de dichos agentes incluyen tanto fármacos proteínicos como no proteínicos. Cuando se co-administran múltiples terapéuticos, las dosificaciones pueden ajustarse de acuerdo con esto, como se reconoce en la técnica pertinente. Las terapias de "coadministración" y combinación no están limitadas a la administración simultánea sino que incluyen regímenes de tratamiento en los que un antagonista de IL-4 se administra al menos una vez durante el curso del tratamiento que implica administrar al menos un agente terapéutico más al paciente.

Los ejemplos de otros agentes que pueden co-administrarse con antagonistas de IL-4 son otros anticuerpos, citoquinas o receptores de citoquinas que se eligen según la afección particular que se va a tratar. Alternativamente,

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que tanto IL-4 como IL-13 juegan un papel en la función de barrera reducida. El método inhibe así tanto la reducción de la función de la barrera inducida por IL-4 como la reducción de la función de la barrera inducida por IL-13. El efecto adverso de IL-13 en la función de la barrera epitelial pulmonar e intestinal puede confirmarse usando técnicas de ensayo tales como las descritas en el ejemplo 7 más adelante. (Véase también Zund et al., J. Biol. Chem. 271(13): 7460-7464, 1996).

Otro método proporcionado en la presente memoria comprende co-administrar antagonista(s) de IL-4 e interferón- (IFN-) a un paciente que tiene una afección que implica la reducción de la función de la barrera epitelial pulmonar. Opcionalmente, dicho método comprende además la co-administración de uno o más antagonistas de IL-13 al paciente (es decir, la co-administración de un antagonista de IL-4, IFN- y un antagonista de IL-13). Otros métodos comprenden administrar IFN- como un único agente, o co-administrar IFN- y un antagonista de IL-13, a un paciente que tiene una afección que implica la reducción de la función de la barrera epitelial pulmonar. En un ejemplo, el paciente tiene asma. Para tratar el asma, el antagonista de IL-4, IFN- y/o el antagonista de IL-13 se administran preferiblemente por inhalación.

Un método descrito en la presente memoria para tratar asma comprende administrar un antagonista de IL-4 e interferón- a un ser humano que tiene asma. Otro método para tratar asma comprende co-administrar un antagonista de IL-4, IFN- un antagonista de IL-13 a un ser humano que tiene asma. En un ejemplo, IFN- se coadministra a un asmático, junto con un anticuerpo que funciona como un antagonista tanto de IL-4 como de IL-13. Dichos anticuerpos se describen en otro lugar en la presente memoria.

Un único agente puede funcionar como un antagonista de IL-4 y un antagonista de IL-13, como se ha discutido anteriormente. Como un ejemplo de dicho agente, algunos anticuerpos producidos frente a IL-4R pueden interferir con la unión de los complejos de receptor tanto de IL-4 como de IL-13, debido al componente compartido IL-4R en dichos complejos de receptor multi-subunidad (discutido anteriormente). Así, puede emplearse un único agente en un método para inhibir la reducción de la función de la barrera.

Los antagonistas pueden co-administrarse con uno o más antagonistas del receptor de leucotrieno para tratar trastornos tales como enfermedades inflamatorias alérgicas, por ejemplo, asma y alergias. Los ejemplos de antagonistas del receptor de leucotrieno incluyen pero no están limitados a montelukast, pranlukast y zafirlukast. Los fármacos que funcionan como inhibidores de 5-lipoxigenasa pueden co-administrarse con un antagonista de IL-4 para tratar asma.

Los métodos descritos en la presente memoria comprenden administrar uno o más de los siguientes a los pacientes con Síndrome de Churg-Strauss: antagonista(s) de IL-4, antagonista(s) de IL-5, antagonista(s) de IL-13 o antagonista(s) de IgE. Un ejemplo de dicho método implica co-administrar antagonista(s) de IL-4 y antagonista(s) de IL-5 a un paciente con Síndrome de Churg-Strauss. En otro ejemplo, los antagonista(s) de IL-4 y los antagonista(s) de IgE se co-administran al paciente. En otro ejemplo más, los antagonista(s) de IL-4 y los antagonista(s) de IL-13 se co-administran al paciente.

La hormona relaxina puede co-administrarse con un antagonista de IL-4 para tratar escleroderma (esclerosis sistémica), fibrosis pulmonar idiopática, o cualquier otro trastorno caracterizado por fibrosis pulmonar, tal como las afecciones que implican fibrosis del pulmón que se han discutido anteriormente. La relaxina humana recombinante se prefiere para usarse para tratar seres humanos.

Un método para tratar hiperplasia benigna de la próstata comprende co-administrar antagonista(s) de IL-4 y uno o más agentes anti-inflamatorios adicionales. Los ejemplos de agentes que inhiben la inflamación incluyen antagonistas del factor de necrosis tumoral (TNF) y antagonistas de IL-17.

Puede emplearse cualquier antagonista de IL-17 adecuado, incluyendo pero no limitado a un receptor de IL-17 (preferiblemente formas solubles de éstos), antagonistas del receptor de IL-17, anticuerpos dirigidos frente a IL-17 o un receptor de IL-17, otras proteínas que interfieren con la unión de IL-17 a un receptor de IL-17 y compuestos que inhiben la transducción de la señal mediada por IL-17. Un receptor de IL-17, incluyendo formas solubles de éste y oligómeros de éste, se describe en WO 96/29408, incorporado por referencia por la presente. Un método alternativo descrito en la presente memoria comprende administrar un antagonista de IL-17 para tratar a un paciente con hiperplasia benigna de próstata.

Asimismo, puede emplearse cualquier antagonista de TNF adecuado, incluyendo pero no limitado a un receptor de TNF (preferiblemente formas solubles de éste), proteínas de fusión que comprenden un receptor de TNF (o que comprenden la parte de unión a TNF de un receptor de TNF), antagonistas del receptor de TNF, anticuerpos dirigidos frente a TNF o un receptor de TNF, otras proteínas que interfieren con la unión de TNF a un receptor de TNF, y compuestos que inhiben la transducción de la señal mediada por TNF. Los ejemplos adicionales de inhibidores de TNF son los fármacos talidomida y pentoxifilina. La proteína receptor de TNF conocida como p75 o p80 TNF-R se emplea preferiblemente. Un antagonista de TNF preferido es un receptor de TNF humano soluble (sTNF-R) en forma dimérica, tales como dímeros de proteínas de fusión sTNF-R/Fc. Uno de dichos dímeros es etanercept (Enbrel, Immunex Corporation, Seattle, WA). p75/p80 TNF-R, incluyendo los fragmentos solubles y otras formas de éste, se describe en WO 91/03553.

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Un antagonista de IL-4 puede co-administrarse con un antagonista de TNF para tratar cualquier afección en la que juegan un papel respuestas inmunes no deseadas inducidas por IL-4 e inducidas por TNF, tales como inflamación. Un método descrito en la presente memoria comprende co-administrar un antagonista de IL-4 y un antagonista de TNF a un paciente con enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. Otros ejemplos están dirigidos a un método que comprende co-administrar un antagonista de IL-4 y un antagonista de TNF a un paciente que tiene Enfermedad de Kawasaki, anemia hemolítica autoinmune, uveoretinitis autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune, síndrome de Sjogren, síndrome de fatiga crónica o hepatotoxicidad inducido por un fármaco tal como diclofenac.

Otro método descrito en la presente memoria comprende co-administrar un antagonista de IL-4 y un antagonista de TNF a una mujer embarazada que ha desarrollado pre-eclampsia. La administración del antagonista de IL-4 y el antagonista de TNF continúa preferiblemente durante la duración del embarazo.

Las dosificaciones adecuadas de etanercept (Enbrel, Immunex Corporation, Seattle, WA) variarán según la naturaleza de la enfermedad que se va a tratar, gravedad de la enfermedad, el tamaño del paciente (por ejemplo, adulto o niño) y otros factores, como se reconoce en el campo pertinente. En una realización de los métodos proporcionados en la presente memoria, Enbrel se administra dos veces a la semana por inyección subcutánea a una dosis de 1 a 25 mg. Un ejemplo de una dosificación pediátrica es 0,4 mg/kg. Los métodos particulares proporcionados en la presente memoria comprenden la co-administración de un antagonista de IL-4 y Enbrel a un paciente que tiene síndrome linfoproliferativo autoinmune o síndrome de Sjogren, en el que Enbrel se proporciona por inyección subcutánea a una dosis de 1 a 25 mg.

Para tratar la enfermedad de injerto frente a huésped, un antagonista de IL-4 se co-administra con al menos uno de los agentes siguientes: un antagonista de TNF, un antagonista de IL-1, esteroides o corticosteroides. El inhibidor de TNF es preferiblemente Enbrel. Un antagonista de IL-1 preferido es una forma soluble de receptor de IL-1 de tipo II, que se describe en la Patente U.S. 5.350.683. En un ejemplo, el GVHD está asociado con (por ejemplo, se desarrolla posteriormente a) trasplante de médula ósea. Un antagonista de IL-4 puede emplearse en combinación con al menos uno de los agentes listados anteriormente, en métodos para suprimir una respuesta inmune dirigida frente a células trasplantadas, tejido y/o aloantígeno.

En la presente memoria se describen varios antagonistas de citoquinas y otros agentes/fármacos como útiles para terapia de combinación (por ejemplo, co-administración con un antagonista de IL-4) para tratar enfermedades particulares. Debe entenderse que dichos antagonistas, agentes o fármacos también encuentran uso como agentes únicos para tratar estas enfermedades. También debe entenderse que la descripción de métodos que implican la administración de un antagonista de una citoquina particular, para tratar una enfermedad, engloba la administración de un tipo de antagonista y también engloba la administración de dos o más antagonistas diferentes para esta citoquina, a no ser que se especifique otra cosa.

Los ejemplos siguientes se ofrecen como ilustración y no como limitación.

Ejemplo 1: Preparación de Anticuerpos Monoclonales

Los polipéptidos de receptor de IL-4 pueden emplearse como inmunógenos para generar anticuerpos monoclonales por técnicas convencionales, por ejemplo, las técnicas descritas en la Patente U.S. 5.599.905, incorporado por referencia en la presente. Se reconoce que los polipéptidos en varias formas pueden emplearse como inmunógenos, por ejemplo, proteínas de longitud completa, fragmentos de éstas, proteínas de fusión de éstas tales como fusiones Fc, células que expresan la proteína recombinante en la superficie celular, etc.

Para resumir un ejemplo de dicho procedimiento, un inmunógeno IL-4R emulsionado en adyuvante completo de Freund se inyecta subcutáneamente en ratas Lewis, en cantidades que varían de 10-100 l. Tres semanas después, los animales inmunizados se refuerzan con inmunógeno adicional emulsionado en adyuvante incompleto de Freund y se refuerzan cada tres semanas desde ese momento. Periódicamente se toman muestras de suero por sangrado retro-orbital o escisión de la punta de la cola para ensayar por ensayo de hibridación sobre mancha, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima) o inhibición de la unión de 125I-IL-4 a los extractos de células que expresan IL4R. Después de la detección de la titulación de un anticuerpo apropiado, se proporcionó a los animales positivos una inyección intravenosa final de antígeno en disolución salina. De tres a cuatro días después, los animales se sacrifican, se recogen los esplenocitos, y se fusionan con la línea celular de mieloma murino AG8653. Las líneas celulares de hibridoma resultantes se siembran en placas en placas de microtitulación múltiples en un medio HAT selectivo (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.

Los clones de hibridoma así generados se criban para reactividad con IL-4R. El cribado inicial de los sobrenadantes de los hibridomas utiliza un anticuerpo de captura y la unión del receptor 125I-IL-4 parcialmente purificado. Los hibridomas que son positivos en este método de cribado se ensayan con un anticuerpo de captura modificado para detectar las líneas celulares de hibridoma que están produciendo el anticuerpo bloqueante. Así, se detectan los hibridomas que secretan un anticuerpo monoclonal capaz de inhibir la unión de 125I-IL-4 a las células que expresan IL-4R. Dichos hibridomas se inyectan en las cavidades peritoneales de ratones desnudos para producir ascites que

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HuIgG y HuKappa, seguido de un recribado para gamma y kappa humana específica para IL-4R. Los clones positivos se evaluaron y el clon 12B5 se identificó como un anticuerpo bloqueante. El clon se subclonó; se aisló una línea celular de hibridoma que produce MAb 12B5; y el MAb 12B5 se purificó del sobrenadante.

Se determinó que 12B5 era un anticuerpo IgG1 y que era completamente humano. Los anticuerpos de otras subclases, tales como anticuerpos monoclonales IgG4 o IgM, pueden obtenerse de 12B5. Las técnicas para alterar (cambiar) la subclase/isotipo de un anticuerpo son conocidas. La región constante de 12B5 puede reemplazarse, por ejemplo, con una región constante obtenida de un anticuerpo IgG4 humano. La información de la secuencia para una cadena pesada IgG4 humana se presenta, por ejemplo, en Ellison et al. (DNA Vol. 1, no. 1, p. 11-18, 1981) que se incorpora por referencia por la presente en la presente memoria.

El ADN que codifica la región variable de la cadena ligera de MAb 12B5 se aisló y la secuencia de nucleótidos de éste se determinó. La secuencia de ADN para la región variable de la cadena ligera se presenta como SEQ ID NO:9; la secuencia de aminoácidos codificada por ésta se presenta en SEQ ID NO:10. Se cree que las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3 (CDR 1-3) corresponden a los aminoácidos 24-35, 51-57 y 90-99 de SEQ ID NO:10, respectivamente.

El ADN que codifica la región variable de la cadena pesada de MAb 12B5 se aisló y la secuencia de nucleótidos de éste se determinó. La secuencia de ADN para la región variable de la cadena pesada se presenta como SEQ ID NO:11; la secuencia de aminoácidos codificada por éste se presenta en SEQ ID NO:12. Se cree que CDR-1 de la cadena pesada corresponde a los aminoácidos 31-35, CDR-2 a los aminoácidos 50-65; y CDR-3 a los aminoácidos 98-104 de SEQ ID NO:12.

Ejemplo 9: Anticuerpos Monoclonales Adicionales que inhiben tanto IL-4 como IL-13

Se produjeron anticuerpos monoclonales humanos adicionales frente al receptor de IL-4 humano, mediante la inmunización de ratones transgénicos con un polipéptido IL-4R humano soluble. Los ratones transgénicos empleados se seleccionaron de las cepas de ratón transgénico descritas en el ejemplo 3.

Se identificaron y aislaron líneas celulares de hibridoma que secretan anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a IL-4R humano y que son capaces de funcionar como antagonistas de IL-4 y antagonistas de IL-13. Los MAb se designaron 27A1, 5A1 y 63. Otro MAb, designado 1B7, se obtuvo de MAb 63 y se diferencia del anticuerpo parental sólo en la cadena ligera. 1B7 retiene la capacidad de unirse a IL-4R y de funcionar como un antagonista de IL-4 y un antagonista de IL-13.

La secuencia de ADN de la región variable de la cadena ligera de MAb 27A1 se presenta en SEQ ID NO:13; y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en SEQ ID NO:14. Las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3 (CDR 1-3) se cree que corresponden a los aminoácidos 24-35, 51-57 y 90-99 de SEQ ID NO:14, respectivamente.

La secuencia de ADN de la región variable de la cadena pesada de MAb 27A1 se presenta como SEQ ID NO:15; y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en SEQ ID NO:16. Las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3 (CDR 1-3) se cree que corresponden a los aminoácidos 31-35, 50-66 y 99-105 de SEQ ID NO:16, respectivamente.

La secuencia de ADN de la región variable de la cadena ligera de MAb 5A1 se presenta en SEQ ID NO:17; y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en SEQ ID NO:18. Las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3 (CDR 1-3) se cree que corresponden a los aminoácidos 24-34, 50-56 y 89-97 de SEQ ID NO:18, respectivamente.

La secuencia de ADN de la región variable de la cadena pesada de MAb 5A1 se presenta como SEQ ID NO:19; y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en SEQ ID NO:20. Las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3 (CDR 1-3) se cree que corresponden a los aminoácidos 31-35, 50-65 y 98-112 de SEQ ID NO:20, respectivamente.

La secuencia de ADN de la región variable de la cadena ligera de MAb 63 se presenta en SEQ ID NO:21; y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en SEQ ID NO:22. Las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3 (CDR 1-3) se cree que corresponden a los aminoácidos 24-34, 50-56 y 89-97 de SEQ ID NO:22, respectivamente.

La secuencia de ADN de la región variable de la cadena pesada de MAb 63 se presenta como SEQ ID NO:23; y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en SEQ ID NO:24. Las regiones determinantes de la complementariedad 1 a 3 (CDR 1-3) se cree que corresponden a los aminoácidos 31-35, 50-66 y 99-106 de SEQ ID NO:24, respectivamente.

La secuencia de ADN de la región variable de la cadena ligera de MAb 1B7 se presenta en SEQ ID NO:25; y la secuencia de aminoácidos codificada se presenta en SEQ ID NO:26. Las regiones determinantes de la

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