ES2549856T3 - Procedimiento y dispositivo para separar por filtración vertical partículas biológicas contenidas en un líquido - Google Patents

Abstract

Procedimiento para buscar células raras en suspensión en una muestra de un líquido biológico, para permitir un diagnóstico, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: a) tratamiento de una muestra de un líquido biológico para lisar células que no presentan interés; b) filtración vertical de la muestra tratada obtenida de la etapa a) a través de un filtro que comprende poros calibrados de un tamaño comprendido entre 3 mm y 100 mm y una densidad de poros comprendida entre 3 x 103 y 10 x 106 poros/cm2, comprendiendo dicho filtro al menos una zona elemental de filtración, teniendo cada zona elemental de filtración una superficie igual a la de un disco que tiene un diámetro comprendido entre 0,6 cm y 3 cm, y estando el número de zonas elementales de filtración seleccionado para que la relación del volumen de líquido a filtrar y de la suma de las superficies de las zonas elementales de filtración, esté entre 0,14 y 40 ml/cm2; y c) análisis de las células que pudieron recuperarse en cada zona elemental de filtración del filtro que sirvió para filtrar la muestra.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

E06726089

09-10-2015

del líquido situado por encima del filtro. Esta sobrepresión debe, sin embargo, seguir siendo inferior a 1 bar. Estas condiciones están particularmente adaptadas a la separación de células.

[0060] El procedimiento puede utilizarse para diferentes objetivos, por ejemplo para buscar células raras en 5 suspensión en un líquido biológico, para permitir un diagnóstico o para depurar un líquido para permitir el análisis en buenas condiciones de los elementos en solución.

[0061] Cuando el procedimiento se utiliza para buscar células y analizarlas, después de la filtración, el filtro que ha servido para filtrar el líquido se recupera procurando que las zonas de filtración estén bien identificadas y que

10 se pueda establecer el vínculo entre estas zonas de filtración y la muestra que ha sido filtrada. El filtro se utiliza a continuación para efectuar un análisis de las células que se han podido recuperar en las zonas de filtración.

[0062] Estos métodos de análisis, conocidos por sí mismos, son por ejemplo del tipo: tinción citológica (hematoxilina, eosina, etc...), inmunomarcado (inmunohistoquímica, inmunofluorescencia) PNA, FISH, PRINS, PCR

15 in situ u otra técnica molecular, espectrofotometría, microdisección láser seguida por análisis moleculares dirigidos al ADN (extracción del ADN, genotipado, PCR cuantitativa, análisis de mutaciones, CGH (hibridación genómica comparada)) ARN (extracción y análisis mediante PCR de los transcritos, PCR cuantitativas) y proteínas (extracción de las proteínas, microsecuenciaciones, etc...).

20 [0063] Los análisis moleculares pueden realizarse en células enriquecidas retenidas en el filtro trasladadas a un portaobjetos mediante una técnica similar a la de Southern, micro-diseccionadas individualmente a partir del filtro

o del portaobjetos según criterios definidos (características morfológicas de las células con o sin marcado de diferentes naturalezas) y sometidas a análisis molecular individualmente o de forma combinada.

25 [0064] Las células también pueden deprenderse del filtro mediante lavado con un tampón apropiado para acceder a la extracción y el análisis de sus ADN, ARN y proteínas.

[0065] Los elementos aislados por filtración son examinados a continuación al microscopio y el análisis de las imágenes obtenidas en el filtro puede realizarse de forma manual o mediante medios automatizados, en particular

30 utilizando aparatos de análisis de imágenes.

[0066] El procedimiento también puede utilizarse para depurar un líquido biológico tal como orina que contiene en solución ADN o ARN o proteínas que se desean analizar. La depuración del líquido tiene como objetivo eliminar todas las partículas biológicas presentes en el líquido, que podrían interferir en el análisis. En este caso, los

35 filtros no se conservan y es el líquido filtrado el que es analizado.

[0067] Este método de filtración, así como los métodos de preparación de la muestra y de análisis pueden utilizarse concretamente como se ha mencionado anteriormente con fines de diagnóstico para detectar patologías asociadas a la presencia de células particulares eventualmente en una cantidad extremadamente reducida. En

40 particular, el procedimiento puede utilizarse para detectar células cancerosas que habrían sido liberadas en la sangre de un paciente durante una operación quirúrgica. El experto en la materia conoce las células que puede ser necesario buscar para detectar una u otra patología.

[0068] Para que estos análisis se realicen en condiciones de fiabilidad satisfactorias, concretamente en el

45 marco de hospitales o de laboratorios de análisis médicos, es deseable que los aparatos empleados garanticen una buena reproductibilidad y una buena fiabilidad de las condiciones de ejecución de los análisis. Para hacer esto, los inventores han desarrollado dispositivos adaptados a la ejecución de estos análisis en condiciones de fiabilidad satisfactorias.

50 [0069] A continuación se describirán estos dispositivos.

[0070] Para realizar los análisis en condiciones satisfactorias de fiabilidad, los líquidos a filtrar son recogidos en un módulo de filtración preferentemente de un solo uso identificado generalmente mediante 1 en la figura 1 y que se montará sobre un bloque de soporte identificado generalmente mediante 2, que forma parte de la máquina de

55 filtración (que no está representada en su conjunto en la figura).

[0071] El módulo de filtración 1 está colocado sobre el bloque de soporte para realizar la filtración. Cuando la filtración ha terminado, el módulo de filtración 1 es retirado del bloque de soporte 2 y el filtro que está contenido en el módulo de filtración es retirado para poder realizar análisis como se explicará más adelante.

7

imagen6

E06726089

09-10-2015

mezclarse con el líquido que pasa por otro agujero, lo que permite filtrar simultáneamente dos líquidos diferentes. Los labios sobresalientes 122, y eventualmente 123, están dispuestos en la cara 124 de la junta que cooperará con la parte inferior del bloque de depósito 11. La segunda cara 125 de la junta, que cooperará con el filtro 13, es plana.

5 [0081] El filtro 13, que constituye una plaquita de forma general rectangular y que es plana, consta de una zona central de filtración 131 constituida por una membrana de policarbonato microporosa de 100 µm de grosor aproximadamente y que tiene una porosidad adaptada al procedimiento. Esta parte central está fijada con ayuda de una cola biológica a un marco 132 de PVC que puede utilizarse para sujetar la plaquita y para llevar en ella inscripciones de referencia. El marco 132 consta de medios de posicionamiento y de localización de la orientación

10 de la plaquita constituidos por dos agujeros 133A y 133B dispuestos en diagonal en la plaquita y que tienen diámetros diferentes y que cooperarán con las espigas 153A y 153B del soporte de filtro. Con esta disposición de los agujeros de localización 133A y 133B, una sola orientación es posible para disponer la plaquita sobre un soporte que consta de espigas de localización complementarias a los agujeros 133A y 133B. Esto permite de localizar de forma muy exacta la orientación de la plaquita, por un lado, cuando está dispuesta en el módulo de separación y, por otro

15 lado, cuando está dispuesta en un aparato de análisis tal como un equipo de tinción o de lectura en un microscopio.

[0082] En una variante representada en la figura 9, la plaquita consta de dos zonas de filtración centrales 131A, 131B, paralelas entre sí y que pueden constar de membranas de porosidades diferentes.

20 [0083] La junta de placa 14 es una junta de placa plana de silicona que consta de aberturas circulares 140 que corresponden a las aberturas 121 de la junta estriada y a las aberturas 117 previstas en el fondo del bloque de depósito. Ésta consta también de agujeros 141A y 141B de diámetros diferentes que corresponden a los agujeros 133A y 133B del filtro.

25 [0084] El cajón de soporte de filtro 15 es una placa de material plástico inyectado que consta de una cara superior 150 que sujetará al conjunto del filtro y las juntas contra la cara inferior 110 del bloque de depósito 11. Esta placa soporte de filtro consta de una serie de agujeros 152 que se situarán en frente de los agujeros correspondientes 140 de la junta de placa, 121 de la junta estriada y 117 del bloque de depósito.

30 [0085] La cara superior 150 del cajón de soporte de filtro consta, además, de espigas 153A y 153B que cooperarán con los agujeros de señalización 133A y 133B de la plaquita de filtro 13, con los agujeros correspondientes 141A y 141B de la junta de placa 14 y con los agujeros de centrado previstos en la cara inferior 110 del bloque de depósito.

35 [0086] Como puede verse en la figura 5B, los agujeros 152 que dejarán pasar el líquido filtrado constan de una parte superior en forma de embudo que se prolonga mediante pequeños tubos 154 sobresalientes en la cara inferior 155 del cajón de soporte de filtro 15. Los pequeños tubos 154 sobresalientes con respecto a la cara inferior 155 del cajón de soporte de filtro tienen como función garantizar un correcto flujo del líquido después de la filtración para no formar gotas que mojarán la cara inferior del soporte de filtro. Se observará que el diámetro de la parte

40 superior de los agujeros 152, del mismo modo que los diámetros de los agujeros 140 de la junta de placa y 151 de la junta estriada, son prácticamente iguales al diámetro de los agujeros 117 previstos en el fondo del bloque de depósito, para delimitar en el filtro zonas de filtración elementales de diámetro correspondiente. La placa cajón de soporte de filtro 15 consta, además, en sus dos bordes laterales de agujeros 151 que recibirán a los ejes de ensamblaje 16. Estos agujeros tienen formas adaptadas para poder introducir los ejes de ensamblaje y bloquear el

45 conjunto en posición cuando se garantiza el montaje del conjunto del módulo de filtración.

[0087] Los ejes de ensamblaje 16 constan, cada uno, de un cabeza 161 coronada por una varilla 162, de diámetro más pequeño, cuyo extremo constituye un gancho 163. La longitud del eje de ensamblaje está adaptada para permitir el bloqueo del apilamiento constituido por el cajón de soporte de filtro, por las juntas y por el filtro 50 cuando está apoyado contra el bloque de depósito. De este modo, un eje de ensamblaje tiene una longitud suficiente para que, cuando se introduce en un agujero 151 del cajón de soporte de filtro, pueda penetrar en el agujero 112 del reborde inferior del bloque de depósito 11, de modo que el gancho 163 situado en el extremo del eje de ensamblaje pueda engancharse en la superficie superior del reborde 111 del bloque de depósito, cooperando la cabeza 161 del eje de ensamblaje 16 con la cara inferior del cajón de soporte de filtro 15 para mantener bloqueado al cajón de

55 soporte de filtro contra el fondo del bloque de depósito 11.

[0088] El módulo de filtración, tal como se acaba de describir, estará dispuesto sobre un bloque de soporte 2 de módulo de filtración que consta, por un lado, de una cara de apoyo 200 que consta de una abertura central 201 que se situará en frente del conjunto de las aberturas de la cara inferior de un bloque de filtración, por otro lado de

9

imagen7

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2

   imagen3