ES2551828A1

ES2551828A1 - Composiciones alimentarias que comprenden sales de tungsteno (VI)

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Publication number: ES2551828A1
Application number: ES201430747A
Authority: ES
Inventors: Ignacio CANALS ALMAZÁN; Agnès ARBAT BUGIÉ
Original assignee: Oxolife SL
Current assignee: Oxolife SL
Priority date: 2014-05-21
Filing date: 2014-05-21
Publication date: 2015-11-23
Anticipated expiration: 2034-05-21
Also published as: TW201600022A; WO2015177393A1; UY36133A; AU2015263221B2; NZ726934A; ES2551828B1; AR100545A1; AU2015263221A1

Abstract

Composiciones alimentarias que comprenden sales de tungsteno (VI) así como su preparación, para favorecer la fertilidad y la reproducción normal en un mamífero hembra no diabético.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones alimentarias que comprenden sales de tungsteno (VI)

La presente invención se refiere al uso de sales de tungsteno (VI) para la preparación de composiciones alimentarias, así como a dichas composiciones alimentarias, en especial 5 para favorecer la fertilidad y la reproducción normal en un mamífero hembra no diabético.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La fertilidad en mamíferos es un proceso multietápico que de forma natural no es totalmente eficiente. Factores como la edad, los hábitos alimenticios o el estilo de vida, entre otros, 10 modulan el éxito de este proceso. Así, se conoce por ejemplo que la tasa de embarazo en mujeres de 20 a 24 años es de aproximadamente el 86%, mientras que en mujeres de 35 a 32 años decae hasta un 50% [Management of the Infertile Woman por Helen A. Carcio; The Fertility Sourcebook por M. Sara Rosenthal, ASAS Summary of FAIR 2012]. Otros factores, como el sobrepeso o el bajo peso, también son responsables de retrasos en la consecución 15 de un embarazo de forma natural o incluso de la imposibilidad de su consecución [Fertil Steril 2013;100:631–7]. Se estima que aproximadamente un 66% de las parejas no conciben de forma natural durante los 3 primeros meses de relaciones sexuales sin protección. Esta cifra disminuye hasta el 15% de las parejas durante el decurso del primer año de relaciones sexuales no protegidas. Infertilidad se define (WHO, ASRM, NICE) como la incapacidad de 20 concebir tras 12 meses de relaciones sexuales regulares no protegidas También se ha acuñado, especialmente en Europa, el término “subfertilidad” para definir a aquellas parejas con alguna forma o grado de fertilidad reducida, que conlleva un retraso en la concepción [Gnoth C et al Definition and prevalence of subfertility and infertility Human reproduction 2005;20(5):1144-1147]. 25

Las principales causas de infertilidad entre las mujeres incluyen disfunciones ovulatorias, patologías del tracto reproductivo, reducción en la calidad de los oocitos y la depleción folicular inherente al envejecimiento. Sin embargo, también existe un porcentaje considerable de mujeres con infertilidad inexplicada, también denominada infertilidad 30 idiopática, de la que una de las posibles causas está relacionada con deficiencias en el proceso de implantación.

El desarrollo folicular, la ovulación, la migración del óvulo inmaduro (oocito), así como la posterior concepción e implantación del cigoto en la pared uterina se encuentra regulado por 35 secreciones hormonales de ciertos órganos endocrinos como por ejemplo la hipófisis, el

hipotálamo y la glándula tiroides. Entre las múltiples causas biológicas de la infertilidad en la mujer se pueden destacar también las causas ligadas a desórdenes de los estímulos hormonales que regulan todo este proceso

Se conocen diferentes tratamientos para la infertilidad femenina entre los que se encuentran 5 la administración de medicamentos para tratar problemas hormonales que conllevan alteraciones de la ovulación. Asimismo se han postulado algunos efectos beneficiosos con numerosos tratamientos en base a la ingesta de suplementos vitamínicos, especialmente vitamina B, vitamina C, vitamina E y ácido fólico, suplementos minerales como sales o complejos de hierro, zinc, o selenio, ácidos grasos esenciales (omega 3), así como extractos 10 de plantas tales como Sauzgatillo (Vitex agnus chastus), Damiana, regaliz, flor de Trébol Rojo, Baya de Agnocasto, Cohosh Negro, Dong Quai (Angelica sinensis), Ñame o Camote Silvestre (Dioscorea villosa), Raíz de Unicornio Falso, té verde, Ortigas (Urtica dioica), Avena salvaje (Avena sativa), Diente de león (Taraxacum officinale), etc. aunque para ninguno de estos tratamientos se ha podido demostrar claramente su eficacia. 15

El porcentaje de embarazos conseguidos mediante los tratamientos mencionados anteriormente presentan limitaciones. Así, por ejemplo, se ha observado que el tratamiento de mujeres cuya ovulación es irregular o ausente mediante la administración de citrato de clomifeno, un fármaco de la familia de los estilbenos, permite la restauración de la ovulación 20 en un porcentaje elevado, pero la tasa de embarazo continua siendo baja, aproximadamente igual o inferior al 50%.

Los tratamientos de fecundación in vitro son muy efectivos en la etapa de fecundación del oocito. Sin embargo, la tasa de implantación de los embriones en la pared uterina es baja. 25 Esto promueve las transferencias múltiples de embriones por cada ciclo de fecundación in vitro, con la consecuencia de un porcentaje mayor de embarazos múltiples considerados de riesgo.

Por último, es conocido que las alteraciones metabólicas como la diabetes o la obesidad 30 conllevan una limitación de la fertilidad. Se conoce que la recuperación parcial o total de la glucemia, la insulinemia y/o el peso corporal de ratones hembra diabéticos u obesos con la función reproductora dañada, comporta una mejora de la fertilidad.

Diferentes tratamientos farmacológicos, como la metformina o sales de tungsteno (VI), o 35 incluso cambios en el estilo de vida, han demostrado mejorar la diabetes o alteraciones en la

insulina, como por ejemplo la deficiencia o la resistencia a la insulina, consiguiendo recuperar la función reproductora total o parcialmente, cuando la infertilidad es debida a la diabetes o alteraciones en la insulina.

En el caso concreto del tungstato sódico, se conoce que ratas con diabetes e insulinopenia 5 inducida por la inyección de estreptozotocina, recuperan parcialmente los niveles de insulina circulantes tras un tratamiento prolongado (10 semanas) con tungstato sódico como consecuencia de revertir parcialmente la diabetes. Posteriormente, cuando las ratas hembras parcialmente recuperadas de la diabetes se aparean con machos sanos, se observa que, de forma paralela a la recuperación parcial de la diabetes, han recuperado 10 parcialmente su capacidad reproductora. En particular, se observa que el porcentaje de partos con respecto al número de raspados positivos en los ratones hembras que habían sido parcialmente recuperadas de la diabetes tras un tratamiento con tungstato sódico aumenta hasta el 66%, porcentaje inferior a las hembras que no padecían diabetes donde el porcentaje es del 100%. (cf. J. Ballester y colaboradores, "Tungstate administration 15 improves the sexual and reproductive function in female rats with streptozotocin-induced diabetes", Human Reproduction, 2007, vol. 22, pp. 2128-2135). No obstante, no se observó ni postuló efecto alguno de las sales de tungsteno (VI) en animales hembra no diabéticos.

El tungsteno se encuentra en cantidades traza en animales y plantas. Por ejemplo, en 20 plantas se han descrito contenidos hasta un máximo de 100 mg/kg [Gbaruko B.C. & Igwe J.C. Global Tungsten: Occurrence, Chemistry, Environmental and Health Exposure Issues. Journal of Environmental Research 2007;1(1):27-32].

En vista de todo lo anterior, a pesar de la intensa investigación y los avances la comprensión 25 y manejo del proceso reproductivo de los mamíferos y de los humanos en particular, todavía numerosas parejas no se benefician de las diferentes aproximaciones disponibles en la actualidad para incrementar la fertilidad por serles ineficaces. Por lo tanto, todavía hay una necesidad de encontrar nuevas alternativas para la mejora de la eficiencia reproductiva natural y/o el tratamiento de infertilidad femenina que den una mayor eficacia. 30

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Se ha encontrado ahora que la administración de una sal de tungsteno (VI), o un solvato de dicha sal es efectiva para favorecer la fertilidad y la reproducción normal en un mamífero hembra no diabético. A pesar de que era conocido que el tungstato sódico puede revertir 35 parcialmente las alteraciones en la función reproductora en ratones hembras diabéticas

debido a que produce una normalización de los niveles de glucosa en sangre, no se ha descrito ni se ha sugerido que el tungstato sódico puede tener un efecto sobre la función del sistema reproductor femenino en mamíferos hembra no diabéticas, favoreciendo la fertilidad y la reproducción normal.

5

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de una sal de tungsteno (VI) o un solvato de la misma, para la preparación de una composición alimentaria para favorecer la fertilidad y la reproducción normal en un mamífero hembra no diabético.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una composición alimentaria, la cual comprende una sal de tungsteno (VI) o un solvato de la misma en una concentración 10 mayor de 100 mg/kg.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Tal y como indicado anteriormente, de acuerdo con un primer aspecto la presente invención se refiere al uso de una sal de tungsteno (VI) o un solvato de la misma, para la preparación 15 de una composición alimentaria para favorecer y/o contribuir a la fertilidad y la reproducción normales en un mamífero hembra no diabético.

En el marco de la presente invención, el término “composición alimentaria” englobaría cualquier alimento, sólido o líquido, enriquecido con sal de tungsteno (VI), así como 20 cualquier suplemento o complemento nutricional que contenga al menos una sal de tungsteno (VI).

El término “favorecer la fertilidad y la reproducción normal” o “contribuir a la fertilidad y la reproducción normal” se refiere a una contribución a la fertilidad y reproducción normales, o 25 mejorar la fertilidad y la reproducción normal (reduciendo los tiempos para lograr un embarazo), entendiendo por “fertilidad y reproducción normales” un estado de fertilidad en el cual se logra, siguiendo las definiciones proporcionadas previamente:

* en una situación de subfertilidad: un embarazo en un periodo de 12 meses de relaciones sexuales regulares y no protegidas; y 30

* en una situación de infertilidad: un embarazo tras un periodo 12 meses de relaciones sexuales regulares y no protegidas. Se incluyen aquí la necesidad de restaurar y/o potenciar la ovulación, mejorar la calidad del oocito y del embrión, aumentar la implantación del cigoto en la pared uterina, regular una alteración del eje hipotalámico-hipofisario-ovárico, incluyendo síndrome de ovario poliquístico, síndrome metabólico, hiperprolactinemia, 35 endometriosis, hipotiroidismo, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso,

cirrosis, artritis reumatoide, celiaquía, fallo renal crónico, causas idiopáticas y desórdenes alimentarios, tales como anorexia nerviosa y bulimia.

De acuerdo con una realización particular, la composición alimentaria de la invención contiene una concentración total (es decir, la suma de todas las sales de tungsteno (VI) 5 contenidas en la composición) de sales de tungsteno de al menos 100 mg/kg; de acuerdo con otras realizaciones particulares, dicha concentración total preferiblemente de al menos 150 mg/kg, al menos 200 mg/kg, al menos 250 mg/kg, al menos 300 mg/kg, al menos 350 mg/kg, al menos 400 mg/kg, al menos 450 mg/kg, al menos 500 mg/kg, al menos 550 mg/kg, al menos 600 mg/kg, al menos 650 mg/kg, al menos 700 mg/kg, al menos 750 10 mg/kg, al menos 800 mg/kg, al menos 850 mg/kg, al menos 900 mg/kg o al menos 850 mg/kg.

De acuerdo con otra realización particular, la concentración total de sales de tungsteno (VI) es igual o inferior a 1000 mg/kg. 15

El mamífero hembra en el marco de la presente invención puede ser cualquier mamífero, incluyendo, pero no limitado a, humanos, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cobayas, hámsteres, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etc.

De acuerdo con una realización particular, el mamífero hembra es humano.De acuerdo con 20 otra realización particular, la composición alimentaria será adecuada para la administración de sales de tungsteno en una dosis diaria de entre 0,001 mg por cada kg de peso corporal del mamífero hembra (en adelante, mg/kg/día) y la dosis máxima tolerada para la especie de mamífero hembra correspondiente.

25

De acuerdo con una realización particular más, la dosis máxima diaria será de 1000 mg/kg/día; de acuerdo con realizaciones particulares adicionales, la administración se realizaría en dosis de al menos 0,001 mg/kg/día, de al menos 0,01 mg/kg/día, de al menos 0,1 mg/kg/día, de al menos 0,5 mg/kg/día, de al menos 1 mg/kg/día, de al menos 10 mg/kg/día, de al menos 25 mg/kg/día, de al menos 50 mg/kg/día, de al menos 100 30 mg/kg/día, de al menos 200 mg/kg/día, de al menos 300 mg/kg/día , de al menos 400 mg/kg/día , de al menos 500 mg/kg/día, de al menos 600 mg/kg/día, de al menos 700 mg/kg/día, de al menos 800 mg/kg/día o de al menos 900 mg/kg/día.

En general, la sal de tungsteno comprende un anión de tungsteno (VI) y un catión 35 dietéticamente o farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el catión es un catión

alcalino o alcalinotérreo. Más preferiblemente, el catión se selecciona entre el grupo que consiste en sodio, potasio, magnesio, calcio y zinc. Según una realización particular, la sal de tungsteno (VI) es la sal sódica de tungsteno (VI).

Por su parte, el anión de tungsteno (VI) se selecciona preferiblemente del listado que 5 consiste en WO42−, HWO4−, W2O72− y HW2O7−. Preferiblemente, el anión es WO42−.

De acuerdo con una realización particular, la sal está en forma de solvato; preferiblemente, el solvato es el hidrato, más concretamente el dihidrato.

Todas las características enumeradas de manera individual para diferentes elementos de la 10 invención pueden ser combinadas entre sí, quedando todas las combinaciones posibles incluidas en el alcance de la presente invención. Así por ejemplo, según una realización preferida, el solvato de la sal de tungsteno (VI) es el dihidrato y el catión es un catión sódico. Al igual, el resto de combinaciones posibles también se pretende estén incluidas en el alcance de la presente invención. 15

La composición alimentaria puede ser una composición líquida, es decir, una bebida según términos más generalmente utilizados en la sociedad. Tal composición líquida, en el marco de la presente invención, incluye, pero no está limitada a, cualquier bebida seleccionada del grupo que consiste en leche de origen animal o vegetal, así como cualquier derivado de la misma, tales como por ejemplo batidos, yogur, kéfir, etc.; zumos de frutas y/o hortalizas; 20 agua sin gas o con gas, o agua o bebidas aromatizadas o edulcoradas (mediante edulcorantes nutritivos (sacarosa, fructosa…) o artificiales); condimentos, tales como por ejemplo cualquier salsa, aliño, kétchup, aceite, vinagre o preparados de vinagre; bebidas alcohólicas de cualquier tipo; té, café; así como todo tipo de bebidas refrescantes o refrescos, o bebidas energizantes. 25

La composición alimentaria también puede ser una composición sólida. Por ejemplo, tal composición sólida puede seleccionarse, pero no está limitado a, del grupo que consiste en derivados de leche de origen animal o vegetal, tales como pueden ser queso, mantequilla, margarina y tofu; cualquier tipo de pan, incluyendo fresco, envasado o congelado, de molde, 30 integrales, especiado, dulce, salado, etc; pasta preparada a partir de cualquier harina de cereal, tal como trigo o sémola (macarrones, espaguetis, tallarines, etc); productos de bollería, incluyendo bizcochos, galletas, magdalenas, rosquillas, etc.; infusiones, té o café, a granel o en bolsitas, para preparar bebidas; gelatinas, caramelos, incluyendo los de goma, más conocidos como “gominolas”; así como cualquier tipo de condimento sólido, por 35 ejemplo orégano, sal, cilantro, perejil, albahaca, etc, o mezclas de los mismos.

Por último, la composición alimentaria también puede ser suplemento o complemento nutricional, dietético o alimenticio, empleándose en el marco de la presente invención cualquiera de estos términos de manera equivalente. Estos términos se usan habitualmente para composiciones consumidas por vía oral, las cuales contienen un ingrediente destinado a complementar la alimentación, en el caso de la presente invención la(s) sal(es) de 5 tungsteno (VI). Nunca serán un sustituto de un alimento convencional ni un componente único de una comida o de la dieta alimenticia. Pueden darse en diferentes presentaciones, tales como pastillas, píldoras, tabletas, cápsulas, cápsulas suaves de gelatina, cápsulas de gelatina, obleas, comprimidos efervescentes, líquidos (disolución, suspensión, jarabe), gránulos y polvos, todas ellas se incluyen como realizaciones particulares en el ámbito de la 10 presente invención. Excipientes dietética- o farmacéuticamente aceptables son evidentes al experto para la obtención de cualquier de las presentaciones anteriores, y se pretenden incluidas en el alcance de la presente invención.

De acuerdo con una realización particular, cualquiera de las composiciones alimentarias 15 anteriores (composición sólida, composición líquida o suplemento/complemento nutricional) comprende en su composición al menos un edulcorante nutritivo, tal como la sacarosa o la fructosa. La ingesta de estos edulcorantes nutritivos debe ser controlada y limitada en pacientes diabéticos, por lo tanto una composición alimentaria que incluya tal edulcorante nutritivo estaría contraindicada en mamíferos diabéticos o al menos debería tenerse en 20 cuenta durante el control de su dieta.

De acuerdo con una realización particular, el mamífero hembra no diabético se selecciona del grupo que consiste en mamíferos hembra que necesitan restaurar y/o potenciar la ovulación, mejorar la calidad del oocito y del embrión, aumentar la implantación del cigoto en 25 la pared uterina, regular una alteración del eje hipotalámico-hipofisario-ovárico, incluyendo síndrome de ovario poliquístico, síndrome metabólico, hiperprolactinemia, endometriosis, hipotiroidismo, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso, cirrosis, artritis reumatoide, celiaquía, fallo renal crónico, causas idiopáticas y desórdenes alimentarios, tales como anorexia nerviosa y bulimia. 30

De acuerdo con otra realización particular, el mamífero hembra no diabético se selecciona del grupo que consiste en mamíferos hembra que presentan insulinresistencia (también conocida como resistencia a la insulina o resistencia insulínica); la insulinresistencia, cuando se presenta junto con una hiperglicemia, puede conducir al desarrollo de diabetes, no 35 obstante la insulinresistencia sola no conduce a un estado diabético. Preferiblemente, los

mamíferos hembra que presentan insulinresistencia se seleccionan del grupo que consiste en hembras mamíferos que presentan una o más de las siguientes condiciones: Obesidad o sobrepeso, Síndrome metabólico, Prediabetes, Síndrome del ovario poliquístico, Hipertensión, Enfermedad coronaria, Hiperlipidemias o dislipemia, Hipertiroidismo, Hiperparatiroidismo, Hiperleptinemia o resistencia a la leptina, Sedentarismo, Desórdenes 5 alimentarios, Síndrome de la apnea obstructiva del sueño, Malnutrición fetal, Síndrome de Prader Willi, Síndrome de Rabson-Mendenhall, Esteatosis hepática, Leprechaunism, Patologias asociadas al exceso de secreción de glucocorticoides (p.ej acromegalia), insulinresistencia causada por tratamientos farmacológico (p.ej glucocorticoides, diuréticos tiazídicos , betabloqueantes), Estrés o Menarquía Precoz [Egas Béjar, Daniela et.al 10 Insulinorresistencia / Insulin resistance. Medicina (Guayaquil);10(2):159-166, abr. 2005; Graves,Thomas K. WHY ISN’T THIS INSULIN WORKING? Western Veterinary Conference 2013 (SA113); Ximena Gaete V. Adelanto de la pubertad en Chile y el mundo. Rev Chil Pediatr 77 (5); 456-465, 2006; Leszek Szablewski Glucose Homeostasis and Insulin Resistance (eISBN: 978-1-60805-) Bentham e-books]. Muchas de estas indicaciones se ha 15 descrito que no están relacionadas con la infertilidad, incluyendo la prediabetes [Acta Diab. Latina 4, 507, 1967].

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición alimentaria, la cual comprende la sal o sales de tungsteno (VI) o un solvato de las mismas en una concentración 20 de al menos 100 mg/kg. De acuerdo con realizaciones particulares, la sal o sales de tungsteno (VI) están comprendidas en la composición en concentraciones de al menos 150 mg/kg, al menos 200 mg/kg, al menos 250 mg/kg, al menos 300 mg/kg, al menos 350 mg/kg, al menos 400 mg/kg, al menos 450 mg/kg, al menos 500 mg/kg, al menos 550 mg/kg, al menos 600 mg/kg, al menos 650 mg/kg, al menos 700 mg/kg, al menos 750 25 mg/kg, al menos 800 mg/kg, al menos 850 mg/kg, al menos 900 mg/kg o al menos 850 mg/kg.

Todas las definiciones y significados preferidos proporcionados anteriormente en relación al primer aspecto de la invención son aplicables a este segundo aspecto de la invención. Así, 30 por ejemplo, la sal de tungsteno (VI) comprenderá un anión de tungsteno (VI) y un catión dietéticamente o farmacéuticamente aceptable, el cual preferiblemente será un catión alcalino o alcalinotérreo, aún más preferiblemente un catión sodio, potasio, magnesio y calcio y zinc. Particularmente, la sal será la sódica de tungsteno (VI). Una vez más, el anión de tungsteno (VI) se selecciona de los iones WO42−, HWO4−, W2O72− y HW2O7−, 35 preferiblemente WO42−, y en caso de presentarse en forma de solvato, el mismo

preferiblemente será el hidrato, más concretamente el dihidrato. El resto de realizaciones particulares proporcionadas anteriormente para el primer aspecto se refieren también a este segundo aspecto.

La composición alimentaria del segundo aspecto de la invención puede ser una composición 5 líquida o bebida, una composición sólida o un suplemento o complemento nutricional (también denominado dietético o alimenticio).

La composición líquida ya ha sido definida anteriormente en relación con el primer aspecto de la invención, y todas las realizaciones preferidas son aplicables también a este segundo aspecto de la invención. 10

Asimismo, la composición sólida se ha definido anteriormente en relación con el primer aspecto de la invención, y todas las realizaciones preferidas son aplicables también a este segundo aspecto de la invención.

15

Al igual, el suplemento o complemento nutricional (o dietético o alimenticio) ha sido definido anteriormente en relación con el primer aspecto de la invención, y todas las realizaciones preferidas son aplicables también a este segundo aspecto de la invención.

Preferiblemente, la composición comprende un edulcorante nutritivo, tal como la sacarosa o 20 la fructosa.

A continuación se incluyen una serie de ejemplos ilustrativos, no limitativos de la presente invención.

25

EJEMPLOS

EJEMPLO 1. DESCRIPCIÓN DEL MODELO ANIMAL (RATONES HEMBRAS IRS2 -/-)

El modelo de ratón empleado para determinar la actividad de sales de tungsteno (VI) para favorecer la fertilidad y la reproducción normales, es el ratón IRS2-/-, un knock-out del gen Irs2 [Burks y colaboradores, "IRS-2 pathways integrate female reproduction and energy 30 homeostasis", Nature, 2000, vol. 407, pp. 377-382]. La deleción del gen Irs2 se traduce en un claro dimorfismo sexual en relación a la fertilidad y al metabolismo de los carbohidratos.

Los machos de este modelo presentan resistencia a la insulina y una severa hiperglicemia iniciada desde edades tempranas. Por contra, en edades tempranas, las hembras se mantienen relativamente euglicémicas y desarrollan una ligera insulin-resistencia, que se 35 mantiene hasta edades avanzadas (4-5 meses). Las hembras IRS2-/- en edades tempranas,

alrededor de 10 semanas de edad, muestran un bajo desarrollo folicular y una anovulación persistente, acompañada de la ausencia del ciclo estral en la mayoría de los ratones. La tasa de embarazos de los ratones hembra IRS2-/- es del 9% frente a una tasa del 100% en ratones hembra IRSwt (IRS-2+/+ wild type). Dado que en estas edades las hembras se mantienen euglicémicas y que únicamente desarrollan una ligera insulin-resistencia, la 5 profunda alteración en la fertilidad, no es una consecuencia directa de las anomalías en el metabolismo de la glucosa.

EJEMPLO 2. ESTUDIO DE OVULACIÓN, IMPLANTACIÓN Y EMBARAZO

A. Animales 10

10 ratones hembra IRS2-/- de edades comprendidas entre 6 y 8 semanas.

6 ratones macho "wild-type" (IRS2wt) de edades comprendidas entre 6 y 8 semanas.

Los ratones hembras y machos se estabularon por separado en condiciones normales, es decir ciclo luz/oscuridad 12h y temperatura y humedad controladas. Los animales se alimentaron a voluntad (también denominado ad libitum) con dieta de pienso estándar. 15

B. Método

Fase de pre-tratamiento

Tras un periodo de aclimatación, los ratones hembra IRS2-/- se estabularon en grupos de 4-6 ratones/jaula. Durante la fase de pre-tratamiento (2 semanas), a los animales se les 20 administro el agua de bebida sin sal de tungstato.

Fase de tratamiento

El tungstato sódico fue administrado en el agua de bebida (ad libitum) mediante una solución de 2 mg/ml de tungstato sódico dihidrato (comercializado por Carlo Erba) en agua 25 destilada tras la fase de pre-tratamiento (día 0 de tratamiento) y hasta 4 semanas antes del sacrificio de los animales. La dosis diaria de tungstato sódico ingerida por los ratones fue aproximadamente de 180 mg/kg de peso corporal.

Cruce 30

Tras las tres primeras semanas de tratamiento, los ratones hembra IRS2-/- se estabularon en jaulas por parejas junto a un ratón macho IRS2wt de forma continua.

Los ratones se observaron diariamente en busca de signos de embarazo o parto.

Tras 4 semanas se intercambiaron los machos entre las jaulas y se mantuvieron durante 4 semanas más. 35

La administración de tungstato se mantuvo durante las 8 semanas en las que machos y hembras se estabularon conjuntamente. Tras estas 8 semanas se retiró el tratamiento y se mantuvo la estabulación conjunta de machos y hembras durante 4 semanas adicionales.

Sacrificio 5

Transcurrido este periodo, las hembras fueron sacrificadas y biopsiadas en busca de indicios de embarazo.

C. Resultados

Resultados del Estudio de ovulación 10

Durante el periodo de pre-tratamiento y durante las 3 primeras semanas de tratamiento se realizaron frotis vaginales a 6 ratones hembras elegidos al azar en los días -8; -5; -2; -1; 7; 8; 14; 15 y 22, para determinar la fase del ciclo estral en que se encontraban.

Se introdujo en la vagina de los ratones entre 1 y 2 ml de solución salina con una pipeta 15 pasteur. Con la misma pipeta se recogió el exudado vaginal y se extendió en un portaobjetos. Una vez secado al aire, se fijó y se tiñó con la técnica de Papanicolau.

La técnica de Papanicolau comprende realizar la tinción de los frotis vaginales fijados en el portaobjetos de la siguiente manera: 20

- 10 inmersiones en alcohol 50 % v/v;

- Sumergir en solución de hematoxilina de Harris durante 3 minutos;

- Enjuagar con agua corriente;

- 10 inmersiones en Alcohol Acido (1% Ac. Clorhídrico);

- Enjuagar con agua corriente; 25

- 10 inmersiones en Alcohol 95 % v/v;

- Sumergir en solución OG-6 durante 30 segundos;

- 10 inmersiones en alcohol 96 % v/v;

- Sumergir en solución de eosina durante 1 minuto;

- 10 inmersiones en alcohol 96 % v/v; 30

- 10 inmersiones en alcohol 86 % v/v; y

- 10 inmersiones en xilol

Las preparaciones se analizaron por personal entrenado y utilizando una codificación y a ciego simple para eliminar el sesgo del observador.

35

Las muestras se identificaron en las siguientes fases: diestro, proestro, estro, metaestro, anestro o no evaluable. La ciclicidad de las cuatro fases en periodos de 4 a 6 días, son indicadores de un ciclo estral normal, mientras que la ausencia de esta ciclicidad y la persistencia en fases anestro, diestro o proestro son indicadores de la ausencia del ciclo estral. 5

De los 10 ratones hembra sometidos a estudio, en la Tabla 1 se resumen las fases del ciclo estral de los frotis vaginales realizadas a 6 de estos ratones hembras IRS2-/- .

Tabla 1 10

Nº Ratón: Tiempo (días)

-8: -5 -2 -1 7 8 14 15 22

72: A A P D E E-M E E A

898: D D P P E E E-M M M

926: D D P P E-M E-M D E P

928: D-P D P P E E E-M M A

942: A D P P E E-M E-M A D

972: D D - P M M - D D

Las fases del ciclo estral son las siguientes: A: Anestro; D: diestro; P: Proestro; E: Estro; y M: metaestro.

Las fases del ciclo estral encontrados en los frotis vaginales de los ratones hembras IRS2-/- 15 de la Tabla 1 muestran que durante el periodo de pre-tratamiento todos los ratones se encontraban en fase proestro (P) o diestro (D), es decir en ausencia de ciclo estral.

Mientras que tras el inicio de la administración de tungstato, se observa que los ratones hembras IRS2-/- se encuentran en fases tardías del ciclo estral, estro (E) y metaestro(M), lo 20 que es indicador de la recuperación del ciclo estral normal.

Estos resultados indican que la administración de una sal de tungsteno (VI) permite la recuperación rápida (al séptimo día de tratamiento) del ciclo estral en ratones hembra infértiles IRS2-/- no diabéticas en el 100% de ratones analizados.

Resultados del Estudio de implantación y embarazo 5

Transcurrido el periodo de cruce del método del apartado B, las hembras fueron sacrificadas y se llevaron a cabo biopsias en busca de indicios de embarazo.

En la tabla 2 se resume la edad en el momento del tratamiento, si hubo embarazo y el número de embriones por hembra. 10

Tabla 2

Nº Ratón: Edad (meses) al inicio del Embarazo Número de embriones Implantados o crías nacidas

tratamiento: cruce

72: 10 12 SI 1 cría

942: 10 12 SI 8 crías

928: 10 12 SI 7 embriones

931: 10 12 SI 3 crías

898: 10 12 SI 7 embriones

900: 10 12 NO -

921: 10 12 SI 6 embriones

926: 10 12 SI 8 crías

972: 8 10 NO -

973: 8 10 SI 7 embriones

Los resultados de la Tabla 2 muestran que mientras que la tasa de embarazo de los ratones hembra IRS2-/- sin tratar es del 9%, la tasa de embarazo de los ratones hembra IRS2-/- 15 tratados con tungstato se incrementa hasta el 80%.

Además, estos resultados también muestran que la media de crías/embriones implantados por ratón hembra embarazo es de aproximadamente 5, número que se puede considerar comparable al número de crías de un ratón hembra.

Así, los resultados de las Tablas 1 y 2 demuestran que una sal de tungsteno (VI) es un 5 tratamiento eficaz para la recuperación de la ovulación y/o el aumento de la implantación del oocito. Así, la administración de una sal de tungsteno (VI) tal y como se define en la presente invención es eficaz para el tratamiento de la infertilidad en mamíferos hembras no diabéticos.

10

EJEMPLO 3. ESTUDIO DE GLUCEMIA Y PESO CORPORAL

A. Animales

6 ratones hembra IRS2-/- de edades comprendidas entre 6 y 8 semanas.

Los ratones hembras se estabularon en condiciones normales, es decir ciclo luz/oscuridad 12h y temperatura y humedad controladas. Los animales se alimentaron a voluntad (también 15 denominado ad libitum) con dieta de pienso estándar.

B. Método

Fase de tratamiento

Tras un periodo de aclimatación, el tungstato sódico fue administrado en el agua de bebida 20 (ad libitum) mediante una solución de 2 mg/ml de tungstato sódico dihidrato (comercializado por Carlo Erba) en agua destilada tras la fase de pre-tratamiento (día 0 de tratamiento) y durante 12 días.

C. Resultados 25

En los días 0, 2, 5, 7, 9 y 12 del período de tratamiento se monitorizó el peso corporal, y tras las 6 horas de ayuno de cada uno de los días mencionados anteriormente se determinó la glucosa en sangre, mediante la extracción de sangre de la vena caudal y con un sensor de glucosa (AccuTrend glucose sensor Roche. Mannheim, Germany).

30

En la tabla 3 se resumen los niveles de glucemia expresados en mg/dl, y en la tabla 4 se resume el peso corporal de los ratones en estudio expresada en gramos.

Tabla 3

Glucemias (mg/dl): R1327 R1345 R1347 R1354 R1376 R1381 Promedio

Día 0: 146 129 115 126 141 112 128,17

Día 2: 136 128 118 110 105 107 117,33

Día 5: 125 142 114 111 137 105 122,33

Día 7: 140 110 106 89 133 135 118,83

Día 9: 125 153 109 108 131 125 125,17

Día 12: 136 116 111 86 123 141 118,83

Tabla 4

Peso corporal (g): 1327 1345 1347 1354 1376 1381 Promedio

Día 0: 22,7 15,33 18,21 16,5 13,99 15,45 17,03

Día 2: 22,9 14,84 18,98 17,01 14,18 16,04 17,33

Día 5: 22,61 14,89 18,2 16,61 13,79 15,72 16,97

Día 7: 22,42 15,07 17,81 16,35 13,74 15,66 16,84

Día 9: 22,85 15,56 17,9 16,89 14,5 16,39 17,35

Día 12: 23,15 15,91 18,24 17,19 14,92 16,89 17,72

Los resultados de la Tabla 3 y 4 muestran que durante la administración de tungstato sódico 5 no se observan variaciones en el peso corporal ni en la glucemia en los primeros 12 días de tratamiento, el mismo período durante el cual a partir del 7 día de tratamiento ya se consigue la restablecer de la ovulación en los ratones hembras ensayados (cf. Tabla 1).

Así, los resultados de las Tablas 1 a 4 demuestran que una sal de tungsteno (VI) es un 10 tratamiento eficaz para la recuperación de la ovulación y/o el aumento de la implantación del oocito, de manera independiente de cambios en el peso corporal y cambios en el metabolismo de los carbohidratos. Así, se demuestra que la administración de una sal de tungsteno (VI) tal y como se define en la presente invención o una composición que contiene tal sal de tungsteno (VI) tiene un efecto directo sobre el sistema reproductor femenino y por 15

lo tanto es eficaz para favorecer la fertilidad y la reproducción normal en mamíferos hembra no diabéticos.

EJEMPLO 4. ESTUDIO DE LA ADHERENCIA EMBRIONARIA EN EL ENDOMETRIO

A. Modelo 5

Para determinar el efecto del tungstato sódico sobre la receptividad endometrial, se utilizó un modelo de adhesión embrionaria humano-humano “in vitro”, compuesto de la línea celular endometrial HEC1-A y la línea celular de trofoectodermo humano JEG-3.

La línea JEG-3, línea celular que simula las células del trofoectodermo de un embrión 10 humano, son células que se crecen en monocapa en el laboratorio, usando placas de baja adherencia, son capaces de formar esferoides que simulan al embrión humano; esta es una de las líneas celulares más usadas para realizar ensayos de adhesión embrionaria in vitro

B. Método 15

Las líneas celulares se adquirieron comercialmente (American Type Culture Collection (ATCC); Rockville, MD, USA) para realizar los experimentos de adherencia embrionaria en el endometrio. Se descongelaron y expandieron durante 4 pases para disponer de suficientes células para realizar todos los ensayos.

20

Las células HEC1-A se plantaron en placas de 24 pocillos y cultivaron con medio de cultivo McCoy 5A, suplementado con 10% suero fetal bovino y 0,1% de antibióticos (fungizona y penicilina), hasta llegar a una confluencia del 90%. Tras alcanzar la confluencia se añadió al medio de cultivo tungstato sódico, a una concentración final de 10 , así como Withaferrin A (como control, compuesto que evita la adhesión embrionaria) o medio de cultivo (datos de 25 adhesión basal), sin ningún componente adicional, durante 24 horas.

Las células JEG-3 se plantaron en placas de baja adhesividad con medio de cultivo ‘Eagle’s minimal essential medium’ (EMEM), suplementado con 10% suero fetal bovino y 0,1% de antibióticos (fungizona y penicilina). 24 horas antes del ensayo de adhesión se realizó la 30 formación de los esferoides trofoblásticos JEG-3 a partir de este cultivo. Para ello, se suspendieron en un Erlenmeyer en agitación células JEG-3 en el medio previamente descrito a una concentración de 6x105 células/6ml. Los esferoides resultantes se recogieron para el ensayo de adhesión.

35

Para el ensayo de adhesión, tras 24h de cultivo de las células HEC-1A con con medio de cultivo añadiendo tungstato sódico, Withaferrin A o sin adicionar ningún tratamiento, se cambió el medio de cultivo por medio de cultivo fresco sin tratamientos en estudio. Se añadieron los esferoides de trofoectodermo sobre la monocapa de células HEC-1A, colocando de 6 a 10 esferoides por pocillo. La adhesión de los esferoides se midió a los 60 5 minutos, contabilizando como esferoide no adherido aquel que se encontraba flotando en el medio de cultivo y esferoide adherido el que no se encontraba flotando. El examen se realizó con un microscopio invertido (Nikon Diaphot 300; Nikon Corp., Tokyo, Japan). El ensayo se realizó por triplicado.

10

C. Resultados

Los resultados obtenidos están recogidos en la tabla 5. Se observó un mayor porcentaje de adhesión embrionaria en las condiciones en las que las líneas HEC-1A fueron tratadas con el tungstato sódico frente a aquellas en las que no lo estuvo. No se observa ninguna adhesión en las células tratadas con el control negativo (C-) Withaferrin A. 15

Tabla 5

: Tasas Absolutas de Adhesión

: Exp1 Exp2 Exp3 Media

Adhesión Basal: 12% 48% 31% 30%

Tungstato sódico 10 μM: 31% 65% 35% 44%

Withaferrin A (C-): 0% 0% 0% 0%

COMPOSICIONES PARTICULARES DE LA INVENCIÓN

A continuación se preparan composiciones alimentarias según la invención, a modo ilustrativo. En ningún caso deben ser interpretadas como limitantes del alcance de la 20 invención.

EJEMPLO 5

Se prepara un aliño de ensalada enriquecido con una sal de tungsteno. Se añade a 250 gr de un aliño disponible comercialmente una cantidad de 25 mg de Na2WO4 (100 mg/kg) y se 25 agita mecánicamente durante 30 minutos.

EJEMPLO 6

Se prepara una salsa tipo kétchup, enriquecida con una sal de tungsteno. Para ello se añaden 170 mg de Ca WO4 a 200 gr de kétchup comercialmente disponible y se agita 30 mecánicamente durante 1 h.

EJEMPLO 7

Se prepara leche enriquecida con una sal de tungsteno. Para ello se dispone 1kg de leche de vaca entera, se añaden 150 mg de ZnWO4 y se agita mecánicamente durante 20 minutos. Inmediatamente antes de su consumo se recomienda agitar el envase.

5

EJEMPLO 8

Se prepara un zumo de fruta enriquecida con una sal de tungsteno. Se añaden 500 mg de MgWO4 a 1 kg de zumo comercial y se agita mecánicamente durante 10 minutos. Inmediatamente antes de su consumo se recomienda agitar el envase.

10

EJEMPLO 9

Se preparan comprimidos recubiertos con la siguiente composición:

Celulosa microcristalina PH200 (Diluyente/deslizante) 250,00 mg

Sílice coloidal anhidra (Deslizante/adsorbente) 3,00 mg

Estearato de magnesio (Lubrificante) 5,00 mg 15

Talco (Lubrificante) 7,00 mg

Opadry® blanco (Opadry® y-1-7000 White)(*) (Película de recubrimiento) 8,00 mg

Tungstato sódico dihidratado 200,00 mg

(*) Mezcla de hidroxipropilmetilcelulosa, polietilenglicol 6000 y dióxido de titanio (E-171)

20

EJEMPLO 10

Se preparan comprimidos efervescentes con la siguiente composición:

Sorbitol, aspartamo, sucralosa y xilitol (edulcorantes) 0,025mg por cada 10 mg

Carbonato cálcico 0,350mg por cada 10 mg

Ácido cítrico (acidulante) 0,650mg por cada 10 mg 25

Carbonato ácido de sodio (corrector de la acidez) 0,350mg por cada 10 mg

Aroma de naranja 0,25mg por cada 10 mg

Sal de tungsteno

Ejemplo 11 30

Se preparan cápsulas de gelatina con la siguiente composición:

Nifedipina 6 mg

Goma de xantano 5 mg

Sabor de naranja 0,3 mg

Acido cítrico 0,4 mg 35

Gelucire 44/14 90 mg

Celulosa microcristalina PH10 (Diluyente) 92,00 mg/cápsula

Tungstato sódico dihidratado 100,00 mg/cápsula

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de una sal de tungsteno (VI) o un solvato de la misma, para la preparación de una composición alimentaria para favorecer la fertilidad y la reproducción normal en un mamífero hembra no diabético. 5
2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración total de sales de tungsteno en la composición es igual o superior a 100 mg/kg.
3. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el 10 mamífero es humano.
4. Uso según la reivindicación 3, caracterizado porque la administración de la composición se realiza en una dosis diaria de entre 0,001 mg y 1000 mg de sal de tungsteno (VI) por cada kg de peso corporal del mamífero hembra. 15
5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la sal comprende un anión de tungsteno (VI) y un catión dietéticamente o farmacéuticamente aceptable.

20
6. Uso según la reivindicación 5, caracterizado porque el catión es un catión alcalino o alcalinotérreo.
7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, caracterizado porque el catión se selecciona entre el grupo que consiste en sodio, potasio, magnesio , calcio 25 y zinc.
8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la sal de tungsteno (VI) es la sal sódica de tungsteno (VI).

30
9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado porque el anión de tungsteno (VI) se selecciona de los iones WO42−, HWO4−, W2O72− y HW2O7−.
10. Uso según la reivindicación 9, caracterizado porque el anión es WO42−.

35
11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el solvato es el dihidrato.
12. Uso según las reivindicaciones 6 a 11, caracterizado porque el solvato de sal de tungsteno (VI) es el dihidrato y el catión es un catión sódico. 5
13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la composición es una composición líquida o una bebida.
14. Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque la composición líquida o bebida 10 se selecciona del grupo que consiste en leche de origen animal o vegetal así como sus derivados, tales como batidos, yogur y kéfir; zumos de frutas y/u hortalizas; agua sin gas, agua con gas y agua aromatizada o edulcorada; condimentos; bebidas alcohólicas; té; café; y bebidas refrescantes o refrescos.

15
15. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la composición es una composición sólida.
16. Uso según la reivindicación 15, caracterizado porque la composición sólida se selecciona entre derivados de leche de origen animal o vegetal, tales como queso, 20 mantequilla, margarina y tofu; harinas; panes; pasta; productos de bollería, incluyendo bizcochos y galletas; gelatinas, caramelos, gominolas; infusiones, té o café; condimentos.
17. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la 25 composición alimentaria es un suplemento o complemento nutricional.
18. Uso según la reivindicación 17, caracterizado porque comprende al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable y se presenta en forma de píldora, tableta, pastilla, cápsula, polvo, oblea, polvo o comprimido efervescentes, 30 disolución, suspensión, jarabe o gránulos.
19. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la composición comprende sacarosa.

35
20. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el mamífero femenino no diabético se selecciona del grupo de mamíferos que necesitan restaurar y/o potenciar la ovulación, mejorar la calidad del oocito o del embrión, aumentar la implantación del cigoto en la pared uterina, regular una alteración del eje hipotalámico-hipofisario, incluyendo síndrome de ovario 5 poliquístico, síndrome metabólico, hiperprolactinemia, endometriosis, hipotiroidismo, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso, cirrosis, artritis reumatoide, celiaquía, fallo renal crónico, causas idiopáticas y desórdenes alimentarios, tales como anorexia nerviosa y bulimia.

10
21. Una composición alimentaria, caracterizada porque comprende una sal de tungsteno (VI) o un solvato de la misma en una concentración igual o mayor de 100 mg/kg.
22. Composición según la reivindicación 21, caracterizada porque la sal comprende un anión de tungsteno (VI) y un catión dietéticamente o farmacéuticamente aceptable. 15
23. Composición según la reivindicación 22, caracterizada porque el catión es un catión alcalino o alcalinotérreo.
24. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 22 y 23, caracterizada 20 porque el catión se selecciona entre el grupo que consiste en sodio, potasio, magnesio y calcio y zinc.
25. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, caracterizada porque la sal de tungsteno (VI) es la sal sódica de tungsteno (VI). 25
26. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, caracterizada porque el anión de tungsteno (VI) se selecciona de los iones WO42−, HWO4−, W2O72− y HW2O7−.

30
27. Composición según la reivindicación 26, caracterizada porque el anión es WO42−.
28. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, caracterizada porque el solvato es el dihidrato.

35
29. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 28, caracterizada porque el solvato de sal de tungsteno (VI) es el dihidrato y el catión es un catión sódico.
30. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 29, caracterizada 5 porque es una composición líquida o una bebida, una composición sólida o un suplemento o complemento nutricional.
31. Composición según la reivindicación 30, caracterizada porque es una composición líquida o una bebida según se define en la reivindicación 14. 10
32. Composición según la reivindicación 30, caracterizada porque es una composición sólida según se define en la reivindicación 16.
33. Composición según la reivindicación 30, caracterizada porque la composición 15 alimentaria es un suplemento o complemento nutricional según se define en la reivindicación 18.
34. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 33, caracterizada porque comprende sacarosa. 20