ES2552337T3 - Procedimientos para la preparación de plasminógeno - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la preparación de plasminógeno, comprendiendo el procedimiento: (a) expresar un plasminógeno recombinante utilizando un sistema de expresión recombinante en condiciones de expresión suficientes para producir un cuerpo de inclusión de plasminógeno recombinante; (b) poner en contacto el cuerpo de inclusión de plasminógeno recombinante con un tampón de solubilización en condiciones de solubilización suficientes para obtener un cuerpo de inclusión de plasminógeno recombinante solubilizado; (c) poner en contacto el cuerpo de inclusión de plasminógeno recombinante solubilizado con una solución de replegamiento en condiciones de replegamiento para obtener una composición que comprende el plasminógeno recombinante, en el que se añade PEG o sulfato de amonio a la solución de replegamiento en condiciones de precipitación, en el que la solución de replegamiento comprende el plasminógeno y polipéptidos agregados, en el que el plasminógeno es plasminógeno replegado, en el que las condiciones de precipitación son suficientes para precipitar todas o una parte sustancial de las proteínas agregadas; (d) diafiltrar la composición después de la etapa (c); (e) poner en contacto la composición con un medio de intercambio catiónico en condiciones de intercambio iónico que son suficientes para que el medio de intercambio catiónico se una al plasminógeno recombinante; (f) eluir el plasminógeno recombinante capturado por el medio de intercambio catiónico para obtener un eluato del medio de intercambio catiónico que comprende el plasminógeno recombinante; (g) poner en contacto el eluato del medio de intercambio catiónico con un primer medio de afinidad en una primera condición de afinidad que es suficiente para que el primer medio de afinidad se una al plasminógeno recombinante; y (h) eluir el plasminógeno recombinante al que se unió por el primer medio de afinidad para obtener una solución de plasminógeno que comprende el plasminógeno recombinante.
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También se contempla que se pueden producir plasminógenos recombinantes mediante procedimientos de síntesis en fase sólida. Véase Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1.985); y la patente de Estados Unidos No. 4.631.211 de Houghten y otros (1986).
Los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de un porcentaje de identidad indicado con respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia de la SEQ ID NO: 1 se pueden determinar utilizando los procedimientos, incluyendo los procedimientos asistidos por ordenador, indicados anteriormente con respecto a polinucleótidos. Las secuencias de aminoácidos del polipéptido se examinan y se comparan, al igual que las secuencias de nucleótidos en la descripción anterior. Un experto en la materia entenderá que conceptos, tales como los puntos finales moleculares descritos para los polinucleótidos tendrán análogos directos cuando se considera la utilización correspondiente de dichos procedimientos y programas para el análisis de polipéptidos. Por ejemplo, las correcciones manuales descritas con respecto a polinucleótidos se refieren a los puntos de los extremos 5' y 3' de los ácidos nucleicos, pero la misma descripción se entenderá como aplicable a los extremos N-terminal y C-terminal de los polipéptidos.
La presente invención también abarca polipéptidos de plasminógeno recombinante que se modifican diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Se pueden llevar a cabo cualquiera de las numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a éstas, la escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8 de S. aureus, NaBH4; acetilación, desamidación, formilación, metilación, oxidación, reducción; síntesis metabólica en presencia de tunicamicina; etc.
Entre las modificaciones adicionales posteriores a la traducción comprendidas por la presente invención se incluyen, por ejemplo, cadenas de carbohidratos unidas a N o unidas a O, procesamiento de los extremos N-terminal o C-terminal, unión de grupos químicos a la estructura de aminoácidos, modificaciones químicas de cadenas de carbohidratos unidas a N o unidas a O, y la adición de un residuo de metionina N-terminal como resultado de vectores y construcciones adaptadas para la expresión de los polipéptidos de plasminógeno recombinante, por ejemplo para la expresión en células huésped cultivadas procariotas. En algunas realizaciones, el plasminógeno recombinante también se puede modificar, por ejemplo, con un marcador de afinidad (por ejemplo, marcas de His, marcas de GST) o un marcador detectable, tal como un marcador enzimático, fluorescente o isotópico.
D. Vectores y células huésped
El procedimiento para la preparación de plasminógeno o una plasmina preparada a partir del mismo comprende expresar el plasminógeno recombinante utilizando un sistema de expresión recombinante.
El origen de la célula huésped para la expresión de la proteína no debe limitarse, por ejemplo, la célula huésped puede ser, por ejemplo, microorganismos, tales como bacterias (por ejemplo, las que pertenecen al género Escherichia y las que pertenecen al género Bacillus) y levaduras (por ejemplo, el género Saccharomyces y el género Pichia). Por ejemplo, el género Escherichia incluye, pero sin limitarse a éstos, Escherichia coli (E. coli) K12DH1, M103, JA221, HBl101, X600, azul XL-1 y JM109. Por ejemplo, el género Bacillus incluye, pero sin limitarse a éstos, Bacillus subtilis MI114 y 207-21. Por ejemplo, la levadura incluye, pero sin limitarse a éstas, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R.sup.-, NA87-11A y DKD-5D y Pichia pastoris. La patente de Estados Unidos No. 6.068.995 divulga la producción de una proteína mediante una célula huésped capaz de expresar la proteína deseada.
Por ejemplo, se puede insertar una molécula que tiene la secuencia codificante de plasminógeno (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) en un vector de clonación apropiado para la expresión en una célula huésped. El vector de clonación se puede construir para proporcionar las funciones reguladoras apropiadas requeridas para la transcripción, la traducción y el procesamiento eficaz de la secuencia codificante. Entre las células huésped adecuadas para expresar el ADN que codifica el plasminógeno se incluyen células procariotas, levaduras, o células eucariotas superiores. Entre las procariotas adecuadas se incluyen, por ejemplo, bacterias, tales como arqueobacterias y eubacterias. Las bacterias preferentes son eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae, tales como E. coli. Además, el vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, un fago, un vector viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser de replicación competente o de replicación defectuosa. En este último caso, la propagación viral se producirá, en general, sólo en células huésped cultivadas de complementación. En una realización, el sistema de expresión recombinante es un sistema de expresión basado en
E. coli.
Además de las procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos o levaduras filamentosas, también pueden ser huéspedes de expresión adecuados para los vectores que codifican el plasminógeno. Por ejemplo, se puede utilizar Saccharomyces cerevisiae. En otra realización, el sistema de expresión recombinante es un sistema de expresión basado en Pichia. Sin embargo, un conjunto de otros géneros, especies y cepas están habitualmente disponibles y son útiles en el presente documento.
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procedimientos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis y otros, Basic Methods in Molecular Biology (“Procedimientos básicos en biología molecular”), 2ª edición (1995).
La transcripción del ADN que codifica los plasminógenos de la presente invención por eucariotas superiores se puede aumentar mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan para aumentar la actividad transcripcional de un promotor en un tipo de célula huésped cultivada determinada. Entre los ejemplos de potenciadores se incluyen el potenciador de SV40, que se encuentra en el lado tardío del origen de replicación en los pb 100 a 270, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus.
Para la secreción de la proteína traducida en el lumen del retículo endoplasmático, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, se pueden incorporar señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.
En diversas realizaciones, los plasminógenos se pueden expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y pueden incluir no sólo señales de secreción, sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Por ejemplo, se puede añadir una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, al extremo N-terminal, por ejemplo, el polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula huésped cultivada, durante la purificación, o durante la posterior manipulación y almacenamiento. Además, se pueden añadir grupos peptídicos al polipéptido para facilitar la purificación. Dichas regiones se pueden eliminar antes de la preparación final del polipéptido. La adición de grupos peptídicos a polipéptidos para generar la secreción o la excreción, para mejorar la estabilidad y para facilitar la purificación, entre otros, son técnicas familiares y rutinarias en el sector de la técnica. Una proteína de fusión preferente comprende una región heteróloga de inmunoglobulina que es útil para solubilizar proteínas. Por ejemplo, el documento EP 0 464 533 A1 (su homólogo canadiense, 2.045.869) da a conocer proteínas de fusión que comprenden diversas partes de la región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína humana o parte de la misma. En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es completamente ventajosa para utilizar en terapia y en diagnóstico y, de este modo, da lugar, por ejemplo, a propiedades farmacocinéticas mejoradas. Por otro lado, para algunas utilizaciones sería deseable poder eliminar la parte de Fc después de que la proteína de fusión se haya expresado, detectado y purificado de la manera ventajosa descrita. Este es el caso cuando la parte de Fc resulta ser un obstáculo para utilizar en terapia y diagnóstico, por ejemplo, cuando la proteína de fusión se va a utilizar como antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, las proteínas humanas se han fusionado con partes de Fc con el objetivo de ensayos de cribado de alto rendimiento (tales como receptor de hIL5 para identificar antagonistas de hIL-5). Véase, Bennett, D., y otros, J. Molecular Recognition, 8: 52-58 (1995) y Johanson, K. y otros, J. Biol. Chem., 270 (16): 9459 -9471 (1995).
En una realización, se aísla el plasminógeno insoluble de las células huésped procariotas en un tampón de aislamiento adecuado. Por ejemplo, las células huésped se pueden exponer a un tampón de fuerza iónica adecuada para solubilizar la mayoría de proteínas del huésped, pero en el que el plasminógeno agregado es sustancialmente insoluble, y rompiendo las células para liberar los cuerpos de inclusión y así tenerlos disponibles para su recuperación, por ejemplo, mediante centrifugación. Esta técnica es conocida por un experto en la materia, y se describe una variación, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos No. 4.511.503, que divulga un procedimiento de solubilización de proteínas heterólogas producidas en una forma refráctil insoluble en un cultivo de células huésped recombinantes. La etapa de expresión del plasminógeno recombinante comprende realizar el sistema de expresión en condiciones de expresión suficientes para producir un cuerpo de inclusión de plasminógeno recombinante.
Sin estar vinculado a ninguna teoría particular, se cree que la expresión de una proteína recombinante, por ejemplo, en E. coli, da lugar con frecuencia a la deposición intracelular de la proteína recombinante en agregados insolubles denominados cuerpos de inclusión. La deposición de proteínas recombinantes en cuerpos de inclusión puede ser ventajosa, tanto porque los cuerpos de inclusión acumulan proteína recombinante altamente purificada, como porque la proteína secuestrada en cuerpos de inclusión está protegido de la acción de proteasas bacterianas.
En general, las células huésped (por ejemplo, células de E. coli) se recogen después de una cantidad apropiada de crecimiento y se suspenden en un tampón adecuado antes de la rotura por lisis utilizando técnicas, tales como, por ejemplo, procedimientos mecánicos (por ejemplo, oscilador sónico), o mediante procedimientos químicos o enzimáticos. Entre los ejemplos de procedimientos químicos o enzimáticos de rotura celular se incluyen la acción de esferoplastos, que comprende la utilización de lisozima para lisar la pared bacteriana, y el choque osmótico, que implica el tratamiento de células viables con una solución de tonicidad elevada y con un lavado en agua fría de tonicidad baja para liberar los polipéptidos.
Después de la rotura de la célula huésped, la suspensión se centrifuga habitualmente para sedimentar los cuerpos de inclusión. El sedimento resultante contiene sustancialmente la totalidad de la fracción de polipéptido insoluble, pero si el proceso de rotura celular no es completo, también puede contener células intactas o fragmentos de células rotas. La completación de la rotura celular se puede analizar mediante la resuspensión del sedimento en una
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una concentración apropiada, y se agita la mezcla para disolver el PEG o sulfato de amonio y se permite que tenga lugar la precipitación resultante de la proteína agregada. Después de un tiempo de precipitación, se puede extraer el precipitado mediante uno o más procedimientos de aclarado (por ejemplo, filtración de profundidad, centrifugación, microfiltración, etc., y combinaciones de los mismos), preferentemente, mediante filtración de profundidad. El filtrado resultante se puede someter a continuación a un procesamiento adicional para preparar el plasminógeno recombinante.
Entre los ejemplos de PEG se incluyen, pero sin limitarse a éstos, PEG 200, PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1000, PEG 2000, PEG 3350, PEG 4000, PEG 4600, PEG 5000, PEG 6000 y PEG 8000. En una realización, se añade un PEG a una solución de replegamiento en condiciones de precipitación, en la que la solución de replegamiento comprende el plasminógeno y polipéptidos agregados, en la que el plasminógeno es plasminógeno replegado, en la que las condiciones de precipitación son suficientes para precipitar la totalidad o una parte sustancial de las proteínas agregadas. En otras realizaciones, se añade el PEG para alcanzar concentraciones finales de PEG, como mínimo, de aproximadamente el 1% (p/v), de manera ilustrativa, aproximadamente el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, y 20% (p/v). En algunas realizaciones, se realiza una primera precipitación con PEG y, como mínimo, una precipitación adicional con PEG.
En otras realizaciones, se añade sulfato de amonio (por ejemplo, sulfato de amonio sólido) a la solución de replegamiento para alcanzar concentraciones finales de sulfato de amonio correspondientes, como mínimo, a aproximadamente el 1% de saturación, de manera ilustrativa, como mínimo, aproximadamente el 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 y 70%,
En una realización, el filtrado resultante (después de la precipitación con PEG o sulfato de amonio) puede ponerse en contacto con un medio de cromatografía de interacción hidrófoba adecuado en condiciones de interacción hidrófoba adecuadas suficientes, de manera que el medio de cromatografía de interacción hidrófoba captura, preferentemente, el plasminógeno. El medio de interacción hidrófoba puede ser una fase sólida que se une al plasminógeno. El medio de cromatografía de interacción hidrófoba puede seleccionarse entre cualquiera del grupo de medios de cromatografía descritos habitualmente como medio de interacción hidrófoba. El medio puede poseer una química o un ligando acoplado al mismo que puede permitir la captura selectiva o preferente del plasminógeno. Los medios de cromatografía útiles comprenden un soporte y uno o más ligandos unidos al mismo que proporcionan la capacidad de unión selectiva o preferente al plasminógeno. Entre los soportes útiles se incluyen, a modo de ejemplo ilustrativo, polisacáridos, tales como agarosa y celulosa, polímeros orgánicos, tales como poliacrilamida, metacrilato de metilo, y copolímeros de poliestireno-divinilbenceno. Se debe entender que en el presente documento no se pretende dar a entender que sólo son adecuados sustratos orgánicos para la utilización como sustrato del medio, ya que también se pueden utilizar materiales de soporte inorgánicos, tales como sílice y vidrios de borosilicato.
En algunas realizaciones, el medio de interacción hidrófoba está en forma de micropartículas, que, en general, pueden ser esféricas, o de forma alternativa, el segundo medio de afinidad se puede disponer de manera útil en partículas o formas divididas que tienen otras formas regulares o irregulares. En una realización, el medio puede estar en forma de membrana. El medio de interacción hidrófoba puede ser de carácter poroso o no poroso y el medio puede ser compresible o incompresible. Los medios de interacción hidrófoba preferentes serán física y químicamente resistentes a las condiciones empleadas en el proceso de purificación. En la técnica se conocen una amplia variedad de medios de interacción hidrófoba, por ejemplo, aquellos en los que el ligando acoplado es un grupo fenilo, octilo o butilo.
En una realización, el medio de interacción hidrófoba comprende un ligando acoplado a un soporte, en el que el ligando es un grupo fenilo, en el que el soporte es una agarosa. Por ejemplo, la cromatografía de interacción hidrófoba se puede realizar en un formato de columna fenil-Sepharose®.
En algunas realizaciones, después de la extracción de los agregados de plasminógeno precipitados mediante centrifugación o filtración, el sobrenadante/filtrado resultante que comprende el plasminógeno recombinante replegado correctamente, opcionalmente, se captura y se purifica directamente mediante cromatografía de interacción hidrófoba.
Si se desea, la utilización de precipitación selectiva y/o cromatografía de interacción hidrófoba puede, aunque no necesariamente, sustituir dichas una o más etapas de filtrado/diafiltración de la mezcla de replegamiento, proporcionando así una estrategia alternativa a la purificación de la proteína recombinante.
En algunas realizaciones, después de la etapa o etapas de someter la mezcla de replegamiento a una o más etapas de filtrado/diafiltración y/o una etapa de precipitación selectiva y/o cromatografía de interacción hidrófoba, la solución resultante que comprende el plasminógeno recombinante puede purificarse adicionalmente mediante contacto de la solución resultante con el medio de intercambio catiónico (por ejemplo, SP-Sepharose®) y/o el primer medio de afinidad (por ejemplo, columna de ECH-lisina).
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En una realización, el material proteico es un fragmento de estreptoquinasa que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 45 kD, tal como se determina mediante electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes, por ejemplo. En otra realización, el fragmento tiene un peso molecular de aproximadamente 40, 25, 15, 10 kD o menos. En algunas realizaciones, el fragmento tiene un peso molecular de aproximadamente 15 kD.
En una realización, antes del contacto de la composición que comprende la plasmina con el intercambiador aniónico, se ajusta el pH de la composición para que sea menor que el pI de la plasmina, pero mayor que el pI del material proteico a separar de la plasmina. En algunas realizaciones, se ajusta el pH de la composición para que sea de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10,0, de manera ilustrativa, aproximadamente: 10, 9,9, 9,8, 9,7, 9,6, 9,5, 9,4, 9,3, 9,2, 9,1, 9, 8,9, 8,8, 8,7, 8,6, 8,5, 8,4, 8,3, 8,2, 8,1, 8, 7,9, 7,8, 7,7, 7,6, 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, 7,1, 7, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1 y 5. En otra realización, se ajusta el pH de la composición para que sea de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7. En otras realizaciones, se ajusta el pH de la composición para que sea de aproximadamente 7 a aproximadamente 8. En todavía otras realizaciones, se ajusta el pH de la composición para que sea de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8.
En diversas realizaciones, el material proteico es un activador de plasminógeno o un fragmento del mismo. En una realización, la composición que comprende la plasmina es una solución de activación en la que un plasminógeno es convertido por un activador de plasminógeno para formar la plasmina. En algunas realizaciones, la solución de activación (que comprende la plasmina formada en la misma) se pone en contacto directamente con el intercambiador aniónico, en el que antes del contacto, se ajusta el pH de la solución de activación, si es necesario. En otra realización, antes del contacto de la solución de activación con el intercambiador, la solución de activación se somete a una o más etapas de purificación de la plasmina, tales como, pero sin limitarse a éstas, filtración, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico y/o cromatografía de interacción hidrófoba. Por consiguiente, en algunas realizaciones, se puede poner en contacto un eluato o una composición de flujo pasante obtenidos a partir de dicha una o más etapas de purificación de plasmina con el intercambiador aniónico después del ajuste apropiado del pH del eluato o la composición de flujo pasante, si es necesario.
Por ejemplo, en una realización, en la que la plasmina comprende un pI de aproximadamente 9 o superior, en la que el material a separar es un fragmento de estreptoquinasa (por ejemplo, un fragmento que tiene un peso molecular de aproximadamente 15 kD o menos) que tiene un pI de aproximadamente 5, se puede ajustar el pH de la composición para que sea de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, para realizar la unión del fragmento (es decir, el material), pero no la plasmina, al intercambiador.
A modo de otro ejemplo, en otras realizaciones, en las que la plasmina comprende un pI de aproximadamente 7 a aproximadamente 8, en las que el material a separar es un fragmento de estreptoquinasa (por ejemplo, un fragmento que tiene un peso molecular de aproximadamente 15 kD o menos) que tiene un pI de aproximadamente 5, se puede ajustar el pH de la composición para que sea de aproximadamente 6 a aproximadamente 7, para realizar la unión del fragmento (es decir, el material), pero no la plasmina, al intercambiador.
En algunas realizaciones, los procedimientos pueden llevarse a cabo en lotes o como procesos continuos.
En otras realizaciones, la solución de flujo pasante obtenida a partir del intercambiador aniónico se puede someter a un procesamiento adicional que incluye la purificación adicional de la plasmina contenida en la misma y/o la reducción de cualquier patógeno que pueda estar contaminando la plasmina. En algunas realizaciones, la purificación adicional se realiza mediante etapas de filtración adicionales (por ejemplo, nanofiltración) y/o etapas de cromatografía, incluyendo, pero sin limitarse a éstas, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de interacción hidrófoba.
El procedimiento para la preparación de plasmina comprende poner en contacto la solución de activación con un medio de intercambio aniónico en condiciones de intercambio aniónico para obtener un flujo pasante en el intercambiador aniónico que comprende la plasmina, en el que las condiciones de intercambio aniónico son tales que el medio de intercambio aniónico se une, preferentemente, al activador de plasminógeno con respecto a la plasmina.
El medio de intercambio aniónico puede ser una fase sólida que se une al activador de plasminógeno presente en la solución de activación. El medio de cromatografía de intercambio aniónico se puede seleccionar entre cualquiera del grupo de medios de cromatografía descritos habitualmente como medios de intercambio aniónico, preferentemente, un intercambiador de aniones fuertes. El medio puede poseer una química o un ligando acoplado al mismo que puede permitir la captura selectiva o preferente del activador de plasminógeno de la solución de activación. Los medios de cromatografía útiles comprenden un soporte y uno o más ligandos unidos al mismo que proporcionan la capacidad de unión selectiva o preferente al plasminógeno recombinante. Entre los soportes útiles se incluyen, a modo de ejemplo ilustrativo, polisacáridos, tales como agarosa y celulosa, polímeros orgánicos, tales como poliacrilamida, metacrilato de metilo, y copolímeros de poliestireno-divinilbenceno. Se debe entender que en el presente documento no se pretende dar a entender que sólo son adecuados sustratos orgánicos para la utilización como sustrato del medio, ya que también se pueden utilizar materiales de soporte inorgánicos, tales como sílice y vidrios de borosilicato.
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Tabla 1: Análisis de precipitación con PEG
- Muestra
- Columna 1 Columna 2 Columna 3 Columna 4 Columna 5 Columna 6 Columna 7 Columna 8
- Sobrenadante de PEG al 0%
- 1,349 0,812 0,266, 0,259 0,328, 0,319 ‘100’ ‘100’ 41,5 52,5
- Sobrenadante de PEG al 5%
- 1,305 0,786 0,255, 0,257 0,324, 0,327 96,7 97,5 60,6 39,5
- Sobrenadante de PEG al 10%
- 0,987 0,595 0,241, 0,242 0,405, 0,407 73,2 92,0 86,9 13,1
- Sobrenadante de PEG al 15%
- 0,789 0,475 0,227, 0,229 0,478, 0,482 58,5 86,9 98,6 1,4
- Sobrenadante de PEG al 20%
- 0,691 0,416 0,219, 0,216 0,526, 0,519 51,2 82,9 99,8 0,2
- En la tabla 1: columna 1, A280 de sobrenadante de PEG; columna 2, la concentración de plasminógeno recombinante total presente en sobrenadante de PEG, calculada dividiendo el valor de A280 por el coeficiente de extinción de 1,66 para una solución 1,0 ml/mg de plasminógeno recombinante; columna 3, concentración de plasminógeno recombinante activo por SK presente en sobrenadante de PEG (valores de ensayo duplicados); columna 4, actividad específica de plasminógeno recombinante activo por SK, calculada dividiendo los valores en la columna 3 por los valores correspondientes en la columna 2 (valores duplicados basados en ensayos duplicados); columna 5, porcentaje del valor de A280 original restante en el sobrenadante de PEG; columna 6, porcentaje de plasminógeno activo por SK original restante en el sobrenadante de PEG; columna 7, porcentaje de plasminógeno recombinante total presente en el sobrenadante de PEG como plasminógeno recombinante monomérico (en base a SEC-HPLC); columna 8, porcentaje de plasminógeno recombinante total presente en el sobrenadante de PEG como proteína agregada (en base a SEC-HPLC).
Ejemplo 5
Precipitación con sulfato de amonio
Se añadió sulfato de amonio sólido a una composición de replegamiento (una composición de replegamiento no dializada que comprende arginina 0,5 M y urea 0,85 M) de plasminógeno recombinante para precipitar la proteína agregada que puede estar presente después de un replegamiento oxidativo
Se añadió sulfato de amonio sólido a partes de 50 ml frías (5ºC) de mezcla de replegamiento, con agitación vigorosa, para lograr concentraciones finales de sulfato de amonio correspondientes al 10, 20 30 o 40% de saturación, respectivamente. Se continuó la agitación durante 60 minutos para asegurar la solubilización completa del sulfato de amonio. Estas muestras, así como una muestra de la mezcla de replegamiento original a la que no se había añadido sulfato de amonio, se centrifugaron a 16.000 rpm durante 30 minutos para sedimentar cualquier precipitado que se hubiera formado. Se recogieron los sobrenadantes claros y se evaluó el contenido de proteína total (mediante la medición de A280) y el contenido de plasminógeno recombinante activo (mediante el ensayo de activación por SK, DiaPharma, West Chester, OH) y se analizaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía líquida de alta resolución (SEC-HPLC). Los resultados se resumen en la tabla 2 y la figura 7 y muestran que la adición de sulfato de amonio daba lugar a: (i.) la precipitación relativamente selectiva de proteína que no era plasminógeno recombinante activo; (ii.) un aumento resultante de la actividad específica del plasminógeno recombinante que permaneció soluble; y (iii.) la eliminación de proteínas agregadas. Estos resultados demuestran que la adición de amonio a la mezcla de replegamiento no dializada causaba la precipitación de algunas proteínas (que no eran plasminógeno recombinante activo) y conservaba la mayor parte del plasminógeno recombinante activo por SK activo en solución. Además, la cromatografía de exclusión por tamaño y la cromatografía líquida de alta resolución (SEC-HPLC) demostraron que la adición de amonio a la mezcla de replegamiento no dializada daba lugar a una reducción progresiva de la proteína agregada y a un aumento correspondiente de plasminógeno recombinante monomérico en los sobrenadantes de sulfato de amonio. Los resultados indican que sulfato de amonio precipitaba de manera algo selectiva plasminógeno recombinante incorrectamente replegado o agregado y, de este modo, enriquecía el plasminógeno replegado correctamente en el sobrenadante de sulfato de amonio. La actividad específica de plasminógeno recombinante activo por SK en esta mezcla de replegamiento no dializada aumentó de 0,33 a 0,48 en el sobrenadante de sulfato de amonio saturado al 30%; la adición de una mayor cantidad de sulfato de amonio tenía el efecto aparente de causar una precipitación significativa de plasminógeno recombinante activo por SK. Los resultados indicaron que la precipitación con sulfato de amonio es un procedimiento viable para eliminar selectivamente, como mínimo, una parte del plasminógeno recombinante inactivo por SK presente en mezclas de replegamiento previo a una cromatografía o una etapa de activación por SK.
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Tabla 2: Análisis de precipitación con sulfato de amonio (AmSO4)
- Muestra
- Columna 1 Column a 2 Columna 3 Columna 4 Columna 5 Columna 6 Columna 7 Columna 8
- Sobrenadante de AmSO4 al 0%
- 1,349 0,812 0,270, 0,272 0,333, 0,335 ‘100’ ‘100’ 46,1 44,5
- Sobrenadante de AmSO4 al 5%
- 1,316 0,793 0,274, 0,270 0,346, 0,340 97,6 100,4 49,1 48,2
- Sobrenadante de AmSO4 al 10%
- 1,109 0,668 0,256, 0,256 0,383, 0,383 82,2 94,5 94,6 5,4
- Sobrenadante de AmSO4 al 15%
- 0,824 0,496 0,236, 0,241 0,476, 0,486 61,1 88 99,1 0,9
- Sobrenadante de AmSO4 al 20%
- 0,669 0,403 0,170, 0,170 0,422, 0,422 49,6 62,7 100 0
- En la tabla 1: columna 1, A280 de sobrenadante de sulfato de amonio; columna 2, la concentración de plasminógeno recombinante total presente en sobrenadante de sulfato de amonio, calculada dividiendo el valor de A280 por el coeficiente de extinción de 1,66 para una solución 1,0 ml/mg de plasminógeno recombinante; columna 3, concentración de plasminógeno recombinante activo por SK presente en sobrenadante de sulfato de amonio (valores de ensayo duplicados); columna 4, actividad específica de plasminógeno recombinante activo por SK, calculada dividiendo los valores en la columna 3 por los valores correspondientes en la columna 2 (valores duplicados basados en ensayos duplicados); columna 5, porcentaje del valor de A280 original restante en el sobrenadante de sulfato de amonio; columna 6, porcentaje de plasminógeno activo por SK original restante en el sobrenadante de sulfato de amonio; columna 7, porcentaje de plasminógeno recombinante total presente en el sobrenadante de sulfato de amonio como plasminógeno recombinante monomérico (en base a SEC-HPLC); columna 8, porcentaje de plasminógeno recombinante total presente en el sobrenadante de sulfato de amonio como proteína agregada (en base a SEC-HPLC).
Ejemplo 6
5
Cromatografía de interacción hidrófoba después de la precipitación con sulfato de amonio
Se añadió (NH4)2SO4 sólido a una composición de replegamiento que contenía plasminógeno recombinante (pH 8,0) hasta 1 M. El precipitado formado se extrajo por filtración (0,45 µm) y la solución resultante de la filtración se puso en
10 contacto con los siguientes medios de cromatografía de interacción hidrófoba: Serie 1. HiTrap® Fenil Sepharose FF: Carga: 25 ml (A280: 0,839); flujo pasante (FT)/lavado: 49,4 g (A280: 0,266); eluato: placa de 96 pocillos con fracciones. Serie 2. HiTrap® Octil Sepharose FF: Carga: 25 ml (A280: 0,839); flujo pasante (FT)/lavado: 49,6 g (A280: 0,407); eluato: placa de 96 pocillos con fracciones. Esta serie no mostró ningún pico de eluato real.
15 Serie 3. HiTrap® Butil Sepharose FF: Carga: 25 ml (A280: 0,839); flujo pasante (FT)/lavado: 49,05 g (A280: 0,215); eluato: placa de 96 pocillos con fracciones. Serie 4. HiTrap® Fenil Sepharose HP: Carga: 25 ml (A280: 0,839); flujo pasante (FT)/lavado: 49,01 g (A280: 0,183); eluato: placa de 96 pocillos con fracciones.
20 Cromatografía: tampón A: Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, y (NH4)2SO4 1 M; y el tampón B: Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM y (gradiente inverso 100 -0% en 40 CV a 1 ml/min). Las fracciones se recogieron en la escala de 1ml.
Las siguientes fracciones de las series se sometieron a diálisis, como mínimo, durante dos días contra Tris-HCl 10
25 mM, pH 9,0, y EDTA 1 mM a 4ºC: fracción # 1-Fenil Sepharose FF (B1-B11); fracción # 2 -Fenil Sepharose FF (B12-D5); fracción # 3 -Fenil Sepharose FF (D6-D11); fracción # 4 -flujo pasante en Fenil Sepharose FF; fracción # 5 -flujo pasante en octil Sepharose; fracción # 6 -carga de columna; fracción # 7 -butil Sepharose (A6-B12); fracción # 8 -butil Sepharose (C1-C7); fracción # 9 -butil Sepharose (C8-D12); fracción # 10 – flujo pasante en butil Sepharose; fracción # 11 -fenil Sepharose HP (A12-B12); fracción # 12 -fenil Sepharose HP (C1-D1); fracción # 13
30 -flujo pasante en fenil Sepharose HP; y fracción # 14 -carga de columna.
Las trazas de absorbancia A280 de las cuatro series de cromatografía de interacción hidrófoba se muestran en la figura 8. El análisis de potencia de las fracciones seleccionadas demostró que la fracción # 2 agrupada de la Fenil Sepharose FF (B12-D5) presentaba una actividad específica de 0,91, mientras que la fracción # 4 agrupada del flujo
35 pasante presentaba una actividad específica de 0,003. De manera similar, la actividad específica de la fracción # 11 agrupada de la Fenil Sepharose HP (A12-B12) fue de 1,01, mientras que la actividad específica de la fracción # 13
24
del flujo pasante para esta serie era insignificante. La fracción # 7, butil Sepharose (A6-B12), presentó una actividad específica de 0,61, la fracción # 8, butil Sepharose (C1-C7), una actividad específica de 0,21, y la fracción # 10, flujo pasante en butil Sepharose, una actividad específica de 0,05. No se consiguió el máximo de captura con la resina de octil Sepharose, y la fracción # 5 del flujo continuo de esta serie presentó una actividad específica de 0,42.
5
El resultado muestra que el sobrenadante/filtrado de la etapa de precipitación con sulfato de amonio es susceptible de aplicación directa a cromatografía de interacción hidrófoba. La fenil Sepharose FF, fenil Sepharose HP y butil Sepharose FF son capaces de capturar de manera selectiva la mayor parte de la proteína recPlasminógeno activo de la mezcla de replegamiento, puesto en evidencia por una alta actividad específica en las fracciones de eluato y
10 una baja actividad específica en las agrupaciones de flujo pasante. De este modo, por ejemplo, después de la precipitación con sulfato de amonio, el precipitado se puede aclarar mediante uno o más procedimientos (por ejemplo, filtración en profundidad, centrifugación, microfiltración, etc., y/o combinaciones de los mismos) que eliminan todo o una cantidad sustancial de cualquier precipitado, y el filtrado aclarado que comprende plasminógeno se puede someter a cromatografía de interacción hidrófoba para capturar el plasminógeno recombinante contenido
15 en el mismo.
Ejemplo 7
Cromatografía de intercambio catiónico
20 El plasminógeno recombinante diafiltrado replegado se capturó en una columna de 206 ml de SP-Sepharose FF (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) a temperatura ambiente. El tampón de equilibrado de la columna fue Tris 25 mM, EDTA 1,0 mM, pH 8,0. Después de lavar la columna con 10 volúmenes de columna de tampón de equilibrado, el plasminógeno recombinante se eluyó con Tris 25 mM, NaCl 200 mM, EDTA 1,0 mM, pH 8,0.
25 El eluato de la columna SP Sepharose proporcionó un plasminógeno recombinante casi homogéneo con una actividad específica de 0,98, con una recuperación de aproximadamente el 89% de la actividad del plasminógeno recombinante. Esta etapa de cromatografía fue muy eficaz en la reducción de la contaminación del plasminógeno recombinante por la proteína de la célula huésped, tal como se muestra en la tabla 3.
30
Tabla 3: Purificación de plasminógeno recombinante a partir de cuerpos de inclusión E. coli
- Etapa de purificación
- Concentración de proteína (mg/ml)a Proteína total (mg)a,b Actividad total (mg)a,b Actividad recuperada (%)a,b Actividad específicac Proteína en la célula huésped (ng/mg proteína)
- Cuerpos de inclusión solubilizados
- 8,88 ± 0,72 4.424 ± 356 DNDd - - DND
- Plasminógeno replegado
- 0,51 ± 0,05 5.133 ± 454 1.720 ± 46 33,6 ± 2,2 0,34 ± 0,02 DND
- (Plasminógeno filtrado después del replegamiento)
- 0,38 ± 0,02 4.039 ± 274 1.604 ± 185 93,2 ± 2,2 0,40 ± 0,02 DND
- (Plasminógeno retenido en la diafiltración)
- 0,34 ± 0,03 3.386 ± 282 1.604 ± 252 99,8 ± 9,2 0,47 ± 0,04 DND
- (Plasminógeno filtrado antes de SP Sepharose)
- 0,32 ± 0,02 3.313 ± 132 1.379 ± 5 87,6 ± 15,0 0,42 ± 0,02 2.464 ± 897
- Plasminógeno en eluato de SP Sepharose
- 2,29 ± 0,13 1.255 ± 25 1.225 ± 26 88,8 ± 1,9 0,98 ± 0,02 31,9 ± 20,5
- Plasminógeno en eluato de ECH-lisina
- 5,96 ± 0,56 1.137 ± 104 1.194 ± 34 97,4 ± 0,7 1,05 ± 0,08 1,60 ± 1,4
- a Los valores representan la media ± la desviación estándar de la media de tres series de purificación diferentes, cada una partiendo con un lote diferente de cuerpos de inclusión.b Valores no corregidos para el volumen de la muestra extraída para ensayos bioanalíticos. c Actividad específica, mg de plasminógeno recombinante activo por mg de proteína total. d El análisis no se llevó a cabo en estas muestras.
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Tabla 4: Purificación de plasmina a partir de plasminógeno purificado
- Etapa de purificación
- Columna 1 Columna 2 Columna 3 Columna 4 Columna 5 Columna 6 Columna 7
- (mg/ml)
- (mg)a,b (mg)a,b (%)a,b Actividad específicac (ng/mg de proteína) (µg/mg de proteína)
- Plasmina activada por estreptoquinasa
- 2,47 ± 0,01 636 ± 49 489 ± 47 82,9 ± 3,6 0,77 ± 0,03 DNDd 4,2 ± 1,5
- Flujo pasante de membrana Q
- 1,00 ± 0,08 574 ± 46 425 ± 30 91,1 ± 0,3 0,74 ± 0,01 DND < QLe
- Plasmina de eluato de benzamidina Sepharose
- 1,09 ± 0,08 472 ± 43 409 ± 37 96,1 ± 4,1 0,87 ± 0,03 < 12 < QL
- Plasmina ultrafiltrada/diafiltrada
- 6,19 ± 0,28 459 ± 29 414 ± 11 101,7 ± 6,5 0,90 ± 0,05 < 0,9 < QL
- En la tabla 4: columna 1: concentración de proteínas; columna 2: proteína total; columna 3: actividad total; columna 4: actividad recuperada en la etapa del proceso; columna 5: actividad específica; columna 6: proteína de la célula huésped; columna 7: concentración de SK. a Valores no corregidos para el volumen de la muestra extraída para ensayos bioanalíticos. b Los valores representan la media ± la desviación estándar de la media de tres series de purificación diferentes. c Actividad específica, mg de plasmina recombinante activa por mg de proteína total.d No se realizó análisis en estas muestras. e Por debajo del nivel de cuantificación (0,15 µg/ml).
Estas estimaciones de pureza se corroboran mediante los resultados de SDS-PAGE presentados en la figura 4, que ilustran la purificación progresiva del plasminógeno, la conversión de plasminógeno de una sola cadena en plasmina de dos cadenas por SK, y la purificación de la plasmina. Se observó un pequeño porcentaje de productos de autolisis en el plasmina ultrafiltrado/diafiltrado al final del proceso de purificación (figura 4, carril 9). Los análisis de HPLC y por exclusión de tamaño de las tres muestras del producto final se superponen en la figura 5; este análisis demostró que el 98% de la proteína se eluyó en el pico correspondiente a plasmina monomérica. La proteína de la célula huésped se redujo a menos de 0,8 ng/mg de plasmina purificada. La SK se redujo por debajo del nivel de cuantificación (menos de 0,02 µg/mg de plasmina).
La proteína de plasminógeno recombinante presente en los cuerpos de inclusión solubilizados se replegó en la proteína activa con un rendimiento de aproximadamente el 48%. La recuperación global de la actividad después de la cromatografía de ECH-lisina Sepharose, en base al zimógeno replegado activo, fue del 70%. El rendimiento de la actividad de la plasmina, en base a la actividad del zimógeno de partida, fue del 65%. De este modo, el rendimiento global calculado de la plasmina, en base al zimógeno replegado activo, fue del 46% para las tres series de purificación presentadas en las tablas 3 y 4.
Ejemplo 15
Cromatografía de intercambio aniónico de plasmina preparada a partir de plasminógeno recombinante
Se implementó una cromatografía con membrana Q inmediatamente después de la activación del plasminógeno recombinante a plasmina utilizando SK. Se ajustó el pH de la mezcla de activación de SK de aproximadamente 7 a aproximadamente 8, se cargó en la membrana Q equilibrada en tampón Tris de pH 8, y se recogió el flujo pasante que contenía plasmina. Se realizaron estudios a escala de laboratorio y se identificaron las condiciones de carga de la membrana que conducían a la unión a SK y la recuperación de plasmina. Las muestras de los experimentos a escala de laboratorio se analizaron para el contenido de SK y se confirmó la pureza de la muestra.
Ejemplo 16
Cromatografía de intercambio aniónico de plasmina preparada a partir de plasminógeno derivado del plasma
Los plasminógenos derivados de la sangre y/o las plasminas preparadas a partir de los mismos se dan a conocer, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos No. 6.355.243, 6.964.764, 6.969.515 y 7.544.500 y las publicaciones de patentes de Estados Unidos No. 2002/0192794 y 2003/0012778; y Deutsch y otros, Science, 170: 1095-6 (1970). Por consiguiente, el plasminógeno se prepara a partir de sangre (por ejemplo, plasma, suero) a efectos de proporcionar una composición que comprende la plasmina.
Por ejemplo, el plasminógeno se prepara a partir de la pasta de la Fracción II + III de Cohn mediante cromatografía de afinidad en Lys-SEPHAROSE, tal como se ha descrito por Deutsch y otros, supra. Por ejemplo, se resuspenden 200 g de pasta de la Fracción II + III de Cohn en 2 litros de tampón de citrato sódico 0,15 M, pH 7,8. La suspensión
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