ES2553254T3

ES2553254T3 - Uso de una composición inmunogénica de PCV2 para reducir los síntomas clínicos en cerdos

Info

Publication number: ES2553254T3
Application number: ES11164854.9T
Authority: ES
Inventors: Michael B. Roof; Marc Allan Eichmeyer; Greg Nitzel; Phillip Wayne Hayes; Merrill Lynn Schaeffer
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2005-12-29
Filing date: 2006-12-28
Publication date: 2015-12-07
Anticipated expiration: 2026-12-28
Also published as: PL2371385T3; US20110217327A1; EP3766518B1; ES2553253T3; AU2006338182A1; US7829273B2; EP2374476A1; CN101426522B; HUE025994T2; EP2371383A1; US20080279876A1; DK1976558T3; EP2371384A1; CA2635430A1; US20080279889A1; US7838213B2; US9011868B2; US20080261887A1; EP1976558A4; CN104474541A

Abstract

Una composición inmunogénica capaz de provocar o reforzar una respuesta inmune contra PCV2 y que comprende proteína ORF2 de PCV2 producida de forma recombinante, para uso en la prevención de la linfadenopatía en combinación con uno o una multiplicidad de los siguientes síntomas en cerdos: (1) neumonía intersticial con edema interlobular, (2) palidez cutánea o íctero, (3) hígados atróficos moteados, (4) úlceras gástricas y (5) nefritis, en donde la proteína ORF2 de PCV2 se ha de administrar una vez a cerdos.

Description

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con la presente, y la vacuna Ingelvac PRRS MLV (Boehringer Ingelheim).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama de flujo esquemático de una construcción preferida de baculovirus recombinante de ORF2 de PCV2; y

las Figs. 2a y 2b son, cada una, un diagrama de flujo esquemático de cómo producir una composición de acuerdo con la presente invención.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Los siguientes ejemplos recogen materiales y procedimientos preferidos de acuerdo con la presente invención. Aunque se puede utilizar en la práctica o someter a ensayo en la presente invención cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria, los métodos, los dispositivos y los materiales preferidos se describen a continuación. Ha de entenderse, sin embargo, que estos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración solamente, y nada en ellos debe considerarse una limitación tras el alcance global de la invención.

Ejemplo 1

Este ejemplo compara los rendimientos relativos de ORF2 utilizando métodos según se describe en esta memoria con métodos que son conocidos en la técnica anterior. Cuatro matraces de centrifugación de 1000 mL se sembraron cada uno con aproximadamente 1,0 x 106 células Sf+/ml en 300 mL de medios exentos de suero de insectos, Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS). El cultivo celular patrón se identifica como SF+ (Spodoptera frugiperda) Master Cell Stock, pasaje 19, Lote nº N112-095W. Las células utilizadas para generar el SF+ Master Cell Stock se obtuvieron de Protein Sciences Corporation, Inc., Meriden, CT. La línea de células SF+ para este ejemplo fue confinada entre los pasajes 19 y 59. Otros pasajes funcionarán para los fines de la presente invención, pero con el fin de aumentar la escala del procedimiento para una producción a gran escala, serán necesarios, probablemente, al menos 19 pasajes, y pasajes más allá de 59 pueden tener un efecto sobre la expresión, aunque esto no se investigó. Con mayor detalle, los cultivos iniciales de células SF+ procedentes de almacenamiento en nitrógeno líquido se hicieron crecer en medio Excell 420 en suspensión en matraces de centrifugación estériles con constante agitación. Los cultivos se hicieron crecer en matraces de centrifugación de 100 mL a 250 mL con 25 a 150 mL de medio exento de suero Excell 420. Cuando las células se habían multiplicado hasta una densidad de células de 1,0 -8,0 x 106 células/mL, éstas se dividieron en nuevos recipientes con una densidad de siembra de 0,5 -1,5 x 106 células/mL. Los cultivos por expansión subsiguientes se hicieron crecer en matraces de centrifugación de hasta 36 litros de capacidad o en biorreactores de acero inoxidable de hasta 300 litros durante un periodo de 2-7 días a 25 -29°C.

Después de la siembra, los matraces se incubaron a 27°C durante cuatro horas. Subsiguientemente, cada uno de los matraces se sembró con un baculovirus recombinante que contenía el gen ORF2 de PCV2 (SEQ ID NO: 4). El baculovirus recombinante que contenía el gen ORF2 de PCV2 se generó como sigue: el gen ORF2 de PCV2 procedente de una cepa de Norte América de PCV2 se amplificó por PCR para que contuviera una secuencia 5' Kozak (SEQ ID NO: 1) y un sitio 3' EcoR1 (SEQ ID NO: 2), clonado en el vector pGEM-T-Easy (Promega, Madison, WI). Luego se escindió subsiguientemente y se subclonó en el vector de transferencia pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). La porción subclonada se representa en esta memoria como SEQ ID NO: 7. El plásmido pVL1392 que contenía el gen ORF2 de PCV2 se designó N47-064Y y luego se co-transfectó con ADN de baculovirus BaculoGold® (BD Biosciences Pharmingen) en células de insecto Sf+ (Protein Sciences, Meriden, CT) para generar el baculovirus recombinante que contenía el gen ORF2 de PCV2. La nueva construcción se proporciona en esta memoria como SEQ ID NO: 8. El baculovirus recombinante que contenía el gen ORF2 de PCV2 se purificó en placa y el virus de la Cepa Madre (Master Seed Virus -MSV) se propagó en la línea de células SF+, se tomaron partes alícuotas y se almacenó a -70ºC. El MSV se identificó positivamente como baculovirus ORF2 de PCV2 mediante PCR-RFLP utilizando cebadores específicos de baculovirus. Las células de insectos se infestaron con baculovirus ORF2 de PCV2 para generar MSV o virus de la Cepa de Trabajo (Working Seed Virus) expresan antígeno ORF2 de PCV2, según se detecta por suero policlonal o anticuerpos monoclonales en un ensayo de anticuerpos fluorescentes indirecto. Adicionalmente, la identidad del baculovirus ORF2 de PCV2 fue confirmada por la secuenciación de aminoácidos N-terminal. El baculovirus ORF2 de PCV2 MSV también se sometió a ensayo en cuanto a la pureza de acuerdo con 9 C.F.R. 113.27 (c), 113.28 y 113.55. Cada baculovirus recombinante sembrado en los matraces de centrifugación tenía multiplicidades de infección (MOIs) variables. El matraz 1 fue sembrado con 7,52 mL de siembra 0,088 MOI; el matraz 2 fue sembrado con 3,01 mL de siembra 0,36 MOI; el matraz 3 fue sembrado con 1,5 mL de siembra 0,18 MOI; y el matraz 4 fue sembrado con 0,75 mL de siembra 0,09 MOI. Un diagrama de flujo esquemático que ilustra las etapas básicas utilizadas para construir un baculovirus recombinante ORF2 de PCV2 se proporciona en esta memoria como Figura 1.

Después de ser sembrados con el baculovirus, los matraces se incubaron luego a 27 ± 2°C durante 7 días y se agitaron también a 100 rpm durante ese tiempo. Los matraces utilizaban tapones ventilados para permitir el flujo de aire. De cada uno de los matraces se tomaron muestras cada 24 horas durante los siguientes 7 días. Después de la extracción, cada una de las muestras se centrifugó y tanto el sedimento como el sobrenadante se separaron y luego

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se microfiltraron a través de una membrana con un tamaño de poros de 0,45-1,0 µm.

Las muestras resultantes tenían la cantidad de ORF2 presente en ellas, cuantificada a través de un ensayo ELISA. El ensayo ELISA se efectuó con anticuerpo de captura Pab IgG Prot. G anti-PCV2 porcino purificado (diluido a razón de 1:250 en PBS), diluido a razón de 1:6000 en tampón carbonato 0,05 M (pH 9,6). 100 µL del anticuerpo se dispusieron luego en los pocillos de la placa de microtitulación, se sellaron e incubaron durante una noche a 37°C. La placa se lavó después tres veces con una solución de lavado que comprendía 0,5 mL de Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO), 100 mL de 10X D-PBS (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA) y 899,5 mL de agua destilada. Subsiguientemente, se añadieron a cada uno de los pocillos 250 µL de una solución de bloqueo (5 g de leche en polvo no grasa Carnation (Nestle, Glendale, CA) en 10 mL de D-PBS QS hasta 100 mL con agua destilada). La etapa siguiente era lavar la placa de ensayo y luego añadir antígeno pre-diluido. El antígeno pre-diluido se produjo añadiendo 200 µL de solución diluyente (0,5 mL de Tween 20 en 999,5 mL de D-PBS) a cada uno de los pocillos en una placa de dilución. La muestra se diluyó luego a una relación de 1:240 y a una relación de 1:480, y 100 µL de cada una de estas muestra diluidas se añadieron después a uno de los pocillos superiores en la placa de dilución (es decir, un pocillo superior recibió 100 µL de la dilución de 1:240 y el otro recibió 100 µL de la dilución de 1:480). Después se hicieron diluciones en serie para el resto de la placa separando 100 µL de cada uno de los pocillos sucesivos y transfiriéndolos al pocillo siguiente de la placa. Cada pocillo se mezcló antes de realizar la siguiente transferencia. El lavado de la placa de ensayo incluía el lavado de la placa durante tres veces con el tampón de lavado. La placa se selló después y se incubó durante una hora a 37°C antes de lavarla tres veces más con el tampón de lavado. El anticuerpo de detección utilizado era anticuerpo monoclonal contra ORF2 de PCV. Se diluyó a razón de 1:300 en solución diluyente y después se añadieron a los pocillos 100 µL del anticuerpo de detección diluido. La placa se selló después y se incubó durante una hora a 37°C antes de lavarla tres veces con el tampón de lavado. Luego se preparó diluyente conjugado añadiendo suero normal de conejo (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) a la solución diluyente hasta una concentración del 1%. Anticuerpo conjugado anti-ratón de cabra (H+l)-HRP (Jackson Immunoresearch) se diluyó en el diluyente de conjugado hasta 1:10.000. 100 µL del anticuerpo conjugado diluido se añadieron entonces a cada uno de los pocillos. La placa se selló después y se incubó durante 45 minutos a 37°C antes de lavarla tres veces con el tampón de lavado. 100 µL de sustrato (Sustrato TMB Peroxidasa, Kirkgaard and Perry Laboratories (KPL), Gaithersberg, MD), mezclados con un volumen igual de Sustrato Peroxidasa B (KPL) se añadieron a cada uno de los pocillos. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. 100 µL de solución de HCl 1 N se añadieron luego a todos los pocillos para detener la reacción. La placa se hizo pasar luego a través de un lector ELISA. Los resultados de este ensayo se proporcionan en la Tabla 1 que figura a continuación:

Tabla 1

Día: Matraz ORF2 en el sedimento (µg) ORF2 en el sobrenadante (µg)

3: 1 47,53 12

3: 2 57,46 22

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3: 53,44 14

3: 4 58,64 12

4: 1 43,01 44

4: 2 65,61 62

4: 3 70,56 32

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4: 64,97 24

5: 1 31,74 100

5: 2 34,93 142

5: 3 47,84 90

5: 4 55,14 86

6: 1 14,7 158

6: 2 18,13 182

6: 3 34,78 140

6: 4 36,88 146

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Tabla 3

Día después de la infección:: ORF2 en el sobrenadante (µg/mL)

4: 29,33

5: 41,33

6: 31,33

7: 60,67

Ejemplo 4

Este ejemplo somete a ensayo la eficacia de siete vacunas candidatas de PCV2 y define, además, parámetros de eficacia después de la exposición a una cepa virulenta de PCV2. Ciento ocho (108) cochinillos desprovistos de calostro derivado de la cesárea (CDCD -siglas en inglés), de 9-14 días de edad, se dividieron al azar en 9 grupos de igual tamaño. La Tabla 4 recoge el Diseño de Estudio General para este Ejemplo.

Tabla 4. Diseño de Estudio General

Grupo: Nº de Cerdos Tratamiento Día de Tratamiento KLH/ICFA el Día 21 y el Día 27 Enfrentados con PCV2 Virulento el Día 24 Necropsia el Día 49

1: 12 Vacuna de PCV2 nº 1 (vORF2 16 µg) 0 + + +

2: 12 Vacuna de PCV2 nº 2 (vORF2 8 µg) 0 + + +

3: 12 Vacuna de PCV2 nº 3 (vORF2 4 µg) 0 + + +

4: 12 Vacuna de PCV2 nº 4 (rORF2 16 µg) 0 + + +

5: 12 Vacuna de PCV2 nº 5 (rORF2 8 µg) 0 + + +

6: 12 Vacuna de PCV2 nº 6 (rORF2 4 µg) 0 + + +

7: 12 Vacuna de PCV2 Nº 7 (mató virus de células completos) 0 + + +

8: 12 Ninguno -Controles de Enfrentamiento N/A + + +

9: 12 Ninguno -Grupo Control Negativo Estricto N/A + - +

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; mató virus de células completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado

10 Siete de los grupos (Grupos 1 -7) recibieron dosis de polipéptido ORF2 de PCV2, uno de los grupos actuó como control de enfrentamiento y no recibió ORF2 de PCV2 y otro grupo actuó como el grupo control negativo estricto y tampoco recibió ORF2 de PCV2. El Día 0, los Grupos 1 a 7 fueron tratados con vacunas asignadas. A los cochinillos del Grupo 7 se les dio un tratamiento de refuerzo el Día 14. Los cochinillos fueron observados en cuanto a sucesos adversos y las reacciones del sitio de inyección después de la vacunación, y el Día 19, los cochinillos se

15 trasladaron al segundo sitio de estudio. En el segundo sitio de estudio, los Grupos 1-8 fueron alojados en grupo en un edificio, mientras que el Grupo 9 fue alojado en un edificio separado. Todos los cerdos recibieron hemocianina de lapa bocallave (KLH)/adyuvante incompleto de Freund (ICFA -siglas en inglés) los Días 21 y 27 y el Día 24, a los

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Grupos 1-8 se les enfrentó con un PCV2 virulento.

Antes y después del enfrentamiento se tomaron muestras de sangre para la serología del PCV2. Después del enfrentamiento se recogieron datos del peso corporal para la determinación de la ganancia de peso media diaria (ADWG -siglas en inglés) y los síntomas clínicos, así como muestras de torunda nasal para determinar la secreción nasal de PCV2. El Día 49, se practicó necropsia a todos los cerdos supervivientes, se anotaron los pulmones en cuanto a lesiones, y los tejidos seleccionados se conservaron en formalina para el ensayo de Inmunohistoquímica (IHC -siglas en inglés) para una fecha posterior.

Materiales y Métodos:

Este era un estudio de capacidad de enfrentamiento frente a la vacunación parcialmente ciego realizado en cerdos CDCD, de 9 a 14 días de edad el Día 0. Para ser incluidos en el estudio, los títulos IFA de PCV2 de cerdas eran ≤ 1:1000. Adicionalmente, el estado serológico de cerdas procedía de una piara PRRS-negativa conocida. Se sometió a ensayo a ventiocho (28) cerdas en cuanto al estado serológico de PCV2. Catorce (14) cerdas tenían un título de PCV2 de ≤ 1000 y fueron transferidas al primer sitio de estudio. Ciento diez (110) cochinillos fueron proporcionados mediante cirugía por sección cesárea y estaban disponibles para este estudio el Día -4. El Día -3 se pesaron 108 cerdos CDCD en el primer sitio de estudio, se identificaron con etiquetas de oreja, se bloquearon por el peso y se asignaron al azar a 1 de 9 grupos, según se recoge antes en la tabla 4. Si cualquier animal de ensayo que cumplía los criterios de inclusión fue enrolado en el estudio y posteriormente fue excluido por cualquier motivo, el Investigador y Monitor consultó con el fin de determinar el uso de datos recogidos del animal en el análisis final. Se documentó la fecha en la que se excluyó a los cerdos enrolados y el motivo de la exclusión. Inicialmente no se excluyó a ninguna cerda. Un total de 108 de 110 cerdos disponibles fue asignado a uno de 9 grupos el Día -3. Los dos cerdos más pequeños (nºs 17 y 19) no fueron asignados a un grupo y estaban disponibles como extras, en caso necesario. Durante el transcurso del estudio, se retiró a varios animales. Cada uno de Cerdo nº 82 (Grupo 9) el Día -1, Cerdo nº 56 (Grupo 6) el Día 3, Cerdo nº 53 (Grupo 9) el Día 4, Cerdo nº 28 (Grupo 8) el Día 8, Cerdo nº 69 (Grupo 8) el Día 7 y Cerdo nº 93 (Grupo 4) el Día 9, fue encontrado muerto antes del enfrentamiento. Estos seis cerdos no fueron incluidos en los resultados del estudio final. El cerdo nº 17 (uno de los cerdos extra) fue asignado al Grupo 9. El restante cerdo nº 19 extra fue excluido del estudio.

Las formulaciones dadas a cada uno de los grupos eran como sigue: el Grupo 1 fue diseñado para administrar 1 ml de ORF2 viral (vORF2) que contenía 16 µg de ORF2/ml. Esto se hizo mezclando 10,24 ml de ORF2 viral (256 µg/25 µg/ml = 10,24 ml de vORF2) con 3,2 ml de Carbopol al 0,5% y 2,56 ml de solución salina tamponada con fosfato a un pH de 7,4. Esto produjo 16 ml de formulación para el grupo 1. El Grupo 2 fue diseñado para administrar 1 ml de vORF2 que contenía 8 µg de vORF2/ml. Esto se hizo mezclando 5,12 ml de vORF2 (128 µg/25 µg/ml = 5,12 ml de vORF2) con 3,2 ml de Carbopol al 0,5% y 7,68 ml de solución salina tamponada con fosfato a un pH de 7,4. Esto produjo 16 ml de formulación para el grupo 2. El Grupo 3 fue diseñado para administrar 1 ml de vORF2 que contenía 4 µg de vORF2/ml. Esto se hizo mezclando 2,56 ml de vORF2 (64 µg/25 µg/ml = 2,56 ml de vORF2) con 3,2 ml de Carbopol al 0,5% y 10,24 ml de solución salina tamponada con fosfato a un pH de 7,4. Esto produjo 16 ml de formulación para el grupo 3. El Grupo 4 fue diseñado para administrar 1 ml de ORF2 recombinante (rORF2) que contenía 16 µg de rORF2/ml. Esto se hizo mezclando 2,23 ml de rORF2 (512 µg/230 µg/ml = 2,23 ml de rORF2) con 6,4 ml de Carbopol al 0,5% y 23,37 ml de solución salina tamponada con fosfato a un pH de 7,4. Esto produjo 32 ml de formulación para el grupo 4. El Grupo 5 fue diseñado para administrar 1 ml de rORF2 que contenía 8 µg de rORF2/ml. Esto se hizo mezclando 1,11 ml de rORF2 (256 µg/230 µg/ml = 1,11 ml de rORF2) con 6,4 ml de Carbopol al 0,5% y 24,49 ml de solución salina tamponada con fosfato a un pH de 7,4. Esto produjo 32 ml de formulación para el grupo 5. El Grupo 6 fue diseñado para administrar 1 ml de rORF2 que contenía 8 µg de rORF2/ml. Esto se hizo mezclando 0,56 ml de rORF2 (128 µg/230 µg/ml = 0,56 ml de rORF2) con 6,4 ml de Carbopol al 0,5% y 25,04 ml de solución salina tamponada con fosfato a un pH de 7,4. Esto produjo 32 ml de formulación para el grupo 6. El Grupo 7 fue diseñado para administrar 2 ml de vacuna de células enteras muertas contra PCV2 (PCV2 KV -siglas en inglés) que contenían la MAX PCV2 KV. Esto se hizo mezclando 56 ml de PCV2 KV con 14 ml de Carbopol al 0,5%. Esto produjo 70 ml de formulación para el grupo 7. Finalmente, el grupo 8 fue diseñado para administrar KLH a razón de 0,5 µg/ml ó 1,0 µg/ml por cada 2 ml de dosis. Esto se hizo mezclando 40,71 ml de KLH (7,0 µg de proteína/ml a 0,5 µg/ml = 570 ml (7,0 µg/ml)(x) = (0,5)(570 ml)), 244,29 ml de solución salina tamponada con fosfato a un pH de 7,4, y 285 ml de adyuvante de Freund. La Tabla 5 describe los intervalos de tiempo para las actividades clave de este Ejemplo.

Tabla 5. Actividades de Estudio

Día de Estudio: Actividad de Estudio

-4, 0 a 49: Observaciones generales para la salud global y síntomas clínicos

-3: Pesado; distribuidos al azar en grupos; muestras de sangre tomadas de todos los cerdos

0: Examen de salud; administrados IVP Nºs 1-7 a los Grupos 1-7, respectivamente

0-7: Cerdos observados en cuanto a reacciones en los sitios de inyección

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Día de Estudio: Actividad de Estudio

14: Grupo 7 reforzado con Vacuna nº 7 contra PCV2; muestras de sangre de todos los cerdos

14-21: Grupo 7 observado en cuanto a reacciones en los sitios de inyección

16-19: Tratados todos los cerdos con antibióticos (falta de datos)

19: Cerdos transportados desde el primer sitio de ensayo a un segundo sitio de ensayo

21: Grupos 1-9 tratados con KLH/ICFA

24: Muestras de sangre y de torunda nasal recogidas procedentes de todos los cerdos; pesados todos los cerdos; Grupos 1-8 enfrentados con material de enfrentamiento de PCV2

25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 47: Muestras de torunda nasal recogidas procedentes de todos los cerdos

27: Grupos 1-9 tratados con KLH/ICFA

31: Muestras de sangre tomadas de todos los cerdos

49: Muestras de sangre y de torunda nasal recogidas procedentes de todos los cerdos; pesados todos los cerdos; necropsia de todos los cerdos; lesiones burdas señaladas con énfasis localizadas en íctero y úlceras gástricas; pulmones evaluados en cuanto a lesiones; guardadas muestras de tejido recientes y fijadas con formalina; completada la fase viva del estudio

Después de completarse la fase en vivo del estudio, tejidos fijados con formalina fueron examinados por inmunohistoquímica (IHC) para la detección de antígeno de PCV2 por parte de un patólogo, las muestras de sangre se evaluaron en cuanto a la serología de PCV2, las muestras de torunda nasal fueron evaluadas en cuanto a la secreción de PCV2, y la ganancia de peso media diaria (ADWG) fue determinada desde el Día 24 al Día 49.

Los animales fueron alojados en el primer sitio de estudio en jaulas individuales en cinco recintos desde el nacimiento hasta aproximadamente 11 días de edad (aproximadamente el Día 0 del estudio). Cada recinto era idéntico en su distribución y consistía en jaulas de acero inoxidable individuales apiladas, siendo suministrado aire calentado y filtrado por separado a cada una de las unidades de aislamiento. Cada recinto disponía de calor y ventilación separados, proporcionando con ello una contaminación cruzada de aire entre los recintos. Los animales fueron alojados en dos edificios diferentes en el segundo sitio de estudio. El Grupo 9 (el grupo control estricto negativo) fue alojado por separado en un edificio de acabado convertido y los Grupos 1-8 fueron alojados en un edificio de crianza convertido. Cada grupo fue alojado en un redil separado (11-12 cerdos por redil) y cada redil proporcionaba aproximadamente 1 metro cuadrado por cerdo. Cada redil se encontraba sobre una cubierta elevada con pisos de lamas de plástico. Un foso debajo de los rediles servía como depósito de excrementos y desechos. Cada edificio tenía sus sistemas calefactores y de ventilación separados, con escasa probabilidad de contaminación cruzada de aire entre los edificios.

En el primer sitio de estudio, los cochinillos fueron alimentados con una ración de leche especialmente formulada desde el nacimiento hasta aproximadamente 3 semanas de edad. Todos los cochinillos consumían una ración sólida, especial mezclada el Día 19 (aproximadamente 4 ½ semanas de edad). En el segundo sitio de estudio, se alimentó a todos los cerdos con una ración mixta comercial habitual, no medicada, en cuanto a su edad y peso, ad libitum. También se disponía ad libitum de agua en los dos sitios de estudio.

Todos los cerdos de ensayo fueron tratados con vitamina E el Día -2, con inyecciones de hierro el Día -1 y con NAXCEL® (1,0 mL, IM, en jamones alternantes) los Días 16, 17, 18 y 19. Además, el Cerdo nº 52 (Grupo 9) fue tratado con una inyección de hierro el Día 3, el Cerdo 45 (Grupo 6) fue tratado con una inyección de hierro el Día 11, el Cerdo nº 69 (Grupo 8) fue tratado con NAXCEL® el Día 6, el Cerdo nº 74 (Grupo 3) fue tratado con dexametazona y penicilina el Día 14, y el Cerdo nº 51 (Grupo 1) fue tratado con dexametazona y penicilina el Día 13 y con NAXCEL® el Día 14 por diversos motivos de salud.

Mientras se encontraban en los dos sitios de estudio, los cerdos se encontraban bajo cuidado veterinario. Exámenes de la salud de los animales se realizaron el Día 0 y se registraron en el Formulario de Registro del Examen de Salud. Todos los animales gozaba de buen estado de salud y nutricional antes de la vacunación, según se determina por observación el Día 0. Se observó que todos los animales de ensayo gozaban de buen estado de salud y nutricional antes del enfrentamiento. Las carcasas y los tejidos fueron desechados mediante vertido. La disposición final de los animales de estudio fue registrada en el Registro de Disposición Animal (Animal Disposition Record).

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Unido) y cada Whirl-pak se dispuso en hielo. Cada recipiente se etiquetó apropiadamente. Las recogidas de muestras se registraron en el Formulario de Informe de la Necropsia. Después de ello, muestras de tejido fijado con formalina y el Formulario de Petición de Diagnóstico se suministraron para el ensayo de IHC. El ensayo de IHC se efectuó de acuerdo con procesos de laboratorio estándares ISU para muestras de recepción, preparación de muestras y portaobjetos y técnicas de tinción. Tejidos recientes en Whirl-paks fueron transportados con paquetes de hielo al Monitor del Estudio para el almacenamiento (-70° ± 10° C) y posible uso futuro. Los tejidos fijados con formalina fueron examinados por un patólogo en cuanto a la detección de PCV2 mediante IHC y se evaluaron utilizando el siguiente sistema de anotación: 0 = ninguno; 1 = tinción escasa positiva, pocos sitios; 2 = tinción moderada positiva, múltiples sitios; y 3 = abundante tinción positiva, difusa por todo el tejido. Debido al hecho de que el patólogo no podía diferenciar positivamente los NL inguinales de los NL mesentéricos, los resultados para estos tejidos fueron etiquetados símplemente como Nódulos Linfáticos y la puntuación daba la puntuación más alta para cada uno de los dos tejidos por animal.

Resultados

Se dan seguidamente los resultados para este ejemplo. Se señala que un cerdo del Grupo 9 murió antes del Día 0, y 5 cerdos más murireron post-vacunación (1 cerdo del Grupo 4; 1 cerdo del Grupo 6; 2 cerdos del Grupo 8; y 1 cerdo del Grupo 9). El examen post-mortem indicaba que todos los seis murieron debido a infecciones subyacentes que no estaban asociadas con la vacunación ni con PMWS. Adicionalmente, en ninguno de los grupos se observaron sucesos adversos ni reacciones en el sitio de la inyección.

Los resultados de la ganancia de peso media diaria (ADWG) se presentan a continuación en la Tabla 6. El Grupo 9, el grupo control estricto negativo, tenía la ADWG más alta (0,48 ± 0,09 kg/día), seguido del Grupo 5 (0,43 ± 0,10 kg/día), que recibieron una dosis de 8 µg de rORF2. El Grupo 3, que recibió una dosis de 4 µg de vORF2, tenía la ADWG más baja (0,22 ± 0,09 kg/día), seguido del Grupo 7 (0,23 ± 0,07 kg/día), que recibieron 2 dosis de vacuna matada.

Tabla 6. Sumario de la Ganancia de Peso Media Diaria (ADWG)

Grupo: Tratamiento N ADWG -kg/día (Día 24 a Día 49) o ajustada para cerdos muertos antes del Día 29

1: vORF2 -16 µg (1 dosis) 12 0,39 ± 0,13 kg/día

2: vORF2 -8 µg (1 dosis) 12 0,32 ± 0,14 kg/día

3: vORF2 -4 µg (1 dosis) 12 0,22 ± 0,09 kg/día

4: rORF2 -16 µg (1 dosis) 11 0,38 ± 0,14 kg/día

5: rORF2 -8 µg (1 dosis) 12 0,43 ± 0,09 kg/día

6: rORF2 -4 µg (1 dosis) 11 0,33 ± 0,11 kg/día

7: KV (2 dosis) 12 0,23 ± 0,07 kg/día

8: Controles de Enfrentamiento 10 0,34 ± 0,09 kg/día

9: Controles Estrictos Negativos 11 0,48 ± 0,08 kg/día

Los resultados de la serología de PCV2 se presentan a continuación en la Tabla 7. Todos los nueve grupos eran seronegativos para PCV2 el Día -3. El Día 14, los Grupos que recibieron vacunas de vORF2 tenían los títulos más elevados, que oscilaban entre 187,5 y 529,2. Los cerdos que recibieron vacunas virales matadas tenían los títulos siguientes más altos, seguidos de los grupos que recibieron vacunas de rORF2. Los Grupos 8 y 9 permanecieron seronegativos en este momento. El Dia 24 y el Día 31 los cerdos que recibieron vacunas de vORF2 continuaban demostrando una fuerte respuesta serológica, seguida de cerca del grupo que recibía dos dosis de una vacuna viral matada. Los cerdos que recibían vacunas de rORF2 respondían serológicamente más lentamente y los Grupos 8 y 9 continuaban siendo seronegativos. El Día 49, los cerdos que recibían vacuna de vORF2, 2 dosis de la vacuna viral matada y la dosis más baja de rORF2 demostraron las respuestas serológicas más fuertes. Los cerdos que recibieron 16 µg y 8 µg de vacunas de rORF2 tenían títulos IFA ligeramente más altos que los controles de enfrentamiento. El Grupo 9 el Día 49 mostró una fuerte respuesta serológica.

Tabla 7. Sumario del Grupo de Títulos IFA de PCV2

TÍTULO IF A MEDIO

Grupo: Tratamiento Día -3 Día 14 Día 24 Día 31** Día 49***

1: vORF2 -16 µg (1 dosis) 50,0 529,2 4400,0 7866,7 11054,5

2: vORF2 -8 µg (1 dosis) 50.0 500,0 3466,7 6800,0 10181.8

3: vORF2 -4 µg (1 dosis) 50,0 187,5 1133,3 5733,3 9333,3

4: rORF2 -16 µg (1 dosis) 50,0 95,5 1550,0 3090,9 8000,0

5: rORF2 -8 µg (1 dosis) 50,0 75,0 887,5 2266,7 7416,7

6: rORF2 -4 µg (1 dosis) 50,0 50,0 550,0 3118,2 10570,0

7: KV (2 dosis) 50,0 204,2 3087,5 4620,8 8680,0

8: Controles de Enfrentamiento 50,0 55,0 50,0 50,0 5433,3

9: Controles Estrictos Negativos 50,0 59,1 59,1 54,5 6136,4

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; mató virus de células completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado *Para fines de cálculo, un título IFA ≤100 se designó como un título de “50"; un título IFA ≥ 6400 se designó como un título de “12.800". **Día de Enfrentamiento ***Día de la Necropsia

Los resultados de las observaciones clínicas post-enfrentamiento se presentan a continuación en la Tabla 8. Este sumario de resultados incluye observaciones del Comportamiento Anormal, Respiración Anormal, Tos y Diarrea. La 5 Tabla 9 incluye los resultados del Sumario de Incidencia de los Síntomas Clínicos Globales del Grupo y la Tabla 10 incluye los resultados del Sumario de Tasas de Mortalidad del Grupo Post-enfrentamiento. El síntoma clínico más común señalado en este estudio era el comportamiento anormal, el cual se clasificó como letargia de suave a grave. Los cerdos que recibían las 2 dosis más bajas de vORF2, los cerdos que recibían 16 µg de rORF2 y los cerdos que recibían 2 dosis de vacuna KV tenían tasas de incidencia de = 27,3%. Los cerdos que recibían 8 µg de

10 rORF2 y el grupo control estricto negativo no tenían un comportamiento anormal. Ninguno de los cerdos en este estudio mostró respiración anormal. El acceso de tos se observó con frecuencia en todos los grupos (0 a 25%), al igual que la diarrea (0-20%). Ninguno de los síntomas clínicos señalados era patonómico para PMWS.

La incidencia global de los síntomas clínicos varió entre grupos. Los grupos que recibían cualquiera de las vacunas de vORF2, el grupo que recibía 16 µg de rORF2, el grupo que recibía 2 dosis de vacuna KV y el grupo control de

15 enfrentamiento tenían la incidencia más alta de síntomas clínicos globales (≥ 36,4%). El grupo control estricto negativo, el grupo que recibía 8 µg de rORF2 y el grupo que recibía 4 µg de rORF2 tenían tasas de incidencia globales de síntomas clínicos de 0%, 8,3% y 9,1%, respectivamente.

También variaban las tasas de mortalidad global entre grupos. El grupo que recibía 2 dosis de vacuna de KV tenía la tasa de mortalidad más alta (16,7%); mientras que los grupos que recibían 4 µg de vORF2, 16 µg de rORF2 u 8

20 µg de rORF2 y el grupo control estricto negativo tenían todos tasas de mortalidad del 0%.

Tabla 8. Sumario de Observaciones del Grupo para el Comportamiento Anormal, Respiración Anormal, Tos y Diarrea

Grupo: Tratamiento N Comportamiento Anormal1 Comportamiento Anormal2 Tos3 Diarrea4

1: vORF2 -16 µg (1 dosis) 12 2/12 (16,7% 0/12 (0%) 3/12 (25%) 2/12 (16/7%)

2: vORF2 -8 µg (1 dosis) 12 4/12 (33,3%) 0/12 (0%) 1/12 (8,3% 1/12 (8,3%)

3: vORF2 -4 µg (1 dosis) 12 8/12 (66,7%) 0/12 (0%) 2/12 (16,7%) 1/12 (8,3%)

4: rORF2 -16 µg (1 dosis) 11 3/11 (27,3%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 2/11 (18,2%)

5: rORF2 -8 µg (1 dosis) 12 0/12 (0%) 0/12 (0%) 1/12 (8,3%) 0/12 (0%)

6: rORF2 -4 µg (1 dosis) 11 1/11 (9,1%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/12 (0%)

7: KV (2 dosis) 12 7/12 (58.3) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 1/12 (8,3%)

8: Controles de Enfrentamiento 10 1/10 (10%) 0/10 (0%) 2/10 (20%) 2/10 (20%)

9: Controles Estrictos Negativos 11 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%)

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; mató virus de células completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado 1Número total de cerdos en cada grupo que mostró algún comportamiento anormal durante al menos un día 2Número total de cerdos en cada grupo que mostró alguna respiración anormal durante al menos un día 3Número total de cerdos en cada grupo que mostró tos durante al menos un día 4Número total de cerdos en cada grupo que mostró diarrea durante al menos un día

Tabla 9. Sumario de la Incidencia Global del Grupo de Síntomas Clínicos

Grupo: Tratamiento N Incidencia de cerdos con Síntomas Clínicos1 Tasa de Incidencia

1: vORF2 -16 µg (1 dosis) 12 5 41,7 %

2: vORF2 -8 µg (1 dosis) 12 5 41,7 %

3: vORF2 -4 µg (1 dosis) 12 8 66,7 %

4: rORF2 -16 µg (1 dosis) 11 4 36,4 %

5: rORF2 -8 µg (1 dosis) 12 1 8,3 %

6: rORF2 -4 µg (1 dosis) 11 1 9,1 %

7: KV (2 dosis) 12 7 58,3 %

8: Controles de Enfrentamiento 10 4 40 %

9: Controles Estrictos Negativos 11 0 0 %

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; mató virus de células completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado 1Número total de cerdos en cada grupo que mostró cualquier síntoma clínico durante al menos un día

Tabla 10. Sumario de las Tasas de Mortalidad del Grupo Post-enfrentamiento

Grupo: Tratamiento N Muertes Postenfrentamiento Tasa de Mortalidad

1: vORF2 -16 µg (1 dosis) 12 1 8,3 %

2: vORF2 -8 µg (1 dosis) 12 1 8,3 %

3: vORF2 -4 µg (1 dosis) 12 0 0 %

4: rORF2 -16 µg (1 dosis) 11 0 0 %

5: rORF2 -8 µg (1 dosis) 12 0 0 %

6: rORF2 -4 µg (1 dosis) 11 1 9,1 %

7: KV (2 dosis) 12 2 16,7 %

8: Controles de Enfrentamiento 10 1 10 %

9: Controles Estrictos Negativos 11 0 0 %

Los resultados de la secreción nasal de PCV2 se presentan a continuación en la Tabla 11. Después del

5 enfrentamiento el Día 24, 1 cerdo en el Grupo 7 comenzó a secretar PCV2 el Día 27. Ninguno de los otros grupos experimentó la secreción hasta el Día 33. La cuantía de secreción nasal se anotó desde el Día 35 al Día 45. Grupos que recibían cualquiera de las tres vacunas de vORF2 y grupos que recibían 4 u 8 µg de rORF2 tenían la incidencia más baja de secreción nasal de PCV2 (≤ 9,1%). El grupo control de enfrentamiento (Grupo 8) tenía la tasa de secreción más alta (80%), seguido del grupo control estricto negativo (Grupo 9), que tenía una tasa de incidencia de

10 63,6%.

Tabla 11. Sumario de la Incidencia de Secreción Nasal de PCV2 en el Grupo

Grupo: Tratamiento N Nº de cerdos que secretó durante al menos un día Tasa de Incidencia

1: vORF2 -16 µg (1 dosis) 12 1 8,3 %

2: vORF2 -8 µg (1 dosis) 12 1 8,3 %

3: vORF2 -4 µg (1 dosis) 12 1 8,3 %

4: rORF2 -16 µg (1 dosis) 11 2 18,2 %

5: rORF2 -8 µg (1 dosis) 12 1 8,3 %

6: rORF2 -4 µg (1 dosis) 11 1 9,1 %

7: KV (2 dosis) 12 5 41,7 %

8: Controles de Enfrentamiento 10 8 80 %

9: Controles Estrictos Negativos 11 7 63,6 %

El Sumario de la Incidencia de Íctero del Grupo, la Incidencia de Úlceras Gástricas en el Grupo, las Anotaciones de Lesiones Pulmonares Medias del Grupo y la Incidencia de Lesiones Pulmonares en el Grupo se muestran a continuación en la Tabla 12. Seis cerdos murieron en el primer sitio de ensayo durante la fase de post-vacunación del estudio (Grupo 4, N = 1; Grupo 6, N = 1; Grupo 8, N = 2; Grupo 9, N = 2). Cuatro de seis cerdos tenían lesiones

5 fibrosas en una o más cavidades corporales, un cerdo (Grupo 6) tenía lesiones consistentes con una enfermedad clostridial, y un cerdo (Grupo 9) no tenía lesiones burdas. Ninguno de los cerdos que murieron durante la fase postvacunación del estudio tenía lesiones consistentes con PMWS.

Se realizó una necropsia a cerdos que murieron post-enfrentamiento y a cerdos sometidos a eutanasia el Día 49. En la necropsia, no estaban presentes en ningún grupo íctero ni úlceras gástricas. Con respecto a % medio en las 10 lesiones pulmonares, el Grupo 9 tenía el % medio más bajo en las lesiones pulmonares (0%), seguido del Grupo 1 con 0,40 ± 0,50% y del Grupo 5 con 0,68 ± 1,15%. Los Grupos 2, 3, 7 y 8 tenían el % medio más alto en las lesiones pulmonares (≥ 7,27%). Cada uno de estos cuatro grupos contenía un cerdo con un % de lesiones pulmonares ≥ 71,5%, que sesgó más altos los resultados para estos cuatro grupos. Con la excepción del Grupo 9 con un 0% de lesiones pulmonares observadas, los restantes 8 grupos tenían un ≤ 36% de lesiones pulmonares.

15 Casi todas las lesiones pulmonares observadas se describieron como rojas/púrpura y se consolidaron.

Tabla 12. Sumario de la Incidencia de Íctero en el Grupo, Incidencia de Úlceras Gástricas en el Grupo, % Medio de Anotaciones de Lesiones Pulmonares en el Grupo e Incidencia de Lesiones Pulmonares en el Grupo Anotados

Grupo: Tratamiento Íctero Úlceras Gástricas % Medio de Lesiones Pulmonares Incidencia de Lesiones Pulmonares Anotadas

1: vORF2 -16 µg (1 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 0,40 ± 0,50% 10/12 (83%)

2: vORF2 -8 µg (1 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 7,41 ± 20,2% 10/12 (83%)

3: vORF2 -4 µg (1 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 9,20 ± 20,9% 10/12 (83%)

4: rORF2 -16 µg (1 dosis) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 1,5 ± 4,74% 4/11 (36%)

5: rORF2 -8 µg (1 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 0,68 ± 1,15% 9/12 (75%)

6: rORF2 -4 µg (1 dosis) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 2,95 ± 5,12% 7/11 (64%)

7: KV (2 dosis) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 7,27 ± 22,9% 9/12 (75%)

8: Controles de Enfrentamiento 0/10 (0%) 0/10 (0%) 9,88 ± 29,2% 8/10 (80%)

9: Controles Estrictos Negativos 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0/11 (0%)

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; KV o mató virus de células completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado

El Sumario de los Resultados de la Incidencia IHC Positiva en el Grupo se muestra en la Tabla 13. El Grupo 1

20 (vORF2 -16 µg) y el Grupo 5 (rORF2 -8 µg) tenían la tasa más baja de los resultados IHC positivos (16,7%). El Grupo 8 (Controles de Enfrentamiento) y el Grupo 9 (Controles Estrictos Negativos) tenían la tasa más alta de los resultados IHC positivos, 90% y 90,9%, respectivamente.

Tabla 13. Sumario de la Tasa de Incidencia IHC Positiva en el Grupo

Grupo: Tratamiento N Nº de cerdos que tenían al menos un tejido positivo para PCV2 Tasa de Incidencia

1: vORF2 -16 µg (1 dosis) 12 2 16,7 %

2: vORF2 -8 µg (1 dosis) 12 3 25,0 %

3: vORF2 -4 µg (1 dosis) 12 8 66,7 %

4: rORF2 -16 µg (1 dosis) 11 4 36,3 %

5: rORF2 -8 µg (1 dosis) 12 2 16,7 %

6: rORF2 -4 µg (1 dosis) 11 4 36,4 %

7: KV (2 dosis) 12 5 41,7 %

8: Controles de Enfrentamiento 10 9 90,0 %

9: Controles Estrictos Negativos 11 10 90,9 %

Post-enfrentamiento, el Grupo 5, que recibió una dosis de 8 µg de antígeno rORF2, superó a los otros 6 grupos de vacuna. El Grupo 5 tenía la ADWG más alta (0,43 ± 0,10 kg/día), la incidencia más baja de comportamiento anormal (0%), la segunda incidencia más baja de tos (8,3%), la incidencia más baja de síntomas clínicos globales

5 (8,3%), la tasa de mortalidad más baja (0%), la tasa más baja de secreción nasal de PCV2 (8,3%), la segunda tasa más baja del % medio de lesiones pulmonares (0,68 ± 1,15%) y la tasa de incidencia más baja para tejidos positivos (16,7%). Grupos que recibían diversos niveles de antígeno rORF2 superó globalmente a grupos que recibían diversos niveles de vORF2 y el grupo que recibía 2 dosis de vacuna contra PCV2 de células enteras matadas se manifestó el peor. Las Tablas 14 y 15 contienen sumarios de datos post-enfrentamiento del grupo.

10 Tabla 14. Sumario de Datos Post-Enfrentamiento en el Grupo -Parte 1

Grupo: N Tratamiento ADWG (kg/día) Comportamiento Anormal Tos Incidencia Global de Síntomas Clínicos

1: 12 vORF2 -16 µg (1 dosis) 0,39 ± 0,13% 2/12 (16,7%) 3/12 (25%) 41,7 %

2: 12 vORF2 -8 µg (1 dosis) 0,32 ± 0,14% 4/12 (33,3% 1/12 (8,3% 41,7 %

3: 12 vORF2 -4 µg (1 dosis) 0,22 ± 0,09% 8/12 (66,7%) 2/12 (16,7% 66,7 %

4: 11 rORF2 -16 µg (1 dosis) 0,38 ± 0,14% 3/11 (27,3%) 0/11 (0%) 36,4 %

5: 12 rORF2 -8 µg (1 dosis) 0,43 ± 0,10% 0/12 (0%) 1/12 (8,3% 8,3 %

6: 11 rORF2 -4 µg (1 dosis) 0,33 ± 0,11% 1/11 (9,1% 0/11 (0%) 9,1 %

7: 12 KV (2 dosis) 0,23 ± 0,07% 7/12(58,3) 0/12 (0%) 58,3 %

8: 10 Controles de Enfrentamiento 0,34 ± 0,09% 1/10 (10%) 2/10 (20% 40 %

9: 11 Controles Estrictos Negativos 0,48 ± 0,07% 0/11 (0%) 0/11 (0%) 0 %

5

10

15

20

25

30

Tabla 15. Sumario de Datos Post-Enfrentamiento en el Grupo -Parte 2

Grupo: N Tratamiento Tasa de Mortalida d Secreción Nasal % Medio de Lesiones Pulmonares Tasa de Incidencia de al menos un tejido IHC positivo para PCV2

1: 12 vORF2 -16 µg (1 dosis) 8,3 % 8,3 % 0,40 ± 0,50% 16,7 %

2: 12 vORF2 -8 µg (1 dosis) 8,3 % 8,3 % 7,41 ± 20,2% 25,0 %

3: 12 vORF2 -4 µg (1 dosis) 0 % 8,3 % 9,20 ± 20,9% 66,7 %

4: 11 rORF2 -16 µg (1 dosis) 0 % 18,2 % 1,50 ± 4,74% 36,3 %

5: 12 rORF2 -8 µg (1 dosis) 0 % 8,3 % 0,68 ± 1,15% 16,7 %

6: 11 rORF2 -4 µg (1 dosis) 9,1 % 9,1 % 2,95 ± 5,12% 36,4 %

7: 12 KV (2 dosis) 16,7 % 41,7 % 7,27 ± 22,9% 41,7 %

8: 10 Controles de Enfrentamiento 10 % 80 % 9,88 ± 29,2% 90,0 %

9: 11 Controles Estrictos Negativos 0 % 63,6 % 0/11 (0%) 90,9 %

Los resultados de este estudio indican que todos los esfuerzos adicionales de vacunas deberían dirigirse a una vacuna de rORF2. En general, la secreción nasal de PCV2 fue detectada post-enfrentamiento y la vacunación con una vacuna contra PCV2 dio como resultado una reducción de la secreción. La inmunohistoquímica de tejidos linfoides seleccionados servía también como un buen parámetro de la eficacia de la vacuna, mientras que grandes diferencias en la ADWG, los síntomas clínicos y las grandes lesiones no se detectaron entre grupos. Este estudio se complicó por el hecho de que PCV2 extraño se introdujo en el mismo punto durante el estudio, según se evidencia por la secreción nasal de PCV2, seroconversión de PCV2 y tejidos IHC positivos en el Grupo 9, el grupo control estricto negativo.

Discusión

Siete vacunas contra PCV2 fueron evaluadas en este estudio, que incluía tres niveles de dosis diferentes de antígeno vORF2 administrada una vez al Día 0, tres niveles de dosis diferentes de antígeno rORF2 administrados una vez el Día 0 y un nivel de dosis de vacuna contra PCV2 de células enteras matadas, administrada el Día 0 y el Día 14. En general, el Grupo 5, que recibía 1 dosis de vacuna que contenía 8 µg de antígeno rORF2, tenía los mejores resultados. El Grupo 5 tenía la ADWG más alta, la incidencia más baja de comportamiento anormal, la incidencia más baja de respiración anormal, la segunda incidencia más baja de tos, la incidencia más baja de síntomas clínicos globales, la tasa de mortalidad más baja, la tasa más baja de secreción nasal de PCV2, la segunda tasa más baja del % medio de lesiones pulmonares y la tasa de incidencia más baja para tejidos IHC positivos.

De manera interesante, el Grupo 4, que recibió una dosis más alta de antígeno rORF2 que el Grupo 5, no se comportó tan bien ni mejor que el Grupo 5. El Grupo 4 tenía una ADWG ligera menor, una mayor incidencis de comportamiento anormal, una mayor incidencia de síntomas clínicos globales, una mayor tasa de secreción nasal de PCV2, un mayor % medio de lesiones pulmonares y una mayor tasa de tejidos IHC positivos que el Grupo 5. Los análisis estadísticos, que pueden indicar que las diferencias entre estos dos grupos no eran estadísticamente significativas, no se realizaron en estos datos, pero existía una tendencia observada de que el Grupo 4 no se comportaba tan bien como el Grupo 5.

Post-vacunación, 6 cerdos murieron en el primer sitio de estudio. Cuatro de los seis cerdos procedían del Grupo 8 o del Grupo 9, que no recibieron ninguna vacuna. Ninguno de los seis cerdos mostró lesiones consistentes con PMWS, no se informó de sucesos adversos y, en general, las siete vacunas parecían ser seguras cuando se administraban a cerdos de aproximadamente 11 días de edad. Durante la fase de post-vacunación del estudio, los cerdos recibieron tres niveles de dosis de vacuna vORF2 o la vacuna de células enteras matadas tenía los niveles IFAT más altos, mientras que el Grupo 5 tenía los niveles IFAT más bajos justo antes del enfrentamiento de los grupos de vacuna.

imagen15

Algunas conclusiones adicionales que surgen de este estudio son que la linfoadenopatía es un distintivo de PMWS. Otro de los distintivos de PMWS es el agotamiento linfoide e histiocitos multinucleados/gigantes. Adicionalmente, no se observaron sucesos adversos ni reacciones en el sitio de inyección para ninguna de las 7 vacunas contra PCV2, y las 7 vacunas contra PCV2 parecían ser seguras cuando se administraban a cerdos jóvenes.

5 Ejemplo 5

Este ejemplo somete a ensayo la eficacia de ocho vacunas candidatas contra PCV2 y reconfirma los parámetros de enfrentamiento a PCV2 de estudios de enfrentamiento anteriores después de la exposición a una cepa virulenta de PCV2. Ciento cincuenta (150) cochinillos desprovistos de calostro derivado de la cesárea (CDCD), de 6-16 días de edad, se bloquearon en peso y se dividieron al azar en 10 grupos de igual tamaño. La Tabla 16 recoge el Diseño de

10 Estudio General para este Ejemplo.

Tabla 16. Diseño de Estudio General

Grupo: Nº de Cerdos Tratamiento Día de Tratamiento KLH/ICFA el Día 22 y el Día 28 Enfrentamiento con PCV2 Virulento el Día 25 PRRSV MLV el Día 46 Necropsia el Día 50

1: 15 Vacuna 1 contra PVC2 16 µg rORF2 – IMS 1314 0 y 14 + + + +

2: 15 Vacuna 2 contra PVC2 16 µg vORF2 – Carbopol 0 y 14 + + + +

3: 15 Vacuna 3 contra PCV2 16 µg rORF2 – Carbopol 0 y 14 + + + +

4: 15 Vacuna 2 contra PCV2 16 µg vORF2 – Carbopol 0 + + + +

5: 15 Vacuna 3 contra PVC2 4 µg rORF2 – Carbopol 0 y 14 + + + +

6: 15 Vacuna 3 contra PVC2 1 µg rORF2 – Carbopol 0 y 14 + + + +

7: 15 Vacuna 3 contra PVC2 0,25 µg rORF2 – Carbopol 0 y 14 + + + +

8: 15 Vacuna 4 contra PVC2 > 8,0 log KV – Carbopol 0 y 14 + + + +

imagen16

fin de determinar el uso de datos recogidos del animal en el análisis final. Se documentó la fecha en la que se excluyó a los cerdos enrolados y el motivo de la exclusión. No se excluyeron cerdas que cumplían con los criterios de inclusión, seleccionadas para el estudio y fueron transportadas al primer sitio de estudio. No se excluyeron cochinillos del estudio, y antes de terminar no se retiró del estudio a ningún animal de ensayo. La Tabla 17 describe los intervalos de tiempo para las actividades clave de este Ejemplo.

Tabla 17. Actividades de Estudio

Día de Estudio: Fechas Reales Actividad de Estudio

-3: 04-4-03 Cerdos pesados; exam. de salud; distribuidos al azar en grupos; muestras tomadas de sangre

-3 0-21: 04-4-03 07-4-03 a 27-5-03 Observados en cuanto a la salud general y en cuanto a sucesos adversos postvacunación

0: 07-4-03 Administrados IVPs respectivos a los Grupos 1-8

0-7: 07-4-03 14-4-03 Cerdos observados en cuanto a reacciones en los sitios de inyección

14: 21-4-03 Grupos 1-3, 5-8 reforzados con IVPs respectivos; tomadas muestras de sangre de todos los cerdos

14-21: 21-4-03 a 28-4-03 Cerdos observados en cuanto a reacciones de inyección

19-21: 26-4-03 a 28-4-03 Todos los cerdos tratados con antibióticos

21: 28-4-03 Cerdos transportados desde Struve Labs, Inc. a Veterinary Resources, Inc. (VRI)

22-50: 28-4-03 a 27-5-03 Cerdos observados en cuanto a síntomas clínicos post-enfrentamiento

22: 29-4-03 Grupos 1-10 tratados con KLH/ICFA

25: 02-5-03 Muestras de sangre tomadas de todos los cerdos; pesados todos los cerdos; Grupos 1-9 enfrentados con material de enfrentamiento de PCV2

28: 05-5-03 Grupos 1-10 tratados con KLH/ICFA

32: 09-5-03 Muestras de sangre tomadas de todos los cerdos

46: 23-5-03 INGELVAC® PRRS MLV administrado a todos los grupos

50: 27-5-03 Muestra tomadas de sangre, pesados y sometidos a necropsia a todos los cerdos; se registraron lesiones burdas; los pulmones se evaluaron en cuanto a lesiones; se guardaron muestras de tejido recientes y fijadas con formalina; se completó la fase viva del estudio

Después de completarse la fase en vivo del estudio, tejidos fijados con formalina fueron examinados por inmunohistoquímica (IHC) para la detección de antígeno de PCV2 por parte de un patólogo, las muestras de sangre

10 se evaluaron en cuanto a la serología de PCV2 y la ganancia de peso media diaria (ADWG) fue determinada desde el Día 25 al Día 50.

Los animales fueron alojados en el primer sitio de estudio en jaulas individuales en siete recintos desde el nacimiento hasta aproximadamente 11 días de edad (aproximadamente el Día 0 del estudio). Cada recinto era idéntico en su distribución y consistía en jaulas de acero inoxidable individuales apiladas, siendo suministrado aire

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6: rORF2 – 1 µg – Carbopol 2 dosis 15 0,50 ± 0,12 kg/día

7: rORF2 – 0,25 µg – Carbopol 2 dosis 15 0,45 ± 0,20 kg/día

8: KV > 8,0 log – Carbopol 2 dosis 15 0,42 ± 0,15 kg/día

9: Controles de Enfrentamiento 14 0,36 ± 0,13 kg/día

10: Controles Estrictos Negativos 15 0,48 ± 0,10 kg/día

Los resultados de la serología de PCV2 se presentan a continuación en la Tabla 19. Todos los diez (10) grupos eran seronegativos para PCV2 el Día -3. El Día 14, los títulos de PCV2 seguían bajos para los diez (10) grupos (intervalo de 50-113). El Día 25, el Grupo 8, que recibía la vacuna de virus matado de células completas tenía el 5 título de PCV2 más alto (4617), seguido del Grupo 2, que recibía 16 µg de vORF2 – Carbopol, el Grupo 4, que recibía como dosis única 16 µg de vORF2 – Carbopol, y el Grupo 3, que recibía 16 µg de rORF2 – Carbopol, que tenían títulos de 2507, 1920 y 1503, respectivamente. El Día 32 (una semana post enfrentamiento), los títulos para los Grupos 1-6 y el Grupo 8 oscilaban entre 2360 y 7619; mientras que los Grupos 7 (0,25 µg de rORF2 – Carbopol), 9 (Control de Enfrentamiento) y 10 (control estricto negativo) tenía títulos de 382, 129 y 78,

10 respectivamente. El Día 50 (día de la necropsia), los diez (10) grupos mostró altos títulos de PCV2 (= 1257).

Los Días 25, 32 y 50, el Grupo 3, que recibía dos dosis de 16 µg de rORF2 – Carbopol tenía títulos de anticuerpos mayores que el Grupo 1, que recibía dos dosis de 16 µg de rORF2 – IMS 1314. Los Días 25, 32 y 50, Grupo 2, que recibía dos dosis de 16 µg de vORF2 tenía títulos mayores que el Grupo 4, que recibía solamente una dosis de la misma vacuna. Los Grupos 3, 5, 6, 7, que recibían niveles decrecientes de rORF2 – Carbopol, de 16, 4, 1 y 0,25 µg,

15 respectivamente, mostró títulos de anticuerpos correspondientemente decrecientes los Días 25 y 32.

Tabla 19. Sumario del Grupo de Títulos IFA de PCV2

Grupo: Tratamiento Día -3 Día 14** Día 25*** Día 32 Día 50****

1: rORF2 -16 µg – IMS 1314 2 dosis 50 64 646 3326 4314

2: vORF2 – 16 µg – Carbopol 2 dosis 50 110 2507 5627 4005

3: rORF2 – 16 µg – Carbopol 2 dosis 50 80 1503 5120 6720

4: vORF2 – 16 µg – Carbopol 1 dosis 50 113 1920 3720 1257

5: rORF2 -4 µg – Carbopol 1 dosis 50 61 1867 3933 4533

6: rORF2 -1 µg – Carbopol 2 dosis 50 70 490 2360 5740

7: rORF2 – 0,25 µg – Carbopol 2 dosis 50 73 63 382 5819

8: KV > 8,0 log – Carbopol 2 dosis 50 97 4617 7619 10817

9: Controles de Enfrentamiento 50 53 50 129 4288

10: Controles Estrictos Negativos 50 50 50 78 11205

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; KV o mató virus de células

completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado *Para fines de cálculo, un título IFA ≤100 se designó como un título de “50"; un título IFA ≥ 6400 se designó como un título de “12.800".

**Día de Enfrentamiento ***Día de la Necropsia

Los resultados de las observaciones clínicas post-enfrentamiento se presentan a continuación. La Tabla 20 incluye observaciones para el Comportamiento Anormal, Respiración Anormal, Tos y Diarrea. La Tabla 21 incluye los resultados del Sumario de Incidencia de los Síntomas Clínicos Globales del Grupo y la Tabla 22 incluye los 5 resultados del Sumario de Tasas de Mortalidad del Grupo Post-enfrentamiento. La incidencia del comportamiento anormal, respiración anormal y tos post-enfrentamiento era baja en cerdos que recibían 16 µg de rORF2–IMS 1314 (Grupo 1), 16 µg de rORF2–Carbopol (Grupo 3), 1 µg de rORF2–Carbopol (Grupo 6), 0,25 µg de rORF2–Carbopol (Grupo 7), y en cerdos en el Grupo Control de Enfrentamiento (Grupo 9). La incidencia del comportamiento anormal, respiración anormal y tos post-enfrentamiento era cero en cerdos que recibían 16 µg de vORF2–Carbopol

10 (Grupo 2), una dosis única de 16 µg de vORF2–Carbopol (Grupo 4), 4 µg de rORF2–Carbopol (Grupo 5), >8 log de KV–Carbopol (Grupo 8), y en cerdos en el Grupo Control Estricto Negativo (Grupo 10).

La incidencia global de los síntomas clínicos varió entre grupos. Los cerdos que recibían de 16 µg de vORF2– Carbopol (Grupo 2), una dosis única de 16 µg de vORF2–Carbopol (Grupo 4), y los cerdos en el grupo control estricto negativo (Grupo 10) tenía tasas de incidencia de 0%; cerdos que recibían 16 µg de rORF2–Carbopol (Grupo

15 3),y1 µg de rORF2–Carbopol (Grupo 6) tenía tasas de incidencia de 6,7%; cerdos que recibían 16 µg de rORF2– IMS 1314 (Grupo 1) tenían una tasa de incidencia global de 7,1%; cerdos que recibían 4 µg de rORF2–Carbopol (Grupo 5), 0,25 µg de rORF2–Carbopol (Grupo 7) y vacuna KV >8 log tenía tasas de incidencia de 13,3%; y cerdos en el Grupo Control de Enfrentamiento (Grupo 9) tenía una tasa de incidencia de 14,3%.

También variaban las tasas de mortalidad global entre grupos. El grupo 8, que recibía 2 dosis de vacuna de KV

20 tenía la tasa de mortalidad más alta de 20,0%; seguido del Grupo 9, el grupo control de enfrentamiento, y el Grupo 7, que recibía 0,25 µg de rORF2–Carbopol y tenía tasas de mortalidad de 14,3% y 13,3%, respectivamente. El Grupo 4, que recibía una dosis de 16 µg de vORF2–Carbopol tenía una tasa de mortalidad de 6,7%. Todos los otros Grupos 1, 2, 3, 5, 6 y 10 tenían una tasa de mortalidad del 0%.

Tabla 20. Sumario de Observaciones del Grupo para el Comportamiento Anormal, Respiración Anormal y Tos Post25 Enfriamiento

Grupo: Tratamiento N Comportamiento Anormal1 Comporta-miento Anormal2 Tos3

1: rORF2 -16 µg – IMS 1314 2 dosis 14 0/14 (0%) 0/14 (0%) 1/14 (7,1 %)

2: vORF2 – 16 µg – Carbopol 2 dosis 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 0/15 (0%)

3: rORF2 – 16 µg – Carbopol 2 dosis 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 1/15 (6,7 %)

4: vORF2 – 16 µg – Carbopol 1 dosis 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 0/15 (0%)

5: rORF2 -4 µg – Carbopol 1 dosis 15 1/15 (6,7 %) 1/15 (6,7 %) 0/15 (0%)

6: rORF2 -1 µg – Carbopol 2 dosis 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 1/15 (6,7 %)

7: rORF2 – 0,25 µg – Carbopol 2 dosis 15 0/15 (0%) 1/15 (6,7 %) 1/15 (0,67 %)

8: KV > 8,0 log – Carbopol 2 dosis 15 1/15 (6,7 %) 1/15 (6,7 %) 0/15 (0%)

9: Controles de Enfrentamiento 14 1/14 (7,1 %) 1/14 (7,1 %) 2/14 (14/3%)

10: Controles Estrictos Negativos 15 0/15 (0%) 0/15 (0%) 0/15 (0%)

1Número total de cerdos en cada grupo que mostró algún comportamiento anormal durante al menos un día 2Número total de cerdos en cada grupo que mostró alguna respiración anormal durante al menos un día 3Número total de cerdos en cada grupo que mostró tos durante al menos un día

Tabla 21. Sumario de la Incidencia Global del Grupo de Síntomas Clínicos Post-Enfrentamiento

1: rORF2 -16 µg – IMS 1314 2 dosis 14 1 7,1 %

2: vORF2 – 16 µg – Carbopol 2 dosis 15 0 0,0 %

3: rORF2 – 16 µg – Carbopol 2 dosis 15 1 6,7 %

4: vORF2 – 16 µg – Carbopol 1 dosis 15 0 0,0 %

5: rORF2 -4 µg – Carbopol 1 dosis 15 2 13,3 %

6: rORF2 -1 µg – Carbopol 2 dosis 15 1 6,7 %

7: rORF2 – 0,25 µg – Carbopol 2 dosis 15 2 13,3 %

8: KV > 8,0 log – Carbopol 2 dosis 15 2 13,3 %

9: Controles de Enfrentamiento 14 2 14,3 %

10: Controles Estrictos Negativos 15 0 0,0 %

vORF2 = ORF2 viral aislado; rORF2 = ORF2 expresado en baculovirus recombinante; KV o mató virus de células completos = virus PCV2 desarrollado en un cultivo celular adecuado 1Número total de cerdos en cada grupo que mostró cualquier síntoma clínico durante al menos un día

Tabla 22. Sumario de las Tasas de Mortalidad del Grupo Post-enfrentamiento

Grupo: Tratamiento N Muertes Postenfrentamiento Tasa de Mortalidad

1: rORF2 -16 µg – IMS 1314 2 dosis 14 0 0,0 %

2: vORF2 – 16 µg – Carbopol 2 dosis 15 0 0,0 %

3: rORF2 – 16 µg – Carbopol 2 dosis 15 0 0,0 %

4: vORF2 – 16 µg – Carbopol 1 dosis 15 1 6,7 %

5: rORF2 -4 µg – Carbopol 1 dosis 15 0 0,0 %

6: rORF2 -1 µg – Carbopol 2 dosis 15 0 0,0 %

7: rORF2 – 0,25 µg – Carbopol 2 dosis 15 2 13,3 %

8: KV > 8,0 log – Carbopol 2 dosis 15 3 20,0 %

9: Controles de Enfrentamiento 14 2 14,3 %

10: Controles Estrictos Negativos 15 0 0,0 %

El Sumario del Porcentaje Medio de Lesiones Pulmonares y la Diagnosis Tentativa se da a continuación en la Tabla

23. El Grupo 9, el grupo control de enfrentamiento, tenía el porcentaje más alto de lesiones pulmonares con una media de 10,81 ± 23,27%, seguido del Grupo 7, que recibía 0,25 µg de rORF2–Carbopol y tenía una media de 6,57

5 ± 24,74%, el Grupo 5, que recibía 4 µg de rORF2–Carbopol y tenía una media de 2,88 ± 8,88%, y el Grupo 8, que recibía la vacuna de KV y tenía una media de 2,01 ± 4,98%. Los restantes seis (6) grupos tenían un porcentaje medio de lesiones pulmonares que oscilaba entre 0,11 ± 0,38% y 0,90 ± 0,15%.

El diagnóstico tentativo de neumonía variaba entre los grupos. El Grupo 3, que recibía dos dosis de 16 µg de rORF2–Carbopol, tenía el diagnóstico tentativo de neumonía más bajo, con 13,3%. El Grupo 9, el grupo control de

10 enfrentamiento, tenía al 50% del grupo diagnosticado tentativamente de neumonía, seguido del Grupo 10, el grupo control estricto negativo y el Grupo 2, que recibieron dos dosis de 16 µg de vORF2–Carbopol, con 46,7% de 40%, respectivamente, diagnosticado tentativamente de neumonía.

Los Grupos 1, 2, 3, 5, 9 y 10 tenían el 0% del grupo diagnosticado tentativamente como infestado con PCV2; mientras que el Grupo 8, que recibía dos dosis de vacuna KV, tenía la más alta tasa en el grupo del diagnóstico

15 tentativo de infección por PCV2, con el 20%. El Grupo 7, que recibía dos dosis de 0,25 µg de rORF2–Carbopol, y el Grupo 4, que recibía una dosis de 16 µg de vORF2–Carbopol tenían diagnósticos de grupo tentativos de infección por PCV2 en el 13,3% y 6,7% de cada grupo, respectivamente.

Úlceras gástricas fueron sólo diagnosticadas en un cerdo en el Grupo 7 (6,7%); mientras que los otros 9 grupos permanecieron exentos de úlceras gástricas.

20 Tabla 23. Sumario del % Medio de Lesiones Pulmonares y Diagnóstico Tentativo en el Grupo

1: rORF2 -16 µg – IMS 1314 2 dosis 15 0 0 %

2: vORF2 – 16 µg – Carbopol 2 dosis 15 1 6,7 %

3: rORF2 – 16 µg – Carbopol 2 dosis 15 3 20,0 %

4: vORF2 – 16 µg – Carbopol 1 dosis 15 2 13,3 %

5: rORF2 -4 µg – Carbopol 1 dosis 15 3 20,0 %

6: rORF2 -1 µg – Carbopol 2 dosis 15 6 40,0 %

7: rORF2 – 0,25 µg – Carbopol 2 dosis 15 7 46,7 %

8: KV > 8,0 log – Carbopol 2 dosis 15 12 80 %

9: Controles de Enfrentamiento 14 14 100,0 %

10: Controles Estrictos Negativos 15 14 93,3 %

El Sumario de los Resultados de la Incidencia IHC Positiva en el Grupo se muestra a continuación en la Tabla 24. El Grupo 1 (16 µg de rORF2 – IMS 1314) tenía la tasa de grupo más baja de resultados IHC positivos con 0% de los cerdos positivos para PCV2, seguido del Grupo 2 (16 µg de vORF2 – Carbopol) y del Grupo 4 (dosis única de 16 µg de vORF2 – Carbopol), que tenía tasas IHC del grupo de 6,7% y 13,3%, respectivamente. El Grupo 9, el grupo control de enfrentamiento, tenía la tasa de incidencia IHC positiva más alta con un 100% de los cerdos positivos para PCV2, seguido del Grupo 10, el grupo control estricto negativo, y el Grupo 8 (vacuna de KV), con 93,3% y 80% de los cerdos positivos para PCV2, respectivamente.

Tabla 24. Sumario de la Tasa de Incidencia IHC Positiva en el Grupo

1: rORF2 -16 µg – IMS 1314 2 dosis 15 0 0 %

2: vORF2 – 16 µg – Carbopol 2 dosis 15 1 6,7 %

3: rORF2 – 16 µg – Carbopol 2 dosis 15 3 20,0 %

4: vORF2 – 16 µg – Carbopol 1 dosis 15 2 13,3 %

5: rORF2 -4 µg – Carbopol 1 dosis 15 3 20,0 %

6: rORF2 -1 µg – Carbopol 2 dosis 15 6 40,0 %

7: rORF2 – 0,25 µg – Carbopol 2 dosis 15 7 46,7 %

8: KV > 8,0 log – Carbopol 2 dosis 15 12 80 %

9: Controles de Enfrentamiento 14 14 100,0 %

10: Controles Estrictos Negativos 15 14 93,3 %

10 Discusión

En este ejemplo se evaluaron siete vacunas contra PCV2, que incluían una alta dosis (16 µg) de antígeno rORF2 adyuvado con IMS 1314 administrado dos veces, una alta dosis (16 µg) de antígeno vORF2 adyuvado con Carbopol administrado una vez a un grupo de cerdos y dos veces a un segundo grupo de cerdos, una alta dosis (16 µg) de antígeno rORF2 adyuvado con Carbopol administrado dos veces, una dosis de 4 µg de antígeno rORF2 adyuvado 15 con Carbopol administrado dos veces, una dosis de 1 µg de antígeno rORF2 adyuvado con Carbopol administrado dos veces, una baja dosis (0,25 µg) de antígeno rORF2 adyuvado con Carbopol administrado dos veces, y una alta dosis (> 8 log) de vacuna contra PCV2 de células enteras matadas, adyuvada con Carbopol. En general, el Grupo 1, que recibía dos dosis de 16 µg de rORF2 – IMS 1314, se comportaba ligeramente mejor que los Grupos 2 a 7, que recibían vacunas que contenían diversos niveles de antígeno vORF2 o rORF2 adyuvado con Carbopol y mucho 20 mejor que el Grupo 8, que recibía dos dosis de vacuna contra PCV2 de células enteras matadas. El Grupo 1 tenía la tercera ADWG más alta (0,81 ± 0,14 kg/día), la incidencia más baja de comportamiento anormal (0%), la incidencia más baja de respiración anormal (0%), una incidencia baja de tos (7,1%), una baja incidencia de síntomas clínicos globales (7,1%), estaba empatado con otros tres grupos en cuanto a la más baja tasa de mortalidad (0%), la segunda tasa más baja del % medio de lesiones pulmonares (0,15 ± 0,34%), la segunda tasa

25 más baja de neumonía (21,4%) y la tasa de incidencia más baja para tejidos IHC positivos (0%). Sin embargo, el Grupo 1 era el único grupo en el que se observaban reacciones en el sitio de inyección, que incluía el 50% de los vacunados 1 día después de la segunda vacunación. Las otras vacunas administradas a los Grupos 2 a 7 se comportaban mejor que la vacuna matada y casi tan bien como la vacuna administrada al Grupo 1.

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Claims

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