ES2553726T3 - Cetol-ácido reductoisomerasa que utiliza NADH - Google Patents

Cetol-ácido reductoisomerasa que utiliza NADH Download PDF

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Mark J. Nelson
Der-Ing Liao
Daniel P. O'keefe
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Abstract

Una enzima cetol-ácido reductoisomerasa como se expone en la ID de SEC Nº: 17 que comprende mutaciones en los restos 47, 50, 52 y 53, que opcionalmente comprende además al menos una mutación en un resto seleccionado del grupo que consiste en 24, 33, 61, 80, 115, 156, 165 y 170, en el que dicha enzima cetol-ácido reductoisomerasa tiene una preferencia por la unión NADH en lugar de por NADPH, y en donde dicha enzima cetol-ácido reductoisomerasa es una enzima cetol-ácido reductoisomerasa de clase I.

Description

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temperaturas durante 10 min era el número promedio de experimentos triples y se normalizó a la actividad medida a temperatura ambiente.
Figura 8 -Alineamiento múltiple de secuencias entre 5 moléculas KARI que existen en la naturaleza. Las posiciones resaltadas en negrita y gris fueron identificados por PCR propensa a error y de las posiciones solo resaltadas en gris 5 fueron objeto de mutagénesis.
Figura 9 -Alineamiento de las veinticuatro secuencias KARI funcionalmente verificadas. El motivo GxGXX(G/A) involucrado en la unión de NAD(P)H se indica debajo del alineamiento.
Figura 10 -Un ejemplo del alineamiento de Pf5-KARI Pseudomonas fluorescens para el perfil HMM de KARI. Las once posiciones que son responsables de conmutación del co-factor están en negrita y sombreadas en gris.
10 Tabla 9-es una tabla del perfil HMM de las enzimas KARI descritas en el Ejemplo 5. Los once posiciones en el perfil HMM que representan las columnas en el alineamiento que corresponden a las once posiciones de conmutación del cofactor en Pf-5-KARI Pseudomonas fluorescens están identificadas como posiciones 24, 33, 47, 50, 52, 53, 61, 80, 115, 156 y 170. Las líneas correspondientes a estas posiciones en el archivo de modelo se resaltan en amarillo. La Tabla 9 se presenta adjunta electrónicamente.
15 Las siguientes secuencias se ajustan a 37 C.F.R. 1.821-1.825 ("Requisitos para las solicitudes de patente que contienen secuencias de nucleótidos y/o divulgaciones de secuencias de aminoácidos -las Reglas de Secuencias") y son compatibles con la Norma ST.25 (1998) de la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (WIPO) y los requisitos del listado de secuencias de los de EPO y PCT (Reglas 5.2 y 49.5 (a-bis), y la Sección 208 y el Anexo C de las Instrucciones Administrativas). Los símbolos y formato utilizados para los datos de secuencias de nucleótidos
20 y aminoácidos cumplen con las reglas establecidas en 37 CFR §1.822.
Tabla 1
Cebadores de oligonucleótidos utilizados en esta invención
Cebadores de oligonucleótidos utilizados en esta invención
ID de SECUENCIA No.
SECUENCIA Descripción
1
TGATGAACATCTTCGCGTATTCGCCGTCCT Cebador inverso para el vector pBAD
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imagen4 Cebador directo de biblioteca C
3
imagen5 Cebador directo de biblioteca E
4
imagen6 Cebador directo de biblioteca F
5
imagen7 Cebador directo de biblioteca G
6
imagen8 Cebador directo de biblioteca H
7
AAGATTAGCGGATCCTACCT Cebador de secuenciación (directo)
8
AACAGCCAAGCTTTTAGTTC Cebador de secuenciación (inverso)
20
CTCTCTACTGTTTCTCCATACCCG pBAD_266-021308f
21
CAAGCCGTGGGCTTCAGCCTTGGCKNN PF5_53Mt022908r
22
CGGTTTCAGTCTCGTCCTTGAAG pBAD 866-021308
49
GCTCAAGCANNKAACCTGAAGG pBAD-405-C33_090808f
50
CCTTCAGGTTKNNTGCTTGAGC pBAD-427-C33_090808r
51
GTAGACGTGNNKGTTGGCCTG pBAD-435-T43_090808f
52
CAGGCCAACKNNCACGTCTAC pBAD-456-T43_090808r
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ID de SEC Nº: 30: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Natronomonas pharaonis DSM 2160 ID de SEC Nº: 31: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 ID de SEC Nº: 32: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ID de SEC Nº: 33: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Phaeospirilum molischianum ID de SEC Nº: 34: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Zymomonas mobilis subsp. mobilis ZM4 ID de SEC Nº: 35: es la secuencia de aminoácidos para KARI Alkalilimnicola ehrlichei MLHE-1 ID de SEC Nº: 36: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Campylobacter lari RM2100 ID de SEC Nº: 37: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Marinobacter aquaeolei VT8 ID de SEC Nº: 38: es la secuencia de aminoácidos para KARI Psychrobacter arcticus 273-4 ID de SEC Nº: 39: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Hahella chejuensis KCTC2396 ID de SEC Nº: 40: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Thiobacillus denitrificans ATCC25259 ID de SEC Nº: 41: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Azotobacter vinelandii AvOP ID de SEC Nº: 42: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Pseudomonas syringae pv. syringae B728a ID de SEC Nº: 43: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000 ID de SEC Nº: 44: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Pseudomonas putida KT2440 ID de SEC Nº: 45: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Pseudomonas entomophila L48 ID de SEC Nº: 46: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Pseudomonas mendocina ymp ID de SEC Nº: 47: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Bacillus cereus ATCC10987 NP_977840.1 ID de SEC Nº: 48: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Bacillus cereus ATCC10987 NP_978252.1 ID de SEC Nº: 63: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Escherichia coli-Número de Acceso al Banco de
Genes P05793
ID de SEC Nº: 64: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Marine Gamma Proteobacterium HTCC2207 -Número de Acceso al Banco de Genes ZP-01224863.1 ID de SEC Nº: 65: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Desulfuromonas acetoxidans -Número de Acceso
al Banco de Genes ZP-01313517.1
ID de SEC Nº: 66: es la secuencia de aminoácidos para KARI de Pisum sativum (pea) -Número de Acceso al Banco de Genes 082043 ID de SEC Nº: 67: es la secuencia de aminoácidos para el mutante 3361G8
(C33L/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/T801)
ID de SEC Nº: 68: es la secuencia de aminoácidos del 2H10 mutante (Y24F/C33L/R47Y/S50A/T52D/V53I/L61F/T80I/A156V) ID de SEC Nº: 69: es la secuencia de aminoácidos del 1D2 mutante
(Y24F/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/T80I/A156V ID de SEC Nº: 70: es la secuencia de aminoácidos del 3F12 mutante (Y24F/C33L/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/T80I/A156V).
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a la generación de enzimas KARI mutadas para usar NADH en lugar de NADPH. Estas enzimas de co-factor conmutado funcionan de manera más eficaz en los sistemas microbianos diseñados para producir isobutanol. Isobutanol es un importante producto químico industrial de entre los productos básicos con una variedad de aplicaciones, donde su potencial como un combustible o un aditivo de combustible es particularmente significativo. Aunque sólo un alcohol de cuatro carbonos, butanol tiene un contenido de energía similar al de la gasolina y se puede mezclar con cualquier combustible fósil. Isobutanol está favorecido como un combustible o un aditivo del combustible, ya que produce sólo CO2 y poco o ningún SOX o NOX cuando se quema en
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un motor estándar de combustión interna. Además el butanol es menos corrosivo que el etanol, el aditivo de combustible más preferido hasta la fecha.
Las siguientes definiciones y abreviaturas se han de utilizar para la interpretación de las reivindicaciones y de la memoria descriptiva.
El término "invención" o la expresión "presente invención" como se utiliza en el presente documento está destinado a aplicarse en general a todas las realizaciones de la invención descritas en las reivindicaciones como presentadas o más tarde modificadas y complementadas, o en la memoria descriptiva.
La expresión "ruta biosintética del isobutanol" se refiere a la ruta enzimática para producir isobutanol. Rutas biosintéticas de isobutanol preferidas se ilustran en la Figura 1 y se describen en el presente documento.
La expresión "ensayo de consumo de NADPH" se refiere a un ensayo enzimático para la determinación de la actividad específica de la enzima KARI, que implica medir la desaparición del cofactor KARI, NADPH, de la reacción enzimática.
"KARI" es la abreviatura de la enzima cetol-ácido reductoisomerasa.
La expresión "proximidad cercana" cuando se refiere a la posición de diversos restos de aminoácidos de una enzima KARI con respecto al adenosil 2’-fosfato de NADPH significa aminoácidos en el modelo tridimensional para la estructura de la enzima que se encuentran a unos 4,5 Å del átomo de fósforo del adenosil 2’-fosfato de NADPH ligado a la enzima.
La expresión "Cetol-ácido reductoisomerasa " (abreviado "KARI"), y "Acetohidroxiácido isomerorreductasa" se utilizarán de forma intercambiable y se refieren a la enzima que tiene el número de la CE, EC 1.1.1.86 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego). La cetol-ácido reductoisomerasa cataliza la reacción de (S)acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato, como se describe más completamente a continuación. Estas enzimas están disponibles a partir de una serie de fuentes, que incluyen, pero no se limitan a E. coli con Número de Acceso al Banco de Genes NC_000913 REGIÓN: 3955993..3957468, Vibrio cholerae con Número de Acceso al Banco de Genes NC_002505 REGIÓN: 157441..158925, Pseudomonas aeruginosa con Número de Acceso al Banco de Genes NC_002516, (ID de SEC Nº: 16) REGIÓN: 5272455..5273471, y Pseudomonas fluorescens con Número de Acceso al Banco de Genes NC_004129 (ID de SEC Nº: 17) REGIÓN: 6017379..6018395. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "enzima cetol-ácido reductoisomerasa de Clase I" significa la forma corta que tiene típicamente entre 330 y 340 restos de aminoácidos, y es distinta de la forma larga, llamada clase II, que tiene típicamente aproximadamente 490 restos.
La expresión "acetolactato sintasa" se refiere a una enzima que cataliza la transformación de piruvato en acetolactato y CO2. Acetolactato tiene dos estereoisómeros ((R)-y (S)-); la enzima prefiere el (S)-isómero, que se produce mediante sistemas biológicos. Acetolactato sintasas preferidas son conocidas por el número EC 2.2.1.6 9 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego). Estas enzimas están disponibles a partir de una serie de fuentes, que incluyen, pero no se limitan a Bacillus subtilis (Nº en el Banco de Genes: CAB15618, Z99122, secuencia de aminoácidos NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) y secuencia de nucleótidos NCBI, respectivamente), Klebsiella pneumoniae (Nº en el Banco de Genes: AAA25079 (ID de SEC Nº: 2), M73842 (ID de SEC Nº: 1)), y Lactococcus lactis (Nº en el Banco de Genes: AAA25161, L16975).
La expresión "acetohidroxiácido deshidratasa" se refiere a una enzima que cataliza la transformación de 2,3dihidroxi-isovalerato a -cetoisovalerato. Las acetohidroxiácido deshidratasas preferidas son conocidas por el número EC 4.2.1.9. Estas enzimas están disponibles a partir de en una amplia variedad de microorganismos, que incluyen, pero no se limitan a E. coli (Nº en el Banco de Genes: YP_026248, NC_000913, S. cerevisiae (Nº en el Banco de Genes: NP_012550, NC_001142), M. maripaludis (Nº en el Banco de Genes: CAF29874, BX957219), y B. subtilis (Nº en el Banco de Genes: CAB14105, Z99115).
La expresión "-cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada" se refiere a una enzima que cataliza la transformación de -cetoisovalerato a isobutiraldehido y CO2. Las -cetoácido descarboxilasas de cadena ramificada preferidas son conocidas por el número EC 4.1.1.72 y están disponibles a partir de una serie de fuentes, que incluyen, pero no se limitan a Lactococcus lactis (Nº en el Banco de Genes: AAS49166, AY548760; CAG34226, AJ746364, Salmonella typhimurium (Nº en el Banco de Genes: NP_461346, NC_003197), y Clostridium acetobutylicum (Nº en el Banco de Genes: NP_149189, NC_001988).
La expresión "alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada" se refiere a una enzima que cataliza la transformación de isobutiraldehido a isobutanol. Las alcohol deshidrogenasas de cadena ramificada preferidas son conocidas por el número EC 1.1.1.265, pero también pueden ser clasificadas bajo otras alcohol deshidrogenasas (específicamente, EC 1.1.1.1 o 1.1.1.2). Estas enzimas utilizan NADH (nicotinamida adenina dinucleótido reducida) y/o NADPH como donante de electrones y están disponibles a partir de una serie de fuentes, que incluyen, pero no se limitan a S. cerevisiae (Nº en el Banco de Genes: NP_010656, NC_001136; NP_ 014051, NC_001145), E. coli (Nº en el Banco de Genes: NP_417484, y C. acetobutylicum (Nº en el Banco de Genes: NP_349892, NC_003030).
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La expresión "ceto ácido deshidrogenasa de cadena ramificada" se refiere a una enzima que cataliza la transformación de -cetoisovalerato a isobutiril-CoA (isobutiril-cofactor A), utilizando NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido) como aceptor de electrones. Las cetoácido deshidrogenasas de cadena ramificada preferidas son conocidas por el número EC 1.2.4.4. Estas cetoácido deshidrogenasas de cadena ramificada comprenden cuatro subunidades, y las secuencias de todas las subunidades están disponibles en una amplia variedad de microorganismos, que incluyen, pero no se limitan a B. subtilis (Nº en el Banco de Genes: CAB14336, Z99116; CAB14335, Z99116; CAB14334, Z99116, y CAB14337, Z99116) y Pseudomonas putida (Nº en el Banco de Genes: AAA65614, M57613; AAA65615, M57613; AAA65617, M57613, y AAA65618, M57613).
Los términos "kcat" y "Km" son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en Enzyme estructure and Mechanism, 2ª ed. (Ferst; W.H. Freeman: NY, 1985; pág. 98-120). La expresión "kcat", a menudo llamado el "número de rotación", se define como el número máximo de moléculas de substrato transformadas a productos por sitio activo por unidad de tiempo, o el número de veces que la enzima da la vuelta por unidad de tiempo. kcat = Vmax/[E], donde [E] es la concentración de la enzima (Ferst, supra). Los términos "rotación total" y "número de rotación total" se utilizan en el presente documento para referirse a la cantidad de producto formado por la reacción de una enzima KARI con substrato.
La expresión "eficiencia catalítica" se define como la kcat/KM de una enzima. La eficiencia catalítica se utiliza para cuantificar la especificidad de una enzima por un substrato.
La expresión "molécula de ácido nucleico aislada", "fragmento de ácido nucleico aislado" y "construcción genética" se usan de forma intercambiable y significará un polímero de ARN o ADN que es monocatenario o bicatenario, que contiene opcionalmente, bases de nucleótidos sintéticas, no natural o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en forma de un polímero de ADN puede estar compuesto de uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico
o ADN sintético.
El término "aminoácido" se refiere a la unidad estructural química básica de una proteína o polipéptido. Las siguientes abreviaturas se usan en el presente documento para identificar aminoácidos específicos:
Aminoácido Abreviaturas de tres letras Abreviaturas de una letra
Alanina
Ala A
Arginina
Arg R
Asparagina
Asn N
Ácido aspártico
Asp D
Cisteína
Cys C
Glutamina
Gln Q
Ácido glutámico
Glu E
Glicina
Gly G
Histidina
Su H
Leucina
Leu L
Lisina
Lys K
Metionina
Met M
Fenilalanina
Phe F
Prolina
Pro P
Serina
Ser S
Treonina
Thr T
Triptófano
Trp W
Tirosina
Tyr Y
Valina
Val V
El término "Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que es capaz de ser expresado como una proteína específica, incluyendo opcionalmente secuencias reguladoras que preceden (secuencias 5' no codificantes) y que siguen (secuencias 3' no codificantes) a la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias
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Técnicas estándar de ADN recombinante y de clonación molecular utilizadas en el presente documento son bien conocidas en la técnica y son descritas por Sambrook et al. (Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) (en adelante "Maniatis"); y por Silhavy et al. (Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY, 1984); y por Ausubel, F.M. et al., (Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience, 1987).
La presente invención se refiere a una necesidad que surge en la producción microbiana de isobutanol, donde la enzima cetol-ácido reductoisomerasa desempeña una función vital. Las enzimas cetol-ácido reductoisomerasa de tipo silvestre normalmente utilizan NADPH como su cofactor. Sin embargo, en la formación de isobutanol un exceso de NADH se produce por rutas metabólicas auxiliares. La invención proporciona enzimas KARI de Clase I mutantes que han evolucionado para utilizar NADH como cofactor, superando el problema del cofactor y aumentando la eficiencia de la ruta biosintética de isobutanol.
La producción de isobutanol utiliza la ruta de la glucólisis presente en el organismo anfitrión. Durante la producción de dos moléculas de piruvato a partir de glucosa durante la glucólisis, existe una producción neta de dos moléculas de NADH a partir de NAD+ por la reacción de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa. Durante producción posterior de una molécula de isobutanol a partir de dos moléculas de piruvato, existe consumo neto de una molécula de NADPH, por la reacción de la KARI, y una molécula de NADH por la reacción de isobutanol deshidrogenasa. La reacción global de la glucosa a isobutanol conduce así a la producción neta de una molécula de NADH y al consumo neto de una molécula de NADPH. La intertransformación de NADH con NADPH es generalmente lenta e ineficiente; por ello, el NADPH consumido se genera por el metabolismo (por ejemplo, por la ruta del fosfato de pentosa) que consume substrato en el proceso. Mientras tanto, la célula se esfuerza por mantener la homeostasis en la relación NAD+/NADH, lo que lleva al exceso de NADH producido en la producción de isobutanol siendo consumido en la reducción excesiva de otros intermediarios metabólicos; p. ej., mediante la producción de lactato a partir de piruvato. Por ello, el desequilibrio entre NADH producido y NADPH consumido por la ruta de isobutanol conduce a una reducción en el rendimiento molar de isobutanol producido a partir de la glucosa de dos maneras: 1) la operación innecesaria de metabolismo para producir NADPH, y 2) reacción excesiva de intermedios metabólicos para mantener homeostasis de NAD+/NADH. La solución a este problema consiste es inventar una KARI que sea específica de NADH como su cofactor, de modo que ambas moléculas de NADH producidas en la glucólisis sean consumidas en la síntesis de isobutanol a partir de piruvato.
Enzimas de Cetol-ácido reductoisomerasa (KARI)
Acetohidroxiácido isomerorreductasa o cetol-ácido reductoisomerasa (KARI; EC 1.1.1.86) cataliza dos etapas en la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada y es una enzima clave en su biosíntesis. KARI se encuentra en diversos organismos y las comparaciones de las secuencias de aminoácidos entre especies han revelado que existen 2 tipos de esta enzima: una forma corta (clase I) que se encuentra en los hongos y en la mayoría de las bacterias, y una forma larga (clase II) típica de las plantas.
Las KARI Clase I tienen típicamente entre 330-340 restos de aminoácidos. Las enzimas KARI de forma larga tienen alrededor de 490 restos de aminoácidos. Sin embargo, algunas bacterias tales como Escherichia coli poseen una forma larga, en donde la secuencia de aminoácidos difiere apreciablemente de la que se encuentra en las plantas. KARI está codificada por el gen ilvC y es una enzima esencial en el crecimiento de E. coli y otras bacterias en un medio mínimo. Típicamente KARI utiliza NADPH como cofactor y requiere un catión divalente tal como Mg++ para su actividad. Además de utilizar acetolactato en la ruta valina, KARI también transforma acetohidroxibutanoato a dihidroximetilpentanoato en la ruta de producción de isoleucina.
Las KARI de Clase II consisten, generalmente en un dominio N-terminal del resto 225 y un dominio C-terminal de resto 287. El dominio N-terminal, que contiene el sitio de unión NADPH, tiene una estructura / y se asemeja a los dominios encontrados en otras oxidorreductasas dependientes de piridina nucleótidos. El dominio C-terminal consiste casi en su totalidad de -hélices y es de una topología previamente desconocida.
La estructura cristalina de la enzima KARI de E. Coli a 2,6 Å de resolución ha sido resuelta (Tyagi, et al., Protein Science, 14, 3089-3100, 2005). Esta enzima consiste en dos dominios, uno con estructura mixta / que es similar a la encontrada en otras deshidrogenasas dependientes de piridina nucleótidos. El segundo dominio es principalmente -helicoidal y muestra una fuerte evidencia de la duplicación interna. La comparación de los sitios activos de KARI de E. Coli, Pseudomonas aeruginosa, y espinaca mostraba que la mayoría de los restos en el sitio activo de la enzima ocupan posiciones conservadas. Mientras que la KARI de E. Coli se cristalizaba como un tetrámero, que es probablemente la unidad probable biológicamente activa, la KARI P. aeruginosa (Ahn, et al., J. Mol. Biol., 328, 505515, 2003) formaba un dodecámero y la enzima de la espinaca formaba un dímero. Las KARI conocidas son enzimas lentas con un número de rotación informado (kcat) de 2 s-1 (Aulabaugh et al.; Biochemistry, 29, 2824-2830, 1990) o 0,12 s-1 (Rane et al., Arch. Biochem. Biophys. 338, 83-89, 1997) para acetolactato. Los estudios han demostrado que el control genético de la biosíntesis de isoleucina-valina en E. coli es diferente de aquella en la Ps. aeruginosa (Marinus, et al., Genetics, 63, 547-56, 1969).
Identificación de sitios diana de aminoácidos para la conmutación del cofactor
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m) el resto en la posición 52 tiene una sustitución de aminoácidos de ácido aspártico;
n) el resto en la posición 53 tiene una sustitución de aminoácidos de alanina;
o) el resto en la posición 61 tiene una sustitución de aminoácidos de fenilalanina;
p) el resto en la posición 156 tiene una sustitución de aminoácidos de valina;
q) el resto en la posición 33 tiene una sustitución de aminoácidos de leucina;
r) el resto en la posición 47 tiene una sustitución de aminoácidos de tirosina;
s) el resto en la posición 80 tiene una sustitución de aminoácidos de isoleucina;
y
t) el resto en la posición 170 tiene una sustitución de aminoácidos de la alanina.
La presente invención incluye un polipéptido mutante que tiene actividad KARI, teniendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la ID de SEC Nº: 24, 25, 26, 27 y 28.
Una secuencia de consenso para el ilvC mutante era generada a partir del alineamiento múltiple de secuencias y se proporciona como ID de SEC Nº: 29 que representa todas las mutaciones verificadas experimentalmente de la enzima KARI basadas en la secuencia de aminoácidos de la enzima KARI aislada de Pseudomonas fluorescens, (ID de SEC Nº: 17)
Además la presente invención describe posiciones de mutación identificadas utilizando un perfil de Modelo Oculto de Markov (HMM) construido basado en secuencias de 25 enzimas KARI Clase I y Clase II funcionalmente verificadas. El perfil HMM identificó las posiciones de mutación 24, 33, 47, 50, 52, 53, 61, 80, 115, 156 y 170 (la numeración se basa en las secuencias de Pseudomonas fluorescens PF5 KARI). Por ello, el experto en la técnica comprenderá que las mutaciones en estas posiciones, así como las comentadas anteriormente que han sido verificadas experimentalmente darán lugar también a enzimas KARI que tienen la capacidad de unir NADH.
Cepas anfitriona para ingeniería Kari
Dos cepas anfitriona de E. coli TOP10, de Invitrogen y E. coli BW25113 (ΔilvC, un gen desactivado ilvC), se utilizaron para fabricar constructos que sobreexpresan la enzima KARI en esta divulgación. En la cepa BW25113, todo el gen ilvC del cromosoma de E. Coli fue reemplazado por una casete de Kanamicina utilizando la tecnología de recombinación de homología rojo Lambda descrita por Kirill et al., (Kirill A. Datsenko y Barry L. Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 97, 6640-6645, 2000).
Homología de modelado de PF5 KARI con substratos ligados
La estructura de PF5-KARI con NADPH ligado, acetolactato e iones magnesio fue construida basada en la estructura cristalina de P. aeruginosa PAO1-KARI (PDB ID 1 NP3, Ahn H.J. et al, J. Mol. Biol., 328, 505-515, 2003), que tiene el 92% de homología de la secuencia aminoácidos con PF5 KARI. La estructura PAO1-KARI es un homododecámero y cada dodecámero consta de seis homo-dímeros con interfaz de dímero extensiva. El sitio activo de KARI se encuentra en esta interfaz dímero. El conjunto biológico está formado por seis homo-dímeros situados en los bordes de un tetraedro dando como resultado un dodecámero muy simétrico de una simetría de 23 grupos puntuales. Por simplicidad, sólo la unidad dimérica (monómero A y monómero B) fue construida para el modelo de homología de PF5-KARI en este estudio debido a que el sitio activo es en la interfaz del homo-dímero.
El modelo de dímero PF5-KARI fue construido en base a las coordenadas del monómero A y del monómero B de PAO1-KARI y la secuencia de PF5-KARI utilizando un visualizador PDB DeepView/Swiss (Guex, N. y Peitsch, MC Electrophoresis 18: 2714-2723, 1997). Este modelo fue importado después para programar O (Jones, T.A. et al, Acta Crystallogr. A 47,110-119, 1991) en un sistema Silicon Graphics para su posterior modificación.
La estructura de PAO1-KARI no tiene NADPH, substrato o inhibidor o magnesio en el sitio activo. Por lo tanto, la estructura KARI de espinacas (PDB ID 1yve, Biou V. et al., The EMBO Journal, 16: 3405-3415, 1997), que tiene iones magnesio, NADPH e inhibidor (N-hidroxi-N-isopropiloxamato) en el sitio de unión del acetolactato, se utilizó para modelar estas moléculas en el sitio activo. La KARI de plantas tiene homología de secuencia muy pequeña con PF5-KARI o con PAO1-KARI (identidad de aminoácidos < 20 %), sin embargo, las estructuras en la región del sitio activo de estas dos enzimas KARI son muy similares. Para superponer el sitio activo de estas dos estructuras KARI, se utilizaron comandos LSQ_ext, LSQ_improve, LSQ_mol en el programa O para alinear el sitio activo de monómero A de la espinaca KARI con el monómero A del modelo PF5 KARI. Las coordenadas de NADPH, dos iones magnesio e inhibidor unido en el sitio activo de la espinaca KARI se extrajeron e incorporaron a la molécula A de PF5 KARI. Un conjunto de las coordenadas de estas moléculas se generaron para el monómero B de PF5 KARI aplicando el operador de transformación de monómero A a monómero B calculado por el programa.
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Debido a que no hay NADPH en el sitio activo de la estructura cristalina PAO1 KARI, las estructuras de la región del bucle de unión de fosfato en el sitio de unión de NADPH (restos 44-45 en PAO1 KARI, 157-170 en Espinaca KARI) son muy diferentes entre los dos. Para modelar la forma ligada NADPH, el modelo del bucle de unión de fosfato PF5-KARI (44-55) fue sustituido por el de 1yve (157-170). Cualquier discrepancia de las cadenas laterales entre estas dos se transformó en las de la secuencia de PF5-KARI utilizando el comando mutate_replace en el programa O, y las conformaciones de las cadenas laterales sustituidas se ajustaron manualmente. El modelo completo PF5-KARI dimérico ligado a NADPH/Mg/inhibidor fue mediante una vuelta de minimización de energía utilizando el programa CNX (ACCELRYS San Diego CA, Burnger, A.T. y Warren, G.L., Acta Crystallogr., D 54, 905-921, 1998) después de lo cual el inhibidor fue sustituido por el substrato, acetolactato (AL), en el modelo. La conformación de AL se ajustó manualmente para favorecer la transferencia de hidruro de C4 de la nicotinamina de NADPH y el substrato. No se realizó ninguna minimización de energía adicional en este modelo (Coordenadas del modelo creado para este estudio se adjuntan en un archivo de Word separado). Los restos en el bucle de unión a fosfato y sus interacciones con NADPH se ilustran en la Figura 3.
Aplicación de un perfil de Modelo Oculto de Markov para la identificación de posiciones de restos involucrados en la conmutación del cofactor en enzimas KARI
Los solicitantes han desarrollado un procedimiento para la identificación de enzimas KARI y las posiciones de los restos que están involucradas en la conmutación del cofactor NADPH por NADH. Para caracterizar estructuralmente las enzimas KARI, se preparó un perfil de Modelo Oculto de Markov (HMM) como se describe en el Ejemplo 5 utilizando secuencias de aminoácidos de las 25 proteínas KARI con función verificada experimentalmente como se indica en la Tabla 6. Estas KARI eran de Pseudomonas fluorescens Pf-5 (ID de SEC Nº: 17), Sulfolobus solfataricus P2 (ID de SEC Nº: 13), Pyrobaculum aerophilum str. IM2 (ID de SEC Nº: 14), Natronomonas pharaonis DSM 2160 (ID de SEC Nº: 30), Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 (ID de SEC Nº: 31), Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (ID de SEC Nº: 32), Phaeospririlum molischianum (ID de SEC Nº: 33), Ralstonia solanacearum GMI1000 (ID de SEC Nº: 15), Zymomonas mobilis subsp. mobilis ZM4 (ID de SEC Nº: 34), Alkalilimnicola ehrlichei MLHE-1 (ID de SEC Nº: 35), Campylobacter lari RM2100 (ID de SEC Nº: 36), Marinobacter aquaeolei VT8 (ID de SEC Nº: 37), Psychrobacter arcticus 273-4 (ID de SEC Nº: 38), Hahella chejuensis KCTC 2396 (ID de SEC Nº: 39), Thiobacillus denitrificans ATCC 25259 (ID de SEC Nº: 40), Azotobacter vinelandii AvOP (ID de SEC Nº: 41), Pseudomonas syringae pv. syringae B728a (ID de SEC Nº: 42), Pseudomonas syringae pv. tomato str. DC3000 (ID de SEC Nº: 43), Pseudomonas putida KT2440 (proteína con ID de SEC Nº: 44), Pseudomonas entomophila L48 (ID de SEC Nº: 45), Pseudomonas mendocina ymp (ID de SEC Nº: 46), Pseudomonas aeruginosa PAO1 (ID de SEC Nº: 16), Bacillus cereus ATCC 10987 (ID de SEC Nº: 47), Bacillus cereus ATCC 10987 (ID de SEC Nº: 48), y Spinacia oleracea (ID de SEC Nº: 18).
Además utilizando procedimientos descritos en esta solicitud, se pueden mencionar las secuencias de enzimas KARI Clase II tales como E. coli (ID de SEC Nº: 63 -Número de Acceso al Banco de Genes P05793), marine gamma Proteobacterium HTCC2207 (ID de SEC Nº: 64 -Número de Acceso al Banco de Genes ZP-01224863.1), Desulfuromonas acetoxidans (ID de SEC Nº: 65 -Número de Acceso al Banco de Genes ZP-01313517.1) y Pisum sativum (pea) (ID de SEC Nº: 66 -Número de Acceso al Banco de Genes-082043
Este perfil HMM de las KARI se puede utilizar para identificar cualquier proteína relacionada KARI. Se espera que cualquier proteína que coincida con el perfil HMM con un valor de E <10-3 utilizando programa de hmmsearch en el paquete HMMER se espera que sea una KARI funcional, que puede ser una KARI bien Clase I o bien Clase II. Las secuencias que coinciden con el perfil HMM dado en el presente documento se analizan entonces para la ubicación de las 12 posiciones en Pseudomonas fluorescens Pf-5 que conmutan el cofactor de NADPH por NADH. Los once nodos, tal como se define en la sección de construcción del perfil HMM, en el perfil HMM que representan las columnas del alineamiento que corresponden a las once posiciones de conmutación del co-factor en Pseudomonas fluorescens Pf-5 KARI se identifican como nodo 24, 33, 47, 50, 52, 53, 61, 80, 115, 156 y 170. Las líneas correspondientes a estos nodos en el archivo del modelo son identificadas en la Tabla 9. Un experto en la técnica podrá identificar fácilmente estas 12 posiciones en la secuencia de aminoácidos de una proteína KARI a partir del alineamiento de la secuencia con el perfil HMM utilizando el programa de hmmsearch en el paquete HMMER.
Las enzimas KARI identificadas por este procedimiento, incluyen tanto las enzimas KARI de Clase I como de Clase II de fuentes naturales microbianas o de plantas. Cualquier KARI identificada por este procedimiento se puede utilizar para la expresión heteróloga en las células microbianas.
Por ejemplo, cada uno de los fragmentos de ácido nucleico que codifican KARI descrito en el presente documento pueden utilizarse para aislar genes que codifican proteínas homólogas. El aislamiento de genes homólogos utilizando protocolos dependientes de la secuencia es bien conocido en la técnica. Ejemplos de protocolos dependientes de la secuencia incluyen, pero no se limitan a: 1) procedimientos de hibridación de ácido nucleico; 2) procedimientos de amplificación de ADN y de ARN, como se ejemplifica mediante diversos usos de tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos [por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), Mullis et al., patente de EE.UU. No. 4.683.202; reacción en cadena de la ligasa (LCR), Tabor, S. et al., Proc. Acad. Sci. EE.UU. 82: 1074 (1985); o amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), Walker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 392 (1992)]; y 3) procedimientos de construcción de bibliotecas y detección por complementariedad.
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Aunque la homología de secuencia entre las enzimas KARI de Clase I y Clase II es baja, la estructura tridimensional de ambas clases de enzimas, particularmente alrededor del sitio activo y de los dominios de unión a nucleótido está altamente conservada (Tygai, R., et al., Protein Science, 34: 399-408, 2001). Los restos de aminoácidos clave que conforman el bolsillo de unión al substrato son altamente conservadas entre estas dos clases incluso aunque no puedan alienarse bien en una simple comparación de secuencias. Puede concluirse, por lo tanto, que los restos que afectan a la especificidad del cofactor identificados en la KARI Clase I (p. ej., las posiciones 24, 33, 47, 50, 52, 53, 61, 80, 115, 156, y 170 de PF5 KARI) pueden hacerse extensibles a las enzimas KARI Clase II.
Rutas biosintéticas del isobutanol
Los microorganismos que utilizan hidratos de carbono emplean la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas-(EMP), la ruta de Entner y Doudoroff y el ciclo de las pentosas fosfato como las rutas metabólicas centrales, rutas metabólicas que proporcionan energía y precursores celulares para el crecimiento y el mantenimiento. Estas rutas tienen en común el intermedio gliceraldehido-3-fosfato y, en última instancia, se forma piruvato directamente o en combinación con la ruta de EMP. Posteriormente, piruvato se transforma en acetil-cofactor A (acetil-CoA) a través de una variedad de medios. Acetil-CoA sirve como un intermedio clave, por ejemplo, en la generación de ácidos grasos, aminoácidos y metabolitos secundarios. Las reacciones combinadas de transformación de azúcar en piruvato producen energía (p. ej., adenosina-5'-trifosfato, ATP) y equivalentes de reducción (por ejemplo, nicotinamida adenina dinucleótido reducida, NADH, y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducida, NADPH). NADH y NADPH se deben reciclar a sus formas oxidadas (NAD+ y NADP+, respectivamente). En presencia de aceptores de electrones inorgánicos (p.
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ej., O2, NO3 y SO42-), los equivalentes de reducción se pueden usar para aumentar el conjunto de energía; como alternativa, se puede formar un subproducto de carbono reducido.
Hay cuatro rutas potenciales para la producción de isobutanol a partir de fuentes de hidratos de carbono con microorganismos recombinantes como se muestra en la Figura 1. Todas las rutas potenciales para la transformación de hidratos de carbono en isobutanol se han descrito en la solicitud de patente de EE.UU. de propiedad común nº 11/586315.
La ruta preferida para la transformación de piruvato a isobutanol consta de etapas enzimáticos "a", "b", "c", "d" y "e" (Figura 1) e incluye las siguientes transformaciones de substrato a producto:
a) de piruvato a acetolactato, catalizada, por ejemplo, por acetolactato sintasa,
b) de (S)-acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato, catalizada, por ejemplo, por acetohidroxiácido isomeroreductasa,
c) de 2,3-dihidroxiisovalerato a -cetoisovalerato, catalizada, por ejemplo, por acetohidroxiácido deshidratasa,
d) de -cetoisovalerato a isobutiraldehido, catalizada, por ejemplo, mediante un cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada, y
e) isobutiraldehido a isobutanol, catalizada, por ejemplo, un alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada.
Esta ruta combina enzimas implicadas en rutas bien caracterizadas para biosíntesis de valina (piruvato a cetoisovalerato) y el catabolismo de valina (-cetoisovalerato a isobutanol). Dado que muchas enzimas de biosíntesis de valina también catalizan reacciones análogas en la ruta de la biosíntesis de isoleucina, la especificidad del substrato es una consideración importante en la selección de las fuentes de genes. Por esta razón, los genes primarios de interés para la enzima acetolactato sintasa son los de Bacillus (alsS) y Klebsiella (budB). Estos acetolactato sintasas particulares son conocidas por participar en la fermentación butanodiol en estos organismos y muestran una mayor afinidad por piruvato en lugar de cetobutirato (Gollop y otros, J. Bacteriol 172, 3444-3449, 1990); y (Holtzclaw et al., J. Bacteriol. 121, 917-922, 1975). Las etapas de las rutas segunda y tercera son catalizadas por acetohidroxiácido reductoisomerasa y deshidratasa, respectivamente. Estas enzimas se han caracterizado a partir de una serie de fuentes, tales como por ejemplo, E. coli (Chunduru et al, Biochemistry 28, 486493, 1989); y (Flint et al., J. Biol. Chem. 268, 14732-14742, 1993). Las dos etapas finales de la ruta preferida de isobutanol se sabe que ocurren en levadura, que puede utilizar valina como fuente de nitrógeno y, en el proceso, secretar isobutanol. El -cetoisovalerato se puede transformar en isobutiraldehido mediante una serie de enzimas cetoácido descarboxilasa, tal como, por ejemplo, piruvato descarboxilasa. Para evitar la desviación de piruvato alejada de la producción de isobutanol, se desea una descarboxilasa con afinidad por piruvato disminuida. Hasta el momento, hay dos de tales enzimas conocidas en la técnica (Smit et al, Appl Environ Microbiol, 71, 303-311, 2005); y (de la Plaza et al., FEMS Microbiol. Lett., 238, 367-374, 2004). Ambas enzimas son de cepas de Lactococcus lactis y tienen una preferencia de 50-200 veces por cetoisovalerato en lugar de por piruvato. Por último, en la levadura se han identificado una serie de aldehido reductasas, muchas de ellas con especificidad de substrato superpuesta. Las conocidas por preferir substratos de cadena ramificada frente a acetaldehido incluyen, pero no se limitan a alcohol deshidrogenasa VI (ADH6) e Ypr1p (Larroy et al, Biochem J. 361, 163-172, 2002); y (Ford et al., Yeast 19, 10871096, 2002), ambos de los cuales utilizan NADPH como donante de electrones. Una reductasa dependiente de NADPH, YqhD, activa con substratos de cadena ramificada también se ha identificado recientemente en E. coli (Sulzenbacher et al., J. Mol. Biol. 342, 489-502, 2004).
Dos de las otras rutas potenciales para la producción de isobutanol también contienen las tres etapas iniciales de
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Yeast medium (YM). Otros medios de cultivo definidos o sintéticos también pueden utilizarse y el medio apropiado para el cultivo del microorganismo particular será conocido por el experto en la técnica de la microbiología o de la ciencia de la fermentación. El uso de agentes conocidos para modular la represión del catabolito directa o indirectamente, p. ej., adenosin-2',3'-monofosfato cíclica (cAMP), también se pueden incorporar en el medio de fermentación.
Los intervalos de pH adecuados para la fermentación están entre pH 5,0 y pH 9,0, donde se prefiere pH 6,0 a pH 8,0 para el estado inicial.
Las fermentaciones se pueden realizar en condiciones aerobias o anaerobias, donde se prefieren las condiciones anaerobias o microaerobias.
Fermentaciones industriales por lote y en continuo
El presente proceso emplea un procedimiento de fermentación por lotes. Una fermentación por lotes clásica es un sistema cerrado donde la composición del medio se fija al comienzo de la fermentación y no está sujeta a alteraciones artificiales durante la fermentación. Por ello, al comienzo de la fermentación el medio se inocula con el organismo u organismos deseados, y se permite que la fermentación tenga lugar sin añadir nada al sistema. Típicamente, sin embargo, una fermentación "por lotes" es por lotes con respecto a la adición de fuente de carbono y a menudo se hacen intentos de controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno. En los sistemas por lotes las composiciones de metabolito y biomasa del sistema cambian constantemente hasta el momento en que se detiene la fermentación. Dentro de los cultivos por lotes, las células se moderan a través de una fase de latencia estática hasta una fase log de gran desarrollo y finalmente a una fase estacionaria donde la velocidad de crecimiento disminuye o se detiene. Si no se tratan, las células en la fase estacionaria finalmente morirán. Las células en la fase log son responsables en general de la mayor parte de la producción del producto final o del intermedio.
Una variación en el sistema por lotes estándar es el sistema de lote alimentado. Los procesos de fermentación de lote alimentado son también adecuados en la presente invención y comprenden un típico sistema por lotes con la excepción de que el substrato se añade en incrementos a medida que progresa la fermentación. Los sistemas de lote alimentado son útiles cuando la represión de catabolito es apta para inhibir el metabolismo de las células y donde es deseable tener cantidades limitadas de substrato en los medios. La medición de la concentración de substrato real en los sistemas de lote alimentado por lotes es difícil y por lo tanto se estima sobre la base de los cambios de factores medibles tales como el pH, el oxígeno disuelto y la presión parcial de gases residuales tales como CO2. Las fermentaciones por lotes y por lote alimentado son comunes y bien conocidas en la técnica y los ejemplos se pueden encontrar en Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, o Deshpande, Mukund (Appl. Biochem. Biotechnol., 36, 227, 1992).
Aunque la presente invención se realiza en modo por lotes se contempla que el procedimiento sería adaptable a procedimientos de fermentación continua. La fermentación continua es un sistema abierto donde se añade un medio de fermentación definido continuamente a un biorreactor y una cantidad igual de medio acondicionado se elimina simultáneamente durante el procesamiento. La fermentación continua mantiene generalmente los cultivos a una alta densidad constante donde las células están principalmente en crecimiento en fase log.
La fermentación continua permite la modulación de un factor o de cualquier número de factores que afectan el crecimiento celular o la concentración de producto final. Por ejemplo, un procedimiento mantendrá un nutriente limitante tal como la fuente de carbono o el nivel de nitrógeno a una tasa fija y permite que los otros parámetros se moderen. En otros sistemas, una serie de factores que afectan al crecimiento puede ser continuamente alterado mientras la concentración celular, medida por la turbidez media, se mantiene constante. Los sistemas continuos se esfuerzan por mantener condiciones de crecimiento en estado estacionario y así la pérdida celular debida al medio que es retirado debe equilibrarse frente al crecimiento celular en la fermentación. Los procedimientos de modulación de nutrientes y factores de crecimiento para los procesos de fermentación continua así como las técnicas para maximizar la tasa de formación de producto son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial y una variedad de procedimientos son detallados por Brock, supra.
Se contempla que la presente invención puede ponerse en práctica utilizando procesos bien por lotes, por lotes alimentados o en continuo, y que cualquier modo conocido de fermentación sería adecuado. Adicionalmente, se contempla que las células pueden inmovilizarse en un substrato como catalizadores de células enteras y someterse a condiciones de fermentación para la producción de isobutanol.
Procedimientos para el aislamiento del isobutanol del medio de fermentación
El isobutanol producido biológicamente puede ser aislado del medio de fermentación utilizando procedimientos conocidos en la técnica para fermentaciones acetona-butanol-etanol (ABE) (véase, por ejemplo, Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 639-648, 1998), y (Groot et al., Proceso. Biochem. 27, 61-75, 1992 y referencias en el mismo). Por ejemplo, los sólidos pueden ser eliminados del medio de fermentación por centrifugación, filtración, decantación y el isobutanol puede ser aislado del medio de fermentación utilizando procedimientos tales como destilación, destilación azeotrópica, extracción líquido-líquido, adsorción, extracción de gas, evaporación por
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consiste en HEPES-KOH100 mM, pH 7,5, MgCl2 10 mM, glucosa-6-fosfato 1 mM (Sigma-Aldrich), 0,2 unidades de glucosa Leuconostoc mesenteroides 6-fosfato deshidrogenasa (Sigma-Aldrich), y diversas concentraciones de NADH o NADPH, hasta un volumen de 96 μl. La reacción se inició mediante la adición de 4 μl de acetolactato hasta una concentración final 4 mM y un volumen final de 100 μl. Después del cronometrado de incubaciones a 30ºC, típicamente entre 2 y 15 min, la reacción se enfrió rápidamente mediante la adición de 10 μl de AEDT 0,5 M, pH 8,0 (Life Technologies, Grand Island, NY 14072). Para medir la KM de NADH, las concentraciones utilizadas fueron 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, y 10 mM.
Para analizar 2,3-dihidroxi-isovalerato, la muestra se diluyó 10 veces con agua, y se inyectaron 8,0 μl en un HPLC Waters Acquity equipado con espectrómetro de masas Waters SQD (Waters Corporation, Milford, MA). Las condiciones cromatográficas fueron: caudal (0,5 ml/min), en una columna HSS T3 de Waters Acquity (2,1 mm de diámetro, 100 mm de longitud). El tampón A consistía en 0,1% (v/v) en agua, el tampón B era ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo. La muestra se analizó utilizando 1% de tampón B (en tampón A) durante 1 min, seguido por un gradiente lineal de 1% de tampón B en 1 min hasta 75% de tampón B en 1,5 min. El producto de reacción, 2,3dihidroxi-isovalerato, fue detectado por ionización a m/z = 133, utilizando el dispositivo de ionización electrospray de -30 V de voltaje de cono. La cantidad de producto 2,3-dihidroxiisovalerato se calculó por comparación con un molde auténtico.
Para calcular la KM para NADH, los datos de velocidad para la formación de DVIH eran representados gráficamente en el Kaleidagraph (Synergy Software, Reading, PA.) y se ajustaron a la ecuación de Michaelis_Menton de un solo substrato, suponiendo que se satura la concentración de acetolactato.
Ejemplo 1
Construcción de Genotecas de Saturación del Sitio
Se construyeron siete genotecas (Tabla 2) utilizando dos etapas: 1) síntesis de MegaCebadores utilizando oligonucleótidos sintetizados comercialmente descritos en la Tabla 1; y 2) construcción de genes mutados utilizando los MegaCebadores obtenidos en la etapa 1. Estos cebadores se prepararon utilizando polimerasa Pfu-Ultra de alta fidelidad-(Stratagene, La Jolla, CA) para un par de cebadores que contienen un cebador directo y uno inverso. Los moldes de las bibliotecas C, E, F, G y H fueron el tipo silvestre de PF5_ilvc. Los moldes de ADN para la biblioteca N fueron los mutantes que tienen actividad NADH detectable desde la biblioteca C, mientras que los de la biblioteca O eran aquellos mutantes que tienen actividad NADH detectable desde la biblioteca H. Una mezcla de reacción de 50 μl contenía: 5,0 μl de 10 veces tampón de reacción suministrado con la Pfu-Ultra polimerasa (Stratagene), 1,0 μl de 50 ng/l de molde, 1,0 μl cada uno de 10 pmol/μl de cebadores directo e inverso, 1,0 μl de 40 mM de mezcla dNTP (Promega, Madison, WI), 1,0 μl de Pfu-Ultra ADN polimerasa (Stratagene) y 39 μl de agua. La mezcla se colocó en un tubo de 200 μl de pared delgada para la reacción de PCR en un equipo de gradiente Mastercycler (Brinkmann Instruments, Inc. Westbury, NY). Las siguientes condiciones se usaron para la reacción PCR: La temperatura de partida fue de 95ºC durante 30 s seguido por 30 ciclos de calentamiento/enfriamiento. Cada ciclo consistía en 95ºC durante 30 segundos, 54ºC durante 1 min y 70ºC durante 2 min. A la finalización del ciclo de temperatura, las muestras se mantuvieron a 70ºC durante 4 minutos más, y después se mantuvieron a la espera de la recuperación de la muestra a 4ºC. El producto de PCR fue limpiado utilizando un kit de limpieza de ADN (nº de Catálogo D4003, Zymo Research, Orange, CA) según lo recomendado por el fabricante.
Tabla 2 -Genotecas
Nombre de la biblioteca
Patrones Posición o posiciones de direccionamiento de Pf5_ilvC Cebadores usados
C
PF5_ilvc 47, 50, 52 y 53 ID de SEC Nº:
E
PF5_ilvc 47 ID de SEC Nº:
F
PF5_ilvc 50 ID de SEC Nº:
G
PF5_ilvc 52 ID de SEC Nº:
H
PF5_ilvc 47, 50 y 52 ID de SEC Nº:
N
Buenos mutantes de la biblioteca C 53 ID de SEC Nº:
O
Buenos mutantes de la biblioteca H 53 ID de SEC Nº:
Los MegaCebadores se utilizaron después para generar genotecas utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange II XL (nº de Catálogo 200524, Stratagene, La Jolla CA). Una mezcla de reacción de 50 μl contenía: 5,0 μl de 10 veces tampón de reacción, 1,0 μl de 50 ng/μl de molde, 42 μl de MegaCebador, 1.0 μl de mezcla dNTP 40 mM, 1,0 μl de Pfu-Ultra ADN polimerasa. Excepto por el MegaCebador y los moldes, todos los reactivos utilizados en
23
el presente documento fueron suministrados con el kit indicado anteriormente. Esta mezcla de reacción se colocó en un tubo de PCR de capacidad 200 μl de pared delgada y se utilizaron las siguientes reacciones para la PCR: La temperatura de partida era de 95ºC durante 30 s seguido por 25 ciclos de calentamiento/enfriamiento. Cada ciclo consistía en 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 min y 68ºC durante 6 min. A la finalización de los ciclos de
5 temperatura, las muestras se mantuvieron a 68ºC durante 8 min más, y después se mantuvieron a 4ºC para el procesamiento posterior. Enzima de restricción Dpn I (1,0 μl) (suministrada con el kit anterior) se añadía directamente a la mezcla de reacción terminada, la digestión enzimática se realizó a 37ºC durante 1 hora y el producto de PCR se limpió utilizando un kit de limpieza de ADN (Zymo Research). El producto de PCR limpiado (10 μl) contenía genes mutados para una genoteca.
10 El producto de PCR limpiado fue transformado en una cepa electro-competente de E. coli Bw25113 (ΔilvC) utilizando un BioRad Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA). Los clones transformados fueron rayados sobre placas con agar que contenían el medio Luria Broth y 100 μg/ml de ampicilina (nº de Catálogo L1004, Teknova Inc. Hollister, CA) y se incubaron a 37ºC durante la noche. Decenas de clones fueron escogidos al azar para la secuenciación de ADN para confirmar la calidad de la biblioteca.
15 Tabla 3
Lista de algunos mutantes que tienen actividades NADH identificadas desde las bibliotecas de saturación
Mutante
Posición 47 Posición 50 Posición 52 Posición 53
SD2
R47Y S50A T52H V53W
SB1
R47Y S50A T52G V53W
SE1
R47A S50W T52G V53W
SH2
R47N S50W T52N V53W
SB2
R47I T52G V53W
SG1
R47Y T52G V53W
SB3
R47G S50W T52G V53W
SE2
R47P S50E T52A V53W
SD3
R47L S50W T52G V53W
C2A6
R47I S50G T52D V53W
C3E11
R47A S50M T52D V53W
C3A7
R47Y S50A T52D V53W
C3B11
R47F S50A T52D V53W
C4A5
R47Y S50A T52S V53W
C3B12
R47I T52D V53W
C4H7
R47I T52S V53W
C1D3
R47G S50M T52D V53W
C4D12
R47C S50W T52G V53W
C1G7
R47P S50G T52D V53W
C2F6
R47P S50V T52D V53W
C1C4
R47P S50E T52S V53W
6924F9
R47P S50G T52D
6881E11
R47P S50N T52C
6868F10
R47P T52S
6883G10
R47P S50D T52S
6939G4
R47P S50C T52D
11463D8
R47P S50F T52D
24
Lista de algunos mutantes que tienen actividades NADH identificadas desde las bibliotecas de saturación
Mutante
Posición 47 Posición 50 Posición 52 Posición 53
9667A11
R47N S50N T52D V53A
9675C8
R47Y S50A T52D V53A
9650E5
R47N S50W T52G V53H
9875B9
R47N S50N T52D V53W
9862B9
R47D S50W T52G V53W
9728G11
R47N S50W T52G V53W
11461D8
R47F S50A T52D V53A
11461A2
R47P S50F T52D V53I
Ejemplo 2
Construcción de bibliotecas de PCR propensas a error
Varias series de bibliotecas de PCR propensas a error (epPCR) se crearon utilizando el kit GeneMorph II (Stratagene) según lo recomendado por el fabricante. Todas las bibliotecas epPCR se dirigen al N-terminal de 5 PF5_KARI. El cebador directo (ID de SEC Nº: 20) y el cebador inverso (ID de SEC Nº: 22) se utilizaron para todas las bibliotecas ePCR.
Los moldes de ADN para cada biblioteca epPCR eran mutantes con relativamente buenas actividades NADH a partir de la biblioteca anterior. Por ejemplo: los moldes de ADN para la n-ésima biblioteca epPCR eran mutantes con buenas actividades de NADH a partir de la (n-1)-ésima biblioteca epPCR. Los moldes de la primera biblioteca 10 epPCR eran mutantes con relativamente buenas actividades de NADH a partir de bibliotecas de N y O. La tasa de mutaciones de la biblioteca obtenida con este kit fue controlada mediante la cantidad de molde añadido en la mezcla de reacción y el número de ciclos de amplificación. Típicamente, se utilizó 1,0 ng de cada molde de ADN en 100 μl de mezcla de reacción. El número de ciclos de amplificación era de 70. Las condiciones siguientes se utilizaron para la reacción de PCR: La temperatura de partida era de 95ºC durante 30 s seguido por 70 ciclos de 15 calentamiento/enfriamiento. Cada ciclo consistía en 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 min, y 70ºC durante 2 min. Después de que los primeros 35 ciclos de calentamiento/enfriamiento terminaron, se añadieron más dNTP y ADN polimerasa Mutazyme II. El producto de PCR se limpió utilizando un kit de limpieza de ADN (nº de Catálogo D4003, Zymo Research, Orange, CA) según lo recomendado por el fabricante. El producto de PCR limpiado se trató como megacebador y se introdujo en el vector utilizando el kit Quickchange como se describe en el Ejemplo 1. La
20 Tabla 4 siguiente enumera los mutantes KARI obtenidos y la mejora significativa observada en sus uniones NADH. La Km se redujo desde 1.100 μM para el C3B11 mutante hasta 50 μM para 12957G9 mutante.
Tabla 4
Lista de algunos mutantes con sus valores de Km medidos
Mutante
Posiciones de Mutación NADH Km (µM)
C3B11
R47F/S50A/T52D/V53W 1100
SB3
R47G/S50W/T52G/V53W 500
11518B4
R47N/S50N/T52DA/53A/A156V 141
11281G2
R47N/S50N/T52D/V53A/A156V/L165M 130
12985F6
R47Y/S50A/T52DN53A/L61F/A156V 100
13002D8
R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/A156V/G170A 68
12957G9
Y24F/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/G170A 50
12978D9
R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/Q115L/A156V 114
Ejemplo 3 Termoestabilidad de PF5-ilvC y sus mutantes 25 Las células que contienen pBAD-ilvC mutados se cultivaron durante la noche a 37ºC en 25 ml de medio LB que 25
imagen18
Tabla 5
Cebadores para el Ejemplo 5
Posición o Posiciones dirigidas de Pf5_ilvC
Cebadores
33
pBAD-405-C33_090808f: GCTCAAGCANNKAACCTGAAGG (ID de SEC Nº: 49) pBAD-427-C33_090808r: CCTTCAGGTTKNNTGCTTGAGC (ID de SEC Nº: 50)
43
pBAD-435-T43_U90808f:GTAGACGTGNNKGTTGGCCTG (ID de SEC Nº: 51) pBAD-456-T43_090808r:CAGGCCAACKNNCACGTCTAC (ID de SEC Nº: 52)
59 y 61
pBAD-484-H59L61_090808f:CTGAAGCCNNKGGCNNKAAAGTGAC (ID de SEC Nº: 53) pBAD-509-H59L61_090808r:GTCACTTTKNNGCCKNNGGCTTCAG (ID de SEC Nº: 54)
71
pBAD-519-A71_090808f: GCAGCCGTTNNKGGTGCCGACT (ID de SEC Nº: 55) pBAD-541-A71_090808r: AGTCGGCACCKNNAACGGCTGC (ID de SEC Nº: 56)
80
pBAD-545-T80_090808f: CATGATCCTGNNKCCGGACGAG (ID de SEC Nº: 57) pBAD-567-T80_090808r: CTCGTCCGGKNNCAGGATCATG (ID de SEC Nº: 58)
101
pBAD-608-A101_090808f: CAAGAAGGGCNNKACTCTGGCCT (ID de SEC Nº: 59) rBAD-631-A101_Q90808r: AGGCCAGAGTKNNGCCCTTCTTG (ID de SEC Nº: 60)
119
pBAD-663-R119_090808f: GTTGTGCCTNNKGCCGACCTCG (ID de SEC Nº: 61) pBAD-685-R119_090808r: CGAGGTCGGCKNNAGGCACAAC (ID de SEC Nº: 62)
Tabla 6
Lista de algunos mutantes con sus valores de Km medidos (las posiciones mutadas en esos mutantes se identificaron mediante herramientas bioinformáticas)
Mutante
Posiciones de la Mutación NADH Km (µM)
ZB1
Y24F/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/A156V (ID de SEC Nº: 24) 40
ZF3
Y24F/C33L/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F (ID de SEC Nº: 25) 21
ZF2
Y24F/C33L/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/A156V (ID de SEC Nº: 26) 17
ZB3
Y24F/C33L/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/G170A (ID de SEC Nº: 27) 17
Z4B8
C33L/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/T80I/A156V (ID de SEC Nº: 28) 14
Tabla 7 Los mutantes optimizados adicionalmente para mejorar la Km (para NADH)
Los mutantes optimizados adicionalmente para mejorar la Km (para NADH)
Mutante
Posiciones de la Mutación NADH Km (µM)
3361G8
C33L/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61 F/T80I (SEQ ID NO: 67) 5.5
2H10
Y24F/C33L/RR47Y/S50A/T52D/V53I/L61F/T80I/A156V (SEQ ID NO : 68) 5.3
1D2
Y24F/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/T80I/A156V (SEQ ID NO: 69) 4.1
3F12
Y24F/C33L/R47Y/S50A/T52D/V53A/L61F/T80I/A156V (SEQ ID NO: 70) 4.0
5 Análisis adicionales utilizando herramientas bioinformáticas se realizaron, por tanto, para expandir los sitios mutacionales a otras secuencias KARI como se describe a continuación. Análisis de secuencias Los miembros de la familia de proteínas de cetol-ácido reductoisomerasa (KARI) fueron identificados a través de
27 5
10
15
20
25
30
búsquedas BlastP de bases de datos disponibles al público utilizando la secuencia de aminoácidos de Pseudomonas fluorescens PF5 KARI (ID de SEC Nº: 17) con los siguientes parámetros de búsqueda: valor de E = 10, tamaño de la palabra = 3, Matriz = Blosum62, y apertura del Hueco = 11 y por extensión de hueco = 1, valor E de corte de 10-3. Se eliminaron las secuencias idénticas y las secuencias que eran más cortas que 260 aminoácidos. Además, también se eliminaron las secuencias que carecían del típico motivo GxGXX(G/A) involucrado en la unión de NAD(P)H en el dominio N-terminal. Estos análisis dieron como resultado un conjunto de 692 secuencias de KARI.
Un perfil de HMM se generó a partir del conjunto de las enzimas KARI Clase I y Clase II verificadas experimentalmente a partir de diversas fuentes, como se describe en la Tabla 8. A continuación se proporcionan los detalles de construcción, calibración, y búsqueda con este perfil de HMM. Cualquier secuencia que pueda ser recuperada por la búsqueda de HMM utilizando el perfil de HMM para KARI a un valor E por encima de 1E-3 se considera un miembro de la familia KARI. Las posiciones en una secuencia KARI alineada con los siguientes en los nodos del perfil de HMM (definidas a continuación en la sección de construcción del perfil de HMM) se reivindica de que son responsables de la utilización de NADH: 24, 33, 47, 50, 52, 53, 61, 80, 115, 156, y 170 (la numeración se basa en las secuencias de Pseudomonas fluorescens PF5 KARI).
Preparación del Perfil de HMM
Un grupo de secuencias KARI se expresaron en E. coli y se ha verificado que tienen actividad KARI Estas KARI se enumeran en la Tabla 6. Las secuencias de aminoácidos de estas KARI funcionales verificadas experimentalmente fueron analizadas utilizando el paquete de software HMMER (la teoría tras los perfiles HMM se describe en R. Durbin, S. Eddy, A. Krogh y G. Mitchison, Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, 1998; Krogh et al, 1994; J. Mol Biol. 235: 1501-1531), siguiendo la guía del usuario que está disponible de HMMER (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA). La salida del programa de software HMMER es un perfil de Modelo Oculto de Markov (perfil HMM) que caracteriza las secuencias de entrada. Como se indica en la guía del usuario, los perfiles HMM son descripciones estadísticas del consenso de un alineamiento múltiple de secuencias. Utilizan las puntuaciones específicas de la posición de los aminoácidos (o nucleótidos) y las puntuaciones de la posición específica para la apertura y extensión de una inserción o eliminación. En comparación con otros procedimientos basados en el perfil, los HMM tienen una base probabilística formal. Los perfiles HMM para un gran número de familias de proteínas están disponibles al público en la base de datos PFAM (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA.).
El perfil HMM se construyó de la forma siguiente:
Etapa1. Construir un alineamiento de secuencia
Las 25 secuencias para las KARI funcionalmente verificada enumeradas anteriormente se alinearon utilizando Clustal W (Thompson, J.D., Higgins, D.G., y Gibson T.J. (1994) Nuc Acid Res. 22: . 4673-4680) con los parámetros por defecto. El alineamiento se muestra en la Figura 9.
Tabla 8
25 enzimas KARI verificadas experimentalmente
Número GI Acceso ID de SEC Nº: Organismo
70732562
YP_262325.1 17 Pseudomonas fluorescens Pf-5
15897495
NP_342100.1 13 Sulfolobus solfataricus P2
18313972
NP_560639.1 14 Pyrobaculum aerophilum str. IM2
76801743
YP_326751.1 30 Natronomonas pharaonis DSM 2160
16079881
NP_390707.1 31 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168
19552493
NP_600495.1 32 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
6225553
O32414 33 Phaeospririlum molischianum
17546794
NP_520196.1 15 Ralstonia solanacearum GMI1000
56552037
YP_162876.1 34 Zymomonas mobilis subsp. mobiles ZM4
114319705
YP_741388.1 35 Alkalilimnicola ehrlichei MLHE-1
57240359
ZP_00368308.1 36 Campylobacter lari RM2100
120553816
YP_958167.1 37 Marinobacter aquaeolei VT8
71065099
YP_263826.1 38 Psychrobacter arcticus 273-4
83648555
YP_436990.1 39 Hahella chejuensis KCTC 2396
28
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