ES2554172T3

ES2554172T3 - Biosíntesis de ácido CMP-legionamínico a partir de fructosa-6-P

Info

Publication number: ES2554172T3
Application number: ES09832761.2T
Authority: ES
Inventors: Ian C. Schoenhofen; Susan M. Logan
Original assignee: National Research Council of Canada
Current assignee: National Research Council of Canada
Priority date: 2008-12-16
Filing date: 2009-12-16
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2029-12-16
Also published as: CA2747214C; US9157105B2; EP2379735B1; EP2379735A1; WO2010069047A1; EP2379735A4; US20120052532A1; CA2747214A1

Abstract

Un método de síntesis que comprende: (a) hacer reaccionar GDP-N-acetil-glucosamina, dinucleótido nicotinamida adenina (NAD) y LegB (4,6- 5 deshidratasa dependiente de NAD) comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado, (b) recuperar GDP-2-acetamido-2,6-didesoxi-alfa-D-xilo-hexos-4-ulosa.

Description

Biosíntesis de ácido CMP-legionamínico a partir de fructosa-6-P

5 Antecedentes de la invención

Los ácidos siálicos son una familia diversa de azúcares α–ceto que comparten un esqueleto estructural definido de 9 carbonos y normalmente son el resto más sobresaliente de los oligosacáridos sobre los glicolípidos y glicoproteínas de vertebrados. Generalmente están unidos a una cadena de azúcar subyacente a través de un enlace α–glicosídico 10 entre su posición 2 (Fig. 1) y el grupo 3-o 6-hidroxilo de galactosa o N-acetilgalactosamina, el grupo 6-hidroxilo de N-acetilglucosamina, o pueden también existir como homopolímeros unidos en α2,8 (Lehman et al., 2006). Con la presencia de varias sustituciones en sus posiciones 4, 5, 7, 8 y 9 (Varki y Varki, 2007), sus diversos enlaces, así como su prominente y accesible localización, no es sorprendente que esta diversa familia de azúcares media y/o modula una multitud de interacciones celulares. La adhesión y señalización intercelular a menudo es el resultado de 15 proteínas de unión específica al ácido siálico, o lectinas, presentes en las superficies de las células de mamífero, más observadas por su importancia en la regulación del sistema inmunitario y en el desarrollo neuronal. Por ejemplo, las Siglecs (lectinas de la superfamilia de Ig que reconocen Sia) MAG y CD22 están implicadas en la unión de las células de la glía a los gangliósidos, que es crucial en la estabilidad a largo plazo de la mielina, así como la inhibición del sobrecrecimiento de neuritas, y en la regulación negativa de la función de los linfocitos B, respectivamente (Varki 20 y Angata, 2006; Crocker et al., 2007; Varki, 2007). Además, la molécula de adhesión a las células neurales (NCAM) posee ácido polisiálico unido por enlaces α2,8, que es importante para el desarrollo del cerebro y la regeneración neural, aunque su expresión se correlaciona con un mal pronóstico para varios tumores neuroendocrinos (Bork et al., 204.7). Otro ejemplo de ácido siálico que tiene significado pronóstico en el cáncer humano es la expresión potenciada de ácido siálico unido por enlaces α2,6 sobre los N-glicanos, lo que se correlaciona con la progresión del

25 cáncer, la diseminación metastásica y un mal pronóstico para el cáncer de colon, de mama y cervical, por citar algunos (Hedlund et al., 2008).

Es posible que la importancia de los ácidos siálicos en los seres humanos haya contribuido a la abundancia de los patógenos que exhiben, se unen o catabolizan ácido siálico. De hecho, actualmente los ácidos siálicos se reconocen 30 como los receptores o ligandos más usados por los virus, las bacterias y protozoos patógenos (Lehman et al., 2006). Adicionalmente, las bacterias patógenas han obtenido la capacidad para exhibir ácidos siálicos en su superficie, bien mediante síntesis de novo o bien a través de mecanismos de secuestro específicos, que se cree que influyen sobre la patogenia a través de la evasión, adhesión e invasión inmunitaria (Hsu et al., 2006; Severi et al., 2007). Por ejemplo, las cápsulas de ácido polisiálico de Neisseria meningitidis B y Escherichia coli K1 son poco inmunogénicas, 35 probablemente debido a su mimetismo molecular con el ácido polisiálico que se encuentra en NCAM. Además de usar los ácidos siálicos del huésped como fuentes de nutrientes, muchas bacterias patógenas poseen lectinas específicas de ácido siálico que ayudan a las interacciones huésped-patógeno y, en última instancia, a la patogenia. Es interesante destacar que también pueden desplegar lectina solubles, o toxinas, que se unen a sialoglicoconjugados, tales como la toxina del cólera AB5 que reconoce el gangliósido GM1 Angstrom et al., 1994;

40 Merrit et al., 1998) y la toxina pertussis que reconoce el gangliósido GD1a (Hausman y Burns, 1993; Stein et al., 1994). Por ultimo, se ha encontrado que un número creciente de patógenos protozoarios usan lectinas específicas de ácido siálico, tal como Plasmodium spp., el agente causante del paludismo (Lehman et al., 2006). Además, los tripanosomas poseen una trans-sialidasa en la superficie celular que permite que estos organismos se recubran con el ácido siálico derivado de mamíferos (Pontes de Carvalho et al., 1993).

45 Además de presentar ácidos siálicos en su superficie, las bacterias pueden incorporar azúcares de tipo ácido siálico (derivados de 5,7–diacetamido–3,5,7,9–tetradeoxy–nonulosonato) en su superficie celular asociados a virulencia, glicoconjugados como lipopolisacárido (LPS), polisacárido capsular, pelos y flagelos (Schoenhofen et al., 2006b). Estos azúcares (Fig. 1) son únicos de los microorganismos y pueden exhibir diferencias configuracionales en

50 comparación con el ácido siálico. Un azúcar de tipo ácido siálico en particular, el ácido legionamínico (ácido 5,7– diacetamido–3,5,7,9–tetradesoxi–D–glicero–D–galacto–nonulosónico; X), tiene la misma configuración absoluta como ácido siálico. El ácido legionamínico se identificó por primera vez en 1994 como componente de LPS de Legionella pneumophila del serogrupo 1, de ahí su nombre (Knirel et al., 1994). No obstante, no fue hasta 2001 que se obtuvo su estereoquímica correcta usando métodos sintéticos Tsvetkov et al., 2001). L. pneumophila, el agente

55 causante de la enfermedad del legionario, invade y se replica dentro de los macrófagos alveolares y produce una neumonía debilitante y en ocasiones mortal (Kooistra et al., 2002). El papel del ácido legionamínico en la progresión de esta enfermedad puede ser significativo, ya que se ha sugerido que el LPS es un determinante clave en la capacidad de L. pneumophila para inhibir la fusión de los fagosomas con los lisosomas (Fernandez–Moreira et al., 2006). El EPS de L. pneumophila de serogrupo 1 contiene tanto ácido legionamínico como su isómero 4-epímero el

60 ácido 4-epi-legionamínico (Fig. 1), aunque la mayoría parece ser un homopolímero unido por enlaces α2,4 de ácido legionamínico (Knirel et al., 2003). Es interesante el hecho de que el primer informe de un proteoglicano que contiene ácido legionamínico (X) era el reciente descubrimiento de este azúcar sobre las flagelinas del patógeno gastrointestinal Campylobacter coli (McNally et al., 2007). En el presente documento se ha identificado que una serie de genes de Campylobacter es crítica para su síntesis mediante detección selectiva de mutantes isogénicos de la

65 presencia de metabolitos de ácido CMP-legionamínico (XI).

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis que comprende:

5 (a) hacer reaccionar GDP–N–acetil–glucosamina, dinucleótido de nicotinamida adenina. (NAD) y LegB comprendidos en un vaso de reacción suministrado,

(b) recuperar de GDP-2-acetamido-2,6-didesoxi-alfa-D-xilo-hexos-4-ulosa.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis como se ha descrito anteriormente, que comprende además hacer reaccionar LegC, piridoxal-fosfato (PLP), y un donante de amino adicional comprendido en el recipiente de reacción, y en el que se recupera GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D– GlcNAc.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis que comprende: 15

(a): hacer reaccionar GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa, LegC, piridoxal-fosfato (PLP) y un donante de amino comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado, y

(b): recuperar GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D–GlcNAc.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, el donante de amino es el ácido L-glutámico.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis como se ha descrito anteriormente, que comprende además hacer reaccionar una N-acetiltransferasa y acetil-CoA comprendido en el recipiente de reacción, y en el que se recupera GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc.

25 De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis que comprende:

(a): hacer reaccionar GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D–GlcNAc, una N-acetiltransferasa, y acetil-CoA comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado, y

(b): recuperar GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–a–D–Glc.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, la N-acetiltransferasa es LegH.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis como se ha descrito 35 anteriormente, que comprende además hacer reaccionar LegG y agua comprendidos en el recipiente de reacción, y en el que se recupera 2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–D–Man.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis que comprende:

(a): hacer reaccionar GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc, LegG y agua comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado, y

(b): recuperar 2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–D-Man.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis como se ha descrito 45 anteriormente que comprende además hacer reaccionar Legl y fosfoenol piruvato (PEP), y en el que se recupera ácido legionamínico.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis como se ha descrito anteriormente que comprende además hacer reaccionar trifosfato de citidina (CTP) y Me2+, y en el que se recupera ácido legionamínico.

(a) hacer reaccionar GDP–N–acetil–glucosamina, LegB, LegC, una N-acetiltransferasa, LegG, Legl, fosfoenol

55 piruvato (PEP), agua, acetil-CoA, piridoxal-fosfato (PLP), nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) y un donante de amino comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado,

(b): convertir GDP–N–acetil–glucosamina en GDP–2–acetamido-= 2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa con la LegB (deshidratasa) y NAD,

(c): convertir GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa en GDP–4–amino–4,6–didesoxi–a–D– GlcNAc con LegC, PLP y el donante de amino,

(d): convertir GDP–4–amino–4,6–didesoxi–a–D–GlcNAc en GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc con N-acetiltransferasa y acetil-CoA,

(e): convertir GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc en 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man con

LegG y agua, 65 (f) convertir 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man en ácido legionamínico con Legl y PEP, y

(g) recuperar el ácido legionamínico.

(a) hacer reaccionar GDP–N–acetil–glucosamina, nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), LegB, LegC,

piridoxal-fosfato (PLP), un donante de amino, una N-acetiltransferasa, acetil-CoA, LegG, agua, LegI, fosfoenol 5 piruvato (PEP), LegF, citidina trifosfato (CTP) y Me2+ comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado,

(b): convertir la GDP–N–acetil–glucosamina en GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa con LegB (deshidratasa) y NAD,

(c): convertir GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa en GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D– GlcNAc con LegC, PLP y el donante de amino,

(d): convertir GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D–GlcNAc en GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc con N-acetiltransferasa y acetil-CoA,

(e): convertir GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc en 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man con LegG y agua,

(f): convertir 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man en ácido legionamínico con Legl y PEP,

15 (g) convertir ácido legionamínico en ácido CMP-legionamínico con LegF, Me2+ y CTP, y

(h) recuperar ácido CMP-legionamínico.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, la N-acetiltransferasa es de este modo LegH.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos– 4–ulosa purificada o aislada.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D–GlcNAc.

25 De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un GDP–2,4–diacetamido–2,4;6–tridesoxi–α–D–Glc.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporciona un uso de LegB para convertir GDP–N–acetil– glucosamina en GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporciona un uso de LegC para convertir GDP–2– acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa en GDP–4–amino = 4,6–didesoxi–α–D–GlcNAc.

De acuerdo con otro aspecto mαs de la invención, se proporciona un uso de LegH para convertir GDP–4–amino– 35 4,6–didesoxi–α–D–GlcNAc en GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc.

De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proporciona un uso de LegG para convertir GDP–2,4– diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc en 2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–D–Man.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporciona un uso de LegG para convertir GDP–GlcNAc en – ManNA.

Como se usa en el presente documento, 'Me2+' se refiere a cualquier catión divalente, por ejemplo, pero de ninguna manera se limita a, Mg2+, Mn2+ y similares.

45 Breve descripción de las figuras

Figura 1. Estructuras de ácido siálico y azúcares de tipo ácido siálico. Se muestran ácido siálico (Neu5Ac; configuración D-glicero-D-galacto), ácido pseudamínico (Pse5Ac7Ac; configuración L-glicero-L-mano), ácido legionamínico (Leg5Ac7Ac; configuración D-glicero-D-galacto), ácido 4-epi-legionamínico (4eLeg5Ac7Ac; configuración de D-glicero-D-talo), y ácido 8-epi-legionamínico (8eLeg5Ac7Ac; configuración L-glicero-D-galacto). Se representan los anómeros termodinámicamente más estables, con grupos carboxilo ecuatoriales. Como referencia, se numeran los 9 átomos de carbono de ácido siálico. Figura 2. La ruta biosintética del ácido CMP-legionamínico en C. jejuni. Esta ruta biosintética implica dos

55 segmentos: 1) síntesis de un bloque componente de GDP-azúcar (a la izquierda de la línea discontinua), y 2) síntesis del CMP-nonulosonato final (a la derecha de la línea de puntos), que están unidos por la etapa enzimática que se muestra en gris. Las enzimas y compuestos intermedios biosintéticos de la ruta del ácido CMP-legionamínico en orden son: PtmA y PtmF, glutaminasa e isomerasa, respectivamente, que comprenden una GlcN–6–P sintasa; PgmL, fosfoglucosamina mutasa; PtmE, GlcN–1–P guanililtransferasa; GlmU, N– acetiltransferasa; LegB, 4,6–dehydratasa dependiente de NAD; LegC, aminotransferasa dependiente de PLP; LegH, N–acetiltransferasa; LegG, NDP–azúcar hidrolasa/2–epimerasa; Legl, ácido legionamínico sintasa; LegF, ácido CMP–legionamínico sintetasa; y (I) Fru–6–P; (II) GlcN–6–P; (III) GlcN–1–P (IV) GDP–GlcN; (V) GDP– GlcNAc; (Vl) GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa; (VII) GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α– D–GlcNAc; (VIII) GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–glucopiranosa; (IX) 2,4–diacetamido–2,4,6–

65 tridesoxi–D–manopiranosa; (X) ácido legionamínico; (XI) ácido CMP–legionamínico. La asignación de números a cada compuesto es coherente con las designaciones de etiquetas que se encuentran en todo el texto. Por

simplicidad, todos los azúcares se muestran en forma 4C1, a excepción de los nonulosonatos y de Fru-6-P.

Figura 3. Una selección de las modificaciones de azúcar extracitoplasmático de la célula Campylobacter.

Estructuras glicosiladas representados son lipooligosacárido (cián), glicoproteínas periplásmicas unidos a N (púrpura), peptidoglicano (naranja y azul) y flagelos, un polímero de glicoproteínas flagelina unidas a O (verde y rojo). Los azúcares que se encuentran dentro de los recuadros difieren solo por su aducto de nucleótidos, una herramienta probablemente discriminatoria para estas rutas de glicosilación. Cabe destacar aún no se han identificado las glicosiltransferasas responsables de la unión O-glicano a la flagelina. Las designaciones números romanos son coherentes con las que se encuentran en todo el texto y se refieren a los intermedios de ácido CMP-legionamínico identificados en este estudio. Las enzimas (números en gris) y los nombres de azúcar alternos se encuentran en las tablas 3 y 4, respectivamente.

Figura 4. Análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (12,5 %) de las enzimas biosintéticas de ácido CMP-legionamínico de Campylobacter jejuni 11168 después de la purificación en níquel-ácido nitrilotriacético. Calle 1, PtmAHis6 (punta de flecha) y His6PtmF (flecha); calle 2, PgmLHis6; calle 3, His6PtmE; calle 4, His6GlmU; calle 5, LegBHis6; calle 6, HiseLegC; calle 7, His6LegH; calle 8, His6LegG; calle 9, His6Legl, calle 10, LegFHis6. Los patrones de masa molecular se muestran a la izquierda en kDa.

Figura 5. Análisis por electroforesis capilar análisis de una reacción enzimática “en un solo recipiente” formando GDP–GlcN a partir de Fru-6-P. Una reacción PTME control (A) contenía inicialmente GlcN-1-P. (III), GTP, y His6PtmE, mientras que la reacción "'en un solo recipiente". (B) contenía Fru–6–P (I), GTP y cada uno de His6PtmF, PtmAHis6, PgmLHis6 y His6PtmE. Las ubicaciones de GTP, IV y el GDP–α–D–Glc también se indican en la figura. u.a., unidades arbitrarias.

Figura 6. Análisis por electroforesis capilar de los productos de reacción obtenidos después de la adición secuencial de LegBHis6 (A), His6LegC (B), His6LegH (C), His6LegGr (D) a GDP–α–D–GlcNAc. Las reacciones contenían GDP–α–D–GlcNAc 1 mM, NAD 0,5 mM, PLP, 8 mM L-Glu 0,8 mM, y acetil-CoA 1,5 mM según sea necesario. Las ubicaciones de GDP–α–D–GlcNAc (V), GDP-2-acetamido-2,6-didesoxi-α-D-xilo-hexos4-ulosa (VI), GDP-4-amino-4,6-didesoxi-α-D-GlcNAc (VII), GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc (VIII), NAD, CoA y GDP se indican en la figura. u.a., unidades arbitrarias. Figura 7. Cinética y especificidad de sustrato de His6LegG. (A) La reacción His6LegG con GDP–2,4– diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc (VIII) se monitorizó directamente con espectroscopia de RMN de 1H. Los espectros de de RMN de 1H se adquirieron con el tiempo (min), como se indica, y se muestra la región de protones C–6 CH3 de sustrato (VIII) y de producto (IX). (B) Análisis por electroforesis capilar de la reacción de His6Leg con UDP-2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-α-D-Glc después de la incubación durante 90 minutos a 37 °C y luego 16 horas a 25 °C; utilizando ~ 10 veces más enzima que en A. Las ubicaciones de UDP y UDP-2,4diacetamido-2,4,6-tridesoxi-α-D-Glc se indican dentro de la figura, donde u.a. son unidades arbitrarias. Figura 8. Espectro de 1H y espectro de correlación de 1H–13C HSQC de ácido CMP-legionamínico (XI). Los espectros se registraron en un espectrómetro de 500 MHz Varian INOVA UNITY con secuencias de pulso estándar Varian en D2O a 25 °C, con 4 exploraciones para el espectro 1H y 32 exploraciones para HSQC. C, citosina; R, ribosa; L, ácido legionamínico; NAC, regiones CH3 de 5-NHAc y 7-NHAc de ácido legionamínico; y acetona se incluyó como referencia interna. Figura 9. Flexibilidad del sustrato de His6PtmE después de una incubación de 30 minutos a 37 °C. Figura 10. Análisis CE-EM (modo de ion negativo) de la reacción His6GlmU. (A) conversión del GDP–GlcN (IV) en GDP–GlcNAc (V). La reacción contenía inicialmente GDP–GlcN, acetil–CoA y His6GlmU. (B) La conversión de GlcN-1-P (III) en GlcNAc-1-P. La reacción se llevó a cabo de forma similar a la anterior, excepto que se incluyó III en lugar de IV. Figura 11. El producto formado a partir de la catálisis de His6LegG de UDP-2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-α-D-Glc. A partir de los datos preliminares de RMN de 1H y 13C, el producto parece ser 6-desoxi-2,4diacetamidoglucal. Figura. 12. Las reacciones catalizadas por PtmA y PtmF. PtmF es una isomerasa que convierte la fructosa-6fosfato (I) en glucosa-6-fosfato. PtmF en combinación con la glutaminasa PtmA, y en presencia de L-glutamina, también llevará a cabo una reacción de amidación que resulta en la conversión de fructosa-6-fosfato (I) en glucosamina-6-fosfato (II). Aunque estas reacciones enzimáticas no son nuevas, el hecho de que estos dos dominios enzimáticos se producen naturalmente como dos polipéptidos separados, PtmF y PtmA, es único. Figura. 13. Las reacciones catalizadas por PgmL. PgmL es un fosfoglucosamina mutasa que convertirá glucosamina-6-fosfato (II) en glucosamina-1-fosfato (III), así como la glucosa-6-fosfato en glucosa-1-fosfato, sin adición exógena de glucosa-1,6-difosfato o glucosamina-1,6-difosfato que normalmente se requiere para otras enzimas fosfoglucosamina mutasa. PgmL junto con PtmF, PtmA y PtmE permitieron una síntesis en un solo recipiente del GDP-glucosamina (IV) a partir de fructosa-6-fosfato (I), una función importante para la producción in vivo. Figura. 14. Las reacciones catalizadas por PtmE. PtmE es una NDP–azúcares pirofosforilasa o nucleotidiltransferasa que convertirá N-acetil-glucosamina-1-fosfato en CDP-N-acetil-glucosamina, el GDP–N– acetil-glucosamina (V) y TDP-N-acetil-glucosamina usando los nucleótidos CTP, GTP y TTP, respectivamente. También convertirá la glucosa-1-fosfato en GDP-glucosa utilizando el nucleótido GTP. Por último, cuando se usa un aceptor de azúcar de glucosamina-1-fosfato, es específico para GTP, se forma GDP-glucosamina (IV). Es esta última función la que probablemente sea su papel in vivo, y, por lo tanto, esta enzima puede denominarse glucosamina-1-fosfato guanililtransferasa. Según los conocimientos de los inventores, la función glucosamina-1fosfato guanililtransferasa específica y eficiente es nueva.

Figura. 15. La reacción catalizada por GlmU. GlmU es bifuncional, siendo N-acetil-glucosamina-1-fosfato uridiltransferasa y glucosamina-1-fosfato (III) N-acetil-transferasa. Es una enzima bien establecida que convierte glucosamina-1-fosfato (III) en UDP-N-acetil-glucosamina en dos etapas. Los inventores notifican por primera vez que GlmU también puede convertir la GDP-glucosamina (IV) en GDP-N-acetil-glucosamina (V) catalizando la

5 transferencia de N-acetilo a partir de acetil-CoA. Figura. 16. La reacción catalizada por LegB. LegB es unA GDP-N-acetil-glucosamina-4,6-deshidratasa dependiente de NAD+ que convertirá GDP-N-acetil-glucosamina (V) en GDP-2-acetamido-2,6-didesoxi-α-D-xilohexos-4-ulosa (VI). Según los conocimientos de los inventores, tanto la actividad como el producto de LegB son nuevos. Figura. 17. La reacción catalizada por LegC. LegC es un GDP-2-acetamido-2,6-didesoxi-α-D-xilo-hexos-4-ulosa aminotransferasa dependiente de PLP que convertirá GDP-2-acetamido-2,6-didesoxi-α-D-xilo-hexos-4-ulosa (VI) en GDP-4-amino-4,6-didesoxi-α-D-GlcNAc (VII) en presencia de PLP y L-glutamato. Según los conocimientos de los inventores, la actividad, el sustrato y el producto de LegC son nuevos. Figura. 18. La reacción catalizada por LegH. LegH es unA GDP-4-amino-4,6-didesoxi-α-D-GlcNAc N-acetil

15 transferasa que convertirá GDP-4-amino-4,6-didesoxi-α-D-GlcNAc (VII) en GDP-2,4-diacetamido-2,4; 6-tridesoxiα-D-Glc (VIII) en presencia de acetil-CoA. Según los conocimientos de los inventores, la actividad, el sustrato y el producto de LegH son nuevos. Figura. 19. La reacción catalizada por LegG. Lega es una GDP-2,4 diacetamido-2,4,6-tridesoxi-α-D-Glc 2epimerasa hidrolizante que convertirá GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc (VIII) en 2,4-diacetamido2,4,6-tridesoxi-D-Man (IX). Según los conocimientos de los inventores, la actividad específica y el producto de LegG son nuevos. Figura. 20. La reacción catalizada por LegI. Legl es una ácido legionamínico sintasa que convertirá 2,4diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man (IX) en ácido 5,7-diacetamido-3,5,7,9-tetradesoxi-D-glicero-D-galactononulosónico ácido o ácido legionamínico (X) por condensación de IX con piruvato, utilizando PEP y liberando

25 fosfato inorgánico. Esta enzima proporciona una producción muy superior de X de lo indicado anteriormente. Figura. 21. La reacción catalizada por LegF. LegF es una ácido CMP-legionamínico sintetasa que convertirá el ácido 5,7-diacetamido-3,5,7,9-tetradesoxi-D-glicero-D-galacto-nonulosónico en ácido legionamínico (X) en ácido CMP-5,7-diacetamido-3,5,7,9-tetradesoxi-D-glicero-D-galacto-nonulosónico o ácido CMP-legionamínico (XI) usando el CTP donante de NTP y liberando de pirofosfato.

Descripción detallada

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que un experto en la técnica a la que la invención pertenece entiende habitualmente. Aunque

35 en la práctica o análisis de la presente invención se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen los procedimientos y materiales preferidos.

El ácido legionamínico azúcar de importancia médica es difícil de sintetizar químicamente; por ejemplo, el uso de 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man y ácido oxaloacético da lugar a rendimientos de ácido legionamínico de sólo el 7 %. Sin embargo, utilizando los métodos descritos en el presente documento, se pueden obtener rendimientos sustancialmente rendimientos cuantitativos, y en algunas realizaciones esencialmente cuantitativos, de ácido legionamínico (X) y ácido CMP-legionamínico (XI) a partir de GDP-GlcNAc in vitro y a partir de fructosa-6-P (I) in vivo También se describe la participación de intermediarios unidos a GDP únicos, así como las enzimas biosintéticas 45 PtmE, LegB, LegC, LegH y LegG que dan como resultado eficiencias biosintéticas enormemente mejoradas. Este método también permite una producción superior de 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man (IX), ácido legionamínico

(X) y ácido CMP-legionamínico (XI) como se trata a continuación.

Como se discute en el presente documento, las enzimas en las rutas de síntesis descritas en el presente documento se denominan por sus designaciones de Campylobacter (Tabla 2). Sin embargo, como entenderá un experto en la técnica, hay otras especies conocidas que producen ácido legionamínico, por ejemplo, pero de ninguna manera se limita a, Legionella, Clostridium, Campylobacter y Vibrio. De acuerdo con lo anterior, debe entenderse que las enzimas a las que se hace referencia en el presente documento se refieren a actividades enzimáticas, no necesariamente a las enzimas específicas de Campylobacter. Por ejemplo, PtmF es una isomerasa y PtmA es una 55 glutaminasa y PtmA/PtmF juntos son una glucosamina-6-fosfato sintasa con actividades de isomerasa y amidotransferasa. De un modo similar, PgmL se refiere a una fosfoglucosamina mutasa o fosfoglucomutasa; PtmE se refiere a una NDP–azúcar pirofosforilasa o nucleotidiltransferasa, y dentro de las rutas descritas anteriormente, específicamente es una glucosamina–1–fosfato guanidiltransferasa; GlmU se refiere a una GDP–glucosamina N– acetiltransferasa; LegB se refiere a una GDP–N–acetil–glucosamina 4,6–deshidratasa dependiente de NAD; LegC se refiere a una GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa aminotransferasa dependiente de PLP; LegH se refiere a una GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D–GlcNAc N–acetIltransferasa; LegG se refiere a una GDP– 2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc-2–epimerasa hidrolizante; Legl se refiere a una ácido legionamínico sintasa; y LegF se refiere a una ácido CMP–legionamínico sintetasa. De acuerdo con lo anterior, las enzimas que tienen actividades similares de otros organismos capaces de la síntesis de ácido legionamínico pueden sustituirlas y 65 están dentro del alcance de la invención. Es de notar que tales enzimas adecuadas pueden identificarlas fácilmente un experto en la técnica mediante diversos medios, por ejemplo, mediante la búsqueda en cualquiera de diversas

bases de datos, ya sea utilizando palabras clave o según la homología de secuencia. Por ejemplo, los números Cj para las enzimas biosintéticas de AEG son los mismos para los organismos Campylobacter jejuni y Campylobacter coli. En la cepa Langeland de tipo F de Clostridium botulinum, los homólogos son: PtmE – CLI_2778; LegB – CLI_2770; LegC – CLI_2769; LegG – CLI_2777; Legl – CLI_2775; LegF – CLI_2773.

5 De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis que comprende:

(a): hacer reaccionar GDP-N-acetil-glucosamina, dinucleótido nicotinamida adenina (NAD) y LegB comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado,

(b): recuperar de GDP-2-acetamido-2,6-didesoxi-alfa-D-xilo-hexos-4-ulosa.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis como se ha descrito anteriormente, que comprende además hacer reaccionar LegC, piridoxal-fosfato (PLP), y un donante de amino adicional comprendido en el recipiente de reacción, y en el que se recupera GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D–

15 GlcNAc.

(b): recuperar GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D–GlcNAc.

25 De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis como se ha descrito anteriormente, que comprende además hacer reaccionar una N-acetiltransferasa y acetil-CoA comprendido en el recipiente de reacción, y en el que se recupera GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc.

(b): recuperar GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc.

35 De acuerdo con otro aspecto de la invención, la N-acetiltransferasa es LegH.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis como se ha descrito anteriormente, que comprende además hacer reaccionar LegG y agua comprendidos en el recipiente de reacción, y en el que se recupera 2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–D–Man.

(a) hacer reaccionar GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc, LegG y agua comprendidos en un

recipiente de reacción proporcionado, y 45 (b) recuperar 2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–D-Man.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis como se ha descrito anteriormente que comprende además hacer reaccionar Legl y fosfoenol piruvato (PEP), y en el que se recupera ácido legionamínico.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis como se ha descrito anteriormente que comprende además hacer reaccionar trifosfato de citidina (CTP) y Me2+,y en el que se recupera ácido legionamínico.

55 De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis que comprende:

(a): hacer reaccionar GDP–N–acetil–glucosamina, LegB, LegC, una N-acetiltransferasa, LegG, Legl, fosfoenol piruvato (PEP), agua, acetil-CoA, piridoxal-fosfato (PLP), nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) y un donante de amino comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado,

(c): convertir la GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa en GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D– GlcNAc con LegC, PLP y el donante de amino,

(d) convertir la GDP–4–amino–4,6–didesoxi–αD–GlcNAc en GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc con 65 la N-acetiltransferasa y la acetil-CoA,

(e) convertir la GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc en 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man con el

LegG y el agua,

(f): convertir 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man en ácido legionamínicmo con Legl y PEP, y

(g): recuperar el ácido legionamínico.

5 De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método de síntesis que comprende:

(a): hacer reaccionar GDP–N–acetil–glucosamina, nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), LegB, LegC, piridoxal-fosfato (PLP), un donante de amino, una N-acetiltransferasa, acetil-CoA, LegG, agua, LegI, fosfoenol piruvato (PEP), LegF, citidina trifosfato (CTP) y Me2+ comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado,

(d) convertir la GDP–4–amino–4,6–didesoxi–αD–GlcNAc en GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc con 15 la N-acetiltransferasa y la acetil-CoA,

(e): convertir la GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc en 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man con el LegG y el agua,

(f): convertir 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man en ácido legionamínicmo con Legl y PEP,

(g): convertir el ácido legionamínico en ácido CMP-legionamínico con LegF, Me2+ y el CTP, y

(h): recuperar ácido CMP-legionamínico.

25 De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos– 4–ulosa purificada o aislada.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D–GlcNAc. El GDP4-amino-4,6-didesoxi-α-D-GlcNAc puede haberse producido mediante uno cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Cabe destacar que usos adecuados para la GDP-4-amino-4,6-didesoxi-α-D-GlcNAc purificada

o aislada incluyen, pero de ninguna manera es limitante, la fabricación de composiciones farmacéuticas para uso como antivirales.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un GDP–2,4–diacetamido–2,4;0,6–tridesoxi–α–D–Glc. Como se usa

35 en el presente documento, "aislado" significa que el compuesto en cuestión ha sido 'aislado', es decir, retirado, de su entorno nativo. Como se usa en el presente documento, "purificada" no necesariamente significa que el compuesto está en pureza absoluta sino que se ha purificado por ejemplo al menos 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces o similar. El GDP-2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-α-D-Glc se puede sintetizar de acuerdo con uno cualquiera de los métodos adecuados descritos en el presente documento. Cabe destacar que usos adecuados para la GDP-22,4diacetamido-2,4,6-tridesoxi-α-D-Glc purificado o aislado incluyen, pero de ninguna manera es limitante, la fabricación de composiciones farmacéuticas para uso como antivirales.

En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de LegB para convertir GDP–N–acetil–glucosamina en GDP– 2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa. Preferiblemente, el uso se lleva a cabo in vitro o en una célula

45 huésped recombinante como se discute en el presente documento.

En otro aspecto más de la invención, se proporciona el uso de LegC para convertir GDP–2–acetamido–2,6– didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa en GDP–4–amino = -4,6–didesoxi–α–D–GlcNAc. Preferiblemente, el uso se lleva a cabo in vitro o en una célula huésped recombinante como se discute en el presente documento.

En otro aspecto mαs de la invención, se proporciona el uso de LegH para convertir GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α– D–GlcNAc en GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc. Preferiblemente, el uso se lleva a cabo in vitro o en una célula huésped recombinante como se discute en el presente documento.

55 En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de LegG para convertir GDP–2,4–diacetamido–2,4,6– tridesoxi–α–D–Glc en 2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–D–Man. Preferiblemente, el uso se lleva a cabo in vitro o en una célula huésped recombinante como se discute en el presente documento.

En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de LegG para convertir GDP–GlcNAc en –ManNA. Preferiblemente, el uso se lleva a cabo in vitro o en una célula huésped recombinante como se discute en el presente documento. Específicamente, como se usa en el presente documento, una "célula huésped recombinante" se refiere a una célula que normalmente no expresa LegG o es una célula que se ha modificado, por ejemplo, a través de la transformación de tal manera que el LegG se sobreexpresa, es decir, se presenta a niveles más altos en comparación con una célula silvestre o control o no transformada.

65 El 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man se puede convertir en ácido legionamínico con Legl en presencia de

fosfoenol piruvato (PEP) y se recupera el ácido legionamínico. Esta etapa adicional se puede aplicar a otros métodos de síntesis apropiados descritos en el presente documento.

Antes de la recuperación del ácido legionamínico, el ácido legionamínico se convierte en ácido CMP-legionamínico 5 con LegF en presencia de trifosfato de citidina (CTP) y Me2+ y se recupera el CMP-legionamínico. Esta etapa adicional se pede aplicar a otros métodos de síntesis apropiados descritos en el presente documento.

La GDP-glucosamina se puede convertir en GDP-N-acetil-glucosamina con GlmU en presencia de acetil-CoA. Esta etapa adicional se pede aplicar a otros métodos de síntesis apropiados descritos en el presente documento.

Cabe destacar que los usos adecuados para el 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man recuperado, es decir aislado o purificado, ácido legionamínico o ácido CMP-legionamínico sintetizado de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero de ningún modo se limitan a, la fabricación de composiciones farmacéuticas para uso como antivirales.

15 La N-acetil-glucosamina-1-fosfato se puede convertir en NDP-N-acetil-glucosamina con PtmE en presencia de nucleótido trifosfato (NTP), Me2+y una pirofosfatasa. Específicamente, N-acetil-glucosamina-1-fosfato, en presencia de GTP, CTP o TTP, se convierte en GDP-GlcNAc, CDP-GlcNAc y TDP-GlcNAc respectivamente. Esta etapa adicional se puede aplicar a otros métodos de síntesis apropiados descritos en el presente documento.

La glucosamina-1-fosfato se puede convertir en GDP-glucosamina con PtmE en presencia de trifosfato de guanosina (GTP), Me2+ y una pirofosfatasa. Esta etapa adicional se pede aplicar a otros métodos de síntesis apropiados descritos en el presente documento.

25 La glucosamina-6-fosfato se puede convertir en glucosamina-1-fosfato con PgmL. Esta etapa adicional se pede aplicar a otros métodos de síntesis apropiados descritos en el presente documento.

La fructosa-6-fosfato se puede convertir en glucosamina-6-fosfato con PtmA y PtmF en presencia de un donante de nitrógeno. El donante de nitrógeno puede ser cualquier donante de nitrógeno adecuado, por ejemplo, L-glutamina (Gln) amoníaco o L-asparagina (Asn). Como apreciará un experto en la técnica, en algunas realizaciones, por ejemplo ciertas realizaciones in vitro, se puede añadir un agente reductor, por ejemplo, pero de ninguna manera limitado a, ditiotreotol (DTT). Esta etapa adicional se pede aplicar a otros métodos de síntesis apropiados descritos en el presente documento.

35 El 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man se puede convertir en ácido legionamínico con Legl en presencia de fosfoenol piruvato (PEP) y se recupera el ácido legionamínico.

Antes de la recuperación del ácido legionamínico, el ácido legionamínico puede convertirse en ácido CMPlegionamínico con LegF en presencia de trifosfato de citidina (CTP) y Me2+ y se recupera el CMP-legionamínico.

El ácido legionamínico se puede convertir en ácido CMP-legionamínico con LegF en presencia de CTP y Me2+ y se recupera el CMP-legionamínico.

La N-acetiltransferasa se refiere a una enzima tal como, por ejemplo LegH o PgLD, que lleva a cabo la reacción de

45 N-acetilación enzimática o a métodos químicos de acetilación que son bien conocidos para un experto en la técnica. Específicamente, los métodos químicos adecuados para la acetilación de los compuestos en cuestión pueden optimizarlos fácilmente con experimentación de rutina un experto en la técnica. Como apreciará un experto en la técnica, se pueden hacer sustituciones de las enzimas mencionadas anteriormente, siempre que la enzima sustituyente tenga suficiente afinidad por el sustrato de manera que la eficiencia de la síntesis global no se vea comprometida en una medida indeseable.

Como apreciará un experto en la técnica, el 'recipiente de reacción' puede ser un sistema de síntesis in vitro o una célula huésped recombinante diseñada para comprender las enzimas apropiadas según lo indicado anteriormente. En realizaciones en las que la síntesis es in vitro, el recipiente de la reacción puede incluir además o comprender un 55 tampón de reacción adecuado como será bien conocido por los expertos en las técnicas bioquímicas. Como apreciará un experto en la técnica, esto se puede realizar mediante el diseño de la célula huésped para expresar las enzimas no nativas enumeradas anteriormente para el método de síntesis. La célula huésped recombinante puede ser procariota o eucariota. En una realización preferida, la célula huésped recombinante es una célula bacteriana, más preferiblemente la célula huésped recombinante es de una cepa bacteriana que tiene UDP-GlcNAc usando rutas pero que normalmente no produce los productos finales mencionados anteriormente. En otras realizaciones, se proporciona la condición de que la célula huésped no sea una célula productora de forma natural de ácido legionamínico, tales como Pneumophilia Legionella, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli o Clostridium botulinum. Sin embargo, como apreciará un experto en la técnica, como resultado de los métodos descritos en el presente documento, las células huésped recombinantes de estos organismos en los que una o más de las enzimas

65 mencionadas anteriormente se sobreproducen, es decir, se sintetizan o expresan a un nivel mayor que en una célula de tipo silvestre comparable pueden diseñarse dentro del alcance de la invención.

Dado que muchas rutas de biosíntesis de carbohidratos bacterianos, incluyendo el metabolismo de hexosamina, proceden a partir de fructosa-6-fosfato, los genes biosintéticos o métodos de síntesis descritos anteriormente se pueden utilizar para el diseño de células recombinantes productoras de GDP-2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi -α-D

5 Glc (VIII), ácido legionamínico (X) o ácido CMP-legionamínico (XI), por ejemplo, células de Escherichia coli, aunque como apreciará un experto en la técnica también se pueden usar otros organismos adecuados, como se ha tratado anteriormente. Puesto que los inventores han descrito los genes necesarios para la conversión de fructosa-6-fosfato en VIII, X o XI, las materias primas adecuadas industriales, tales como glucosa, fructosa, glicerol, maltosa o N-acetilglucosamina, se pueden utilizar para esta producción in vivo de E. coli. Las células de E. coli diseñadas por ingeniería pueden ser similares a las de Lundgren y Boddy (2007), sin embargo las células incorporarían los genes de los inventores para la producción de I-VIII, IX o I-XI.

El ácido legionamínico azúcar de tipo ácido siálico se encuentra como glicoconjugado de superficie asociado con la virulencia asociada en Legionella pneumophila y Campylobacter coli. En este trabajo, los inventores han purificado y

15 caracterizado bioquímicamente once enzimas biosintéticas candidatas a partir de C. jejuni, de modo que reconstituyen completamente la biosíntesis de ácido legionamínico (X) y su forma CMP activada (XI), a partir de fructosa-6-P (I). Esta ruta implica intermedios unidos a GDP únicos y proporciona un medio fácil para la eficiente síntesis a gran escala de un mimético de ácido siálico importante (Figura 2; Tablas 1 y 2).

El esclarecimiento de la ruta del ácido legionamínico dentro de Campylobacter se basó en gran medida en un enfoque "holístico" que implica análisis bioinformáticos, de genómica comparativa, metabolómicos y funcionales. Una de las ideas más importantes fue la consideración de que esta ruta puede implicar intermedios unidos nucleótidos alternativos. Como está bien documentado que los diferentes nucleótidos dentro de los NDP-azúcares permiten la separación de las rutas biosintéticas y esto es importante porque proporciona un medio para su control y 25 regulación independientes, se creía que la ruta del ácido legionamínico dentro de Campylobacter puede ser selectiva para NDP distintos de UDP. Esto facilitaría su separación de las rutas de Campylobacter similares que usan UDP coexistentes, tales como las de ácido pseudamínico y 2,4-diacetamido-bacilosamina (Fig. 3). Varios hallazgos iniciales apoyaron esta hipótesis y son como sigue. En primer lugar, Cj1329,se encontró que un miembro del locus de glicosilación de la flagelina de Campylobacter (Cj1293-Cj1344) exhibía similitud de secuencia con NDP-azúcar pirofosforilasas o nucleotidiltransferasas, y, en particular, posee motivos similares al activador característico (G–X– G–T–R–X2–P–X–T) y los dominios de unión de azúcar ((E–E–K–P) encontrados dentro de las NDP-glucosa pirofosforilasas (Silva et al., 2005). Además de los componentes esperados de la ruta Cj1328, Cj1327 y Cj1331 (homólogos NeuC, B y A), también se encontró que los productos génicos Cj1329, Cj1330 y Cj1332 eran necesarios para la acumulación de ácido CMP-legionamínico (XI) en el metaboloma de E. coli (McNally et al., 2007). El requisito 35 de una posible nucleotidiltransferasa apoyó la hipótesis de los inventores y sugirió que algunos miembros del locus Cj1293-Cj1344 pueden ser responsables de la producción de un precursor de azúcar-1-P. Tras un examen más intenso, se encontró que Cj1332 y Cj1330 compartían una similitud de secuencia muy limitada con los dominios en N-terminal de glutaminasa y en C-terminal de amidación / isomerasa, respectivamente, de la glucosamina-6-P sintasa, una enzima clave del metabolismo de la hexosamina (Mouilleron et al., 2006). Esto fue muy sorprendente, ya que la glucosamina-6-P sintasa contiene ambos de estos dominios dentro de un polipéptido, y las enzimas Cj1330 / Cj1332 serían el primer informe en el que estos dominios se están produciendo de forma natural como dos polipéptidos separados. La hipótesis de los inventores fue respaldada por los rendimientos biosintéticos muy limitados de XI obtenidos al utilizar los homólogos NeuC, B y A de Campylobacter (Cj1328, Cj1327 y Cj1331) con intermediarios unidos a UDP derivados de la enzima PgI (Fig. 3). Curiosamente, Glaze et al. (2008) informaron

45 recientemente de dificultades similares, es decir malos rendimientos de XI, cuando se usan los mismos intermedios unidos a UDP derivados de la enzima Pgl con los homólogos NeuC, B y A de L. pneumophila. En el resto de el presente documento se discutirán los hallazgos de análisis funcionales in vitro de once enzimas producidas de forma recombinante y purificadas por afinidad a partir de C. jejuni 11168 (Fig. 4). Para la nomenclatura correspondiente y la función enzimática asociada a determinados números de Cj, consulte Tabla 2 y las Figs. 12–21.

Biosíntesis de GDP-glucosamina

Otra prueba de que Cj1330 (PtmF) y Cj1332 (PtmA) funcionan en tándem como glucosamina-6-P sintasa (GIcN-6-P sintasa) fue la estabilización observada de PtmF mediante copurificación con PtmA. Los intentos de aislar solamente

55 PtmF dieron lugar a agregados que no pudieron entrar en los geles de poliacrilamida-SDS al 12,5 %. Cuando PtmF y PtmA se copurificaron, el péptido PtmF todavía parecía agregarse, como se indica por la presencia de una especie de mayor peso molecular adicional mediante SDS-PAGE (Fig. 4), aunque en un grado mucho menor. Como se observó para otras, las GIcN-6-P sintasas (Teplyakov et al., 1999), se encontró que PtmF y PtmA convertían de manera eficiente fructosa-6-P (I) en glucosamina-6-P (II) o glucosa-6-P dependiendo de la presencia o ausencia de L-glutamina, respectivamente (Fig. 12). Que se sepa, este es el primer informe de una GIcN-6-P sintasa cuyos dominios funcionales, glutaminasa e isomerasa, no se fusionan naturalmente, cuyo significado se desconoce actualmente.

La siguiente etapa comprometida en la biosíntesis bacteriana de hexosamina implicaría la conversión de IIa en

65 glucosamina-1-P (III) por un mutasa fosfoglucosamina. La mutasa apropiada estaba clara, y como tal, se tuvo que buscar fuera del locus de glicosilación flagelar. Dado que la GIcN-6-P sintasa es la enzima limitante de la velocidad

en el metabolismo de la hexosamina, se creía que una mutasa "constitutiva" general podría ser suficiente para realizar las interconversiones necesarias para la glicosilación de la flagelina. Originalmente, se analizaron Cj0360 o GIrnM, una proteína mutasa anotada. Aunque, sólo parecía acumular GIcN–1,6–diP a partir de de II. Sorprendentemente, el gen Gj1407c también fue anotado como una fosfoglucomutasa, que causalmente está

5 yuxtapuesta a fliL(Cj1408), un componente flagelar que se localiza en la cara citoplasmática del anillo MS del cuerpo basal flagelar en Campylobacter. Cj1407c, ahora anotada como PgmL por su implicación en la ruta del ácido legionamínico, catalizó la interconversión de II en III (Fig. 13) sin la adición exógena de Glc–1,6–diP o GIcN–1,6–diP que normalmente se requiere para las enzimas GImM (Mengin–Lecreulx y van Heijenoort, 1996; Jolly et al., 1999), y permitió una síntesis enzimática “en un solo recipiente” de GDP–GIcN (IV) (véase más adelante). Cj1407c o PgmL también pudieron convertir Glc–6–P en GIc = 1–P (Fig. 13).

Al determinar el nucleótido utilizado por la ruta del ácido legionamínico, inicialmente los inventores buscaron en la especificidad de la nucleotidiltransferasa. Se encontró que Cj1329, o PtmE, eran absolutamente específicos de GTP en las reacciones que implican III (Figs. 9 y 14). Cabe destacar que esto permitió la producción a gran escala y 15 purificación de GDP–GlcN (IV) (Fig. 5a y Tabla 5). Además, cuando se utiliza GlcNAc-1-P como un aceptor de azúcar, PtmE exhibió promiscuidad con respecto al los donantes de NTP activador (Figs. 9 y 14). Esto permitió la producción a gran escala y la purificación de GDP-GlcNAc (V), CDP-GlcNAc y TDP-GlcNAc (Tablas 1y 5) para realizar más pruebas dentro de la ruta. Dado que los eucariotas acumulan GIcNAc–1–P principalmente debido a las acciones de una glucosamina–6–P N–acetiltransferasa (Buse et al., 1996), los inventores se sorprendieron de la promiscuidad del donante de NTP de PtmE con un aceptor de azúcar GIcNAc–1–P. Sin embargo, los inventores supusieron que las células bacterianas, posiblemente, acumulan GIcN-1-P en lugar de GlcNAc-1-P debido a la naturaleza bifuncional de la enzima GImU formadora de UDP-GlcNAc (Mengin-Lecreulx y van Heijenoort, 1994), y que tal vez la función natural de PtmE dentro de la ruta del ácido legionamínico es la formación de GDP GIcN (IV) a partir de GIcN-1-P (III). Si este escenario es correcto, se esperaría que la ruta del ácido legionamínico utilizara

25 precursores de nucleótidos de guanina. En última instancia, esto se conformó mediante análisis adicional de los componentes de la ruta (véase más adelante). Además, PtmE exhibió especificidad para la configuración C4 de GIc porque no observó ninguna actividad cuando se utiliza GaIN–1–P (Fig. 9), pero se observó actividad con GIc–1–P, GIcN–1–P y GIcNAc–1–P (Fig. 14). Cabe destacar que ptmE contiene una secuencia adicional aguas arriba de función desconocida llamada un dominio CBS (originalmente encontrada en cistationina beta-sintasa), que puede estar involucrada en algún nivel de regulación.

La eficiencia de estas enzimas NDP-hexosamina se demostró mediante la producción de IV a partir de una reacción enzimática en “un solo recipiente" que implica PtmF, PtmA, PgmL y PtmE, comenzando desde I (Fig. 5). Además de IV, la acumulación de GDP-GIc también se observó en la reacción "en un solo recipiente", una consecuencia de la

35 producción por PtmF/PtmA de Glc-6-P tras la depleción de L-glutamina, así como la promiscuidad de las enzimas aguas abajo. Las identidades de los dos productos observados en la Fig. 5b se confirmaron mediante purificación adicional y CE-EM análisis, análisis de RMN (Tabla 5) y comparaciones con una preparación de control de IV (Fig. 5a).

Conversión de GDP-GIcN en GDP-GlcNAc:

Dado que síntesis del ácido legionamínico (X) que cabría esperar para utilizar un azúcar 2,4-diacetamido-hexosa, la suposición era que un intermedio de GDP-HexNAc se introdujera en la ruta nonulosonato, reduciendo así el número de manipulaciones enzimáticas requeridas, es decir, IV no era el bloque componente nonulosonato inicial. Esto se 45 confirmó después, ya que la enzima de la ruta de nonulosonato inicial mostraba preferencia por el grupo N-acetilo de V (véase más adelante). De todas las manipulaciones enzimáticas que conducen al precursor de la ruta de nonulosonato V, es esta etapa en la que los inventores tienen más inseguridad. Dado que la enzima bifuncional GImU formadora de UDP-GlcNAc que es responsable de la conversión de III en GlcNAc-1-P con la posterior uridilación, es capaz de convertir UDP-GIcN en UDP-GlcNAc en eficiencias bajas (Pompeo et al., 2001), los inventores han tratado de de determinar si GlmU de Campylobacter podía N-acetilar IV. Este GImU se encontró que convertía IV en V, pero no hasta el final como se ve con una reacción control de N-acetilación utilizando su sustrato natural III en lugar de IV (Figs. 10 y 15). 10 y 15). Actualmente, se están evaluando otras N-acetiltransferasas putativas del locus de glicosilación flagelar, tales como Cj1296/97, Cj1321 y Cj1322/23, para determinar su capacidad para catalizar la conversión eficiente de IV en V. Finalmente, los inventores no creen que la ruta

55 inicialmente proceda I → II → III→GlcNAc-1-P→ V, ya que la naturaleza promiscua de PtmE con GIcNAc–1–P probablemente daría lugar a la síntesis disminuida de V, pero no se puede descartar esta posibilidad. Es importante destacar que el esquema sugerido de los inventores (Figura 2) también permitiría que PtmE actuara sobre abundantes niveles de III endógeno.

Biosíntesis de ácido CMP-legionamínico a partir de GDP–GlcNAc.

El uso de los conocimientos adquiridos en la aclaración de la ruta del ácido CMP-pseudamínico en Helicobacter pylori (Schoenhofen, Lunin et al., 2006; Schoenhofen, McNally, Brisson et al., 2006; Schoenhofen, McNally, Vinogradov et al., 2006), los inventores comenzaron a desentrañar la ruta biosintética para XI, cuyos resultados se 65 resumen en la Figura 2 y la Tabla 1. Recientes hallazgos metabolómicos descontaron Cj1319 (LegB) y Cj1320 (LegC), la única deshidratasa putativa restante y aminotransferasa que queda en el locus de glicosilación flagelar de

Campylobacter, por tener un papel en la síntesis de ácido legionamínico (McNally et al., 2007), aunque los inventores encontraron que estas manipulaciones enzimáticas eran necesarias dentro de la ruta. Al examinar la capacidad de LegB para actuar como deshidratasa, los inventores descubrieron que realizaban la deshidratación en C4,6 de V (Fig. 16). Inicialmente sólo incluyeron reacciones V y LegB, pero fracasaron. Dado que NAD

5 (P)+normalmente está estrechamente acoplado a estas enzimas particulares y es un cofactor necesario para la reacción deshidratasa C4,6, los inventores han añadido NAD+y NADP+ exógenamente en reacciones separadas. Al hacerlo, se encontró que LegB para catalizaba la rotación eficiente de V de un modo dependiente de NAD+ formando el producto de GDP-2-acetamido-2,6-didesoxi-α-D-xilo-hexos-4-ulosa (VI; Figs. 6a y 16). 6a y 16). Cabe destacar que otras reacciones de LegB, en presencia o ausencia de NAD (P)+, con IV, UDP-GlcNAc, CDP-GlcNAc, TDP-GlcNAc y TDP-GIc no dieron un producto discernible.

Además, LegC catalizó la aminotransferencia eficiente de VI, formando GDP-4-amino-4,6-didesoxi-α-D-GlcNAc (VII) de una manera dependiente de PLP (Figs. 6b y 17). LegC es específico del intermedio GDP-ceto VI, ya que fue incapaz de convertir los intermedios UDP-ceto del ácido pseudamínico o las tutas de 2,4-diacetamido-bacilosamina

15 (Fig. 3), lo que apoya adicionalmente su papel en la síntesis de ácido legionamínico. La discrepancia metabolómica in vivo y enzimática in vitro de LegB/LegC puede explicarse por la posible comunicación de bajo nivel de los intermedios de la ruta dentro de Campylobacter. Esto se ve reforzado adicionalmente por la observación de los inventores de que se pueden obtener niveles bajos de XI por el uso de productos intermedios unidos a UDP de la ruta de Pgl 2,4-diacetamido-bacilosamina.

La siguiente etapa prevista en la síntesis de XI involucraría la N-acetilación de VII por una transferasa respectiva. Dado que hay varias de estas transferasas no caracterizaras en el locus de glicosilación de la flagelina de Campylobacter (Cj1296/97, Cj1298, Cj1321 y Cj1322/23), inicialmente los inventores intentaron reacciones con PgID, una N–acetiltransferasa implicada en la biosíntesis de Pgl 2,4–diacetamido–bacilosamina (Fig. 3) (Olivier et

25 al., 2006). El sustrato normal de PgID es idéntico a VII solo está unido a UDP. Para sorpresa de los inventores, PgID fue capaz de catalizar la N-acetiltransferencia de VII, formando GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi-α-D-Glc (VIII). Aunque, la eventual detección de Cj1298 (LegH) exhibió velocidades catalíticas mucho mayores, dando como resultado un 100 % de conversión de VII en VIII (Figs. 6c y 18). Como tal, LegH es probablemente un componente dedicado de la biosíntesis de ácido legionamínico. Es importante destacar que esta complementación cruzada in vitro de la función de LegH por PgID puede haber impedido su identificación inicial mediante detección metabolómica in vivo. Es importante destacar que, sin la identificación in vitro de LegB, LegC y LegH, la producción enzimática eficiente de VIII y los intermedios / productos posteriores no serían posibles.

Probablemente, el punto de control más crítico entre las rutas de Pgl glicano y de ácido legionamínico dentro de

35 Campylobacter es la reacción catalizada por el homólogo de NeuC Cj1328 (LegG). Cabe esperas que esta enzima realice una epimerización de C2 que resulta en la eliminación de NDP, y, de hecho, se encontró que LegG eliminaba de manera eficiente el NDP del sustrato VIII (Fig. 6d). Después de examinar el producto de azúcar formado, mediante la realización de reacciones de RMN “en tubo”, se observó la catálisis eficiente de VIII, de tal manera que la formación de 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man (IX) estaba a punto de completarse en 75 minutos utilizando sólo 4 µg de LegG (Figs. 7a y 19). Usando condiciones similares, IX no se observó cuando el producto de UDP– 2,4–diacetamido-2,4,6-tridesoxi-α-D-Glc, se utilizó como sustrato. Aunque, cuando los inventores aumentaron la cantidad de LegG 10 veces dentro de esta reacción, se observó la eliminación de UDP (Fig. 7b), pero no del producto IX. En cambio, los inventores observaron pequeñas cantidades de 6-desoxi-2,4-diacetamidoglucal (Fig. 11), un candidato poco probable para la siguiente reacción de condensación. Como los inventores fueron capaces

45 de generar pequeñas cantidades de XI utilizando el intermedio unido a UDP anterior, similar a los hallazgos recientes de Glaze et al. (2008), es posible que el producto glucal, o cantidades no detectables de IX, puede condensarse ineficientemente con piruvato en la siguiente etapa enzimática. Sin embargo, se concluyó que la ruta sintética natural es como se resume en la Figura 2. Cabe destacar que LegG también se encontró que catalizaba el recambio de V con una eficacia moderada según la evaluación de CE, que puede ser un medio alternativo de acumular el precursor de ácido siálico ManNAc en Campylobacter. Esta es la razón por la cual la biosíntesis a gran escala de X de los inventores implicó dos 'reacciones “en un solo recipiente” separadas (es decir, V → VIII, después VIII → X).

Por último, los papeles de los homólogos de Neub y Neua Cj1327 (LegI) y Cj1331 (LegF), respectivamente, se

55 confirmaron. Legl catalizó la condensación de IX con piruvato para formar X, Mientras que LegF activó con CMP eficientemente el X (Tabla 1; Figs. 20 y 21).

En resumen, los inventores han descrito un método fácil y eficaz para la preparación enzimática de XI (Fig. 8) y los intermedios de la ruta correspondientes. Dado que los rendimientos sintéticos obtenidos a partir de métodos químicos son bajos, sólo el 7 % de la condensación de IX con ácido oxalacético (Tsvetkov et al., 2001), el método enzimático de los inventores proporciona una alternativa sintética atractiva. Y, ya que los inventores han definido las capas enzimáticas de NDP-hexosamina a partir de I, la ingeniería de las cepas productoras de E. coli es ahora posible (Lundgren y Boddy, 2007), con eficiencias de producción que superan con mucho las de los métodos enzimáticos in vitro

Procedimientos experimentales

Expresión y purificación de la proteína marcada con His6

La construcción y secuenciación de ADN plasmídico fueron similares a los métodos descritos previamente

5 (Schoenhofen et al., 2006a; Schoenhofen et al., 2006b). El vector o los plásmidos recombinantes se transformaron por electroporación en células de Escherichia coli TTop10F' o DH10B electrocompetentes (Invitrogen) para fines de clonación o células E. coli BL21 [DE3] (Novagen) para la producción de proteínas, a excepción del clon de expresión pNRC51.1 que se sometió a electroporación en células de E. coli BL21 CodonPlus-[DE3] -RIL (Novagen). La PCR se usó para amplificar el ADN de Campylobacter jejuni 11168 para la posterior clonación. Una lista de los vectores de clonación y plásmidos recombinantes se proporciona en la Tabla 6 y los oligonucleótidos correspondientes se proporcionan en Tabla 7. Los plásmidos de nueva construcción son: pNRC145.3, que codifica un derivado marcado con His6 en N–terminal de Cj1330 o PtmF; pNRC141.1, que codifica un derivado marcado con His6 en C–terminal de Cj1332 o PtmA; pNRC173.1, que codifica un derivado marcado con His6 en C–terminal de Cj1407c o PgmL; pNRC136.1; que codifica un derivado marcado con His6 en N–terminal de Cj1329 o PtmE; pNRC175.1, que codifica

15 un derivado marcado con His6 en N–terminal de Cj0821 o GlmU; pNRC16.1, que codifica un derivado marcado con His6 en C–terminal de Cj1319 o LegB; pNRC83.1, que codifica un derivado marcado con His6 en N–terminal de Cj1320 o LegC; pNRC164.3, que codifica un derivado marcado con His6 en N–terminal de Cj1298 o LegH; pNRC134.1, que codifica un derivado marcado con His6 en N–terminal de Cj1328 o LegG; pNRC51.1, que codifica un derivado marcado con His6 en N–terminal de Cj1327 o Legl; y pNRC139.1, que codifica un derivado marcado con His6 en C–terminal de Cj1331 o LegF.

Normalmente, cada cepa de expresión se cultivó en 1 a 2 1 de triptona de levadura 2x (Schoenhofen et al., 2006a), dependiendo del nivel de expresión, ya sea con kanamicina 50 µg ml–1), ampicilina (75 µg ml–1) o ampicilina y cloranfenicol (100 µg ml–1 y 40 µg ml–1) para la selección. Los cultivos se cultivaron a 30 °C, se indujeron a una 25 DO600 de 0,6 con isopropil-1-tio-β-D-galactopiranósido 0,1 mM y se recogieron 2,75 horas más tarde. Para las enzimas biosintéticas de la 'GDP-hexosamina' (PtmF, PtmA, PgmL, y PtmE), los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 400 mM, β-mercaptoetanol 10 mM) que contenía imidazol 10 mM y mezcla completa de inhibidor de la proteasa, libre de EDTA (Roche Ciencias Aplicadas). Después de la adición de 10 µg ml–1 de DNasal (Roche Applied Science), las células se rompieron mediante dos pases a través de un Emulsiflex C5 (20.000 psi = aprox. 138 x 106 Pa). Los lisados se centrifugaron a 100.000 xg durante 50 min a 4 ° C y la fracción sobrenadante se aplicó a una columna de 2 ml de níquel-ácido nitrilotriacético (Qiagen) equilibrada en de tampón de lisis de imidazol 10 mM, utilizando un caudal de 1 ml min-1. Después de la aplicación de la muestra, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis imidazol 10 mM. Para eluir la proteína de interés, se aplicó un gradiente lineal de 10 a 100 mM de imidazol, en tampón de lisis, sobre 25 35 volúmenes de columna a la columna antes de un pulso final de 20 volúmenes de columna de tampón de lisis imidazol 200 mM. Las fracciones que contenían la proteína de interés purificada, según lo determinado mediante SDS-PAGE (12,5 %) y la tinción de Coomassie, se agruparon y se dializaron frente a tampón de diálisis (Tris 25 mM, pH 7,5) durante la noche a 4 °C. Al purificar PtmE para la producción "a gran escala" de NDP-azúcares, el tampón de diálisis contenía Tris 50 mM a pH 7,5. Además, PtmF y PtmA se purificaron combinando los respectivos sedimentos celulares se resuspendidos antes de la lisis celular. Para las enzimas biosintéticas de 'nonulosonato' (LegB, LegC, LegH, LegG, LegI y LegF) y GImU, la purificación fue similar a la anterior, excepto que el tampón de lisis contenía fosfato de sodio 50 mM en lugar de Tris y el tampón de diálisis consistió en fosfato de sodio 25 mM, NaCl 25 mM. El pH se ajustó de 7,3 a 7,8, dependiendo de la pi teórica de cada proteína. Además, el tampón de diálisis para GImU contenía adicionalmente β-mercaptoetanol 10 mM. La concentración de proteínas se midió por

45 espectrofotometría utilizando valores de A280 0,1 % (PgmLHis6, 0,693; His6PtmE, 0,513; His6GImU, 0,517; LegBHis6, 0,892; His6LegC, 0,625; His6LegH, 1,06; His6LegG, 0,432; His6LegI, 0,242; LegFHis6, 0,385; y la concentración de proteínas se estimó para preparaciones de His6PtmF/PtmAHis6 utilizando un valor promedio al 0,1 % de 0,82). Los rendimientos de la proteína purificada fueron normalmente de 20 mg l-1 de cultivo de células, a excepción de His6LegC, His6LegH y His6LegI con rendimientos de 6, 2,5 y 7,5 mg l–1 de cultivo celular, respectivamente.

Reacciones enzimáticas y purificación de metabolitos

Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo durante 4,5 horas a 37 °C, y luego durante la noche a 25 °C, con aproximadamente 200 µg ml–1 de la concentración de proteínas respectivas utilizando productos químicos de Sigma 55 (a menos que se indique lo contrario). Biosíntesis de GDP-glucosamina La síntesis enzimática "en un solo recipiente” de GDP–GlcN a partir de Fru–6–P (I→IV) se consiguió usando una reacción de 3 ml que contenía His6PtmF, PtmAHiS6, PgmLHis6, His6PtmE, Fru–6–P (I) 5 mM, L–Gln 10 mM, DTT 1 mM, MgCl2 5 mM, 0,8 U ml–1 de pirofosfatasa, y GTP 2,5 mM en Tris 25 mM a pH 7,5. La síntesis enzimática a gran escala de GDP–GlcN (IV) se consiguió usando una reacción de 12 ml que contenía Tris 50 mM a pH 7,5, GTP 1 mM, MgCl2 1 mM, 0,8 U ml–1 de pirofosfatasa, GlcN–1–P (III)1,2 mM y aproximadamente 4,8 mg de His6Ptm. La síntesis enzimática a gran escala de GDP–GlcNAc se realizó de forma similar a la anterior, excepto que la escala se incrementó cinco veces y se usó GlcNAc–1–P en lugar de GlcN–1–P (III). La evaluación de la especificidad de sustrato de His6PtmE se realizó utilizando 9 reacciones de 80 µl cada una, que contenían Tris 50 mM a pH 7,5, MgCl2 2 mM, 50 µg de His6PtmE, y diversas combinaciones de azúcar–1–P 10 mM (GalN–1–P, GlcN–1–P o GlcNAc–1–P) y NTP (CTP, GTP, o TTP) 65 0,2 mM. Conversión de GDP–GlcN en GDP–GlcNAc: La reacción de His6GlmU se realizó con usando GDP–GlcN

(IV) 1 mM, acetil–CoA 1,2 mM y His6GlmU en fosfato de sodio 25 mM a pH 7,8, NaCl 25 mM, β-mercaptoetanol10

mM. Además, se realizó una reacción de control que contiene GlcN-1-P (III) 1 mM en lugar de IV. Biosíntesis de ácido legionamínico a partir de GDP–GlcNAc. La síntesis enzimática gradual de intermedios o productos se llevó a cabo en 2 etapas (V→VI→VII→VIII, y luego VIII→IX→X) usando 1 mM de V, NAD 0,5 mM, PLP 0,8 mM, L-Glu 8 mM, acetil-CoA 1,2 mM, PEP 1,2 mM, LegBHis6, His6LegC, His6LegH, His6LegG, y His6LegI según sea adecuado, 5 en fosfato de sodio 25 mM a pH 7,3, NaCl 25 mM. La evaluación de la actividad de His6LegG implicó la monitorización de la cinética de la reacción mediante RMN de 1H (véase Espectroscopia de RMN)) durante 75 min usando GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc (VIII) 0,75 mM, 4 µg de His6LegG en 200 µl de fosfato de sodio 25 mM a pH 7,3, NaCl 25 mM a 25 °C. Además, la flexibilidad de de sustrato de His6LegG se evaluó mediante una reacción de 300 µl que contenía 40 µg de His6LegG, fosfato de sodio 25 mM a pH 7,3, NaCl 25 mM y UDP–2,4– diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc 0,75 mM, con incubación a 37 °C durante 1,5 h, y después durante la noche a 25 °C. Biosíntesis de ácido CMP-legionamínico. La activación con CMP de ácido legionamínico (X→XI) se llevó a cabo usando una reacción de 20 ml que contiene aproximadamente 0,2 mM de X, MgCl2 50 mM, CTP 3 mM y 15 mg de LegFHis6 en fosfato de sodio 25 mM a pH 7,8, NaCl 25 mM, con incubación a 37 °C durante 5 horas, y luego a 25 °C durante 72 horas. Purificación de metabolitos. Normalmente, las reacciones se hicieron pasar a través de una

15 membrana de filtro Amicon Ultra–15 (10.000 de peso molecular de corte) o Ultra-4 (5.000 de peso molecular de corte) antes del análisis. Cuando fuera necesario, los preparaciones de NDP-azúcar (GDP–Glc, GDP–GlcN, GDP– GlcNAc, CDP–GlcNAc, TDP–GlcNAc, y CMP–Leg) se liofilizaron y desalaron / purificaron utilizando una columna Superdex Péptido 10/300 GL (Amersham Biosciences) en bicarbonato de amonio 25 mM, pH 7,9. Para mayor pureza, las muestras de NDP-azúcar anteriores se sometieron a cromatografía de intercambio aniónico (Mono Q 4.6/100 PE, Amersham Biosciences) usando bicarbonato de amonio a pH 7,9. La cuantificación de las preparaciones de NDP-azúcar se determinó utilizando los coeficientes de extinción molar de CMP (ε260= 7,400), GDP (ε260= 11.500), TDP (ε260 = 8.700), y UDP (ε260 = 10.000).

Análisis CE y CE-EM

25 Se realizó un análisis CE utilizando un sistema P/ACE 5510 o P/ACE MDQ (Beckman Instruments, Mississauga, ONT) con detección por red de diodos. Los capilares fueron sílice desnuda 50 µm x 50 cm, con un detector a 50 cm, y el tampón de recorrido fue tetraborato sódico 25 mM a pH 9,4. Las muestras se introdujeron mediante inyección a presión durante 6 segundos, y la separación se realizó a 18 kV durante 20 minutos. La integración de los picos se realizó utilizando el software de la estación Beckman P/ACE.

CE-EM se realizó usando un sistema Prince CE (Prince Technologies) acoplado a un espectrómetro de masas QTRAP 4000 (Applied Biosystems / MDS Sciex). Las separaciones se obtuvieron en un capilar de sílice desnuda de ~ 90 cm usando morfolina 30 mM en agua desionizada, pH 9. Una tensión de separación de 20 kV, junto con una

35 presión de 500 mbar se utilizó para el análisis rápido CE-EM. El voltaje de ionización por electropulverización -5,2 kV se utilizó para la detección de modo de iones negativos.

Espectroscopia de RMN

Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo en tubos de RMN de 3 mm a 25 °C en 10 % de D2O y se controlaron a través de la adquisición del espectro de 1H a varios intervalos de tiempo (indicado en minutos) usando un espectrómetro Varian Inova 500 MHz (1H) con una sonda de 3 mm de gradiente Z Varian. Para la caracterización estructural de los compuestos, las reacciones enzimáticas filtradas o el material purificado se intercambiaron en 100 % de D2O. Se realizó el análisis estructural usando un espectrómetro Varian 600 MHz (1 H) con una sonda

45 refrigerada criogénicamente de resonancia de triple gradiente Z Varian 5 mm para una sensibilidad óptima. Todos los espectros hicieron referencia a un patrón de acetona interno (δH 2,225 ppm y δc 31,07 ppm).

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35 Tsvetkov YE, Shashkov AS, Knirel YA, Zähringer U. 2001. Synthesis and identification in bacterial lipopolysaccharides of 5,7–diacetamido–3,5,7,9–tetradeoxy–D–glycero–D–galacto– and –D–glycero–D– talo–non–2–ulosonic acids. Carbohydr Res. 331:233–237.

40 Varki A. 2007. Glycan–based interactions involving vertebrate sialic–acid–recognizing proteins. Nature. 446: 1023–1029.

Varki A and Angata T. 2006. Siglecs–the major subfamily of I–type lectins. Glycobiology. 16:1R–27R. Varki NM and Varki A. 2007. Diversity in cell surface sialic acid presentations: implications for biology and 45 disease. Lab Invest. 87:851–857.

Yu VL, Plouffe JF, Pastoris MC, Stout JE, Schousboe M, Widmer A, Summersgill J, File T, Heath CM, Paterson DL, et al. 2002. Distribution of Legionella species and serogroups isolated by culture in patients with sporadic community–acquired legionellosis: an international collaborative survey. J Infect Dis. 186:127–

50 128.

Tabla 1. Desplazamientos químicos de RMN δ (ppm) para los azúcares de los compuestos V a XI.

13C

Compuesto 1H δ11 (ppm) δc (ppm)

V H1 5,51 C1 95,1 H2 3,99 C2 54,5 H3 3,81 C3 71,7 H4 3,55 C4 70,3 H5 3,92 C5 73,8 H6 3,82/3,86 C6 61,2

VI H1 5,45 C1 95,3 H2 4,10 C2 53,5 H3 3,82 C3 72,4

H5: 4,11 C5 70,9

H6: 1,21 C6 12,4

VII: H1 5,50 C1 95,6

H2: 4,06 C2 55,0

H3: 3,87 C3 69,1

H4: 2,96 C4 58,6

H5: 4,21 C5 68,0

H6: 1,32 C6 18,0

VIII: H1 5,50 C1 95,4

H2: 4,05 C2 55,2

H3: 3,80 C3 69,8

H4: 3,68 C4 57,9

H5: 4,05 C5 69,3

H6: 1,16 C6 18,0

α/β
α/β

IX: H1 5,11/4,96 C1 94,0/94,0

H2: 4,30/4,46 C2 53,8/54,8

H3: 4,06/3,84 C3 67,7/71,7

H4: 3,77/3,66 C4 54,8/54,5

H5: 3,97/3,51 C5 68,1/72,6

H6: 1,19/1,21 C6 18,0/18,0

X: H3a 1,83 C3 40,8

H3e: 2,22

H4: 3,96 C4 68,5

H5: 3,72 C5 53,8

H6: 4,24 C6 70,4

H7: 3,86 C7 54,3

H8: 3,86 C8 67,5

H9: 1,16 C9 20,4

XI: H3a 1,63 (J3a,4 11,9; J3a,P 5,8) C3 42,6

H3e: 2,48 (J3c,4 4,7; J3c,3a 13,4)

H4: 3,98 (J4,5 10,3) C4 68,3

H5: 3,72 (J5,6 10,3) C5 53,7

H6: 4,33 (J6,7 1,5) C6 72,3

H7: 3,77 (J7,8 9,5) C7 55,3

H8: 4,03 (J8,9 6,4) C8 66,9

H9: 1,10 C9 19,5

Tabla 2. Enzimas caracterizadas funcionalmente en este estudio. Las enzimas implicadas en la biosíntesis de ácido CMP-legionamínico se muestran en orden secuencial, en el que cada producto es un sustrato para la siguiente etapa biosintética. El sustrato inicial para la ruta es Fructosa–6–P (I).

Número Cj: Nomenclatura recomendada Nomenclatura(s) previas Función enzimática in vitro Producto(s) biosintéticos

Cj1330: PtmF PtmF isomerasa GlcN–6–P (II)

Cj1332: PtmA PtmA glutaminasa

Cj1407c: PgmL fosfoglucosamina mutasa GlcN–1–P (III)

Cj1329: PtmE PtmE GlcN–1–P guanililtransferasa GDP–GlcN (IV)

Cj0821: GlmU GlmU N–acetiltransferasa GDP–GlcNAc (V)

Cj1319: LegB 4,6–deshidratasa GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi– α–D–xilo–hexos–4–ulosa (VI)

Cj1320: LegC aminotransferasa GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D– GlcNAc (VII)

Cj1298: LegH N–acetiltransferasa GDP–2,4–diacetamido–2,4,6– tridesoxi–α–D–Glc (VIII)

Cj1328: LegG NeuC2, PtmD 2–epimerasa / NDP– azúcar hidrolasa 2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi– D–Man (IX)

Gj1327: LegI NeuB2, PtmC AEG sintasa Ácido 5,7–diacetamido–3,5,7,9– tetradesoxi–D–glicero–β–D– galacto–nonulosónico (X, LeG)

Cj1331: LegF NeuA3, PtmB CMP–Leg sintetasa CMP–Leg (XI)

Tabla 3. Descripciones enzimáticas para la Figura 3.

Número: Número Cj Nombre del gen Función enzimática

1: 1366c glmS glucosamina–6–P sintasa

2: 1330 ptmF isomerasa

3: 1332 ptmA glutaminasa (2 y 3 equivalentes a 1)

4: 0360 glmM fosfoglucosamina mutasa

5: 1407c pgmL fosfoglucosamina mutasa

6: 0821 glmU nucleotidiltransferasa / N–acetiltransferasa

7: 1142 neuC1 2–epimerasa hidrolizante

8: 1141 neuB1 Ácido siálico sintasa

9: 1143 neuA1 Ácido CMP–siálico sintetasa

10: 1140 cstIII sialiltransferasa

11: 1120c pglF deshidratasa

12: 1121c pglE aminotransferasa

13: 1123c pglD N–acetiltransferasa

14: 1124c pglC glicosiltransferasa

15: 1125c pglA glicosiltransferasa

16: 1127c pglJ glicosiltransferasa

17: 1129c pglH glicosiltransferasa

18: 1128c pglI glicosiltransferasa

19: 1130c pglK flipasa

20: 1126c pglB oligosacariltransferasa

21: 0858c murA enolpiruvil transferasa

22: 1676 murB reductasa

23: 1054c murC L–Ala ligasa

24: 0432c murD D–Glu ligasa

25: 1641 murE L–Lis (o A2pm) ligasa

26: 0795c murF D–Ala–D–Ala ligasa

27: 0433c mraY glicosiltransferasa (lípido I sintasa)

28: 1039 murG glicosiltransferasa (lípido II sintasa)

29: 1293 pseB deshidratasa / epimerasa

30: 1294 pseC aminotransferasa

31: 1313 pseH N–acetiltransferasa

32: 1312 pseG UDP–azúcar hidrolasa

33: 1317 pseI Ácido pseudamínico sintasa

34: 1311 pseF Ácido CMP–pseudamínico sintetasa

35: 1329 ptmE nucleotidiltransferasa

36: 1319 legB deshidratasa

37: 1320 legC aminotransferasa

38: 1298 legH N–acetiltransferasa

39: 1328 legG 2–epimerasa hidrolizante

40: 1327 legI Ácido legionamínico sintasa

41: 1331 legF Ácido CMP–legionamínico sintetasa

Tabla 4. Nomenclatura alterna de carbohidratos alternativo para la Figura 3. CMP, citidina-5'-monofosfato; GDP, guanosina-5'-difosfato; UDP, uridina-5'-difosfato

Nomenclatura abreviada de carbohidratos: Nomenclatura completa de carbohidratos

(I) Fru–6–P: D–fructosa–6–fosfate

(II) GlcN–6–P: D–glucosamina–6–fosfato

(III) GlcN–1–P: α–D–glucosamina–1–fosfato

GlcNAc–1–P: N–acetil–α–D–glucosamina–1–fosfato

UDP–GlcNAc: UDP–N–acetil–α–D–glucosamina

ManNAc: N–acetil–D–manosamina

Sia: Ácido 5–acetamido–3,5–didesoxi–D–glicero–β–D– galacto–nonulosónico (ácido siálico)

CMP–Sia: Ácido CMP–5–acetamido–3,5–didesoxi–D–glicero–β–D– galacto–nonulosónico (ácido CMP–siálico)

UDP–4–keto–6–desoxi–GlcNAc: UDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4– ulosa

UDP–4–amino–6–desoxi–GlcNAc: UDP–4–amino–4,6–didesoxi–N–acetil–α–D–glucosamina

UDP–2,4–diNAc–6–desoxi–Glc: UDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–glucosa

UDP–4–keto–6–desoxi–AltNAc: UDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–β–L–arabino–hexos– 4–ulosa

UDP–4–amino–6–desoxi–AltNAc: UDP–4–amino–4,6–didesoxi–N–acetil–β–L–altrosamina

UDP–2.4–diNAc–6–desoxi–Alt: UDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–β–L–altrosa

2,4–diNAc–6–desoxi–Alt: 2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–L–altrosa

Pse: Ácido 5,7–diacetamido–3,5,7,9–tetradesoxi–L–glicero–α– L–manno–nonulosónico (ácido pseudamínico)

CMP–Pse: ÁcidoCMP–5,7–diacetamido–3,5,7,9–tetradesoxi–L– glicero–α–L–manno–nonulosónico (ácido CMP– pseudamínico)

(IV) GDP–GlcN: GDP–α–D–glucosamina

(V) GDP–GlcNAc: GDP–N–acetil–α–D–glucosamina

(VI) GDP–4–keto–6–desoxi–GlcNAc: GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4– ulosa

(VII) GDP–4–amino–6–desoxi–GlcNAc: GDP–4–amino–4,6–didesoxi–N–acetil–α–D–glucosamina

(VIII) GDP–2,4–diNAc–6–deoxy–Glc: GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–glucosa

(IX) 2,4–diNAc–6–deoxy–Man: 2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–D–manosa

(X) Leg: Ácido 5,7–diacetamido–3,5,7,9–tetradeoxy–D–glicero–β– D–galacto–nonulosónico (ácido legionamínico)

(XI) CMP–Leg: Ácido CMP–5,7–diacetamido–3,5,7,9–tetradeoxy–D– glycero–β–D–galacto–nonulosónico (ácido CMP– legionamínico)

Tabla 5. Desplazamientos químicos de RMN δ (ppm) para los azúcares de los compuestos IV, así como GDP–α–D– Glc, CDP–α–D–GlcNAc Y TDP–α–D–GlcNAc.

Compuesto: 1H δH (ppm) 13C δC (ppm)

IV: H1 5,56 C1 97,3

H2: 2,76 C2 56,3

H3: 3,63 C3 74,3

H4: 3,44 C4 70,5

H5: 3,89 C5 74,3

H6: 3,74,3,84 C6 61,4

Guanina: 8:1–138,5; 117,3; 153,8 ppm

GDP–Glc: H1 5,58 C1 96,6

H2: 3,50 C2 72,7

H3: 3,88 C3 73,9

H4: 3,43 C4 70,5

H5: 3,76 C5 73,9

H6: 3,73,3.83 C6 61,5

Guanina: 8,09–138,4; 117,3; 152,7 ppm

CDP–GlcNAc: H1 5,52 C1 95,7

H2: 3,99 C2 54,8

H3: 3,81 C3 72,1

H4: 3,55 C4 70,7

H5: 3,92 C5 74,1

H6: 3,80,3,86 C6 61,4

CItidina: 6,12–97,7; 7,94; acetato 2,07/23,3 ppm

TDP–GlcNAc: H1 5,51 C1 95,8

H2: 3,99 C2 54,8

H3: 3,81 C3 72,1

H4: 3,55 C4 70,7

H5: 3,93 C5 74,1

H6: 3,81,3,86 C6 61,5

Timidina: H–6:7,73; Me 1,94–12,7; N–acetato 2,08/23,3 ppm

Tabla 6. Plásmidos utilizados en este estudio

Plásmido: Descripción Fuente / referencia

pCR2.1: Apr, Knr, oriColE1, promotor lac, utilizado para la clonación Invitrogen

pET30a: Knr, oriColE1, promotor de T7, utilizado para la expresión de proteínas marcadas con His6 en C-terminal Novagen

pFO4: Derivado de pET15b, Apr, oriColE1, promotor de T7, utilizado para la expresión de proteínas marcadas con His6 en N-terminal Schoenhofen et al., 2006a

pNRC145.3: cj1330 BamHI–EcoRI En pFO4 codifica His6PtmF de C. jejuni Este estudio

pNRC141.1: cj1332 NdeI–XhoI in pET30a codifica PtmAHis6 de C. jejuni Este estudio

pNRC173.1: cj1407c NdeI–XhoI en pET30a codifica PgmLHis6 de C. jejuni Este estudio

pNRC136.1: cj1329 BamHI–EcoRI En pFO4 codifica HiS6PtmE de C. jejuni Este estudio

pNRC175.1: cj0821 in pFO4, codifica His6GlmU de C. jejuni Este estudio

pNRC16.1: cj1319 NdeI–XhoI en pET30a codifica LegBHis6 de C. jejuni Este estudio

pNRC83.1: cj1320BamHI–EcoRI En pFO4 codifica His6LegC de C. jejuni Este estudio

pNRC164.3: cj1298 BamHI–EcoRI en pFO4, codifica His6LegH de C. jejuni Este estudio

pNRC134.1: cj1328 BamHI–EcoRI En pFO4 codifica His6LegGde C. jejuni Este estudio

pNRC51.1: cj1327BamHI–EcoRI En pFO4 codifica His6LegI de C. jejuni Este estudio

pNRC139.1: cj1331 NdeI–XhoI en pET30a codifica LegFHis6 de C. jejuni Este estudio

pNRC152.1: cj1123c NdeI–XhoI en pET30a codifica PglDHis6 de C. jejuni Este estudio

Tabla 7. Oligonucleótidos utilizados en este estudio

Oligo: Secuencia (5'→ 3') Objetivo

NRC239 NRC240: GGATCCAAAGTCTTAATCATAGGCTTTGGAAGC GAATTCTCAGCCATTTTTTTTCCTTACTTCATC Clonación de pNRC145.3

NRC231 NRC232: CATATGCTTGAAAATAAAATCATCTTTGTAGCAG CTCGAGTAAGCCCCATCCATCATCTACC Clonación de pNRC141.1

NRC300 NRC301: CATATGAATTTGAAGGAAAAAATGTTAGATGTGATTTTTAG CTCGAGATTCTTAAATCTAGCTTTTATATCATTAAACAAAGTAAATAC Clonación de pNRC173.1

NRC221 NRC222: GOATCCGATATAAACAAACTCAAACTCACCCC GAATTCTCATTTAAAATCCTCATTGGCTTTTAAAAAC Clonación de pNRC136.1

NRC296 NRC297: GGATCCAAAACTTCTATTTGATTTTAGCGGCAGG GAATTCTCATTTTTGAAATTTCTTATAATAATAATCTTTTATCATTTTATG Clonación de pNRC175.1

NRC39 NRC40: CATATGAOAAATATTTTAGTTACAGGTGC CTCGAGAACATTATAAAGCTCGCTTTTATAATTTTC Clonación de pNRC16.1

NRC139 NRC140: GGATCCATGTTTAAAAAAGAAATTTCTTTTATAAAAAGTC GAATTCTCATTCCTTTTTATTTGCTATTCTAAC Clonación de pNRC83.1

NRC280 NRC281: GGATCCAAATATTTACTTGAATTTGAAAATAAAAAATACTCCAC GAATTCTTAATATATTGTATCATAATTTTCTATTAGAATTGTTTGG Clonación de pNRC164.3

NRC217 NRC218: GGATCCAGTAAAAGAAAAATTTGTATAGTCAGTGCAAC GAATTCTTATAAATCGATGAAATTTTTATGTAAAATTGTATC Clonación de pNRC134.1

NRC99 NRC100: GGATCCATGAAAAAAACTTTAATCATCGCAGAAG GAATTCTTACTCACGGATAAGCTCATCTTC Clonación de pNRC51.1

NRC227 NRC228: CATATGGCTGAAATTTTATGTACTATTTGTGC CTCGAGAAAATCCTTTGGCGATAAATTTTTTAAAGAG Clonación de pNRC139.1

NRC253 NRC254: CATATGGCAAGAACTGAAAAAATTTATATTTATGGTG CTCCAGCATCCTTTTTGCAGGTACTCCC Clonación de pNRC152.1

T7–F T7–R: TAATACGACTCACTATAGGG GCTAGTTATTGCTCAGCGG Secuenciación de construcciones de pET30a

NRC175 NRC160: TTAATACGACTCACTATAGGGGAATTG GGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGG Secuenciación de construcciones de pFO4

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> National Research Council of Canada 5

<120> Biosíntesis de ácido CMP-legionamínico a partir de fructosa-6-P, y los respectivos intermedios de la ruta, usando nuevos precursores unidos a GDP

<130> 12317-PT-WO-EP 10

<140> 0983276.1

<141>

<150> US 61/122973 15 <151>

<160> 28

<170> PatentIn versión 3.3 20

<210> 1

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

<223> cebador

<400> 1 30 ggatccaaag tcttaatcat aggctttgga agc 33

<210> 2

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> cebador

<400> 2 gaattctcag ccattttttt tccttacttc atc 33

<210> 3

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> cebador

<400> 3 catatgcttg aaaataaaat catctttgta gcag 34

<210> 4

<211> 28

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 4 ctcgagtaag ccccatccat catctacc 28

<210> 5

<211> 41 35 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 5 catatgaatt tgaaggaaaa aatgttagat gtgattttta g 41

<210> 6 45 <211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 6 ctcgagattc ttaaatctag cttttatatc attaaacaaa gtaaatac 48

55 <210> 7

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 7

ggatccgata taaacaaact caaactcacc cc 32 65

<210> 8

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> cebador

<400> 8 gaattctcat ttaaaatcct cattggcttt taaaaac 37

<210> 9

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> cebador

<400> 9 ggatccaaaa cttctatttt gattttagcg gcagg 35

<210> 10

<211> 51

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 10 gaattctcat ttttgaaatt tcttataata ataatctttt atcattttat g 51

<210> 11

<211> 29 35 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 11 catatgagaa atattttagt tacaggtgc 29

<210> 12 45 <211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 12 ctcgagaaca ttataaagct cgcttttata attttc 36

55 <210> 13

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador

<400> 13

ggatccatgt ttaaaaaaga aatttctttt ataaaaagtc 40 65

<210> 14

<211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5: <220> <223> cebador

<400> 14 gaattctcat tcctttttat ttgctattct aac 33

15: <210> 15 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador

<400> 15 ggatccatgt ttaaaaaaga aatttctttt ataaaaagtc 40

25: <210> 16 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 16 gaattcttaa tatattgtat cataattttc tattagaatt gtttgg 46

35: <210> 17 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 17 ggatccagta aaagaaaaat ttgtatagtc agtgcaac 38

45: <210> 18 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 18 gaattcttat aaatcgatga aatttttatg taaaattgta tc 42

55: <210> 19 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

65: <400> 19 ggatccatga aaaaaacttt aatcatcgca gaag 34 <210> 20

<211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5: <220> <223> cebador

<400> 20 gaattcttac tcacggataa gctcatcttc 30

15: <210> 21 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador

<400> 21 catatggctg aaattttatg tactatttgt gc 32

25: <210> 22 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 22 ctcgagaaaa tcctttggcg ataaattttt taaagag 37

35: <210> 23 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 23 catatggcaa gaactgaaaa aatttatatt tatggtg 37

45: <210> 24 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

<400> 24 ctcgagcatc ctttttgcag gtactccc 28

55: <210> 25 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

65: <400> 25 taatacgact cactataggg 20 <210> 26

<211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5: <220> <223> cebador

10 15: <400> 26 gctagttatt gctcagcgg 19 <210> 27 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador

20: <400> 27 ttaatacgac tcactatagg ggaattg 27

25: <210> 28 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador

30: <400> 28 ggttatgcta gttattgctc agcgg 25

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de síntesis que comprende:

5 (a) hacer reaccionar GDP-N-acetil-glucosamina, dinucleótido nicotinamida adenina (NAD) y LegB (4,6deshidratasa dependiente de NAD) comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado,

(b) recuperar GDP-2-acetamido-2,6-didesoxi-alfa-D-xilo-hexos-4-ulosa.
2.

El método de la reivindicación 1, que comprende además hacer reaccionar LegC (aminotransferasa dependiente de PLP), piridoxal-fosfato (PLP), y un donante de amino adicional comprendidos en el recipiente de reacción, y en el que se recupera GDP-4-amino-4,6-didesoxi-α -D-GlcNAc.
3.

Un método de síntesis que comprende:

15 (a) hacer reaccionar GDP-2-acetamido-2,6-didesoxi-α-D-xilo-hexos-4-ulosa, LegC, piridoxal-fosfato (PLP) y un donante de amino comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado, y

(b) recuperar GDP-4-amino-4,6-didesoxi-α-D-GlcNAc.
4.

El método de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en el que el donante de amino es ácido L-glutámico.
5.

El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, que comprende además hacer reaccionar una N-acetiltransferasa y acetil-CoA comprendidos en el recipiente de reacción, y en el que se recupera GDP-2,4diacetamido-2,4,6-tridesoxi-α-D-Glc.

25 6. Un método de síntesis que comprende:

(a)

hacer reaccionar GDP-4-amino-4,6-didesoxi-α-D-GlcNAc, una N-acetiltransferasa, y acetil-CoA comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado, y

(b)

recuperar GDP-2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-α-D-Glc.
7.

El método de la reivindicación 5 o 6, en el que la N-acetiltransferasa es LegH (GDP-4-amino-4,6-didesoxi-α-D-GlcNAc N-acetiltransferasa).
8.

El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que comprende además hacer reaccionar

35 LegG (NDP-azúcar hidrolasa/2-epimerasa y agua comprendidos adicionalmente en el recipiente de reacción, y en el que se recupera 2,4–diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man.
9. Un método de síntesis que comprende:

(a)

hacer reaccionar GDP–2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-α-D-Glc, LegG y agua comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado, y

(b)

recuperar 2,4-diacetamido-2,4,6–tridesoxi-D-Man.
10. El método de la reivindicación 8 o 9, que comprende además hacer reaccionar LegI (ácido legionamínico 45 sintasa) y fosfoenolpiruvato (PEP), y en el que se recupera ácido legionamínico.
11.

El método de la reivindicación 10, que comprende además hacer reaccionar LegF (ácido CMP-legionamínico sintasa), citidina trifosfato (CTP), y Me2+ (catión divalente), y en el que se recupera ácido CMP-legionamínico.
12.

Un método de síntesis que comprende:

(a) hacer reaccionar GDP-N-acetil-glucosamina, LegB, LegC, una N-acetiltransferasa, LegG, Legl, fosfoenol piruvato (PEP), agua, acetil-CoA, piridoxal-fosfato (PLP), nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) y un donante de amino comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado,

55 (b) convertir la GDP–N–acetil–glucosamina en GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa con la LegB y NAD,

(c)

convertir la GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa en GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D– GlcNAc con la LegC, PLP y el donante de amino,

(d)

convertir la GDP–4–amino–4,6–didesoxi–αD–GlcNAc en GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc con la N-acetiltransferasa y la acetil-CoA,

(e)

convertir la GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc en 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man con la LegG y el agua,

(f)

convertir la 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man en ácido legionamínicmo con la Legl y PEP, y

(g) recuperar el ácido legionamínico. 65
13. Un método de síntesis que comprende:

(a) hacer reaccionar GDP–N–acetil–glucosamina, nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), LegB, LegC, piridoxal-fosfato (PLP), un donante de amino, una N-acetiltransferasa, acetil-CoA, LegG, agua, LegI, fosfoenol piruvato (PEP), LegF, citidina trifosfato (CTP) y Me2+ comprendidos en un recipiente de reacción proporcionado,

5 (b) convertir la GDP–N–acetil–glucosamina en GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa con la LegB (deshidratasa) y NAD,

(c) convertir la GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa en GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D– GlcNAc con la LegC, PLP y el donante de amino,

(d)

convertir GDP–4–amino–4,6–didesoxi–αD–GlcNAc en GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc con la 10 N-acetiltransferasa y la acetil-CoA,

(e)

convertir la GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc en 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man con la LegG y el agua,

(f)

convertir la 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-D-Man en ácido legionamínicmo con la Legl y PEP,

(g)

convertir el ácido legionamínico en ácido CMP-legionamínico con la LegF, Me2+ y el la CTP, 15 y

(h) recuperar ácido CMP-legionamínico.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en el que la N-acetiltransferasa es LegH.

20 15. Una GDP-2-acetamido-2,6-didesoxi-α-D-xilo-hexos-4-ulosa purificada o aislada.
16. Un GDP–4–amino–4,6–didesoxi–α–D–GlcNAc purificado o aislado.
17.

Un GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc purificado o aislado. 25
18. Uso de LegB para convertir GDP–N–acetil–glucosamina en GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos– 4–ulosa.
19.

Uso de LegC para convertir GDP–2–acetamido–2,6–didesoxi–α–D–xilo–hexos–4–ulosa en GDP–4–amino–4,6– 30 didesoxi–α–D–GlcNAc.
20. Uso de LegH para convertir GDP-4-amino-4,6-didesoxi-α-D-GlcNAc en GDP-2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxi-α-D-Glc.

35 21. Uso de LegG para convertir GDP–2,4–diacetamido–2,4,6–tridesoxi–α–D–Glc en 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxiD-Man.
22. Uso de para convertir GDP–GlcNAc en ManNAc.

EP 2 379 735 B1