ES2660227T3

ES2660227T3 - Sistema biosintético que produce polisacáridos inmunogénicos en células procariotas

Info

Publication number: ES2660227T3
Application number: ES10831896.5T
Authority: ES
Inventors: Michael Wacker; Charles Waechter
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2009-11-19
Filing date: 2010-11-16
Publication date: 2018-03-21
Anticipated expiration: 2030-11-16
Also published as: JP2017018098A; KR101855380B1; PL2501406T3; CN102724997A; EP2501406B1; IL219733A; HUE038456T2; EP2501406A1; PT2501406T; EP2501406B8; KR20120102086A; CN102724997B; EP2501406A4; DK2501406T3; CY1119995T1; IL219733A0; JP5968784B2; US8846342B2; US20150190492A1; AU2010322454A1

Abstract

Un organismo procariota recombinante que es una E. coli que comprende ácidos nucleicos que codifican: i) una epimerasa que sintetiza N-acetilgalactosamina sobre pirofosfato de undecaprenilo, en el que dicho ácido nucleico que codifica dicha epimerasa es al menos un 95 % idéntico a la SEQ ID NO: 1; ii) glicosil transferasas que ensamblan un oligo o polisacárido en un vehículo lipídico; iii) una oligosacaril transferasa de Campylobacter jejuni; y iv) una proteína que comprende una o más de una secuencia de consenso introducida recombinantemente, D/E - X - N - Z - S/T, en la que X y Z son independientemente cualquier aminoácido natural excepto prolina en el que el oligosacárido ensamblado por dichas glicosiltransferasas se puede transferir desde el vehículo lipídico a la proteína diana que tiene una o más secuencias de consenso optimizadas, por la oligosacaril transferasa.

Description

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La secuencia de gel Z3206 se muestra en la SEQ ID NO: 1. Los informes previos identificaban que dos genes de E. coli 055 (Wang, L., Huskic, S., Cisterne, A., Rothemund, D. y Reeves, P.R. (2002) J. Bacteriol. 184, 2620-2625) y E. coli 086 (Guo, H., Yi, W., Li, L. y Wang, P. G. (2007) Biochem. Biophys. Res. Comm., 356, 604-609), el gen gne de

E. coli 055 y el gen gneI de E. coli 086, respectivamente, que son un 100 % idénticos al gen Z3206 (Tabla 1). La secuencia del gen gne de E. coli 055 se muestra como la SEQ ID NO: 3, y la secuencia del gen gneI de E. coli 086 se muestra como la SEQ ID NO: 5.

TABLA 1

Correlación del gen Z3206 en cepas bacterianas que expresan cadenas del antígeno O con GalNAc en los extremos reductores

% de identidad con Z3206: GalNAc en el extremo reductor de la unidad de repetición del antígeno O

gne de E. coli 055 (SEQ ID NO: 3): 100 Sí

gneI de E. coli 086 (SEQ ID NO: 5): 100 Sí

gne de Shigella boydii 018 (SEQ ID NO: 7): 88 Sí

gne de Salmonella enterica 030 (SEQ ID NO: 9): 94 Sí

gne de C. jejuni (SEQ ID NO: 11): 21 No

galE de E. coli K12 (SEQ ID NO: 13): 27 No

gne2 de E. coli 086 (SEQ ID NO: 15): 18 Sí

En consecuencia, los inventores concluyen que el gne de E. coli 055 y gen I de E. coli 086 también codifican epimerasas capaces de convertir el GlcNAc-P-P-Und en GalNAc-P-P-Und en las cepas 055 y 086, respectivamente, que también producen unidades de repetición del antígeno O con GalNAc en los extremos reductores.

Dos estrategias experimentales en el presente estudio indican que la proteína Z3206 no cataliza la epimerización de UDP-GlcNAc a UDP-GalNAc en la cepa 0157. Primero, cuando las membranas de la cepa 0157 se incubaron con [3H]UDP-GalNAc, no se detectaban ni [3H] GlcNAc-P-P-Und ni [3H] GalNAc-P-P-Und (Tabla 3). Si Z3206 catalizara la conversión de [3H]UDP-GalNAc a [3H]UDP-GlcNAc, se esperaría que se debería observar [3H] GlcNAc-P-P-Und.

Segundo, los inventores han demostrado que la Z3206 marcada con hemaglutinina era incapaz de complementar el sistema indicador de N-glicosilación en C. jejuni dependiente de UDP-GalNAc (FIG. 8).

El gen gne de E. coli 055 de la cepa 055 (Wang, L., Huskic, S., Cisterne, A., Rothemund, D. y Reeves, P.R. (2002) J. Bacteriol. 184, 2620-2625) también se ensayó en cuanto a la actividad epimerasa incubando extractos en bruto con UDP-GalNAc y ensayando indirectamente la conversión a UDP-GlcNAc midiendo un aumento de la reactividad con p-dimetil-aminobenzaldehído después de la hidrólisis ácida. En ambos estudios, la formación del producto se basaba en los cambios de la reactividad con p-dimetilaminobenzaldehído, y sin caracterización definitiva del producto final azúcar nucleotídico. También se demostró que el 90 % del gne I de E. coli 086 marcado con polihistidina puro tenía un bajo nivel de actividad UDP-glucosa epimerasa con respecto a gne 2 en un ensayo acoplado.

En consecuencia, una realización de la invención se refiere a un sistema biosintético procariota que contiene el gen Z3206, el gen gne de E. coli 055 o el gen gne I de E. coli 086 que convierte el GlcNAc-P-P-Und en GalNAc-P-P-Und.

Es significativo que la E. coli 086, que sintetiza un antígeno O que contiene restos de GalNAc, que presumiblemente necesitaría UDP-GalNAc como donante glicosílico para el extremo GalNAc no reductor adicional, también posee un gen GlcNAc 4-epimerasa, llamado gne 2, en el agrupamiento genético del antígeno O (Guo, H., Yi, W., Li, L. y Wang,

P. G. (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun., 356, 604-609). Este gen de epimerasa adicional tiene una alta homología con el gen GalE del agrupamiento genético del ácido colánico y parece que es una UDP-GlcNAc 4epimerasa capaz de sintetizar UDP-GalNAc.

El gen Z3206 parece que está altamente conservado en los serotipos O de E. coli iniciados con GalNAc. En un recientes estudio, se exploraron 62 cepas de E. coli, con estructuras de unidades repetidas de antígenos O establecidos, en cuanto a la expresión de Z3206 mediante un procedimiento basado en una reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores de nucleótido diseñados para detectar específicamente el gen Z3206 de E. coli 0157 (Wang, L., Huskic, S., Cisterne, A., Rothemund, D. y Reeves, P.R. (2002) J. Bacteriol. 184, 2620-2625). En este estudio se detectó el Z3206 en 16 de las 22 cepas de E. coli que se sabía que contenían GalNAc, y en solo 4 de las 40 cepas que carecían de GalNAc. Además, una exploración similar de 22 cepas que contenían GalNAc con cebadores diseñados para detectar una epimerasa alternativa con actividad UDP-GlcNAc 4-epimerasa (el gen GaIE de E. coli 0113) no detectaba cepas que albergaran este gen, indicando que el Z3206 es el gen de la GlcNAc 4

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En otra realización adicional más, la presente invención se refiere a un sistema de expresión para la producción de una vacuna bioconjugada contra al menos una bacteria que comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica una oligosacaril transferasa; una secuencia de nucleótido que codifica un vehículo proteico que comprende al menos un secuencia de consenso insertada, D/E-X-N-Z-S/T, en el que X y Z puede ser cualquier aminoácido natural excepto prolina; al menos un agrupamiento genético de polisacárido de la al menos una bacteria, en el que el polisacárido contiene GalNAc en el extremo reductor; y el gen Z3206. En una realización adicional, el agrupamiento genético de polisacárido codifica un polisacárido antigénico.

En otra realización, la presente divulgación se refiere a una vacuna bioconjugada que comprende: un vehículo proteico; al menos una cadena de polisacárido inmunogénico unida al vehículo proteico, en el que dicho polisacárido tiene GalNAc en el extremo reductor, y adicionalmente en el que dicho GalNAc está unido directamente al vehículo proteico; y un adyuvante.

En una realización adicional más, la presente divulgación se refiere a una vacuna bioconjugada que comprende. un vehículo proteico que comprende al menos una secuencia de consenso insertada, D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z puede ser cualquier aminoácido natural excepto prolina; al menos un polisacárido inmunogénico de al menos una bacteria, unido al vehículo proteico, en el que al menos un polisacárido inmunogénico contiene GalNAc en el extremo reductor unido directamente al vehículo proteico; y, opcionalmente, un adyuvante.

Otra realización de la divulgación se refiere a un procedimiento de producción de una vacuna bioconjugada, comprendiendo dicho procedimiento: ensamblaje de un polisacárido que tiene GalNAc en el extremo reductor en un organismo recombinante mediante el uso de glicosil transferasas; unir dicho GalNAc a un resto de asparagina de una o más proteínas diana en dicho organismo recombinante, en el que dicha una o más proteínas diana contienen uno o más epítopos de linfocitos T.

En una realización adicional, la presente divulgación se refiere a un procedimiento de producción de una vacuna bioconjugada, comprendiendo dicho procedimiento: la introducción de información genética que codifica un aparato metabólico que lleva a cabo la N-glicosilación de una proteína diana en un organismo procariota para producir un organismo procariota modificado; en el que la información genética necesaria para la expresión de una o más proteínas recombinantes se introduce en dicho organismo procariota; en el que la información genética necesaria para la expresión de la epimerasa de la cepa 0157 de E. coli se introduce en dicho organismo procariota; y en el que el aparato metabólico comprende glicosil transferasas de un tipo que ensambla un polisacárido que tiene GalNAc en el extremo reductor en un vehículo lipídico, y una oligosacaril transferasa, uniendo covalentemente la oligosacaril transferasa el GalNAc del polisacárido a un resto de asparagina de la proteína diana, y conteniendo la proteína diana al menos un epítopo de linfocito T; producir un cultivo del organismo procariota modificado; y obtener las proteínas glicosiladas del medio de cultivo.

Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica. Un aspecto adicional de la divulgación implica una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína N-glicosilada de acuerdo con la invención. A la luz de la divulgación del presente documento, la preparación de medicamentos que comprenden las proteínas se conoce bien en la técnica. un aspecto adicional más de la divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende un antibiótico que inhibe una epimerasa que convierte GlcNAc-P-P-Und en GalNAc-P-P-Und. En una realización preferida, la composición farmacéutica de la invención comprende un excipiente, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Los excipientes, diluyentes y/o adyuvantes adecuados se conocen bien en la técnica. Un excipiente o diluyente puede ser un material sólido, semi-sólido o líquido que puede servir como vehículo o medio para el principio activo. Un experto en la técnica en el campo de la preparación de composiciones puede seleccionar fácilmente la forma apropiada y modo de administración dependiendo de las características particulares del producto seleccionado, la enfermedad o afección que se va a tratar, el estadio de la enfermedad o afección, y otras circunstancias relevantes (Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (1990)). La proporciona y naturaleza del diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable se determinan por la solubilidad y propiedades químicas del principio farmacéuticamente activo seleccionado, la vía de administración escogida, y la práctica farmacéutica convencional. La preparación farmacéutica puede adaptarse para su uso oral, parenteral o tópico y puede administrarse al paciente en forma de comprimidos, cápsulas, supositorios, solución, suspensiones o similares. Los compuestos farmacéuticamente activos de la presente divulgación, aunque son efectivos por sí mismos, se pueden formular y administrar en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, tales como sales por adición de ácido o sales por adición de bases, con fines de estabilidad, conveniencia de cristalización, aumento de solubilidad, y similares.

En ciertos casos en los que las secuencias específicas de nucleótidos o aminoácidos se señalan, se entenderá que la presente divulgación engloba secuencias homólogas que tengan la misma funcionalidad de las secuencias señaladas. En una realización de la divulgación, dichas secuencias son al menos un 90 % homólogas. En otras realizaciones adicionales más, dichas secuencias son al menos un 95 % homólogas.

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se conoce por los expertos en la técnica.

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(continuación)

Plásmidos utilizados en los Ejemplos

Plásmido: Descripción Ref.

pACYCpgI: Agrupamiento de pgl de C. jejuni CmR Wacker, y col. (2002)

pACYCgne::kan: Agrupamiento de pgl de C. jejuni que contiene un casete kan en gne, CmR, KanR Linton, y col. (2005)

pWA2: AcrA soluble pariglásmica marcada con hexa-His bajo el control del promotor Tet en pBR322, AmpR Feldman, y col. (2005)

Materiales – Se obtuvieron [I,6-3H]GlcNAc (30 Ci/mmol), UDP-[I-3H]GlcNAc (20 Ci/mmol) y UDP-[6-3H]GalNAc (20 Ci/mmol) en American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, MO). Las placas de capa fina en gel G de sílice Quantum 1 son un producto de Quantum Industries (Fairfield, NJ),y placas de Gel G de sílice Si250 Baker se fabricaron en Mallinckrodt Chemical Works. El extracto de levadura y Bacto-peptona son productos de BD Biosciences. Todos los demás productos químicos se obtuvieron de fuentes comerciales convencionales. Se añadieron Trimetoprim (50 µg/ml), cloranfenicol (20 µg/ml), ampicilina (100 µg/ml), y kanamicina (50 µg/ml) si era necesario.

Construcción de Plásmidos recombinantes – La cepa DH5a de E. coli se utilizó para los experimentos de clonación de ADN y los plásmidos construidos se verificaron por secuenciación de ADN. El gen Z3206 se amplificó a partir de

E. coli 0157: H45 por PCR con los oligonucleótidos Z3206-Fw y Z3206-RvHA (AAACCCGGGATGAACGATAACGTTTTGCTC (SEQ ID NO: 17) y AAATCTAGATTAAGCGTAATCTGGAACATC GTATGGGTACTCAGAAACAAACGTTATGTC (SEQ ID NO: 18); los sitios de restricción están subrayados). El fragmentos de PCR se digirió con SmaI y XbaI y se ligó en el vector pMLBAD escindido en SmaI-XbaI (Lefebre, M.

D. y Valvano M. A. (2002) Appl Environ Microbiol 68: 5956-5964). Esto daba como resultado el plásmido pMLBAD:Z3206 (SEQ ID NO: 23) que codifica Z3206 con un marcador de hemaglutinina en el extremo C.

El gne se amplificó a partir del pACYCpgI (Wacker, M., Linton, D., Hitchen, P.G., Nita-Lazar, M., Haslam, S.M., North, S.J., Panico, M., Morris, H.R., Dell, A., Wrenn, B.W., Aebi, M. (2002) Science 298, 1790-1793), que codifica el agrupamiento pgI de Campylobacter jejuni, con los oligonucleótidos gne-Fw y gne-RV (AAACCATGGATGAAAATTCTTA TTAGCGG (SEQ ID NO: 19) y AAATCTAGATTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGCACTGTTTTTCCCAATC (SEQ ID NO: 20); los sitios de restricción están subrayados). El producto de la PCR se digirió con NcoI y XbaI y se ligó en los mismos sitios del pMLBAD para generar el plásmidos pMLBAD: gne (SEQ ID NO: 24) que codifica Gne con un marcador de hemaglutinina en el extremo C (Tabla 2).

Condiciones de cultivo, Expresión proteica e inmunodetección – Las cepas de E. coli se cultivaron en medio Luria-Bertani (un 1 % extracto de levadura, un 2 % de Bacto-peptona, un 0,6 % de NaCl) a 37 ºC con agitado vigoroso. La expresión inducible por arabinosa se consiguió añadiendo arabinosa a una concentración final de un 0,02-0,2 % (p/v) a las células de E. coli hasta un A600 de 0,05-0,4. Se añadió la misma cantidad de arabinosa de nuevo 5 h tras la inducción, y se continuó la incubación durante 4-15 h.

Procedimientos analíticos – Las concentraciones proteicas se determinaron utilizando el ensayo proteico BCA (Pierce) después de la precipitación de las proteínas de membrana con desoxicolato y ácido tricloroacético de acuerdo con el boletín Pierce Biotechnology “Eliminate Interfering Sustances from Samples for BCA Protein Assay”. Las muestras se analizaron en cuanto a la radioactividad por espectrometría de centelleo en un espectrofotómetro de centelleo líquido Packard Tri-Carb 2100TR después del a adición de 0,5 ml de un 1 % de SDS y 4 ml de Econosafe Economical Biodegradable Counting Mixture (Research Products International, Corp., Mount Prospect, IL).

Ejemplo 1: Identificación de un gen de E. coli 0157 que codifica GlcNAc-P-P-Und 4-epimerasa

Los inventores describen en el presente documento el sorprendente descubrimiento de una nueva ruta biosintética en la que se forma GalNAc-P-P-Und por epimerización del 4-OH de GlcNAc-P-P-Und catalizada por la acción desconocida anteriormente de una 4-epimerasa. En esta ruta, el GlcNAc-P-P-Und se forma por la transferencia de GlcNAc-P del UDP-GlcNAc, catalizada por WecA, y después se epimeriza el GlcNAc-P-P-Und en GalNAc-P-P-Und por la GlcNAc-P-P-Und-4-epimerasa, que era una ruta desconocida previamente (FIG. 2).

El gen que codifica un candidato para la GlcNAc-P-P-Und-4-epimerasa se identificó por búsqueda de homología de ADN. Las búsquedas de homología se llevaron a cabo utilizando las bases de datos de la U.S. National Library of Medicine que se encuentra en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Se exploraron las secuencias genómicas de las diferentes bacterias que codifican las unidades repetidas del antígeno O que tienen un GalNAc en el extremo reductor. Un grupo con una unidad repetida que contenía GalNAc en el extremo reductor, y un segundo grupo que carecía de un GalNAc terminal en la unidad repetida se compararon para identificar las epimerasas potenciales.

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Utilizando estos criterios, se identificó el Z3206 como candidata de GlcNAc-P-P-Und-4-epimerasa (Tabla 1).

Los genes de GlcNAc 4-epimerasa presentes en las cepas de E. coli con unidades repetidas del antígeno O que contenían GalNAc se pueden separar en dos grupos de homología como se muestra en la Tabla 1. Se descubrió sorprendentemente que un grupo de homología (que contenía el gneI) se correlacionaba claramente con la presencia de GalNAc como el azúcar de inicio en la unidad repetida del antígeno O. Se descubrió sorprendentemente adicionalmente que el segundo grupo (que contenía gneI) presentaba un alto grado de similitud con la UDP-Glc epimerasa, GalE, y se encuentra en las cepas de E. coli que no inician la síntesis de unidades repetidas del antígeno O con GalNAc. Se identificó el gen Z3206 en E. coli 0157, un gen con un alto grado de homología con gneI, como un candidato para la GlcNAc-P-P-Und-4-epimerasa. La localización genómica del gen Z3206 es consistente con un papel en esta ruta, ya que reside entre gaIF del agrupamiento del antígeno O y wcaM que pertenece al agrupamiento del ácido colánico.

La investigación descrita en los Ejemplos 2-1 1 confirma además los descubrimientos anteriores, incluyendo la GlcNAc 4-epimerasa (E. coli 0157 Z3206) como que cataliza la formación de GalNAc-P-P-Und.

Ejemplo 2: UDP-GalNAc no es un sustrato para WecA de E. coli (GlcNAc-fosfotransferasa)

Para determinar si la WecA de E. coli utilizará el UDP-GalNAc como un donante GalNAc-P para formar GalNAc-P-P-Und, se incubaron fracciones de membrana de las cepas K12, PR4019 de E. coli, una cepa que sobre-expresa WecA, y 0157, que sintetiza un tetrasacárido de unidad repetida de antígeno O con GalNAc en el extremo reductor presumiblemente iniciado por la síntesis de GalNAc-P-P-Und, con UDP-[3H]GalNAc.

Preparación de la membrana de E. coli – Las células bacterianas se recolectaron por centrifugación a 1.000 x g durante 10 min, se lavaron una vez con solución salina tampón de fosfato enfriada en hielo, una vez con agua fría, y una vez con 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 0,25 M de sacarosa, 10 mM EDTA que contenía 0,2 mg/ml de lisozima, y se incubó a 30 ºC durante 30 min. Las células bacterianas se recuperaron por centrifugación a 1.000 x g durante 10 minutos, se re-suspendieron rápidamente en 40 volúmenes de Tris-HCl 10 mM enfriado en hielo, pH 7,4, y se colocaron en hielo. Después de 10 min las células se homogeneizaron con 15 golpes con un homogeneizador de Dounce ajustado y se suplementaron con 0,1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo y sacarosa a una concentración final de 0,25 M. Las células sin romper se retiraron por centrifugación a 1.000 x g durante 10 min, y los envoltorios celulares se recuperaron por centrifugación a 40.000 x g durante 20 min. La fracción de membrana se res-suspendió en 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 0,25 M de sacarosa, 1 mM de EDTA y de nuevo se sedimentó a 40.000 x g y se resuspendió en el mismo tampón a una concentración de ~ 20 mg/ml. Las fracciones de membrana se almacenaron a -20 ºC hasta que se necesitaran.

Ensayo para la biosíntesis de [3H] GlcNAc-P-P-Und y [3H] GalNAc-P-P-Und en membranas de E. coli – Las mezclas de reacción in vitro para la síntesis de GlcNAc-P-P-Und y GalNAc-P-P-Und contenían 50 mM de Tris-HCl, pH 8, 40 mM de MgCl2, 5 mM de ditiotreitol, 5 mM de 5’AMP, fracción de membrana de E. coli (50-200 µg de proteína de membrana), y 5 µM de UDP-[3H]GlcNAc/GalNAc (500-2500 dpm/pmol) en un volumen total de 0,05 ml. Después de la incubación a 37 ºC se terminaron las reacciones por la adición de 40 volúmenes de CHCl3/CH3OH (2:1), y el extracto lipídico total que contiene [H]HexNAc-P-P-undecaprenoles se preparó como se había descrito previamente (Waechter, C. J., Kennedy, J. L. y Harford, J. B. (1976) Arch. Biochem. Biophys. 174, 726-737). Después de la partición, la fase orgánica se secó con una corriente de nitrógeno y se re-disolvió en 1 ml de CHCl3/CH3OH (2:1) y se retiró una alícuota (0,2 ml), se secó en un vial de centelleo, y se analizó en cuanto a la radioactividad por espectrometría de centelleo líquida en un espectrómetro de centelleo líquido Packard Tri-Carb 2100 TR. Para determinar la tasa de síntesis de [3H] GlcNAc-P-P-Und o [3H] GalNAc-P-P-Und, se secó el extracto lipídico bajo una corriente de nitrógeno, se re-disolvió en una pequeño volumen de CHCl3/CH3OH (2:1), y se esparció en una placa de gel de sílice Baker Si250 impregnada de borato de 10 x 20 cm, y se desarrolló la placa con CHCl3, CH3OH, H2O, 0,2 M de borato sódico (65:25: 2:2). Los glicolípidos individuales se detectaron en un Bioscan AR2000 Imaging Scanner (Bioscan, Washington, D.C). Las tasas biosintéticas de cada glicolípido se calcularon multiplicando la cantidad total de radioactividad en [3H] GlcNAc/ GalNAc-P-P-Und por el porcentaje de los [3H]glicolípidos individuales.

Las fracciones de membrana de las diferentes cepas de E. coli (K12, PR4019 y 0157) se incubaron con UDP[3H]GlcNAc o UDP-[3H]GalNAc y se determinó la incorporación en [3H] GlcNAc/ GalNAc-P-P-Und como se ha descrito anteriormente. Como se ve en la Tabla 3, no se detectaron glicolípidos marcados después de la incubación con UDP-[3H]GalNAc, solo era detectable el GlcNAc-P-P-Und cuando las fracciones de membrana se incubaron con UDP-[3H]GlcNAc.

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Después de la hidrólisis se aplicaron las muestras en una columna de intercambio iónico en lecho mixto de 0,8 ml que contenía 0,4 ml de AG50WX8 (H+) y 0,4 ml de AG 1x8 (forma de acetato) y se eluyeron con 1,5 ml de agua. El eluído se secó bajo una corriente de nitrógeno, se re-disolvió en un pequeño volumen de H2O (0,02 ml), se dispersó en una tira de 30 cm de papel Whatman Nº 1 impregnado de borato, y se desarrolló en modo descendente con butanol/piridina/agua (6:4:3) durante 40-50 h. Después del secado, las tiras de papel se cortaron en zonas de 1 cm y se analizaron en cuanto a la radioactividad por espectrometría de centelleo. Las referencias de GlcNAc y GalNAc se detectaron utilizando un reactivo de inmersión de anilina-difenilamina (Schwimmer, S. y Benvenue, A. (1956) Science 123, 543-544).

Los productos de glicanos se convirtieron en sus correspondientes alditoles por reducción con 0,1 M de NaBttt en 0,1 M de NaOH (volumen final de 0,1 ml) a continuación de hidrólisis ácido moderada como se ha descrito anteriormente. Después de la incubación a temperatura ambiente durante una noche, las reacciones se inactivaron con varias gotas de ácido acético glacial y se secaron bajo una corriente de nitrógeno sin metanol que contenía una gota de ácido acético, varias veces. Los alditoles se disolvieron en agua, se des-salaron por el pasaje en columnas de 0,5 ml de AG50WX8 (H+) y AG 1x8 (acetato), se secó bajo nitrógeno y se dispersó en tiras de 30 cm de papel de Whatman Nº 3MM. Las tiras de Whatman Nº 3MM se desarrollaron durante una noche en modo descendente con enil acetato, piridina, 0,1 M de ácido bórico (65:25:20), se secó y se cortó en zonas de 1 cm, y se analizaron en cuanto a radioactividad por espectrometría de centelleo. Las referencias de GlcNAcitol y GalNAcitol se visualizaron utilizando una modificación del procedimiento de inmersión en peryodato-bencidina (Gordon, H. T., Thornburg, W. y Werum, L. N. (1956) Anal. Chem. 28, 849-855). Las tiras de papel se sumergieron en acetona, 0,1 M de NaIO4 (95:5), se permitió que se secara al aire durante 3 min, y entonces se sumergió en acetona/ácido acético/H2O/otoluidina (96:0,6:4,4:0.2 g). Los alditoles que contienen m-dioles se teñían como puntos amarillos en un fondo azul.

Espectrometría de masas (“MS”) de glicolípidos – Los glicolípidos se analizaron utilizando un espectrómetro de masas ABI/MDS Sciex 4000 Q-Trap hybrid triple quadrupole lineal ion trap con una fuente de iones ABI Turbo V electrospray (ABI/MDS-Sciex, Toronto, Canadá). En resumen, si infundieron las muestras a 10 µl/min con los ajustes de la fuente de iones determinados empíricamente, y la información de la MS/MS (espectrometría de masas en una segunda dimensión) se obtuvo por fragmentación del ion molecular en modo de atrapamiento de iones lineal.

Cuando el glicolípido se trataba con ácido moderado (0,01 N HCl, 100 ºC, 15 min), el producto hidrosoluble se cocromatografíó con [3H]GalNAc en cromatografía en papel descendente con papel Whatman Nº 1 impregnado con borato (FIG. 3). Además, cuando el azúcar marcado se reducía, se convertía en [3H]alditol, GalNAc-OH (FIG. 3D). Además, el análisis MS de ion negativo daba lugar al [M-H]-ion de m/z = 1128, esperado para GalNAc-P-P-Und, y el espectro iónico hermano de MS/MS mostraba un ion prominente a m/z = 907, esperado para un glicolípido que contiene P-P-Und (Guan, Z., Breazeale, S. D. y Raetz, C. R. (2005) Anal. Biochem. 345, 336-339). La identificación del producto glicolipídico formado por la cepa 0157 como GalNAc-P-P-Und también se mantiene por su formación a partir de GlcNAc-P-P-Und exógeno (véase el Ejemplo 7).

Ejemplo 4: Marcado metabólico de [3H] GalNAc-P-P-Und (in vivo) con [3H] GlcNAc en células de E. coli queexpresan el gen Z3206

Para investigar si la expresión del gen Z3206 de la E. coli 0157 hacia posible que las células sintetizaran GalNAc-PP-Und, la cepa 21546 de E. coli (Meier-Dieter, U., Starman, R., Barr, K., Mayer, H. y Rick, P. D. (1990) J. Biol. Chem., 265, 13490-13497) que expresa el gen Z3206 se marcó metabólicamente con [3H]GlcNAc y se analizó en cuanto a la formación de [3H] GlcNAc/ GalNAc-P-P-Und.

Marcado metabólico de células bacterianas – Las células de E. coli se cultivaron con agitado vigoroso en medio Luria-Bertani a 37 ºC hasta un Λ 0o θi 0,5-1.

Se añadió [3H]GlcNAc a una concentración final de 1 mCi/ml y se continuó la incubación durante 5 min a 37 ºC. La incorporación del radiomarcador en glicolípidos se terminó por la adición de 0,5 g/ml de hielo picado, y los cultivos se mezclaron concienzudamente. Las células bacterianas se recuperaron por centrifugación a 4000 x g durante 10 min, y el sobrenadante se desechó. Las células se lavaron con solución salina tampón de fosfato enfriada en hielo, se resuspendieron por removido vigoroso mezclado en 10 volúmenes (del aglomerado celular) de metanol, y se sonicó brevemente con una sonda sonicadora y al 40 % de potencia total. Después de la sonicación, se añadieron 20 volúmenes de cloroformo, y se mezclaron vigorosamente los extractos y se les dejó en reposo a temperatura ambiente durante 15 min. El material insoluble se sedimentó por centrifugación, y el aglomerado se re-extrajo con un pequeño volumen de CHCl3/CH3OH (2:1) dos veces. Los extractos orgánicos combinados se procesaron como se describe posteriormente.

La purificación de GlcNAc-P-P-Und y GalNAc-P-P-Und-GlcNAc/GalNAc-P-P-Und se extrajeron con CHCl3/CH3OH

(2:1): y se liberaron en material hidrosoluble por partición como se describe en otro sitio (Waechter, C. J., Kennedy, J.

L.: y Harford, J. B. (1976) Arch. Biochem. Biophys. 174, 726-737). El extracto orgánico se secó entonces bajo una corriente de nitrógeno, y el volumen de glicerofosfolípidos se destruyó por desacilación en tolueno/metanol (1:3) que contenía 0,1 N de KOH a 0 ºC durante 60 min. La reacción de desacilación se neutralizó con ácido acético, diluido con 4 volúmenes de CHCl3/CH3OH (2:1), y se lavó con 1/5 volúmenes de 0,9 % de NaCl. La fase orgánica (inferior) se lavó con 1/3 de volúmenes de CHCl3/CH3OH H2O (10:10:3) y entonces se eluyeron con CHCl3/CH3OH H2O

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Claims

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